BRPI9911086B1 - composição de limpeza, processo para tratar tecidos a máquina, e uso de uma mananase - Google Patents

Abstract

"mananase isolada, molécula isolada de polinucleotídeo, vetor de expressão, célula cultivada, polipeptídeo isolado, preparação de enzima. enzima isolada, processos para produzir um polipeptídeo, para melhorar as propriedades de fibras celulósicas ou sintéticas, fios, tecido ou não tecido, para degradar ou modificar material vegetal, para processar extrato líquido de café e para tratar tecidos a máquina, composição de limpeza e uso de uma preparação de enzima ou de uma enzima". as novas mananases que compreendem, por exemplo, uma sequência de aminoácido como mostrado nas posições de 31 a 330 da seq id no: 2 ou seus homólogos, podem ser derivadas, por exemplo, do bacillus sp. 1633 ou podem ser codificadas por moléculas de polinucleotídeos que compreendam uma sequência de nucleotídeos como mostrado na seq id no: 1, do nucleotídeo 91 ao nucleotídeo 990, moléculas de polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo que seja pelo menos 65 % idêntico à sequência de aminoácido da seq id no: 2, do resíduo de aminoácido 31 ao resíduo de aminoácido 330 ou suas sequências degeneradas de nucleotídeo. as mananases são alcalinas e são utilizáveis, por exemplo, em composições de limpeza, em um fluído de ruptura utilizável para romper uma formação subterrânea, para modificar um material vegetal e para o tratamento de fibras celulósicas.

Description

"COMPOSIÇÃO DE LIMPEZA, PROCESSO PARA TRATAR TECIDOS A MÁQUINA, E USO DE UMA MANANASE A presente invenção diz respeito a mananases microbianas, mais especifícamente a enzimas microbianas que exibem atividade de mananase como a sua principal atividade enzimática nas faixas de pH neutra e alcalina; a um método de produzir tais enzimas e a métodos par usar tais enzimas nas indústrias de processamento de papel e polpa, têxtil, perfuração de óleo, limpeza, lavanderia, detergente e fibra de celulose.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os polissacarídeos que contenham manana são um componente principal da fração de hemicelulose em madeiras e endospermas em muitas sementes de leguminosas e em algumas sementes maduras de vegetais não leguminosos. Essencialmente, a beta-1,4-manana linear, não substituída é encontrada em alguns vegetais não leguminosos. A beta-1,4-manana não substituída que está presente, por exemplo, nas jarinas parece-se com a celulose na conformação das cadeias individuais de polissacarídeo e é insolúvel em água. Nas sementes de leguminosas, a galactomanana solúvel em água é a principal armazenagem de carboidrato que compreende até 20 % do peso seco total. As galactomananas têm uma cadeia principal de beta-1,4-manana substituída por uma única alfa-l,6-galactose, opcionalmente substituída com grupos acetila. As mananas também são encontradas em vários vegetais monocotiledôneos e são os polissacarídeos mais abundantes no material da parede celular na farinha da semente da palmeira As glicomananas são polissacarídeos lineares com uma cadeia principal de manose e de glicose ligados a beta-1,4 que se alternam de uma maneira mais ou menos regular, a cadeia principal sendo opcionalmente substituída por grupos galactose e/ou acetila. As mananas, galactomananas, glicomananas e galactoglicomananas (isto é, as cadeias principais de glicomanana com galactose ramificada) contribuem para mais do que 50 % da hemicelulose da madeira mole. Além, disso, a celulose de muitas das algas vermelhas contém uma quantidade significante de manose.

As mananases foram identificadas em diversos organismos de Bacillus. Por exemplo, Talbot et ah, Appl. Environ. Microbiol., Vol. 56, N-11, pp. 3505 a 3510 (1990) descreve uma beta-mananase derivada do Bacillus stearothermophilus na forma de dímero tendo peso molecular de 162 kDa e um pH ótimo de 5,5 a 7,5. Mendoza et al., World J. Microbiol. Biotech, Vol. 10, N2 5, pp. 551 a 555 (1994) descreve uma beta-mananase derivada do Bacillus subtilis tendo um peso molecular de 38 kDa, uma atividade ótima no pH 5,0 e a 55° C e um pi de 4,8. A JP-A-03047076 divulga uma beta-mananase derivada do Bacillus sp., tendo um peso molecular de 37 ± 3 kDa medido pela filtração em gel, um pH ótimo de 8 a 10 e um pi de 5,3 a 5,4. A JP-A-63056289 descreve a produção de uma beta-mananase alcalina, termoestável que hidrolisa as ligações de beta-l,4-D-manopiranosídeo de, por exemplo, mananas e produz mano-oligossacarídeos. A JP-A-63036775 diz respeito ao microorganismo de Bacillus FERM P-8856 que produz beta-mananase e beta-manosidase em um pH alcalino. A JP-A-08051975 divulga beta-mananases alcalinas do Bacillus sp. alcalofílico AM-001 tendo pesos moleculares de 43 ± 3 kDa e 57 ± kDa e pH ótimo de 8 a 10. Uma mananase purificada do Bacillus amyloliquefadens utilizável no branqueamento de polpa e de papel e um método de sua preparação é divulgado na WO 97/11164. A WO 91/18974 descreve uma hemicelulase tal como uma glicanase, xilanase ou mananase ativa em pH e temperatura extremos. A WO 94/25576 divulga uma enzima do Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, que exibe a atividade de mananase que pode ser utilizável para a degradação ou modificação de material de parede celular vegetal ou de algas. A WO 93/24622 divulga uma mananase isolada do Trichoderma reseei utilizável para o branqueamento de polpas lignocelulósicas. A WO 95/35362 divulga composições de limpeza que contenham enzimas que degradam a parede celular vegetal tendo atividade de pectinase e/ou hemicelulase e opcionalmente de celulase para a remoção de manchas de origem vegetal e divulga ainda uma mananase alcalina da cepa Cl 1SB.G17. É um outro objetivo da presente invenção fornecer uma enzima nova e eficiente que apresente atividade de mananase também na faixa de pH alcalino, por exemplo, quando aplicado em composições de limpeza ou em processos industriais diferentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores descobriram agora novas enzimas tendo atividade substancial de mananase, isto é enzimas que apresentem atividade de mananase que podem ser obtidas de uma cepa bacteriana do gênero Bacülus e foram bem sucedidos na identificação das sequências de DNA que codificam tais enzimas. As sequências de DNA estão listadas na listagem de sequência como SEQ ID Nos: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 e 31 e as sequências de aminoácido deduzidas estão listadas na listagem de sequência como SEQ ID Nos: 2, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 e 32, respectivamente. Acredita-se que as novas enzimas serão classificadas de acordo com a Nomenclatura de Enzima na Classe de Enzima EC 3.2.1.78.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma mananase que é i) um polipeptídeo produzido pelo Bacillus sp. 1633, ii) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido como mostrado nas posições de 31 a 330 da SEQ ID NO: 2 ou íii) um análogo do polipeptídeo definido em i) ou ii) que seja pelo menos 65 % homólogo ao dito polipeptídeo é derivado do dito polipeptídeo pela substituição, supressão ou adição de um ou de vários aminoácidos ou que seja imunologicamente reativo com um anticorpo policlonal incitado contra o dito polipeptídeo na forma purificada.

Dentro de um aspecto, a presente invenção fornece uma molécula isolada de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste de (a) moléculas de polinucleotídeo que codificam um polipeptídeo tendo atividade de manase e que compreenda uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 91 ao nucleotídeo 990; (b) espécies homólogas de (a); (c) moléculas de polinucleotídeo que codificam um polipeptídeo tendo atividade de mananase que seja pelo menos 65 % idêntico à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 do resíduo de aminoácido 31 até o resíduo aminoácido 330; (d) moléculas complementares a (a), (b) ou (c) e (e) sequências de nucleotídeo degenerado de (a); (b), (c) ou (d). O plasmídeo pBXM3 que compreende a molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA) que codifica uma mananase da presente invenção foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os Propósitos de Procedimento de Patente no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha, em 29 de maio de 1998 sob o número de deposito DSM 12197.

Dentro de um outro aspecto da invenção fomeceu-se um vetor de expressão que compreende os seguintes elementos operavelmente ligados: um promotor de transcrição; um segmento de DNA selecionado do grupo consistindo de (a) moléculas de polinucleotídeo que codificam um polipeptídeo tendo atividade de mananase e que compreenda uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 91 até o nucleotídeo 990; (b) espécies homólogas de (a); (c) moléculas de polinucleotídeo que codifiquem um polipeptídeo tendo atividade de mananase que seja pelo menos 65 % idêntico à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 do resíduo de aminoácido 31 até o resíduo aminoácido 330; e (d) sequências de nucleotídeo degenerado de (a), (b) ou (c); e um terminador de transcrição.

Dentro de um outro aspecto da presente invenção fomeceu-se uma célula cultivada na qual foi introduzido um vetor de expressão como divulgado acima, em que a dita célula expressa o polipeptídeo codificado pelo segmento de DNA.

Outros aspectos da presente invenção fornecem um polipeptídeo isolado tendo atividade de mananase selecionado do grupo que consiste de (a) moléculas de polipeptídeo que compreendam uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 2 do resíduo de aminoácido 31 até o resíduo de aminoácido 330; (b) espécies homólogas de (a); e uma proteína de fusão tendo atividade de mananase que compreende uma primeira parte de polipeptídeo que apresenta atividade de mananase e uma segunda parte de polipeptídeo que apresenta a função de ligação de celulose, o segundo polipeptídeo sendo preferivelmente um domínio de ligação de celulose (CBD), tal como uma proteína de fusão representada pela SEQ ID NO: 4.

Dentro de um outro aspecto da presente invenção fomeceu-se uma composição que compreende um polipeptídeo purificado de acordo com a invenção em combinação com outros polipeptídeos.

Dentro de um outro aspecto da presente invenção fomeceu-se métodos para produzir um polipeptídeo de acordo com a invenção que compreende cultivar uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão como divulgado acima, por meio do qual a dita célula expressa um polipeptídeo codificado pelo segmento de DNA e de recuperar o polipeptídeo. A nova enzima da presente invenção é utilizável para o tratamento de material celulósico, especialmente fibras que contenham celulose, fios, tecidos ou não tecidos, tratamento de polpas de fabricar papel mecânico, polpas de papel kraft ou papel de sobras recicladas e para a maceração de fibras. O tratamento pode ser realizado durante o processamento do material celulósico em um material pronto para a fabricação de papel ou de peças de roupa ou de tecido, o último, por exemplo, na etapa de desengomadura ou de lavagem; ou durante a lavagem industrial ou doméstica de tal tecido ou peça de roupa.

Consequentemente, em outros aspectos a invenção diz respeito a uma composição de limpeza ou de detergente que compreende a enzima da invenção e a uso da enzima da invenção para o tratamento, por exemplo, limpeza, de fibras, fios, tecido ou não tecido, que contenham celulose, bem como tecidos sintéticos ou parcialmente sintéticos. É considerado que a enzima da invenção é utilizável em um processo de lavagem e/ou desengomadura (remoção da goma manana) na preparação de material celulósico, por exemplo, para uma resposta apropriada nas operações subsequentes de fingimento. A enzima também é útil para a remoção de pasta de impressão que contenha manana. Além disso, as composições detergentes que compreendem a nova enzima são capazes de remover ou branquear certas sujeiras ou manchas presentes na lavagem de roupa, especialmente sujeiras e manchas que resultam de alimentos, vegetais e outros que contenham manana. Além disso, o tratamento com as composições de limpeza ou de detergente que compreendam a nova enzima pode melhorar a brancura bem como impedir a ligação de certas sujeiras ao material celulósico.

Consequentemente, a presente invenção também diz respeito a composições de limpeza, incluindo composições de lavar roupas, de lavagem de louça, limpadoras de superfície dura, de limpeza pessoal e orais/dentais, que compreendam a mananase da invenção. Além disso, a invenção diz respeito a tais composições de limpeza que compreendam uma mananase e uma enzima selecionada de celulases, proteáses, lipases, amilases, enzimas que degradam a pectina e xiloglicanases, tais composições fornecendo desempenho superior de limpeza, isto é remoção superior de manchas, remoção de encardidos ou manutenção da brancura.

DEFINIÇÕES

Antes de debater esta invenção em mais detalhes, os seguintes termos serão primeiro definidos. O termo “ortóíogo” (ou “espécie homóloga”) denota um polipeptídeo ou proteína obtidos de uma espécie que tenha homologia a um polipeptídeo ou proteína análogos de uma espécie diferente. O termo “parálogo” denota um polipeptídeo ou proteína obtidos de uma espécie dada que tenha homologia a um polipeptídeo ou proteína diferentes desta mesma espécie. O termo “vetor de expressão” denota uma molécula de DNA, linear ou circular que compreenda um segmento que codifica um polipeptídeo de interesse operacionalmente ligado a segmentos adicionais que fornecem a sua transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e termínadoras e podem opcionalmente incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um acentuador, um sinal de poliadenilação e outros. Os vetores de expressão são, no geral, derivados de DNA plasmídico ou viral ou podem conter elementos de ambos, O vetor de expressão da invenção pode ser qualquer vetor de expressão que esteja convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e a escolha do vetor dependerá frequentemente da célula hospedeira na qual o vetor deve ser introduzido. Desta maneira, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação do cromossoma, por exemplo, um plasmídeo. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) foi integrado. O termo “recombinante expressado” ou “recombinantemente expressado” usado aqui em conecção com a expressão de um polipeptídeo ou proteína é definido de acordo com a defmição padrão na técnica. A expressão recombinante de uma proteína é realizada, no geral, usando-se um vetor de expressão como descrito imediatamente acima. O termo “isolado”, quando aplicado a uma molécula de polinucleotídeo, denota que o polinucleotídeo foi removido do seu ambiente genético natural e está, desta maneira, livre de outras sequências codificadoras estranhas ou não desejadas e está em uma forma adequada para o uso dentro de sistemas de produção de proteína geneticamente engendradas. Tais moléculas isoladas são aquelas que são separadas do seu ambiente natural e incluem cDNA e clones genômicos. As moléculas de DNA isoladas da presente invenção são livres de outros genes com os quais são habitualmente associados, porém podem incluir regiões não traduzidas 5’ e 3’ que ocorram naturalmente tais como promotores e terminadores. A identificação de regiões associadas estará evidente a uma pessoa de habilidade comum na técnica (ver por exemplo, Dynan e Tijan, Nature 316: 774 a 778, 1985). O termo “um polinucleotídeo isolado” pode ser altemativamente denominado “um polinucleotídeo clonado”.

Quando aplicado a uma proteína/polipeptídeo, o termo “isolado” indica que a proteína é encontrada em uma condição outra que não no seu ambiente natural. Em uma forma preferida, a proteína isolada é substancialmente livre de outras proteínas, particularmente de outras proteínas homólogas (isto é, “impurezas homólogas” (ver abaixo)). É preferido fornecer a proteína em uma forma mais do que 40 % pura, mais preferivelmente em uma forma mais do que 60 % pura.

Ainda mais preferivelmente é preferível fornecer a proteína em uma forma altamente purificada, isto é, mais do que 80 % pura, mais preferivelmente mais do que 95 % pura e ainda mais preferivelmente mais do que 99 % pura, como determinado pelo SDS-PAGE. O termo “proteína/polipeptídeo isolados” pode ser altemativamente denominado “proteína/polipeptídeo purificados”. O termo “impurezas homólogas” significa qualquer impureza (por exemplo, um outro polipeptídeo que não o polipeptídeo da invenção) que origina da célula homóloga quando o polipeptídeo da invenção é originalmente dela obtido. O termo “obtido de” como aqui usado em conecção com uma fonte microbiana específica, significa que o polinucleotídeo e/ou o polipeptídeo é produzido pela fonte específica (expressão homóloga) ou por uma célula em que um gene da fonte foi inserido (expressão heteróloga). O termo “operacionalmente ligado”, quando se refere a segmentos de DNA, denota que os segmentos são dispostos de modo que a sua fimção de comum acordo com o seu propósito pretendido, por exemplo, iniciar a transcrição no promotor e prosseguir através do segmento codificador par ao terminador. O temo “polinucleotídeo” denota um polímero de filamento único ou duplo de bases de desoxirribonucleotídeo ou de ribonucleotídeo lidas da extremidade 5’ para a extremidade 3’. Os polinucleotídeos incluem RNA e DNA e podem ser isolados de fontes naturais, sintetizados in vitro ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas O termo “complementos de moléculas de polinucleotídeo denota moléculas de polinucleotídeo que tenham uma sequência de base complementar e de orientação reversa quando comparada a uma sequência de referência. Por exemplo, a sequência 5’ ATGCACGGG 3’ é complementar à 5’ CCCGTGCAT 3’. O termo “sequência degenerada de nucleotídeo” denota uma sequência de nucleotídeos que inclui um ou mais códons degenerados (quando comparados a uma molécula de polinucleotídeo de referência que codifica um polipeptídeo). Os códons degenerados contêm tripletos diferentes de nucleotídeos, porém codificam o mesmo resíduo de ammoácido (isto é, os tripletos GAU e GAC codificam cada um o Asp). O termo “promotor” denota uma porção de um gene contendo sequências de DNA que fornecem a ligação da RNA polimerase e o início da transcrição. As sequências promotoras são habitualmente, porém não sempre, encontradas nas regiões não codificadoras 5’ dos genes. O termo “sequência secretora de sinal” denota uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo (um “peptídeo secretor”) que, como um componente de um polipeptídeo maior direciona o polipeptídeo maior através de um caminho secretor de uma célula em que é sintetizado. O peptídeo maior é habitualmente privado para se remover o peptídeo secretor durante o trânsito através do caminho secretor. O termo “núcleo de enzima” denota uma enzima de domínio único que pode ou não ter sido modificada ou alterada, porém que reteve a sua atividade original; o domínio catalítico como conhecido na técnica permaneceu intacto e funcional.

Pelo termo “ligador” ou “espaçador” pretende-se um polipeptídeo que compreenda pelo menos dois aminoácidos que podem estar presentes entre os domínios de uma proteína de domínio múltiplo, por exemplo, uma enzima que compreenda um núcleo de enzima e um domínio de ligação tal como um domínio de ligação de celulose (CBD) ou qualquer outro híbrido de enzima ou entre duas proteínas ou polipeptídeos expressados como um polipeptídeo de fusão, por exemplo, uma proteína de fusão que compreenda duas enzimas de núcleo. Por exemplo, a proteína de fusão de um núcleo de enzima com um CBD é fornecida pela fusão de uma sequência de DNA que codifica o núcleo de enzima, uma sequência de DNA que codifica o ligador e uma sequência de DNA que codifica o CBD, sequencialmente em uma matriz de leitura aberta e que expressa esta construção. O termo “mananase” ou “galactomananase” denota uma enzima de mananase definida de acordo com a técnica como sendo oficialmente chamada de endo-l,4-beta-manosidase de manana e tendo os nomes alternativos de beta-mananase e de endo-1,4-mananase e que catalisa as hidrólises das ligações 1,4-beta-D-manosídicas nas mananas, galactomananas, glicomananas e galactoglicomananas cuja enzima é classificada de acordo com a Nomenclatura de Enzima como EC 3.2.1.78 (http://www.expasy.ch/enzyme).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como usar a sequência da invenção para se obter outras sequências relacionadas: A informação de sequência divulgada aqui em relação a uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma mananase da invenção pode ser usada como uma ferramenta para se identificar outras mananases homólogas. Por exemplo, a reação de polimerase de cadeia (PCR) pode ser usada para amplificar sequências que codificam outras mananases homólogas a partir de uma variedade de fontes microbianas, em particular de diferentes espécies de Bacillus.

ENSAIO PARA TESTE DE ATIVIDADE

Um polipeptídeo da invenção que tenha atividade de mananase pode ser testado quanto a atividade de mananase de acordo com procedimentos padrão de teste conhecidos na técnica, tais como pela aplicação de uma solução a ser testada a furos de 4 mm de diâmetro escavados em placas de agar contendo 0,2 % de AZCL galactomanana (alfarroba), isto é o substrato para o ensaio de endo-1,4-beta-D-mananase disponível como CatNe I-AZGMA da companhia Megazyme (endereço da Megazyme na Internet: http://www.megazyme.com/Purchase/index.html). POLINUCLEOTÍDEOS

Dentro das modalidades preferidas da invenção, um polinucleotídeo isolado da invenção hibridizará com regiões similarmente dimensionadas da SEQ ID NO: 1 ou com uma sequência complementar a esta, sob condições de pelo menos média severidade.

Em particular os polinucleotídeos da invenção hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 91 a 990 da SEQ ID NO: 1 seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 91 a 990 da SEQ ID NO: 1, cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes abaixo. As condições experimentais adequadas para se determinar a hibridização em severidade média ou alta entre uma sonda de nucleotídeo e uma sequência homóloga de DNA ou RNA envolve pré embeber o filtro contendo os fragmentos de DNA ou o RNA a hibridizar em 5 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio, Sambrook et al., 1989) durante 10 minutos e a pré hibridização do filtro em uma solução de 5 x SSC, 5 x solução de Denhardt (Sambrook et ah, 1989), 0,5 % de SDS e 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturizado, sonificado (Sambrook et al., 1989), seguido pela hibridização na mesma solução contendo uma concentração de 10 ng/ml de uma sonda imprimada aleatoriamente (Feinberg, A. P. e Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6 a 13), rotulada com 32P-dCTP (atividade específica maior do que 1 x 109 cpm/pg) por 12 horas em cerca de 45° C. O filtro é depois lavado duas vezes durante 30 minutos em 2 x SSC, 0,5 % de SDS a pelo menos 60° C (severidade média), ainda mais preferivelmente a pelo menos 65° C (severidade média/alta), ainda mais preferivelmente a pelo menos 70° C (severidade alta) e ainda mais preferivelmente a pelo menos 75° C (severidade muito alta).

As moléculas com as quais a sonda de oligonucleotídeo hibridiza sob estas condições são detectadas usando-se uma película de raios X.

Outros polinucleotídeos isolados úteis são aqueles que hibridizarão com regiões similarmente dimensionadas das SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 31, respectivamente ou com uma sequência complementar a estas, sob condições de pelo menos média severidade.

Particularmente utilizáveis são os polinucleotídeos que hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 5 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 94 a 1032 da SEQ ID NO: 5, seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 94 a 1032 da SEQ ID NO: 5, cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 9 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 94 a 1086 da SEQ ID NO: 9, seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 94 a 1086 da SEQ ID NO: 9, cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 11 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 97 a 993 da SEQ ID NO: 11, seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 97 a 993 da SEQ ID NO: 11 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 13 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 498 a 1464 da SEQ ID NO: 13, seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 498 a 1464 da SEQ ID NO: 13 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 15 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 204 a 1107 da SEQ ID NO: 15, seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 204 a 1107 da SEQ ID NO: 15 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência apresentada na SEQ ID NO: 17 ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência da SEQ ID NO: 17 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência apresentada na SEQ ID NO: 19 ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência da SEQ ID NO: 19 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 21 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 88 a 960 da SEQ ID NO: 21, seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 88 a 960 da SEQ ID NO: 21 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridízarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 23 ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência da SEQ ID NO: 23 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridízarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 25 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 904 a 1874 da SEQ ID NO: 25, seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 904 a 1874 da SEQ ID NO: 25 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridízarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 27 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 498 a 1488 da SEQ ID NO: 27, seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 498 a 1488 da SEQ ID NO: 27 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 29 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 79 a 1083 da SEQ ID NO: 29, seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 79 a 1083 da SEQ ID NO: 29 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima; bem como polinucleotídeos que hibridizarão com uma sonda desnaturizada de DNA de filamento duplo que compreenda a sequência completa apresentada na SEQ ID NO: 31 ou uma sequência parcial que compreenda o segmento apresentado nas posições de 1779 a 2709 da SEQ ID NO: 31, seguimento este que codifica o domínio cataliticamente ativo ou o núcleo de enzima da mananase da invenção ou qualquer sonda que compreenda uma subsequência apresentada nas posições de 1779 a 2709 da SEQ ID NO: 31 cuja subsequência tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 pares de base sob condições de pelo menos média severidade, porém preferivelmente em condições de alta severidade como descrito em detalhes acima.

Como anteriormente observado, os polinucleotídeos isolados da presente invenção incluem DNA e RNA. Os métodos para isolar o DNA e o RNA são bem conhecidos na técnica. O DNA e o RNA que codificam genes de interesse podem ser clonados em Bancos de Gene ou em bibliotecas de DNA por meio de métodos conhecidos na técnica.

Os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que tenham a atividade de mananase da invenção são depois identificados e isolados, por exemplo, por hibridização ou PCR. A presente invenção ainda fornece polipeptídeos e polinucleotídeos de contraparte de diferentes cepas bacterianas (ortólogos ou parálogos). São de interesse particular os polipeptídeos de mananase das cepas alcalofílicas gram-positivas, incluindo as espécies de Bacillus tais como Bacillus sp., Bacillus agaradhaerens, Bacillus halodurans, Bacillus clausii e Bacillus licheniformis; e polipeptídeos de mananase do grupo Thermoanaerobacter, que inclui as espécies do Caldicellulosiruptor·. Da mesma maneira, os polipeptídeos de mananase do fungo Humicola ou Scytalidium, em particular da espécie Humicola insolens ou Scytalidium thermophilum são de interesse.

As espécies homólogas de um polipeptídeo com atividade de mananase da invenção podem ser clonadas usando-se a informação e as composições fornecidas pela presente invenção em combinação com técnicas convencionais de clonagem. Por exemplo, uma sequência de DNA da presente invenção pode ser clonada usando-se o DNA cromossômico obtido de um tipo de célula que expresse a proteína. As fontes adequadas de DNA podem ser identificadas investigando-se os Northern e Southern blots com sondas planejadas a partir das sequências aqui divulgadas. Uma biblioteca é então preparada a partir do DNA cromossômico de uma linha celular positiva. Uma sequência de DNA da invenção que codifica um polipeptídeo tendo atividade de mananase pode ser depois isolada por uma variedade de métodos, tais como investigando-se com sondas planejadas a partir das sequências divulgadas no presente relatório descritivo e reivindicações ou com um ou mais dos conjuntos de sondas degeneradas com base nas sequências divulgadas. Uma sequência de DNA da invenção também pode ser clonada usando-se a reação de polimerase de cadeia ou PCR (Mullis, Patente U.S. 4.683.202), usando-se iniciadores planejados a partir das sequências aqui divulgadas. Dentro de um método adicional, a biblioteca de DNA pode ser usada para transformar ou transfectar células hospedeiras e a expressão do DNA de interesse pode ser detectada com um anticorpo (monoclonal ou policlonal) incitado contra a mananase clonada do B.sp, expressada e purificada como descrito no capítulo Materiais e Métodos e no Exemplo lou por um teste de atividade relacionado a um polipeptídeo que tenha atividade de mananase. A parte que codifica a mananase da sequência de DNA (SEQ 1D NO: 1) clonada no plasmxdeo pBXM3 presente no Escherichia coli DSM 12197 e/ou uma sequência de DNA análoga da invenção pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus sp. 1633, ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 5) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 18 de maio de 1998 sob o número de depósito DSM 12180; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 5) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus agaradhaerens, por exemplo, a partir da cepa do tipo DSM 8721, ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 9) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 7 de outubro de 1998 sob o número de depósito DSM 12433; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ÍD NO: 9) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus sp. AAI12 ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 11) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 9 de outubro de 1998 sob o número de depósito DSM 12441; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO; 11) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus halodurans ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 13) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 11 de maio de 1995 sob o número de depósito DSM 9984; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 13) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie fungica Humicola insolens, ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase aa moiecuia ae polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 15) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 5 de outubro de 1998 sob o número de depósito DSM 12432; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 15) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus sp. AA349 ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 17) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 4 de junho de 1999 sob o número de depósito DSM 12847; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 17) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus sp. ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 19) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at th* Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 4 de junho de 1999 sob o número de depósito DSM 12848 esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 19) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus sp. ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 21) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 4 de junho de 1999 sob o número de depósito DSM 12849; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 21) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus clausii ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 23) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 4 de junho de 1999 sob o número de depósito DSM 12850; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 23) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus sp. ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 25) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 4 de junho de 1999 sob o número de depósito DSM 12846; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 25) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus sp. ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 27) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 4 de junho de 1999 sob o número de depósito DSM 12851; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 27) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus sp. ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 29) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 4 de junho de 1999 sob o número de depósito DSM 12852; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 29) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Bacillus licheniformis ou um outro organismo relacionado como aqui descrito. A parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 31) foi transformada em uma cepa do Escherichia coli que foi depositada pelos inventores de acordo com o Tratado de Budapest no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Republica Federal da Alemanha em 5 de outubro de 1998 sob o número de depósito DSM 12436; esta parte que codifica a mananase da molécula de polinucleotídeo (a sequência de DNA da SEQ ID NO: 31) e/ou uma sequência de DNA análoga desta pode ser clonada a partir de uma cepa da espécie bacteriana Caldicellulosiruptor sp. ou um outro organismo relacionado como aqui descrito.

Altemativamente, a sequência análoga pode ser construída com base na sequência de DNA obtenível do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12197 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 1), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12180 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 5), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12433 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 9), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12441 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 11), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 9984 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 13), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12432 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 15), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12847 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 17), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12848 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 19), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12849 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 21), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12850 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 23), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12846 (que acrcdita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 25), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12851 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 27), do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12852 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 29) ou do plasmídeo presente no Escherichia coli DSM 12436 (que acredita-se seja idêntico ao ligado na SEQ ID NO: 31), por exemplo, seja uma subsequência deste e/ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que não dê origem a uma outra sequência de aminoácido da mananase codificada pela sequência de DNA, mas que corresponda ao uso do códon do organismo hospedeiro pretendido para a produção da enzima ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que possam dar origem a uma sequência de aminoácido diferente (isto é, uma variante da enzima que degrada a manana da invenção).

POLIPEPTÍDEOS A sequência de aminoácidos nas posições de 31 a 490 da SEQ ID NO: 2 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n- de 1 a 30 da SEQ ID NO: 2 é o peptídeo de sinal. Acredita-se que a subsequência de amínoácidos nas posições de 31 a 330 da SEQ ID NO: 2 seja o domínio catalítico da enzima mananase e que a enzima madura adicionalmente compreende um ligador nas posições 331 a 342 e pelo menos um domínio de terminal C de função desconhecida nas posições de 343 a 490. Visto que o objetivo da presente invenção é obter um polipeptídeo que exiba atividade de mananase, a presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que compreenda a sequência de amínoácidos n- de 31 a 330 da SEQ ID NO: 2, isto é um domínio catalítico, opcionalmente ligado de modo operável, no terminal N ou no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente. O domínio tendo a subsequência de aminoácidos n— de 343 a 490 da SEQ ID NO: 2 é um domínio da enzima de mananase de função desconhecida, este domínio sendo altamente homólogo com domínios similares em mananases conhecidas, conforme o exemplo 1, A sequência de aminoácidos nas posições de 32 a 494 da SEQ ID NO: 6 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n22 de 1 a 31 da SEQ ID NO: 6 é o peptídeo de sinal. Acredita-se que a subsequência de aminoácidos nas posições de 32 a 344 da SEQ ID NO: 6 seja o domínio catalítico da enzima mananase e que a enzima madura adicionalmente compreende pelo menos um domínio de terminal C de função desconhecida nas posições de 345 a 494. Visto que o objetivo da presente invenção é obter um polipeptídeo que exiba atividade de mananase, a presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que compreenda a sequência de aminoácidos n- de 32 a 344 da SEQ ID NO: 6, isto é um domínio catalítico, opcionalmente ligado de modo operável, no terminal N on no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente. A sequência de aminoácidos nas posições de 32 a 586 da SEQ ID NO: 10 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n— de 1 a 31 da SEQ ID NO: 10 é o peptídeo de sinal. Acredita-se que a subsequência de aminoácidos nas posições de 32 a 362 da SEQ ID NO; 10 seja o domínio catalítico da enzima mananase e que a enzima madura adicionalmente compreende pelo menos um domínio de terminal C de função desconhecida nas posições de 363 a 586. Visto que o objetivo da presente invenção é obter um polipeptídeo que exiba atividade de mananase, a presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que compreenda a sequência de aminoácidos n— de 32 a 362 da SEQ ID NO: 10, isto é um domínio catalítico, opcionalmente ligado de modo operável, no terminal N ou no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente. A sequência de aminoácidos nas posições de 33 a 331 da SEQ ID NO: 12 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n^ de 1 a 32 da SEQ ID NO: 12 é o peptídeo de sinal. Acredita-se que a subsequência de aminoácidos nas posições de 33 a 331 da SEQ ID NO: 12 seja o domínio catalítico da enzima mananase. Este núcleo de enzima de mananase compreende a sequência de aminoácidos n— de 33 a 331 da SEQ ID NO; 12, isto é um domínio catalítico, podendo ou não ser ligado de modo operável, no terminal N ou no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente, isto é sendo parte de uma proteína de fusão. A sequência de aminoácidos nas posições de 22 a 488 da SEQ ID NO: 14 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n- de 1 a 21 da SEQ ID NO: 14 é o peptídeo de sinal. Acredita-se que a subsequência de aminoácidos nas posições de 166 a 488 da SEQ ID NO: 14 seja o domínio catalítico da enzima mananase e que a enzima madura adicionalmente compreende pelo menos um domínio de terminal N de função desconhecida nas posições de 22 a 164. Visto que o objetivo da presente invenção é obter um polipeptídeo que exiba atividade de mananase, a presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que * ¥ m compreenda a sequência de aminoácidos n— de 166 a 488 da SEQID NO 14 isto é um domínio catalítico, opcionalmente ligado de modo operável, no terminal N ou no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente. A sequência de aminoácidos nas posições de 26 a 369 da SEQ ID NO: 16 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n— de 1 a 25 da SEQ ID NO: 16 é o peptídeo de sinal. Acredita-se que a subsequência de aminoácidos nas posições de 68 a 369 da SEQ ID NO: 16 seja o domínio catalítico da enzima mananase e que a enzima madura adicionalmente compreende pelo menos um domínio de terminal N de função desconhecida nas posições de 26 a 67. Visto que o objetivo da presente invenção é obter um polipeptídeo que exiba atividade de mananase, a presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que compreenda a sequência de aminoácidos n— de 68 a 369 da SEQ ID NO: 16, isto é um domínio catalítico, opcionalmente ligado de modo operável, no terminal N ou no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente. A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 é uma sequência parcial que forma parte de uma sequência de mananase madura. A presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que compreenda a sequência de aminoácidos n— de 1 a 305 da SEQ ID NO: 18. A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 é uma sequência parcial que forma parte de uma sequência de mananase madura. A presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que compreenda a sequência de aminoácidos n— de 1 a 132 da SEQ ID NO: 20. A sequência de aminoácidos nas posições de 29 a 320 da SEQ ID NO: 22 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n- de I a 28 da SEQ ID NO: 22 é o peptídeo de sinal. Acredita- se que a subsequência de aminoácidos nas posições de 23 a 320 da SEQ ID NO: 22 seja o domínio catalítico da enzima mananase. Este núcleo de enzima mananase compreende a sequência de aminoácido n— de 29 a 320 da SEQ ID NO: 22 isto é um domínio catalítico, podendo ou não ser ligado de modo operável, no terminal N ou no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente, isto é sendo parte de uma proteína de fusão. A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 é uma sequência parcial que forma parte de uma sequência de mananase madura, A presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que compreenda a sequência de aminoácidos n— de 29 a 188 da SEQ ID NO; 24. A sequência de aminoácidos nas posições de 30 a 815 da SEQ ID NO: 26 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n— de 1 a 29 da SEQ ID NO: 26 é o peptídeo de sinal. Acredita-se que a subsequência de aminoácidos nas posições de 301 a 625 da SEQ ID NO; 26 seja o domínio catalítico da enzima mananase e que a enzima madura adicionalmente compreende pelo menos dois domínio de terminal N de função desconhecida nas posições de 44 a 166 e de 195 a 300, respectivamente, e um domínio de terminal C de função desconhecida nas posições de 626 a 815. Visto que o objetivo da presente invenção é obter um polipeptídeo que exiba atividade de mananase, a presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que compreenda a sequência de aminoácidos n— de 301 a 625 da SEQ ID NO: 26, isto é um domínio catalítico, opcionalmente ligado de modo operável, no terminal N ou no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente. A sequência de aminoácidos nas posições de 38 a 496 da SEQ ID NO: 28 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n— de 1 a 37 da SEQ ID NO: 28 é o peptídeo de sinal. Acredita- se que a subsequência de aminoácidos nas posições de 166 a 496 da SEQ ID NO: 28 seja o domínio catalítico da enzima mananase e que a enzima madura adicionalmente compreende pelo menos um domínio de terminal N de função desconhecida nas posições de 38 a 165. Visto que o objetivo da presente invenção é obter um polipeptídeo que exiba atividade de mananase, a presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que compreenda a sequência de aminoácidos n— de 166 a 496 da SEQ ID NO: 28, isto é um domínio catalítico, opcionalmente ligado de modo operável, no terminal N ou no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente. A sequência de aminoácidos nas posições de 26 a 361 da SEQ ID NO: 30 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n- de 1 a 25 da SEQ ID NO: 30 é o peptídeo de sinal. Acredita-se que a subsequência de aminoácidos nas posições de 26 a 361 da SEQ ID NO: 30 seja o domínio catalítico da enzima mananase. Este núcleo de enzima mananase compreende a sequência de aminoácido n— de 26 a 361 da SEQ ID NO: 30 isto é um domínio catalítico, podendo ou não ser opcionalmente ligado de modo operável, no terminal N ou no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente. A sequência de aminoácidos nas posições de 23 a 903 da SEQ ID NO: 32 é uma sequência de mananase madura. A sequência de aminoácidos n~ de 1 a 22 da SEQ ID NO: 32 é o peptídeo de sinal. Acredita-se que a subsequência de aminoácidos nas posições de 593 a 903 da SEQ ID NO: 32 seja o domínio catalítico da enzima mananase e que a enzima madura adicionalmente compreende pelo menos três domínio de terminal N de função desconhecida nas posições de 23 a 214, de 224 a 424 e de 434 a 592, respectivamente. Visto que o objetivo da presente invenção é obter um polipeptídeo que exiba atividade de mananase, a presente invenção diz respeito a qualquer enzima de mananase que compreenda a sequência de aminoácidos n— de 593 a 903 da SEQ ID NO: 32, isto é um domínio catalítico, opcionalmente ligado de modo operável, no terminal N ou no terminal C, a um ou dois ou a mais do que dois outros domínios de uma funcionalidade diferente. A presente invenção também fornece polipeptídeos de mananase que são substancialmente homólogos aos polipeptídeos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ TD NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 32, respectivamente e espécies homólogas (parálogos ou ortólogos) destas. O termo “ substancialmente homólogo” é aqui usado para denotar polipeptídeos que tenham 65 %, preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 90 % de identidade de sequência à sequência apresentada nos aminoácidos n— 33 a 340 ou n— 33 a 490 da SEQ ID NO: 2 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 32 a 344 ou n- 32 a 494 da SEQ ID NO: 6 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n- 32 a 362 ou n— 32 a 586 da SEQ ID NO: 10 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 33 a 331 da SEQ ID NO: 12 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n- 166 a 488 ou n— 22 a 488 da SEQ ID NO: 14 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 68 a 369 ou n— 32 a 369 da SEQ ID NO: 16 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos η— 1 a 305 da SEQ ID NO: 18 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos η— 1 a 132 da SEQ ID NO: 20 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n~ 29 a 320 da SEQ ID NO: 22 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 29 a 188 da SEQ ID NO: 24 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 301 a 625 ou n— 30 a 625 da SEQ ID NO: 26 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 166 a 496 ou n— 38 a 496 da SEQ ID NO: 28 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 26 a 361 da SEQ ID NO: 30 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 593 a 903 ou n- 23 a 903 da SEQ ID NO: 32 ou seus ortólogos ou parálogos.

Tais polipeptídeos mais preferivelmente serão pelo menos 95 % idênticos e mais preferivelmente 98 % ou mais idênticos à sequência apresentada nos aminoácidos n— 31 a 330 ou n25 31 a 490 da SEQ ID NO: 2 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 32 a 344 ou n- 32 a 494 da SEQ ID NO: 6 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 32 a 362 ou n~ 32 a 586 da SEQ ID NO: 10 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n- 33 a 331 da SEQ ID NO: 12 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n^ 166 a 488 ou n^ 22 a 488 da SEQ ID NO: 14 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n~ 68 a 369 ou n— 32 a 369 da SEQ ID NO: 16 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos η— 1 a 305 da SEQ ID NO: 18 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos η2* 1 a 132 da SEQ ID NO: 20 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 29 a 320 da SEQ ID NO: 22 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n~ 29 a 188 da SEQ ID NO: 24 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 301 a 625 ou n— 30 a 625 da SEQ ID NO: 26 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 166 a 496 ou n— 38 a 496 da SEQ ID NO: 28 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n— 26 a 361 da SEQ ID NO: 30 ou seus ortólogos ou parálogos; ou à sequência apresentada nos aminoácidos n- 593 a 903 ou n— 23 a 903 da SEQ ID NO: 32 ou seus ortólogos ou parálogos. O percentual de identidade de sequência é determinado por métodos convencionais, por meio de programas de computador conhecidos na técnica tais como o GAP fornecido no pacote de programa GCG (Manual de Programa para o Wisconsin Package, Versão 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) como divulgado em Needleman, S. B, e Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443 a 453, que é por intermédio desta incorporada por referência em sua totalidade. O GAP é usado com os seguintes ajustes para a comparação de sequência de polipeptídeo: penalidade de criação GAP de 3,0 e penalidade de extensão GAP de 0,1. A identidade de sequência de moléculas de polinucleotídeo é determinada por métodos similares usando-se o GAP com os seguintes ajustes para comparação de sequência de DNA: penalidade de criação GAP de 5,0 e penalidade de extensão GAP de 0,3. A preparação de enzima da invenção é preferivelmente derivada de um microorganismo, preferivelmente de uma bactéria, de uma archea ou um fungo, especialmente de uma bactéria tal como uma bactéria pertencente ao Bacillus, preferivelmente a uma cepa de Bacillus que pode ser selecionado do grupo que consiste da espécie Bacillus sp. e espécies de Bacillus altamente relacionadas em que todas as espécies são preferivelmente pelo menos 95 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 % homólogas ao Bacillus sp. 1633, Bacillus halodurans ou Bacillus sp. AAI12, com base no alinhamento das sequências de rDNA 16S.

Estas espécies são reivindicadas com base nos relacionamentos filogênicos identificados a partir das sequências de rDNA 16S alinhadas do RDP (Ribosomal Database Project) (Bonne L. Maidak, Neils Larson, Michael J. McCaughey, Ross Overbeek, Gary J. Olsen, Karl Fogel, James Blandy e Carl R. Woese, Nucleic Acids Research, 1994, Vol 22, N2 17, p. 3485 a 3487, The Ribosomal Database Project). O alinhamento foi fundamentado na estrutura secundária. O calculo das similaridades de sequência foram estabelecidas usando-se o “Cálculo de matriz completa” com ajustes por falta do método de união adjacente, integrado no pacote de programa ARB (Oliver Strunk e Wolfgang Ludwig, Technical University of Munich, Alemanha).

As informações derivadas da tabela II são as bases para a reivindicação de toda a família de 5 mananases das espécies de Bacillus altamente relacionadas em que todas as espécies acima de 93 % de homologia em relação ao Bacillus sp. 1633 são reivindicadas. Estas incluem: Bacillus sporothermodurans, Bacillus acalophilus, Bacillus pseudoalcalophilus e Bacillus clausii. Ver a Figura 1: Árvore filogênica gerada do programa ARP que relaciona as espécies mais próximas ao Bacillus sp. 1633. O RNA 16S é mostrado na SEQ ID NO: 33.

TABELA II índice de homologia do ma ribossômico 16S para espécies selecionadas de Bacillus BaiSpor2 BaiAlcal BaiSpec3 B'aiSpec5 B.sp.I633 BaiSpor2 92.75% 92.98% 92.41% 93.43% BaiAlcal 98.11% 94.69% 97.03% BaiSpec3 94.49% 96.39% BaiSpecS 93 > 67% BaiSpor2 = B sporothermodurans, U49079 BaiAlcal = B. B. alcalophilus, x76436 BaiSpec3 = B. pseudoalcalophilus, x76449 BaiSpecB = B clausii, x76440 Outras 5 famílias úteis de mananases são aquelas derivadas das espécies Bacillus altamente relacionadas em que todas as espécies apresentam mais do que 93 % de homologia ao Bacillus halodurans com base nas sequências 16S alinhadas. Estas espécies de Bacillus incluem: Sporolactobacülus laevis, Bacillus agaradhaerens e Marinococcus halophilus. Ver a Figura 2: árvore fílogênica gerada do programa ARP que relaciona espécies mais próximas ao Bacillus halodurans.

TABELA III índice de homologia do RNA ribossômico 16s para espécies de Bacillus selecionadas SplLaev3 BaiSpecG BaiSpell MaoHalo2 NN

SplLaev3 90.98% 87.96% 85.94% 91.32% BaiSpec6 91.63% 87.96% 99.46% BaiSpell 89.04% 92.D4% Ma°Hal°2 88.17% NN = Sporolactobacillus laevis, D16287 BaiSpec6 = B, halodurans, X76442 BaiSpell = B. agaradhaerens, X76445 MaoHalo2 = Marinococcus halophilus, X62171 NN = organismo doador da invenção (B. halodurans) Outras 5 famílias de mananases utilizáveis são aquelas derivadas de uma cepa selecionada do grupo que consiste das espécies Bacillus agaradhaerens e espécies de Bacillus altamente relacionadas em que todas as espécies têm preferivelmente pelo menos 95 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 %, homólogas ao Bacillus agaradhaerens, DSM 8721, com base nas sequências de rDNA 16S alinhadas. 26 famílias utilizáveis de mananases são por exemplo aquelas derivadas da espécie de Bacillus altamente relacionadas em que todas as espécies acima de 93 % de homologia em relação ao Bacillus sp. AAI12 são reivindicadas. Estas incluem: Bacillus sporothermodurans, Bacillus acalophilus, Bacillus pseudoalcalophilus e Bacillus clausit. Ver a Figura 3 Árvore fílogênica gerada do programa ARP que relaciona as espécies mais próximas ao Bacillus sp. AAI12. O RNA 16S é mostrado na SEQ ID NO: 34.

TABELA IV índice de homologia do RNA ribossômico 16s para espécies selecionadas de Bacillus Baa.Spor2 BaiAlcal BaiSpec3 BaiSpecS S.sp. AAI1 BaiSpor2 92.75% 92.98% 92.41% 92.24% BaiAlcal 98.11% 94.69% 97.28% BaiSpec3 94.49% 96.10% BaiSpecS 93.83% BaiSpor2 = b spcrothermodurans, u49079 BaiAlcal = B. B. alcalophilus, X76436 BaiSpec3 = B. pseudoalcalophilus, X76449 BaiSpec5 = B clausii, X76440 Outras 26 famílias utilizáveis de mananases são aquelas derivadas de uma cepa selecionada do grupo que consiste da espécie de Bacillus licheniformis e de espécies de Bacillus altamente relacionadas em que todas as espécies são preferivelmente de pelo menos 95 %, ainda mais preferivelmente de pelo menos 98 %, homólogas em relação ao Bacillus licheniformis com base nas sequências de rDNA 16S alinhadas.

As proteínas e polipeptídeos substancialmente homólogos são caracterizados como tendo uma ou mais substituições, supressões ou adições de aminoácido. Estas mudanças são preferivelmente de uma natureza menor, isto é substituições de aminoácido conservativas (ver Tabela 2) e outras substituições que não afetem significativamente a duplicação ou a atividade da proteína ou do polipeptídeo; pequenas supressões, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos e pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina no terminal amino, um pequeno peptídeo ligador de até cerca de 20 a 25 resíduos ou uma pequena extensão que facilite a purificação (uma afinidade tag), tal como um trato de poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991. Ver, no geral, Ford et al., Proteín Expression and Purifícation 2: 95 a 107, 1991, que é incorporada aqui por referência. Os DNAs que codificam os tags de afinidade estão disponíveis dos fornecedores comerciais (por exemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA).

Entretanto, ainda que as mudanças descritas acima sejam preferivelmente de uma natureza menor, tais mudanças também podem ser de uma natureza maior tais como a fusão de polipeptídeos maiores de até 300 aminoácidos ou mais tanto como extensões do terminal amino quanto do terminal carbóxi para um polipeptídeo de mananase da invenção. TABELA 1 Substituições conservativas de aminoácido Básicas: arginina lisina histidina Ácidas: ácido glutâmico ácido aspártico Polares: glutamina asparagina Hidrofóbicas: leucina isoleucina valina Aromáticas: fenilalanina triptofano tirosina Pequenas: glicina alanina serina treonina metionina Além dos 20 aminoácidos padrão, aminoácidos não padrão (tais como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina e a-,metil serina) podem ser substituídos no lugar dos resíduos de aminoácido de um polipeptídeo de acordo com a invenção. Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético e aminoácidos não naturais podem ser substituídos no lugar dos resíduos de aminoácido. “Aminoácidos não naturais” foram modificados depois da síntese de proteína e/ou têm uma estrutura química em sua{s) cadeia(s) lateral(is) diferente daquela dos aminoácidos padrão. Os aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados ou preferivelmente estão comercialmente disponíveis e incluem ácido pipecólico, ácido tiazolidino carboxílico, desidroprolina, 3- e 4-metilprolina e 3,3-dimetilprolina.

Os aminoácidos essenciais nos polipeptídeos de mananase da presente invenção podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese direcionada por sítio ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, Science 244: 1081 a 1085, 1989). Na última técnica mutações únicas de alanina são introduzidas em cada resíduo na molécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade biológica (isto é, a atividade de mananase) para identificar resíduos de aminoácido que sejam críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699 a 4708, 1996. O sítio ativo da enzima ou outras interações biológicas também podem ser determinadas pela análise física da estrutura, como determinado por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, diffação de elétron ou rotulação por fotoafínidade, em conjunção com mutações de aminoácidos de sítio de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., Science 255: 306 a 312, 1992; Smith et al., J. Mol, Biol. 224: 899 a 904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59 a 64, 1992.

As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser deduzidas a partir da análise de homologias com polipeptídeos que são relacionados a um polipeptídeo de acordo com a invenção.

As substituições múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando-se métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento seguido por um procedimento de avaliação relevante, tal como aquele divulgado por Reidhaar-Olson e Sauer (Science 241: 53 a 57, 1988), Bowie e Sauer (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152 a 2156, 1989), WO 95/17413 ou WO 95/22625. Em resumo, estes autores divulgam métodos para randomizar simultaneamente duas ou mais posições em um polipeptídeo ou recombínação/embaralhamento de mutações diferentes (Wo 95/17413, WO 95/22625, seguido pela seleção quanto ao polipeptídeo funcional e depois sequenciar os polipeptídeos mutagenizados para determinar o espectro de substituições permissíveis em cada posição. Outros métodos que podem ser usados incluem demonstração de fago (por exemplo, Lowman et al., Biochem. 30: 10832 a 10837, 1991; Ladner et al., Patente U.S. N2 5.223.409; Huse, Publicação WIPO WO 92/06204) e mutagênese direcionada à região (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127,1988).

Os métodos de mutagênese/embaralhamento como divulgados acima podem ser combinados com métodos de avaliação automatizada de auto rendimento para detectar a atividade de polipeptídeos clonados, mutagenizados em células hospedeiras. As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando-se equipamento moderno. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos de aminoácido individuais em um polipeptídeo de interesse e podem ser aplicados a polipeptídeos de estrutura desconhecida.

Usando-se os métodos debatidos acima, uma pessoa de habilidade comum na técnica pode identificar e/ou preparar uma variedade de polipeptídeos que sejam substancialmente homólogos aos resíduos de 33 a 340 ou de 33 a 490 da SEQ ID NO: 2; ou a resíduos de 32 a 344 ou de 32 a 494 da SEQ ID NO: 6; ou a resíduos de 32 a 362 ou de 32 a 586 da SEQ ID NO: 10; ou a resíduos de 33 a 331 da SEQ ID NO: 12; ou a resíduos de 166 a 488 ou de 22 a 488 da SEQ ID NO: 14; ou a resíduos de 68 a 369 ou de 32 a 369 da SEQ ID NO: 16; ou a resíduos de 1 a 305 da SEQ ID NO: de 18; ou a resíduos de 1 a 132 da SEQ ID NO: 20; ou a resíduos de 29 a 320 da SEQ ID NO: 22; ou a resíduos de 29 a 188 da SEQ ID NO: 24; ou a resíduos de 301 a 625 ou de 30 a 625 da SEQ ID NO: 26; ou a resíduos de 166 a 496 ou de 38 a 496 da SEQ ID NO: 28; ou a resíduos de 26 a 361 da SEQ ID NO: 30; ou a resíduos de 593 a 903 ou de 23 a 903 da SEQ ID NO: 32 e reter a atividade de mananase da proteína do tipo selvagem. A enzima de mananase da invenção pode, além do núcleo da enzima compreender o domínio catalítico, d mesma maneira compreende um domínio de ligação de celulose (CBD), o domínio de ligação de celulose e o núcleo de enzima (o domínio cataliticamente ativo) da enzima que é operavelmente ligada. O domínio de ligação de celulose (CBD) pode existir como uma parte inteira da enzima codificada ou um CBD de uma outra origem pode ser introduzido na enzima que degrada a manana criando deste modo uma enzima híbrida. Neste contexto, o termo “domínio de ligação de celulose” é intencionado a ser entendido como definido por Peter Tomme et al., “Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties” em “Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates”, John N. Saddler e Michaeí H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series N- 618, 1996. Esta definição classifica mais do que 120 domínios de ligação de cellilose em 10 famílias (I-X) e demonstra que os CBDs são encontrados em várias enzimas tais como celulases, xilanases, mananases, arabinofuranosidases, acetilesterases e quitinases. Os CBDs também foram encontrados em algas, por exemplo, a alga vermelha Porphiria purpurea como uma proteína de ligação a polissacarídeo não hidrolítica, ver Tomme et al., op. cit. Entretanto, a maioria dos CBDs são de celulases e xilanases, os CBDs são encontrados nos términos N e C das proteínas ou são internos. Os híbridos de enzima são conhecidos na técnica, ver por exemplo, WO 90/00609 e WO 95/16782 e podem ser preparados transformando-se em uma célula hospedeira uma construção de DNA que compreenda pelo menos um fragmento de DNA que codifica o domínio de ligação de DNA ligado com ou sem um ligador a uma sequência de DNA que codifica a enzima que degrada a manana e cultivando-se a célula hospedeira para expressar o gene fundido. Os híbridos de enzima podem ser descritos pela seguinte fórmula: CBD-MR-X em que o CBD é a região de terminal N ou e terminal C de uma sequência de aminoácido que corresponde pelo menos ao domínio de ligação da celulose; MR é a região central (o ligador) e pode ser uma ligação, ou um grupo de ligação curto preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 100 átomos de carbono, mais preferivelmente de 2 a 40 átomos de carbono; ou é preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 100 aminoácidos, mais preferivelmente de 2 a 40 aminoácidos e X é uma região de terminal N ou de terminal C da mananase da invenção. A SEQ ID NO: 4 divulga a sequência de aminoácido de um híbrido de enzima de um núcleo de enzima de mananase e um CBD.

Preferivelmente, a enzima de mananase da presente invenção tem a sua atividade catalítica máxima em um pH de pelo menos 7, mais preferivelmente de pelo menos 8, mais preferivelmente de pelo menos 8,5 mais preferivelmente de pelo menos 9, mais preferivelmente de pelo menos 9,5, mais preferivelmente de pelo menos 10, ainda mais preferivelmente de pelo menos 10,5, especialmente de pelo menos 11 e preferivelmente a atividade máxima da enzima é obtida em uma temperatura de pelo menos 40° C, mais preferivelmente de pelo menos 50° C, ainda mais preferivelmente de pelo menos 55° C.

Preferivelmente, a composição de limpeza da presente invenção fornece, por exemplo, quando usada para tratar tecidos durante um . ciclo de lavagem de uma processo de lavagem a máquina, uma solução de lavagem tendo um pH tipicamente entre cerca de 8 e cerca de 10,5. Tipicamente, tal solução de lavagem é usada em temperaturas entre cerca de 20° C e cerca de 95° C, preferivelmente entre cerca de 20° C e cerca de 60° C, preferivelmente entre cerca de 20° C e cerca de 50° C.

PRODUÇÃO DE PROTEÍNA

As proteínas e polipeptídeos da presente invenção, incluindo as proteínas de comprimento completo, seus fragmentos e proteínas de fusão podem ser produzidos em células hospedeiras geneticamente engendradas de acordo com técnicas convencionais. As células hospedeiras adequadas são aqueles tipos de célula que podem ser transformados ou transfectados com DNA exógeno e desenvolvimento em cultura e incluem bactéria, células fungicas e células eucarióticas superiores cultivadas. As células bacterianas, particularmente as células cultivadas de organismos gram-positivos são preferidas. As células gram-positivas do gênero Bacillus são especialmente preferidas, tais como do grupo que consiste de Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus clausii, Bacillus agaradhaerens, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis, Bacillus licheniformis e Bacillus sp., em particular Bacillus sp. 1633, Bacillus sp. AAI12, Bacillus clausii, Bacillus agaradhaerens e Bacillus licheniformis.

Em uma outra modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula fúngica. “Fungos” como aqui usado inclui o phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (como definido por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) bem como o Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1985, acima). Os grupos representativos do Ascomycota inclui, por exemplo, Neurospora, Eupenicillium (= Penicillium), Emericella (= Aspergillus), Eurotium (= Aspergillus) e as leveduras verdadeiras listadas acima. Os exemplos de Basidiomycota incluem cogumelos, mofos e ferrugem. Os grupos representativos de Chytridiomycota incluem, por exemplo, hallomyces, Blastocladiella, Coelomomyces e fungos aquáticos. Os grupos representativos de Oomycota incluem, por exemplo, fungos aquáticos Saprolegniomycetous (bolores da água) tais como Achlya. Os exemplos de fungos mitospóricos incluem Aspergillus, Penicillium, Candida e Alternaria. Os grupos representativos de Zygomycota incluem, por exemplo, Rhizopus e Mucor. Já em outras modalidades preferidas, a célula hospedeira fúngica é uma célula fungica filamentosa. Os “fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, acima). Em uma modalidade mais preferida, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de uma espécie dos, porém não limitados a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium e Trichoderma ou um teleomorfo ou sinônimo destes.

Em particular, a célula pode pertencer a uma espécie de Trichoderma, preferivelmente Trichoderma harzianum ou Trichoderma reesei ou uma espécie de Aspergillus, mais preferivelmente Aspergillus oiyzae ou Aspergillus niger ou uma espécie de Fusariumi mais preferivelmente um Fusarium sp. que tenha a identificação característica do Fusarium ATCC 20334, como ainda descrito na PCT/US/95/07743.

As células fungicas podem ser transformadas por um processo que envolva a formação de protoplasto, a transformação dos protoplastos e a regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus são descritos na EP 238 023 e em Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470 a 1474. Um método adequado de transformar espécies de Fusarium está descrito por Malardier et al1989, Gene 78: 147 a 156 ou na co-pendente US Série N2 08/269.449. A levedura pode ser transformada usando-se os procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J. N. e Simon, M. I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182 a 187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983 Journal of Bacteriology 153: 163 e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. As células mamíferas podem ser transformadas por absorção direta usando-se o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e Van der Eb (1978, Virology 52: 546).

As técnicas para manipular moléculas de DNA clonadas e introduzir DNA exógeno em uma variedade de células hospedeiras são divulgadas por Sambrook eí al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc, NY, 1987; e “Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bactéria”, Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C., que são aqui incorporadas por referência.

No geral, uma sequência de DNA que codifica uma mananase da presente invenção está operativamente ligada a outros elementos genéticos requeridos para a sua expressão, no geral incluindo um promotor e um terminador de transcrição dentro de um vetor de expressão. O vetor habitualmente conterá também um ou mais marcadores selecionáveis e uma ou mais origens de replicação, embora aqueles habilitados na técnica reconhecerão que dentro de certos sistemas os marcadores selecionáveis possam ser fornecidos em vetores separados e a replicação do DNA exógeno pode ser fornecida pela integração no genoma da célula hospedeira. A seleção de promotores, terminadores, marcadores selecionáveis, vetores e de outros elementos é um assunto de planejamento de rotina dentro do nível de habilidade comum na técnica. Muitos de tais elementos são descritos na literatura e estão disponíveis por intermédio de fornecedores comerciais.

Para direcionar um polipeptídeo pelo caminho secretor de uma célula hospedeira, uma sequência de sinal secretor (também conhecida como uma sequência líder, sequência prepro ou sequência pre) é fornecida no vetor de expressão. A sequência de sinal secretor pode ser aquela do polipeptídeo ou pode ser derivada de uma outra proteína secretada ou sintetizada de novo. Numerosa sequências de sinal secretor adequadas são conhecidas na técnica e referência é feita a “Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bactéria”, Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C., e Cutting, S. M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990, para descrição adicional das sequências de sinal secretor adequadas, especialmente para a secreção em uma célula hospedeira de Bacillus. A sequência de sinal secretor é unida à sequência de DNA na matriz de leitura correta. As sequências de sinal secretor são habitualmente posicionadas em 5’ em relação à sequência de DNA que codifica o polipeptídeo de interesse, embora certas sequências de sinal possam ser posicionadas em qualquer lugar na sequência de DNA de interesse (ver, por exemplo, Welch et al., Patente U.S. Na 5.037.743; Holland et al., Patente U.S. N2 5.143.830). O vetor de expressão da invenção pode ser qualquer vetor de expressão que seja convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e a escolha do vetor dependerá frequentemente da célula hospedeira na qual o vetor deverá ser introduzido. Desta maneira, o vetor pode ser um vetor que replique de modo autônomo, isto é, um vetor que exista como uma entidade extracromossômica, cuja replicação seja independente da replicação do cromossoma, por exemplo, um plasmídeo. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) foi integrado.

Os exemplos de promotores adequados para o uso em células hospedeiras de fungo filamentoso são, por exemplo, o promotor ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093 a 2099) ou o promotor tpiA. Os exemplos de outros promotores utilizáveis são aqueles derivados do gene que codifica a Aspergillus oryzae TAKA amilase, a Rhizomucor miehei aspártico proteinase, a Aspergillus niger a-amilase neutra, & Aspergillus niger a-amilase estável em ácido, a Aspergillus niger ou a Aspergillus awamori glicoamilase (gluA), a Rhizomucor miehei lipase, a Aspergillus oryzae alcalino protease, a Aspergillus oryzae triose fosfato isomerase ou a Aspergillus nidulans acetamidase.

As células hospedeiras transformadas ou transfectadas são cultivadas de acordo com procedimentos convencionais em um meio de cultura contendo nutrientes e outros componentes requeridos para o desenvolvimento das células hospedeiras escolhidas. Uma variedade de meios adequados, incluindo meio definido e meio complexo são conhecidos na técnica e no geral incluem uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais. O meio também pode conter componentes tais como fatores de desenvolvimento ou soro, como requerido. O meio de desenvolvimento, no geral, selecionará as células que contenham o DNA exogenamente adicionado, por exemplo por seleção medicamentosa ou pela deficiência em um nutriente essencial que seja complementado pelo marcador selecionável carregado no vetor de expressão ou co-transfectado na célula hospedeira.

ISOLAÇÃO DA PROTEÍNA

Quando o polipeptídeo recombinante expressado é secretado, o polipeptídeo pode ser purificado a partir do meio de desenvolvimento. Preferivelmente as células hospedeiras de expressão são removidas do meio antes da purificação do polipeptídeo (por exemplo, por centrifiigação).

Quando o polipeptídeo recombinante expressado não é secretado da célula hospedeira, as células hospedeiras são preferivelmente rompidas e o polipeptídeo liberado em um “extrato” aquoso que é o primeiro estágio de tais técnicas de purificação. Preferivelmente as células hospedeiras de expressão são coletadas do meio antes do rompimento celular (por exemplo, por centrifugação). O rompimento celular pode ser realizado por técnicas convencionais tais como pela digestão de lisozima ou forçando-se as células através de alta pressão. Ver (Robert K. Scobes, Protein Purification, Segunda edição, Springer-Verlag) para descrição adicional de tais técnicas de rompimento celular.

Quer sejam secretados ou não, os polipeptídeos recombinantes expressados (ou polipeptídeos quiméricos) podem ser purificados usando-se métodos e meios de fracionamento e/ou purificação convencionais. A precipitação com sulfato de amônio e ácido ou a extração caotrópica pode ser usada para o fracionamento de amostras. As etapas exemplares de purificação podem incluir hidroxiapatita, exclusão por tamanho, FPLC e cromatografia líquida de alto desempenho, de fase reversa. Meios de troca de ânion adequado inclui dextranas derivatizadas, agarose, celulose, poliacrilamida, sílicas especiais e outros. Os derivados de PEI, DEAE, QAE e Q são preferidos com a Sefarose de DEAE de fluxo rápido (Pharmacia, Piscataway, NJ) sendo particularmente preferido. Os meios cromatográíicos exemplares incluem aqueles meios derivatizados com grupos fenila, butila ou octila tais como o Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) e outros ou resinas poliacrílicas, tais como a Amberchrom CG 71 (Toso Haas) e outras. Os suportes sólidos adequados incluem pérolas de vidro, resinas com base em sílica, resinas celulósicas, pérolas de agarose, pérolas de agarose reticuladas, pérolas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas e outros que sejam insolúveis sob as condições na qual deverão ser usados. Estes suportes podem ser modificados com grupos reativos que permitam a ligação de proteínas por grupos amino, grupos carboxila, grupos sulfidrila, grupos hidroxila e/ou porções de carboidrato. Os exemplos das químicas de ligação incluem a ativação do brometo de cianogênio, a ativação da N-hidroxisuccinimida, a ativação do epóxido, a ativação da sulfidrila, a ativação da hidrazida e de derivados de carboxila e de amino para as químicas de ligação da carbodiimida. Estes e outros meios sólidos são bem conhecidos e amplamente usados na técnica e são disponíveis de fornecedores comerciais. A seleção de um método particular é um assunto de planejamento de rotina e é determinada em parte pelas propriedades do suporte escolhido. Ver, por exemplo, Affmity Chromatography: Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suécia, 1988.

Os polipeptídeos da invenção ou seus fragmentos também podem ser preparados pela síntese química. Os polipeptídeos da invenção podem ser monômeros ou multímero; glicosilados ou não glicosilados, cavilhados ou não cavilhados e podem ou não incluir um resíduo inicial do aminoácído metionina.

Com base na informação de sequência aqui divulgada uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 1, pelo menos a sequência de DNA da posição 94 até a posição 990 ou, altemativamente, a sequência de DNA da posição 94 até a posição 1470, pode ser clonada. Da mesma maneira pode ser clonada uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 5, pelo menos a sequência de DNA da posição 94 até a posição 1032 ou, altemativamente, a sequência de DNA da posição 94 até a posição 1482; e uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 9, pelo menos a sequência de DNA da posição 94 até a posição 1086 ou, altemativamente, a sequência de DNA da posição 94 até a posição 1761; ; e uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 11, pelo menos a sequência de DNA da posição 97 até a posição 993; ; e uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 13, pelo menos a sequência de DNA da posição 498 até a posição 1464 ou, altemativamente, a sequência de DNA da posição 64 até a posição 1464; ; e uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 15, pelo menos a sequência de DNA da posição 204 até a posição 1107 ou, altemativamente, a sequência de DNA da posição 76 até a posição 1107; e uma sequência de DNA que codifica parcialmente uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 17; e uma sequência de DNA que codifica parcialmente uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 19; e uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 21, pelo menos a sequência de DNA da posição 88 até aposição 960; e uma sequência de DNA que codifica parcialmente uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 23; e uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 25, pelo menos a sequência de DNA da posição 904 até a posição 1875 ou, altemativamente, a sequência de DNA da posição 88 até a posição 2443; e uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 27, pelo menos a sequência de DNA da posição 498 até a posição 1488 ou, altemativamente, a sequência de DNA da posição 112 até a posição 1488; e uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 29, pelo menos a sequência de DNA da posição 79 até a posição 1083; e uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica uma mananase da invenção e que compreende a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 31, pelo menos a sequência de DNA da posição 1779 até a posição 2709 ou, altemativamente, a sequência de DNA da posição 67 até a posição 2709. A clonagem c realizada por procedimentos padrão conhecidos -na técnica tais como pela: preparação de uma biblioteca genômica de uma cepa de Bacillus, especialmente uma cepa selecionada do B. sp. 1633, B. sp. AAI12, B. sp. AA349, Bacillus agaradhaerens, Bacillus halodurans, Bacillus clausii e Bacillus licheniformis ou de uma cepa fungica, especialmente a cepa Humicola insolens; semeadura em placa tal biblioteca em placas de substrato adequado; identificação de um clone que compreenda uma sequência de polipeptídeo da invenção pelas técnicas de hibridização padrão usando-se uma sonda com base em qualquer uma das sequências das SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25,27, 29 ou 31; ou pela identificação de um clone da dita biblioteca genômica por uma estratégia de PCR inversa usando-se iniciadores com base na informação de sequência das SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 ou 31. Referência é feita a M. J, MCPherson et al., (“PCR A practical approach” Information Press Ltd, Oxford England) para detalhes adicionais com respeito à PCR Inversa.

Com base na informação de sequência aqui divulgada (SEQ ID NOs: 1,2,5,6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22,23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32) é trabalho de rotina para uma pessoa habilitada na técnica isolar sequências homólogas de polipeptídeo que codifica a mananase homóloga da invenção por uma estratégia similar usando bibliotecas genômicas de organismos microbianos relacionados, em particular de bibliotecas genômicas de outras cepas do gênero Bacillus, tais como as espécies alcalofilicas do Bacillus sp. ou de cepas fungicas tais como as espécies do Humicola.

Altemativamente, o DNA que codifica a manana ou a enzima que degrada a galactomanana da invenção podem ser, de acordo com procedimentos bem conhecidos, convenientemente clonados a partir de uma fonte adequada, tal como qualquer um dos organismos mencionados acima, pelo uso de sondas sintéticas de oligonucleotídeos preparadas com base na sequência obtenível do plasmídeo presente em qualquer uma das cepas do Escherichia coli DSM 12197, DSM 12180, DSM 12433, DSM 12441, DSM 9984, DSM 12432, DSM 12436, DSM 12846, DSM 12847, DSM 12848, DSM 12849, DSM 12850, DSM 12851 e DSM 12852.

Consequentemente, a molécula de polínucleotídeo da invenção pode ser isolada a partir de qualquer um dos Escherichia coli DSM 12197, DSM 12180, DSM 12433, DSM 12441, DSM 9984, DSM 12432, DSM 12436, DSM 12846, DSM 12847, DSM 12848, DSM 12849, DSM 12850, DSM 12851 e DSM 12852, em que o plasmídeo obtido pela clonagem tal como descrita acima é depositado. Da mesma maneira a presente invenção diz respeito a uma cultura biológica isolada, substancialmente pura de qualquer uma das cepas do Escherichia coli DSM 12197, DSM 12180, DSM 12433, DSM 12441, DSM 9984, DSM 12432, DSM 12436, DSM 12846, DSM 12847, DSM 12848, DSM 12849, DSM 12850, DSM 12851 e DSM 12852.

No presente contexto, o termo “preparação de enzima” é intencionado significar um produto de fermentação enzimática convencional, possivelmente isolado e purificado a partir de uma espécie única de um microorganismo, tal preparação habitualmente compreendendo várias atividades enzimáticas diferentes; ou uma mistura de enzimas de monocomponente, preferivelmente enzimas derivadas de espécies bacterianas ou fúngicas pelo uso de técnicas recombinantes convencionais, cujas enzimas foram fermentadas e possivelmente isoladas e purificadas separadamente e que podem originar de espécies diferentes, preferivelmente espécies fúngicas ou bacterianas; ou o produto da fermentação de um microorganismo que atue como uma célula hospedeira para a expressão de uma mananase recombinante, todavia cujo microorganismo produza simultaneamente outras enzimas, por exemplo, enzimas que degradem a pectina, proteases ou celulases, que sejam produtos de fermentação, que ocorra naturalmente, dos microorganismos, isto é, o complexo de enzima convencionalmente produzido pelo microorganismo correspondente, que ocorra naturalmente. A preparação da mananase da invenção pode ainda compreender uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de proteases, celulases (endo-P-l,4-glicanases), β-glicanases (endo-β-1,3(4) glicanases), lipases, cutinases, peroxidases, lacases, amilases, glicoamilases, pectinases, reductases, oxidases, fenoloxidases, ligninases, pululanases, hemicelulases, pectato liases, xiloglicanases, xilanases, pectin acetil esterases, ramnogalacturonan acetil esterases, poligalaeturonases, ramnogalacturonases, pectina liases, pectina metilesterases, celobioidrolases, transglutaminases ou misturas destas. Em uma modalidade preferida, uma ou mais ou todas as enzimas na preparação são produzidas usando-se técnicas recombinantes, isto é, a(s) enzima(s) é/são enzima(s) de mono-componente que é/são misturada(s) com outra(s) enzima(s) para formar uma preparação de enzima com a combinação de enzima desejada.

Em um outro aspecto, a presente invenção também diz respeito a um método de produzir a preparação de enzima da invenção, o método compreendendo cultivar um microorganismo, por exemplo, uma cepa do tipo selvagem, capaz de produzir a mananase sob condições que permitam a produção da enzima e recuperar a enzima da cultura. A cultura pode ser realizada usando-se técnicas convencionais de fermentação, por exemplo, cultivar em frascos de agitação ou em fermentadores com agitação para garantir a aeração suficiente em um meio de cultura que induza a produção da enzima de mananase. O meio de cultura pode conter uma fonte convencional de Ntal como peptona, extrato de levedura ou ácidos de casamino, uma quantidade reduzida de uma fonte convencional de C tal como dextrose ou sacarose e um indutor tal como goma guar ou goma de alfarroba. A recuperação pode ser realizada usando-se técnicas convencionais, por exemplo, pela separação da bio-massa e do sobrenadante por centrifugação ou filtração, pela recuperação do sobrenadante ou rompimento das células se a enzima de interesse for intracelular, talvez seguido por outro purificação como descrito na EP 0 406 314 ou por cristalização como descrito na WO 97/15660.

Os exemplos de bactéria utilizável que produza a enzima ou ã preparação de enzima da invenção são bactérias Gram positivas, preferivelmente da subdivisão BacillusíLactobacillus, preferivelmente uma cepa do gênero Bacillus, mais preferivelmente uma cepa do Bacillus sp. Já em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma mananase isolada tendo as propriedades descritas acima e que seja livre de impurezas homólogas e seja produzida usando-se técnicas recombinantes convencionais.

REATIVIDADE IMUNOLÓGICA CRUZADA

Anticorpos policlonais para serem usados na determinação da reatividade imunológica cruzada podem ser preparados pelo uso de uma enzima de mananase purificada. Mais especificamente, o antisoro contra a mananase da invenção pode ser incitado imunizando-se coelhos (ou outros roedores) de acordo com o procedimento descrito por N. Axelsen et ah, no: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23 ou A. Johnstone e R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (mais especificamente nas páginas de 27 a 31). As imunoglobulinas purificadas podem ser obtidas a partir do antisoro, por exemplo pela precipitação salina ((NH4)2 S04), seguido pela diálise e pela cromatografia de troca iônica, por exemplo, em DEAE-Sephadex. A caracterização imunoquímica de proteínas pode ser feita pela análise Outcherlony de difusão dupla (O. Ouchterlony no: Elandbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Ed.) Blackwell Scientific Publications, 1967, páginas 655 a 706), pela imunoeletroforese cruzada (N. Axelsen et al., acima, Capítulos 3 e 4) ou pela imunoeletroforese foguete (N. Axelsen et al., Capítulo 2).

USO NA INDÚSTRIA DE DETERGENTE

Em outros aspectos, a presente invenção diz respeito a uma composição detergente que compreende a mananase ou a preparação de mananase da invenção para um processo para o tratamento a máquina de tecidos, que compreende tratar o tecido durante um ciclo de lavagem de um processo de lavagem a máquina com uma solução de lavagem que contenha a mananase ou a preparação de mananase da invenção e a composições de limpeza que incluem composições de lavar roupa, de lavar louça, de limpador de superfície dura, de limpeza pessoal e oral/dentária, que compreendem uma mananase e opcionalmente uma outra enzima selecionada dentre celulases, amilases, enzimas que degradam a pectina e xiloglicanases e que forneçam desempenho de limpeza superior, isto é remoção superior de manchas, limpezas de encardidos e manutenção da brancura.

Sem estar ligado a esta teoria, acredita-se que a mananase da presente invenção seja capas de degradar ou hidrolisar eficazmente qualquer sujeiras ou manchas que contenham galactomananas e, consequentemente, de limpar roupas que contenham tais sujeiras ou manchas.

As composições de limpeza da invenção devem conter pelo menos um componente detergente adicional. A natureza exata destes componentes adicionais e os níveis de sua incorporação dependerão da forma física da composição e da natureza d operação de limpeza para a qual devem ser usados.

As composições de limpeza da presente invenção preferivelmente compreenderão ainda um ingrediente detergente selecionado de um tensoativo selecionado, uma outra enzima, um construtor e/ou um sistema de branqueamento.

As composições de limpeza de acordo com a invenção podem ser líquidas, em pasta, em géis, barras, tabletes, pulverização, espuma, pó ou granular. As composições granulares também podem estar na forma “compacta” e as composições líquidas também podem estar em uma forma “concentrada”.

As composições da invenção podem ser formuladas, por exemplo, como composições de lavar louças a mão e a máquina, composições detergentes de lavar roupa a mão ou a máquina que incluem composições de aditivos de lavar roupa de composições adequadas para o uso nas operações de molho e/ou pré tratamento de tecidos tingidos, composições amaciantes de tecido adicionadas no enxágue e composições para o uso nas operações de limpeza de superfície dura nos cuidados domésticos gerais. As composições que contenham tais carboidrases também podem ser formuladas como produtos de sanitização, limpadores de lentes de contato e produtos de cuidados de saúde e de beleza tais como cuidado oral/dentário e composições de limpeza pessoal.

Quando formulados como composições para o uso em métodos de lavagens manuais de louça, as composições da invenção preferivelmente contém um tensoativo e preferivelmente outros compostos detergentes selecionados de compostos poliméricos orgânicos, agentes acentuadores de espuma, íons metálicos do grupo II, solventes, hidrótropos e enzimas adicionais.

Quando formulados como composições adequadas para o uso em um método de lavagem em máquina de lavar roupas, as composições da invenção preferivelmente contém tanto um composto tensoativo quanto um construtor e adicionalmente um ou mais componentes detergentes, preferivelmente selecionados de compostos poliméricos orgânicos, agentes de branqueamento, enzimas adicionais, supressores de espuma, dispersantes, dispersantes de cal-sabão, agentes de suspensão de sujeira e anti-redeposição e inibidores de corrosão. As composições de lavar roupa também pode conter agentes amaciantes como componentes detergentes adicionais. Tais composições que contenham carboidrase podem fornecer limpeza de tecido, remoção de manchas, manutenção da brancura, amaciamento, destaque de cor, inibição da transferência de corante e sanitização quando formulados como composições detergentes de lavar roupas.

As composições da invenção também podem ser usadas como produtos aditivos de detergente na forma sólida ou líquida. Tais produtos aditivos são intencionados a suplementar ou reforçar o desempenho de composições detergentes convencionais e podem ser adicionados em qualquer estágio do processo de limpeza.

Se for necessário a densidade das composições detergentes de lavar roupas variam aqui de 400 a 1200 g/litro, preferivelmente de 500 a 950 g/litro da composição medidos a 20° C. A forma “compacta” das composições neste é melhor refletida pela densidade e, em termos de composição, pela quantidade de sal enchedor inorgânico; os sais enchedores inorgânicos são ingredientes convencionais das composições detergentes na forma de pó; em composições detergentes convencionais, os sais enchedores estão presentes em quantidades substanciais, tipicamente de 17 a 35 % em peso da composição total. Nas composições compactas, o sal enchedor está presente em quantidades que não excedam a 15 % da composição total, preferivelmente não excedendo a 10 %, mais preferivelmente não excedendo a 5 % em peso da composição. Os sais enchedores inorgânicos tais como os referidos nas presentes composições são selecionados dos sais de metal alcalino e de metal alcalino terroso de sulfatos e cloretos. UM sal enchedor preferido é o sulfato de sódio.

As composições detergentes líquidas de acordo com a presente invenção também podem estar em uma “forma concentrada”, em tais casos, as composições detergentes líquidas de acordo com a presente invenção conterão uma quantidade menor de água, comparado aos detergentes líquidos convencionais. Tipicamente, o teor de água do detergente líquido concentrado é preferivelmente menor do que 40 %, mais preferivelmente menor do que 30 %, ou mais preferivelmente menor do que 20 % em peso da composição detergente.

COMPOSIÇÕES DE LIMPEZA SISTEMA DE TENSOATIVO

As composições de limpeza ou detergentes de acordo com a presente invenção compreendem um sistema de tensoativo, em que o tensoativo pode ser selecionado de tensoativos não iônicos e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou anfolíticos e/ou zwiteriônicos e/ou semi-polares. O tensoativo está tipicamente presente em um nível de 0,1 % a 60 % em peso. O tensoativo é preferivelmente formulado para ser compatível com o híbrido de enzima e componentes de enzima presentes na composição. Em composições líquidas ou em gel o tensoativo é formulado mais preferivelmente de um modo tal que promova, ou pelo menos não degrade, a estabilidade de qualquer híbrido de enzima ou enzima destas composições.

Sistemas adequados para o uso de acordo com a presente invenção compreende como um tensoativo um ou mais dos tensoativos não iônicos e/ou aniônicos aqui descritos. Óxidos de polietileno, polipropileno e de polibutileno condensados de fenóis alquílicos são adequados para o uso como o tensoativo não iônico dos sistemas de tensoativo da presente invenção, com os condensados de oxido de polietileno sendo os preferidos. Estes compostos incluem os produtos de condensação dos fenóis alquílicos tendo um grupo alquila contendo de cerca de 6 a cerca de 14 átomos de carbono, preferivelmente de cerca de 8 a cerca de 14 átomos de carbono na configuração de uma cadeia reta ou ramificada com o óxido de alquileno. Em uma modalidade preferida, o óxido de etileno está presente em uma quantidade igual a aproximadamente 2 até cerca de 25 moles mais preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 15 moles de óxido de etileno por mol de alquil fenol. Comercialmente, os tensoativos não iônicos disponíveis deste tipo incluem Igepal® CO-630, comercializado pela GAF Corporation e Ttiton® X-45, X-114, X-100 e X-102, todos comercializados pela Rohm &

Haas Company. Estes tensoativos são habitualmente chamados de alquilfenóis alcoxilados (por exemplo, alquil fenóis etoxilados).

Os produtos de condensação de álcoois alifáticos primários e secundários com cerca de 1 a cerca de 25 moles de óxido de etileno são adequados para o uso como o tensoativo não iônico dos sistemas de tensoativo não iônico da presente invenção. A cadeia alquílica do álcool alifático pode ser reto ou ramificada, primária ou secundária e, no geral contém de cerca de 8 a cerca de 22 átomos de carbono. Preferidos são os produtos de condensação de álcoois que tenham um grupo alquila contendo de cerca de 8 a cerca de 20 átomos de carbono, mais preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 18 átomos de carbono, com cerca de 2 a cerca de 10 moles de óxido de etileno por mol de álcool. Cerca de 2 a cerca de 7 moles de óxido de etileno e o mais preferivelmente de 2 a 5 moles de óxido de etileno por mol de álcool estão presentes nos ditos produtos de condensação. Os exemplos de tensoativos não iônicos comercialmente disponíveis deste tipo incluem TergitoL 15-S-9 (o produto de condensação de álcool linear Cn-C,5 com 9 moles de óxido de etileno), Tergitol® 24-L-6 NMW (o produto de condensação do álcool primário C12-C14 com 6 moles de óxido de etileno com uma distribuição restrita de peso molecular), ambos comercializados pela Union Carbide Corporation; Neodol® 45-9 (o produto de condensação de álcool linear Cl4-C15 com 9 moles de óxido de etileno), neodol® 23-3 (o produto de condensação de álcool linear C12“C13 com 3,0 moles de óxido de etileno), Neodol® 45-7 (o produto de condensação de álcool linear C14-C15 com 7 moles de óxido de etileno), Neodol® 45-5 (o produto de condensação de álcool linear C14-Ci5 com 5 moles de óxido de etileno), comercializados pela Shell Chemical Company, Kyro® EOB (o produto de condensação de álcool CirC,5 com 9 moles de óxido de etileno), comercializado pela The Procter & Gamble Company e Genapol LA 050 (o produto de condensação de álcool C12-CH com 5 moles de óxido de etileno), comercializado pela Hoechst. A faixa preferida de HLB nestes produtos é de 8 a 11 e o mais preferido de 8 a 10.

Da mesma maneira utilizáveis como o tensoativo não iônico dos sistemas de tensoativo da presente invenção são os alquilpolissacarídeos divulgados na US 4.565.647, tendo um grupo hidrofóbico contendo de cerca de 6 a cerca de 30 átomos de carbono, preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 16 átomos de carbono e um polissacarídeo, por exemplo, um poliglicosídeo, um grupo hidrofílico contendo de cerca de 1,3 a cerca de 10, preferivelmente de cerca de 1,3 a cerca de 3, o mais preferivelmente de cerca de 1,3 a cerca de 2,7 unidades de sacarídeo. Qualquer sacarídeo redutor contendo 5 ou 6 átomos de carbono pode ser usado, por exemplo, porções de glicose, galactose e galactosila podem ser substituídas no lugar das porções de glicosila (opcionalmente o grupo hidrofóbico está ligado nas posições 2, 3, 4, etc., dando assim uma glicose ou galactose como oposto a um glicosídeo ou galactosídeo). As ligações intersacarídicas podem ser, por exemplo, entre a posição um das unidades adicionais de sacarídeo e as posições 2, 3, 4 e/ou 6 nas unidades precedentes de sacarídeo.

Os alquilpoliglicosídeos preferidos têm a fórmula: R20(CnH2nO)t(glicosil)x Em que R2 é selecionado do grupo que consiste de alquila, alquilfenila, hidroxialquila, hidroxialquilfenila e misturas destes em que os grupos alquila contêm de cerca de 10 a cerca de 18, preferivelmente de cerca de 12 a cerca de 14 átomos de carbono; n é 2 ou 3, preferivelmente 2; t é de 0 a cerca de 10, preferivelmente 0; e x é de cerca de 1,3 a cerca de 10, preferivelmente de cerca de 1,3 a cerca de 3, o mais preferivelmente de cerca de 1,3 a cerca de 2,7. A glicosila é preferivelmente derivada da glicose. Para preparar estes compostos, o álcool ou o álcool alquilpolietóxi é primeiro formado e depois reagido com a glicose ou com uma fonte de glicose, para formar o glicosídeo (ligação na posição 1). As unidades adicionais de glicosila podem ser depois ligadas entre a sua posição 1 e as unidades de glicosila precedentes nas posições 2, 3, 4 e/ou 6, preferível e predominantemente na posição 2 Os produtos de condensação do óxido de etileno com uma base hidrofóbica formada pela condensação do óxido de propileno com propileno glicol também são adequados para o uso como os sistemas adicionais de tensoativo não iônico da presente invenção. A porção hidrofóbica destes compostos terão preferivelmente um peso molecular de cerca de 1500 a cerca de 1800 e exibirão insolubilidade em água. A adição de porções de polioxietileno a esta porção hidrofóbica tende a aumentar a solubilidade em água das moléculas como um todo e o caráter líquido do produto é retido até o ponto onde o teor de polioxietileno é de cerca de 50 % do peso total do produto de condensação que corresponde à condensação com até cerca de 40 moles de óxido de etileno. Os exemplos de compostos deste tipo incluem alguns dos tensoativos Pluronic® comercialmente disponíveis, comercializados pela BASF.

Também adequados para o uso como o tensoativo não iônico do sistema de tensoativo não iônico da presente invenção são os produtos de condensação do óxido de etileno com o produto que resulta da reação de óxido de propileno e eíüenodiamina. A porção hidrofóbica destes produtos consiste do produto de reação da etileno diamina e óxido de propileno em excesso e, no geral, tem um peso molecular de cerca de 2500 a cerca de 3000. Esta porção hidrofóbica é condensada com óxido de etileno até o ponto em que o produto de condensação contenha de cerca de 40 % a cerca de 80 % em peso de polioxietileno e tenha um peso molecular de cerca de 5.000 a cerca de 11.000. Os exemplos deste tipo de tensoativo não iônico incluem alguns dos compostos Tetronic® comercialmente disponíveis, comercializados pela BASF.

Preferidos par o uso como o tensoativo não iônico dos sistemas de tensoativo da presente invenção são os óxidos de polietileno condensados de alquil fenóis, os produtos de condensação de álcoois alifáticos primários secundários cerca de 1 a cerca de 2 5 moles de oxido de etileno, alquilpolissacarídeos e misturas destes. Os mais preferidos são os etoxilados de alquilfenol C8-C14 tendo de 3 a 15 grupos etóxi e etoxilados de álcool C8-C1S (preferivelmente C10 avg.) tendo de 2 a 10 grupos etóxi e misturas destes.

Os tensoativos não iônicos altamente preferidos são tensoativos de poliidróxi ácido graxo de amida da fórmula: em que R1 é H ou Rl é hidrocarbila 0Μ, 2-hidroxietila, 2-hidroxipropila ou uma mistura destes, R2 é hidrocarbila C5_3I e Z é uma poliidroxiidrocarbila tendo uma cadeia de hidrocarbila linear com pelo menos 3 hidroxilas diretamente conectadas na cadeia ou um derivado alcoxilado desta. Preferivelmente, R1 é metila, R2 é cadeia reta de alquila C1M5 ou alquila C16_1S ou alquenila tal como alquila de coco ou misturas destes e Z é derivado de um açúcar redutor tal como glicose, frutose, maltose ou lactose em uma reação de aminação redutiva.

Os tensoativos aniônicos altamente preferidos incluem tensoativos de alquil sulfato alcoxilados. Os exemplos destes são sais ou ácidos solúveis em água da fórmula R0(A)mS03M em que R é um gmpo alquila ou hidroxialquila C10-C24 não substituídos tendo um componente alquila Ci0-C24, preferivelmente uma alquila ou hidroxialquila C12-C20, mais preferivelmente uma alquila ou hidroxialquila C12-C1S, A é uma unidade etóxi ou propóxi, m é maior do que 0, tipicamente entre cerca de 0,5 e cerca de 3 e M é H ou um cátion que pode ser, por exemplo, um cátion de metal (por exemplo, sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, etc.), cátion amônio ou amônio substituído. Os alquil sulfatos etoxilados bem como os alquil sulfatos propoxilados são aqui considerados. Os exemplos específicos de cátions amônio substituídos incluem cátions de metil-, dimetil-, trimetil-amônio e cátions de amônio quaternário tais como cátions tetrametil-amônio e dimetil piperidínio e aqueles derivados de alquilaminas tais como etilamina, dietilamina, trietilamina, mistura destes e outros. Os tensoativos exemplares sâo sulfato de alquila Cl2-C18 polietoxilado (1,0) (C12-ClgE(l,0)M), sulfato de alquila C12-C18 polietoxilado (2,25) (C12-C18(2,25)M), sulfato de alquila C12-C1S polietoxilado (3,0) (C12-C1SE(3,0)M) e sulfato de alquila C,2-CiS polietoxilado (4,0) (Ci2-ClgE(4,0)M), em que M é convenientemente selecionado de sódio e potássio.

Os tensoativos aniônicos adequados para serem usados são os tensoativos de éster de alquilsulfonato incluindo os ésteres lineares de ácidos carboxílicos Cg-C20 (isto é, ácidos graxos) que são sulfonados com S03 gasoso, de acordo com “The Journal of the American Oil Chemists Society”, 52 (1975), pp. 323 a 329. Os materiais de partida adequados podem incluir substâncias graxas naturais como as derivadas de sebo, óleo de palma, etc. O tensoativo de éster de alquil sulfonato preferido, especialmente para aplicações na lavagem de roupas, compreende os tensoativos de éster de alquil sulfonato da fórmula estrutural: em que R3 é uma hidrocarbila C8-C20, preferivelmente uma alquila ou uma combinação destas, R4 é uma hidrocarbila C1-C6, preferivelmente uma alquila ou uma combinação destas e M é um cátion que forme um sal solúvel em água com o éster de alquil sulfonato. Os cátions formadores de sal adequados incluem os metais tais como sódio, potássio e lítio e cátions de amônio substituídos ou não substituídos, tais como monoetanolamina, dietanolamina e trietanolamina. Preferivelmente, R3 é alquila Cl0-Cí6 e R4 é metila, etila ou isopropila. São especialmente preferidos os ésteres de metil sulfonato em que R3 é alquila C10-C16, Outros tensoativos aniônicos adequados incluem os tensoativos de alquil sulfato que sejam sais ou ácidos solúveis em água da fórmula R0S03M, em que R é uma hidrocarbila Ci0-C24, preferivelmente uma alquila ou hidroxialquila tendo um componente de alquila C10-C20, mais preferivelmente uma alquila ou hidroxialquila C12-Clg e M é H ou um cátion, por exemplo, um cátion de metal alcalino (por exemplo, sódio, potássio, lítio) ou amônio ou amônio substituído (por exemplo, cátions metil-, dimetil- e trimetil amônio e cátions de amônio quaternário tais como cátioris tetrametil-amônio e dimetil piperidinio e cátions de amônio quaternário derivados de alquilaminas tais como etilamina, dietilamina, trietilamina e misturas destes, e outros). Tipicamente, as cadeias alquílicas de C12-C16 são preferidas para temperaturas de lavagem mais baixas (por exemplo, abaixo de cerca de 50° C) e as cadeias alquílicas C!6-C18 são preferidas para temperaturas de lavagem mais altas (por exemplo, acima de cerca de 50° C). Outros tensoativos aniônicos utilizáveis para propósitos detersivos também podem ser incluídos nas composições detergentes de lavar roupas da presente invenção. Estes podem incluir sais (incluindo, por exemplo, sais de sódio, potássio, amônio e amônio substituído, tais como sais de mono-, di- e trietanolamina) de sabão, alcanossulfonatos Cg-C22, primários ou secundários, olefmsulfonatos Cg-C24, ácidos policarboxílicos sulfonados preparados pela sulfonação do produto pírolizado de citratos de metal alcalino terroso, por exemplo, como descrito no pedido de patente Britânico N- 1.082.179, alquilpoliglicoletersulfatos Ca-C24 contendo até 10 moles de óxido de etileno); sulfonatos de alquil glicerol, sulfonatos graxos de acil glicerol, sulfatos graxos de oleil glicerol, sulfatos éter de alquil fenol de óxido de etileno, sulfonatos de parafina, fosfatos de alquila, isetionatos tais como os isetionatos de acila, tauratos de N-acila, succinamatos e sulfosuccinatos de alquila, monoésteres de sulfosuccinatos (especialmente monoésteres C12-C18 saturados e não saturados) e diésteres de sulfosuccinatos (especialmente diésteres C6-C12 saturados e não saturados), sarcosinatos de acila, sulfatos de alquilpolisacarídeos tais como os sulfatos de alquilpoliglicosídeo (os compostos não iônicos, não sulfatados são descritos abaixo), sulfatos de alquila primária, ramificada e carboxilatos de alquil polietóxi tais como aqueles da fórmula R0(CH2CH20)k-CH2C00-M+, em que R é uma alquila Cg-C22, k é um número inteiro delalOeMé um cátion formador de sal solúvel. Os ácidos de resina e os ácidos de resina hidrogenada também são adequados, tais como colofonia de breu, colofonia de breu hidrogenada e ácidos de resina e ácidos de resina hidrogenados presentes em tall-oil ou derivados deste.

Os sulfonatos de alquilbenzeno são altamente preferidos. São especialmente preferidos os sulfonatos de alquil benzeno lineares (de cadeia reta) (LAS) em que o grupo alquila preferivelmente contém de 10 a 18 átomos de carbono.

Outros exemplos são descritos em “Surface Active Agents and Detergents” (Vol. I e II por Schwartz, Perrry e Berch). Uma variedade de tais tensoativos também são no geral divulgados na US 3.929.678, (Coluna 23, linha 58 até Coluna 29, Linha 23, incorporados aqui por referência).

Quando incluídos nestes, as composições detergentes de lavagem de roupas da presente invenção tipicamente compreende de cerca de 1 % a cerca de 40 %, preferivelmente de cerca de 3 % a cerca de 20 % em peso de tais tensoativos aniônicos.

As composições detergentes de limpeza ou de lavagem de roupas da presente invenção também podem conter tensoativos catiônicos, anfolíucos, zwiteriônicos e semi polares, bem como os tensoativos não iônicos e/ou aniônicos outros que não aqueles já descritos aqui.

Os tensoativos detersivos catiônicos adequados para o uso nas composições detergentes de lavar roupa da presente invenção são aqueles que tenham um grupo hidrocarbila de cadeia longa. Os exemplos de tais tensoativos catiônicos incluem os tensoativos de amônio tais como os halogenídeos de aíquiltrimetilamônio e aqueles tensoativos que tenham a fórmula: [R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X- em que R2 é um grupo alquila ou alquil benzila tendo de cerca de 8 a cerca de 18 átomos de carbono na cadeia alquílica, cada R3 é selecionado do grupo que consiste de -CH2CH2-, CH2CH(CH3)-, -CH2CH(CH2OH)-5 -CH2CH2CH2-e misturas destes; cada R4 é selecionado do grupo que consiste de alquila Cr C4, hidroxialquila C;-C4) estruturas de anel de benzila formadas pela união de dois grupos R4, -CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH, em que R6 é qualquer hexose ou polímero de hexose tendo um peso molecular menor do que cerca de 1000 e hidrogênio quando y não é 0; R5 é o mesmo como R4 ou é uma cadeia alquílica, em que o número total de átomos de carbono ou R2 mais R5 não é mais do que cerca de 18; cada y é de 0 a cerca de 10 e a soma dos valores y é de 0 a cerca de 15 e X é qualquer ânion compatível.

Os tensoativos catiônicos altamente preferidos são os compostos de amônio quaternário solúveis em água utilizáveis na presente composição tendo a fórmula: R1R2R3R4N+X(i) em que Rj é alquila Cg-C16s cada um de R2, R3 e R4 é independentemente alquila CrC4, hidróxi alquila C,-C4 benzila e -(C2H40)XH onde x tem um valor de 2 a 5 e X é um ânion. Não mais do que um de R2, R3 e R4 deve ser benzila. O comprimento preferido da cadeia alquílica para Rj é C12-C,5, particularmente onde o grupo alquila é uma mistura de comprimentos de cadeia derivados de gordura de coco ou de semente de palma ou é derivado sinteticamente pela olefina formada ou pela síntese de álcoois OXO.

Os grupos preferidos para R2, R3 e R4 são grupos metila e hidroxietila e o ânion X pode ser selecionado de íons haleto, metossulfato, acetato e fosfato.

Os exemplos de compostos adequados de amônio quaternário das fórmulas (i) para o uso nesta são: cloreto ou brometo de trimetil amônio de coco; cloreto ou brometo de metil diidroxietil amônio de coco; cloreto de decil trietil amônio; cloreto ou brometo de decil dimetil hidroxietil amônio; cloreto ou brometo de dimetil C12-C15 hidroxietil amônio; cloreto ou brometo de dimetil hidroxietil amônio de coco; metil sulfato de miristil trimetil amônio; cloreto ou brometo de lauril dimetil benzil amônio; cloreto ou brometo de lauril dimetil (etenóxi)4 amônio; ésteres de colina (os compostos da fórmula (i) em que R, é dialquil imidazolinas [compostos da fórmula (i)].

Outros tensoativos catiônicos utilizáveis nesta também estão descritos na US 4.228.044 e na EP 000 224.

Quanto desta maneira incluídos, as composições detergentes de lavar roupas da presente invenção tipicamente compreende de 0,2 % a cerca de 25 %, preferivelmente de cerca de 1 % a cerca de 8 % em peso de tais tensoativos catiônicos.

Os tensoativos anfolxticos também são adequados para o uso nas composições detergentes de lavar roupas da presente invenção. Estes tensoativos podem ser amplamente descritos como derivados alifáticos de aminas secundárias ou terciárias ou derivados alifáticos de aminas heterocíclicas secundárias e terciárias em que o radical alifático pode ser de cadeia reta ou ramificada. Um dos substituintes alifáticos contêm pelo menos cerca de 8 átomos de carbono, tipicamente de cerca de 8 a cerca de 18 átomos de carbono e pelo menos um contém um grupo aniônico que solubiliza em água, por exemplo, carbóxi, sulfonato, sulfato. Ver a US 3.929.678 (coluna 19, linhas 18 a 35) para exemplos de tensoativos anfolíticos.

Quando incluídos nesta, as composições detergentes de lavar roupas da presente invenção tipicamente compreendem de 0,2 % a cerca de 15 %, preferivelmente de cerca de 1 % a cerca de 10 % em peso de tais tensoativos anfolíticos.

Os tensoativos zwiteriônicos também são adequados para o uso em composições detergentes de lavar roupas. Estes tensoativos podem ser amplamente descritos como derivados de aminas secundárias e terciárias ou derivados de aminas heterocíclicas secundárias e terciárias ou compostos derivados de amônio quaternário, fosfônio quaternário ou sulfônio terciário. Ver a US 3.929.678 (coluna 19, linha 38 até a coluna 22, linha 48) para exemplos de tensoativos zwiteriônicos.

Quando incluídos nesta, as composições detergentes de lavar roupas da presente invenção tipicamente compreendem de 0,2 % a cerca de 15 %, preferivelmente de cerca de 1 % a cerca de 10 % em peso de tais tensoativos zwiteriônicos.

Os tensoativos não iônicos, semi-polares são uma categoria especial de tensoativos não iônicos que inclui óxidos de amina solúveis em água contendo uma porção alquila de cerca de 10 a cerca de 18 átomos de carbono e duas porções selecionadas do grupo que consiste de grupos alquila e grupos hidroxialquila contendo de cerca de 1 a cerca de 3 átomos de carbono; os óxidos de fosfina solúveis em água contendo uma porção alquila de cerca de 10 a cerca de 18 átomos de carbono e duas porções selecionadas do grupo que consiste de grupos alquila e grupos hidroxialquila contendo de cerca de 1 a cerca de 3 átomos de carbono e sulfóxidos solúveis em água contendo uma porção alquila de cerca de 10a 18 átomos de carbono e uma porção selecionada do grupo que consiste de porções de alquila e de hidroxialquila de cerca de 1 a cerca de 3 átomos de carbono Os tensoativos detergentes não iônicos, semipolares incluem os tensoativos de óxido de amina que tenham a fórmula: Em que R3 é um grupo alquila, hidroxialquila ou alquil fenila ou misturas destes contendo de cerca de 8 a cerca de 22 átomos de carbono; R4 é um grupo alquileno ou hidroxialquileno contendo de cerca de 2 a cerca de 3 átomos de carbono ou misturas destes; x é de 0 a cerca de 3 e cada R5 é um grupo alquila ou hidroxialquila contendo de cerca de 1 a cerca de 3 átomos de carbono ou um grupo de óxido de polietileno contendo de cerca de 1 a cerca de 3 grupos de óxido de etileno. Os grupos R5 podem ser ligados uns aos outros, por exemplo, através de um átomo de oxigênio ou de nitrogênio, para formar uma estrutura de anel.

Estes tensoativos de óxido de amina em particular incluem óxidos de alquil dimetil amina e óxidos de alcóxi C8-Ci2 etil diidróxi etil amina.

Quando incluídos nesta, as composições detergentes de lavar roupas da presente invenção tipicamente compreendem de 0,2 % a cerca de 15 %, preferivelmente de cerca de 1 % a cerca de 10 % em peso de tais tensoativos não iônicos semi-polares.

SISTEMA FORMADOR

As composições de acordo com a presente invenção podem ainda compreender um sistema formador. Qualquer sistema formador convencional é adequado para o uso nesta incluindo materiais de aluminossilicato, silicatos, policarboxilatos e ácidos graxos, materiais tais como etilenodiamino tetraacetato, sequestrantes de íon metálico tais como aminopolifosfonatos, particularmente ácido etilenodiamino tetrametileno fosfônico e ácido dietileno triamina pentamentilenofosfônico Embora menos preferidos por razões ambientais óbvias, os formadores de fosfato também podem ser aqui usados.

Os formadores adequados podem ser um material inorgânico de troca iônica, habitualmente um material inorgânico de aluminossilicato hidratado, mais particularmente um zeólito sintético hidratado, tal como os zeólitos hidratados A, X, B, HS ou MAP.

Um outro material formador inorgânico adequado é silicato em camada, por exemplo, SKS-6 (Hoechst). O SKS-6 é um silicato cristalino em camada que consiste de silicato de sódio (Na2Si205).

Os policarboxilatos adequados que contenham um grupo carbóxi incluem ácido lático, ácido glicólico e derivados de éter destes, como divulgado nas Patentes Belgas N— 831.368, 821.369 e 821.370. Os policarboxilatos que contenham dois grupos carbóxi incluem os sais solúveis em água de ácido succínico, ácido malônico, ácido (etilenodióxi) diacético, ácido maléico, ácido diglicólico, ácido tartárico, ácido tartrônico e ácido fumárico, bem como os carboxilatos de éter descritos na German Offenle-enschrift 2.446.686 e 2.446.487, US 3.935.257 e os carboxilatos de sulfmila descritos na Patente Belga N° 840.623. Os policarboxilados que contenham três grupos carbóxi incluem, em particular, os citratos, aconitratos e citraconatos solúveis em água bem como os derivados de succinato tais como os carboximetiloxissuccinatos descritos na Patente Britânica N- 1.379.241, os lactoxissuccinatos descritos no pedido Holandês 7205873 e os materiais de oxipolicarboxilato tais como os 2-oxa-l,l,3-propano tricarboxilatos descritos na Patente Britânica Ns 1.387.447.

Os policarboxilatos que contenham quatro grupos carbóxi incluem os oxidissuccinatos divulgados na Patente Britânica N- 1.261.829, os 1,1,2,2-etano tetracarboxilatos, 1,1,3,3-propano tetracarboxilatos que contenham substituintes sulfo incluem os derivados de sulfossucinato divulgados nas Patentes Britânicas N~ 1.398.421 e 1.398.422 e na US 3.936.448 e os citratos pirolisados, sulfonados descritos na Patente Britânica N- 1.082.179, enquanto os policarboxilatos que contenham substituintes de fosfona são divulgados na Patente Britânica N- 1.439.000.

Os policarboxilatos alicíclicos e heterocíclicos incluem ciclopentano-cis,cis-cis-tetracarboxilatos, pentacarboxilatos de ciclopentadienida, 2,3,4,5-tetraidro-furan-cis,cis,cis-tetracarboxilatos, 2,5-tetraidro-furan-cis, discarboxilatos, 2,2,5,5-tetraidrofuran-tetracarboxilatos, 1,2,3,4,5,6-hexano-hexacarboxilatos e derivados de carboximetila de álcoois poliídricos tais como sorbitol, manitol e xilitol. Os policarboxilatos aromáticos incluem ácido melítico, ácido piromelítico e os derivados do ácido ftálico divulgados na Patente Britânica N- 1.425.343.

Dos acima, os policarboxilatos preferidos são os hidroxicarboxilatos que contenham até três grupos carbóxi por molécula, mais particularmente citratos.

Os sistemas formadores preferidos para o uso nas composições presentes incluem uma mistura de um formador de aluminossilicato insolúvel em água tal como o zeólito A ou de um silicato em camada (SKS-6) e um agente de quelação de carboxilato solúvel em água tal como o ácido cítrico.

Um quelante adequado para a inclusão nas composições detergentes de acordo com a invenção é o ácido etilenodiamino-Ν,Ν’-dissuccínico (EDDS) ou os seus sais de metal alcalino, metal alcalino terroso, amônio ou de amônio substituído ou misturas destes. Os compostos de EDDS preferidos são os da forma de ácido livre e seus sais de sódio ou de magnésio. Os exemplos de tais sais de sódio preferidos de EDDS incluem Na2EDDS e Na4EDDS. Os exemplos de tais sais de magnésio preferidos de EDDS incluem MgEDDS e Mg2EDDS. Os sais de magnésio são os mais preferidos para a inclusão nas composições de acordo com a invenção.

Os sistemas formadores preferidos incluem uma mistura de um formador de aluminossilicato insolúvel em água tal como o zeólito A e um agente de quelação de carboxilato solúvel em água tal como o ácido cítrico.

Outros materiais formadores que podem formar parte do sistema formador para o uso em composições granulares incluem materiais inorgânicos tais como carbonatos de metal alcalino, bicarbonatos, silicatos e materiais orgânicos tais como os fosfonatos orgânicos, os amino polialquileno fosfonatos e os amino policarboxilatos. Outros sais orgânicos solúveis em água adequados são os ácidos homo- ou co-poliméricos ou seus sais em que o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxíla separados um do outro por não mais do que dois átomos de carbono.

Os polímeros deste tipo são divulgados na GB-A-1.596.756. Os exemplos de tais sais são poliacrilatos de peso molecular de 2000 a 5000 e seus copolímeros com anidrido maléico, tais copolímeros tendo um peso molecular de 20.000 a 70.000, especialmente de cerca de 40.000.

Os sais formadores de detergência são normalmente incluídos em quantidades de 5 % a 80 % em peso da composição. Os níveis preferidos de formadores para detergentes líquidos são de 5 % a 30 %. ENZIMAS: A mananase é incorporada nas composições de limpeza ou de detergente de acordo com a invenção, preferivelmente em um nível de 0,0001 % a 2 %, mais preferivelmente de 0,0005 % a 0,5 %, o mais preferido de 0,001 % a 0,1 % da enzima pura por peso da composição.

As composições de limpeza da presente invenção podem ainda compreender como um elemento essencial uma carboidrase selecionada do grupo que consiste de celulases, amilases, enzimas que degradam a pectina e xiloglicanases. Preferivelmente, as composições de limpeza da presente invenção compreenderão uma manase, uma amilase e uma bioscouring-type da enzima selecionada do grupo que consiste de celulases, enzimas que degradam pectina e xiloglicanases.

As celulases utilizáveis na presente invenção incluem tanto celulases bacterianas quanto fungicas. Preferivelmente terão um pH ótimo entre 5 e 12 e uma atividade específica acima de 50 CEVU/mg (Unidade de Viscosidade de Celulose). As celulases adequadas são divulgadas nas Patentes U.S. 4.435.307, J61078384 e WO 96/02653 que divulgam a celulase fúngica produzida a partir do Humicola insolens, Trichoderma, Thielavia e Sporotrichum, respectivamente. A EP 739 982 descreve celulases isoladas das novas espécies de Bacillus. As celulases adequadas também são divulgadas nas GB-A-2075028; GB-A-2095275; DE-OS-22 47 832 e WO 95/26398.

Os exemplos de tais celulases são as celulases produzidas por uma cepa do Hunicola insolens (.Humicola grisea var. thermoidea), particularmente a cepa Humicola insolens, DSM 1800. Outras celulases adequadas são as celulases originadas do Humicola insolens tendo um peso molecular de cerca de 50 kD, um ponto isoelétrico de 5,5 e contendo 415 aminoácidos, e uma endo-beta-l,4-glicanase de ~4,3kD derivada do Humicola indolens, DSM 1800; uma celulase preferida tem a sequência de aminoácido divulgada no Pedido de Patente PCT N2 WO 91/17243. As celulases também adequadas são as celulases EGIII do Trichoderma longibrachiatum descrita na WO 94/21801. As celulases especialmente adequadas são as celulases que tenham os benefícios de proteção da cor. Os exemplos de tais celulases são as celulases descritas nas WO 96/29397, EP-A-0495257, WO 91/17243, WO 91/17244 e WO 91/21801. Outras celulases adequadas para propriedades de proteção e ou limpeza de tecidos são descritas nas WO 96/34092, WO 96/17994 e WO 95/24471.

As ditas celulases são normalmente incorporadas na composição detergente em níveis de 0,0001 % a 2 % da enzima pura por peso da composição detergente.

As celulases preferidas para o propósito da presente invenção são celulases alcalinas, isto é enzima que tenha pelo menos 25 %, mais preferivelmente pelo menos 40 % da sua atividade máxima em um pH que varia de 7 a 12. As celulases mais preferidas são as enzimas que tenham a sua atividade máxima em um pH que varie de 7 a 12. Uma celulase alcalina preferida é a celulase vendida sob o nome comercial de Carezyme® pela Novo Nordisk A/S.

As amilases (a e/ou β) podem ser incluídas para a remoção de manchas com base em carboidrato. A WO 94/02597, Novo Nordisk A/S publicada em 03 de fevereiro de 1994, descreve composições de limpeza que incorporam amilases mutantes. Ver também a WO 95/10603, Novo Nordisk A/S, publicada em 20 de abril de 1995. Outras amilases conhecidas para o uso em composições de limpeza incluem tanto as a- quanto as β-amilases. As α-amilases são conhecidas na técnica e incluem aquelas divulgadas nas Patente US N- 5.003.257; EP 252.666; WO 91/00353; FR 2.676.456; EP 285.123; EP 525.610; EP 368.341; e relatório descritivo da Patente Britânica N2 1.296.839 (Novo). Outras amilases adequadas são amilases acentuadas na estabilidade descritas na WO 94/18314, publicada em 18 de agosto de 1994 e na WO 96/05295, Genencor, publicada em 22 de fevereiro de 1996 e variantes de amilase que tenham modificações adicionais no precursor imediato, disponível da Novo Nordisk A/S, divulgada na WO 95/10613, publicada em abril de 1995. Também adequadas são as amilases descritas na EP 277 216, WO 95/26397 e na WO 96/23873 (todas da Novo Nordisk).

Os exemplos de produtos comerciais de α-amilases são Purafect Ox An® da Genencor e Termamyl®, Ban®, Fungamyl® e Duramyl®, todas disponíveis da Novo Nordisk A/S Dinamarca. A WO 95/26397 descreve outras amilases adequadas: α-amilases caracterizadas por terem uma atividade específica pelo menos 25 % mais alta do que a atividade específica do Termamyl® em uma faixa de temperatura de 25° C a 55° C e em um valor de pH na faixa de 8 a 10, medidos pelo ensaio de atividade de a-amilase Phadebas®. As adequadas são as variantes das enzimas acima, descritas na WO 96/23873 (Novo Nordisk). Outras enzimas amilolíticas com propriedades melhoradas com respeito ao nível de atividade e a combinação de termoestabilidade e um nível mais alto de atividade estão descritas na WO 95/35382.

As amilases preferidas para o propósito da presente invenção são as amilases vendidas sob o nome comercial Termamyl, Duramyl e Maxamyl e/ou as variantes de α-amilase, que demonstram a termoestabilidade aumentada, divulgada como a SEQ ID NO: 2 na WO 96/23873.

As amilases preferidas para aplicações específicas são amilases alcalinas, isto é enzimas que tenham uma atividade enzimática de pelo menos 10 %, preferivelmente pelo menos 25 %, mais preferivelmente pelo menos 40 % da sua atividade máxima em um pH que varia de 7 a 12. As amilases mais preferidas são enzimas que tenham a sua atividade máxima em um pH que varia de 7 a 12.

As enzimas amilolíticas são incorporadas nas composições detergentes da presente invenção em um nível de 0,0001 % a 2 %, preferivelmente de 0,00018 % a 0,06 %, mais preferivelmente de 0,00024 % a 0,048 % da enzima pura por peso da composição. O termo “enzima que degrada a pectina” é intencionada a abranger arabinanase (EC 3.2.1.99), galactanases (EC 3.2.1.89), poligalacturonase (EC 3.2.1.15), exo-poligalacturonase (EC 3.2.1.67), exo-poli-alfa-galacturonidase (EC 3.2.1.82), pectino liase (EC 4.2.2.10), pectino esterase (EC 3.2.1.11), pectato liase (EC 4.2.2.2), exo-poligalacturonato liase (EC 4.2.2.9) e hemicelulases tais como endo-l,3-P-xilosidase (EC 3.2.1.32), xilan-l,4-p-xilosidase (EC 3.2.1.37) e α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55). As enzimas que degradam pectina são misturas naturais das atividades enzimáticas mencionadas acima. As enzimas de pectina incluem portanto as pectino metilesterases que hidrolisam as ligações do éster de pectino metila, as poligalacturonases que clivam as ligações glicosídicas entre as moléculas do ácido galacturônico e as pectino transeliminases ou liases que atuam sobre os ácidos pécticos para realizar a divagem não hidrolítica de ligações a-1—>4 glicosídicas para formar derivados não saturados de ácido galacturônico.

As enzimas que degradam a pectina são incorporadas nas composições de acordo com a invenção, preferivelmente em um nível de 0,0001 % a 2 %, mais preferivelmente de 0,0005 % a 0,5 %, ou mais preferido de 0,001 % a 0,1 % de enzima pura por peso da composição total.

As enzimas preferidas que degradam a pectina para aplicações específicas são enzimas alcalinas que degradam a pectina, isto é enzimas que tenham uma atividade enzimática de pelo menos 10 %, preferivelmente de pelo menos 25 %, mais preferivelmente de pelo menos 40 % da sua atividade máxima em um pH que varia de 7 a 12. As enzimas mais preferidas que degradam a pectina são enzimas que tenham a sua atividade máxima em um pH que varia de 7 a 12. As enzimas alcalinas que degradam a pectina são produzidas por microorganismos alcalofílicos, por exemplo, microorganismos bacterianos, fungicos e de levedura tais como as espécies Bacillus. Os microorganismos preferidos são o Bacillus firmus, Bacillus circulans e o Bacillus subtilis, como descrito na JP 56131376 e na JP 56068393. As enzimas alcalinas que decompõem a pectina incluem a galacturan-l,4-a-galacturonase (EC 3.2.1.67), atividades de poli-galacturonase (EC 3.2.1.15), pectino esterase (EC 3.1.1.11), pectato liase (EC 4.2.2.2) e suas isso enzimas e estas podem ser produzidas por intermédio das espécies Erwinia. Os preferidos são E. chrysanthemi, E. carotovora, E. amylovora, E. herbicola, E. dissolvens como descrito nas JP 59066588, JP 63042988 e no World J. Microbiol. Microbiotechnol. (8, 2, 115 a 120) 1992. As ditas enzimas alcalinas de pectina também podem ser produzidas pelas espécies Bacillus como divulgado na JP 73006557 e no Agr. Biol. Chem. (1972), 36(2) 285 a 293. O termo xiloglicanase abrange a família das enzimas descritas por Vincken e Voragen na Wageningen University [Vincken et al, (1994) Plant Physiol., 104, 99 a 107] e são capazes de degradar xiloglicanos como descrito em Hayashi et ah, (1989) Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 139 a 168. Vincken et al, demonstraram a remoção de revestimento de xiloglicano da celulose da parede celular isolada de maçã por uma xiloglicanase purificada a partir do Trichoderma viride (endo-IV-glicanase). Esta enzima acentua a degradação enzimática da celulose embutida na parede celular e trabalha em sinergia com as enzimas de pectina. A Rapidase LIQ+ da Gist-Brocades contém uma atividade de xiloglicanase.

Esta xiloglicanase é incorporada nas composições de limpeza de acordo com a invenção preferivelmente em um nível de 0,0001 % a 2 %, mais preferivelmente de 0,0005 % a 0,5 %, ou mais preferido de 0,001 % a 0,1 % de enzima pura por peso da composição.

As xiloglicanases preferidas para aplicações específicas são as xiloglicanases alcalinas, isto é enzimas que tenham uma atividade enzimática de pelo menos 10 %, preferivelmente de pelo menos 25 %, mais preferivelmente de pelo menos 40 % da sua atividade máxima em um pH que varia de 7 a 12. As xiloglicanases mais preferidas são enzimas que tenham a sua atividade máxima em uma faixa de pH de 7 a 12.

As enzimas mencionadas acima podem ser de qualquer origem adequada, tal como de origem vegetal, animal, bacteriana, fungica e de levedura. A origem pode ser ainda mesofílica ou extremofílica (psicrofílica, psicrotrópica, termofílica, barofílica, alcalofílica, acidofílica, halofílica, etc.). As formas purificadas ou não purificadas destas enzimas podem ser usadas. Atualmente, é prática comum modificar enzimas do tipo selvagem pelas técnicas de proteína/engendramento genético, de modo a otimizar a sua eficiência de desempenho nas composições de limpeza da invenção. Por exemplo, as variantes podem ser planejadas tal que a compatibilidade da enzima aos ingredientes habitualmente encontrados em tais composições seja aumentada·. Altemativamente, a variante pode ser planejada tal que o pH ótimo, a estabilidade do branqueamento ou quelante, a atividade catalítica e outros, da variante de enzima sejam ajustados para condizer com a aplicação particular de limpeza.

Em particular, a tensão deve ser focalizada sobre os aminoácidos sensíveis à oxidação no caso de estabilidade ao branqueamento e sobre as cargas de superfície quanto a compatibilidade do tensoativo. O ponto isoelétrico de tais enzimas podem ser modificados pela substituição de alguns aminoácidos carregados, por exemplo, um aumento no ponto isoelétrico pode ajudar a melhorar a compatibilidade com tensoativos aniônicos . A estabilidade das enzimas pode ser ainda acentuada pela criação de por exemplo pontes salinas adicionais e sítios de ligação de metal de reforço para aumentar a estabilidade do quelante. AGENTES DE BRANQUEAMENTO: Os ingredientes detergentes opcionais adicionais que podem ser incluídos nas composições detergentes da presente invenção incluem agentes de branqueamento tais como PB 1, PB4 e percarbonato com um tamanho de partícula de 400 a 800 mícrons. Estes componentes de agente de branqueamento podem incluir um ou mais agentes de branqueamento de oxigênio e, dependendo do agente branqueador escolhido, um ou mais ativadores de branqueamento. Quando presentes, os compostos de branqueamento de oxigênio estarão tipicamente presentes em níveis de cerca de 1 % a cerca de 25 %. No geral, os compostos de branqueamento são componentes opcionais adicionados em formulações não líquidas, por exemplo detergentes granuláveis.

Um componente de agente de branqueamento para o uso nesta pode ser qualquer um dos agentes de branqueamento, utilizáveis para composições detergentes, incluindo branqueadores de oxigênio, bem como outros conhecidos na técnica.

Um agente de branqueamento adequado para a presente invenção pode ser um agente de branqueamento ativado ou não ativado.

Uma categoria de agente de branqueamento de oxigênio que pode ser usada abrange agentes de branqueamento de ácido percarboxílico e seus sais. Os exemplos adequados desta classe de agentes inclui monoperoxiftalato de magnésio hexaidratado, o sal de magnésio do ácido meta-cloro perbenzóico, o ácido 4-nonilamino-4-oxoperoxibutírico e o ácido diperoxidodecanodióico. Tais agentes de branqueamento são divulgados nas US 4.483.781, US 740.446, EP 0 133 354 e US 4.412.934. Os agentes de branqueamento altamente preferidos também incluem o ácido 6-nonilamino-6-oxoperoxicapróico como descrito na US 4.634.551.

Uma outra categoria de agentes de branqueamento que podem ser usados abrange os agentes de branqueamento de halógeno. Os exemplos de agentes de branqueamento de hipoaleto, por exemplo, incluem o ácido tricloro isocianúrico e os dicloroisocianuratos de sódio e de potássio e N-cloro e N-bromo alcano sulfonamidas. Tais materiais são normalmente adicionados de 0,5 a 10 % em peso do produto acabado, preferivelmente de 1 a 5 % em peso.

Os agentes que liberam peróxido de hidrogênio podem ser usados em combinação com ativadores de branqueamento tais como tetraacetiletilenodiamina (TAED), nonanoiloxibenzenossulfonato (NOBS, descrito na US 4.412.934), 3,5-trimetilexanoloxibenzenossulfonato (TSONOBS, descrito na EP 120 591) ou pentaacetilglicose (PAG) que são peridrolisados para formar um perácido como as espécies branqueadora ativas, levando a um efeito melhorado de branqueamento. Além disso, muito adequado são os ativadores de branqueamento C8 (6-octanamido-caproil) oxibenzeno-sulfonato, C9(ó-nonanamido caproil) oxibenzenossulfonato e CIO (6-decanamido caproil) oxibenzenossulfonato ou mistura destes. Da mesma maneira, os ativadores adequados são ésteres de citrato acilado tais como os divulgados no Pedido de Patente Européia N° 91870207.7.

Os agentes branqueadores utilizáveis, incluindo peroxiácidos e sistemas branqueadores que compreendem ativadores de branqueamento e compostos branqueadores de peroxigênio para o uso em composições de limpeza de acordo com a invenção estão descritos no Pedido USSN 08/136.626. O peróxido de hidrogênio também pode estar presente pela adição de um sistema enzimático (isto é, uma enzima e um substrato desta) que seja capaz da geração de peróxido de hidrogênio no início ou durante o processo de lavagem e/ou enxágue. Tais sistemas enzimáticos são divulgados no Pedido de Patente Européia EP0537381.

Os agentes de branqueamento outros que não os agentes de branqueamento de oxigênio também são conhecidos na técnica e podem ser aqui utilizados. Um tipo de agente de branqueamento que não de oxigênio, de interesse particular inclui agentes de branqueamento fotoativados tais como as ftalocianinas sulfonadas de zinco e/ou de alumínio. Estes materiais podem ser depositados no substrato durante o processo de lavagem. Na irradiação com luz, na presença de oxigênio, tal como pendurando-se roupas para secar na luz do dia, a ftalocianina sulfonada de zinco é ativada e, consequentemente, o substrato é branqueado. A ftalocianina de zinco preferida e um processo branqueador fotoativado são descritos na US 4.033.718. Tipicamente, a composição detergente conterá cerca de 0,025 % a cerca de 1,25 % em peso de ftalocianina sulfonada de zinco.

Os agentes de branqueamento também podem compreender um catalisador de manganês. O catalisador de manganês pode ser, por exemplo, um dos compostos descritos em “Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching”, Nature 369, 1994, páginas 637 a 639. SUPRESSORES DE ESPUMAS: Um outro ingrediente opcional é um supressor de espumas, exemplificado por siliconas e misturas de sílica-silicona. As siliconas podem ser, no geral, representadas por materiais alquilados de polisiloxana, enquanto a sílica é normalmente usada em formas finamente divididas, exemplificada por aerogéis e xerogéis de sílica e sílicas hidrofóbicas de vários tipos. Estes materiais podem ser incorporados como particulados, em que o supressor de espuma é vantajosa e livremente incorporado em um carregador impermeável, detergente, de superfície substancialmente não ativa, solúvel em água ou dispersível em água. Altemativamente, o supressor de espuma pode ser dissolvido ou disperso em um carregador líquido e aplicado por pulverização sobre um ou mais dos outros componentes.

Um agente controlador de espuma preferido de silicona é divulgado na US 3.933.672. Outros supressores de espuma particularmente utilizáveis são os supressores de espuma de silicona alto emulsificantes, descritos no Pedido de Patente Alemã DTOS 2.646.126. Um exemplo de tal composto é o DC-544, comercialmente disponível da Dow Corning, que é um copolímero de siloxana-glicol. Os agentes controladores de espuma especialmente preferidos são os sistemas supressores de espuma que compreendem uma mistura de óleos de silicona e 2-alquil-alcanóis. Os 2-alquil-alcanóis adequados são 2-butil-octanol que são comercialmente disponíveis sob o nome comercial Isofol 12 R.

Os sistemas supressores de espuma são descritos no Pedido de Patente Européia N2 92201649.8. As ditas composições podem compreender uma mistura de silicona/sílica em combinação com sílica fumigada não porosa tais como Aerosil®.

Os supressores de espuma descritos acima são normalmente utilizados em níveis de 0,001 % a 2 % em peso da composição, preferivelmente de 0,01 % a 1 % em peso. OUTROS COMPONENTES: Outros componentes usados nas composições detergentes podem ser utilizados, tais como agentes de suspensão de sujeira, agentes de liberação de sujeira, abrilhantadores óticos, abrasivos, bactericidas, inibidores de embaciamento, agentes corantes e/ou perfumes encapsulados ou não encapsulados.

Os materiais de encapsulação especialmente adequados são cápsulas solúveis em água que consistem de uma matriz de polissacarídeo e compostos de poliidróxi, tais como os descritos na GB 1.464.616.

Outros materiais de encapsulação solúveis em água, adequados compreendem dextrinas derivadas de ésteres ácidos de amido não gelatinizados de ácidos dicarboxílicos substituídos tais como os descritos na US 3.455.838. Estas dextrinas de éster ácido são, preferivelmente =, preparadas de amidos tais como milho ceroso, sorgo ceroso, sagú, tapioca e batata. Os exemplos adequados de materiais de encapsulação incluem N-Lok fabricado pela National Starch. O material de encapsulação N-Lok consiste de um amido de milho modificado e glicose. O amido é modificado pela adição de grupos monofuncionais substituídos, tais como anidrido de ácido octenil succínico.

Os agentes de anti-redeposição e de suspensão de sujeira adequados nesta incluem derivados de celulose tais como celulose metílica, celulose carboximetílica e celulose hidroxietílica e ácidos policarboxílicos homo- ou co-poliméricos ou seus sais. Os polímeros deste tipo incluem os poliacrilatos e copolímeros de anidrido maléico-ácido acrílico anteriormente mencionados como formadores, bem como copolímeros de anidrido maléico com etileno, éter metilvinílico e ácido metacrílico, o anidrido maléico,-constituíndo pelo menos 20 % em mol do copolímero. Estes materiais são normalmente usados em níveis de 0,5 % a 10 % em peso, mais preferivelmente de 0,75 % a 8 %, o mais preferivelmente de 1 % a 6 % em peso da composição.

Os abrilhantadores óticos preferidos são aniônicos no caráter, os exemplos dos quais são 4,4’-bis-(2-dietanolamino-4-anüino-s-triazm-ó-ilamino)estilbeno-2:2’ dissulfonato de dissódio, 4,4,-bis-(2-morfolino-4-anilino-s-triazin-ó-ilamino-estilbeno^^-dissulfonato de dissódio, 4,4’-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamÍno-estilbeno-2:2 ’-dissulfonato de dissódio, 4’,4”-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino-estilbeno-2-sulfonato de monossódio, 4,4,-bis-(2-anilino-4-(N-metil-N-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamino-estilbeno-2,2’-dissulfonato de dissódio, 4,4’-bis-(4-fenil-2,l,3-triazol-2-il)-estilbeno-2,2’-dissulfonato de dissódio, 4,4’-bis-(2-anilino-4-(l-metil-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamino-estilbeno-2,2,-dissulfonato de dissódio, 2-(estilbil-4”-(nafto-l’,2,:4,5)-l,2,3-triazol-2”-sulfonato de sódio e 4,45-bis(2-sulfoestiril)bifenila.

Outros materiais poliméricos utilizáveis são os polietileno glicóis, particularmente aqueles de peso molecular entre 1.000 e 10.000, mais particularmente de 2.000 a 8.000 e o mais preferivelmente em tomo de 4.000. Estes são usados em níveis de 0,20 % a 5 %, mais preferivelmente de 0,25 % a 2,5 % em peso. Estes polímeros e os sais de poli-carboxilato homo- ou co-poliméricos anteriormente mencionados são valiosos para melhorar a manutenção da brancura, a deposição de cinzas do tecido e desempenho de limpeza sobre a argila, proteináceos e sujeiras oxidáveis na presença de impurezas de metal de transição.

Os agentes de liberação de sujeira utilizáveis nas composições da presente invenção são convencionalmente copolímeros ou terpolímeros do ácido tereftálico com unidades de etileno glicol e/ou propileno glicol em vários arranjos. Os exemplos de tais polímeros são divulgados nas US 4.116.885 e 4.711.730 e na EP 0 272 033. Um polímero particular preferido, de acordo com a EP 0 272 033 tem a fórmula: (CH3(PEG)43)o,75(POH)0i2i[(T-PO)2,8(T-PEG)0,4]T(POH)0,25((PEG)43CH3)0.75 onde PEG é -(0C2H4)0-, PO é (0C3H60) e T é (pOOC6H4CO).

Também são muito utilizáveis os poliésteres modificados como copolímeros aleatórios de tereftalato de dimetila, sulfoisoftalato de dimetila, etileno glicol e 1,2-propanodiol, os grupos finais consistindo primariamente de sulfobenzoatos e em segundo lugar de mono ésteres de etileno glicol e/ou 1,2-propanodiol. O objetivo é obter um polímero encapuzado em ambas as extremidades por grupos de sulfobenzoato, “primariamente”, no presente contexto, a maioria dos ditos copolímeros aqui serão encapuzados na extremidade por grupos de sulfobenzoato. Entretanto, alguns copolímeros serão menos do que completamente encapuzados e portanto seus grupos finais podem consistir de monoésteres de etileno glicol e/ou 1,2-propanodiol, destes consiste o “em segundo lugar” de tal espécie.

Os poliésteres selecionados aqui contêm cerca de 46 % em peso de ácido dimetil tereftálico, cerca de 16 % em peso de 1,2-propanodiol, cerca de 10 % em peso de etileno glicol, cerca de 13 % em peso de ácido dimetil sulfobenzóico e cerca de 15 % em peso de ácido sulfoisoftálico e têm um peso molecular de cerca de 3.000. Os poliésteres e seu método de preparação estão descritos em detalhes na EP 311 342. AGENTES AMACIANTES: Os agentes amaciantes de tecido também podem ser incorporados nas composições detergentes de lavar roupas de acordo com a presente invenção. Estes agentes podem ser do tipo inorgânico ou orgânico. Os agentes amaciantes inorgânicos são exemplificados pelas argilas de esmectita divulgadas na GB-A-1 400898 e na US 5.019.292. Os agentes orgânicos de amaciantes de tecido incluem as aminas terciárias insolúveis em água como divulgado na GB-A1 514 276 e na EP 0 011· 340 e a sua combinação com sais de amônio mono quaternário C12-C14 são divulgados na EP-B-0 026 528 e di-amidas de cadeia longa como divulgado na EP 0 242 919. Outros ingredientes orgânicos utilizáveis dos sistemas de amaciamento de tecido incluem materiais de óxido de polietileno de alto peso molecular como divulgado na EP 0 299 575 e EP 0 313 146.

Os níveis de argila de esmectita estão normalmente na faixa de 5 % a 15 %, mais preferivelmente de 8 % a 12 % em peso, com o material sendo adicionado como um componente misturado a seco ao resto da formulação. Os agentes orgânicos de amaciamento de tecido tais como as aminas terciárias insolúveis em água ou os materiais de di-amida de cadeia longa são incorporados em níveis de 0,5 % a 5 % em peso, normalmente de 1 % a 3 % em peso, embora os materiais de óxido de polietileno de alto peso molecular e os materiais catiônicos solúveis em água seja adicionados em níveis de 0,1 % a 2 %, normalmente de 0,15 % a 1,5 % em peso. Estes materiais são normalmente adicionados à porção secada por pulverização da composição, embora em alguns exemplos possa ser mais conveniente adiciona-los como um particulado misturado a seco ou pulverizando-os como um líquido fundido sobre os outros componentes sólidos da composição. AGENTES POLIMÉRICOS INIBIDORES DA TRANSFERÊNCIA DE PIGMENTO

As composições detergentes de acordo com a presente invenção também podem compreender de 0,001 % a 10 %, preferivelmente de 0,01 % a 2 %, mais preferivelmente de 0,05 % a 1 % em peso dos agentes poliméricos inibidores da transferência de pigmento. Os ditos agentes poliméricos inibidores da transferência de pigmento são normalmente incorporados nas composições detergentes para inibir a transferência de pigmentos dos tecidos coloridos para os tecidos lavados junto com eles. Estes polímeros têm a capacidade de complexar ou adsorver os pigmentos fugitivos lixiviados dos tecidos pigmentados antes que os pigmentos tenham a oportunidade de se ligarem a outros artigos na lavagem.

Os agentes poliméricos inibidores da transferência de pigmento especialmente adequados são polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona e de N-vinilimidazol, polímeros de polivinilpirrolidona, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazóis ou misturas destes. A adição de tais polímeros também acentua o desempenho das enzimas de acordo com a invenção.

USO NA INDÚSTRIA DE POLPA DE PAPEL

Além disso, é considerado que a mananase da presente invenção é utilizável nos processos de branqueamento isentos de cloro para polpa de papel (polpas químicas, polpas semíquímicas, polpas mecânicas ou polpas de kraft) de modo a aumentar o seu brilho. Diminuindo ou eliminando deste modo a necessidade para peróxido de hidrogênio no processo de branqueamento.

USO NAS INDÚSTRIAS DE PROCESSAMENTO TÊXTIL E DE FIBRA CELULÓSICA A mananase da presente invenção pode ser usada em combinação com outras enzimas que degradem carboidrato (por exemplo, xiloglicanase, xilanase e várias pectinases) para a preparação de fibras ou para a limpeza de fibras em combinação com detergentes.

No presente contexto, o termo “material celulósico” é intencionado significar fibras, tecidos costurados ou não costurados, incluindo malhas, tecido transado, brim, fios e atoalhados, feitos de algodão, misturas de algodão ou celulósicos naturais ou biossintéticos (por exemplo, originários de fibras de celulose que contenham xilana tais como de polpa de madeira) ou misturas destes. Os exemplos de misturas são misturas de algodão ou rayon/viscose com um ou mais materiais associados tais como lã, fibras sintéticas (por exemplo, fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de álcool polivinílico, fibras de cloreto de polivinila, fibras de cloreto de polivinilideno, fibras de poliuretano, fibras de poli uréia, fibras de aramide) e fibras que contenham celulose (por exemplo, rayon/viscose, rami, cânhamo, fibra de linho/tecido de linho, juta, fibras de celulose acetato, lyocell). O processamento de material celulósico para a indústria têxtil, como por exemplo fibra de algodão, em um material pronto para a confecção de peças de roupa envolve várias etapas: a fiação da fibra em um fio; a construção do tecido trançado ou costurado, a partir do fio e a preparação subsequente, operações de tingimento e acabamento. Os artigos de tecido são construídos trançando-se fios de enchimento entre uma série de fios urdidos; os fios podem ser de dois tipos diferentes.

Desengomadura: a goma polimérica como por exemplo, manana, amido é adicionada antes da tecedura de modo a aumentar a velocidade da urdidura; este material deve ser removido antes dos procedimentos subsequentes. A enzima da invenção é utilizável para a remoção da goma que contém manana.

DEGRADAÇÃO DOS ESPESSANTES

As galactomananas tais como a goma guar e a goma de alfaiToba são amplamente usadas como agentes espessantes, por exemplo, em alimentos e em pasta de impressão para a impressão artigos têxteis tais como impressões de camisetas. A enzima ou a preparação de enzima de acordo com a invenção podem ser usados para reduzir a viscosidade de por exemplo, alimentos residuais no equipamento de processamento e deste modo facilitar a limpeza após o processamento. Além disso, é considerado que a enzima ou a preparação de enzima é utilizável para reduzir a viscosidade da pasta de impressão, facilitando deste modo a lavagem da pasta de impressão em excesso após a estampagem dos artigos têxteis.

DEGRADAÇÃO OU MODIFICAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL A enzima ou a preparação de enzima de acordo com a invenção é preferivelmente usada como um agente para a degradação ou modificação de material contendo manana, galactomanana, glicomanana ou galactoglicomanana de origem vegetal. Os exemplos de tais materiais são goma guar e goma de alfarroba. A mananase da invenção pode ser usada na modificação das propriedades fisicoquímicas de material derivado de vegetal, tais como a viscosidade. Por exemplo, a mananase pode ser usada para reduzir a viscosidade de alimentação ou alimento que contenha manana e para promover o processamento de material viscoso que contenha manana e para promover o processamento de material que contenha manana viscosa. EXTRAÇÃO DE CAFÉ A enzima ou a preparação de enzima da invenção também podem ser usadas para hidrolisar as galactomananas presentes em um extrato líquido de café, preferivelmente de modo a inibir a formação de gel durante a secagem por congelamento do café (instantâneo). Preferivelmente, a mananase da invenção é imobilizada de modo a reduzir o consumo de enzima e evitar a contaminação do café. Este uso é ainda divulgado na EP-A-676 145. USO NA FRATURA DE UMA FORMAÇÃO SUBTERRÂNEA (PERFURAÇÃO DE PETRÓLEO) Além disso, é considerado que a enzima da presente invenção seja utilizável como um rompedor de enzima como divulgado nas Patentes US N— 5.806.597, 5.562.160, 5.201.360 e 5.067.566 concedida à BJ Services Company (Houston, TX, U.S.A.), todas as quais são aqui incorporadas por referência.

Consequentemente, a mananase da presente invenção é utilizada em um método de fraturar uma formação subterrânea em um poço em que um fluído de fraturação passível de formar gel é primeiro formado misturando-se um fluído aquoso, um polímero hidratável, um agente de reticulação adequado para reticular o polímero hidratável para formar um gel de polímero e um rompedor de enzima, isto é a enzima da invenção. O gel polimérico reticulado é bombeado para dentro do poço sob pressão suficiente para quebrar a formação em tomo deste. O rompedor de enzima é introduzido para degradar o polímero reticulado com o tempo para reduzir a viscosidade do fluído de modo que o mesmo pode ser bombeado da formação de volta para a superfície do poço. O rompedor de enzima pode ser o ingrediente de um fluído de rompimento ou um complexo de rompedor-polímero reticulado que ainda compreenda um polímero hidratável e um agente de reticulação. O fluído ou complexo de fraturamento pode ser um gel ou pode ser passível de formar gel. O complexo é utilizável em um método para usar o complexo em um fluído de fraturamento para fraturar uma formação subterrânea que esteja em tomo de um poço pelo bombeamento do fluído para uma localização desejada do poço sob pressão suficiente para fraturar a formação subterrânea em tomo deste. O complexo pode ser mantido em um estado substancialmente não reativo pela manutenção de condições específicas de pH e de temperatura, até um tempo no qual o fluído c colocado no poço e a fratura desejada é completada. Uma vez que a fratura esteja completada, as condições específicas nas quais o complexo é inativo não são mais mantidas. Quando as condições mudam suficientemente, o complexo toma-se ativo e o rompedor inicia a catalisar a degradação do polímero motivando que o fluído de fraturamento tome-se suficientemente fluídico para ser bombeado da formação subterrânea para a superfície do poço.

MATERIAIS E MÉTODOS

ENSAIOS PARA TESTE DE ATIVIDADE

Um polipeptídeo da invenção que tenha atividade de mananase pode ser testado quanto a atividade de mananase de acordo com procedimentos de teste padrão conhecidos na técnica, tais como pela aplicação de uma solução a ser testada a furos de 4 mm de diâmetro feitos em placas de agar contendo 0,2 % de galactomanana AZCL (alfarroba), isto é substrato para o ensaio de endo-1,4-beta-D-mananase disponível como CatN-I-AZGMA da companhia Megazyme (endereço da Megazyme na Internet: http://www.megazyme.com/Purchase/index.html).

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CATALÍTICA (ManU) DA MANANASE

ENSAIO COLORIMÉTRICO

Substrato: 0,2 % de AZCL-Galactomanana (Megazyme, Austrália) de alfarroba em tampão 0,1 M de glicina, pH 10,0. O ensaio é realizado em um micro tubo de Eppendorf de 1,5 ml em um termomisturador com agitação e controle de temperatura a 40° C. A incubação de 0,750 ml de substrato com 0,05 ml de enzima por 20 minutos, interrompida por centrifugação durante 4 minutos a 15.000 ppm. A cor do sobrenadante é medido em 600 nm em uma cubeta de um cm.

Uma ManU (unidades de mananase) dá 0,24 abs em 1 cm. CEPAS E ORGANISMO DOADOR O Bacillus sp. 1633 mencionado acima compreende a beta- 1,4-mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 1. O E. coli DSM 12197 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-1,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 1). O Bacillus agaradhaerens NCIMB 40482 mencionado acima compreende a beta-l,4-mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 5. O E. coli DSM 12180 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-l,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 5). O Bacillus sp. AAI12 mencionado acima compreende a beta- 1.4- mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 9. O E. coli DSM 12433 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-1,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 9). O Bacillus halodurans mencionado acima compreende a beta- 1.4- mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 11. O E. coli DSM 12441 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-1,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 11). O Humicola insolens mencionado acima compreende a beta- 1.4- mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 13. O E. coli DSM 9984 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-l,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 13). O Bacillus sp. AA349 mencionado acima compreende a beta- 1.4- mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 15. O E. coli DSM 12432 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-l,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 15). O E. coli DSM 12847 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-l,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 17). O E. coli DSM 12848 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-l,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 19). O Bacillus clausii mencionado acima compreende a beta-1,4-mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 21. O E. coli DSM 12849 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-l,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 21). Ο Ε. coli DSM 12850 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-1,4-mananase da invenção(SEQ ID NO: 23) O Bacillus sp. compreende a beta-1,4-mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 25. O E. coli DSM 12846 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-l,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 25). O Bacillus sp. compreende a beta-l,4-mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 27. O E. coli DSM 12851 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-1,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 27). O Bacillus licheniformis mencionado acima compreende a beta-1,4-mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 29. O E. coli DSM 12852 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-l,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 29). O Bacillus sp. compreende a beta-l,4-mananase que codifica a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 31. O E. coli DSM 12436 compreende o plasmídeo contendo o DNA que codifica a beta-1,4-mananase da invenção (SEQ ID NO: 31).

Cepa E. coli: Células de E. coli SJ2 (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315 a 4321), foram preparadas e transformadas pela eletroporação usando-se um eletroporador Gene PulserTM a partir de BIO-RAD como descrito pelo fornecedor. B. subtilis PL 2306. Esta cepa é o B. subtilis DN 1885 com os genes apr e npr rompidos (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315 a 4321), rompidos na unidade transcricional. do gene de celulase do Bacillus subtilis conhecido, que resulta em células de celulase negativas O rompimento foi realizado essencialmente como descrito em (Eds. A. L. Sonenshein, J. A. Hoch e Richard Losick (1993) Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bactéria, American Society for microbiology, p. 618).

As células competentes foram preparadas e transformadas como descrito por Yasbin, R. E., Wilson, G. A. e Young, F, E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol., 121: 296 a 304. MÉTODOS GERAIS DE BIOLOGIA MOLECULAR: A menos de que de outro modo estabelecido, todas as manipulações e transformações de DNA foram realizadas usando-se métodos padrão de biologia molecular (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al., (eds.) “Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. e Cutting, S. M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990).

As enzimas para as manipulações de DNA foram usadas de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo, endonucleases de restrição, ligases, etc. são obteníveis da New England Biolabs, Inc.). PLASMÍDEOS pSJ1678: (ver o Pedido de Patente International publicado como WO 94/19454). pBK-CMV (Stratagene inc., La Jolla Ca.) pMOL944. Este plasmídeo é um derivado do pUBllO, contendo essencialmente elementos que tomam o plasmídeo propagável no Bacillus subtilis, o gene de resistência à canamicina e tendo um promotor forte e um peptídeo de sinal clonado a partir do gene amyL do B. licheníformis ATCC14580. O peptídeo de sinal contém um sítio SacII que o toma conveniente para clonar o DNA que codifica a parte madura de uma proteína em fusão com o peptídeo de sinal. Isto resulta na expressão de uma Pré-proteína que é direcionada contra o exterior da célula. O plasmídeo foi construído por meio de engendramento genético comum e é resumidamente descrito a seguir. CONSTRUÇÃO DE pMOL944: O plasmídeo pUBllO (McKenzie,T. et al, 1986, Plasmid 15: 93 a 103) foi digerido com a enzima de restrição única Ncil. Um fragmento de PCR amplificado a partir do promotor amyL codificado no plasmídeo pDN1981 (P, L. Jorgensen et al, 1990, Gene, 96, p37 a 41.) foi digerido com Ncil e inserido no pUBl 10 digerido por Ncil para dar o plasmídeo pSJ2624.

Os dois iniciadores de PCR usados têm as seguintes sequências: U LWN5494 5’-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3’ # LWN5495 5’-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGT C G ACCT GC AGAAT G AGGC AGC AAGAAGAT - 3 ’ O iniciador #LWN5494 insere um sítio Notl no plasmídeo. O plasmídeo pSJ2624 foi depois digerido com Saci e Notl e um novo fragmento de PCR amplificado no promotor amyL codificado no pDN1981 foi digerido com Saci e Notl e este fragmento de DNA foi inserido no pSJ2624 digerido por Sacl-Notl para dar o plasmídeo pSJ2670, Esta clonagem substitui a primeira clonagem do promotor amyL com o mesmo promotor mas na direção oposta. Os dois iniciadores usados para a amplificação por PCR têm as seguintes sequências: #LWN593 8 5 ’-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTG TCGACCTGC AGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3 ’ #LWN5939 5’-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3’ O plasmídeo pSJ2670 foi digerido com as enzimas de restrição PstI e Bell e um fragmento de PCR amplificado § partir de uma sequência clonada de DNA que codifica a alcalino amilase SP722 (Patente # W09526397-A1) foi digerido com PstI e Bell e inserido para dar o plasmídeo pMOL944. Os dois iniciadores usados para a amplificação por PCR têm a seguinte sequência: #LWN7864 5 ’ -AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3 ’ #LWN7901 5 ’ - AACTGC AGCCGCGGC AC ATC ATAATGGGAC AAATG GG-3’ O iniciador #LWN7901 insere um sítio SacII no plasmídeo. CULTIVO DE CEPAS DOADORAS E ISOLAÇÃO DE DNA GENÔMICO A cepa relevante de Bacillus, por exemplo, Bacülus sp. 1633 foi cultivado em TY com pH ajustado para aproximadamente pH 9,7 pela adição de 50 ml de Sesquicarbonato de sódio 1 M por 500 ml de TY. Após 24 horas de incubação a 30° C e 300 rpm, as células foram colhidas e o DNA genômico foi isolado pelo método descrito por Pitcher et ah, [Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J., Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate; Lett. Appl. Microbiol. 1989 8 151 a 156].

MEIO TY (como descrito em Ausubel F. M. et al.f (eds.) “Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995). LB agar (como descrito em Ausubel F. M. et al, (eds.) “Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995). LBPG é o LB agar suplementado com 0,5 % de glicose e 0,05 M de fosfato de potássio, pH 7,0. AZCL-galactomanana é adicionado ao LBPG-agar para 0,5 % de AZCL-galactomanana, é da Megazyme, Austrália.

Meio BPX é descrito na EP 0 506 780 (WO 91/09129). NZY agar (por litro) 5 g de NaCl, 2 g de MgS04, 5 g de extrato de levedura, 10 g de amina NZ (hidrolizato de caseína), 15 g de agar; água desionizada adicionada para 1 litro, pH ajustado com NaOH para pH 7,5 e autoclave.

Caldo NZY (por litro) 5 g de NaCl, 2 g de MgS04, 5 g de extrato de levedura, 10 g de amina NZ (hidrolizato de caseína), água desionizada adicionada para 1 litro, pH ajustado com NaOH para pH 7,5 e autoclave. NZY Top Agar (por litro) 5 g de NaCl, 2 g de MgS04, 5 g de extrato de levedura, 10 g de amina NZ (hidrolizato de caseína), 0,7 % (p/v) de agarose; água desionizada adicionada para 1 litro, pH ajustado com NaOH para pH 7,5 e autoclave.

Os seguintes exemplos não limitantes ilustram a invenção. EXEMPLO 1 Mananase derivada do Bacillus sp (1633) Construção de uma biblioteca genômica do Bacillus sp. 1633 no vetor lambdaZAPExpress O DNA genômico do Bacillus sp. 1633 foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3A e fracionada no tamanho pela eletroforese em um gel de agarose a 0,7 % (SeaKem agarose, FMC, USA). Os fragmentos entre 1,5 e 10 kb no tamanho foram isolados e concentrados a uma faixa de DNA rodando-se os fragmentos de DNA retrogradamente em um gel de agarose a 1,5 % seguido pela extração dos fragmentos das fatias de gel de agarose usando-se o conjunto de extração de gel Qiaquick de acrodo com as instruções do fabricante (Qiagen Inc., USA). Para construir uma biblioteca genômica, ca. 100 ng de DNA fracionado, purificado do acima foi ligado com 1 ug da subdivisão do vetor lambdaZAPexpress desfosforilado, clivado por BamHI (Stratagene, La Jolla CA, USA) por 24 horas a + 4° C, de acordo com as instruções do fabricante. Uma alíquota de 3 ul da mistura de ligação foi empacotada diretamente usando-se um extrato de empacotamento GigaPacklII Gold (Stratagene, USA) de acrodo com as instruções dos fabricantes (Stratagene). A biblioteca genômica do fago lambdaZAPExpress foi titulada usando-se a cepa MRE- do E. coli XLl-Blue da Stratagene (La Jolla, USA). A biblioteca genômica não amplificada compreendeu de 3 xlO7 unidades formadoras de placa (pfu) com um fundo de vetor de menos do que 1 %. AVALIAÇÃO QUANTO AOS CLONES DE BETA-MANANASE PELA EXPRESSÃO FUNCIONAL EM lambdaZAPExpress Aproximadamente 5.000 unidades formadoras de placa (pfu) da biblioteca genômica foram colocadas em placa sobre placas de NZY-agar contendo 0,1 % de AZCL-galactomanana (MegaZyme, Austrália, cat. no. I-AZGMA), usando-se o E. coli XLl-Blue MRF’ (Stratagene, USA) como um hospedeiro, seguido pela incubação das placas a 37° C por 24 horas. Os clones lambda positivos em mananase foram identificados pela formação de halos azuis de hidrólise em tomo dos clones de fago positivo. Estes foram recuperados pela avaliação das placas retirando a parte central das fatias de TOP-agar contendo as placas de interesse em 500 ul de tampão SM e 20 ul de clorofórmio. Os clones lambdaZAPExpress positivos em mananase foram purificados de placa colocando-se em placa uma alíquota do estoque fago e tirado sobre placas de NZY contendo 0,1 % de AZCL-galactomanana como acima. Os clones lambda positivos em mananase, únicos foram retirados em 500 ul de tampão SM e 20 ul de clorofórmio e purificados por mais uma rodada de colocação em placa como descrito acima.

EXCISÃO IN VIVO DE CLONE ÚNICO DOS FAGOMÍDEOS DOS CLONES lambdaZAPExpress POSITIVOS EM MANANASE

As células XLl-Blue E. coli (Stratagene, La Jolla Ca.) foram preparadas e recolocadas em suspensão em 10 nM de MgS04 como recomendado pela Stratagene (La Jolla, USA). Alíquotas de 250 ul dos estoques de fago puro dos clones positivos em mananase foram combinadas em tubos Falcon 2059 com 200 ul de células XLl-Blue MRF’ (OD600 = 1,0) e > IO6 pfu/ml do fago auxiliar ExAssist Ml3 (Stratagene) e as misturas foram incubadas a 37° C por 15 minutos. Três ml do caldo NZY foram adicionados a cada tubo e os tubos foram incubados a 37° C por 2,5 horas. Os tubos foram aquecidos a 65 °C por 20 minutos para matar as células de E. coli e os bacteriofagos lambda; os fagomídeos sendo resistentes ao aquecimento. Os tubos foram girados a 3000 rpm por 15 minutos para remover os escombros celulares e os sobrenadantes foram decantados em tubos Falcon 2059 limpos. As alíquotas dos sobrenadantes contendo os fagomídeos de filamento único excisados foram usados para infectar 200 ul de células XLOLR do E. coli (Stratagene, OD600 = 1,0 em MgS04 10 mM) pela incubação a 37° C por 15 minutos. 350 ul de caldo NZY foi adicionado às células e os tubos foram incubados por 45 minutos a 37° C. As alíquotas das células foram colocadas em placa sobre placas de agar com LB canamicina e incubadas por 24 horas a 37° C. Cinco colônias únicas excisadas foram novamente riscadas sobre placas de agar com LB canamicina contendo 0,1 % de AZCL-galactomanana (MegaZyme, Austrália). Os clones fagomídeos positivos em mananase foram caracterizados pela formação de halos azuis de hidrólise em tomo das colônias positivas. Estas foram ainda analisadas por digestões em enzimas de restrição do DNA fagomídeo isolado (conjunto QiaSpin, Qiagen, USA) com EcoRI, PstI, EcoRI-PstI e HindlII seguido por eletroforese em gel de agarose, ANÁLISE DE SEQUÊNCIA DE NUCLETOTÍDEO A sequência de nucleotídeo do clone genômico de beta-1,4-mananase pBXM3 foi determinado a partir de ambos os filamentos pelo método de terminação de cadeia de didesóxi (Sanger, F., Nicklen, S. e Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 74, 5463 a 5467) usando-se 500 ng de padrão purificado Qiagen (Qiagen, USA) o conjunto de sequenciamento de ciclo de terminal de Taq desóxi (Perkin-Elmer, USA), terminadores fluorescentemente rotulados e 5 pmol de cada um dos iniciadores poliligadores pBK-CMV (Stratagene, USA) ou iniciadores oligonucleotídicos sintéticos. A análise dos dados de sequência for realizada de acordo com Devereux et al, 1984 (Devereux, JHaeberli, P., e Smithies, O. (1994) Nucleic Acids Res. 12, 387 a 395).

ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIA

Um alinhamento múltiplo de sequência da família da glicoidrolase 5-beta-l,4-mananase do Bacillus sp. 1633 da presente invenção (isto é, a SEQ ID NO: 2), bacillus circulam (GenBank/EMBL acesso n° 066185), Vibrio sp. (acesso n° 069347), Streptomyces lividans (acesso n° P51529) e Caldicelulosiruptor saccharolyticus (acesso n° P22533). O alinhamento múltiplo de sequência foi criado usando-se o programa PileUp da GCG Wisconsin software package, versão 8.1; com penalidade de criação gap de 3,00 e penalidade de extensão gap de 0,10.

SIMILARIDADES DE SEQUÊNCIA A sequência de aminoácido deduzida da família 5-beta-l,4-mananase da presente invenção clonada a partir do Bacillus sp. 1633 apresenta 75 % de similaridade e 60,1 % de identidade de sequência à beta- 1.4- mananase do Bacillus circulans (GenBank/EMBL acesso n° 066185), 64,4 % de similaridade e 44,6 % de identidade à beta-1,4-mananase do Vibrio sp. (acesso n° 069347), 63 % de similaridade e 43,2 % de identidade à beta- 1.4- mananase do Streptomyces lividans (acesso nü P51529), 52,5 % de similaridade e 34,4 % de identidade de sequência à beta-1,4-mananase do Caldicellulosiruptor (acesso n° P2253). As sequências foram alinhadas usando-se o programa GAP da GCG Wisconsin software package, versão 8.1; com penalidade de criação gap de 3,00 e penalidade de extensão gap de 0,10. CLONAGEM DO GENE DE MANANASE DO BACILLUS sp. (1633) A. S UB CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA ENZIMA DE MANANASE DE NÚCLEO CATALÍTICO NO B. SUBTILIS: A sequência de DNA que codifica a mananase da invenção foi amplificada por PCR usando-se o conjunto de iniciador de PCR que consiste dos dois oligo nucleotídeos seguintes: BXM2, sup erior. S ac II 5’-GTT GAG AAA GCG GCC GCC TTT TTT CTA TTC TAC AAT CAC ATT ATC-3’ BXM2.núcleo.inferior.Notl 5’-GAC GAC GTA CAA GCG GCC GCT CAC TAC GGA GAA GTT CCT CCA TC A G-3’ Os sítios de restrição SacIT e Notl estão sublinhados. O DNA cromossômico isolado do Bacillus sp. 1633 como descrito acima foi usado como padrão em uma reação de PCR usando-se Amplitaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) de acordo com as instruções dos fabricantes. A reação de PCR foi ajustada em tampão de PCR (10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM de KC1, 1,5 mM de Mg Cl2, 0,01 % (p/v) de gelatina) contendo 200 μΜ de cada dNTP, 2,5 unidades de AmpliTaq polimerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA) e 100 pmol de cada iniciador.

As reações de PCR foram realizadas usando-se um ciclador térmico de DNA (Landgraf, Alemanha). Uma incubação a 94° C por 1 minuto seguido por trinta ciclos de PCR realizados usando-se um perfil de ciclo de desnaturação a 94° C por 30 segundos, cosendo-se a 60° C por 1 minuto, e extensão a 72° C por 2 minutos. Alíquotas de cinco μΐ do produto da amplificação foram analisados por eletroforese em 0,7 % de géis de agarose (NuSieve, FMC). O aparecimento de um tamanho de fragmento de DNA de 1,0 kb indicou a amplificação apropriada do segmento de gene. SUBCLONAGEM DO FRAGMENTO DE PCR: Alíquotas de quarenta e cinco μΐ dos produtos de PCR gerados como descrito acima foram purificados usando-se o conjunto de purificação de PCR QIAquick (Qiagen, USA) de acordo com as instruções dos fabricantes. O DNA purificado foi eluído em 50 μΐ de Tris-FfCl 10 mM, pFI 8,5. 5 pg de pMOL944 e vinte e cinco μΐ do fragmento purificado de PCR foram digeridos com SacII e Notl, submetidos a eletroforese em géis de agarose a 0,8 % abaixo da temperatura de formação de gel (SeaPlaque CTGF, FMC), os fragmentos relevantes foram excisados dos géis e purificados usando-se o conjunto de extração QIAquick Gel (Qiagen, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de DNA isolado por PCR foi depois ligado ao pMOL944 digerido e purificado por SacII-NotI. A ligação foi realizada durante a noite a 16o C usando-se 0,5 \xg de cada fragmento de DNA, 1 U de T4 DNA ligase e tampão T4 ligase (Boehringer Mannheim, Alemanha). A mistura de ligação foi usada para transformar o B. subtilis PL2306 competente. As células transformadas forma colocadas em placa sobre placas de LBPG-10 pg/ml de canamicina-agar. Após 18 horas de incubação a 37° C, as colônias foram semeadas nas placas. Diversos clones foram analisados isolando-se o DNA plasmídico do caldo de cultura da noite anterior.

Um tal clone positivo foi novamente riscado várias vezes sobre placas de agar como usado acima, este clone foi chamado MB748. O clone MB748 foi cultivado durante a noite em TY-10 pg/ml de canamicina a 37° C e no dia seguinte 1 ml das células foram usadas para isolar o plasmídeo das células usando-se o conjunto Qiaprep Spin Plasmid Miniprep #27106 de acordo com as recomendações dos fabricantes para as preparações do plasmídeo de B. subtilis. Este DNA foi sequenciado e revelou a sequência de DNA que corresponde à parte madura da mananase (que corresponde às posições 91 a 990 na sequência de DNA anexa SEQ ID NO: 1 e às posições de 31 a 330 na sequência de proteína anexa SEQ ID NO: 2) com o códon de parada introduzido substituindo o resíduo de aminoácido n- 331 que corresponde às posições de pares de base de 1201 a 1203 na SEQ ID NO: 1. B. SUBCLONAGEM E EXPRESSÃO DE MANANASE MADURA DE COMPRIMENTO COMPLETO NO B. SUBTILIS. A sequência de DNA que codifica a sequência de DNA da invenção foi amplificada por PCR usando-se o conjunto de iniciador de PCR que consiste destes dois oligo nucleotídeos: BXM2.superior.SacII

5 ’-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AAT TCC GGA TTT TAT GTA AGC GG-3 ’ BXM2.inferior.NotI 5’-GTT GAG AAA GCG GCC GCC TTT TTT CTA TTC TAC AAT CAC ATT ATC-3’ Os sítios de restrição SacII e Notl estão sublinhados. O DNA cromossômico isolado do Bacillus sp. (1633) como descrito acima foi usado como padrão em uma reação de PCR usando-se Amplitaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) de acordo com as instruções dos fabricantes. A reação de PCR foi ajustada em tampão de PCR (10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM de KC1, 1,5 mM de Mg Cl2, 0,01 % (p/v) de gelatina) contendo 200 μΜ de cada dNTP, 2,5 unidades de AmpliTaq polimerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA) e 100 pmol de cada iniciador.

As reações de PCR foram realizadas usando-se um ciclador térmico de DNA (Landgraf, Alemanha). Uma incubação a 94° C por 1 minuto seguido por trinta ciclos de PCR realizados usando-se um perfil de ciclo de desnaturação a 94° C por 30 segundos, cosendo-se a 60° C por 1 minuto, e extensão a 72° C por 2 minutos. Alíquotas de cinco μΐ do produto da amplificação foram analisados por eletroforese em 0,7 % de géis de agarose (NuSieve, FMC). O aparecimento de um tamanho de fragmento de DNA de 1,5 kb indicou a amplificação apropriada do segmento de gene. SUBCLONAGEM DO FRAGMENTO DE PCR: Alíquotas de quarenta e cinco μΐ dos produtos de PCR gerados como descrito acima foram purificados usando-se o conjunto de purificação de PCR QIAquick (Qiagen, USA) de acordo com as instruções dos fabricantes. O DNA purificado foi eluído em 50 μΐ de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. 5 de pMOL944 e vinte e cinco μΐ do fragmento purificado de PCR foram digeridos com SacII e Notl, submetidos a eletroforese em géis de agarose a 0,8 % abaixo da temperatura de formação de gel (SeaPlaque GTG, FMC), os fragmentos relevantes foram excisados dos géis e purificados usando-se o conjunto de extração QIAquick Gel (Qiagen, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de DNA isolado por PCR foi depois ligado ao pMOL944 purificado e digerido por SacII-NotI. A ligação foi realizada durante a noite a 16° C usando-se 0,5 pg de cada fragmento de DNA, 1 U de T4 DNA ligase e tampão T4 ligase (Boehringer Mannheim, Alemanha). A mistura de ligação foi usada para transformar o B. subtilis PL2306 competente. As células transformadas forma colocadas em placa sobre placas de LBPG-10 pg/ml de canamicina-agar. Após 18 horas de incubação a 37° C, as colônias foram semeadas nas placas. Diversos clones foram analisados isolando-se o DNA plasmídico do caldo de cultura da noite anterior.

Um tal clone positivo foi novamente riscado várias vezes sobre placas de agar como usado acima, este clone foi chamado MB643. O clone MB643 foi cultivado durante a noite em TY-10 pg/ml de canamicina a 37° C e no dia seguinte 1 ml das células foi usado para isolar o plasmídeo das células usando-se o conjunto Qiaprep Spin Plasmid Miniprep #27106 de acordo com as recomendações dos fabricantes para as preparações do plasmídeo de B. subtilis. Este DNA foi sequenciado e revelou a sequência de DNA que corresponde à parte madura da mananase posição de 317 a 1693 na SEQ ID NO: 1 e 33 a 490 na SEQ ID NO: 2. O clone MB643 foi cultivado em 25 x 200 ml de meio BPX com 10 pg/ml de canamicina em frascos de agitação com duas placas de deflexão de 500 ml por 5 dias a 37° C a 300 rpm. A sequência de DNA que codifica o domínio do terminal C de função desconhecida do resíduo de aminoácido n- 341 até o resíduo de aminoácido η- 490 apresenta alta homologia a um domínio denominado XI8 de uma mananase conhecida. Este XI8 é encontrado no EMBL entrada AB007123 de: Yoshida S., Sako Y., Uchida A.: “Cloning, sequence analysis, and expression in Escherichia coli of a gene coding for an enzyme from Bacillus circulans K-l that degrades guar gum” em Biosci. Biotechnol. Biochem. 62: 514 a 520 (1998). Este gene codifica o peptídeo, de sinal (aa 1 a 34), o núcleo catalítico de uma família de 5 mananase (aa 35 a 335), um ligador (aa 336 a 362) e finalmente o domínio XI8 de função não conhecida (aa 363 a 516).

Este domínio X18 também é encontrado na beta-mananase do Bacillus subtilis no banco de dados de proteína Suiço entrada P55278 que divulga um gene que codifica um peptídeo de sinal (aa 1 a 26), um núcleo catalítico da família de 26 mananases (aa 27 a 360) e este domínio de proteína XI8 de função não conhecida (aa 361 a 513); (Cloning and sequencing of beta-mannanase gene from Bacillus subtilis NM-39, Mendoza NS; Arai M; Sugimoto K; Ueda M; Kawaguchi T; Joson LM, Phillippines. In Biochimica Et Biophysica Acta Vol. 1243, N- 3 pp. 552 a 554 (1995)). EXEMPLO 2 expressão, purificação e caracterização da mananase do Bacillus sp. 1633 O clone MB748 obtido como descrito no Exemplo 1 e sob o título Materiais e Métodos foi cultivado em 25 x 200 ml de meio de BPX com 10 pg/ml de canamicina em frascos de agitação com dois defletores de 500 ml por cinco dias a 37° C a 300 rpm. 4500 ml do fluído de cultura do frasco de agitação do clone MB748 foi coletado e o pH foi ajustado para 5,6. 100 ml do agente catiônico (10 % C521) e 180 ml de agente aniônico (Al 30) foram adicionados durante a agitação para floculação. O material floculado foi separado por centrifugação usando-se uma centrífuga Sorval RC 3B a 9000 rpm por 20 minutos a 6o C. O sobrenadante foi clarificado usando-se filtros de vidro Whatman GF/D e C e finalmente concentrado em um filtron com um corte de lOkDa. 700 ml deste concentrado foi ajustado ao pH 7,5 usando-se hidróxido de sódio. A solução clara foi aplicada à cromatografia de troca aniônica usando-se uma coluna Q-Sepharose de 1000 ml equilibrada com 50 mmoles de Tris pH 7,5. A atividade de mananase ligada foi eluída em 1100 ml usando-se um gradiente de cloreto de sódio. Este foi concentrado a 440 ml usando-se uma membrana Filtron. Para se obter a mananase altamente pura, o concentrado foi passado em uma coluna Superdex 200 equilibrada com acetato de sódio 0,1 M, pH 6,0. A enzima pura deu uma faixa única no SDS-PAGE com um peso molecular de 34 kDa. CINÉTICA DE ESTADO FIXO USANDO-SE GOMA DE ALFARROBA: O teste foi realizado usando-se quantidades diferentes do substrato de goma de alfarroba, incubando-se por 20 minutos a 40° C no pFl 10 em tampão de glicina 0,1 M, seguido pela determinação da formação de açúcares redutores. A glicose foi usada como padrão para o cálculo da formação micromolar de açúcar redutor durante o estado fixo. O seguinte dado foi obtido para a mananase altamente purificada da invenção: Kcat de 467 por segundo com um desvio padrão de 13; KM de 0,7 com um desvio padrão de 0,07. O programa de computador grafit por Leatherbarrow da Erithacus Software U. K. foi usado para os cálculos. O açúcar redutor foi determinado usando-se o método PHBAH (Lever, M. (1972), A new reaction for colormetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. 47, 273 a 279.) A seguinte sequência de terminal N da proteína purificada foi determinada: ANSGFYVSGTTLYDANG.

Estabilidade: a mananase foi completamente estável entre o pH 6,0 e 11 após a incubação por dois dias na temperatura ambiente A enzima precipitou em pH baixo. O perfil de atividade de pH mostra que a enzima é mais do que 60 % ativa entre o pH 7,5 e o pH 10. O ótimo de temperatura foi descoberto ser 50° C no pH 10. A calorimetría de varredura diferencial DSC deu 66° C como o ponto de fusão no pH 6,0 em tampão de acetato de sódio indicando que esta enzima de mananase é termoestável.

Propriedades imunológicas: o soro monoespecífico policlonal de coelho foi incitado contra a mananase clonada altamente purificada usando-se técnicas convencionais na companhia Dinamarquesa DAKO. O soro formou um bom e único precipitado em géis de agarose com a mananase bruta não purificada da invenção. EXEMPLO 3 Uso da enzima do exemplo 2 em detergentes Usando-se detergentes comerciais ao invés de tampão e incubação por 20 minutos a 40° C com 0,2 % de AZCL-galactomanana (Megazyne, Austrália) do grau de alfarroba como descrito acima seguido pela determinação da formação de cor azul, a enzima obtida como descrito no Exemplo 2 foi ativa no detergente em pó Europeu Ariel Futur com 60 % de atividade relativa, no detergente líquido Europeu Ariel Futur com 80 % de atividade relativa, no pó US Tide com 45 % de atividade relativa e no detergente líquido US Tide com 37 % de atividade relativa em relação à atividade relativa em tampão de glicina. Nestes testes, a concentração de detergente foi como recomendada nos pacotes de detergente comercial e a água de lavagem foi água de torneira tendo 18 graus de dureza Alemã sob condições Européias (Ariel Futur) e 9 graus sob as condições US (US Tide). EXEMPLO 4 Construção e expressão de proteína de fusão entre a mananase do Bacillus sp. 1633 (exemplos 1 E 2) e um domínio de ligação de celulose (cbd) O CBD que codifica a sequência de DNA do gene CipB do Clostridium thermocellum da cepa YS (Poole DM; Morag E; Lamed R; Bayer EA; Hazlewood GP; Gilbert HJ (1992) Identification of the cellulose-binding domain of the cellulosome subunit SI from Clostridium thermocellum YS, Fems Microbiology Letters Vol. 78, Na 2-3 pp. 181 a 186 foi previamente introduzido em um vetor pMOL 1578. O DNA cromossômico que codifica o CBD pode ser obtido como descrito em Poole DM; Morag E; Lamed R; Bayer EA; Hazlewood GP; Gilbert HJ (1992) Identification of the cellulose-binding domain of the cellulosome subunit SI from Clostridium thermocellum YS, Fems Microbiology Letters Vol. 78, N-2-3 pp. 181a 186. Uma amostra de DNA que codifica o CBD foi usada como padrão em PCR e o CBD foi clonado em um plasmídeo pMB993 apropriado com base no vetor pMOL944. O vetor pMB993 contém o CBD CipB com um ligador peptídico precedendo o CBD. O ligador consiste da seguinte sequência de peptídeo ASPEPTPEPT e está diretamente seguida pelo CBD CipB. Os aminoácidos AS são derivados da sequência de DNA que constitui o sítio de Restrição de Endonuclease Nhel, que a seguir é usado par clonar a mananase da invenção.

Mananase.Superior, SacII 5 J-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AAT TCC GGA TTT TAT GTA AGC GG-3’ Mananase. inferíor.Nhel 5’-CAT CAT GCT AGC TGT AAA AAC GGT GCT TAA TCT CG-3’ Os sítios de restrição Nhel e SacII estão sublinhados. O DNA cromossômico isolado do Bacillus sp. (1633) como descrito acima foi usado como padrão em uma reação de PCR usando-se Amplitaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) de acordo com as instruções dos fabricantes. A reação de PCR foi ajustada em tampão de PCR (10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM de KC1, 1,5 mM de Mg Cl2, 0,01 % (p/vj de gelatina) contendo 200 μΜ de cada dNTP, 2,5 unidades de AmpliTaq polimerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA) e 100 pmol de cada iniciador.

As reações de PCR foram realizadas usando-se um ciclador térmico de DNA (Landgraf, Alemanha). Uma incubação a 94° C por 1 minuto seguido por trinta ciclos de PCR realizados usando-se um perfil de ciclo de desnaturação a 94° C por 30 segundos, cosendo-se a 60° C por 1 minuto, e extensão a 72° C por 2 minutos. Alíquotas de cinco μΐ do produto da amplificação foram analisadas por eletroforese em 0,7 % de géis de agarose (NuSieve, FMC). O aparecimento de um tamanho de fragmento de DNA de 0,9 kb indicou a amplificação apropriada do segmento de gene. SUBCLONAGEM DO FRAGMENTO DE PCR: Alíquotas de quarenta e cinco μΐ dos produtos de PCR gerados como descrito acima foram purificados usando-se o conjunto de purificação de PCR QIAquick (Qiagen, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA purificado foi eluído em 50 μΐ de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. 5 μg de pMB993 e vinte e cinco μΐ do fragmento purificado de PCR foram digeridos com Sacll e Nhel, submetidos a eletroforese em géis de agarose a 0,7 % abaixo da temperatura de formação de gel (SeaPlaque GTG, FMC), os fragmentos relevantes foram excisados dos géis e purificados usando-se o conjunto de extração QIAquick Gel (Qiagen, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de DNA isolado por PCR foi depois ligado ao pMB993 purificado e digerido por SacII-Nhel. A ligação foi realizada durante a noite a 16° C usando-se 0,5 μg de cada fragmento de DNA, 1 U de tampão T4 DNA ligase e T4 ligase (Boehringer Mannheim, Alemanha). A mistura de ligação foi usada para transformar o B. subtilis PL2306 competente. As células transformadas forma colocadas em placa sobre placas de LBPG-10 pg/ml de canamicina-agar, Após 18 horas de incubação a 37° C, as colônias foram semeadas nas placas. Diversos clones foram analisados isolando-se o DNA plasmídico do caldo de cultura da noite anterior.

Um tal clone positivo foi novamente riscado várias vezes sobre placas de agar como usado acima, este clone foi chamado MB 1014. O clone MB 1014 foi cultivado durante a noite em TY-10 pg/ml de canamicina a 37° C e no dia seguinte 1 ml das células foi usado para isolar o plasmídeo das células usando-se o conjunto Qiaprep Spin Plasmid Miniprep #27106 de acordo com as recomendações dos fabricantes para as preparações do plasmídeo de B. subtilis. Este DNA foi sequenciado e revelou a sequência de DNA que corresponde à parte madura da mananase-ligador-cbd como representado na SEQ ID NO: 3 e na sequência de proteína anexa SEQ ID NO: 4.

Assim, a construção final contém os seguintes elementos de expressão relevante (amyL-promotor)-(amyL-peptídeo de sinal)-mananase-ligador-CBD.

EXPRESSÃO E DETECÇÃO DE PROTEÍNA DE FUSÃO DE MANANASE-CBD A MB 1014 foi incubada por 20 horas em meio TY a 37° C e 250 rpm. 1 ml do sobrenadante isento de célula foi misturado com 200 μΐ de Avicel 10 % (Merck, Darmstadt, Alemanha) em Millipore H20. A mistura foi deixada por Ά hora em incubação a 0o C após esta ligação da proteína de fusão BXM2-Ligador-CBD ao Avicel, o Avicel com a proteína ligada foi centrifugado 5 minutos a 5000g. O grão foi recolocado em suspensão em 100 μΐ de tampão SDS-PAGE, ebulido a 95° C por 5 minutos, centrifugado a 5000g por 5 minutos e 25 μΐ foi carregado em um gel SDS-PAGE NOVEX com 4 a 20 % de Laemmli Tris-glicina (Novex USA). As amostras foram submetidas à eletroforese em uma mini célula X cell® (NOVEX, USA) como recomendado pelo fabricante, todo o manuseio subsequente dos géis incluindo o tingimento com comassie, a retirada de pigmento e a secagem foram realizados como descrito pelo fabricante. O aparecimento de uma faixa de proteína de aproximadamente 53 kDa, verificou a expressão no B. subtilis da fusão de comprimento completo de Mananase-Ligador-CBD codificada no plasmídeo pMB1014, EXEMPLO 5 Mananase derivada do Bacillus agaradhaerens Clonagem do gene de mananase do Bacillus agaradhaerens Preparação do dna genômico A cepa do Bacillus agaradhaerens NCIMD 40482 foi propagada em meio líquido como descrito na WO 94/01532. Após 16 horas de incubação a 30° C e 300 rpm, as células foram colhidas e o DNA genômico isolado pelo método descrito por Pitcher et ah, (Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. (1989). Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol., 8, 151 a 156). CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA GENÔMICA O DNA genômico foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3A e fracionado no tamanho pela eletroforese em um gel de agarose a 0,7 %. Os fragmentos entre 2 e 7 kb no tamanho foram isolados por eletroforese sobre DEAE-papel de celulose (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1991) A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels. Anal. Biochem., 112, 295 a 298).

Os fragmentos de DNA isolados foram ligados ao DNA plasmídico pSJ1678 digerido por BamHI e a mistura de ligação foi usada para transformar o E. coli SJ2.

IDENTIFICAÇÃO DE CLONES POSITIVOS

Uma biblioteca de DNA no E. coli, construída como descrito acima foi avaliada em placas de LB agar contendo 0,2 % de AZCL-galactomanana (Megazyme) e 9 pg/ml de Cloranfenico e incubadas durante a noite a 37° C. Os clones que expressam a atividade de mananase apareceram com halos de difusão azuis. O DNA plasmídeo de um destes clones foi isolado por Qiagen plasmid spin preps em 1 ml de caldo de cultura da noite anterior (as células incubadas a 37° C em TY com 9 pg/ml de Cloramfenicol e agitação a 250 rpm).

Este clone (MB525) foi ainda caracterizado pelo sequenciamento de DNA do fragmento de DNA Sau3A clonado. O sequenciamento de DNA foi realizado por primerwalking, usando-se o conjunto de sequenciamento de ciclo de terminal desóxi Taq (Perkin-Elmer, USA), terminadores fluorescentemente rotulados e oligonucleotídeos apropriados como iniciadores. A análise dos dados de sequência foi realizada de acordo com Devereux et ai, (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387 a 395. A sequência que codifica a mananase é apresentada na SEQ ID NO: 5. A sequência de proteína derivada é apresentada na SEQ ID NO: 6.

SUBCLONAGEM E EXPRESSÃO DA MANANASE DO b. A GARADHAERENS EM B. SUBTILIS A mananase que codifica a sequência de DNA da invenção foi amplificada por PCR usando-se o conjunto de iniciadores de PCR que consiste destes dois oligo nucleotídeos: Mananase. superior. SacII 5’-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCA AGT ACA GGC TTT TAT GTT GAT GG-3’ Mananase. inferior.Notl 5’-GAC GAC GTA CAA GCG GCC GCG CTA TTT CCC TAA CAT GAT GAT ATT TTC G-3’ Os sítios de restrição SacII e NotII estão sublinhados.

O DNA cromossômico isolado do B. agaradherens NCIMB 40482 como descrito acima foi usado como padrão em uma reação de PCR usando-se Amplitaq DNA Polymerase (Perkin Eliner) de acordo com as instruções dos fabricantes. A reação de PCR foi ajustada em tampão de PCR (10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM de KC1, 1,5 mM de Mg Cl2, 0,01 % (p/v) de gelatina) contendo 200 μΜ de cada dNTP, 2,5 unidades de AmpliTaq polimerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA) e 100 pmol de cada iniciador.

As reações de PCR foram realizadas usando-se um ciclador térmico de DNA (Landgraf, Alemanha). Uma incubação a 94° C por 1 minuto seguido por trinta ciclos de PCR realizados usando-se um perfil de ciclo de desnaturação a 94° C por 30 segundos, cosendo-se a 60° C por 1 minuto, e extensão a 72° C por 2 minutos. Alíquotas de cinco μΐ do produto da amplificação foram analisadas por eletroforese em 0,7 % de géis de agarose (NuSieve, FMC). O aparecimento de um tamanho de fragmento de DNA de 1,4 kb indicou a amplificação apropriada do segmento de gene. SUBCLONAGEM DO FRAGMENTO DE PCR: Alíquotas de quarenta e cinco μΐ dos produtos de PCR gerados como descrito acima foram purificados usando-se o conjunto de purificação de PCR QIAquick (Qiagen, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA purificado foi eluído em 50 μΐ de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. 5 pg de pMOL944 e vinte e cinco μΐ do fragmento purificado de PCR foram digeridos com SacII e Notl, submetidos a eletroforese em géis de agarose a 0,8 % abaixo da temperatura de formação de gel (SeaPlaque GTG, FMC), os fragmentos relevantes foram excisados dos géis e purificados usando-se o conjunto de extração QIAquick Gel (Qiagen, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de DNA isolado por PCR foi depois ligado ao pMOL944 purificado e digerido por SacII-NotI. A ligação foi realizada durante a noite a 16° C usando-se 0,5 pg de cada fragmento de DNA, 1 U de tampão T4 DNA ligase e T4 ligase (Boehringer Mannheim, Alemanha). A mistura de ligação foi usada para transformar o B subtilis PL2306 competente. As células transformadas forma colocadas em placa sobre placas de LBPG-10 pg/ml de canamicina. Após 18 horas de incubação a 37° C, as colônias foram semeadas nas placas. Diversos clones foram analisados isolando-se o DNA plasmídico do caldo de cultura da noite anterior.

Um tal clone positivo foi novamente riscado várias vezes sobre placas de agar como usado acima, este clone foi chamado MB594. O clone MB594 foi cultivado durante a noite em TY-10 pg/ml de canamicina a 37° C e no dia seguinte 1 ml das células foi usado para isolar o plasmídeo das células usando-se o conjunto Qiaprep Spin Plasmid Miniprep #27106 de acordo com as recomendações dos fabricantes para as preparações do plasmídeo de B. subtilis. Este DNA foi sequenciado e revelou a sequência de DNA que corresponde à parte madura da mananase, isto é as posições de 94 a 1404 da SEQ ID NO: 7 anexa. A proteína madura derivada é apresentada na SEQ ID NO: 8. Parecerá que o fmal 3’ da mananase codificado pela sequência da SEQ ID NO: 5 foi mudado para aquele apresentado na SEQ ID NO: 7 devido ao planejamento do iniciador inferior usado na PCR. A sequência de aminoácido resultante é apresentada na SEQ ID NO: 8 está evidente que o término C da SEQ ID NO: 6 (S HHVREIGV QF S AADN S SGQT AL YVDNVTLR) está trocado pelo término C da SEQ ID NO: 8 (IIMLGK). EXEMPLO 6 Expressão, purificação e caracterização da mananase do Bacillus agaradhaerens O clone MB594 obtido como descrito no Exemplo 5 foi cultivado em 25 x 200 ml de meio de BPX com 10 pg/ml de canamicina em frascos de agitação com dois defletores de 500 ml por cinco dias a 37° C a 300 rpm. 6500 ml do fluído de cultura do frasco de agitação do clone MB594 (lote #9813) foi coletado e o pH foi ajustado para 5,5. 146 ml do agente catiônico (C521) e 292 ml de agente aniônico (A130) foram adicionados durante a agitação para floculação. O material floculado foi separado por centrifúgação usando-se uma centrífuga Sorval RC 3B a 9000 rpm por 20 minutos a 6o C. O sobrenadante foi clarificado usando-se filtros de vidro Whatman GF/D e C e finalmente concentrado em um filtron com um corte de 10 kDa. 750 ml deste concentrado foram ajustados ao pH 7,5 usando-se hidróxido de sódio. A solução clara foi aplicada à cromatografia de troca aniônica usando-se uma coluna Q-Sepharose de 900 ml equilibrada com 50 mmoles de Tris pH 7,5. A atividade de mananase ligada foi eluída usando-se um gradiente de cloreto de sódio. A enzima pura deu uma faixa única no SDS-PAGE com um peso molecular de 38 kDa. A sequência de aminoácido da enzima de mananase, isto é a sequência traduzida de DNA é apresentada na SEQ ID NO: 6.

Determinação das constantes cinéticas: Substrato: goma de alfarroba (alfarroba) e análise de açúcar redutor (PHBAH). Goma de alfarroba da Sigma (G-0753).

Determinação cinética usando-se diferentes concentrações de goma de alfarroba e incubação durante 20 minutos a 40° C no pH 10 deu Kcat: 467 por segundo. K^; 0,08 grama por litro.

Pm: 38 kDa ΡΪ (ponto isoelétrico): 4,2 A temperatura ótima da mananase foi descoberta ser 60° C. O perfil de atividade em pH apresentou atividade máxima entre ο pH 8 e 10. A calorimetria de varredura diferenciai DSC deu 77° C como o ponto de fusão no pH 7,5 em tampão Tris indicando que esta enzima é muito termoestável. A compatibilidade a detergente usando-se 0,2 % de AZCL-Galactomanana de alfarroba como substrato e incubação como descrito acima a 40° C apresenta excelente compatibilidade com detergentes líquido convencionais e boa compatibilidade com detergentes em pó convencionais. F.XFMPLO 7 Uso da enzima da invenção em detergentes A enzima purificada obtida como descrito no Exemplo 6 (lote #9813) apresentou desempenho de limpeza melhorado quando testada em um nível de 1 ppm em um teste de minilavagem usando-se um detergente líquido comercial convencional. O teste foi realizado sob as condições de lavagem Norte Americanas convencionais. EXEMPLO 8 Mananase derivada do Bacillus sp. AAI12 Construção de uma biblioteca genômica do Bacillus sp. AAI12 O DNA genômico do Bacillus sp. foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3A e fracionada no tamanho pela eletroforese em um gel de agarose a 0,7 % (SeaKem agarose, FMC, USA). Os fragmentos entre 1,5 e 10 kb no tamanho foram isolados e concentrados a uma faixa de DNA rodando-se os fragmentos de DNA retrogradamente em um gel de agarose a 1,5 % seguido pela extração dos fragmentos das fatias de gel de agarose usando-se o conjunto de extração de gel Qiaquick de acrodo com as instruções do fabricante (Qiagen Inc., USA). Para construir uma biblioteca genômica, ca. 100 ng de DNA ffacionado, purificado do acima foi ligado com 1 ug da subdivisão do vetor lambdaZAPexpress desfosforilado, clivado por BamHI (Stratagene, La Jolla CA, USA) por 24 horas a + 4o C, de acordo com as instruções do fabricante. Uma alíquota de 3 ul da mistura de ligação foi empacotada diretamente usando-se um extrato de empacotamento GigaPacklII Gold (Stratagene, USA) de acrodo com as instruções dos fabricantes (Stratagene). A biblioteca genômica do fago lambdaZAPExpress foi titulada usando-se a cepa MRF- do E. coli XLl-Blue da Stratagene (La Jolla, USA). A biblioteca genômica não amplificada compreendeu de 7,8 x 107 unidades formadoras de placa (pfu) com um fundo de vetor de menos do que 1 %. AVALIAÇÃO QUANTO AOS CLONES DE BETA-MANANASE PELA EXPRESSÃO FUNCIONAL EM lambdaZAPExpress Aproximadamente 5.000 unidades formadoras de placa (pfu) da biblioteca genômica foram colocadas em placa sobre placas de NZY-agar contendo 0,1 % de AZCL-galactomanana (MegaZyme, Austrália, cat. no. I-AZGMA), usando-se o E. coli XLl-Blue MRF’ (Stratagene, USA) como um hospedeiro, seguido pela incubação das placas a 37° C por 24 horas. Os clones lambda positivos em mananase foram identificados pela formação de halos azuis de hidrólise em tomo dos clones de fago positivo. Estes foram recuperados das placas de avaliação retirando a parte central das fatias de TOP-agar contendo as placas de interesse em 500 ul de tampão SM e 20 ul de clorofórmio. Os clones lambdaZAPExpress positivos em mananase foram purificados de placa colocando-se em placa uma alíquota do estoque fago e tirado sobre placas de NZY contendo 0,1 % de AZCL-galactomanana como acima. Os clones lambda positivos em mananase, únicos foram retirados em 500 ul de tampão SM e 20 ul de clorofórmio e purificados por mais uma rodada de colocação em placa como descrito acima.

EXCISÃO IN VIVO DE CLONE ÚNICO DOS FAGOMÍDEOS DOS CLONES lambdaZAPExpress POSITIVOS EM MANANASE

As células XLl-Blue E. coli (Stratagene, La Jolla Ca.) foram preparadas e recolocadas em suspensão em 10 nM de MgS04 como recomendado pela Stratagene (La Jolla, USA). Alíquotas de 250 ul dos estoques de fago puro dos clones positivos em mananase foram combinadas em tubos Falcon 2059 com 200 ul de células XLl-Blue MRF’ (OD600 = 1,0) e > 106 pfu/ml do fago auxiliar ExAssist Ml3 (Stratagene) e as misturas foram incubadas a 37° C por 15 minutos. Três ml do caldo NZY foram adicionados a cada tubo e os tubos foram incubados a 37° C por 2,5 horas. Os tubos foram aquecidos a 65 °C por 20 minutos para matar as células de E. coli e os bacteriofagos lambda; os fagomídeos sendo resistentes ao aquecimento. Os tubos foram girados a 3000 rpm por 15 minutos para remover os escombros celulares e os sobrenadantes foram decantados em tubos Falcon 2059 limpos. As alíquotas dos sobrenadantes contendo os fagomídeos de filamento único excisados foram usados para infectar 200 ul de células XLOLR do E. coli (Stratagene, OD600 = 1,0 em MgS04 10 mM) pela incubação a 37° C por 15 minutos. 350 ul de caldo NZY foram adicionados às células e os tubos foram incubados por 45 minutos a 37° C. As alíquotas das células foram colocadas em placa sobre placas de agar com LB canamicina e incubadas por 24 horas a 37° C. Cinco colônias únicas excisadas foram novamente riscadas sobre placas de agar com LB canamicina contendo 0,1 % de AZCL-galactomanana (MegaZyme, Austrália). Os clones fagomídeos positivos em mananase foram caracterizados pela formação de halos azuis de hidrólise em tomo das colônias positivas. Estas foram ainda analisadas por digestões em enzimas de restrição do DNA fagomídeo isolado (conjunto QiaSpin, Qiagen, USA) com EcoRI, PstI, EcoRI-PstI e HindIII seguido por eletroforese em gel de agarose. ANÁLISE DE SEQUÊNCIA DE NUCLETOTÍDEO A sequência de nucleotídeo do clone genômico de beta-1,4-mananase pBXMl foi determinado a partir de ambos os filamentos pelo método de terminação de cadeia de didesóxi (Sanger, F., Nicklen, S. e Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 74, 5463 a 5467) usando-se 500 ng de padrão purificado Qiagen (Qiagen, USA) o conjunto de sequenciamento de ciclo de terminal de Taq desóxi (Per«;in-El mer, USA), terminadores fluorescentemente rotulados e 5 pmol de cada um dos iniciadores poliligadores pBK-CMV (Stratagene, USA) ou iniciadores oligonucleotídicos sintéticos. A análise dos dados de sequência foi realizada de acordo com Devereux et al, 1984 (Devereux, J., Haeberli, P., e Smithies, O. (1994) Nucleic Acids Res. 12, 387 a 395).

ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIA

Um alinhamento múltiplo de sequência da família da glicoidrolase 26 beta-l,4-mananases do Bacillus sp. AAI12 da presente invenção (isto c, a SEQ ID NO: 10), Caldicelulosiruptor saccharolyticus (GenBank/EMBL acesso n° P77847), Dictyoglomus thermophilum (acesso n° 030654), Rhodothermus marinus (acesso n° P49425), Piromyces sp. codificado pela ManA (acesso n° P55296), Bacillus sp. (acesso n° P91007), Bacillus subtilis (acesso n° 005512) e Pseudomonas fluorescens (acesso n° P49424) foi criado usando-se o programa PileUp da GCG Wisconsin software package, versão 8.1 (ver acima); com penalidade de criação gap de 3,00 e penalidade de extensão gap de 0,10.

SIMILARIDADES DE SEQUÊNCIA A sequência de aminoácido deduzida da família 26 beta-1,4-mananase da invenção clonada a partir do Bacillus sp. AAI12 apresenta 45 % de similaridade de sequência e 19,8 % de identidade de sequência à beta-1,4-mananase do Caldicellulosiruptor saccharolyticus (GenBank/EMBL acesso n° P77847), 49 % de similaridade e 25,1 % de identidade à beta-1,4-mananase do Dictyogflomus thermophilum (acesso n° 030654), 48,2 % de similaridade e 26,8 % de identidade à beta-l,4-mananase do Rhodothermus marinus (acesso n° P49425), 46 % de similaridade e 19,5 % de identidade de sequência à beta-l,4-mananase codificada por ManA do Piromyces sp. (acesso n° P55296), 47,2 % de similaridade e 22 % de identidade à beta-1,4- mananase do Bacillus sp. (acesso n° P91007), 52,4 % de similaridade e 27,5 % de identidade de sequência à beta-l,4-mananase do Bacillus subtilus (acesso n° 005512) e 60,6 % de similaridade e 37,4 % de identidade à beta-1,4-mananase do Pseudomonas fluorescens (acesso n° P49424). As sequências foram alinhadas usando-se o programa GAP da GCG Wisconsin software package, versão 8.1; com penalidade de criação gap de 3,00 e penalidade de extensão gap de 0,10. CLONAGEM DO GENE DE MANANASE DO BACILLUS sp. (AAI12) A. SUBCLONAGEM E EXPRESSÃO DE MANANASE NO B. SUBTILIS: A sequência de DNA que codifica a mananase da invenção foi amplificada por PCR usando-se o conjunto de iniciador de PCR que consiste destes dois oligo nucleotídeos: BXM1. superior. SacII 5’-CAT TCT GCA GCC GCG GCA TTT TCT GGA AGC GTT TCA GC-3’ BXM1. inferior. Notl 5’-CAG CAG TAG CGG CCG CCA CTT CCT GCT GGT ACA TAT GC-3’ Os sítios de restrição SacII e Notl estão sublinhados. O DNA cromossômico isolado do Bacillus sp. AAI12 como descrito acima foi usado como padrão em uma reação de PCR usando-se Amplitaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) de acordo com as instruções dos fabricantes. A reação de PCR foi ajustada em tampão de PCR (10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM de KC1, 1,5 mM de Mg Cl2, 0,01 % (p/v) de gelatina) contendo 200 μΜ de cada dNTP, 2,5 unidades de AmpliTaq polimerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA) e 100 pmol de cada iniciador.

As reações de PCR foram realizadas usando-se um ciclador térmico de DNA (Landgraf, Alemanha). Uma incubação a 94° C por 1 minuto seguido por trinta ciclos de PCR realizados usando-se um perfil de ciclo de desnaturação a 94° C por 30 segundos, cosendo-se a 60° C por 1 minuto, e extensão a 72° C por 2 minutos. Alíquotas de cinco μΐ do produto da amplificação foram analisados por eletroforese em 0,7 % de géis de agarose (NuSíeve, FMC). O aparecimento de um tamanho de fragmento de DNA de 1,0 kb indicou a amplificação apropriada do segmento de gene. SUBCLONAGEM DO FRAGMENTO DE PCR: Alíquotas de quarenta e cinco μΐ dos produtos de PCR gerados como descrito acima foram purificados usando-se o conjunto de purificação de PCR QIAquick (Qiagen, USA) de acordo com as instruções dos fabricantes. O DNA purificado foi eluído em 50 μΐ de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. 5 pg de pMOL944 e vinte e cinco μΐ do fragmento purificado de PCR foram digeridos com SacII e Notl, submetidos a eletroforese em géis de agarose a 0,8 % abaixo da temperatura de formação de gel (SeaPlaque GTG, FMC), os fragmentos relevantes foram excisados dos géis e purificados usando-se o conjunto de extração QIAquick Gel (Qiagen, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de DNA isolado por PCR foi depois ligado ao pMOL944 digerido e purificado por SacII-NotI. A ligação foi realizada durante a noite a 16° C usando-se 0,5 pg de cada fragmento de DNA, 1 U de T4 DNA ligase e tampão T4 ligase (Boehringer Mannheim, Alemanha). A mistura de ligação foi usada para transformar o B. subtilis PL2306 competente. As células transformadas forma colocadas em placa sobre placas de LBPG-10 pg/ml de canamicina-agar. Após 18 horas de incubação a 37° C, as colônias foram semeadas nas placas. Diversos clones foram analisados isolando-se o DNA plasmídico do caldo de cultura da noite anterior.

Um tal clone positivo foi novamente riscado várias vezes sobre placas de agar como usado acima, este clone foi chamado MB747. O clone MB747 foi cultivado durante a noite em TY-10 pg/ml de canamicina a 37° C e no dia seguinte 1 ml das células foram usadas para isolar o plasmídeo das células usando-se o conjunto Qiaprep Spin Plasmid Miniprep #27106 de acordo com as recomendações dos fabricantes para as preparações do plasmídeo de B. subtilis. Este DNA foi sequenciadoe revelou a sequência de DNA que corresponde à parte madura da mananase na SEQ ID NO: 9. EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA MANANASE DO BA CILL US sp. AAI12 O clone MB747 obtido como descrito acima foi cultivado em 25 x 200 ml de meio de BPX com 10 pg/ml de canamicina em frascos de agitação com dois defletores de 500 ml por cinco dias a 37° C a 300 rpm. 4100 ml do fluído de cultura do frasco de agitação do clone MB747 foram coletados e o pH foi ajustado para 7,0 e EDTA foi adicionado para uma concentração final de 2 mM. 1S5 ml do agente catiônico (10 % C521) e 370 ml de agente aniônico (Al30) foram adicionados durante a agitação para floculação. O material floculado foi separado por centrifugação usando-se uma centrífuga Sorval RC 3B a 9000 rpm por 20 minutos a 6o C. O sobrenadante foi clarificado usando-se filtros de vidro Whatman GF/D e C e finalmente concentrado em um filtron com um corte de 10 kDa. 1500 ml deste concentrado foi ajustado ao pH 7,5 usando-se hidróxido de sódio. A solução clara foi aplicada à cromatografia de troca aniônica usando-se uma coluna Q-Sepharose de 1000 ml equilibrada com 25 mmoles de Tris pH 7,5. A atividade de mananase ligada foi eluída em 1100 ml usando-se um gradiente de cloreto de sódio. Este foi concentrado a 440 ml usando-se uma membrana Filtron. Para se obter mananase altamente pura o concentrado foi passado em uma coluna Superdex equilibrada com acetato de sódio 0,1 M, pH 6,0. A enzima pura deu uma faixa única no SDS-PAGE com um peso molecular de 62 kDa. A sequência de aminoácido da enzima de mananase, isto é a sequência traduzida de DNA é apresentada na SEQ ID NO: 10. A seguinte sequência de terminal N foi determinada: FSGSVSASGQELKMTDQN. pi (ponto isoelétrico): 4,5 A calorimetria de varredura diferencial DSC deu 64° C como o ponto de fusão no pH 6,0 em tampão de acetato de sódio indicando que esta enzima de mananase é termoestável.

Foi descoberto que a atividade catalítica aumenta com a força iônica indicando que a atividade específica da enzima pode ser aumentada usando-se tampão de sal de fosfato com alta força iônica. A atividade de mananase do polipeptídeo da invenção é inibida pelos íons cálcio.

Propriedades imunológicas: o soro monoespecífico policlonal de coelho foi incitado contra a mananase altamente purificada usando-se técnicas convencionais na companhia Dinamarquesa DAKO. O soro formou um bom e único precipitado em géis de agarose com a mananase bruta da invenção. EXEMPLO 9 Uso da enzima do exemplo 8 em detergentes Usando-se detergentes comerciais ao invés de tampão e incubação por 20 minutos a 40° C com 0,2 % de AZCL-galactomanana (Megazyne, Austrália) do grau de alfarroba como descrito acima seguido pela determinação da formação de cor azul, a enzima obtida como descrito no Exemplo 8 foi ativa no detergente em pó Europeu Ariel Futur com 132 % de atividade relativa, no pó US Tide com 108 % de atividade relativa e no detergente líquido US Tide com 86 % de atividade relativa em relação à atividade medida em tampão de glicina. Nestes testes, a concentração de detergente foi como recomendada nos pacotes de detergente comercial e a água de lavagem foi água de torneira tendo 18 graus de dureza Alemã sob condições Européias (Ariel Futur) e 9 graus sob as condições US (US Tide). EXEMPLO 10 Mananase derivada do Bacillus halodurans Construção de uma biblioteca genômica do Bacillus halodurans no vetor pSJ1678 O DNA genômico do Bacillus halodurans foi parcialmente digerido com a enzima de restrição SauiA e fracionada no tamanho pela eletroforese em um gel de agarose a 0,7 % (SeaKem agarose, FMC, USA). Os fragmentos de DNA entre 2 e 10 kb no tamanho foram isolados por eletroforese sobre DEAE-papel de celulose (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1981) A reliable method for the recovery of DNA fragments fforn agarose e acrilamide gels, Anal. Biochem., 112, 295 a 298). Os fragmentos de DNA foram ligados ao DNA plasmídico pSJ1678 digerido por BamHI e a mistura de ligação foi usada para transformar o E. coli SJ2.

AVALIAÇÃO QUANTO AOS CLONES DE BETA-MANANASE PELA EXPRESSÃO FUNCIONAL EM ESCHERICHIA COLI

Aproximadamente 10.000 unidades formadoras de colônia (cfu) da biblioteca genômica foram colocadas em placa sobre placas de LB-agar contendo 9 pg/ml de cloranfenicol e 0,1 % de AZCL-galactomanana (MegaZyme, Austrália, cat. no. I-AZGMA), usando-se o E. coli SJ2 como um hospedeiro, seguido pela incubação das placas a 37° C por 24 horas. As colônias de E. coli positivas em mananase foram identificados pela formação de halos azuis de hidrólise em tomo dos clones plasmídicos positivos. Os clones positivos em mananase no pSJ1678 foram purificados na colônia riseando-se novamente as colônias isoladas sobre placas de LB contendo 9 pg/ml de cloranfenicol e 0,1 % de AZCL-galactomanana como acima. Os clones plasmídicos positivos em mananase, únicos foram inoculados em 5 ml de meio LB contendo 9 pg/ml de cloranfenicol, para a purificação do DNA plasmídico.

ANÁLISE DE SEQUÊNCIA DE NUCLETOTÍDEO A sequência de nucleotídeo do clone genômico de beta-1,4-mananase pBXM5 foi determinada a partir de ambos os filamentos pelo método de terminação de cadeia de didesóxi (Sanger, F., Nicklen, S. e Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 74, 5463 a 5467) usando-se 500 ng de padrão purificado Qiagen (Qiagen, USA) o conjunto de sequenciamento de ciclo de terminal de Taq desóxi (Perkin-Elmer, USA), terminadores fluorescentemente rotulados e 5 pmol de cada um dos iniciadores poliligadores pBK-CMV (Stratagene, USA) ou iniciadores oligonucleotídicos sintéticos. A análise dos dados de sequência foi realizada de acordo com Devereux et ai, 1984 (Devereux, J., Haeberli, P., e Smithies, O. (1994)Nucleic Acids Res. 12, 387 a 395).

ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIA

Um alinhamento múltiplo de sequência da família da glicoidrolase 5-beta-l,4-mananase do Bacillus halodurans da presente invenção (isto é, a SEQ ID NO: 12), bacillus circulans (GenBank/EMBL acesso n° 066185), Vibrio sp. (acesso n° 069347), Streptomyces lividans (acesso n° P51529) e Caldicelulosiruptor saccharolyticus (acesso n° P22533). O alinhamento múltiplo de sequência foi criado usando-se o programa PileUp da GCG Wisconsin software package, versão 8.1; com penalidade de criação gap de 3,00 e penalidade de extensão gap de 0,10. SIMILARIDADES DE SEQUÊNCIA A sequência de aminoácido deduzida da família 5-beta-1,4-mananase da presente invenção clonada a partir do Bacillus halodurans apresenta 77 % de similaridade e 60 % de identidade de sequência à beta-1,4-mananase do Bacillus circulans (GenBank/EMBL acesso n° 066185), 64,2 % de similaridade e 46 % de identidade à beta-l,4-mananase do Vibrio sp. (acesso n° 069347), 63 % de similaridade e 41,8 % de identidade à beta-1,4-mananase do Streptomyces lividans (acesso n° P51529), 60,3 % de similaridade e 42 % de identidade de sequência à beta-1,4-mananase do Caldicellulosiruptor saccharolyticus (acesso n° P2253). As sequências foram alinhadas usando-se o programa GAP da GCG Wisconsin software package, versão 8.1; com penalidade de criação gap de 3,00 e penalidade de extensão gap de 0,10. CLONAGEM DO GENE DE MANANASE DO BACILLUS HALODURANS SUBCLONAGEM E EXPRESSÃO DA MANANASE MADURA DE COMPRIMENTO COMPLETO NO B. SUBTILIS: A sequência de DNA que codifica a mananase da invenção foi amplificada por PCR usando-se o conjunto de iniciador de PCR que consiste destes dois oligo nucleotídeos: BXM5. superior. SacII 5’-CAT TCT GCA GCC GCG GCA CAT CAC AGT GGG TTC CAT G-3’ BXM5. inferior .Notl 5’-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT TAT TGA AAC AC A CTG CTT CTT TTA G- 3’ Os sítios de restrição SacII e Notl estão sublinhados. O DNA cromossômico isolado do Bacillus halodurans como descrito acima foi usado como padrão em uma reação de PCR usando-se Amplitaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) de acordo com as instruções dos fabricantes. A reação de PCR foi ajustada em tampão de PCR (10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM de KC1, 1,5 mM de Mg Cl2, 0,01 % (p/v) de gelatina) contendo 200 μΜ de cada dNTP, 2,5 unidades de AmpliTaq polimerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA) e 100 pmol de cada iniciador.

As reações de PCR foram realizadas usando-se um ciclador térmico de DNA (Landgraf, Alemanha). Uma incubação a 94° C por 1 minuto seguido por trinta ciclos de PCR realizados usando-se um perfil de ciclo de desnaturação a 94° C por 30 segundos, cosendo-se a 60° C por 1 minuto, e extensão a 72° C por 2 minutos. Alíquotas de cinco μΐ do produto da amplificação foram analisados por eletroforese em 0,7 % de géis de agarose (NuSieve, FMC). O aparecimento de um tamanho de fragmento de DNA de 0,9 kb indicou a amplificação apropriada do segmento de gene SUBCLONAGEM DO FRAGMENTO DE PCR: Alíquotas de quarenta e cinco μΐ dos produtos de PCR gerados como descrito acima foram purificados usando-se o conjunto de purificação de PCR QIAquick (Qiagen, USA) de acordo com as instruções dos fabricantes. O DNA purificado foi eluído em 50 μΐ de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. 5 pg de pMOL944 e vinte e cinco μΐ do fragmento purificado de PCR foram digeridos com SacII e Notl, submetidos a eletroforese em géis de agarose a 0,8 % abaixo da temperatura de formação de gel (SeaPlaque GTG, FMC), os fragmentos relevantes foram excisados dos géis e purificados usando-se o conjunto de extração QIAquick Gel (Qiagen, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de DNA isolado por PCR foi depois ligado ao pMOL944 digerido e purificado por SacII-NotI. A ligação foi realizada durante a noite a 16° C usando-se 0,5 pg de cada fragmento de DNA, 1 U de tampão T4 DNA ligase e T4 ligase (Boehringer Mannheim, Alemanha). A mistura de ligação foi usada para transformar o B. subtilis PL2306 competente. As células transformadas forma colocadas em placa sobre placas de LBPG-10 pg/ml de canamicina-agar. Após 18 horas de incubação a 37° C, as colônias foram semeadas nas placas. Diversos clones foram analisados isolando-se o DNA plasmídico do caldo de cultura da noite anterior.

Um tal clone positivo foi novamente riscado várias vezes sobre placas de agar como usado acima, este clone foi chamado MB878. O clone MB878 foi cultivado durante a noite em TY-10 pg/ml de canamicina a 37° C e no dia seguinte 1 ml das células foi usado para isolar o plasmídeo das células usando-se o conjunto Qiaprep Spin Plasmid Miniprep #27106 de acordo com as recomendações dos fabricantes para as preparações do plasmídeo de B. subtilis. Este DNA foi sequenciado e revelou a sequência de DNA que corresponde à parte madura da mananase na posição de 97 a 993 na SEQ ID NO: 11 e de 33 a 331 na SEQ ID NO: 12.

EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA MANANASE DO BA CILL US HALODURANS O clone MB878 obtido como descrito acima foi cultivado em 25 x 200 ml de meio de BPX com 10 pg/ml de canamicina em frascos de agitação com dois defletores de 500 ml por cinco dias a 37° C a 300 rpm. 5000 ml do fluído de cultura do frasco de agitação do clone MB878 foi coletado e o pH foi ajustado para 6,0. 125 ml do agente catiônico (10 % C521) e 250 ml de agente aniônico (Al 30) foram adicionados durante a agitação para floculação. O material floculado foi separado por centrifugação usando-se uma centrífuga Sorval RC 3B a 9000 rpm por 20 minutos a 6o C. O sobrenadante foi ajustado ao pH 8,0 usando-se NaOH e clarificado usando-se filtros de vidro Whatman GF/D e C. Depois 50 g de DEAE A-50 Sephadex foram equilibrados com acetato de sódio 0,1 M, pH 6,0 e adicionados ao filtrado, a enzima foi ligada e deixada durante a noite na temperatura ambiente, A enzima ligada foi eluída com NaCl 0,5 M no tampão de acetato. Depois o pH foi ajustado para 8,0 usando-se hidróxido de sódio e depois concentrada em um Filtron com um corte de 10 kDa a 450 ml e depois estabilizada com 20 % de glicerol, 20 % de MPG e 2 % de Berol. O produto foi usado para testes de aplicação. 2 ml deste concentrado foi ajustado ao pH 8,5 usando-se hidróxido de sódio. Para se obter mananase altamente pura, o concentrado foi passado em uma coluna Superdex equilibrada com fosfato de sódio, pH 8,5 .A enzima pura deu uma faixa única no SDS-PAGE com um peso molecular de 34 kDa. A sequência de aminoácido da enzima de mananase, isto é a sequência traduzida de DNA é apresentada na SEQ ID NO: 12. A seguinte sequência de terminal N da proteína purificada foi determinada: AHHSGFHVNGTTLYDA. O perfil de atividade em pH usando-se o ensaio de ManU (incubação por 20 minutos a 40° C) apresenta que a enzima tem uma atividade relativa mais alta do que 50 % entre o pH 7,5 e o pH 10. O ótimo de temperatura foi descoberto (usando-se o ensaio de ManU, tampão de glicina) como sendo entre 60° C e 70° C no pH 10.

Propriedades imunológicas: o soro monoespecífico policlonal de coelho foi incitado contra a mananase clonada altamente purificada usando-se técnicas convencionais na companhia Dinamarquesa DAKO. O soro formou um bom e único precipitado em géis de agarose com a mananase bruta não purificada da invenção. EXEMPLO 11 Uso da enzima de mananase do exemplo 10 em detergentes Usando-se detergentes comerciais ao invés de tampão e incubação por 20 minutos a 40° C com 0,2 % de AZCL-galactomanana (Megazyne, Austrália) do grau de alfarroba como descrito acima seguido pela determinação da formação de cor azul, a enzima de mananase obtida como descrito no Exemplo 10 foi ativa com uma atividade mais alta do que 40 % em relação a atividade em tampão no detergente em líquido Europeu Ariel Futur, no pó US Tide e no detergente líquido US Tide. Nestes testes, a concentração de detergente foi como recomendada nos pacotes de detergente comercial e a água de lavagem foi água de torneira tendo 18 graus de dureza Alemã sob condições Européias (Ariel Futur) e 9 graus sob as condições US (US Tide). EXEMPLO 12 Mananase derivada do Bacillus sp. AA349 Clonagem do gene de mananase do Bacillus sp. (AA349) subclonagem e expressão de uma enzima de mananase de núcleo catalítico no B. subtilis: A sequência de DNA que codifica a mananase da invenção foi amplificada por PCR usando-se o conjunto de iniciador de PCR que consiste dos dois oligo nucleotídeos seguintes: BXM7.superior.SacII 5’-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AGT GGA CAT GGG CAA ATG C-3’ BXM7. inferi or.Notl 5’-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT TAT TTT TTG TAT ACA CTA ACG ATT TC-3’ Os sítios de restrição SacII e Notl estão sublinhados. O DNA cromossômico isolado do Bacillus sp. AA349 como descrito acima foi usado como padrão em uma reação de PCR usando-se Amplitaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) de acordo com as instruções dos fabricantes. A reação de PCR foi ajustada em tampão de PCR (10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM de KC1, 1,5 mM de Mg Cl2, 0,01 % (p/v) de gelatina) contendo 200 μΜ de cada dNTP, 2,5 unidades de AmpliTaq polimerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA) e 100 pmol de cada iniciador.

As reações de PCR foram realizadas usando-se um ciclador térmico de DNA (Landgraf, Alemanha). Uma incubação a 94° C por 1 minuto seguido por trinta ciclos de PCR realizados usando-se um perfil de ciclo de desnaturação a 94° C por 30 segundos, cosendo-se a 60° C por 1 minuto, e extensão a 72° C por 2 minutos. Alíquotas de cinco μΐ do produto da amplificação foram analisadas por eletroforese em 0,7 % de géis de agarose (NuSieve, FMC). O aparecimento de um tamanho de fragmento de DNA aproximado de 1,0 kb indicou a amplificação apropriada do segmento de gene. SUBCLONAGEM DO FRAGMENTO DE PCR: Alíquotas de quarenta e cinco μΐ dos produtos de PCR gerados como descrito acima foram purificados usando-se o conjunto de purificação de PCR QIAquick (Qiagen, USA) de acordo com as instruções dos fabricantes. O DNA purificado foi eluído em 50 μΐ de Tris-HCl 10 mM, pfí 8,5. 5 pg de pMOL944 e vinte e cinco μΐ do fragmento purificado de PCR foram digeridos com SacII e Notl, submetidos a eletroforese em géis de agarose a 0,8 % abaixo da temperatura de formação de gel (SeaPlaque GTG, FMC), os fragmentos relevantes foram excisados dos géis e purificados usando-se o conjunto de extração QIAquick Gel (Qiagen, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de DNA isolado por PCR foi depois ligado ao pMOL944 digerido e purificado por SacII-NotI. A ligação foi realizada durante a noite a 16° C usando-se 0,5 pg de cada fragmento de DNA, 1 U de tampão T4 DNA ligase e T4 ligase (Boehringer Mannheim, Alemanha). A mistura de ligação foi usada para transformar o B. subtilis PL2306 competente. As células transformadas forma colocadas em placa sobre placas de LBPG-10 pg/ml de canamicina-agar. Após 18 horas de incubação a 37° C, as colônias foram semeadas nas placas. Diversos clones foram analisados isolando-se o DNA plasmídico do caldo de cultura da noite anterior.

Um tal clone positivo foi novamente riscado várias vezes sobre placas de agar como usado acima, este clone foi chamado MB879. O clone MB879 foi cultivado durante a noite em TY-10 pg/ml de canamicina a 37° C e no dia seguinte 1 ml das células foram usadas para isolar o plasmídeo das células usando-se o conjunto Qiaprep Spin Plasmid Miniprep #27106 de acordo com as recomendações dos fabricantes para as preparações do plasmídeo de B. subtilis. Este DNA foi sequenciado e revelou a sequência de DNA que corresponde à parte madura da mananase (que corresponde às posições 204 a 1107 na sequência de DNA anexa SEQ ID NO: 15 e às posições de 26 a 369 na sequência de proteína anexa SEQ ID NO: 16). EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA MANANASE DO Bacillus sp. AA349 O clone MB 879 obtido como descrito acima foi cultivado em 25 x 200 ml de meio de BPX com 10 μg/ml de canamicina em frascos de agitação com dois defletores de 500 ml por cinco dias a 37° C a 300 rpm. 400 ml do fluído de cultura do frasco de agitação do clone MB879 foi coletado e o pH foi 6,5. 19 ml do agente catiônico (10 % C521) e 38 ml de agente aniônico (Al30) foram adicionados durante a agitação para floculação. O material floculado foi separado por centrifugação usando-se uma centrífuga Sorval RC 3B a 5000 rpm por 25 minutos a 6o C. O então concentrado foi lavado com água para reduzir a condutividade em um Filtron com corte de 10 kDa para 150 ml. Depois o pH foi ajustado 4,0 e o líquido aplicado à cromatografia em coluna de S-Sepharose em um tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 4,0. A coluna foi primeiro eluída com um gradiente de NaCl para 0,5 M, depois a mananase eluiu usando-se tampão de glicina 0,1 M, pH 10. A fração de mananase ativa foi reunida e deu uma faixa única no SDS-PAGE com um peso molecular de 38 kDa. A sequência de aminoácido da enzima de mananase, isto é a sequência traduzida de DNA é apresentada na SEQ ID NO: 16. O perfil de atividade em pH usando-se o ensaio de ManU (incubação por 20 minutos a 40° C) apresenta que a enzima tem uma atividade relativa mais alta do que 30 % entre o pH 5 e o pH 10. O ótimo de temperatura foi descoberto (usando-se o ensaio de ManU, tampão de glicina) como sendo entre 60° C e 70° C no pH 10.

Propriedades imunológicas: o soro monoespecífico policlonal de coelho foi incitado contra a mananase clonada altamente purificada usando-se técnicas convencionais na companhia Dinamarquesa DAKO. O soro formou um bom e único precipitado em géis de agarose com a mananase bruta não purificada da invenção. EXEMPLO 13 Uso da enzima do exemplo 12 em detergentes Usando-se detergentes comerciais ao inves de tampão e incubação por 20 minutos a 40° C com 0,2 % de AZCL-galactomanana (Megazyne, Austrália) do grau de alfarroba como descrito acima seguido pela determinação da formação de cor azul, a enzima obtida como descrito no Exemplo 12 foi ativa com uma atividade mais alta do que 65 % em relação à atividade no tampão no detergente líquido Europeu Ariel Futur e no detergente líquido US Tide. A mananase foi mais do que 35 % ativa em detergentes em pó da Europa, Ariel Futur e no pó US Tide. Nestes testes, a concentração de detergente foi como recomendada nos pacotes de detergente comercial e a água de lavagem foi água de torneira tendo 18 graus de dureza Alemã sob condições Européias (Ariel Futur) e 9 graus sob as condições US (US Tide). EXEMPLO 14 Mananase derivada da cepa fungica do Humicola insolens DSM 1800 Clonagem de expressão de uma família de 26 beta-1,4-mananases do Humicola insolens Cepa fungica e condições de cultivo A cepa DSM1800 do Humicola insolens foi fermentada como descrito na WO 97/32014, o micélio foi colhido após cinco dias de cultivo a 26° C, imediatamente congelado em N2 líquido e armazenado a -80° C. PREPARAÇÃO DE VIDRARIA, PONTEIRAS E SOLUÇÕES ISENTOS DE Rnase Toda a vidraria usada nas isolações de RNA foram fervidas a + 220° C por pelo menos 12 horas. Os tubos de Eppendorf, as pontas de pipetas e as colunas plásticas foram tratados com 0,1 % de dietilpirocarbonato (DEPC) em EtOH por 12 horas e submetidos a autoclave. Todos os tampões e a água (exceto os tampões contendo Tris) foram tratados com 0,1 % de DEPC por 12 horas a 37° C e autoclavados.

EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL O RNA foi preparado pela extração com tiocianato de guanidínio seguido por ultra centrifugação através de uma almofada de CsCl 5,7 M (Chirgwin et ai, 1979) usando-se as seguintes modificações. O micélio congelado foi moído em N2 líquido até um pó fmo com um almofariz e um pistilo, seguido pela moagem em um moinho de café pré esfriado e imediatamente colocado em suspensão em 5 volumes de tampão de extração de RNA (GuSCN 4 M, 0,5 % de Na-laurilsarcosina, Na-citrato 25 mM, pH 7,0, β-mercaptoetanol 0,1 Μ). A mistura foi agitada por 30 minutos na temperatura ambiente e centrifugada (30 minutos, 5000 rpm, temperatura ambiente, Heraeus Megafuge 1,0 R) para granular o escombro celular. O sobrenadante foi coletado, cuidadosamente disposto em camada sobre uma almofada de CsCl 5,7 M (CsCl 5,7 M, EDTA 0,1 M, pH 7,5, DEPC 0,1 %; autoclavada antes do uso) usando-se 26,5 ml do sobrenadante por cada 12,0 ml de almofada de CsCl e centrifugado para se obter o RNA total (Beckman, rotor SW28, 25.000 rpm, temperatura ambiente, 24 horas). Após a centrifugação, o sobrenadante foi cuidadosamente removido e o fundo do tubo contendo o grão de RNA foi cortado e enxaguado com EtOH a 70 %. O grão de RNA total foi transferido para um tubo de Eppendorf, colocado em suspensão em 500 ml de TE, pH 7,6 (se difícil, aquecer ocasionalmente por 5 minutos a 65° C), o fenol extraído e precipitado com etanol por 12 horas a -20° C (2,5 volumes de EtOH, 0,1 volume de NaAc 3 M, pH 5,2). O RNA foi coletado por centrifugação, lavado em EtOH a 70 % e recolocado em suspensão em um volume mínimo de DEPC-DIW. A concentração de RNA foi determinada medindo-se o OD260/280.

ISOLAÇÃO DE POLI(A)+RNA

Os poli(A)+ RNAs foram isolados pela cromatografia de afinidade oligo(dT)-celulose (Aviv & Leder, 1972). Tipicamente, 0,2 g de oligo(dT)-celulose (Boehringer Mannheim, checado quanto a capacidade de ligação) foi pré intumescido em 10 ml de 1 x tampão de carga de coluna (Tris-Cl 20 mM, pH 7,6, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, 0,1 % SDS) carregada em uma coluna plástica tampada, tratada com DEPC (Coluna Cromatográfica Poly Prep, Bio Rad) e equilibrada com 20 ml, 1 x de tampão de carga. O RNA total foi aquecido a 65° C por 8 minutos, extinto em gelo por 5 minutos e após a adição de um volume 2 x tampão de carga de coluna em relação a amostra de RNA carregada na coluna. O eluato foi coletado e novamente carregado de 2 a 3 vezes aquecendo-se a amostra como acima e arrefecendo em gelo antes de cada carga. A coluna de oligo(dT) foi lavada com 10 volumes de 1 x de tampão de carga, depois com 3 volumes de tampão de meio salino (Tris-Cl 20 mM, pH 7,6, NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM, 0,1 % de SDS), seguido pela elução do poli(A)+RNA com três volumes de tampão de elução (Tris-Cl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, 0,05 % de SDS) pré aquecido a + 65° C, coletando-se frações de 500 ml. O OD260 foi lido para cada fração coletada e as frações contendo mRNA foram reunidas e precipitadas com etanol a -20° C por 12 horas. O poli(A)+ RNA foi coletado por centrifugação, recolocado em suspensão em DEPC-DIW e armazenado em alíquotas de 5 a 10 mg a -80°C.

SÍNTESE DO cDNA

SÍNTESE DO PRIMEIRO FILAMENTO O cDNA de filamento duplo foi sintetizado a partir de 5 mg de poli(A)+ RNA do Humicola insolens pelo método da RNase H (Gubler & Hoffman 1983, Sambrook et al., 1989) usando-se a modificação de grampo de cabelo desenvolvida por F, S. Hagen {pers. comm.). O poli(A)+ RNA (5 mg em 5 ml de água tratada com DEPC) foi aquecido a 70° C por 8 minutos, arrefecido em gelo e combinado em um volume final de 50 ml com tampão de transcriptase reversa (Tris-Cl 50 mM, pH 8,3, KC1 75 mM, MgCl2 3 mM, DTT 10 mM, Bethesda Research Laboratories) contendo 1 mM de cada dNTP (Pharmacia), 40 unidades de inibidor de ribonuclease de placenta humana (Rnasin, Promega), 10 mg de iniciador oligo(dT)12_18 (Pharmacia) e 1000 unidades de transcriptase reversa SuperScript II RNase H (Bethesda Research Laboratories). O primeiro filamento do cDNA foi sintetizado incubando-se a mistura de reação a 45° C por 1 hora.

SÍNTESE DO SEGUNDO FILAMENTO

Após a síntese, 30 ml de Tris-Cl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM foram adicionados e os híbridos mRNA:cDNA foram precipitados por etanol por 12 horas a -20° C pela adição de 40 mg de carregador de glicogênio (Boehringer Mannheim), 0,2 volumes de NH4Ac 10 M e 2,5 volumes de EtOH a 96 %. Os híbridos foram recuperados por centrifugação, lavados em EtOH a 70 %, secados ao ar e recolocados em suspensão em 250 ml do tampão do segundo filamento (Tris-Cl 20 mM, pH 7,4, KC1 90 mM, MgCl2 4,6 mM, (NH4)2S04 10 mM, pNAD+ 16 mM) contendo 100 mM de cada dNTP, 44 unidades de E. coli DNA polimerase I (Amersham), 6,25 unidades de RNase H (Bethesda Research Laboratories) e 10,5 unidades de E. coli DNA ligase (New England Biolabs). A síntese do cDNA do segundo filamento foi realizada pela incubação do tubo de reação a 16° C por três horas e a reação foi interrompida pela adição de EDTA para concentração final de 20 mM seguido pela extração com fenol.

TRATAMENTO POR FEIJÃO MUNG NUCLEASE O cDNA de filamento duplo (ds) foi precipitado com etanol a 20° C por 12 horas pela adição de 2 volumes de pela adição de 2 volumes de EtOH a 96 %, 0,1 volume de NaAc 3 M, pH 5,2, recuperado por centrifugação, lavado em EtOH a 70 %, secado (SpeedVac) e recolocado em suspensão em 30 ml de tampão de feijão Mung nuclease (NaAc 30 mM, pH 4,6, NaCl 300 mM, ZnS04 1 mM, DTT 0,35 mM, 2 % de glicerol) contendo 36 unidades de feijão Mung nuclease (Bethesda Research Laboratories). O DNA de grampo de cabelo de filamento único foi preso pela incubação da reação a 30° C por 30 minutos, seguido pela adição de 70 ml de Tris-Cl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, extração com fenol e precipitação com etanol com dois volumes de EtOH a 96 % e 0, 1 volume de NaAc 3 M pH 5,2 a -20° C durante 12 horas.

TÉRMINO ABRUPTO COM T4 DNA POLIMERASE O ds cDNA foi terminado de forma abrupta com T4 DNA polimerase em 50 ml de tampão T4 DNA polimerase (Tris-acetato 20 mM, pH 7,9, MgAc 10 mM, KAc 50 mM, DTT lmM) contendo 0,5 mM de cada dNTP e 7,5 unidades de t$ DNA polimerase (Invitrogen) incubando-se a mistura de reação a +37° C por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de EDTA para uma concentração final de 20 mM, seguido pela extração com fenol e precipitação com etanol.

LIGAÇÃO ADAPTADORA E SELEÇÃO DE TAMANHO

Após a reação estar completa o DNA foi ligado a adaptadores não palindrômicos BstX I (1 mg/ml, Invitrogen) em 30 ml de tampão de ligação (Tris-Cl 50 mM), pH 7,8, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, 25 mg/ml de albumina de soro fetal bovino) contendo 600 pmol de adaptadores BstX I e 5 unidades de T4 ligase (Invitrogen) incubando-se a mistura de reação a + 16° C por 12 horas. A reação foi interrompida aquecendo-se a + 70° C por 5 minutos e o cDNA adaptado foi fracionado no tamanho por eletroforese em gel de agarose (0,8 % de HSB-agarose, FMC) para separar os adaptadores não ligados e os cDNA pequenos. O cDNA foi selecionado por tamanho com um corte em 0,7 kb e o cDNA foi eletroeluído a partir de gel de agarose em Tris-Cl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM por 1 hora a 100 volts, o fenol extraído e o etanol precipitado a -20° C por 12 horas como acima. CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE cDNA DO HUMICOLA INSOLENS Os cDNAs adaptados foram recuperados por centrifugação, lavados em EtOH a 70 % e recolocado em suspensão em 25 ml de DIW. Antes da ligação da biblioteca em escala maior, quatro ligações teste foram realizadas em 10 ml de tampão de ligação (o mesmo como acima) cada um contendo 1 ml de ds cDNA (tubos de reação #1 a #3) 2 unidades de T4 ligase (Invitrogen) e 50 ng (tubo #1), 100 ng (tubo #2) e 200 ng (tubo #3 e #4) do vetor pYES 2.0 clivado por BstX I (Invitrogen). As reações de ligação foram realizadas pela incubação a + 16° C por 12 horas, aquecido a 70° C por 5 minutos e 1 ml de cada ligação eletroporada (200 W, 2,5 kV, 25 mJF) para 40 ml de células E. coli 1061 competente (ODóOO = 0,9 em 1 litro de caldo LB, lavado duas vezes em DIW frio uma vez em 20 ml de glicerol a 10 %, recolocado em suspensão em 2 ml de glicerol a 10 %). Após a adição de 1 ml de SOC a cada mistura de transformação, as células foram cultivadas a + 37° C por 1 hora, 50 ml colocados em placa sobre placas de LB + ampicilina (100 mg/ml) e cultivados a + 37° C por 12 horas.

Usando-se as condições ótimas, uma ligação em larga escala foi ajustada em 40 ml de tampão de ligação contendo 9 unidades de T4 ligase e a reação foi incubada a + 16° C por 12 horas. A reação de ligação foi interrompida aquecendo-se a 70° C por 5 minutos, o etanol precipitou a -20° C por 12 horas, recuperados por centrifugação e recolocados em suspensão em 10 ml de DYW. Alíquotas de um ml foram transformados em células E. coli 1061 eletrocompetentes usando-se as mesmas condições de eletroporação como acima e as células transformadas foram tituladas e a biblioteca colocada em placa sobre placas de LB + ampicilina com 5000 a 7000 c.f.u./placa. A biblioteca de cDNA que compreende 1 x 106 clones recombinantes foi armazenada como 1) agrupamentos individuais (5000 a 7000 c.f.u./agrupamento) em glicerol a 25 % a -80° C, 2) grãos de célula dos mesmos agrupamentos a -20° C e 3) DNA plasmídico purificado por Qiagen a partir dos agmpamentos individuais a -20° C (Qiagen Tip 100, Diagen). CLONAGEM DE EXPRESSÃO EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE DOS cDNAs DA BETA -1,4-MANANASE DO HUMICOLA INSOLENS

Alíquotas de um ml de DNA plasmídico purificado (100 ng/ml) dos agrupamentos individuais foram submetidos a eletroporação (200 W, 1,5 kV, 25 mF) em 40 ml de células de S çerevisiaê W3124 eletrocompetente (MATa; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prcl::HIS3, prbl::LEU2; cir +) (OD600 = 1,5 em 500 ml de YPD, lavado duas vezes em DIW frio, uma vez em sorbitol 1 M frio, recolocado em suspensão em 0,5 ml de sorbitol 1 M, Becker & Guarante, 1991). Após a adição de 1 ml de sorbitol frio 1 M, alíquotas de 80 ml foram colocados em placa sobre SC + glicose - uracila para dar 250 a 400 unidades formadoras de colônia por placa e incubadas a 30° C durante 3 a 5 dias. As placas foram replicadas em placas de SC + galactose - uracila, contendo AZC1-galactomanana (MegaZyme, Austrália) incorporado nas placas de agar. No total, ca. 50.000 colônias de levedura da biblioteca do H. insolens foram avaliadas quanto aos clones positivos em mananase.

Os clones positivos foram identificados pela formação de halos azuis de hidrólise em tomo das colônias de levedura correspondente. Os clones foram obtidos como colônias únicas, os insertos de cDNA foram diretamente amplificados a partir dos lisatos de célula de levedura usando-se iniciadores poliligadores pYES biotinilados, purificados por sistema de pérolas magnéticas (Dynabead M-280, Dynal) e caracterizados individualmente pelo sequenciamento do final 5’ de cada clone de cDNA usando-se o método de terminação de cadeia (Sanger et al., 1977) e sistema Sequenase (United States Biochemical).

As colônias de levedura positivas em mananase foram inoculadas em 20 ml de caldo YPD em tubos de 50 ml. Os tubos foram agitados por 2 dias a 30°C e as células foram colhidas por centrifugaçao por 10 minutos a 3000 rpm. O DNA total de levedura foi isolado de acordo com a WO 94/14953, dissolvido em 50 ml de água autoclavada e transformado no E. coli por eletroporação como acima. Os clones de cDNA pYES 2.0 contendo o inserto foram recuperados colocando-se em placa sobre placas de LB + ampicilina agar, o DNA plasmídeo foi isolado a partir do E. coli usando-se procedimentos padrão e analisado pela digestão com enzimas de restrição.

ANÁLISE DE SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO

A sequência de nucleotídeo do clone de cDNA da beta-1,4-mananase do H. insolens de comprimento completo pClM59 foi determinada de ambos os filamentos pelo método de terminação de cadeia didesóxi (Sanger et al, 1977), usando-se 500 ng de padrão purificado por Qiagen (Qiagen, USA), o conjunto de sequenciamento de ciclo de terminal Taq desóxi (Perkin-Elmer, USA), terminadores fluorescentemente rotulados e 5 pmol dos iniciadores poliligadores pYES 2.0 (Invitrogen, USA). A análise dos dados de sequência foi realizada de acordo com Devereux et al, (1984). EXPRESSÃO HETERÓLOGA NO ASPERGILLUS ORYZAE TRANSFORMAÇÃO DO ASPERGILLUS ORYZAE

A transformação do Aspergillus oryzae foi realizada como descrito por Christensen et al, (1988), Biotechnology 6, 1419 a 1422. CONSTRUÇÃO DO CASSETE DE EXPRESSÃO DA BETA-1,4-MANANASE PARA EXPRESSÃO DE ASPERGILLUS O DNA plasmídico foi isolado do clone de mananase pClM59 usando-se procedimentos padrão e analisado pela análise de enzima de restrição. O inserto de cDNA foi excisado usando-se enzimas de restrição apropriadas e ligados no vetor de expressão do Aspergillus pHD414, que é um derivado do plasmídeo p775 (descrito na EP 238023). A construção do pHD414 é ainda descrita na WO 93/11249.

TRANSFORMAÇÃO DO ASPERGILLUS ORYZAE OU ASPERGILLUS NIGER

Procedimento geral: 100 ml de YPD (Sherman et al, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) são inoculados com esporos de A. oryzae ou A. niger e incubados com agitação a 37° C por cerca de 2 dias. O micélio é colhido por filtração através de miracloth e lavado com 200 ml de MgS04 0,6 Μ. O micélio é colocado em suspensão em 15 ml de MgS04 1,2 M, NaH2P04 10 mM, pH = 5,8. A suspensão é esfriada em gelo e 1 ml de tampão contendo 120 mg de Novozym® 234 é adicionado. Após 5 minutos, 1 ml de BSA 12 mg/ml é adicionado e a incubação com agitação suave é continuada por 1,5 a 2,5 horas a 37° C até que uma grande quantidade de protoplastos seja visível em uma amostra inspecionada sob o microscópio. A suspensão é filtrada através de miracloth, o filtrado transferido para um tubo estéril e coberto com 5 ml de sorbitol 0,6 M, Tris-HCl 100 mM, pH 7,0. A centrifugação é realizada por 15 minutos a lOOg e os protoplastos são coletados do topo da almofada de MgS04. 2 volumes de STC são adicionados à suspensão de protoplasto e a mistura é centrifugada por 5 minutos a lOOOg. O grão de protoplasto é recolocado em suspensão em 3 ml de STC e novamente peletizado. Isto é repetido. Finalmente os protoplastos são recolocados em suspensão em 0,2-1 ml de STC. 100 μΐ de suspensão de protoplasto são misturados com 5-25 pg do DNA apropriado em 10 μΐ de STC. Os protoplastos são misturados com p3SR2 (um plasmídeo que carrega o gene amdS do A. nidulans). A mistura é deixada na temperatura ambiente por 25 minutos. 0,2 ml de PEG 4000 a 60 %, CaCl2 10 mM e Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 é adicionado e cuidadosamente misturado (duas vezes) e finalmente 0,85 ml da mesma solução é adicionado e cuidadosamente misturado. A mistura é deixada na temperatura ambiente por 25 minutos, centrifugados a 2500g por 15 minutos e o grão é recolocado em suspensão em 2 ml de sorbitol 1,2 M. Depois de mais uma sedimentação, os protoplastos são disseminados sobre placas apropriadas. Os protoplastos são disseminados sobre placas mínimas para inibir o desenvolvimento de fundo. Após a incubação por 4 a 7 dias a 37° C os esporos foram coletados e disseminados para colônias únicas. Este procedimento foi repetido e os esporos de uma colônia única após a segunda re-isolação são armazenados como um transformante definido.

PURIFrCAÇÃO DOS TRANSFORMANTES DE ASPERGILLUS ORYZÁE

As colônias do Aspergillus oryzae são purificadas através de esporos conidiais em AmdS+-placas (+ 0,01 % de Triton X-100) e cultivadas em YPM por 3 dias a 30° C.

IDENTIFICAÇÃO DE TRANSFORMANTES DE ASPERGILLUS ORYZAE POSITIVOS EM MANANASE

Os sobrenadantes dos transformantes do Aspergillus oryzae foram avaliados quanto à atividade de beta-l,4-mananase sobre placas de agar contendo 0,2 % de AZCl-galactomanana (MegaZyme, Austrália) como substrato. Os transformantes positivos foram identificados analisando-se as placas quanto aos halos azuis de hidrólise após 24 horas de incubação a 30° C.

ANÁLISE DE SDS-PAGE A análise de SDS-PAGE dos sobrenadantes dos transformantes do Aspergillus oryzae que produzem beta-1,4-mananase. Os transformantes foram cultivados em 5 ml de YPM por 3 dias. 10 μΐ de sobrenadante foram aplicados a gel de SDS-poliacrilamida a 12 % que foi subsequentemente corado com Coomassie Brilliant Blue.

PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA MANANASE DO HUMICOLA INSOLENS O gene foi transformado em ads do A. oryzae descrito acima e a cepa transformada foi cultivada em um fermentador usando-se um padrão médio de xarope de maltose, sacarose, MgS04, Ka2P04 e K2S04 e extrato de levedura em ácido cítrico e traços de metais. Incubação durante 6 dias a 34° C com ar. O caldo de fermentação (5000 ml) foi colhido e o micélio separado do líquido por filtraçao. O líquido claro foi concentrado em um filtron para 275 ml. A mananase foi purificada usando-se a cromatografia catiônica. Uma coluna de S-Spharose foi equilibrada com ácido cítrico 25 mM pH 4,0 e a ligação da mananase à coluna e foi eluído usando-se um gradiente de cloreto de sódio (0-0,5 M). As frações ativas em mananase foram reunidas e o pH ajustado para 7,3. Os 100 ml de mananase reunida foram depois concentradas a 5 ml com proteína em tomo de 13 mg por ml e usadas para testes de aplicação. Para uma purificação adicional 2 ml foram aplicados à cromatografia de tamanho em Superdex 200 em tampão de acetato de sódio pH 6,1. A fração ativa em mananase apresentou faixas coradas iguais no SDS-PAGE com um peso molecular dc 45 kDa e 38 kDa, indicando a degradação proteolítica do domínio não catalítico de terminal N. A sequência de aminoácido da enzima mananase, isto é, a sequência traduzida de DNA é apresentada na SEQ ID NO: 14. A sequência de DNA da SEQ ID NO: 13 codifica um peptídeo de sinal nas posições de 1 a 21. Um domínio de função desconhecida também encontrado em outras mananases é representado na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14 nas posições de 22 a 159 e o domínio catalítico ativo é encontrado nas posições de 160 a 488 da SEQ ID NO: 14, A mais alta homologia de sequência foi encontrada para DICTYOGLOMUS THERMOPHILUM (49 % de identidade); sequência de mananase EMBL; AF013989 apresentada por REEVES R. A., GIBBS M. D., BERGQUIST P. L., apresentada em julho de 1997, Peso Molecular: 38 kDa. DSC em tampão de acetato de sódio, pH 6,0 foi de 65°. O perfil de atividade em pH usando-se o ensaio de ManU (incubação por 20 minutos a 40° C) apresenta que a enzima tem uma atividade ótima no pH 8. O ótimo de temperatura foi descoberto (usando-se o ensaio de ManU, goma de alfarroba AZCL, Megazyme como o substrato) como sendo 70° C no pH 10.

Propriedades imunológicas: o soro monoespecffíco policlonal de coelho foi incitado contra a mananase clonada altamente purificada usando-se técnicas convencionais na companhia Dinamarquesa DAKO. O soro formou um bom e único precipitado em géis de agarose com a mananase bruta não purificada da invenção. EXEMPLO 15 Avaliação de lavagem da família de 26 mananases do Humicola insolens O desempenho de lavagem foi avaliado lavando-se uma amostra de tecido revestida com goma de alfarroba em uma solução de detergente com a mananase da invenção. Após a lavagem o efeito foi visualizado sujando-se as amostras de tecido com óxido de ferro.

Preparação das amostras de tecido com goma de alfarroba: amostras de tecidos de algodão limpas foram embebidas em uma solução de 2 g/litro de goma de alfarroba e secadas durante a noite na temperatura ambiente. As amostras de tecido foram pré lavadas em água e novamente secadas.

Lavagem: As amostras de tecido com goma de alfarroba, pequenas, circulares foram colocadas em um béquer com 6,7 g/litro de Ariel Futur líquido em água a 15°dH e incubadas por 30 minutos a 40° C com agitação magnética. As amostras de tecido foram enxaguadas em água de torneira e secadas.

Sujeira: As amostras de tecido foram colocadas em um béquer com 0,25 g/litro de Fe203 e agitadas por 3 minutos. As amostra foram enxaguadas em água de torneira e secadas.

Avaliação: A remissão das amostras de tecido foi medida a 440 nm usando-se um espectrofotômetro de remissão MacBeth ColorEye 7000.

Os resultados são expressos como: DcltS d6 remissão QLpós lavagem - ^aníes da lavagemlenzima ” C^após lavagem "" Rantes da lavagemlcontrole’ onde R é a remissão a 440 nm. A mananase desta invenção é claramente eficaz nas amostras de tecido com goma de alfarroba, com um desempenho de lavagem ligeiramente melhor do que a mananase de controle do Bacillus sp. 1633. O desempenho de lavagem da família de 26 mananases do Humicola insolens comparado à mananase do Bacillus sp. 1633 (Exemplos de 1 a 3) dados como valores de delta de remissão: Dose de enzima em Mananase de I633mananase mg/1 Humicola insolens Bacillus sp. 0 0 0 0,01 6,6 5,0 0,1 9,3 8,6 1.0 10,2 77 10.0 10,5 9,7 EXEMPLOS DE 16 a 40 Os seguintes exemplos são intencionados a exemplificar as composições da presente invenção, mas não são necessariamente intencionados a limitar ou de outro modo definir o escopo da invenção, Nas composições de detergente, os níveis de enzimas são expressados por enzima pura em peso da composição total e a menos que de outro modo especificado, os ingredientes detergentes são expressos em peso das composições totais, Aqui as identificações abreviadas de componente têm os seguintes significados: LAS : Alquila Cn-13 linear benzeno sulfonato de sódio, TAS : Alquil sulfato sódico de sebo, CxyAS : Alquila Clx - C]y sulfato de sódio, CxySAS : (2,3) Alquila C)x - Cly secundária sulfato de sódio, r CxyEz : Álcool C]x - Cly primário, predominantemente linear condensado com uma média de z moles de óxido de etileno, CxyEzS : Alquila Clx - CJy sulfato de sódio condensado com uma média de z moles de óxido de etileno, QAS : R2,N+(CH3)2(C2H4OH) com R2 = CI2-C14 QAS 1 : R2,N+(CH3)2(C2H4OH) com R2 = C8-C„, APA : Amido propil dímetil amina Cg-10, Soap : Carboxilato sódico de alquila linear derivado de uma mistura 80/20 de ácidos graxos de sebo e de coco, Não iônico : Álcool graxo C13-C15 misto etoxilado/propoxilado com um grau médio de etoxilação de 3,8 e um grau médio de propoxilação de 4,5, r Neodol 45-13 : Álcool primário linear CJ4-C15 etoxilado, vendido pela Shell Chemical CO, STS : Tolueno sulfonato de sódio, CFAA : Alquila C12-C,4 N-metil glicamida, TFAA : Alquila CI6-Clg N-metil glicamida, TPKFA : Ácidos graxos Cl2~C14 de corte integral de topo, Silicato : Silicato de sódio amorfo (relação Si02;Na20 = 1,6 a 3,2), Metassilicato : Metassilicato de sódio (relação Si02:Na20 = 1,0), Zeólito A : Aluminossilicato de sódio hidratado da fórmula Na]2(A102Si02)12, 27H20 tendo um tamanho de partícula primária na faixa de 0,1 a 10 micrômetros (Peso expresso em uma base anidra), Na-SKS-6 : Silicato cristalino disposto em camada da fórmula ô-Na2Si205, Citrato : Citrato trissódico diidratado de atividade de 86,4 % com uma distribuição de tamanho de partícula entre 425 e 850 micrômetros, Cítrico : Ácido cítrico anidro, Borato : Borato de sódio Carbonato : Carbonato de sódio anidro com um tamanho de partícula entre 200 e 900 micrômetros, Bi carbonato : Hidrogeno carbonato de sódio anidro com uma distribuição de tamanho de partícula entre 400 e 1200 micrômetros, Sulfato : Sulfato de sódio anidro, Mg Sulfato : Sulfato de magnésio anidro, STPP : Tripolifosfato de sódio, TSPP : Pirofosfato Tetrassódico, MA/AA : Copolímero aleatório de acrilato/maleato 4:1, peso molecular médio de cerca de 70.00 a 80.000, MA/AA 1 : Copolímero aleatório de acrilato/maleato 6:4, peso molecular médio de cerca de 10.000, AA : Polímero de poliacrilato de sódio de peso molecular médio de 4,500, r PA30 : Acido poliacrílico de peso molecular médio entre cerca de 4.500 a 8.000, 480N : Copolímero aleatório de acrilato/metacrilato 7:3, peso molecular médio de cerca de 3,500, Polygel/carbopo: Poliacrilatos reticulados de alto peso molecular, PB1 : Perborato de sódio anidro monoidratado de fórmula nominal NaB02,H202, PB4 : Perborato de sódio tetraidratado de fórmula nominal NaB 02,3 H20,H202, Percarbonato : Percarbonato de sódio anidro de fórmula nominal 2Na2C03,3H202, NaDCC : Dicloroisocianurato de sódio, TAED : Tetxaacetiletilenodiamina, NOBS : Sulfonato de Nonanoiloxybenzeno na forma do Sal de sódio, NACA-OBS : (6-nonamidocaproil) oxybenzeno sulfonato, __ r DTPA : Acido dietileno triamino pentaacético, r HEDP : Acido 1,1 -hidroxietano difosfônico, DETPMP : Dietiltriamino penta (metileno) fosfonato, comercializado pela Monsanto sob o nome comercial de Dequest 2060, EDDS : Ácido etilenodiamino-N,N’-dissuccímco, (S,S) isômero na forma do seu sal de sódio, MnTACN : l,4,7-trimetil-l,4,7-triazaciclononano de manganês, Branqueador : Ftalocianina de zinco sulfonada encapsulada em fotoativado polímero solúvel em destrina Branqueador : Alumino ftalocianina sulfonada encapsulada em Fotoativado 1 em polímero solúvel de dextrina, PAAC : Sal de cobalto (III) de pentaamino acetato, Parafina : Óleo de parafina vendido sob o nome comercial Winog 70 pela Wintershall, NaBz : Benzoato de sódio, BzP : Peróxido de Benzoíla, Mananase : Como aqui descrita, Protease : Enzima proteolítica vendida sob o nome comercial Savinase, Alcalase, Durazym pela Novo Nordisk A/S, Maxacal, Maxapem vendidos pela Gist-Brocades e as proteases descritas nas patentes WO 91/06637 e/ou WO 95/10591 e/ou EP 251 446, Amilase : Enzima amilolítica vendida sob o nome comercial Purafact Ox AmR descrita nas WO 94/18314 e WO 96/05295 vendida pela Genencor; Termamyl®, Fungamyl® e Duramyl®, todas disponíveis da Novo Nordisk AIS e aquelas descritas na WO 95/26397, Lipase : Enzima lipolítica vendida sob o nome comercial de Lipolase, Lipolase Ultra pela Novo Nordisk A/S e Lipomax pela Gist-Brocades, Celulase : Enzima celulítica vendida sob o nome comercial Carezyme, Celluzyme e/ou Endolase pela Novo Nordisk A/S, CMC : Celulose carboximetílica sódica, PVP : Polímero polivinílico, com um peso molecular médio de 60.000, PVNO : Polivinilpiridina-N-óxido, com um peso molecular médio de 50.000, PVPVI : Copolímero de vinilimidazol e vinilpirrolidona, com um peso molecular médio de 20,000, Abrilhantador 1: 4,4'-bis(2~sulfoestiril)bifenil dissódico, Abrilhantador 2: 4,4,-bis(4-anilino-6-morfolino-l,3,5-triazin-2-il)- estilbeno-2:2'-dissulfonato de dissódio, Silicona anti- ; Controlador de espuma de polidimetilsiloxano com espuma copolímero de siloxano-oxialquileno como agente dispersante com uma relação do dito controlador de espuma para o dito agente dispersante de 10:1 a 100:1, Supressor de : 12 % de Silicona/sílica, 18 % de álcool estearílico, espuma 70 % de amido na forma granular, Opacificador : Mistura aquosa de látex de monoestireno, vendida pela BASF Aktiengesellschaft sob o nome comercial de Lytron 621. SRP 1 : Polí ésteres de extremidade anionicamente encapuzados, SRP2 : Polímero de bloco curto de poli(l,2-propileno tereftalato) dietoxílado, QEA : bis((C2Hs0)(C2H40)n)(CH3)-N+-C,Hl2-N+- (CH3)bis((C2H50)-(C2H40))n, em que n = de 20 a 30, PEI : Polietilenoimina com um peso molecular médio de 1800 e um grau médio de etoxilação de 7 resíduos de etilenoóxi por nitrogênio, SCS : Cumeno sulfonato de sódio, HMWPEO : Óxido de polietileno de alto peso molecular, PEGx : Polietileno glícol de um peso molecular de x, PEO : Óxido de polietileno com um peso molecular médio de 5.000; TEPAE : Tetraetilenopentaamina etoxilada, BTA : Benzotriazol, PH : Medido como uma solução a 1 % em água destilada a 20°C, EXEMPLO 16 As seguintes composições detergentes de lavar roupas de alta densidade foram preparadas de acordo com a presente invenção: ι ιι ιπ iv ν νι LAS 8,0 8,0 8,0 2,0 6,0 6,0 TAS - 0,5 - 0,5 1,0 0,1 C46 (S)AS 2,0 2,5-- - C25AS --- 7,0 4,5 5,5 C68AS 2,0 5,0 7,0 - - C25E5 - - 3,4 10,0 4,6 4,6 C25E7 3,4 3,4 1,0 - - C25E3S --- 2,0 5,0 4,5 QAS -0,8-- - - QAS 1 ---0,8 0,5 1,0 Zeólito 18,1 18,0 14,1 18,1 20,0 18,1 Cítrico --- 2,5 - 2,5 Carbonato 13,0 33,0 27,0 10,0 10,0 13,0 Na-SKS-6 - - - 10,0 - 10,0 Silicato 1,4 1,4 3,0 0,3 0,5 0,3 Citrato - 1,0 - 3,0 Sulfato 26,1 26,1 26,1 6,0 Mg sulfato 0,3 - - 0,2 - 0,2 MA/AA 0,3 0,3 0,3 4,0 1,0 1,0 CMC 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4 0,4 PB4 9,0 9,0 5,0 Percarbonato ... . 18,0 18,0 TAED 1,5 0,4 1,5 - 3,9 4,2 NACA-OBS 2,0 1,0 DETPMP 0,25 0,25 0,25 0,25 SRP 1 0,2 0,2 EDDS - 0,25 0,4 - 0,5 0,5 CFAA - 1,0 - 2,0 - HEDP 0,3 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 QEA 0,2 - 0,5 Protease 0,009 0,009 0,01 0,04 0,05 0,03 Mananase 0,05 0,009 0,03 0,009 0,03 0,009 Amilase 0,002 0,002 0,002 0,006 0,008 0,008 Celulase 0,0007 - - 0,0007 0,0007 0,0007 Lipase 0,006 - - 0,01 0,01 0,01 Branqueador fotoativado (ppm) 15 15 15 - 20 20 PVNO/PVPVI - - - 0,1 Abrilhantador 1 0,09 0,09 0,09 - 0,09 0,09 Perfume 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 Silicona anti-espuma 0,5 0,5 0,5 - 0,3 0,3 Densidade em g/litroMiscelânea e 850 850 0,5 850 850 850 menores Miscelânea e menores até 100% EXEMPLO 17 As seguintes composições detergentes granulares de lavar roupas de utilidade particular sob condições de lavagem em máquina Européia foram preparadas de acordo com a presente invenção: ι π m ιν ν vi LAS 5,5 7,5 5,0 5,0 6,0 7,0 TAS 1,25 1,9 - 0,8 0,4 0,3 C46 (S)AS/C25AS - 2,2 5,0 5,0 5,0 2,2 C25E3S - 0,8 1,0 1,5 3,0 1,0 C45E7 3,25 ... - 3,0 TFAA 2,0 - C25E5 5,5 - QAS 0,8 - QAS 1 - 0,7 1,0 0,5 1,0 0,7 STPP 19,7 - - ZeólitoA - 19,5 25,0 19,5 20,0 17,0 Na-SKS-6/ácido cítrico (79:21) - 10,6 - 10,6 Na-SKS-6 - 9,0 10,0 10,0 Carbonato 6,1 21,4 9,0 10,0 10,0 18,0 Bicarbonato - 2,0 7,0 5,0 - 2,0 Silicato 6,8 - - 0,3 0,5 Citrato - - 4,0 4,0 Sulfato 39,8 5,0 - 12,0 Mg sulfato - - 0,1 0,2 0,2 MA/AA 0,5 1,6 3,0 4,0 1,0 1,0 CMC 0,2 0,4 1,0 1,0 0,4 0,4 PB4 5,0 12,7 - Percarbonato - - - - 18,0 15,0 TAED 0,5 3,1 - 5,0 NACA-OBS 1,0 3,5 - - - 2,5 DETPMP 0,25 0,2 0,3 0,4 - 0,2 HEDP - 0,3 - 0,3 0,3 0,3 QEA - - 1,0 1,0 1,0 Protease 0,009 0,03 0,03 0,05 0,05 0,02 Mananase 0,03 0,03 0,001 0,03 0,005 0,009 Lipase 0,003 0,003 0,006 0,006 0,006 0,004 Celulase 0,0006 0,000 0,0005 0,0005 0,0007 0,0007 Amilase 0,002 0,002 0,006 0,006 0,01 0,003 PVNO/PVPVI - 0,2 0,2 PVP 0,9 1,3 - - - 0,9 SRP 1 0,2 0,2 0,2 Alvcj ante fotoativado (ppm) 15 27 - - 20 20 Alvejante fotoativado 1 (ppm) 15 - Abrilhantador 1 0,08 0,2 - - 0,09 0,15 Abrilhantador 2 - 0,04 - Perfume 0,3 0,5 0,4 0,3 0,4 0,3 Silicona anti-espuma 0,5 2,4 0,3 0,5 0,3 2,0 Densidade em g/litro 750 750 750 750 750 750 Miscelânea e menores até 100% EXEMPLO 18 As seguintes composições detergentes de utilidade particular sob condições de lavagem de máquina Européia foram preparadas de acordo com a presente invenção: I II III IV Pó soprado LAS 6,0 5,0 11,0 6,0 TAS 2,0 - - 2,0 Zeólito A 24,0 - - 20,0 STPP - 27,0 24,0 Sulfato 4,0 6,0 13,0 MA/AA 1,0 4,0 6,0 2,0 Silicato 1,0 7,0 3,0 3,0 CMC 1,0 1,0 0,5 0,6 Abrilhantador 1 0,2 0,2 0,2 0,2 Antiespuma de silicone 1,0 1,0 1,0 0,3 DETPMP 0,4 0,4 0,2 0,4 Pulverização Abrilhantador 0,02 - - 0,02 C45E7 - - . - 5,0 C45E2 2,5 2,5 2,0 C45E3 2,6 2,5 2,0 Perfume 0,5 0,3 0,5 0,2 Antiespuma de silicone 0,3 0,3 0,3 Aditivos secos QEA - 1,0 EDDS 0,3 - - Sulfato 2,0 3,0 5,0 10,0 Carbonato 6,0 13,0 15,0 14,0 Cítrico 2,5 - - 2,0 QAS 1 0,5 - - 0,5 Na-SKS-6 10,0 Percarbonato 18,5 PB4 - 18.0 10,0 21,5 TAED 2,0 2,0 - 2,0 NACA-OBS 3,0 2,0 4,0 Protease 0,03 0,03 0,03 0,03 Mananase 0,009 0,01 0,03 0,001 Lipase 0,008 0,008 0,008 0,004 Amilase 0,003 0,003 0,003 0,006 Abrilhantador 1 0,05 - - 0,05 Miscelânea e menores até 100% EXEMPLO 19 As seguintes composições detergentes granulares foram preparadas de acordo com a presente invenção: I II III IV V VI Pó soprado LAS 23,0 8,0 7,0 9,0 7,0 7,0 TAS - - - 1,0 C45AS 6,0 6,0 5,0 8,0 C45AES - 1,0 1,0 1,0 C45E35 10,0 - - - 2,0 4,0 Zeólito A - 18,0 14,0 12,0 10,0 10,0 MA/AA 7,0 0,5 - - - 2,0 MA/AA 1 ------ AA 5,0 3,0 3,0 2,0 3,0 3,0 Sulfato 10,0 6,3 14,3 11,0 15,0 19,3 Silicato 15,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Carbonato 0,4 20,0 10,0 20,7 8,0 6,0 PEG 4000 - 1,5 1,5 1,0 1,0 1,0 DTP A 0,3 0,9 0,5 - - 0,5 Abrilhantador 2 0,2 0,3 - 0,1 0,3 Pulverização C45E7 3,0 2,0 - - 2,0 2,0 C25E9 - - 2,0 C23E9 0,3 - 1,5 2,0 - 2,0 Perfume 0,3 0,3 0,3 0,3 Aglomerados C45AS - 5,0 5,0 2,0 - 5,0 LAS - 2,0 2,0 - - 2,0 Zeólito A - 7,5 7,5 8,0 - 7,5 Carbonato - 4,0 4,0 5,0 - 4,0 PEG 4000 - 0,5 0,5 - - 0,5 Miscelânea (água, etc.) - 2,0 2,0 2,0 - 2,0 Aditivos secos QAS - - - 1,0 Cítrico - - 2,0 PB4 - - - - 12,0 1,0 PB1 4,0 1,0 3,0 2,0 Percarbonato - - - - 2,0 10,0 Carbonato - 5,3 1,8 - 4,0 4,0 NOBS 4,0 6,0 - 0,6 Metil celulose 0,2 . Na-SKS-6 8,0 STS 2,0 1,0 Ácido sulfônico culmeno - 1,0 - - - 2,0 Protease 0,02 0,02 0,02 0,01 0,02 0,02 Mananase 0,0009 0,01 0,03 0,009 0,01 0,001 Lipase 0,004 - 0,004 - 0,004 0,008 Amilase 0,003 - 0,002 - 0,003 Celulase 0,0005 0,0005 0,0005 0,000 0,0005 0,0005 PVPVI - - - - 0,5 0,1 PVP .... 0,5 PVNO - - 0,5 0,3 QEA - - - 1,0 - SRP1 0,2 0,5 0,3 - 0,2 Antiespuma de silicone 0,2 0,4 0,2 0,4 0,1 Sulfato de Mg 0,2 0,2 Miscelânea e menores Até 100% EXEMPLO 20 As seguintes composições detergentes não contendo nenhum branqueador de uso particular na lavagem de roupas coloridas foram preparadas de acordo com a presente invenção I II III Pó soprado Zeólito A 15,0 15,0 Sulfato - 5,0 LAS 3,0 3,0 DETPMP 0,4 0,5 CMC 0,4 0,4 MA/AA 4,0 4,0 Aglomerados C45AS - - 11,0 LAS 6,0 5,0 TAS 3,0 2,0 Silicato 4,0 4,0 Zeólito A 10,0 15,0 13,0 CMC - - 0,5 MA/AA - - 2,0 Carbonato 9,0 7,0 7,0 Pulverização Perfume 0,3 0,3 0,5 C45E7 4,0 4,0 4,0 C25E3 2,0 2,0 2,0 Aditivos secos MA/AA - - 3,0 Na-SKS-6 - - 12,0 Citrato 10,0 - 8,0 Bicarbonato 7,0 3,0 5,0 Carbonato 8,0 5,0 7,0 PVPVI/PVNO 0,5 0,5 0,5 Protease 0,03 0,02 0,05 Mananase 0,001 0,004 0,03 Lipase 0,008 0,008 0,008 Amilase 0,01 0,01 0,01 Celulase 0,001 0,001 0,001 Antiespuma de silicone 5,0 5,0 5,0 Sulfato - 9,0 Densidade (g/í) 700 700 700 Miscelânea e menores Até 100% EXEMPLO 21 As seguintes composições detergentes foram preparadas de acordo com a presente invenção: I II III TV

Grânulo base ZeólitoA 30,0 22,0 24,0 10,0 Sulfato 10,0 5,0 10,0 7,0 MA/AA 3,0 AA - 1,6 2,0 MA/AA 1 - 12,0 - 6,0 LAS 14,0 10,0 9,0 20,0 C45AS 8,0 7,0 9,0 7,0 C45AES - 1,0 1,0 Silicato - 1,0 0,5 10,0 Sabão - 2,0 Abrilhantador 1 0,2 0,2 0,2 0,2 Carbonato 6,0 9,0 10,0 10,0 PEG 4000 - 1,0 1,5 DTP A 0,4 Pulverização C25E9 - - - 5,0 C45E7 1,0 1,0 C23E9 - 1,0 2,5 Perfume 0,2 0,3 0,3 Aditivos secos Carbonato 5,0 10,0 18,0 8,0 PVPVI/PVNO 0,5 - 0,3 Protease 0,03 0,03 0,03 0,02 Mananase 0,002 0,009 0,015 0,03 Lipase 0,008 - - 0,008 Amilase 0,002 - - 0,002 Celulase 0,0002 0,0005 0,0005 0,0002 NOBS - 4,0 - 4,5 PB1 1,0 5,0 1,5 6,0 Sulfato 4,0 5,0 - 5,0 SRP 1 0,4 Supressores de espuma - 0,5 0,5 Miscelânea e menores Até 100% EXEMPLO 22 As seguintes composições detergentes granulares foram preparadas de acordo com a presente invenção: I M III Pó soprado ZeólitoA 20,0 - 15,0 STPP - 20,0 Sulfato - - 5,0 Carbonato - - 5,0 TAS - - 1,0 LAS 6,0 6,0 6,0 C68AS 2,0 2,0 Silicato 3,0 8,0 MA/AA 4,0 2,0 2,0 CMC 0,6 0,6 0,2 Abrilhantador 1 0,2 0,2 0,1 DETPMP 0,4 0,4 0,1 STS - - 1,0 Pulverização C45E7 5,0 5,0 4,0 Antiespuma de silicone 0,3 0,3 0,1 Perfume 0,2 0,2 0,3 Aditivos secos QEA - - 1,0 Carbonato 14,0 9,0 10,0 PB1 1,5 2,0 PB 4 18,5 13,0 13,0 TAED 2,0 2,0 2,0 QAS - - 1,0 Alvejante fotoativado 15 ppm 15ppm 15 rpm Na-SKS-ó - - 3,0 Protease 0,03 0,03 0,007 Mananase 0,001 0,005 0,02 Lipase Amilase 0,004 0,004 0,004 Celulase 0,006 0,006 0,003 Sulfato 0,0002 0,0002 0,0005 Densidade (g/1) 10,0 20,0 5,0 700 700 700 Miscelânea e outros Até 100% EXEMPLO 23 As seguintes composições detergentes foram preparadas de acordo com a presente invenção: I II III Pó soprado Zeólito A 15,0 15,0 15,0 Sulfato - 5,0 LAS 3,0 3,0 3,0 QAS - 1,5 1,5 DETPMP 0,4 0,2 0,4 EDDS - 0,4 0,2 CMC 0,4 0,4 0,4 MA7AA 4,0 2,0 2,0 Aglomerados LAS 5,0 5,0 5,0 TAS 2,0 2,0 1,0 Silicato 3,0 3,0 4,0 Zeólito A 8,0 8,0 8,0 Carbonato 8,0 8,0 4,0 Pulverização Perfume 0,3 0,3 0,3 C45E7 2,0 2,0 2,0 C25E3 2,0 Aditivos secos Ci trato 5,0 - 2,0 Bicarbonato - 3,0 Carbonato 8,0 15,0 10,0 TAED 6,0 2,0 5,0 PB1 14,0 7,0 10,0 PEQ - - 0,2 Argila de bentonia - - 10,0 Protease 0,03 0,03 0,03 Mananase 0,001 0,005 0,01 Lipase 0,008 0,008 0,008 Celulase 0,001 0,001 0,001 Amilase 0,01 0,01 0,01 Antiespuma de silicone 5,0 5,0 5,0 Sulfato - 3,0 Densidade (g/I) 850 850 850 Miscelânea e outros Até 100% EXEMPLO 24 As seguintes composições detergentes foram preparadas de acordo com a presente invenção: I II III IV LAS 18,0 14,0 24 0 20,0 QAS 0,7 1,0 - 0,7 TFAA - 1,0 - C23E56,5 - 1,0 - C45E7 - 1,0 C45E3S 1,0 2,5 1,0 STPP 32,0 18,0 30,0 22,0 Silicato 9,0 5,0 9,0 ,8,0 Carbonato 11,0 7,5 10,0 5,0 Bicarbonato - 7,5 - PB1 3,0 1,0 PB4 - 1,0 - NOBS 2,0 1,0 - - DETPMP - 1,0 - - DTP A 0,5 - 0,2 0,3 SRP 1 0,3 0,2 - 0,1 MA/AA 1,0 1,5 2,0 0,5 CMC 0,8 0,4 0,4 ,0,2 PEI - - 0,4 Sulfato 20,0 10,0 20,0 30,0 Mg sulfato 0,2 - 0,4 0,9 Mananase 0,001 0,005 0,01 0,015 Protease 0,03 0,03 0,02 0,02 Amilase 0,008 0,007 - 0,004 Lipase 0,004 - 0,002 Celulase 0,0003 - - 0,0001 Branqueador 30 ppm 20 ppm - 10 ppm Fotoativado Perfume 0,3 0,3 0,1 0,2 Abrilhantador 1/2 0,05 0,02 0,08 0,1 Miscelânea e menores Até 100 % EXEMPLO 25 As seguintes formulações detergentes líquidas foram preparadas de acordo com a presente invenção (Os teores são dados em partes em peso, as enzimas são expressas em enzima pura) I II III iv v LAS 11,5 8,8 - 3,9 C25E2,5S - 3,0 18,0 - 16,0 C45E2,25S 11,5 3,0 - 15,7 C23E9 - 2,7 1,8 2,0 1,0 C23E7 3,2 - CFAA - - 5,2 3,1 TPKFA 1,6 - 2,0 0,5 2,0 Cítrico (50%) 6,5 1,2 2,5 4,4 2,5 Formiato de Ca 0,1 0,06 0,1 Formiato de Na 0,5 0,06 0,1 0,05 0,05 SCS 4,0 1,0 3,0 1,2 Borato 0,6 - 3,0 2,0 2,9 hidróxido de Na 5,8 2,0 3,5 3,7 2,7 Etanol 1,75 1,0 3,6 4,2 2,9 1.2 Propanodiol 3,3 2,0 8,0 7,9 5,3 Monoetanolamina 3,0 1,5 1,3 2,5 0,8 TEPAE 1,6 - 13 1,2 2 Mananase 0,001 0,01 0,015 0,015 0,001 Protease 0,03 0,01 0,03 0,02 0,02 Lipase - - 0,002 Amilase - - - 0,002 Celulase - - 0,0002 0,0005 0,0001 SRP1 0,2 - 0,1 - DTP A - - 0,3 - PVNO - - 0,3 0,2 Abrilhantador 1 0,2 0,07 0,1 Anti-espumante 0,04 0,02 0,1 0,1 0,1 de silicona Miscelânea e água EXEMPLO 26 As seguintes formulações detergentes líquidas foram preparadas de acordo com a presente invenção (Os teores são dados em partes em peso, as enzimas são expressas em enzima pura) I II III IV LAS 10,0 13,0 9,0 C25AS 4,0 1,0 2,0 10,0 C25E3S 1,0 - - 3,0 C25E7 6,0 8,0 13,0 2,5 TFAA 4,5 APA - 1,4 TPKFA 2,0 - 13,0 7,0 Cítrico 2,0 3,0 1,0 1,5 Ácido Dodecenil/ 12,0 10,0 tetradecenil succínico Ácido graxo de 4,0 2,0 1,0 semente de colza Etanol 4,0 4,0 7,0 2,0 1.2 Propanodiol 4,0 4,0 2,0 7,0 Monoetanolamina - - - 5,0 Trietanolamina - - 80 TEPAE 0,5 - 0,5 0,2 DETPMP 1,0 1,0 0,5 1,0 Mananase 0,001 0,015 0,01 0,03 Protease 0,02 0,02 0,01 0,008 Lipase - 0,002 - 0,002 Amilase 0,004 0,004 0,01 0,008 Celulase - 0,002 SRP 2 0,3 - 0,3 0,1 Ácido bórico 0,1 0,2 1,0 2,0 Cloreto de Ca - 0,02 - 0,01 Abrilhantador 1 - 0,4 Supressor de 0,1 0,3 - 0,1 espuma Opacificador 0,S 0,4 - 0,3 NaOHatépH 8,0 8,0 7,6 7,7 Miscelânea e água EXEMPLO 27 As seguintes composições deterg entes líquidas foram preparadas de acordo com a presente invenção (Os níveis são dados em partes em peso, a enzima são expressas em enzima pura) I II III IV LAS 25,0 C25AS - 13,0 18,0 15,0 C25E3S - 2,0 2,0 4,0 C25E7 - - 4,0 4,0 TFAA - 6,0 8,0 8,0 APA 3,0 1,0 2,0 TPKFA - 15,0 11,0 11,0 Cítrico 1,0 1,0 1,0 1,0 Ácido dodecenil/ 15,0 ... tetradecenil succínico Ácido graxo de 1,0 - 3,5 semente de colza Etanol 7,0 2,0 3,0 2,0 1,2 Propanodiol 6,0 8,0 10,0 13,0 Monoetanolamina - - 9,0 9,0 TEPAE - - 0,4 0,3 DETPMP 2,0 1,2 1,0 Mananase 0,001 0,0015 0,01 0,01 Protease 0,05 0,02 0,01 0,02 Lipase - - 0,003 0,003 Amílase 0,004 0,01 0,01 0,01 Celulase - - 0,004 0,003 SRP 2 - - 0,2 0,1 Ácido bórico 1,0 1,5 2,5 2,5 Argila Bentonita 4,0 4,0 Abrilhantador 1 0,1 0,2 0,3 Supressor de espuma 0,4 - Opacifícador 0,8 0,7 NaOHatépH 8,0 7,5 8,0 8,2 Miscelânea e água EXEMPLO 28 As seguintes composições detergentes líquidas foram preparadas de acordo com a presente invenção (Os teores são dados em partes em peso, as enzimas são expressas em enzima pura) I II LAS 27,6 18,9 C45AS 13,8 5,9 C13E8 3,0 3,1 Ácido Oléico 3,4 2,5 Cítrico 5,4 5,4 Hidróxido Na 0,4 3,6 Formiato de Ca 0,2 0,1 Formiato de Na - 0,5 Etanol 7,0 Monoetanolamina 16,5 8,0 1,2 propanodiol 5,9 5,5 Ácido xileno sulfômco - 2,4 TEPAE 1,5 0,8 Protease 0,05 0,02 Mananase 0,001 0,01 PEG - 0,7 Abrilhantador 2 0,4 0,1 Perfume 0,5 0,3 Água e Menores EXEMPLO 29 As seguintes composições detergentes granulares de tecido que fornece capacidade de “maciez através da lavagem” foram preparadas de acordo com a presente invenção I II C45AS - 10,0 LAS 7,6 C68AS 1,3 C45E7 4,0 C25E3 - 5,0 Hidróxi alquil-dimetil de coco 1,4 1,0 cloreto de etil amônio Citrato 5,0 3,0 Na-SKS-6 - 11,0 Zeólito A 15,0 15,0 MA/AA 4,0 4,0 DETPMP 0,4 0,4 PB1 15,0 Percarbonato - 15,0 TAED 5,0 5,0 Argila Smectita 10,0 10,0 HMWPEO - 0,1 Mananase 0,001 0,01 Protease 0,02 0,01 Lipase 0,02 0,01 Amilase 0,03 0,005 Celulase 0,001 Silicato 3,0 5,0 Carbonato 10,0 10,0 Supressor de espuma 1,0 4,0 CMC 0,2 0,1 Miscelânea e menores até 100 % EXEMPLO 30 A seguinte composição amaciante de tecido adicionada no enxágue foi preparada de acordo com a presente invenção DEQA (2) 20,0 Mananase 0,0008 Celulase 0,001 HC1 0,03 Agente anti-espumante 0,01 Corante Azul 25 ppm CaC12 0,20 Perfume 0,90 Miscelânea e água até 100 % EXEMPLO 31 As seguintes composições condicionadoras adicionadas com amaciante e secante de tecidos foram preparadas de acordo com a presente invenção; i II III iv v DEQA 2,6 19,0 DEQA(2) - - - - 51,8 DTMAMS - - - 26,0 SDASA - - 70,0 42,0 40,2 Ácido esteárico de IV=0 0,3 - Neodol 45-13 - - 13,0 Ácido Hidroclórico 0,02 0,02 ...

Etanol - - 1,0 Mananase 0,0008 0,0002 0,0005 0,005 0,0002 Perfume 1,0 1,0 0,75 1,0 1,5 Glycoperse S-20 - - - - 15,4 Monostearato - - - 26,0 de glicerol Digeranil Succinato - - 0,38 Anti-espumante 0,01 0,01 de silicona Eletrólito - 0,1 Argila - - - 3,0 - Corante 10 ppm 25 ppm 0,01 Água e menores 100% 100 % - EXEMPLO 32 As seguintes composições detergentes de barra de lavar roupa foram preparadas de acordo com a presente invenção (Os teores são dados em partes em peso, as enzimas são expressas em enzima pura) I II III VI V III vi v LAS - - 19,0 15,0 21,0 6,75 8,8 C28AS 30,0 13,5 - - - 15,75 11,2 22,5 Laurato de Na 2,5 9,0 ------ Zeólito A 2,0 1,25 - - - 1,25 1,25 1,25 Carbonato 20,0 3,0 13,0 8,0 10,0 15,0 15,0 10,0 Carbonato 27,5 39,0 35,0 - - 40,0 - 40,0 de Ca Sulfato 5,0 5,0 3,0 5,0 3,0 5,0 TSPP 5,0 - - - 5,0 2,5 STPP 5,0 15,0 10,0 - - 7,0 8,0 10,0 Argila - 10,0 --5,0--- Bentonita DETPMP - 0,7 0,6 - 0,6 0,7 0,7 0,7 CMC - 1,0 1,0 1,0 1,0 - - 1,0 Talco - - 10,0 15,0 10,0 Silicato - - 4,0 5,0 3,0 - PVNO 0,02 0,03 - 0,01 - 0,02 MA/AA 0,4 1,0 - - 0,2 0,4 0,5 0,4 SRP 1 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Mananase 0,001 0,001 0,01 0,01 0,015 0,001 0,05 0,01 Amilase - - 0,01 - - 0,002 Protease 0,001 0,004 0,001 0,003 0,003 0,001 0,001 0,003 Lipase - 0,002 - 0,002 - Celulase - ,0003 - - ,0003 ,0002 PEO - 0,2 - 0,2 0,3 - - 0,3 Perfume 1,0 0,5 0,3 0,2 0,4 - - 0,4 Sulfato Mg - - 3,0 3,0 3,0 - Abrilhantador 0,15 0,1 0,15 - - - - 0,1 Branqueador 15,0 15,0 15,0 15,0 - - 15,0 fotoativado (ppm) EXEMPLO 33 As seguintes composições detergentes aditivas foram preparadas de acordo com a presente invenção I II III LAS - 5,0 5,0 STPP 30,0 - 20,0 Zeólito A - 35,0 20,0 PB1 20,0 15,0 TAED 10,0 8,0 Mananase 0,001 0,01 0,01 Protease 0,3 0,3 0,3 Amilase - 0,06 0,06 Menores, água e miscelâneas Até 100 % EXEMPLO 34 As seguintes composições detergentes de lavar louças compactas de alta densidade (0,96 Kg/litro) foram preparadas de acordo com a presente invenção I II III IV V VI VII VIII STPP - - 54,3 51,4 51,4 - - 50,9 Citrato 35,0 17,0 - - - 46,1 40,2 Carbonato - 17,5 14,0 14,0 14,0 - 8,0 32,1 Bicarbonato - - - - - 25,4 - Silicato 32,0 14,8 14,8 10,0 10,0 1,0 25,0 3,1 Metassihcato - 2,5 - 9,0 9,0 - PB1 1,9 9,7 7,8 7,8 7,8 - PB4 8,6 ------ - Percarbonato - - - - - 6,7 11,8 4,8 Não iônico 1,5 2,0 1,5 1,7 1,5 2,6 1,9 5,3 TAED 5,2 2,4 - - - 2,2 - 1,4 HEDP 1,0 ----- DETPMP - 0,6 ----- - MnTACN ...... 0,008 PAAC - - 0,008 0,01 0,007 BzP ----1,4--- Parafma 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6 Mananase 0,001 0,001 0,002 0,002 0,001 0,003 0,002 0,002 Protease 0,072 0,072 0,029 0,053 0,046 0,026 0,059 0,06 Arailase 0,012 0,012 0,006 0,012 0,013 0,009 0,017 0,03 Lipase - 0,001 - 0,005 .... BTA 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 - 0,3 0,3 MA/AA ...... 4,2 - 480N 3,3 6,0 0,9 Perfume 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 0,1 Sulfato 7,0 20,0 5,0 2,2 0,8 12,0 4,6 pH 10,8 11,0 10,8 11,3 11,3 9,6 10,8 10,9 Miscelânea e água até 100 % EXEMPLO 35 As seguintes composições detergentes granulares de lavar louças de densidade 1,02 Kg/litro foram preparadas de acordo com a presente invenção I II III IV V VI VII VII STPP 30,0 30,0 33,0 34,2 29,6 31,1 26,6 17,6 Carbonato 30,5 30,5 3Γ,0 30,0 23,0 39,4 4,2 45,0 Silicato 7,4 7,4 7,5 7,2 13,3 3,4 43,7 12,4 Metassilicato - - 4,5 5,1 - Percarbonato ..... 4,0 PB1 4,4 4,2 4,5 4,5 - NADCC 2,0 1,6 1,0 Não iônico 1,2 1,0 0,7 0,8 1,9 0,7 0,6 0,3 TAED 1,0 ----0,8-- PAAC - 0,004 0,004 0,004 - BzP ---1,4---- Parafina 0,25 0,25 0,25 0,25 ....

Mananase 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 Protease 0,036 0,015 0,03 0,028 - 0,03 Amilase 0,003 0,003 0,01 0,006 - 0,01 - Lipase 0,005 - 0,001 - BTA 0,15 0,15 0,15 0,15 ....

Perfume 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 0,2 0,2 Sulfato 23,4 25,0 22,0 18,5 30,1 19,3 23,1 23,6 pH 10,8 10,8 11,3 11,3 10,7 11,5 12 7 10,9 Miscelânea e água Até 100 % EXEMPLO 36 As seguintes composições detergentes de tablete foram preparadas de acordo com a presente invenção pela compressão de uma composição detergente granular de lavar louças em uma pressão de 13 KN/cm2 usando-se uma prensa padrão 12 de cabeçote rotativo: I II III IV V VI STPP - 48,8 49,2 38,0 - 46,8 Citrato 26,4 - - - 31,1 Carbonato - 5,0 14,0 15,4 14,4 23,0 Silicato 26,4 14,8 15,0 12,6 17,7 2,4 Mananase 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,02 Protease 0,058 0,072 0,041 0,033 0,052 0,013 Amilase 0,01 0,03 0,012 0,007 0,016 0,002 Lipase 0,005 - PB1 1,6 7,7 12,2 10,6 15,7 PB4 6,9 - - - - 14,4 Não iônico 1,5 2,0 1,5 1,65 0,8 6,3 PAAC * - 0,02 0,009 MnTACN .... 0,007 TAED 4,3 2,5 - - 1,3 1,8 HEDP 0.7 - - 0,7 0,4 DETPMP 0,65 .....

Parafina 0,4 0,5 0,5 0,55 ETA 0,2 0,3 0,3 0,3 PA30 3,2 MA/AA .... 4,5 o,55 Perfume - - 0,05 0,05 0,2 0,2 Sulfato 24,0 13,0 2,3 - 10,7 3,4 Peso do 25 g 25 g 20 g 30 g 18 g 20 g tablete pH 10,6 10,6 10,7 10,7 10,9 11,2 Miscelânea e água até 100 % EXEMPLO 37 As seguintes composições detergentes líquidas de lavar louças de densidade 1,40 Kg/litro foram preparadas de acordo com a presente invenção I II III IV STPP 17,5 17,5 17,2 16,0 Carbonato 2,0 - 2,4 Silicato 5,3 6,1 14,6 15,7 NaOCl 1,15 1,15 1,15 1,25 Poligen/carbopol 1,1 1,0 1,1 1,25 Não iônico - - 0,1 NaBz 0,75 0,75 Mananase 0,001 0,005 0,01 0,001 NaOH - 1,9 - 3,5 KOH 2,8 3,5 3,0 pH 11,0 11,7 10,9 11,0 Sulfato, miscelânea e água até 100 % EXEMPLO 38 As seguintes composições líquidas de lavar louças foram preparadas de acordo com a presente invenção I II III iv v C17ES 28,5 27,4 19,2 34,1 34,1 Oxido Amina 2,6 5,0 2,0 3,0 3,0 Cl2 glicose amida - - 6,0 Betaína 0,9 - - 2,0 2,0 Xileno sulfonato 2,0 4,0 - 2,0 Neodol Cl 1E9 - - 5,0 - Amida poliidróxi 6,5 6,5 de ácido graxo dietileno penta - - 0,03 acetato de sódio (40 %) TAED - - - 0,06 0,06 Sacarose - - - 1,5 1,5 Etanol 4,0 5,5 5,5 9,1 9,1 Óxido de Alquil - - - - 2,3 dífenil dissulfonato Formiato de Ca ... o,5 1,1 Citrato de amônio 0,06 0,1 Cloreto de Na - 1,0 Cloreto de Mg 3,3 - 0,7 Cloreto de Ca - 0,4 Sulfato de Na - - 0,06 Sulfato de Mg 0,08 ....

Hidróxido de Mg ... 2,2 2,2 Hidróxido de Na ... 1,1 1,1 Peróxido de hidrogênio 200 ppm 0,16 0,006 Mananase 0,001 0,05 0,001 0,001 0,015 Protease 0,017 0,005 0,035 0,003 0,002 Perfume 0,18 0,09 0,09 0,2 0,2 Água e menores até 100 % EXEMPLO 39 As seguintes composições líquidas de limpeza de superfície dura foram preparadas de acordo com a presente invenção I II III IV V

Mananase 0,001 0,0015 0,0015 0,05 0,01 Amilase 0,01 0,002 0,005 Protease 0,05 0,01 0,02 Peróxido - - - 6,0 6,8 de hidrogênio Acetil trietil - - - 2,5 - citrato DTP A - - - 0,2 - Hidróxi Butila ... o,05 tolueno EDTA* 0,05 0,05 0,05 Cítrico / Citrato 2,9 2,9 2,9 1,0 LAS 0,5 0,5 0,5 C12AS 0,5 0,5 0,5 C10AS 1,7 C12 (E) S 0,5 0,5 0,5 C12,13 E6,5 7,0 7,0 7,0 não iônico Neodoi 23-6,5 - - - 12,0 Dobanol 23-3 - - - - 1,5 Dobanol 91-10 - 1,6 C25AE1,8S - - - 6,0 parafina ... 6,0 sulfonato de Na Perfume 1,0 1,0 1,0 0,5 0,2 Propanodiol - - - 1,5 tetraetileno - - - 1,0 pentaimina Etoxilado 2. Butil octanol - 0,5 Hexil carbitol** 1,0 1,0 1,0 SCS 1,3 1,3 1,3 pH ajustado para 7-12 7-12 7-12 4 Miscelânea e água até 100 % * ácido Na4 etilenodiamino diacético **Éter monoexilico de dietileno glicol EXEMPLO 40 As seguintes composições de pulverização para limpeza de surperfícies dura e remoção de mofo doméstico foram preparadas de acordo com a presente invenção Mananase 0,01 Amilase 0,01 Protease 0,01 octil sulfato Na 2,0 dodecil sulfato Na 4,0 hidróxido de Na 0,8 Silicato 0,04 Butil carbitol* 4,0 Perfume 0,35 Água/menores até 100% *Éter monobutílico de dietileno glicol LITERATURA

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REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. Composição de limpeza, caracterizada pelo fato de que compreende mananase, que consiste em um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrada nas posições 31 -330 de SEQ ID NO:2, em que a dita enzima ou preparação de enzima esta presente a um nível de 0,0001% a 2%, preferivelmente de 0,0005% a 0,5%, mais preferivelmente de 0,001% a 0,1% da enzima pura em peso da composição total, dita composição de limpeza compreendendo ainda uma enzima selecionada de celulases, proteases, lipases, amilases, enzimas que degradam a pectina e xiloglueanases; e ingrediente detergente convencional.

2. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima é uma amilase.

3. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que ainda compreende uma outra enzima selecionada de celulase, protease, lipase, enzima que degrada a pectina c xiloglucanase.

4. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um tensoativo selecionado de tensoativo aniônico, não iônico. catiônico e/ou misturas destes.

5. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo lato de que compreende um agente de branqueumento.

6. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação I, caracterizada pelo fato de que compreende um formador.

7. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um tensoativo catiônico que compreende dois comprimentos de cadeia longa.

8. Processo para tratar tecidos a máquina, caracterizado pelo fato de que compreende tratar o tecido durante um ciclo de lavagem de um processo de máquina de lavar com uma mananase que consiste em um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrada nas posições 31-330 de SEQ ID NO:2, ou com uma composição de limpeza como definida na reivindicação 1.

9. Uso de uma mananase isolada que consiste em um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrada nas posições 31-330 de SEQ ID NO:2, junto com uma enzima selecionada de celulase, protease, lipase, amilase, enzima que degrada a pectina e xiloglucanase, caracterizado pelo fato de que é em uma composição de limpeza para limpar tecido e/ou para remover manchas em tecido.

10. Uso de uma mananase isolada que consiste em um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrada nas posições 31-330 de SEQ ID NO:2, junto com uma enzima selecionada de celulase, protease, lipase, amilase, enzima que degrada a pectina e xiloglucanase, caracterizado pelo fato de que é em uma composição de limpeza para lavagem de louças manual e a máquina.