JPS6384499A

JPS6384499A - 酵素によるデルタ睡眠誘発ペプチドの製造法

Info

Publication number: JPS6384499A
Application number: JP22870186A
Authority: JP
Inventors: Kazuyuki Morihara; 森原　和之; Atsushi Sakina; 先名　淳
Original assignee: Toho Pharmaceutical Industries Co Ltd
Current assignee: Toho Pharmaceutical Industries Co Ltd
Priority date: 1986-09-26
Filing date: 1986-09-26
Publication date: 1988-04-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、１９７７年にシェネルベルゲル（Ｓｃｈｏｅ
ｎｅｒｂｔｒｑｅｒ　）　　等によりウサギの血液中か
ら単離されたアミノ酸９個からなる徐波睡眠促腫性（デ
ルタ−スリーブ　インデューシング）作用を有するペプ
チドを、初めて酵素法により製造することに関する。

〔従来の技術〕

このペプチドは前記した１９７７年の単離に際し、その
構造式が：Ｈ−Ｔｒｐ　−Ａｌａ−Ｇｌ）−Ｇｌ）−Ａｓｐ　−ｋ
ｌａ　−８ｒｒ−Ｇｌ）−Ｇｌｕ　−０：Ｆ（であるこ
とが確認され、爾後その薬理効果の研究と誘導体をも含
めた化学的合成法が相次いで発表されて現在に至ってい
るが、酵素法による製造は現在まで知られていない。

化学的合成法の若干例を示せば次の通りである：Ｈｓｕ
　Ｊｅｚｔｎ　ｔｔ　ａｌ、　、　：　Ｐ　ＲＣ−Ｆ　
ＲＧ　　Ｊｏｉｎｔ８ｐｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｎｕｔ
ｌｅｉｔ　Ａｃ１ｄｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　（
Ａｂｓｔｒａｃｔ）　、　　５ｈａｎ＄ａｉ＋　　（１
９７９Ｌ　６８　６９゜Ｋａｓｔｉｎ、　　Ｐ　Ｔ　ｔ
ｔ　ａｌ、　、　　；　Ｂｒａｉｎ　Ｒｔｓ、　　Ｂｕ
ｔム、３゜６９１−６９５　（１９７８）。

Ｎｏｚａｋｉ、　Ｓ　ｅｔ　ａｌ、　、　　：　Ｂｕｌ
ｌ、　Ｃｈｔｎｔ、、　Ｆ３ｏｔ、　Ｊａｐａｎ。

５５、　２１６５−２１６８　（１９８２）。

なお、本ペプチドは一般に徐波型（デルタ）睡眠の誘発
を促進する効果があるとされているが、ネコにおいて逆
説睡眠をも誘発する作用があシ、ヒトにおいては静脈内
注射によって昼間の覚醒レベルが充まシ、夜間の睡眠は
促進される効果が認められ、不眠症治療剤として化学合
成品が市販されている現状である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

−一般に適用されることではあるが、本デルタ睡眠誘発
ペプチドの製造についても、化学的合成法に比して本発
明の酵素的製造方法は構成アミノ酸のラセミ化がなく、
反応条件が穏やかであるので副反応物の生成をみること
が少く、かつ、反応に際して有害な試薬を使用しなくて
済む、等の長所が数・見られる。

より段階的にペプチド鎖化して下記する三つの区分フラ
グメントを製造した：〔Ｉ〕：保護化したＳｔｒ　−Ｇｌ）　−Ｇｌｕ　。

〔■〕：保護化した０１）　−Ａ＄　−Ａｌａ　。

〔■〕：保護化したＴｒｐ−Ａｌａ　−Ｇｌ）ここに、
各フラグメントの末端の保護基はフェニルヒドラジドと
した。アミノ酸としてトリプトファンはベンジルオキシ
カルボニル、その他のアミノ酸は第三ブチルオキシカル
ボニルでＮ末端を保護したものを用いた。アスパラギン
酸、グルタミン酸の側鎖カルボキシルはベンジルエステ
ル、セリンの側鎖水酸基はベンジルエーテルとして保護
したものを用いた。ペプチド結合の形成には、カンプリ
ング法及び置換法を併用した。フラグメント結合には置
換法を採用した。

なお、説明の便宜上、ペプチド化学の常例に従い、次の
略号符を本明細書でも用いるものとする。

２：ベンジルオキシカルボニルＢｏｔ：第三ブチルオキシカルボニル７３ｚｌ　　：ペンジルＴＦＡ：　）ルフルオロ酢酸 −ＯＭｅ　；メチルエステル一０ＢＪＩ　：ベンジルエステル −Ｎ２’ｆ１２Ｐｈ　：フェニルヒドラジド実施例：　
Ｈ−Ｔｒｐ−Ａｌａ　−Ｇｌｐ　−Ｇｌ＆　−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｂｙ　−Ｑ／）二Ｇｌｕ−ＯＲの製造本実施例の実験は下記する手技によって行なわれた。

融点ニヤマド社製ＭＰ−２１型融点測定装置、未補正旋光度：堀場５ＥＰＡ−２００薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：メルク社製キーゼ
ルゲル６０展開溶媒Ｒｆ１；クロロホルム：メタノール＝１０　：
　１Ｒ／２　；　ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１アミノ酸分析：日立８３５型アミノ酸分析計試料は封管
中、６Ｎ塩酸で１１ＣＩ’Ｃ１１８時間加水分解した。

トリプトファンを含むペプタイドは封管中、４Ｍノタン
スルホン酸で１１０°０１１８時間加水分解した。

アミノペプチダーゼＭによる本発明の目的ペプチドの加
水分解ニアミノペプチダーゼＭの０，０５Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，７３）の溶液（２Ｕ量）で３７°Ｃ１
２４時間ペプチドを消化し、アミノ酸分析を行なった。

ＰＨ測定ニガラス電極により測定ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）：装置；高滓
ＬＣ−４Ａ、検出器；高滓ＳＰＤ２　Ａｓカラム；　Ｎｕｔｌｅｏｓｉ１５Ｃ１Ｂ　　（０，４Ｘ
　２０　ｃＭ）流速９１肩ｌ／分検出器２２０　ｎｍ溶出；１４チメタノール／Ｑ、１チＴＦＡ試薬：保護ア
ミノ酸はＬ−型を用い、ペプチド研究所（大阪）よシ購
入。パパインは和光紬薬（１：３５０）、α−キモトリ
プシンはシグマ（…型）そしてアミノペプチダーゼＭは
ペーリンガーマンハイムよりそれぞれ購入した。その他
の試薬は特級品を使用。

分取ＨＰＬＣ：装置；高滓Ｌ　Ｃ−４Ａ　、検出器：高滓ＳＰＤＡＳカラム；　Ｎｕｃｌｔｏｓｉｌ　５ＣＩＢ　（１，ＯＸ
　２５　ｆｆ１）流速Ｈ５ｒｘｌ／分検出ｉ　２８０　ｎｍ溶出；Ａ　メタノールＢ　Ｏ２８チ酢酸０−→２分　１５チＡ２→１７分　１５　２１％Ａ保持時間１６分付近の主ピークを分取した。

［１−）　：　Ｂｏｃ−Ｓｙ　（”ｆｉＱＢｚｌ　）　
−Ｇｌｐ　−Ｇｌｕ　（ＯＢｚ／　）　−Ｎ２．Ｈ２Ｐ
ｈの合成（イ）Ｂｏｔ　−Ｇｌｕ　（ＯＢｇ／　）−Ｎ２Ｈ２Ｒ
＆の製造フェニルヒドラジン塩酸塩（８，６８，６０ミ
リ−Ｅ：　ル）　、Ｂｏｃ　−Ｇｌｕ　（細ｘ／　）　
−ＯＨ（６，７５ｔ、２０ミリモル）に２Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５，０）４００ｍｌ及びメタノール１
５０ｓｔ／を加え、加温溶解した。２Ｎ水酸化ナトリウ
ム（約２０ｆｆｌ）で所５．０に調整し、窒素ガスを数
分間バブリングした。２−メルカプトエタノール（３，
１０？）、パパイン（５，００？）を加え、室温で１８
時間攪拌した。生成した沈澱をｐ取、水洗浄後、酢酸エ
チル（約２００ｍ１）に溶解、分液ロート上、酢酸エチ
ル層を冷０．５Ｎ塩酸、５チ炭酸水素ナトリウム、飽和
食塩水で順次洗浄後、芒硝上乾燥、濾過後、酢酸エチル
を減圧留去し、残渣を酢酸エチルと石油エーテルで再結
晶した。

収量８．１０１ｉ′（収率９５％）、融点１１３．５−
１１５°Ｃ１Ｒ７１０，６５、〔６３１％５−１６．イ
（ＣＣ１５、メタノール）。

元素分析（イ）：　Ｃ２３Ｈ２９Ｎ３０５として理論値
：　Ｃ１６４，６２、Ｈ，６，８４、ＮＳ９．８３測定
値：Ｃ１６４，３１；Ｈ，６，９Ｃ１；Ｎ、　９．７４
（ｏ）　Ｂｏｔ　−Ｇｌ＆　−Ｇｌｕ　（０Ｂｚｌ　）
　−Ｎ２　Ｈ２Ｐｈ　　の製造前工程の生成物Ｂｏｃ　
−Ｃ４１ｕ　（ＯＢＺ／　）−Ｎ２Ｉ（２ＰＡ　（６，
４１５’、１５ミリモル）をＴＦＡ（１Ｂ＋！Ｉｌ）で
室温３０分間処理し、脱Ｂｏｔ化した。過剰の’Ｉ’Ｆ
Ａを減圧留去し、水酸化カリウム上３時間減圧乾燥した
。これに２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＴ（５，０）５
５ｔｘｔ、メタノール２５ｍ１を加え、次いでＢｘ　−
Ｇｌ？　−ＯＨ（２，６３°１．１５ミリモル）を加え
た。

２Ｎ水酸化ナトリウム（約５ｇ／）でｐＴ（５，０に調
整し、２−メルカプトエタノール（０，８ＯＳ’）及び
パパイン（２，２！Ｍ’）を加え、室温で２４時間攪ト
リウム、飽和食塩水で順次洗浄後、芒硝上乾燥した。濾
過後、酢酸エチルを減圧下留去、残渣をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー（３Ｘ２５Ｃ＊）に付し、クロロ
ホルム−メタノール（５０：１）で溶出した。目的物を
含むフラクションを濃縮し、メタノールと石油エーテル
で再結晶した。

収量３，６３５’（収率５０ｔ１６）、融点５８−５９
．５°Ｃ、Ｉｔ／１０．５３、〔α〕Ｄ−１５，２（Ｃ
Ｃ１５、メタノ−・ル）。

元素分析＠）：Ｃ２５Ｈ３２Ｎ４０６として理論値：　
Ｃ，６１，９７ＨＨ１６，６６１Ｎ１１１．５６測定値
：　Ｃ１６１，８８、Ｈ，６，７＋　１Ｎ１１１．３９
（ハ）Ｂｘ−８ｒｒ（Ｂｚｌ　）−（４−Ｇｌｕ　（Ｏ
Ｂｚ／　）−Ｎ２Ｈ２Ｐｈの製造前工程の生成物Ｂｏｔ：　−Ｇｌｐ　−Ｇｌｕ　（０Ｂ
ｔｒｒｌ　）　−Ｎ２Ｈ２Ｐｈ（２，９１Ｆ、６ミリモ
ル）をＴＦＡ（８笥ｔ）で室温６０分間処理し、脱Ｂｏ
Ｃ化した。過剰のＴＦＡを減圧留去し、水酸化カリウム
上３時間減圧乾燥した。これに０．２　Ｍ炭酸ナトリウ
ム１０ｍ／ｓ　メタノール１２ｍ１を加えた後、２Ｎ水
酸化ナトリウム（約０．５笥ｔ）でｐＨ８に調整した。

Ｂｏｃ　−Ｓｙ　（＆／　）　−〇Ｎし　（３，７１Ｓ
’、１２ミリモル）、２−メルカプトエタノール（０，
２５ｒ）及びパパイン（０，９０２）を加え、３７°Ｃ
で９０分間攪拌した。反応液に酢酸エチル（約１５０ｍ
／）を加え、分液ロート上、冷０．５Ｎ塩酸、５％炭酸
水素ナトリウム、飽和食塩水で順次洗浄後、芒硝上乾燥
した。濾過後、酢酸エチルを減圧下留去、残渣にエーテ
ルを加え沈澱させ、残存ＢｏＣ−Ｓｒｒ　（Ｂｚｌ　）
　−ＯＭｚを除去した。固体の残渣をメタノール−エー
テル−石油エーテルで再沈澱した。

収量２．７８１（収率７０％）、融点１３９−１４０°
Ｃ，Ｒ／ｉ　　　　０．９５、　Ｃ（ＩＥｐ）”　　　
−７１”　　（００，５、メタノール）。

元素分析鍾）　：　Ｃ３５Ｈ４３Ｎ５０８・６Ｈ２０と
して理論値：　Ｃ１５Ｂ、７３　ｉＨ，６，９０、Ｎ、
　９．７８測定値：　Ｃ１５８，９８、Ｈ，６，８５、
Ｎ、９７５アミノ酸分析：　Ｓ”（０，９８）　、Ｇｌ
ｕ（Ｑ、９９）、Ｇｌｐ（ｉ、ｏｏ）（１）　：　Ｂｏｔ−Ｇｌ＆−ＡＱ　（ＯＢｚ／　）　
−Ａｌａ−ＯＭｚの合成（イ）Ｂｔｘ　−Ａｌａ−Ｎ２
Ｈ２ＰｈＯ製造フエニルヒドラジン塩酸塩（２１，６９
ｆ、１５０ミリモル）及びＢｏｔニーＡｌａ　−ＯＨ（
９，４６？、５０ミリモル）を２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５゜０）１７５ｍｌに溶解、２Ｎ水酸化ナトリ
ウム（約７５ｍ１＞でｐＩ（５に調整し、窒素ガスを数
分間バブリングした。２−メルカプトメタノール（２，
００！ｉ’）及びパパイン（ｔｏｏＦ）を加え、室温で
１８時間攪拌した。生成した沈澱を炉取し、水で洗浄後
、酢酸エチル（約２００ｔｌ）に溶解した。分液ロート
上、酢酸エチル層を冷０．５Ｎ塩酸、５％炭酸水素ナト
リウム、飽和食塩水で順次洗浄後、芒硝上乾燥した。濾
過後、酢酸エチルを減圧留去し、残渣を酢酸エチルと石
油エーテルで再結晶した。

収量１３．３８Ｓ’（収率９６チ）、融点１５３−１５
４．５°Ｃ，Ｒ７１０，５１、〔α）ｊ５−４９．６’
　（ＣＣ１５、メタノール）。

元素分析（イ）：　Ｃ１４Ｈ２１Ｎ３０３として理論値
：　Ｃ，６０，２０ｉＨ，７，５８ｉＮ、　１５．０４
測定値：　Ｃ，５８，９７、Ｒ１７，５３１Ｎ１１５．
２２（ｏ）ＢＯｃ−Ａｙ／（ＯＢＺ／）　−Ａ／（２−
Ｎ２Ｈ２ＰＡ　　ｔ７）製造前工程の生成物Ｂａｔ　−
Ａｌａ　−Ｎ２Ｈ２Ｐｈ　（４，１９ｆ、１５ミリモル
）をＴＦＡ（１５笥ｔ）で室温３０分間処理し、脱Ｂｏ
ｔ化した。過剰のＴＦＡを減圧留去し、水酸化カリウム
上３時間減圧乾燥した。これを０．２Ｍ炭酸ナトリウム
６０ゴに溶解した後、２Ｎ水酸化ナトリウム（約３Ｂｙ
ｌ）でｐＨ９に調整した。ここに、酢酸エチル６０肩ｔ
％ＢＫ−Ａｓｐ（ＯＢ、”／）−〇ル　（６，７５グ、
２０ミリモル）、次いで２−メルカプトエタノール（ｔ
２０ｓ’）及びパパイン（３，０Ｏｆ）を加え、室温で
１８時間攪拌した。

反応液に酢酸エチル（約１００１１Ｉｌ）を加え、分液
ロート上、冷０．５Ｎ塩酸、５％炭酸水素ナトリウム、
飽和食塩水で順次洗浄後、芒硝上乾燥した。

濾過後、酢酸エチルを減圧留去、残渣にエーテル−石油
エーテル（ｉ：５ｖ／ｖ）　　混液を加えて沈澱させ、
残存ＢθＣ−Ｍ戸（ＯＢｚ／　）　−０Ｐｙしを除去し
た。

固体の残渣を酢酸エチルと石油エーテルで再結晶した。

収量ｔ７２ｒ（収率６５％）、融点１１４．５−１１５
°Ｃ，Ｒ７１０，５６、〔α）ｊ５−３３．７”　（Ｃ
Ｃ１５、メタノール）元素分析帳）　：　Ｃ２５Ｈ３２Ｎ４０６・Ｒ２０とし
て理論値：　０．５９．７５　ｉｎ、　６．８２　ｉＮ
、　１１．１５測定値：　Ｃ，５９，９５、ｎ、　６．
８８　、Ｎ、　１１．１１（ハ）Ｂｏｅ−Ｇ／）　−１
’ｕｌ）　（ＯＢＪ／　）−Ａ／（Ｚ　−Ｎ２Ｈ２Ｐｈ
　　の製造前工程の生成物ＢＯｔ　−Ａｓｐ　（０Ｂｚ
ｌ　）　−Ａｌａ　−Ｎ２Ｈ２Ｐｈ（４，８４１ｉ′、
１０ミリモル）をＴＦＡ　（１５笥ｔ）で室温３０分間
処理し、脱ｆ３ｏｔ化した。過剰のＴＥＡを減圧留去し
、水酸化カリウム上３時間減圧乾燥した。これに０．２
　Ｍ炭酸ナトリウム１３ｍ／、メタノール６　ｍｌを加
えた後、２Ｎ水酸化ナトリウム（約１耐）でｐＨＢに調
整し、ｆ３ｏｔ　−Ｇｌｐ−０Δしく３．７８ＳＦ、２
０ミリモル）、２−メルカプトエタノール（１，０ＣＮ
ｉＩ）及びパパイン（１，５０１）を加え、３７°Ｃで
３０分間攪拌した。反応液に酢酸エチル（約１５０ｍ／
）を加え、分液ロート上、冷０．５Ｎ塩酸、５チ炭酸水
素ナトリウム、飽和食、　　塩水で順次洗浄後、芒硝上
乾燥した。濾過後、酢酸エチルを減圧下留去、残渣をシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（３Ｘ２５０）に付
し、クロロホルム−メタノール（５０：１）で溶出した
。

目的物を含むフラクションを濃縮し、酢酸エチルと石油
エーテルで再沈澱した。

収量２．３８５Ｆ（収率４４チ）、融点１５０．５−１
５２°Ｃ，Ｒ７１０，４１、〔α）２５−２６．４７　
（ＯＣ１５、メタノール）元素分析（１）：Ｃ２７Ｈ３５Ｎ５０７　　として理論
値：　Ｃ，５９，８８ｉＨ，６，５１士Ｎ、１２．９３
測定値：　Ｃ，５９，７３、Ｈ，６，３７、Ｎ、　１２
．９６アミノ酸分析：　Ｉ’−Ｋｌ’（，１，０６）　
、Ｇｌ）（１，００）、Ａｌａ（１，０１）に）Ｂｏｔ　−Ｇｌ）−ｋ戸（’０Ｂｚｌ　）　−Ａｌ
ａ　−ＯＭｔ　　の製造前工程の生成物Ｂｔｙｔ　−Ｇ
ｌ）−Ａｓ／）　（０Ｂｚｌ　）　−Ｎａ　−Ｎ２Ｈ２
Ｐ／ｒ　　（２，１７ｙ、４ミリモル）をジクロロメタ
ン（２００肩／）に溶解し、ピリジン（４１６ｆｉ）を
加え、以下遮光してＮ−ブロモコノ・り酸イミドＣ７６
Ｂｌ１ｆ、４．３２ミリモル）を加え、２０分間激しく
攪拌した。反応液を分液ロートに移し、冷０．５Ｎ塩酸
、５ｑ６炭酸水素ナトリウム、水で順次洗浄後、芒硝上
乾燥、濾過後、ジクロロメタンを減圧留去、残渣にジク
ロロメタン（１２０ｍ？）、無水メタノール（１２，４
Ｂｚｌ）を加え、−夜撹拌した（これまで遮光下）。反
応液を分液ロートに移し、冷０．５　Ｎ塩酸、５条炭酸
水素ナトリウム、水で順次洗浄後、芒硝上乾燥した。濾
過後ジクロロメタンを減圧留去、残渣をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー（２，５×２０ＣＩＲ）に付し、
クロロホルム−メタノール（１５０：１）で溶出した。

目的物を含むフラクションを濃縮し、酢酸エチルと石油
エーテルで再結晶した。

収量１．０３ｆ（収率５５％）、融点８８．５−８９．
５℃、Ｒ／１　０．５３、〔αＩＤ５２２．８’　（Ｃ
Ｏ３５、メタノール）元素分析＠）二Ｃ２２Ｈ３１Ｎ３０８として理論値：Ｃ
，５６，７６、Ｎ１６．７１１Ｎ１９．０．３測定値：
　Ｃ１５６，６５、Ｈ，６，６９ｉ”Ｌ　９．１５アミ
ノ酸分析：　Ａ５戸（１，０６）　、’　Ｇ４（１，０
０）、Ａｌａ（１，００）［：　ｌ［）　：　Ｚ−Ｔｒｐ−ｋｌａ　−０４−ＯＭ
ｅ　　（Ｄ合成（イ）Ｂｏｔ　−Ｇｌ）−Ｎ２　Ｎ２　
Ｐｈの製造フェニルヒドラジン塩酸塩（２１，６９１，
１５０ミリモル）　、ＢＯｔ−Ｇｌ＆−ＯＨ（８，７６
ｔ、５０ミリモル）及び無水酢酸ナトリウム（２８Ｐ）
を２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＩ（５，０）１７０ｍ
ｌ？に溶解（ｐＨは５であった）、窒素ガスを数分間バ
ブリングした後、２−メルカプトエタノール（７５０Ｐ
）及びパパイン（ａ、ｏｏｙ）を加え、室温で１８時間
清押した。生成した沈澱を戸数し、水で洗浄後、酢酸エ
チル（約２００ｍ１）に溶解し、分液ロート上、酢酸エ
チル層を冷０．５Ｎ塩酸、５チ炭酸水素ナトリウム、飽
和食塩水で順次洗浄後、芒硝上乾燥した。濾過後、酢酸
エチルを減圧留去し、残渣を酢酸エチルと石油エーテル
で再結晶した。

収量１１．４１ｆ°（収率８６係）、融点１２３−１２
４°Ｃ５Ｒ７１０，４５元素分析（働：Ｃ１３Ｈ１９Ｎ３０３として理論値：　
０．５８．８５　、Ｈ，７，２２、Ｎ１１５．８４測定
値＝０１５８．３７；Ｈ１７２０；Ｎ１１５．９２（ｏ
）　Ｂ＆　−Ａｌａ　−Ｇｌ）−Ｎ２　Ｎ２　Ｐｈ　　
の製造前工程の生成物Ｂθｃ　−Ｇｌｐ−Ｎ２Ｈ２Ｐｈ
（１０，６１？、４０ミリモル）をＴＦＡ（１５肩ｌ）
で室温３０分間処理し、脱Ｂｏｃ化した。過剰のＴＦＡ
を減圧留去し、水酸化カリウム上３時間減圧乾燥した。

これを２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＩ（５，０）３０
ゴに溶解し、Ｂｏｃ−Ａｌａ　−ＯＨ（３，７８Ｓ’、
２０ミリモル）を加え溶かした後、２Ｎ水酸化ナトリウ
ム（約５ｍ／）でｐＩ（５に調整し、窒素ガスを数分間
バブリングした。２−メルカプトエタノール（２，００
２）及びパパイン（２，００２）を加え、室温で２４時
間攪拌、生成した沈澱を戸数した後、ｐｔＬに２−メル
カプトエタノール（０，５０ｆ）及びパパイン（ｏ、５
ｏｆ）を追加し、更に室温で２４時間攪拌した。生成し
た沈澱を炉取し、先の沈澱と合わせ水で洗浄、５チクエ
ン酸、５チ炭酸水素ナトリウム、水で順次バッチ法で洗
浄した。次いでメタノールとエーテルで再結晶した。

収量４．５１Ｓ’（収率６７％）、融点２１８．５−２
１９°Ｃ％Ｒ７ｉ　　０．４０、〔α〕’１５−５．６
’（Ｃ０５、メタノール）元素分析（％）　：　Ｃ１６Ｈ２４Ｎ４０４として理論
値：ｃ、５７．１３ｉＨ，７，１９，Ｎ、１６．６６測
定値：ｃ、　５７．５１　、Ｈ，７，１１、Ｎ、　１６
．７４（ハ）Ｚ　−Ｔｒｐ　−ｋｌａ　−Ｇｌ）−Ｎ２
　Ｈ２Ｐｈの製造前工程の生成物Ｂｏｔ　−Ａｌａ　−
Ｇｌｐ−Ｎ２Ｈ２Ｐｈ（４，０４７，１２ミリモル）を
ＴＦＡ　（１０肩ｌ）で室温３０分間処理し、脱Ｂｗ化
した。過剰のＴＦＡを減圧留去し、水酸化カリウム上３
時間減圧乾燥した。

これに２Ｍ酢酸ナトリウム（１００＊ｌ）、メタノール
（１２ｍｉ？）　及ＵＺ−Ｔｒｐ−ＯＨ（４，０６ｔ、
１２ミリモル）を加え、加温溶解した（ｐＨは７であっ
た）。α−キモトリプ７ン（１，２０ｆ）を加え３７°
Ｃで１８時間攪拌した。反応液に水（１００ｍ／）を加
え、得られる粉末を５チクエン酸、５係炭酸水素ナトリ
ウム、水で順次バッチ法で洗浄した。得られた粗生成物
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３Ｘ２５ｃ１
ｎ）に付し、クロロホルム−メタノール（４０：１）で
溶出した。目的物を含むフラクションを濃縮し、メタノ
ールとエーテルで再結晶した。

収量２．４７１（収率３７％）、融点２１２．５−２１
３８°Ｃ，Ｒ／１　０．３３、〔α〕２５　　ａ、　ｏ
ｏ（ＣＯ３５、ＤＭＦ’）元素分析＠）：Ｃ６０Ｈ３２Ｎ６０５・２Ｈ２０として
理論値：　Ｃ，６０，８０ｉＨ，６，１２、Ｎ、　１４
．１８測定値：　０．６１．９４　、Ｈ，６，３８、Ｎ
、　１４．４０アミノ酸分析：　Ｃ７）（１，００）　
、Ａｌａ（［］、９６）、Ｔ’／’（０，８８）に）Ｚ　−Ｔｒｆｉ　−Ａｌａ　−Ｇｌｐ　−ＯＭｔ　
ノ製造前工程の生成物Ｚ−ＴＱ−Ａｌａ　−（Ｊｌｐ−
Ｎ２Ｈ２Ｐｈ（２，２３ｆ、４ミリモル）をジオキサン
（３６ｔ／）ニ溶解、塩化第二鉄（Ｆｒ（ｕ３−６Ｈ２
０）　１２．８　ｔを水２９ｔｘｔに溶かした液を上の
液に６５°Ｃで攪拌しつつ徐々に滴下した。１５分間攪
拌後、２Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８とし、生じ
た沈澱を２、００　Ｏｒ、　ｌ）、ｍ、、５分間遠心分
離し、上澄液と沈澱とに分離した。沈澱に０．１Ｎ炭酸
すｌ−ＩＪウム（３０πｔ）を加え、同様に遠心分離し
、上澄液を得た。雨上澄液を合し、１０％クエン酸を加
えて酸性とし、生じた粉末を５％クエン酸、水で順次バ
ッチ法で洗浄、粗生成物をメタノールとエーテルで再沈
澱した。１．２６ｆのＺ−Ｔｒｐ−Ａｌａ　−Ｇｌ＆　
−０Ｈ（収率６７チ）を得だ。

このもの１．１７　ｆ　（２，５ミリモル）をジクロロ
メタン（６０Ｍ／）中、４−ジメチルアミノピリジン（
２８〜）、無水メタノール（５００縛）、１−エチル−
５−（３−ジメチルアミンプロピル）−カルボジイミド
塩酸塩（５２５〜）でＯ’０．２時間、次いで室温で一
夜攪拌し、メチル化を行なった。ジクロロメタンを減圧
留去し、残渣に酢酸エチル（１００ｍ／）を加え、分液
ロート上、５％クエン酸、５チ炭酸水素ナトリウム、水
で順次洗浄後、芒硝上乾燥した。濾過後、酢酸エチルを
減圧留去し、酢酸エチルと石油エーテルで再結晶した。

収量０．９ＣＮＦ（収率７５チ）、融点１５１−１５２
．５°Ｃ１〔α）Ｄ−１２，５（ＣＤ、５、メタノール
）、几７ｉ０．４２元素分析（（６）：　Ｃ２５Ｈ２ＢＮ４０１６　　とし
て理論値：Ｃ，６２，４９逼Ｈ，５，８７ｉＮ、　１１
．６６測定値：　Ｃ，６２，５４、ｕ、　５．５９　ｉ
Ｎ、　１１．８６アミノ酸分析：　Ｇ４（１，００）　
、Ａｌａ（１，０１）、Ｔヶ（０，９２）［■　〕　〕Ｚ−Ｔｒｐ−Ａ７２−０４−Ｇｌ）−１ｕ
ｐ（ＯＢｚｌ）、−Ａｌａ−８ｔｒ（Ｂｄ　）　−Ｇｌ
）−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ　）−Ｎ２Ｈ２Ｐｈの合成（〔Ｉ
〕、〔■〕及び〔■〕フラクションの縮合）（イ）Ｂｏｔ：　−Ｇｌｐ　−ｋｓｐ　（０Ｂｚｌ　）
　−Ａｌａ　−５ｔｒ（Ｂｚｔ　）　−Ｇｌｐ−Ｇｌｕ
　（０＆／　）−Ｎ２Ｈ２Ｐｈの製造（〔１〕と（ｎ）
フラクションの縮合）先に製造したＣＩ）フラクション
すなわちＢｏｔ　−８ｔｒ（Ｂｚｌ　）　−Ｇｌ＆−Ｇ
ｌｕ　（ＯＢｘｌ　）　−Ｎ２Ｈ２ＰＡ　　（４６３Ｗ
／、０．７ミリモル）をＴＦＡ　（３ｍｌ）で室温３０
分間処理し、脱ｆＪｏｔ化した。過剰のＴＦＡを減圧留
去し、水酸化カリウム上３時間減圧乾燥した。ここに０
．２　Ｍ炭酸ナトリウム（１０，５ｒｔ）、エタノ−シル（３，５ｙｔ／）を加えた後、２Ｎ塩酸（約２００１
／）でｐＨＦ３に調整した。Ｂｘ　−Ｇｌｐ−Ａｓｐ（
ＯＢｚｌ　）　−Ａｌａ　−ＯＭｅ（９７７ｑ、２．１
　ミリモル）、２−メルカプトエタノール（０，３５２
）、パパイン（０，３５７）を加え、３７°Ｃで１時間
攪拌した。反応液に酢酸エチル（約１５０ｍ１）を加え
、分液ロート上、冷０．５Ｎ塩酸、５チ炭酸水素ナトリ
ウム、飽和食塩水で順次洗浄後、芒硝上乾燥し、沖過後
、酢酸エチル減圧留去し、残渣をメタノールとエーテル
で再沈澱した。

収量４１０〜（収率５９チ）、融点２０４−２０５°Ｃ
，（αゾ５−１０．８°（Ｃ０，５、ＤＭＦ）、Ｒ／’
ｉｏ、４５元素分析（４）：　Ｃ５１Ｈ６２Ｎ８０１３・５Ｈ２０
として理論値：　Ｃ，５６，４５、Ｈ１６，６９、Ｎ、
　１０．３３測定値：　Ｃ，５７，０３１Ｈ１６，９２
；Ｎ、　１０．０２アミノ酸分析：　Ａｓ、ｏ（１，ｏ
　１　）、５ｅｒ（０，９５）−Ｇｌｐ　−Ｇｌｕ　（
ＯＢＪ／　）−Ｎ２Ｈ２ＰｈＯ製造（〔■〕フラクショ
ンの製造）前工程の生成物Ｂｅｘ　−Ｇｌｐ　−Ａｓ１ｒ　（０Ｂ
ｚｌ　）　−、ｋｌａ　−８ｅｒ（Ｂｚｌ　）　−Ｇｌ
ｐ　−Ｇｌｕ　（ＯＢｘｌ　）−Ｎ２Ｈ２ＰＡ　　（２
９９ｔｎダ、０．６ミリモル）をＴＦＡ（２ｍｌ）で室
温３０分間処理し、脱ＢＫ化した。過剰のＴＦＡを減圧
留去し、水酸化カリウム上３時間減圧乾燥した。ここに
０．２Ｍ炭酸ナトリウム（１，５ｍ／）、エタノール（
４，５肩りを加えた後、２Ｎ塩酸（約５０ＩＣで１））
Ｉ　Ｂに調整した。フラクション（Ｉｔ）すなわチｚ−
Ｔｒｐ−Ａｌｌｌ　−０４−ＯＭｅ　（４３２’ｆｌ、
０．９ミリモル）、２−メルカプトエタノール（５０Ｍ
ダ）、パパイン（５０１１１ｆ）を加え、６７°Ｃで２
時間攪拌した。

反応液に水（２０ｍ／）を加えた後、５％クエン酸、５
係炭酸水素ナトリウム、水、メタノールで順次バッチ法
で洗浄した。得られた粗生成物をジメチルホルムアミド
（Ｄ　Ｍ　Ｆ　）とメタノールで再沈澱した。

収量１８１ダ（収率４５チ）、融点２３６．５−２３　
Ｚ　５°Ｃ１几ｆ１　　０、　〔α）２５−　１　３．
６”　　（ＣＣ１５、ＤΔ（Ｆ）元素分析（ｅｌＡ：　ｃ７０Ｈ７８Ｎ１２ｏ１６・６Ｈ
２ｏ　として理論値：　Ｃ，５７，９２１Ｈ１６，２５
、Ｎ、　１１．５８測定値：ｃ、５７４３；Ｈ，６，１
２ｉＮ、１１．４７アミノ酸分析：　Ａｊ７（１，０９
）　、＆ｙ（０，９６）、Ｇｌｕｅｌ、　０３）　、Ｇ
４（３，００）　、Ａｌａ（２，０１）、Ｔｒｌ’Ｃ０
，９１）〔■〕目的化合物Ｈ−Ｔｒｐ　−Ａｌａ　−Ｇｌｐ　−
Ｇｌｐ　−Ａｓｐ　−Ａｌａ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｐ　−
０＆　−ＯＨの取得（保護基の離脱及び精製）前工程の生成物Ｚ　−Ｔｒｐ−Ａｌａ　−Ｇｌｐ　−Ｇ
ｌ＆−ＡＳ、ａ（ＯＢｘｌ）−Ａｌａ−８ｅｒ（Ｂｚｌ
）−Ｇｉｇ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｎ２Ｈ２Ｐｈ（１０
９，８’＃、００８２ミリモル）をＤ　Ｍ　Ｆ　６　ｍ
ｌに溶解、塩化第二鉄溶液（塩化第二鉄・ろ水和物３２
７を水７２ｍ１に溶解して調製）１ｍｌを加え、６５°
Ｃ１３０分間反応させた。反応後、水５０ｙｎｔを加え
、遠心分離（３０００ｒ　ｐｍ、１０分間）した。上清
液を除去し、沈澱に水３０ａ＋／を加え攪拌した後、再
度遠心分離（３，０００ｒ、　ｌ’、ｍ、、１０分間）
しだ。上清°液を除去し、沈澱を減圧下シリカゲル上で
乾燥し、脱ヒドラジド体１０４．７ｑを得た。これにギ
酸８ｍｌを加え溶解し、ギ酸アンモニウム８４ｑ１パラ
ジウム黒１ｏ５ｍｙを加え、室温で２時間還元した。次
いで水１０ｍ／を加え、更に３０分間還元した。ｐ過に
よりパラジウム黒を除去し、ろ液を減圧下約１／３容ま
で濃縮した。

この溶液を数回に分けて分取ＨＬＰＣに注入して、目的
化合物を含む分画を集めた。減圧下約１／２容まで濃縮
後、凍結乾燥し、題記の目的化合物３０．２Ｗ（収率４
４チ）を得た。

本目的化合物の物性値及び純度は下記する通りである：融点２１３−２１５°Ｃ（分解）、（／Ｚ　〕２５−１
７．３−（Ｃ０，２、Ｈ２Ｏ）、Ｒ／’２０．１４にン
ヒドリン試薬）元素分析（％）　：　Ｃ３５Ｈ４８Ｎ１ｏＯｉ５．ＣＨ
３ＣＯ０Ｈ，５Ｈ２０理論値：　Ｃ，４４，４９ｉ”Ｌ
　６．２６　、Ｎ、　１４．０２測定瞳：　Ｃ，４４，
２６ｉＨ，６，４１ＢＮ、　１４．１５アミノ酸分析：
メタンスルホン酸分解　ん戸（１，１２）、５ｅｒ（１
，０６）、Ｇｌｕ（１，０６）、Ｇｌ）（３，００）　
、Ａｌａ（１，９９）　、Ｔｒ）（０，８４）　、Ｇ４
の回収率は８０％。

アミノペプチターゼＭ消化二ＡＳ戸（１，１１）、５ｙ
（１，０５）　、Ｇｌｕ（１，０４）　、Ｇ４（３，０
０）、Ａｌ’（２，０３）　、Ｔｒ／（０，９９）　、
Ｇｌｐ　ＬＤ回収率は７３％。

本品の純度はＨＰＬＣ法により測定した結果はほぼ１０
０％であり、まだ化学的に合成された本ペプタイド（ペ
プチド研究所、大阪より購入）品とＨＬＰＣ上で同一位
置に溶出された。

さらに、本品はアミノペプチターゼＭ消化の結果より、
すべてがＬ体からなり、ラセミ化は生じておらず、かつ
、アスパラギン酸残基での転位は認められなかった。

〔発明の効果〕

かくして、本発明の酵素法により製造されたデルタ睡眠
誘発ペプチド（ＤＳＩＰ）は化学的合成品のものとは異
なり、光学活性体として特異な生理効果を発揮するもの
として期待される。

（特許出願人　東宝薬品工業株式会社）（代理人　弁理
士　糟谷　安）

Claims

【特許請求の範囲】１、公知のデルタ睡眠誘発ペプチドとして知られる：【アミノ酸配列があります】の製造において、まず各構成アミノ酸を酵素を用いて段階的に結合させてペプチド鎖を伸長させ
て行く方法により、［１］保護されたＳｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ、［２］保護されたＧｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ及び
［３］保護されたＴｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙなる三つのフ
ラグメントを製造する第一段階と、この三つのフラグメ
ントを縮合させる第二段階と、次いで保護基を順次離脱
させて行く第三段階とよりなることを特徴とする公知有
用ペプチドの製造法。２、各構成アミノ酸より段階的にペプチド結合させて三
つのフラグメントを製造するに当ってはカップリング法
と置換法とを併用し、これら三つのフラグメント間の縮
合は置換法により行なうことを特徴とする特許請求の範
囲第一項記載の公知有用ペプチドの製造法。３、三つのフラグメントのカルボキシル末端の保護基は
フェニルヒドラジドとし、アミノ酸としてトリプトファ
ンはベンジルオキシカルボニル、その他のアミノ酸は第
三ブチルオキシカルボニルでＮ末端を保護し、アスパラ
ギン酸及びグルタミン酸の側鎖カルボキシルはベンジル
エステル、そしてセリンの側鎖水酸基はベンジルエーテ
ルとして保護したものを用いることを特徴とする特許請
求の範囲第一項及び同第二項記載の公知有用ペプチドの
製造法。