JPS645043B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酸性ムコ多糖類（Acidic
mucopolysaccharides.以下、AMPSと略記する）
の解重合方法に係り、特に、β−Ｄ−ヘキソサミ
ニド結合を選択的に切断するAMPSの解重合方
法に関する。 かかるAMPSとしては、例えばヒヤルロン酸、
コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６
−硫酸、デルマタン硫酸などが存在する。これら
のAMPSは、ウロニド結合とβ−Ｄ−ヘキソサ
ミニド結合が交互に繰りかえされた多糖類である
が、本発明の解重合方法によると、β−Ｄ−ヘキ
ソサミニド結合が選択的に切断され、ウロニド結
合は切断されにくいため、還元末端にヘキソサミ
ンを有する構成単位二糖及びそれより成るオリゴ
糖が生成する。このとき、硫酸基を含むAMPS
においては、脱硫酸化が優先的に進行する。Ｎ−
アセチル基の脱離は起らない。 これらAMPSのうち、ヒヤルロン酸、コンド
ロイチン硫酸、デルマタン硫酸につき、表１に化
学構造と大体の分子量範囲、並びに本発明の方法
により得られるオリゴ糖を記した。なお、デルマ
タン硫酸は、数年前まではウロン酸成分としてＬ
−イズロン酸のみを含むと考えられていたが、現
在ではウロン酸成分としてＬ−イズロン酸とＤ−
グルクロン酸の両者を含み、デルマタン硫酸中の
両者の比率は原料によつて異なることが明らかに
なつている。従つて、デルマタン硫酸に由来する
構成単位二糖には２種類あり、さらにオリゴ糖は
両ウロン酸の含有比及び配列順序を異にして多様
に存在する。 【表】 このようなAMPSの構成単位二糖及びオリゴ
糖類は、様々な生理活性が期待される物質群の製
造原料として極めて重要であるにもかゝわらず、
これらを供給する製造方法が開発されなかつたた
め、これら酸性ムコ多糖由来のオリゴ糖類の医薬
領域への応用は殆んど絶無であつた。これらのオ
リゴ糖類の適当なる化学修飾により期待される生
理活性として、ヒヤルロン酸系では例えばビフイ
ダス因子（Bifidus factor）様活性、コンドロイ
チン硫酸およびデルマタン硫酸系ではこれらの系
のオリゴ糖類を多硫酸化することにより血液凝固
システムにおけるアンチトロンビンの活性増強
又は直接トロンビン活性阻害などによる血液凝固
阻止作用、また動脈硬化の主因とされる高脂血症
に対する効果的な脂血清澄活性などが挙げられ
る。さらに、これら二糖およびオリゴ糖類のりん
酸エステル化により、インターフエロン産生能誘
起物質群を合成することも出来よう。なお、これ
らオリゴ糖類にたいして複数の化学反応を適用し
た場合、さらに多くの可能性をもつた有用な物質
を製造することが出来るであろう。 このように、AMPSの構成単位二糖およびそ
れより成るオリゴ糖は医薬領域における活用が期
待される有用な物質であるため、これまでにも、
AMPSの塩酸・メタノールなどによるメタノリ
シス、または酸性水溶液中における加水分解が研
究室規模において行われて来た。しかしこれらの
方法はいずれもＮ−アセチル基の離脱を伴ない、
更に塩酸・メタノールの場合にはウロン酸のメチ
ルエステル化を伴なうという難点があつた。とり
わけ、これらの方法の最大の欠点は強酸性（約PH
１）系での反応であるためにウロン酸部分の分解
が著しいことであつた。結局、表１右欄記載のオ
リゴ糖類を初めとする、AMPSの構成単位二糖、
特にそれより成るオリゴ糖類は、その一部を除い
て従来の方法によつては得られておらず、本発明
の解重合方法により初めて得ることができた。 本発明の目的は、かかるAMPSのβ−Ｄ−ヘ
キソサミニド結合を選択的に切断し、上述のごと
く医薬領域における活用が期待される構成単位二
糖及びそれより成るオリゴ糖類の製造に有用な
AMPSの解重合方法を提供することにある。 本発明の解重合方法は、特に加水分解の処理条
件に特色があり、即ち、AMPSを、PH２以上5.5
以下の酸性条件下、水を含むジメチルスルホキシ
ド（以下、DMSOと略記する）中で処理するこ
とを特徴とするものである。 本発明において重要なことは、溶媒として含水
DMSOを用いること、及び反応過程をPH２以上
5.5以下の酸性条件に保持することである。この
条件に従えば、AMPSの脱硫酸化と、それに続
くβ−Ｄ−ヘキソサミニド結合の切断が進行し、
構成単位二糖及びそれより成るオリゴ糖類を生成
する解重合反応が進行する。この解重合反応は、
まず脱硫酸化反応が速やかに進行し、続いてβ−
Ｄ−ヘキソサミニド結合が選択的に切断されるも
のと考えられる。 もし、反応をPH２未満の強い酸性条件で行う
と、Ｎ−アセチル基の離脱、ウロニド結合の切断
が起り、更にはウロン酸部分の分解も起るため、
目的とするAMPSの構成単位二糖及びこれより
成るオリゴ糖類を得ることは極めて困難となる。 また、溶媒として含水DMSOを用いずに、水
のみを用いて反応を行わしめた場合には、脱硫酸
が進まず、β−Ｄ−ヘキソサミニド結合の切断及
びウロニド結合の切断の反応性に余り差違がなく
なるため、硫酸が結合した単糖及び各種のオリゴ
糖の混合物が生成する結果となる。 従つて、本発明においては、液性をPH２以上
5.5以下の酸性条件に保持し、かつ溶媒として含
水DMSOを用いることは不可欠の要件である。
なお、酸性条件であつてもPH値が高い程解重合の
速度が遅くなる傾向があるため、実用的にはPH３
〜5.5の酸性条件が一般に好ましい。 本発明の解重合方法により、β−Ｄ−ヘキソサ
ミニド結合が選択的に切断される理由は、
DMSOがこの結合の分解反応に触媒的に作用す
るためと考えられる。DMSOに含有される水の
量は、β−Ｄ−ヘキソサミニド結合、硫酸エステ
ル結合の加水分解に必要な理論量以上で20重量％
以下が好ましい。水が過度に存在すると、脱硫酸
が進まなくなり前記の糖鎖切断の選択性が低下し
ウロニド結合も切断され易くなるという不都合が
生じる。 AMPSは、通常ナトリウム塩の形で入手でき
るが、本発明の方法により処理するAMPSは、
このような塩の状態でも、遊離酸の状態であつて
もよい。反応過程におけるPH条件がPH２以上5.5
以下の酸性条件に保持され、溶媒に均一に溶解さ
れるならば、出発材料の状態は問題ではない。 反応溶液のPHの調節には、適宜の塩基、酸を用
いればよいが、弱塩基を用いると酸性域での緩衝
効果を期待することができるため、反応中におけ
るPH値の変動が抑制される利点がある。かかる弱
塩基としては、ピリジン、キノリン、コリジン、
ピコリン等の有機弱塩基が好ましい。 なお、Ｌ−イズロン酸含量の多いデルマタン硫
酸（例えばブタ皮膚由来のもの）では、他の
AMPSに比しＬ−イズロン酸（単糖）が副生し
易いため、反応溶液のPH値を若干高め、大体PH
4.0以上に調節した方がよい。かかる条件で解重
合を行えばＬ−イズロン酸の副生を抑制すること
ができる。 本発明の方法によるAMPSの解重合は室温に
おいても進行するが、温度依存性は大である。例
えば、コンドロイチン−６−硫酸ピリジニウム塩
を10％含水DMSO中（PH3.8〜4.0）、95℃または
105℃でそれぞれ18時間加熱した場合の反応生成
物のゲル過クロマトグラムを示すと図１のごと
くである（実線：95℃、破線：105℃）。反応温度
を95℃とした場合、単位二糖および四糖（表１−
２、ｎ＝０および１）を主生成物（22.3および
21.5％）とし、ほかにｎ≧２のオリゴ糖（56.2
％）が生成する。一方、反応温度を105℃とした
場合には単位二糖を主生成物（54.8％）とし、ｎ
≧１のオリゴ糖（42.5％）が生成した。この例に
見るように、反応温度を選択することにより
AMPSの解重合度を調節することが出来る。デ
ルマタン硫酸（表１−３）は化学構造上、コンド
ロイチン−４−および６−硫酸に類似するが、解
重合にはより抵抗する。例えばニワトリ・トサカ
を原料とするデルマタン硫酸ピリジニウム塩を10
％含水DMSO中（PH3.8〜4.0）、105℃で18時間ま
たは30時間加熱した場合の反応生成物のゲル過
クロマトグラムを図３に示す（実線：105℃×
18hr、破線：105℃×30hr）。反応時間が18時間の
場合、単位二糖および四糖（表１−３、ｎ＝０、
１）を主生成物（20.4および23.1％）とし、ほか
にｎ≧２のオリゴ糖（34.7％）が生成する。一
方、30時間反応させた場合には単位二糖を主生成
物（63.4％）とし、四糖及び六糖を主成分とする
オリゴ糖（30.8％）を生成した（実施例３）。こ
の様に、反応時間を伸縮することによつても解重
合度を調節することが出来る。従つて、反応過程
のPH、反応温度および時間は出発物質である
AMPSの種類により、また目的とする製品によ
り選ばれるが、反応温度は室温〜120℃が適当で
あり、実用的には80〜120℃が好ましい。本発明
の解重合方法はウロン酸の分解を殆んど伴なわず
にβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニド結合のみを切
断するから、上記の温度範囲において十分な反応
時間をかければ主生成物は単位二糖（表１−１〜
３、ｎ＝０）のみとなり、その収量は良好であ
り、生成した総オリゴ糖のウロン酸回収率はほぼ
100％である。 ヒヤルロン酸は、これら硫酸基を有する
AMPSよりはるかに高分子であるにもかゝわら
ず、近似の条件（含水量、PH、温度、時間）のも
とでは、単位二糖を主生成物とするオリゴ糖混合
物（表１−１、ｎ＝０およびｎ≧１）を生成する
（図４および実施例４参照）。 以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説
明する。 実施例 １ コンドロイチン−６−硫酸ピリジニウム塩
（500mg）を10％含水DMSO（200ml）に溶解し、
撹拌しながら105℃で18時間加熱した。この間反
応溶液のPHは3.8〜4.0であつた。反応終了後、等
量の水および0.5M NaOH溶液を加えてPH6.8と
し減圧濃縮した（約10ml）。これをセフアデツク
スＧ−25（商品名、フアルマシアAB製）カラム
（２×92cm）の上端に移し入れ、0.1MNaClで溶
出させた。図１に分析的規模（サンプル量10mg、
カラムサイズ1.6×88cm）で行なつたクロマトグ
ラムを示す。（破線‐‐‐‐）。二糖（Di）、四糖
（Tetra）、六糖（Hexa）に相当する各画分を集
め、凍結乾燥したのち個別に10％エタノールに溶
解し、セフアデツクスＧ−15（商品名、フアルマ
シアAB製）カラム（2.5×90cm）／10％エタノー
ルにより脱塩した。各画分を凍結乾燥することに
より二糖、四糖および六糖の各ナトリウム塩をそ
れぞれ193、97、53mgの収量で得た。 なお、コンドロイチン−６−硫酸ピリジニウム
塩を、95℃の温度で処理した以外は、上記実施例
と同じ条件で解重合させた場合の、前記に対応す
る分析的規模のクロマトグラム（セフアデツクス
Ｇ−25カラム、溶離度：0.1MNaCl）を図１に実
線――にて示した。 実施例 ２ コンドロイチン−６−硫酸ピリジニウム塩
（500mg）を10％含水DMSO（125ml）に溶解し、
撹拌しながら90℃で14時間加熱した。この間反応
液のPHは3.6〜3.9の範囲にあつた。反応終了後、
等量の水および0.5MNaOH溶液を加えてPH6.8と
し、減圧濃縮した溶液（約10ml）を陰イオン交換
樹脂AG1×４（商品名、BIORADバイオラド社
製）Cl^-型カラム（2.5×47cm）の上端に移し入
れ、溶離液LiCl溶液の濃度を図２−１に破線
（‐‐‐‐）で示す如く0Mから0.4Mまで直線的に
高めながら溶出させた。二糖（ｎ＝０）〜八糖
（ｎ＝３）の画分をそれぞれ分離し、濃縮して10
％エタノールに溶解させ、セフアデツクスＧ−15
カラム（2.5×90cm）／10％エタノールにより脱
塩したのち凍結乾燥して、それぞれ淡黄白色の粉
末として二糖、四糖、六糖および八糖の各リチウ
ム塩33.2、41.4、42.6、36.1mgを得た。 図２−１の十糖（ｎ＝４）以上の画分をセフア
デツクスＧ−15カラムで脱塩したのち濃縮して、
十糖以上のオリゴ糖混合物153mgを得た。これを
少量の水に溶解し、再び陰イオン交換樹脂AG1
×２（Cl^-型）カラム（1.5×88cm）を用いて、溶
離液としてLiCl溶液を用い、その濃度を0.2Mか
ら0.4Mまで直線的に変えながら分離を行つた。
その結果、図２−２の如く十糖〜二十糖までの各
オリゴ糖画分が得られた。各画分をそれぞれ濃縮
し、10％エタノールに溶解してセフアデツクスＧ
−15カラム／10％エタノールにより脱塩したのち
凍結乾燥し、白色粉末としてそれぞれのリチウム
塩を35.3、33.4、26.8、16.0、8.7および7.3mgの収
量で得た。 本実施例で得られたコンドロイチン−６−硫酸
の脱硫酸された構成単位二糖（Ｎ−アセチルコン
ドロシン）及びそれより成るオリゴ糖（二〜二十
糖、表１−２のｎ＝０〜９に相当）について次の
化学分析、物性測定を行つた。 (1) 〔α〕²⁹ _D溶媒：水、濃度：0.13〜0.15（ｇ／100
ml） (2) RGluA（紙電気泳動法によるグルクロン酸
に対する相対移動度） 緩衝液：ピリジン−酢酸−１−ブタノール−水
（５：１：５：250容量比）、PH5.8、23V／
cm、時間60分、温度４℃ (3) 薄層クロマトグラフイ（Rf値） 上昇法展開、セルロースプレート使用 溶媒：
ｎ−ブタン酸−0.5Nアンモニア水（５：３）
混合液 (4) ウロン酸及びヘキソサミンの含量 ●ウロン酸： 吉沢らの改良カルバゾール法（M.
Kosakai、Z.Yosizawa、Anal.Biochem.、
93（1979）295−298） ●ヘキソサミン： アントノポーロスの方法（C.A.
Antonopoulos、Arkiv.Kemi.、25（1966）
243） (5) ウロン酸に対するヘキソサミンのモル比 A.リンカーらの方法（A.Linker、K.Meyer、
P.Hoffman、J.Biol.Chem.、181（1949）149−
151）によりオリゴ糖を還元。 NaBH₄による還元により、Ｎ−アセチルコ
ンドロシン及びそれより成るオリゴ糖の還元末
端位にあるＮ−アセチルガラクトサミンはＮ−
アセチルガラクトサミニトールとなり、その結
果前記(4)の方法によるアミノ糖の定量にかから
なくなる。従つて、還元前後のウロン酸／ヘキ
ソサミンモル比を測定することにより各オリゴ
糖の重合度を知ることができる。 (6) ウロン酸に対するＮ−アセチルヘキソサミン
のモル比 ●ライスイヒらの方法（J.L.Reissig、J.L.
Storominger、L.F.Leloir、J.Biol.Chem.、
217（1955）959−966）により、Ｎ−アセチ
ルヘキソサミンの含量を測定し、前記(4)の方
法で求めたウロン酸量とから、モル比を求め
た。 表２に測定結果をまとめて示す。遊離型のＮ−
アセチルコンドロシンの標準品（市販のコンドロ
シン標準品（生化学工業製）をダニシエフスキイ
（Danishefsky）らの方法でＮ−アセチル化して
得たもの）についての測定値も併記した。 【表】 【表】 ＊１、＊２ 括弧内は計算値
実施例 ３ ニワトリ・トサカ由来デルマタン硫酸ピリジニ
ウム塩（200mg）を10％含水DMSO（100ml）に溶
解し、撹拌しながら105℃で30時間加熱した。こ
の間、反応溶液のPHは3.8〜4.0の範囲であつた。
反応終了後、等量の水および0.5MNaOH溶液を
加えてPH6.8とし、減圧濃縮した（約10ml）。セフ
アデツクスＧ−25／0.1M NaClによる分析的ゲ
ル過クロマトグラム（サンプル量10mg、カラム
サイズ1.6×88cm）（図３−１破線‐‐‐‐）によれ
ば、反応生成物は二糖を主成分とし四糖、六糖お
よび少量の単糖からなる混合物であつた。上に得
られた濃縮液を陰イオン交換樹脂AG1×４（Cl^-
型）カラムを用いて実施例２と同様に処理し、二
糖、四糖、六糖画分に分離した（図３−２）。各
画分を凍結乾燥し、それぞれセフアデツクスＧ−
15カラム／10％エタノールにより脱塩したのち、
再び凍結乾燥し、二糖、四糖、六糖の各リチウム
塩をそれぞれ81、32.4、11.2mgの収量で得た。 なお、図３−１の実線――で示されたクロマト
グラムは、反応時間を18時間とした以外は上記の
実施例と同一条件で解重合させた場合の分析的ゲ
ル過クロマトグラムである。 実施例 ４ ヒヤルロン酸（遊離型）（500mg）をDMSO
（225ml）に溶解し、これに0.05Mピリジン硫酸塩
水溶液（25ml）を加え、撹拌しながら105℃で30
時間加熱した。この間、反応溶液のPHは3.6〜3.9
であつた。反応後、等量の水および0.5M NaOH
溶液を加えてPH6.8とし、減圧濃縮した（約10
ml）。セフアデツクスＧ−25／0.1M NaClによる
分析的ゲル過クロマトグラム（サンプル量約
4.0mg、カラムサイズ1.6×84cm）によれば、二
糖、四糖および六糖の混合物である（図４、実線
――）。上に得られた濃縮液を陰イオン交換樹脂
AG1×４（Cl^-型）カラムを用いて実施例３と同
様に処理し、二糖、四糖、六糖画分に分離した。
各画分を凍結乾燥し、それぞれセフアデツクスＧ
−15／10％エタノールにより脱塩したのち再び凍
結乾燥し、二糖、四糖、六糖の各リチウム塩をそ
れぞれ239、108、36mgの収量で得た。 なお、図４の破線‐‐‐‐で示されたクロマト
グラムはピリジン硫酸塩の代りにピリジン塩酸塩
を用いた以外は上記実施例と同一条件で解重合
（この間のPHは3.5〜3.8の範囲であつた）させた
場合のもので、同様にして得られた分析的ゲル
過クロマトグラムである。 実施例 ５ ブタ・皮膚由来のデルマタン硫酸ピリジニウム
塩（100mg）を0.3％ピリジン水溶液／DMSO
（１：９）50mlに溶解し、撹拌しながら105℃で30
時間加熱した。この間、反応液のPHは4.4〜4.6の
範囲であつた。反応終了後、実施例３と同様に処
理し、セフアデツクスＧ−25／0.1M NaClによ
る分析的ゲル過クロマトグラフイーにかけた結
果（図５）によれば、二糖を主成分とする四糖、
六糖および少量の八糖と単糖からなる混合物であ
る。上記反応で得た生成物の全量を陰イオン交換
樹脂AG1×４（HCOO^-型）カラム（1.6×90cm）
に載せ、0.3M HCOOHおよび1M HCOOHで溶
出し、図６に示す如く、二糖（Ｎ−アセチルデル
モシン(a)およびＮ−アセチルコンドロシン(b)に分
離されている）、四糖、六糖および単糖（Ｌ−イ
ズロン酸(c)およびＤ−グルクロン酸(d)）のそれぞ
れが分画された。各分画は凍結乾燥され、遊離型
のオリゴ糖および単糖が下記の収量で得られた。 Ｎ−アセチルデルモシン（20.5mg）、Ｎ−アセ
チルコンドロシン（6.7mg）、Ｌ−イズロン酸
（6.1mg）、四糖（２ピーク）18.1mg、六糖（11.2
mg）。

【図面の簡単な説明】

図１はコンドロイチン−６−硫酸ピリジニウム
塩の10％含水DMSO中95℃、18時間および105
℃、18時間のそれぞれの反応生成物のセフアデツ
クスＧ−25ゲル過クロマトグラムであり、図２
−１および２−２は同じく90℃、14時間の反応生
成物の陰イオン交換クロマトグラムである。図３
−１はニワトリ・トサカ由来のデルマタン硫酸ピ
リジニウム塩の10％含水DMSO中105℃、18時間
および105℃、30時間のそれぞれの反応生成物の
ゲル過クロマトグラムである。図３−２は同じ
く105℃、30時間の反応生成物の陰イオン交換ク
ロマトグラムである。図４はヒヤルロン酸（遊離
型）のピリジン硫酸塩水溶液：DMSO（１：９）、
105℃、30hr及びピリジン塩酸塩水溶液・DMSO
（１：９）、105℃、30hrにおけるそれぞれの反応
生成物のゲル過クロマトグラムである。図５は
ブタ・皮膚由来のデルマタン硫酸ピリジニウム塩
の0.3％ピリジン水溶液／DMSO（１：９）中、
105℃、30時間の反応生成物のゲル過クロマト
グラムである。図６は同じく105℃、30時間の反
応生成物の陰イオン交換クロマトグラムである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酸性ムコ多糖類を、PH２以上5.5以下の酸性
   条件下、水を含むジメチルスルホキシド中で処理
   することを特徴とする酸性ムコ多糖類の解重合方
   法。 ２ 酸性ムコ多糖類が、基本的にウロン酸とヒキ
   ソサミンから成る構成単位二糖から構成されたも
   のである特許請求の範囲第１項に記載の解重合方
   法。 ３ 酸性ムコ多糖類が、ヒヤルロン酸、コンドロ
   イチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、
   又はデルマタン硫酸である特許請求の範囲第２項
   に記載の解重合方法。 ４ ジメチルスルホキシド中の水含量が、β−Ｄ
   −ヘキソサミニド結合及び硫酸エステル結合の加
   水分解に必要な理論量以上20重量％以下である特
   許請求の範囲第１項に記載の解重合方法。 ５ 酸性条件が、PH３〜5.5である特許請求の範
   囲第１項に記載の解重合方法。