KR20020008157A - 라벨-표지 표적을 검출하기 위한 단일층 및 전극과 그것의사용방법 - Google Patents
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Abstract
결합쌍 멤버들 간의 상호작용을 검출하기 위한, 비전도성 자가-회합 단일층의 형성에 의해 변형된 전극 및 그러한 전극을 이용하여 핵산 혹은 수용체, 리간드, 항원 혹은 항체를 포함한 다른 표적과 같은 생분자를 검출하는 방법. 표적 핵산과 접촉 시, 상기 자가-회합된 단일층에 결합된 올리고뉴클레오티드 프로브는 상기 표적 핵산과 반응하여 상기 변형된 전극 표면상에 혼성화된 핵산을 형성한다. 상기 혼성화된 핵산을 산화-환원 반응에서 상기 혼성화된 핵산에서의 기선택된 염기를 산화시킬 수 있는 전이금속 복합체와 반응시키고, 상기 산화-환원 반응을 검출하고, 그리고 상기 핵산의 존재 여부를 상기 검출된 산화-환원 반응으로부터 결정한다.
Description
관련 기술의 설명
본 발명은 결합쌍 멤버간의 상호작용을 검출하기 위한 비전도성 자기 중합 단일층의 형성에 의해 변형된 전극 및 그러한 전극을 사용하여 핵산 또는 수용체, 리간드, 항원 혹은 항체를 포함하는 다른 표적을 검출하는 방법에 관한 것이다.
고체 표면에서의 핵산 혼성화의 검출은 임상 표본에서의 전염성 생물의 동정(Spargo, C.A. 등, 1993, Molecular and Cellular Probes 7, 395-404; Martin, W.J., 1994, Infectious Disease, In The Polymerase Chain Reaction(K.B. Mullis, F. Ferre and R.A. Gibbs, eds), pp. 406-417, Berkhauser, Boston), 유전자 발현 분석을 위한 mRNA의 정량(Schena, M., 1995, Science 270, 467-470), 및 고밀도 "칩" 어레이 상의 유전자 DNA의 시퀀싱 혹은 리시퀀싱(resequencing)(Chee, M., 등, 1996, Science 274, 610-613)에 사용되어 왔다. 여기에서 참조하는 간행물과 특허출원의 공개물은 참조로 여기에 통합되어 있다. 현재, 이런 검출은 형광 라벨이 표적핵산과 부착한 뒤 프로브-변형된 표면과 혼성화되고 혼성화되지 않은 DNA를 고체 표면으로부터 세척하여 제거하는 것을 수반한다. 혼성화의 검출을 위해 광자의 검출이 필요하므로, 이러한 방법으로 부착된 어레이의 분석을 위해서는 고해상 형광현미경을 필요로 한다. 선택적으로는, 혼성화의 간접적 검출을 샌드위치 분석(Sandwich assays)을 이용하여 수행할 수 있다. 샌드위치 분석에서는 표면-결합 하이브리드가 하나 이상의 형광 라벨-표지 부가적인 단일 프로브 혹은 비형광 기질을 형광기질로 전환시키는 효소와 혼성화 된다(Spargo, C.A. 등, 1993, Molecular and Cellular Probes 7, 395-404). 단일 프로브에 다중 효소를 부착시킴으로써, 큰 신호 증폭을 이룰 수 있다(Holodniy, M. 등, 1995, J. Virology 69,3510-3516). 그러나, 이러한 다중 효소 시스템의 제조는 복잡하다.
다른 연구자들은 캐리어에 고정된 핵산 프로브 및 이중가닥 핵산에 대한 특정 인식 물질을 이용하는 유전자 검출방법을 개발하였으나, 이러한 방법은 핵산내로 리포터(reporter) 그룹의 개재(intercalation)가 필요하기 때문에 단일-가닥 표적을 인식할 수 없다(Hashimoto 등, 미국특허번호 5,776,672).
Heller의 특허(미국특허번호 5,532,129; 5,565,322; 5,605,662; 및 5,632,957)는 전극 상에 놓인 아가로오스 겔인 투과층을 갖는 전극의 용도를 개시한다. 그 전극에 전위를 적용하면 전극의 반응 부위로 프로브 혹은 표적 핵산이 이동하지만, 형광 프로브의 이용을 통해 진행되는 검출단계 부분은 아니다.
Chrisey 등의 특허(미국특허번호 5,688,642)에서 나타난 바와 같이, 오르가노실란은 이산화규소와 같은 기질의 수산화된 표면의 선택된 부위에 공유결합하여 오르가노실란 단일층 혹은 이중층 또는 코팅을 형성한다. 기질의 수산화된 표면에 결합하기 위한 적어도 하나의 반응부위; 및 코팅의 다른 오르가노실란 혹은 기질에 결합할 수 없지만, 티올 혹은 아미노기의 부가에 의해 변형된 핵산과 같은 전혀 다른 분자와 결합하는데 사용될 수 있는 다른 반응 부위를 갖는 오르가노실란을 사용한다.
라벨된 단백질 및 가용성 시약을 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위해 사용해 왔다. 예를 들어, Weetall의 특허(미국특허번호 5,066,372)는 시약이 스며들고 단백질이 고정될 수 있는 작용 전극 상의 지지층을 개시한다. Hill의 미국특허번호 4,945,045, Higgins의 미국특허번호 4,545,382 그리고 Gratzel의 미국특허번호 5,378,628을 또한 참조하라.
Wang 등의 논문(Wang 등, 1997, Anal. Chem. 69, 4056-4059)에는 고분자 핵산이 존재할 경우의 올리고뉴클레오티드 분석을 위한 막으로 덮여진 탄소전극이 기술되어 있다. 상기 막의 목적은 고분자 DNA를 배재하고 반면에 저분자가 탄소전극에 의한 전기분석을 위한 막을 통해 통과할 수 있게 하기 위한 것이다. 상기 막은 프로브의 부착을 위해 사용되지 않으며, 상기 막으로 덮여진 전극은 시퀀스 레벨의 차별을 제공하지 않는다.
모출원(parent application)은 그 모든 명세서, 도면 및 청구범위가 특이적으로 참조로 여기에 통합되어 있으며, 다른 발명 중에서 시퀀싱 및 핵산 혼성화를 정성적 및 정량적으로 검출하는 방법을 개시한다. 그런 발명은 당해 기술 분야에서 기술상의 주요 진전을 나타내고, 효소 혹은 형광라벨의 첨가없이 촉매적 방법으로 작용하는 산화-환원 복합체를 제공하고, 표적 핵산의 존재 유무를 결정하는데 유용한 방법으로 구아닌 혹은 호생의 염기의 농도를 부여하는 촉매적 전류를 제공하고, 매우 정확한 시험법을 제공한다.
표면상의 자가-회합된 단일층의 형성으로 특이적 산화환원-활성 애널라이트(analyte), 태양에너지 전환 및 근본적 전기화학 연구를 위한 새로운 경계면의 디자인이 가능하게 되었다. 이전의 단일층은 알칸티올-금 연결을 통해 형성되었고 카르복실산염과 인산염 및 주석-처리된 산화인듐과 같은 산화금속 표면 사이의 연결과 관련이 있다. 그러므로, 자가-회합은 헥사메틸렌 링커에 의해 올리고뉴클레오티드에 연결된 티올기로 5'말단에 기능화된 DNA로 고염농도에서 금 위에서의 올리고머 DNA 단일층의 구조를 조절하는데 사용된다. DNA는 명백히 티올 말단기를 통해 부착되어 남아 있으나, 반면에 DNA 골격과 표면 사이의 접촉은 머캅토헥사놀 단일층의 형성으로 저지된다. 올리고머 핵산 프로브는 쉽게 그것의 상보적 배열과 혼성화된다(Levicky, R. 등, 1998, J. Amer. Chem. Soc., 120, 9787). 전극과 접촉한 핵산으로부터의 직접적인 전자이동을 이용하여 디자인되었지만 매개된 전자이동도 자가-회합 단일층도 이용하지 않는 다른 시스템에는, Hall 등, PCT/GB93/00631이 있다.
와이드-밴드갭(wide-bandgap) 반도체의 표면 변형에서의 사용을 위해 혹은 경계면의 전자-이동 반응 동역학을 알아내기 위해, 카르복실산-관능기를 갖는 루테늄 비피리딜 복합체는 표면 부착을 획득하기 위한 하나의 방법으로써 고-영역 나노크리스탈린(high-area nanocrystalline) 이산화티타늄과 함께 사용될 수 있다. 나노크리스탈린 TiO2의 필름(전극) 혹은 콜로이드 형태로의 표면부착을 수행하고 넓은 pH 영역에 걸친 분자의 뒤이은 보유를 위한 또 다른 방법은 Ru(bpy)3 2+의 헥사포스포네이션(hexaphosphonation)이다(Yan, S.G. 등, 1996, J. Physical Chem., 100, 6867). 이러한 선행 기술은 본 발명과 같은 매개된 용액 전기화학에 관한 것이 아니고 오히려 전압 대신 자극과 같은 빛을 사용하는 직접적인 전자이동에 관한 것이다.
자가-회합된 단일층에 관한 종래 연구는 결합쌍의 멤버가 결합될 수 없고 단일층의 생분자의 결합과는 다른 목적으로 사용되고 일반적으로 일치하지 않는 메틸혹은 수산기와 같은 구성요소에 의해 종결되는 단일층의 형성을 포함하였다. 예를 들어, 산화금속에 흡착되고 메틸 혹은 수산기에 의해 종결된 자가-회합된 장쇄 알칸하이드록삼산은 금속에서의 부식억제를 위해 사용되었고(Folkers, J.P. 등, 1995, Langmuir, 11, 813 및 Laibinis, P.E. 등, 1989, Science, 245, 845) 정전기적으로 금속과 결합하는 자가-회합된 티올-종결 단일층이 형성되었다(Tarlov, M.J. 및 Bowden, E.F., 1991, J. Am. Chem. Soc., 113, 1847).
여기에 기술된 본 발명과 관련된 초기 연구는 인듐 주석 옥사이드(ITO)전극 상에 1,12-도데칸디카르복실산(DDCA)의 단일층 형성으로 수행되었다. 여기서 전극은 수용성 카르보디이미드로 활성화된 후에 뉴클레오베이스의 내생성 아민과 한쪽의 카르복실레이트의 반응을 경유하여 DNA로 더욱 유도된다(Napier, M. 등, 1997, Langmuir, 13, 6342). DNA의 전극으로의 부착은 산화된 금속 복합체 Ru(bpy)3 3+에 의한 구아닌의 산화 때문에 큰 촉매 증진을 야기한다. 카르복실레이트-ITO 경계면은 E1/2=1.05V(vs Ag/AgCl)에서 Ru(bpy)3 2+/3+의 전기화학과 양립가능하며, 그것은 금-티올 단일층을 갖는 경우가 아니다. 그러나, 1,12 도데칸 디카르복실산 단일층은 열적 스트레스 하에서 안정하지 않으며, 여기의 본 발명의 포스포네이트와 비교하면 카르복실레이트 단일층은 낮은 안정성 때문에 재생산 가능하게 형성되지 않는다.
여기의 본 발명 이전에, 올리고뉴클레오티드 프로브의 똑바른(straightforward) 결합과 구아닌 산화를 경유한 고정된 DNA의 전기화학적 검출을 허락하는 자가-회합 단일층이 개시되었다. 이 발명의 자가-회합 단일층은열적으로 안정하고, 산화 저항성이 있으며, 신속하게 그리고 재생산 가능하게 생성된다. 카르복실레이트가 말단기로 사용될 때, 비특이적 결합은 최소화된다. 더욱이, 상기 발명에 사용되는 바람직한 포스포네이트 화합물은 이미 이용할 수 없거나 합성하기 매우 어렵다(상업적으로 이용가능한 것으로 알려진 C3카르복시 포스포네이트 및 C3아미노 포스포네이트 만으로).
다른 포스포네이트 화합물에 관한 이전의 연구는 예를 들어 크로마토그래피 분리를 증진시키거나(Lukes, I. 등, 1994, J. Am. Chem. Soc., 116, 1737), 절연 다중층 필름(예, 티올 포스포네이트 in Hong, H-G, 등, 1991, Langmuir, 7, 2362, 및 금속 알칸바이포스포네이트 in Yang, H.C. 등, 1993, J. Am. Chem. Soc. 115, 11855) 혹은 단일층의 절연(올리고뉴클레오티드를 전극으로부터 떨어지게 하는 전극 표면상의 처리제는 하전 캐리어를 전극 표면으로부터 떨어지게 하고 전극으로의 용매접근 가능성을 차단하여 전자이동이 단지 원하는 위치에서 일어나게 하는 것을 제공하는 Kayyem, j. 등, PCT/US97/20014)을 형성하거나 포스폰산의 금속표면과의 반응을 연구(Gao, W. 등, 1996, Langmuir, 12, 6429)하기 위해 용액상태였다. 기능화된 티올, 카르복실산 혹은 포스폰산의 직각 자가-회합을 위한 예를 들어 페로센으로 붙여진 시스템은 Gardner, T.J. 등, 1995, J. Am. Chem. Soc., 117, 6927에 의해 연구되었다. 이러한 연구는 어떤 것도 전극상에 자가-회합 포스포네이트 단일층에 대한 결합쌍의 멤버의 결합과 관련이 없다. DNA가 이전의 그러한 필름에 고정되는 경우, 그것은 공유결합이 아닌 정전기적 결합에 의해서 이중가닥 DNA에서 DNA의 삽입을 경유하여 이루어진다(Xu, X-H 등, 1994, J. Am. Chem. Soc., 116, 8386).
전극 상의 층에 관한 다른 연구는 단일층에 관한 것이 아니고, 예를 들어 SiO2상에 회합된 이중층을 함유하는 지질과 생분자를 갖는 리간드의 상호작용을 조사하는 이중층(Boxer 등, PCT/US97/21835) 혹은 막과 선택된 핵산 시퀀스를 검출하기 위해 사용되는 전극 사이에 공간을 갖는 이중층(Harding 등, PCT/Au97/00316) 중 어느 하나; 표준 지질 단일층 기술에 의해 형성된 계면활성제 필름에서 다불포화된 그룹의 중합의 결과로서 전기적으로 전도성인 균일하게 배향된 층으로서 존재하는 특이적 결합쌍의 멤버가 결합한 전기적으로 전도성의 계면활성제층을 갖는 전기적, 광학적 그리고 기계적 신호를 이용하는 바이오센서를 사용하는 중합된 층(Ribi(EP 0 492 917B1); 혹은 완전히 다른 목적을 위해 사용하는 반-침투성 막에 관한 것이다(Maley 등, 미국특허번호 5,711,868, 여기에서 전기화학적 센서는 효소에 의해 포도당을 감지하는데 이용되고, 작용 전극이 반투과성막으로 덮여있다.).
그러므로, 본 발명의 목적은 ITO와 같은 전극 표면에 올리고뉴클레오티드 프로브 혹은 단백질-결합 물질을 고정화하여 표적 핵산과의 혼성화 혹은 표적 단백질과의 결합 및 산화-환원 반응을 경유한 이후의 검출을 가능하게 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 핵산 또는 수용체, 리간드, 항원 혹은 항체를 포함한 다른 표적과 같은 표적 생분자의 검출 및 정량을 위해 사용할 수 있는 전극에 비전도성 자가-회합 단일층을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 목적 및 잇점은 다음의 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해질 것이다.
관련출원의 교차참조
본 출원은 함께 계류 중인 1998년 10월 27일 출원한 출원번호 09/179,665의 일부계속출원이다. 1998년 10월 27일 출원한 출원번호 09/179,665는 1996년 6월 20일에 출원하고 현재는 미국특허번호 5,871,918인 특허출원번호 08/667,338의 분할출원이며, 1995년 6월 27일에 출원한(현재 포기된) 특허출원번호 08/495,817 과 1997년 10월 14일에 출원하고 함께 계류 중인 특허출원번호 08/950,503의 일부계속출원이다. 특허출원번호 08/950,503은 1996년 6월 20일에 출원하고 현재는 미국특허번호 5,871,918인 특허출원번호 08/667,338의 일부계속출원이다. 상기 특허출원의 공개는 모두 참조로 여기에 통합되어 있다.
기술분야
본 발명은 결합쌍(binding pair) 상호작용의 분석을 위해 변형된 전극과 특히 핵산 분석과 단백질-단백질 상호작용에서의 이러한 전극의 용도에 관한 것이다.
도 1a 및 1b는 구아닌-함유 올리고뉴클레오티드의 양(pmol)에 대한 본 발명의 자가-회합 단일층의 회합시간의 그래프이다. 이것은 단일층이 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브의 양의 함수로서 단일층 형성에 대한 자가-회합 시간의 효과를 나타낸다.
도 2는 자가-회합된 단일층에 짝지워진 구아닌-함유 올리고뉴클레오티드의 전기화학적 반응에 의해 나타나는, 단일층 형성에서 자가-회합 용액에서의 C12카르복시포스포네이트의 농도의 효과를 그래프로 나타낸다. 20V/s의 스캔속도로 그리고 100μM의 Ru(bpy)3 2+농도로 사이클릭볼타메트리를 사용하여 전기화학적 측정을 하였다.
도 3은 12-탄소 카르복시-알킬 포스포네이트를 사용하여 본 발명에 따라 제조된 구아닌-함유 올리고뉴클레오티드 단일층의 안정성을 그래프로 나타낸다. 20V/s의 스캔속도로 그리고 100μM의 Ru(bpy)3 2+농도로 사이클릭볼타메트리를 사용하여 전기화학적 측정을 하였다.
도 4는 부착된 구아닌-함유 올리고뉴클레오티드의 양을 다양화한 올리고뉴클레오티드-결합 단일층에 대한 용량 반응을 나타내는 사이클릭볼타모그램 시리즈이다. 20V/s의 스캔속도로 그리고 100μM의 Ru(bpy)3 2+농도로 사이클릭볼타메트리를 사용하여 전기화학적 측정을 하였다.
도 5는 도 4에서 보여지는 용량 반응을 그래프로 나타낸다. 20V/s의 스캔속도로 그리고 100μM의 Ru(bpy)3 2+농도로 사이클릭볼타메트리를 사용하여 전기화학적 측정을 하였다.
발명의 요약
본 발명은 전극 상의 자가-회합 포스포네이트 단일층이며, 보다 바람직한 구체예에서는 ITO 표면 상의 카르복시-알킬 포스포네이트이고, 거기에 결합쌍의 멤버가 공유결합하고 있다. 본 발명은 또한 단일층 물질을 사용하여 자가-회합된 단일층을 전극 표면에 형성하는 방법 및 변형된 전극표면에 결합쌍 멤버를 고정시키는 방법을 또한 포함한다. 바람직한 실시예에서 자가-회합된 단일층을 갖는 전극은 핵산에서의 기선택된 염기의 전기화학적 검출 및 표본에서 표적핵산의 존재를 결정하는데 유용하다. 표적 핵산과 접촉 시, 자가-회합된 단일층에 짝지워진 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적핵산과 반응하여 변형된 전극표면에 혼성화된 핵산을 형성한다. 상기 혼성화된 핵산은 산환-환원 반응에서 혼성화된 핵산에서의 기선택된 염기를 산화할 수 있는 전이금속 복합체와 반응하고, 상기 산화-환원 반응이 검출되고 혼성화된 핵산의 존재유무가 상기 검출된 산화-환원 반응으로부터 결정된다. 고정된 결합쌍으로부터 전이금속 복합체로의 전자의 이동 후에 상기 단일층은 전이금속 복합체가 전극의 표면으로 전자를 수송하는 것을 허여하여 이곳에서 전자가 검출되기 때문에, 상기 산화-환원 반응은 본 발명에 따라 검출될 수 있다. 그러므로, 자가-회합 단일층은 비전도성이고, 전극 표면 가까이에 반응물을 고정시키고, 전자의 수송을 허여하도록 고정된 반응물로부터 전극의 전도성 작용 표면으로 전이금속복합체가 자유롭게 이동하하도록 한다. 어떤 경우에는, 당해 기술분야에 알려진 증폭기술을 본 발명과 결합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 다른 표적(예, 수용체, 리간드, 항원, 항체, 등)을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 표본에서의 표적 단백질을 본 발명의 자가-회합 단일층에 부착된 항체와 같은 단백질 결합물질과 표적 단백질을 반응시킨 후, 산화-환원 반응에서 환원될 수 있는 라벨에 결합된 이차 항체와 같은 이차 단백-결합물질을 부가함으로써 검출할 수 있다. 핵산에서와 같이, 상기 라벨은 산화-환원 반응에서 라벨을 산화시킬 수 있는 전이금속 복합체와 반응한다. 산화-환원 반응을 검출하면 표적 단백질의 존재여부를 결정할 수 있다. 본 발명에서의 사용에 적합한 라벨 중 하나는 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 다른 목적 및 특징은 다음의 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 보다 확실히 명백해질 것이다.
본 발명의 상세한 설명 및 그것들의 바람직한 구체예
본 발명은 전극 상에 공유결합된 결합쌍 멤버를 갖는 자가-회합된 포스포네이트 단일층을 제공한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 비전도성 "단일층"은 전극의 전도성 작용 표면을 덮는 단일층을 포함하고, 바람직하게는 전극의 전도성 작용 표면에 포스포네이트 상의 산소와 전극 상의 금속원자 사이에 "공여" 혹은 "배위" 결합으로 전극의 전도성 작용 표면에 ITO 전극 표면으로 자가-회합된 알킬 포스포네이트를 포함한다(바람직한 구체예). 본 발명의 단일층의 형성은 전자를 공유하여 진정한 공유결합을 형성할 수 있는 C, N 및 O와 같은 두 개의 비금속 사이에서 발견되는 것과 같은 진정한 공유결합의 형성을 포함하지 않는다. 여기서의 본 발명은 또한 폴리머 막을 포함하지 않는다.
상세하게는, 본 발명의 자가-회합된 단일층은 ITO 전극과 같은 전극에 부착하여 변형시킬 수 있는 포스포네이트 분자로부터 형성된다. 본 발명에서 사용된 분자는 ITO 표면에 결합하는 적어도 하나의 표면-활성 작용기, 바람직하게는 포스포네이트, 그리고 결합쌍이 공유적으로 결합하는 카르복시, 아미노, 히드록시 혹은 메틸과 같은 적어도 하나의 말단 종결기, R1을 갖는 다작용성이다. 게다가, 이런 분자들은 바람직하게는 하나 이상의 탄소 원자와 포스포네이트기 및 R1기 사이에 결합된 치환체(일반적으로 수소)를 함유하는 유기 스페이서 R2를 갖을 수 있다. 바람직하게 상기 포스포네이트 단일층은 카르복시-알킬 포스포네이트(여기서 R1=-CO2H, 그리고 R2=-(CH2)n-)을 포함하고, 아래 보다 상세하게 설명한 바와 같이 가장 바람직하게는 11-카르복시운데칸 포스폰산(여기서 R1=-CO2H 그리고 R2=-(CH2)11-)이다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합쌍 멤버"는 핵산, 수용체, 리간드, 항체, 항원 및 탄수화물과 같이 서로 결합할 수 있는 모든 생분자를 포함한다. 여기서의 실시예가 주로 올리고뉴클레오티드의 사용과 관련되어 있지만, 당해 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람은 다른 생분자에 대해서 여기의 실시예 및 설명을 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 전극은 전도성 물질 혹은 전도성 작용전극으로 작용하는 외부표면을 갖는 기질을 포함한다. 상기 기질은 그것 자체가 전도성이거나 혹은 비전도성이지만 전도성 작용 표면을 갖을 수 있다. 상기 전극은 외부에 전도성 작용표면을 갖는 원통형 전극 혹은 한쪽에 형성된 전도성 작용 표면을 갖는 평평한 쉬트와 같은 당해 기술에서 종래에 있었던 어떠한 모양일 수 있다. 단일층이 회합되는 전도성 기질은 금속 혹은 흑연, 유리탄소, 열분해성 흑연, 탄소 페이스트 및 탄소섬유와 같은 탄소를 함유하는 종래에 사용된 비금속 물질; 인듐-도프처리된 산화주석(TIO), 산화주석, 산화티타늄, 산화망간, 및 산화납과 같은 도프 처리된 산화물 및 도프 처리되지 않은 산화물; 그리고 Si, Ge, ZnO, CdS, TiO2, 및 GaAs와 같은 반도체 물질 등일 수 있다. ITO가 저렴하고 물에서 중성 pH 및 상대적으로 낮은 전하량에서 높은 산화압 한계값을 갖기 때문에 상대적으로 특성이 잘 알려져 있어서 ITO를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명을 그것과 관련하여 더욱 설명할 것이다. 티올 혹은 다른 디설파이드를 흡착한 금과 같은 금속은 구아닌 산화에 필요한 것보다 더 낮은 전압에서 산화하기 때문에 본 발명에 사용될 수 없다.
라벨-표지 표적의 존재 결정을 위한 장치는 예를 들어 액체표본을 수용하기 위한 표본 용기; 그 위에 전도성 작용표면을 갖는 기질을 포함하는 전극; 그리고 상기 전도성 작용 표면 상에 비전도성 자가-회합 단일층, 즉 상기 포스포네이트 분자를 포함하는 단일층; 그리고 상기 단일층과 전자적으로 연락되는 포텐시오스탓을 포함한다. 상기 포스포네이트 분자를 포함하는 단일층에서 포스포네이트 분자 각각은 최소 적어도 하나의 포스포네이트기와 적어도 하나의 R1기를 갖으며, 여기서 R1기는 결합쌍 멤버와 공유결합하고, 그 단일층을 통해서 전이금속 복합체는 자유롭게 고정된 반응물에서 전도성 작용표면으로 이동하여 전자를 전도성 작용표면으로 수송할 수 있다. 상기 장치는 더욱 자가-회합된 단일층에 부착된 올리고뉴클레오티드 프로브 혹은 자가-회합된 단일층에 부착된 단백질-결합 물질과 같은 결합쌍 멤버를 더욱 포함한다.
일반적으로, 표본에서 표적 핵산의 존재를 결정하는 방법은 전극에 자가-회합된 단일층과 올리고뉴클레오티드를 접촉시켜서 올리고뉴클레오티드 프로브를 단일층에 공유결합으로 부착시키는 단계; 상기 전극 상의 프로브로 변형된 단일층을 핵산용액과 접촉시켜서 표적핵산 및 올리고뉴클레오티드 프로브가 변형된 전극 상에 혼성화된 핵산을 형성시키는 단계; 상기 혼성화된 핵산을 산화-환원 반응으로 상기 혼성화된 핵산의 기선택된 염기를 산화시킬 수 있는 전이금속 복합체와 반응시키는 단계; 상기 산화-환원 반응을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 산화-환원 반응으로부터 상기 핵산의 존재유무를 결정하는 단계를 포함한다. 택일적으로, 상기 뉴클레오티드 프로브는 전극 상의 단일층 회합 전에 포스포네이트에 짝지워질 수 있다.
단백질에 있어서, 표본의 표적 단백질의 존재를 결정하는 방법은 전극 상에 자가-회합된 단일층을 단백질-결합물질과 접촉시켜서 그 결합물질이 본 발명에 따른 단일층에 공유결합시키는 단계; 상기 전극 사의 단백질-변형 단일층을 표본과 접촉시키는 단계; 상기 변형된 전극을 라벨을 함유하기 위해 변형된 이차 단백질-결합물질과 접촉시키는 단계; 상기 단일층을 산화-환원반응으로 라벨을 산화시킬 수 있는 전이금속 복합체와 반응시키는 것; 상기 산화-환원 반응을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 산화-환원반응으로부터 표적 단백질의 존재 유무를 걸정하는 단계를 포함한다. 이런 발명에서의 사용에 적절한 라벨은 올리고뉴클레오티드이다. 택일적으로, 상기 단백질-결합 물질은 전극 상에 단일층 회합 전에 포스포네이트에 짝지워 질 수 있다.
포스포네이트
앞서 논의한 바와 같이, 본 발명의 자가-회합 단일층을 형성하는 분자는 포스포네이트기(-PO3H2)를 포함하며, 그것은 ITO 전극 표면과 결합쌍 멤버와 공유결합을 할 수 있는 R1기와 결합한다. 상기 포스포네이트기는 모노포스포네이트, 디포스포네이트, 트리포스포네이트, 테트라포스포네이트, 혹은 폴리포스포네이트 부분일 수 있다. 상기 R1말단기는 카르복실, 할로산, 산무수물, 히드록실, 에폭사이드, 알데히드, 케톤, 설프히드릴, 니트릴 및 아미노기가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 포스포네이트기 및 R1은 유기 스페이스 즉, R2에 의해 연결되며, 존재할 경우 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향성 구조를 포함하며, 그것은 선형, 측쇄, 환 혹은 고분자 구조일 수 있다. R2는 ITO 표면에 결합할 수 있는 어떠한 수의 포스포네이트 분자로 치환될 수 있다.
바람직하게 상기 포스포네이트 원천은 카르복시-알킬 포스포네이트이다. 상기 본 발명의 자가-회합된 단일층에서, 카르복시-알킬 포스포네이트의 포스포네이트 부분은 알킬부분의 탄소수의 증가 시 증가된 안정성으로 ITO와 결합한다. 상기 카르복시 부분은 상기 단일층에 음의 전하를 부여하고, 상기 결합쌍의 멤버와 짝짓는 것은 카르복시기이다. 아미노알킬 포스포네이트는 양의 단일층 전하가 원한다면 사용될 수 있고 메틸 혹은 히드록시 포스포네이트는 중성 표면 전하를 위해 사용될 수 있다.
최근에 행한 실험에 근거하여 가장 바람직한 상기 카르복시-알킬 포스포네이트는 12-카본 카르복시-알킬 포스포네이트(또한 여기서는 11-카르복시운데칸 포스폰산라고 부른다)(바람직한 새로운 제조방법을 위해 실시예 2 참조)이다. 이런 12-카본포스포네이트는 여기의 실시예에 기술된 시험에서 주로 사용되었다. 시험 결과, 알킬기에 2-14 탄소를 갖는 카르복시-알킬 포스포네이트가 여기 본 발명에서의 사용을 위해 요구되는 충분한 안정성 및 특징을 갖는 자가-회합 단일층을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에서는 단일층에 단독으로 사용 시, 12-탄소 카르복시-알킬 포스포네이트 뒤에 3-카본 아미노-알킬 포스포네이트 및 3-카본 카르복시알킬 포스포네이트의 순서로 유용성이 감소한다. 포스포네이트 체인의 탄소수가 증가함에 따라 결과물인 단일층의 안정성이 증가한다.
실시예 2에서 보다 상세하게 설명된 카르복시-알킬 포스포네이트의 합성은 일반적으로 (1) 브로모알킬 카르복실산을 옥살릴클로라이드와 반응시킴으로써 클로로산 중간체로 변환시키는 단계; (2) 상기 클로로산 중간체를 알칼리성 상태하에서 에탄올과 같은 알콜과 반응시킴으로써 브로모알킬 에스터로 변환시키는 단계; (3) 상기 브로모알킬 에스터 중간체는 트리에틸 포스파이트(혹은 트리메틸 포스파이트)와 반응시킴으로써 카르복시-알킬 포스포네이트로 변환된 후에 산가수분해에 의해 산을 재생산할 수 있는 단계를 포함한다.
여기의 실시예에 논의된 상기 자가-회합 포스포네이트 단일층은 화학적으로 균질, 즉 단지 카르복시-알킬 포스포네이트로 구성된다. 그러나, 상기 발명은 상기 단일층의 물리적 화학적 특징, 예를 들어 단일층의 전체적인 전하 혹은 전하분포를 바꾸는 다른 물질, 예를 들어 아미노-알킬 포스포네이트, 히드록시-알킬 포스포네이트, 메톡시-알킬 포스포네이트, 메틸-알킬 포스포네이트, 티올-알킬 포스포네이트, 알데히드-알킬 포스포네이트, 트리플루오로메틸-알킬 포스포네이트, 및 다양한 길이의 양성이온(zwitterionic) 포스포네이트로 이러한 포스포네이트가 보충되는 자가-회합 불균일 단일층을 포함한다. 결합쌍 멤버와 공유결합할 수 있거나 없을 수 있다. 특정조건에서 혼합된 단일층은 특정 표적 분자의 결합쌍 멤버와의 결합을 증진시키고/거나 전극표면에 비-표적 분자의 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다.
시험 표본
상기 방법은 표적핵산 혹은 단백질과 같은 다른 표적 생분자를 함유하는 시험 표본에서 이루어 질 수 있다. 표적을 함유한다고 의심되는 어떤 시험표본도 사용될 수 있으며, 생검 표본과 같은 조직 표본 및 혈액, 타액, 소변 및 정자 표본과 같은 생물학적 액체, 세균 배양물, 토양 표본, 식품 표본, 세포 배양물, 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 표적은 시험의 특정 목적에 따라 동물, 식물 혹은 미생물(예, 바이러스, 세균, 원충 및 곰팡이 등을 포함하는 원핵세포 및 진핵세포 생명체)을 포함하여 어떠한 기원도 가능하다. 실시예에서는 외과적 표본, 의학적 진단에 사용되는 표본, 유전학적 시험에 사용되는 표본, 환경 표본, 세포 배양물 표본, 음식물 표본, 치과적 표본 및 수의학적 표본을 포함한다. 상기 표본은 본 방법을 수행하기 전에 당해 기술분야에 대한 통상적인 지식을 가진 자에게 알려져 있거나 명백한 기술에 따라 처리되거나 정제될 수 있다; 및 거기에서 상기 핵산은 원한다면 본 방법을 수행하기 전에 절단되고 분해되고 및/또는 증폭될 수 있다(이하 참조).
증폭
본 발명에 따른 자가-회합 단일층을 갖는 전극을 사용하는 방법은 상기 표적 핵산 표본을 올리고뉴클레오티드 프로브로 접촉시켜 혼성화된 핵산을 생산하는 것을 포함하므로, 본 발명을 사용하는 어떤 적용에 있어서는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키기 전에 핵산을 증폭시키는 것이 바람직할 수 있다. 선택된 혹은 표적 핵산 시퀀스의 증폭을 함께-계류중인 출원(SN 09/179,665 및 SN08/950,503)에 개시되고 설명된 것과 같은 적절한 방법으로 수행할 수 있다.
핵산의 검출
위에서 기재한 바와 같이, 자가-회합된 단일층이 형성된 본 발명의 전극 및 전기 전극을 사용하는 방법은 혼성화된 핵산의 검출을 가능하게 한다. 이런 방법에 있어서, 표적핵산은 자가-회합 단일층에 결합되어 있는 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉하여 혼성화된 핵산을 형성한다. 본 발명의 방법에 유용한 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 약 4 혹은 6개의 염기와 약 80 혹은 100개의 염기 혹은 그 이상까지, 보다 바람직하게는 약 8과 약 30개 사이의 염기를 포함하는 어떠한 프로브도가능하다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 당해 기술분야에서 잘 알려진 기술에 따라 매우 다양한 염기 시퀀스를 갖도록 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 제조에 적절한 염기는 자연적으로 발생하는 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 및 티아민과 같은 뉴클레오티드 염기 그리고 8-옥소-구아닌, 6-머캅토구아닌, 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시히드록시에틸)유리딘, 2'-O-메틸시티딘, 5-카르복시메틸아미노-메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, 디히드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, β,D-갈락토실큐에오신, 2'-O-메틸구아닌, 이노신, 7-데아자구아닌, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, βD-만노실큐에오신, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-β-D-리보퓨라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)쓰레오닌, N-((9-β-D-리보퓨라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)쓰레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산, 비부톡소신, 슈도우리딘, 큐에오신, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-β-D-리보퓨라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 비부토신, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘, 2'-O-메틸아데닌, 및 2'-O-메틸이노신과 같은 비자연적으로 생성되는 즉, "합성" 뉴클레오티드 염기로부터 선택될 수 있다. DNA, RNA, 탄소환과 같은 변형된 당 및 플루오로 및 메톡시와 같은 2' 치환체를 함유하는 당을 포함하여 어떠한 뉴클레오티드 골격도 적용될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 인터뉴클레오티드(internucleotid) 연결 포스페이트 잔기 중 적어도 하나 혹은 모두가 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포노티오에이트, 포스포로몰폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 및 포스포르아미데이트(예를 들어, 뉴클레오티드 연결 포스페이트 잔기는 기술된 바와 같이 변형 가능하다)와 같은 변형된 포스페이트인 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 P. Nielsen 등 1991, Science 254, 1497-1500에 기술된 바와 같은 "펩티드 핵산"일 수 있다. 유일한 조건은 뉴클레오티드 프로브가 표적 핵산의 시퀀스 일부분과 상보적인 적어도 한부분의 시퀀스를 가져야 한다는 것이다. 어떤 적용에 있어서는 다른 염기 시퀀스를 갖는 많은 수의 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 핵산 표본을 접촉시키는 것이 바람직할 수 있다(예, 표본에 두 개 이상의 표적 핵산이 존재하는 경우, 혹은 하나의 표적 핵산이 "샌드위치" 분석에서 두 개 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 경우).
기선택된 염기
혼성화 후, 전극에 자가-회합된 단일층에 부착된 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화된 표적 핵산을 적절한 매개체와 반응시킨다. 상기 기선택된 염기는 기선택된 매개체와의 반응 시 산화가 일어나는 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드 염기이거나 합성 뉴클레오티드 염기일 수 있다. 상기 기선택된 염기는 상기 기선택된 염기가 짝지워지지 않을 때에 비교하여 짝지워졌을 때 독특한 산화율을 나타낸다. 상기 기선택된 염기는 네 개의 자연적으로 생성되는 각각의 염기와 짝지울 때, 독특한 산화율을 나타내야 한다. 일반적으로, 5'-모노뉴클레오티드(예, 5'-데옥시리보뉴클레오티드 또는 5'-리보뉴클레오티드)가 104M-1s-1이 넘는 속도상수를 나타내는 염기를 촉매반응을 이용하여 검출할 수 있다. 적절한 기선택된 염기의 예에는 구아닌, 아데닌, 8-옥소-구아닌, 8-옥소-아데닌, 8-브로모-구아닌, 잔틴, 슈도우리딘, 6-머캅토구아닌, 8-머캅토구아닌, 2-티오잔틴, 6-티오잔틴, 6-머캅토퓨린, 2-아미노-6-카르복시메틸-머캅토퓨린, 2-머캅토퓨린, 6-메톡시퓨린, 2-아세틸아미노-6-히드록시퓨린, 6-메틸티오-2-히드록시퓨린, 2-디메틸아미노-6-히드록시퓨린, 2-히드록시퓨린, 2-아미노퓨린, 6-아미노-2-디메틸알릴-퓨린, 2-티오아데닌, 8-히드록시아데닌 및 8-메톡시아데닌이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 전형적으로 상기 기선택된 염기는 구아닌, 아데닌, 6-머캅토구아닌, 8-옥소-구아닌, 및 8-옥소-아데닌으로 구성된 그룹에서 선택되며, 구아닌이 현재 바람직한 자연적으로 생성된 기선택된 염기이고 8-옥소-구아닌 혹은 6-머캅토구아닌이 현재 바람직한 합성 기선택된 염기이다.
매개체
전자이동을 가능하게 하는데 필요한 매개체는 핵산으로부터 전극에 전자를 수송하는 독특한 산화력으로 기선택된 염기와 반응성이 있는 양이온, 음이온, 비이온, 혹은 양성이온 분자와 같이 어떠한 분자여도 된다. 그러므로, 매개체의 선택은 선택된 특정 기선택된 염기에 의존하고, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 쉽게 결정될 수 있을 것이다. 특히 바람직한 매개체는 기선택된 염기로 금속-핵산 전자이동이 가능하여 상기 금속 복합체의 환원형이 촉매반응 주기가 종료될때 재생산되는 전이금속 복합체를 포함한다. 본 발명의 방법에 있어서의 사용에 적절한 전이금속 복합체의 예로는 루테늄2+(2,2'-비피리딘)3("Ru(bpy)3 2+"), 루테늄2+(4,4'-디메틸-2,2'-비피리딘)3(Ru(Me2-bpy)3 2+"), 루테늄2+(5,6-디메틸-1,10-페난스롤린)3("Ru(Me2-펜)3 2+), Fe2+(2,2'-비피리딘)3("Fe(bpy)3 2+"), Fe2+(5-클로로페난쓰롤린)3("Fe(5-Cl-펜)3 2+"), 오스뮴2+(2,2'-비피리딘)3("Os(bpy)3 2+"), 오스뮴2+(5-클로로페난쓰롤린)3("Os(5-Cl-펜)3 2+"), 디옥소레늄1+포스핀, 및 디옥소레늄1+피리딘("ReO2(py)4 1+")가 있다. 매개체로서 유용한 어떤 음이온 복합체는 Ru(bpy)((SO3)2-bpy)2 2-및 Ru(bpy)((CO2)2-bpy)2 2-이고 매개체로서 유용한 몇 양성이온은 Ru(bpy)2((SO3)2-bpy) 및 Ru(bpy)2((CO2)2-bpy)이며, 여기서 (SO3)2-bpy2-는 4,4'-디설포네이토-2,2'-비피리딘이고 (CO2)2-bpy2-는 4,4'-디카르복시-2,2'-비피리딘이다. 피리딘, 비피리딘, 및 페난쓰롤린기의 적절한 치환된 유도체가 앞서 기술한 금속 중 어떤 것과도 복합체로 적용될 수 있다. 적절한 치환된 유도체에는 4-아미노피리딘, 4-디메틸피리딘, 4-아세틸피리딘, 4-니트로피리딘, 4,4'-디아미노-2,2'-비피리딘, 5,5'-디아미노2,2'-비피리딘, 6,6'-디아미노-2,2'-비피리딘, 4,4'-디에틸렌디아민-2,2'-비피리딘, 5,5'-디에틸렌디아민-2,2'-비피리딘, 6,6'-디에틸렌디아민-2,2'-비피리딘, 4,4'-디히드록실-2,2'-비피리딘, 5,5'-디히드록실-2,2'-비피리딘, 6,6'-디히드록실-2,2'-비피리딘, 4,4',4"-트리아미노-2,2',2"-테르피리딘, 4,4',4"-트리에틸렌디아민-2,2',2"-테르피리딘, 4,4',4"-트리히드록시-2,2',2"-테르피리딘, 4,4',4"-트리니트로-2,2',2"-테르피리딘, 4,4',4"-트리페닐-2,2',2"-테르피리딘, 4,7-디아미노-1,10-페난쓰롤린, 3,8-디아미노-1,10-페난쓰롤린, 4,7-디에틸렌디아민-1,10-페난쓰롤린, 3,8-디에틸렌디아민-1,10-페난쓰롤린, 4,7-디히드록시-1,10-페난쓰롤린, 3,8-디히드록실-1,10-페난쓰롤린, 4,7-디니트로-1,10-페난쓰롤린, 3,8-디니트로-1,10-페난쓰롤린, 4,7-디페닐-1,10-페난쓰롤린, 3,8-디페닐-1,10-페난쓰롤린, 4,7-디스페라민-1,10-페난쓰롤린, 3,8-디스페라민-1,10-페난쓰롤린, 디피리도[3,2-a:2',2'-c]페나진, 6,6'-디클로로-2,2'-비피리딘, 프탈로시아닌 및 포르피린이 있으나 이에 한정되지는 않는다.
산화-환원 반응
상기 매개체는 상기 매개체의 기선택된 염기와의 산화-환원 반응에 영향을 주기에 충분한 조건 하에서 상기 혼성화된 핵산과 반응시킬 수 있다. 상기 산화-환원반응이 일어나는 용매는 핵산을 용해하기에 적절한 어떠한 용매일 수 있으며 바람직하게는 물을 포함한다. 산화-환원반응을 일어나도록 허여하는 적절한 조건은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있을 것이다.
산화-환원 반응의 검출
상기 산화-환원 반응의 발생은 본 발명에 따른 자가-회합 단일층을 갖는 전극에서 검출되어 산화-환원 반응 발생을 나타내는 전기적 신호의 변화를 관찰할 수 있다. 상기 전극은 매개체의 용액과 접촉하도록 놓여있고, 일반적으로 참조전극(보조전극을 통해서 전류 대부분이 지나가는)과 보조전극은 또한 작용 전극과 접촉한 용액과 접촉하도록 놓여있다. 유사하게, 적절한 참조전극은 또한 당해 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 Ag/AgCl 전극을 포함한다. 적절한 보조전극은 Pt 전극이다.
상기 산화-환원 반응과 연관된 전기적 신호를 검출하면 표적의 존재 유무를 결정할 수 있다. 표적의 존재 유무를 결정하는 단계는 (i)산화-환원 반응의 반응속도를 결정하는 단계, (ⅱ) 상기 측정된 반응속도와 핵산과 함께 혹은 없이 전이금속복합체의 산화-환원 반응속도를 비교하는 단계, 그리고 나서,(ⅲ) 상기 측정된 반응속도가 표적과 함께 혹은 없이 전이금속복합체의 산화-환원 반응속도와 본질적으로 동일한지 여부를 결정하는 단계를 전형적으로 포함한다. 예를 들어, 상기 상대적 반응속도는 동일한 스캔속도, 프로브 농도, 표적농도, 매개체, 완충용액, 온도 및/또는 전기화학적 방법에서 전류를 비교함으로써 결정할 수 있다.
산화-환원 반응 속도는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 적절한 방법에 따라 측정할 수 있다. 전형적으로, 산화-환원 반응 속도는 산화-환원 반응의 발생과 연관된 전기적 신호를 측정함으로써 측정한다. 예를 들어, 여기에 개시된 바와 같은 자가-회합 단일층으로 코팅된 전극과의 전기적 연락에 있어서의 적절한 장치를 제공함으로써 산화-환원 반응과 연관된 전기신호를 측정할 수 있다. 적절한 장치는 혼성화된 핵산 및 매개체 사이 반응의 산화-환원 반응속도의측정을 제공하기 위해, 생산되는 전기신호를 측정할 수 있는 포텐시오스탓이다. 단백질이 검출되기 위한 표적일 때, 상기 검출기는 산화-환원 반응에서 산화될 수 있는 라벨에 그것을 부착시키며, 그런 라벨 중 하나는 기선택된 염기를 함유하는 올리고뉴클레오티드이다.
상기 전기적 산출은 사이클릭 볼타메트리, 정상 펄스 볼타메트리, 크로노암페로메트리(chronoamperometry), 크로노쿨로메트리(chronocoulometry), 혹은 네모파 볼타메트리(square-wave voltametry)를 포함한 모든 전기화학적 방법의 특성이며, 사이클릭 볼타메트리와 크로노암페로메트리가 현재 바람직한 형태이다. 당해 기술분야에 알려진 컴퓨터가 전극사용을 조절하고 그런 사용의 결과를 기록하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 ITO 전극에 자가-회합된 단일층 상의 핵산을 분석하기 위해 가장 자주 사용되는 방법은 사이클릭 볼타메트리이다. 사이클릭 볼타메트리에서 전기화학적 시스템의 전위는 초기전위(0-800mV)부터 최종전위(1300-2000mV)까지 직선적으로 다양하다. 초기 전위에 도달 시, 스캔방향을 역전시키고 동일한 전위범위를 반대방향으로 하였다. 전위는 동일한 스캔속도에서 다양하다(예를 들어, 약 10mV/s에서 약 5000V/s 까지). 다수의 실험에 있어, 초기 전위는 0mV로 맞췄고 최종 전위는 스캔속도에 의해 실험적으로 결정하였다. 현재 바람직한 스캔속도는 1600mV 최종전압을 갖는 20V/s이다. 전류를 각각의 전위에서 수집하고 그 데이터를 전류 대 전위 스펙트럼으로 도시하였다.
사이클릭 볼타메트리의 대안으로서, 크로노쿨로메트리 혹은 크로노암페로메트리와 같은 전위단계 방법을 사용하여 본 발명의 단일층 상의 핵산을 분석할 수있다. 크로노쿨로메트리에서, 전기화학적 시스템은 직접적으로 초기 전압(0mV-800mV)에서 최종전압(1000mV-1600mV)로 단계적으로 변화한다. 상기 전기화학적 시스템은 최종전압에서 특정 시간동안 (50μs에서 30s) 유지되고, 전하가 시간에 대한 함수로서 수집된다. 현재는 비록 행해지지는 않지만, 원한다면, 전위를 다시 초기 전위로 단계적으로 변화시키고 전하를 시간에 대한 함수로서 초기 전위에서 수집할 수 있다. 크로노암페로메트리에서는, 전기화학적 시스템이 초기 전위(0mV-800mV)에서 직접적으로 최종전위(100-1600mV)로 어떤 특정시간동안(50μs에서 30s) 단계적으로 변화되어 전류를 시간에 대한 함수로서 수집한다. 원한다면, 상기 전위는 전위를 다시 초기 전위로 단계적으로 변화시키고 전하를 시간에 대한 함수로서 초기 전위에서 수집할 수 있다. 비록 바람직한 전위 및 시간은 다른 분석 파라미터에 따라 달라질 수 있지만, 바람직한 전위는 500ms의 수집시간동안 1100mV이다.
검출방법
여기의 본 발명에 따른 비전도성 자가-회합 단일층을 갖는 전극을 사용하여 표적핵산 상의 기선택된 염기의 검출은 (a) 본 발명에 따른 단일층에 결합되어 있고, 표적 핵산과 특이적으로 결합하여 혼성화된 핵산을 형성하는 올리고뉴클레오티드 프로브에 시험 표본을 접촉시키는 단계, (b) 상기 혼성화된 핵산을 산화-환원 반응으로 기선택된 염기를 산화시키는 전이금속 복합체에 접촉시키는 단계, (c) 상기 혼성화된 핵산과 연관된 산화-환원 반응의 존재 여부를 검출하는 단계, (d) 상기 기선택된 염기에서 상기 검출된 산화-환원 반응으로부터 상기 시험 표본에서 표적 핵산의 존재여부를 결정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 표적핵산은 올리고뉴클레오티드 프로브보다 적어도 10개 이상의 기선택된 염기를 함유하거나, 보다 바람직하게는 올리고뉴클레오티드보다 기선택된 염기를 적어도 50 혹은 100개 이상 함유한다. 표적핵산이 올리고뉴클레오티드 프로브보다 많은 기선택된 염기를 갖고 있을 때, 보다 큰 전류 흐름이 유익하게 얻어진다.
표적 핵산은 바람직하게는 올리고뉴클레오티드보다 더 길고, 기선택된 염기 중 적어도 어느 하나는 미국특허번호 5,871,918에 기재된 바와 같이 "돌출"되어 있고, 상기 혼성화된 핵산에서 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화되지 않는다. 바람직하게는 적어도 10, 50, 혹은 100의 기선택된 염기가 "돌출"염기이고, 그로인해 검출되는 전기화학적 신호의 충분한 증폭이 이루어진다.
선택적이지만 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 시퀀스는 기선택된 염기가 없다. 편의적으로 표적핵산에 혼성화되지만 기선택된 염기를 포함하지 않는 자연적으로 생성되는 염기의 그러한 시퀀스를 얻을 수 없는 경우에, 산화환원 불활성인 교대염기(아래에 논의된)를 적용하는 전략을 이용할 수 있다.
예를 들어, 어떠한 구아닌 잔기도 함유하지 않는 올리고뉴클레오티드 프로브 시퀀스(예, 단지 A, T, 및 C)를 선택할 수 있다. 이런 가닥의 존재 시, Ru(bpy)3 2+의 사이클릭볼타모그램은 올리고머가 없는 경우의 그것과 매우 비슷하다. 그리고 나서, 이런 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적핵산이 올리고뉴클레오티드 프로브보다 길다면 겹치는 염기-쌍 부위 및/또는 돌출 부위 중 어느 하나에서 구아닌을 함유하는 표적핵산 가닥에 혼성화 된다. 다수의 구아닌이 검출되기 때문에, 형성되는 하이브리드의 숫자에 상대적으로 신호가 증폭된다. 유전자 DNA 혹은 RNA가 표적핵산 가닥인 경우에, 많은 수의 돌출 구아닌이 나타나고, 이로 인해 엄청난 신호증폭이 생성된다.
보다 바람직한 구체예에서, 표적핵산 가닥 상의 기선택된 염기 분석은 전극 표면상의 자가-회합 단일층에서의 (바람직하게는 산화환원반응 불활성의)올리고뉴클레오티드 프로브 가닥의 고정화를 연루하며, 이는 매개체의 존재 시 스캔되는 낮은 배경 신호를 제공한다. 그리고 나서, 상기 단일층을 기선택된 염기를 포함하는 표적핵산 용액과 접촉시킨다. 혼성화가 일어나면, 상기 표적핵산은 전극 가까이에 위치할 것이고, 전류의 증가가 매개체 존재 시 검출될 것이다.
올리고뉴클레오티드 프로브에서 구아닌을 대체하지만(즉, 구아닌과 같이 핵산 듀플렉스(duplex)에서의 다른 염기들보다 시토신에 대해 더 큰 결합친화성을 갖는 염기), 적용 가능한 반응조건 하에서 매개체에 의해 산화되지 않는 염기가 사용될 수 있다. 상기 표적핵산에서 기선택된 염기가 구아닌이고 상기 표적핵산 또한 시토신(통상적으로 올리고뉴클레오티드 프로브의 구아닌과 결합한다)을 함유하고 있을 때, 상기 프로브는 혼성화된 핵산에서 시토신과 결합하는 교대염기를 함유한다. 상기 교대염기는 구아닌보다 전기화학적 반응성이 103더 작은 이노신일 수 있다. 상기 반응단계는 전형적으로, 교대염기를 산화시키는 것 없이 기선택된 염기의 선택적 산화에 영향을 주기에 충분한 조건 하에서 전이금속복합체를 핵산과 반응시키는 것을 포함한다.
그러므로, 상기 표적핵산이 적어도 하나의 기선택된 염기를 함유하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 교대 산화환원 불활성 염기를 함유하는 경우, 표적핵산을 검출하는 방법은 (a) 표적핵산에 특이적으로 결합하여 혼성화된 핵산을 형성하는 상보적 올리고뉴클레오티드 프로브에 표적핵산을 접촉시키는 단계; (b) 산화-환원 반응에서 기선택된 염기를 산화할 수 있는 전이금속복합체와 상기 혼성화된 핵산을 반응시키는 단계; (c) 상기 산화-환원 반응을 검출시키는 단계; 그리고 (d) 상기 혼성화된 핵산의 존재 여부를 기선택된 염기에서 검출된 산화-환원반응으로부터 결정하는 단계를 포함한다.
핵산의 정량
상기 기술된 방법은 핵산의 정량적 검출에 특히 잘 맞는다. 이 섹션에 기술된 경우에서, 매개체에 의한 혼성화된 핵산의 산화속도상수(예, Ru(bpy)3 2+)는 디지털 시뮬레이션에 의한 사이클릭 볼타모그램으로부터 결정할 수 있다. 대부분의 조건 하에서, 이런 반응은 이차 동역학에 따를 것이고, 속도=k[Ru(bpy)3 2+][DNA]이며, 여기서 k는 특정 올리고뉴클레오티드 프로브-표적핵산 하이브리드에 대해 특이적인 속도상수이고, [Ru(bpy)3 2+]는 매개체의 농도이며, [DNA]는 혼성화된 핵산의 농도(DNA-RNA 하이브리드일 수 있다)이다. k와 [Ru(bpy)3 2+]가 알려져 있으면, 혼성화된 핵산의 양을 결정할 수 있다. 실제로, 표적 핵산을 함유하는 다른 양의 표준용액에서 얻어지는 전류의 증가와 직접적으로 혼성화된 핵산에 대한 양을 얻기 위해 사용되는 전류의 증가에 대한 교정곡선이 구성된다. 그리고 나서, 이러한 양은 표적핵산(예, 임상적 표본에서의 감염 생명체)을 함유하는 물질의 양에 직접적으로 관련이 있다. M. Holodniy 등, 1995, J. Virol. 69, 3510-3516; J. Mellors 등, 1996, Science 272, 1167-1170 참조.
단백질에서의 이용
전극의 전도성 작용 표면에 자가-회합된 단일층은 단백질과 같이 핵산이외의 다른 생분자의 검출을 위해 여기의 본 발명의 설명을 이용하여 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 단백질로 연구하는 방법으로 또한 사용될 수 있다. 핵산에서와 같이, 본 발명을 다른 생분자에 적용 시, 효소라벨이 필요하지 않다. 예를 들어, 표본에서 표적 단백질을 검출하는 방법은 (a) 전도성 작용 전극 상의 자가-회합된 단일층에 단백질-결합 물질을 부착시키는 단계; (b) 상기 단일층에 짝지워진 단백질-결합 물질에 표적 단백질을 접촉시키는 단계; (c) 상기 단일층에 결합된 표적단백질을 산화-환원 반응에서 산화될 수 있는 라벨에 부착된 2차 단백-결합물질에 접촉시키는 단계; (d) 상기 표적핵산에 결합된 2차 단백-결합물질 상의 라벨을 산화-환원 반응에서 라벨을 산화시킬 수 있는 전이금속 복합체와 반응시키는 단계; (e) 산화-환원 반응을 검출하는 단계; 그리고 (f) 상기 검출된 산화-환원 반응으로부터 표적 단백질의 존재유무를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 특징은 다음의 실시예를 참조하면 보다 명백하게 이해될 것이며, 다음의 실시예는 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다.
실시예 1
시약 및 DNA
이런 실험에 사용되는 무기 시약은 분석용 혹은 그 이상의 것이다. 시약의 출처는 다음과 같다: 실시예 2에 따라 제조된 혹은 Sigma Chemicals(St. Louis, MO) 혹은 Aldrich(Milwaukee, WI)에 의한 카르복시-알킬 포스포네이트; 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC), N-히드록시석신이미드(NHS) 및 에탄올아민(Sigma 혹은 Aldrich); [γ-32P]아데노신 트리포스페이트(ATP)(Pharmaciabiotech, Inc., Piscataway, NJ); 물(Millipore의 Milli-Q 플러스 정제 시스템, Bedford, MA); 합성 올리고뉴클레오티드(Oligos Etc., Inc., Wilsonville, OR); 1-브로모도데카논산(bromododecanoic acid), N,N'-디메틸포름아마이드, 및 트리에틸 포스파이트(Sigma); 옥살릴클로라이드, 디클로로메탄, 무수 에탄올, 및 트리에틸아민(Aldrich); 그리고 Na2HPO4, HaH2PO4, NaCl 그 및 농축 HCl(Fisher, Pittsburgh, PA).
실시예 2
C-12 포스포네이트의 바람직한 제조방법
비록 어떤 포스폰산, 예를 들어, 아미노 프로필 포스폰산 및 2-카르복시 에틸 포스폰산(Sigma 혹은 Aldrich)이 현재 상업적으로 이용가능하다 하여도 11-카르복시운데칸 포스폰산(C-12 포스포네이트)와 같이 탄소수가 더 많은 포스폰산을 사용하는 것이 바람직하다.
C-12 포스포네이트를 다음과 같이 제조하였다: 브로모도데카논산 1.12g(4mmoles)를 50mL 둥근바닥플라스크에서 10mL 디클로로메탄에 용해하였다. 옥실클로라이드(2M, 2ml)를 실온에서 질소분위기 하에서 교반하면서 부가하고, 100μl N,N'-디메틸포름아마이드(DMF)를 부가하여 반응을 개시시켰다. 반응 시작 후, 1,2분 후에, 추가로 DMF 100μL를 용액에 부가하였다. 15분 후에, 디클로로메탄 8mL를 상기 반응 혼합물에 부가하고 15분동안 질소 항에서 교반을 계속하였다. 그리고 나서, 상기 용매를 질소의 흐름으로 염소산 중간체로부터 제거하였다.
상기 염소산 중간체를 즉시 10mL 디클로로메탄에 용해하고, 신속하게 교반하면서 에탄올(350μL) 및 트리에틸아민(835μL)를 부가하였다. pH 종이로 시험 시 상기 용액의 pH는 7과 8사이였다. 상기 용액을 실온에서 한 시간동안 교반하였다. 용매를 증발시켜 제거하고, 그 산물을 10mL 헥산에 용해한 뒤, 10mL 물로 세척하였다. 헥산 상(phase)을 회수하고 증발건조시켜 에틸 에스테르 중간체를 얻었다.
100mL 둥근바닥 플라스크에서 트리에틸 포스파이트(1.5mL)를 상기 에틸에스터 중간체에 부가하고, 상기 용액을 질소 하에서 환류하였다. 1.5시간 후에 트리에틸 포스파이트 1.5mL를 추가로 상기 반응 혼합물에 부가하고 질소 하에서 환류를 4.5시간동안 계속하였다. 상기 반응 혼합물을 약 50℃로 냉각시키고, 농축 HCl13.2mL를 부가하였다. 16시간 동안 환류한 후, 반응 혼합물을 비이커에 피펫으로 옮기고 물 5mL를 부가하였다. 반응혼합물을 실온으로 냉각시키면, 12-포스포도데카논산 산물이 용액으로부터 침전하였다. 상기 산물을 여과하여 수거하고, 물로 세척한 뒤 건조하였다.
실시예 3
전극 상의 단일층 제조
원하는 크기와 모양, 예를 들어 15mm×15mm 사각형으로서 10ohms/square의 저항을 가지며, 2000 Å두께의 SiO2하부층을 갖고 1400-1600Å두께의 ITO층을 갖는 소정의 크기와 모양을 갖는 유리 상의 ITO 전극(Delta Technologies, Stillwater, MN)을 사용 전 세척하고 공기로 건조하였다.
상기 세척하고 건조한 전극을 실온에서 유기용매(예를 들어, 메탄올 혹은 에탄올)에 용해된 선택된 카르복시-알킬 포스포네이트에 노출시켰다. 카르복시-알킬 포스포네이트는 용해성이 매우 좋고 메탄올에서 풍부하게 자가-회합되기 때문에 메탄올이 바람직하였다. 단일층을 형성하기에 바람직한 카르복시-알킬 포스포네이트는 2-5mM로서, 카르복시-알킬 포스포네이트의 농도는 0.1-20mM의 범위였다. 적절한 자가-회합 시간은 3초부터 20시간까지 다양하며, 30분이 현재 바람직하다. 상기 부착되지 않은 카르복시-알킬 포스포네이트를 ITO 전극에서 세 번 세척하여 제거하고 전극을 건조하였다. 포스포네이트가 불충분하다면, 상기 단일층이 빈약하게 배열될 수 있고, 상기 카르복실레이트기는 활성화와 올리고뉴클레오티드 프로브 부착이 쉽지 않다. 단일층이 과도하면 올리고뉴클레오티드로부터 전극 표면으로의 전이금속복합체의 움직임을 억제함으로써 전자수송에 대한 장벽으로서 작용한다. 또한, 과도한 카르복시-알킬 포스포네이트 단일층은 올리고뉴클레오티드 프로브 결합 및 표적 혼성화의 정전기적 억제를 유발할 수 있다.
본 발명의 단일층/ITO 전극으로의 시료의 배치는 예를 들어 전극을 비전도성 면에 표시함으로써, 당해 기술분야에 알려진 바와 같이 표준화되었다.
실시예 4
전극 상의 단일층의 활성화
실시예 3에 따른 단일층을 갖는 ITO 전극을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시석신이미드(NHS) 4:1 몰비로서 활성화/짝짓기 화합물에 노출시켰다. EDC의 농도는 20-400mM 농도의 범위이며, NHS의 농도는 5-100mM의 범위였다. 현재 바람직한 농도는 400mM EDC 및 100mM NHS였다. EDC/NHS 용액 30μl를 각각의 ITO 전극/단일층에 피펫으로 옮기고, 30분동안 실온에서 반응하였다. 상기 비부착된 EDC/NHS를 ITO 전극으로부터 물로 3회 세척하여 없애고 그리고 나서 전극을 공기로 건조시켰다.
실시예 5
DNA 프로브의 부착
3'- 혹은 5'- 말단상에 알킬아민 링커를 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는 상기 활성화된 단일층에 짝지워졌다. 상기 알킬아민의 길이는 적어도 탄소 3개이어야 하며, 바람직하게는 3개에서 12개 탄소의 범위이며, 현재 가장 바람직한 길이는 6개의 탄소이다. 1M NaCl/0.25M NaHCO3, pH 9에서 20 내지 100μM 농도의 올리고뉴클레오티드 프로브(20μL)를 상기 활성화된 단일층에 피펫으로 옮기고 실온(약 25℃)에서 30분간 배양하였다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 용액을 제거하고 상기 전극을 물에 담금으로써 세척한 뒤 0.1M pH7 인산나트륨 완충용액, 1.0M NaCl 및 물로 세척하였다. 상기 단일층으로의 올리고뉴클레오티드 부착의 정도는 상기 반응 혼합물에32P-라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브를 부가함으로써 방사화학적으로 측정할 수 있다.
올리고뉴클레오티드와 반응하지 않은 활성화된 카르복실기는 에탄올아민으로 차단하여 비특이적 표적 결합을 감소시켰다. 상기 전극을 25℃에서 약 20분간 0.1M 에탄올아민에 담궜다. 에탄올아민을 물로 3번 세척하여 전극에서 제거하고 공기로 건조하였다.
상기 올리고뉴클레오티드의 농도, pH, 배양시간, 온도 및 차단제는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것으로서 다양하게 변화할 수 있다.
실시예 6
표적 핵산으로의 전극의 노출
올리고뉴클레오티드 프로브 시퀀스의 일부분과 상보적인 핵산 시퀀스를 갖는 핵산 표적을 상기 프로브와 혼성화 하였다. 현재, 23개의 구아닌을 함유하는 상보적 합성 올리고뉴크레오티드를 사용하고 있다. 상기 표적핵산(0.8M NaCl 및 0.05M NaH2PO4, pH 7.0, 20μl)을 상기 올리고뉴클레오티드 프로브/단일층에 피펫으로 옮기고 한 시간 동안 25℃에서 반응시켰다. 상기 표적핵산 용액을 제거하고 전극을물로 세척한 뒤 0.1M pH7.0 NaH2PO4, 1.0M NaCl, 및 물로 세척하였다. 상기 혼성화 조건은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 다양하게 변할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브에 표적핵산의 혼성화 정도를32P-라벨된 표적 핵산을 상기 혼합물에 부가함으로써 방사화학적으로 평가할 수 있다.
실시예 7
전극의 전기화학
비록 크로노암페로메트리, 크로노쿨로메트리 및 단계 볼타메트리와 같은 전기화학적 조사방법이 또한 유용하다고 하여도, 현재 전기화학적으로 전극을 조사하는 바람직한 방법은 사이클릭 볼타메트리이다. 사이클릭볼타메트리는 각각의 ITO 전극에서 다음과 같이 수행된다. 적절한 스캔속도는 약 50mV/s-5000V/s의 스캔속도를 포함하고, 바람직한 스캔속도는 20V/s이다. 이런 스캔속도에서, 결합된 DNA로부터 최대 신호가 있고, 배경으로부터 최소 신호가 있다. 전위는 처음에는 개시전위를 0 V로 하여 양의 방향으로 하고, 스캔속도에 따라 1.3과 1.8V로 사이로 전위를 바꿨다. 세 개의 전극장비를 사용한다: Ag/AgCl 참조전극, 백금선 보조전극, 및 본 발명에 따른 변형된 ITO 작용전극. 상기 변형된 ITO 전극을 전기화학적 셀 내에 위치시키고, 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0)에 100μM Ru(bpy)3 2+200μL를 상기 변형된 전극 위에 위치시켰다. 상기 완충용액은 NaCl을 함유하고(일반적으로 약 1M 까지 혹은 연구 하에서의 특정 시스템에 대해 바람직하게), 이것이 어떤 경우에는 신호분리를 증가시킨다. 상기 참조전극 및 백금전극은 전기화학적 셀 내에Ru(bpy)3 2+용액과 접촉시켜 위치시켰다. 상기 표본을 조사하고, 데이터를 수집, 저장하고 분석하였다.
실시예 8
단일층 형성 평가
도 1a 및 도 1b는 상기 단일층이 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브의 양(pmol)에 의해 나타나는, 단일층 형성에 대한 자가-회합 시간에의 영향을 보여준다. 도 1a는 2시간까지의 자가회합 시간에 대한 것이고, 도 1b는 90시간까지의 자가회합 시간에 대한 것이다. 단일층에 결합된 올리고뉴클레오티드 프로브의 양은 단일층 형성의 간접적인 측정방법이다. 약 10시간까지의 자가회합시간에 대해 자가회합 시간은 실질적으로 상기 단일층이 뉴클레오티드 프로브에 결합하는 능력에 영향을 미치는 것 같지 않다. 자가-회합 약 20시간 후에, 상기 단일층이 올리고뉴클레오티드와 결합하는 능력은 급속하게 떨어졌다. 단일층에 결합된 올리고뉴클레오티드 프로브의 양은 약 3초에서 10시간까지의 반응시간동안 일정하다는 것이 밝혀졌다.
단일층 형성을 상기 전극이 노출되는 포스페이트 용액의 농도의 함수로서 평가하였다. 이런 평가는 도 2에 나타낸 바와 같이 올리고뉴클레오티드 가닥의 구아닌 pmol당 배경위의 전류(전류 분리)를 조사함으로써 수행된다. 상기 단일층을 2-시간의 자가-회합시간을 이용하여 모든 농도에서 형성하였고 20V/s에서 100μM 농도의 Ru(bpy)3 2+로 사이클릭 볼타메트리를 이용하여 전기화학적 측정을 하였다. 상기전기화학적 반응을 상기 단일층에 결합된 구아닌 pmol 당 배경에 대한 피크 분리의 μA로서 측정하였다. 자가-회합 용액에서의 12-탄소 카르복시-알킬 포스포네이트의 농도는 0.1에서 20mM의 범위였다. 상기 포스포네이트 용액의 효과는 미세했다.
올리고뉴클레오티드가 있는 경우와 없는 경우의 자가-회합된 단일층의 안정성을 평가하였다. 0 일째에 단일층은 ITO 전극 상에서 자가-회합 하였고 구아닌-함유 올리고뉴클레오티드를 전극의 60%에 부착시켰다. 그리고 나서 모든 전극을 냉동 보관하였다. 1, 2, 3, 6 및 7일째, 다섯 개의 전극(2개는 단일층만 있고, 3개는 단일층과 올리고뉴클레오티드가 결합된 것)을 선택하여 전기화학적으로 분석하여 생성된 신호를 결정하였다.
20V/s에서 100μM 농도의 Ru(bpy)3 2+로 사이클릭 볼타메트리를 이용하여 전기화학적 측정을 하였다. 상기 표본을 평가하여, 전극에 결합된 올리고뉴클레오티드 가닥에서의 구아닌의 pmol당 배경위에 생성된 신호(전류) μA를 결정하였다. 7일이 넘도록 전기화학적 반응 상에 알아볼 수 있는 변화가 없었으며, 그러므로 상기 단일층은 이런 조건 하에서 7일이 넘게 안정함이 밝혀졌다(도 3).
실시예 9
단일층의 사이클릭 볼타모그램
도 4는 다양한 양으로 부착된 구아닌-함유 올리고뉴클레오티드를 갖는 자가-회합된 단일층 전극의 용량에 따른 반응을 보여준다. 상기 단일층에 짝지워진 올리고뉴클레오티드의 양은 각 전극 당 0.008 내지 0.466pmol의 올리고뉴클레오티드 가닥의 범위였다. 상기 올리고뉴크레오티드는 가닥 당 23구아닌을 갖는 합성 34-mer였다. 20V/s에서 100μM 농도의 Ru(bpy)3 2+로 사이클릭 볼타메트리를 이용하여 전기화학적 측정을 하였다. 이 도면은 부착된 올리고뉴클레오티드의 양을 달리하는 단일층 사이를 차별화 할 수 있다는 것을 보여준다. 신호(전류)는 각각의 전극에서의 구아닌 숫자에 비례한다.
도 5는 도 4를 그래프로 다시 표현한 것으로서, 여기서는 각 전극에서의 올리고뉴클레오티드 가닥 상의 구아닌의 pmol에 대한 배경의 신호 μA를 도시하였다. 다양한 양의 올리고뉴클레오티드를 갖는 단일층을 제조하고 상기 전기화학적 반응(배경에 대한 피크 분리의 μA)을 측정하고, 단일층에 부착된 올리고뉴클레오티드에서의 구아닌의 양(pmol)의 함수로 도시하였다. 상기 그래프는 전기화학적 반응과 구아닌의 양 사이의 직접적인 상관관계를 보여준다.
실시예 10
카르복시-알콜 포스포네이트를 경유하여 올리고뉴클레오티드를 고정하는 대체적인 방법
부착된 올리고뉴클레오티드를 갖는 자가-회합 단일층을 형성하는 대체적인 방법은 카르복시-알킬 포스포네이트를 자가-회합 단일층의 형성 전에 올리고뉴클레오티드에 짝지우는 것이다. 3'- 혹은 5'- 말단에 알킬아민을 갖는 올리고뉴크레오티드를 0.005-1mM 카르복시-알킬 포스포네이트, 0.2M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 0.05M N-히드록시석신이미드(NHS)를 함유하는 디메틸설폭사이드 용액에 부가하였다. 반응 혼합물의 최종 부피를 100-200μl로 하였고 올리고뉴클레오티드의 농도는 20μM로 하였다. 상기 반응 혼합물을 25℃에서 6-8시간동안 배양하였다. 전극으로의 올리고뉴클레오티드-포스포네이트 부착의 정도를 정량하고자 하는 경우, 방사성동위원소로 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 카르복시-알킬 포스포네이트 올리고뉴크레오티드 접합체를 함유하는 상기 반응 혼합물(20μl)를 ITO 유리전극 상에 피펫으로 옮기고 2-4시간 동안 25℃에서 배양하여 단일층을 형성하도록 하였다. 상기 부착된 물질을 제거하고 상기 전극을 순차적으로 물, 0.1M NaH2PO4, pH 7.0, 1.0M NaCl 및 물로 세척하였다.
일반적으로, 카르복시-알킬 포스포네이트를 올리고뉴클레오티드에 짝지우는 방법은 올리고뉴클레오티드에 부착된 카르복시-알킬포스포네이트기를 하나 이상 갖고, 그 주요 부착부위는 올리고뉴클레오티드의 3'- 혹은 5'-말단 상의 알킬아민이고, 염기의 다른 엑소사이클릭 아민이 카르복시-알킬포스포네이트의 두 번째 부착부위로서 작용하는 불균일한 산물을 생산한다. ITO 전극으로의 부착 및 표적 핵산분자의 혼성화는 얼마나 많은 카르복시-알킬 포스포네이트기가 올리고뉴클레오티드에 존재하는가에 의해 영향받을 수 있다.
차단된 엑소사이클릭 아미노기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 단지 하나의 카르복시-알킬 포스포네이트가 5'- 혹은 3'-말단의 알킬아민을 경유하여 각각의 올리고뉴크레오티드에 부착된 올리고뉴클레오티드-포스포네이트 산물을 제조하는데 다른 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 수성-비수성 용매 혼합물에서의 카르보디이미드는 합성 후 유리 비드 상에 고정된 올리고뉴클레오티드에 카르복시-알킬 포스포네이트를 짝지우는데 사용될 수 있고 여전히 보호기를 엑소사이클릭 아민 상에 보유한다. 카르복실-알킬 포스포네이트의 접합 후에 상기 반응물을 쉽게 세척하여 순수한 산물을 생산할 수 있다.
상기 순수한 카르복시-알킬 포스포네이트 올리고뉴클레오티드 접합체는 우선 85-100% 디메틸 설폭사이드에 용액함으로써 바람직하게 ITO 전극에 부착하였다. 유리 카르복시-알킬 포스포네이트를 상기 용액에 부가하여 5μM-5mM의 농도를 갖는 알킬 포스포네이트 용액을 제조하였다. 이 혼합물(20μl)을 ITO 유리전극 상에 피펫으로 옮기고, 2-4시간 25℃에서 배양하여 단일층이 형성하도록 하였다. 부착되지 않은 물질은 제거하고, 전극을 순차적으로 물, 0.1M 인산나트륨, pH7.0, 1.0M NaCl, 및 물로 세척하였다.
본 발명은 구체적인 예를 들어 설명하였지만, 수많은 변화, 변형, 및 구체예가 가능하고, 따라서 모든 그러한 변화, 변형 및 구체예는 본 발명의 정신과 영역 내에 있다는 것을 알아야 할 것이다.
Claims (120)
- (a) 그 위에 전도성 작용 표면을 갖는 기질; 및(b) 상기 전도성 작용표면 상의 비전도성 자가-회합 단일층을 포함하며, 상기 단일층은 최소한 적어도 하나의 포스포네이트기 및 결합쌍 멤버에 공유결합한 적어도 하나의 R1기를 갖는 포스포네이트 분자를 포함하며, 상기 포스포네이트 단일층을 통해 전이금속복합체가 단일층에 고정된 반응물로부터 전도성 작용표면으로 자유롭게 이동하여 전자를 전도성 작용표면에 수송시킬 수 있는 전극.
- 제 1 항에 있어서, 유기 스페이서기 R2가 포스포네이트기 및 R1기 사이에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 2 항에 있어서, 상기 R2는 (CH2)11을 포함하는 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 1 항에 있어서, 상기 포스포네이트 분자는 카르복시-알킬 포스포네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 4 항에 있어서, 상기 카르복시-알킬 포스포네이트는 11-카르복시운데칸 포스폰산인 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전도성 표면은 ITO 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 1 항에 있어서, 상기 R1기는 자가-회합 단일층의 형성 전에 상기 결합쌍 멤버에 짝지워지는 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 1 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버는 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)를 포함하는 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 1 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버는 단백질-결합 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 9 항에 있어서, 상기 단백질-결합 물질은 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 1 항에 있어서, 상기 R1기는 결합제(coupling agent)로 활성화되는 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 11 항에 있어서, 상기 결합제는 카르보디이미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 전극.
- 제 1 항에 있어서, 상기 기질은 금속 기질 및 비금속 기질로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 전극.
- (a) 액체표본을 보유하는 표본 용기;(b) 위에 전도성 작용 표면을 갖는 기질; 및 단일층은 최소한 적어도 하나의 포스포네이트기 및 결합쌍 멤버에 공유결합한, 적어도 하나의 R1기를 갖는 포스포네이트 분자를 포함하며, 단일층을 통해 전이금속복합체가 고정된 반응물로부터 전도성 작용표면으로 자유롭게 이동하여 전자를 전도성 작용표면에 수송시킬 수 있는, 상기 전도성 작용표면상의 비전도성 자가-회합 단일층을 포함하는 전극; 및(c) 상기 전극과 전자적 연락이 이루어지는 포텐시오스탓을 포함하는 장치.
- 제 14 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버가 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제 14 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버는 단백질-결합 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 적어도 하나의 포스포네이트기 및 결합쌍의 멤버에 공유적으로 결합한 R1기를 적어도 하나 갖는 포스포네이트 분자를 포함하는 기질상의 비전도성 자가-회합 단일층.
- 제 17 항에 있어서, 유기 스페이서기 R2가 포스포네이트기 및 R1기 사이에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 18 항에 있어서, 상기 R2가 (CH2)11을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 17 항에 있어서, 상기 포스포네이트 분자가 카르복시-알킬 포스포네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 20 항에 있어서, 상기 카르복시-알킬 포스포네이트가 11-카르복시운데칸 포스폰산인 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 17 항에 있어서, 상기 기질이 ITO 표면을 포함하는 전도성 작용표면을 갖는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 17 항에 있어서, 상기 R1기가 자가-회합 단일층의 회합 전에 결합쌍 멤버에 짝지워지는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 17 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버가 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 17 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버가 단백질-결합 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 25 항에 있어서, 상기 단백질-결합 물질이 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 17 항에 있어서, 상기 R1기가 상기 결합쌍 멤버에 공유결합하기 전에 결합제로 활성화되는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 27 항에 있어서, 상기 결합제가 카르보디이미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- 제 17 항에 있어서, 상기 기질이 금속기질 및 비금속기질로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자가-회합 단일층.
- (a) 단일층은 최소한 적어도 하나의 포스포네이트기 및 결합쌍 멤버에 공유결합한 적어도 하나의 R1기를 갖는 포스포네이트 분자를 포함하며, 단일층을 통해 전이금속복합체가 단일층에 고정된 반응물로부터 전도성 작용표면으로 자유롭게 이동하여 전자를 전도성 작용표면에 수송시킬 수 있는, 전도성 작용표면을 갖는 전극상의 비전도성 자가-회합 단일층을 산화-환원 반응에서 산화될 수 있는 라벨-표지 표적을 함유한다고 의심되는 표본과 접촉시켜서, 결합쌍의 고정된 멤버와 존재한다면 상기 표적이 상기 단일층상에 표적 복합체를 형성하는 단계;(b) 상기 단일층과 존재한다면 상기 표적 복합체를 산화-환원 반응에서 라벨-표지 표적을 산화시킬 수 있는 전이금속복합체와 접촉시키는 단계;(c) 산화-환원 반응을 검출하는 단계; 및(d) 상기 검출된 산화-환원 반응으로부터 표적의 존재유무를 결정하는 단계를 포함하는, 표본에서의 라벨-표지 표적의 존재를 결정하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 전이금속복합체는 Ru(bpy)3 2+이고 상기 검출된 산화-환원 반응은 구아닌 산화인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 유기 스페이서기 R2는 포스포네이트기와 R1기 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, 상기 R2는 (CH2)11을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 포스포네이트 분자는 카르복시-알킬 포스포네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34 항에 있어서, 상기 카르복시-알킬 포스포네이트는 11-카르복시운데칸 포스폰산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 라벨-표지 표적은 핵산, 단백질 및 탄수화물로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 전도성 작용 표면은 ITO 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30항에 있어서, 상기 라벨-표지 표적은 구아닌을 함유하는 핵산이고 상기 고정된 결합쌍 멤버는 상기 표적과 혼성화하여 혼성화된 표적 복합체를 생성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 38 항에 있어서, 상기 자가-회합 단일층을 상기 표적과 접촉시키기 전에 상기 표적 핵산을 증폭하여 증폭된 핵산 용액을 생산하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39 항에 있어서, 상기 증폭을 중합효소연쇄반응, 가닥이동증폭(strand displacement amplification), 연결효소연쇄반응(ligase chain reaction), 및 핵산 시퀀스-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification)으로 구성된 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버가 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것을 특징을 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버가 단백질-결합 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 42 항에 있어서, 상기 단백질-결합 물질은 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 표본은 합성 혹은 천연 올리고뉴클레오티드, 외과적 표본, 의학적 진단에 사용되는 표본, 유전학적 검사에 사용되는 표본, 환경적표본, 세포 배양물 표본, 음식 표본, 치과적 표본 및 수의학적 표본으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 단계 (a)전에 R1기가 결합쌍 멤버에 공유결합하고 그리고 나서 그 결과물인 포스포네이트 분자를 상기 전극에 적용시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 전도성 작용 표면을 갖는 전극과 최소한 적어도 하나의 포스포네이트기와 R1기가 결합쌍 멤버에 공유결합되어 있거나 결합쌍 멤버에 공유결합할 수 있는 R1기를 적어도 하나 갖고 있는 포스포네이트 분자를 접촉시켜서, 상기 전극상에 상기 단일층을 통해서 전이금속 복합체가 상기 단일층에 고정된 반응물로부터 상기 전도성 작용표면으로 자유롭게 이동하여 상기 전도성 작용표면에 전자를 수송할 수 있는 비전도성 자가-회합된 단일층을 형성하는 단계;(b) 상기 R1기가 아직 결합되어 있지 않다면 R1기를 결합제로 활성화 시키고 그 활성화된 R1기를 표적과 결합할 수 있는 결합쌍 멤버와 접촉시킴으로써 결합쌍 멤버에 R1기를 결합시켜서, 결합쌍 멤버를 고정하는 단계;(c) 그 위에 고정된 결합쌍 멤버를 갖는 상기 자가-회합 단일층을 산화-환원 반응에서 산화될 수 있는 라벨-표지 표적을 함유한다고 의심되는 표본과 접촉시켜서, 상기 고정된 결합쌍 멤버와 상기 표적이 상기 단일층 상에 표적 복합체를 형성하는 단계;(d) 상기 단일층과 존재한다면 상기 표적 복합체를 산화-환원 반응에서 라벨-표지 표적을 산화할 수 있는 전이금속 복합체와 접촉시키는 단계;(e) 상기 산화-환원 반응을 검출하는 단계;(f) 상기 검출된 산화-환원 반응으로부터 상기 표적의 존재유무를 결정하는 단계를 포함하는, 표본에서의 라벨-표지 표적의 존재를 결정하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 상기 전이금속 복합체가 Ru(bpy)3 2+이고 상기 검출된 산화-환원 반응이 구아닌 산화인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 유기 스페이서기 R2가 포스포네이트기 및 R1기 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 48 항에 있어서, 상기 R2가 (CH2)11을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 상기 포스포네이트 분자는 카르복시-알킬 포스포네이트기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 50 항에 있어서, 상기 카르복시-알킬 포스포네이트는 11-카르복시운데칸 포스폰산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 상기 라벨-표지 표적은 핵산, 단백질 및 탄수화물로 구성된 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 상기 전도성 작용 표면은 ITO 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 상기 라벨-표지 표적은 구아닌을 함유하는 핵산이고 상기 고정된 결합쌍 멤버는 상기 표적과 혼성화하여 혼성화된 표적 복합체를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 54 항에 있어서, 상기 자가-회합 단일층을 상기 표적과 접촉시키기 전에 상기 표적 핵산을 증폭시켜서 증폭된 핵산 용액을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 55 항에 있어서, 상기 증폭은 중합효소연쇄반응, 가닥이동증폭(strand displacement amplification), 연결효소연쇄반응(ligase chain reaction), 및 핵산 시퀀스-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification)으로 구성된 그룹중에서 선택된 방법에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버가 단백질-결합 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 58 항에 있어서, 상기 단백질-결합 물질이 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 상기 결합제는 카르보디이미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 상기 표본은 합성 혹은 천연 올리고뉴클레오티드, 외과적 표본, 의학적 진단에 사용되는 표본, 유전학적 검사에 사용되는 표본, 환경적 표본, 세포 배양물 표본, 음식 표본, 치과적 표본 및 수의학적 표본으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 전도성 작용 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계;(b) 자가-회합 단일층이 비전도성이고 전이금속 복합체가 단일층을 통해 단일층에 고정된 반응물로부터 전도성 작용표면으로 자유롭게 이동하여 전도성 작용표면에 전자를 수송할 수 있는, 최소한 적어도 하나의 포스포네이트기 및 결합쌍 멤버와 공유결합할 수 있는 적어도 하나의 R1기를 갖는 포스포네이트 분자를 제공하는 단계;(c) 상기 기질을 상기 포스포네이트 분자와 접촉시켜서 자가-회합 단일층을 형성시키는 단계를 포함하는, 전극상에 자가-회합 단일층을 제조하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 유기 스페이서기 R2는 포스포네이트기 및 R1기 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 63 항에 있어서, 상기 R2는 (CH2)11을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 포스포네이트 분자는 카르복시-알킬 포스포네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 65 항에 있어서, 상기 카르복시-알킬 포스포네이트는 11-카르복시운데칸 포스폰산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 전도성 작용 표면은 ITO 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 R1기를 상기 자가-회합 단일층이 형성되기 전에 결합쌍 멤버에 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버는 단백질-결합 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 70 항에 있어서, 상기 단백질-결합 물질은 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, R1기를 결합제로 활성화시키는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 72 항에 있어서, 상기 결합제는 카르보디이미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 전도성 작용 표면을 갖는 전극을 제공하는 단계;(b) 상기 표면을, 상기 표면상에 비전도성 자가-회합 단일층의 형성에 도움이 되는 조건 하에서, 최소한 적어도 하나의 포스포네이트기 및 결합쌍 멤버과 공유결합할 수 있는 적어도 하나의 R1기를 갖는 선택된 포스포네이트 분자에 노출시켜서, 그 포스포네이트 단일층을 통해서 전이금속 복합체가 단일층에 고정된 반응물로부터 전도성 작용표면으로 자유롭게 이동하여 전도성 작용표면으로 전자를 수송할 수 있게 하는 단계;(c) 상기 R1기를 결합제로 활성화시키는 단계; 및(d) 상기 자가-회합된 단일층을 상기 결합쌍 멤버와 접촉시키는 단계를 포함하는 전극 표면상에 결합쌍 멤버를 고정시키는 방법.
- 제 74 항에 있어서, 유기 스페이서기 R2는 포스포네이트기 및 R1기의 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 75 항에 있어서, 상기 R2는 (CH2)11을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 74 항에 있어서, 상기 포스포네이트 분자가 카르복시-알킬 포스포네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 77 항에 있어서, 상기 카르복시-알킬 포스포네이트는 11-카르복시운데칸 포스폰산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 77 항에 있어서, 상기 전도성 작용 표면은 ITO 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 74 항에 있어서, 상기 R1기를 상기 자가-회합 단일층 형성 전에 결합쌍 멤버에 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 74 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 74 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버는 단백질-결합 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 82 항에 있어서, 상기 단백질-결합 물질은 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 74 항에 있어서, 상기 결합제는 카르보디이미드이미드는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 전도성 작용 표면을 갖는 전극 상에, 최소한 적어도 하나의 포스포네이트기 및 올리고뉴클레오티드 프로브에 공유결합한 적어도 하나의 R1기를 갖는 포스포네이트 분자를 포함하는 단일층, 그 단일층을 통해 전이금속 복합체가 단일층에 고정된 복합체로부터 전도성 작용표면으로 자유롭게 이동하여 전도성 작용표면에 전자를 수송시킬 수 있는, 비-전도성 자가-회합 단일층을 제공하는 단계;(b) 위에 고정된 올리고뉴클레오티드 프로브를 갖는 자가-회합 단일층을 산화-환원 반응에서 산화될 수 있는 표적 핵산을 함유한다고 의심되는 표본과 접촉시켜서, 고정된 올리고뉴클레오티드 프로브 및 존재한다면 표적 핵산이 단일층 위에서 표적 복합체를 형성하도록 하는 단계;(c) 상기 단일층 및 존재한다면 표적 복합체를 산화-환원 반응에서 표적 핵산을 산화시킬 수 있는 전이금속 복합체와 접촉시키는 단계;(d) 상기 산화-환원 반응을 검출하는 단계; 및(e) 상기 표적 핵산의 존재 여부를 상기 산화-환원 반응으로부터 결정하는 단계를 포함하는 표본에서의 표적 핵산의 존재를 결정하는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 상기 전이금속 복합체는 Ru(bpy)3 2+이고 구아닌 산화가검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 유기 스페이서기 R2는 포스포네이트기 및 R1기 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 87 항에 있어서, 상기 R2는 (CH2)11을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 상기 포스포네이트 분자는 카르복시-알킬 포스포네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 89 항에 있어서, 상기 카르복시-알킬 포스포네이트는 11-카르복시운데칸 포스폰산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 상기 전도성 작용 표면은 ITO 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 상기 R1기를 자가-회합 단일층 형성 전에 결합쌍 멤버에 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 상기 자가-회합된 단일층을 상기 표적과 함께 접촉시키기 전에 상기 표적 핵산을 증폭시켜 증폭된 핵산용액을 형성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 93 항에 있어서, 상기 증폭은 상기 증폭을 중합효소연쇄반응, 가닥이동증폭(strand displacement amplification), 연결효소연쇄반응(ligase chain reaction), 및 핵산 시퀀스-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification)으로 구성된 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 상기 표본은 합성 혹은 천연 올리고뉴클레오티드, 외과적 표본, 의학적 진단에 사용되는 표본, 유전학적 검사에 사용되는 표본, 환경적 표본, 세포 배양물 표본, 음식 표본, 치과적 표본 및 수의학적 표본으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 전도성 작용 표면을 갖는 전극 상에, 최소한 적어도 하나의 포스포네이트기 및 단백질-결합 물질에 공유결합한 적어도 하나의 R1기를 갖는 포스포네이트 분자를 포함하는 단일층, 그 단일층을 통해 전이금속 복합체가 단일층에 고정된 복합체로부터 전도성 작용표면으로 자유롭게 이동하여 전도성 작용표면에 전자를 수송시킬 수 있는, 비-전도성 자가-회합 단일층을 제공하는 단계;(b) 위에 고정된 단백질-결합 물질을 갖는 자가-회합 단일층을 표적 단백질을 함유한다고 의심되는 표본과 접촉시키는 단계;(c) 만약 존재한다면, 상기 단일층에 결합된 상기 표적 단백질을 산화-환원 반응에서 산화될 수 있는 라벨을 결합시킨 제 2 단백질-결합물질과 접촉시켜서 단백질-결합물질 및 존재한다면 표적 단백질이 단일층상에 표적 복합체를 형성하는 단계;(d) 상기 단일층 및 존재한다면 표적 복합체를 산화-환원 반응에서 라벨을 산화시킬 수 있는 전이금속 복합체와 접촉시키는 단계;(e) 상기 산화-환원 반응을 검출하는 단계; 및(f) 상기 표적 단백질의 존재 여부를 상기 검출된 산화-환원 반응으로부터 결정하는 단계를 포함하는, 표본에서의 표적 핵산의 존재를 결정하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 상기 라벨은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 상기 단백질-결합 물질은 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 유기 스페이서기 R2는 상기 포스포네이트기 및 상기 R1기 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 99 항에 있어서, 상기 R2는 (CH2)11을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 상기 포스포네이트 분자는 카르복시-알킬 포스포네이트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 101 항에 있어서, 상기 카르복시-알킬 포스포네이트는 11-카르복시운데칸 포스폰산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 상기 전도성 작용 표면은 ITO 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 상기 표본은 합성 혹은 천연 올리고뉴클레오티드, 외과적 표본, 의학적 진단에 사용되는 표본, 유전학적 검사에 사용되는 표본, 환경적 표본, 세포 배양물 표본, 음식 표본, 치과적 표본 및 수의학적 표본으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 전도성 작용 표면을 갖는 전극 상에, 최소한 적어도 하나의 포스포네이트기 및 단백질-결합 물질에 공유결합한 적어도 하나의 R1기를 갖는 포스포네이트분자를 포함하는 단일층, 그 단일층을 통해 전이금속 복합체가 단일층에 고정된 복합체로부터 전도성 작용표면으로 자유롭게 이동하여 전도성 작용표면에 전자를 수송시킬 수 있는, 비-전도성 자가-회합 단일층을 제공하는 단계;(b) 위에 고정된 단백질-결합 물질을 갖는 자가-회합 단일층을 산화-환원 반응에서 산화될 수 있는 라벨을 부착시킨 표적 단백질을 함유한다고 의심되는 표본과 접촉시켜서, 고정된 단백질-결합 물질 및 존재한다면 표적단백질이 단일층 위에서 표적 복합체를 형성하도록 하는 단계;(c) 상기 단일층 및 존재한다면 상기 표적 복합체를 산화-환원 반응에서 라벨을 산화시킬 수 있는 전이금속 복합체와 접촉시키는 단계;(d) 상기 산화-환원 반응을 검출하는 단계; 및(e) 상기 표적 단백질의 존재 여부를 상기 검출된 산화-환원 반응으로부터 결정하는 단계를 포함하는, 표본에서의 표적 핵산의 존재를 결정하는 방법.
- 제 105 항에 있어서, 상기 라벨은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 105 항에 있어서, 상기 단백질-결합 물질은 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 105 항에 있어서, 유기 스페이서기 R2는 상기 포스포네이트기 및 상기 R1기 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 108 항에 있어서, 상기 R2는 (CH2)11을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 105 항에 있어서, 상기 포스포네이트 분자는 카르복시-알킬 포스포네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 110 항에 있어서, 상기 카르복시-알킬 포스포네이트는 11-카르복시운데칸 포스폰산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 105 항에 있어서, 상기 전도성 작용 표면은 ITO 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 최소한 적어도 하나의 포스포네이트기와 결합쌍 멤버에 공유결합된 적어도 하나의 R1기를 갖는 포스포네이트 분자.
- 제 113 항에 있어서, 유기 스페이서기 R2는 상기 포스포네이트기 및 상기 R1기 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 포스포네이트 분자.
- 제 114 항에 있어서, 상기 R2는 (CH2)11을 포함하는 것을 특징으로 하는 포스포네이트 분자.
- 제 113 항에 있어서, 포스포네이트 분자는 카르복시-알킬 포스포네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 포스포네이트 분자.
- 제 116 항에 있어서, 상기 카르복시-알킬 포스포네이트는 11-카르복시운데칸 포스폰산인 것을 특징으로 하는 포스포네이트 분자.
- 제 113 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 포스포네이트 분자.
- 제 113 항에 있어서, 상기 결합쌍 멤버는 단백질-결합 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 포스포네이트 분자.
- 제 119 항에 있어서, 상기 단백질-결합 물질은 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 포스포네이트 분자.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PA0105 | International application |
Patent event date: 20011020 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
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Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20040312 Comment text: Request for Examination of Application |
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| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20051128 Patent event code: PE09021S01D |
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| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20060308 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20051128 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |