JPS6368084A - キメラ酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はデンノン加水分解酵素に関する。さらに詳しく
は、本発明はキメラα−アミラーゼ、該キメラα−アミ
ラーゼの産生方法およびデンプンのハイＤＸシロップ（
ＤＸはシロップの乾燥物質（ＤＳ）に基づいて計算され
るデキストロース（Ｄ−グルコース）の重量％を意味す
る）への全体的酵素転化におけるこれらの使用に関する
。

（従来技術および発明が解決しようとする問題点〕デン
プンからのハイＤＸシロ、プの製造に一般に適する全体
的酵素方法は二つの段階を要する：すなわち、液化およ
び糖化である。第一の段階、液化はデンプンのオリゴ糖
混合物、いわゆるマルトデキストリンへの加水分解を含
む。この方法は、少なくとも７５℃、好ましくは約９０
℃の温度でα−アミラーゼによシ触媒化されるか、また
はジェットクツキング法、すなわちデンプンスラリーを
少なくとも数分間１０５〜１１０′ｃまで、通常はα−
アミラーゼの一回投与とともに加熱し、次いで少なくと
も一時間約９０℃に保つととによシ触媒化される。

様々力微生物性、特にバクテリア性のα−アミラーゼが
液化方法のために市販されておシ、たとエハパｙ（ＢＡ
Ｎ）　　（バチルス　アミロリフエフアシエンスＢａｃ
ｉｌｌｕｓ＋　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　
）およびターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）■（バチルス
　リチェニホルミスＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｇ　）（両方とも）がインダストリイ社（Ｎ
ＯＶＯＩＮＤＵＳＴＲＩ　　Ａ／Ｓ　）、デンマークか
ら供給）、およびサーモラーゼ（ＴａＥＲＭｏＬＡｓｘ
）　　（バチルス　ステア四テルモフィルスＢａｅｉｌ
ｌｕ＋ｓＳｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）　
（工ｙデイム　デペラプアント　コーポレーション、ニ
ューヨーク、アメリカ合衆国から入手可能である）であ
る。Δンα−アミラーゼは約８５℃までの温度に安定な
だけであフそれゆえジェット−クツキング法にあまシ適
当ではないが、一方ターマミルとサーモラーゼの両酵素
は熱に安定なためにデンプン液化のほとんどすべての好
ましい方法に良く適している。

マルトデキストリンをデキストロースへ転化する糖化段
階はグルコアミラーゼ酵素によシ主として触媒化される
。市販のグルコアミラーゼ製剤は、通常アスペルギルス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）またはリゾ−パス（Ｒｈ
１ｚｏｐｕａ　）種から誘導されるもので、様々な製品
から、たとえばＡＭＧＴＭ２００Ｌ［：アスペルギルス
　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕａ　ｎｉｇｏｒ　）か
ら作られノボ　インダストリイ社（デンマーク）によシ
製造される製品〕として入手可能である。

３０〜４０重量％ＤＸマルトデキストリン溶液からデキ
ス）ｏ−ス収率をさらに増加する目的で、板切シ酵素の
存在下にグルコアミラーゼを用いて糖化工程を行ないデ
ンプンのアミロペクチン部分から生ずる枝分れしたオリ
ゴ糖の加水分解を促進するととが通常行なわれるように
なってきた。グルコアミラーゼと同じ声および温度範囲
に最大活性を有するこのような板切シ酵素の１つがヨー
ロッパ特許出願第８２３０２００１．１号（公開番号第
００６３９０９号）に開示されている。板切シ酵素は、
ノ？　インダストリイ社（ＮＯＶＯＩＮＤＵＳＴＲＩ　
Ａ／Ｓ　）デンマークによシ商標名プロモザイム（ＦＲ
ＯＭＯＺＹＭＥ）として、または商標名デキストロザイ
ム（ＤＥＸＴＲＯＺＹＭＥ）のもとにグルコアミラーゼ
を適当に混合した組成物として市販されている。

残念なことに、デンプンのハイＤＸシＩｆｆ、プヘの転
化における液化用のバチルス　リチェニホルミスα−ア
ミラーゼと糖化用のグルコアミラーゼープロモザイムの
他の点では非常に好ましい組合わせには不便外ことがあ
る。液化段階からの残留α−アミラーゼ活性はグルコア
ミラーゼープロモザイムを用いた糖化によシ得られうる
ＤＸ最大量に負の効果を有することが見出された０問題
は、糖化の好ましい条件（それぞれ２約４．６と温度約
６０℃）でいまだに活性である熱安定性バチルスリチェ
ニホルミスα−アミラーゼで最も大きい。

少なくとも９０℃の温度に保ちながら液化デンプンをｐ
Ｈ４，５未満まで酸性化することによシ糖化の前にα−
アミラーゼを不活化することからなる救済が考え出され
た。α−アミラーゼの不活化に続いて、温度と−を糖化
状態に調節しなければならず、このことは−を約４．５
まで上げねばならないことを意味する。この追加の一調
節は必然的にシロップの塩含有量を増やしそれゆえ最終
シロップの脱塩化に関連する出費がかさむ。

本発明の目的は、デンプンのハイＤＸシｐ、ゾヘの転化
に対するバチルス　リチェニホルミスα−アミラーゼの
使用に関連する上述の不都合を克服するためのものであ
る。続いて本明細書で扱うこの目的および他の目的は、
新しい型のα−アミラーゼを用いて液化法を行なうこと
によシ達成される。

〔問題点を解決するための手段、発明の作用および効果〕

本発明のキメラα−アミラーゼ酵素は、バチルス　リチ
ェニホルミスから誘導されるα−アミラーゼのカルがキ
シ末端と結合したバチルス　アミロリクエファシェンス
から誘導されるα−アミラーゼのアミン末端の全部また
は一部からなる。簡単に記載すると、本発明は、次式■
： Ｑ　−Ｒ−Ｌ　　　　　（１） （式中、 Ｑはアミノ酸残基５５〜６０個のＮ−末端ポリペプチド
であって、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８
０％、よシ好ましくは少なくとも９０％−１）Ｅ　バチ
ルス　アミロリクエファシェンスα−アミラーゼ（タッ
キネンら、１９８３．Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：１００７−１０１３）に
おける５７個のＮ−末端アミノ酸残基と相同であるもの
であシ： Ｒは次式１ａ： （Ｉａ） Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｘ８−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　−Ｘ、−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ　−Ｘｌ　（ａ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｙ
ｅ で表わされるポリペプチドであシ；その際Ｘ８はＨｉｓ
またはＧｉｎであシ、 Ｘ９はＧｌｙまたはＳｅｒであシ、 Ｘ、。はＳｅｒまたはＡｓｐであシ、 Ｌはアミノ酸残基３９０〜４００個のＣ−末端ポリ檀プ
チドであって、少なくとも７５ｑ６、好ましくは少なく
とも８０％、さらに好ましくは少なくと４９０％カバチ
ルス　リチェニホルミス５８４（ＡＴＣＣ２７８１１）
α−アミラーゼ（ステファンら、　１９８４　、　Ｊ、
Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ　、　１５８　：　３６９−３７２
）における３９５個のＣ−末端アミノ酸残基と相同であ
るものである。） で表わされるキメラα−アミラーゼを提供するものであ
る。

その配列の一部が本発明のキメラアミラーゼに含まれて
いるバチルス　アミロリクエファシェンスおよびバチル
ス　リチェニホルミスによシ産生されるα−アミラーゼ
のアミノ酸配列の決定において、タッキネンら（同上）
およびステフェンら（同上）の関連性のために、これら
の文献はその全体が参考によシ編入される。

上記で記載し示されたキメラ酵素のアミノ酸配列は、配
列内でアミノ酸残基の置換、欠失または追加によシ変性
されその結果分子に静かな変化が生じこのため生成物が
その活性を維持する。このようなアミノ酸置換は、含ま
れる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および
／または両親媒性に基づいて行なわれる。たとえば、酸
性アミノ酸（ｐｉ−１６，０で陰性に荷電）はアスパラ
ギン酸およびグルタミン酸を含む；塩基性アミノ酸（声
６．０で陽性に荷電）はりシンおよびアルギニンを含む
；同様な親水性を有する非荷電の極性頭部基または無極
性頭部基を有するアミノ酸は次のものを含む：ロイシン
、インロイシン、パリｙ、グリシン、アラニン、アスパ
ラギン、グルタミン、セ１）：／、トレオニン、フェニ
ルアラニン、チロシン。

別の点において、本発明は上記第一の点の新規アミラー
ゼの製法に関する。この第二の点にしたがりて、本発明
のアミラーゼは通常の遺伝子工学技術たとえば遺伝子ス
プライシングを用いてもしくは次に記載されるインビが
組換えを用いて、または化学的合成技術を用いて作られ
うる。

第三の点において、本発明は、ハイＤＸシロ。

プの製造において、特に上述のジェット−クツキング法
において液化段階でキメラアミラーゼを使用することに
関する。

本発明の基礎となるキメラα−アミラーゼは、驚くべき
ことにバチルス　リチェニホルミスから誘導されるα−
アミラーゼの優れた熱的安定性を示すが、同時に糖化前
に不活性化されることなくＤＸの最大収量に対する逆効
果が低下する。ここにおいて本発明は、例として、バチ
ルス　リチェニホルミスα−アミラーゼのＮ末端から計
算して、はぼアミノ酸残基５７個からほぼアミノ酸残基
８７個までからなるバチルス　リチェニホルミスα−ア
ミラーゼの部分、またはこれに代わってその全Ｎ−末端
部分をバチルス　アミロリクエファシェンスα−アミラ
ーゼの相当部分と交換することを示す。キメラα−アミ
ラーゼの残留活性はグルコアミラーゼーゾロモザイムで
糖化されることによシ得られうるＤＸ最大量に関するほ
とんどわずかな逆効果を有するだけであシ、一方バチル
スリチェニホルミスα−アミラーゼの優れた熱安定性が
維持される。

本明細書で使用されるように、次の語は記載した意味を
有するものである： ＤＳ＝乾燥物質 ＤＸ＝デキストロース（Ｄ−グルコース）の重量％ 本発明はさらに添付の図面を用いながら以下の明細書お
よび実施例においてさらに詳しく説明される。

第１図は、バチルス　リチェニホルミスおよびｒｔｆル
ス　アミロリクエファシェンスからのα−アミラーゼお
よび本発明によるα−アミラーゼのダル透過クロマトグ
ラムを示す。

第２図はプラスミドｐＤＮ１８２２の制限地図を示し、 第３図はシラスミドｐＤＮ１８５０の制限地図を示し、 第４図はプラスミドｐＤＮ１８６４の制限地図を示す。

上記で示したように、本発明は次式！＝Ｑ　−Ｒ−Ｌ　
　　　　　　（１ （式中、Ｑ、ＲおよびＬは上記で定義されたものである
。） で表わされるα−アミラーゼに関する。好ましい式は次
に記載するものである。

式Ｉで表わされる好ましいα−アミラーゼは、式中Ｑが
次式Ｉｂ： （Ｉｂ） Ｘｌ　−Ａｌｌ！１−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌ＠ｕ　−Ｍｅ
　ｔ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ　−１５２゜ Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｘ２−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｉｎ　−Ｋｌ　５−Ｔｒｐ　−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
Ｌｓｕ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｘ３−Ｌｓｕ　−Ｘ
４−Ｇｌｙ　−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ　−Ｔ
ｒｐ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌｍ　−Ｔｙｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ　−Ｘ５−８ｃ＋ｒ−Ｇｉｎ　−Ｘ６−Ａ
ｍｐ　−Ｘ７−Ｇｌｙ　−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ を表わし、その際 ＸｌはＡｌ　ｅ、−Ａｓｎ−ＬｅｕまたはＶａｌを表わ
し、Ｘ２はＭｅｔまたはＴｈｒを表わし、 Ｘ３は５ｅｒ−Ａｌａ−ＴｙｒまたはＡｌａ−Ｇｌｕ−
Ｈｉｓを表わし、 Ｘ４はＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓまたは５ｅｒ−Ａｓｐｌ
ｌｅを表わし、 Ｘ５はＴｈｒ　’ＪたはＬｅｕを表わし、Ｘ６はＡｌａ
またはＳｅｒを表わし、 Ｘ７はＶａｌまたはＡｓｎを表わし、そしてＲとＬは前
記定義のものである。

一般式Ｉで表わされる別の好ましいα−アミラーゼにお
いて、ＱおよびＲはすでに定義したものでチシ、Ｌは次
式Ｉｃで表わされるＣ−末端ポリペア″′残８″″′“
　　　　　　　　　　　ウ下余白−ｃＩＪＩ−Ｌ４　　
　　　　リ　　　　　−一式■で表わされる別の好まし
いα−アミラーゼにおいて、Ｑは式１ｂを表わし、Ｌは
一般式ｌｅのＣ−末端ポリペプチド残基を表わし、その
際Ｘ、はＶａｌであシ、Ｘ２はＴｈｒであ）、Ｘ３はＡ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｌｇであシ、Ｘ４は５ｅｒ−Ａｓｐ−
Ｉｌｅであシ、Ｘ５はＬｅｕであシ、Ｘ６はＳｅｒでｓ
ｂ、モしてＸ、はＡａｎである。

式Ｉで表わされるさらに別の好ましいα−アミラーゼに
おいて、Ｑは式Ｉｂを表わし、その際Ｘ。

はｖａｌであル、Ｘ２はＴｈｒであシ、Ｘ３はＡｌａ−
Ｇｌｕ−Ｈｉｓであ）、Ｘ４はＳｅｒ”Ａ＋５ｐ−Ｉｌ
ｅであシ、Ｘ５はＬｅｕであシ、Ｘ６はＳｅｒであシ、
そしてＸ７はＡｓｎであシ、Ｌは式ｌｃで表わされるＣ
−末端ペプチド残基でお）、只のアミノ酸残基Ｘ８．Ｘ
、およびＸｌ。はそれぞれＧｉｎ　、　ＳｅｒおよびＡ
ｓｐである。

式■で表わされるさらに別の好ましいα−アミラーゼは
、Ｑが弐１ｂを表わし、その際Ｘ１　　はＭａｌであシ
、Ｘ２はＴｈｒであシ、ＸｓはＡｌａ−Ｇｌｕ　−Ｈｌ
ｇであシ、ｘ４は５ｅｒ−Ａｓｐ−１１ｅであシ、Ｘ５
はＬｅｕであシ、Ｘ６はＳｅｒで６Ｊ、Ｘ７はＡｌＩｎ
であシ、Ｌは式Ｉｃで表わされるＣ−末端ポリペプチド
残基を表わし；そしてＲのアミノ酸残基Ｘ８．Ｘ、およ
びＸ、。はそれぞれＨｉｓ　、　ＧｌｙおよびＳｅｒで
ある。

本発明のアミラーゼはキメラ酵素であり、本発明の第二
の観点によれば次に記載する多数の方法で作られる。

天然産生アミノ酸はランダムのまたは特定部位の突然変
異誘発によシ遺信子的に変性されうる。

これに代わシ、１つの酵素の一部を別の一部に代えてキ
メラ酵素を得るようにしてもよい。この置換は通常のイ
ンビトロ遺伝子スプライシング法またはインビデ組換え
のいずれかによシまたは両方の技術を組合わせて達成さ
れる。通常のインビトロ遺伝子スプライシング法を用い
ると、α−アミラーゼ遺伝子コード配列の所望の部分を
、適当な部位特異的制限酵素を用いて欠失させ；次いで
コード配列の欠失部分を、異なったα−アミラーゼコー
ド配列の所望の部分を挿入することによシ置き換え、こ
れによシ新しいα−アミラーゼをコード化するキメラヌ
クレオチド配列が作られる。

インピ？組換技術は、非常に似通った領域（ＤＮＡ配列
の同一性）を有する異なったＤＮＡ部分を組換える、す
なわち、ＤＮＡを破壊し、そして相同領域に新しい結合
を確立するという事実に基づくものである。したがって
、２つの異なったしかしながら相同のアミラーゼ酵素に
対するコード配列を宿主細胞の形質転換のために使用す
る場合、相同配列のインビデの組換えの結果キメラ遺伝
子配列が製造される。宿主細胞によるこれらのコード配
列の翻訳は、キメラアミラーゼ遺伝子生成物を作る結果
となる。

バチルス　リチェニホルミスからのα−アミラーゼ遺伝
子（以後、ａｍｙＬとする）およびバチルスアミロリク
エファシェンスからのα−アミラーゼ遺伝子（以後、ａ
ｍｙＱとする）はＤＮＡレベルでほぼ７０チが相同であ
シ、インビが遺伝子スプライシングによ如ハイブリッド
形成に適する。

別の実施態様において、キメラ酵素は当該技術で公知の
標準的化学方法によシ合成されうる。たとえば、バンカ
ピラーら（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）。

１９８４　、Ｎａｔｕｒｅ　３１０：１０５−１１１参
照。

同上のアミノ酸配列を有するペプチドは全体または部分
的に合成されそして結合され本発明キメラ酵素な形成す
る。

第三の観点によれば、本発明はデンプンのハイＤＸシロ
ップへの全体的酵素転化における液化段階において新規
α−アミラーゼの使用に関する。

予め示したように、液化段階におけるバチルスリチェニ
ホルミスからの熱安定α−アミラーゼの使用による残留
活性は、アスペルギルス　ニガーグルコアミラーゼおよ
びバチルス　アミド　プルリティカス　プルラナーゼを
用いると、糖化段階において得られうる最大Ｄ−グルコ
ース収率に逆効果を有することになる。

この逆効果の理由は十分に理解されていないが、しかし
ながらバチルス　リチェニホルミスα−アミラーゼが１
限界デキストリン”を生じ、これはアミロペクチンにお
ける枝分れ点に近い１，４−α−グルコシド結合を加水
分解することによるバチルス　ア２トシルリティカス　
プルラナーゼに対し好ましくない基質であると考えられ
る。１個以上の側鎖においてあま）に少ないグルコース
単位を含むこれらの限界デキストリンはバチルスアミド
ゾルリティカス　プルラナーゼ攻撃に対し感受性が低い
であろう。

第１図において、アミロペクチンにおけるバチルス　リ
チェニホルミスα−アミラーゼ、バチルス　アミロリク
エファシェンス　α−アミラーゼおよびハイブリッドＱ
Ｌ１８６４α−アミラーゼに対する作用パターンは４８
時間後にアミロペクチン消化物から採られたダルー透過
クロマトグラムによシ示される。

図から、アミロペクチンにおけるバチルス　リチェニホ
ルミスα−アミラーゼの作用パターンがバチルス　アミ
ロリクエファシェンスα−アミラーゼのものと異なるこ
とがわかる。バチルス　リチェニホルミス酵素は主にＤ
Ｐ６．　ＤＰ５およびＤＰ３を最初に作る。延長した加
水分解においてＤＰ６分画はさらに加水分解され、主な
成分はＤＰ５．　ＤＰ。

およびＤＰ２である。バチルス　アミロリクエファフェ
ンスα−アミラーゼを用いると、主な成分はＤＰ６であ
る。

アミロペクチンにおけるＱＬ１８６４α−アミラーゼに
よシ例示されるような本発明のα−アミラーゼの作用ノ
ぐターンは両方の天然産生α−アミラーゼから著しく異
なシ、そして以下に示すように、この変化した作用ノぐ
ターンは、驚くべきことにＤ−グルコース収率における
バチルス　リチェニホルミスα−アミラーゼの逆効果を
除き、その間熱安定性は維持されるという結果になる。

したがって、本発明のα−アミラーゼはデンプンの液化
に非常に効率良く使用されることがわかった０ 〔実施例〕 例１ 以下の例はキメラα−アミラーゼＱＬＩ　８６４の製造
および特性を記載する。

（１，１）　　ハイブリッドＱＬ　１８６４の構築常法
によシ、ａｍｙＬとａｍｙＱを枯草菌（Ｂ。

ｓｕｂｔｉｌｌｇ　）にクローンする。２つの遺伝子の
制限酵素地図は、バチルス　リチェニホルミスアξラー
ゼ（ａｍｙＬ）（ステフェンら、１９８６゜Ｊ、Ｂａｅ
ｔｅｒｉｏｌ、１５８：３６９．１９８４）およびバチ
ルス　アミロリクエファシェンスアミラーゼ（ａｍｙＱ
）（タッキネンら、　１９８３　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ２５８：１００７）１９８３）の遺伝子それぞ
れに対し公表されたＤＮＡ配列と一致する。

ａｎｙ　Ｑ（ａｍｙＱ＋）とａｍｙ　ＬのＣ−末端部分
（ａｍｙＬ−）をプラスミドｐＤＮ１８２２に平行ニ入
れる。これはクローニングベクターｐＵＢ１１０から銹
導されそしてクローニングベクターｐｃ　１９４のクロ
ラムフェニコール耐性（ｅａｍＲ）遺伝子（ｃａｔ遺伝
子）を持つ枯草菌プラスミドである。ｐＤＮ１８２２の
制限地図を第２図に示す。ことでは遺伝子は矢印で示さ
れる。ｐＤＮ１８２２におけるａｎｙ　ＱのＣ−末端部
を次いでＰｖｕ　Ｉ　−Ｐｖｕ　Ｉ断片の削除（第２図
にへ゛ツチで示される）によシ欠失し、プラスミドｐＤ
Ｎ　１８５０を得る（第３図）。ｐＤＮ１８５０はアミ
ラーゼ陰性（Ａｍｙ−’）であるがしかしａｍｙ　Ｑの
Ｎ−末端部分およびａｍｙＬのＣ−末端部分を有する。

しかしながら、約１０−４の頻度で、ａｍｙ　Ｑとａｍ
ｙＬの間の組換えの結果ハイブリッドＱＬアミラーゼ遺
伝子を有しくａｍｙＱＬ＋）そしてアミラーゼ陽性表現
型（Ａｒｎｙ”　）のシラスミドが得られる。

デンプン含有寒天プレートにおいてｐＤＮ１８５０のプ
ラスミド製剤を用いてＣａｍＲを選択するプラスミド不
含有枯草菌へ形質転換すると活性アミラーゼを産生ずる
約ｉ　：　ｉ　ｏ’の形質転換細胞が得られる。これら
の形質転換細胞を、ヨウ素蒸気によシ同定されうる分解
デンプンの輪によシ周囲を囲む。これらのＡｍｙ＋形質
転換細胞はシラスミドにＱＬハイブリッドアミラーゼ遺
伝子を有する。これらの形質転換細胞からプラスミドｐ
ＤＮ１８５１〜ｐＤＮ１８６５を単離し、プラスミドｐ
ＤＮ１８５１゜ｐＤＮ　１８５８〜ｐＤＮ１８６２およ
びｐＤＮ１８６４を含む形質転換細胞が本発明の目的を
満足するα−アミラーゼを産生ずることが見出された。

プラスミ）’ｐＤＮ１８６４（７）制限酵素地図によシ
、ａｍｙＱＬ１８６４遺伝子は特徴づけられ（第４図）
、そしてａｍｙＱからのＡｖａｌ［部位を有するがしか
しａｍｙ　Ｑからの近くのＥｃｏＲＩ部位を有さないこ
とが見られる。それゆえ、第３図においてり四スーハッ
チ区域によシ示されたａｍｙ　Ｑとａｍｙ　Ｌの間の組
換えは、バチルス　リチェニホルミスα−アミラーゼに
おけるアミノ酸４５８と４６７をコードするコドンの間
で生じる。したがって、枯草菌ｐＤＮ　１８６４は、Ｎ
−末端で約１／６　ａｍｙＱアミラーゼとＣ−末端で約
５７６　ａｎｙ　Ｌアミラーゼからなるキメラアミラー
ゼを産生ずる。

（１，２）　　ＱＬ１８６４によシ産生されるキメラア
ミラーゼの分析 次の試験において、使用される酵素単位は以下のように
定義される： α−アミラーゼ活性のＩＮＵ（）が単位）は、３７℃、
ｐＨ５，６およびＣａ＋＋０．００４３Ｍにて１時間轟
シ溶解デンプン５．２６１ｎ９を反応時間７−２０分か
けて分解する酵素の量である。

グルコアミラーゼ活性のＩＡＧ単位は、２５℃で声４．
３にて１分につきマルトースの１ミクロモルを加水分解
する酵素の量である。

１プルラナ一ゼ単位（ＰＵＮ）は、標準状態（温度４０
℃でｐＨ５，０）下で１分につきグルコース１ミクロモ
ルと同等の還元基の形成に和尚する速度でプルランを加
水分解する酵素の量として定義される。

（２，１）　　キメラアミラーゼの糖化試験上記の説明
のように、液化段階から生ずる残留バチルス　リチェニ
ホルミスα−アミラーゼ活性の存在は、バチルス　アミ
ドグルリティカス　プルラナーゼおよびアスペルギルス
　ニガー　グルコアミラーゼを組合わせて用いたとき、
糖化段階における最大Ｄ−グルコース収率に逆効果を有
することがわかる。

糖化段階における本発明のキメラα−アミラーゼからの
残留活性の影響を評価するために、これらを次の方法で
バチルス　リチェニホルミスα−アミラーゼと比較する
： 糖化のための基質は、ＤＥ８スゾレ一一乾燥マルトデキ
ストリン（ＡＰＳ　　８４０９６４Ａ）を脱イオン水中
にＤＳ　　（乾燥物質）はぼ３０チになるまで再溶解す
ることによシ調製される。糖化実験は標準５００ｆｉ！
１！実験室パッチ反応物中で行なう。

声は６０℃の緩衝液中で目盛シ付きの調整された一電極
および声メーターを用いて糖化温度にて測定される。

次の標準状態が使用される： ｐＨ（初期、６０℃）４．６ 酵素投与量： グルコアミラーゼ　　０．１５ＡＧ／７　　ＤＳプルラ
ナーゼ　　　　０．３３ＰＵＮ／ｇ　ＤＳα−アミラー
ゼ　　　　６０　　ＮＵ／１１　　ＤＳ第１表 キメラアミラーゼの糖化試験 反応条件 時間 （対照）　　４Ｂ　　４．４９６．７　１．８　０．７
　０．８７２　４．４９６．８　２．０　　０．６　　
０．６ホル償ス　　　４８　４．５９５．９　　１．８
　　１．５　　０．９７２　４．４９６．２　２．０　
　１．１　　０．７９６　４．４９６．４　２．１　　
０．９　　０．６ＱＬ１Ｂ６４　　２４　４．６９２．
１　２．８　　１．９　　３．２４８　４．５９６．３
　１．７　　１．２　　０．９７２　４．５９６．５　
２．０　　０．９　　０．７９６　４．５９６．６　２
．１　　０．８　　０．６第１表に示される結果から、
ＱＬ１８６４　α−アミラーゼはＤＸ最大収量をやや減
らす（対照物と比較して）ものの、バチルス　リチェニ
ホルミスα−アミラーゼを越える重大な改善を示すこと
がわかる。

（２，２）　　キメラアミラーゼの熱的活性化形質転換
された株によ）作られるキメラα−アミラーゼの熱的活
性化を評価するために、キメラα−アミラーゼに次の試
験を行なう： 基質：ファデパス表（ンアデバスＰｈａｄ＠ｂａｓ■ア
ミラーゼ試験、ファルマシア　ダイ アグノスティクス、スウェーデン）水 に不溶の架橋した青色テンプンポリマ ー〇 緩衝液：０．１Ｍリン酸塩、ｐｌ（６，１およびトリス
緩衝液ｐＨ９，５’ 酵　素：　０．０９　Ｍ’ＣａＣ２２に１−２　Ｎ１３
７ｍはで希釈されたα−アミラーゼ、ｐ）Ｉ　６．１温
　度＝３７℃および８５℃ １−のα−アミラーゼ希釈液を５−緩衝液と十分に混合
し、所望の温度で水浴中にてインキユペートシてからフ
ァデパス表の１つを加える。

試験管を回転ミキサー中で１５秒間振とうしてからこれ
を再び水浴へ入れる。正確に１５分後、ｌ　Ｍ　ＮａＯ
Ｈ１−を加えて反応を停止する。混合後、混合物を９ｃ
ｆｎワツトマン（Ｗｈａｔｍａｎ）■ＦＧ／ＣのＧＦ／
Ａフィルターを通して濾過する。

゛　Ｆ液の光学密度を波長６２０　ｎｍで測定し、そし
て添加したα−アミラーゼの活性と直線的関係があるこ
とが見出された。

結果を次の第■表に示す。この表には、純粋なバチルス
　リチェニホルミスとバチルス　アミロリクエファシェ
ンスα−アミラーゼを用いり試験からの値も一緒に記す
。

以下余白 キメラアミラーゼの熱的活性化 ファデベス３７℃　　ファデパス　ｐＨ６，１α−アミ
ラーゼ　　ｐＨ６，１：ｐＨ９，５７５℃＝３７℃ＱＬ
１８６４　　　　　　２．５　　　　　　　　　２．５
ＱＬ１８６１　　　　　　２．２　　　　　　　　　２
．２ＱＬ１８５１　　　　　　２．１　　　　　　　　
　２．１ＱＬ１８６２　　　　　　２．０　　　　　　
　　　２．０ＱＬ１Ｂ５８　　　　　　２．０　　　　
　　　　　２．０第■表に示されたデータは、本発明の
キメラα−アミラーゼがバチルス　リチェニホルミスα
−アミラーゼと同じ程熱的に活性化され、そしてバチル
ス　アミロリクエファシェンスα−アミラーゼよジアル
カリ住戸に対し感受性が低いことを示す。

（２，３）　キメラアミラーゼの熱的安定性本発明のα
−アミラーゼの安定性を評価するために、次のスチール
チューブ試験を行なう。

以下の条件下で基質として脱イオン水に再溶解したＤＥ
７マルトデキストリンを使用する：基質　　　　　　３
２−３３ｑ６ α−アミラシー与量　　１２ＯＮＵ／、９マルトデキス
トリン温度　　　　　　１０５℃ ｐｉ（５，５ カルシウム含有量　　６０　ｐｐｍ 各試験において上記反応混合物を含む５本のスチール製
試験管を１０５℃の油浴に入れ、それぞれ１０分、２０
分、３０分、４０分および６０分後に取シ出し、上述の
ファデパス法によシ残留α−アミラーゼ活性を測定する
。半減期ＴＨを鞠←残留活性）対時間の線状回帰によシ
計算される。

結果を次の第■表に示す。

第■表 ぺｈスア和り匂アＺＱス（対照）　　　　５ＱＬ　　１
８５１　　　　　　　　　　　　　　２２ＱＬ　　１８
５８　　　　　　　　　　　　　　２５ＱＬ　　１８６
１　　　　　　　　　　　　　　１８ＱＬ　　１８６２
　　　　　　　　　　　　　　２２ＱＬ　　１８６４　
　　　　　　　　　　　　　２４メグルスリチエニホル
ミス（対照）２３第■表に示す結果から本発明のハイブ
リ、ドα−アミラーゼがバチルス　リチェニホ／ｌ／　
ミスα−アミラーゼの安定性を維持することが明らかで
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図はバチルス　リチェニホルミスおよびバチルス　
アミロリクエファシェンスからのα−アミラーゼおよび
本発明によるα−アミラーゼのゲル透過クロマトダラム
であシ、 第２図はシラスミドｐＤＮ１８２２の制限地図であシ、 第３図はプラスミドｐＤＮ　１８５０の制限地図であシ
、 第４図はシラスミドｐＤＮ１８６４の制限地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式 I ： Ｑ−Ｒ−Ｌ（ I ） （式中、 Ｑはアミノ酸残基５５〜６０個のＮ−末端ポリペプチド
   であって、タッキネンらによりＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
   ．￥２５８￥（１９８３）１００７−１０１３に記載さ
   れたようなバチルスアミ ロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ
   −ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼの５５個
   のＮ−末端アミノ酸残基と少なくとも７５％が相同する
   ものであり、 Ｒは次式 I ａ： 【遺伝子配列があります】 からなるポリペプチドであって、その際 Ｘ＿８はＨｉｓまたはＧｌｎを表わし、 Ｘ＿９はＧｌｙまたはＳｅｒを表わし、 Ｘ＿１＿０はＳｅｒまたはＡｓｐを表わし、Ｌはアミノ
   酸残基３９０〜４００個のＣ末端ポリペプチドであって
   バチルスリチェニホル ミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
   ）５８４（ＡＴＣＣ２７８１１）α−アミラーゼの３９
   ５個のＣ−末端アミノ酸残基と少なくとも７５％が相同
   するものである。） で表わされるキメラα−アミラーゼ。 ２、Ｘ＿８がＨｉｓであり、 Ｘ＿９がＧｌｙであり、 Ｘ＿１＿０がＳｅｒである 特許請求の範囲第１項記載のキメラα−アミラーゼ。 ３、Ｘ＿８がＧｌｎであり、 Ｘ＿９がＳｅｒであり、 Ｘ＿１＿０がＡｓｐである 特許請求の範囲第に項記載のキメラα−アミラーゼ。 ４、相同部分が少なくとも８０％である特許請求の範囲
   第１項記載のキメラα−アミラーゼ。 ５、相同部分が少なくとも９０％である特許請求の範囲
   第１項記載のキメラα−アミラーゼ。 ６、Ｑが一般式 I ｂ： （ I ｂ） 【遺伝子配列があります】 からなるＮ−末端ポリペプチド残基からなり、その際 Ｘ＿１がＡｌａ−Ａｓｎ−ＬｅｕまたはＶａｌであり、
   Ｘ＿２がＭｅｔまたはＴｈｒであり、 Ｘ＿３がＳｅｒ−Ａｌａ−ＴｙｒまたはＡｌａ−Ｇｌｕ
   −Ｈｉｓであり、 Ｘ＿４がＡｌａ−Ｇｌｙ−ＨｉｓまたはＳｅｒ−Ａｓｐ
   −Ｉｌｅであり、Ｘ＿５がＴｈｒまたはＬｅｕであり、 Ｘ＿６がＡｌａまたはＳｅｒであり、 Ｘ＿７がＶａｌまたはＡｓｎである 特許請求の範囲第１項記載のキメラα−アミラーゼ。 ７、Ｘ＿１がＶａｌであり、 Ｘ＿２がＴｈｒであり、 Ｘ＿３がＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓであり、 Ｘ＿４がＳｅｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅであり、 Ｘ＿５がＬｅｕであり、 Ｘ＿６がＳｅｒであり、 Ｘ＿７がＡｓｎである 特許請求の範囲第６項記載のキメラα−アミラーゼ。 ８、Ｌが一般式 I ｃ： （ I ｃ） 【遺伝子配列があります】 （ I ｃ）続き 【遺伝子配列があります】 からなるＣ−末端ポリペプチド残基からなる特許請求の
   範囲第４、５、６または７項記載のα−アミラーゼ。 ９、（ａ）バチルスアミロリクェファシエンスのα−ア
   ミラーゼ遺伝子のＮ−末端コード領域をバチルスリチェ
   ニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子のＣ−末端コード領
   域とインビボ組換えして組換体を形成し； （ｂ）熱的に安定でそしてデンプンの糖化に対しアスペ
   ルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼお
   よびバチルスアシドプルリチカス（Ｂ．ａｃｉｄｏｐｕ
   ｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）プルラナーゼの使用に逆効果減
   少を示すキメラα−アミラーゼを産生する組換え体を選
   択し； （ｃ）選択した組換体を適当な増殖培地で培養し； （ｄ）培地からキメラα−アミラーゼを回収する ことからなるキメラα−アミラーゼの産生方法。 １０、（ａ）特許請求の範囲第１項、２項、３項、４項
   、５項、６項または７項記載のキメラα−アミラーゼと
   デンプンとを反応させてオリゴ糖を作り； （ｂ）段階（ａ）で形成されたオリゴ糖をグルコアミラ
   ーゼと反応させてデキストロースを作ることからなるデ
   ンプンのハイデキストロースシロップへの転化方法。 １１、（ａ）デンプンを特許請求の範囲第８項記載のキ
   メラα−アミラーゼと反応させてオリゴ糖を作り； （ｂ）段階（ａ）で形成されたオリゴ糖をグルコアミラ
   ーゼと反応させてデキストロースを作ることからなるデ
   ンプンのハイデキストロースシロップへの転化方法。