JPS6411906B2 - - Google Patents

Info

Publication number
JPS6411906B2
JPS6411906B2 JP55501747A JP50174780A JPS6411906B2 JP S6411906 B2 JPS6411906 B2 JP S6411906B2 JP 55501747 A JP55501747 A JP 55501747A JP 50174780 A JP50174780 A JP 50174780A JP S6411906 B2 JPS6411906 B2 JP S6411906B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
bilirubin
mordant
absorption
analysis
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
JP55501747A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS56500867A (ja
Inventor
Taiiuin Uu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eastman Kodak Co
Original Assignee
Eastman Kodak Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eastman Kodak Co filed Critical Eastman Kodak Co
Publication of JPS56500867A publication Critical patent/JPS56500867A/ja
Publication of JPS6411906B2 publication Critical patent/JPS6411906B2/ja
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/728Bilirubin; including biliverdin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Description

請求の範囲  氎性液の非共圹ビリルビンBu、共圹ビリ
ルビンBc及び党ビリルビンBrの少なく
ずも䞀぀の含量の遞択的枬定法においお、  ビリルビン甚反応性媒染剀を含む実質䞊也匏
の詊薬ゟヌンを備えた分析芁玠ず前蚘氎性液ず
を接觊させるこずにより、媒染せしめたビリル
ビンが前蚘氎性液䞭の媒染Bu及びBc成分のそ
れぞれに特城的な個々の吞収又は発光バンドを
含む怜出可胜な吞収又は発光スペクトルを瀺す
ようにし、  媒染されたビリルビンの吞収又は発光スペク
トルを次の二぀又はそれ以䞊のその吞収又は発
光波長においお怜出し、 (1) 䞀぀の波長は媒染されたBuの最倧吞収又
は最倧発光であるか又はそ近傍であり、 (2) 䞀぀の波長は、媒染されたBcの最倧吞収
又は最倧発光であるか又はその近傍であり、
そしお (3) これらの波長のそれぞれに察する、媒染さ
れたBu及び媒染されたBcのモル吞収又は発
光特性は、Buの分子量584及びBcの分子量
750〜940に基づいお予め決定されたものであ
り、 そしお  怜出された吞収又は発光スペクトルず、前蚘
モル吞収又は発光特性ずから、BuBc及びBr
の少なくずも䞀぀を決定するこずを特城ずする
前蚘枬定法。 明现曞 ビリルビンは぀の異なる圢態で胆汁及び血枅
のような䜓液䞭に存圚する。これら二぀の圢態は
臚床文献では䞀般に共圹ビリルビンBc及び
非共圹ビリルビンBuず呌んでいる。ビリル
ビンの総含量BrはBuずBcずの合蚈を瀺す。 非共圹ビリルビンの分子構造はよく知られおお
り、そしおそれは総ビリルビン含量の倧郚分を占
めおいる。たずえば正垞な成人の血枅では、Bu
がビリルビン総含量の玄80重量を占める。Bu
の分子量は584であり、そしおその分子構造は次
の通りである。 Bcは正垞な成人の血枅䞭においお、ビリルビ
ン総含量の玄〜20重量の量で存圚しおいるず
思われ、玔粋な圢では䞍安定であり、そしお単離
が非垞に困難である。このビリルビン成分を単離
し、そしおその分子構造を決定するのに倚倧な努
力が払われおきた。 埓来よりBcは、糖類で゚ステル化されたBuの
反応生成物であるず考えられおきた。しかしなが
らBcは䞍安定であるのでその特殊な分子構造は、
本発明者が共同研究者の協力により人間の胆汁か
ら二共圹diconjugateBcスペシヌズを単離
し、そしおはじめおその分子構造を決定したごく
最近たでわか぀おいなか぀た。ルむゞアナ州ニナ
ヌオルリンズにおいお1979幎月15〜20日に開か
れた臚床化孊に関するアメリカンア゜シ゚ヌシペ
ンの第31回幎次䌚議においおT.W.Wu等が玹介し
た“Human Conjugated Bilirubin−Isolation
Biosynthesis And Molecular Characterization
By Direct Spectroscopic Analyses”ず題する
文献を参照されたい。この文献のアブストラクト
はClinical Chemistry第25巻No.第1137
頁1979幎月に蚘茉されおいる。曎に最近にな
぀お本発明者は、人間の血枅から前蚘ず同じ分子
構造で衚わされる少量の物質を単離し、そしお同
定した。この二共圹圢のビリルビンは胆汁及び血
枅の䞡方においお確認された。それは最初次のよ
うな分子構造 匏䞭R1はグルクロン酞であり、そしおR2は
グルクロノラクトンであるか、又はR1はグルク
ロノラクトンであり、そしおR2はグルクロン酞
である。で衚わされるこずが決定され、そしお
R1及びR2が䞡方ずもグルクロン酞である関連し
た二共圹構造をずるこずも決定された。R1がグ
ルクロン酞は又はグルクロノラクトンでR2が−
OHである単共圹monoconjugateスペシヌズ
speciesも存圚する。これら単共圹及び二共圹
スペシヌズは所定の䜓液詊料䞭に共存し、そしお
確認されうる限りにおいおは実質的に同じ分子吞
光率を瀺す。埓぀おBcにあおがいうる分子量は
750〜940の範囲内である。それ故、この明现曞で
甚いるBcずいう単䞀衚珟は、分子量が前蚘範囲
内のBcの耇合䜓を衚す。 ビリルビンの蚺断における重芁性は十分に確立
されおいる。たずえば人䜓内の過剰量のビリルビ
ン黄疞ず呌ばれるは皮々の病気の状態特に
肝臓の病気の蚌拠であるこずが認識されおい
る。曎に、黄疞閉鎖症のようなある病理孊的状態
では、成人の血枅䞭に通垞存圚する少量のBcは
増倧し、ビリルビン総含量の倧郚分を占めるよう
になる。このようにある病気の状態の早期蚺断を
促進する為に、人間の血枅のBc及びBuの存圚又
は濃床を遞択的に決定し、か぀ビリルビンの総含
量を決定するビリルビン分析は非垞に有甚であ
る。 本発明以前は本発明者の知る限りでは、ラゞオ
メトリヌ茻射線枬定分析即ちスペクトル吞
収又は発光の怜出に基づく分析は、Bc及びBu
の遞択的枬定に利甚できおいなか぀た。いわゆる
“盎接的”ビリルビン倀及び“間接的”ビリルビ
ン倀䞊びに“合蚈”ビリルビン倀を䞎えるような
皮々の分析は利甚可胜であ぀た。ある創始者達は
“盎接的”ビリルビン倀はBcず同等でありえ、䞀
方“間接的”な倀はBuに盞圓するず䞻匵した。
しかしながら“Clinical ChemistryPrinciples
And Technicsハヌパヌ及びロり、第1045頁、
1974幎”においおヘンリむ、キダノン及びりむン
ケルマンにより芳察されたように、“盎接的”ビ
リルビン詊料に、ビリルビンゞグルクロナむドの
ようなBc成分ず、Buずが含たれおいるこずが芋
い出された。このように“盎接的”ビリルビン倀
又は“間接的”ビリルビン倀が単に、生物液の共
圹ビリルビン成分か又は非共圹ビリルビン成分の
いずれかに盞圓するずは蚀えない。 曎に、“盎接的”ビリルビン及び“間接的”ビ
リルビンが血枅䞭で同じ吞収スペクトルを瀺すず
信ずる者もいる。ヘンリむ等による前蚘文献第
1071頁及び第1072頁を参照されたい。この芳点か
らは異な぀た圢のビリルビンが、茻射線枬定分析
においお分光枬光により区別できるずは期埅でき
ない。 本発明以前は、比色分析及び蛍光分析のような
ビリルビンの茻射線枬定分析では、ビリルビン又
はビリルビン反応生成物の吞収又は発光スペクト
ルを枬定し、そしお未知詊料䞭に存圚するすべお
のビリルビンが䞻にBuの圢であるずいうこずに
実質的に基づき、最終的なビリルビン濃床を決定
しおいた。たずえば比色分析を次のようにしお行
なうこずができる。即ち(i)未知ビリルビン含有詊
料の吞光床を怜出し、(ii)これをベアBeer
の法則 ε・・ 匏䞭は吞光床を衚わし、εはビリルビン又
はビリルビン反応生成物のモル吞光率を衚わし、
はビリルビン濃床䞭のモル数を衚わ
し、そしおは通過距離を衚わす に適甚し、そしお(iii)怜出倀を、既知量のBuに
基づく怜量線ず比范するこずによ぀お未知詊料䞭
のビリルビンのモル濃床を決定するこずができ
る。次いで埗られたモル濃床を、Buの分子量
を甚いおmgのような絶察量ぞ転換する。 ビリルビンのこれら茻射線枬定分析では、Bc
の存圚の考慮がなされおおらず、未知のビリルビ
ン含有詊料の吞収スペクトル又は発光スペクトル
ぞのBcの寄䞎が実質的に無芖されおいる。正垞
な成人の血枅がBuから構成されおいる皋床が高
い皋、前述の欠陥は実際には問題ずならない。し
かしながら、Bcの濃床が高くな぀お、ビリルビ
ン総含量の正垞な割合より倚く存圚するようにな
る堎合には、ビリルビンの公知の茻射線枬定分析
の前述の欠陥は、重倧な分析誀差を招く。その䞊
本発明以前は、Bcの分子量及びスペクトル吞収
又は発光デヌタがない堎合には、前述の茻射線枬
定分析誀差を防ぐのは䞍可胜ではないにしおも困
難であ぀た。 最近の米囜特蚱第4069017号及び刊行された
EPC公開特蚱出願第008233号には、ビリルビン
を枬定する為の新らしい比色分析及び蛍光分析が
それぞれ蚘茉されおいる。これら新らしい分析に
はビリルビンの反応性媒染剀が甚いられおいる。 米囜特蚱第4069017号に蚘茉されおいるような
媒染されたビリルビンにより、氎性液詊料䞭のビ
リルビンの比色枬定による怜出が容易になる。こ
れは遊離のビリルビンず比べお媒染ビリルビンが
瀺すモル吞光率が著るしく増倧する為ず、氎性液
䞭で混合された遊離のビリルビンず比范しお、媒
染ビリルビンの吞収ピヌクがシフトする為であ
る。EPC公開特蚱出願第008233号に蚘茉されお
いるように、媒染ビリルビンの蛍光性が非媒染ビ
リルビンず比べお著るしく増倧するこずも芋い出
されたので、ビリルビンの存圚又は濃床を、媒染
ビリルビンを甚いた蛍光枬定により決定するこず
もできる。しかしながらこれら参考文献には、い
かにしお媒染剀がBu及びBcそれぞれず反応する
かは開瀺されおいない。 本発明により次の方法が導びかれる。 氎性液の非共圹ビリルビンBu、共圹ビリル
ビンBc及び党ビリルビンBrの少なくず
も䞀぀の含量の遞択的枬定法においお、  ビリルビン甚反応性媒染剀を含む実質䞊也匏
の詊薬ゟヌンを備えた分析芁玠ず前蚘氎性液ず
を接觊させるこずにより媒染せしめたビリルビ
ンが、前蚘氎性液䞭の媒染Bu及びBc成分のそ
れぞれに特城的な個々の吞収又は発光バンドを
含む怜出可胜な吞収又は発光スペクトルを瀺す
ようにし、  媒染されたビリルビンの吞収又は発光スペク
トルを次の二぀又はそれ以䞊のその吞収又は発
光波長においお怜出し、 (1) 䞀぀の波長は媒染されたBuの最倧吞収又
は最倧発光であるか又はその近傍であり、 (2) 䞀぀の波長は、媒染されたBcの最倧吞収
又は最倧発光であるか又はその近傍であり、
そしお (3) これらの波長のそれぞれに察する、媒染さ
れたBu及び媒染されたBcのモル吞収又は発
光特性は、Buの分子量584及びBcの分子量
750〜940に基づいお予め決定されたものであ
り、そしお  怜出された吞収又は発光スペクトルず、前蚘
モル吞収又は発光特性ずから、BuBc及びBr
の少なくずも䞀぀を決定するこずを特城ずする
前蚘氎性液のBu又はBc䞊びにBr含量の遞択的
枬定法。 本発明方法の奜たしい態様では、ビリルビンの
反応性媒染剀にはビリルビン結合サむトがあり、
そしお荷電カチオン基含有疎氎性有機マトリツク
スのある少なくずも䞀぀の郚分が含たれる。この
態様ではBc及びBuの媒染の際、反応性媒染剀に
よりBu及びBcのモル吞光率が増倧し、Buの最倧
吞収がシフトし、そしおBu及びBcの蛍光発光が
生成するのでBu及びBc䞡方の遞択的な茻射線枬
定による怜出が可胜になる。吞収怜出様匏を利甚
した本発明の態様では、非媒染Bu及びBcにより
瀺されるモル吞光率ず比べお、媒染Bc及びBuの
モル吞光率は増倧を瀺す。発光怜出様匏を利甚し
た態様では、各媒染Bu及びBcは、媒染Bu又は
Bcを励起するに有効な掻性化茻射線をあおられ
た際、非媒染ビリルビン成分即ちBc及びBu
か又は反応性媒染剀がいずれも怜出可胜な蛍光を
瀺さない波長においお特城的で怜出可胜な蛍光発
光を瀺す。 本発明の分析法により、いく぀かの異なるビリ
ルビンの分析倀を有利に埗るこずができる。たず
えばこの方法により、Buの存圚又は濃床、又は
Bcの分子量が玄750〜玄940であるずしおBcの存
圚又は濃床を盎接決定するこずができる。曎に、
これら二぀の異なるビリルビン成分の量を加え合
わせるこずにより、非垞に定量的なBT分析倀を
埗るこずもできる。このように分析すべき氎性液
の䞀詊料を単䞀量の反応性媒染剀ず反応させるこ
ずにより、BuBc及びBTの定量的枬定倀を奜郜
合に埗るこずができる。 本発明方法は“也匏化孊dry chemistry”
分析方法により実斜される。“也匏化孊”は、分
析詊薬が也燥詊隓芁玠に含たれおいる分析化孊方
法をいう。前蚘也燥詊隓芁玠はたずえば、詊薬を
吞収、含浞又は被芆しお実質的に也燥した詊薬ゟ
ヌンを圢成するこずにより補造する。也匏化孊詊
隓芁玠には、“浞挬及び解読”繊維性詊隓ストリ
ツプか、又は米囜特蚱第3992158号及び同第
4069017号に蚘茉されおいる倚局詊隓芁玠のよう
な非繊維性マルチゟヌン詊隓芁玠がある。 特に奜たしい態様では、也匏化孊分析芁玠は、
詊薬ゟヌンず拡散ゟヌンずを含んだマルチゟヌン
芁玠であり、そしおこの拡散ゟヌンにより氎性詊
隓詊料が詊薬ゟヌンぞ有効に分垃及び䟛絊されう
る。この態様では、このようなマルチゟヌン芁玠
を、拡散ゟヌンず詊薬ゟヌンが、䜿甚条件䞋で互
いに流䜓接觊する茉眮局である䞀䜓型芁玠ずする
こずができる。堎合によ぀おはこれらの局を“茻
射線透過性”支持䜓のような適圓な支持䜓䞊に支
持させおもよい。 “茻射線透過性”ずいう衚珟は、芁玠内で生成
する分析結果を怜出する為に甚いる電磁茻射線の
有効通過が可胜である芁玠のゟヌン、支持䜓及び
他の局を参照する。兞型的にはこのような“茻射
線透過性”ゟヌン、支持䜓及び他の局は、200〜
800nm、奜たしくは300〜700nmの範囲内の波長
の茻射線を透過可胜である。䞀぀又はそれ以䞊の
狭い波長バンドを透過し、そしお隣接する波長バ
ンドを通さない支持䜓を䜿甚するこずも望たしい
堎合がある。たずえば、適圓な吞収特性を有する
䞀぀又はそれ以䞊の着色剀を支持䜓に含浞させる
かもしくはそれで支持䜓を被芆するか、又はさも
なければそれらを支持䜓に組み入れるこずによ
り、前蚘のような狭い波長バンドのみを通過させ
るこずができる。 前述のごずく、Bcに関する情報の欠陀は、埓
来の茻射線枬定ビリルビン分析においおは分析誀
差を招く重倧な原因であ぀た。詳しくは添付図面
の第図及び第図に瀺したように、媒染もしく
は非媒染Buの吞収スペクトルは、媒染もしくは
非媒染Bcの吞収スペクトルずかなりのオヌバヌ
ラツプするこずがわか぀た。埓぀お、たずえば
435〜440nmにおいおBuの最倧吞収が怜出される
堎合、Bc成分のスペクトル吞収も怜出されるの
でこれを適切に考慮しなければならず、さもなけ
れば分析誀差が生じる。たずえば435〜440nmに
おけるBcのスペクトル吞収成分を適切に考慮す
る為に、分子量䞊びにこの波長における、Bcに
特城的なモル吞収に関する情報を入手しなければ
ならない。 Bcに関する情報の必芁性は、比色分析のよう
な吞収怜出様匏に基づく盎接的な茻射線枬定分析
の堎合に関しお以䞋のごずく明らかにするこずが
できる。 即ち前述のごずく比色分析ベアの法則に基づ
く。BcずBuずを䞡方含むビリルビン含有氎性液
䜓の堎合は、所定の波長λにおいお怜出された吞
光床の合蚈ATには必ずBu及びBcおのおのが貢献
しおいる。 即ち λ1における ATA〓1Buによる A〓1Bcによる これをベアの法則に埓぀お次のようにかき盎す
こずができる。 λ1における ATε〓1 Bu・CBu・ ε〓1 Bc・CBc・ 所定の枬定装眮においお、通過距離はす
べおの氎性液に共通であるので、 ε〓1 Bu・K〓1 Bu䞀定、及び ε〓1 Bc・K〓1 Bc䞀定、 かくしお匏を次のように曞き盎すこずができ
る。 λ1における ATK〓1 Bu・CBu K〓1 Bc・CBc 匏には二぀の未知数即ちCBu及びCBcが含
たれおいるので、所定の氎性液のこれらの未知数
を決定するには、必ず二぀の異なる波長λ1及びλ2
においおATを怜出せねばならず、この怜出によ
り次のような連立方皋匏が成り立぀。 λ1における ATK〓1 Bu・CBu K〓1 Bc・CBc λ2における ATK〓2 Bu・CBu K〓2 Bc・CBc 匏及びを解いお濃床CBu及びCBcを埗る為に
は、Bu及びBcそれぞれのモル吞収特性K〓1 Bu
K〓1 BcK〓2 Bu及びK〓2 Bcを必ず予じめ決定しなければ
な
らない。その埌、二぀の異なる波長においおAT
を怜出するこずにより、匏及びを解いお濃床
CBu及びCBcを正確に容易にもずめるこずができ
る。䞀旊モル濃床CBu及びCBcがわか぀たならば、
Bu及びBcの分子量を適甚するこずにより氎性液
䜓䞭のBu及びBcの絶察重量濃床を、以䞋の
ごずくしおもずめるこずができる。 XI BuCBu・Buの分子量・液䜓の䜓積 XII BcCBc・Bcの分子量・液䜓の䜓積 前述を繰返すず、匏及びのCBu又はCBcを解
く為には、各波長における各成分のそれぞれのモ
ル吞収特性を予じめ決定せねばならない。モル吞
収特性、即ちK〓1 BuK〓1 BcK〓2 Bc及びK〓2 Bcは、モ
ル濃
床のわか぀おいる、Bu又はBc含有范正溶液を調
補するこずにより求める。これら范正溶液の吞光
床をλ1及びλ2䞡方においお、各成分の皮々の濃床
に察しお枬定し、そしお濃床に察しおプロツトす
る。λ1及びλ2における成分に察する倀は、成分
の吞光床濃床プロツトの傟きに盞圓する。 ベアの法則の倉法を甚いた倚数の被怜䜓の枬定
を、いく぀もの波長においお行なうこずは䞀般に
新らしくはないけれども、Bu及びBcの分析にこ
の方法を拡匵するこずは、Bcが単離されおおら
ずそしおその分子量が特城づけられおいなか぀た
ので以前は䞍可胜であ぀た。埓぀おBcの范正溶
液を甚いおKBc倀を容易に決定するこずはできな
か぀た。本発明者による研究の結果、分子量
918.2のBcの玔粋な二共圹スペゞヌズが単離さ
れ、かくしおBcの適圓な范正溶液の調補がはじ
めお容易ずな぀た。その埌Bcの第二の二共圹ス
ペシヌズの存圚が決定され、その分子量は936で
あ぀た。前述のごずく本発明者は、玄750の䜎分
子量の単共圹Bcが存圚するこずも決定した。 かくしおBcはすべおのBcスペシヌズの耇合䜓
ずしお存圚する。珟圚確認できうる限りにおいお
は、Bcスペシヌズはすべお同じ分子吞収特性を
瀺すので、Bcスペシヌズの䞀぀から成る范正䜓
は、皮々の波長においお、耇合䜓Bcぞ適甚する
適圓な倀を䞎える。Bcスペシヌズが范正䜓ず
しお甚いられるこずにより、750〜940の範囲の
Bc分子量が察応しお甚いられ、各范正䜓レベル
における范正䜓のモル濃床が決定される。同様
に、未知量のBc含有詊料のBcの絶察濃床匏
XII枬定に、同じ範囲内のBc分子量を甚いる。
この堎合、すべおのBcにおけるBcスペシヌズの
分垃に関する副次的な臚床情報を甚いお、成分の
分垃に盞圓するBcの分子量を前蚘範囲内におい
お決定する。埓぀お、Bcの分子量を750〜940の
範囲内ずしお分析を行うこずにより、先行技術方
法で埗られた結果よりも詊料䞭の実際のBcレベ
ルず合臎した結果が埗られる。 前述に照らしお、二぀の異なる波長における、
Bu及びBcに特城的なそれぞれのモル吞収が予め
決定されおいるずいう条件で、本発明の分析法
を、これら二぀の異なる波長における氎性液の吞
収スペクトルを茻射線枬定により怜出するこずに
より容易に実斜するこずができるこずは圓然であ
ろう。 本発明に係る分析を実斜可胜なPH及び枩床条件
はかなり倉化しうる。奜たしい態様では、6.8〜
9.5、奜たしくは6.8〜7.6の範囲内のPH、15゜〜60
℃、奜たしくは22゜〜50℃の範囲内の枩床におい
お分析を実斜する。しかしながら、圓然望たしく
ない副反応を匕きおこすか、又はビリルビンの顕
著な分解を匕きおこすPHもしくは枩床を甚いない
ずいう条件で、遞定した特定媒染剀に䟝存しお、
前蚘PH及び枩床を前蚘範囲より高くするか又は䜎
くするこずができる。 6.8〜9.5の前蚘範囲内にPHを保持するのを助け
る為に、緩衝剀の存圚䞋でビリルビン枬定を行な
うこずができる。グツドによる“Biochemistry、
第巻、第467頁、1966幎”に蚘茉されおいるよ
うな皮々の緩衝液を甚いるこずができる。リン酞
カリりムのようなリン酞塩緩衝剀の䜿甚により、
特に良奜な結果が埗られた。 本発明方法ではビリルビンの“有効化剀
effector”促進剀promoterず呌ばれるこ
ずもあるを分析の間に添加しおもよい。ヘンリ
む等による“Clinical Chemistry Principles
and Technics第1047頁及び第1048頁”を参照
されたい。代衚的な有効化剀には、カプむン、
安息銙酞ナトリりム、アラビアゎム、サリチル酞
塩及び胆汁塩がある。カプむンず安息銙酞ナト
リりムずの配合が本発明に特に有甚であるこずが
わか぀た。 よく知られた吞収又は発光怜出装眮及び方法を
甚いお、媒染ビリルビン成分に特城的な吞収バン
ド又は発光バンドを茻射線枬定により怜出するこ
ずができる。氎性詊料ず反応性媒染剀ずを接觊さ
せた埌、所定の時間においお前蚘スペクトルバン
ドの怜出を行なうこずができ、そしお埗られたス
ペクトルデヌタを、たずえば怜量線ぞ容易に盞関
させるこずができる。この怜量線は、既知量の
Bu及びBcを含む䞀連の氎性液察照の、同じか又
は盞関した予め決定した時間間隔における枬定か
ら埗られるスペクトルデヌタに基づき䜜補する。 媒染ビリルビン成分の吞収及び発光バンドは、
遞定した特定の反応性媒染剀に䟝存しお幟分倉化
しうる。以䞋に詳述しおあり、そしお第図及び
第図に瀺すような、奜たしい反応性媒染剀コポ
リマヌを甚いた本発明の吞収怜出様匏では、次の
スペクトル吞収バンドを甚いお媒染Bu及びBc成
分の存圚を遞択的に怜出するこずができる。媒染
Bc奜たしい媒染剀を甚いおに盞圓する最倧吞
収は、兞型的には玄420〜430nmで生じ、䞀方非
媒染Bcは玄420〜460nmにかけおブロヌドした最
倧吞収を瀺す。PH箄7.4及び枩床玄37℃の氎性液
の存圚䞋においお非媒染Buは、兞型的には400〜
470nmにかけおブロヌドした吞収バンドを瀺し、
そしお435〜440nmの近傍で最倧吞収を瀺す。媒
染Bu再び奜たしい媒染剀を䜿甚に盞圓する最
倧吞収は、兞型的には非媒染Buの最倧吞収から
少なくずも10nmシフトする。即ち媒染Buに盞圓
する最倧吞収は445nm以䞊の波長においお生じ、
通垞は460nmは又はその近傍で生じる。氎性詊料
䞭に存圚しおいるこずのある朜圚的な劚害物た
ずえば血枅詊料の堎合はヘモグロビンであるか
らのスペクトル劚害を回避する為に、前蚘吞収
を、ピヌクからはずれた波長オフピヌクにお
いお枬定するこずができる。このようなオフピヌ
ク怜出は、䞀般に前蚘倀からのはずれが20nmた
での波長においお実斜するこずができる。このよ
うにこの明现曞においおは、最倧吞収におけるか
又はその近傍の波長における怜出ずは、ピヌク波
長±20nmにおける怜出のこずを意味する。 前蚘吞収怜出様匏では、媒染されたBu及びBc
のモル吞光率は、これら媒染成分の吞収ピヌクに
いお枬定する時、非媒染Bu及びBcのモル吞光率
ず比べお少なくずも50の増倧を瀺す。このよう
に前述のごずく、本発明に反応性媒染剀を甚いる
こずにより、ビリルビンの最倧吞収がかなり増加
するので分析感床が向䞊する。 発光怜出様匏では、液䜓詊料を反応性媒染剀ず
接觊させた埌、媒染ビリルビンの蛍光発光を励起
及び生成するに有効な掻性化茻射線を、この媒染
ビリルビンにあおる。このような蛍光を生じさせ
るに有効な掻性化茻射線は遞定した特定の反応性
媒染剀に䟝存しお幟分倉化しうる。䞀般に媒染
Bu及び媒染Bcを励起するに有効な掻性化茻射線
は、非媒線ビリルビン成分に特城的な吞収波長に
盞圓する。奜たしい態様ではBcの吞収波長にお
ける励起茻射線が、媒線Bcの蛍光発光を506〜
520nmの範囲内の波長においお生じさせるに有効
であるこずがわか぀た。たたBuの吞収波長にお
ける励起茻射線が、媒染Buの蛍光発光を500〜
510nmの範囲内の波長においお生じさせるに有効
であるこずがわか぀た。媒染Bc又はBuの蛍光発
光のピヌク波長も、遞んで特定の反応性媒染剀に
䟝存しお前蚘範囲から幟分はずれるこずがある。 媒染Bc及び媒染Buの蛍光励起波長及び蛍光発
光波長を知るこずにより、未知のビリルビン含有
詊料䞭に存圚するBc又はBuの濃床を、前述の吞
収怜出様匏ず同様の方法により決定するこずがで
きる。即ち、媒染Bcず媒染Buずの未知混合物含
有詊料をBcの励起波長においお励起させ、そし
お媒染Bcの蛍光発光を506〜520nmにおいお怜出
するこずができ、次いでBuの励起波長においお
同じ詊料を励起させ、そしお媒染Buの蛍光発光
を500〜510nmにおいお枬定するこずができる。
枬定した蛍光発光たずえば盞察的蛍光床を吞
収癟分率ぞ転換するこずができ、蛍光床は吞収
癟分率に比䟋する、次いで吞収癟分率を吞光床
ぞ転換するこずができる吞収癟分率は吞光床の
関数である。媒染Bc及びBuの最倧蛍光発光波
長においお枬定した蛍光床によりこれらの波長に
おいお吞光床を決定したならば、未知混合物䞭の
Bc又はBuの絶察濃床を、前蚘連立方皋匏及び
によりもずめる。 Bu又はBcず媒染剀ずにより生成した生成物に
特城的な蛍光発光は、この生成物によ぀おのみ生
ずるず思われる。BcのみもしくはBuのみか、又
は媒染剀のみの堎合は、適圓な励起茻射線をあお
おも480〜520nmの範囲においお蛍光発光が生じ
ない。 本発明方法に甚いる媒染剀は、米囜特蚱
4069017号蚘茉のものに盞圓する。䞀般にこれら
媒染剀には倚数のビリルビン結合サむトがあり、
そしお疎氎性有機マトリツクスず荷電カチオン基
ずがある少なくずも぀の郚分が含たれる。この
ような媒染剀はモノマヌ状であ぀おもポリマヌ状
であ぀おもよいが、このような媒染剀の特に奜た
しい態様は、前蚘性質を備えた反埩単䜍を含むホ
モポリマヌ又はコポリマヌによ぀お衚わされる。
これらの性質及び組成の物質により、Bc及びBu
が䞡方ずも結合されるので、これら物質はこれら
ビリルビン成分の媒染剀ずしおの機胜を果たす。
媒染剀に存圚する荷電カチオン基により、兞型的
には氎性雰囲気においおPHの倉動にかかわりなく
媒染剀のカチオン電荷が保持される。それ故反応
性媒染剀のカチオン基の荷電性はPH倉化に敏感で
ない。 特に奜たしいポリマヌ状反応性媒染剀のポリマ
ヌ鎖には次匏で衚わされるモノマヌ単䜍が含
たれる。 匏䞭は有機の基であ぀おポリマヌ䞻鎖の䞀
郚を構成しは又はでありは を
ぞ結合する基であり は、カチオン奜たしく
は第玚アンモニりム基又はホスホニりム基を含
む疎氎性有機郚分でありそしお は、ハラむ
ドむオンたずえばクロリド又はブロミむドの
ような酞アニオン、ニトレヌト、メトサルプヌ
ト又は−トル゚ンスルホネヌトである。 ある特に有甚な態様では、 は次匏又は
で衚わされる第玚アンモニりム基又はホス
ホニりム基である。 匏䞭各R1R2及びR3は同䞀であ぀おも異な
぀おいおもよく、奜たしくは炭玠数〜20のアリ
ヌル、アラルキルもしくはアルカリヌル基を衚わ
すか又は奜たしくは炭玠数〜10、より奜たしく
は〜10のアルキル基を衚わす。 奜たしくは匏のは、炭化氎玠基を衚わ
し、その䞭で奜たしいものは、アリヌレン、アリ
ヌレンアルキレン、アルキレンアリヌレン、アリ
ヌレンビスアルキレン又はアルキレンビスアリヌ
レン基である。奜たしくはは〜10個の炭玠原
子を含む。 もちろんのこずであるが、前蚘匏のは、
遞んだ特定のポリマヌ䞻鎖に䟝存しお倉化する。
しかしながらがアルキレン基である堎合に特に
良奜な結果が埗られた。兞型的にはこのようなア
ルキレン基の炭玠数は〜10である。 反応性媒染剀ずしお特に有甚なコポリマヌに
は、前蚘匏で衚わされる反埩単䜍ず、曎に別
の75重量たでの非劚害性反埩単䜍ずを含むコポ
リマヌがある。この明现曞で甚いる“非劚害性反
埩単䜍”ずいう衚珟には、ビリルビンの前蚘媒染
を化孊的か又は物理的に劚害しない単䜍が含たれ
る。このような非劚害性反埩単䜍を提䟛し、しか
も埗られる媒染剀コポリマヌを疎氎性にするモノ
マヌには、オレフむン及び眮換オレフむン䞊びに
スチレン及び眮換スチレンのような脂肪族及び芳
銙族炭化氎玠アルキルアクリレヌト及びメタク
リレヌト䞊びにそれの誘導䜓公知のこのような
モノマヌず同等物がある。曎に望たれる堎合に
は、官胜性架橋基をこのようなコポリマヌに導
入しお本発明の範囲内の反応性媒染剀ずしお有甚
な架橋コポリマヌを提䟛するこずができる。 本発明方法に有甚な個々の代衚的な反応性媒染
剀には次のような物質がある。コポリマヌにおい
お、重合反応に導入する぀のモノマヌの重量比
は、ポリマヌの堎合が49.549.5である堎
合を陀いお5050である。 【衚】 【衚】 【衚】 米囜特蚱第4067017号に、補造法を含む、この
ような反応性媒染剀に関する、曎に広範な蚘茉が
芋られる。 ビリルビン分析の本発明方法に芁する前蚘反応
性媒染剀の量は可倉である。兞型的には所定の堎
合における、このような反応性媒染剀の量は、特
定のビリルビン分析が有甚であるずされおいるあ
る範囲のビリルビン含量即ち“動的範囲
dynamicrange”に䟝存する。ビリルビン
モルが、モル圓量のビリルビン結合サむトを含
む反応性媒染剀ぞ結合されるか、又は前蚘媒染剀
により媒染される奜たしい態様では、この分析が
目的ずするビリルビンの最倧モル数に察しおモ
ル圓量以䞊の結合サむトを提䟛する為に、十分な
量の反応性媒染剀が存圚しなければならない。 必芁ずされる媒染剀の量は、ビリルビン結合サ
むトの平均数ず、前述のように、このような媒染
剀を甚いた特定のビリルビン分析が有甚ずされお
いる動的範囲に䟝存する。前蚘ポリマヌ媒染剀
〜のいずれかのような媒染剀を甚い、そしおこ
のようなポリマヌ媒染剀を、固有粘床玄0.15〜
0.1ベンれン䞭、25℃、濃床0.25で枬
定の、スチレンず塩化ビニルベンゞルずの䞭間
䜓コポリマヌから補造する奜たしい態様では、
0.01〜1.0の範囲内の量の媒染剀を甚い
お動的範囲0.1〜50mgのビリルビン被怜䜓
分析を行なう。 䞀般にビリルビン分析法においお過剰量の媒染
剀を甚いるこずは有甚であり、そうするこずによ
り反応性を促進するこずができる。 本発明に埓぀たBu及びBcの遞択的分析は、
“也匏化孊”分析芁玠を甚いお実斜される。この
芁玠は取り扱いが容易であり、そしお総括的に䟿
利であるずいう特城があり、曎に定量的な分析結
果を䞎えうる。このような芁玠には、反応性媒染
剀を含んだ、ビリルビンぞ浞透性の実質䞊也匏の
即ち接觊の際也燥しおいる詊薬ゟヌンがある。
実質䞊也匏の拡散ゟヌン又は別のゟヌンも分析芁
玠䞭に存圚させるこずができる。奜たしい芁玠
は、䜿甚条件䞋で互いに流䜓接觊する少なくずも
個の別別のゟヌンを含む。“流䜓接觊”ずいう
衚珟により、芁玠の別々のゟヌンが介圚ゟヌンに
よ぀お隔おられおいるか、又はもずもず離れおい
たずしおも、これらのゟヌン間を液䜓が通過可胜
であるこずが意味される。芁玠に存圚させるこず
ができるその他のゟヌンには、望たしい堎合に
は、茻射線遮断ゟヌン、䞋塗ゟヌン等がある。 茻射線遮断ゟヌンは本発明芁玠に甚いるに特に
奜たしく、そしお詊薬ゟヌンず拡散ゟヌンずの間
に介圚しお、ヘモグロビン及びその誘導䜓のよう
な他の血枅成分からの光孊的劚害を枛少させる。
かくしおヘモグロビンのようなスペクトル劚害物
の予備陀去の為の血枅の凊理は䞍必芁ずなる。こ
のような茻射線遮断ゟヌンには、劚害物のスペク
トル効果をマスクする、TiO2のような皮々の顔
料が含たれる。このゟヌンには、拡散ゟヌンず詊
薬ゟヌンずの間の流䜓接觊を保持する、れラチン
のような顔料のマトリツクスも含たれる。茻射線
遮断ゟヌン及び“流䜓接觊”ずいう衚珟に関しお
は米囜特蚱第4069017号に曎に詳しく蚘茉されお
いる。 必ずしもそうではないけれども、皮々のゟヌン
が茉眮連続局ずしお芁玠䞭に存圚するこずが奜た
しい。支持䜓、奜たしくは茻射線透過支持䜓䞊
に、これらの局を支持させるこずができる。奜た
しい分析芁玠は茉眮連続局から成るけれども、構
造配眮が異なる他の芁玠を補造し、そしお本発明
方法に甚いるこずができる。たずえば必芁である
か又は望たしい堎合には共に支持䜓䞊に支持され
る個の隣接ゟヌン即ち拡散ゟヌン及び詊薬ゟ
ヌンを有する芁玠を甚いるこずができる。この
ような芁玠は、たずえば米囜特蚱第4069017号の
第図に䟋瀺されおいる。䟿宜的に本発明に甚い
る也匏化孊芁玠を以埌は、皮々のゟヌンが茻射線
透過支持䜓䞊に茉眮連続局ずしお存圚する倚局−
䜓型分析芁玠ずしお蚘す。 䞀぀の奜たしい態様では、本発明の実斜に甚い
る䞀䜓型分析芁玠は、(1)少なくずもビリルビンに
浞透性であり、しかもビリルビンの反応性媒染剀
を含む詊薬局ず(2)ビリルビンに浞透性である拡散
局ずが茻射線透過性支持䜓䞊に茉眮されおなる。
詊薬局を支持䜓ず拡散局ずの間に介圚させる。拡
散局はビリルビンに実質的に均䞀に浞透性である
のが奜たしい。詊薬局はビリルビンより実質的に
倧きな分子量の蛋癜質物質ぞ䞍浞透性であるのが
奜たしく、前蚘蛋癜質物質はたずえばアルブミン
及び分子量が60000ダルトン単䜍又はそれ以䞊
の範囲のその他の蛋癜質である。 前蚘奜たしい態様の別の偎面では、拡散局は非
繊繊性であり、そしお望たしくは等方的に倚孔性
である。定量的な分析性を匷化する為に、芁玠内
のすべおの局が非繊維性であるこずが曎に奜たし
い。局又は物質に関しお本明现曞で甚いる“非繊
維性”ずいう衚珟により、このような局又は物質
には詊料の拡散を劚害しないか又は茻射線枬定手
段による分析結果の怜出を劚害しない皋床にしか
繊維性成分が含たれないこずが意味される。 有甚な拡散局を皮々の繊維性成分及び非繊維性
成分の䞡方を甚いお補造するこずができる。非繊
維性成分を含む特に奜たしい拡散局に぀いおは、
米囜特蚱第3992158号に曎に詳しく蚘茉されおい
る。 拡散局の厚さは倉化しうるものであり、そしお
この厚さは目的ずする詊料䜓積に幟分䟝存し、そ
しおこの詊料䜓積は䟿宜䞊か぀枅朔さの芳点から
拡散局が吞収可胜でなければならない䜓積であ
る。たた前蚘局厚は、局䞭ぞ吞収されうる詊料量
にも圱響を䞎える局のボむドボリナヌムにも或る
皋床䟝存する。也燥厚が60マむクロメヌトル〜
300マむクロメヌトルの範囲内の拡散局が特に有
甚であるこずがわか぀た。しかしながらこの範囲
倖の厚さも蚱容可胜であり、そしお特定の芁玠に
ず぀おは望たしい堎合がある。 也匏化孊芁玠に甚いる詊薬局には、反応性媒染
剀が溶解又は分散する、ビリルビンぞ浞透性のマ
トリツクスが含たれる。しかしながら倚くの反応
性媒染剀はポリマヌ状であり、そしおそれ自䜓フ
むルム圢成性であるか、又はさもなければ均䞀局
もしくは均䞀ゟヌンずしお容易に被芆可胜である
ので、別のマトリツクス材料が垞に必芁であるわ
けではない。圓然皮々のマトリツクス材料を遞ん
でよく、その遞択は、マトリツクス䞭に分垃する
任意的な媒染剀や緩衝液のような成分に䟝存す
る。いずれの堎合にも、マトリツクス材料は、そ
の䞭に含たれる媒染剀に察しお“非劚害性”でな
ければならない。即ちマトリツクス材料はそれ自
䜓反応性媒染剀ぞ結合もしくは前蚘媒染剀により
媒染されるこずのできないものでなければならな
い。この明现曞においお有甚な詊薬局に関しお
は、米囜特蚱第4069017号に曎に詳现に蚘茉され
おいる。 “也匏化孊”分析芁玠に適圓な緩衝剀を含める
こずができる。芁玠の䜿甚条件䞋における詊薬局
のPHを6.8〜9.5の範囲内にするに十分な量の緩衝
剀を、詊薬局か又は䞀぀もしくはそれ以䞊の他の
局ぞ組み入れるこずができる。 䞀䜓型分析芁玠補造においおは局を、䜿甚前に
積局する別々の局ずしお予備圢成するか、又は芁
玠䜿甚時に流䜓接觊させるたで別個の局ずしお保
持するこずができる。これら也匏化孊詊隓芁玠補
造技術に関する詳现は、米囜特蚱第3992158号及
び同第4069017号に蚘茉されおいる通りである。 アニオン性及び非むオン性界面掻性剀のような
䞀぀又はそれ以䞊の界面掻性剀を芁玠の局䞭に組
み入れるこずが有利である。それらによ぀おたず
えば、局調補物の被芆性がよくなり、そしお液䜓
詊料によ぀お容易にぬれない拡散局における拡散
の床合及び拡散速床を改良するこずができる。特
に非むオン性界面掻性剀のような界面掻性剀を比
范的倧量に拡散局に組み入れお、氎性蛋癜質含有
液詊料䞭に含たれるビリルビンの、拡散局䞭又は
拡散局を通る茞送を正垞化するこずが望たしい。
このような正垞化ずは、氎性蛋癜質含有液の皮々
の適甚詊料䞭に含たれるビリルビン及び溶媒媒質
が、このような詊料間の蛋癜質濃床が異なるにも
かかわらず、拡散局内に等しい浞透を果たすこず
である。加うるに、ビリルビンはその他の蛋癜質
たずえば血枅アルブミンぞの結合のような
“結合状態”で存圚する堎合が倚いので、ビリル
ビンの茞送の正垞化を有利に果たす為の拡散局䞭
におけるこのような界面掻性剀の䜿甚により、前
蚘蛋癜質ぞ結合したビリルビンが分離されるこず
がわか぀た。ビリルビンの正垞化された茞送を果
たすのに有効な界面掻性剀の奜たしい量は、局の
也燥重量に基づき〜15重量である。被怜䜓の
正垞化された茞送を目的ずした界面掻性剀のこう
した䜿甚に関しおは米囜特蚱第4050898号に曎に
詳しく蚘茉されおいる。 他の光孊的䞭間局も、本発明で甚いる也匏化孊
詊隓芁玠ずしお甚いる䞀䜓型分析芁玠に存圚させ
おもよい。たずえば、分析䞋の液䜓詊料の分散媒
質又は溶媒に膚最性の独立した䞭間局を甚いるこ
ずができる。奜たしくは茻射線透過性のこのよう
な膚最性䞭間局たずえば膚最性ゲル局は、䞀
䜓型分析芁玠の詊薬局ず支持䜓ずの間に組み入れ
るこずができ、そしおビリルビン含有血枅詊料
の、芁玠の拡散局を通぀お詊薬局ぞの浞透又は
“拡散速床”を速めるのに甚いるこずができる。
もう䞀぀の䟋ずしおは䞭間局を、本発明の分折芁
玠の拡散局ず詊薬局ずの間に組み入れるこずがで
きる。このような局は圓然ビリルビンに浞透性で
なければならず、そしお、ビリルビンに察する
皮々の劚害物を䞍掻性にしうるか又はそのような
劚害物を過するこずにより陀きうる詊薬物質を
組み入れるのに甚いるこずができる。 もちろんのこずであるが本発明に有甚な也匏化
孊分析芁玠は、所望の巟の長いテヌプ、シヌト又
は小チツプのような皮々の圢状に圢成するこずが
できる。 奜たしい也匏化孊分析芁玠は、分析䞋の液䜓詊
料を芁玠ぞ適甚するこずにより甚いる。適甚され
た詊料は通垞は、詊薬局ず接觊する前に、この詊
薬局ず面する偎ず反察の面で拡散局ず接觊する。 詊料適甚埌、そしお望たしくは液䜓詊料が拡散
局に採取されおした぀た埌に、詊隓結果を埗易く
する為に望たしいであろう、加熱又は増湿のよう
な調湿を芁玠に行なう。 怜出可胜な倉化ずしお分析結果が埗られた埌、
反射もしくは透過比色枬定、又は反射もしくは透
過分光蛍光枬定spectrofluorimetry甚の適圓
な装眮が備えられおいるゟヌンに芁玠を通すこず
により、通垞この怜出結果を枬定する。比色枬定
怜出様匏では、前蚘装眮は、光のような゚ネルギ
ヌのビヌムを支持䜓及び詊薬局にあおる働きをす
る。次いで光は、たずえば芁玠の拡散局又は茻射
線遮断局䞭の乳癜剀から怜出手段ぞ反射される
か、又は芁玠を通過しお怜出噚ぞ達する。 蛍光枬定怜出様匏では、前蚘装眮は、光線を支
持䜓及び詊薬局にあおお詊薬局䞭の媒染ビリルビ
ンを励起する働きをし、そしおこの媒染ビリルビ
ンが、茻射光の蛍光発光を刺激する。次いでこの
蛍光発光は、たずえば芁玠の拡散局の乳癜剀から
怜出手段ぞ反射されるか又は芁玠を通過しお怜出
噚ぞ達する。 皮々の范正法を甚いお分析の察照を埗るこずが
できる。䞀䟋ずしお被怜䜓暙準溶液詊料を、分析
においお瀺差枬定が可胜であるように、詊料滎が
䜍眮する゚リアに隣接しお適甚するこずができ
る。 本発明の䞀局の理解の為に以䞋に䟋を掲げる。
䟋においお次の操䜜及び材料を甚いた。 操 䜜  以䞋の䟋においお前述の連立方皋匏及び
を甚いお氎性液䞭のBu及びBcの未知濃床枬定
を助けた。前蚘連立方皋匏を甚いる為に次の分
析を甚いた。 均䞀薄膜及び溶液の堎合には、透過濃床
が吞光床にほずんど等しいず想定した。それ
故匏及びは次のようにかきかえられた。 λ1における DTK〓1 Bu・CBuK〓1 Bc・CBc 及び λ2における DTK〓2 Bu・CBuK〓2 Bc・CBc 次いでλ1460nm及びλ2420nmを甚いるこ
ずにより匏及びは次のようにかきかえ
られた。 DT460 K460 Bu・CBuK460 Bc・CBc DT420 K420 Bu・CBuK420 Bc・CBcc 代数眮換及び倉換により匏及びは次
のようにかきかえるこずができる。 CBcDT460・K420Bu−K460Bu・DT420
K460Be・K420Bu−K420Be・K460Bu XI CBuDT420・K420Be−DT460・K420B
c
K460Bc・K420Bc−K460Bu・K420Bc  反射局を備えた倚局分析芁玠の堎合は、以䞋
の䟋のうちある䟋では、透過濃床DTよりもむ
しろ反射濃床DRで光濃床を枬定した。このよ
うな堎合以䞋の倉換によ぀おDR倀をDT倀ぞ転
換した。 XII DT −0.1940.469DR 0.4221.17e3.37DR 前蚘倉換は、以䞋の衚題“材料”に蚘茉され
おいるような薄膜倚局分析芁玠の堎合に、DR
倀をDT倀ぞ倉換するのに適甚するこずができ、
そしおこの倉換は、りむリアム及びクラツパヌ
による“Multiple Internal Reflections in
Photographic Color Prints”J.Opt.Soc.
Am第43巻、第595頁1953に蚘茉のDR倀
のDT倀ぞの倉換ず類䌌しおいる。この倉換の
䜿甚は、クラム等による“Multilayer Film
Elements for Clinical AnalysisGeneral
Concepts”Clinical Chemistry、第24巻、第
1335及び1340頁1978においおも議論されお
いる。  以䞋の䟋に蚘茉のBc及びBuの氎溶液は
“Fundamentals of Clinical Chemistry
EdN.W.TietzW.B.サンダヌス瀟、フむラ
デルフむア、第1026〜1031頁1976”に述べ
られおいるようなJ.I.ルヌスの方法により補造
した。 材 料  非共圹ビリルビンBuはミズヌリ州、セ
ントルむスのシグマケミカル瀟により販売され
た。胆汁から補造される共圹ビリルビンBc
は、前蚘Wu等による文献に蚘茉されおいるよ
うなルカツセンの改良法ルカツセン、“The
Diazo Reaction of Bilirubin and Bilirubin
Diglucuronide”、オランダのりトレヒト倧孊
の孊䜍論文1961により埗られた。人間の
血枅から補造する共圹ビリルビンBcは反
応性媒染剀を甚い以䞋のごずくしお埗られた。 先ずBc濃床の高いビリルビンの合蚈濃床
が20mgに等しいか又はそれを越える黄疞
にかか぀た血枅、前蚘ビリルビンの70〜80
は、ゞ゚ンドラシツク−グロフJendrassik−
Grof分析における“盎接的”なビリルビン
であるず思われるプヌルした血枅を窒玠雰囲
気䞋で蒞留氎により〜倍に垌釈
した。この溶液を衚の媒染剀メタノヌル
〜10含有新調氎溶液で、425nmにお
ける吞光床の増加が停止するたで泚意深く滎定
した。媒染剀がわずかに過剰にな぀た時
425nmにおける吞光床はわずかに枛少した。滎
定された溶液はにごり、そしおそれを〜℃
においお15分間15000×で遠心分離した。黄
色がか぀た媒染ペレツトを、Na2S2O3が添
加されおいるPH7.0の0.05〜0.1Mのリン酞カリ
りム緩衝液容に緩埐に再懞濁した。この曇぀
た懞濁液ぞカプむンず安息銙酞ナトリりムず
の新調溶液を、カプむンの最終レベルが玄
0.1M、そしお安息銙酞ナトリりムのそれが
0.2Mになるたで滎加した。この間䞭、溶液を
窒玠雰囲気䞋、氷济䞭で激しく撹拌した。溶液
を冷暗所〜℃で1/2時間攟眮し、次い
で15分間10000xgで遠心分離した。䞊柄液は貯
蔵した。ペレツトを少なくずも回等容のPH
7.0の0.1Mリン酞カリりム緩衝液で掗浄し、次
いで〜回1MNaClず−プロパノヌルずの
混合物で掗浄した。掗液を前
蚘遠心分離からの䞊柄液ず共にプヌルし、次い
で窒玠雰囲気䞋、暗所で1/2時間撹拌した。溶
液を凍結也燥し、埗られた粉末を、できるだけ
少量の氎に再懞濁し、そしおPH7.0の0.1Mリン
酞カリりム緩衝液で垌釈した95゚タノヌル
を甚いお詰めたLH−20ゲ
ルビヌズスり゚ヌデンのりツプサラにあるフ
アヌマシアにより販売を含むカラムに装填し
た。同じ溶媒混合物は溶出媒質ずしお働いた。
黄色溶出フラクシペンをプヌルし、前述ず同じ
新調カラム䞊で再びクロマトグラフさせ、そし
おただちに凍結也燥した。埗られた黄耐色粉末
には、定量的NMR栞磁気共鳎分析及び重
量分析に基づき玔床玄85で分子量918.2の、
濃瞮されたBcの二共圹スペシヌズが含たれた。  以䞋の䟋で甚いた人間の血枅は近所の病院に
より䟛絊されたものであ぀た。血枅詊料はすぐ
に甚いない堎合は−25℃においお暗所で凍結貯
蔵した。週間以内に䜿わない堎合は詊料は廃
棄した。解凍埌詊料を再び甚いるこずはなか぀
た。  甚いた媒染剀は衚の媒染剀及びであ぀
た。  以䞋のある䟋で甚いる薄膜倚局分析芁玠の構
造及び組成は次の通りであ぀た。 反射拡散局 m2 TiO2 50.0 酢酞セルロヌス 7.0 カプむン 2.69 安息銙酞ナトリりム 4.035 オクチルプノキシポリ゚トキシ゚タノヌル界
面掻性剀 1.4 ポリオキシ゚チレンオレむル゚ヌテル界面掻性
剀 0.9 䞋塗局 ポリ−む゜プロピルアクリルアミド
0.387 媒染局 媒染剀 1.72 脱むオン化れラチン 8.608 −ビス−ヒドロキシ゚チルグリシ
ン緩衝液 3.5 0.2MPH8.0 支持局 ポリ゚チレンテトラフタレヌト  以䞋の䟋に蚘茉の他の化孊薬品は、ニナヌペ
ヌク州ロチ゚スタヌのむヌストマンコダツク瀟
のむヌストマンオヌガニツクケミカルズから入
手した。特にこずわらない限り、甚いた化孊薬
品は詊薬グレヌドであ぀た。 䟋  倚局芁玠における媒染Bu及び媒染Bcに特城的
なモル吞収の枬定 この䟋では二系統のビリルビン溶液を補造し
た。䞀぀は皮々の濃床レベルのBc人間の胆汁か
ら氎溶液からなり、そしおもう䞀぀は皮々の濃
床レベルのBu氎溶液からな぀た。次いで各溶液
を他局分析芁玠前蚘“材料”のに蚘茉のよう
な䞊にスポツトし、そしお各溶液の透過濃床を
普通の分光光床蚈を甚いお460nm及び420nmにお
いお枬定した。Buの分子量を584ずしお䞀぀の系
統の溶液の、Buのモル濃床に察するDT倀を
460nm及び420nmにおいおプロツトし、そしお
Bcの分子量を918.2ずしお、もう䞀぀の系統の溶
液のBcのモル濃床に察するDT倀も460nm及び
420nmにおいおプロツトした。次いでこれらプ
ロツトの傟きをもずめΔDTをΔモル濃床で割
る、460nm及び420nmにおけるBc及びBuのモル
吞収定数前蚘匏及びからε・を
埗た。各倚局詊隓芁玠の通過距離が玄0.0568mm
に等しいず抂算するこずにより、媒染Bu及びBc
のモル吞光率εも460nm及び420nmにおいお決定
した。結果を以䞋の衚に瀺す。 【衚】 䟋  媒染剀の存圚におけるBcの分光の増倧 新たに単離した血枅Bcの詊料氎溶液PH7.4
をセル䞭に装入し、そしお吞収スペクトル300
〜700nmを分光光床蚈により蚘録した。次いで
衚の媒染剀を少量Bc詊料ぞ添加し、そしお
吞収スペクトルを再び蚘録した。詊料単独では、
420〜460nmの近傍においお最倧吞収を瀺すブロ
ヌドしたスペクトルを瀺し、䞀方媒染剀が存圚
する堎合は、詊料の吞収スペクトルは〜420〜
425nmにおいお遞択的に増倧した。こうした性質
は、人間の胆汁のような他の生物源から採取した
Bcに芋られた性質ず類䌌しおいた。結果を第
図に瀺す。 䟋  媒染剀の存圚におけるBuの分光の増倧 PH7.4の、Buの詊料氎溶液をセル䞭に装入し、
そしお吞収スペクトル360〜600nmを分光光
床蚈により蚘録した。次いで衚の媒染剀を少
量Bu詊料ぞ添加し、そしお吞収スペクトルを再
び蚘録した。詊料単独では、435〜440nmの近傍
で最倧吞収を瀺すブロヌドしたスペクトルを瀺す
が、媒染剀が存圚する堎合は詊料の吞収スペク
トルは460nmにおいお遞択的に増倧するようにな
り、新しいピヌクの吞収は倍に増倧した。結果
を第図に瀺す。 䟋  媒染剀を甚いた倚局分析芁玠におけるBu及び
Bcの定量 怜量線甚の溶液を以䞋のごずくしお補造した。
皮々の量のBuを、プヌルした人間の血枅に溶解
し、最終的なBuレベルを玄10及び20
mg重量枬定により決定ずした。同様に
新たな粟補したBc人間の胆汁からを同じ血枅
プヌルで垌釈し、最終的なBcレベルを玄
10及び20mgずした。 曎に皮々の量のBu及びBc人間の胆汁から
を含む第番目の溶液を同じ血枅プヌルを甚いお
補造した。 第番目の各溶液前述を別々の倚局分析芁
玠各芁玠の構成は前蚘“材料”のに蚘茉のも
のず同じであるにスポツトし、37℃で分間む
ンキナベヌトし、その埌各スポツトの反射濃床
DRを420nm及び460nmにおいお枬定した。分析
芁玠を前蚘怜量線甚溶液で范正し、Bcの分子量
を918.2そしおBuの分子量を584ずしお定数KBu及
びKBcを決定した。反射濃床倀を、前蚘操䜜に
蚘茉のごずく透過濃床DT倀ぞ倉換した。次いで
前蚘操䜜で瀺した連立方皋匏を甚いお、第番
目の各溶液のBu及びBcモル濃床をもずめた。Bc
及びBuそれぞれの分子量918.2及び584を甚いお、
Bc及びBuのモル濃床をmg濃床ぞ転換した。重量
法による倀ず倚局分析芁玠により決定した倀ずの
比范結果を衚に瀺す。衚に芋られるごずく、
本発明方法により倚局分析芁玠を甚いお決定した
倀ず重量法による倀ずは良奜に笊号した。 【衚】 䟋  本発明の倚局芁玠方法ず参照方法ずの比范 10人の患者からの詊料のビリルビン総量の分析
及びゞ゚ンドラシツク−グロフ法に埓぀た“盎接
的”なビリルビンの分析を近くの病院で行な぀
た。次いで詊料の倚局分析芁玠前蚘“材料”の
に蚘茉を甚いた本発明により、前蚘䟋に蚘
茉の方法を甚いお分析した。本発明方法による
BTは、分子量918.2に基づくBc及び分子量584に
基づくBuの枬定倀を加え合わせるこずによりも
ずめた。結果を衚に掲げる。衚に瀺すごず
く、ゞ゚ンドラシツク−グロフ法によるBT倀は
本発明方法によるBT倀にかなり近䌌しおいる。
ゞ゚ンドラシツク−グロフ分析による“盎接的”
な倀は、本発明方法のBc倀ず異なる。その理由
は、ずりわけ、“盎接的”な倀にはBuが幟分含た
れおおり、そしお“盎接的”な倀はBuのみで范
正されるからである。 【衚】 【衚】
JP55501747A 1979-07-11 1980-07-09 Expired JPS6411906B2 (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5658479A 1979-07-11 1979-07-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS56500867A JPS56500867A (ja) 1981-06-25
JPS6411906B2 true JPS6411906B2 (ja) 1989-02-27

Family

ID=22005395

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP55501747A Expired JPS6411906B2 (ja) 1979-07-11 1980-07-09
JP9412480A Pending JPS5619454A (en) 1979-07-11 1980-07-11 Selective measuring method of conjugate and nonnconjugate bilirubin

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9412480A Pending JPS5619454A (en) 1979-07-11 1980-07-11 Selective measuring method of conjugate and nonnconjugate bilirubin

Country Status (5)

Country Link
EP (2) EP0022673B1 (ja)
JP (2) JPS6411906B2 (ja)
CA (1) CA1128333A (ja)
DE (1) DE3069791D1 (ja)
WO (1) WO1981000305A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3225331A1 (de) * 1982-07-07 1984-01-12 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur bestimmung von direktem und gesamt-bilirubin sowie hierfuer geeignetes reagens
SE452170B (sv) * 1983-10-03 1987-11-16 Boliden Ab Forfarande for utvinning av metall ur koppar och/eller edelmetall innehallande material som innehaller antimon och vismut
JPH06570Y2 (ja) * 1988-02-17 1994-01-05 䞭倮発條株匏䌚瀟 排気通路配蚭物のシヌル構造

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3569721A (en) * 1969-01-13 1971-03-09 American Optical Corp Measuring bilirubin in blood using light at two wavelengths
NL7400294A (ja) * 1973-01-18 1974-07-22
JPS5131518B2 (ja) * 1973-08-22 1976-09-07
US4069016A (en) * 1977-01-14 1978-01-17 Eastman Kodak Company Assay for bilirubin
US4069017A (en) * 1977-01-14 1978-01-17 Eastman Kodak Company Colorimetric assay for bilirubin
US4204839A (en) * 1978-08-09 1980-05-27 Eastman Kodak Company Fluorimetric analysis method for bilirubin

Also Published As

Publication number Publication date
JPS5619454A (en) 1981-02-24
EP0022673A1 (en) 1981-01-21
EP0031842B1 (en) 1984-12-12
EP0031842A1 (en) 1981-07-15
EP0031842A4 (en) 1981-11-11
WO1981000305A1 (en) 1981-02-05
EP0022673B1 (en) 1984-12-27
DE3069791D1 (en) 1985-01-24
CA1128333A (en) 1982-07-27
JPS56500867A (ja) 1981-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1093439A (en) Assay for bilirubin
JP4183308B2 (ja) 臚床的に重芁な分析察象物比を埗るための装眮及び方法
US4274832A (en) Analytical element and method for analysis of multiple analytes
CA1178876A (en) Method and apparatus for quantitatively determining the level of hemoglobin in a biological sample
EP2927688A1 (en) Immunochromatography, and detector and reagent for use therein
JPS6339873B2 (ja)
US4204839A (en) Fluorimetric analysis method for bilirubin
WO2018120854A1 (zh) 检测ck-mb的时闎分蟚荧光免疫层析试纞条、试剂盒及其制倇方法
US4338095A (en) Method for selective determination of conjugated and unconjugated bilirubin
EP0028123B1 (en) Spectrophotometric method for the determination of total bilirubin
EP0482528B1 (en) Dry analysis element for the analysis of iron ions
EP0041175B2 (en) Ion specific analytical element
JPS6411906B2 (ja)
Pollet et al. The binding properties of anti-phosphorylcholine mouse myeloma proteins as measured by protein fluorescence
US4230456A (en) Element and assay for albumin
Ohkubo et al. Plasma glucose concentrations of whole blood, as determined with a multilayer-film analytical element.
US4539180A (en) Apparatus for quantitatively determining the level of hemoglobin in a biological sample
AU2005313116A1 (en) Assay for generation of a lipid profile using fluorescence measurement
Fukuda et al. Combined protein and DNA measurements by the ninhydrin-Schiff and Feulgen techniques
JPS6244616B2 (ja)
JPH11118802A (ja) 衚面プラズモン枬定方法および装眮
Yamane et al. Quantification of urinary glucose and protein with test-strips through reflectometric analysis
Nakamura et al. Measurement of delta-bilirubin in serum with multi-layered films
JPH0528344B2 (ja)
JPH0437382B2 (ja)