JPS647341B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトミオグロビン（以下、本明細書に
おいて、「ミオグロビン」は「ヒトミオグロビン」
を指称する）のラジオイムノアツセイ（RIA）に
関するものである。

ミオグロビンは筋組織中に存在するヘム蛋白で
あり、筋からの抽出には塩析法（Singerら、
Blood Ｘ、979−986（1955））、イオン交換体に
よる方法（Brownら、J.Biol.Chem.236、2238−
2240（1961））及びゲル濾過法（Awadら、
Nature、198、1201−1202（1963））による精製法
及びと（Kaganら、Amer.J.Physiol、211、
656−660（1966））またはと（Stoneら、J.
Clin.Invest.56、1334−1339（1975））を組合せた
方法がその精製法として知られている。

最近、心筋硬塞等に関連した血中ミオグロビン
濃度の変動に関心が集り、そのRIAによる微量定
量法の研究も行なわれているが、末だその報告は
多くなく、充分な成果が挙がつていない。すなわ
ち、前記のミオグロビン精製法では電気泳動的に
単一バンドを与えるミオグロビンが得られるが、
免疫学的にはなお不純であり、抗体産生や標識抗
原（トレーサー）の製造には満足し得るものでは
なかつた。また、これらの原因の他にも、良い抗
ミオグロビン抗体が得られないためミオグロビン
のRIAは感度が低く臨床への応用にも問題があつ
た。そこで本発明者は研究を重ねた結果純度の良
いミオグロビンの製法を確立するとともに、優れ
た抗ミオグロビン抗体とトレーサーを用いた感度
のよいRIAを可能とし、本発明を完成した。

本発明は、粗製ミオグロビンを硫安分画法、ゲ
ル濾過法及びイオン交換クロマト法の三者を組合
せて処理して得た精製ミオグロビンを標準物質と
し、これをクロラミンＴ法により放射性ヨウ素で
標識したトレーサーを用い、さらにアフイニテイ
クロマトグラフイ及びゲル濾過法で精製した抗体
を用いるミオグロビンのRIAに関するものであ
る。

精製ミオグロビンを得るには、ミオグロビン
尿、ミオグロビン血清または骨格筋等のホモジネ
ートから遠沈等により得た粗製ミオグロビンを原
料とし、このものの緩衝溶液に硫安を加えて塩析
する。塩析には例えば40％（飽和濃度）硫安を加
えて塩析した後、次に50％飽和硫安で塩析し、遠
沈した後、その上清を順次65％、79％、80％、
100％の濃度の硫安を用いて段階的に分画を行な
うのが適当である。次いで得られた沈澱を少量の
水または緩衝液に溶かしてセフアデツクスＧ−
75、Ｇ−50等を用いゲル濾過を行なう。さらに、
このものをジエチルアミノエチル（DEAE）−セ
ルロースを用いるイオン交換クロマトを行なうと
微量のアルブミン等も完全に除去でき精製ミオグ
ロビンが得られる。このものはSDS電気泳動で単
一のバンドを示し、免疫学的にも各種血清蛋白と
は反応せず純粋である。この精製ミオグロビンを
用いて動物を免疫すると特異性の高い抵体が得ら
れ、かつ放射性ヨウ素での標識を直接行なうこと
ができる。これらのことは、本発明の独創的な点
である。すなわち、Reichlinらはヒトミオグロビ
ンの直接標識は成功しないと報告しており
（Clinical Research、24、421A（1976））、また、
ミオグロビンのRIAについて報告した前記文献の
Stoneら及びRosanoら（Clin.Chem.23、69−75
（1977））は、ともに、３−（４−ヒドロキシフエ
ニル）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
エステルを ¹²⁵Iで標識し、このものをミオグロ
ビンに結合させる間接標識法（Bolton＆Hunter、
Biochem.J.133、529〜539（1973））によつてい
る。この方法は操作が繁雑であり試薬も高価であ
つて実用的でない。

ミオグロビンを直接にRI標識することは、本
発明の独創であるが、このことは上述のごとく独
特に精製した精製ミオグロビンを用いてはじめて
可能である。具体的にはこのミオグロビンにハン
ター・グリーンウツド法（クロラミンＴ法）とし
て知られている方法を適用するもので、ミオグロ
ビンに放射性ヨウ化ナトリウム及びクロラミンＴ
を加え１分程度反応させ、次いでソジウム・メタ
ビサルフアイトを加えて反応を止める方法が適当
である。この方法で得た標識ミオグロビンは非常
に安定であり50日後でも使用できる。一方前記の
間接標識法で得たトレーサーは30日後まで使用で
きると言われている。

RIA用の抗体を作製するには、一般に行なわれ
ている方法と同様に、例えば、家兎の趾尖皮下
に、フロインドのコンプリートアジユバントに乳
濁させた抗原（精製ミオグロビン）を注射し、そ
の後も毎週追加免疫を行ない５〜６週後に抗体価
が最高になつた時点で採血し、抗ミオグロビン抗
血清を得る。次いで、精製抗体を得るにはミオグ
ロビン結合アガロースでこの抗血清を処理する。
ミオグロビン結合アガロースは臭化シアンで活性
化したアガロースにミオグロビンを反応させて作
製する。これに抗ミオグロビン抗血清を加え室温
で反応させ、余分の蛋白を除去するとアガロース
−ミオグロビン−抗ミオグロビン抗体結合物が得
られるのでこれのカラムを例えば酸性緩衝液で展
開すると抗ミオグロビン抗体が得られる。しか
し、この抗体にはミオグロビンが少量混存してい
ることが認められたので、更にセフアデツクス等
によりゲル濾過を行なうと無色透明の溶液として
精製抗ミオグロビン抗体が得られる。このものは
0.01M燐酸緩衝液で透析して保存することもでき
凍結乾燥することもできる。このようにして得ら
れる抗ミオグロビン抗体は免疫学的にも家兎IgG
抗血清と反応し、オークテロニー法ではヒトミオ
グロビンとのみ反応し、ヒトヘモグロビン及びヒ
トアルブミンとは反応せず、ヒト骨格筋ホモジネ
ート上清とは一本の沈降線しかつくらず純度のよ
い抗体である。この精製抗ミオグロビン抗体は原
抗ミオグロビン抗血清の約23倍の活性をもつてい
る。

以上のようにして得られる標識ミオグロビン
（トレーサー）及び精製抗ミオグロビン抗体を用
いてRIAを行なうことにより、感度よく簡便に血
中ミオグロビンを定量することができる。RIAの
操作は通常の方法と同様に行なうことができる
が、一例を挙げれば次の如くである。緩衝液等の
希釈剤0.5mlに抗体0.1ml及び標準ミオグロビン
（又は検体）0.1ml及び標識ミオグロビン0.1mlを
加え37℃で数時間インキユベートし、次いで、ポ
リエチレングリコール1.0ml及び牛γ−グロブリ
ン0.2mlを加えてインキユベート（ポリエチレン
グリコール法）、正常家兎血清、抗家兎γ−グロ
ブリン山羊血清（二抗体法）あるいはまたチヤコ
ール５ｇ／dl0.4ml、デキストラン250 10.5ｇ／
dl0.4ml（チヤコールデキストラン法）によつて
BF分離を行なう。その沈澱又は上清の放射能を
測定する。

本発明のRIAでは、従来行なわれている方法に
比し感度が10倍に上昇し、0.3nｇまで検出でき
る。標準曲線の一例を挙げれば第１図の如くであ
り、ｄで表わされる本発明の曲線は抗血清を用い
た他の曲線に比し勾配が急で、かつ10nｇ以下の
濃度でもＢ／Ｔが30％以上であり感度と信頼性が
高い。また試料血清の影響が少なくミオグロビン
濃度が100nｇ／ml以下の低濃度の試料でも馬血
清等を用いて補正をする必要がない。このことは
第２図及び第３図に示した標準曲線から明らかで
ある。すなわち、一般に行なわれているように抗
血清を用いてRIAを行なうと、第２図に示された
ようにトレーサーと血清成分との非特異的結合が
起り、緩衝液系の曲線に対して人血清又は馬血清
を加えた曲線との間に解離がみられる。これに対
して精製した抗体を用いた本発明法のRIAでは第
３図のごとく、このような影響がなく三種類の曲
線が殆んど一本となつて表わされ補正の必要がな
いことが理解される。

次に例を挙げて説明する。

例１： 精製ヒトミオグロビンの製造 ヒト骨格筋0.5ｇより脂肪織及び結合織を除き、
等量の蒸留水を加えてホモジネートし、４〜５℃
に一夜静置する。次いで10000rpmで60分遠沈し、
上清に0.5M塩基性酢酸鉛を筋の1/10量加え、PH
7.0に調節して再び10000rpmで60分遠沈する。次
いで、この上清にNa₂HPO₄mg及びNa₃PO₄4mgの
割合で加え、PH7.0に調節して10000rpmで60分遠
沈する。得られた上清に40％飽和硫安を加えて塩
析し、さらにこれを50％飽和硫安に塩析し、遠沈
した後上清を65％、79％、80％及び100％硫安で
順次塩析する。最後に得られた沈澱を少量の水ま
たは緩衝液（0.01M燐酸緩衝液PH7.2）に溶かし、
セフアデツクスＧ−75（２×100cm）のカラムを通
す。次いでこの流出液をDEAE−セルロース（２
×10cm）のカラムに通して同じ緩衝液で溶出さ
せ、精製ミオグロビンの溶液を得た。この溶液は
NaN₃0.05％を加え４℃で保存すると６ケ月間安
定である。

この精製ミオグロビンはSDS電気泳動で単一の
バンドを示し、アクリルアミドゲル、セルロース
アセテート膜電気泳動で４種のサブコンポーネン
トに分離する。

可視部吸収スペクトル（PH5.4） 吸収極大（ｍμ）：409、500、630 580−610ｍμにメト型ミオグロビンに特徴的
なパターンを示す。

紫外部吸収スペクトル（PH8.6） 吸収極大（ｍμ）：281 免疫学的性質としては、この精製ミオグロビン
は、オークテロニー法で抗ヒト筋型クレアチンキ
ナーゼ（血清）、抗ヘモグロビン血清または抗ミ
オシン血清と反応させた際、そのいずれに対して
も沈降線を認めなかつた。また、このミオグロビ
ンを家兎に感作して得た抗血清で逆にヒトミオグ
ロビンの同定を行なうと一体の沈降線しか作らな
かつた。この抗ミオグロビン抗血清は人骨格筋ホ
モジネート上清と一本の沈降線を作るが、ヒトヘ
モグロビン、ヒトクレアチンキナーゼ及び人血清
とは反応しない。

例２： ミオグロビンの放射性ヨウ素による標識 Na ¹²⁵I １ｍCi、ミオグロビン2.5μｇ／5μお
よび0.4Mリン酸緩衝液（PH7.5）25μを加えた
ものにクロラミンＴ（25mg／10ml0.04Mリン酸緩
衝液（PH7.5））10μを加え60秒反応させる。こ
れにソジウムメタビサルフアイト（25mg／10ml
0.04Mリン酸緩衝液（PH7.5））25μを加えて反
応を止め、さらに10％KI10μを加える。この反
応液をあらかじめ２％BSA ２mlでコーテイング
したセフアデツクスＧ−75スーパーフアイン（１
×20cm）のカラムを用いリン酸緩衝生理食塩水
（以下PBSと略す：0.15Mリン酸緩衝液（PH7.4）
＋0.85％生理食塩水）で溶出し、１mlの分画を行
なうと８および９本目に ¹²⁵I標識ミオグロビン
が得られる。この ¹²⁵I標識ミオグロビンの比放
射能は60μCi／μｇ（収量33μCi）である。この
ものは−20℃に保存すると50日後でも安定であり
使用できる。

例３： 抗ミオグロビン抗体の製造 (1) 精製ヒトミオグロビン２mgを生理食塩水で希
釈して２mlとし、等量のフロインドのコンプリ
ートアジユバンドを加えて乳濁液とする。これ
を成熟家兎（雄、約３Kg）の趾尖皮下に注射し
て免疫する。その後0.5mg／mlのヒトミオグロ
ビンを１mlの生理食塩水で希釈したものを耳静
脈に注射して追加免疫を毎週行なう。通常５〜
６週で抗体価は最高値を示すので採血し、抗血
清を得る。

(2) CNBr−活性化セフアロース4B（フアルマシ
ア社製）２ｇに精製ヒトミオグロビン２mg／ml
５mlを加え、さらに0.5M食塩−0.1Mホウ酸緩
衝液（PH8.3）を加えて室温で２時間反応させ
る。次いで同じ緩衝液で洗滌し、さらに1Mエ
タノールアミン（PH9.0）を加えて室温で２時
間反応させ余分の活性基をブロツクする。この
ゲルを0.5M食塩−0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）及
び0.5M食塩−0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.5）で
各々３回洗滌し、余分の蛋白を除去する。この
ようにして得られたミオグロビン結合セフアロ
ースに、(1)で得た抗ヒトミオグロビン家兎血清
20mlを加え室温で２時間反応させると、セフア
ロース−ヒトミオグロビン−抗ヒトミオグロビ
ン抗体結合体が得られる。このものを0.5M食
塩−0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.3）で洗滌し、余
分の蛋白を除いた後0.8×15cmのカラムにつめ、
0.5M食塩−0.17Mグリシン塩酸緩衝液（PH2.5）
で展開すると抗ミオグロビン抗体が溶出する。
この抗体溶液には微量のミオグロビンが混在し
ているので、さらにセフアデツクスＧ−75のカ
ラム（２×100cm）にかけ、0.17Mグリシン塩
酸緩衝液（PH2.5）で抗体を溶出させる。得ら
れた精製抗体は無色透明の溶液である。このも
のは家兎IgGであり、電気泳動でγ−グロブリ
ンの易動度を示し、抗家兎IgG抗血清と反応す
る。また、免疫学的にはオウクテルロニー法で
ヒトミオグロビンとのみ反応し、ヒトヘモグロ
ビン及びヒトアルブミンとは反応しない。ヒト
骨格筋ホモジネート上清とは一本の沈降線しか
つくらない。ラジオイムノアツセイでは、ヒト
ミオグロビンとの交叉反応を100％とするとヒ
トヘモグロビンとは0.003％、ヒトアルブミン
とは0.00001％及びヒト筋型クレアチンキナー
ゼとは0.0005％以上の交叉反応はない。この精
製抗体の抗体活性は原抗ミオグロビン抗血清の
約23倍である。この精製抗体の保存には0.01M
リン酸緩衝液で透析後凍結乾燥しておくのが適
当である。

例４： ミオグロビンのRIA 希釈液（0.01Mリン酸緩衝液PH7.4、0.15M食
塩、0.05M EDTA、0.01％NaN₃、１％BSA、１
ｍＭ FOY（エチル−ｐ−（６−グアニジノヘキ
サノイルオキシ）ベンゾエート・メタンスルホネ
ート））0.5mlに精製抗体0.1ml、標準ミオグロビ
ン（または検体）0.1mlおよび ¹²⁵I−標識ミオグ
ロビン0.1mlを加え37℃で４時間インキユベート
する。次いで、このものにポリエチレングリコー
ル1.0mlおよび牛γ−グロブリン0.2mlを加えて４
℃で15分間インキユベートし、遠心分離して得ら
れる沈澱の放射能をγ線カウンターで測定した。
得られた標準曲線を抗血清を用いた曲線とともに
第１図に示す。また、同様の方法で、抗血清を用
いたときと精製抗体を用いたときの人血清または
馬血清が及ぼす影響を標準曲線により検討したの
が第２図及び第３図である。これらの図から明ら
かなように、本発明のRIAは感度がよく、低濃度
の検体についても血清の影響が少なくて極めて優
れた方法である。さらに、精製ミオグロビンは免
疫学的にも純度が高く、これから得られる標識ミ
オグロビンは製造も容易で長期間安定であり有用
な物質である。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図はミオグロビンのRIAの標準曲線で
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 硫安分画法、ゲル濾過法及びジエチルアミノ
   エチル−セルロースを用いるイオン交換クロマト
   法の三者を組合せて処理して得た精製ヒトミオグ
   ロビンを標準物質とし、該標準物質をクロラミン
   Ｔ法により直接放射性ヨウ素化した放射性ヨウ素
   標識ヒトミオグロビンをトレーサーとし、更にア
   フイニテイクロマト法とゲル濾過法により精製し
   た抗ヒトミオグロビン抗体を用いることを特徴と
   するヒトミオグロビンのラジオイムノアツセイ
   法。