KR20020008111A - 스크리닝 방법 - Google Patents

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KR20020008111A
KR20020008111A KR1020017008291A KR20017008291A KR20020008111A KR 20020008111 A KR20020008111 A KR 20020008111A KR 1020017008291 A KR1020017008291 A KR 1020017008291A KR 20017008291 A KR20017008291 A KR 20017008291A KR 20020008111 A KR20020008111 A KR 20020008111A
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기따다찌에꼬
스즈끼노부히로
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다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
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Abstract

MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 SLC-1 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시킬 수 있는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법은, 식욕 (섭식) 증진제 외, 미약진통, 이완출혈, 태반만출전후, 자궁복고부전, 제왕절개술, 인공임신중절, 유즙울체 등의 예방ㆍ치료약 등으로서 사용할 수 있는 SLC-1 아고니스트 및 항비만제 (약), 식욕 (섭식) 조절제 등 외, 과강진통, 강직성 자궁수축, 태아가사, 자궁파열, 경관열상, 조산, Prader-Willi 증후군 등의 예방ㆍ치료약 등으로서 사용할 수 있는 SLC-1 안타고니스트의 스크리닝 방법으로서 유용하다.

Description

스크리닝 방법{SCREENING METHOD}
인간 게놈으로부터 발견된 인간형 SLC-1 (FEBS Letters 398 (1996) 253-258) 및 래트 뇌의 cDNA 라이브러리로부터 발견된 래트형 SLC-1 (Biochimica et Biophysica Acta 1401 (1998) 216-220) 은 G 단백질 공액형 리셉터 또는 7 회 막관통형 리셉터라고 총칭되는 것으로, 수많은 리간드가 명확하지 않은 소위 오펀 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 1 종이다.
이들 오펀 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 리간드를 결정하는 일반적인 수단으로서는 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 1 차 구조상의 유사성으로부터 추정할 수 밖에 없었다. 그러나, 많은 오펀 G 단백질 공액형 리셉터 단백질은 기지의 리셉터와의 상동성이 낮은 것이 많고, 실제로는 기지의 리간드의 리셉터 서브타입인 경우를 제외하고는 1 차 구조상의 유사성만으로 그 리간드를 추정하는 것은곤란했다. 한편, 유전자 해석으로부터 많은 오펀 G 단백질 공액형 리셉터가 발견되고 있는 것으로부터 대응하는 미지의 리간드가 아직 많이 존재하고 있는 것이 추정되고 있지만, 이제까지 실제로 오펀 G 단백질 공액형 리셉터의 리간드를 동정한 예는 적으며, SLC-1 에 대해서도 그 리간드의 존재는 보고되어 있지 않다.
오펀 리셉터 단백질인 SLC-1 에 대한 리간드의 탐색과, SLC-1 및 그 리간드를 사용하는 것을 특징으로 하는 화합물 등의 스크리닝 방법의 확립이 과제로 되어 있다.
본 발명은 오펀 리셉터 단백질인 SLC-1 (FEBS Letters 398 (1996) 253-258 등) 또는 그의 염과 MCH (멜라닌 응집 호르몬 ; Melanin Concentrating Hormone (Endocrinology, vol.125, 1660-1665 (1989) 등) 또는 그의 유도체 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 항비만약 또는 식욕조제약 등의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.
도 1 은 래트 뇌로부터 조제한 HPLC 분획에 대하여 CHO/SLC-1 세포 특이적인 cAMP 합성억제활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2 는 참고예 1 중의 래트 뇌 HPLC 분획 #34 의 cAMP 합성억제활성의 프로나아제 처리에 대한 거동을 나타낸다.
도 3 은 참고예 3 중의 ODS 칼럼 (Develosil ODS-UG-3) 으로 정제한 분획에 대하여 CHO/SLC-1 세포에 특이적인 cAMP 합성억제활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4 는 래트 SLC-1 유전자 발현 CHO 세포주에 대하여 in situ 하이브리다이제이션에 의한 유전자 발현량의 비교를 나타낸다.
도 5 는 다양한 농도의 MCH 의 CHO/SLC-1 세포에 대한 cAMP 합성억제활성을 나타낸다.
도 6 은 다양한 농도의 MCH 의 CHO/SLC-1 세포에 대한 아라키돈산 대사물 방출활성을 나타낸다.
도 7 은 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 의 GTPγS 결합 분석법을 사용한 아고니스트 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8 은 비동위원소 보르톤헌터 시약에 의해 유도체화된 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) 및 MCH(5-19) 의 GTPγS 결합 분석법을 사용한 아고니스트 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9 는 보르톤헌터 시약을 사용하여 제작한 [125I]-표지MCH(4-19) 의 인간 SLC-1 발현 CHO 세포로부터 조제한 세포막분획에 대한 특이적 결합을 나타낸다.
도 10 은 보르톤헌터 시약을 사용하여 제작한 [125I]-표지MCH(4-19) 에 대한 MCH 의 결합저해활성을 나타낸다.
본 발명자들은 SLC-1 을 코딩하는 cDNA 를 적당한 수단으로 발현시킨 세포를 사용하고, 특이적인 세포자극 (시그널 전달) 활성의 측정 등을 지표로, 상기 리셉터 단백질이 리간드로서 인식하는 폴리펩티드를 스크리닝하는 것에 성공하여 이 폴리펩티드가 MCH (멜라닌 응집 호르몬 ; Melanin Concentrating Hormone) 인 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 활성인자인 MCH 또는 그의 염과 상기 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있는 것을 발견하였다.
또, 본 발명의 인간형 SLC-1 의 아미노산 서열은 이미 보고된 것 (FEBS Letters 398 (1996) 253-258, WO 96/18651 호) 과는 다른 신규 서열인 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은
(1) 멜라닌 응집 호르몬 (MCH) 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 SLC-1 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법,
(2) MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 SLC-1 또는 그의 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트,
(3) 상기 (1) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (2) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어질 수 있는, MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염,
(4) 상기 (3) 에 기재된 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어지는 의약,
(5) 항비만약인 상기 (4) 에 기재된 의약,
(6) 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 단백질 또는 그의 염,
(7) 상기 (6) 에 기재된 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA,
(8) MCH 가 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 펩티드인 상기 (1) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (2) 에 기재된 스크리닝용 키트,
(9) 유도체가 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제 5 번째 내지 제 19 번째의 부분서열을 함유하는 펩티드인 상기 (1) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (2) 에 기재된 스크리닝용 키트,
(10) 유도체가 보르톤헌터 시약에 의해 유도된 MCH 또는 보르톤헌터 시약에 의해 유도된 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제 5 번째 내지 제 19 번째의 부분서열을 함유하는 펩티드인 상기 (1) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (2) 에 기재된 스크리닝용 키트,
(11) 보르톤헌터 시약에 의해 유도된 MCH 또는 보르톤헌터 시약에 의해 유도된 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제 5 번째 내지 제 19 번째의 부분서열을 함유하는 펩티드 또는 그의 염, 및
(12) 식
로 표시되는 화합물 또는 그의 염 등을 제공하는 것이다.
본 발명에서의 SLC-1 에 관하여, 구체적으로는 상술한 공지된 SLC-1 또는 그의 염 등을 들 수 있을 뿐만 아니라,
(13) 서열번호 : 5 또는 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 SLC-1 또는 그의 염, 또는
(14) 서열번호 : 5 또는 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열중의 1 개이상 30 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, 서열번호 : 5 또는 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열에 1 개 이상 30 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 부가된 (또는 삽입된) 아미노산 서열, 또는 서열번호 : 5 또는 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열중의 1 개 이상 30 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 함유하는 단백질인 상기 (13) 에 기재된 SLC-1 또는 그의 염 등을 들 수 있다.
또, 본 발명에서의 MCH 에 관하여, 구체적으로는 상술한 공지된 MCH 또는 그의 염 등을 들 수 있을 뿐만 아니라,
(15) 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염, 또는
(16) 단백질이 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열중의 1 개 이상 10 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 5 개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열에 1 개 이상 10 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 5 개 이하의 아미노산이 부가된 (또는 삽입된) 아미노산 서열, 또는 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열중의 1 개 이상 10 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 5 개 이하의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 함유하는 펩티드인 상기 (15) 에 기재된 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「실질적으로 동일」이란, 폴리펩티드 등의 활성, 예컨대 리간드 (MCH) 와 수용체 (SLC-1) 의 결합활성, 생리적인 특성 등이 실질적으로 동일한 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 그의 염 (이하, 단지 SLC-1 이라고 약칭하는 경우가 있음) 및 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 (이하, 단지 MCH 라고 약칭하는 경우가 있음) 의 제조법을 이하에 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 SLC-1 및 MCH 로서는 인간, 온혈동물 (예컨대, 모르모트, 래트, 마우스, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 및 어류 등의 소위 조직 (예컨대, 하수체, 췌장, 뇌, 신장, 간장, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 근육, 폐, 소화관, 혈관, 심장 등) 또는 세포 등에 유래하는 폴리펩티드로서, SLC-1 로서는 서열번호 : 5 또는 서열번호 : 11, MCH 로서는 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드이면 어떠한 것이어도 된다. 예컨대, 본 발명의 SLC-1 로서는 서열번호 : 5 또는 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 등 외에, 서열번호 :5 또는 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 활성을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질의 활성으로서는, 예컨대 리간드 결합활성, 시그널 전달활성 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질이란, 리간드 결합활성 등이 성질적으로 동질인 것을 나타낸다. 따라서, 리간드 결합활성의 강도 등의 강약, 폴리펩티드의 분자량 등의 양적 요소는 상이해도 된다. 본 발명의 MCH 로서는 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 등 외에, 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 활성을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질의 활성으로서는, 예컨대 리셉터 결합활성 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질이란, 리셉터 결합활성 등이 성질적으로 동질인 것을 나타낸다. 따라서, 리셉터 결합활성의 강도 등의 강약, 폴리펩티드의 분자량 등의 양적 요소는 상이해도 된다.
본 명세서에서의 SLC-1 및 MCH 는 펩티드 표기의 관례에 따라 좌단이 N 말단 (아미노 말단), 우단이 C 말단 (카르복실말단) 이다. 예컨대, 서열번호 : 2, 서열번호 : 5 또는 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열 등을 함유하는 폴리펩티드는 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO-) 이지만, C 말단이 아미드 (-CONH2) 또는 에스테르 (-COOR) 이어도 된다. 에스테르의 R 로서는, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 또는 n-부틸 등의 C1-6알킬기, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C3-8시클로알킬기, 페닐, α-나프틸 등의 C6-12아릴기, 벤질, 펜에틸, 벤즈히드릴 등의 페닐-C1-2알킬, 또는 α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C1-2알킬 등의 C7-14아랄킬기 외에, 경구용 에스테르로서 범용되는 피발로일옥시메틸기 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 SLC-1 및 MCH 의 염으로서는 생리학적으로 허용되는 염기 (예컨대, 알칼리 금속 등) 나 산 (유기산, 무기산) 과의 염이 사용되는데, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로서는, 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화 수소산, 황산) 과의 염, 또는 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸말산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.
본 발명에서 사용되는 SLC-1 및 MCH 는 공지된 방법 (예, FEBS Letters 398 (1996) 253-258, WO 96/18651 호에 기재된 방법) 에 준한 방법, 즉 인간이나 온혈동물의 조직 또는 세포로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법에 의해 제조할 수도 있고, 후술하는 단백질 (펩티드) 합성법에 준하여 제조할 수도 있다. 또 후술하는 단백질 (펩티드) 을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써도 제조할 수 있다.
인간, 온혈동물, 어류 등의 조직 또는 세포로부터 제조하는 경우, 인간, 온혈동물, 어류 등의 조직 또는 세포를 균질화한 후, 산, 유기용매 등으로 추출하고, 이 추출액을 염석, 투석, 겔여과, 역상 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 조합함으로써 정제단리할 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명에서 사용되는 SLC-1 및 MCH 는 자체 공지된 단백질 (펩티드) 의 합성법에 따라, 또는 SLC-1 및/또는 MCH 를 함유하는 단백질 (펩티드) 을 적당한 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있다. 단백질 (펩티드) 의 합성법으로는, 예컨대 고상합성법, 액상합성법 중 어느것에 따라도 된다. 즉, SLC-1 및/또는 MCH 를 구성할 수 있는 부분 펩티드 또는 아미노산과 잔여부분을 축합시키고, 생성물이 보호기를 갖는 경우에는 보호기를 탈리함으로써 목적의 단백질 (펩티드) 을 제조할 수 있다. 공지된 축합방법이나 보호기의 탈리로서는, 예컨대 이하의 ① ∼ ⑤ 에 기재된 방법을 들 수 있다.
① M. Bodanszky 및 M.A. Ondetti, 펩티드 신세시스 (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966 년)
② Schroeder 및 Luebke, 더 펩티드 (The Peptide), Academic Press, New York (1965 년)
③ 이즈미야노부오 외, 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠 (주) (1975 년)
④ 야지마하루아키 및 사카키바라준뻬, 생화학실험강좌 1, 단백질의 화학 IV, 205, (1977 년)
⑤ 야지마하루아키 감수, 속 의약품의 개발 제 14 권 펩티드 합성 히로가와쇼텐
또 반응후에는 통상의 정제법, 예컨대 용매추출ㆍ증류ㆍ칼럼 크로마토그래피ㆍ액체 크로마토그래피ㆍ재결정 등을 조합하여 단백질 (펩티드) 을 정제단리할 수있다. 상기 방법으로 얻어지는 단백질 (펩티드) 이 유리체인 경우에는 공지된 방법에 의해 적당한 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻어진 경우에는 공지된 방법에 의해 유리체로 변환할 수 있다.
SLC-1 및 MCH 의 아미드체는 아미드 형성에 적합한 시판되는 펩티드 합성용 수지를 사용할 수 있다. 그와 같은 수지로는, 예컨대 클로로메틸 수지, 히드록시메틸 수지, 벤즈히드릴아민 수지, 아미노메틸 수지, 4-벤질옥시벤질알콜 수지, 4-메틸벤즈히드릴아민 수지, PAM 수지, 4-히드록시메틸메틸페닐아세토아미드메틸 수지, 폴리아크릴아미드 수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-히드록시메틸)페녹시 수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc 아미노에틸)페녹시 수지 등을 들 수 있다. 이와 같은 수지를 사용하고, α-아미노기와 측쇄 관능기를 적당히 보호한 아미노산을, 목적으로 하는 펩티드의 서열대로 자체 공지된 각종 축합방법에 따라 수지상에서 축합시킨다. 반응의 마지막에 수지로부터 단백질 (펩티드) 을 잘라냄과 동시에 각종 보호기를 제거하고, 필요에 따라 고희석 용액중에서 분자내 디술피드 결합 형성반응을 실시하고, 목적의 단백질 (펩티드) 을 취득한다.
상기한 보호된 아미노산의 축합에 관해서는, 단백질 (펩티드) 합성에 사용할 수 있는 각종 활성화 시약을 사용할 수 있지만, 특히, 카르보디이미드류가 좋다. 카르보디이미드류로는 DCC, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 등을 들 수 있다. 이들에 의한 활성화에는 라세미화 억제 첨가제 (예컨대, HOBT, HOOBT 등) 와 함께 보호된 아미노산을 직접 수지에 첨가하거나 또는, 대칭 산무수물 또는 HOBT 에스테르 또는 HOOBT 에스테르로서 미리 보호된 아미노산의 활성화를 행한 후 수지에 첨가할 수 있다. 보호된 아미노산의 활성화나 수지와의 축합에 이용되는 용매로는, 단백질 (펩티드) 축합반응에 사용할 수 있는 것이 알려져 있는 용매로부터 적당히 선택될 수 있다. 예컨대, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세토아미드, N-메틸피롤리돈 등의 산아미드류, 염화메틸렌, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소류, 트리플루오로에탄올 등의 알콜류, 디메틸술폭시드 등의 술폭시드류, 피리딘 등의 3 급 아민류, 디옥산, 테트라히드로푸란 등의 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 에스테르류 또는 이들의 적당한 혼합물 등이 사용된다. 반응온도는 펩티드 결합 형성반응에 사용될 수 있는 것이 알려져 있는 범위에서 적당히 선택되고, 통상 약 -20 ℃ ∼ 50 ℃ 의 범위에서 적당히 선택된다. 활성화된 아미노산 유도체는 통상 1.5 내지 4 배 과잉으로 사용된다. 닌히드린 반응을 이용한 테스트의 결과, 축합이 불충분한 경우는 보호기의 탈리를 행하지 않고 축합반응을 반복함으로써 충분한 축합을 행할 수 있다. 반응을 반복해도 충분한 축합을 얻을 수 없을 때에는, 무수아세트산 또는 아세틸이미다졸을 사용하여 미반응 아미노산을 아세틸화하여 나중의 반응에 영향을 미치지 않도록 할 수 있다.
원료 아미노산의 아미노기의 보호기로는, 예컨대 Z, Boc, tert-펜틸옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, Cl-Z, Br-Z, 아다만틸옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프탈로일, 포르밀, 2-니트로페닐술페닐, 디페닐포스피노티오일, Fmoc 등을 들 수 있다. 카르복실기의 보호기로는, 예컨대 R로서 상기한 C1-6알킬기, C3-8시클로알킬기, C7-14아랄킬기 외, 2-아다만틸, 4-니트로벤질, 4-메톡시벤질, 4-클로로벤질, 펜아실트레오닌벤질옥시카르보닐히드라지드, tert-부톡시카르보닐히드라지드, 트리틸히드라지드 등을 들 수 있다.
세린 및 트레오닌의 수산기는, 예컨대 에스테르화 또는 에테르화에 의해 보호할 수 있다. 이 에스테르화에 적합한 기로는, 예컨대 아세틸기 등의 저급 알카노일기, 벤조일기 등의 알로일기, 벤질옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등의 탄소로부터 유도되는 기 등을 들 수 있다. 또 에테르화에 적합한 기로는, 예컨대 벤질기, 테트라히드로피라닐기, tert-부틸기 등이다.
티로신의 페놀성 수산기의 보호기로는, 예컨대 Bzl, Cl2-Bzl, 2-니트로벤질, Br-Z, tert-부틸 등을 들 수 있다.
히스티딘의 이미다졸의 보호기로는, Tos, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐, DNP, 벤질옥시메틸, Bum, Boc, Trt, Fmoc 등을 들 수 있다.
원료의 카르복실기가 활성화된 것으로는, 예컨대 대응하는 산무수물, 아지드, 활성에스테르 [알콜 (예컨대, 펜타클로로페놀, 2,4,5-트리클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸알콜, 파라니트로페놀, HONB, N-히드록시숙시미드, N-히드록시프탈이미드, HOBT) 과의 에스테르] 등을 들 수 있다. 원료의 아미노기가 활성화된 것으로는, 예컨대 대응하는 인산아미드를 들 수 있다.
보호기의 제거 (탈리) 방법으로는, 예컨대 Pd 흑 또는 Pd 탄소 등의 촉매의 존재하에서의 수소기류 중에서의 접촉환원이나, 또, 무수불화수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로아세트산 또는 이들의 혼합액 등에 의한 산처리나, 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피페리딘, 피페라진 등에 의한 염기처리, 또 액체 암모니아중나트륨에 의한 환원 등도 들 수 있다. 상기 산처리에 의한 탈리반응은 일반적으로 -20 ℃ ∼ 40 ℃ 의 온도에서 행해지지만, 산처리에서는 아니솔, 페놀, 티오아니솔, 메타크레졸, 파라크레졸, 디메틸술피드, 1,4-부탄디티올, 1,2-에탄디티올과 같은 양이온 포착제의 첨가가 유효하다. 또 히스티딘의 이미다졸 보호기로서 사용되는 2,4-디니트로페닐기는 티오페놀 처리에 의해 제거되며, 트립토판의 인돌 보호기로서 사용되는 포르밀기는 상기의 1,2-에탄디티올, 1,4-부탄디티올 등의 존재하의 산처리에 의한 탈보호 이외에, 희수산화 나트륨, 희암모니아 등에 의한 알칼리 처리에 의해서도 제거된다.
원료의 반응에 관여해서는 안되는 관능기의 보호 및 보호기, 및 그 보호기의 탈리, 반응에 관여하는 관능기의 활성화 등은 공지된 기 또는 공지된 수단에서 적당히 선택할 수 있다.
SLC-1 및 MCH 의 아미드체를 얻는 다른 방법으로는, 먼저 카르복실 말단 아미노산의 α-카르복실기를 아미드화한 후, 아미노기측에 펩티드사슬를 원하는 사슬길이까지 연장한 후, 이 펩티드사슬의 N 말단의 α-아미노기의 보호기만을 제거한 펩티드와 C 말단의 카르복실기의 보호기만을 제거한 펩티드 (또는 아미노산) 를 제조하고, 이 양 펩티드를 상기한 바와 같은 혼합용매 중에서 축합시킨다. 축합반응의 상세에 대해서는 상기와 동일하다. 축합에 의해 얻어진 보호 펩티드를 정제한 후, 상기 방법에 의해 모든 보호기를 제거하고, 원하는 조(粗)단백질 (펩티드) 을 얻을 수 있다. 이 조단백질 (펩티드) 은 기지의 각종 정제수단을 구사하여 정제하고, 주요 분획을 동결건조함으로써 원하는 단백질 (펩티드) 의 아미드체를 얻을 수 있다.
SLC-1 및 MCH 의 에스테르체를 얻으려면 카르복시 말단 아미노산의 α-카르복실기를 원하는 알콜류와 축합하여 아미노산 에스테르로 한 후, 단백질 (펩티드) 의 아미드체와 동일하게 하여 원하는 단백질 (펩티드) 의 에스테르체를 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 MCH 의 유도체로는, ① MCH 의 부분 펩티드, ② MCH 의 구성 아미노산이 결실된 펩티드, 구성 아미노산에 다른 아미노산이 부가된 펩티드, 구성 아미노산이 다른 아미노산에 치환된 펩티드, 또는 ③ MCH, 상기 ① 에 기재된 부분 펩티드 또는 ② 에 기재된 펩티드가 표지화된 것 등, SLC-1 과의 결합능을 갖는 것이면 어느것이어도 된다.
MCH 의 부분 펩티드로서 구체적으로는, 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 5 번째 내지 제 19 번째의 부분서열을 함유하는 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그의 염 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 서열번호 : 19, 서열번호 : 20, 서열번호 : 21, 서열번호 : 22, 서열번호 : 23 또는 서열번호 : 24 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염 등을 들 수 있다.
또한, SLC-1 을 사용하여 후술하는 스크리닝을 행하는 경우, 특히 바람직하게는 서열번호 : 21 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 아미드또는 그의 에스테르 또는 그의 염이 바람직하게 사용된다.
또, MCH 의 구성 아미노산이 결실된 펩티드, 구성 아미노산에 다른 아미노산이 부가된 펩티드, 구성 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 펩티드로는, 서열번호 : 2 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 또는 2 개)) 의 아미노산이 결실되고, 또는 그 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 또는 2 개)) 의 아미노산이 부가되고, 또는, 그 아미노산 서열중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 또는 2 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 펩티드 등을 들 수 있다.
상기 아미노산 서열중의 아미노산의 실질적으로 동일한 치환물로는, 예컨대 그 아미노산이 속하는 곳의 클래스 중 다른 아미노산류로부터 선택할 수 있다. 비극성 (소수성(疎水性)) 아미노산으로는, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌 등을 들 수 있다. 극성(중성) 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 등을 들 수 있다. 양전하를 갖는 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신, 히스티딘 등을 들 수 있다. 음전하를 갖는 (산성) 아미노산으로는 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다.
단, 상기한 다른 아미노산이 결실, 치환되는 위치로는 MCH 의 구성 아미노산중 Cys 이외의 위치인 것이 바람직하다.
MCH, 상기 ① 에 기재된 펩티드 또는 ② 에 기재된 펩티드가 표지화된 것으로는, 자체 공지된 방법으로 동위원소표지된 것, 형광표지된 것 (예컨대, 플루오레세인 등에 의한 형광표지), 비오틴화된 것, 효소표지된 것 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 예컨대 공지된 방법에 의해 [3H], [125I], [14C], [35S] 등으로 표지된 MCH 등을 이용할 수 있다. 특히, 보르톤헌터 시약을 사용하여 공지된 방법으로 조제한 MCH 또는 그의 유도체의 표지체를 이용할 수도 있다.
이 MCH 또는 그의 유도체의 표지체의 구체예로는, 예컨대
(1) [125I]-[N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Asp1]-MCH
(2) [125I]-[N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Phe2]-MCH(2-19)
(3) [125I]-[N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Asp3]-MCH(3-19)
(4) [125I]-[N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Met4]-MCH(4-19)
(5) [125I]-[N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Leu5]-MCH(5-19)
(6) [125I]-[N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Arg6]-MCH(6-19)
(7) [125I]-[N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Cys7]-MCH(7-19)
등을 들 수 있다.
그 중에서도, 특히 [125I]-[N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Met4]-MCH(4-19) 가 바람직하게 사용된다.
MCH 또는 그의 유도체의 염으로는, 상기 SLC-1 및 MCH 의 염과 동일한 것 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 SLC-1 을 코딩하는 DNA 로는 서열번호 : 5 또는 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA, 본 발명에서 사용되는 MCH 를 코딩하는 DNA 로는 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA 이면 어떠한 것이어도 된다. 또한 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 조직ㆍ세포 유래의 cDNA, 상기한 조직ㆍ세포 유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 중 어느것이어도 된다. 라이브러리에 사용하는 벡터는 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 등 어느것 이어도 된다. 또한 상기한 조직ㆍ세포로부터 RNA 분획을 조제한 것을 사용하여 직접 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (이하, RT-PCR 법이라 약칭함) 에 의해 증폭할 수도 있다.
보다 구체적으로는 (1) 엄격한 조건하에서, 서열번호 : 2, 서열번호 : 5 또는 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA 가 갖는 서열과 하이브리다이즈하는 DNA, (2) 유전코드의 축중(縮重)을위하여, 서열번호 : 2, 서열번호 : 5 또는 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA 가 갖는 서열 및 (1) 에 정해져 있는 서열과 하이브리드 형성하지 않으나, 동일 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA 등이 사용된다. 하이브리다이제이션은 자체 공지된 방법 또는 그에 준한 방법에 따라 행할 수 있다. 상기 엄격한 조건으로는, 예컨대 42 ℃, 50 % 포름아미드, 4 ×SSPE (1 ×SSPE = 150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4ㆍH2O, 1 mM EDPA pH 7.4), 5 ×덴하트용액, 0.1 % SDS 이다.
본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 코딩하는 DNA 는 이하의 유전자공학적 수법에 의해서도 제조할 수 있다.
본 발명의 SLC-1 또는 MCH 를 완전히 코딩하는 DNA 의 클로닝 수단으로는, 본 발명의 SLC-1 또는 MCH 의 부분염기서열을 갖는 합성 DNA 프라이머를 사용하여 자체 공지된 PCR 법에 의해 상기 DNA 라이브러리 등으로부터 목적으로 하는 DNA 를 증폭하거나, 또는 적당한 벡터에 삽입한 DNA 를 예컨대, SLC-1 또는 MCH 를 코딩하는 염기서열의 일부 또는 전체영역을 갖는 DNA 단편 또는 합성 DNA 를 사용하여 표지한 것과의 하이브리다이제이션에 의해 선별할 수 있다. 하이브리다이제이션 방법은, 예컨대 Molecular Cloning (2nd ed.; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) 에 기재된 방법 등에 따라 행해진다. 또한 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우, 첨부된 사용설명서에 기재된 방법에 따라 행한다.
클론화된 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 코딩하는 DNA 는 목적에 따라 그대로, 또는 원하는 바에 따라 제한효소로 소화하거나, 링커를 첨가하여 사용할 수 있다. 상기 DNA 는 그의 5' 말단측에 번역개시코돈으로서의 ATG 를 가지며, 또한 3' 말단측에는 번역종지코돈으로서의 TAA, TGA 또는 TAG 를 가지고 있어도 된다. 이들 번역개시코돈이나 번역종지코돈은 적당한 합성 DNA 어댑터를 사용하여 부가할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 의 발현벡터는, 예컨대 (가) 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 코딩하는 DNA 로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 잘라내고, (나) 이 DNA 단편을 적당한 발현벡터중의 프로모터의 하류에 연결함으로써 제조할 수 있다.
벡터로는 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래 플라스미드 (예, pSH19, pSH15), λ파지 등의 박테리오파지, 레트로바이러스, 백시니아바이러스, 버큘로바이러스 등의 동물 바이러스 등이 사용된다. 사용되는 프로모터로는 유전자의 발현에 사용하는 숙주에 대응하여 적절한 프로모터이면 어떠한 것이어도 된다.
형질전환할 때의 숙주가 동물세포인 경우에는 SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인프로모터, 히트쇼크프로모터, 사이트메갈로바이러스프로모터, SRα프로모터 등을 이용할 수 있다. 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 Trp 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터 등이, 숙주가 바실루스속균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등, 숙주가 효모인 경우에는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH1 프로모터, GAL 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 곤충세포인 경우에는 폴리헤드린프로모터, P10 프로모터 등이 바람직하다.
발현벡터에는 이상의 것 이외에, 원하는 바에 따라 인핸서, 스플라이싱시그널, 폴리 A 부가시그널, 선택마커, SV40 복제오리진(이하, SV40 ori 라 약칭하는 경우가 있음) 등을 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 선택마커로는, 예컨대 디히드로엽산환원효소 (이하, dhfr 이라 약칭하는 경우가 있음) 유전자 〔메소트렉세이트 (MTX) 내성〕, 암피실린 내성유전자 (이하, Ampr이라 약칭하는 경우가 있음), 네오마이신 내성유전자 (이하, Neo 라 약칭하는 경우가 있음, G418 내성) 등을 들 수 있다. 특히, CHO (dhfr-) 세포를 이용하여 DHFR 유전자를 선택마커로서 사용하는 경우, 티미딘을 함유하지 않는 배지에 의해서도 선택할 수 있다.
또한 필요에 따라, 숙주에 맞는 시그널서열을 폴리펩티드 또는 그 부분펩티드의 N 말단측에 부가한다. 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 phoAㆍ시그널서열, OmpAㆍ시그널서열 등이, 숙주가 바실루스속균인 경우에는 α-아밀라아제ㆍ시그널서열, 서브티리신ㆍ시그널서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 메이팅팩터 α(MFα)ㆍ시그널서열, 인베르타아제ㆍ시그널서열 등, 숙주가 동물세포인 경우에는, 예컨대 인슐린ㆍ시그널서열, α-인터페론ㆍ시그널서열, 항체분자ㆍ시그널서열 등을 각각 이용할 수 있다.
이렇게 하여 구축된 SLC-1 또는 MCH 를 코딩하는 DNA 를 함유하는 벡터를 사용하여 형질전환체를 제조할 수 있다.
숙주로는, 예컨대 에쉐리키아속균, 바실루스속균, 효모, 곤충 또는 곤충세포, 동물세포 등이 사용된다.
에쉐리키아속균으로는 에쉐리키아ㆍ콜리 (Escherichia coli) K12ㆍDH1 〔프로시딩즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이언시즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60 권, 160 (1968)〕, JM103 〔뉴클릭ㆍ애시즈ㆍ리서치 (Nucleic Acids Research), 9 권, 309 (1981)〕, JA221 〔저널ㆍ오브ㆍ모레큘러ㆍ바이올러지 (Journal of Molecular Biology)], 120 권, 517 (1978)〕, HB101 〔저널ㆍ오브ㆍ모레큘러ㆍ바이올러지, 41 권, 459 (1969)〕, C600〔제네틱스 (Genetics), 39 권, 440 (1954)〕 등이 사용된다.
바실루스속균으로는, 예컨대 바실루스ㆍ서브틸리스 (Bacillus subtilis) MI114 〔진, 24 권, 255 (1983)〕, 207-21 〔저널ㆍ오브ㆍ바이오케미스트리 (Journal of Biochemistry), 95 권, 87 (1984)〕 등이 사용된다.
효모로는, 예컨대 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12 등이 사용된다.
곤충으로는, 예컨대 누에의 유충 등이 사용된다 〔마에다 등, 네이처 (Nature), 315 권, 592 (1985)〕.
곤충세포로는, 예컨대 바이러스가 AcNPV 인 경우에는 밤나방의 유충 유래 주화세포 (Spodoptera frugiperda cell; Sf 세포), Trichoplusia ni 의 중장 유래의 MG1 세포, Trichoplusia ni 의 알 유래의 High FiveTM세포, Mamestra brassicae 유래의 세포 또는 Estigmena acrea 유래의 세포 등이 사용된다. 바이러스가 BmNPV 인 경우에는 누에 유래 주화세포 (Bombyx mori N ; BmN 세포) 등이 사용된다. 상기 Sf 세포로는, 예컨대 Sf9 세포 (ATCC CRL1711), Sf21 세포 〔이상, Vaughn, J.L. 등, 인ㆍ비트로 (in Vitro), 13 권, 213-217 면 (1977 년)〕 등이 사용된다.
동물세포로는, 예컨대 원숭이 COS-7 세포, Vero 세포, 차이니즈 햄스터 세포 CHO, DHFR 유전자결손 차이니즈 햄스터 세포 CHO (dhfr-CHO 세포), 마우스 L 세포, 마우스 3T3 세포, 마우스 미엘로머 세포, 인간 HEK293 세포, 인간 FL 세포, 293 세포, C127 세포, BALB 3T3 세포, Sp-2/O 세포 등이 사용된다.
에쉐리키아속균을 형질전환하려면, 예컨대 프로시딩즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이언시즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69 권, 2110 (1972) 나 진 (Gene), 17 권, 107 (1982) 등에 기재된 방법에 따라 행해진다.
바실루스속균을 형질전환하려면, 예컨대 모레큘러ㆍ앤드ㆍ제너럴ㆍ제네틱스 (Molecular & General Genetics), 168 권, 111 (1979) 등에 기재된 방법에 따라 행해진다.
효모를 형질전환하려면, 예컨대 프로시딩즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이언시즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75 권,1929 (1978) 에 기재된 방법에 따라 행해진다.
곤충세포 또는 곤충을 형질전환하려면, 예컨대 바이오/테크놀러지 (Bio/Technology), 6 권, 47-55 면 (1988 년) 등에 기재된 방법에 따라 행해진다.
동물세포를 형질전환하려면, 예컨대 바이럴러지 (Virology), 52 권, 456 (1973) 에 기재된 방법에 따라 행해진다.
발현벡터의 세포로의 도입방법으로는, 예컨대 리포펙션법 〔Felgner, P.L. et al. 프로시딩즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이언시즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ유에스에이 (Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America), 84 권, 7413 면 (1987 년)〕, 인산칼슘법 〔Graham F.L. and van der Eb, A.J. 바이럴러지 (Virology), 52 권, 456-467 면 (1973 년)〕, 전기천공법 〔Nuemann, E. et al. 엠보ㆍ저널 (EMBO J.), 1 권, 841-845 면 (1982 년)〕등을 들 수 있다.
이렇게 하여, 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 코딩하는 DNA 를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체가 얻어진다.
또한 동물세포를 사용하여 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 안정적으로 발현시키는 방법으로는, 상기 동물세포에 도입된 발현벡터가 염색체에 삽입된 세포를 클론선택에 의해 선택하는 방법이 있다. 구체적으로는 상기 선택마커를 지표로 하여 형질전환체를 선택한다. 또한 이렇게 선택마커를 사용하여 얻어진 동물세포에 대하여 반복클론선택을 행함으로써 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 의 고발현능을 갖는 안정적인 동물세포주를 얻을 수 있다. 또한 dhfr 유전자를 선택마커로 사용한 경우, MTX 농도를 서서히 올려 배양하고, 내성주를 선택함으로써, dhfr 유전자와 함께 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 코딩하는 DNA 를 세포내에서 증폭시켜 더욱 고발현의 동물세포주를 얻을 수도 있다.
상기 형질전환체를 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 코딩하는 DNA 가 발현 가능한 조건하에서 배양하고, 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 생성, 축적시킴으로써 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 제조할 수 있다.
숙주가 에쉐리키아속균, 바실루스속균인 형질전환체를 배양할 때, 배양에 사용되는 배지로는 액체배지가 적당하며, 그 중에는 상기 형질전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물, 그 밖의 것이 함유된다. 탄소원으로는 예컨대 글루코스, 덱스트린, 가용성 전분, 자당 등, 질소원으로는 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 콘스치프ㆍ리커, 펩톤, 카세인, 고기엑기스, 콩깻묵, 감자추출액 등의 무기 또는 유기물질, 무기물로는 예컨대 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 등을 들 수 있다. 또한 효모, 비타민류, 생장촉진인자 등을 첨가해도 된다. 배지의 pH 는 약 5 ~ 8 이 바람직하다.
에쉐리키아속균을 배양할 때의 배지로는, 예컨대 글루코스, 카자미노산을 포함하는 M9 배지 [밀러 (Miller), 저널ㆍ오브ㆍ익스페리먼츠ㆍ인ㆍ모레큘러ㆍ제네틱스 (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] 가 바람직하다. 여기에 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작용시키기 위해, 예컨대 3β-인돌릴아크릴산과 같은 약제를 첨가할 수 있다.
숙주가 에쉐리키아속균인 경우, 배양은 통상 약 15 ∼ 43 ℃ 에서 약 3 ∼ 24 시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 더할 수도 있다.
숙주가 바실루스속균인 경우, 배양은 통상 약 30 ∼ 40 ℃ 에서 약 6 ∼ 24 시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 더할 수도 있다.
숙주가 효모인 형질전환체를 배양할 때, 배지로는 예컨대 버크홀더 (Burkholder) 최소 배지 [Bostian, K.L. 등,「프로시딩즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이언시즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77 권, 4505 (1980)] 나, 0.5 % 카자미노산을 함유하는 SD 배지 [Bitter, G.A. 등, 「프로시딩즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이언시즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81 권, 5330 (1984)] 를 들 수 있다. 배지의 pH 는 약 5 ∼ 8 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 ℃ ∼ 35 ℃ 에서 약 24 ∼ 72 시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 더한다.
숙주가 곤충세포인 형질전환체를 배양할 때, 배지로는 Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C., 네이처 (Nature), 195,788 (1962)) 에 비동화한 10 % 소 혈청 등의 첨가물을 적당하게 첨가한 것 등이 사용된다. 배지의 pH 는 약 6.2 ∼ 6.4 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 27 ℃ 에서 약 3 ∼ 5 일간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 더한다.
숙주가 동물세포인 형질전환체를 배양할 때, 배지로는 예컨대 약 5 ∼ 20 % 의 태아소 혈청을 포함하는 MEM 배지 [사이언스 (Science), 122 권, 501 (1952)], DMEM 배지 [바이럴러지 (Virology), 8 권, 396 (1959)], RPMI 1640 배지 [저널ㆍ오브ㆍ더ㆍ아메리카ㆍ메디컬ㆍ어소시에이션 (The Journal of The American Medical Association), 199 권, 519 (1967)], 199 배지 [프로시딩즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ소사이어티ㆍ포ㆍ더ㆍ바이올로지컬ㆍ메디슨 (Proceeding of The Society for The Biological Medicine), 73 권, 1 (1950)] 등이 사용된다. pH 는 약 6 ∼ 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30 ℃ ∼ 40 ℃ 에서 약 15 ∼ 60 시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 더한다.
특히 CHO (dhfr-) 세포 및 dhfr 유전자를 선택마커로서 사용하는 경우에는, 티미딘을 거의 함유하지 않은 투석 소태아혈청을 포함하는 DMEM 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 배양물로부터 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 분리정제하기 위해서는, 예컨대 하기의 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 배양균체 또는 세균에서 추출할 때, 배양 후, 공지된 방법으로 균체 또는 세포를 모아 이것을 적당한 완충액에 현탁하고, 초음파, 리조자임 및/또는 동결융해 등에 의해 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심분리나 여과에 의해 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 의 조추출액을 얻는 방법 등을 적당하게 사용할 수 있다. 완충액중에 요소나 염산구아니딘 등의 단백질변성제나, 트리톤 X-100 (등록상표. 이하, TM 으로 생략하는 경우가 있음) 등의 계면활성제가 포함되어 있어도 된다.
배양액중에 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 가 분비되는 경우에는, 배양 종료 후, 자체 공지된 방법으로 균체 또는 세포와 상청을 분리하여 상청을 모은다.
이렇게 하여 얻어진 배양상청, 또는 추출액중에 포함되는 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 의 정제는, 자체 공지된 분리ㆍ정제법을 적절하게 조합하여 행할 수 있다. 이들 공지된 분리, 정제법으로는 염석이나 용매침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석법, 한외여과법, 겔여과법, 및 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법 등의 주로 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온교환 크로마토그래피 등의 하전의 차이를 이용하는 방법, 친화성 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동법이나 크로마토포커싱 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등이 사용된다.
이렇게 얻어진 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 가 유리체에서 얻어진 경우에는 자체 공지된 방법 또는 그에 준하는 방법에 의해 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염에서 얻어진 경우에는 자체 공지된 방법 또는 그에 준하는 방법에 의해 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.
또한, 재조합체가 생산하는 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 를 정제전 또는 정제후에 적당한 단백질수식효소를 작용시킴으로써, 임의로 수식을 더하거나, 단백질 (펩티드) 을 부분적으로 제거할 수도 있다. 단백질수식효소로는, 예컨대 트립신, 키모트립신, 아르기닐엔도펩티다아제, 프로테인키나아제, 글리코시다아제 등이 사용된다. 또, N 말단 아미노산을 결실시키기 위해서는 에드만(Edman) 시약 (페닐이소티오시아네이트) 을 사용한 공지된 에드만법을 사용할 수 있다.
이렇게 생성되는 본 발명에서 사용되는 SLC-1 또는 MCH 의 존재는 특이항체를 사용한 효소면역분석법 등에 의해 측정할 수 있다.
(2) MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 SLC-1 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법 또는 MCH 또는 그의 표지체 또는 그의 염 및 SLC-1 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트 (이하, 본 발명의 스크리닝 방법, 본 발명의 스크리닝용 키트로 약기함) 에 대해 이하에 상세히 서술한다.
SLC-1 또는 그의 염을 사용하거나 또는 재조합형 SLC-1 의 발현계를 구축하고, 이 발현계를 사용한 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염과의 결합분석계 (리간드ㆍ리셉터분석계) 를 사용함으로써, MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 (예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등) 또는 그의 염을 스크리닝할 수 있다.
이와 같은 화합물에는, SLC-1 을 통해 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 갖는 화합물 (즉 SLC-1 아고니스트) 과 상기 세포자극활성을 갖지 않는 화합물 (즉 SLC-1 안타고니스트) 등이 포함된다. 「MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염과의 결합성을 변화시킨다」란, MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염과의 결합을 저해하는 경우와 리간드와의 결합을 촉진하는 경우 양측을 포함하는 것이다.
즉, 본 발명은 (ⅰ) SLC-1 또는 그의 염에 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염을 접촉시킨 경우와 (ⅱ) 상기한 SLC-1 또는 그의 염에 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 시험화합물을 접촉시킨 경우의 비교를 행하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서는, (ⅰ) 상기한 SLC-1 또는 그의 염에, MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염을 접촉시킨 경우와 (ⅱ) 상기한 SLC-1 또는 그의 염에, MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 시험화합물을 접촉시킨 경우에서의, 예컨대 상기 SLC-1 또는 그의 염에 대한 리간드의 결합량, 세포자극활성 등을 측정하여 비교한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 구체적으로는,
① 표지한 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 (「MCH 의 유도체 또는 그의 염」으로서 상기의 「MCH 등이 표지화된 것 또는 그의 염」을 사용하는 경우에는 추가로 표지할 필요는 없다. 이하 동일) 을 상기한 SLC-1 또는 그의 염에 접촉시킨 경우와, 표지한 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 시험화합물을 SLC-1또는 그의 염에 접촉시킨 경우에서의, 표지한 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염의 상기 SLC-1 또는 그의 염에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법,
② 표지한 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염을 SLC-1 을 함유하는 세포 또는 이 세포의 막분획에 접촉시킨 경우와, 표지한 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 시험화합물을 SLC-1 을 함유하는 세포 또는 이 세포의 막분획에 접촉시킨 경우에서의, 표지한 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염의 상기 세포 또는 상기 막분획에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 염과 SLC-1 의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법,
③ 표지한 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염을 SLC-1 을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현한 SLC-1 에 접촉시킨 경우와, 표지한 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 시험화합물을 SLC-1 을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현한 SLC-1 에 접촉시킨 경우에서의, 표지한 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염의 SLC-1 에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 염과 SLC-1 의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법,
④ SLC-1 을 활성화하는 화합물 (예컨대, MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염) 을 SLC-1 을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우와, SLC-1 을 활성화하는 화합물 및 시험화합물을 SLC-1 을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우에서의, SLC-1 을 통한세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 염과 SLC-1 의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법, 및
⑤ SLC-1 을 활성화하는 화합물 (예컨대, MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 등) 을 SLC-1 을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현한 SLC-1 에 접촉시킨 경우와, SLC-1 을 활성화하는 화합물 및 시험화합물을 SLC-1 을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현한 SLC-1 에 접촉시킨 경우에서의, SLC-1 을 통한 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산유리, 아세틸콜린유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산생산, 세포막전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 염과 SLC-1 의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법 등이다.
이하에, 본 발명의 스크리닝 방법을 구체적으로 설명한다.
먼저 본 발명의 스크리닝 방법에 사용하는 SLC-1 로는 상기의 SLC-1 을 함유하는 것이면 어느것이어도 되지만, 인간, 온혈동물, 어류 등 장기의 막분획 등이 적합하다. 그러나, 특히 인간 유래의 장기는 입수가 매우 곤란하기 때문에, 스크리닝에 사용되는 것으로는 재조합체를 사용하여 대량 발현시킨 SLC-1 등이 적합하다. 특히 인간형 SLC-1 에 대해서는 이미 보고된 것 (FEBS Letters 398 (1996) 253-258 등) 의 아미노산 서열로 표시되는 SLC-1 에 비해, 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 SLC-1 을 사용함으로써 감도가 좋은 스크리닝이 가능해진다.
SLC-1 을 제조하기 위해서는 상술한 방법 등이 사용된다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 SLC-1 을 함유하는 세포 또는 이 세포막분획 등을 사용하는 경우, 후술하는 조제법에 따르면 된다.
SLC-1 을 함유하는 세포를 사용하는 경우, 이 세포를 글루탈알데히드, 포르말린 등으로 고정화해도 된다. 고정화방법은 그 자체 공지된 방법에 따라 행할 수 있다.
SLC-1 을 함유하는 세포로는 SLC-1 을 발현한 숙주세포를 말하는데, 이 숙주세포로는 상술한 대장균, 고초균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등을 들 수 있다.
막분획으로는 세포를 파쇄한 후, 그 자체 공지된 방법으로 얻어지는 세포막이 많이 포함되는 분획을 말한다. 세포의 파쇄방법으로는 Potter-Elvehjem 형 호모지나이저로 세포를 눌러 찌부러뜨리는 방법, 워링블렌더나 폴리트론 (Kinematica 사 제조) 에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 프렌치프레스 등으로 가압하면서 세포를 가는 노즐로부터 분출시킴에 의한 파쇄 등을 들 수 있다. 세포막의 분획에는 분획원심분리법이나 밀도구배원심분리법 등의 원심력에 의한 분획법이 주로 사용된다. 예컨대, 세포파쇄액을 저속 (500 rpm ∼ 3000 rpm) 으로 단시간 (통상, 약1 분 ∼ 10 분) 원심하고, 상청을 보다 고속 (15000 rpm ∼ 30000 rpm) 으로 통상 30 분 ∼ 2 시간 원심하고, 얻어지는 침전을 막분획으로 한다. 이 막분획 중에는, 발현한 SLC-1 과 세포 유래의 인지질이나 막단백질 등의 막성분이 많이 함유된다.
상기 SLC-1 을 함유하는 세포나 막분획 중의 SLC-1 의 양은, 1 세포당 103∼ 108분자인 것이 바람직하고, 105∼ 107분자인 것이 바람직하다. 또, 발현량이 많을수록 막분획당 리간드 결합활성 (비활성) 이 높아지고, 고감도의 스크리닝계의 구축이 가능해질 뿐 아니라, 동일 로트로 대량의 시료를 측정할 수 있게 된다.
MCH 또는 그의 염과 SLC-1 의 결합성을 변화시키는 화합물을 스크리닝하는 상기 ① ∼ ③ 을 실시하기 위해서는, 적당한 SLC-1 분획과, 표지한 리간드 또는 리간드 활성을 갖는 화합물 (MCH 또는 그의 유도체) 이 사용된다. SLC-1 분획으로는, 천연형의 SLC-1 분획이나, 또는 그와 동등한 활성을 갖는 재조합형 SLC-1 분획 등이 바람직하다. 여기에서, 동등한 활성이란, 동등한 리간드 결합활성 등을 나타낸다. 표지한 리간드 또는 리간드 활성을 갖는 화합물로는, 표지한 리간드 또는 리간드 활성을 갖는 화합물 (MCH 또는 그의 유도체) 등이 사용된다. 예컨대 [3H], [125I], [14C], [35S] 등으로 표지된 리간드 (MCH 또는 그의 유도체) 등을 이용할 수 있다. 특히, 보르톤헌터 시약을 사용하여 공지된 방법으로 조제한 MCH 의 유도체의 표지체를 이용할 수도 있다.
MCH 유도체의 표지체의 구체예로는, 예컨대 상기의 (1) ∼ (7) 로 표시되는 화합물 등을 들 수 있다.
구체적으로는, MCH 또는 그의 염과 SLC-1 의 결합성을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행하기 위해서는, 먼저 SLC-1 을 함유하는 세포 또는 세포의 막분획을 스크리닝에 적합한 버퍼에 현탁함으로써 리셉터 표품을 조제한다. 버퍼에는 pH 4 ∼ 10 (바람직하게는 pH 6 ∼ 8) 의 인산 버퍼, 트리스-염산 버퍼 등의 리간드와 리셉터의 결합을 저해하지 않는 버퍼이면 어느것이어도 된다. 또, 비특이적 결합을 저감시킬 목적으로, CHAPS, Tween-80TM(가오-아트라스사), 디기토닌, 데옥시콜레이트 등의 계면활성제를 버퍼에 첨가할 수도 있다. 또한, 프로테아제에 의한 SLC-1 이나 MCH 또는 그의 유도체의 분해를 억제할 목적으로 PMSF, 로이펩틴, E-64 (펩티드겡큐쇼 제조), 펩스타틴 등의 프로테아제 저해제를 첨가할 수도 있다. 0.01 ㎖ ∼ 10 ㎖ 의 상기 리셉터 용액에 일정량 (5000 cpm ∼ 500000 cpm) 의 표지한 MCH 또는 그의 유도체를 첨가하고, 동시에 10-4∼ 10-1μM 의 시험화합물을 공존시킨다. 비특이적 결합량 (NSB) 을 알기 위해 대과잉의 미표지의 MCH 또는 그의 유도체를 첨가한 반응 튜브도 준비한다. 반응은 0 ℃ 에서 50 ℃, 바람직하게는 4 ℃ 에서 37 ℃ 에서 20 분에서 24 시간, 바람직하게는 30 분에서 3 시간 행한다. 반응후, 유리섬유 여과지 등으로 여과하고, 적당량의 동 버퍼로 세정한 후, 유리섬유 여과지에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터 또는 γ-카운터로 계측한다. 길항하는 물질이 없는 경우의 카운트 (B0) 로부터비특이적 결합량 (NSB) 를 뺀 카운트 (B0-NSB) 를 100 % 로 했을 때, 특이적 결합량 (B-NSB) 이 예컨대 50 % 이하가 되는 시험화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로서 선택할 수 있다.
또, SLC-1 과 MCH 또는 그의 유도체의 결합을 측정하는 방법으로서, BIAcore (아마샴팔마시아바이오테크사 제조) 를 사용할 수도 있다. 이 방법에서는, MCH 또는 그의 유도체를 장치에 첨부한 프로토콜에 따른 아미노커플링법에 의해 센서칩에 고정하고, SLC-1 을 함유하는 세포 또는 SLC-1 을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질변환체로부터 정제한 SLC-1 또는 SLC-1 을 함유하는 막분획, 또는 정제한 SLC-1 또는 SLC-1 을 함유하는 막분획 및 시험화합물을 함유하는 인산 버퍼 또는 트리스 버퍼 등의 완충액을 센서칩상을 매분 2 - 20 ㎕ 의 유량으로 통과시킨다. 센서칩상의 MCH 또는 그의 유도체와 SLC-1 이 결합함으로써 발생하는 표면 플라즈몬 공명의 변화를 공존하는 시험화합물이 변화시키는 것을 관찰함으로써 SLC-1 과 MCH 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 이 방법은, SLC-1 을 센서칩에 고정하고, MCH 또는 그의 유도체 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 함유하는 인산 버퍼 또는 트리스 버퍼 등의 완충액을 센서칩상을 통과시키는 방법을 사용해도 동일하게 측정할 수 있다. 시험화합물로는, 상기와 동일한 것 등을 들 수 있다.
MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 화합물을 스크리닝하는 상기 ④ ∼ ⑤ 의 방법을 실시하기 위해서는, SLC-1 을 통한 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 공지된 방법 또는 시판되는 측정용 키트를 사용하여 측정할 수 있다. 구체적으로는, 먼저 SLC-1 을 함유하는 세포를 멀티 웰 플레이트 등에 배양한다. 스크리닝을 행함에 있어서는 미리 신선한 배지 또는 세포에 독성을 나타내지 않는 적당한 버퍼로 교환하고, 시험화합물 등을 첨가하여 일정시간 인큐베이트한 후, 세포를 추출 또는 상청액을 회수하여 생성된 산물을 각각의 방법에 따라 정량한다. 세포자극활성의 지표로 하는 물질 (예컨대, 아라키돈산 등) 의 생성이, 세포가 함유하는 분해효소에 의해 검정 곤란한 경우에는, 이 분해효소에 대한 저해제를 첨가하여 분석을 행해도 된다. 또, cAMP 생산억제 등의 활성에 대해서는, 폴스콜린 등으로 세포의 기초적 생산량을 증대시켜 둔 세포에 대한 생산억제작용으로서 검출할 수 있다.
세포자극활성을 측정하여 스크리닝을 행하기 위해서는, 적당한 SLC-1 을 발현한 세포가 필요하다. 본 발명의 SLC-1 을 발현한 세포로는, 상술한 재조합형 SLC-1 발현세포주 등이 바람직하다. 형질전환체인 SLC-1 발현세포는 안정 발현주라도 일과성 발현주라도 관계없다. 또, 동물세포의 종류는 상기와 동일한 것이 사용된다.
시험화합물로는, 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물,발효생산물, 세포추출액, 식물추출액, 동물조직 추출액 등을 들 수 있다.
상기의 리간드ㆍ리셉터 분석계에 대해, 더욱 구체적으로 기재하면 이하와 같은 분석계가 사용된다.
(1) 수용체 발현세포가 수용체 아고니스트에 의해 자극되면 세포내의 G 단백질이 활성화되어 GTP 가 결합한다. 이 현상은 수용체 발현세포의 막분획에서도 관찰된다. 통상, GTP 는 가수분해되어 GDP 로 변화하지만, 이 때 반응액 중에 GTPγS 를 첨가해 두면 GTPγS 는 GTP 와 동일하게 G 단백질에 결합하지만, 가수분해되지 않고 G 단백질을 함유하는 세포막에 결합한 상태가 유지된다. 표지한 GTPγS 를 사용하면 세포막에 잔존한 방사활성을 측정함으로써 수용체 아고니스트의 수용체 발현세포 자극활성을 측정할 수 있다. 이 반응을 이용하여 MCH 또는 그의 유도체의 SLC-1 발현세포에 대한 자극활성을 측정할 수 있다. 이 방법은, 상기 ④ ∼ ⑤ 와 같이 SLC-1 을 함유하는 세포를 사용하는 것이 아니라, ① ∼ ③ 과 같이 SLC-1 을 함유하는 막분획을 사용하는 분석법이지만, ④ ∼ ⑤ 와 같이 세포자극활성을 측정하는 것이며, 본 측정법에서 SLC-1 막분획으로의 GTPγS 결합촉진활성을 나타내는 물질은 아고니스트가다. 구체적으로는 후술하는 실시예 9, 실시예 16 및 그들에 준한 방법으로 행해진다. 여기에서, MCH 또는 그의 유도체 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가하고, MCH 또는 그의 유도체의 단독투여에 비해 SLC-1 세포막분획으로의 GTPγS 결합촉진활성에 변화가 발생하는 것을 관찰함으로써 MCH 와 SLC-1 의 결합성을 변화시키는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체에 의한 SLC-1 세포막분획으로의 GTPγS 결합촉진활성을 억제하는 활성을 나타내는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로서 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만을 투여하고, SLC-1 세포막분획으로의 GTPγS 결합촉진활성을 관찰함으로써 아고니스트의 스크리닝을 행할 수도 있다.
스크리닝법의 일례에 대해 보다 구체적으로 이하에 설명한다. 후술하는 실시예 9 또는 실시예 16 에 서술한 방법으로 조제한 인간 또는 래트 SLC-1 을 함유하는 세포막분획을, 막희석 완충액 (50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 μM GDP, 0.1 % BSA pH 7.4) 으로 희석한다. 희석률은, 수용체의 발현량에 따라 다르다. 이것을 Falcon2053 에 0.2 ㎖ 씩 분주하고, MCH 또는 그의 유도체 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가하고, 추가로 최종농도 200 pM 이 되도록 [35S]GTPγS 를 첨가한다. 25 ℃ 에서 1 시간 보온한 후, 빙냉한 세정용 완충액 (50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.1 % BSA, 0.05 % CHAPS pH 7.4 1.5 ㎖) 을 첨가하여, 유리섬유 여과지 GF/F 로 여과한다. 65 ℃, 30 분 보온하여 건조한 후, 액체 신틸레이션 카운터로 여과지상에 남은 막분획에 결합한 [35S]GTPγS 의 방사활성을 측정한다. MCH 또는 그의 유도체만을 첨가한 실험구의 방사활성을 100 %, MCH 또는 그의 유도체를 첨가하지 않았던 실험구의 방사활성을 0 % 로 하여, MCH 또는 그의 유도체에 의한 GTPγS 결합촉진활성에 대한 시험화합물의 영향을 산출한다. GTPγS 결합촉진활성이 예컨대 50 % 이하가 되는 시험화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로서 선택할 수 있다.
(2) SLC-1 발현세포는 MCH 자극에 의해 세포내 cAMP 량이 감소한다. 이 반응을 이용하여 MCH 의 SLC-1 발현세포에 대한 자극활성을 측정할 수 있다.
SLC-1 을 발현시킨 여러 가지 동물세포의 cAMP 생산량은 마우스, 래트, 토끼, 염소, 소 등을 면역하여 얻어진 항 cAMP 항체와125I 표지 cAMP (모두 시판품) 를 사용함으로써 RIA 또는 항 cAMP 항체와 표지 cAMP 를 조합한 다른 EIA 계로도 측정할 수 있다. 또, 항 cAMP 항체를 단백질 A 또는 항 cAMP 항체 생산에 사용한 동물의 IgG 등에 대한 항체 등을 사용하여 고정한 신틸란트를 함유하는 비즈와125I 표지 cAMP 를 사용하는 SPA 법에 의한 정량도 가능하다 (아마샴팔마시아바이오테크 제조의 키트를 사용함).
cAMP 생산억제의 분석은, 구체적으로는 후술하는 실시예 14 및 그에 준한 방법으로 행해진다. 이 계에 있어서, 폴스콜린 또는 칼시토닌세포 cAMP 량을 증가시키는 리간드 등에 의해 세포내 cAMP 량을 상승시키고, MCH 또는 그의 유도체 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가함으로써 MCH 또는 그의 유도체의 단독투여에 의한 세포내 cAMP 량의 억제가 변화하는 것을 관찰하고, MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체에 의한 SLC-1 발현세포의 cAMP 생산억제활성을 저해하는 활성을 나타내는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로서 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만을 첨가하여 cAMP 생산억제활성을 조사함으로써 아고니스트 활성을 나타내는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다.
스크리닝법을 보다 구체적으로 이하에 기재한다. CHO/SLC-1 세포를 24 웰 플레이트에 5 ×104세포/웰 로 파종하고, 48 시간 배양한다. 세포를 0.2 mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 로 세정한다 (이하, 0.2 mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 를 반응용 버퍼라 함). 그 후, 0.5 ㎖ 의 반응용 버퍼를 첨가하여 30 분간 배양기에서 보온한다. 반응용 버퍼를 제거하고, 새로이 0.25 ㎖ 의 반응용 버퍼를 세포에 첨가한 후, 2 μM 폴스콜린을 함유하는 0.25 ㎖ 의 반응용 버퍼에 1 nM 의 MCH 또는 그의 유도체 또는 1 nM 의 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가한 것을 세포에 첨가하여 37 ℃ 에서 24 분간 반응시킨다. 100 ㎕ 의 20 % 과염소산을 첨가하여 반응을 정지시키고, 다음으로 빙상에서 1 시간 둠으로써 세포내 cAMP 를 추출한다. 추출액 중의 cAMP 량은, cAMP EIA 키트 (아마샴팔마시아바이오테크) 를 사용하여 측정한다. 폴스콜린 자극에 의해 생산된 cAMP 량을 100 % 로 하고, 1 nM 의 MCH 또는 그의 유도체의 첨가에 의해 억제된 cAMP 량을 0 % 로 하여, MCH 또는 그의 유도체에 의한 cAMP 생산억제활성에 대한 시험화합물의 영향을 산출한다. MCH 또는 그의 유도체의 활성을 저해하여 cAMP 생산활성이 예컨대 50 % 이상이 되는 시험화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로서 선택할 수 있다.
cAMP 생산촉진활성을 측정하기 위해서는, 폴스콜린을 첨가하지 않고 CHO/SLC-1 세포에 시험화합물을 첨가하여 생산된 cAMP 를 상기의 방법으로 정량한다.
(3) CRE (cAMP response element) 를 함유하는 DNA 를, 피커진 베이식벡터 또는 피커진 인핸서벡터 (도요잉크세이조 (주)) 의 루시페라아제 유전자 상류의 멀티클로닝사이트에 삽입하고, 이것을 CRE-리포터 유전자 벡터로 한다. CRE-리포터 유전자 벡터를 트랜스펙션한 세포에 있어서, cAMP 상승을 수반하는 자극은 CRE를 통한 루시페라아제 유전자 발현과 그에 이어지는 루시페라아제 단백질의 생산을 유도한다. 즉, 루시페라아제 활성을 측정함으로써, CRE-리포터 유전자 벡터 도입세포내의 cAMP 량의 변동을 검출할 수 있다. CRE-리포터 유전자 벡터를 SLC-1 발현세포에 트랜스펙션한 세포를 이용하여 MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 구체적인 스크리닝법을 이하에 기재한다.
CRE-리포터 유전자 도입 SLC-1 발현세포를 24 웰 플레이트에 5 ×103세포/웰 로 파종하고, 48 시간 배양한다. 세포를 0.2 mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 로 세정한다 (이하, 0.2 mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 를 반응용 버퍼라 함). 그 후, 0.5 ㎖ 의 반응용 버퍼를 첨가하여 30 분간 배양기에서 보온한다. 반응용 버퍼를 제거하고, 새로이 0.25 ㎖ 의 반응용 버퍼를 세포에 첨가한 후, 1 nM 의 MCH 또는 그의 유도체, 또는 1 nM 의 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물와 2 μM 폴스콜린을 포함하는 0.25 ㎖ 의 반응용 버퍼를 세포에 첨가하여 37 ℃ 에서 24 분간 반응시킨다. 세포를 피커진용 세포용해제 (도요잉크세이조 (주)) 로 용해하고, 용해액에 발광기질 (도요잉크세이조 (주)) 을 첨가한다. 루시페라아제에 의한 발광은 루미노미터, 액체 신틸레이션 카운터 또는 톱 카운터에 의해 측정한다. MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은 루시페라아제에 의한 발광량을 MCH 또는 그의 유도체를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체의 투여에 의해 폴스콜린 자극에 의한 발광량의 증가가 억제되지만, 이 억제를 회복시키는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만을 투여하고, 폴스콜린 자극에 의해 상승한 발광량의 MCH 또는 그의 유도체와 동일한 억제를 관찰함으로써 아고니스트의 스크리닝을 행할 수도 있다.
리포터 유전자로서 루시페라아제 이외에 예컨대 알칼리포스파타아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제 또는 β-갈락토시다아제를 사용할 수도 있다. 이들 리포터 유전자의 유전자 산물의 효소활성은 다음과 같이 시판되는 측정 키트를 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 알칼리포스파타아제 활성은 예컨대 와꼬준야꾸 제조 Lumi-Phos 530 에 의해, 클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제 (chloramphenicol acetyltransferase) 활성은 예컨대 와꼬준야꾸 제조 FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay KiT 에 의해, β-갈락토시다아제 활성은 예컨대 와꼬준야꾸 제조 Aurora Gal-XE 에 의해 측정할 수 있다.
(4) SLC-1 발현 세포는 MCH 자극의 결과 아라키돈산 대사물을 세포밖으로 방출한다. 미리 방사활성을 갖는 아라키돈산을 세포에 주입시켜 둠으로써, 이 활성을 세포밖으로 방출된 방사활성을 측정함으로써 측정할 수 있다. 측정은 후술하는 실시예 6 및 그에 준한 방법에 의해 행해진다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체, 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가하여 MCH 또는 그의 유도체의 아라키돈산 대사물 방출활성에 대한 영향을 조사함으로써 MCH 와 SLC-1 의 결합에 영향을 미치는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체에 의한 아라키돈산 대사물 방출활성을 저해하는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 또, 시험화합물만을 첨가하고, SLC-1 발현세포의 아라키돈산 대사물 방출활성을 후술하는 실시예 6 에 준한 방법으로 조사함으로써 아고니스트 활성을 나타내는 화합물의 스크리닝을 행할 수도 있다. MCH 와 SLC-1 의 결합에 영향을 미치는 화합물의 스크리닝법을 보다 구체적으로 이하에 서술한다.
CHO/SLC-1 세포를 24 웰 플레이트에 5 ×104세포/웰 로 파종하고, 24 시간 배양후, [3H] 아라키돈산을 0.25 μCi/웰 이 되도록 첨가한다. [3H] 아라키돈산 첨가 16 시간후, 세포를 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 포함하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 로 세정하고, 각 웰에 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 포함하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 에 용해한 최종농도 10 nM 의 MCH 또는 그의 유도체, 또는 10 nM 의 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 포함하는 버퍼 500 ㎕ 를 첨가한다. 이후, 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 포함하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 를 반응용 버퍼라고 부른다. 37 ℃ 에서 60 분간 인큐베이트한 후, 반응액 400 ㎕ 를 신틸레이터에 첨가하고, 반응액중에 유리한 [3H] 아라키돈산 대사물의 양을 신틸레이션 카운터에의해 측정한다. MCH 또는 그의 유도체의 비첨가반응 버퍼에 의한 배지중의 [3H] 아라키돈산 대사물의 양을 0 % 로 하고, 10 nM 의 MCH 또는 그의 유도체를 첨가했을 때의 배지중의 [3H] 아라키돈산 대사물의 양을 100 % 로 하여 시험화합물의 MCH 또는 그의 유도체와 SLC-1 의 결합에 대한 영향을 산출한다. 아라키돈산 대사물 생산 활성이 예컨대 50 % 이하가 되는 시험화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다.
(5) SLC-1 발현세포를 MCH 에 의해 자극함으로써 세포내의 Ca 농도가 상승한다. 이것을 이용함으로써 MCH 와 SLC-1 의 결합에 대한 시험화합물의 영향을 조사할 수 있다.
SLC-1 발현세포를 멸균한 현미경용 커버글래스상에 뿌리고, 2 일후 배양액을 4 mM Fura-2AM (도진가가꾸겡큐쇼) 을 현탁한 HBSS 로 치환하여 실온에서 2 시간 30 분 방치한다. HBSS 로 세정한 후, 큐베트에 커버글래스를 세트하고, 형광측정기로 MCH 또는 그의 유도체, 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가했을 때의 여기파장 340 nm 및 380 nm 에서의 505 nm 의 형광강도의 비의 상승을 측정한다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체를 단독으로 투여했을 때와 비교하여 시험화합물의 첨가에 의해 발생하는 형광강도의 변화를 측정함으로써 MCH 와 SLC-1 의 결합에 대하여 영향을 미치는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 또, 다음과 같이 FLIPR (모레큘러디바이스사 제조) 을 사용할 수도 있다. 즉, 세포현탁액에 Fluo-3AM (도진가가꾸겡큐쇼 제조) 을 첨가하여 세포에 주입시킨 후, 상청을원심에 의해 몇번 세정한 후, 96 웰 플레이트에 세포를 뿌린다. FLIPR 장치에 세트하고, Fura-2 의 경우와 동일하게 MCH 또는 그의 유도체, 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가하고, MCH 또는 그의 유도체를 단독으로 투여했을 때와 비교하여 시험화합물의 첨가에 의해 관측되는 형광강도의 변화를 측정함으로써 MCH 또는 그의 유도체와 SLC-1 의 결합에 대하여 영향을 미치는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 이들에 있어서, MCH 또는 그의 유도체에 의한 형광강도의 상승을 억제하는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만의 첨가에 의한 형광강도의 상승을 관찰함으로써 아고니스트의 스크리닝을 행할 수도 있다.
SLC-1 발현세포에 애쿠오린 등과 같이 세포내 Ca 이온의 상승에 의해 발광하는 단백질의 유전자를 동시에 발현시켜 두고, 세포내 Ca 이온 농도의 상승에 의해 애쿠오린 이 Ca 결합형이 되어 발광하는 것을 이용하여 MCH 또는 그의 유도체, 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가하고, MCH 또는 그의 유도체를 단독으로 투여했을 때와 비교하여 시험화합물의 첨가에 의해 관측되는 발광강도의 변화를 측정함으로써 MCH 와 SLC-1 의 결합에 대하여 영향을 미치는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 방법은 형광물질을 주입시키지 않는 것 이외에는 상기와 동일하다.
(6) 수용체를 발현하는 세포에 수용체 아고니스트를 첨가하면, 세포내 이노시톨 3 인산 농도가 상승함이 알려져 있다. MCH 에 의해 발생하는 SLC-1 세포에서의 이 반응을 관찰함으로써 MCH 와 SLC-1 의 결합에 영향을 미치는 화합물의스크리닝을 행할 수 있다. 24 웰 플레이트에 뿌려 1 일째의 세포에 myo-[2-3H]이노시톨 (2.5 마이크로 Ci/웰) 을 첨가한 배지중에서 1 일 배양한 세포를 잘 세정한 후, MCH 또는 그의 유도체, 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가한 후 10 % 과염소산을 첨가하여 반응을 멈춘다. 1.5 M KOH, 60 mM HEPES 용액으로 중화하고, 0.5 ㎖ 의 AG1 ×8 수지 (Bio-Rad) 를 채운 칼럼에 통과시키고, 5 mM Na2BO360mM HCOONH4로 세정한 후, 1 M HCOONH40.1 M HCOOH 로 용출한 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정한다. MCH 또는 그의 유도체의 비첨가반응 버퍼에 의한 배지중의 방사활성을 0 % 로 하고, MCH 또는 그의 유도체를 첨가했을 때의 배지중의 방사활성을 100 % 로 하여 시험화합물의 MCH 또는 그의 유도체와 SLC-1 의 결합에 대한 영향을 산출한다. 이노시톨 3 인산 생산 활성이 예컨대 50 % 이하가 되는 시험화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만의 첨가에 의한 이노시톨 3 인산 생산 상승을 관찰함으로써 아고니스트의 스크리닝을 행할 수도 있다.
(7) TRE (TPA response element) 를 포함하는 DNA 를 피커진 베이식벡터 또는 피커진 인핸서벡터 (도요잉크세이조 (주)) 의 루시페라아제 유전자 상류의 멀티클로닝사이트에 삽입하고, 이것을 TRE-리포터 유전자 벡터로 한다. TRE-리포터 유전자 벡터를 트랜스펙션한 세포에서, 세포내 Ca 상승을 수반하는 자극은 TRE 를 통한 루시페라아제 유전자 발현과 그에 이어지는 루시페라아제 단백질의 생산을 유도한다. 즉, 루시페라아제 활성을 측정함으로써 TRE-리포터 유전자 벡터 도입세포내의 칼슘량의 변동을 검출할 수 있다. TRE-리포터 유전자 벡터를 SLC-1 발현세포에 트랜스펙션한 세포를 이용한 MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 구체적인 스크리닝법을 이하에 기재한다.
TRE-리포터 유전자 도입 SLC-1 발현세포를 24 웰 플레이트에 5 ×103세포/웰 로 파종하고, 48 시간 배양한다. 세포를 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 포함하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 로 세정한 후, 10 nM 의 MCH 또는 그의 유도체 또는 10 nM 의 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가하여 37 ℃ 에서 60 분간 반응시킨다. 세포를 피커진용 세포용해제 (도요잉크세이조 (주)) 로 용해하고, 용해액에 발광기질 (도요잉크세이조 (주)) 을 첨가한다. 루시페라아제에 의한 발광은 루미노미터, 액체 신틸레이션 카운터 또는 톱 카운터에 의해 측정한다. MCH 또는 그의 유도체와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은 루시페라아제에 의한 발광량을 MCH 또는 그의 유도체를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체의 투여로 인해 세포내 Ca 의 상승에 의해 발광량이 증가하지만, 이 증가를 억제하는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편 시험화합물만을 투여하고, MCH 또는 그의 유도체와 동일한 발광량의 증가를 관찰함으로써 아고니스트의 스크리닝을 행할 수도 있다.
리포터 유전자로서 루시페라아제 이외에 예컨대 알칼리포스파타아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제 또는 β-갈락토시다아제를 사용할 수도 있다. 이들 리포터 유전자의 유전자 산물의 효소활성은 다음과 같이 시판되는 측정 키트를 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 알칼리포스파타아제 활성은 예컨대 와꼬준야꾸 제조 Lumi-Phos 530 에 의해, 클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제 (chloramphenicol acetyltransferase) 활성은 예컨대 와꼬준야꾸 제조 FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kit 에 의해, β-갈락토시다아제 활성은 예컨대 와꼬준야꾸 제조 Aurora Gal-XE 에 의해 측정할 수 있다.
(8) MCH 에 응답한 SLC-1 발현세포는 MAP 키나아제 활성화에 의해 증식이 관찰된다. 이 증식을 MAP 키나아제 활성, 티미딘 주입, 세포수 측정 (MTT 등) 에 의해 측정할 수 있다. 이것을 이용하여 MCH 또는 그의 유도체와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다.
MAP 키나아제 활성은 MCH 또는 그의 유도체, 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 세포에 첨가한 후, 세포용해액으로부터 항 MAP 키나아제 항체를 사용한 면역침강에 의해 MAP 키나아제 분획을 얻은 후, 예컨대 와꼬준야꾸 제조 MAP kinase Assay Kit 와 γ-[32P]-ATP 를 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 티미딘 주입활성은 SLC-1 발현세포를 뿌리고, MCH 또는 그의 유도체, 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가한 후, [메틸-3H] -티미딘을 첨가하고, 그 후 세포내에 주입된 표지 티미딘의 방사활성을 세포에 용해하여 액체 신틸레이션 카운터로 계수함으로써 측정할 수 있다.
SLC-1 발현세포의 증식은 발현세포를 뿌리고, MCH 또는 그의 유도체, 또는MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 첨가한 후 MTT(3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸리윰 브로마이드)를 첨가하고, 세포내에 주입되어 MTT 가 변화한 MTT 포르마잔을 염산산성으로 한 이소프로판올로 세포를 용해한 후, 570 nm 의 흡수를 측정하는 것에 의해서도 측정할 수 있다.
MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 표지 티미딘 주입활성을 이용한 구체적인 스크리닝법을 이하에 기재한다.
SLC-1 발현세포를 24 웰 플레이트에 웰당 5000 개 뿌려 1 일간 배양한다. 다음으로 혈청을 포함하지 않은 배지에서 2 일간 배양하여 세포를 기아상태로 한다. MCH 또는 그의 유도체, 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 세포에 첨가하여 24 시간 배양한 후 [메틸-3H] -티미딘을 웰당 0.015 MBq 첨가하여 6 시간 배양한다. 세포를 PBS 로 세정한 후, 메탄올을 첨가하여 10 분간 방치한다. 다음으로 5 % 트리클로로아세트산을 첨가하여 15 분간 방치후, 고정된 세포를 증류수로 4 회 세정한다. 0.3 N 수산화 나트륨 용액으로 세포를 용해하고, 용해액중의 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정한다. MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은, 티미딘 주입에 의한 방사활성의 상승을 MCH 또는 그의 유도체를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체의 투여에 의한 방사활성의 증가를 억제하는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편 시험화합물만을 투여하고, MCH 또는 그의 유도체와 동일한 방사활성의 증가를 관찰함으로써 아고니스트의 스크리닝을 행할 수도 있다.
(9) SLC-1 발현세포에 MCH 를 첨가하면 K 채널이 활성화되어, 세포내에 있는 K 이온이 세포밖으로 유출된다. K 이온과 동족원소인 Rb 이온은 K 이온과 구별없이 K 채널을 통해 세포밖으로 유출되기 때문에, 세포에 표지 Rb ([86Rb]) 를 첨가하여 주입시켜 둔 후, MCH 의 자극에 의해 유출되는 [86Rb] 의 흐름을 측정함으로써 MCH 의 작용을 측정할 수 있다. MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의, [86Rb] 유출활성을 이용한 구체적인 스크리닝법을 이하에 기재한다.
24 웰에 뿌려 2 일후의 SLC-1 발현세포를 1 mCi/㎖ 의86RbCl 을 함유하는 배지중에서 2 시간 보온한다. 배지를 잘 세정하고, 외액 중의86RbCl 을 완전히 제거한다. MCH 또는 그의 유도체 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 세포에 첨가하여 30 분후의 외액을 회수하고, γ카운터로 방사활성을 측정한다. MCH 또는 그의 유도체와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은, [86Rb] 유출에 의한 방사활성의 상승을 MCH 또는 그의 유도체를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체의 투여에 의한 방사활성의 상승을 억제하는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편 시험화합물만을 투여하고, MCH 또는 그의 유도체와 동일한 방사활성의 상승을 관찰함으로써 아고니스트의 스크리닝을 행할 수도 있다.
(10) SLC-1 발현세포가 MCH 에 반응하여 변화하는 세포외의 pH (acidification rate) 를 사이토센서(Cytosensor) 장치 (모레큘러디바이스사) 를 사용하여 측정함으로써 MCH 의 활성을 측정할 수 있다. 사이토센서 장치를 이용한, 세포외 pH 변화를 측정함에 의한 MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 구체적인 스크리닝법을 이하에 기재한다.
SLC-1 발현세포를 사이토센서 장치용의 캡슐내에서 밤새 배양하고, 장치의 챔버에 세트하여 세포외 pH 가 안정될 때까지 약 2 시간 0.1 % BSA 를 함유하는 RPMI 1640 배지 (모레큘러디바이스사 제조) 를 관류시킨다. pH 가 안정된 후, MCH 또는 그의 유도체 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 함유하는 배지를 세포상에 관류시킴으로써 발생하는 배지의 pH 변화를 측정한다. MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은, SLC-1 발현세포의 세포외 pH 변화를 MCH 또는 그의 유도체를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이때, MCH 또는 그의 유도체의 투여에 의한 세포외 pH 변화를 억제하는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만을 투여하고, MCH 또는 그의 유도체와 동일한 세포외 pH 변화를 관찰함으로써 아고니스트의 스크리닝을 행할 수도 있다.
(11) 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 의 합플로이드 α-메이팅 형 (haploid α-mating Type) (MATα) 의 성페로몬수용체 STe2 는 G 단백질 Gpa1 과 커플되어 있고, 성페로몬 α-메이팅팩터에 응답하여 MAP 키나아제 를 활성화하고, 이하 Farl (cell-cycle arrest) 및 전사활성화인자 Ste12 가 활성화된다.Ste12 는 접합에 관여하는 FUS1 을 함유하는 여러 가지 단백질의 발현을 유도한다. 한편, 제어인자 Sst2 는 이상의 과정에 억제적으로 기능한다. 이 계에 있어서, 수용체 유전자 도입한 효모를 제작하고, 수용체 아고니스트 자극에 의해 효모세포내의 시그널 전달계를 활성화하고, 그 결과 발생되는 증식 등의 지표를 사용한, 수용체 아고니스트와 수용체의 반응의 측정계의 시도가 행해지고 있다 (Pausch, M.H., Trends in Biotechnology, vol. 15, pp. 487-494 (1997)). 이러한 수용체 유전자 도입효모의 계를 이용하여 MCH 및 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다.
MATα효모의 Ste2 및 Gpa1 을 코딩하는 유전자를 제거하고, 그 대신에 SLC-1 유전자 및 Gpa1-Gai2 융합단백질을 코딩하는 유전자를 도입한다. Far 을 코딩하는 유전자를 제거하여 세포 주기 어레스트 (cell-cycle arrest)가 발생되지 않도록 하고, 또한 Sst 를 코딩하는 유전자를 제거함으로써 MCH 에 대한 응답 감도를 향상시켜 둔다. 또한, FUS1 에 히스티딘 생합성유전자 HIS3 을 연결한 FUS1-HIS3 유전자를 도입한다. 이상의 유전자 재조합 조작은, 예컨대 Price 등 (Price, L.A. et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pp. 6188-6195 (1995)) 의 보고에 기재된 방법에 있어서, 소마토스타틴 수용체 타입 2 (SSTR2) 유전자를 SLC-1 로 치환하여 실시함으로써 용이하게 행할 수 있다. 이렇게 하여 구축된 형질변환효모는 SLC-1 의 리간드인 MCH 에 고감도로 반응하고, 그 결과 MAP 키나아제의 활성화가 일어나 히스티딘 생합성효소가 합성되어 히스티딘 결핍배지에서 생육할 수 있게 된다. 이것을 이용하여, 히스티딘 결핍배지에서의 효모의생육을 지표로 하여 MCH 에 의한 SLC-1 발현효모의 응답을 관찰할 수 있다. 이하에 MCH 및 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝법을 서술한다.
상기와 같이 하여 제작된 형질변환효모를 완전합성배지의 액체배지에서 밤새 배양하고, 2 ×104세포/㎖ 의 농도로 히스티딘을 제거한 용해한천배지에 첨가하고, 9 ×9 ㎝ 의 사각형 샬레에 뿌린다. 한천이 고화된 후, MCH 또는 그의 유도체 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 스며들게 한 멸균여과지를 한천 표면에 놓고, 30 ℃ 에서 3 일간 배양한다. MCH 또는 그의 유도체와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은, 여과지 주위의 효모의 생육을 MCH 또는 그의 유도체를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체의 투여에 의한 효모의 생육을 억제하는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만을 투여하고, MCH 또는 그의 유도체와 동일한 효모의 생육을 관찰함으로써 아고니스트의 스크리닝을 행할 수도 있다. 또한, 미리 한천배지에 MCH 또는 그의 유도체를 첨가해 두고 멸균여과지에 시험화합물만을 스며들게 하여 배양하고, 샬레 전체면에서의 효모의 생육이 여과지의 주위에서 영향을 받는 것을 관찰함으로써도 MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향을 조사할 수 있다.
(12) SLC-1 유전자 RNA 를 아프리카쯔메가에루 난모(卵母)세포에 주입하고, MCH 에 의해 자극하면 세포내 Ca 이온농도가 상승하여 칼슘-활성화 클로라이드 흐름 (calcium-activated chloride current)이 발생된다. 이것을 막전위의 변화로서 파악할 수 있다 (K 이온농도구배에 변화가 있는 경우에도 동일함). MCH 에 의해 발생되는 SLC-1 도입 아프리카쯔메가에루 난모세포에 있어서의 이 반응을 관찰함으로써, MCH 와 SLC-1 의 결합에 영향을 미치는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다.
빙냉하여 움직일 수 없게 된 암컷의 아프리카쯔메가에루로부터 인출한 난모세포 덩어리를, MBS 액 (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.41 mM CaCl2, 0.33 mM Ca(NO3)2, 0.82 mM MgSO4, 2.4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7.4) 에 용해시킨 콜라게나아제 (0.5 ㎎/㎖) 로 알 덩어리가 풀릴 때까지 19 ℃, 1 - 6 시간, 150 rpm 으로 처리한다. 외액을 MBS 액으로 치환함으로써 3 번 세정하고, 마이크로머니퓰레이터로 poly(A)+SLC-1 cRNA (50 ng/50 nl) 를 마이크로인젝션한다. SLC-1 mRNA 는 조직이나 세포로부터 조제해도, 플라스미드로부터 인비트로 (in vitro)로 전사해도 된다. 이것을 MBS 액중에서 20 ℃ 에서 3 일 배양한다. 이것을 링게르액을 흘리고 있는 전압 클램프 장치의 움푹 패인 곳에 놓고, 전위고정용 유리미소전극, 전위측정용 유리미소전극을 세포내에 찔러 넣고, (-) 극은 세포외에 놓는다. 전위가 안정되면, MCH 또는 그의 유도체 또는 MCH 또는 그의 유도체 및 시험화합물을 함유하는 링게르액을 흘려 전위변화를 기록한다. MCH 와 SLC-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은, SLC-1 도입 아프리카쯔메가에루 난모세포의 세포막 전위변화를 MCH 또는 그의 유도체를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, MCH 또는 그의 유도체의 투여에 의한 세포막 전위변화를 억제하는 화합물을 길항저해능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만을 투여하고, MCH 또는 그의 유도체와 동일한 세포막 전위변화를 관찰함으로써 아고니스트의 스크리닝을 행할 수도 있다.
이 계에서, 반응의 변화량을 증대시켜 측정하기 쉽도록 각종 G 단백질 유전자의 poly(A)+RNA 를 도입할 수도 있다. 또한 애쿠오린과 같은 Ca 존재하에서 발광을 일으키는 단백질의 유전자의 poly(A)+RNA 를 동시에 주입함으로써 막전위변화가 아니고 발광을 관찰하여 이 반응을 측정할 수도 있다.
MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트는, SLC-1 또는 그의 염, SLC-1 을 함유하는 세포, 또는 SLC-1 을 함유하는 세포의 막분획, 및 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염을 함유하는 것이다.
본 발명의 스크리닝용 키트의 예로는, 다음의 것을 들 수 있다.
1. 스크리닝용 시약
① 측정용 완충액 및 세정용 완충액
행크스 평형염액 (Hanks' Balanced Salt Solution) (기브코사 제조) 에, 0.05 % 의 소 혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 첨가한 것.
구멍직경 0.45 ㎛ 의 필터로 여과멸균하고, 4 ℃ 에서 보존하거나, 또는 사용시 조제해도 된다.
② SLC-1 표품
SLC-1 을 발현시킨 CHO 세포를, 12 웰 플레이트에 5 ×105개/웰로 계대하고, 37 ℃, 5 % CO2, 95 % 공기에서 2 일간 배양한 것.
③ 표지 리간드
[3H], [125I], [14C], [35S] 등으로 표지한 MCH.
적당한 용매 또는 완충액에 용해시킨 것을 4 ℃ 또는 -20 ℃ 에서 보존하고, 사용시에 측정용 완충액으로 1 μM 으로 희석한다.
④ 리간드 표준액
MCH 를 0.1 % 소 혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 함유하는 PBS 로 1 mM 이 되도록 용해하고, -20 ℃ 에서 보존한다.
2. 측정법
① 12 웰 조직배양용 플레이트에서 배양한 SLC-1 을 발현시킨 세포를, 측정용 완충액 1 ㎖ 로 2 회 세정한 후, 490 ㎕ 의 측정용 완충액을 각 구멍에 첨가한다.
② 10-3~ 10-10M 의 시험화합물 용액을 5 ㎕ 첨가한 후, 표지한 MCH 를 5 ㎕ 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시킨다. 비특이적 결합량을 알기 위해서는 시험화합물 대신에 10-3M 의 리간드 (MCH) 를 5 ㎕ 첨가해 둔다.
③ 반응액을 제거하고, 1 ㎖ 의 세정용 완충액으로 3 회 세정한다. 세포에 결합된 표지 리간드 (MCH) 를 0.2 N NaOH-1 % SDS 로 용해하고, 4 ㎖ 의 액체신틸레이터 A (와꼬준야꾸 제조) 와 혼합한다.
④ 액체 신틸레이션 카운터 (베크만사 제조) 를 이용하여 방사활성을 측정하고, 최대결합의 % (Percent Maximum Binding) (PMB) 을 다음 식 [수학식 1] 로 구한다.
[수학식 1]
PMB = [(B-NSB)/(B0-NSB)] ×100
PMB : 최대결합의 %
B : 검체를 첨가했을 때의 값
NSB : 비특이적 결합량
B0: 최대 결합량
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는 화합물 또는 그의 염은, MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합을 변화시키는 (결합을 저해 또는 촉진함) 화합물이고, 구체적으로는 SLC-1 을 통해 세포자극활성을 갖는 화합물 또는 그의 염 (소위 SLC-1 아고니스트), 또는 상기 자극활성을 갖지 않는 화합물 (소위 SLC-1 안타고니스트) 이다. 이 화합물로는 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 공지된 화합물이어도 된다.
상기 SLC-1 아고니스트인지 안타고니스트인지의 구체적인 평가방법은 이하의 (ⅰ) 또는 (ⅱ) 에 따르면 된다.
(ⅰ) 상기 ① ~ ③ 의 스크리닝 방법에서 나타나는 결합ㆍ분석을 행하고, MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 (특히, 결합을 저해함) 화합물을 얻은 후, 이 화합물이 상기한 SLC-1 을 통한 세포자극활성을 갖고 있는지를 측정한다. 세포자극활성을 갖는 화합물 또는 그의 염은 SLC-1 아고니스트가고, 이 활성을 갖지 않는 화합물 또는 그의 염은 SLC-1 안타고니스트가다.
(ⅱ) (a) 시험화합물을 SLC-1 을 함유하는 세포에 접촉시키고, 상기 SLC-1 을 통한 세포자극활성을 측정한다. 세포자극활성을 갖는 화합물 또는 그의 염은 SLC-1 아고니스트가다.
(b) SLC-1 을 활성화하는 화합물 (예컨대, 본 발명의 폴리펩티드 또는 SLC-1 아고니스트 등) 을 SLC-1 을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우와, SLC-1 을 활성화하는 화합물 및 시험화합물을 SLC-1 을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우에 있어서의, SLC-1 을 통한 세포자극활성을 측정하고, 비교한다. SLC-1 을 활성화하는 화합물에 의한 세포자극활성을 감소시킬 수 있는 화합물 또는 그의 염은 SLC-1 안타고니스트가다.
상기 SLC-1 아고니스트는, SLC-1 에 대한 MCH 또는 그의 염이 갖는 생리활성과 동일한 작용을 갖고 있기 때문에, MCH 또는 그의 염과 동일하게 안전하고 저독성의 의약으로서 유용하다.
반대로, SLC-1 안타고니스트는, SLC-1 에 대한 MCH 또는 그의 염이 갖는 생리활성을 억제할 수 있기 때문에, 상기 리셉터 활성을 억제하는 안전하고 저독성의 의약으로서 유용하다.
MCH 또는 그의 염은 식욕 (섭식(攝食)) 증진작용 및 옥시토신 분비촉진작용 등에 관여하고 있는 점에서, 식욕 (섭식) 증진제 또는 옥시토신 분비촉진제 등으로 사용할 수 있기 때문에, 상기 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는 화합물 중, SLC-1 아고니스트는 식욕 (섭식) 증진제로서 사용할 수 있는 것 외에, 미약진통, 이완출혈, 태반만출전후, 자궁복고부전, 제왕절개술, 인공임신중절, 유즙 울체(鬱滯), 신경성 식욕부진증 등의 식욕부진 및 그에 수반되는 빈혈, 저단백질증 등의 예방ㆍ치료약 등으로 사용할 수 있고, SLC-1 안타고니스트는 항비만제 (약), 식욕 (섭식) 조절제 등으로 사용할 수 있는 것 외에, 과강(過强)진통, 강직성 자궁수축, 태아가사, 자궁파열, 경관열상(頸管裂傷), 조산, Prader-Willi 증후군, 당뇨병 및 그 합병증 (당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경장해 등), 고혈압, 고지혈증, 관상동맥경화증, 통풍, 호흡기질환 (Pickwick 증후군, 수면시 무호흡증후군), 지방간, 불임증, 변형성 골관절증 등 (특히 항비만제 (약), 식욕 (섭식) 조절제 등) 의 예방ㆍ치료약 등으로 사용할 수 있다.
상기의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물의 염으로서는, 예컨대 약학적으로 허용 가능한 염 등을 사용할 수 있다. 예컨대, 무기염기와의 염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등을 들 수 있다.
무기염기와의 염의 적합한 예로서는, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리토류금속염, 및 알루미늄염, 암모늄염 등을 들 수 있다.
유기염기와의 염의 적합한 예로서는, 예컨대 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민 등과의 염 등을 들 수 있다.
무기산과의 염의 적합한 예로서는, 예컨대 염산, 브롬화 수소산, 황산, 인산 등과의 염을 들 수 있다.
유기산과의 염의 적합한 예로서는, 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산, 푸말산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 숙신산, 말산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 벤조산 등과의 염을 들 수 있다.
염기성 아미노산과의 염의 적합한 예로서는, 예컨대 아르기닌, 리신, 오르니틴 등과의 염을 들 수 있으며, 산성 아미노산과의 적합한 예로서는, 예컨대 아스파라긴산, 글루타민산 등과의 염을 들 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 또는 그의 염을 상술한 의약으로서 사용하는 경우, 상기의 본 발명의 폴리펩티드를 의약으로서 실시하는 경우와 동일하게 하여 실시할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 또는 그의 염을 상술한 의약으로서 사용하는 경우, 상투 수단에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, 필요에 따라 당의(糖衣)나 장용성 피막을 입힌 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제 등으로서 경구적으로 또는, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제 등의 주사제의 형태로비경구적으로 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 화합물 또는 그의 염을 생리학적으로 인정되는 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 단위용량형태로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이들 제제에서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.
정제, 캡슐제 등에 혼합할 수 있는 첨가제로서는, 예컨대 젤라틴, 옥수수전분, 트라간트검, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제(膨化劑), 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 젖당 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 아카모노유 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용된다. 조제단위형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클 중의 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등의 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용 수성액으로서는, 예컨대 생리식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 함유하는 등장액 (예컨대, D-솔비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등을 들 수 있으며, 적당한 용해보조제, 예컨대 알콜 (예컨대 에탄올), 폴리알콜 (예컨대 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제 (예컨대 폴리솔베이트 80 (TM), HCO-50) 등과 병용해도 된다. 유성액으로서는 참기름, 대두유 등을 들 수 있으며, 용해보조제로서 벤조산벤질, 벤질알콜 등과 병용해도 된다.
또, 완충제 (예컨대, 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예컨대, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예컨대, 인간혈청알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예컨대, 벤질알콜, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다.
이와 같이 하여 얻어지는 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 인간이나 포유동물 (예컨대, 마우스, 래트, 모르모트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이, 침팬지 등) 에 대하여 투여할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 또는 그의 염의 투여량은 증상 등에 따라 차이는 있지만, 경구투여의 경우, 일반적으로 성인 (체중 60 kg 으로) 에서는 1 일당 약 0.1 에서 1000 mg, 바람직하게는 약 1.0 에서 300 mg, 보다 바람직하게는 약 3.0 에서 50 mg 이다. 비경구적으로 투여하는 경우에는 그 1 회 투여량은 투여대상, 투여장기, 증상, 투여방법 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 주사제의 형태로는 성인의 비만증환자 (체중 60 kg 으로) 로의 투여에서는 SLC 안타고니스트를 1 일당 약 0.01 에서 30 mg 정도, 바람직하게는 약 0.1 에서 20 mg 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 에서 10 mg 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60 kg 당 환산한 양을 투여할 수 있다.
본 명세서 및 도면에서 염기나 아미노산 등을 약호로 표시하는 경우, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature 에 의한 약호 또는 당해 분야에서의 관용 약호에 기초하는 것으로, 그 예를 이하에 기재한다. 또 아미노산에 관하여 광학이성체가 있을 수 있는 경우에는 특별히 명시하지 않으면 L 체를 나타내는 것으로 한다.
DNA : 데옥시리보핵산
cDNA : 상보적 데옥시리보핵산
A : 아데닌
T : 티민
G : 구아닌
C : 시토신
Y : 티민 또는 시토신
N : 티민, 시토신, 아데닌 또는 구아닌
R : 아데닌 또는 구아닌
M : 시토신 또는 아데닌
W : 티민 또는 아데닌
S : 시토신 또는 구아닌
RNA : 리보핵산
mRNA : 메신저 리보핵산
dATP : 데옥시아데노신 3 인산
dTTP : 데옥시티미딘 3 인산
dGTP : 데옥시구아노신 3 인산
dCTP : 데옥시시티딘 3 인산
ATP : 아데노신 3 인산
EDTA : 에틸렌디아민 4 아세트산
SDS : 도데실황산나트륨
TFA : 트리플루오로아세트산
EIA : 효소면역분석
Gly 또는 G : 글리신
Ala 또는 A : 알라닌
Val 또는 V : 발린
Leu 또는 L : 루이신
Ile 또는 I : 이소루이신
Ser 또는 S : 세린
Thr 또는 T : 트레오닌
Cys 또는 C : 시스테인
Met 또는 M : 메티오닌
Glu 또는 E : 글루타민산
Asp 또는 D : 아스파라긴산
Lys 또는 K : 리신
Arg 또는 R : 알기닌
His 또는 H : 히스티딘
Phe 또는 F : 페닐알라닌
Tyr 또는 Y : 티로신
Trp 또는 W : 트립토판
Pro 또는 P : 프롤린
Asn 또는 N : 아스파라긴
Gln 또는 Q : 글루타민
pGlu : 피로글루타민산
Me : 메틸기
Et : 에틸기
Bu : 부틸기
Ph : 페닐기
TC : 티아졸리딘-4(R)-카르복사미드기
Bom : 벤질옥시메틸
NMP : N-메틸피롤리돈
PAM : 페닐아세토아미드메틸
또, 본 명세서 중에서 자주 사용되는 치환기, 보호기 및 시약을 하기의 기호로 표기한다.
Tos : p-톨루엔술포닐
HONB : N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드
Bzl : 벤질
Z : 벤질옥시카르보닐
Br-Z : 2-브로모벤질옥시카르보닐
Cl-Z : 2-클로르벤질옥시카르보닐
Boc : t-부틸옥시카르보닐
HOBt : 1-히드록시벤즈트리아졸
DCC : N,N'-디시클로헥실카르보디이미드
TFA : 트리플루오로아세트산
Fmoc : N-9-플루오레닐메톡시카르보닐
DNP : 디니트로페닐
Bum : tert-부톡시메틸
Trt : 트리틸
BSA : 소 혈청 알부민
CHAPS : 3-[(3-코라미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포나이트
PMSF : 페닐메틸술포닐플루오리드
E64 : (L-3-트랜스-카르보키옥실란-2-카르보닐)L-류실-아그마틴
GDP : 구아노신-5'-2 인산
MEMα : 최소필수배지
Fura-2AM : 1-[6-아미노-2-(5-카르복시-2-옥사졸릴)-5-벤조프라니록시]-2-(2-아미노-5메틸페녹시)-에탄-N,N,N',N'-4 아세트산 펜타아세톡시메틸에스테르
HBSS : 행크스 평형염액
Fluo-3AM : 1-[2-아미노-5-(2,7-디클클로-6-히드록시-3-옥시-9-크산테닐)페녹시]-2-(2-아미노-5-메틸페녹시)에탄-N,N,N',N'-4 아세트산 펜타아세톡시메틸에스테르
HEPES : 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산
MeBzl : 4-메틸벤질
NMP : N-메틸피롤리돈
본원 명세서의 서열목록의 서열번호는 이하의 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 1]
래트 뇌로부터 정제된 SLC-1 에 대한 리간드펩티드의 N 말단 아미노산 서열해석의 결과로부터 얻어진 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 2]
래트 MCH 로서 동정된 래트 뇌로부터 정제된 SLC-1 에 대한 리간드펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 3]
래트 SLC-1 을 코딩하는 cDNA 의 스크리닝에 사용한 합성 DNA 를 나타낸다.
[서열번호 : 4]
래트 SLC-1 을 코딩하는 cDNA 의 스크리닝에 사용한 합성 DNA 를 나타낸다.
[서열번호 : 5]
래트 SLC-1 의 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 6]
5' 측에 Sal I 인식서열이 부가되고, 또한 3' 측에 Spe I 인식서열이 부가된래트 SLC-1cDNA 의 전체염기서열을 나타낸다.
[서열번호 : 7]
래트 SLC-1 발현 CHO 세포의 각 클론에 있어서의 SLC-1mRNA 의 발현량을 측정하기 위해 사용한 리보프로브 (riboprobe) 를 나타낸다.
[서열번호 : 8]
인간 SLC-1 을 코딩하는 cDNA 를 취득하기 위해 사용한 합성 DNA 를 나타낸다.
[서열번호 : 9]
인간 SLC-1 을 코딩하는 cDNA 를 2 개 사슬로 하기 위해 사용한 프라이머를 나타낸다.
[서열번호 : 10]
인간 SLC-1 을 코딩하는 cDNA 전체염기서열을 나타낸다.
[서열번호 : 11]
인간 SLC-1 의 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 12]
인간 SLC-1(S) 를 코딩하는 cDNA 의 스크리닝에 사용한 합성 DNA 를 나타낸다.
[서열번호 : 13]
인간 SLC-1(S) 를 코딩하는 cDNA 의 스크리닝에 사용한 합성 DNA 를 나타낸다.
[서열번호 : 14]
인간 SLC-1(L) 을 코딩하는 cDNA 의 스크리닝에 사용한 합성 DNA 를 나타낸다.
[서열번호 : 15]
인간 SLC-1(L) 을 코딩하는 cDNA 의 스크리닝에 사용한 합성 DNA 를 나타낸다.
[서열번호 : 16]
5' 측에 Sal I 인식서열이 부가되고, 또한 3' 측에 Spe I 인식서열이 부가된 인간 SLC-1(S) cDNA 의 전체염기서열을 나타낸다.
[서열번호 : 17]
5' 측에 Sal I 인식서열이 부가되고, 또한 3' 측에 Spe I 인식서열이 부가된 인간 SLC-1(L) cDNA 의 전체염기서열을 나타낸다.
[서열번호 : 18]
인간 SLC-1(S) 발현 CHO 세포 및 인간 SLC-1(L) 발현 COH 세포의 각 클론에 있어서의 SLC-1mRNA 의 발현량을 측정하기 위해 사용한 리보프로브 (riboprobe) 를 나타낸다.
[서열번호 : 19]
Des-Asp1-MCH(MCH(2-19)) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호 :20]
Des-[Asp1,Phe2]-MCH(MCH(3-19)) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 21]
Des-[Asp1,Phe2,Asp3]-MCH(MCH(4-19)) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 22]
Des-[Asp1,Phe2,Asp3,Met4]-MCH(MCH(5-19)) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 23]
Des-[Asp1,Phe2,Asp3,Met4,Leu5]-MCH(MCH(6-19)) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 24]
Des-[Asp1,Phe2,Asp3,Met4,Leu5,Arg6]-MCH(MCH(7-19)) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예 8 에서 얻어진 서열번호 : 11 로 표시되는 염기서열을 코딩하는 DNA 를 포함하는 프라스미드에 의한 형질전환체 Escherichia coli DH10B/phSLC1L8 은 1999 년 2 월 1 일부터 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-6632 로서, 1999 년 1 월 21 일부터 재단법인ㆍ발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16254 로서 기탁되어 있다.
실시예
이하에 실시예 및 참고예를 나타내어 본 발명을 보다 상세하게 설명하는데,이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
참고예 1 래트 뇌추출물에 포함되고, CHO/SLC-1 세포의 cAMP 합성을 특이적으로 억제하는 활성의 검출
래트 뇌추출물의 고속액체 크로마토그래피 (HPLC) 분획을 이하에 서술하는 방법으로 조제하였다. 찰즈리버 (주) 에서 구입한 100 마리의 위스터 래트 (수컷, 8 주령) 로부터 뇌를 꺼내어, 바로 끓인 증류수 0.8 ℓ에 넣고 10 분간 데운다. 데운후, 즉시 빙냉하고, 48 ㎖ 의 아세트산을 첨가하여 최종농도 1.0 M 으로 하고, 폴리트론 (20,000 rpm, 6 분간) 을 사용하여 파쇄하였다. 파쇄액을 원심 (8,000 rpm, 30 분) 하여 상청을 얻고, 침전에는 1.0 M 아세트산 0.8 ℓ를 첨가하여 다시 폴리트론에 의해 파쇄하고, 원심 (8,000 rpm, 30 분) 하여 상청을 얻었다. 침전에는 1.0 M 아세트산 0.8 ℓ를 첨가하여 다시 폴리트론에 의해 파쇄하여 하룻밤 교반한 후, 원심 (8,000 rpm, 30 분) 하여 상청을 얻었다. 상청에 2 배량의 냉아세톤을 4 ℃ 에서 천천히 적가한 후, 1 회째의 원심에 의해 얻은 상청에 대해서는 하룻밤 교반하고, 2 회째의 원심에 의해 얻은 상청에 대해서는 4 시간 교반하였다. 아세톤을 첨가한 추출액은 원심 (8,000 rpm, 30 분) 하여 침전을 제거하고, 얻어진 상청에서 이배퍼레이터에 의해 감압하에 아세톤을 제거하였다. 아세톤을 제거한 추출액에 등량의 디에틸에테르를 첨가하고, 분액 로트를 사용하여 지질을 포함하는 에테르층을 분리하여 수층을 회수하였다. 에테르 탈지한 추출액은 이배퍼레이터에 의해 감압하에 농축하여 에테르를 완전히 제거하였다. 농축액을 유리섬유 여과지 (아도반테크, DP70 (90 ㎜ø)) 로 여과하고, 여과액을 유리제 칼럼 (20 ㎜ø×240 ㎜) 에 충전한 C18 (YMC, YMCgel ODS-AM 120-S50) 칼럼에 첨가하였다. 칼럼을 1.0 M 아세트산 300 ㎖ 로 세정후, 0.1 % 트리플루오로아세트산을 포함하는 60 % 아세토니트릴 300 ㎖ 로 용출하였다. 용출액을 감압하에 농축하여 용매를 제거한 후, 농축액을 동결건조시켰다. 동결건조품 약 0.24 g 을 5 ㎖ 의 DMSO 에 용해하고, 이어서 1.0 M 아세트산 45 ㎖ 를 첨가하여 래트 뇌추출표품으로 하였다. 래트 뇌추출표품을 1.0 M 아세트산으로 평형화한 SP-Sephadex C-25 칼럼 (아마샴팔마시아바이오테크, 겔체적 : 100 ㎖) 에 첨가하고, 1.0 M 아세트산 50 ㎖ 로 세정한 후, 2.0 M 피리딘 100 ㎖ 용출분획과 2.0 M 피리딘ㆍ아세트산 100 ㎖ 용출분획을 차례로 얻었다. 2.0 M 피리딘ㆍ아세트산 용출액을 감압하에 농축하여 용매를 제거한 후, 농축액을 동결건조시켰다. 동결건조품 약 100 ㎎ 을 10 ㎖ 의 0.1 % 트리플루오로아세트산을 포함하는 10 % 아세토니트릴에 용해하고, C18 칼럼 (토소, TSKgel ODS-80Ts(21.5 ø×300 ㎜)) 을 사용한 10 % 에서 60 % 의 0.1 % 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세토니트릴의 농도구배용출법에 의한 HPLC 로 처리했다. 각 분획을 감압하에 농축ㆍ건고시키고, 잔사를 0.2 ㎖ 의 디메틸술폭시드 (DMSO) 로 용해하였다.
실시예 4 에서 제작한 CHO/SLC-1 세포 및 mock CHO 세포를 24 웰 플레이트에 5 ×104세포/웰 로 파종하고, 48 시간 배양하였다. 세포를 0.2 mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 포함하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 로 세정하였다 (이하, 0.2 mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를포함하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 를 반응용 버퍼라고 함). 그 후, 0.5 ㎖ 의 반응용 버퍼를 첨가하여 30 분간 배양기에서 보온한다. 반응용 버퍼를 제거하고, 새로이 0.25 ㎖ 의 반응용 버퍼를 세포에 첨가한 후, HPLC 분획과 2 μM 폴스콜린을 포함하는 0.25 ㎖ 의 반응용 버퍼를 세포에 첨가하고 37 ℃ 에서 24 분간 반응시켰다. 100 ㎕ 의 20 % 과염소산을 첨가하여 반응을 정지시키고, 이어서 빙상에서 1 시간 둠으로써 세포내 cAMP 를 추출하였다. 추출액중의 cAMP 의 양은 cAMP EIA 키트 (아마샴팔마시아바이오테크) 를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 분획번호 33, 34, 35 에 CHO/SLC-1 세포 특이적인 cAMP 합성억제활성이 검출되었다 (도 1). 도 1 중, cAMP 합성억제활성은 폴스콜린을 포함하는 반응용 버퍼를 첨가하였을 때의 세포내 cAMP 의 양에서 반응용 버퍼를 첨가하였을 때의 세포내 cAMP 의 양을 뺀 양을 100 % 로 하여 HPLC 분획 (각 분획을 DMSO 로 100 배 희석한 용액을 1 ㎕ 첨가했음) 을 첨가했을 때의 세포내 cAMP 의 양에서 반응용 버퍼를 첨가하였을 때의 세포내 cAMP 의 양을 뺀 양을 % 로 표시했다.
참고예 2 래트 뇌추출물중의 래트 SLC-1 발현 CHO 세포에 대해 특이적으로 cAMP 합성억제활성을 나타내는 활성물질의 프로나아제에 의한 실활
참고예 1 에서 CHO/SLC-1 세포에 대한 cAMP 합성억제활성을 나타낸 HPLC 분획 34 를 단백질분해효소인 프로나아제 (Sigma, protease Type ⅩⅣ (P5147)) 로 처리하여 활성물질이 단백질성인지를 조사하였다.
상기 래트 뇌추출물 HPLC 분획 (#34) 2 ㎕ 를 0.2 M 아세트산 암모늄 100 ㎕ 에 첨가하고, 이것에 프로나아제 3 ㎍ 을 첨가하여 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트한 후, 비등수 안에서 10 분간 가열하여 프로나아제를 실활시켰다. 이것에 BSA 0.05 ㎎ 및 CHAPS 0.05 ㎎ 을 포함하는 증류수 2 ㎖ 를 첨가하고나서 동결건조시켰다. 프로나아제 그 자체 또는 가열 및 동결건조의 영향을 조사하기 위해 프로나아제만, HPLC 분획만 및 프로나아제만을 가열처리한 후 HPLC 분획을 첨가한 것에 대해서도 동일하게 처리하여 동결건조시켰다. 동결건조된 각 시료를 2 μM 폴스콜린을 포함하는 반응용 버퍼 용해하고, 참고예 1 에 나타내는 방법으로 CHO/SLC-1 세포에 첨가하여 cAMP 합성억제활성을 측정하였다. 결과를 도 2 에 나타냈다. 래트 뇌추출물중의 CHO/SLC-1 세포에 대한 cAMP 합성억제활성을 나타내는 활성물질은 프로나아제에 의해 완전히 실활한 점에서 이 물질이 단백질 또는 펩티드임이 나타났다.
참고예 3 래트 뇌로부터의 래트 SLC-1/CHO 세포에 대해 특이적으로 cAMP 합성억제활성을 나타내는 활성물질의 정제
CHO/SLC-1 세포에 대해 특이적으로 cAMP 합성억제활성을 나타내는 활성물질을 래트 뇌로부터 정제한 대표예를 이하에 구체적으로 서술한다.
참고예 1 에서 활성이 인정된 분획 33 을 다음과 같이 정제하였다. 활성 분획을 감압하에 농축하여 용매를 제거한 후, 동결건조시켰다. 이것을 10 % 아세토니트릴을 포함하는 10 mM 포름산 암모늄 (pH 5.25) 5 ㎖ 에 용해하고, 양이온 교환 칼럼 (토소, TSKgel CM-2SW (4.6 ㎜ø×150 ㎜)) 에 첨가한 후, 10 % 아세토니트릴을 포함하는 10 mM 내지 500 mM 의 포름산 암모늄 (pH 5.25) 의 농도구배에 의해 활성물질을 용출하였다. 활성은 포름산 암모늄 320 mM 부근에 회수되었다. 활성 분획 2 ㎖ 에 0.1 % 트리플루오로아세트산을 포함하는 10 % 아세토니트릴 2.5 ㎖ 를 첨가하고, 디페닐 칼럼 (세퍼레이션 그룹, Vydac 219-TP54) 에 첨가한 후, 0.1 % 트리플루오로아세트산을 포함하는 27.5 % 에서 42.5 % 의 아세토니트릴의 농도구배에 의해 용출하였다. 활성은 아세토니트릴 31.3 % 부근에 출현하였다. 활성 분획 0.96 ㎖ 에 0.1 % 트리플루오로아세트산을 포함하는 10 % 아세토니트릴 4.4 ㎖ 를 첨가하고, ODS 칼럼 (노무라가가꾸, Develosil ODS-UG-3) 에 첨가한 후, 0.1 % 트리플루오로아세트산을 포함하는 27.5 % 에서 42.5 % 의 아세토니트릴의 농도구배에 의해 용출하였다. 용출액은 피크마다 수동으로 분취하였다. 활성은 아세토니트릴 36.8 % 부근 (분획 No.16) 에 단일 피크로서 출현하였다 (도 3).
참고예 4 래트 뇌로부터 정제된 래트 SLC-1 발현 CHO 세포에 대해 특이적으로 cAMP 합성억제활성을 나타내는 활성물질의 래트 MCH 로서의 동정
참고예 3 에서 정제된 래트 SLC-1 발현 CHO 세포에 대해 특이적으로 cAMP 합성억제활성을 나타내는 활성물질의 구조해석을 행하였다. 본 활성물질은 참고예 2 에 나타낸 바와 같이 단백질 또는 펩티드임이 추정되어 있었으므로, 활성 피크를 포함하는 용출액을 사용하여 베크만사 LF3400 Protein Sequencer 에 의한 아미노 말단 아미노산 서열분석을 행하였다. 분석결과, 서열번호 : 1 에 나타내는 서열이 얻어졌다. 7 번째 잔기와 16 번째 잔기에는 서열분석의 반응중에 Cys 잔기에서 생성된 데히드로알라닌의 PTH 유도체가 검출되어 Cys 로 결정되었다. 이 서열은 래트 멜라닌 응집 호르몬 (melanin-concentrating hormone, MCH) 의 N말단에서 16 잔기까지의 아미노산 서열과 일치하였다. 그래서 본 활성물질을 JEOL HX110 에 의한 질량분석계에 의해 측정한 결과 래트 MCH 의 분자량과 거의 일치하는 m/z 2387.3 에 시그널이 관찰되었으므로 활성물질의 추정 아미노산 서열로서 래트 MCH 의 서열 (서열번호 : 2) 이 결정되었다. 그리고, 참고예 3 에서 얻어진 활성분획 34 및 35 에 대해서도 생성을 행하여 활성물질을 얻었지만, 모든 활성이 래트 MCH 임이 확인되었다. 또한, 페닌스라사에서 구입한 래트 MCH 는 래트 SLC-1 발현세포에 대해 실시예 5 에 서술하는 방법으로 행한 cAMP 생산억제활성의 분석에 있어서 용량의존적으로 억제활성을 나타내어 본 활성물질이 래트 MCH 임이 확인되었다.
실시예 1 래트 뇌 유래 cDNA 를 사용한 PCR 법에 의한 래트 SLC-1 수용체 cDNA 의 증폭
래트 뇌 유래 poly (A)＋RNA (클론테크사) 를 주형으로 하고, 랜덤 프라이머를 사용하여 역전사반응을 행하였다. 역전사반응은 다까라 RNA PCR ver.2 키트의 시약을 사용하였다. 이어서 이 역전사 생성물을 주형으로 사용하고, 서열번호 : 3 및 4 의 합성 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의한 증폭을 행하였다. 합성 DNA 프라이머는 수용체 단백질으로 번역되는 영역의 유전자가 증폭되도록 구축하였으나, 그 때에 유전자의 5' 측에 제한효소 Sal I 이 인식하는 염기서열이 부가되고, 또한 3' 측에 제한효소 Spe I 이 인식하는 염기서열이 부가되도록, 5' 측 및 3' 측에 각각의 제한효소의 인식서열을 부가하였다. 반응액의 조성은 cDNA주형 5 ㎕, 합성 DNA 프라이머 각 0.4 μM, 0.25 mM dNTPs, pfu (스트라타진사) DNA 폴리머라아제 0.5 ㎕ 및 효소에 부속된 버퍼로, 총반응량은 50 ㎕ 로 하였다. 증폭을 위한 사이클은 서멀사이클러 (파킨엘마사) 를 사용하고, 94 ℃ㆍ60 초의 가열후, 94 ℃ㆍ60 초, 60 ℃ㆍ30 초, 72 ℃ㆍ150 초의 사이클을 35 회 반복하고, 마지막으로 72 ℃ 에서 10 분간 반응시켰다. 증폭산물의 확인은 0.8 % 아갈로스 겔 전기영동후, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 행하였다.
실시예 2 PCR 산물의 플라스미드벡터로의 서브클로닝 및 삽입 cDNA 부분의 염기서열의 해독에 의한 증폭 cDNA 서열의 확인
실시예 1 에서 행한 PCR 후의 반응산물은 0.8 % 의 저융점 아갈로스 겔을 사용하여 분리하고, 밴드 부분을 면도칼로 잘라낸 후 세편화(細片化), 페놀추출, 페놀ㆍ클로로포름 추출, 에탄올 침전을 행하여 DNA 를 회수하였다. PCR-ScriptTMAmp SK(+) 클로닝키트 (스트라타진사) 의 처방에 따라 회수된 DNA 를 플라스미드벡터 pCR-Script Amp SK(+) 로 서브클로닝하였다. 이것을 에쉐리키아 콜리 (Escherichia coli) XL-1 Blue (스트라타진사) 에 도입하여 형질전환한 후, cDNA 삽입 단편을 갖는 클론을 암피실린 및 X-gal 을 포함한 LB 한천 배지 중에서 선택하고, 백색을 띠는 클론만 멸균된 이쑤시개를 사용하여 분리하여 형질전환체 E.coli XL-1 Blue/래트 SLC-1 을 얻었다. 개개의 클론을 암피실린을 포함한 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, QIA prep 8mini prep (키아겐사) 를 사용하여 플라스미드 DNA 를 조제하였다. 조제된 DNA 일부를 사용하여 제한효소 sal I 및 Spe I에 의해 절단하여 삽입되어 있는 수용체 cDNA 단편의 크기를 확인하였다. 염기서열 결정을 위한 반응은 DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (파킨엘마사) 를 사용하여 행하고, 형광식 자동 시퀀서를 사용하여 해독하였다. 얻어진 3 클론의 서열을 해석하여 모든 서열이 보고되어 있는 래트 SLC-1 단백질 (서열번호 : 5) 을 코딩하는 cDNA 서열 (Lakaye, B. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol.1401, pp.216-220(1998), accession No.AF08650) 의 5' 측에 Sal I 인식서열이 부가되고, 3' 측에 Spe I 인식서열이 부가된 유전자 서열과 일치함을 확인하였다 (서열번호 : 6).
실시예 3 래트 SLC-1 발현 CHO 세포의 제작
실시예 2 에서 서열이 확인된 래트 뇌 유래의 SLC-1 의 전체 길이 아미노산 서열을 코딩하고, 5' 측에 Sal I 인식서열이 부가되고, 또한 3' 측에 Spe I 인식서열이 부가된 유전자가 도입된 플라스미드에 의해 형질전환된 E.coli 의 클론에서 Plasmid Midi Kit (키아겐사) 를 사용하여 플라스미드를 조제하고, 제한효소 Sal I 및 Spe I 로 절단하여 인서트 부분을 잘라냈다. 인서트 DNA 는 전기영동후, 아갈로스 겔에서 면도칼로 잘라내고 이어서 세편화, 페놀 추출, 페놀ㆍ클로로포름 추출, 에탄올 침전을 행하여 회수하였다. 이 인서트 DNA 를 Sal I 및 Spe I 로 절단한 동물세포 발현용 벡터 플라스미드 pAKKO-111H (Hinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol.1219, pp.251-259(1994) 에 기재된 pAKK01.11H 와 동일한 벡터 플라스미드) 에 첨가하고, T4 라이게이스 (다까라슈조) 를 사용하여 라이게이션을 행하고, 단백질 발현용 플라스미드 pAKKO- SLC-1 을 구축하였다.
pAKKO- SLC-1 로 형질전환한 E.coli DH5 (토요보) 를 배양후, Plasmid Midi Kit (키아겐사) 를 사용하여 pAKKO- SLC-1 의 플라스미드 DNA 를 조제하였다. 이것을 Cell Phect Transfection Kit (아마샴팔마시아바이오테크사) 를 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라 CHO dhfr-세포에 도입하였다. 10 ㎍ 의 DNA 를 인산칼슘과의 공침 현탁액으로 하고, 24 시간전에 5 ×105또는 1 ×106개의 CHO dhfr-세포를 파종한 10 ㎝ 샬레에 첨가하였다. 10 % 소 태아 혈청을 함유한 MEMα배지에서 1 일간 배양한 후 계대하고, 선택배지인 10 % 투석 소 태아 혈청을 함유하는 핵산불함(核酸不含) MEMα배지에서 배양하였다. 선택 배지 중에서 증식되는 SLC-1 발현 CHO 세포인 형질전환세포의 콜로니 56 클론을 선택하였다.
실시예 4 전체 길이 래트 SLC-1 리셉터 단백질 mRNA 의 발현량이 높은 CHO/SLC-1 세포주의 선택
실시예 3 에서 수립된 CHO/SLC-1 주 56 클론의 전체 길이 래트 SLC-1 리셉터 단백질 mRNA 의 발현량을 Cytostar T Plate (아마샴팔마시아바이오테크사) 를 사용하고, 첨부된 프로토콜에 따라 이하와 같이 측정하였다. CHO/SLC-1 주의 각 클론을 Cytostar T Plate 의 각 웰에 2.5 ×104개씩 파종하여 24 시간 배양한 후, 10 % 포르말린에 의해 세포를 고정하였다. 각 웰에 0.25 % Triton X-100 을 첨가하여 세포의 투과성을 높인 후,35S 라벨한 서열번호 : 7 의 리보프로브 를 첨가하여 하이브리다이즈시켰다. 20 ㎎/㎖ 의 RNaseA 를 각 웰에 첨가하여 유리의 리보프로브를 소화시키고, 플레이트를 잘 세정한 후 하이브리다이즈한 리보프로브의 방사활성을 Topcounter 로 측정하였다. 방사활성이 높은 주가 mRNA 발현량이 높다. mRNA 발현량이 높은 3 클론 (#3, 6 및 44) 을 이하의 실험에 사용하였으나, 특히 클론번호 44 를 주로 사용하였다 (도 4).
실시예 5 MCH 에 의한 래트 SLC-1 발현 CHO 세포에 대한 cAMP 합성억제활성
합성 MCH (페닌스라사) 를 여러 가지 농도로 희석하고, 래트 SLC-1 발현 CHO 세포에 대한 cAMP 합성억제활성을 이하에 나타낸 방법으로 측정하였다. 실시예 4 에서 선택한 CHO/SLC-1 세포를 24 웰 플레이트에 5 ×104세포/웰 로 파종하고, 48 시간 배양하였다. 세포를 0.2 mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유한 행크스버퍼 (pH 7.4) 로 세정하였다 (이하, 0.2 mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유한 행크스버퍼 (pH 7.4) 를 반응용 버퍼라고 함). 그 후, 0.5 ㎖ 의 반응용 버퍼를 첨가하여 30 분간 배양기에서 보온하였다. 반응용 버퍼를 제거하고, 새로이 0.25 ㎖ 의 반응용 버퍼를 세포에 첨가한 후, 여러 가지 양의 MCH 와 2 μM 폴스콜린을 함유한 0.25 ㎖ 의 반응용 버퍼를 세포에 첨가하고, 37 ℃ 에서 24 분간 반응시켰다. 100 ㎕ 의 20 % 과염소산을 첨가하여 반응을 정지시키고, 이어서 빙상에서 1 시간 둠으로써 세포내 cAMP 를 추출하였다. 추출액중의 cAMP 의 양은 cAMP EIA 키트 (아마샴팔마시아바이오테크사) 를 사용하여 측정하였다. 그 결과, MCH 는 0.1 nM 의 농도로 확실히 세포내 cAMP 의 양을 저하시키고, 더욱 펩티드 농도를 늘리면 용량의존적으로 세포내 cAMP 의 양은 감소되었다 (도 5). 도면 중 cAMP 합성억제활성은 폴스콜린을 함유한 반응용 버퍼를 첨가하였을 때의 세포내 cAMP 의 양으로부터 반응용 버퍼를 첨가하였을 때의 세포내 cAMP 의 양을 뺀 양을 100 % 로 하고, MCH 를 첨가하였을 때의 세포내 cAMP 의 양으로부터 반응용 버퍼를 첨가하였을 때의 세포내 cAMP 의 양을 뺀 양을 % 로 표시했다.
실시예 6 MCH 가 래트 SLC-1 발현 CHO 세포에 대해 야기하는 아라키돈산 대사물 방출활성
여러 가지 농도의 합성 MCH (페닌스라사) 가 나타내는 래트 SLC-1 발현 CHO 세포에 대한 아라키돈산 대사물 방출활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 실시예 4 에서 선택한 CHO/SLC-1 세포를 24 웰 플레이트에 5 ×104세포/웰 로 파종하고, 24 시간 배양후, [3H]아라키돈산을 0.25 μCi/웰 이 되도록 첨가하였다. [3H]아라키돈산 첨가 16 시간후, 세포를 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유한 행크스버퍼 (pH 7.4) 로 세정하고, 각 웰에 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유한 행크스버퍼 (pH 7.4) 에 용해한 여러 가지 농도의 합성 래트 MCH 500 ㎕ 를 첨가하였다. 이후, 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 포함한 행크스버퍼 (pH 7.4) 를 반응버퍼라고 한다. 37 ℃ 에서 60 분간 인큐베이트한 후에 반응액 400 ㎕ 를 신틸레이터에 첨가하고, 반응액중에 유리된 [3H]아라키돈산 대사물의 양을 신틸레이션 카운터로 측정하였다. 합성 래트 MCH3nM 농도에서 명확한 아라키돈산 대사물방출이 일어나고, 더욱 펩티드농도를 늘리면 용량의존적으로 아라키돈산 대사물이 배지중으로 방출되었다 (도 6). 도면 중 아라키돈산 대사물 방출활성은 합성 래트 MCH 비첨가 반응버퍼에 의한 배지 중의 [3H]아라키돈산 대사물 양을 100 % 로 하였을 때의 합성 래트 MCH 첨가 반응버퍼에 의한 배지중의 [3H]아라키돈산 대사물 양의 상대값으로 나타냈다.
실시예 7 인간 SLC-1 cDNA 를 함유한 플라스미드의 단리
인간 태아 뇌 유래 cDNA 라이브러리 (SUPERSCRIPTTMcDNA 라이브러리 ; GIBCOBRL 사) 를 Genetrapper cDNA positive selection system (GIBCOBRL 사) 의 매뉴얼에 따라 파지 F1 엔도누클레아제를 사용하여 DNA 에 닉(nick)을 넣은 후, 에쉐리키아 콜리 엑소누클레아제Ⅲ 으로 소화시킴으로써 1개 사슬 인간 태아 뇌 유래 cDNA 라이브러리를 조제하였다.
Kolakowski Jr. 등 (Kolakowski Jr., et al (1996) FEBS Lett. Vol.398, pp.253-258) 의 보고에 기초하여 제작된 서열번호 : 8 의 합성 올리고누클레오티드 (accession No.U71092 의 1434-1451 에 상당) 의 3' 말단에 비오틴-14-dCTP 를 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) 를 사용하여 부가하고, 비오틴 화 올리고누클레오티드를 조제하였다. 반응액 조성, 반응시간은 매뉴얼에 따랐다.
1개 사슬 인간 태아 뇌 유래 cDNA 라이브러리 4 ㎍ 을 95 ℃ 에서 1 분 보온한 후, 빙상에서 급냉하고, 비오틴 화 올리고누클레오티드 20 ng 를 첨가하고, 37℃ 에서 1 시간, 첨부 하이브리다이제이션버퍼로 하이브리다이즈하였다. 스트렙토아비딘비즈를 첨가하고, MAGNA-SEP Magnetic Particle Separator (GIBCOBRL 사) 를 사용하여 비오틴 화 올리고누클레오티드에 하이브리다이즈한 1개 사슬 인간 태아 뇌 유래 cDNA 를 단리하고, Kolakowski Jr. 등의 보고 (Kolakowski Jr., et al (1996) FEBS Lett. Vol.398, pp.253-258) 에 기초하여 제작된 서열번호 : 9 의 합성 올리고누클레오티드 (accession No.U71092 의 1011-1028 에 상당) 50 ng 를 프라이머로 하여 매뉴얼에 따라 상보사슬을 합성하여 2개 사슬 플라스미드로 하였다.
실시예 8 단리된 인간 SLC-1 cDNA 를 함유한 플라스미드의 염기서열의 결정
실시예 7 에서 얻어진 플라미스미드를 ELECTROMAXTMDH10BTMCells 에 일렉트로포레이션법으로 도입하여 형질전환한 후, cDNA 삽입 단편을 갖는 클론을 암피실린 및 X-gal 를 포함한 LB 한천 배지 중에서 선택하고, 백색을 띠는 클론만 멸균된 이쑤시개로 찔러 분리하고, 형질전환체 E.coli. DH10B/hSLC-1 을 얻었다. 개개의 클론을 암피실린을 포함한 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, QIA prep 8mini prep (키아겐사) 를 사용하여 플라스미드 DNA 를 정제하였다. 염기서열 결정을 위한 반응은 DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (파킨엘마사) 를 사용하여 행하고, 형광식 자동 시퀀서를 사용하여 해독하였다. 그 결과, 서열번호 : 10 에 나타낸 서열이 얻어졌다. 여기에 얻어진 염기서열이 코딩하는 아미노산 서열 (서열번호 : 11) 은 Lakaye 등의 보고 (Lakaye, B. et al. (1998) Biochim. Biophys.Acta, Vol.1401, pp.216-220) 에서 인간 SLC-1 의 서열을 함유한 인간 염색체 DNA 서열 (accession numver:Z86090) 을 기초로 하여 래트 SLC-1 에서 유추된 서열로서 추정되고 있던 인간 SLC-1 아미노산 서열과는 다르며, 추정서열의 69 및 64 아미노산 상류에 개시 코돈인 ATG 가 mRNA 상에서 존재함을 나타내고 있다. 이 서열을 코딩하는 DNA 를 함유한 플라스미드에 의한 형질전환체 에쉐리키아 콜리 DH10B/phSLC1L8 을 IFO 및 NIBH 에 기탁하였다.
실시예 9 MCH 가 유기하는 래트 SLC-1 발현 CHO 세포막분획으로의 GTPγS 결합활성의 측정
MCH 의 래트 SLC-1 발현 CHO 세포막분획에 대한 [35S]-구아노신 5'-(γ-티오)트리포스페이트의 결합촉진활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 처음에 막분획의 조제법을 기재한다. 1 ×108개의 CHO/SLC-1 세포에 10 ㎖ 의 균질화버퍼 (10 mM NaHCO3, 5 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴, 4 ㎍/㎖ E64, 20 ㎍/㎖ 류펩틴)을 첨가하고, 폴리트론 (12,000 rpm, 1 분간) 을 사용하여 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 원심 (1,000 g, 15 분간) 하여 상청을 얻었다. 이어서, 이 상청을 초원심분리 (Beckman Type 30 로터, 30,000 rpm, 1 시간) 하여 얻어진 침전물을 래트 SLC-1 발현 CHO 세포막분획으로 하였다.
GTPγS 결합활성의 측정은 이하와 같다. 래트 SLC-1 발현 CHO 세포막분획을 막희석 완충액 (50 mM 트리스염산 완충액 (pH 7.4), 5 mM MgCl2, 150 mMNaCl, 1 μM GDP) 으로 희석하여 단백질 농도 30 ㎎/㎖ 의 분석용 세포막분획 용액을 제조한다. 분석용 막분획 용액 200 ㎕ 에 51.5nM 농도의 [35S]-구아노신 5'-(γ-티오)트리포스페이트 (NEN 사) 를 2 ㎕ 와 여러 가지 농도의 MCH (페닌스라사) 를 2 ㎕ 첨가하고, 이 혼합액을 25 ℃ 에서 1 시간 보온하였다. 혼합액을 필터 여과하고, 그리고 필터를 세정용 버퍼 (50 mM 트리스염산 완충액 (pH 7.4), 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0.1 % BSA) 1.5 ㎖ 로 2 회 세정한 후, 필터의 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다. MCH 는 용량의존적으로 막분획에 결합하는 [35S]-구아노신 5'-(γ-티오)트리포스페이트의 양을 증대시켰다. 또, 약 0.5 nM 농도의 MCH 는 최대 결합의 50 % 의 결합을 유기하였다.
실시예 10 인간 태아 뇌 유래 cDNA 를 사용한 PCR 법에 의한 인간 SLC-1 cDNA 의 증폭
진 트랩법으로 클로닝된 인간 SLC-1 DNA 서열을 함유한 플라스미드를 주형으로 하고, 서열번호 : 12 및 13 의 합성 DNA 프라이머와 서열번호 : 14 및 15 의 합성 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의한 증폭을 각각 행하였다. 전자의 증폭 DNA 를 인간 SLC-1(S) 로, 후자의 증폭 DNA 를 인간 SLC-1(L) 로 명명하였다. 합성 DNA 프라이머는 수용체 단백질으로 번역되는 영역의 유전자가 증폭되도록 구축하였으나, 그 때에 유전자의 5' 측에 제한효소 Sal I 이 인식하는 염기서열이 부가되고, 또한 3' 측에 제한효소 Spe I 이 인식하는 염기서열이 부가되도록 5' 측 및 3' 측에 각각의 제한효소의 인식 서열을 부가하였다. 인간 SLC-1(S) 증폭의 반응액 조성은 인간 SLC-1 DNA 서열을 함유한 플라스미드 주형 5 ㎕, 합성 DNA 프라이머 각 0.4 μM, 0.2 mM dNTPs, pfuDNA 폴리머라아제 0.5 ㎕ 및 효소에 부속된 버퍼로, 총 반응량은 50 ㎕ 로 하였다. 증폭을 위한 사이클은 서멀사이클러 (파킨엘마사) 를 사용하고, 94 ℃ㆍ60 초의 가열후, 94 ℃ㆍ60 초, 57 ℃ㆍ60 초, 72 ℃ㆍ150 초의 사이클을 25 회 반복하고, 마지막에 72 ℃ㆍ10 분 보온하였다. 또, 인간 SLC-1(L) 증폭의 반응액 조성은 인간 SLC-1 DNA 서열을 함유한 플라스미드 주형 5 ㎕, 합성 DNA 프라이머 각 0.4 μM, 0.2 mM dNTPs, pfuDNA 폴리머라아제 0.5 ㎕ 및 효소에 부속된 버퍼로, 총 반응량은 50 ㎕ 로 하였다. 증폭을 위한 사이클은 서멀사이클러 (파킨엘마사) 를 사용하고, 94 ℃ㆍ60 초의 가열후, 94 ℃ㆍ60 초, 60 ℃ㆍ60 초, 72 ℃ㆍ3 분의 사이클을 25 회 반복하고, 마지막에 72 ℃ㆍ10 분 보온하였다. 증폭산물의 확인은 0.8 % 아가로스 겔 전기영동후, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 행하였다.
실시예 11 PCR 산물의 플라스미드 벡터로의 서브클로닝 및 삽입 cDNA 부분의 염기서열 해독에 의한 증폭 cDNA 서열의 확인
실시예 10 에서 행한 PCR 후의 반응산물은 0.8 % 의 저융점 아가로스 겔을 사용하여 분리하고, 밴드 부분을 면도칼로 잘라낸 후 세편화, 페놀 추출, 페놀ㆍ클로로포름 추출, 에탄올 침전을 행하여 DNA 를 회수하였다. PCR-ScriptTMAmp SK(+) 클로닝 키트 (스트라타진사) 의 처방에 따라, 회수한 DNA 를 플라스미드 벡터 pCR-Script Amp SK(+) 로 서브클로닝하였다. 이것을 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) DH5 α컴피턴트 세포 (토요보) 에 도입하여 형질전환한 후, cDNA 삽입 단편을 갖는 클론을 암피실린 및 X-gal 을 함유하는 LB 한천배지 중에서 선택하고, 백색을 띠는 클론만 멸균된 이쑤시개를 사용하여 분리하고, 인간 SLC-1(S) 의 형질전환체 E.coli DH5 α/hSLC-1(S) 와 인간 SLC-1(L) 의 형질전환체 E.coli DH5 α/hSLC-1(L) 을 얻었다. 개개의 클론을 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, QIA prep8 mini prep (키아겐사) 를 사용하여 플라스미드 DNA 를 조제하였다. 조제한 DNA 의 일부를 사용하여 제한효소 Sal I 및 Spe I 에 의한 절단을 행하고, 삽입되어 있는 수용체 cDNA 단편의 크기를 확인하였다. 염기서열의 결정을 위한 반응은 DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (파킨엘마사) 를 사용하여 행하고, 형광식 자동 시퀀서를 사용하여 해독하였다. 얻어진 클론의 서열은 인간 SLC-1 유전자를 주형으로 하여 서열번호 : 12 및 13 의 합성 DNA 프라이머로 증폭되어야 할 DNA 서열 (서열번호 : 16) 및 인간 SLC-1 유전자를 주형으로 하여 서열번호 : 14 및 15 의 합성 DNA 프라이머로 증폭되어야 할 DNA 서열 (서열번호 : 17) 과 각각 일치하였다.
실시예 12 인간 SLC-1(S) 발현 CH0 세포 및 인간 SLC-1(L) 발현 CH0 세포의 제작
실시예 11 에서 서열이 확인된 인간 SLC-1(S) 와, 인간 SLC-1(L) 이 도입된 플라스미드에 의해 형질전환된 E.coli 의 클론에서 Plasmid Midi Kit (키아겐사) 를 사용하여 플라스미드를 조제하고, 제한효소 Sal I 및 Spe I 로 절단하여 인서트 부분을 잘라냈다. 인서트 DNA 는 전기영동후, 아가로스 겔로부터 면도칼로 잘라내고, 이어서 세편화, 페놀 추출, 페놀ㆍ클로로포름 추출, 에탄올 침전을 행하여회수하였다. 이 인서트 DNA 를 Sal I 및 Spe I 로 절단한 동물세포 발현용 벡터 플라스미드 pAKKO-111H (Hinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol.1219, pp.251-259 (I994) 에 기재된 pAKKO1.11H 와 동일한 벡터 플라스미드) 에 첨가하고, T4 라이게이스 (다까라슈조) 를 사용하여 라이게이션을 행하고, 단백질발현용 플라스미드 pAKKO-hSLC-1(S) 와 pAKKO-hSLC-1(L) 을 구축하였다.
pAKKO-hSLC-1(S) 및 pAKKO-hSLC-1(L) 로 형질전환한 E.coli DH5 α(토요보) 를 배양후, Plasmid Midi Kit (키아겐사) 를 사용하여 pAKKO-hSLC-1(S) 와 pAKKO-hSLC-1(L) 의 플라스미드 DNA 를 조제하였다. 이것을 Cell Phect Transfection Kit (아마샴팔마시아바이오테크사) 를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 CHO dhfr-세포에 도입하였다. 10 ㎍ 의 DNA 를 인산칼슘과의 공침 현탁액으로 하고, 24 시간전에 5 ×105또는 1 ×106개의 CHO dhfr-세포를 파종한 1O ㎝ 샬레에 첨가하였다. 1O % 소 태아 혈청을 포함하는 MEMα배지에서 1 일간 배양한 후 계대하고, 선택배지인 10 % 투석 소 태아 혈청을 포함하는 핵산불포함 MEMα배지에서 배양하였다. 선택배지 중에서 증식되는 인간 SLC-1(S) 유전자 도입 CHO 세포인 형질전환세포의 콜로니 56 클론 및 인간 SLC-1(L) 유전자 도입 CHO 세포인 형질전환세포의 콜로니 61 클론을 선택하였다.
실시예 13 인간 SLC-1(S) 및 인간 SLC-1(L) mRNA 의 발현량이 높은 유전자 도입 세포주의 선택
실시예 12 에서 수립된 CH0/hSLC-1(S) 주 56 클론 및 CH0/hSLC-1(L) 주 61클론의 mRNA 의 발현량을 Cytostar T Plate (아마샴팔마시아바이오테크사) 를 사용하고, 첨부된 프로토콜에 따라 아래와 같이 측정하였다. CHO/hSLC-1(S) 주 및 CHO/hSLC-1(L) 주의 각 클론을 Cytostar T Plate 의 각 웰에 2.5 ×1O4개씩 파종하여 24 시간 배양한 후, 10 % 포르말린으로 세포를 고정하였다. 각 웰에 0.25 % TritonX-100 을 첨가하여 세포의 투과성을 높인 후,35S 라벨한 서열번호 : 18 의 리보프로브를 첨가하여 하이브리다이즈시켰다. 20 ㎎/㎖ 의 RNaseA 를 각 웰에 첨가하여 유리의 리보프로브를 소화시키고, 플레이트를 잘 세정한 후, 하이브리다이즈한 리보프로브의 방사활성을 탑카운터 (Topcounter)로 측정하였다. 방사활성이 높은 주가 mRNA 발현량이 높다.
실시예 14 MCH 에 의한 인간 SLC-1 발현 CHO 세포에 대한 cAMP 합성억제활성
합성 MCH (페닌스라사) 를 여러 가지 농도로 희석하고, 인간 SLC-1 발현 CHO 세포에 대한 cAMP 합성억제활성을 이하에 나타내는 방법으로 측정하였다. 실시예 13 에서 선택한 인간 SLC-1 발현 CHO 세포인 CHO/hSLC-1(S) 주 또는 CHO/hSLC-1(L) 주를 24 웰 플레이트에 5 ×104세포/웰 로 파종하여 48 시간 배양하였다. 세포를 O.2 mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 로 세정하였다 (이하, 0.2 mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 를 반응용 버퍼라 함). 그 후, 0.5 ㎖ 의 반응용 버퍼를 첨가하여 3O 분간 배양기에서 보온하였다. 반응용 버퍼를 제거하고, 새로이 0.25 ㎖ 의 반응용 버퍼를 세포에 첨가한 후, 여러가지 양의 MCH 와 2 μM 폴스콜린을 함유하는 0.25 ㎖ 의 반응용 버퍼를 세포에 첨가하여 37 ℃ 에서 24 분간 반응시켰다. 1OO ㎕ 의 2O % 과염소산을 첨가하여 반응을 정지시키고, 이어서 빙상에서 1 시간 둠으로써 세포내 cAMP 를 추출하였다. 추출액 중의 cAMP 의 양은 cAMP EIA 키트 (아마샴팔마시아바이오테크) 를 사용하여 측정하였다. 그 결과, MCH 는 용량의존적으로 인간 SLC-1 발현세포의 세포내 cAMP 의 양을 저하시켰다.
실시예 15 MCH 가 인간 SLC-1 발현 CH0 세포에 대해 야기하는 아라키돈산 대사물 방출활성
여러 가지 농도의 합성 MCH (페닌스라사) 가 나타내는 인간 SLC-1 발현 CH0 세포에 대한 아라키돈산 대사물 방출활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 실시예 13 에서 선택한 인간 SLC-1 발현 CHO 세포인 CHO/hSLC-1(S) 주 또는 CHO/hSLC-1(L) 주를 24 웰 플레이트에 5 ×104세포/웰 로 파종하여 24 시간 배양후, [3H] 아라키돈산을 0.25 μCi/웰 이 되도록 첨가하였다. [3H] 아라키돈산 첨가 16 시간후, 세포를 0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 함유하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 로 세정하고, 각 웰웰에0.05 % BSA 와 20 mM HEPES 를 포함하는 행크스버퍼 (pH 7.4) 에 용해한 여러 가지 농도의 합성 MCH 500 ㎕ 을 첨가하였다. 37 ℃ 에서 60 분간 인큐베이트한 후, 반응액 400 ㎕ 를 신틸레이터에 첨가하여 반응액 중에 유리한 [3H] 아라키돈산 대사물의 양을 신틸레이션 카운터로 측정하였다. 그 결과, 합성 MCH 는 용량의존적으로 인간 SLC-1 발현세포에 대해 아라키돈산 대사물 방출활성을 나타냈다.
실시예 16 인간 SLC-1 발현 CH0 세포막분획을 사용한 GTPγS 결합활성의 측정
인간 SLC-1 발현 CH0 세포막분획을 이하의 방법에 의해 조제하였다. 5 mM EDTA (에틸렌디아민 4 아세트산) 를 첨가한 인산완충 생리식염수 (pH 7.4) 에 인간 SLC-1 발현 CHO 세포 (1 ×108개) 를 부유시켜 원심하였다. 세포의 펠릿에 균질화버퍼 (10 mM NaHC03, 5 mM EDTA, pH 7.5) 를 10 ㎖ 첨가하고, 폴리트론 호모지나이저를 사용하여 균질화하였다. 400 ×g 으로 15 분간 원심하여 얻어진 상청을 다시 100,000 ×g 으로 1 시간 원심하여 막분획의 침전물을 얻었다. 이 침전물을 2 ㎖ 의 분석버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1 % BSA (소 혈청 알부민), 1O mM MgCl2, 1OO mM NaCl, 1 mM GDP (구아노신5'-2 인산), 0.25 mM PMSF (페닐메틸술포닐플루오라이드), 1 ㎍/㎖ 펩스타틴, 20 ㎍/㎖ 로이펩틴, 10 ㎍/㎖ 포스포라미돈] 에 현탁하여 100,000 ×g 으로 1 시간 원심하였다. 침전물로서 회수된 막분획을 다시 20 ㎖ 의 분석버퍼에 현탁하고, 분주후 -80 ℃ 로 보존하고, 사용할 때마다 해동하여 사용하였다.
GTPγS 결합활성의 측정은 이하와 같이 실시하였다. 폴리프로필렌제 96 웰 플레이트에 분석버퍼로 희석한 인간 SLC-1 발현 CHO 세포막분획 173 ㎕ 를 분주한 후, 여러 가지 농도의 MCH (Bachem 사 제조) 를 용해한 DMSO 용액 2 ㎕ 및[35S]-구아노신 5'-(γ-티오)트리포스페이트 (다이이찌가가꾸야꾸힝사 제조) 25 ㎕ 를 동시에 첨가하였다 (세포막 최종농도 : 20 ㎍/㎖, [35S]-구아노신 5'-(γ-티오)트리포스페이트 최종농도 : 0.33 nM). 이 반응액을 25 ℃ 에서 1 시간 교반하면서 반응시킨 후, 글래스필터 (GF-C) 를 사용하여 흡인여과하고, 다시 세정액 (50 mM Tris-HCl 완충액 pH 7.5) 300 ㎕ 로 3 회 세정하였다. 글래스필터에 액체 신틸레이터를 50 ㎕ 첨가하고, 남은 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다.
MCH 는 용량의존적으로 인간 SLC-1 발현 CHO 세포막분획에 결합하는 [35S]-구아노신 5'(γ-티오)트리포스페이트 의 양을 증대시켰다. 또, MCH 의 인간 SLC-1 발현 CHO 세포막분획에 대한 ED50값은 0.2 nM 이었다.
실시예 17 수동 에드만 분해에 의한 MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) (서열번호 : 19-24) 의 조제
MCH 0.1 mg (시그마사) 을 30 ㎕ 의 50 % 피리딘에 용해하고, 1 ㎕ 의 페닐이소티오시아네이트 (와꼬준야꾸) 를 첨가하여 질소치환한 후, 45 ℃ 로 보온하였다. 10 분 간격으로 교반하여 1 시간이 경과한 시점에서 보온을 멈추고 질소기류하에서 건고하였다. 20 ㎕ 의 에탄올에 다시 용해하여 질소기류하, 이어서 감압하에서 용매를 제거하여 건고하였다. 반응생성물인 페닐티오카르바모일 유도체를 20 ㎕ 의 트리플루오로아세트산 (와꼬준야꾸) 에 의해 용해하고, 질소치환하여 45 ℃ 에서 20 분간 보온함으로써 펩티드의 아미노 말단 아미노산을 아닐리노티아졸리논 유도체로서 절단하였다. 질소기류로 트리플루오로아세트산을 제거한 후, 30 ㎕ 의 물 및 100 ㎕ 의 아세트산 n-부틸을 첨가하고, 아세트산 n-부틸에 의해 과잉의 시약 및 아닐리노티아졸리논 유도체를 추출하여 제거하였다. 아세트산 n-부틸에 의한 추출은 3 회 반복하였다. 아미노 말단이 1 잔기 단축된 MCH(2-19) 를 포함하는 수상을 질소기류하, 이어서 감압하에서 건고하였다.
이 분해과정을 1 회만 행함으로써 아미노 말단의 1 잔기만 결실된 MCH(2-19) 를 얻었다. 동일한 분해과정을 2 회, 3 회, 4 회, 5 회 또는 6 회 반복함으로써 1 잔기씩 N 말단의 아미노기가 단축된 MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 를 얻었다.
상기한 분해반응에 의해 얻어진 MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 를 다음과 같이 정제한 후, 질량분석 및 아미노산 분석에 의해 구조를 확인하였다. 이하에 MCH(4-19) 에 대하여 상세하게 서술하는데, 다른 유도체에 대해서도 거의 동일한 조작을 행하였다. 얻어진 MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 의 분석값을 표 1 에 나타냈다.
[표 1]
MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-l9) 의 질량분석값 및 아미노산 분석값
MCH(4-19) 를 이하와 같이 HPLC 로 정제하였다. Spheri-5 RP-18 역상 고속액체 크로마토그래피용 칼럼 (브라운리사, 2.1 ㎜ ×30 ㎜) 에 미리 A 액 (0.1 % 트리플루오로아세트산) 을 유속 300 ㎕/min 으로 흘려 25 ℃ 에서 평형화하였다.반응산물은 270 ㎕ 의 0.1 % 트리플루오로아세트산에 용해하여 1 회 50 ㎕ 를 칼럼에 주입한 후, 유속 300 ㎕/min 을 유지하면서 30 분간에 걸쳐 B 액 (0.1 % 트리플루오로아세트산/70 % 아세토니트릴) 농도를 70 % 까지 상승시켰다. 용출액을 210 ㎚ 의 흡광도로 모니터하여 피크를 수동으로 분취하였다. MCH(4-19) 는 17.1 분에 용출하였다. 1 개의 시험관에 모은 MCH(4-19) 를 농축 건고하여 100 ㎕ 의 DMSO 에 용해하였다.
질량분석은 닛뽕덴시 JMS-HX110 으로 LSIMS 법으로 행하였다. 즉, 프로브칩 상에서 1 ㎕ 의 3-니트로벤질알콜과 글리세롤이 3 : 2 로 이루어지는 매트릭스와 1 ㎕ 의 샘플을 혼합하여 이온원에 도입하였다. 15 kV 로 가속된 세슘이온을 조사하고, 생성된 정(正) 2 차 이온을 10 kV 로 가속하여 검출기에 안내하였다.
아미노산 분석을 위한 가수분해는 샘플 5 ㎕ 를 유리관에 담아 감압 건고하여 반응 바이알에 넣고, 그 바닥부에 6N 공비염산 (피아스사, Sequenal Grade) 200 ㎕ 를 넣어 워터즈사 Pico-Tag 워크스테이션을 사용하여 워터즈사가 추천하는 방법에 따라 탈기후, 110 ℃, 24 시간 보온하여 행하였다.
반응 바이알중의 염산을 진공펌프에 의해 감압하 제거한 후, 150 ㎕ 의 20 mM 염산으로 시료를 희석하고, 분석 바이알에 주입하여 아미노산 분석장치에 세트하고, 100 ㎕ 를 분석에 사용하였다. 아미노산 분석은 히타치 L-8500 고속 아미노산 분석계를 이용하고, 오르토프탈알데히드 시약 (와꼬준야꾸) 을 유도체화 반응에 이용한 형광분석법으로 분석하였다. 형광분석용 완충액의 조제법, 반응액의 조제법, 분석조건은 L-8500 아미노산 분석계 취급 설명서의 기재에 따랐다. 루이신을 기준으로 하였을 때의 측정값의 몰비는 표 1 에 나타낸 바와 같다.
또, MCH 또는 MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) 및 MCH(5-19) 는 실시예 24 에서 실시예 28 에 기재된 고상합성법에 의해서도 조제할 수 있다.
실시예 18 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) 및 MCH(5-19) 의 비동위원소 보르톤-헌터 시약에 의한 유도체화
MCH 및 실시예 17 에서 얻어진 MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) 및 MCH(5-19) 및 MCH (6-19) 의 비동위원소 보르톤-헌터 시약에 의한 유도체화를 행하였다. MCH(4-19) 의 유도체화를 예로 들어 이하에 서술한다.
디메틸포름아미드 50 ㎕ 에 용해한 MCH(4-19) 1 n㏖ 에 비동위원소 보르톤-헌터 시약인 3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피온산N-숙신이미딜(와꼬준야꾸) 100 n㏖ 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (와꼬준야꾸) 100 n㏖ 을 첨가하여 37 ℃ 에서 4 시간 반응시켰다.
반응혼합물에 0.1 % 트리플루오로아세트산을 함유하는 10 % 아세토니트릴 450 ㎕ 를 첨가하여 HPLC 로 정제하였다. 크로마토그래피의 조건은 이하와 같다. 칼럼은 Wakosil-Ⅱ 5C18HG (4.6 ×150 ㎜) 로 유속은 매분 1.0 ㎖ 로 하였다. 용출은 0.1 % 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴수를 사용하고, 아세토니트릴 농도를 2 분간 10 % 로 유지한 후, 5 분간 20 % 까지 상승시키고, 그 후 20 분간 50 % 까지 상승시켜 행하였다. MCH(4-19) 의 비동위원소 보르톤-헌터 시약에 의한 유도체인 [N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Met4]-MCH(4-19) 는 22.9 분에 용출되어 수동으로 분취하였다. MCH 또는 MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(5-19) 및 MCH(6-19) 에 대해서도 거의 동일한 조작으로 N 말단 아미노산의 아미노기에 3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐기를 도입하여 유도체화하고, HPLC 에 의해 분취하였다. 이들 유도체를 실시예 17 에 기재한 방법과 동일하게 하여 산가수분해한 후, 아미노산 분석을 행하였다. 결과를 표 2 에 나타냈다.
[표 2]
유도체화 MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19) 및 MCH(6-19) 의 아미노산 분석값
실시예 19 방사성동위원소 표지 MCH(4-19) 의 제작
실시예 17 에서 조제한 MCH 의 N 말단 아미노산 3 잔기 결실체인 MCH(4-19) 를, 보르톤-헌터법으로 방사성동위원소 표지하였다. 튜브중에서 벤젠에 용해되어 있는 [125I]-보르톤-헌터 시약 (3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피온산N-숙신이미딜) 9.25 MBq (0.11 n㏖) (NEN 라이프사이언스프로덕츠사, 81.4 TBq/m㏖) 에 건조질소가스를 분출하여 벤젠을 제거하였다. 이 튜브에 18 ㎕ 의 50 mM 인산완충액 (pH 7.5) 과 1.5 ㎕ 의 디메틸술폭시드에 용해한 2.3 n㏖ 의 MCH(4-19) 와 0.5 ㎕ 의 디메틸술폭시드를 첨가하여 잘 혼합하였다. 혼합액을 37 ℃ 에서 2 시간 보온한 후, 보르톤-헌터 시약에 의한 MCH(4-19) 의 방사화 유도체인 [125I]-[N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Met4]-MCH(4-19) (구조식은 상기 (4) 에 기재) 를 역상 HPLC 에 의해 분취하였다. [125I]-[N-(3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐)-Met4]-MCH(4-19) 는, ODS 칼럼 (토소, ODS-80TM (4.6 ㎜ ×150 ㎜)) 으로부터 아세토니트릴농도 43.6 % 부근에 용출하였다.
동일하게 하여 [125I]-보르톤-헌터 시약을 사용함으로써 N 말단 아미노산의 아미노기에 [125I]-3-(4-히드록시-3-요오도페닐)프로피오닐기를 도입하여 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 의 방사성동위원소 유도체 (상기 (1) ∼ (3), (5) ∼ (7)) 를 조제할 수 있다.
실시예 20 방사요오드표지 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 의 제작
동위원소 표지 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 는 이하와 같이 아미노산 서열중의 Tyr13을 방사요오드화하여 제작할 수도 있다. MCH(4-19) 에 대하여 예시하는데, 동일한 방법에 의해 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 의 방사요오드화체를 제작할 수 있다.
MCH(4-19) 5 ㎍ 을 25 ㎕ 의 0.4 M 아세트산나트륨 (pH 5.6) 에 용해하고, 이것에 200 ng 의 락토퍼옥시다아제 (와꼬준야꾸 제조) 를 첨가한 후, 1 mCi 의 [125I]-요오드화 나트륨 (아마샴팔마시아바이오테크사) 및 200 ng 의 과산화수소 (10 ㎕)를 첨가한다. 실온에서 10 분간 정치한 후, 추가로 200 ng 의 과산화수소 (10 ㎕)를 첨가하여 10 분간 정치한다. 이것을 TSKgel ODS-80Ts칼럼 (4.6 ㎜ ×25 ㎝, 토소) 을 사용한 HPLC 에 의해 정제하여 [125I]-표지 MCH(4-19) 를 얻는다.
실시예 21 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 의 GTPγS 결합분석법을 사용한 아고니스트 활성의 측정
래트 SLC-1 발현 CHO 세포막분획은 이하의 방법에 의해 조제하였다. 5 mM EDTA (에틸렌디아민 4 아세트산) 를 첨가한 인산완충 생리식염수 (pH 7.4) 에 래트 SLC-1 발현 CHO 세포 (1 × 108개) 를 부유시켜 원심하였다. 세포의 펠릿에 균질화버퍼 (10 mM NaHCO3, 5 mA EDTA, pH 7.5) 를 10 ㎖ 첨가하고, 폴리트론 호모지나이저를 사용하여 균질화하였다. 400 ×g 으로 15 분간 원심하여 얻어진 상청을 다시 100,000 ×g 으로 1 시간 원심하여 막분획의 침전물을 얻었다.이 침전물을 2 ㎖ 의 분석버퍼 (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1 % BSA (소 혈청 알부민), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 μM GDP (구아노신5'-2 인산), 0.25 mM PMSF (페닐메틸술포닐플루오라이드), 1 ㎍/㎖ 펩스타틴, 20 ㎍/㎖ 로이펩틴, 10 ㎍/㎖ 포스포라미돈) 에 현탁하고, 100,000 ×g 으로 1 시간 원심하였다. 침전물로서 회수된 막분획을 다시 20 ㎖ 의 분석버퍼에 현탁하고, 분주후 -80 ℃ 로 보존하고, 사용할 때마다 해동하여 사용하였다.
MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 의 아고니스트 활성의 측정은 이하와 같이 실시하였다. 폴리프로필렌제 96 웰플레이트에 분석버퍼로 희석한 래트 SLC-1 발현 CHO 세포막분획 173 ㎕ 을 분주한 후, DMSO 용액으로 여러 가지 농도로 희석한 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 용액을 2 ㎕, 및 [35S]-구아노신 5'-(γ-티오)트리포스페이트 (다이이찌가가꾸야꾸힝사 제조) 를 25 ㎕ 를 동시에 첨가하였다 (세포막 최종농도 : 20 ㎍/㎖, [35S]-구아노신 5'-(γ-티오)트리포스페이트 최종농도 : 0.33 nM). 이 반응액을 25 ℃ 에서 1 시간 교반하면서 반응시킨 후, 유리필터 (GF-C) 를 사용하여 흡인여과하고, 다시 세정액 (50 mM Tris-HCl 완충액 pH 7.5) 300 ㎕ 로 3 회 세정하였다. 유리필터에 액체 신틸레이터를 50 ㎕ 첨가하고, 남은 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다.
MCH(6-19) 및 MCH(7-19) 의 아고니스트 활성이 MCH 와 비교하여, 각각 10 배 및 200 배 정도 저하되어 있었던 것에 대하여, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19)및 MCH (5-19) 는 MCH 와 거의 동등한 아고니스트 활성을 나타냈다 (도 7).
실시예 22 비동위원소 보르톤-헌터 시약에 의해 유도체화된 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) 및 MCH(5-19) 의 GTPγS 결합분석법을 사용한 아고니스트 활성의 측정
실시예 18 에서 얻어진 비동위원소 보르톤-헌터 시약에 의해 유도체화된 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) 및 MCH(5-19) 의 아고니스트 활성을, 실시예 21 과 동일하게 GTPγS 결합결합을 사용하여 측정하였다.
유도체화된 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) 및 MCH(5-19) 는 MCH 와 동일하게 용량의존적으로 인간 SLC-1 발현 CHO 세포막분획에 결합하는 [35S]-구아노신 5'-(γ-티오)트리포스페이트 의 양을 증대시키고, 비동위원소 보르톤-헌터 시약에 의해 유도체화된 각종 MCH 가 아고니스트 활성을 갖는 것을 확인하였다 (도 8). 도면 중, BH-MCH, BH-MCH(2-19), BH-MCH(3-19), BH-MCH(4-19) 및 BH-MCH(5-19) 는 각각 비동위원소방사성터 시약에 의해 유도체화된 MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) 및 MCH(5-19) 를 나타낸다.
실시예 23 보르톤-헌터 시약을 사용하여 제작한 [125I]-표지 MCH(4-19) 를 사용한 수용체 결합실험
실시예 19 에서 보르톤-헌터 시약을 사용하여 제작한 [125I]-표지 MCH(4-19) (구조식은 상기 (4) 에 기재) 및 인간 SLC-1 발현 CHO 세포로부터 조제한 세포막분획을 사용하여 수용체 결합실험을 행하였다.
인간 SLC-1 발현 CHO 세포로부터 실시예 16 에 따라 조제한 세포막분획을, 분석용 버퍼 (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (에틸렌디아민 4 아세트산), 0.1 % BSA (소 혈청 알부민), 0.25 mM PMSF (페닐메틸술포닐플루오라이드), 1 ㎍/㎖ 펩스타틴, 20 ㎍/㎖ 로이펩틴, 10 ㎍/㎖ 포스포라미돈, pH 7.5) 로 각종 농도로 희석후, 96 웰 플레이트에 173 ㎕ 씩 분주하였다. 최대결합량 (TB) 을 측정하기 위해, 2 ㎕ 의 DMSO 와, 100 pM 의 [125I]-표지 MCH(4-19) 25 ㎕ 를, 또 비특이적 결합 (NSB) 을 측정하기 위해, 100 μM MCH 의 DMSO 용액 2 ㎕ 와, 100 pM 의 [125I]-표지 MCH(4-19) 25 ㎕ 를, 막분획용액에 첨가하였다. 25 ℃ 에서 60 분간 반응시킨 후, 폴리에틸렌이민처리한 와트만 글래스필터 (GF-C) 를 사용하여 반응액을 흡인여과하였다. 여과후, γ-카운터를 사용하여 여과지상에 남은 [125I]-표지 MCH(4-19) 의 방사활성을 측정하였다. 도 9 에 나타낸 바와 같이, 막분획의 농도에 의존한 [125I]-표지 MCH(4-19) 의 특이적인 결합 (SB) 이 보였다.
또, 막분획농도를 2.5 ㎍/㎖ 로 설정하여 저해율 (%) 로부터 MCH 의 50 % 저해농도 (IC50값) 를 산출한 결과, IC50값은 0.2 nM 이었다 (도 10).
래트 SLC-1 발현 CHO 세포로부터 조제한 막분획과 [125I]-표지 MCH(4-19) 를 사용하여 동일한 결합실험을 행할 수 있다.
실시예 24 MCH (Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val) 의 제조
시판 Boc-Val-OCH2-PAM 수지 (0.77 m㏖/g 수지) 0.5 m㏖ 분을 펩티드합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-식 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로 Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex), Boc-Phe, Boc-Asp(OcHex) 를 차례로 도입하여 목적의 보호펩티드수지를 얻는다. 이 수지 0.6 g 을 p-크레졸 2 g, 1,4-부탄디티올 1.2 ㎖ 와 함께 무수불화수소 10 ㎖ 중, 0 ℃ㆍ60 분 교반한 후, 불화수소를 감압제거하고, 잔류물로 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 여과한다. 이 침전에 50 % 아세트산수를 첨가하여 추출하고, 불용부분을 제외하고, 추출액을 충분히 농축후, 50 % 아세트산수로 충전한 세파덱스 (상품명) G-25 칼럼 (2.0 ×80 ㎝) 으로 동 용매로 전개, 주요분획을 모아 LiChroprep (상품명) RP-18 을 충전한 역상 크로마토칼럼 (2.6 ×60 ㎝) 으로 0.1 % TFA수 200 ㎖ 로 세정, 0.1 % TFA수 300 ㎖ 와 0.1 % TFA함유 40 % 아세토니트릴수 300 ㎖ 를 사용한 선형구배용출을 행하고, 주요분획을 모아 농축한다. 이것을 약 4 ㎖ 의 아세트산에 용해하고, 증류수로 240 ㎖ 로 희석한 후, 암모니아수를 사용하여 pH 7.5 로 조정하고, 서서히 공기를 불어넣어 교반한다. 반응을 HPLC 로 추적하여, SH체 펩티드의 피크가 전부 SS체로 변화한 것을 확인후, 아세트산을 첨가하여 용액의 pH 를 3 으로 조정하고, 상기 LiChroprep (상품명) RP-18 칼럼에 흡착한다. 칼럼을 0.1 % TFA수 200 ㎖ 로 세정후, 0.1 % TFA수 300 ㎖ 와 0.1 % TFA 함유 50 % 아세토니트릴수 300 ㎖ 를사용한 선형구배용출을 행하고, 주요분획을 모아 동결건조시켜 목적으로 하는 펩티드를 얻는다.
질량분석에 의한 (M+H)+2387.3 (이론값 2387.9)
HPLC 용출시간 : 20.9 분
칼럼조건
칼럼 : Wakosil-Ⅱ 5C18HG (4.6 ×150 ㎜)
용리액 : A 액 - 0.1 % TFA 함유 10 % 아세토니트릴수, B 액 - 0.1 % TFA 함유 60 % 아세토니트릴수를 사용하고, A/B : 20/80 ∼ 80/20 으로 직선형 농도구배용출 (20 분)
유속 : 1.0 ㎖/분
실시예 25 Des-Asp1-MCH (MCH(2-19), Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val) 의 제조
시판 Boc-Val-OCH2-PAM 수지 (0.77 m㏖/g 수지) 0.5 m㏖ 분을 펩티드합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-식 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로 Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex), Boc-Phe 를 차례로 도입하여 목적의 보호펩티드수지를 얻는다. 이 수지를 실시예 24 와 동일하게 탈보호, 고리화, 정제를 행하여 목적의 펩티드를 얻는다.
질량분석에 의한 (M+H)+2272.3 (이론값 2272.1)
HPLC 용출시간 : 20.6 분
칼럼조건
칼럼 : Wakosil-Ⅱ 5C18HG (4.6 ×150 ㎜)
용리액 : A 액 - 0.1 % TFA 함유 10 % 아세토니트릴수, B 액 - 0.1 % TFA 함유 60 % 아세토니트릴수를 사용하고, A/B : 20/80 ∼ 80/20 으로 직선형 농도구배용출 (20 분)
유속 : 1.0 ㎖/분
실시예 26 Des-[Asp1,Phe2]-MCH (MCH(3-19), Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val) 의 제조
시판 Boc-Val-OCH2-PAM 수지 (0.77 mmol/g 수지) 0.5 mmol 분을 펩티드합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-식 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로 Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex) 를 차례로 도입하여 목적의 보호펩티드수지를 얻는다. 이 수지를 실시예 24 와 동일하게 탈보호, 고리화, 정제를 행하여 목적의 펩티드를 얻는다.
질량분석에 의한 (M+H)+2124.8 (이론값 2125.0)
HPLC 용출시간 : 19.2 분
칼럼조건
칼럼 : Wakosil-Ⅱ 5C18HG (4.6 ×150 ㎜)
용리액 : A 액 - 0.1 % TFA 함유 10 % 아세토니트릴수, B 액 - 0.1 % TFA 함유 60 % 아세토니트릴수를 사용하고, A/B : 20/80 ∼ 80/20 으로 직선형 농도구배용출 (20 분)
유속 : 1.0 ㎖/분
실시예 27 Des-[Asp1,Phe2,Asp3]-MCH (MCH(4-19), Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val) 의 제조
시판 Boc-Val-OCH2-PAM 수지 (0.77 mmol/g 수지) 0.5 mmol 분을 펩티드합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-식 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로 Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met 를 차례로 도입하여 목적의 보호펩티드수지를 얻는다. 이 수지를 실시예 24 와 동일하게 탈보호, 고리화, 정제를 행하여 목적의 펩티드를 얻는다.
질량분석에 의한 (M+H)+2009.9 (이론값 2010.0)
HPLC 용출시간 : 17.9 분
칼럼조건
칼럼 : Wakosil-Ⅱ 5C18HG (4.6 ×150 ㎜)
용리액 : A 액 - 0.1 % TFA 함유 10 % 아세토니트릴수, B 액 - 0.1 % TFA 함유 60 % 아세토니트릴수를 사용하고, A/B : 20/80 ∼ 80/20 으로 직선형 농도구배용출 (20 분)
유속 : 1.0 ㎖/분
실시예 28 Des-[Asp1,Phe2,Asp3,Met4]-MCH (MCH(5-19), Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-OH) 의 제조
시판 Boc-Val-OCH2-PAM 수지 (0.77 mmol/g 수지) 0.5 mmol 분을 펩티드합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-식 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로 Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu 를 차례로 도입하여 목적의 보호펩티드수지를 얻는다. 이 수지를 실시예 24 와 동일하게 탈보호, 고리화, 정제를 행하여 목적의 펩티드를 얻는다.
질량분석에 의한 (M+H)+1878.9 (이론값 1878.9)
HPLC 용출시간 : 17.4 분
칼럼조건
칼럼 : Wakosil-Ⅱ 5C18HG (4.6 ×150 ㎜)
용리액 : A 액 - 0.1 % TFA 함유 10 % 아세토니트릴수, B 액 - 0.1 % TFA 함유 60 % 아세토니트릴수를 사용하고, A/B : 20/80 ∼ 80/20 으로 직선형 농도구배용출 (20 분)
유속 : 1.0 ㎖/분
(서열목록 프리텍스트)
서열번호 : 1
서열에 관한 다른 정보 : 제 7 번째 및 제 16 번째의 2 개의 Cys 잔기는 분자내 디술피드결합을 형성하고 있다.
서열번호 : 2
서열에 관한 다른 정보 : 제 7 번째 및 제 16 번째의 2 개의 Cys 잔기는 분자내 디술피드결합을 형성하고 있다.
서열번호 : 19
서열에 관한 다른 정보 : 제 6 번째 및 제 15 번째의 2 개의 Cys 잔기는 분자내 디술피드결합을 형성하고 있다.
서열번호 : 20
서열에 관한 다른 정보 : 제 5 번째 및 제 14 번째의 2 개의 Cys 잔기는 분자내 디술피드결합을 형성하고 있다.
서열번호 : 21
서열에 관한 다른 정보 : 제 4 번째 및 제 13 번째의 2 개의 Cys 잔기는 분자내 디술피드결합을 형성하고 있다.
서열번호 : 22
서열에 관한 다른 정보 : 제 3 번째 및 제 12 번째의 2 개의 Cys 잔기는 분자내 디술피드결합을 형성하고 있다.
서열번호 : 23
서열에 관한 다른 정보 : 제 2 번째 및 제 11 번째의 2 개의 Cys 잔기는 분자내 디술피드결합을 형성하고 있다.
서열번호 : 24
서열에 관한 다른 정보 : 제 1 번째 및 제 10 번째의 2 개의 Cys 잔기는 분자내 디술피드결합을 형성하고 있다.
본 발명의 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 SLC-1 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법은, 식욕 (섭식) 증진제 외, 미약진통, 이완출혈, 태반만출전후, 자궁복고부전, 제왕절개술, 인공임신중절, 유즙울체 등의 예방ㆍ치료약 등으로서 사용할 수 있는 SLC-1 아고니스트, 항비만제 (약), 식욕 (섭식) 조절제 등 외, 과강진통, 강직성 자궁수축, 태아가사, 자궁파열, 경관열상, 조산, Prader-Willi 증후군 등의 예방ㆍ치료약 등으로서 사용할 수 있는 SLC-1 안타고니스트의 스크리닝 방법으로서 유용하다.

Claims (12)

  1. 멜라닌 응집 호르몬 (MCH) 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 SLC-1 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  2. MCH 또는 그의 유도체 또는 그의 염 및 SLC-1 또는 그의 염을 함유하는 것을 특징으로 하는, MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트.
  3. 제 1 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 2 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어질 수 있는, MCH 또는 그의 염과 SLC-1 또는 그의 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그의 염.
  4. 제 3 항에 기재된 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어지는 의약.
  5. 제 4 항에 있어서, 항비만약인 의약.
  6. 서열번호 : 11 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 단백질 또는 그의 염.
  7. 제 6 항에 기재된 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA.
  8. MCH 가 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 펩티드인 제 1 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 2 항에 기재된 스크리닝용 키트.
  9. 유도체가 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제 5 번째 내지 제 19 번째의 서열을 함유하는 펩티드인 제 1 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 2 항에 기재된 스크리닝용 키트.
  10. 유도체가 보르톤헌터 시약에 의해 유도된 MCH 또는 보르톤헌터 시약에 의해 유도된 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제 5 번째 내지 제 19 번째의 서열을 함유하는 펩티드인 제 1 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 2 항에 기재된 스크리닝용 키트.
  11. 보르톤헌터 시약에 의해 유도된 MCH 또는 보르톤헌터 시약에 의해 유도된 서열번호 : 2 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제 5 번째 내지 제 19 번째의 서열을 함유하는 펩티드 또는 그의 염.
  12. 식
    로 표시되는 화합물 또는 그의 염.
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