ES2241240T3 - Conjugador antigenicos de lipooligosacaridos conservados de bacterias gramnegativas. - Google Patents
Conjugador antigenicos de lipooligosacaridos conservados de bacterias gramnegativas.Info
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Abstract
SE PROPORCIONAN CONJUGADOS ANTIGENICOS QUE COMPRENDEN UNA PROTEINA PORTADORA, FIJADA DE MANERA COVALENTE A LA PARTE CONSERVADO DE UN LIPOPOLISACARIDO DE UNA BACTERIA GRAM-NEGATIVA, CARACTERIZADOS PORQUE DICHA PARTE CONSERVADA DEL LIPOPOLISACARIDO COMPRENDE EL NUCLEO INTERIOR Y LAS PARTES DE LIPIDO A DE DICHO LIPOPOLISACARIDO, PROVOCANDO EL CITADO CONJUGADO UNA RESPUESTA INMUNE REACTIVA CRUZADA CONTRA CEPAS HETEROLOGAS DE LAS CITADAS BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS.
Description
Conjugados antigénicos de lipooligosacáridos
conservados de bacterias gramnegativas.
La presente invención se refiere a conjugados
antigénicos de la porción conservada de los lipopolisacáridos de
ciertas bacterias gramnegativas, y a vacunas que contienen dichos
conjugados antigénicos. Los conjugados generan anticuerpos que
presentan reactividad cruzada contra cepas heterólogas de bacterias
gramnegativas, y las vacunas que contienen dichos conjugados
provocan la formación de anticuerpos que son funcionales y que
protegen contra dichos organismos bacterianos gramnegativos.
Los lipopolisacáridos (LPS) son importantes
antígenos de superficie presentes abundantemente en la superficie de
bacterias gramnegativas. Las moléculas de LPS constan de: (1) una
porción de lípido A que comprende un disacárido de glucosamina
sustituida con fosfatos, grupos de fosfoetanolamina y ácidos grasos
de cadena larga en enlaces éster y amida; (2) una porción del núcleo
interno unida a la porción del lípido A mediante un azúcar de ocho
carbonos, cetodesoxioctonoato (KDO), que puede estar sustituido por
1 a 2 moléculas adicionales de KDO y por hasta 3 grupos de heptosa;
(3) una porción del núcleo externo que comprende hexosas tales como
glucosa, galactosa, N-acetilglucosamina y
N-acetilgalactosamina; y (4) una cadena O específica
que comprende unidades repetidas de oligosacáridos que varían
ampliamente entre las cepas bacterianas. La polimerización de estas
unidades repetidas para formar estructuras de más de 60.000 daltons
no es inusual. Las moléculas de LPS pueden variar considerablemente
en sus características estructurales y antigénicas entre las cepas
bacterianas, aunque la estructura del núcleo interno está en gran
medida conservada entre las especies bacterianas. Una estructura
típica del núcleo interno de lípido-A del LPS de
Salmonella typhimurium se ilustra en la Figura 1. Se cree que
la respuesta inmunitaria responsable de la evolución de los
anticuerpos protectores naturales surge por inmunización natural
contra esta región del LPS.
En patógenos no entéricos, la estructura del LPS
carece de unidades repetidas del antígeno O. Es más, la maquinaria
genética completa para el ensamblaje de las unidades repetidas del
antígeno O parece estar ausente en dichos patógenos, por lo que
estas estructuras de LPS se han denominado lipooligosacáridos (LOS).
Existen similitudes entre las estructuras de LPS y LOS en dichos
patógenos. Por ejemplo, todas las estructuras de LPS y LOS enlazan
las regiones del lípido A a los núcleos por medio de un puente de
KDO. El número de residuos de KDO puede variar desde uno (por
ejemplo, Haemophilus influenzae y Haemophilus ducreyi)
a dos (por ejemplo, Neisseria meningitidis y Neisseria
gonorrhoeae). Los estudios recientes indican que los
oligosacáridos ramificados se sintetizan de forma independiente de
la región del núcleo, y que el ensamblaje de toda la estructura del
LOS se completa en la zona externa de la membrana citoplásmica
(véase Preston, et al., "The Lipooligosaccharides of
Pathogenic Gram-Negative Bacteria", Critical
Reviews In Microbiology, 22:139-180 (1996)).
Por consiguiente, hay una sola región del núcleo
en dichas estructuras de LOS, sin regiones del núcleo internas y
externas distintas. La estructura del núcleo de estos patógenos
puede variar de una especie a otra, y puede comprender KDO con
ausencia total de heptosa (por ejemplo, Moraxella
catarrhalis); KDO en presencia de una estructura de
di-heptosa (por ejemplo, Neisseria
meningitidis y Neisseria gonorrhoeae); o KDO en presencia
de una estructura de tri-heptosa (por ejemplo,
Haemophilus influenzae y Haemophilus ducreyi).
Ejemplos de las estructuras del núcleo de Haemophilus y
Neisseria se presentan en la Figura 2. Las unidades de
oligosacárido pueden extenderse a partir de cada una de las heptosas
y/o pueden estar sustituidas por grupos de fosfoetanolamina.
Ejemplos típicos de estructuras completas de LOS de la cepa 2019 de
Haemophilus influenzae (véase Phillips et al.,
"Structural Characterization of the Cell Surface
Lipooligosaccharides from a Non-Typable Strain of
Haemophilus Influenzae," Biochemistry,
31:4515-4526 (1992)) y la cepa 1291 de Neisseria
gonorrhoeae (véase John et al., "The Structural Bases
for Pyocin Resistance in Neisseria gonorrhoeae
lipooligosaccharides," J. Biol. Chem.,
266:1903-1911 (1991)) se muestran en en la Figura
3.
La utilización de LPS en el desarrollo de vacunas
es conocida en la técnica. Hace tiempo que se ha reconocido que una
respuesta de anticuerpos específicos dirigidos contra el LPS de un
patógeno bacteriano particular puede contribuir a conferir
protección contra la cepa específica. También se sabe que las
estructuras de sacáridos (por ejemplo, las porciones sacáridas del
LPS) pueden conjugarse con una proteína transportadora, de modo que
la composición de vacuna que contiene dicho conjugado provoque la
respuesta deseada dependiente de linfocitos T. Un ejemplo de lo
anterior lo constituyen las vacunas eficaces con glucoconjugado
contra bacterias que presentan sacáridos de la cápsula específicos
de tipo; véase, Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant
Approach, Powell, M.F. y Newman, M.J., 673-694
(1995). Esta categoría de respuesta inmunitaria es la base de la
eficacia en niños de una nueva generación de vacunas con conjugado
sacárido-proteína, que se examinan en Vaccine
Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M.F. y
Newman, M.J., 695-718 (1995).
Sin embargo, dado que los LPS de cepas
heterólogas de dichos patógenos presentan una considerable variación
del sacárido y/o la cadena específica O del núcleo externo, los
esfuerzos para generar una respuesta de anticuerpos contra diversas
cepas heterólogas o géneros heterólogos de bacterias utilizando una
vacuna que contiene un único LPS no han tenido éxito hasta el
presente.
Con el objeto de desarrollar una vacuna basada en
LPS contra Neisseria meningitidis, se ha conjugado el toxoide
tetánico con oligosacáridos aislados a partir de LPS de varias cepas
de Neisseria meningitidis (véase, Jennings et al.,
Infect. Immun., 43:407-412 (1984)). Sin
embargo, los anticuerpos generados por este conjugado eran
específicos de oligosacáridos y presentaban una alta especificidad
de serotipo.
Verheul et al., Infect. Immun.,
61:187-196 (1993), describen la conjugación de
oligosacáridos de LPS de meningococos bien con el toxoide tetánico o
bien con la proteína de la membrana externa de meningococos. En
ratones, los conjugados con toxoide tetánico generaron anticuerpos
específicos de oligosacáridos que no eran bactericidas contra los
meningococos. Los conjugados de proteína de la membrana externa -
LPS generaron anticuerpos contra la proteína de la membrana externa,
pero no contra el LPS. Verheul et al., Infect. Immun.,
59:843-851 (1991), también describieron la
inmunogenicidad de los conjugados de oligosacáridos de varias cepas
de Neisseria meningitidis y toxoide tetánico en conejos. Los
resultados demostraron que los anticuerpos generados están dirigidos
solamente contra la porción oligosacárida del LPS que contiene
epítopos específicos de inmunotipo.
La preparación de oligosacáridos procedentes del
LPS de la cepa salvaje A1, adaptada al laboratorio, de Neisseria
meningitidis y la conjugación subsiguiente de la misma con el
toxoide tetánico como proteína transportadora fue descrita en Gu
et al., Infect. Immun., 61:1873-1880
(1993). Los conjugados fueron inmunogénicos en ratones y conejos, y
la mayoría de los anticuerpos estaban dirigidos contra epítopos de
LPS específicos de inmunotipo. Asimismo, los antisueros contra el
conjugado presentaron menor reactividad cruzada contra diferentes
inmunotipos de LPS que los antisueros contra el LPS. Estos estudios
demuestran que los conjugados con oligosacáridos procedentes de LPS
generan anticuerpos contra el inmunotipo de oligosacárido
específico. Sin embargo, no hubo indicios de que el conjugado
generase cantidades significativas de anticuerpos de reacción
cruzada contra una estructura nuclear común de sacáridos presente en
la mayoría de las cepas de Neisseria meningitidis.
Verhaul et al., Microbiological
Reviews., 57(1):34-39 (1993), presentan
una revisión del componente superficial del LPS de N.
meningitidis.
Baker et al., Infection and
Immunity, 2257-2269, junio de 1994, examinan las
estructuras moleculares que influyen en las propiedades
inmunomoduladoras de los oligosacáridos del Lípido A y de la región
del núcleo interno de lipopolisacáridos bacterianos. Se afirma que
la estructura mínima que parece ser necesaria para la expresión de
la inmunosupresión añadida observada es un hexasacárido que contiene
un residuo de 2-ceto-desoxioctanato,
dos residuos de glucosa y tres residuos de heptosa a los que están
unidos dos grupos de pirofosforiletanolamina.
Bhattacharjee et al., J. Infect.
Dis., 173:1157-1163 (1996), describieron la
mezcla de LPS de Escherichia coli con la proteína de la
membrana externa de Neisseria meningitidis grupo B, que da
lugar a la formación de complejos de los mismos no conjugados y no
covalentes. Se comprobó que estos complejos generaban anticuerpos
que presentaban reactividad cruzada con varias bacterias
gramnegativas. Sin embargo, no se proporcionaron pruebas que
indicasen que estos complejos tenían propiedades diferentes a las de
otras preparaciones de estructuras sacáridas no conjugadas, que se
sabe que son incapaces de generar una respuesta de anticuerpos
dependiente de linfocitos T susceptible de ser potenciada tras la
administración de dosis posteriores. Es más, se sabe que dichos
sacáridos no conjugados no generan una respuesta inmunitaria
apropiada en niños.
Gu et al., Infect. Immun.,
64:4047-4053 (1996), describen la preparación de
conjugados de oligosacáridos a partir de Haemophilus
influenzae no tipificable y toxoide tetánico. Sin embargo, los
antisueros generados en conejos demostraron actividad bactericida
sólo contra cepas homólogas.
Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad
de obtener conjugados antigénicos y vacunas que contienen dichos
conjugados que sean capaces de generar de forma eficaz una respuesta
inmunogénica, preferiblemente una respuesta dependiente de
linfocitos T, contra una especie dada de bacterias gramnegativas, y
que presenten también reactividad cruzada eficaz contra cepas o
serotipos heterólogos de bacterias gramnegativas pertenecientes a un
género dado. Es más, sería ventajoso que dichos conjugados y vacunas
generasen anticuerpos que presenten reactividad cruzada contra
géneros heterólogos de bacterias gramnegativas.
La presente invención se refiere a conjugados
antigénicos que comprenden una proteína transportadora unida
covalentemente a la porción conservada del LOS de una bacteria
gramnegativa patógena no entérica, en los que la porción conservada
del LOS comprende
GlcNAc-Hep_{2}fosfoetanolamina-KDO_{2}-Lípido
A. El conjugado genera una respuesta inmunitaria cruzada contra
cepas heterólogas de bacterias gramnegativas y, preferiblemente,
contra géneros heterólogos de bacterias gramnegativas.
La presente invención se refiere, además, a
vacunas que comprenden dichos conjugados antigénicos y a métodos
para inmunizar individuos con dichas vacunas destinado a prevenir
varias enfermedades causadas por bacterias gramnegativas.
La Figura 1A muestra la estructura típica del
núcleo interno con el lípido A de Salmonella typhimurium.
La Figura 1B muestra las estructuras típicas del
antígeno O, o polisacárido repetido de Salmonella
typhimurium.
La Figura 1C muestra una estructura del
heptaacil-Lípido A de Salmonella
typhimurium.
La Figura 2A muestra la estructura del núcleo del
LOS de especies de Haemophilus.
La Figura 2B muestra la estructura del núcleo del
LOS de especies de Neisseria.
La Figura 3A muestra la estructura del LOS de la
cepa 2019 de Haemophilus influenzae.
La Figura 3B muestra la estructura del LOS de la
cepa 1291 de Neisseria gonorrhoeae.
La presente invención se refiere a conjugados
antigénicos de una proteína transportadora y el LOS conservado de
bacterias gramnegativas patógenas no entéricas, en los que dicha
porción conservada del LOS comprende
GlcNAc-Hep_{2}fosfoetanolamina-KDO_{2}-Lípido
A, en los que dicho conjugado genera una respuesta inmunitaria de
reacción cruzada contra cepas heterólogas de dichas bacterias
gramnegativas, y a vacunas que contienen dichos conjugados. Los
conjugados de la presente memoria utilizan los LOS de varias
bacterias gramnegativas, incluidas, sin limitarse a las mismas:
Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae,
Haemophilus influenzae, Haemophilus influenzae no
tipificable, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori,
Chlamydia, Proteus mirabilis, Pseudomonas
aeruginosa, Moraxella catarrhalis, Bordetella
pertussis, Klebsiella y Vibrio cholerae.
Los conjugados mencionados en la presente memoria
y las vacunas que contienen dichos conjugados generan una respuesta
de anticuerpos policlonales funcionales contra la porción conservada
del LOS contenida en los conjugados. Por tanto, las vacunas son
capaces de reaccionar contra un gran número de cepas heterólogas de
patógenos, induciendo de este modo una respuesta de anticuerpos de
reacción cruzada y funcional contra diferentes cepas de bacterias
gramnegativas. Esta respuesta de reacción cruzada se demuestra tanto
contra cepas heterólogas pertenecientes a un género dado, como
contra géneros heterólogos de bacterias gramnegativas.
La presente invención se refiere, por tanto, a
conjugados antigénicos que generan una respuesta de anticuerpos
contra las porciones comunes conservadas del LOS de una bacteria
gramnegativa, es decir, las porciones del LOS que son comunes a
varias bacterias gramnegativas.
Como se ha mencionado anteriormente, los LPS de
bacterias gramnegativas comprenden la porción del núcleo interno, la
porción de Lípido A, la porción del núcleo externo, y el antígeno O
específico. Para generar una respuesta contra cepas o géneros
heterólogos de bacterias, la estructura de las porciones del núcleo
interno y del lípido A deben estar conservadas y utilizadas.
El término "porción conservada" del LOS, tal
y como se utiliza en la presente memoria, incluye por lo menos el
disacárido de glucosamina sustituido con fosfatos, grupos
fosfoetanolamina y ácidos grasos de cadena larga en enlaces éster y
amida (es decir, la porción del lípido A); y la función KDO del
núcleo interno y los sustituyentes de heptosa, si están presentes.
Los grupos fosfato, fosfoetanolamina y pirofosfoetanolamina que
puedan estar contenidos en el núcleo interno también pueden
incluirse en la "porción conservada", aunque pueden no ser
necesarios. La porción del patógeno contenida en la "porción
conservada" está altamente conservada entre cepas bacterianas y,
por tanto, pueden generarse anticuerpos de amplia reactividad
cruzada a partir de estas estructuras (véase, por ejemplo, Apicella
et al.,"The Normal Human Serum Bactericidal Antibody
Response to the Lipooligosaccaride de Neisseria
gonorrhoeae", J. Infect. Dis.,
153:520-528 (1986).
También se encuentra dentro del alcance de la
presente invención que los oligosacáridos de cepas que portan LOS
puedan estar conservados como parte de la "porción conservada",
tal como se ha definido en la presente memoria. No obstante, esto no
es necesario ni incluso deseable en muchos casos.
Los inventores de la presente invención han
comprobado que la generación de un conjugado que utiliza dicha
porción conservada de la estructura del LOS provoca una respuesta de
IgG, potenciable, dependiente de linfocitos T en el individuo
sometido a tratamiento, y que los anticuerpos resultantes reaccionan
de forma cruzada con la superficie de cepas heterólogas
pertenecientes a un género bacteriano particular, así como con
géneros heterólogos de bacterias gramnegativas. Es más, se ha
comprobado que los anticuerpos que reaccionan con la superficie,
generados por los conjugados de la presente memoria, son tanto
bactericidas (es decir, demuestran una propiedad funcional asociada
a la inmunoprotección) como protectores.
Las porciones conservadas del LOS utilizadas en
los conjugados de la presente memoria pueden prepararse mediante
diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por
ejemplo, la estructura conservada puede prepararse por: (1) síntesis
química de toda o parte de la estructura conservada del núcleo, (2)
selección de cepas de tipo salvaje que producen LOS que contienen
predominantemente la estructura conservada, (3) escisión enzimática
de residuos de azúcar no reductor de LOS sintetizados por cepas de
tipo salvaje, y (4) síntesis de la estructura conservada del LOS de
un organismo bacteriano dado por varios mutantes y progenies
derivadas de dichos mutantes, tales como los descritos en la
publicación de la solicitud PCT nº WO97/19688 (por ejemplo, la
producción de la porción conservada del núcleo del LOS de
Neisseria meningitidis por cepas mutantes que presentan un
defecto en la biosíntesis de LOS; la producción de mutantes de LOS
de Neisseria gonorrhoeae mediante exposición de las cepas de
tipo salvaje a piocina, y las progenies derivadas de dichos
mutantes; la generación de mutaciones, inducidas por transposones,
de enzimas específicas involucradas en la biosíntesis de LOS; y las
mutaciones dirigidas de enzimas específicas involucradas en la
biosíntesis de LOS y las progenies derivadas de dichas cepas
mutantes).
El método preferido de preparación de las
porciones conservada del LOS para su utilización en los conjugados
de la presente memoria es la síntesis de la porción conservada del
LOS por medio de cepas bacterianas mutantes y sus progenies (ruta 4
anterior). Más preferiblemente, se utilizan las siguientes cepas
mutantes para sintetizar la porción conservada del LOS: organismos
que expresan sólo los sacáridos del núcleo conservado del LOS, tales
como los organismos con núcleo R_{a} que no añaden glucosa a la
porción del núcleo del LOS; organismos que no añaden galactosa a la
porción del núcleo del LOS, tales como la cepa mutante 281.25 de
Haemophilus influenzae de tipo b, como se describe en
Biochemistry, 35:5837-5947 (1996); organismos
que no añaden glucosa a la porción del núcleo del LOS debido
mutaciones en el gen de la fosfoglucomutasa (PGM), tales como la
cepa NMB R6 de Neisseria meningitidis y la cepa
1291-R6 de Neisseria gonorrhoeae descritas en
J. Biol. Chem., 269:11162-11169 (1994);
organismos que no añaden galactosa a la porción del núcleo del LOS
debido mutaciones en el gen de la
galactosa-epimerasa (GalE), tales como la cepa
mutante SS3 de Neisseria meningitidis descrita en Infect.
Immun., 63:2508-2515 (1995); y organismos que no
añaden glucosa o galactosa a la porción del núcleo del LOS debido
mutaciones en las enzimas transferasas correspondientes, tales como
mutaciones en la enzima transferasa correspondiente, tales como
mutaciones en los genes de la glucosil- o
galactosil-transferasa descritas en J. Exp.
Med., 180:2181-2190
(1994).
(1994).
Los estudios realizados por Lee et al.,
Infect. Immun., 63:2508-2515 (1995) han
demostrado que una mutación en la
galactosa-epimerasa da lugar a la expresión de un
LPS que está truncado después del núcleo externo o las regiones
ramificadas que contienen glucosa. Un cribado de los mutantes,
generados con Tn916, de Neisseria meningitidis del grupo B
demostró que una cepa mutante estable del LOS (denominada cepa
NMB-R6) expresaba un núcleo profundo de LPS en la
estructura:
GlcNAc-Hep_{2}(PEA)-KDO_{2}-Lípido
A. Otros estudios han demostrado que el transposón se inserta en el
gen putativo de la fosfo-glucomutasa (véase J.
Biol. Chem., 269:11162-11169 (1994)). Los
extractos exentos de células de la cepa mutante no presentaron
actividad fosfo-glucomutasa. De forma similar, otra
mutación inducida por transposones elimina la actividad
UDP-glucosa-4 epimerasa.
La biosíntesis del LOS procede mediante la
síntesis inicial de la porción de Lípido A, seguido por la adición
sucesiva de residuos de azúcar al núcleo interno y después al núcleo
externo. Se sabe que la adición de unidades de hexosa, tales como
glucosa y galactosa, al núcleo (por ejemplo,
GlcNAc-Hep_{2}(PEA)-KDO_{2}-Lípido
A de Neisseria meningitidis) está catalizada por una serie de
enzimas involucradas en la biosíntesis. Por ejemplo, la glucosa es
convertida en glucosa-6-fosfato por
la glucoquinasa. Una enzima, la fosfo-glucomutasa,
convierte la glucosa-6-fosfato en
glucosa-1-fosfato, que después es
convertida en UDP-glucosa por la
UTP-glucosa-1-fosfato-uridil-tranferasa.
La UDP-glucosa también es convertida en
UDP-galactosa por la
UDP-glucosa-4-epimerasa.
Las unidades de hexosa de estos intermediarios de UDP se transfieren
después al núcleo del LOS mediante reacción catalizada por las
transferasas. La pérdida de estas actividades de transferencia, o de
las enzimas responsables de la generación de
UDP-glucosa y UDP-galactosa, da
lugar a la formación de estructuras de LOS que contienen solamente
el núcleo interno. La ruta necesaria para la síntesis del núcleo del
LOS no se vería afectada por la pérdida de
fosfo-glucomutasa,
UTP-glucosa-1-fosfato-uridil-transferasa,
UDP-glucosa-4
epimerasa, o las UDP-glucosa- o
UDP-galactosa-transferasas. Por
consiguiente, cualquier defecto en estas enzimas dará lugar a la
terminación de la cadena del LOS.
Aunque el LOS de una bacteria gramnegativa dada
puede utilizarse de cualquier forma para preparar los conjugados de
la presente memoria, es preferible que las porciones conservadas del
LOS de la presente invención estén
des-O-aciladan antes de la
conjugación. La estructura del LOS puede
des-O-acilarse de forma ventajosa
mediante hidrólisis alcalina suave de la misma con hidróxido de
sodio, como se escribe en, por ejemplo, J. Biol. Chem.,
250:1926-1932 (1975) y en J. Biol. Chem.,
256:7305-7310 (1981) o mediante tratamiento suave
con hidracina, como se escribe en, por ejemplo, Eur. J.
Biochem., 177:483-492 (1988). Se ha comprobado
que la des-O-acilación del LOS
mejora su inmunogenicidad y reduce su toxicidad. Como alternativa,
la porción no tóxica del LOS puede aislarse a partir de mutantes no
tóxicos de bacterias gramnegativas patógenas, por ejemplo, de la
forma descrita en el documento WO/97/19688.
Para la producción de los conjugados antigénicos
de la presente invención, la porción conservada del LOS se acopla a
una proteína transportadora por medio de un compuesto acoplante
apropiado. La utilización de dichos compuestos acoplantes es
conocida en la técnica, y se examina, por ejemplo, en Conjugate
Vaccines, Cruise et al., 48-114, Karger
Publishing (1989).
Por ejemplo, grupos reactivos de las porciones
del Lípido A o del núcleo interno de la estructura conservada del
LOS pueden unirse a agentes acoplantes heterobifuncionales y
homobifuncionales conocidos. Los agentes acoplantes
heterobifuncionales contienen extremos reactivos heterólogos y
producen intermediarios con el LOS conservado. Los intermediarios se
acoplan a un extremo del LOS mientras que el extremo opuesto
contiene un grupo reactivo. Los agentes acoplantes homobifuncionales
también contienen dos grupos reactivos; sin embargo, dichos grupos
son idénticos. En general, los agentes acoplantes conectan la
porción conservada del LOS a la proteína transportadora por medio de
grupos amino, hidroxilo o carboxilo. Los acoplamientos con grupos
amino e hidroxilo se forman con los sacáridos del lípido A o del
núcleo interno del LOS conservado. Los acoplamientos con grupos
carboxilo se forman con el KDO del núcleo interno. El extremo
opuesto del agente acoplante contiene preferiblemente un grupo
sulfhidrilo para la reacción posterior con la proteína
transportadora.
Agentes acoplantes adecuados para su utilización
en la presente invención incluyen, por ejemplo,
sulfosuccinimidil-6-(3-[2-piridilditio]propionamido)-hexanoato
(Sulfo-LC-SPDP);
succinimidil-6-(3-[2-piridilditio]propionamido)-hexanoato
(LC-SPDP); reactivo de Traut
(2-iminotiolano);
N-succinimidil-S-acetil-tioacetato
(SATA);
N-succinimidil-3-(2-piridil-ditio)propionato
(SPDP),
succinimidil-acetil-tiopropionato
(SATP),
succinimidil-4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxilato
(SMCC), éster de
maleimido-benzoil-N-hidroxi-succinimida
(MBS),
N-succinimidil-(4-iodoacetil)aminobenzoato
(SIAB),
succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato
(SMPB), éster de ácido
bromoacético-N-hidroxi-succinimida
(BANS),
1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-carbodiimida
(EDAC), dihidrazida del ácido adípico (ADH), cistamina y
ditiobis(succinimidil-propionato)
(DTSSP).
La porción conservada del LOS se deja reaccionar
con el agente acoplante en una solución tampón que no contiene amino
(tal como solución salina tamponada con fosfato o bicarbonato de
sodio) a un pH neutro a ligeramente alcalino durante un período de
tiempo adecuado (por ejemplo, aproximadamente una hora a temperatura
ambiente). Después se retira el intermediario del reactivo no
reaccionado mediante cualquier medio adecuado (por ejemplo,
filtración en gel). A continuación se activa la proteína
transportadora por reacción con un agente acoplante adecuado
seleccionado a partir del grupo mencionado anteriormente. El
intermediario de LOS conservado se hace reaccionar después con la
proteína transportadora activada, en condiciones adecuadas, para
producir los conjugados de la presente memoria.
En el caso del acoplamiento por medio de grupos
sulfhidrilo, el intermediario de LOS-agente
acoplante se hace reaccionar con un agente reductor adecuado o con
hidroxilamina, para reducir el enlace disulfuro del agente acoplante
y exponer los grupos sulfhidrilo libres. Los agente reductores
adecuados incluyen ditiotreitol (DTT) y mercaptoetanol. El
intermediario con grupos sulfhidrilo expuestos se hace reaccionar
después con una proteína transportadora activada para proporcionar
un conjugado unido covalentemente mediante enlace tioéter.
La formación de un conjugado antigénico por medio
de grupos sulfhidrilo se ilustra en el esquema presentado a
continuación:
Como alternativa, los aldehídos pueden exponerse
en la estructura del LOS por oxidación con peryodato de los grupos
vicinil-hidroxilo de las estructuras sacáridas, como
se escribe en, por ejemplo, Morrison, R. T. y Boyd, R. N.,
Organic Chemistry, Allyn and Bacon, Inc.,
875-905 (1966), o por tratamiento del LOS que
contiene una lactosa terminal no reductora o un residuo de
N-acetil-galactosamina con
galactosa-oxidasa, para transformar el grupo
hidroxilo de C-6 en un grupo aldehído, como se
describe, por ejemplo, en Avigaeld et al., J. Biol.
Chem., 237:2736, (1962). El LPS que contiene aldehído puede
después unirse a una proteína transportadora adecuada, por ejemplo,
por aminación reductiva.
En otro método alternativo, los conjugados de la
presente memoria pueden formarse por acoplamiento de la porción
conservada del LOS y la proteína transportadora mediante los grupos
carboxilo del LOS, utilizando un reactivo de carbodiimida tal como
clorhidrato de
1-etil-3-(dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDAC). En este método es preferible que los conjugados se preparen
por acoplamiento de los grupos carboxilo del sacárido del LOS a los
grupos carboxilo de la proteína transportadora. En este caso, el LOS
conservado se hace reaccionar primero con un compuesto acoplante
adecuado, tal como dihidrazida del ácido adípico (ADH) en presencia
de EDAC. La proteína transportadora puede hacerse reaccionar después
con el intermediario ADH-LOS en presencia de un
compuesto acoplante apropiado, tal como EDAC. Se obtiene un
conjugado acoplado con carboxilo.
La formación de un conjugado antigénico mediante
el acoplamiento de los grupos carboxilo se ilustra en el esquema
presentado a continuación.
En otra realización alternativa, los conjugados
de la presente memoria pueden formarse por acoplamiento de los
grupos carboxilo del sacárido del LOS a los grupos amino de una
proteína transportadora. En este caso, el LOS conservado se hace
reaccionar primero con cistamina en presencia de EDAC. El grupo
sulfhidrilo del intermediario cistamina-LOS se
expone utilizando un agente reductor, tal como ditiotreitol, y se
hace reaccionar finalmente con una proteína transportadora
bromo-acetilada.
Las proteínas transportadoras útiles en la
preparación de los conjugados antigénicos de la presente memoria
incluyen toxinas y toxoides bacterianos (por ejemplo, toxina o
toxoide tetánico, toxina o toxoide diftérico, mutantes no tóxicos de
la toxina diftérica CRM-_{197} (como se describe,
por ejemplo, en Immunochem., 9:891-906
(1972)), exotoxina A de Pseudomonas, toxina o toxoide
colérico, toxinas de estreptococos del grupo A, pneumolisina de
Streptococcus pneumoniae, etc.); hemaglutinina filamentosa
(FHA) o fragmento(s) de FHA de Bordetella pertussis;
pili o pilinas de Neisseria gonorrhoeae; pili o pilinas de
Neisseria meningitidis; proteínas de la membrana externa
bacteriana (por ejemplo, complejos de proteínas de la membrana
externa de Neisseria meningitidis (por ejemplo, tales como
proteína de la membrana externa de la clase 1 y proteína de la
membrana externa de la clase 3 de Neisseria meningitidis));
proteínas de la membrana externa de Neisseria gonorrhoeae;
peptidasa C5A de Streptococcus; y proteína superficial ubicua
de Moraxella catarrhalis. La proteína transportadora
preferida es CRM-_{197}.
Las vacunas que contienen los conjugados
antigénicos de la presente invención pueden contener, de forma
ventajosa, varios adyuvantes que se sabe que aumentan la respuesta
inmunitaria al antígeno de la vacuna. Se cree que dichos adyuvantes
aumentan la respuesta de anticuerpos mediante la estimulación no
específica del sistema inmunitario del paciente. La utilización de
adyuvantes es bien conocida en la técnica, y se describe, por
ejemplo, en "Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant
Approach", Powell et al., Plenum Press (1995). Ejemplos de
adyuvantes adecuados para su utilización en vacunas que contienen
los conjugados de la presente memoria incluyen: fosfato de aluminio,
hidróxido de aluminio, monofosforil-lípido A,
monofosforil-lípido A 3-desacilado,
QS-21 (como se describe en J. Immunol.,
146:431-437 (1991)), así como varios detergentes
(por ejemplo, Triton™X100, detergentes con zwitteriones, y
desoxicolato) en combinación con los compuestos de aluminio. En
general, la respuesta de anticuerpos a los conjugados de la presente
memoria se incrementa sustancialmente cuando se incluye uno o más
adyuvantes en la
vacuna.
vacuna.
Se sabe que muchos métodos son adecuados para la
administración de una formulación de vacuna a individuos que la
necesitan. Los métodos adecuados de administración incluyen la
administración por vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa, intraarterial, vaginal, subcutánea, ocular, intranasal
y oral.
Las formulaciones de vacunas que contienen los
conjugados antigénicos de la presente memoria pueden comprender el
conjugado en un vehículo aceptable desde el punto de vista
fisiológico, tal como solución isotónica, solución salina, solución
salina tamponada con fosfato, etc. La formulación de vacuna se
administra a un individuo en una cantidad eficaz desde el punto de
vista profiláctico.
Debido a su reactividad cruzada contra varias
especies bacterianas diferentes o heterólogas, los conjugados
antigénicos de la presente invención son eficaces como componentes
de vacunas para producir una reacción inmunológica en los seres
humanos contra la enfermedad causada por organismos bacterianos
productores de LPS. Las vacunas que contienen los conjugados de la
presente memoria pueden prepararse utilizando métodos y materiales
que son conocidos por los expertos en la materia.
Los anticuerpos generados por los conjugados de
la presente memoria pueden utilizarse para determinar si una
infección ha sido causada por un organismo bacteriano productor de
LOS analizando muestras sanguíneas, líquidos fisiológicos o muestras
de biopsias del individuo infectado. Las aplicaciones terapéuticas y
profilácticas incluyen la utilización de las vacunas de la presente
memoria, así como los anticuerpos obtenidos con las mismas. La
inmunización activa con los conjugados antigénicos de la presente
invención puede ser útil para la prevención de infecciones o
enfermedades bacterianas.
Las vacunas de la presente invención también son
útiles para la profilaxis del choque septicémico causado por varias
bacterias gramnegativas, por ejemplo, Neisseria,
Haemophilus, Klebsiella y Pseudomonas. Se ha
descubierto que, en algunos casos, se libera una cantidad
significativa de LOS de las células bacterianas muertas tras el
tratamiento con antibióticos convencionales: J. Infect. Dis.,
157:567-568 (1988), con lo que pueden presentarse
complicaciones, inducidas por endotoxinas, en estos pacientes.
Una estrategia destinado a prevenir el choque
septicémico y las complicaciones relacionadas con el mismo es la
administración al paciente de anticuerpos monoclonales o
policlonales contra la región nuclear común del LOS de las bacterias
potencialmente involucradas. Dicho antisuero puede prevenir los
efectos tóxicos de la producción excesiva de LOS por el organismo
bacteriano.
La presente invención se ilustra a continuación
mediante los siguientes ejemplos específicos, no limitantes.
Se construyó un mutante, inducido por Tn916, del
LOS de la cepa NMB-R6 de Neisseria
meningitidis siguiendo el procedimiento descrito en Zhou et
al., J. Biol. Chem. 269:11162-11169
(1994). Esta cepa es un mutante fenotípicamente estable que expresa
LOS con una masa molecular de aproximadamente 3,1 - 3,2 KDa. Se ha
demostrado que la incapacidad de esta cepa mutante para convertir la
glucosa-6-fosfato en
glucosa-1-fosfato da lugar a una
porción truncada del LOS que contiene solamente la estructura del
núcleo conservado del LOS de Neisseria meningitidis. La
estructura del LOS producido por esta cepa mutante ha sido
identificada como
GlcNAc-Hep_{2}fosfoetanolamina-KDO_{2}-Lípido
A.
Esta cepa mutante se cultivó en medio para placas
de agar GC durante 6 h a 35ºC en CO_{2} al 5%. Después se
cultivaron las células del cultivo de agar sólido durante 18 horas
en un medio líquido enriquecido que contenía dializado de extracto
de levaduras al 0,2%. El cultivo se transfirió a continuación a
matraces de Fernbach y se cultivó durante otras
18-24 horas. Después se mataron las células por
tratamiento térmico y se recogieron por centrifugación para la
purificación de la estructura del LOS.
Se extrajo el LOS de las células
NMB-R6 utilizando el método de extracción con fenol
caliente-agua, descrito en Wu et al.,
Anal. Chem., 160:298-289 (1987) y se purificó
por ultracentrifugación. Más específicamente, los sedimentos
celulares se suspendieron en 3 volúmenes (3 ml de tampón/g de peso
húmedo) de tampón fosfato (pH 7,1) que contenía EDTA 5 mM y azida de
sodio al 0,02%. Después se añadió lisozima (comercializada por Sigma
Chemical Co.) a la suspensión, a una concentración de 2 mg/ml. A
continuación se digirió esta mezcla durante toda la noche a 4ºC. La
suspensión se llevó a 37ºC y se digirió adicionalmente con RNAsa y
DNAsa a una concentración de 100 \mug/ml durante 3 horas. La
suspensión digerida se llevó después a 70ºC y se le añadió un
volumen igual de fenol a 70ºC. Esta mezcla se extrajo durante un
período de 15 minutos, y la suspensión se enfrió después hasta 4ºC y
se centrifugó a 10.000 x g durante 30 minutos. La fase acuosa se
recuperó y la fase fenólica se extrajo de nuevo con un volumen igual
de agua a 70ºC durante 15 minutos. Esta fase se centrifugó después a
10.000 x g durante 30 minutos, y después se separó la fase acuosa.
Se añadió acetato de sodio a los sobrenadantes acuosos combinados a
una concentración de 5 mg/ml. A continuación se añadieron a esta
mezcla dos volúmenes de acetona enfriada con hielo, y se dejó que el
LOS precipitase durante toda la noche a 4ºC. El LOS precipitado se
separó por centrifugación a 10.000 x g durante 30 minutos. El LOS
recuperado se resuspendió en agua estéril y se sometió a tres rondas
de ultracentrifugación a 105.000 x g durante tres horas. El
sedimento final se resuspendió en un pequeño volumen de agua estéril
para su utilización en experimentos posteriores. Típicamente, se
purificaron 3 mg de LOS a partir de 1 g de peso húmedo de células
NMB-R6.
El LOS purificado de la forma descrita
anteriormente, fue después
des-O-acilado haciéndolo reaccionar
con 45 mM de NaOH a 80ºC durante 20 minutos. El material
des-O-acilado se neutralizó después
con HCI y se purificó por filtración en gel en una columna de Biogel
P6 utilizando NaHCO_{3} 0,1 M como eluyente. El LOS
des-O-acilado (denominado en lo
sucesivo en la presente memoria "DeA-LOS") se
conjugó a continuación con la proteína transportadora CRM_{197}
por acoplamiento de los grupos amino de los sacáridos de la
estructura del LOS conservado a los grupos amino de la proteína
transportadora utilizando el procedimiento descrito más adelante. La
CRM_{197} es una proteína mutante no tóxica de la toxina
diftérica, y ha sido utilizada como proteína transportadora para la
producción comercial de vacunas de glucoconjugados para su
utilización en seres humanos.
Se utilizó el
sulfo-N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato
de cadena larga (sulfo-LC-SPDP,
comercializado por Pierce Chemical Company) para la transformación
en grupos tiolato del grupo o grupos amino primarios del
DeA-LOS. Se añadió
sulfo-LC-SPDP a 15 mg del LPS en
NaHCO_{3} 0,1 M (pH 7,9) en una relación de 1:1 (p/p). Esta mezcla
se incubó continuación durante una hora a temperatura ambiente. Al
final de la reacción, la mezcla se purificó en una columna de Biogel
P6 equilibrada en NaHCO_{3} 0,1 M. Las fracciones recuperadas
fueron analizadas en busca de KDO según el procedimiento descrito en
Keleti y Lederer, Biochem. Biophys.,
74:443-450 (1974), y las fracciones que contenían
KDO se mezclaron. Los
N-piridil-disulfuros presentes en
los derivados de SPDP del LOS fueron reducidos con ditiotreitol
(DTT) 50-100 mM y sometidos a filtración en gel en
una columna de Biogel P6 como se ha descrito anteriormente. El
material con grupos tiolato que contenía las fracciones positivas a
KDO se mezcló nuevamente. La adición de grupos tiolato a los
oligosacáridos del DeA-LOS se controló con arreglo a
la reacción descrita en Ellman, G. L., Arch. Biochem.
Biophys., 74:443-450 (1958). Se mezclaron 0,1 ml
del material con 0,1 ml de reactivo de Ellman (es decir, 40 mg de
ácido
5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)
en 10 ml de tampón fosfato pH 8,0). Tras 15 minutos de incubación,
la absorbancia se midió a 412 nm. Se utilizó cisteína como reactivo
sulfhidrilo estándar.
La proteína transportadora CRM_{197} se
bromoacetiló siguiendo el procedimiento descrito en Bernatowitz y
Matsueda, Anal. Biochem., 155:95-102 (1986).
Se añadió el éster de ácido
bromoacético-N-hidroxi-succinimida
(comercializado por Sigma Chemical Co.) en 100 mg/ml de
dimetil-formamida, gota a gota, a 3 ml de la
proteína (en NaHCO_{3} 0,1 M) en una relación de 1:1 (p/p) a 4ºC.
La solución se mezcló y se incubó durante 1 hora a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción se sometió después a filtración en
gel en una columna de Biogel P6 como se ha descrito anteriormente, y
se mezclaron las fracciones nulas que contenían la proteína
bromoacetilada. La derivatización de los grupos amino de la proteína
transportadora para formar grupos bromoacetilo se controló por el
descenso en la cantidad de grupos amino libres.
Después se añadió la CRM_{197} bromoacetiladaen
NaHCO_{3} 0,1 M al DeA-LOS con grupos tiolato en
una relación 1:1,5 de proteína a LOS (p/p) en NaHCO_{3} 0,1 M. La
mezcla de reacción se incubó durante toda la noche a 4ºC. El
conjugado final (denominado en lo sucesivo
"DeA-LOS -SPDP-CRM") se
purificó por filtración en gel en una columna de Biogel P30
(Bio-Rad) equilibrada en NaHCO_{3} 0,1 M/EDTA 1
mM, pH7-9.
La inmunogenicidad del conjugado de
DeA-LOS -SPDP-CRM preparado
anteriormente se determinó en ratones Swiss Webster con arreglo al
siguiente procedimiento. Se inmunizaron grupos de ratones hembras de
6-8 semanas de edad, 10 por grupo, por vía
subcutánea con 10 \mug de LOS, 10 \mug de
DeA-LOS, 10 \mug de
DeA-LPS-SPDP (es decir, el
intermediario no conjugado) y 10 \mug del conjugado
DeA-LOS-SPDP-CRM.
También se administraron 10 \mug de CRM_{197} a los ratones,
como testigo. Cada uno de estos inmunógenos contenía, además, 20
\mug de QS-21 (comercializado por Aquila), como
adyuvante en un volumen final de 0,1 ml de solución salina tamponada
con fosfato (PBS), por dosis. Se inmunizó un grupo adicional con 10
\mug de LOS sin el adyuvante QS21. Los animales fueron inmunizados
en las semanas 0, 3 y 6, y se extrajeron muestras de sangre antes de
cada inmunización, para la determinación de anticuerpos. También se
extrajeron muestras de sangre en la semana 8, para la determinación
de anticuerpos.
Los niveles de anticuerpos contra LOS fueron
determinados utilizando el procedimiento de análisis por
inmunoabsorción enzimática (ELISA) frente a LOS purificados de R6 y
otras cepas de tipo salvaje y específicas de inmunotipo de
Neisseria meningitidis identificadas más adelante. Las cepas
específicas de inmunotipo fueron obtenidas del Walter Reed Army
Medical Center, Washington. El LOS fue purificado a partir de estas
cepas utilizando el método de extracción con fenol
caliente-agua descrito anteriormente.
El LOS purificado fue diluido en PBS exenta de
endotoxinas hasta alcanzar las siguientes concentraciones:
10 \mug/ml para las cepas de Neisseria meningitidis A1, H44/76, 2996 y los inmunotipos L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L10, L11 y L12; y 2,5 \mug/ml para la cepa R6. Se recubrieron placas de microvaloración de poliestireno con 100 \mul por pocillo de las mezclas que contenían LOS diluido, y se incubaron durante 3 horas a 37ºC, y después se conservaron a 4ºC durante toda la noche. El LOS no unido se eliminó después de las placas mediante succión, utilizando un lavador de placas automático. Después se añadieron a las placas 150 \mul por pocillo de PBS/gelatina al 0,1%, y las placas se incubaron a continuación durante 60 minutos a 37ºC. Después de la incubación, y entre cada una de las etapas posteriores, se lavaron las placas con una mezcla de PBS y Tween 20 al 0,1% utilizando un lavador de placas automático.
10 \mug/ml para las cepas de Neisseria meningitidis A1, H44/76, 2996 y los inmunotipos L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L10, L11 y L12; y 2,5 \mug/ml para la cepa R6. Se recubrieron placas de microvaloración de poliestireno con 100 \mul por pocillo de las mezclas que contenían LOS diluido, y se incubaron durante 3 horas a 37ºC, y después se conservaron a 4ºC durante toda la noche. El LOS no unido se eliminó después de las placas mediante succión, utilizando un lavador de placas automático. Después se añadieron a las placas 150 \mul por pocillo de PBS/gelatina al 0,1%, y las placas se incubaron a continuación durante 60 minutos a 37ºC. Después de la incubación, y entre cada una de las etapas posteriores, se lavaron las placas con una mezcla de PBS y Tween 20 al 0,1% utilizando un lavador de placas automático.
Se sometió a diluciones sucesivas el suero de
prueba de ratón en una mezcla de PBS, Tween 20 al 0,05% y gelatina
al 0,1%. Se añadieron a las placas 100 \mul por pocillo de la
dilución. Las placas se incubaron durante 60 minutos a 37ºC. Después
se añadieron anticuerpos caprinos contra la IgG de ratón conjugados
con fosfatasa alcalina (de Southern Biotechnology), diluidos en una
mezcla de PBS y Tween 20 al 0,5%, en una cantidad de 100 \mul por
pocillo, y se incubó durante 60 minutos a 37ºC. El color se reveló
utilizando 100 \mul de una solución de 1 mg/ml de
p-nitrofenol-fosfato en un tampón de
dietanolamina. Se dejaron reaccionando estos materiales durante 60
minutos a temperatura ambiente, y después se paró la reacción
añadiendo 50 \mul por pocillo de NaOH 3 N. Los valores de
absorbancia se determinaron utilizando un lector automático de ELISA
con una prueba a 405 nm y un filtro de referencia a 690 nm.
Los datos que demuestran la inmunogenicidad del
conjugado de
DeA-LOS-SPDP-CRM
contra LOS homólogos de la cepa R6 en las semanas 0, 3, 6 y 8 se
muestran en la Tabla 1. Como puede apreciarse en estos datos, el
conjugado produjo una respuesta de anticuerpos de IgG significativa
y potenciable.
| DeA-LOS: | LOS des-O-acilado, no conjugado |
| DeA-LOS-SPDP: | LOS des-O-acilado activado, no conjugado |
| DeA-LOS-SPDP-CRM: | LOS des-O-acilado conjugado con CRM_{197} mediante SPDP |
| ND = No realizado | |
| *El valor representa las diluciones de punto final a las que el suero diluido da un valor de D.O. de 0,1. |
La inmunogenicidad de reacción cruzada del
conjugado producido en los ejemplos de la presente memoria contra
LOS heterólogos de varias cepas de Neisseria meningitidis
también fue examinada siguiendo el procedimiento descrito
anteriormente, y los datos obtenidos se presentan en la Tabla 2. Las
cepas examinadas fueron: A1, R6, H44/76, 2996, inmunotipos L1, L2,
L3, L4, L5, L6, L7, L8, L10, L11 y L12. Como puede apreciarse en la
Tabla 2, el conjugado de LOS-proteína produjo una
significativa respuesta de anticuerpos, particularmente en
comparación con el LOS no conjugado.
| DeA-LOS-SPDP: | LOS des-O-acilado activado, no conjugado |
| DeA-LOS-SPDP-CRM: | LOS des-O-acilado conjugado con CRM_{197}mediante SPDP |
La reactividad cruzada de los antisueros contra
el conjugado de LOS (los antisueros contra
DeA-LOS-SPDP-CRM) se
examinó además por análisis de inmunoelectrotransferencia frente a
LOS purificados de varias cepas de diversas bacterias gramnegativas.
Las muestras de LOS purificados de Neisseria meningitidis,
Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae,
Moraxella catarrhalis y Helicobacter pylori se
digirieron primero con proteasa y se sometieron a un procedimiento
estándar de separación por SDS-PAGE (18%). Después
se transfirieron las muestras a una membrana de nitrocelulosa
mediante un procedimiento estándar de inmunoelectrotransferencia. La
membrana se bloqueó con seroalbúmina bovina (BSA) al 3% en una
mezcla de PBS/Tween 20 al 0,05% durante 30 min y se hizo reaccionar
con una dilución 1:100 de suero de prueba de ratón. Después se
lavaron las membranas de inmunotransferencia con una mezcla de PBS/
Tween 20 al 0,05% y se incubaron con anticuerpos caprinos contra la
Ig de ratón conjugados con fosfatasa alcalina, diluidos en una
mezcla de PBS/ Tween 20 al 0,05%. Tras el procedimiento de lavado,
las membranas de inmunotransferencia se revelaron utilizando el
sistema de sustrato de fosfatasas formado por
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(BCIP)/concentrado de nitroazul de tetrazolio (NBT) siguiendo las
instrucciones del fabricante (Kirkegaard and Perry Laboratories,
Inc., MD). El procedimiento de revelado comprende mezclar una parte
de cada uno de los concentrados de BCIP y NBT con diez partes de
solución tampón Tris en un recipiente de vidrio y añadir estas
mezclas a las membranas de inmunotransferencia. Tras el revelado del
color, se paró la reacción lavando las membranas con agua de calidad
reactiva.
Como puede apreciarse en la Figura 4, el LOS de
cada uno de los organismos, con la excepción de Helicobacter
pylori, reaccionaba intensamente con el antisuero. Parece ser
que también estaba presente una ligera reactividad cruzada, aunque
de menor intensidad, contra el LOS de Helicobacter pylori.
Estos resultados indican claramente que los anticuerpos generados
contra el conjugado de LOS de Neisseria meningitidis
reaccionan de forma cruzada con otros organismos gramnegativos
distintos.
Las actividades bactericidas de los antisueros se
examinaron adicionalmente utilizando la cepa R6, la cepa (A1) del
grupo A, y dos cepas del grupo B: H44/76 y 2996. Se diluyeron
muestras de suero en 5 \mul de PCM (PBS que contenía Ca y Mg) y se
añadió esta dilución a mezclas de reacción que contenían
2-5 x 10^{3} células de Neisseria
meningitidis (10 \mul), complemento sérico humano (10 \mul)
y PCM (25 \mul). Esta mezcla se incubó a continuación durante 45
min a 36ºC en CO_{2} al 5%. Después se terminó la reacción
diluyendo con 200 \mul de PBS. A continuación se sembraron dos
partes alícuotas (50 \mul) de la mezcla en placas de agar GC y se
incubaron nuevamente en CO_{2} al 5% a 36ºC. Después se
determinaron los títulos bactericidas (BC50). Los títulos
bactericidas representan el recíproco de la dilución de antisuero
que mata al 50% de las células de Neisseria meningitidis
formadoras de colonias en el ensayo. Los datos se presentan más
adelante en la Tabla 3.
Como puede apreciarse en la Tabla 3, el antisuero
contra el conjugado fue capaz de matar bacterias que expresaban
diferentes inmunotipos de LOS. Dichos conjugados provocaron una
respuesta de IgG dependiente de linfocitos T y potenciable.
| *Se utilizó antisuero testigo positivo (de ratón contra el LOS de A1) en el ensayo, y arrojó un título de 100. | |
| ND= No realizado | |
| DeA-LOS-SPDP: | LOS des-O-acilado activado, no conjugado |
| DeA-LOS-SPDP-CRM: | LOS des-O-acilado conjugado con CRM_{197} mediante SPDP |
Por consiguiente, puede apreciarse claramente a
partir de los datos presentados anteriormente que los conjugados
antigénicos de la presente invención producen una significativa
respuesta inmunitaria contra el LOS de un organismo bacteriano dado.
Es más, estos datos demuestran que los conjugados de la presente
memoria provocan una respuesta de reacción cruzada contra diferentes
cepas del organismo bacteriano, así como contra diferentes especies
de organismos bacterianos.
Claims (17)
1. Conjugado antigénico que comprende una
proteína transportadora unida covalentemente a la porción conservada
de un lipooligosacárido (LOS) de una bacteria gramnegativa patógena
no entérica, en el que dicha porción conservada del LOS comprende
GlcNAc-Hep_{2}fosfoetanolamina-KDO_{2}-Lípido
A, generando dicho conjugado una respuesta inmunitaria de reacción
cruzada contra cepas heterólogas de dichas bacterias
gramnegativa.
2. Conjugado antigénico según la reivindicación
1, en el que dicho conjugado genera una respuesta inmunitaria de
reacción cruzada contra géneros heterólogos de bacterias
gramnegativas.
3. Conjugado antigénico según la reivindicación 1
o la reivindicación 2, en el que dicho LOS está
des-O-acilado.
4. Conjugado antigénico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha proteína transportadora se
selecciona a partir del grupo formado por toxina o toxoide tetánico,
toxina o toxoide diftérico, mutante de la toxina diftérica
CRM_{197}, exotoxina A de Pseudomonas, toxina o toxoide
colérico, toxinas de estreptococos del grupo A, pneumolisina de
Streptococcus pneumoneae, hemaglutinina filamentosa (FHA),
fragmentos de FHA de Bordetella pertussis; pili o pilinas de
Neisseria gonorrhoeae, pili o pilinas de Neisseria
meningitidis; proteínas de la membrana externa de Neisseria
meningitidis, proteínas de la membrana externa de Neisseria
gonorrhoeae; peptidasa C5A de Streptococcus y proteína
superficial de Moraxella catarrhalis.
5. Conjugado antigénico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha proteína transportadora está
acoplada a dicha porción conservada del LOS con un compuesto
seleccionado a partir de los siguientes:
sulfosuccinimidil-6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)-hexanoato
(Sulfo-LC-SPDP);
succinimidil-6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)-hexanoato
(LC-SPDP); reactivo de Traut
(2-iminotiolano);
N-succinimidil-S-acetil-tioacetato
(SATA);
N-succinimidil-3-(2-piridil-ditio)propionato
(SPDP),
succinimidil-acetil-tiopropionato
(SATP),
succinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciclohexano-1-carboxilato
(SMCC), éster de
maleimido-benzoil-N-hidroxi-succinimida
(MBS),
N-succinimidil-(4-iodoacetil)aminobenzoato
(SIAB),
succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato
(SMPB), éster de ácido
bromoacético-N-hidroxi-succinimida
(BANS),
1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-carbodiimida
(EDAC), dihidrazida del ácido adípico (ADH), cistamina y
ditiobis(succinimidil-propionato)
(DTSSP).
6. Conjugado antigénico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha bacteria gramnegativa se
selecciona a partir del grupo formado por Neisseria
meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus
influenzae, Haemophilus influenzae no tipificable,
Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori,
Chlamydia, Proteus mirabilis, Pseudomonas
aeruginosa, Moraxella catarrhalis, Bordetella
pertussis, Klebsiella y Vibrio cholerae.
7. Conjugado antigénico según la reivindicación
6, en el que dicha bacteria gramnegativa es Neisseria
meningitidis.
8. Conjugado antigénico según la reivindicación
4, que comprende la proteína transportadora CRM_{197} de toxina
diftérica unida covalentemente a la porción conservada de un LOS de
Neisseria meningitidis con
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato
de cadena larga y éster de ácido
bromoacético-N-hidroxisuccinimida,
en el que dicha porción conservada comprende
GlcNAc-Hep_{2}fosfoetanolamina-KDO_{2}-Lípido
A, generando dicho conjugado una respuesta inmunitaria de reacción
cruzada contra cepas heterólogas pertenecientes al género
Neisseria meningitidis.
9. Conjugado antigénico según la reivindicación
8, en el que dicho conjugado genera una respuesta inmunitaria de
reacción cruzada contra géneros heterólogos de bacterias
gramnegativas.
10. Formulación de vacuna que comprende una
cantidad eficaz del conjugado antigénico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9.
11. Formulación de vacuna según la reivindicación
10, que comprende además un vehículo fisiológico y un adyuvante.
12. Utilización de una cantidad eficaz de un
conjugado antigénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9
en la preparación de una formulación de vacuna para la inmunización
de un individuo destinado a prevenir una enfermedad causada por un
patógeno gramnegativo.
13. Utilización según la reivindicación 12, en la
que la formulación de vacuna se administra al individuo por una vía
de administración seleccionada a partir del grupo formado por
administración por vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa, vaginal, subcutánea, ocular, intranasal y oral.
14. Utilización según la reivindicación 12, en la
que dicha formulación de vacuna comprende además un vehículo
fisiológico y un adyuvante.
15. Utilización de una cantidad eficaz de un
conjugado antigénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9
en la preparación de un medicamento destinado a prevenir la
septicemia bacteriana en un mamífero que lo necesite, en la que
dicho conjugado genera una respuesta inmunitaria de reacción cruzada
contra cepas heterólogas de dichas bacterias gramnegativas.
16. Utilización según la reivindicación 15, en la
que dicho conjugado genera una respuesta inmunitaria de reacción
cruzada contra géneros heterólogos de dichas bacterias
gramnegativas.
17. Conjugado antigénico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para su utilización como medicamento.
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