KR19990077705A - 그람 음성균의 보존된 리포폴리사카라이드의 항원성 접합체 - Google Patents

그람 음성균의 보존된 리포폴리사카라이드의 항원성 접합체 Download PDF

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윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그
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Abstract

그람 음성균의 리포폴리사카라이드의 보존 부분에 공유 결합된 캐리어 단백질을 포함하고, 여기서 리포폴리사카라이드의 보존 부분이 리포폴리사카라이드의 내부 코어 및 지질 A부를 포함하는 항원성 접합체가 제공되고, 상기 접합체는 그람 음성균의 이종 균주에 대한 교차 반응성 면역 반응을 유도한다.

Description

그람 음성균의 보존된 리포폴리사카라이드의 항원성 접합체{Antigenic conjugates of conserved lipopolysaccharides of gram negative bacteria}
본 발명은 특정 그람 음성균의 리포폴리사카라이드의 보존된 부분의 항원성 접합체 및 이러한 항원성 접합체를 포함하는 백신에 관한 것이다. 이 접합체는 그람 음성균의 이종 균주에 대한 교차 반응성을 나타내는 항체를 유도하고, 이러한 접합체를 포함하는 백신은 이러한 그람 음성균 유기체에 대한 작용성이고 보호성인 항체를 유도한다.
리포폴리사카라이드(LPS)는 그람 음성균의 표면 상에 풍부하게 놓인 주요 표면 항원이다. LPS 분자는 (1) 에스테르 및 아미드 결합에서 포스페이트, 포스포에탄올아민 그룹 및 장쇄 지방산으로 치환된 글루코스아민 디사카라이드로 구성된 지질 A부; (2) 8개의 탄소 당인 케토데옥시옥토노에이트(KDO)에 의해 지질 A부에 결합되고, 1 내지 2개의 추가 KDO 분자 및 3개 이하의 헵토스 잔기에 의해 치환될 수 있는 내부 코어부; (3) 글루코스, 갈락토스, N-아세틸글루코스아민 및 N-아세틸갈록토스아민 등의 헥소스를 포함하는 외부 코어부; 및 (4) 세균 균주 중에서 널리 변화하는 반복 올리고사카라이드 단위를 포함하는 O-특이적 쇄로 구성되어 있다. 이들 반복 단위의 60,000 달톤을 초과하는 구조로의 중합은 통상적이다. 내부 코어의 구조는 세균 종들 사이에서 대부분 보존되지만, LPS 분자는 세균 균주들 사이의 구조적 및 항원성 수준에서 크게 변화할 수 있다. 살모넬라 티피무륨의 지질 A 내부 코어의 전형적인 구조는 도 1에 예시한다. 자연적인 보호 항체의 진화에 책임있는 면역 반응은 LPS의 이러한 영역에 대한 자연 면역화에 의해 발생하는 것으로 생각된다.
비장내 병원체에서, LPS 구조는 반복되는 O-항원 단위가 결여되어 있다. 더욱이, O-항원 반복 단위의 어셈블리를 위한 완전한 유전자 기구는 이러한 병원체에서 부재하는 것으로 보인다. 이는 리포올리고사카라이드(LOS)로서 이들 LPS 구조의 지정을 유도한다. 이러한 병원체에서 LPS와 LOS 구조들 사이에 유사성이 있다. 예를 들면, 모든 LPS 및 LOS 구조는 지질 A 영역을 KDO 접합을 통해 코어에 결합시킨다. KDO 잔기의 수는 1(예: 헤모필루스 인플루엔자에 및 헤모필루스 두크레이(Haemophilus ducreyi)) 내지 2(예: 나이세리아 메닌기티디스(Neisseriameningitidis) 및 나이세리아 고노르호에아에)로 변화할 수 있다. 최근 연구들은 분지된 올리고사카라이드가 코어 영역으로부터 개별적으로 합성되고, 전체 LOS 구조의 어셈블리는 세포질막의 외부에서 완성됨을 나타낸다(참조: Preston et al., "The Lipooligosaccharides of Pathogenic Gram-Negative Bacteria",Critical Reviews In Microbiology,22:139-180(1996)).
따라서, 뚜렷한 내부 및 외부 코어 영역이 없이 LOS 구조에서 단일 코어 영역이 존재한다. 이들 병원체의 코어 구조는 종에 따라 변화할 수 있으며, 헵토스의 완전한 부재하의 KDO(예: 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis); 디-헵토스 구조의 존재하의 KDO(예: 나이세리아 메닌기티디스 및 나이세리아 고노르호에아에); 또는 트리-헵토스 구조의 존재하의 KDO(예: 헤모필루스 인플루엔자에 및 헤모필루스 두크레이)를 포함할 수 있다. 헤모필루스 및 나이세리아로부터 코어 구조의 예는 도 2에 나타낸다. 올리고사카라이드 단위는 각각의 헵토스로부터 확장할 수 있고(있거나) 포스포에탄올아민 그룹으로 치환될 수 있다. 헤모필루스 인플루엔자에 균주 2019(참조: Phillips et al., "Structural Characterization of the Cell Surface Lipooligosaccharides from a Non-Typable Strain ofHaemophilus influenzae",Biochemistry, 31:4515-4526(1992)) 및 나이세리아 고노르호에아에 균주 1291(참조: John et al., "The Structural Bases for Pyocin Resistance inNeisseria gonorrhoeaeLipooligosaccharides",J. Biol. Chem., 266:1903-1911(1991))의 완성된 LOS 구조의 전형적인 예는 도 3에 나타낸다.
백신의 개발에 LPS를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 특정 세균 병원체의 LPS에 대한 지시된 특정 항체 반응은 특정 균주에 대한 보호에 기여할 수 있는 것으로 오랫동안 인식되어 왔다. 사카라이드 구조(예: LPS의 사카라이드 부분)은 캐리어 단백질에 접합됨으로써, 이러한 접합체를 함유하는 백신 조성물은 목적하는 T-의존성 반응을 유도할 것이라는 것도 공지되어 있다. 그 예는 유형-특이적 캡슐형 사카라이드를 갖는 세균에 대한 성공적인 글리코접합체 백신이다(참조:Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell. M. F., and Newman. M. J., 673-694(1995)). 이러한 범주의 면역 반응은 문헌[참조:Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell. M. F., and Newman. M. J., 695-718(1995)]에서 논의된 바의 신세대 사카라이드-단백질 접합체 백신의 유아에서의 효과에 대한 기초이다.
그러나, 이러한 병원체의 이종 균주의 LPS는 외부 코어 사카라이드 및(또는) O-특이적 쇄의 광대한 변화를 보여주기 때문에, 단일 LPS를 함유하는 백신을 이용하는 세균의 많은 이종 균주 또는 이종 속에 대한 항체 반응을 발생시키려는 노력은 오늘날까지 성공하지 못하고 있다.
나이세리아 메닌기티디스에 대한 LPS-계 백신을 개발하려는 노력으로, 파상풍 변성 독소는 많은 나이세리아 메닌기티디스 균주의 LPS로부터 분리된 올리고사카라이드와 접합되어 왔다(참조: Jennings et al.,Infect. Immun., 43:407-412(1984)). 그러나, 이러한 접합체로부터 유도된 항체는 올리고사카라이드 특이적이고, 고도의 혈청형 특이성을 나타낸다.
문헌[참조: Verheul et al.,Infect. Immun., 61:187-196(1993)]은 파상풍 변성 독소 또는 메닌고코칼 외막 단백질 부분에 대한 메닌고코칼 LPS의 올리고사카라이드의 접합을 개시하고 있다. 마우스에서, 파상풍 변성 독소 접합체는 메닌고코씨에 대해 살균성이 아닌 올리고사카라이드 특이적 항체를 유도한다. 외막 단백질-LPS 접합체는 LPS에 대해서가 아니라 외막 단백질에 대한 항체를 유도한다. 문헌[참조: Verheul et al.,Infect. Immun., 59:843-851(1991)]은 토끼에서 여러 가지 나이세리아 메닌기티디스 균주의 올리고사카라이드 및 파상풍 변성 독소의 접합체의 면역원성을 연구하고 있다. 그 결과는 유도된 항체가 면역형 특이적 에피토프를 포함하는 LPS의 올리고사카라이드 부분 쪽으로만 지시됨을 보여준다.
나이세리아 메닌기티디스의 실험실 채택된 야생 균주 A1의 LPS로부터 올리고사카라이드의 제조 및 캐리어 단백질로서 파상풍 변성 독소에 대한 그의 후속하는 접합은 문헌[참조: Gu et al.,Infect. Immun.61:1873-1880(1993)]에 개시되어 있다. 이 접합체는 마우스 및 토끼에서 면역원성이었고, 대부분의 항체는 면역형 특이적 LPS 에피토프에 대하여 지시된다. 또한, 이 접합체 항혈청은 LPS 항혈청보다 상이한 면역형의 LPS에 대한 적은 교차 반응성을 나타낸다. 이들 연구는 LPS-유도된 올리고사카라이드 접합체가 특이적 올리고사카라이드 면역형에 대한 항체를 유도함을 나타낸다. 그러나, 이 접합체가 대부분의 나이세리아 메닌기티디스 균주에 존재하는 공통 코어 사카라이드 구조에 대한 현저한 교차 반응성 항체를 유발한다는 증거는 없다.
문헌[참조: Bhattacharjee et al.,J. Infect, Dis., 173:1157-1163(1996)]은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 LPS와 나이세리아 메닌기티디스 그룹 B의 외막 단백질의 혼합물이, 그의 비접합된 비공유 착물을 형성시킴을 개시하고 있다. 이들 착물은 많은 그람 음성균과 교차 반응하는 항체를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이들 착물이 후속하는 용량을 투여함에 따라 촉진될 수 있는 T-의존형 항체 반응을 유도할 수 없는 것으로 알려진 다른 비접합 사카라이드 구조의 제제와 상이한 특성을 갖는 것을 나타내는 증거는 제공되지 않았다. 더욱이, 이러한 비접합 사카라이드들은 유아에서 적절한 면역 반응을 유도하지 않는 것으로 알려졌다.
문헌[참조: Gu et al.,Infect. Immun., 64:4047-4053(1996)]은 형별 불능 헤모필루스 인플루엔자에로부터의 올리고사카라이드 및 파상풍 변성 독소의 접합체의 제조를 개시하고 있다. 그러나, 토끼에서 유도된 항혈청은 동종 균주에 대해서만 살균 활성을 나타낸다.
따라서, 주어진 종의 그람 음성균에 대한 면역원성 반응, 바람직하게는 T-의존형 반응을 효과적으로 유도할 뿐만 아니라, 주어진 속의 그람 음성균의 이종 균주 또는 혈청형에 대한 효과적인 교차 반응성을 나타내는 항원성 접합체 및 이러한 접합체를 함유하는 백신에 대한 필요성은 여전히 남아있다. 더욱이, 이러한 접합체 및 백신은 그람 음성균의 이종 속에 대한 교차 반응성을 나타내는 항체를 유도해 낼 수 있다.
본 발명은 그람 음성균의 보존된 LPS 부분에 공유 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 항원성 접합체에 관한 것으로, 여기서 LPS의 보존된 부분은 적어도 LPS의 보존된 내부 코어 및 지질 A부를 포함한다. 이 접합체는 그람 음성균의 이종 균주, 바람직하게는 그람 음성균의 이종 속에 대한 교차 반응성 면역 반응을 유도한다.
또한, 본 발명은 이들 항원성 접합체를 포함하는 백신 및 그람 음성균에 의해 유발된 여러 가지 질병을 예방하기 위해 이들 백신으로 개체를 면역시키는 방법에 관한 것이다.
도 1a는 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)의 지질 A-내부 코어의 전형적인 구조를 나타낸다.
도 1b는 살모넬라 티피무륨의 O-항원 또는 반복되는 폴리사카라이드의 전형적인 구조를 나타낸다.
도 1c는 살모넬라 티피무륨의 헵타아실 지질 A에 대한 구조를 나타낸다.
도 2a는 헤모필루스(Haemophilus) 종의 코어 LOS 구조를 나타낸다.
도 2b는 나이세리아(Neisseria) 종의 코어 LOS 구조를 나타낸다.
도 3a는 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 균주 2019의 LOS 구조를 나타낸다.
도 3b는 나이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae) 균주 1291의 LOS 구조를 나타낸다.
도 4는 상이한 세균으로부터의 LOS에 대한 항-LOS-접합체 혈청의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
본 발명은 캐리어 단백질 및 그람 음성균의 보존된 LPS의 항원성 접합체 및 이러한 접합체를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명의 접합체는 여러 가지 그람 음성균, 예를 들면, 나이세리아 메닌기티디스, 나이세리아 고노르호에아에, 헤모필루스 인플루엔자에, 형별 불능 헤모필루스 인플루엔자에, 헤모필루스 두크레이, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 에스케리키아 콜라이, 클라미디아(Chlamydia), 살모넬라, 살모넬라 티피무륨, 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 모락셀라 카타르할리스, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 시겔라(Shigella), 클레브시엘라(Klebsiella) 및 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae)의 LPS를 이용하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
본 발명의 접합체 및 이들 접합체를 함유하는 백신은 접합체에 포함된 보존된 LPS 부분에 대한 작용성 폴리클로날 항체 반응을 생성한다. 따라서, 이 백신은 병원체의 많은 이종 균주에 반응할 수 있으므로, 그람 음성균의 상이한 균주에 대한 교차 반응성 및 교차-작용성 항체 반응을 유도한다. 이러한 교차 반응성 반응은 주어진 속의 이종 균주에 대해서 뿐만 아니라 그람 음성균의 이종 속에 대하여 나타난다.
따라서, 본 발명은 그람 음성균의 LPS의 공통 보존 부분, 즉 많은 그람 음성균에 공통적인 LPS의 부분들에 대한 항체 반응을 생성시키는 항원성 접합체에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바의 "LPS"는 평활한 LPS 및 LOS(또한, "조야한 LPS"라 함) 모두를 포함하는 것을 의미한다.
상기한 바와 같이, 그람 음성균의 LPS는 내부 코어부, 지질 A부, 외부 코어부 및 O-특이적 항원을 포함한다. 세균의 이종 균주 또는 속에 대한 반응을 유도하기 위해, 내부 코어 및 지질 A부의 구조는 본 발명의 접합체 내에서 보존되고 이용되어야 한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바의 LPS의 "보존된 부분"이라는 용어는 적어도 에스테르 및 아미드 결합에서 포스페이트, 포스포에탄올아민 그룹 및 장쇄 지방산으로 치환된 글루코스아민 디사카라이드(즉, 지질 A부); 및 내부 코어의 KDO 작용 그룹 및 만일 있다면 헵토스 치환체를 포함하는 것을 의미한다. 내부 코어에 포함될 수 있는 포스페이트, 포스포에탄올아민 및 피로포스포에탄올아민 그룹은 필요치 않을 수 있지만, "보존된 부분"에 포함될 수도 있다. "보존된 부분"에 포함된 병원체 부분은 세균 균주 중에서 고도로 보존되므로, 폭넓게는 교차 반응성 항체는 이들 구조로부터 생성될 수 있다(참조: Apicella et al., "The Normal Human Serum Bactericidal Antibody Response to the Lipooligosaccaride ofNeisseria gonorrhoeae",J. Infect. Dis.,153:520-528(1986)).
본 발명의 범위에서, LPS-함유 균주의 내부 코어의 추가의 분지된 탄수화물 또는 LOS-함유 균주의 올리고사카라이드는 본 명세서에 정의된 바의 "보존된 부분"의 일부로서 보존될 수 있다. 그러나, 이는 많은 경우에 필요치 않거나 또는 심지어 바람직하지 못하다.
LPS 구조의 이와 같이 보존된 부분을 이용하는 접합체의 생성은 처리되는 개체에서 상승될 수 있는 T-세포 의존형 IgG 반응을 유도하고, 생성된 항체는 특정 세균 속에서 이종 균주의 표면 뿐만 아니라 그람 음성균의 이종 속과 교차 반응하는 것으로 본 발명의 발명자들에 의해 밝혀졌다. 더욱이, 본 발명의 접합체에 의해 유도된 표면 반응성 항체는 살균성(즉, 면역보호와 연관된 작용 특성을 나타냄) 및 보호성 모두인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 접합체에 이용된 LPS의 보존된 부분은 당업계의 숙련자들에게 공지된 많은 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 보존된 구조는 (1) 보존된 코어 구조의 전체 또는 일부의 화학적 합성, (2) 보존된 구조를 우세하게 함유하는 LPS를 생산할 야생형 균주의 선택, (3) 야생형 균주에 의해 합성된 LPS의 비환원 당 잔기의 효소 분해, 및 (4) PCT 출원 공개 제WO97/19688호에 개시된 바의 여러 가지 돌연변이체 및 돌연변이체로부터 유도된 자손(progeny)에 의해 주어진 세균 유기체의 LPS의 보존된 구조의 합성(예: LPS의 생합성에서 결실된 돌연변이체 균주에 의해 나이세리아 메닌기티디스 LPS의 보존된 코어부의 생산; 박테리오파지에 노출시킴으로써 살모넬라 및 에스케리키아 콜라이의 코어-결실의 조야한 돌연변이체의 생산; 야생형 균주의 피오신(pyocin) 노출에 의한 나이세리아 고노르호에아에 LPS 돌연변이체 및 이들 돌연변이체로부터 유도된 자손의 생산; LPS의 생합성에 연루된 특이적 효소의 트랜스포산-유도된 돌연변이의 발생; 및 LPS 생합성에 연루된 특이적 효소의 부위-지시된 돌연변이 및 이들 돌연변이체 균주로부터 유도된 자손)에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 접합체에 사용하기 위한 LPS의 보존된 부분을 제조하기 위한 바람직한 수단은 돌연변이체 세균 균주 및 이들의 자손을 통해 LPS 보존된 부분의 합성을 통해 이루어진다(상기 경로 4). 보다 바람직하게는, 하기 돌연변이체 균주, 즉 살모넬라의 Ra코어(내부 및 외부 코어 모두), 살모넬라의 Rc및 Re및 에스케리키아 콜라이의 J5등의 LPS의 보존된 코어 사카라이드 만을 발현시키는 유기체; LPS의 코어부에 글루코스를 부가하지 않는 유기체; 문헌[참조:Biochemistry, 35:5837-5947 (1996)]에 기재된 바의 헤모필루스 인플루엔자에 타입 b로부터 돌연변이체 균주 281.25 등의 LPS의 코어부에 갈락토스를 부가하지 않는 유기체; 문헌[참조:J. Biol. Chem., 269:11162-11169(1994)]에 기재된 나이세리아 메닌기티디스의 NMB R6 균주 및 나이세리아 고노르호에아에의 1291-R6 균주 등의 포스포글루코뮤타제(PGM) 유전자에서 돌연변이로 인해 LPS의 코어부에 갈락토스를 부가하지 않는 유기체; 문헌[참조:Infect. Immun., 63:2508-2515(1995)]에 기재된 나이세리아 메닌기티디스의 돌연변이체 균주 SS3 등의 갈락토스 에피머라제(GalE) 유전자에서 돌연변이로 인해 LPS의 코어부에 갈락토스를 부가하지 않는 유기체; 및 문헌[참조:J. Exp. Med., 180:2181-2190(1994)]에 기재된 글루코실 또는 갈락토실 트랜스퍼라제 유전자에서 돌연변이와 같은 대응하는 트랜스퍼라제 효소에서 돌연변이와 같은 대응하는 트랜스퍼라제 효소에서 돌연변이로 인해 LPS의 코어부에 글루코스 또는 갈락토스를 부가하지 않는 유기체가 LPS 보존 부분을 합성하기 위해 이용된다.
문헌[참조: Lee et al.,Infect. Immun., 63:2508-2515(1995)]의 연구는 갈락토스 에피머라제에서의 돌연변이가 글루코스를 함유하는 분지 영역 또는 외부 코어 영역 후에 절단되는 LPS의 발현을 초래함을 보여준다. 그룹 B 나이세리아 메닌기티디스의 Tn916-생성된 돌연변이체의 스크리닝은 안정한 LPS 돌연변이체 균주(NMB-R6 균주라 지정됨)가 구조: GlcNAc-Hep2(PEA)-KDO2-지질 A을 갖는 심층 코어 LPS를 발현시킴을 보였다. 추가의 연구는 트랜스포손이 추정되는 포스포-글로코뮤타제 유전자로 삽입됨을 보여준다(참조:J. Biol. Chem., 269:11162-11169(1994)). 돌연변이체 균주의 세포 유리 추출물은 어떠한 포스포-글루코뮤타제 활성을 나타내지 않는다. 마찬가지로, 다른 트랜스포손-유도된 돌연변이는 UDP-글루코스-4-에피머라제 활성을 제거한다.
LPS는 지질 A부의 초기 합성 후 내부 코어 및 이어서 외부 코어의 당 잔기의 연속적인 추가에 의해 생합성된다. 글루코스 및 갈락토스 등의 헥소스 단위를 코어(예: 나이세리아 메닌기티디스의 GlcNAc-Hep2(PEA)-KDO2-지질 A)에 가하는 것은 생합성에 연루된 일련의 효소들에 의해 촉매되는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 글루코스는 글루코키나아제에 의해 글루코스-6-포스페이트로 변환된다. 효소인 포스포-글루코뮤타제는 글루코스-6-포스페이트를 글루코스-1-포스페이트로 변환시키고, 이어서 이는 UTP-글루코스-1-포스페이트-우리딜-트랜스퍼라제로 변환된다. 또한, UDP-글루코스는 UDP-글루코스-4-에피머라제에 의해 UDP-갈락토스로 변환된다. 이어서, 이들 UDP 중간체로부터 얻은 헥소스 단위는 트랜스퍼라제에 의해 촉매된 LPS의 코어로 전송된다. 이들 전송 활성의 손실 또는 UDP-글루코스 및 UDP-갈락토스의 발생에 책임있는 효소는 내부 코어만을 함유하는 LPS 구조의 제조를 초래한다. 코어 LPS를 제조하는 데 필요한 경로는 포스포-글루코뮤타제, UDP-글루코스-1-포스페이트-우리딜 트랜스퍼라제, UDP-글루코스-4 에피머라제 또는 UDP-글루코스 또는 UDP-갈락토스 트랜스퍼라제의 손실에 의한 영향을 받지 않을 수 있다. 따라서, 이들 효소에서 임의의 결함은 LPS의 쇄 종결을 초래할 것이다.
임의의 형태의 주어진 그람 음성균의 LPS는 본 발명의 접합체를 제조하기 위해 이용될 수 있지만, 본 발명의 보존된 LPS 부분이 접합 전에 데-O-아실화되는 것이 바람직하다. LPS 구조는 문헌[참조:J. Biol. Chem., 250:1926-1932(1975) andJ. Biol. Chem., 256:7305-7310(1981)]에 기재된 바와 같이 수산화나트륨에 의한 완만한 알칼리성 가수분해에 의해 또는 문헌[참조:Eur. J. Biochem., 177:483-492(1988)]에 기재된 완만한 하이드라진 처리에 의해 데-O-아실화되는 것이 유리할 수 있다. LPS를 데-O-아실화시키는 것은 그의 면역원성을 개선시키고 그의 독성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 대안으로, 비독성 LPS 부분은 병원체 그람 음성균의 비독성 돌연변이체로부터 예를 들면 국제 특허 제WO/97/19688호에 기재된 방식으로 분리될 수 있다.
본 발명의 항원성 접합체를 생산하는 데 있어서, 보존된 LPS 부분은 적절한 링커 화합물을 통해 캐리어 단백질에 결합된다. 이러한 링커 화합물의 사용은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌[참조:Conjugate Vaccines, Cruise et al., 48-114, Karger Publishing(1989)]에서 논의하고 있다.
예를 들면, 보존된 LPS 구조의 지질 A 또는 내부 코어부의 반응성 그룹은 공지된 이종의 이작용성 및 동종의 이작용성 결합제에 결합될 수 있다. 이종의 이작용성 결합제는 이종 반응성 말단을 함유하고, 보존된 LPS에 따라 중간체를 생산한다. 이 중간체는 LPS의 한쪽 말단에 결합되는 한편, 반대쪽 말단은 반응성 그룹을 포함한다. 또한, 동종의 이작용성 결합제는 2개의 반응성 그룹을 함유하지만, 이들은 동일하다. 일반적으로, 결합제는 보존된 LPS부를 아미노 그룹, 하이드록실 그룹 또는 카복실 그룹을 통해 캐리어 단백질에 결합시킨다. 아미노 그룹 및 하이드록실 그룹 결합은 지질 A의 사카라이드 또는 보존된 LPS의 내부 코어에 의해 형성된다. 카복실 그룹 결합은 내부 코어의 KDO에 의해 형성된다. 결합제의 반대쪽 말단은 캐리어 단백질과의 추가의 반응을 위해 술프하이드릴 그룹을 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용하기에 적절한 결합제로는, 예를 들면, 술포숙신이미딜-6-(3-[2-피리딜디티오]프로피온아미도)-헥사노에이트(술포-LC-SPDP), 숙신이미딜-6-(3-[2-피리딜디티오]프로피온아미도)-헥사노에이트(LC-SPDP), 트라우트(Traut) 시약(2-이미노티올란), N-숙신이미딜-S-아세틸 티오아세테이트(SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜 디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜 아세틸 티오프로피오네이트(SATP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도 메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 말레이미도 벤조일-N-하이드록시 숙신이미드 에스테르(MBS), N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트(SIAB), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(SMPB), 브로모아세트산-N-하이드록시 숙신이미드(BANS) 에스테르, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노 프로필) 카보디이미드(EDAC), 아디프산 디하이드라지드(ADH), 시스타민 및 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP)를 포함한다.
LPS의 보존된 부분은 아미노 그룹을 함유하지 않는 완충 용액(예: 포스페이트 완충 염수 또는 중탄산나트륨)에서 적절한 시간(예: 실온에서 약 1시간)동안 중성 내지 약 알칼리성 pH에서 결합제와 반응하게 된다. 이어서, 중간체는 임의의 적절한 수단(예: 겔 여과)에 의해 미반응 시약으로부터 제거된다. 이어서, 캐리어 단백질은 상기 그룹으로부터 선택된 적절한 결합제와 반응하여 활성화된다. 이어서, 보존된 LPS 중간체는 적절한 조건 하에 활성화된 캐리어 단백질과 반응하여 본 발명의 접합체를 생산한다.
술프하이드릴 그룹을 통한 결합의 경우에, LPS-결합제 중간체는 적절한 환원제 또는 하이드록실아민과 반응하여 유리 술프하이드릴 그룹을 노출시키기 위해 결합제 상의 디설파이드 결합을 환원시킨다. 적절한 환원제로는 디티오트레이톨(DTT) 및 머캅토에탄올을 들 수 있다. 이어서, 술프하이드릴-노출된 중간체는 활성화된 캐리어 단백질과 반응하여 티오에테르-결합된 공유 결합 접합체를 제공한다.
술프하이드릴 그룹을 통한 항원성 접합체의 형성은 하기 반응식 1로 예시한다:
(B)
(C)
대안으로, 알데하이드는 예를 들면 문헌[참조: Morrison, R. T. and Boyd, R. N.,Organic Chemistry, Allyn and Bacon, Inc., 875-905(1966)]에 개시된 바의 사카라이드 구조 상의 인접 하이드록실 그룹의 과요오드산염 산화에 의해 또는 문헌[참조: Avigaeld et al.,J. Biol. Chem., 237:2736(1962)]에 개시된 바와 같이 C-6 하이드록실 그룹을 알데하이드 그룹으로 변환시키기 위해 갈락토스 옥시다제로 LPS-함유 비환원성 말단 갈락토스 또는 N-아세틸 갈락토스아민 잔기를 처리함으로써 LPS 구조 상에 노출될 수 있다. 이어서, 알데하이드-함유 LPS는 예를 들면 환원성 아민화에 의해 적절한 캐리어 단백질에 결합될 수 있다.
또 다른 임의의 방법에서, 본 발명의 접합체는 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDAC) 등의 카보디이미드 시약을 사용하여 LPS 상의 카복실 그룹을 통해 LPS의 보존된 부분과 캐리어 단백질을 결합시킴으로써 형성될 수 있다. 이 방법에서, 접합체는 캐리어 단백질의 카복실 그룹에 LPS 사카라이드의 카복실 그룹을 결합시킴으로써 제조되는 것이 바람직하다. 이러한 경우에, 보존된 LPS는 먼저 EDAC의 존재하에 아디프산 디하이드라지드(ADH) 등의 적절한 링커 화합물과 반응한다. 이어서, 캐리어 단백질은 EDAC 등의 적절한 링커 화합물의 존재하에 ADH LPS 중간체와 반응할 수 있다. 카복실 결합된 접합체가 얻어진다.
카복실 그룹의 결합을 통한 항원성 접합체의 형성은 하기 반응식 2로 예시한다:
(B)
다른 대안의 양태에서, 본 발명의 접합체는 캐리어 단백질의 아미노 그룹에 LPS 사카라이드의 카복실 그룹을 결합시킴으로써 형성될 수 있다. 이 경우에, 보존된 LPS는 먼저 EDAC의 존재하에 시스타민과 반응한다. 시스타민-LPS 중간체로부터 술프하이드릴 그룹은 디티오트리톨 등의 환원제에 의해 노출되고, 최종적으로 브로모-아세틸화된 캐리어 단백질과 반응한다.
본 발명의 항원성 접합체의 제조에 유용한 캐리어 단백질로는 세균 독소 및 변성 독소(예: 파상풍 독소 또는 변성 독소, 디프테리아 독소 또는 변성 독소, 디프테리아 독소 CRM197의 비독성 돌연변이체[참조:Immunochem., 9:891-906(1972)], 슈도모나스 외독소 A, 콜레라 독소 또는 변성 독소, 그룹 A 스트렙토코칼(streptococcal) 독소, 스트렙토코커스 뉴모네아에의 뉴몰리신(pneumolysin ofStreptococcus pneumoneae) 등); 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)의 섬유상 헤마글루티닌(FHA) 또는 FHA 단편(들); 나이세리아 고노르호에아에의 선모 또는 필린(pilin); 나이세리아 메닌기티디스의 선모 또는 필린; 세균성 외막 단백질(예: 나이세리아 메닌기티디스의 1군 외막 단백질 및 3군 외막 단백질과 같은 나이세리아 메닌기티디스의 외막 단백질 착물); 나이세리아 고노르호에아에의 외막 단백질; 스트렙토코커스의 C5A 펩티다제 및 모락셀라 카타르할리스의 편재하는 표면 단백질이 있다. 바람직한 캐리어 단백질은 CRM197이다.
본 발명의 항원성 접합체를 함유하는 백신은 백신 항원에 대한 면역 반응을 증대시키는 것으로 공지된 여러 가지 보조제를 함유하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 보조제는 환자의 면역 시스템의 비특이적 자극에 의해 항체 반응을 증가시키는 것으로 믿어진다. 보조제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌[참조: "Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", Powell et al., Plenum Press(1995)]에 기재되어 있다. 본 발명의 접합체를 함유하는 백신에 사용하기 적절한 보조제의 예로는 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 모노포스포릴 지질 A, 3-데아실화된 모노포스포릴 지질 A, QS-21(참조:J. Immunol., 146:431-437(1991)) 뿐만 아니라 알루미늄 화합물과 조합된 여러 가지 세제(예: TritonTMX100, 쯔비터 시약(zwittergent) 및 데옥시콜레이트)를 들 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 접합체에 대한 항체 반응은 백신 내에 1개 이상의 보조제를 포함시킴으로써 실질적으로 증가된다.
백신 제형의 투여를 필요로 하는 개체에 이를 투여하기 적절한 많은 방법이 공지되어 있다. 적절한 투여 방법으로는 피내 투여, 근육내 투여, 복막내 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 질내 투여, 피하 투여, 안내 투여, 비내 투여 및 경구 투여를 들 수 있다.
본 발명의 항원성 접합체를 함유하는 백신 제형은 생리학적으로 허용되는 담체, 예를 들면 등장 용액, 염수, 포스페이트 완충 염수 중의 접합체를 포함할 수 있다. 백신 제형은 효과적인 예방량으로 개체에 투여된다.
많은 상이한 세균 종 또는 이종 세균 종에 대한 교차 반응성으로 인해, 본 발명의 항원성 접합체는 LPS-생성 세균 유기체에 의해 유발된 질병에 대한 인간의 면역학적 반응을 생산하는 백신의 성분으로서 효과적이다. 본 발명의 접합체를 함유하는 백신은 당업계의 숙련자들에게 공지된 물질 및 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 접합체에 의해 생성된 항체는 감염된 개체의 혈액 샘플, 체액 또는 생검 샘플을 시험함으로써 LPS-생성 세균 유기체에 의해 감염이 유발되었는지 여부를 검사하기 위해 사용된다. 치료 및 예방 용도로는 본 발명의 백신 뿐만 아니라 그에 따라 얻어진 항체의 사용을 포함한다. 본 발명의 항원성 접합체에 의한 능동 면역은 세균 감염증 또는 질병의 예방에 유용할 수 있다.
본 발명의 백신은 여러 가지 그람 음성균, 예를 들면 살모넬라, 에스케리키아 콜라이, 나이세리아, 헤모필루스, 시겔라, 클레브시엘라 및 슈도모나스에 의해 유발된 패혈증성 쇼크의 예방에 유용하다. 특정 경우에, 현저한 양의 LPS가 종래의 항생제[참조:J. Infect. Dis., 157:567-568(1988)]에 의해 치료 후 세균의 사세포로부터 방출되는 것이 발견되었다. 이는 환자에서 내독소-유도된 합병증을 유발할 수 있다.
패혈증성 쇼크 및 그의 관련 합병증을 예방하기 위한 한가지 시도는 잠재적으로 포함된 세균의 LPS의 공통 코어 영역에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 환자에게 투여하는 것이다. 이러한 항혈청은 세균 유기체에 의해 과도하게 생산된 LPS의 독성 효과를 예방할 수 있다. 에스케리키아 콜라이 또는 살모넬라 미네소타 면역원의 돌연변이체에 의해 생산된 LPS를 사용하는 동물 모델에서 LPS 항체 요법의 가능성은 문헌[참조: Applemelk and Cohen in, "Bacterial Endotoxic Lypopolysaccharides - Vol. II",Immunopharmacology and Pathology, CRC Press, (1992)]에 의해 검토한다.
본 발명을 이하 하기 비제한적인 특정 실시예로서 예시한다.
실시예
세균의 선택 및 성장 조건:
나이세리아 메닌기티디스 균주 NMB-R6의 Tn916 유도된 LPS 돌연변이체를 문헌[참조: Zhou et al.,J. Biol. Chem., 269:11162-11169(1994)]에 나타낸 방법에 따라 작제한다. 이러한 균주는 약 3.1 - 3.2 KDa의 분자량을 갖는 LPS를 발현시키는 표현형적으로 안정한 돌연변이체이다. 글루코스-6-포스페이트를 글루코스-1-포스페이트로 변환시키는 돌연변이체 균주의 무능은 나이세리아 메닌기티디스의 보존된 코어 LPS 구조만을 함유하는 절단된 LPS 부분을 초래하는 것으로 나타난다. 이러한 돌연변이체 균주에 의해 생산된 LPS의 구조는 GlcNAc-Hep2포스포에탄올아민-KDO2-지질 A로서 식별된다.
이러한 돌연변이체 균주는 5% CO2에서 35℃에서 6시간 동안 GC 한천 평판 배지 상에서 성장시킨다. 이어서, 고체 한천 배양액으로부터 세포들을 0.2% 효모 추출 투석물을 함유하는 보충된 액체 배지 중에서 18시간 동안 성장시킨다. 이어서, 배양액을 Fernbach 플라스크로 옮기고, 추가로 18-24 시간 동안 성장시킨다. 이어서, 세포들을 가열하여 치사시키고, LPS 구조의 정제를 위해 원심 분리에 의해 수확한다.
LPS 정제:
LPS를 문헌[참조: Wu et al.,Anal. Chem., 160:298-289(1987)]에 기재된 고온 페놀-물 추출 방법에 의해 NMB-R6 세포로부터 추출하고, 초원심분리를 통해 정제한다. 보다 상세하게는, 세포 펠릿들을 5mM EDTA 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 3용적(3ml 완충액/gm 습윤 중량)의 포스페이트 완충액(pH 7.1)에 현탁시킨다. 이어서, 리소자임(Sigma Chemical Co.)을 2mg/ml 농도로 현탁액에 가한다. 이어서, 이 혼합물을 4℃에서 철야 분해시킨다. 현탁액을 37℃로 되게 하고, 추가로 100μg/ml 농도의 RNAse 및 DNAse로 추가로 3시간 분해시킨다. 이어서, 분해물을 70℃로 되게 하고, 이에 동일한 용적의 페놀을 70℃에서 가한다. 이 혼합물을 15분의 기간 동안 추출하고, 이어서, 현탁액을 4℃로 냉각시키고, 30분 동안 10,000g으로 원심분리한다. 수성상을 회수하고, 페놀상을 70℃에서 15분 동안 동일한 용적의 물로 재추출한다. 이어서, 이 상을 30분 동안 10,000g으로 원심분리하고, 수성상을 분리한다. 나트륨 아세테이트를 5mg/ml의 농도로 합한 수성 상청액에 가한다. 이어서, 2용적의 빙냉 아세톤을 이 혼합물에 가하고, LPS를 4℃에서 철야 침전시킨다. 침전된 LPS를 30분 동안 10,000g으로 원심분리에 의해 분리한다. 회수된 LPS를 멸균수중에 현탁시키고, 3시간 동안 105,000g으로 3회 초원심분리시킨다. 최종 펠릿을 후속 실험을 위해 소용적의 멸균수 중에 현탁시킨다. 전형적으로, LPS 3mg을 NMB-R6 세포 1gm 습윤 중량으로부터 정제한다.
캐리어 단백질, CRM197에 접합:
이어서, 상기 방식으로 정제된 LPS를 80℃에서 20분 동안 NaOH 45mM과 반응시킴으로써 데-O-아실화시킨다. 데-O-아실화된 물질을 HCl로 중화시키고, 용출제로서 0.1M NaHCO3를 사용하여 Biogel P6 칼럼 상에서 겔 여과에 의해 정제한다. 이어서, 데-O-아실화된 LPS(이하 "DeA-LPS"라 칭함)는 보존된 LPS 구조 상의 사카라이드의 아미노 그룹을 아래 기재된 방법을 이용하여 캐리어 단백질의 아미노 그룹에 결합시킴으로써 캐리어 단백질 CRM197에 접합시킨다. CRM197은 디프테리아 독소의 무독성 돌연변이체 단백질이고, 인체용 글리코접합체 백신의 시판용 캐리어 단백질로서 사용되어 왔다.
장쇄 술포-N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(Pierce Chemical Company, 술포 LC-SPDP)이 DeA-LPS의 1급 아미노 그룹(들)를 티올화하기 위해 사용되었다. 술포 LC-SPDP는 0.1M NaHCO3(pH 7.9) 중의 LPS 15mg에 1:1(w/w)의 비율로 가한다. 이어서, 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 반응의 종료시에, 혼합물을 0.1M NaHCO3중에서 평형에 이른 Biogel P6 칼럼 상에서 정제한다. 회수된 분획을 문헌[참조: Keleti and Lederer,Biochem Biophys., 74:443-450(1974)]에 기재된 방법에 따라 KDO에 대해 분석하고, KDO를 함유하는 분획을 풀링시킨다. LPS의 SPDP 유도체 중에 존재하는 N-피리딜 디설파이드를 50-100mM 디티오트레이톨(DTT)로 환원시키고, 상기한 바와 같이 Biogel P6 칼럼 상에서 겔 여과시킨다. KDO 양성 분획을 함유하는 티올화된 물질을 다시 풀링시킨다. DeA-LPS의 올리고사카라이드의 티올화를 문헌[참조: Ellman, G. L.,Arch. Biochem. Biophys., 74:443-450 (1958)]에 기재된 반응에 따라 모니터하고, 이 물질 0.1ml를 Ellman 시약(즉, pH 8.0 포스페이트 완충액 10ml 중의 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) 40mg) 0.1ml와 혼합한다. 인큐베이션한지 15분 후, 흡광도는 412nm였다. 시스테인이 표준 술프하이드릴 시약으로서 사용되었다.
CRM197-캐리어 단백질을 문헌[참조: Bernatowitz and Matsueda,Anal. Biochem.,155:95-102(1986)]에 기재된 방법에 따라 브로모아세틸화시킨다. 100mg/ml의 디메틸 포름아미드 중의 브로모아세트산-N-하이드록시 숙신이미드 에스테르(Sigma Chemical Co.)를 4℃에서 1:1(w/w)의 비율로 단백질(0.1M NaHCO3중) 3ml에 적가한다. 용액을 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 상기한 바와 같이 Biogel P6 칼럼 상에서 겔 여과시키고, 브로모아세틸화된 단백질을 함유하는 공극 분획을 풀링시킨다. 캐리어 단백질 상의 아미노 그룹을 브로모아세틸 그룹으로 유도하는 것은 유리 아미노 그룹의 양을 감소시킴으로써 모니터된다.
이어서, 0.1M NaHCO3중의 브로모아세틸화된 CRM197을 0.1M NaHCO3중의 1:1.5(w/w)의 LPS에 대한 단백질의 비율로 티올화된 DeA-LPS에 가한다. 반응 혼합물을 4℃에서 철야 인큐베이션시킨다. 최종 접합체(이하, "DeA-LPS-SPDP-CRM"이라 칭함)를 0.1M NaHCO3/1mM EDTA(pH 7-9)에서 평형에 이른 Biogel P30(Bio-Rad) 칼럼 상에서 겔 여과에 의해 정제시킨다.
면역원성 결정:
상기한 바와 같이 제조한 DeA-LPS-SPDP-CRM 접합체의 면역원성을 하기 방법에 따라 스위스 웹스터 마우스에서 측정한다. 1 그룹당 10마리의 6-8 주된 마우스 암컷의 그룹을 LPS 10μg, DeA-LPS 10μg, DeA-LPS-SPDP(즉, 접합되지 않은 중간체) 10μg, 및 DeA-LPS-SPDP-CRM 접합체 10μg을 피하로 면역시킨다. CRM19710μg가 대조군으로서 작용하도록 마우스에 투여되었다. 이들 면역원들 각각은 포스페이트 완충 염수(PBS)를 함유하는 최종 용적 0.1ml 중의 보조제로서 용량당 QS-21(Aquila) 20μg를 추가로 함유한다. 추가의 그룹을 QS21 보조제 없이 LPS 10μg으로 면역시킨다. 마우스를 0, 3 및 6주에 면역시키고, 항체 결정을 위해 각각의 면역화 전에 혈액 샘플을 취한다. 혈액 샘플을 항체 결정을 위해 8주에 추가로 취한다.
LPS 항체 수준을 R6 및 아래 확인된 기타 야생형 및 면역형 특이적 나이세리아 메닌기티디스로부터 정제된 LPS에 대한 효소 결합된 면역용매 분석(ELISA)에 의해 측정한다. 면역형 특이적 균주를 Walter Reed Army Medical Center(Washington)로부터 얻는다. LPS를 상기 고온 페놀-물 추출 방법에 의해 이들 균주로부터 정제한다.
정제된 LPS를 나이세리아 메닌기티디스 균주 A1, H44/76, 2996 및 면역형 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L10, L11 및 L12에 대해 10μg/mL; 및 R6 균주에 대해 2.5μg/mL의 농도로 내독소-유리 PBS 중에서 희석시킨다. 폴리스티렌 미량적정기 플레이트를 희석된 LPS-함유 혼합물 100μL/웰로 코팅하고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시키고, 4℃에서 철야 저장한다. 이어서, 결합되지 않은 LPS를 자동 플레이트 세척기를 이용하여 흡인에 의해 플레이트로부터 제거한다. PBS/0.1% 젤라틴 150μL/웰을 플레이트에 가하고, 이어서 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨다. 이러한 인큐베이션 후, 모든 후속 단계들 사이에서, 플레이트를 자동 플레이트 세척기를 이용하여 PBS와 0.1% Tween 20의 혼합물로 세척한다.
시험 마우스 혈청을 PBS, 0.05% Tween 20 및 0.1% 젤라틴의 혼합물 중에서 연속적으로 희석시킨다. 희석액 100μL/웰을 플레이트에 가한다. 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨다. PBS와 0.5% Tween 20의 혼합물 중에 희석된 염소의 항-마우스 IgG 알칼리성 포스페이트(Southern Biotechnology)을 100μL/웰의 양으로 가하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨다. 칼러는 디에탄올아민 완충액 중의 p-니트로페놀 포스페이트 용액 1mg/ml의 100μL를 사용하여 전개시킨다. 이들 물질을 실온에서 60분 동안 반응시키고, 그 후 3N NaOH 50μL/웰을 가함으로써 반응을 종료시킨다. 흡광도 값은 405nm 시험 필터 및 690nm 기준 필터를 갖는 자동화된 ELISA 리더를 사용하여 측정한다.
0, 3, 6 및 8주에 R6 균주로부터 동종 LPS에 대한 DeA-LPS-SPDP-CRM 접합체의 면역원성을 나타내는 데이터를 표 1에 나타낸다. 이러한 데이터로부터 알 수 있듯이, 접합체는 현저한 상승하는 IgG 항체 반응을 유도한다.
면역원 하기 주에서 R6 LPS에 대한 IgG 항체 반응*
0주 3주 6주 8주
LPSLPS + QS-21DeA-LPS+QS-21DeA-LPS-SPDP-CRM197+QS-21CRM197+QS-21 <50 365 769 17,633<50 1,079 24,225 84,491ND ND ND 221<50 203 6,647 56,062<50 <50 <50 <50
DeA-LPS: 데-O-아실화된 LPS, 접합되지 않음
DeA-LPS-SPDP: 활성화된 데-O-아실화된 LPS, 접합되지 않음
DeA-LPS-SPDP-CRM: SPDP에 의해 CRM197에 접합된 데-O-아실화된 LPS
ND - 행해지지 않음
* 이 값은 희석된 혈청이 0.1의 O.D. 값을 제공하는 희석 종료점을 나타낸다.
나이세리아 메닌기티디스의 여러 가지 균주의 이종 LPS에 대한 본 실시예에서 생산된 접합체의 교차 반응성 면역원성은 상기 방법에 따라 조사하여 얻어진 데이터를 표 2에 나타낸다. 조사된 균주는 A1, R6, H44/76, 2996, 면역형 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L10, L11 및 L12이다. 표 2에 나타낸 바와 같이, LPS-단백질 접합체는 접합되지 않은 LPS에 비해 특히 현저한 항체 반응을 초래한다.
균주 DeA-LPS-SPDP DeA-LPS-SPDP-CRM197
R6A1H44/762996L1L2L3L4L5L6L7L8L10L11L12 443<100147<100<100350304412259129<100232141<100142 33,06736,92324,81111,46711,96345007,93612,82016,25111,60016,53316,27811,98232004,870
DeA-LPS-SPDP: 활성화된 데-O-아실화된 LPS, 접합되지 않음
DeA-LPS-SPDP-CRM: SPDP에 의해 CRM197에 접합된 데-O-아실화된 LPS
항-LPS 접합체 항혈청(DeA-LPS-SPDP-CRM에 대한 항혈청)의 교차 반응성은 여러 가지 그람 음성균의 여러 가지 균주로부터 정제된 LPS에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 조사한다. 나이세리아 메닌기티디스, 헤모필루스 인플루엔자에, 나이세리아 고노르호에아에, 모락셀라 카타르할리스 및 헬리코박터 필로리의 정제된 LPS 샘플은 먼저 프로테아제로 분해시키고, 표준 SDS-PAGE(18%) 분리 과정에 적용시킨다. 이어서 샘플을 표준 웨스턴 블롯 방법에 의해 니트로세포룰로스막에 옮겼다. 막을 PBS/0.05% Tween 20의 혼합물 중의 3% 송아지 혈청 알부민(BSA)으로 30분 동안 봉쇄시키고, 시험 마우스 혈청의 1:100 희석액과 반응시킨다. 이어서, 블롯들을 PBS/0.05% Tween 20의 혼합물로 세척하고, PBS/0.05% Tween 20의 혼합물 중에 희석된 염소의 항-마우스 IgG 알칼리성 포스페이트로 인큐베이션시킨다. 세척 공정에 이어, 블롯들을 제조업자(Kirkegaard 및 Perry Laboratories, Inc., MD)에 의해 기재된 바의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트(BCIP)/니트로블루 테트라졸륨 농축물(NBT) 포스파타제 기질 시스템을 사용하여 전개시킨다. 이러한 전개 방법은 유리 용기중에서 BCIP와 NBT 농축물 각각 1부와 Tris 완충 용액 10부를 혼합시키는 단계 및 이들 혼합물을 블롯에 가하는 단계를 포함한다. 컬러 전개 후, 반응은 시약 품질의 물로 블롯을 헹굼으로써 종료시킨다.
도 4로부터 알 수 있듯이, 헬리코박터 필로리를 제외하고, 각각의 유기체의 LPS는 항혈청과 강하게 반응한다. 강하지 못하지만, 헬리코박터 필로리로부터 LPS에 대한 약간의 교차 반응성이 있는 것으로 보인다. 이들 결과는 나이세리아 메닌기티디스의 LPS 접합체로부터 생성된 항체가 많은 다른 그람 음성균과 교차 반응함을 분명히 나타낸다.
항혈청의 살균 활성은 R6 균주, 그룹 A 균주(A1) 및 2개의 그룹 B 균주: H44/76 및 2996을 사용하여 추가로 조사한다. 혈청 샘플을 PCM(Ca 및 Mg를 함유하는 PBS) 5μl에 희석시키고, 이 희석액을 2-5x103나이세리아 메닌기티디스(10μl), 사람 혈청 보체(10μl) 및 PCM(25μl)를 함유하는 반응 혼합물에 가한다. 이어서, 이 혼합물을 5% CO2중에서 36℃에서 45분 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, PBS 200μl로 희석시킴으로써 반응을 종료시킨다. 2 분량(50μl)의 혼합물을 GC 한천 플레이트 상에 판금하고, 5% CO2중에서 36℃에서 추가로 인큐베이션시킨다. 살균 역가(BC50)를 측정한다. 살균 역가는 분석에서 나이세리아 메닌기티디스를 형성하는 클로니의 50%를 치사시키는 항혈청의 역 희석을 나타낸다. 데이터를 아래 표 3에 기재한다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 접합체 항혈청은 상이한 LPS 면역형을 발현시키는 세균을 치사시킬 수 있다. 이러한 접합체들은 상승되는 T 세포 의존형 IgG 반응을 유도한다.
BC50역가
면역원 균주H44/76 균주2996 균주A1 *균주R6
LPSDeA-LPS-SPDPDeA-LPS-SPDP-CRM197정상 마우스의 혈청 <50<5050<50 <50<5070<50 <50<50350<50 <50ND<50<50
* 양성 대조군 항혈청(마우스의 항-A1 LPS)이 분석에 사용되었으며, 100의 역가를 제공한다.
ND-행해지지 않음
DeA-LPS-SPDP: 활성화된 데-O-아실화된 LPS, 접합되지 않음
DeA-LPS-SPDP-CRM: SPDP에 의해 CRM197에 접합된 데-O-아실화된 LPS
따라서, 본 발명의 항원성 접합체가 주어진 세균 유기체의 LPS에 대한 현저한 면역 반응을 초래하는 것을 상기한 데이터로부터 용이하게 알 수 있다. 더욱이, 이 데이터는 본 발명의 접합체가 상이한 종의 세균 유기체에 대해서 뿐만 아니라 세균 유기체의 상이한 균주에 대해서 교차 반응성 반응을 유도하는 것을 나타낸다.
본 발명은 본 발명의 정신 및 본질에서 벗어나지 않는 다른 특정 형태로 실시될 수 있고, 따라서, 본 발명의 범위를 나타내는 바와 같이 상기 명세서에 대해서보다는 첨부된 특허청구범위에 대한 참고가 이루어져야 한다.
본 발명의 접합체는 상이한 종의 세균 유기체에 대해서 뿐만 아니라 세균 유기체의 상이한 균주에 대해서 교차 반응성 반응을 유도하는 것을 나타낸다.

Claims (18)

  1. 그람 음성균의 리포폴리사카라이드의 보존된 부분에 공유 결합된 캐리어 단백질을 포함하고, 여기서, 리포폴리사카라이드의 보존된 부분이 리포폴리사카라이드의 내부 코어 및 지질 A부를 포함하며, 그람 음성균의 이종 균주에 대한 교차 반응성 면역 반응을 유도하는 항원성 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 그람 음성균의 이종 속에 대한 교차 반응성 면역 반응을 유도하는 항원성 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 리포폴리사카라이드가 데-O-아실화되는 항원성 접합체.
  4. 제1항에 있어서, 캐리어 단백질이 파상풍 독소 또는 변성 독소, 디프테리아 독소 또는 변성 독소, 디프테리아 독소 CRM197의 돌연변이체, 슈도모나스 외독소 A, 콜레라 독소 또는 변성 독소, 그룹 A 스트렙토코칼(streptococcal) 독소, 스트렙토코커스 뉴모네아에의 뉴몰리신(pneumolysin ofStreptococcus pneumoneae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)의 섬유상 헤마글루티닌(FHA), FHA 단편들; 나이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae)의 선모 또는 필린(pilin); 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)의 선모 또는 필린; 나이세리아 메닌기티디스의 외막 단백질, 나이세리아 고노르호에아에의 외막 단백질; 스트렙토코커스의 C5A 펩티다제 및 모락셀라 카타르할리스의 표면 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원성 접합체.
  5. 제1항에 있어서, 캐리어 단백질이 술포숙신이미딜-6-(3-[2-피리딜디티오]프로피온아미도)-헥사노에이트(술포-LC-SPDP), 숙신이미딜-6-(3-[2-피리딜디티오]프로피온아미도)-헥사노에이트(LC-SPDP), 트라우트(Traut) 시약(2-이미노티올란), N-숙신이미딜-S-아세틸 티오아세테이트(SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜 디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜 아세틸 티오프로피오네이트(SATP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도 메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 말레이미도 벤조일-N-하이드록시 숙신이미드 에스테르(MBS), N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트(SIAB), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(SMPB), 브로모아세트산-N-하이드록시 숙신이미드(BANS) 에스테르, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노 프로필) 카보디이미드(EDAC), 아디프산 디하이드라지드(ADH), 시스타민 및 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물로 리포폴리사카라이드의 보존된 부분에 결합되는 항원성 접합체.
  6. 제1항에 있어서, 그람 음성균이 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 나이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 형별 불능 헤모필루스 인플루엔자에, 헤모필루스 두크레이(Haemophilus ducreyi), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클라미디아(Chlamydia), 살모넬라(Salmonella), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 시겔라(Shigella), 클레브시엘라(Klebsiella) 및 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원성 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 그람 음성균이 나이세리아 메닌기티디스인 항원성 접합체.
  8. 장쇄 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피온네이트 및 브로모아세트산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르에 의해 나이세리아 메닌기티디스의 리포폴리사카라이드의 보존된 부분에 공유 결합된 캐리어 단백질 디프테리아 독소 CRM197를 포함하고, 여기서, 리포폴리사카라이드의 보존된 부분이 리포폴리사카라이드의 내부 코어 및 지질 A부를 포함하며, 나이세리아 메닌기티디스 속의 이종 균주에 대한 교차 반응성 면역 반응을 유도하는 항원성 접합체.
  9. 제8항에 있어서, 그람 음성균의 이종 속에 대한 교차 반응성 면역 반응을 유도하는 항원성 접합체.
  10. 제1항의 항원성 접합체를 유효량 포함하는 백신 제형.
  11. 제2항의 항원성 접합체를 유효량 포함하는 백신 제형.
  12. 제8항의 항원성 접합체를 유효량 포함하는 백신 제형.
  13. 제9항의 항원성 접합체를 유효량 포함하는 백신 제형.
  14. 그람 음성균의 리포폴리사카라이드의 보존된 부분에 공유 결합된 캐리어 단백질을 포함하고, 여기서, 리포폴리사카라이드의 보존된 부분이 리포폴리사카라이드의 내부 코어 및 지질 A부를 포함하며, 그람 음성균의 이종 균주에 대한 교차 반응성 면역 반응을 유도하는 항원성 접합체를 포함하는 예방 유효량의 백신 제형으로 개체를 백신 접종하는 단계를 포함하는, 그람 음성 병원체에 의해 유발되는 질병을 예방하기 위한 개체의 면역 방법.
  15. 제14항에 있어서, 백신 제형이 피내 투여, 근육내 투여, 복막내 투여, 정맥내 투여, 질내 투여, 피하 투여, 안내 투여, 비내 투여 및 경구 투여로 이루어진 그룹으로부터 선택된 투여 경로에 의해 개체에 투여되는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 백신 제형이 생리학적 담체 및 보조제를 추가로 포함하는 방법.
  17. 그람 음성균의 리포폴리사카라이드의 보존된 부분에 공유 결합된 캐리어 단백질을 포함하고, 여기서, 리포폴리사카라이드의 보존된 부분이 리포폴리사카라이드의 내부 코어 및 지질 A부를 포함하며, 그람 음성균 유기체의 이종 균주에 대한 교차 반응성 면역 반응을 유도하는 항원성 접합체를 포함하는 유효량의 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 세균성 패혈증의 예방을 요하는 포유 동물에서의 세균성 패혈증의 예방 방법.
  18. 그람 음성균의 리포폴리사카라이드의 보존된 부분에 공유 결합된 캐리어 단백질을 포함하고, 여기서, 리포폴리사카라이드의 보존된 부분이 리포폴리사카라이드의 내부 코어 및 지질 A부를 포함하며, 그람 음성균 유기체의 이종 속에 대한 교차 반응성 면역 반응을 유도하는 항원성 접합체를 포함하는 유효량의 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 세균성 패혈증의 예방을 요하는 포유 동물에서의 세균성 패혈증의 예방 방법.
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