KR20090051063A

KR20090051063A - 항체 매개된 신경병증의 치료를 위한 방법과 조성물

Info

Publication number: KR20090051063A
Application number: KR1020097004369A
Authority: KR
Inventors: 수잔 할스테드; 휴 윌슨; 러셀 피. 로데르
Original assignee: 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드
Priority date: 2006-09-05
Filing date: 2007-09-05
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2027-09-05
Also published as: DK2061810T3; EP3199549A1; HK1126793A1; EP2380907B1; WO2008030505A2; EP2061810B1; MX2009002426A; CA2662480A1; SI2061810T1; JP2010502708A; BRPI0715869A2; EP2061810A2; WO2008030505A3; US20100143343A1; ES2530428T3; JP2014240438A; CA2662480C; IL197148A; ES2616204T3; KR101503540B1

Abstract

항체 매개된 신경병증을 치료하기 위한, 보체를 저해할 수 있는 치료제(therapeutic agent), 예를 들면, 항-C5 항체의 용도가 개시된다.

항-C5 항체

Description

항체 매개된 신경병증의 치료를 위한 방법과 조성물{Methods and Compositions for the Treatment of Antibody Mediated Neuropathies}

관련된 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2006년 9월 5일 제출된 U.S. 가출원 No. 60/842,296에 우선권을 주장하는데, 이는 순전히 참조로서 편입된다.

본 발명의 기술 분야

본 출원은 신경 손상을 유발하는 보체(complement)를 활성화시키는 항체 매개된 신경병증(antibody mediated neuropathy)의 치료를 위한 방법과 조성물을 제시한다. 특정 구체예에서, 본 출원은 항체 매개된 신경병증을 치료하는 치료제(therapeutic agent)로서 보체 캐스케이드 저해물질(complement cascade inhibitor)의 용도에 관계한다.

신경병증(neuropathy)은 말초 신경계(peripheral nervous system)의 질병을 기술하는데 이용되는 속명(generic term)이다. 말초 신경병증(peripheral neuropathy)을 유발하는 대략 200가지의 상이한 원인이 알려져 있다. 대부분의 신경병증은 3가지 주요 종류의 신경 섬유(nerve fiber) 모두에 다양한 정도로 영향을 주지만, 일부 질환은 1가지 또는 2가지의 신경 섬유에만 연루되고, 따라서 순수하 게 또는 우세하게 운동 신경병증(motor neuropathy), 감각 신경병증(sensory neuropathy), 또는 자율 신경병증(autonomic neuropathy)으로 불린다.

귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome, GBS)은 캄필로박터(Campylobacter) 장염(enteritis)을 비롯하여, 독감-유사 질환(flu-like disease) 또는 다른 감염후 2주 내지 3주 시점에 통상적으로 발생하는 말초 신경계(peripheral nervous system)의 급성 질환이다. 상기 질환은 대개는 운동 신경병증인데, 이는 그 증상이 운동 신경(motor nerve)의 연루(involvement)에 거의 관련된다는 것을 의미한다. 상기 질환의 근본적인 운동 특성(motor nature)에도 불구하고, 최초의 증상은 하지(lower extremities)에서 느껴지는 무감각(numbness)과 저림(tingling)이고, 그 직후에, 하지의 원위 근육(distal muscle)의 약화가 뒤따른다. 이러한 약화가 호흡 근육에 연루되면 위험해진다. GBS는 광범위한 특정의 당지질 구조(glycolipid structure)에 대한 항-갱글리오사이드 자가항체(anti-ganglioside autoantibody, AGA) 및 일부 사례에서, 미엘린 단백질(myelin protein)과 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)을 비롯한 다른 신경 성분(nerve component)에 대한 항체를 동반하는 사례의 비율에서 연관되고, 다른 GBS 사례에서는 항체가 존재하는 것으로 추정되지만 아직 공식적으로 확인되지는 않았다.

밀러 피셔 증후군(Miller Fisher syndrome, MFS)은 귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)의 변종이며, 사례 중에서 5-10%를 차지한다. 한 조사에서, 연간 발생률(annual incidence)은 100,000명당 0.09명인 것으로 추정된다. MFS는 눈 근육 마비(ophthalmoplegia), 운동실조(ataxia)와 무반사(areflexia)의 급성 발병(acute onset)으로 특징된다. 항-GQ1b 갱글리오사이드 항체는 MFS의 혈청학적 증표(serological hallmark)이다. 상기 항체는 일부 사례에서, 캄필로박터(Campylobacter) 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)와 분자 유사성(molecular mimicry)을 통하여 발생한다. 현재, MFS 환자의 90% 이상이 상기 질환의 급성 단계(acute phase) 동안 항-GQ1b IgG 항체를 보유하는 것으로 받아들여지고 있다. 정상적인 대조군(control group)과 다른 질병 대조군으로부터 항-GQ1b IgG 항체의 완전한 부재가 동등하게 유의한데, 이는 이러한 질병 연관(disease association)에 대한 높은 수준의 특이성(specificity)을 지시한다. 이들 항체 역가(antibody titer)는 임상적 출현(clinical presentation)에서 최대가 되고, 임상적 회복(clinical recovery) 과정 동안 급속하게 약화된다. 항-GQ1b IgG 항체 역가 역시 눈 근육 마비를 동반하는 귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)을 앓는 일부 환자의 급성 단계 혈청(acute phase serum)에서 상승한다. 항-GQ1b IgG 항체 마커 역시, 외부 눈 근육 마비 또는 소뇌성-유사 운동실조(cerebellar-like ataxia)의 존재를 공통적으로 나타내는, 부전형(formes fruste)의 MFS로 종종 간주되는 한 무리의 밀접하게 관련된 증후군을 판정한다.

AGA-매개된 사례를 비롯한 GBS에 대한 현재의 치료는 정맥내 면역글로불린(intravenous immunoglobulin, IVI), 혈장 교체(plasma exchange), 또는 둘 모두의 조합이다. GBS와 같은 일부 신경병증은 통상적으로 자기-제한적 질환(self-limiting illness)이지만, 집중 치료 개입(intensive therapeutic intervention)이 종종 요구된다. 일부 개체는 잔여 장애(residual deficit)가 남는다. 다른 신경병증은 만성이고, 통증과 같은 증상만 치료된다. 항체 매개된 신경병증의 증상을 향상시키고 이의 회복 시간(recovery time)을 감소시키는 추가적인 치료제가 절실하게 요구된다.

본 발명의 요약

항체-매개된 신경병증(antibody mediated neuropathy)으로 고통받는 환자를 치료하기 위한 방법과 조성물이 제시된다. 특정 구체예에서, 포유동물에서 항체 매개된 신경병증을 치료하는 방법이 제시되는데, 상기 방법은 보체 캐스케이드 저해물질(complement cascade inhibitor)의 치료 효과량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다.

다수의 신경병증에서, 신경의 특정 성분에 대한 항체가 확인되었다. 이들 질환 중에서 일부, 예를 들면, 귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)의 밀러 피셔 변종(Miller Fisher variant)은 항-갱글리오사이드 자가항체와 항-당지질 자가항체에 의해 매개된다. GM1, GM1(NeuGc), GM1b, GalNAc-GM1b, GD1a, GalNAc-GD1a, GD1b, 9-O-아세틸 GD1b, GD3, GT1a, GT1b, GQ1b, GQ1bα, LM1, 갈락토세레브로시드(galactocerebroside)와 SGPG를 비롯한 광범위한 당지질에 대한 항체가 증례 보고서(case report)로서 또는 연속간행물로서, 염증성 신경병증(inflammatory neuropathy)에 대한 논문에서 보고되었다. 전형적인 구체예에서, 포유동물에서 AGA 매개된 신경병증을 치료하는 방법은 보체 캐스케이드 저해물질, 예를 들면, 항-C5 항체의 치료 효과량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다.

단백질과 당단백질(glycoprotein)을 비롯한 다른 신경 성분에 대한 항체 역시 신경병증에서 원인이 되는 것으로 보고되었다. 가령, 미엘린-연결된 당단백질(myelin-associated glycoprotein)에 대한 단클론 IgM은 항-MAG IgM 파라프로테인성 신경병증을 유발한다(Willison and Yuki, Brain, 2002, 125, 2591-2625). 신경병증 사례의 비율에서, 항체는 항체-연관된 사례에서 볼 수 있는 바와 같이 유사한 병리학적 패턴(pathological pattern)과 치료 반응(treatment response)으로 인하여 존재할 것으로 추정되지만, 이러한 추정된 항체의 특이성(specificity)은 아직 공식적으로 확인되지 않았다. 특정 구체예에서, 항체 매개된 신경병증은 급성 운동성 축삭 신경병증(acute motor axonal neuropathy), 급성 염증성 탈수초성 다발신경병증(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy), Bickerstaff 뇌간뇌염(Bickerstaff's brainstem encephalitis), 급성 외안근마비(acute ophthalmoparesis), 운동실조성 귈레인 바레 증후군(ataxic Guillain-Barre syndrome), 인두-경부-팔 약화(pharyngeal-cervical-brachial weakness), 항-당지질 항체를 동반하는 만성 신경병증 증후군(chronic neuropathy syndrome), 항-MAG IgM 파라프로테인성 신경병증(paraproteinemic neuropathy), 항-디시알로실 항체(anti-disialosyl antibody)를 동반하는 만성 감각성 운동실조성 신경병증(chronic sensory ataxic neuropathy), IgM, IgG와 IgA 파라프로테인성 신경병증(paraproteinemic neuropathy), 항-GM1과 항-GM2 항체를 동반하는 운동 신경병증(motor neuropathy), 만성 염증성 탈수초성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating neuropathy, CIDP), 다초점성 운동 신경병증(multifocal motor neuropathy, MMN), 또는 다초점성 후천성 탈수초성 감각과 운동 신경병증(multifocal acquired demyelinating sensory and motor neuropathy, MADSAM) 중에서 한 가지 이상이다.

일부 신경병증, 예를 들면, 유전성 아밀로이드 신경병증(hereditary amyloid neuropathy)에서, 보체의 활성화는 항체-의존성이다. 상기 질환에서, 초기 고전 경로 활성화 마커(early classical pathway activation marker), C1q와 C4는 탐지가능 항체의 부재에서 아밀로이드 침착(amyloid deposit)에서 탐지되었다(Hafer-Macko et al., J Peripher Nerv Syst. 2000 Sep;5(3):131-9; 본 명세서에 참조로서 편입됨). 이는 고전 경로의 항체-의존성 활성화가 진행될 수 있고, 보체 캐스케이드 저해물질이 항체-독립성, 보체 매개된 신경병증을 치료하는데 효과적일 수 있음을 암시한다. 전형적인 구체예에서, 포유동물에서 항체-독립성, 보체 매개된 신경병증을 치료하는 방법은 보체 캐스케이드 저해물질의 치료 효과량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 고전 경로, 대체 경로 또는 렉틴 보체 경로의 활성화를 저해한다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 보체 성분 C5, C5b, C6, C7, C8과 C9를 포함하는 군의 임의의 구성원에 대한 항체이다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 C5에 대한 항체이다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 C5 절단의 저해물질이다.

특정 구체예에서, 본 발명의 보체 캐스케이드 저해물질은 폴리펩티드, 폴리펩티드 유사체, 펩티드모방체, 항체, 핵산, RNAi 구조체, 핵산 유사체, 또는 소형 분자에서 선택된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 완전 항체(whole antibody) 또는 항체 단편이다. 특정 구체예에서, 상기 완전 항체 또는 항체 단편은 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항체 단편, 디아바디(diabody), 키메라화 또는 키메라 항체 또는 항체 단편, 인간화 항체 또는 항체 단편, 면역제거된 인간 항체 또는 항체 단편, 완전 인간 항체 또는 항체 단편, 단일 사슬 항체, Fv, Fab, Fab', 또는 F(ab')₂에서 선택된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 고전 경로, 대체 경로 또는 렉틴 보체 경로의 활성화를 저해한다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 보체 성분 C5, C5b, C6, C7, C8과 C9를 포함하는 군의 임의의 구성원에 대한 항체이다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 C5에 대한 항체이다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 C5 절단의 저해물질이다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 에쿨리주맙(eculizumab)이다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 펙셀리주맙(pexelizumab)이다. 특정 구체예에서, 에쿨리주맙(eculizumab)으로 치료는 장기적이다. 특정 구체예에서, 펙셀리주맙으로 치료는 급성 에피소드(acute episode)의 치료를 포함한다.

특정 구체예에서, 포유동물은 항체를 정맥내 투여함으로써 치료된다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 포유동물에 전신 투여된다. 특정 구체예에서, 상기 치료제는 포유동물에 국소 투여된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 치료는 포유동물에서 감소된 뉴런 손상(neural injury)을 결과한다.

특정 구체예에서, 포유동물은 항체 의존성 신경병증에 기인한 과도한 신경 손상에 기인한 바람직하지 않은 생리 상태의 양(amount) 및/또는 정도(extent)를 저해하거나 감소시키기 위하여 치료된다. 특정 구체예에서, 바람직하지 않은 생리 상태는 눈 근육 마비(ophthalmoplegia), 운동실조(ataxia), 무반사(areflexia), 비정상적인 근육 공조(muscle coordination), 눈 근육의 마비, 근육에서 통증(aching pain), 건반사(tendon reflex)의 부재, 하지(lower extremities)에서 느껴지는 무감각(numbness)과 저림(tingling), 하지의 원위 근육(distal muscle)의 약화, 발처짐(footdrop), 전체 하지에서 약화, 상지(upper extremities)에서 약화, 호흡 근육에서 약화, 또는 사망에서 선택된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 전시냅스 운동 축삭(presynaptic motor axon)에서 감소된 막 공격 복합체(membrane attack complex, MAC) 형성을 결과한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 미세 종판 전위(miniature endplate potential)의 정상 빈도의 복원을 결과한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 신경근 연접(neuromuscular junction)에서 시냅스 전달(synaptic transmission)의 복원을 결과한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 신경근 연접에서 말단 일체성(terminal integrity)의 감소된 상실을 결과한다.

다른 구체예에서, 포유동물에서 귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)을 치료하는 방법은 보체 캐스케이드 저해물질, 예를 들면, 항-C5 항체의 치료 효과량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 포유동물에서 귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)의 밀러 피셔 변종(Miller Fisher variant)을 치료하는 방법은 보체 캐스케이드 저해물질, 예를 들면, 항-C5 항체의 치료 효과량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다.

도 1A-1F에서는 시험관내 MFS 모형에서 NMJ에서 MAC 침착과 운동 말단 축삭병증(terminal motor axonopathy)에 대한 에쿨리주맙(eculizumab)의 보호 효과의 면역학적 증명(immunohistological demonstration)을 보여준다. 생쥐 편측 횡격막(hemi-diaphragm) 표본(preparation)은 항-GQ1b 갱글리오사이드 mAb CGM3(50 ㎍/㎖)과 함께 사전-배양하고, 이후 에쿨리주맙(eculizumab)(항-인간 C5 중화; 100 ㎍/㎖) 또는 비-특이적 아이소타입(isotype)-대응된 대조 mAb(100 ㎍/㎖)가 첨가된 40% 정상 인간 혈청(NHS)으로 처리하고, 처리되지 않은 조직과 비교하였다. 도 1A에서는 NHS/에쿨리주맙으로 처리된 조직이 NHS/대조 mAb-처리된 조직에서와 유사하게 신경근 연접(NMJ)에서 강한 C3c 염색을 보인다는 것을 증명한다(p=0.12). 도 1B에서는 막 공격 복합체(MAC) 염색이 에쿨리주맙의 존재에서 관찰되지 않는다는 것을 보여주는데(기준선에 필적하는 강도, p=0.92), 이는 말단 보체의 완전한 저해를 지시한다. 도 1C에서는 신경섬유(neurofilament)(NF) 신호의 존재에 의한 평가에서, 처리되지 않은 대조에서 기준선에 필적하는 축삭 일체성(axonal integrity)이 에쿨리주맙의 존재에서 관찰된다는 것을 증명한다(p=0.80). 도 4D, 4E와 4F는 NHS/ 대조 mAb 처리와 비교하여, MAC 침착(도 4D), 시냅스주위 슈반 세포(perisynaptic Schwann cell)(pSC) 손상(도 4E)과 말단 운동 축삭(terminal motor axonal) 손상(도 4F)에 대한 에쿨리주맙의 보호 효과를 증명하는, 전재 근육(whole-mount muscle)에서 NMJ의 전형적인 면역형광 영상(immunofluorescent image)이다. NMJ의 윤곽을 확인하기 위하여 후시냅스 니코틴 아세틸콜린 수용체(Postsynaptic nicotinic acetylcholine receptor)(nAChR; 진홍색) 염색이 이용되었다. 중간단계 보체 단백질 C3c(도 4D)는 NMJ에서 풍부하게 침착된다. *p<0.01, 처리되지 않은 표본과 상이함; #p<0.01, 대조 mAb-처리된 표본과 상이함; 스케일 바(scale bar) = 20 ㎛.

도 2A-2G에서는 에쿨리주맙이 시험관내 MFS 모형에서 NMJ에서에서 유도된 전기생리학적(electrophysiological) 결함과 기능적 결합으로부터 보호한다는 것을 보여준다. 생쥐 편측 횡격막 표본은 항-GQ1b 갱글리오사이드 mAb CGM3(50 ㎍/㎖)과 함께 사전-배양하고, 이후 100 ㎍/㎖ 에쿨리주맙(항-인간 C5 중화 mAb) 또는 비-특이적 아이소타입(isotype)-대응된 대조 mAb가 첨가된 40% 정상 인간 혈청(NHS)으로 처리하였다. 도 2A에서는 NMJ에서 MEPP 빈도로서 측정된 자발적 유니콴탈 아세틸콜린 방출(spontaneous uniquantal acetylcholine release)을 보여준다. 에쿨리주맙은 높은 MEPP 빈도의 유도를 예방하였다(p<O.001, n = 5개 근육). 도 2B에서는 에쿨리주맙(위쪽 흔적) 또는 대조 mAb(아래쪽 흔적)가 첨가된 NHS와 함께 배양 동안 획득된 대표적인 1시간 흔적을 보여준다. 도 2C에서는 NHS에 의해 유도된 근섬유(muscle fiber)의 비동기 경련(asynchronous twitching)이 에쿨리주맙에 의해 거 의 예방된다는 것을 증명한다(p<0.01, n = 5개 근육). 도 2D에서는 에쿨리주맙이 '침묵' NMJ(즉, 탐지가능한 시냅스성 전기생리학적 신호 없음)의 발생을 완전하게 예방한다는 것을 증명한다. 도 2E, 2F와 2G의 경우에, 편측 횡격막 근육-신경 표본은 200 ㎍/㎖ CGM3과 함께 사전 배양하고, NHS에 첨가된 여러 농도의 에쿨리주맙(0-100 ㎍/㎖, n = 2-5개 근육/농도)의 보호 효과를 근육 수축력 기록 실험(muscle contraction force recording experiment)에서 관찰하였다. 도 2E에서는 에쿨리주맙이 첨가되지 않거나, 또는 6 또는 100 ㎍/㎖ 에쿨리주맙이 추가된 NHS의 배양 시작후 0, 30분, 60분과 90분 시점에 관찰된 수축 프로필(contraction profile)의 실례를 보여준다. 각 수축은 40 Hz에서 3초 동안 횡격 신경(phrenic nerve)의 초극대 전기 자극(supramaximal electric stimulation)에 의해 유도되었다. 도 2F에서는 다양한 농도의 에쿨리주맙이 첨가된 NHS의 배양 동안 수축 상실(contraction loss)의 발생을 보여준다. 도 2G에서는 에쿨리주맙 및 NHS 배양 시작후 90분 시점에 수축 상실로부터 보호의 농도-효과 상관관계(concentration-effect relationship)을 보여준다. Boltzmann S자 곡선(sigmoidal curve)을 데이터 지점(data point)을 통하여 일치시켜 7.1 ㎍/㎖의 EC₅₀을 산출한다. 도 2A, 2D, 2F와 2G에서 오차 막대(error bar)는 S. E. M을 표시한다.

도 3A-3B에서는 생체내에서 에쿨리주맙 용량 반응 곡선(dose response curve)을 보여준다. 도 3A에서는 증가하는 용량의 에쿨리주맙이 NMJ에서 MAC 침착의 용량-의존성 감소(dose-dependent reduction)를 결과한다는 것을 증명한다. 도 3B에서는 신경섬유 신호(neurofilament signal)를 보여주고, PBS 처리된 기준선 대조와 비교하여 조사된 모든 용량의 에쿨리주맙에서 축삭 일체성의 보존을 증명한다.

도 4A-4H에서는 생체내 MFS 모형에서 호흡 마비(respiratory paralysis)가 횡격막 내에서 신경근 전달(neuromuscular transmission)의 전시냅스 차단(presynaptic block)의 저해로 인하여 에쿨리주맙에 의해 예방된다는 것을 증명한다. 생쥐(n = 6)는 1.5 ㎎ 항-GQ1b 갱글리오사이드 mAb CGM3을, 그리고 16시간후 보체 공급원으로서 0.5 ㎖ 100% 정상 인간 혈청(NHS)을 복강내 주입하였다. NHS 주입 직전에, 200 ㎍ 용량의 에쿨리주맙 또는 대조 mAb를 꼬리 정맥(tail vein)에 주입하였다. 도 4A에서는 NHS 주입후 2시 시점에 악력 분석(grip-strength analysis)을 보여준다. 에쿨리주맙은 대조 mAb 군에서 관찰되는 견인력(pulling force)의 상실을 예방하였다(p<0.01). 도 4B에서는 평균 일회호흡량(average tidal volume)을 보여주고, 도 4C에서는 NHS 주입 이전 및 NHS 주입 이후 2시, 4시와 6시 시점에, 전신 체적변동기록(whole-body plethysmography)으로 측정된 호흡수(breathing rate)를 보여준다. 호흡 장애(breathing difficulty)의 발생이 에쿨리주맙에 의해 예방되었다. 도 4D에서는 에쿨리주맙-처리된 생쥐와 대조 mAb-처리된 생쥐에서 획득된 체적변동기록 신호(plethysmography signal)의 1초간 흔적의 실례를 보여준다. 도 4E에서는 경련력(twitch force)을 보여주고, 도 4F에서는 각각, 단일 전기 신경 자극(electrical nerve stimulation)과 40 Hz 전기 신경 자극에 의해, 절개된 횡격막 근육에서 유도된 강직력(tetanic force)을 보여준다. 에쿨리주맙은 대조 mAb-처리된 생쥐로부터 근육에서 관찰되는 심각한 마비를 완전하게 예방하였다(p<0.01). 도 4G에서는 에쿨리주맙이 이들 생쥐에서 '침묵' NMJ(즉, 탐지가능한 시냅스성 전기생리학적 신호 없음)(p<0.001)의 발생을 거의 완전하게 예방한다는 것을 입증한다. 도 4H에서는 에쿨리주맙-처리된(위쪽 흔적) 또는 대조 mAb-처리된(아래쪽 흔적) 생쥐로부터 근육의 NMJ에서 획득된 30개 중첩된(superimposed) 대표적인 1초간 흔적을 보여준다. 이들 도면의 막대그래프에서 오차 막대는 S.E.M을 표시한다.

도 5A-5F에서는 생체내 MFS 생쥐로부터 횡격막 조직의 NMJ의 형태학적 분석(morphological analysis)을 보여준다. 생쥐는 1.5 ㎎ 항-GQ1b 갱글리오사이드 mAb, CGM3으로 수동 면역시키고, 16시간후 0.5 ㎖ 100% 정상 인간 혈청(복강내) 및 에쿨리주맙 또는 대조 mAb(정맥내; 200 ㎍)를 동시 주입하였다. 도 5A와 5B에서는 C3c와 막 공격 복합체(MAC) 침착이 에쿨리주맙-처리된 생쥐와 대조 mAb-처리된 생쥐 모두의 신경근 연접(NMJ)에서 감소한다는 것을 증명한다(p<0.01). 도 5C에서는 신경섬유(NF) 신호가 대조와 비교하여, 에쿨리주맙-처리된 생쥐로부터 근육의 NMJ에서 유의하게 크다는 것을 증명한다(p<0.01). 도 5D와 5E에서는 전재 근육(whole mount muscle)에서 NMJ의 전형적인 면역형광 영상(immunofluorescent image)을 보여준다. NMJ의 윤곽을 확인하기 위하여 후시냅스 니코틴 아세틸콜린 수용체(postsynaptic nicotinic acetylcholine receptor)(nAChR; 진홍색) 염색이 이용되었다. 도 5D에서는 또한, C3c와 MAC 침착을 보여준다. 도 5E에서는 또한, NF 일체성과 MAC 침착을 보여준다. 도 5F는 조밀하게 밀집된 시냅스 소포(synaptic vesicle)를 보유하는 에쿨리주맙-보호된 신경 말단 및 병렬 크리스테(parallel cristae)를 보유하는 전자 밀집 미토콘드리아(electron dense mitochondria)의 전자 현미경사진(electron micrograph)이다. 대조 mAb-처리된 생쥐로부터 NMJ에서, 신경 말단은 성긴 시냅스 소포와 팽창된 미토콘드리아로 전자 밀도가 낮다. #p<0.01, 대조 mAb-처리된 표본과 상이함. 도 5D와 5E에서 스케일 바 = 20 ㎛; 도 5F에서 스케일 바 = 1 ㎛.

개요

본 발명에서, 보체 저해물질로 항체 매개된 신경병증 환자의 치료는 뉴런 손상을 완화시킬 것으로 제안된다. 가령, 항체 매개된 신경병증은 AGA 매개된 신경병증이다. 보체 캐스케이드(complement cascade)의 구성원의 저해물질에는 예로써, C5, C5b, C6, C7, C8과 C9와 같은 성분에 대한 항체가 포함된다. 특정 구체예에서, 본 발명에서는 C5의 C5a와 C5b로의 절단(cleavage)을 저해하는 것으로 알려져 있는 항-C5 항체 에쿨리주맙(완전 항체)의 이용을 안출한다. 따라서 이런 저해물질로 환자의 치료는 보체 매개된 뉴런 손상을 감소시킨다. 에쿨리주맙은 임상 연구(clinical study)에 이용되고 있고, 최소 부작용으로 충분히 관용되는 것으로 밝혀졌다(참조: U.S. Patent 6,355,245와 Hillmen et al., New Engl. J. Med. 350:552-559 (2004), 이들의 내용은 본 명세서에 참조로서 편입된다).

보체계(complement system)

이러한 보체계(complement system)는 세포 병원체와 바이러스 병원체의 침입(intrusion)으로부터 방어하기 위하여 신체의 다른 면역계(immunological system)와 공동으로 기능한다. 최소한 25가지 보체 단백질이 존재하는데, 이들은 혈장 단백질(plasma protein)과 막 보조인자(membrane cofactor)의 복합적인 집합으로서 발견된다. 혈장 단백질(이는 대부분의 다른 체액(body fluid), 예를 들면, 림프, 골수, 활액(synovial fluid)과 뇌척수액(cerebrospinal fluid)에서도 발견된다)은 척추동물 혈청 내에서 글로불린의 대략 10%를 구성한다. 보체 성분은 일련의 미묘하지만 정확한 효소 절단과 막 결합 현상에서 상호작용함으로써 면역 방어 기능(immune defensive function)을 달성한다. 결과의 보체 캐스케이드(complement cascade)는 옵소닌(opsonic), 면역조절(immunoregulatory)과 용해(lytic) 기능을 갖는 산물의 생산을 결과한다.

이러한 보체 캐스케이드는 고전 경로(classical pathway) 또는 대체 경로(alternative pathway)를 통하여 진행된다. 이들 경로는 다수의 성분을 공유하고, 최초 단계에서 구별되긴 하지만 표적 세포와 바이러스의 활성화와 파괴를 주도하는 동일한 "말단 보체" 성분으로 수렴하고 공유한다.

고전적 보체 경로는 전형적으로, 표적 세포 상에서 항원 부위의 항체 인식과 항원 부위에 항체 결합에 의해 개시된다. 이러한 표면 결합된 항체(surface bound antibody)는 차후에, 보체의 제 1 성분, C1과 반응한다. 이렇게 결합된 C1은 일단의 자기촉매 반응(autocatalytic reaction)을 겪는데, 이러한 반응은 특히, 보체 성분 C2와 C4에 작용하는 C1 단백분해 활성(proteolytic activity)의 유도를 결과한다.

이러한 활성화된 C1은 C2와 C4를 C2a, C2b, C4a와 C4b로 절단한다. C2b의 기능은 아직 명확하지 않다. C2a와 C4b는 합쳐 C4b,2a 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 고전적 C3 전환효소(convertase)로 알려져 있는 활성 프로테아제(active protease)이다. C4b,2a는 C3을 C3a와 C3b로 절단하는 작용을 한다. C3a와 C4a는 둘 모두 비만 세포(mast cell)의 탈과립(degranulation)을 유도하여 히스타민(histamine)과 염증의 다른 매개인자의 방출을 결과하는 상대적으로 약한 아나필락톡신(anaphylatoxin)이다.

C3b는 복수 기능을 갖는다. 옵소닌(opsonin)으로서, C3b는 세균, 바이러스와 다른 세포와 입자에 결합하고 순환으로부터 제거를 위하여 이들을 표지한다. C3b는 또한, C4b,C2a와 복합체를 형성하여 C4b,2a,3b, 또는 고전적인 C5 전환효소를 생성하는데, 이는 C5를 C5a(다른 아나필락톡신)와 C5b로 절단한다. 대체 C5 전환효소는 C3b,Bb,C3b인데, 이는 동일한 기능을 수행한다. C5b는 C6과 합쳐 C5b,6을 산출하는데, 이러한 복합체는 C7과 합쳐 3원 복합체(ternary complex) C5b,6,7을 형성한다. C5b,6,7 복합체는 세포 막의 표면에서 C8에 결합한다. C9에 결합후, 완전 막 공격 복합체(MAC)가 형성되는데(C5b-9), 이는 외래 세포, 미생물과 바이러스의 용해를 매개한다.

고전 보체 경로의 추가적인 논의 및 보체 활성화의 대체 경로의 상세한 설명은 예로써, Muller-Eberhard, Annu Rev Biochem. 1988;57:321-47을 비롯한 다수의 간행물에서 찾아볼 수 있다.

보체 캐스케이드의 저해물질

특정 구체예에서, 보체 저해물질은 소형 분자(최대 6,000 Da 분자량), 핵산 또는 핵산 유사체, 펩티드모방체, 또는 핵산 또는 단백질이 아닌 거대분자(macromolecule)이다. 이들 작용제에는 소형 유기 분자(small organic molecule), RNA 압타머(aptamer), L-RNA 압타머, 스피겔머(Spiegelmer), 안티센스 화합물(antisense compound), 이중 가닥 RNA(double stranded RNA), 소형 간섭 RNA(small interfering RNA), 잠금된 핵산 저해물질과 펩티드 핵산 저해물질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

특정 구체예에서, 보체 저해물질은 단백질 또는 단백질 단편이다. CD59, CD55, CD46 및 C8과 C9의 다른 저해물질을 비롯한, 보체 캐스케이드를 저해하는 단백질은 공지되어 있다(참조: U.S. Patent 6,100,443). 보체에 결합하고 보체 수용체로 알려져 있는 단백질 역시 공지되어 있다(참조: 공개된 PCT 특허 출원 WO 92/10205와 U.S. Patent 6,057,131). 보체 수용체의 가용성 형태(soluble form), 예를 들면, 가용성 CR1의 이용은 보체 활성화의 결과, 예를 들면, 호중구 산화성 폭발(neutrophil oxidative burst), 보체 매개된 뉴런 손상 및 C3a와 C5a 생산을 저해할 수 있다. 당업자는 보체와 이의 활성화를 저해하는 공지된 방법의 일부로써 이들을 인지할 것이다.

특정 구체예에서, 보체 저해물질은 보체를 저해할 수 있는 항체, 예를 들면, MAC의 형성을 차단할 수 있는 항체일 수 있다. 가령, 항체 보체 저해물질에는 항-C5 항체가 포함된다. 이런 항-C5 항체는 C5 및/또는 C5b와 직접적으로 상호작용하여, C5b의 형성 및/또는 생리 기능을 저해할 수 있다.

적절한 항-C5 항체는 당업자에게 공지되어 있다. 항체는 활성화된 보체의 개별 성분, 예를 들면, C7, C9 등에 대하여 만들어질 수 있다(참조: U.S. Patent 6,534,058; 공개된 U.S. patent application US 2003/0129187; U.S. Patent 5,660,825). U.S. Patent 6,355,245에서는 C5에 결합하고 C5a와 C5b로의 절단을 저해하여 C5a뿐만 아니라 하류 보체 성분의 형성을 감소시키는 항체를 교시한다.

체액(body fluid) 내에서 C5a와 C5b의 농도 및/또는 생리 활성은 당분야에 널리 공지된 방법으로 측정될 수 있다. C5a의 경우에, 이런 방법에는 화학주성 검사(chemotaxis assay), RIA, 또는 ELISA가 포함된다(참조: Ward and Zvaifler, J Clin Invest. 1971 Mar; 50(3): 606-16; Wurzner, et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991). C5b의 경우에, 용혈성 검사 또는 본 명세서에 언급된 가용성 C5b-9에 대한 검사가 이용될 수 있다. 당분야에 공지된 다른 검사법 역시 이용될 수 있다. 이들 또는 다른 적합한 유형의 검사법을 이용하여, 현재 알려져 있거나 차후에 동정될, 항-C5 항체와 같은 보체를 저해할 수 있는 후보 항체는 1) 이러한 적용에 유용한 화합물을 확인하고, 2) 이런 화합물의 적절한 용량 수준(dosage level)을 결정하기 위하여 선별될 수 있다.

보체를 저해할 수 있는 항체, 예를 들면, C5b에 영향을 주는 항-C5 항체는 바람직하게는, 환자의 최소한 하나의 혈액-유래된 체액(blood-derived fluid) 내에서 보체의 활성화 이후 상기 체액 내에 존재하는 C5b 수준에서 실질적인 감소(즉, 항-C5 항체의 부재에서와 비교하여 최소한 25% 감소)를 제공하는 농도로 이용된다. 이런 농도는 체액 내에 존재하는 보체의 세포-용해 능력(cell-lysing ability)(가령, 용혈 활성(hemolytic activity)), 또는 체액 내에 존재하는 가용성 C5b-9의 수준을 측정함으로써 편의하게 결정될 수 있다. 따라서 C5b에 영향을 주는 항체의 특이적인 농도는 최소한 하나의 환자 혈액-유래된 체액 내에 존재하는 보체의 세포-용해 능력에서 실질적인 감소(즉, 최소한 25% 감소)를 결과하는 농도이다. 환자의 체액 내에 존재하는 보체의 세포-용해 능력의 감소는 당분야에 널리 공지된 방법, 예를 들면, Kabat and Mayer (eds), "Experimental Immunochemistry, 2d Edition", 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), pages 135-139에 기술된 용혈성 검사와 같은 통상의 용혈성 검사, 또는 하기에 기술된 병아리 적혈구 용혈 방법과 같은 상기 검사의 통상적인 이형에 의해 측정될 수 있다.

보체를 저해할 수 있는 특이적인 항체, 예를 들면, 항-C5 항체는 상대적으로 특이적이고 초기 보체 성분의 기능을 차단하지 않는다. 특히, 이들 특이적인 작용제는 신체로부터 외래 입자와 물질의 소거(clearance) 수단을 제공하는 기능을 하는, 보체 성분 C3b와 연관된 옵소닌화(opsonization) 기능을 실질적으로 손상시키지 않는다.

C3b는 C3의 절단에 의해 산출되는데, 이러한 절단은 고전 및/또는 대체 C3 전환효소에 의해 수행되고 C3a와 C3b 모두의 산출을 결과한다. 이런 이유로, C3b와 연관된 옵소닌화 기능을 손상시키지 않기 위하여, 보체를 저해할 수 있는 특이적인 항체, 예를 들면, 항-C5 항체는 환자의 체액(가령, 혈청) 내에서 보체 성분 C3의 C3a와 C3b로의 절단을 실질적으로 간섭하지 않는다. C3 절단의 이러한 간섭은 C3 전환효소의 작용에 의해 동등 몰 비율(equimolar ratio)로 생산되는 C3a 및/또는 C3b의 체액 수준을 측정함으로써 탐지될 수 있다. 이런 측정은 유익한데, 그 이유는 절단이 보체를 저해할 수 있는 항체, 예를 들면, 항-C5 항체에 의해 간섭되면 C3a와 C3b 수준이 감소(보체를 저해할 수 있는 항체, 예를 들면, 항-C5 항체가 없는 대응된 샘플과 비교하여)하기 때문이다.

실제로, 이런 절단의 정량적 측정은 체액 C3b 수준보다는 체액 C3a 수준의 측정에 의해 수행될 때 일반적으로 더욱 정확한데, 그 이유는 C3a가 유체 상태로 존속하는 반면, C3b가 급속하게 소거되기 때문이다. 체액 내에서 C3a 수준은 당분야에 널리 공지된 방법, 예를 들면, Quidel Corporation(San Diego, Calif.)에 의해 판매되는 상업적으로 가용한 C3a EIA 키트를 이용하여 제조업체의 명세에 따라 측정될 수 있다. 보체를 저해할 수 있는 특이적인 항체, 예를 들면, 항-C5 항체는 이들 검사법으로 조사될 때, 보체 활성화 이후 체액 C3a 수준에서 본질적으로 감소를 발생시키지 않는다.

본 발명의 특정 항체는 C5a와 C5b를 형성하는 C5의 절단을 예방하고, 따라서 C5a와 연관된 아나필락톡신 활성(anaphylatoxic activity)의 발생을 예방하고 C5b와 연관된 막 공격 복합체(membrane attack complex)의 조합을 예방한다. 앞서 논의된 바와 같이, 특정 구체예에서, 이들 항-C5 항체는 C3b의 작용과 연관된 옵소닌화 기능을 손상시키지 않는다.

보체 활성을 저해하는 바람직한 방법은 보체 C5에 결합하고 절단을 저해하는 단클론 항체를 이용하는 것이다. 이는 C5a와 C5b의 형성을 감소시키고, 이와 동시에 수용자에게 유익한 C3a와 C3b의 형성을 가능하게 한다. 인간 보체에 특이적인 이런 항체는 공지되어 있다(U.S. Patent 6,355,245). U.S. Patent 6,355,245에 기술된 이들 항체에는 선호되는 완전 항체(whole antibody)(현재, 에쿨리주맙)가 포함된다. 생쥐 C5에 대한 유사한 항체는 BB5.1로 불린다(Frei et al., MoI. Cell. Probes. 1: 141-149 (1987)). 보체 활성을 저해하는 항체는 단클론 항체일 필요가 없다. 이들은 예로써, 다클론 항체일 수 있다. 이들은 부가적으로, 항체 단편일 수 있다. 항체 단편에는 Fab, F(ab'), F(ab')₂, 단일-사슬 항체 및 Fv가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 게다가, 항체가 인간화 항체(Jones et al., Nature 321 :522-5 (1986)), 키메라화 항체, 또는 면역제거된 항체일 수 있음은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명에 이용되는 항체는 이들 중에서 한 가지이다. 인간화 항체를 이용하는 것이 바람직하다.

특정 구체예에서, 본 발명의 치료제는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 항체와 이의 단편은 임의의 통상적인 방법, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 방법에 의해 만들어진다. 항체는 복수 형태, 예를 들면, IgA, IgG, IgM 등으로 발견된다. 부가적으로, 항체는 다양한 방법으로 가공될 수 있다. 이들은 단일-사슬 항체(소형 모듈 면역약제 또는 SMIPs™), Fab와 F(ab')₂ 단편 등으로 만들어질 수 있다. 항체는 인간화 항체, 키메라화 항체, 면역제거된 항체, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 다수의 간행물에서 여러 유형의 항체 및 이런 항체를 가공하는 방법을 기술한다. 가령, U.S. Patent No. 6,355,245; 6,180,370; 5,693,762; 6,407,213; 6,548,640; 5,565,332; 5,225,539; 6,103,889; 5,260,203을 참조한다.

본 발명에서는 항-C5 항체의 단편을 제시하는데, 이들 단편은 고유 항체의 일부분, 바람직하게는, 고유 항체의 항원-결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 실례에는 Fab, Fab', F(ab')₂와 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체(Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062 (1995)); 단일-사슬 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.

항체의 파파인 절단(papain digestion)은 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편(이들 각각은 단일 항원-결합 부위를 보유한다) 및 잔여 "Fc" 단편(이의 명칭은 용이하게 결정(結晶)하는 능력을 반영한다)을 산출한다. 항체의 펩신(pepsin) 처리는 2개의 항원 결합 부위(antigen-combining site)를 보유하고 항원을 여전히 교차-연결할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 산출한다.

"Fv"는 완전 항원-인식과 항원-결합 부위를 보유하는 최소 항체 단편을 지칭한다. 상기 영역은 단단한 비-공유 결합에서 1개의 중쇄와 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 배열에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개의 CDR이 항체에 대한 항원-결합 특이성(antigen-binding specificity)을 공여한다. 하지만, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 반쪽) 역시, 전체 결합 부위보다는 친화성이 낮을 가능성이 높지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1) 역시 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역(hinge region)으로부터 하나이상의 시스테인(cysteine)을 비롯한 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단(carboxy terminus)에서 몇몇 잔기의 추가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올기(free thiol group)를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 최초, 힌지 시스테인이 사이에 존재하는 Fab' 단편의 쌍으로 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 결합 역시 공지되어 있다.

"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H와 V_L 도메인을 포함하는데, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 적절하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 적합한 구조를 형성할 수 있도록 하는, V_H와 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함한다. scFv의 개관을 위하여, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, eds. (Springer-Verlag: New York, 1994), pp. 269-315를 참조한다.

SMIP는 표적 결합 영역, 작동체 도메인(CH2와 CH3 도메인)을 포함하도록 가공된 일군의 단일-사슬 펩티드이다(참조: U.S. Patent Application Publication No. 20050238646). 표적 결합 영역은 본 발명의 항체, 예를 들면, 항-C5 항체의 가변 영역 또는 CDR로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 표적 결합 영역은 C5에 결합하는 단백질로부터 유래된다.

"디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 보유하는 소형 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 내에서 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함한다(V_H-V_L). 동일한 사슬 상에서 이들 두 도메인 사이에 짝짓기(pairing)를 가능하게 하기에는 짧은 링커(linker)를 이용함으로써, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제적으로 짝지어 2개의 항원-결합 부위를 발생시킨다. 디아바디는 예로써, EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)에 더욱 상세하게 기술된다.

Fc 영역을 보유하는 항체의 분자(또는 병원체)에 결합은 상기 분자(또는 병원체)의 처리(processing)와 소거(clearance)를 보조하는 것으로 알려져 있다. 항체의 Fc 부분은 면역 작동체 세포(immune effector cell)에 의해 발현되는 특수화된 수용체에 의해 인식된다. IgG1과 lgG3 항체의 Fc 부분은 대식세포(macrophage)와 호중구(neutrophil)와 같은 식세포(phagocytic cell)의 표면 상에 존재하는 Fc 수용체에 의해 인식되는데, 이들 식세포는 이들 아이소타입(isotype)의 항체로 덮여있는 분자 또는 병원체에 결합하고 삼킬 수 있다(C. A. Janeway et al., Immunobiology 5th edition, page 147, Garland Publishing (New York, 2001)).

본 발명에서는 또한, 단클론 항-C5 항체를 제시한다. 단클론 항체는 실질적으로 상동한 항체의 집합으로부터 획득될 수 있다, 다시 말하면, 이러한 집합을 구성하는 개별 항체는 미량으로 존재하는 자연-발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부위를 지향한다. 게다가, 상이한 결정부위(에피토프)를 지향하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인(다클론) 항체 제조물과 대조적으로, 각 단클론 항체는 항원 상에서 단일 결정부위를 지향한다. 단클론 항체는 특이성 이외에, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양액(hybridoma culture)에 의해 종종 합성된다는 점에서 유리하다. 단클론 항체는 또한, 형질감염된 세포, 예를 들면, CHO 세포와 NSO 세포에서 생산될 수도 있다. 수식어 "단클론"은 실질적으로 상동한 항체 집합으로부터 획득되는 항체의 특성을 지시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하지 않는다. 가령, 본 발명에 이용되는 단클론 항체는 Kohler et al., Nature 256:495-497 (1975)에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 만들어지거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조: U.S. Patent No. 4,816,567과 6,331,415)에 의해 만들어질 수 있다. 또한, "단클론 항체"는 예로써, Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)과 Marks et al., J. MoI. Biol. 222:581-597 (1991)에 기술된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리(phage antibody library)로부터 분리될 수도 있다.

특이적인 결합 특성을 나타내는 생쥐 항-인간-C5 단클론 항체의 집합에 관한 설명은 U.S. Patent Application Publication No. 20050226870에서 제공된다. Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328-340 (1991)에서는 N19-8과 N20-9로 지칭되는 다른 생쥐 항-인간-C5 단클론 항체의 집합을 기술한다.

특이적으로 고려되는 다른 항체는 "과클론성(oligoclonal)" 항체이다. 본 명세서에서, "과클론성 항체"는 상이한 단클론 항체의 미리 결정된 혼합물을 지칭한다(참조: PCT publication WO 95/20401; U.S. Patent No. 5,789,208과 6,335,163). 한 구체예에서, 하나이상의 에피토프에 대한 항체의 미리 결정된 혼합물로 구성되는 과클론성 항체는 단일 세포에서 산출된다. 다른 구체예에서, 과클론성 항체는 1개의 공통 경쇄와 짝짓기 하여 복수 특이성(multiple specificity)을 나타내는 항체를 산출할 수 있는 복수의 중쇄를 포함한다(가령, PCT publication WO 04/009618). 과클론성 항체는 단일 표적 분자(가령, C5) 상에서 복수 에피토프를 표적하는 것이 요구되는 경우에 특히 유용하다. 본 명세서에 기술된 검사법과 에피토프에 비추어, 당업자는 의도된 목적과 요구에 적용될 수 있는 항체 또는 항체 혼합물을 산출하거나 선택할 수 있다.

인간화 및/또는 키메라 항체와 관련된 특정 구체예에서, 하나이상의 CDR은 항-인간 C5 항체로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 모든 CDR은 항-인간 C5 항체로부터 유래된다. 다른 특정 구체예에서, 하나이상의 항-인간 C5 항체로부터 CDR은 키메라 항체 내에서 혼합되고 대응된다. 가령, 키메라 항체는 두 번째 항-인간 C5 항체의 경쇄로부터 CDR2와 CDR3과 결합된 첫 번째 항-인간 C5 항체의 경쇄로부터 CDR1을 포함하고, 중쇄로부터 CDR은 세 번째 항-인간 C5 항체로부터 유래될 수 있다. 게다가, 골격 영역(framework region)은 동일한 항-인간 C5 항체 중의 하나로부터, 하나이상의 상이한 항체, 예를 들면, 인간 항체로부터, 또는 인간화 항체로부터 유래될 수 있다. 인간 또는 인간화 항체는 인간 환자 투여에 특이적이다.

특정 구체예에서, 단일 사슬 항체, 키메라, 인간화 또는 영장화(primatized)(CDR-이식된) 항체 및 상이한 종으로부터 유래된 부분을 포함하는 키메라 또는 CDR-이식된 단일 사슬 항체 역시 항체의 항원-결합 단편으로서 본 발명에 포함된다. 이들 항체의 다양한 부분은 통상적인 기술에 의해 화학적으로 서로 연결되거나, 또는 유전자 조작 기술(genetic engineering technique)을 이용하여 연속 단백질(contiguous 단백질)로서 제조될 수 있다. 가령, 키메라 또는 인간화 사슬을 인코딩하는 핵산은 연속 단백질을 생산하기 위하여 발현될 수 있다(참조: U.S. Pat. No. 4,816,567과 6,331,415; U.S. Pat. No. 4,816,397; European Patent No. 0,120,694; WO 86/01533; European Patent No. 0,194,276 B1; U.S. Pat. No. 5,225,539; European Patent No. 0,239,400 B1; 영장화 항체와 관련하여, Newman et al., BioTechnology 10:1455-1460 (1992); 단일 사슬 항체와 관련하여, Ladner et al., U.S. Pat. No. 4,946,778과 Bird et al., Science 242:423-426 (1988)). 이에 더하여, 키메라, 인간화, 영장화 또는 단일 사슬 항체의 단편을 비롯한 항체의 기능성 단편(functional fragment) 역시 생산될 수 있다. 본 발명의 항체의 기능성 단편은 그들이 유래된 전장 항체(full-length antibody)의 최소한 하나의 결합 기능 및/또는 조절 기능을 유지한다. 선호되는 기능성 단편은 상응하는 전장 항체의 항원-결합 기능(가령, C5에 결합하는 항-C5 항체의 능력)을 유지한다.

동물의 면역화(immunization)(본 발명에서 C5 및/또는 C5b 등으로), 항체 생산 세포의 분리, 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 산출하기 위한 이들 세포와 영속 세포(가령, 골수종 세포)의 융합, 분비된 단클론 항체와 표적 항원(본 발명에서, 면역원(immunogen) 또는 면역원을 포함하는 분자)의 반응성(reactivity)에 대한 하이브리도마 상층액의 스크리닝(screening), 하이브리도마 상층액 또는 복수액(ascites fluid) 내에서 이들 항체의 다량 제조, 이들 단클론 항체의 정제와 보관을 위한 일반적인 방법은 다수의 간행물에서 확인할 수 있다. 이들에는 Coligan, et al., eds. Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons, New York, 1992; Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Liddell and Cryer, A Practical Guide To Monoclonal Antibodies. John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, England, 1991; Montz et al., Cellular Immunol. 127:337-351 (1990); Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328-340 (1991); Mollnes et al., Scand. J. Immunol. 28:307-312 (1988)가 포함된다.

제약학적 제제와 용도

소형 분자, 단백질과 핵산의 투여 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 항체의 투여 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 원하는 저해를 달성하기 위하여, 항체는 다양한 단위 제형(unit dosage form)으로 투여될 수 있다. 용량은 특정 항체에 따라 달라진다. 가령, 상이한 항체는 상이한 부피 및/또는 친화성을 나타내고, 따라서 상이한 용량 수준을 요구한다. Fab 단편으로 제조된 항체 역시 등가의 고유 면역글로불린과 상이한 용량을 필요로 하는데, 그 이유는 이들의 부피가 고유 면역글로불린보다 훨씬 적고, 따라서 환자의 혈액 내에서 동일한 몰 수준에 도달하는데 더욱 적은 용량이 필요하기 때문이다. 용량은 또한, 투여 방식, 치료되는 환자의 특정 증상, 상기 환자의 전반적인 건강, 상태, 크기와 연령 및 처방 의사의 판단에 따라 달라진다. 인간 개체에 대한 항체의 용량 수준은 일반적으로, 매 치료 시에 환자 체중 ㎏당 대략 1 ㎎ 내지 100 ㎎, 바람직하게는, 매 치료 시에 환자 체중 ㎏당 대략 5 ㎎ 내지 50 ㎎이다. 혈중 농도(plasma concentration)의 관점에서, 항체 농도는 바람직하게는, 대략 25 ㎍/㎖ 내지 대략 500 ㎍/㎖이다. 하지만, 심각한 사례에서는 더욱 많은 양이 요구되고, 경미한 사례에서는 더욱 적은 양으로 충분할 수도 있다.

항-C5 항체의 투여는 일반적으로, 혈관내 경로(intravascular route)에 의해, 예를 들면, 주사에 의한 정맥내 주입(intravenous infusion)을 통하여 수행된다. 원하는 경우에 다른 투여 경로가 이용될 수 있긴 하지만, 정맥내 경로가 가장 바람직하다. 주사에 적합한 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)에서 확인된다. 이들 제제는 무균이고 비-발열성이며, 약학적으로 효과적인 담체, 예를 들면, 염수, 완충된(가령, 인산염 완충된) 염수, Hank 용액, 링거액, 덱스트로스/염수, 글루코오스 용액 등을 일반적으로 포함한다. 이들 제제는 필요에 따라, 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들면, 긴장 조절제(tonicity adjusting agent), 습윤제(wetting agents), 살균제(bactericidal agent), 보존제(preservative), 안정제(stabilizer) 등을 포함한다.

보체를 저해할 수 있는 항체, 예를 들면, 항-C5 항체의 투여는 일반적으로, 비경구 경로(parenteral route)에 의해, 전형적으로, 동맥내 또는 정맥내 주사(가령, 정맥내 주입) 또는 근육내 주사와 같은 주사를 통하여 수행된다. 투여되는 보체를 저해할 수 있는 특정 항체에 적합한 경우에 다른 투여 경로, 예를 들면, 경구(p.o.) 경로가 이용될 수도 있다. 보체를 저해할 수 있는 항체, 예를 들면, 항-C5 항체는 또한, 다양한 단위 제형으로 투여될 수 있는데, 이들의 용량은 투여되는 보체를 저해할 수 있는 특정 항체의 크기, 효능(potency)과 생체내 반감기(in vivo half-life)에 따라 달라진다. 보체를 저해할 수 있는 항체, 예를 들면, 항-C5 항체의 용량은 또한, 투여 방식, 치료되는 환자의 특정 증상, 상기 환자의 전반적인 건강, 상태, 크기와 연령 및 처방 의사의 판단에 따라 달라진다.

특정 구체예에서, 전형적인 치료적 처리는 일련의 복용(dose)을 포함하는데, 이들은 통상적으로, 임상적 종점(clinical endpoint)의 모니터링과 동시에 투여되고, 용량 수준은 원하는 임상 결과를 달성하기 위하여 필요에 따라 조정된다. 특정 구체예에서, 치료제는 최소한 1주 동안 복수 용량으로 투여된다. 특정 구체예에서, 치료제는 최소한 1개월 동안 복수 용량으로 투여된다. 특정 구체예에서, 치료제는 최소한 1년 동안 복수 용량으로 투여된다. 특정 구체예에서, 치료제는 환자의 여생동안 복수 용량으로 투여된다.

투여 빈도 역시 다양한 파라미터에 따라 조정될 수 있다. 이들에는 임상적 반응(clinical response), 본 발명의 치료제의 혈중 반감기(plasma half-life) 및 체액, 예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청 또는 활액(synovial fluid) 내에서 항체의 수준이 포함된다. 투여 빈도의 조정을 인도하기 위하여, 체액 내에서 본 발명의 치료제의 수준은 치료 과정 동안 모니터된다.

특정 구체예에서, 투여 빈도는 하나이상의 환자 체액 내에 존재하는 보체의 세포-용해 능력을 측정하는 검사에 따라 조정된다. 이러한 세포-용해 능력은 본 명세서에 기술된 유형의 용혈성 검사에서 용혈 백분율(percent hemolysis)로서 측정될 수 있다. 본 발명의 실시에 이용되는 보체를 저해할 수 있는 항체로 치료 이후에 체액 내에 존재하는 보체의 세포-용해 능력에서 10%, 25% 또는 50% 감소는 치료 이후 용혈 백분율이 치료 이전 용혈 백분율의 각각, 90%, 75% 또는 50%임을 의미한다.

보체를 저해할 수 있는 항체, 예를 들면, 항-C5 항체의 전신 투여(systemic administration)(국소 투여(local administration)에 대조적으로)에 의한 항체 매개된 신경병증의 치료를 위하여, 많은 최초량, 다시 말하면, 환자 혈청의 용혈 활성에서 실질적인 감소, 더욱 바람직하게는, 최소한 50% 감소를 산출할 만큼 충분한 단일 최초량의 투여가 특이적이다. 적절하게는, 이런 많은 최초량 이후에 혈청 용혈성 역가(serum hemolytic titer)의 실질적인 감소를 유지하기 위하여 필요에 따라 점점 적어지는 복용량(tapered dose)의 규칙적이고 반복된 투여가 수행된다. 다른 구체예에서, 최초량은 국소와 전신 경로 모두에 의해 제공되고, 이후 앞서 기술된 바와 같이 점점 적어지는 복용량의 반복된 전신 투여가 수행된다. 인간에 항-C5 항체의 투여와 관련하여, Hillmen et al, N. Engl. J. Med. 350:552-559 (2004)를 참조한다. 상기 문헌에서, 투여되는 항체의 수준은 항체의 반감기에 기초하고, 신경병증 치료와 같은 다른 치료(indication)를 위한 항-C5 항체의 투여에 적합하다.

항체-기초된 치료제에 특히 유용한 제제는 U.S. Patent App. Publication No. 20030202972, 20040091490과 20050158316에 기술된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 액상 제제는 계면활성제 및/또는 무기염이 실질적으로 존재하지 않는다. 다른 특정 구체예에서, 액상 제제는 대략 5.0 내지 대략 7.0 범위의 pH를 갖는다. 또 다른 특정 구체예에서, 액상 제제는 대략 1 mM 내지 대략 100 mM 범위의 농도로 히스티딘을 포함한다. 또한, 액상 제제는 하나이상의 부형제(excipient), 예를 들면, 당류(saccharide), 아미노산(가령, 아르기닌, 리신과 메티오닌)과 폴리올을 더욱 포함할 수 있다. 액상 제제를 제조하고 분석하는 추가적인 상세와 방법은 예로써, PCT publications WO 03/106644, WO 04/066957과 WO 04/091658에서 확인할 수 있다.

습윤제, 유화제(emulsifier)와 윤활제(lubricant), 예를 들면, 소디움 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate)와 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 착색제(coloring agent), 방출제(release agent), 코팅제(coating agent), 감미료(sweetening agent), 풍미제(flavoring agent)와 방향제(perfuming agent), 보존제(preservative) 및 항산화제(antioxidant) 역시 본 발명의 약학 조성물 내에 존재할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체 제제는 내독소(endotoxin) 및/또는 관련된 발열성 물질이 실질적으로 존재하지 않는 발열원-없는 제제이다. 내독소에는 미생물(microorganism) 내부에 한정되고 이들 미생물이 파괴되거나 사멸할 때 방출되는 독소가 포함된다. 발열성 물질에는 세균과 다른 미생물의 외부 막으로부터 발열-유도 열안정성 물질(당단백질) 역시 포함된다. 이들 물질은 인간에 투여되면 발열(fever), 저혈압(hypotension)과 쇼크(shock)를 유발할 수 있다. 잠재적으로 유해한 효과로 인하여, 정맥내 투여된 약학적 약제 용액으로부터 소량의 내독소라도 제거하는 것이 바람직하다. Food & Drug Administration ("FDA")에서는 정맥내 약제 적용을 위하여 1회 1시간 동안 체중 ㎏당 5 내독소 단위(endotoxin unit, EU)/복용량의 상한선(upper limit)을 설정하였다(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). 단클론 항체의 경우에서처럼 치료 단백질이 체중 ㎏당 수백 또는 수천 ㎎의 양으로 투여될 때, 미량의 내독소라도 제거하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항체의 제제에는 경구, 식이, 국소, 비경구(가령, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하 주사), 안구(가령, 국소 또는 안내(intraocular)), 흡입(가령, 기관지내(intrabronchial), 비강내(intranasal) 또는 경구 흡입, 비강내 점적(intranasal drop)), 직장(rectal) 및/또는 질내(intravaginal) 투여에 적합한 것들이 포함된다. 다른 적합한 투여 방법에는 충전가능(rechargeable) 또는 생물분해성(biodegradable) 장치 및 서방(controlled release) 중합성 장치 역시 포함될 수 있다. 스텐트(stent)는 특히, 본 발명의 작용제와 혼합된 서방 중합체(controlled release polymer)로 코팅된다. 본 발명의 약학 조성물은 다른 작용제와 복합 요법(combinatorial therapy)(동일한 제제에서 또는 별개의 제제에서)의 일부로서 투여될 수도 있다.

치료 효과적인 제제의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 이에 더하여, 최적 용량 범위(optimal dosage range)를 확인하는데 도움이 되도록 시험관내 검사가 선택적으로 이용될 수 있다. 제제에 이용되는 정확한 용량은 투여 경로 및 질병이나 질환의 심각도에 좌우되고, 의사의 판단과 각 환자의 상황에 따라 결정된다. 효과량은 시험관내 또는 동물 모형 검사 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선(dose-response curve)으로부터 외삽된다. 투여되는 조성물의 용량은 표준 용량-반응 연구와 함께, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 이러한 결정을 내릴 때 고려해야 하는 관련된 상황에는 치료되는 질환, 투여되는 조성물의 선택, 개별 환자의 연령, 체중과 반응 및 환자 증상의 심각도가 포함된다. 가령, 실제 환자 체중을 이용하여 투여되는 제제의 용량을 밀리리터(㎖) 단위로 산정할 수 있다. "이상적인" 중량에서 하향 조정(downward adjustment)은 없다. 이런 상황에서, 적절한 용량은 아래의 공식에 의해 산정될 수 있다: 용량(㎖) = [환자 체중(㎏) x 용량 수준(㎎/㎏)/ 약제 농도(㎎/㎖)].

원하는 치료 효과를 달성하기 위하여, 항-C5 항체는 다양한 단위 제형으로 투여될 수 있다. 용량은 특정 항체에 따라 달라진다. 가령, 상이한 항체는 상이한 부피 및/또는 친화성을 나타내고, 따라서 상이한 용량 수준을 요구한다. Fab' 단편 또는 단일 사슬 항체로서 제조된 항체 역시 등가의 고유 면역글로불린과 상이한 용량을 필요로 하는데, 그 이유는 이들의 부피가 고유 면역글로불린보다 훨씬 적고, 따라서 환자의 혈액 내에서 동일한 몰 수준에 도달하는데 더욱 적은 용량이 필요하기 때문이다.

본 발명의 다른 치료제 역시 다양한 단위 제형으로 투여될 수 있는데, 이들의 용량 역시 투여되는 특정 치료제의 크기, 효능(potency)과 생체내 반감기(in vivo half-life)에 따라 달라진다.

본 발명의 치료제의 용량은 또한, 투여 방식, 치료되는 환자의 특정 증상, 상기 환자의 전반적인 건강, 상태, 크기와 연령 및 처방 의사의 판단에 따라 달라진다.

본 발명의 제제는 포장 물질(packaging material) 및 보체를 저해할 수 있는 항체와 투여 방식에 적합한 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학적 작용제를 포함하는 제조 물품(article of manufacture)으로서 유통될 수 있다. 포장 물질에는 상기 제제가 항체 매개된 신경병증의 치료에 사용된다는 것을 지시하는 라벨(label)이 포함될 수 있다. 항체, 특히, 인간에서 하류 보체 성분(downstream complement component)의 축적을 감소시키는데 안전하고 효과적인 것으로 이미 밝혀진 항-C5 항체가 선호되긴 하지만, 다른 보체 저해물질의 이용 역시 본 발명에 의해 안출된다. 본 발명의 약학적 제제와 용도는 당분야에 공지된 임의의 보체 저해물질 또는 항체 매개된 신경병증 치료제와 복합될 수도 있다.

치료 방법

본 발명의 방법은 항체 매개된 신경병증(antibody mediated neuropathy) 연관된 증상을 치료하는데 이용될 수 있다. 가령, 본 발명의 방법은 AGA 매개된 신경병증 증상을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome) 연관된 증상을 치료하는데 이용될 수 있다. 항체 매개된 신경병증의 치료제는 표준 수단에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 치료제는 항체 매개된 신경병증을 치료하기 위한 본 발명의 다른 치료제 또는 공지된 치료제와 병용될 수 있다. 본 발명의 치료제는 항체 매개된 신경병증의 증상을 치료하는 다른 치료제와 공동-투여될 수 있다. 본 발명의 치료제의 투여는 일반적으로, 비경구 경로(parenteral route)에 의해, 전형적으로, 동맥내 또는 정맥내 주사(가령, 정맥내 주입) 또는 근육내 주사와 같은 주사를 통하여 수행된다. 투여되는 보체를 저해할 수 있는 특정 항체에 적합한 경우에 다른 투여 경로, 예를 들면, 경구(p.o.) 경로가 이용될 수도 있다.

참조에 의한 편입

본 명세서에 언급된 모든 간행물과 특허는 순전히 참조로서 편입된다. 상충되는 경우에, 본 명세서에서 임의의 정의를 비롯한 본 발명이 우선한다.

본 발명의 방법은 아래의 실시예에 관련하여 기술되는데, 이들 실시예는 예시의 목적으로 제공되고 본 발명을 결코 한정하지 않는다. 당분야에 널리 공지된 표준 기술, 또는 아래에 구체적으로 설명된 기술이 이용된다.

실시예 1. 에쿨리주맙은 시험관내 MFS 모형에서 보체-매개된 구조적 병소와 기능적 병소를 예방한다.

시험관내 MFS 모형에서, 에쿨리주맙에 대한 음성 대조(negative control)로서 기능하는 무관한 아이소타입 대응된 mAb(100 ㎍/㎖)의 존재에서 CGM3 항-GQ1b mAb와 정상 인간 혈청(NHS)으로 횡격막 신경-근육 표본의 처리는 NMJ에서 보체 활성화를 유도하였다. 이는 C3c와 MAC 침착(도 1A, 1B, 1D, 1E와 1F), 그리고 에치디움 호모다이머(ethidium homodimer-1, EthD-1) 염색으로 확인되는 손상된 시냅스주위 슈반 세포(perisynaptic Schwann cell, pSC)와 운동 신경 말단 및 신경섬유(NF) 염색의 상실(각각, 도 1C, 1E와 1F)에 의해 형태학적으로 확증되었다. 이들 특징은 이전에 보고된 특징과 일치하였다(Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708(1999); Halstead et al. Brain 127:2109-2123 (2004); O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). 보체 공급원으로서 NHS에 100 ㎍/㎖ 에쿨리주맙의 첨가는 MAC 침착(도 1B, 1D, 1E와 1F; p<0.001) 및 말단 축삭 NF 상실(도 1C와 1F; p<0.001)을 완전히 예방하는 반면, 더욱 이전의 보체 성분 C3c의 침착은 영향을 받지 않았다(도 1A와 1D; p= 0.2). 게다가, pSC에 대한 손상이 소멸되었는데, 그 이유는 대조 mAb-처리된 조직에서 조사된 1529개 NMJ 중에서 33%와 비교하여, 조사된 1439개의 NMJ 중에서 2%만 하나이상의 EthD-1 양성 핵(positive nucleus)을 보유하였기 때문이다(도 1E; p<0.001).

이들 면역조직학적 관찰결과는 전기생리학적 관찰결과 및 기능적 관찰결과에 상응하였다. CGM3 미리 배양된 NMJ에서, 대조 mAb의 존재에서 NHS(40%)는 기존 문헌(Goodyear et al. J. CHn. Invest 104:697-708 (1999))에서 보고된 바와 같이, 미세 종판 전위(MEPP, 전시냅스 운동 신경 말단으로부터 단일 아세틸콜린 양자(acetylcholine quantum)의 자발적 방출로부터 발생하는 후시냅스 현상(postsynaptic event))의 빈도에서 상당한 증가를 유도하였다. 이러한 효과는 100 ㎍/㎖ 에쿨리주맙에 의해 거의 완전하게 예방되었다. MEPP 빈도는 50 ㎍/㎖ CGM3 배양 전후에 대략 0.7 s^-1이었고, 100 ㎍/㎖ 대조 mAb가 첨가된 NHS의 존재에서 34.0 ± 4.6 s^-1로 증가하였다. 대조적으로, 100 ㎍/㎖ 에쿨리주맙이 첨가된 NHS의 존재에서 MEPP 빈도는 3.1 ± 1.3 s^-1에 불과하였다(도 2A와 2B; n = 5개 근육; p<O.001).

에쿨리주맙은 근섬유 안정막 전위(muscle fiber resting membrane potential) 또는 MEPP 크기(amplitude), 상승 시간(rise time)과 붕괴 시간(decay time)을 변화시키지 않았다(데이터 제시되지 않음). 기존 문헌(Goodyear et al. J. CHn. Invest 104:697-708 (1999); Plomp et al. Ann. Neurol. 45:189-199 (1999))에서 보고된 바와 같이, 개별 근섬유(muscle fiber)의 비동기 경련(asynchronous twitching)이 NHS 배양 동안 나타난다(평균 시각 스코어(median visual score) 4; n = 5개 근육). 에쿨리주맙은 이런 높은 등급의 경련을 예방하고, 1의 평균 스코어만 관찰되는데(도 2C; n = 5개 근육, p<0.01, Mann-Whitney 검증), 이는 CGM3 배양 전후에 관찰 기간(observation period)에 관찰된 낮은 기초 수준(basal level)에 필적한다.

항-CGM3/보체-매개된 전시냅스 손상의 최종 결과는 아세틸콜린을 방출하지 못함으로 인한 NMJ에서 시냅스 전달의 차단이다(Goodyear et al. J. CHn. Invest 104:697-708 (1999)). 에쿨리주맙은 이러한 효과를 완전히 예방하였다. '침묵' NMJ(즉, MEPP와 신경-자극 촉발된 근육 활동 전위(muscle action potential)의 부재)는 전혀 관찰되지 않는 반면, 대조 mAb 조건에서는 견본으로 조사된 NMJ의 총수에서 19 ± 2.6 %가 침묵하는 것으로 관찰되었다(도 2D; n = 5개 근육). 더 나아가, 시험관내 MFS 모형에서 근육 마비(muscle paralysis)에 대한 에쿨리주맙의 보호 효과를 정량하였다. 에쿨리주맙은 200 ㎍/㎖ CGM3과 33% NHS 처리후 농도 의존성 방식(concentration dependent manner)으로, 편측 횡격막 표본의 신경 자극-촉발된 수축력(contraction force)의 상실을 저해하였다(도 2E와 2F). 에쿨리주맙 없는 대조 실험에서, NHS는 90분 이내에 수축력의 거의 완전한 상실을 유도하였다. NHS에 3 또는 6 ㎍/㎖ 에쿨리주맙의 첨가는 수축력 상실의 속도를 현저하게 완만하 게 하였다(50% 상실이 대조 조건에서 27분과 비교하여, 각각 39분과 60분에 관찰되었다; 도 2F). 9와 12 ㎍/㎖의 더욱 높은 농도의 에쿨리주맙은 거의 완전한 보호 효과를 나타내고(90분후 최초 수축의 >90% 유지), 25, 50과 100 ㎍/㎖는 수축의 CGM3/NHS-유도된 상실을 완전하게 예방하였다. 획득된 농도-효과 데이터 지점(concentration-effect data point)을 통하여 일치된 Boltzmann S자 곡선(sigmoidal curve)은 이들 조건 하에서 에쿨리주맙에 대하여 7.1 ㎍/㎖의 EC₅₀을 산출하였다(도 2G).

이들 면역학적 분석결과와 기능적 분석결과는 에쿨리주맙이 시험관내 MFS 모형에서 보체-매개된 병리생리학적 효과(pathophysiological effect)를 효율적으로 예방한다는 것을 증명한다.

실시예 2. 생체내 에쿨리주맙 용량 반응 곡선.

그 다음, 귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)의 이러한 뮤린 모형(murine model)에서 에쿨리주맙의 생체내 이익을 조사하였다. 생쥐는 항-갱글리오사이드 항체 또는 PBS(음성 대조로서)로 수동 면역시키고, 이후 PBS에서 0, 50, 100, 200과 400 ㎍/생쥐로 NHS(복강내)와 에쿨리주맙(정맥내)을 동시 주입하였다. 보체 C3은 항-갱글리오사이드 항체가 투여된 모든 생쥐의 NMJ에서 풍부하게 침착되었다. 증가하는 용량의 에쿨리주맙은 NMJ에서 MAC 침착의 용량-의존성 감소(dose-dependent reduction)를 결과한다(도 3A). 신경섬유 신호의 조사는 PBS 처리된 기준선 대조와 비교하여, 조사된 에쿨리주맙의 모든 용량에서 축삭 일체성의 보존을 증명한다(각 용량에서, n = 3)(도 3B).

실시예 3. 에쿨리주맙은 생체내 MFS 모형에서 신경병증과 호흡 마비로부터 보호한다.

에쿨리주맙의 생체내 효능을 결정하기 위하여, 보체 공급원으로서 CGM3 항-GQ1b 항체와 NHS의 복강내 주입을 통하여 생체내 MFS 생쥐 모형을 산출하였다. CGM3 주입후 16시 시점에, 200 ㎍ 용량의 에쿨리주맙 또는 대조 mAb를 꼬리 정맥(tail vein)을 통하여 전신 투여하고, 이후 0.5 ㎖ NHS를 복강내 주입하였다. 에쿨리주맙과 NHS의 상이한 주입 경로(injection route)의 프로토콜은 복강(peritoneal cavity)의 제한(confinement) 내에서 에쿨리주맙에 의한 NHS에서 C5의 즉시 저해(immediate inhibition)를 피하기 위하여 적용되었다. CGM3, NHS와 대조 mAb로 처리된 생쥐(n = 10)는 NHS 주입후 2시간 이내에 전반적으로 약화된 외관, 일부 경우에, 저배 자세(low-back posture), 함입된 배의 옆구리 및 호흡 장애(breathing difficulty)(헐떡임)가 발생하였다. 정맥내 에쿨리주맙 주입은 이들 증상의 발생을 완전하게 예방하였다(n = 11). 대조 mAb 또는 에쿨리주맙 및 NHS의 주입 이전과 주입 이후 2시 시점에, CGM3 미리 처리된 생쥐에서 악력 측정(grip-strength measurement)으로 약화를 정량하였다(도 4A). 대조 군 생쥐(n = 5)는 대조 mAb와 NHS 주입 직전에 56.0 ± 5.7 g을 견인하는 반면, 에쿨리주맙 군 생쥐(n = 5)는 이 단계에서 54.3 ± 8.4 g을 견인하였다(p = 0.87). 대조 mAb/NHS 주입후 2시 시점에 견인력(pulling force)은 22% 낮았다(43.7 ± 4.5 g; p<0.005). 에쿨리주맙은 이런 효과를 완화시켰다(8% 감소; p=0.07). 호흡 곤란(respiratory disturbance)은 6시간 동안 mAb/NHS 주입후 지속적으로, 전신 체적변동기록으로 평가하였다(도 4B와 4C; n = 5마리 생쥐/군). CGM3 주입 이전에 이러한 일회호흡량(tidal volume)은 양쪽 군에서 유사하였다(대조 mAb 군과 에쿨리주맙 군에서 각각, 0.21 ± 0.01과 0.22 ± 0.03 ㎖). NHS 주입후 4시와 6시 시점에, 대조 mAb 군에서 대략 50%의 감소(p<0.001)가 관찰되었다. 이런 감소는 에쿨리주맙에 의해 거의 예방되었다(이들 시점에서 17% 감소, 도 4B). 유사하게, 대조 mAb 군에서 호흡수(respiration rate)는 NHS 주입후 4시와 6시 시점에 대략 30% 감소하였다(p<0.01). 에쿨리주맙 군에서, 이러한 감소는 7%에 불과하였다(도 4C). 양쪽 처리군은 CGM3 주입 이전에 호흡수와 비교하여, mAb/NHS 주입후 2시 시점에 측정에서 호흡수의 대략 40%의 동등한 최초 감소를 보였는데, 이는 명백하게, 복강내 주입 섭생에 기인하였다. 획득된 호흡 신호(respiration signal) 흔적의 실례는 도 4D에 도시된다.

편측 횡격막 횡격 신경 표본은 NHS 주입후 4시 시점에, 생체내 CGM3/NHS 처리된 생쥐로부터 떼어내고, NMJ에서 전기생리학적 측정, 근육수축 실험과 상세한 면역조직학적 분석을 수행하였다. 시각 검사에서, 횡격 신경의 초극대 전기 자극(supramaximal electrical stimulation) 이후에 에쿨리주맙-처리된 생쥐로부터 획득된 근육의 완전한 수축과 비교하여, 대조 mAb-처리된 생쥐로부터 근육의 극히 일부만 수축하는 것으로 확인되었다. 수동 면역화(passive immunization)로부터 수확된 조직 내에서 시험관내 수축 실험에서, 이러한 효과를 정량하였다(도 4E와 4F). 대조 mAb 군(n = 4)에서 경련과 강직(40Hz) 긴장은 각각, 0.07 ± 0.06과 0.92 ± 0.61 g인 반면, 에쿨리주맙 군(n = 4)에서 이들은 각각, 1.36 ± 0.29와 9.26 ± 0.65 g이고, NHS 처리되지 않은 연령-대응된 생쥐로부터 근육의 수치에 필적하였다(데이터 제시되지 않음). 전기생리학적 분석으로, 마비가 NMJ 기능장애(dysfunction)에 의해 유발되는 지를 조사하였다. 대조 mAb 군으로부터 떼어낸 근육에서, 견본으로 조사된 NMJ의 66 ± 7%가 '침묵'하였다, 다시 말하면, 신경 자극(nerve stimulation) 이후에, 탐지가능 MEPP 및 근육 활동 전위가 관찰되지 않았다. 에쿨리주맙 군에서는 단지 3 ± 2%만 '침묵'하였다(도 4G와 4H; p<0.001). 면역조직학적 분석에서, CGM3은 2가지 처리군의 NMJ에서 동등하게 침착되는 것으로 밝혀졌다(데이터 제시되지 않음). C3c 침착물은 에쿨리주맙 군에서 강도가 다소 덜하긴 하지만 양쪽 군의 NMJ에서 확인되었다(도 5A와 5D; p<0.001). MAC는 대조 mAb-처리된 생쥐로부터 근육의 NMJ에서는 분명하게 침착되지만, 에쿨리주맙-처리된 군에서는 실질적으로 부재하였다(도 5B, 5D와 5E). 에쿨리주맙은 종판 영역(endplate region) 위에서 NF 신호 강도와 패턴에 의해 확증되는 바와 같이, 대조-mAb-처리된 생쥐의 NMJ에서 말단 일체성의 상실을 예방하였다, 다시 말하면, 말단 축삭 가지(terminal axonal branching)가 본래 상태로 분명하게 존속하였다(도 5C와 5E). 이에 더하여, 전기 검경(electron microscopy)은 특징적인 말단 팽창(swelling), 시냅스 소포 고갈(synaptic vesicle depletion)과 팽창된 미토콘드리아(swollen mitochondria)를 보이는 대조-mAb-처리된 생쥐 것과 비교하여, 에쿨리주맙-처리된 생쥐의 NMJ에서 충분히 보존된 전시냅스 초미세구조(ultrastructure)의 존재를 증명하였다(도 5F)(O'Hanlon et al. Brain 124:893- 906 (2001)). 이들 전기생리학적, 기능적, 그리고 면역조직학적 데이터는 보체-매개된 말단 운동 신경병증이 생체내 MFS 모형에서 발생하고, 횡격막 마비가 관찰된 호흡 결함(respiratory deficit)의 원인이 된다는 것을 증명한다. 더욱 중요하게는, 생체내 에쿨리주맙 처리는 이들 생체내 신경병증 결함(neuropathological defect)을 효과적으로 예방하였다.

실시예 4. 방법

생쥐

수컷 Balb/c 생쥐(3-6 주령, 10-25 g)는 Harlan(UK 또는 NL)으로부터 구입하였다. 일부 근육 수축 실험(하기 참조)에서, 수컷과 암컷 GM2/GD2-신타아제 null-변이 생쥐(Bullens et al. J. Neurosci. 22:6876-6884 (2002))는 12-22 주령(19-37 g)에 이용되었다. 모든 동물 실험은 UK Home Office 가이드라인(UK PPL60/3096), Dutch 법규 및 Glasgow and Leiden University 가이드라인에 따라 수행되었다.

단클론 항체와 정상 인간 혈청

IgM 항-GQ1b 갱글리오사이드 mAb, CGM3은 GT1a-보유 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 리포올리고사카라이드(lipooligosaccharide)로 접종된 생쥐로부터 유래되었다(Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708 (1999)). CGM3은 말단 디시알릴갈락토오스 구조(disialylgalactose structure)를 공유하는 갱글리오사이드 GQ1b, GD3과 GT1a와 반응한다. 기존 연구에서, CGM3은 유사한 갱글리오사이드 특이성을 보유하고, 인간 MFS 혈청으로서 동일한 보체-의존성 병원성 효과(pathogenic effect)를 유도하는 것으로 밝혀졌다(Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708 (1999)). CGM3 농도는 정량적 ELISA(Bethyl Laboratories, Texas, USA)를 이용하여 측정하였다. 정상 인간 혈청(NHS)은 새로 동결되고, 보체 활성을 보존하기 위하여 -7O℃에서 복수 분량으로 보관된 단일 공여자 스톡(donor stock)으로부터 채취하였다. 실험적 이용에 앞서, CGM3과 NHS는 링거액(116 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 1 mM NaH₂PO₄, 23 mM NaHCO₃, 11 mM 글루코오스, pH 7.4)에 4℃에서 24시간 동안 투석하고, 95% O₂/5% CO₂로 미리 가스처리(gassing)하였다. 인간화 항-인간 C5 mAb 에쿨리주맙과 비-특이적인 아이소타입-대응된 대조 mAb ALXN3300은 Alexion Pharmaceuticals(Cheshire, USA)로부터 구입하고 4℃에서 보관하였다.

시험관내 MFS 모형

CGM3과 NHS를 이용한 MFS에 대한 시험관내 모형은 기존 문헌(Goodyear et al. J Clin. Invest 104:697-708 (1999); O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001))에서 기술되었다. 간단히 말하면, 횡격 신경(또는 일부 경우에 예시적인 NMJ 면역조직을 위하여 삼각형 자루 근육(triangularis sterni muscle))이 부착된 생쥐 편측 횡격막은 떼어내고, 실온(20-22℃)에서 링거 매체(Ringer's medium)에 올려놓았다. 처리되지 않은 소형 대조 절편(section)은 배양에 앞서 각 근육 표본으로부터 제거하고, 차후의 기준선 면역조직학적 분석을 위하여 드라이아이스 상에서 순간 동결시켰다. 근육은 32℃에서 2-2.5시간 동안, 그리고 4℃에서 30분 동안 CGM3(50 ㎍/㎖)과 함께 배양하고, 이후 실온에서 10분 동안 평형화시키고, 링거 매 체에서 씻어내고, 실온에서 1시간 동안 링거 매체에서 33 또는 40% NHS에 차후 노출시켰다. 에쿨리주맙(100 ㎍/㎖) 또는 대조 mAb(100 ㎍/㎖)는 근육 표본의 배양 10분전에 NHS와 혼합하였다. NMJ에서 시험관내 전기생리학적 측정(하기 참조) 및 이러한 모형에서 NMJ에서 통제되지 않은 전달물질 방출(transmitter release)의 징표인 근섬유 경련의 스코어링(scoring)(Jacobs et al. Muscle Nerve 25:549-558 (2002); O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001))은 CGM3 배양 전후에, 그리고 1시간 NHS 배양 동안 수행하였다. 근육 조각(muscle strip)은 NHS와 함께 배양 전후에, 드라이아이스 상에서 동결시키고 -20℃에서 보관하였다. NMJ와 말단 운동 축삭은 IgM, C3c, MAC, NF의 수준 및 pSC 생존능(viability)을 평가하였다(하기 참조).

생체내 MFS 모형

Balb/c 생쥐(3-4 주령, 10-15 g)는 1.5 ㎎ CGM3을 복강내 주입하고, 16시간후 0.5 ㎖ 100% NHS를 복강내 주입하였다. 생쥐는 추가로 4-6시간 동안 관찰하고, 기존 문헌(Kaja et al. Eur J. Neurosci 25:2009-2020 (2007))에서 기술된 바와 같이, 전신 체적변동기록(하기 참조)과 악력 검사(grip-strength testing)로 분석하였다. 생쥐는 이후, CO₂ 질식(asphyxiation)으로 희생시키고, 편측 횡격막 근육 조직을 떼어내고 전기생리학적 실험과 근육 수축 실험(하기 참조)에서 분석하거나, 또는 면역조직학적 분석(하기 참조)을 위하여 더욱 처리하였다. 생체내 증상 및 차후에 분석된 전기생리학적, 기능적, 그리고 조직학적 병소에 대한 에쿨리주맙의 효 과는 이러한 모형에서, 복강내 NHS 주입 직전에 꼬리 정맥(tail vein) 내에 200 ㎍ 에쿨리주맙 또는 대조 mAb를 주입함으로써 조사하였다. 최초 용량-범위(dose-range) 확인 실험결과(데이터 제시되지 않음)는 >50 ㎍/생쥐의 용량에서 에쿨리주맙이 신경병증으로부터 보호한다는 것을 지시하였다.

체적변동기록

생체내 실험에서 호흡 파라미터(breathing parameter)에서 변화를 증명하기 위하여 비-침해성 전신 체적변동기록(EMMS, Hants, UK)이 이용되었다. 기준선 데이터는 실험의 시작에 앞서 수집하였다. 생쥐는 CGM3을 주입하고, 16시간후 에쿨리주맙 또는 대조 mAb와 함께 NHS를 투여하고(상기한 바와 같은 프로토콜), 6시간 동안 연속적으로 모니터하였다. 호흡 빈도와 일회호흡량의 흐름 유래된 파리미터(flow derived parameter)는 25개의 인정된 호흡(accepted breath)으로부터 수집하고 1시간 기간으로 평균하였다.

NMJ의 시험관내 전기생리학적 분석 및 근육 수축력(contractility)의 시각적 스코어링(visual scoring)

횡격 신경이 부착된 좌측과 우측 편측 횡격막은 실온에서 실리콘-고무 라인 접시(silicone rubber-lined dish) 내에 1.5 ㎖ 링거 매체에서 떼어내고 핀 아웃(pin out)하였다. 미세 종판 전위(MEPP, 전시냅스 운동 신경 말단으로부터 단일 아세틸콜린 양자(acetylcholine quantum)의 자발적 방출로부터 발생하는 후시냅스 현상(postsynaptic event))의 세포내 기록(intracellular recording)은 20-22℃에서 NMJ에서 수행하였다. 근섬유는 신호의 증폭과 필터링(filtering)(10 kHz 로우 패스(low-pass))을 위하여 GeneClamp 500B 증폭기(amplifier)(Axon Instruments/Molecular Devices, Union City, CA, USA)에 연결된, 3 M KCl로 충전된 10-20 MΩ 유리 마이크로-전극(glass micro-electrode)으로 NMJ 인근에 꿰매어졌다. 신호는 디지털화시키고, 보관하고, Digidata 1322A 인터페이스, Clampex 9.2와 Clampfit 9.2 프로그램(모두, Axon Instruments/Molecular Devices), Mini 분석 6.0(Synaptosoft, Fort Lee, USA) 및 Matlab에서 프로그램된 루틴(routine)(The Math Works Inc., Natick, MA, USA)을 이용하여 분석하였다(오프-라인(off-line)).

CGM3/보체-매개된 전시냅스 손상에 기인하는 높은 MEPP 빈도에 의해 유도되는 자발적 비동기 섬유 경련(spontaneous asynchronous fiber twitch)의 발생(Plomp et al. Ann. Neurol. 45:189-199 (1999))은 5분마다 시각적으로 등급을 매겼다(O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). 조직은 활성 없음의 경우에 0, <10개 섬유의 경련의 경우에 1, 조직 전체에 소량 경련의 경우에 2, 중간량 경련의 경우에 3, 대량 경련의 경우에 4. 각 측정 기간 동안 평균 스코어를 산정하였다. CGM3/보체-매개된 전시냅스 손상의 최종 결과는 NMJ에서 시냅스 전달의 침묵(silencing)이다.

'침묵' NMJ(즉, 탐지가능 MEPP 및 횡격 신경-자극 촉발된 근육 활동 전위의 발생 없음)의 숫자는 각 실험 조건 하에 근육내에서, 견본으로 조사된 NMJ의 총수(8-41)의 비율로서 표시하였다.

근육 수축 실험

편측 횡격막 표본의 신경 자극-촉발된 수축력의 시험관내 CGM3/NHS-유도된 상실에 대한 에쿨리주맙의 보호 효능을 조사하였다. GM2/GD2-신타아제 null-변이 생쥐로부터 횡격막을 이용하였는데, 그 이유는 기존 연구에서 수축의 CGM3/NHS-유도된 상실에 대한 이러한 변종(strain)의 근육의 더욱 높은 감수성(sensitivity)이 확인되었기 때문이다(Bullens et al. J. Neurosci. 22:6876-6884 (2002)). 32℃에서 3시간 동안 200 ㎍/㎖ CGM3과 함께 미리 배양된 좌측과 우측 횡격 신경/편측 횡격막 표본은 실온(20-22℃)에서, 2.25 ㎖ml 링거 매체를 포함하는 실리콘-고무 라인 접시에 올려놓고, 95% O₂/5% CO₂로 연속적으로 발포하였다. 상기 근육의 흉곽 측면(ribcage side)은 복수의 소형 핀으로 접시의 바닥에 단단하게 고정시키고, 중심널힘줄(central tendon)은 기존 문헌(Kaja et al. Eur J. Neurosci 25:2009-2020 (2007))에 기술된 바와 같이, 증폭기(amplifier)와 디지털화 기구(digitizing equipment)에 연결된 힘변환기(force transducer)에 금속 후크(metal hook)와 끈(string)을 통하여 연결하였다. 100 ㎲ 지속 기간의 초극대 자극(통상적으로, ~10 V)은 Master-8 프로그램가능 자극장치(stimulator)(AMPI, Jerusalem, Israel)로부터 40 Hz에서 3s 동안 5분마다 전달하였다. 극대 자극된 강직 수축력(통상적으로, 대략 10 g)을 달성하기 위하여 Vernier 컨트롤로 기초 긴장(basic tension)을 조정하였다. 유도된 수축의 안정성은 30-50분 동안 모니터하였다. 차후에, 매체를 에쿨리주맙(3, 6, 9, 12, 25, 50 또는 100 ㎍/㎖)이 추가되고 첨가에 앞서 ~10분 동안 혼합된 NHS(33%)로 교체하고, 95% O₂/5% CO₂로 연속적으로 부드럽게 발포하면서 100-200분 동안 효과를 모니터하였다. 에쿨리주맙 첨가 없는 대조 실험에서, 100 ㎍/㎖의 대조 mAb를 NHS에 추가하였다. 수축의 크기는 각 신경 자극 작업의 시작후 2s에서, Clampfit 9.0 프로그램(Axon Instruments/Molecular Devices, Union City, USA)에서 오프-라인 커서-측정하였다.

강직과 경련 수축력 역시 생체내 MFS 프로토콜에 종속되었던 생쥐로부터 떼어낸 좌측 편측 횡격막 근육의 시험관내 신경 자극 이후에 측정하였다.

면역조직학적 분석

고정되지 않은 편측 횡격막 절편은 Lipshaw's M-1 적재 배지(mounting medium)(Pittsburgh, PA, USA)에 올려놓고, 3-아미노프로필트리에톡시실란(aminopropyltriethoxysilane) 코팅된 슬라이드로 종단 냉동조직 절편(longitudinal cryostat section)(8-20 ㎛)을 절단하고, 자연 건조시키고, 이후 -20℃에서 보관하였다. NMJ 위치를 확인하기 위하여, TRITC와 Bodipy-표지된 α-붕가로톡신(bungarotoxin)(α-BTx, 1.3 ㎍/㎖로 1/750 희석됨; Molecular Probes, Eugene, Oregon)을 이용하였다. 중간 보체 성분 C3c는 4℃에서 1시간 동안 FITC-표지된 토끼 항-C3c(1/300; Dako, Ely, UK)와 함께 배양으로 탐지하였다. MAC는 각각, 4℃에서 1시간 동안, 생쥐 항-인간 C5b-9(1/50; Dako)와 FITC 결합된 염소 항-생쥐 IgG(1/300)를 순차적으로 이용하여 탐지하였다.

NF 염색을 위하여, 고정되지 않은 조직의 절편은 4℃에서 1시간 동안 TRITC-결합된 α-BTx와 함께 미리 배양하고, 씻어내고, -20℃에서 20분 동안 에탄올에 담그고, 이후 실온에서 하룻밤동안 토끼 다클론 혈청 1211(1/750; 인산화된 NF와 반응; Affiniti Research Products Ltd. Exeter, UK)과 함께, 이후 4℃에서 3시간 동 안 FITC 결합된 염소 항-토끼 IgG(1/300; Southern Biotechnology Associates)와 함께 배양하였다. 모든 탐지 항체는 인산염-완충된 염수(phosphate-buffered saline, PBS)에서 희석하였다.

pSC 생존능(viability)은 막-투과된 세포(membrane-permeabilized cell)의 핵산을 적색 형광(red fluorescence)으로 표지하는 막 불투과 염료(membrane impermeant dye), EthD-1(Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)을 이용하여 평가하였다. 간단히 말하면, 신경-근육 표본은 2 μM EthD-1을 포함하는 링거 매체에 노출시켰다. 조직은 실온에서 1시간 동안 암실에서 배양하고, 링거액에서 씻어내고, 면역조직연구(immunohistology)를 위하여 동결시켰다. NMJ는 Bodipy 결합된 α-BTx(1.3 ㎍/㎖) 염색으로 15 ㎛ 냉동조직 절편(cryostat section)에서 확인하고, NMJ에서 EthD-1 양성 핵(positive nucleus)을 갖는 NMJ의 비율을 산정하였다.

예증을 위하여, 전재 삼각형 자루 근육(whole mount triangularis sterni muscle)은 CGM3(50 ㎍/㎖)과 형광색소(fluorochrome)-결합된 α-BTx(TRITC/FITC/CYS)(2 ㎍/㎖; 1:500)과 함께, 이후 NHS + 에쿨리주맙 또는 대조 mAb와 함께 배양하였다. 표본은 실온에서 1시간 동안 링거 매체에서 형광 결합된 α-BTx 및 다양한 농도의 생쥐 항-C5b-9(1:40; Dako), 항-C3c-FITC(1:200; Dako), 또는 EthD-1(2 μM)과 함께 배양하고, 링거 매체에서 씻어내고, 이후 PBS에 녹인 4% 포름알데히드(formaldehyde)에서 20분 동안 고정시켰다. 비반응성 알데히드 기는 0.1 M 글리신(glycine)과 함께 10분 동안 배양함으로써 소멸시켰다. 항체는 이후, PBS에 다시 집어넣고, 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 세포내 항원의 염색을 위하여, 근육은 4% 포름알데히드에서 20분 동안, 이후 0.1 M 글리신에서 10분 동안 고정시키고, PBS에 녹인 0.5% Triton-X100의 투과성 용액(permeabilizing solution)에서 RT에서 30분 동안 배양하고, 투과성 용액에 희석된 토끼 항-S100(1:150; Dako) 또는 토끼 항-NF(1:150; Chemicon, Hampshire, UK)를 실온에서 하룻밤동안 가하였다. 조직은 PBS에서 씻어내고, 필요한 경우에, 1:300 희석된 아래의 형광 결합된 항체; 항-토끼 IgG-FITC, 항-생쥐 IgG-FITC 또는 항-생쥐 IgG-TRITC에서 배양하고, RT에서 7시간 동안 암실에서 교반하였다. 조직은 PBS에서 씻어내고 Citifluor 적재 배지(mounting medium)(Citifluor Products, Canterbury, UK)에 올려놓았다.

영상 획득(image acquisition), 정량(quantitation)과 통계학적 분석(statistical analysis)

디지털 영상은 ApoTome와 함께, Zeiss Pascal 공초점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscope)과 Zeiss Axio Imager Z1을 모두 이용하여 포착하였다. 영상-분석 측정은 Scion Image(Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA) 영상 분석 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. IgM, C3c, MAC와 NF의 정량적 분석을 위하여, 각 마커의 3회 염색 작업을 최소한 3개의 개별 편측 횡격막으로부터 조직에서 수행하고, 기존 문헌(O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001))에 기술된 바와 같이 정량하였다. 모든 연구는 관찰자 맹검이었다. 비-모수 데이터(non-parametric data)의 면역조직학적 분석을 위하여, 1% 유의성(significance) 수준을 이용한 Mann-Whitney 검증으로 통계학적 비 교(statistical comparison)를 수행하였다. NMJ에서 EthD-1 양성 pSC의 비교를 위하여, 1% 유의성 수준에서 카이-제곱(chi-squared) 검증을 이용하였다.

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Claims

항체 매개된 신경병증(antibody mediated neuropathy)을 앓는 포유동물을 치료하는 방법에 있어서, 보체 캐스케이드 저해물질(complement cascade inhibitor)의 치료 효과량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 포유동물은 항-갱글리오사이드(anti-ganglioside) 항체 또는 항-당지질 항체(anti-glycolipid, AGA) 매개된 신경병증을 앓는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 항체 매개된 신경병증은 급성 운동성 축삭 신경병증(acute motor axonal neuropathy), 급성 염증성 탈수초성 다발신경병증(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy), Bickerstaff 뇌간뇌염(Bickerstaff's brainstem encephalitis), 급성 외안근마비(acute ophthalmoparesis), 운동실조성 귈레인 바레 증후군(ataxic Guillain-Barre syndrome), 인두-경부-팔 약화(pharyngeal-cervical-brachial weakness), 항-당지질 항체를 동반하는 만성 신경병증 증후군(chronic neuropathy syndrome), 항-MAG IgM 파라프로테인성 신경병증(paraproteinemic neuropathy), 항-디시알로실 항체(anti-disialosyl antibody)를 동반하는 만성 감각성 운동실조성 신경병 증(chronic sensory ataxic neuropathy), IgM, IgG와 IgA 파라프로테인성 신경병증(paraproteinemic neuropathy), 항-GM1과 항-GM2 항체를 동반하는 운동 신경병증(motor neuropathy), 만성 염증성 탈수초성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating neuropathy, CIDP), 다초점성 운동 신경병증(multifocal motor neuropathy, MMN), 또는 다초점성 후천성 탈수초성 감각과 운동 신경병증(multifocal acquired demyelinating sensory and motor neuropathy, MADSAM)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 보체 캐스케이드 저해물질은 폴리펩티드, 폴리펩티드 유사체, 펩티드모방체(peptidomimetic), 항체, 핵산, RNAi 구조체, 핵산 유사체, 또는 소형 분자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 5에 있어서, 보체 캐스케이드 저해물질은 항체인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 6에 있어서, 항체는 완전 항체(whole antibody) 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 7에 있어서, 완전 항체 또는 항체 단편은 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항체 단편, 디아바디(diabody), 키메라화 또는 키메라 항체 또는 항체 단편, 인간화 항체 또는 항체 단편, 면역제거된 인간 항체 또는 항체 단편, 완전 인간 항체 또는 항체 단편, 단일 사슬 항체, Fv, Fab, Fab', 또는 F(ab')₂에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 6에 있어서, 항체는 고전 보체 경로(classical complement pathway), 보체 대체 경로(alternative complement pathway) 또는 렉틴 보체 경로(lectin complement pathway)의 활성화를 저해하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 6에 있어서, 항체는 보체 성분(complement component) C5, C5b, C6, C7, C8과 C9로 구성되는 군의 임의의 구성원에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 10에 있어서, 항체는 C5에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 11에 있어서, 항체는 C5 절단의 저해물질인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 12에 있어서, 항체는 에쿨리주맙(eculizumab)인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 12에 있어서, 항체는 펙셀리주맙(pexelizumab)인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 13에 있어서, 치료는 장기적인 치료인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 14에 있어서, 치료는 급성 에피소드(acute episode)의 치료를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 6에 있어서, 포유동물은 항체를 정맥내 투여함으로써 치료되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 6에 있어서, 항체는 포유동물에 전신 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 보체 캐스케이드 저해물질은 포유동물에 국소 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 치료는 포유동물에서 감소된 뉴런 손상(neural injury)을 결과하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 보체 캐스케이드 저해물질은 과도한 신경 손상에 기인하는 바람직하지 않은 생리 상태의 양(amount) 또는 정도(extent), 또는 둘 모두를 저해하거나 감소시키는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 21에 있어서, 바람직하지 않은 생리 상태는 눈 근육 마비(ophthalmoplegia), 운동실조(ataxia), 무반사(areflexia), 비정상적인 근육 공조(muscle coordination), 눈 근육의 마비, 근육에서 통증(aching pain), 건반사(tendon reflex)의 부재, 하지(lower extremities)에서 느껴지는 무감각(numbness)과 저림(tingling), 하지의 원위 근육(distal muscle)의 약화, 발처짐(footdrop), 전체 하지에서 약화, 상지(upper extremities)에서 약화, 호흡 근육에서 약화, 또는 사망에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 치료는 전시냅스 신경근 연접(presynaptic neuromuscular junction)에서 감소된 막 공격 복합체(membrane attack complex, MAC) 형성을 결과하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 치료는 미세 종판 전위(miniature endplate potential)의 정상 빈도를 복원하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 치료는 신경근 연접에서 시냅스 전달(synaptic transmission)을 복원하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 1에 있어서, 치료는 신경근 연접에서 말단 일체성(terminal integrity)의 상실을 저해하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)을 앓는 포유동물을 치료하는 방법에 있어서, 보체 캐스케이드 저해물질의 치료 효과량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 27에 있어서, 포유동물은 귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)의 밀러 피셔 변종(Miller Fisher variant)을 앓는 것을 특징으로 하는 치료 방법.