JPS6387996A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡｊｉ
域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞及び該倣生物＃Ｉ胞を用い
た新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、７ミ／酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用さ１ｔた方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。

Ａ１ａＬ７ラニン Ａｒｇ　　Ｌ−フルギニン ＡｓｎＬ−７スパラギン Ａｓｐ　　Ｌ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｉｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 ｃｌｙ　　グリシン ＨｉｓＬ−ヒスチジン １１ｅ　　Ｌ−インロイシン Ｌｓｕ　　Ｌ−ロイシン Ｌｙｓ　　Ｌ−リジン ＭｅｔＬ−メチオニン Ｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニン Ｐｒｏ　　Ｌ−プロリン Ｓｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン ＴｒｐＬ−）　　リ　ブ　ト　フ　７　ンＴｙｒ　　Ｌ
−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（ＨｔＮ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列の７ミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′）−及び−（３′
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（２）　　発明の背景 Ｃａｒｓｖｒｅｌｌａらは、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａ
１ｍ５ｔｔｓ−ＧｕＪｒｉｎ（ＢＣＧ）などで前もって
刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に採
収した血清中に、移植したＭｅｔｈ硝種による癌を出血
壊死させる物質が含１れていることを見出し、この物質
を腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａ
ｃｔｏｒ　。

以下ＴＮＦと略記することもある）と名づけだ（Ｅ、Ａ
、Ｃａｒｓｗｅｌｌ　　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、。

ＵＳＡＩＬＩ、３６６６（１９７５））。このＴＮＦは
マウス、ウサギ、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細
胞に特異的に、しかも種を越えて働くことから、制癌剤
としての利用が期待されてきた。

最近になり【、Ｐｅｎｎ１ｅａらは、ヒトＴＮＦのｃＤ
ＮＡりｐ−ニングを行ない、ヒ）　ＴＮＦ蛋白質の一次
構造を明らかＫすると共Ｋ、太腸歯におけるヒ）　ＴＮ
Ｆ遺伝子の発現について報告した（　Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃ
ａら、　Ｎａｔｕｒｅ　、３１２，７２４（１９８４）
）。

その後、白井ら（Ｔ、５ｈｉｒａｉらＨＮａ　ｔ　ｕ　
ｒｅ　＋　ＬＬＬ　ｒ８０３（１９８５））、宗村ら〔
宗村ら、癌と化学療法＋１２ｔ　　１６０（１９８５）
）、Ｗａｎｇら（Ａ、Ｍ。

Ｗａ　ｎｇらｔ　５ｃｉｅｎｃｅ、２２８＋　　１４９
（１９８５））及びＭａｒｍｅｎｏｕｔら（Ａ、Ｍａｒ
ｍａｎｏｕｔら、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｓｍ、、１５２＋　　５１５（１９８５））
が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌における発ｆｉＫついて
相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。

たとえば、癌末期や重症感染症患者に見られる悪液質を
引き起こす鳳因の一つであるカケクチンがＴＮＦＫ非常
に類似しており（Ｂ、Ｂｅｕｌｔｅｒら＋　Ｎａｔｕｒ
ｅ、３１６，５５２（１９８５））、カケクチンがリボ
プロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、ＴＮ
Ｆの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、その
結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能性
のあることが示唆された。

また、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他の７ミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。このようにして、
天然に存在する蛋白質を改変して、特定の目的にかなっ
た新しい蛋白質を創製する研究が、数多く成されている
。

ヒ）ＴＮＦ蛋白質の改変についても、特開昭６１−４０
２２１明細書にその可能性についての記載があるが、生
理活性について詳細にはふれていない。一方、ヒ）　Ｔ
ＮＦ蛋白質の７ミノ末端の一部が欠失した形のポリペプ
チドも生理活性を有していることが知られている（特開
昭６１−５０９２３　　明細書及びＰＣＴ出願公開ＷＯ
３６１０２３８１号）。

そこで、本発明者らは比活性の向上２反応スペクトルの
広域化、副作用の低減化等を目的と　　“して、ヒ）Ｔ
ＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、本発明を
完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、ｌＦｒ規抗腫瘍活性ポリペプチドを提
供することＫある。

本発明の他の目的は、新規抗魔瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）　　発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、第１
図に示した１３番目のｖａｌから１５７番目のＬｅａま
でで表わされるアミノ酸配列において、ｌまたはそれ以
上のアミノ酸残基の置換。

欠失または挿入がなされた配列のうち、少なくとも１８
８番目ＡｌｔのＰｒｏへの置換を含むような配列を含有
する新規生理活性ポリペプチドを提供することＫよって
達成され、また上記新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供するこ
とによって達成され、更にかくして得られた組換えプラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞、その
微生物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを産生ずる方法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを含有する医薬組成物を提供することによって達成さ
れることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

囚　ヒトＴＮＦ遺伝子のりｐ−ン化； ヒトＴＮＦ遺伝子は、ζ）ＴＮＦｌｉｅ質を構成するア
ミノ酸ＣＤ、Ｐｅｎｎ１ｃａら、前出〕を指定するいく
つかのコドンの中から適当なものを選び、それを化学合
成することＫよって取得できる。ｔ＝）ＴＮＦ遺伝子の
設計に際しては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを
選択することが望ましく、後にりｐ−ン化及び遺伝子改
変を容易に行なえるように適当な位置に適当な制限酵素
による切断部位を設けることが望ましい。

また、ヒ）　ＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、
その上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開
始コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流
方向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コ
ドン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ　）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは１発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒ）ＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒ）ＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれｋついて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法（Ｈ，Ｇ、Ｋｈｏｒａｎａ　
ｔ’Ｓｏｍｅ　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆＰｈｏｓｐｈａｔ
ｅ　Ｅｓｔ＠ｒｓ　ｏｆ　Ｂｆｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｉｎ
ｔ＠ｒｅｓｔ”。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　、　Ｉｎｅ
、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９６１））。

トリエステル法（Ｒ，Ｌ、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、　Ｊ
、Ａｍ。

Ｃｈ＠ｍ、Ｓｏｅ、、８９．４８０１（１９６７））　
　及びホスファイト法ＣＭ、Ｄ、Ｍａｔｌｅｕｃｃｉら
ｒ　Ｔｅｔｒａｈｅｄ−ｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　２１　
、　７１９（１９８０））があるが、合成時間、収率、
操作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いた
ホスファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴ
ヌクレオチ　・ドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速
液体りロマトグラフイー等を、適宜単独もしくは組合せ
て用いることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５／末端側
の水陵基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、７二−リングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いて連結する。合成オリゴ
ヌクレオチドを連結してヒ）　ＴＮＦ遺伝子を作成する
方法としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブ
ロックに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２（Ｆ。

Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｏｎｅ、２．９５（１９７７）、
ｌのようなベクターに一度クローン化した後、それらの
各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が好ましい。こ
のようなヒ）　ＴＮＦ遺伝子を構成するブロックのＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦＩ
ＢＲ、ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３　　が用いられる
。

上記のようにしてりｐ−７化したヒトＴ　Ｎ　Ｆ遺伝子
を構成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当
なプロモーター、ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより１発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン拳プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペーン・ブーモーター（ｌａｃ　７’ロ
モーター）　、　ｔａｅプｐモーター、ｐＬプロモータ
ー：　Ｉｐｐプｐモーター等があげられるが、とりわけ
ｔｒｐプロモーターが好適である。この発現型ヒ）ＴＮ
Ｆ遺伝子を、たとえばｐＢＲ３２２のようなベクターに
クローン化することにより、発現型プラスミドが作成で
きる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドとして、好ま
しくはｐＴＮＦ４０１′洲が用いられる。

田）　新規抗ｎ瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
； こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒ）ＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることＫより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意の７
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したリ、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４３４．　ｐＴ
ＮＦ４３５．　ｐＴＮＦ４３６、　　ｐＴＮＦ４３フ、
　　ｐＴＮＦ”４２９．　　ｐＴＮＦ４３８．　　ｐＴ
ＮＦ４３９゜ｐＴＮＦ４４０．　ｐＴＮＦ４４１．　ｐ
ＴＮＦ４４２．　ｐＴＮＦ４４３．　ｐＴＮＦ４４４、
　ｐＴＮＦ４４５又はｐＴＮＦ４４６０　発現確認及び
活性評価 ヒ）　’ｌ’ＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ド遺伝子を発現させるための微生物宿主としては、大腸
菌、枯草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌〔
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉａ　ｃｏｌ
ｉ　）　）が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プ
ラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドは。

たとえば公知の方法（Ｍ、Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄら、　Ｇ
ｅｎｅ＊３．２７９（１９７８））を用いて、微生物宿
主、たとえばニジエリア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株（Ａ
ＴＣＣ３３５２５）に導入することができる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地（Ｔ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら編＋　”　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ″
、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１
９８２）参照〕があげられ、必要に応じて、たとえばア
ンピシリン等を添加するのが望ましい。培養は目的の組
換え微生物に適した条件、たとえば振とうによる通気、
攪拌を加えながら、３７℃で２〜３６時間行なう。また
、培養開始時または培養中に、プルモーターを効率良く
機能させる目的で、３−β−インドールアクリル酸岬の
薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒ）　ＴＮＦ蛋白質及び新規抗
腫瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植し
たＭｓｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｌ　ｖ！ｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら、前出）マウスＬ
細胞に対する細胞障害性を見る１ｎｖｉｔｒｏ活性測定
法（Ｒｕｆｆ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２６゜２
３５（１９８１））等により行なえるが、測定時間、定
量性、測定の簡便さ等の点から、乃ｖｉｔｒｏ活性測定
法による評価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒ）ＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
により【抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒ）ＴＮＦ遺伝子を設計した
。設計に際しては、Ｐｅｎｎ１ｃａら〔Ｄ。

Ｐｅｎｎ１ｃａら　＋　Ｎａｔｕｒｅ＋　　３１２．　
７２４（１９８４））の報告したヒトＴＮＦ前駆体ｃＤ
ＮＡ　　の構造遺伝子部分の塩基配列を基盤として、適
当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設しナ、５
′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′側に２
個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ　）をそれぞれ
付与した。また、５′側翻訳開始フドン上流には制限酵
素（ＪａＩ　Ｋよる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳開
始コドン間を適切な状態に保った形でのプルモーターと
の連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止７ドン下流
には制限酵素ＨｉｎｄＩｎによる切断部位な設け、ベク
ター・プラスミドと容易に連結できるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒ）ＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ、モデル３８０Ａ）を用いて、ホスフ
ァイト法により行なった。危成オリゴヌクレオチドの精
製は、アプライド・バイオシステムズ社のマニュアルに
準じて行なった。すなわち、合成オリゴヌクレオチドを
含むアンモニア水浴液を５５℃で一部保つことにより、
ＤＮＡ塩基の保護基をはずし、セファデックスＧ−５０
フフイン・ゲル（ファルマシア）を用いたゲル濾過によ
って、高分子量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取す
る。ついで、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ゲル濃度２０％）の後、紫外線シャドウィング
法により泳動パターンの観察を行なう。目的とする大き
さのバンド部分を切出して、そのポリアクリルアミドゲ
ル断片を細か（破砕した後、２〜５−の溶出用バッファ
　　（５００ｍＮｆ　ＮＨ４０Ａｃ−１ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ
　Ａ　−０，１％ＳＤＳ　（ｐＨ７，５）　　）を加え
、３７℃で一部振とうした。遠心分離により、目的のＤ
ＮＡを含む水相の回収を行なった。最後に合成オリゴヌ
クレオチドを含む溶液をゲル濾過カラム（セファデック
スＧ−５０）にかけることにより、合成オリゴヌクレオ
チドの精製品を得た。なお、必要に応じて、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオ
チドの純度の向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒ）　ＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのプルツクに分けてクローン化した。

０．１〜１．０所の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−２
〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ４
−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ、ｃｏｌｉＢタイプ、
宝酒造）を用いて、それぞれ別々にリン酸化する。リン
酸化反応はｌＯ〜２０μｊの５０ｍＭＴｒｉａ−ＨＣｊ
ｌ（ｐＨ９，５、ｌ　ＯｍＭ　Ｍ！？ＣＩ＠　、　５　
ｍＭジチオスレイトール１１０ｍＭＡＴＰ水溶液中で、
３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、すべての合
成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し、フェノー
ル抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌクレオチドキ
ナーゼを失活、除去する。この合成オリゴヌクレオチド
混合液に、新たに０．１〜１．０μｓの合成オリゴヌク
レオチドＴＮＦ−１及びＴＮＦ−７を加え、９０℃で５
分間加熱した後室温まで徐冷して、アニーリングを行な
う。次に、と、れを減圧乾固した後に、３０ｐｌの６６
　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）　、　６．
６　ＷＬＭ　ＭＩＩＣｌｘ　、　１０７ＦＬＭジチオス
レイトールｅ１ｍＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユ
ニツトの７４−ＤＮＡ！Ｊガーゼ（宝酒造）を加えて、
ｌ１℃で１５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行な
い、エチジウムブロマイド染色法により泳動パターンの
観察を行なう。目的とする大きさく約２２０ｂｐ）のバ
ンド部分を切出して、実施例２の方法に従ってポリアク
リルアミドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３所の大腸菌用プラスミドｐＢＲ３２２（約４．
４　Ｋｂｐ　）を３０ｐｌのｌ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　−
ＨＣｌ　（ｐＨ７，５Ｌ６０　ｍＭ　ＮａＣ１、７ｍＭ
　ＮａＣ６，水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵
素（ＪａＩにューイングランド・バイオラプス）を添加
して、３７℃で１時間切断反応を行なった。制限酵素Ｃ
１ａ　Ｉ　による切断の後、フェノール抽出、エーテル
抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収する
。このＤＮＡを３０ｐｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ
ｌ　（ｐＨ７，４）　＋　１００ｍＭＮｈＣ１、Ｉ　Ｏ
ｍＭ　Ｍ、９ＳＯ４水溶液に溶解させ、１０ユニツトの
制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を添加して、３７℃で１
時間切断反応を行なった。反応終了後、アガｐ−スゲル
電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行ない、エチジウムブ
ロマイド染色法により切断パターンの観察を行なう。プ
ラス６　ト°ｐＢ１３２２の大部分を含む約３．７　Ｋ
ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切出し、そのア
ガｐ−スゲル断片を３倍量（ｖｏｌ／ｗｔ　）の８　Ｍ
　ＮａＣＡ’Ｏａ水溶液に溶解させた。

Ｃｈ＠ｎ　　らのグラスフィルター法（Ｃ，Ｗ、Ｃｈｅ
ｎら。

Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｅｈｅｍ、上り上、　　３３９（１
９８０））により、約３．７　ＫｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ
１ｅｆ　ｍ　５ａｌＩ　）を７ガロースゲルより回収し
た。

先に得られたヒ）ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＰ、　３２２
の大部分を含む約３．７ＫｂｐのＤ　ＩＩ　Ａ水溶液と
混合する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じ【両
ＤＮＡ断片の連結反応を行なった。

↓ エシェリヒア・フリＣ６Ｃ６０Ｏ−株の形質転換は、通
常のＣａＣ１＊法（Ｍ、Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄらの方法）
の改良法で行なった。すなわち、５ｚ／のＬ培地（ｌチ
トリプトン、０．５％醇母エキス、０．５％ＮａＣＪｔ
ｐＨ７，２）にエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−荒一株
の１８時間培養基を接種し、菌体な含む培養液の６００
ｎｍ　　における濁度（ＯＴ）　ａｎ　）が０．３に達
するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バッ
フ　７−　Ｃ０，ＩＭ　ＮａＣｊｆ、　５ｍＭ　ＭＩＩ
Ｃ１ｘ＋　５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６、０
℃）〕中で２回洗い、２　ｍｌの冷したカルシウム・バ
ッファー（ｌ　ＯＯｍＭ　ｃａａｌｔ＋２５０　ｍＭ　
ＫＣＩ　＋　５　ｍＭ　ＷＬ９Ｃ１ｘ　ｔ　５　ｍＭ　
Ｔｒ　ｉ　ａ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６＋０℃）〕中に再
懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２　：　Ｉ　
（ｖｏｌ、：ｖｏｌ、）　　混合する。この混合物を６
０分間、０℃で保った後、１ｍのＬＢＧ培地（１％トリ
プトン、０．５％酵母エキス、１％Ｎａα。

０．０８％グルコース、　ｐＨ７，２）を添加し、３７
℃で１時間振と５培養する。培養液を、選択培地（７ン
ビシリン（シグマ）３０μｇ／ｄをを含むＬ培地プレー
）　）　Ｋ　１００．μｌ／プレートの割合で接種する
。プレートを３７℃で１晩培養して、形質　４転換株を
生育させる。得られたアンピシリン耐性のコルニーより
、公知の方法を用いてＤＮＡを調製し、７ガーースゲル
電気泳動により、目的のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約
４．ＯＫｂｐ　）の取得を確認した。第３図Ｋ、プラス
ミドｐＴＮＦＩＢＨの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．Ｉ　Ｋｂｐ　）を、合成オリゴヌクレオチドＴ
ＮＦ−１４〜ＴＮＦ−１７を用い【プラスミドｐＴＮＦ
３　（約２，４　Ｋｂｐ　）を、それぞれ作成した。

第４図及び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴ
ＮＦ３の作成方法を、それぞれ示す。こうして得られた
ヒ）ＴＮＦ”遺伝子の一部を含むプラスミドｐＴＮＦＩ
ＢＲ、ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、合成オリゴヌク
レオチド使用部分の塩基配列が設計通りであることは、
マキサム・ギルバート法（Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｍら！Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、＋　６５．　４９９（１
９８０））　　Ｋよって確認した。

実施例４（ヒ）ＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ屋
を、実施例３と同様にして制限酵素Ｃ１ａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒ）　ＴＮＦ
遺伝子の一部を含む約２２ＱｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａ
Ｉ　０５ａｌＩ　）をポリアクリルアミドゲルより回収
した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２１０μ
ｙを１００μＪの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ
７，５）。

６０　ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ　ＷＬｆｌＣｌ、水溶液
に溶解させ、４０ユニツトの制限酵素Ｐｖｕｌｌ　（全
酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行なった。

そして、実施例３の方法に準じて制限酵素５ａｌｌ　　
による切断、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒ）ＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約１７０ｂｐのＤＮＡ断片（５ａｉ１
４＋Ｐｖｕｌｌ）をポリアクリルアミドゲルより回収し
た。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３１Ｏμ
ｇも１００μノの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　（
ｐＨ７−５Ｌ６０　ｍＭ　ＮａＣＡ’　、　７　ｍＭ　
ＭＥＣ１＊水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限酵素
Ｐｖｕ■　及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉｎｄｌ［Ｉ
　（全酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行な
った。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒ）　ＴＮ
Ｆ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｐｖ
ｕｌ　Ｍ　Ｈｉｎｄｌｌｌ　）をポリアクリルアミドゲ
ルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙ８３１Ｎ（約４．７　Ｋｂｐ　）　５μｇを、上記と
同様に制限酵素ＣＪａｌ及びＨｉ　ｎｄｌｌｌで切断し
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、
実施例３の方法に準じて、プラスミドｐＹ８３１Ｎの大
部分を含む約４．７　ＫｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ１ａｌ　
０　Ｈ３ｎｄｍ　）を７ガ！−スグルより回収した。

こうして得られた、ヒ）ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ＋約１７０ｂｐ及び約ｘｌｏｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミドｐＹ８３１Ｎの大部分を含む約４．
７ＫｂｐのＤ　Ｎ　Ａ断片とを混合し、エタノール沈澱
の後、実施例３の方法忙準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方
法に準じてエシェリヒア・コｉｊｃ６００ｒ−ｍ−株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒ）ＴＮＦ遺伝子発
現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２　Ｋｂｐ
　）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラ
スミドｐＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒ）　ＴＮＦ遺伝子発現屋プラスミ
ドｐＴＮＦ４０１ＮＮ　２０所を、実施例４の方法に準
じて制限酵素ＣＪａＩ及びＨｌｎｄｌ［［で切断し、ポ
リアクリル７ξトグル電気泳動（ゲル濃度５％）及び７
ガｐ−スゲルミ気泳動（ゲル濃度０．８％）の後。

それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つ
のＤＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約４．７　Ｋｂｐ両方
共（Ｊａｌ　０　Ｈｉｎｄｌｌｌ　）をゲルより回収し
た。

ここで得られたヒ）ＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０ｐｌのＩＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ
　（ｐＨ７，４）　＋　１０ｍＭＭｇＳＯ４，１ｍＭジ
チオスレイトール水溶液に溶解させ、ｌＯユニットの制
限酵素ＨａｐＨ（全酒造）を添加して、３７℃で１時間
切断反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方
法に準じて、ヒ）　ＴＮＦ遺伝子の大部分を含む３９０
ｂｐのＤＮＡ断片（ＨａｐＨｍ　Ｈｌｎｄ［ｌＩ　）を
ポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第７図記載のｔｘ基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μｇについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ　４−Ｄ
ＮＡ　！＋ガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約４．７ｂｐのＤＮＡ断片（ＣＪａｌ→Ｈｉ
ｎｄｌｌ！　）及びヒ）　ＴＮＦ遺伝子の大部分を含む
約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈａｐ！ｌ　ｍ　Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ　）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の
方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を
行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェ
リヒア・コリＣ６０Ｑｒ−ｔｕ−株に導入し、形質転換
株の中より目的のプラスミドＩ）ＴＮＦ４２９　（約５
．２Ｋｂｐ　）を有するクローンを選択した。このプラ
スミドはヒトＴＮＦの７ミノ末端の７アミノ酸残基を欠
失させ、なおかつ１８番目のＡｌａをＰｒｏへ置換させ
た形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、
第７図にその作成方法を示した。

さらに、上記と同様な手法で、第７図記載の塩基配列を
有する合成オリゴヌクレオチドのかわりに第８図〜第１
７図記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを
用いることにより、ヒトＴＮＦの７ミノ末端の１１１１
０ｙ９ｔ８＋６＋５＋４＋３＋２又はアミノ酸残基を欠
失させ、なおかつ１８番目のＡｊａをＰｒｏへ置換させ
た形の新規抗頴瘍活性ポリペプチドをフードする新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ
　４３４　＋　ｐＴＮＦ　４３５　。

ｐＴＮＦ４３６．　ｐＴＮＦ４３７．　ｐＴＮＦ４３８
ｔ　ｐＴＮＦ４３９．　ｐＴＮＦ４４０゜ｐＴＮＦ４４
１．　ｐＴＮＦ４４２．又はｐＴＮＦ４４３　（すべて
約５．２Ｋｂｐ　）を、それぞれ作成した。また、第１
８図記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを
用いることＫより、ヒトＴＮＦの１８番目のＡＪａをＰ
ｒｏに置換させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードする新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラ
スミ）　ｐＴＮＦ４４４　（約５．２　Ｋｂｐ　）を作
成した。さらに、第１９図又は第２０図記載の塩基配列
を有する合成オリゴヌクレオチドを用いることＫより、
ヒトＴＮＦの７ミノ末端ＫＡ／ａ又は（Ｈ，Ｎ）−Ｇｌ
　ｎ−Ａｌ　ａ−（ＣＯＯＨ）を結合させ、なおかつ１
８番目のＡｌｔをＰｒｏへ置換させた形の新規抗腫瘍活
性ポリペプチド遺伝子発現壓プラスミドｐ・ＴＮＦ４４
５又はｐＴＮＦ４４６　（共に約ｓ、ｚ　Ｋｂｐ　）を
、それぞれ作成した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４及び５で得られた、ヒ）ＴＮＦ遺伝子発現
凰プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ及び本発明の各種新規
抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドのそれ
ぞれを有するエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株を
、３０〜５０μ、ｌｉｔ　／　ｍｌのアンピシリン。

０．２チのグルコース及び４　ｒｎｙ／ｄのカザミノ酸
を含むＭ９培地〔０，６％Ｎａ、ＨＰＯ，−０、３％Ｋ
Ｊ（Ｐｏ４−　ｏ　、０５％　ＮａＣＡ！　−０，１％
ＮＨ４Ｃ６水溶液（ｐＨ７，４）をオートクレーブ滅菌
した後に、別途にオートクレーブ滅菌したｍｓｏ、水溶
液及びＣａＣ４水溶液をそれぞれ最終濃度２ｄ及び０．
１ｍＭＫなるように加える。〕ＩＪに液洩し、ＯＤ、。

。が０．７に達するまで、３７℃で振と５培養を行なっ
た。次いで、最終濃度キ５０１／Ｉｄの３−β−インド
ールアクリル酸を培養液中に添加し、さらに３７℃で１
２時間振と５培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
ー（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　　を含む２０７１！Ｍリン
酸バッファー、ｐＨ７，４）を用いて菌体の洗浄を行な
った。洗浄後の菌体を３０ｄのＰＢＳバッファーに懸濁
させ、超音波発生装置（久保田、２００Ｍ。

型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残
渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、ＴｒＩｓ−
ＨＣＩ　　バッファー（ｐＨ６，８）　＋　ｓ　Ｄｓ　
＋　２−メルカプトエタノール、グリセルールを、それ
ぞれ最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるよう
に加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔銘
木、遺伝、３１．４３（１９７７））を行なった。分離
用ゲルは１２．５％とし、泳動バッフ７−はＳ　Ｄ　Ｓ
　＋　Ｔｒｉｓ−グリシン系（Ｕ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ
　ＩＮａｔｕｒｅ　、２２７，６８０（１９７０））を
用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシー
プル−Ｒ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発
現の確認を行なった。結果の一部を複写して第２１図に
示した。

染色後のゲルについてりρマドスキャナー（自律＋Ｃ８
９３０型）を用いた解析を行なったところ発現聾プラス
ミドｐＴＮＦ４２９によりコードされる新規抗腫瘍活性
ポリペプチドの産生量はｌ：）ＴＮＦ蛋白質の６．０倍
にも及んでいた。

実施例７（活性の評価） ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活
性測定は、前記Ｒｕｆｆ　　の方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られたヒ）ＴＮＦ蛋白質又は新
規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートを順
次培地で希釈した試料１００μノと、４　Ｘ　１０’個
／ゴの濃度のマウスＬ、−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−９２９）Ｉ！！ｉ！濁液１００μｌを、９６穴
の組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で混合
した。なおこの際に、最終濃度１ｐｆｊ／ｎｔの７クチ
ノマイシンＤ（コスメゲン。

萬有展薬）を添加しておく。培地としては、５チ（ｖｏ
ｌ　／　ｖｏｌ　）のウシ胎児血清を含むイーグルのミ
ニマム・エツセンシャル培地（日水裂薬）を用いた。上
記マイクロプレートを、５チ炭酸ガスを含む空気中、３
７℃で２０時間培養した後、クリスタル・バイオレット
溶液（５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）メタノール水溶液に、
　ｏ、５　％　（ｗｔ／ｖｏｌ　）のクリスタル・バイ
オレットを溶解させたもの〕を用いて生細胞を染色した
。余分なりリスタル・バイオレットを洗い流し乾燥した
後、残ったクリスタル・バイオレットを１００μノの０
．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５ｎｍＫおけろ
吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東洋囲器、ＥＴＹ−
９６型）で測定する。この吸光度は、生き残った細胞舷
に比例する。そこで、ヒ）ＴＮＦ蛋白質又は新規抗腫瘍
活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を
加えない対照の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ラ
イゼートの希釈率をグラフ（第８図）によって求め、そ
の希釈率をユニットと定義する。

第２２図より、実施例６で得られた発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ４２９にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを含む大腸菌ライゼー）１００μｊは同じ〈実施例６
で得られたヒトＴＮＦ蛋白質な含む大腸菌ライゼー）１
００μｌの１０倍の活性を有していることが明らかＫな
った。また、他の発現製プラスミドによりフードされる
新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートに
ついても、それぞれ著量の活性が認められた。

実施例６で得られたヒ）　ＴＮＦ蛋白質又は新規抗腫瘍
活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総
蛋白質量は、プロティン・７ツセイ・キット（バイオ・
ランド）を用いて定量し、クシ血清アルブミンを用いた
検量線より計算した。実施例６で得られた発現量の値、
上記で得られた活性の値及び蛋白質定量の結果よりヒ）
ＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの比活性
を計算したところ、発現型プラスミドｐＴＮＦ４２９に
よりコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドはヒトＴ
ＮＦ蛋白質の約１．２倍の比活性を有しているご−とが
明らかになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴ　Ｎ　Ｆ　Ｒ公子の塩基配列を
、第２図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基
配列を、それぞれ示したものである。第３図、第４図及
び第５図は、ヒ）ＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミ
ドｐＴＮＦＩＢＲ＊　ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作
成方法を、それぞれ示したものである・。 第６図はヒ）ＴＮＦ遺伝子公子世プラスミドｐＴＮＦ４
０１ＮＮの作成方法を示したものであり、第７図〜第２
０図は各種新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現屋プ
ラスミドの作成方法を示したものである。第２１図は各
種発現型プラスミドの発現確認結果を示したものである
。縞２２図はヒ）ＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの活性測定結果を示したものである。

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番目
   のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１ま
   たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
   なされた配列のうち、少なくとも１８番目のＡｌａのＰ
   ｒｏへの置換を含むような配列を含有する新規生理活性
   ポリペプチド。
2. （２）少なくとも次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 を含む、第１項記載のポリペプチド。
3. （３）アミノ末端にＰｒｏが結合していることを特徴と
   する第１項記載のポリペプチド。
4. （４）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（
   ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴とする第１項記載
   のポリペプチド。
5. （５）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐ
   ｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴とする第
   １項記載のポリペプチド。
6. （６）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌ
   ｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴
   とする第１項記載のポリペプチド。
7. （７）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａ
   ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合しているこ
   とを特徴とする第１項記載のポリペプチド。
8. （８）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓ
   ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合し
   ていることを特徴とする第１項記載のポリペプチド。
9. （９）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐ
   ｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）
   が結合していることを特徴とする第１項記載のポリペプ
   チド。
10. （１０）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
    Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（
    ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴とする第１項記載
    のポリペプチド。
11. （１１）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−
    Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐ
    ｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴とする第
    １項記載のポリペプチド。
12. （１２）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−
    Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌ
    ｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴
    とする第１項記載のポリペプチド。
13. （１３）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
    Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａ
    ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合しているこ
    とを特徴とする第１項記載のポリペプチド。
14. （１４）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ−
    Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓ
    ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合し
    ていることを特徴とする第１項記載のポリペプチド。
15. （１５）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−
    Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐ
    ｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）
    が結合していることを特徴とする第１項記載のポリペプ
    チド。
16. （１６）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｇｌｎ−Ａｌａ−
    Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔ
    ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（Ｃ
    ＯＯＨ）が結合していることを特徴とする第１項記載の
    ポリペプチド。
17. （１７）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴
    とする第３項〜第１６項のいずれかに記載のポリペプチ
    ド。
18. （１８）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番
    目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１
    またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入
    がなされた配列のうち、少なくとも１８番目のＡｌａの
    Ｐｒｏへの置換を含むような配列を含有する新規生理活
    性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプ
    ラスミド。
19. （１９）該プラスミドがｐＴＮＦ４３４、ｐＴＮＦ４３
    ５、ｐＴＮＦ４３６、ｐＴＮＦ４３７、ｐＴＮＦ４２９
    、ｐＴＮＦ４３８、ｐＴＮＦ４３９、ｐＴＮＦ４４０、
    ｐＴＮＦ４４１、ｐＴＮＦ４４２、ｐＴＮＦ４４３、ｐ
    ＴＮＦ４４４、ｐＴＮＦ４４５、またはｐＴＮＦ４４６
    である第１８項記載のプラスミド。
20. （２０）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番
    目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１
    またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入
    がなされた配列のうち、少なくとも１８番目のＡｌｓの
    Ｐｒｏへの置換を含むような配列を含有する新規生理活
    性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプ
    ラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞。
21. （２１）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
    ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特徴とする第
    ２０項記載の微生物細胞。
22. （２２）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番
    目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１
    またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入
    がなされた配列のうち、少なくとも１８番目のＡｌａの
    Ｐｒｏへの置換を含むような配列を含有する新規生理活
    性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプ
    ラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞を培養
    し、培養物中に新規生理活性ポリペプチドを生成蓄積せ
    しめ、得られた培養物から新規生理活性ポリペプチドを
    分離することを特徴とする、新規生理活性ポリペプチド
    の製造方法。
23. （２３）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番
    目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１
    またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入
    がなされた配列のうち、少なくとも１８番目のＡｌａの
    Ｐｒｏへの置換を含むような配列を含有する新規生理活
    性ポリペプチドを含有する医薬組成物。