KR20020008131A

KR20020008131A - 혈소판 부착 차단용 단백질

Info

Publication number: KR20020008131A
Application number: KR1020017011881A
Authority: KR
Inventors: 스트리트마테르볼프강; 귀조브데틀레프; 호프만우베; 헴베르게르위르겐; 포테프지시; 쇼이블베른하르트
Original assignee: 플레믹 크리스티안; 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2002-01-29
Anticipated expiration: 2020-03-10
Also published as: ATE295883T1; PL350147A1; BR0009074A; AR023099A1; CA2367457A1; US6774107B1; RU2292351C2; PL200384B1; NO20014506D0; EP1161530A1; CZ301524B6; CO5241328A1; AU3166200A; HK1045330A1; CZ20013341A3; US20060094079A1; MY123371A; MXPA01009363A; WO2000056885A1; AU767172B2

Abstract

콜라겐에 강하게 결합하여 천연 혈소판의 콜라겐 부착 억제제로써 작용하는, 의약용 거머리히루도 메디시날리스의 침에서 단리되는 천연 생성 단백질이 기재된다. 본 단백질은 약 12000 의 분자량과 산성 등전점을 가지며, 6 개의 시스테인을 포함한다. 단백질을 서열분석하여,히루도 메디시날리스cDNA-라이브러리로부터 유전자를 클로닝하였다. 재조합 기법에 의한 상기 폴리펩티드의 제조 방법이 개시된다. 재조합 및 천연 생성 단백질은 콜라겐 의존적 혈소판 부착의 강력한 억제제이므로, 심장 질환 및 순환계 질환과 관련된 다양한 상태의 치료적 처치에 유용하다. 또한, 단백질은 천연 또는 인공 콜라겐 표면을 코팅하여, 이들을 세포 비부착성으로 만들고 세포의 활성화를 방지하는데 유용하다.

Description

혈소판 부착 차단용 단백질 {PROTEIN FOR BLOCKING PLATELET ADHESION}

발명의 개요

콜라겐에 강하게 결합하여 천연 혈소판의 콜라겐 부착 억제제로써 작용하는, 의약용 거머리히루도 메디시날리스 (Hirudo medicinalis)의 침에서 단리되는 천연 생성 단백질이 기재된다. 본 단백질은 약 12000 의 분자량과 산성 등전점을 가지며, 6 개의 시스테인을 포함한다. 단백질을 서열분석하여,히루도 메디시날리스cDNA-라이브러리로부터 유전자를 클로닝하였다. 재조합 기법에 의한 상기 폴리펩티드의 제조 방법이 개시된다. 재조합 및 천연 생성 단백질은 콜라겐 의존적 혈소판 부착의 강력한 억제제이므로, 심장 질환 및 순환계 질환과 관련된 다양한 상태의 치료적 처치에 유용하다. 또한, 단백질은 천연 또는 인공 콜라겐 표면을 코팅하여, 이들을 세포 비부착성으로 만들고 세포의 활성화를 방지하는데 유용하다.

콜라겐 및/또는 vWF 인자 유도 혈소판 부착을 직접적으로 방해하는 본 발명에 개시된 바와 같은 접근법은, 심혈관계 이상의 처치에서의 차후 개선 가능성에기여할 수 있다.

혈소판 부착을 방지하는 몇몇 신규 억제제들은 vWF 에 대한 단일클론 항체이다. 또한, 당단백질 IIb/IIIa 억제제도 혈소판 부착 억제에 유리할 수 있을 것으로 제시되어 왔다.

단일클론 항체 c7E3 같은 이들 억제제의 일부는 이미 임상 실험되고 있으나, KGD- 및 RGDF-억제제 같은 다른 것들은 여전히 연구 중이다. 그러나, 이러한 새로운 억제제 대부분의 특이성은 매우 자세히 연구되지 않았으므로, 이 억제제들을 사용함으로써 유도될 부작용의 스펙트럼이 여전히 존재하며, 주의깊은 검사를 필요로 한다.

콜라겐 유도 혈소판 부착을 방해하는 새로운 화합물의 탐색을 위한 풍부한 원천은 천연 흡혈 동물을 통해 얻어진다. 하기 문헌들에 기재된 바와 같이, 몇몇 억제제들이 천연에서 단리되어 있다:히루도 메디시날리스에서 단리된 칼린 (Calin) 이라 불리는 65 kD 단백질 (US 5,587,360, WO 92/07005) (Munro, R., et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2, 179-184) 및 거머리해멘테리아 오피시날리스 (Haementeria officinalis)의 침샘에서 단리된 16 kD (LAPP) 단백질 (US 5,324,715). 두 단백질 모두 콜라겐 의존적 혈소판 응집의 정역학적 분석에서 시험된 응집 억제제로서 기재되어 있다.

증명된 시험관 내 활성에도 불구하고, LAPP 는 몇몇의 잘 확립된 생체 내 모델에서 작용하는데 실패하였다 (Schaffer L.W. et al.; Arterioscler. Thromb., 1993, 13, 1593-1601 및 Connolly T.M. et al.; Thromb. Haemostas., 1993, 69,589). 연진드기 (soft tick,Ornithodoros moubata) 또한, 콜라겐 촉진 혈소판 응집의 예방에 활성이 있는 (Waxman, L. et al.; J. Biol. Chem., 1993, 268, 5445-49) 항혈소판 단백질 (마우바틴, Moubatin) 을 함유한다. 흡혈 벌레로부터의 또다른 혈소판 응집 억제제가 Noeske-Jungblut C. et al. 의 WO 9309137 에 개시되어 있다. Smith et al. 은 뱀 독에서 50 kDa 단백질을 단리하였고, 19 kDa 단백질이 흡혈 벌레인트리아토마 팔리디펜니스 (Triatoma pallidipennis)의 침에서 단리되었다. 상기 단백질은 콜라겐 유도 혈소판 응집을 특이적으로 억제하는 인자를 함유하는 것으로 나타났다. 팔리디핀 (pallidipin) 으로 명명된 19 kDa 단백질은 혈장에서 콜라겐 매개 혈소판 응집을 억제한다. 다른 주효인자 (ADP, 트롬빈, 트롬복산 A2 모방 U46619, 포르볼 에스테르) 에 의해 촉진된 응집의 억제는 관찰되지 않았다. 팔리디핀은 콜라겐으로의 혈소판 부착에는 효과를 나타내지 않았으나, 혈소판의 ATP 방출을 억제하였다. 이는 혈소판과 가역적으로 상호작용하였고, 콜라겐과 함께 혈소판 상에 공동 표적을 공유할 수도 있다. 상기 단백질의 정확한 작용 기작과 치료적 효용은 연구 중이다. Gan et al. 은 피브리노겐 수용체 GP IIa/IIIb 로의 결합 억제제로 에키스타틴 (Echistatin) 을 기재하였다 (J. Biol. Chem, 1988, 263, 19827-32).

이러한 흥미로운 개발품들에도 불구하고, 응괴 형성, vWF-유도 혈소판 활성화 또는 내피세포 활성화의 억제에 증가된 효능을 갖고, 약학적으로 사용될 수 있으며 상업적 실현가능량으로 제조될 수 있는, 또다른 항응고제 및 항트롬빈제의 공급에 대한 요구가 계속 존재해왔다.

현재까지 기재된 공지된 단백질 중 어느 것도 이상적인 치료 프로파일을 갖는 화합물로 개발되지 못했으므로, 본 발명의 발명자들은 보다 적절한 단백질을 검출하기 위한 새로운 탐색 전략을 진행하기로 결정하였다.

지혈 및 혈전증에서, 혈소판은 손상된 혈관의 세포-세포외 기질에 부착하여 상해 부위의 표면을 덮는다. 혈전증 및 동맥 폐색의 병인론에 중요한 상기 초기 단계를 방지하는 것은, 혈전성 질환을 예방하기 위한 치료로 유익할 것이다. 콜라겐은 가장 혈전형성적인 표면 성분으로 간주되며, 혈소판 부착, 응집 및 이들의 과립을 분출시켜 (Ruggeri, Z.M. et al.; Seminars in Hematology, 1994, 31, 229-39), 추가적인 혈소판을 이 부위로 동원하여 응집물 또는 혈전을 형성케 하는 강력한 자극제임이 밝혀진 바 있다. 혈소판과 혈관 표면의 초기 접촉은 콜라겐에 결합된 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand Factor, vWF) 및 혈소판 상의 특이적 vWF 수용체인, 당단백질 Ib-V-IX 복합체에 의해 매개된다. ADP 에 덧붙여 에피네프린 및 순환 응고 인자가 혈소판의 활성과 과정을 보다 진행시키고, 동시에 트롬빈 활성 증가가 가교된 피브린 응괴의 형성에 기여한다. 혈소판-혈소판 응집은 이 과정을 지지하며, 당단백질 IIb/IIIa 수용체를 통해 세포들을 가교시키는 매개물인 피브리노겐에 의해 주로 진행된다.

상기 정상적인 생리적 반응은, 혈소판이 경화성 병변에 노출된 콜라겐에 부착하여 (Van der Rest M. et al.; FASEB Journal, 1991, 5, 2814-23) 폐색을 형성하기 시작하는 병리학적 과정 중에 매우 중요하다. 폐색의 위치 및 정도에 따라, 심근경색, 뇌졸중, 염증 또는 폐 경색과 같은 심각한 합병증이, 상기 과정의 심각한 결과일 수 있다.

직접 작용하는 항혈전제로서, 트롬빈 활성을 차단하여 피브린 풍부 혈전의 형성을 예방하는 헤파린이, 최근에 항혈전 개입에 사용되는 가장 널리 공지된 약물이다. 헤파린은 하기와 같은 적응증에 널리 사용된다: 불안정형 협심증 및 급성 심근경색. 그러나, 널리 사용됨에도 불구하고, 정맥내 적용, 보조인자로 항-트롬빈-III 가 필요, 응괴결합 트롬빈에 대한 친화도 감소, 여러 혈장 단백질에 의한 불활성화, 때때로 혈소판감소증 유발 및 생물학적 불균질성과 같은 몇몇 심각한 단점들이 해결되지 않고 남아있다. 따라서, 임상적 환경에서의 헤파린 사용결과는 현재까지 압도적이지 않다.

최근의 저분자량 헤파린 개발로 피하 적용용 별형 (version) 을 얻었으나, 표준 헤파린에 대한 치료적 이점은 수수하였다. 불행하게도, 히루딘 (Hirudin), 히루로그 (Hirulog) 및 와파린 (Warfarin) 과 같은 기타 직접적으로 작용하는 항트롬빈제도 마찬가지이다. 주요 문제점 중의 하나는 항혈전제 처리 하의 증가된 트롬빈 생성과 관련된 것으로 나타났다 (Rao, A.K et al., Circulation, 1996, 94, 389-2395).

따라서, 최근의 기타 전략들은 인자 Xa 에 의해 진행되는 프로트롬빈 활성화 과정에 초점을 맞추고 있다. 주요 난제는 상기 인자에 맞춰진 적합한 억제제를 설계하는 것이다. 따라서 요약하자면, 상기 유형의 개입의 완전한 치료적 잠재력은 아직 실현되지 않았다고 말할 수 있다.

치료제의 또다른 구획은 혈전용해 요법으로 표시되며, 스타필로키나아제 (staphylokinase), 스트렙토키나아제 (streptokinase), 유로키나아제 (urokinase) 유형 플라스미노겐 활성제, 조직 (tissue) 유형 플라스미노겐 활성제 및 아니솔화-플라스미노겐-스트렙토키나아제 활성제 복합체의 개발에 초점을 맞추고 있다. 재관류 유도를 위해 필요한 시간차는 이들 각각의 혈전용해제가 현저히 상이하지만, 전체 사망률 감소의 관점에서의 기여도는 모든 제품이 동일하다. 또한, 재폐색 또는 지속되는 출혈이 자주 나타나는 합병증이다. 이는, 이들 화합물의, 피브린에 대한 비교적 낮은 특이성과 짧은 혈장 반감기 때문일 수 있다. 최근에는, 혈전용해 치료에서의 현재 단점의 일부를 극복하기 위해, 다양한 적용 요법 및 상이한 피브린용해 원리의 병용을 시험하고 있다. 그러나 기대되는 개선은 다소 적다.

최근에는, 혈관성형술, 죽종절제술, 동맥 이식 또는 혈관벽 스텐트술과 같은 방법으로 인한 급성 혈전성 폐색 및 늦은 재협착과 같은 문제를 갖는 새로운 환자군이 발생하고 있다. 가능한 치료적 개입에는 항혈소판, 항혈전 및 혈전용해 전략이 포함된다. ADP 길항제로 작용하는 티클로프딘 (ticlopdine) 또는 칼슘 이온담체 A-23187 와 같은 다양한 기타 약제 및 특히 아스피린은 혈소판 기능에 직접 영향을 미치며, 혈소판 응집을 예방하거나 최소화하기 위해 제안되거나 사용되어 왔다. 본 발명에 따른 새로운 항혈소판 부착 물질 또한, 수술 중에 적용되는 경우, 이러한 임상 합병증의 극복을 도울 수 있을 것이다.

본 주제와 관련된 또다른 합병증은, 인공 표면이 혈액과 접촉한 후, 혈소판의 활성화 및/또는 응괴의 유도에 의한 혈전성 과정을 유도하는 경향이 증가되면 일어난다. 이러한 효과는 혈관 이식, 심장 판막, 스텐트, 카테터 또는 임의의 기타 혈액 접촉 장치 또는 물질의 부전을 일으킬 수 있다. 따라서, 비혈전형성적 표면을 생성하는 본원에 개시된 단백질능을, 이 단백질을 상기 기재된 물질 및 장치에 고정시킴으로써 보다 활용할 수 있을 것이다. 상기 처치는 상기 물질 또는 장치를 생체적합성 및 혈전저항성으로 만든다.

사용가능성한 항혈전제와 관련된 제한들 때문에, 새로운 대체 전략 및 치료제가 실제로 요구되고 있다.

도에 대한 자세한 사항들은 실시예 1 내지 10 에 설명된다.

도 1

침 성분의 제조. 사라틴의 용출은 * 로 표시된다.

a) DEAE 음이온성 교환 후, 침의 분리 프로파일을 나타낸다. 사라틴 분획은 피크 3 에서 수합되었다 (실시예 2).

b) Mono Q HR5/5 상에서의, 합해진 분획들의 재크로마토그래피를 나타낸다. 막대기로 표시된 주 피크의 마지막 부분에서 샘플을 수합하였다 (실시예 2).

c) Mono Q HR5/5 에서 수합된 사라틴 양성 분획들 (실시예 2) 의, 반제조성 분석적 RP-HPLC 상에서의 최종 크로마토그래피 단계를 나타낸다. 활성 사라틴은 주 피크 (피크 3) 에서 회수되었다.

도 2

RP-HPLC 에서 수합된 분획들의 SDS-PAGE. 사라틴 양성 분획은 * 로 표시된다 (실시예 2 및 3).

도 3

사라틴용 E. coli 발현 벡터 (실시예 7).

도 4

사라틴용 바큘로 (Baculo) 공여 플라스미드 (실시예 8)

도 5

전혈을 인공 콜라겐 표면에 노출시켜 혈소판 부착을 염색으로 시각화하였다. 사라틴을 억제제로 사용하였다 (단백질 #607). 실시예 9

도 6

가혹 조건 하에서, 콜라겐 III 유형이 코팅된 커버슬립 상으로의 혈소판 부착 억제. 침 및 사라틴의 비교. 실시예 9

도 7

사라틴은 가혹 조건 하에서, 콜라겐 III 유형이 코팅된 커버슬립 상으로의 혈소판 결합 부착을 용량 의존적으로 억제함을 보여준다. 실시예 9

도 8

사라틴용 효모 발현 벡터 (실시예 13)

본 발명에서는, 콜라겐-혈소판 상호작용에 직접적으로 작용하여, 혈소판 활성화 및 초기 혈소판-혈소판 상호작용을 억제하는,히루도 메디시날리스에서 단리된 억제제가 기재된다.

현재까지 문헌에서는, 천연 생성 화합물원으로부터의 용해성 단백질뿐만 아니라 응집 억제제를 배제하는 탐색 접근법을 이용함으로써, 새로운 항부착 기작 또는 화합물들을 동정할 수 있음을 제시하는 긍정적인 예가 없었다. 그러나, 상기 전략을 본 발명에 사용하였다. 여섯개 이상의 상이한 혈소판 표면 당단백질이 콜라겐 부착에 관여함이 공지되어 있고, 또한 폰 빌레브란트 인자, 피브로넥틴 및 트롬보스폰딘과 같은 몇몇 혈소판 유래 화합물들이 콜라겐-혈소판 부착의 간접적 매개체로서 관여함이 나타나 있었으므로, 새로운 부착 억제제의 동정 시작에서는 거의 희망이 없었다.

그럼에도 불구하고, 혈소판 수용체에 직접적으로 작용하는 화합물뿐만 아니라, 모든 문서화되거나 공지되지 않은 vWF 관련 억제제들이 배제될 수 없음을 알고, 본 접근법을 사용하여히루도 메디시날리스침을 탐색하였다. 따라서, 탐색 결과는 놀라운 것이었다: 혈소판에 대한 항부착 활성을 갖는 사라틴 (Saratin) 이라 명명된 새로운 단백질을, 많이 연구된 거머리 종인히루도 메디시날리스의 조직 및 분비물로부터 단리할 수 있었다

본 발명에는 거머리히루도 메디시날리스에서 단리된 활성 폴리펩티드 사라틴이 포함된다. 본 단백질은, 가압 투석 및 음이온성 교환 크로마토그래피와 같은 하나 이상의 크로마토그래피 단계, 그리고 하나 이상의 역상 고성능 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계를 병용하여, 침에서 단리되었다. 가압 투석 단계는, 이 단계가 없을 경우의 생동성 사라틴의 상당한 손실을 고농도의 침이 극복할 수 있게 하므로, 침으로부터의 사라틴 회수 중에 절대적으로 결정적인 것으로 나타났다. 단리된 사라틴은 몇몇 콜라겐에 강하게 결합하고, 콜라겐이 코팅된 상기 표면으로의 혈소판 부착을 용량 의존적 방식으로 차단한다.

탐색 과정을 최적화시키기 위해, 최근 사용가능한 기법을 개발하여 혈소판 부착과 혈소판 응집을 구별하였다: 섬유를 통한 흐름을 억제하거나 중단시키는 혈소판능, 시험관내 응괴 형성에서의 혈소판 기여도, 유리 비드 부착 실험 또는 필터를 통한 전혈 흐름 및 조절된 압력 구배 하에서 유리 섬유 또는 콜라겐으로 구성된 필터로의 항응고된 혈소판 풍부 혈장의 혈소판 부착.

본 단백질 (사라틴으로 명명됨) 은, 서열 (서열 번호 제 2 번) 에 표시된 아미노산 서열을 특징으로 하며, 약 12068 달톤 ±1 kDa 의 이론적 상대 분자량을 이루는 103 개의 아미노산으로 구성된다. 본 단백질은 이미 기술된 기타 서열과 유효한 유사성을 갖지 않는 독특한 일차 구조를 나타낸다. 본 단백질은 IEF-PAGE 로 측정된 pH 3.7 ±0.5 의, 본 분자의 낮은 등전점에 기여하는 아스파르트산 및 글루탐산이 풍부하다.

SDS-PAGE 분석에서, 전기영동 이전의 단백질 환원시, 번역후 변형을 시사하는 커다란 이동성 변위가 나타났다. 본 폴리펩티드의 서열분석에서, 단백질의 번역후 변형이 일어날 수 있는 6 개의 시스테인 분자가 나타났다. 사라틴의 전기분무 질량 분광측정 (Electrospray mass spectrometry) 에서, 3 개 이하의 디술피드 결합이 본 단백질 원형의 2 차 구조 형성에 관여함을 시사하는 12061 의 실제 분자량을 얻었다.

본 발명에 따른 부착 억제제는, 거머리에서 단리된 공지된 응집 억제제, 특히 칼린 또는 LAPP 와 분자량, 등전점 및 아미노산 서열과 생물학적 활성이 상이하므로 새로운 것이다.

또한 본 발명은, 본 단백질에서 나타난 아미노산 서열을 갖는 거머리 유래 혈소판 부착 억제제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단리된 DNA 를 제공한다. 상기 cDNA 클론이 표시하는 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 제 1 번에 나타낸다. 뉴클레오티드 서열의 위치 1-63 은 추정되는 21 개 아미노산의 리더 서열을 표시하고, 위치 64-372 에는 103 개 아미노산 잔기이고 서열 번호 제 2 번의 성숙 단백질에서 보이는 아미노산 서열인 폴리펩티드를 코딩하는 개방 해독틀 (open reading frame) 이 포함된다.

본 발명은 또한, 본 발명의 거머리 유래 혈소판 부착 억제제를 코딩하는 합성 유전자가 포함된 재조합 벡터와, 재조합 벡터가 함유된 숙주 세포에 관한 것이다. 발현된 단백질의 회수 및 단리 방법은 태그 (tag) 기법을 기초로 하거나, 천연 생성 사라틴을 위해 개발된 정제 공정을 변형하였다. 적합한 벡터로 형질전환된 효모 세포, 곤충 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 및 E. coli 세포에서 세포외 또는 세포내 발현에 사용되는 개별 프로토콜에 따라, 상청액 또는 침전물에서의 재조합 단백질 회수 단계를 전문가에서 공지된 기법으로 변형시켜야 한다. pelB 리더 서열을 삽입하여 세포질 발현시키는 E. coli 를 숙주로 하여, 뛰어난 발현이 관찰되었다. 대장균 (E. coli) 에서의 생성물 회수 (약 5 mg/ℓ) 는 삼투용해 및 원심분리로 수행되었다. 대안적인 효모용 벡터를 갖는 사카로미세스 세레비시애 (S. cerevisiae) (> 10 mg/배양 브로스ℓ) 를 유사한 실험에 사용하였다. 분비된 물질은 원심분리로 단리하였다. 크로스-플로우 (cross-flow) 여과 및 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. COS 세포 또는 CHO 세포를 이용한 다른 발현 접근법에서, 생성물 발현은 약 750 ng/ml 이었다. 정제된 재조합 물질은 전기 영동 및 크로마토그래피 분석으로 순수하고 균질함을, 아미노산 서열분석 및 분자량 측정에서 보여진 침 유래 사라틴과 동일함을 확인하였다.

또한 본 발명에는, 거머리의 미정제 침에서 활성 단백질을 정제하는 방법 과, 정역학적 및 동역학적 분석 방법에 의해 혈소판에 대한 그의 활성을 측정하는 방법뿐만 아니라, 재조합 단백질을 단리하기 위한 이러한 방법의 용도가 포함된다.

그러나, 사라틴의 제조 기법은 실시예 6, 7, 8 및 13 을 포함하지만, 사용될 발현 방법은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 유전자조작 마우스 또는 기타 포유류를 포함하는 기타 생명체를 또한 사라틴의 발현에 사용할 수 있다.

본 발명의 단백질에는, 활성을 보유하는 단편 또는 서브유닛, 천연 생성 변형물, 대립유전자의 변형물, 무작위로 생성된 인공 돌연변이 및 첨가와 같은 의도적 서열 변형물을 포함하는, 개시된 서열의 활성이 보존되는 변형물이 포함된다. 단편 또는 서브유닛이란, 예컨대 전체 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 부위가 제외된 부분적 서열과 같은, 전체 단백질보다 적은 수의 아미노산을 갖는 임의 서열 부위를 말한다.

더욱이 본 발명은, 융합 단백질 또는 발현 벡터 내 다중 유전자의 발현으로 생성된 단백질과 같은 하이브리드 단백질을 포함하며, 펩티드 결합으로 다른 폴리펩티드에 연결된, 개시된 단백질의 특이적 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 명백하게, 본 발명의 단백질의 기타 변형물, 특히 단리된 단백질과 보존성 아미노산의 치환만이 다른 임의 변형물이 포함된다. 상기 보존성 아미노산 치환은 문헌 [Taylor et al., J. Mol. Biol., 1986, 188, 233] 에 정의되어 있다.

또한, 콜라겐-혈소판 상호작용을 억제함으로써 혈소판 활성화를 방지하거나 지연시키기 위한 단백질의 사용 방법이 포함된다. 본 단백질은 혈전성 질환의 방지, 예방, 치료 및 처치에 유용하다. 혈소판 상의 다양한 표면 단백질에 작용하는 상기 기재된 이러한 모든 단백질들과는 다르게, 본 발명의 단백질은 독특한 작용 기작을 갖는다. 이것은 콜라겐 표면에 강력하게 결합하며, 특정 콜라겐 측면을 덮어서 혈소판의 상호작용 및 결합이 더 이상 가능하지 못하게 하는 것이 작용 기작의 하나로 주어진다. 이런 유형의 새로운 기작은, 단백질의 적용 중에 혈소판이 기능적으로 손상없이 유지되므로, 상기 처치에서 예상되는 출혈 경향이 매우 낮거나 심지어 전혀 없다는 점에서 매우 유리하다.

또다른 중요 이용 분야는 다양한 표면을 본 단백질로 처리하여, 이들을 혈소판 비부착성으로 만들어서, 혈액 적합성 장치를 제조할 수 있다는 것이다.

상기 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 약학적 조성물 및 배합물 중에 약학적으로 유효한 화합물로서 적합하다.

본 발명에 따른 약학적 제제는 아스피린, 항응고제 예컨대 히루딘 또는 헤파린, 또는 혈전용해제 예컨대 플라스미노겐 활성제 또는 스트렙토키나아제와 같은 추가 활성 성분을 임의 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 신규 폴리펩티드는 임의의 무독성, 유기산 또는 무기산과 함께 약학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 예를 들어, 무기산에는 염산, 브롬화수소산, 황산 또는 인산과, 소듐 모노히드로겐 오르토포스페이트 및 포타슘 히드로겐 술페이트와 같은 산 금속염이 있다. 유기산의 예에는 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 히드록시말레산, 벤조산, 히드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산 및 술폰산 예컨대 메탄 술폰산과 같은 모노, 디 및 트리 카르복실산이 있다. 카르복시 말단 아미노산 모이어티의 염에는 임의의 적합한 무기 또는 유기 염기로 형성되는 무독성 카르복실산염이 포함된다. 예를 들어, 이들 염에는 소듐 및 포타슘과 같은 알칼리 금속, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속, 알루미늄을 포함하는 IIIA 족의 경금속 및 유기 1 차, 2 차 및 3 차 아민 예컨대 트리에틸아민을 포함하는 트리알킬아민, 프로카인, 디벤질아민, 1-에텐아민, N,N'-디벤질에틸렌-디아민, 디히드로아비에틸아민 및 N-알킬피페리딘이 포함된다.

본원에서 사용되는, "약학적으로 허용가능한 담체" 라는 용어는 활성 화합물 또는 환자에게 역으로 작용하지 않는 불활성, 무독성 고체 또는 액체 충진제, 희석제 또는 캡슐화제 물질을 뜻한다. 멸균수, 식염수, 수성 덱스트로오스, 설탕 용액, 에탄올, 글리콜, 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 유래의 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유 및 미네랄유를 포함하는 오일과 같은 적합하고, 바람직하게는 액체인 담체가 당 분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명에 따른 제제는 비경구 투여에 전형적인, 통상적인 무독성의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 보조제 및 매개체가 함유된 단위 용량으로 투여될 수 있다.

본원에서 "비경구" 라는 용어에는 피하, 정맥내, 동맥내 및 기관내 주사 및 주입 기법이 포함된다. 또한, 경구 투여 및 국소 적용과 같은 기타 투여도 적합하다. 비경구 조성물 및 배합물은 가장 바람직하게는 공지된 방법에 따른 볼루스 형태 또는 지속 주입으로 정맥내 투여된다.

경구 투여용 정제 및 캡슐은 결합제, 충진제, 희석제, 정제화제, 윤활제, 붕해제 및 습윤제와 같은 통상적인 부형제를 함유한다. 정제는 당 분야에 널리 공지된 방법에 따라 코팅될 수 있다.

경구 액체 제제는 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽 또는 일릭서의 형태일 수 있고, 또는 사용 전에 물 또는 또다른 적합한 매개체로 복원하기 위한 건조 제품으로 제시될 수도 있다. 상기 액체 제제는 현탁화제, 에멀젼화제, 비수성 매개체 및 방부제와 같은 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다.

국소 적용물은 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 젤리 또는 바람직하게는 에멀젼 연고의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 단위 용량에는 본 발명에 따른 단백질의 1 일 필요량, 또는 목적한 용량을 채우기 위한 그의 약수배량이 함유될 수 있다. 주어진 환자 (인간을 포함하는 포유류) 를 위한 치료적으로 허용가능한 최적 용량 및 용량률은 사용하는 특정 활성 물질의 활성, 연령, 체중, 일반 건강, 성별, 식사, 투여 시간 및 경로, 제거율, 처리 목적, 즉, 치료 또는 예방, 및 처리할 혈전성 질환의 성질, 항혈소판 또는 항응고 활성과 같은 다양한 요인에 좌우된다.

따라서, 처리되는 환자에게 (생체 내) 항혈전제로 유용한 조성물 및 배합물에서, 본 발명의 펩티드의 약학적 유효 1 일 용량은 약 0.01 내지 100 mg/체중kg, 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/체중kg 이다. 적용 형태에 따라, 1 개의 단일 용량은 트롬빈 억제제 0.5 내지 10 mg 을 함유할 수 있다. 체외 혈액에서 항응고 효과를 얻기 위한, 본 발명의 펩티드의 약학적 유효량은 0.2 내지 150 mg/체외 혈액ℓ, 바람직하게는 1 mg 내지 20 mg/체외 혈액ℓ 이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 및 청구항에서 정의되는 고정된 폴리펩티드로 코팅되어 장치 표면이 실질적으로 혈전저항성이 되는, 체액과 접촉하여 사용하기 위한 이식가능 또는 체외 의료 장치를 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 의료 장치 상에 고정되어, 표면을 생체적합성 및 혈전저항성으로 만든다. 때때로 상기 장치는 혈소판 응집을 전형적으로 유도하는 표면 특성을 가지며, 이는 혈액 또는 기타 체액과 접촉되는 이식가능 및 체외 장치의 목적한 용도에 불리하다. 보통 플라스틱재 및 합성 섬유로 제조되는 상기 장치의 예에는 프로테스 (prothese), 인공 장기, 각막 렌즈, 봉합사, 인공 혈관 분절, 카테터, 투석기, 혈액 운반 관 및 용기가 있다.

후방 피막 혼탁 (PCO: Posterior capsule opacification) 은 백내장 적출술 이후에, 이 과정에서 사용되는 현대 수술 기술 및 렌즈에도 불구하고 흔하게 나타나는 합병증이다. PCO 는 후방 피막을 통한 수정체 표피 세포의 증식 및 이동에 의해 일어나서 시력을 감소시킨다. PCO 발생을 감소시키기 위해, 화학적으로 변형된 렌즈뿐만 아니라 물리적 처치도 제시되고 있다. 헤파린 렌즈 코팅 또는 국소 헤파린 점안액이 PCO 를 감소시키기 위해 사용되고 있으며, 이는 PCO 발생에 혈전성 기작이 관여함을 시사한다.

사라틴은 헤파린에 비해 혈전형성의 방지 및 차단에 있서 상당한 이점을 가지고 있는 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명의 또다른 특징은, 수술적으로 눈에 이식될 수 있는 굴절성 전방 또는 후방 안구 이식물에 사용되는 렌즈 재료에, 혈전형성능을 감소시키는 사라틴 함유 코팅물을 제공하는 것이다. 이러한 새로운 유형의 코팅물에서는, 세포 성장의 촉진에 의해 일어나는 문제가 배제된다. 예를 들어, 세포 사멸을 부여하는 기타 약제와 병용되어, 사라틴 코팅물은 후방 피막 혼탁을 완전히 극복할 수 있게 한다.

실시예 1

부착 억제제 탐색

콜라겐으로의 혈소판 부착이 침 성분의 탐색을 위한 기능적 배경이었다. 또한, AZOCOLL 분석, 아미다아제 활성 분석, v빌레브란트 의존적 결합 분석 및 혈소판 응집 분석과 같은, 항혈전 약물의 다양한 작용 평가를 위해 가능한 4 개의 추가 시험을 사용하여, 부착 억제제에 이상적으로 연관되지 않을 기능적 특성을 배제하였다. 여기 사용된 이들 분석의 대부분이 표준 분석이지만, 혈소판 응집 분석은 우리의 특정 요구를 만족시키기 위해 변형해야 했다. 간단하게: 20 ㎍/ml 농도의 산성화된 콜라겐을 이용하여 플레이트에서 밤새 반응시켜서, Horm 콜라겐 (Nycomed) 을 96 웰 플레이트 (Nunc) 에 코팅하였다. 플레이트를 PBS 로 3 번 세척한 후, 웰의 나머지 표면을 1% BSA 로 차단하였다. 시트로닐화 인간혈에서 방금 단리된 혈소판을 각각의 칼럼 단계에서 얻은 분획들과 동시에 첨가하였다. 필요한 경우, 사용 전에 혈소판을 2 가 마그네슘 이온의 존재 하에서 TBS 에서 배양하여,혈소판을 전활성화시켰다. 총 단백질 농도를 200 ㎍/ml 로 표준화한 미정제 침을, 억제제 활성 비교를 위한 기준으로 사용하였다. 혈소판 억제 분석은 완충용액 변화 및 증가된 염 농도에도 크게 민감한 것으로 나타났다. 모든 표본들이 이온 교환 크로마토그래피로 처리되었으므로, 억제 분석에서 분획들을 직접 시험하는 것은 복잡하고 신뢰도가 낮게 나타났다. 따라서, 시험될 모든 표본들을 측정 전에, 동시에 이온 강도를 감소시키고 농축시키는 센트리콘 (Centricon) 기재 농축 단계에 적용하였다.

실시예 2

천연 억제제의 정제

본 발명은, 히루딘, 엘라스타아제 억제제, 콜라게나아제 및 혈소판 응집 억제제 예컨대 칼린 (Munro, R. et al.; Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2, 179-184) 및 LAPP (Schaffer, L.W. et al.; Arterioscler. Thromb., 1993, 13, 1593-1601) 와 같은 여러 생활성 단백질을 함유하는 것으로 알려진히루도 메디시날리스에서 수합된 침을 사용하였다. 이러한 밝혀진 단백질들 이외에도, SDS-PAGE 로 검출가능한 대략 80 개의 단백질 대다수가 여전히 알려지지 않고 있다. 본 발명에서는, 실시예 1 에 기재된 바와 같은 분획화된 침 및 탐색 전략을 이용하여, 혈소판 콜라겐 상호작용을 직접적으로 방해하는 신규한 단백질을 탐색하였다.

주로, 첫번째 크로마토그래피 단계에서의 부착 억제 활성 대부분의 비가역적 손실 때문에, 미정제 침에서의 부착 억제제 활성의 분리가 결정적인 작업으로 나타났다. Munro. R. et al. 이 추천한 12% 에탄올 및 2 가 양이온과 같은 첨가제는상황을 개선시키지 못했다. 그러나, 낮은 전체 단백질 농도 (190-250 ㎍/ml) 과 더불어, 침의 높은 염 농도는 초기 농축 또는 완충용액 교환 단계를 필요로 하였다. 따라서 강화, 농축 또는 완충용액 교환을 위한 몇몇 전략들을 조사하였다. 통상적 투석은 활성의 완전 손실을 일으켰다. 이온 교환물, 친화 칼럼, 크기별 제거와 같은 기타 표준 기법의 대부분이, 분리 기술의 성질 또는 사용하는 완충용액 및 첨가제에 무관하게 실패하였다 (손실은 칼럼 수지와 무관하였다). 놀랍게도, 500 ml 침의 가압 투석이 침 단백질을 농축 (약 30-40 배) 하고 원치 않는 완충용액 성분을 동시에 제거하는데 성공적인 방법으로 나타났다. 예상과 달리, 이러한 방식으로 조작된 침 미정제 물질은 차후 정제를 위해 이상적인 출발 물질이었으며, 침에서의 생활성 항부착 성분의 회수는 더이상 실제 문제가 되지 않았다. 양이온성 교환물 또는 친화 칼럼이 정제에 불충분한 단계로 드러났으므로, DEAE-Fastflow 또는 EMD-DEAE-Fractogel 과 같은 약한 음이온성 교환물을 사용하였다. 12% 에탄올 및 2 가 양이온을 시험해보았으나, 이들 첨가제가 있든 없든 결과는 비슷하였다. 크로마토그래피 단계의 추가 최적화로, DEAE-칼럼, Mono Q-칼럼 및 최종 단계로 역상 RP18 칼럼의 순서를 얻었다. 크로마토그래피 조건의 최적화는 파마시아에서 시판되는 분석 칼럼을 이용하여, BiaCore 크로마토그래피 시스템 상에서 수행하였다. DEAE-칼럼, Mono Q-칼럼 및 RP18 칼럼의 수행에 사용된 농도구배는 도 1a, b, c 에 주어진다. BiaCore 에 기초한 분리를 FPLC 기법을 이용하여 대규모화시켰다. 최적화된 수행 조건을, Biacore 기법에서 유지되는 RP18 칼럼 단계를 제외하고는 제조자의 지시에 따라 반제조 규모의 분리로 직접 변환시켜서 정제 물질의 손실을 최소화하였다. 최종 크로마토그래피 RP-단계로부터의 정제 단백질의 회수는 스피드 진공 원심분리로 수행하였다. 최종 RP-단계에서 수합된 표본들을 수합하여, SDS-PAGE 로 분석하였다 (도 2). 이어서, 표본들을 PBS 중에 현탁시키고, 분석 및 기능 시험을 수행하는데 사용하였다. 전형적으로 약 750 ㎍/ℓ인 수율의 사라틴을 미처리된 침에서 회수하였다.

실시예 3

생화학적 특징분석

실시예 1 에 개시된 바와 같은 사라틴의 정제로, SDS-PAGE 에서 환원 조건 하에 약 21 kDa 의 뚜렷한 분자량을 갖는 본질적으로 순수한 단백질을 얻었다 (도 2). 전체 아미노산 서열은 정제된 단백질의 최초 48 개 아미노산을 직접 서열분석하여 얻고 효소 분해로 얻어진 몇몇 내부 펩티드를 서열분석하여 완료하였다. 전체 단백질 서열을 서열 번호 제 2 번에 개시한다.

본 단백질은 계산된 분자량이 12067.9 이고 ESI-질량 분광계로 얻은 실제 분자량이 12061.9 인, 103 개 아미노산으로 구성된다. 이론적 및 측정 분자량 간의 이러한 차이는, 사라틴에서 확인된 6 개의 모든 시스테인이 S-S 가교 형성에 관여함을 시사한다. 이 발견은, 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 로 크로마토그래피하는 경우, 단백질 이동성의 커다란 변화 관측에 의해서도 지지된다. 나아가, 단백질은 Glu 및 Asp 와 같은 산성 산이 풍부하다. IEF-PAGE (Immobiline) 기법을 이용한 등전점 초점정합에서, pH 3.7 ±0.5 의 등전점을 확인하였다. 비교 실험에서는 대조군으로 정제된 거머리 단백질을 사용하여, 이를 바큘로, 효모 및E. coli 발현에서 얻은 재조합 사라틴의 물리화학적 특성과 비교하였다. 모든 3 개 단백질은 그 특성이 동일한 것으로 나타났다. 코마시 (Coomassie) (도 2) 또는 은 염색 및/또는 웨스턴 블롯 분석으로 시각화시킨 SDS-PAGE 에 의한 단백질 특징분석에서, 상기 단백질은 균일하고, 당쇄화되지 않은 형태임이 드러났다.

실시예 4

mRNA 제조 및 cDNA 합성

구아니디늄 티오시아네이트 방법을 이용하여, 의약 거머리,히루도 메디시날리스로부터 RNA 를 제조하였다. "Oligotex mRNA 키트" (QIAGEN) 를 이용하여, 전체 RNA 로부터 mRNA 를 정제하였다.

"Marathon cDNA amplification kit" (CLONTECH) 를 이용하여 cDNA 를 합성하였다. 사라틴을 코딩하는 DNA 서열을, 공급자의 지시에 따라 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 초기 증폭시켰다. cDNA 합성 후, cDNA 의 양쪽 말단에 공통 어댑터를 결찰시켰다. 상기 키트 공급자의 지시에 따라, 공통 어댑터 및 공통 프라이머 AP1 또는 AP2 의 서열을 선별하였다.

실시예 5

PCR 에 의한 사라틴 유전자의 증폭 및 단리

변성 (degenerate) 프라이머를 역번역된 사라틴 아미노산 서열의 N-말단 옆을 기준으로 합성하였다.

이들 프라이머01 및 프라이머02 는 사라틴 cDNA 의 5'-말단에 특이적으로 보합화되도록 설계되었다. 프라이머 설계는 정제된 사라틴 단백질에서 실험적으로결정된 8 개의 N-말단 아미노산의 역번역된 아미노산 서열을 기준으로 하였다. 2 개의 프라이머, 프라이머01 및 프라이머02 는, 변성도 (degeneracy) 를 가능한 낮게 하고, 프라이머의 결정적인 3'-말단이 사라틴 cDNA 서열과 완전히 상동성인 8 개 염기쌍 길이를 가져서 주형 cDNA 의 효율적이고 특이적인 증폭을 확실케 하도록 합성되었다. DNA 변성 알파벳 (IUPAC 코드) 에 따라, R = A 또는 G; M = A 또는 C; Y = C 또는 T; 및 N = A 또는 G 또는 C 또는 T 이다.

프라이머01 및 프라이머02 와, AP1 또는 AP2 중 하나의 공통 프라이머의 혼합물을 이용하여, 3'-RACE PCR 반응을 수행하였다. PCR 산물을 TA 클로닝 벡터 pCR2.1 또는 pCR Script SK(+) 벡터로 클로닝하여 서열분석하였다. 수득한 몇몇의 3'-RACE PCR 단편을 서열분석한 후, 5'-미번역 부위, 신호 펩티드 서열 및 성숙 단백질의 N-말단의 최초 8 개 아미노산을 코딩하는 서열을 제외한 사라틴 유전자 서열을 얻었다. 상기 결여된 사라틴 cDNA 서열 정보를 얻기 위해, 사라틴 cDNA 의 중간의 유전자 특이적 프라이머와 AP1 또는 AP2 중 하나의 공통 프라이머를 이용하여, 5'-RACE PCR 반응을 수행하였다. 생성된 여러 5'-RACE PCR 단편을 서열분석한 후, 전체 사라틴 유전자 서열을 얻었다. 사라틴 유전자의 3'-말단과 5'-말단 모두에 대한 유전자 특이적, 비변이성 프라이머를 이용한 PCR 로 사라틴 유전자를 증폭하여, 전체 길이의 사라틴 유전자를 얻었다.

15 개 초과의 상이한 PCR 클론으로 DNA 서열분석을 수행하였다. 그러나, 단 하나의 클론에서만 아미노산 서열 변화를 일으키는 하나의 중요한 변화가 관찰되었다. 이 변화는 PCR 에 의해 일어났을 가능성이 높다. 아미노산 서열 변화를 일으키지 않는 또다른 5 개의 무증상 (silent) 변화도 관찰되었다. 상이한 클론에서 동일한 변화가 관찰되었으므로, 이들 변화는 PCR 에 의해 일어난 것이 아닐 가능성이 있다.

사라틴 유전자 ORF 는 372 bp 이고, 21 개 아미노산 신호 서열과, 성숙 단백질을 코딩하는 103 개 아미노산 서열을 포함한다. PCR 클론에서 추정된 아미노산 서열은 천연 침 유래 단백질의 서열분석에서 얻어진 서열과 동일한 것으로 나타났다.

실시예 6

COS 세포에서의 발현 및 발현 단백질의 검출

COS 또는 CHO 와 같은 포유류 세포에서 사라틴 유전자를 발현시키기 위해, XhoI+XbaI 을 사용하여 pCR Script SK(+) 벡터로부터 사라틴 유전자를 잘라내고, 포유류 세포 발현 벡터 pCI-neo (Promega) 내로 클로닝하였다. pCI-neo 는 시험관 내 발현을 위한 T7 및 T3 프로모터 및, G418 선별을 위한 네오마이신 내성 유전자를 포함하고, COS 및 CHO 세포 둘 다에서 사용할 수 있으므로 선별되었다.

신호 서열 및 성숙 단백질 서열에 덧붙여, 삽입 서열에는 효율적인 번역을 위한 5' 말단의 Koz 서열 및 단백질 발현 검출, 정제 및 농축을 위한 3' 말단 (C-말단)의 his-태그 MRGS(H)₆가 포함된다. 플라스미드 구축물을 pNC-31 이라고 명명하였다.

pNC-31 플라스미드 DNA 를 사용하여 COS 세포를 트랜스펙션시켰다. 로그 상에서 자라고 있는 COS 세포를 PBS 로 2 번 세척하고, 1 ×10⁷/ml 농도로 PBS 중에 현탁시켰다. 이어서, 12㎍ 의 플라스미드 DNA (H₂O 또는 TE 완충용액 중에 50㎕ 미만임) 를 0.7-0.8 ml COS 세포 현탁액에 첨가하고, 일렉트로포레이션 큐벳에서 혼합하였다. 1.9 kv, 25μFD 에서 10 분 동안 일렉트로포레이션을 수행하여, 90mm 플레이트로 옮겼다. 10% FCS 및 항생제를 함유하는 DMEM 매질 8 ml 을 첨가한 후, 세포를 3 일 동안 배양하였다. 상청액 및 세포를 사용하여, 단백질을 보다 단리 및 검출하였다. 발현된 단백질은 항-MRGS(H)6 항체를 이용한 웨스턴 블롯 방법으로 검출하였다. 칼럼 매트릭스 상에 고정되고 Co, Ni 또는 Cu 와 같은 금속 이온으로 변형된 이미도 아세트산 또는 NTA 와 같은 킬레이터를 이용하여 정제를 수행하였다.

실시예 7

E. coli발현 벡터의 구축 및 발현

상이한 생물학적 시스템에서의 다양한 코돈 사용으로 인해, 일부 코돈은E. coli에서 거의 사용되지 않는다.E. coli에서의 최적화된 형식으로 발현시키기 위해, 유전자를 표준 방법에 따라E. coli코돈을 사용하도록 전환시켜야 한다.

tet 프로모터 부위를 갖는 플라스미드 pASK75 의 변형된 별형을 이용하여,E. coli에서 발현을 수행하였다 (Skerra, A., et al., Gene, 1994, 151, 131 - 135). 간단하게: XbaI 및 HindIII 위치 사이에 새로운 링커 (linker) 를 클로닝하여 변형시켰다 (도 3). 새로운 링커에는 ompA 리더 서열, 또다른 다중 클로닝위치 및 스트렙-태그 대신 6 ×His-태그가 포함된다.

사라틴용 발현 벡터를 구축하기 위해, 5' ClaI 및 3' Eco47III 제한위치를 PCR 방법으로 도입해야 했다.

따라서, 5'-프라이머03 및 3'프라이머04 를 사용하였다. 첫번째 PCR 산물을 PCR II 벡터 시스템 (Invitrogen) 에 클로닝하고, 서열분석하였다.

두번째 단계에서, 사라틴 유전자를 5' ClaI 및 3' HindIII 제한위치를 이용하여, 변형된 pASK75 벡터 내로 클로닝하였다.

두번째 PCR 반응에서, 상기 재조합 사라틴의 발현 및 활성을 증명한 후, His-태그를 제거하고 사라틴 유전자의 개시 코돈을 omp A 리더 서열과 직접 융합시켰다. 상기 PCR 반응을 위한 5'-프라이머05 및 3'-프라이머06 을 서열 리스트에 나타낸다.

E. coli에서의 발현예로서, ompA 리더 서열에 융합된 사라틴의 구조 유전자를 포함하는 발현 벡터 pRG72 (도 3) 을, W3110 수용성 (competent) 세포 내로 형질전환시켰다. 세포가 로그 상 중간으로 자란 후, 발현유도하였다. 그 1 시간 후, 재조합 사라스타틴을 뚜렷이 검출할 수 있었다.

실시예 8

바큘로 공여 플라스미드의 구축 및 발현

바큘로 바이러스 발현 시스템에서의 사라틴 발현을 위해, Gibco Life Technologies 사의 Bac-To-Bac^TM바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하였다. 선별시스템을 얻기 위해, 꿀벌 멜리틴 리더 서열을 사라틴 유전자에 융합시키고, 5'BamHI 및 3'KpnI 제한위치를 도입하기 위해, 5'-프라이머07 및 3'-프라이머08 을 이용하여 한번의 단일 PCR 반응을 수행하였다. 해당 PCR 산물을 PCR II 벡터 (Invitrogen) 로 클로닝하고 서열분석하였다. 이어서, 멜리틴-사라틴 융합물을 5'BamHI 및 3'KpnI 제한 위치를 이용하여 pFastBac 벡터로 클로닝하여, pTD13 을 얻었다 (도 4). 재조합 바큘로바이러스의 생성 및 사라틴 발현을 Bac-To-Bac 발현 시스템으로 수행하였다. 공여 플라스미드 pTD13 을, mini-attTn7 표적 위치를 갖는 백미드 (bacmid) 및 헬퍼 플라스미드를 함유하는 DH10Bac 수용성 세포 내로 형질전환시켰다. 공여 플라스미드 상의 mini-Tn7 요소는, 헬퍼 플라스미드가 제공하는 전위 단백질의 존재 하에서, 백미드 상의 mini-attTn7 표적 위치로 전위할 수 있다. 재조합 백미드를 포함하는 콜로니들을lacZ유전자를 붕괴시켜 동정하였다. 고분자량 mini-prep DNA 를 재조합 백미드를 포함하는 선별된E. coli클론으로부터 제조한 후, 상기 DNA 를 곤충 세포로 트랜스펙션시켰다. 상세한 설명은 발현 키트의 제조 매뉴얼에 포함되어 있다.

실시예 9

유동 조건 하에서 콜라겐으로의 혈소판 부착 (동역학적 분석)

혈소판 부착 분석에서, Sakariassen et al. 이 문헌 [Meth. Enz., 1988, 169, 37 - 70] 에 본래 기재한 바와 같이, 평형 유동 챔버를 통해 전혈을 관류시켜, 강한 전단흐름 하에서 (생체 내 동맥 조건의 의태) 콜라겐으로 코팅된 커버슬립으로의 혈소판 부착 활성을 조사한다. 50 mmol/L 아세트산 중에 가용화된 인간태반 콜라겐 III 유형 (Sigma) 을 수정 에어브러쉬로 깨끗한 유리 커버슬립 (18 mm ×18 mm) 상에 분무하였다. 커버슬립을 4℃ PBS 중에 밤새 보관하였다.

신선한 인간 전혈 (저분자량 헤파린 (20 U/ml) 으로 항응고화됨) 을 사용하기 10 분 전에 37℃ 로 예열하였다. 본 발명에 따른 단백질 제조물을 커버슬립 상에 피펫팅하고 (커버슬립 당 30㎕), 관류 챔버에 삽입하기 전에, 실온의 고습 챔버에서 10 분 동안 반응시켰다. 혈액을 챔버를 통해 관류시켰다 (1300s^-1의 전단율로, 37℃ 에서 5 분 동안).

이어서, 커버슬립을 제거하고, PBS 로 세척하고, 0.25% 글루테르알데히드로 30 분 동안 고정시킨 후, 메이-그륀발트 김자 (May-Gruenwald Giemsa) 로 염색하였다. 도 9 는 전형적인 예를 보여준다. 비처리 대조군 표면에서는, 염색된 혈소판으로 과도하게 덮인 것이 보인다. 사라틴으로 전처리된 비교 표면에서는 현저히 감소된 (80% 가량) 혈소판 결합을 나타낸다. 혈소판 부착을 컴퓨터화된 이미지 분석계 (Leica) 가 커플링된 도 5 에 나타낸 바와 같은 광 현미경 (확대 ×1000) 으로 정량화하였다. 결과를 혈소판 및 혈소판 응집물로 덮인 표면의 퍼센트로 나타내었다.

도 6 에 나타낸 바와 같이, 침 억제 활성의 비교를 정제 단백질에 대해 비교하였다. 미정제 침 (#616) 은, 1300 s-1 의 전단율에서 콜라겐 III 유형으로 코팅된 커버슬립으로의 혈소판 부착을 대조군에 비해 약 48% 억제하였다. 정제 단백질 (#607; 사라틴) 은 표준화된 단백질 농도에서 약 81% 의 혈소판 부착 감소를 나타내었다. 도 7 에 나타낸 바와 같이, 정제 단백질의 농도가 높을수록, 사라틴에 의한 억제는 용량 의존적 방식으로 증가하였다.

실시예 10

면역화 및 항체

사용가능한 고정제 천연 단백질의 1 차 로트로, 즉시 동물의 면역화를 개시하였다. 토끼에서 면역 혈청을 만들어, 추가적인 탐색을 위한 고역가 시약을 얻었다. 전체 단백질의 펩티드 서열이 얻어졌을 때, 표준 링커 방법으로 KLH 에 커플링된 3 개의 합성 펩티드를 합성하여 (아미노산 서열 83-103, 13-30, 58-69) 면역화에 사용하고, 추가 항혈청을 얻었다. N-말단 펩티드 절편에 대한 3 개의 혈청과, C-말단 펩티드에 특이적인 2 개의 혈청을 구축하였다. 사용가능한 고역가 면역 혈청으로, Elisa 기술을 구축 및 이용하여, 재조합 단백질뿐만 아니라 천연 정제된 단백질을 모니터 및 정량할 수 있었다. 따라서, 시간 소모적이고 비교적 노동 집약적인 혈소판 억제 분석을 대체할 수 있었고, 최종적으로 정제된 단백질의 억제 가능성을 확인하기 위해서만 사용하였다.

실시예 11

사라틴 결합의 산정을 위한 면역분석

산성화된 Horm 콜라겐 (Nycomed) 를 사용하여 96 웰 마이크로타이터 플레이트 (Nunc) 를 코팅하였다. 콜라겐 용액 (20 ㎍/ml) 50 ㎕ 를 사용하여 플레이트를 밤새 코팅하였다. 시험 전에, 플레이트를 PBS 로 3 번 세척하고, BSA 용액 (1%) 과 함께 반응시켜 비특이적인 부착을 방지하였다. 순차적으로 희석된 사라틴 50㎕ 를 첨가하고, 1 시간 동안 반응시켰다. 검출용 항사라틴 항체를 적용하기 전에, 플레이트를 3 번 세척하였다. 항체와 함께 1 시간 더 반응시킨 뒤 제거하고, 검출용 2 차 바이오틴-표지된 항체를 사용하였다. ODB-정제 (Dako) 와 같은 기질로 스트렙토아비딘-POD 촉매된 발색 반응을 수행하여, 490 nm 에서 측정하였다.

실시예 12

억제제 탐색을 위한 경쟁 분석

실시예 7 에 기재된 바와 같이 제조된 태깅된 재조합 사라틴 (His-태그) 과 태그되지 않은 천연 사라틴을 콜라겐 결합에 대해 비교하였다. 산성화된 Horm-콜라겐 (Nycomed) 으로 코팅된 플레이트를 실시예 11 에 기재된 바와 같이 제조하였다. 토끼 항사라틴 항체로 검출을 수행하였다. 태그된 사라틴 및 태그되지 않은 사라틴은 동일한 결합 특성을 보였다. 이와는 달리, 태그되지 않은 사라틴 별형을 바이오틴화로 변형시켜 (Pierce, 바이오틴화 키트) 미변형 사라틴과 비교하였다. 콜라겐에 대한 결합 특성은 동일하였다. 바이오틴화된 사라틴을 이용하여, 미변형 사라틴, 펩티드, 침 유래 사라틴, 전체 침 또는 사라틴에 대한 항체와 교차 경쟁시키는 실험을 더 수행하였다. 스트렙타비딘-POD 연합물 및 검출용 ODB-기질 반응을 이용하여 바이오틴화된 사라틴의 결합을 산정함으로써, 다양한 "경쟁자" 들의 콜라겐으로의 결합을 시험하였다. 바이오틴화된 사라틴을 함유하는 이러한 분석을 침 중 사라틴의 농도 산정 (750㎍/ℓ), 사라틴에 대한 항체의 에피토프 맵핑 (epitope mapping), 생활성 사라틴, 돌연변이된 사라틴의 검정에 전형적으로 사용하였다. 분석의 능력을 확인하기 위해, 특정 사라틴 펩티드에 대한 차단 및 비차단 항사라틴 항체를 사용하였다.

실시예 13

효모 발현 벡터 및 발현

효모 발현의 전형적인 예로서, 피치아 (pichia) 다중카피 발현 시스템 (Invitrogen) 을 사용하였다. 효모 발현 벡터의 구축물을 도 8 에 나타낸다. 사라틴용 발현 벡터를 생성하기 위해, PCR 증폭 방법을 사용하여 적절한 벡터 (pPIC9K) 내로 결찰할 수 있는 제한 말단 (5' EcoR I, 3'Not I) 을 생성하였다. 하기 5'-프라이머09 및 3'-프라이머10.

피치아 (Pichia) 스페로플라스트 (spheroplast) 를 형질전환시키기 전에, 발현 벡터를 Sal I 으로 선형화시켰다. His⁺Mut⁺-양성 돌연변이에 대한 콜로니를 탐색하여, 사라틴 유전자의 삽입을 확인하였다. 전형적인 배양 조건은 하기와 같다: 28-30℃, 광학 밀도 OD 2-6 이하. 원심분리된 세포를 매질 중에 재현탁시키고, 최종 농도 0.5% 이하로 메탄올을 첨가하여 발현을 유도한 후, 보통 24 시간인 연장된 기간 동안 상기 조건을 유지하였다. 6 일 동안의 통상적인 발효 기간 후, 상청액으로부터 산물을 회수하여 SDS-PAGE 및 ELISA 로 분석하였다.

Claims

콜라겐 의존적 혈소판 부착 억제제의 생물학적 활성을 갖고 약 12,000 ±1 kD 의 분자량을 갖는,히루도 메디시날리스 (H. medicinalis)에서 단리된 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서, pH 3.7 ±0.5 의 등전점을 갖는 폴리펩티드.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, -S-S- 가교를 형성할 수 있는 6 개의 시스테인 분자를 갖는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서, 서열 번호 제 1 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
그 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 제 1 번의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한, 제 4 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 제 2 번의 DNA 서열 또는 상기 DNA 서열에 상보적인 DNA 서열을 포함하며, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제 7 항에 있어서, 그 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 제 1 번과 80% 이상 동일한 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
제 9 항에 따른 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포.
제 10 항에 따른 숙주 세포를 함유하는 발현 시스템.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 제조에 충분한 조건 하에서 제 10 항에 따른 숙주를 배양하고, 배양 상청액 또는 세포 잔여물로부터 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 면역특이적인 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 이를 위한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 혈전색전성 과정의 처치를 위한 약학 활성제.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 아스피린, 헤파린 또는 스트렙토키나아제 또는 그의 배합물로부터 선택되는 추가 약물을 함유하는 약학적 조성물.
혈전색전성 질환 처치용 의약의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
인공 표면의 코팅을 위한 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
렌즈 물질의 혈전생성능을 감소시키도록 안구내 렌즈를 변형시키기 위한, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
렌즈 표면의 접촉을 위한 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
상기 렌즈 물질을 공유 가교화시켜 변형하기 위한, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
제 12 항으로부터 유래되거나 처리 대상으로부터 유래된 표본의 측정을 위한 제 13 항에 따른 항체 및 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
결합, 또는 기능적 응답의 촉진 또는 억제를 관찰함으로써 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 억제(길항)하거나 작동시키는 화합물을 동정하는 방법.
제 23 항에 따른 방법에 의해 동정되는 작동제.
제 23 항에 따른 방법에 의해 동정되는 길항제.