ES2616204T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento de neuropatías mediadas por anticuerpos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso en el tratamiento de una neuropatía mediada por anticuerpos anti-gangliósidos o anti-glicolípidos en un mamífero, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a: (i) el componente del complemento C5 e inhibe la escisión de C5 en fragmentos C5a y C5b; o (ii) C5b, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la formación del complejo de ataque a membrana; y en el que dicha neuropatía mediada por anticuerpos anti-gangliósidos o anti-glicolípidos se selecciona del grupo que consiste en: neuropatía axonal motora aguda, polineuropatía desmienilizante inflamatoria aguda, encefalitis del tallo cerebral de Bickerstaff, oftalmoparesia aguda, síndrome de Guillain-Barré atáxico, debilidad faríngeo-cervicalbraquial, síndromes de neuropatía crónica con anticuerpos anti-glicolípidos, neuropatía paraproteinémica IgM anti- MAG, neuropatía atáxica sensorial crónica con anticuerpos anti-disialosilo, neuropatía paraproteinémica IgM, IgG e IgA, neuropatía motora con anticuerpos anti-GM1 y anti-GM2, neuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), neuropatía motora multifocal (MMN), y neuropatía sensorial y motora desmielinizante multifocal adquirida (MADSAM).

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones para el tratamiento de neuropatfas mediadas por anticuerpos CAMPO DE LA INVENCION

Esta solicitud proporciona composiciones para el tratamiento de neuropatias mediadas por anticuerpos, que activan el complemento para inducir lesion neuronal. En realizaciones espedficas, la solicitud se refiere al uso de inhibidores de la cascada del complemento como agentes terapeuticos para tratar neuropatias mediadas por anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Neuropatfa es un termino generico utilizado para describir enfermedades del sistema nervioso periferico. Hay aproximadamente 200 causas diferentes conocidas de neuropatfas perifericas. Si bien la mayona de las neuropatfas afectan a las tres clases principales de fibras nerviosas en grados variables, algunas enfermedades implican solamente una o dos, y de este modo se dice que son neuropatfas pura o predominantemente motoras, sensoriales o autonomas.

El smdrome de Guillain-Barre (GBS) es una enfermedad aguda que implica al sistema nervioso periferico, que usualmente ocurre dos a tres semanas despues de una enfermedad de tipo gripe u otra infeccion, incluyendo enteritis por Campylobacter. Principalmente es una neuropatfa motora, lo que significa que sus smtomas estan relacionados en gran medida con la implicacion de los nervios motores. A pesar de la naturaleza primordialmente motora de la enfermedad, los smtomas mas tempranos pueden ser entumecimiento y hormigueo en las extremidades inferiores, seguido de un corto penodo de debilidad de los musculos distales de las extremidades inferiores. El peligro surge cuando la debilidad implica a los musculos de la respiracion. El GBS esta asociado en una proporcion de casos con autoanticuerpos antigangliosidos (AGA) contra un amplio intervalo de estructuras glicolfpidas espedficas, y tambien con anticuerpos contra otros componentes nerviosos, incluyendo protemas de mielina y glicosaminoglicanos en algunos casos, y en otros casos de GBS se supone que los anticuerpos estan presentes pero todavfa no han sido identificados formalmente.

El smdrome de Miller Fisher (MFS) es una variante del smdrome de Guillain-Barre, que da cuenta del 5-10% de los casos. En una encuesta, la incidencia anual se ha estimado en 0,09 por cada 100.000 personas de la poblacion. El MFS se caracteriza por el comienzo agudo de oftalmoplejfa, ataxia y arreflexfa. Anticuerpos anti-gangliosidos GQ1b son el sello distintivo serologico de MFS. Los anticuerpos pueden aparecer en algunos casos mediante imitacion molecular con lipopolisacaridos de Campylobacter. Ahora se acepta ampliamente que mas del 90% de los pacientes con MFS tienen anticuerpos IgG anti-GQ1b durante la fase aguda de la enfermedad. Es igualmente significativa la ausencia total de anticuerpos IgG anti-GQ1b de grupos de control normales y de otras enfermedades, indicativo de un alto nivel de especificidad para esta asociacion de enfermedad. Los tftulos de anticuerpo aumentan hasta un pico en la presentacion clmica, decayendo rapidamente con el curso de la recuperacion clmica. Los tftulos de anticuerpos IgG anti-GQ1b tambien son elevados en el suero en la fase aguda de algunos pacientes con el smdrome de Guillain- Barre con oftalmoplejfa. El marcador del anticuerpo IgG anti-GQ1b tambien identifica un grupo de smdromes estrechamente relacionados, considerados con frecuencia formas frustradas de MFS, que tienen en comun la presencia de oftalmoplejfa externa o ataxia de tipo cerebelosa.

El tratamiento actual para GBS, incluyendo casos mediados por AGA, es la inmunoglobulina intravenosa (IVIg), cambio de plasma, o una combinacion de ambos. Si bien algunas neuropatfas como el GBS son usualmente enfermedades auto-limitantes, con frecuencia es necesaria la intervencion terapeutica intensa. Algunos individuos quedan con deficits residuales. Otras neuropatfas son cronicas y solamente se tratan smtomas tales como el dolor. Hay una gran necesidad de tratamientos adicionales para mejorar los smtomas y disminuir el tiempo de recuperacion de las neuropatfas mediadas por anticuerpos.

Halstead et al. 2005 (Annals of Neurology (58), 203 - 210) describe que APT070 elimina la lesion terminal neuronal en modelos de roedores de smdrome de Miller Fisher, mediante reduccion de C3 convertasa intermedia asf como mediante inhibicion de C5 convertasa. APT070 es una forma soluble de la protema del receptor 1 del complemento (sCR1) que se une a C3b y C4b y de ese modo inhibe, entre otros, la opsonizacion mediante fagocitos del hospedante (por ejemplo, macrofagos) de objetos a los que estan unidos C3b y C4b.

El documento US 2005/004031 describe inhibidores de pequenas moleculas de uno o mas del receptor de C5a, C1r, C1q, C1s, y MASP-2, y el uso de estos inhibidores de pequena molecula en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

El documento WO 2004/007553 describe la generacion y caracterizacion de un anticuerpo denominado TS-A12/22 que se une al componente C5 del complemento. TS-A12/22 inhibe la hemolisis y la formacion de MAC in vitro, e inhibe el influjo de celulas polimorfonucleares (PMN) mediado por seroalbumina bovina en las articulaciones de ratas.

El documento WO 95/29697 describe anticuerpos anti-C5 para uso en el tratamiento de glomerulonefritis (GN).

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SUMARIO DE LA INVENCION

Se presentan composiciones para tratar a pacientes que sufren de neuropatfas mediadas por anticuerpos, como se caracteriza en las reivindicaciones anejas.

En una cantidad de neuropatias se han identificado anticuerpos contra componentes espedficos de los nervios. Algunas de estas enfermedades estan mediadas por anticuerpos anti-gangliosidos y anti-glicoKpidos, tales como la variante de Miller Fisher del smdrome de Guillain-Barre. Los anticuerpos contra un amplio intervalo de glicolfpidos, incluyendo GM1, GMI(NeuGc), GM1b, GalNAc-GM1b, GD1a, GalNAc-GD1a, GD1b, 9-O-acetil GD1b, GD3, GT1a, GTlb, GQ1b, GQ1ba, LM1, galactocerebrosido y SGPG se han dado a conocer en documentos sobre neuropatfas inflamatorias, como informes de casos y en mayores series.

Tambien se ha dado a conocer que los anticuerpos contra otros componentes nerviosos, incluyendo protemas y glicoprotemas, son los causantes de neuropatfas. Por ejemplo, la IgM monoclonal contra la glicoprotema asociada a mielina produce neuropatfa paraproteinemica IgM anti-MAG (Willison y Yuki, Brain, 2002, 125, 2591-2625). En una proporcion de casos de neuropatfa, se supone que los anticuerpos estan presentes debido a patrones patologicos y respuestas al tratamiento similares a las que se observan en los casos asociados con anticuerpos, pero la especificidad del anticuerpo que se presupone todavfa tiene que ser identificada formalmente. Segun la presente invencion, la neuropatfa mediada por anticuerpos puede ser una o mas de las siguientes: neuropatfa axonal motora aguda, polineuropatfa desmienilizante inflamatoria aguda, encefalitis del tallo cerebral de Bickerstaff, oftalmoparesia aguda, smdrome de Guillain-Barre ataxico, debilidad faringeo-cervical-braquial, smdromes de neuropatfa cronica con anticuerpos anti-glicolfpidos, neuropatfa paraproteinemica IgM anti-MAG, neuropatfa ataxica sensorial cronica con anticuerpos anti-disialosilo, neuropatfa paraproteinemica IgM, IgG e IgA, neuropatfa motora con anticuerpos anti- GM1 y anti-GM2, neuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica (CIDP), neuropatfa motora multifocal (MMN), y neuropatfa sensorial y motora desmielinizante multifocal adquirida (MADSAM).

En algunas neuropatfas, la activacion del complemento puede ser independiente del anticuerpo, por ejemplo en neuropatfa amiloide hereditaria. En esta enfermedad, se han detectado marcadores de activacion de la ruta clasica tempranos, C1q y C4, en depositos de amiloide en ausencia de anticuerpo detectable (Hafer-Macko et al., J Peripher Nerv Syst. 2000 Sep; 5(3): 131-9; incorporado aqrn como referencia). Esto sugiere que puede ocurrir la activacion de la ruta clasica independiente del anticuerpo, y que los inhibidores de la cascada del complemento pueden ser efectivos para tratar neuropatfas mediadas por el complemento, independientes del anticuerpo. Un anticuerpo de la solicitud inhibe la activacion de la ruta clasica, la ruta alternativa o la ruta de lectina del complemento. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo es un anticuerpo contra cualquier miembro del grupo que comprende los componentes del complemento C5 o C5b. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo es un anticuerpo contra C5. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo es un inhibidor de la escision de C5.

Tambien se describe aqrn un inhibidor de la cascada del complemento seleccionado de: un polipeptido, un analogo de polipeptido, un peptidomimetico, un anticuerpo, un acido nucleico, un constructo de iARN, un analogo de acido nucleico, y una molecula pequena.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la solicitud es un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo policlonal, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal, un diacuerpo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo quimerizado o quimerico, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano desinmunizado, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo totalmente humano, un anticuerpo monocatenario, un Fv, un Fab, un Fab', o un F(ab')2.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la solicitud inhibe la activacion de la ruta clasica, la ruta alternativa o la ruta de lectina del complemento. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo es un anticuerpo contra cualquier miembro del grupo que comprende los componentes del complemento C5 y C5b. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo es un anticuerpo contra C5. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo es un inhibidor de la escision de C5.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la solicitud es eculizumab. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo es pexelizumab. En ciertas realizaciones, dicho tratamiento con eculizumab es cronico. En ciertas realizaciones, dicho tratamiento con pexelizumab comprende tratar un episodio agudo.

En ciertas realizaciones, un marnffero de la solicitud se trata administrandole dicho anticuerpo por via intravenosa. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo se administra sistemicamente a dicho mamffero. En ciertas realizaciones, dicho agente se administra localmente a dicho mairnfero.

En ciertas realizaciones, los tratamientos de la solicitud producen disminucion de la lesion neuronal en un mamffero de la solicitud.

En ciertas realizaciones, un mamffero de la solicitud se trata para inhibir o disminuir la cantidad y/o el grado de una condicion fisiologica indeseable resultante de lesion nerviosa excesiva debido a neuropatfa dependiente de anticuerpos. En ciertas realizaciones, dicha condicion fisiologica indeseable se selecciona del grupo que consiste en

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oftalmop^a, ataxia, arreflexia, coordinacion muscular anormal, paralisis de los musculos oculares, dolor muscular constante, ausencia de los reflejos de tendon, entumecimiento y hormigueo en las extremidades inferiores, debilidad de los musculos distales de las extremidades inferiores, pie pendulo, debilidad que implica a todas las extremidades inferiores, debilidad que implica a las extremidades superiores, debilidad en los musculos de la respiracion, y muerte.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo para uso segun la invencion da como resultado disminucion en la formacion del complejo de ataque a membrana (MAC) en los axones motores presinapticos.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo para uso segun la invencion da como resultado la restauracion de una frecuencia normal de los potenciales miniatura de terminal de placa.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo para uso segun la invencion da como resultado la restauracion de la transmision sinaptica en las uniones neuromusculares.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo para uso segun la invencion da como resultado disminucion de la perdida de integridad terminal en las uniones neuromusculares.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Las FIGURAS 1A-1F muestran una demostracion immunohistologica del efecto protector de eculizumab contra la deposicion de MAC y axonopatfa motora terminal en NMJs en el modelo de MFS in vitro. Se preincubaron preparaciones de hemidiafragma de raton con mAb anti-gangliosido GQ1b CGM3 (50 |ig/ml) y posteriormente se trataron con 40% de suero humano normal (NHS) con eculizumab anadido (mAb neutralizante anti-C5 humano; 100 |ig/ml) o mAb de control coincidente con isotipo no espedfico (100 |ig/ml), y se compararon con el tejido no tratado. La FIG. 1A muestra que los tejidos tratados con NHS/eculizumab muestran tincion intensa con C3c en las uniones neuromusculares (NMJs), similar a la de tejidos tratados con NHS/mAb de control (p = 0,12). La FIG. 1B muestra que no se observo tincion del complejo de ataque a membrana (MAC) en presencia de eculizumab (intensidad comparable a la lmea de base, p = 0,92), lo que indica la inhibicion completa del complemento terminal. La FIG. 1C muestra que la integridad axonal se conservo en presencia de eculizumab, de acuerdo con lo evaluado mediante la presencia de senal de neurofilamento (NF), comparable a la lmea de base en los controles no tratados (p = 0,80). Las FIGs. 4D, 4E y 4F son imagenes inmunofluorescentes ilustrativas de NMJs en musculo de preparacion completa que demuestran el efecto protector de eculizumab frente a la deposicion de MAC (FIG. 4D), dano en la celula de Schwann perisinaptica (pSC) (FIG. 4E) y dano axonal motor terminal (FIG. 4F), en comparacion con el tratamiento con NHS/mAb de control. Se uso tincion con el receptor de acetilcolina nicotmico postsinaptico (nAChR; purpura) para delinear la NMJ. La protema del complemento intermedia C3c (FIG. 4D) permanece depositada abundantemente en las NMJ. *p < 0,01, diferente de los no tratados; #p < 0,01, diferente de los tratados con mAb de control; barra de escala = 20 |im.

Las FIGURAS 2A-2G muestran que eculizumab protege contra defectos electrofisiologicos y funcionales inducidos en las NMJs en el modelo de MFS in vitro. Se preincubaron preparaciones de hemidiafragma de raton con mAb anti-gangliosido GQ1b CGM3 (50 |ig/ml) y posteriormente se trataron con 40% de suero humano normal (NHS) con 100 |ig/ml de eculizumab (mAb neutralizante anti-C5 humano) anadido o con mAb de control con isotipo coincidente no espedfico. La FIG. 2A muestra la liberacion espontanea de acetilcolina unicuantal, medida como frecuencia de MEPP, en la NMJ. Eculizumab evito la induccion de una frecuencia alta de MEPP (p < 0,001, n = 5 musculos). La FIG. 2B muestra trazos de duracion de 1 s representativos obtenidos durante la incubacion con NHS, ya sea con eculizumab anadido (trazo superior) o con mAb de control (trazo inferior). La FIG. 2C muestra que las sacudidas asmcronas de fibras musculares inducidas por NHS fueron evitadas en gran medida por eculizumab (p < 0,01, n = 5 musculos). La FIG. 2D muestra que eculizumab evito completamente la aparicion de NMJs “silenciosas” (es decir, sin senales electrofisiologicas sinapticas detectables). Para las FIGs. 2E, 2F y 2G, se preincubaron preparaciones musculo-nervio de hemi-diafragma con 200 |ig/ml de CGM3 y se observo el efecto protector de varias concentraciones de eculizumab (0-100 |ig/ml, n = 2-5 musculos por concentracion) anadidas al NHS en experimentos con registro de fuerza de contraccion muscular. La FIG. 2E muestra ejemplos de los perfiles de contraccion observados a 0, 30, 60 y 90 min despues del inicio de la incubacion de NHS, ya sea sin eculizumab anadido o con 6 o 100 |ig/ml de eculizumab anadido. Cada contraccion fue producida por estimulacion electrica supramaxima del nervio frenico durante 3 s a 40 Hz. La FIG. 2F muestra el desarrollo de la perdida de contraccion durante la incubacion de NHS con las diversas concentraciones de eculizumab anadido. La FIG. 2G muestra la relacion concentracion-efecto de eculizumab y la proteccion contra la perdida de contraccion despues de 90 min tras el inicio de la incubacion de NHS. Una curva sigmoidal de Boltzmann se ajusta a traves de los puntos de datos, produciendo una EC50 de 7,1 |ig/ml. Las barras de error en las FIGs. 2A, 2D, 2F y 2G representan el Error Estandar de la Media (S.E.M.).

Las FIGURAS 3A-3B muestran la curva de respuesta a la dosis de eculizumab in vivo. La FIG. 3A muestra que un aumento en la dosis de eculizumab produce una reduccion dependiente de la dosis en la deposicion de MAC en la NMJ. La FIG. 3B muestra la senal de neurofilamento y demuestra la conservacion de la integridad axonal en todas las dosis de eculizumab investigadas cuando se comparan con control de lmea de base tratado con PBS.

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Las FIGURAS 4A-4H muestran que la paralisis respiratoria en el modelo de MFS in vivo es evitada por eculizumab debido a la inhibicion de bloqueo presinaptico de transmision neuromuscular en el diafragma. Se inyecto intraperitonealmente a ratones (n = 6) con 1,5 mg de mAb anti-gangliosido GQ1b CGM3 y, 16 h despues, con 0,5 ml de 100% de suero humano normal (NHS) como fuente de complemented Se inyecto una dosis de 200 |ig de eculizumab o de mAb de control en la vena de la cola muy poco antes de la inyeccion de NHS. La FIG. 4A muestra el analisis de la fuerza de agarre 2 h despues de la inyeccion de NHS. Eculizumab evito la perdida de fuerza de traccion observada en el grupo con mAb de control (p < 0,01). La FIG. 4B muestra el volumen corriente promedio, y la FIG. 4C muestra la frecuencia respiratoria medida con pletismograffa de cuerpo completo antes de la inyeccion de NHS y durante la 2a, 4a y 6a hora despues de la inyeccion de NHS. El desarrollo de dificultad para respirar fue evitado por eculizumab. La FIG. 4D muestra ejemplos de trazos de 1 s de senales de pletismograffa obtenidas en ratones tratados con eculizumab y con mAb de control. La FIG. 4E muestra la fuerza de las sacudidas, y la FIG. 4F presenta la fuerza tetanica producida en el musculo de diafragma disecado mediante estimulacion nerviosa sola y electrica de 40 Hz, respectivamente. Eculizumab evito completamente la paralisis severa observada en los musculos de ratones tratados con mAb de control (p < 0,01). La FIG. 4G muestra que eculizumab evito casi completamente la aparicion de NMJs “silenciosas” (es decir, sin senales electrofisiologicas sinapticas detectables) en estos ratones (p < 0,001). La FIG. 4H muestra treinta trazos representativos superpuestos de 1 s de duracion obtenidos en las NMJs de musculo de ratones tratados con eculizumab (trazos superiores) o tratados con mAb de control (trazos inferiores). Las barras de error en los graficos de barras de estas figuras representan el S.E.M.

Las FIGURAS 5A-5F muestran un analisis morfologico de NMJs de tejido de diafragma de ratones con MFS in vivo. Los ratones se inmunizaron pasivamente con 1,5 mg de mAb anti-gangliosido GQ1b, CGM3, seguido 16 h despues de inyecciones concomitantes de 0,5 ml de 100% de suero humano normal (intraperitoneal) y eculizumab o mAb de control (intravenoso; 200 |ig). Las FIGs. 5A y 5B muestran que la deposicion de C3c y de complejo de ataque a membrana (MAC) se reduce en las uniones neuromusculares (NMJs) de ratones tratados con eculizumab y con mAb de control (p < 0,01). La FIG. 5C muestra que la senal de neurofilamento (NF) fue significativamente mayor en las NMJs de musculos de ratones tratados con eculizumab, en comparacion con el control (p < 0,01). Las FIGs. 5D y 5E muestran imagenes inmunofluorescentes ilustrativas de NMJs en musculo de preparaciones completas. Se uso tincion con receptores de acetilcolina nicotmicos postsinapticos (nAChR; purpura) para delinear las NMJs. La FIG. 5D muestra ademas la deposicion de C3c y MAC. La FIG. 5E muestra ademas la integridad de NF y la deposicion de MAC. La FIG. 5F es una microfotograffa electronica de terminales nerviosos protegidos con eculizumab con vesteula sinaptica fuertemente empaquetada y mitocondrias con crestas paralelas densas en electrones. En las NMJs de ratones tratados con mAb de control, los terminales nerviosos son transparentes a los electrones, con vesteulas sinapticas escasas y mitocondrias hinchadas. #p < 0,01, diferente de los tratados con mAb de control. Barras de escala en las FIGs. 5D y 5E = 20 |im; y en la FIG. 5F = 1 |im.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Resumen

Aqu se propone que el tratamiento de un paciente con neuropatfa mediada por anticuerpos con un inhibidor del complemento atenuara la lesion neuronal. Por ejemplo, la neuropatfa mediada por anticuerpos puede ser una neuropatfa mediada por AGA. Los inhibidores de miembros de la cascada del complemento incluyen, por ejemplo, anticuerpos contra componentes tales como C5, C5b, C6, C7, C8, y C9. En realizaciones particulares, esta solicitud contempla el uso del anticuerpo anti-C5 eculizumab (un anticuerpo completo) que se sabe que inhibe la escision de C5 en C5a y C5b. El tratamiento de pacientes con tales inhibidores disminuye de ese modo la lesion neuronal mediada por el complemento. El eculizumab se ha utilizado en estudios clmicos y se ha encontrado que es bien tolerado, con efectos secundarios mmimos. Vease la patente U.S. 6.355.245 y Hillmen et al., New Engl. J. Med. 350:552-559 (2004).

El sistema del complemento

El sistema del complemento actua en conjunto con otros sistemas inmunologicos del cuerpo para defenderse contra la intrusion de patogenos celulares y virales. Hay al menos 25 protemas del complemento, las cuales se encuentran como una coleccion compleja de protemas plasmaticas y cofactores de membrana. Las protemas plasmaticas (que tambien se encuentran en muchos otros fluidos corporales, tales como linfa, medula osea, fluido sinovial y fluido cerebroespinal) constituyen alrededor de 10% de las globulinas en el suero de los vertebrados. Los componentes del complemento obtienen sus funciones defensivas inmunitarias interactuando en una serie de intrincados, pero precisos, sucesos de escision enzimatica y union a la membrana. La cascada del complemento resultante conduce a la produccion de productos con funciones opsonicas, inmunorreguladoras y lfticas.

La cascada del complemento avanza por medio de la ruta clasica o la ruta alternativa. Estas rutas comparten muchos componentes y, si bien difieren en sus primeras etapas, ambas convergen y comparten los mismos componentes del complemento terminal responsables de la destruccion de celulas y virus diana.

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La ruta clasica del complemento se inicia tipicamente mediante el reconocimiento por el anticuerpo y union a un sitio antigenico en una celula diana. Este anticuerpo unido a la superficie reacciona posteriormente con el primer componente del complemento, C1. El C1 as^ unido experimenta un conjunto de reacciones autocataltticas que dan como resultado, entre otras, la induccion de actividad proteolftica de C1, que actua sobre los componentes del complemento C2 y C4.

Este C1 activado escinde a C2 y C4 en C2a, C2b, C4a, y C4b. La funcion de C2b esta poco comprendida. C2a y C4b se combinan para formar el complejo C4b,2a, que es una proteasa activa conocida como convertasa C3 clasica. C4b,2a actua para escindir C3 en C3a y C3b. C3a y C4a son ambos anafilatoxinas relativamente debiles que pueden inducir la desgranulacion de mastocitos, dando como resultado la liberacion de histamina y otros mediadores de inflamacion.

C3b tiene multiples funciones. Como opsonina, se une a las bacterias, virus y otras celulas y partmulas y las marca para su eliminacion de la circulacion. C3b tambien puede formar un complejo con C4b,C2a para producir C4b,2a,3b, o convertasa C5 clasica, la cual escinde C5 en C5a (otra anafilatoxina) y C5b. Una convertasa C5 alternativa es la C3b,Bb,C3b y realiza la misma funcion. C5b se combina con C6 para producir C5b,6, y este complejo se combina con C7 para formar el complejo ternario C5b,6,7. El complejo C5b,6,7 se une a C8 en la superficie de una membrana celular. Con la union de c9, se forma el complejo de ataque a membrana (MAC) completo (C5b-9), el cual media la lisis de celulas, microorganismos, y virus extranos.

Otras discusiones de la ruta clasica del complemento, asf como tambien una descripcion detallada de la ruta alternativa de activacion del complemento, se pueden encontrar en numerosas publicaciones, incluyendo, por ejemplo, Muller-Eberhard, Annu Rev Biochem. 1988; 57:321-47.

Inhibidores de la cascada del complemento

En ciertas realizaciones, un inhibidor del complemento puede ser una molecula pequena (de hasta 6.000 Da de peso molecular), un acido nucleico o analogo de acido nucleico, un peptidomimetico, o una macromolecula que no es un acido nucleico o una protema. Estos agentes incluyen, sin limitarse a ellos, moleculas organicas pequenas, aptameros de ARN, aptameros de L-ARN, Spiegelmeros, compuestos antisentido, ARN bicatenario, ARN interferente pequeno, inhibidores de acido nucleico bloqueados, e inhibidores de acido nucleico peptfdico.

En ciertas realizaciones, un inhibidor del complemento puede ser una protema o fragmento de protema. Se conocen protemas que inhiben la cascada del complemento, incluyendo CD59, CD55, CD46 y otros inhibidores de C8 y C9 (vease, por ejemplo, la patente U.S. 6.100.443). Tambien se conocen protemas que se sabe que son receptores del complemento y que se unen al complemento (vease, solicitud de patente PCT publicada WO 92/10205 y la patente U.S. 6.057.131). El uso de formas solubles de receptores del complemento, por ejemplo CR1 soluble, puede inhibir las consecuencias de la activacion del complemento, tales como el estallido oxidativo de neutrofilos, lesion neuronal mediada por el complemento, y produccion de C3a y C5a. Los expertos en la tecnica reconoceran los anteriores como algunos, pero no todos, de los metodos conocidos para inhibir el complemento y su activacion.

En ciertas realizaciones, un inhibidor del complemento puede ser un anticuerpo capaz de inhibir el complemento, tal como un anticuerpo que puede bloquear la formacion de MAC. Por ejemplo, un anticuerpo inhibidor del complemento puede incluir un anticuerpo anti-C5. Tales anticuerpos anti-C5 pueden interactuar directamente con C5 y/o C5b, para inhibir la formacion y/o la funcion fisiologica de C5b.

Los anticuerpos anti-C5 adecuados son conocidos por los expertos en la tecnica. Los anticuerpos se pueden obtener contra componentes individuales del complemento activado, por ejemplo anticuerpos contra C7, C9, etc. (vease, por ejemplo, la patente U.S. 6.534.058; la solicitud de patente U.S. publicada US 2003/0129187; y la patente U.S. 5.660.825). La patente U.S. 6.355.245 presenta un anticuerpo que se une a C5 e inhibe la escision en C5a y C5b, disminuyendo de ese modo no solo la formacion de C5a sino tambien de los componentes del complemento aguas abajo.

La concentracion y/o la actividad fisiologica de C5a y C5b en un fluido corporal se pueden medir usando metodos bien conocidos en la tecnica. Para C5a, tales metodos incluyen analisis de quimiotaxia, RIAs, o ELISAs (veanse, por ejemplo, Ward y Zvaifler, J Clin Invest. 1971 Mar; 50(3):606-16; Wurzner, et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991). Para C5b, se pueden usar analisis hemoltticos o analisis para C5b-9 soluble, como se discute aqrn. Tambien se pueden usar otros ensayos conocidos en la tecnica. Usando ensayos de estos o de otros tipos apropiados, se pueden seleccionar anticuerpos candidatos capaces de inhibir el complemento, tales como anticuerpos anti-C5, conocidos ahora o identificados posteriormente, con el fin de 1) identificar compuestos que son utiles en la practica de la solicitud y 2) determinar los niveles de dosificacion apropiados de estos compuestos.

Un anticuerpo capaz de inhibir el complemento, tal como un anticuerpo anti-C5 que afecte a C5b, se usa preferiblemente en concentraciones que proporcionan reduccion sustancial (es decir, reduccion de al menos alrededor de 25% en comparacion con la lograda en ausencia del anticuerpo anti-C5) en los niveles de C5b presentes en al menos uno de los fluidos obtenidos de la sangre del paciente tras la activacion del complemento en el fluido. Tales concentraciones se pueden medir convenientemente midiendo la capacidad de lisar celulas (por ejemplo, la actividad hemolttica) del complemento presente en el fluido, o los niveles de C5b-9 soluble presente en el

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fluido. En consecuencia, una concentracion espedfica para un anticuerpo que afecta a C5b es aquella que da como resultado una reduccion sustancial (es dedr, una reduccion de al menos 25%) en la capacidad de lisar celulas del complemento presente en al menos uno de los fluidos obtenidos de la sangre del paciente. Las reducciones de la capacidad de lisar celulas del complemento presente en los fluidos corporales del paciente se pueden medir mediante metodos bien conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, mediante un ensayo hemolftico convencional, tal como el ensayo de hemolisis descrito por Kabat y Mayer (eds.), “Experimental Immunochemistry, 2a Edicion”, 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), paginas 135-139, o una variacion convencional de ese ensayo, tal como el metodo de hemolisis de eritrocitos de pollo descrito mas adelante.

Los anticuerpos espedficos capaces de inhibir el complemento, tales como un anticuerpo anti-C5, son relativamente espedficos y no bloquean las funciones de componentes iniciales del complemento. En particular, tales agentes espedficos no alteraran sustancialmente las funciones de opsonizacion asociadas con el componente del complemento C3b, cuyas funciones proporcionan un medio para el aclaramiento de partfculas y sustancias extranas del cuerpo.

C3b se genera por la escision de C3, la cual es efectuada por convertasas C3 clasicas y/o alternativas, y da como resultado la generacion de C3a y C3b. Por lo tanto, con el fin de no alterar las funciones de opsonizacion asociadas con C3b, los anticuerpos espedficos capaces de inhibir el complemento aguas abajo de C3, tales como un anticuerpo anti-C5, no interfieren sustancialmente con la escision del componente C3 del complemento en un fluido corporal del paciente (por ejemplo, suero) en C3a y C3b. Tal interferencia con la escision de C3 puede ser detectada midiendo los niveles en el fluido corporal de C3a y/o C3b, los cuales se producen en relaciones equimolares mediante las acciones de las convertasas C3. Tales mediciones son informativas debido a que los niveles de C3a y C3b seran reducidos (en comparacion con una muestra similar sin el anticuerpo capaz de inhibir el complemento, tal como un anticuerpo anti-C5) si la escision es interferida por un anticuerpo capaz de inhibir el complemento.

En la practica, la medida cuantitativa de tal escision generalmente es mas exacta cuando se lleva a cabo mediante la medida de los niveles de C3a en el fluido corporal en lugar de los niveles de C3b en el fluido corporal, dado que C3a permanece en fase fluida, mientras que C3b se aclara rapidamente. Los niveles de C3a en un fluido corporal se pueden medir mediante metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo usando un kit EIA C3a disponible comercialmente, por ejemplo el que vende Quidel Corporation, San Diego, California, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Particularmente, los anticuerpos espedficos capaces de inhibir el complemento, tales como un anticuerpo anti-C5, no producen esencialmente ninguna reduccion en los niveles de C3a en el fluido corporal tras la activacion del complemento cuando se someten a evaluacion en tales ensayos.

Algunos anticuerpos de la descripcion evitaran la escision de C5 para formar C5a y C5b, impidiendo asf la generacion de la actividad anafilatoxica asociada con C5a y evitando el ensamblaje del complejo de ataque a membrana asociado con C5b. Como se discutio anteriormente, en una realizacion particular, estos anticuerpos anti- C5 no alteraran la funcion de opsonizacion asociada con la accion de C3b.

Un metodo preferido para inhibir la actividad del complemento es usar un anticuerpo monoclonal que se une al complemento C5 e inhibe la escision. Esto disminuye la formacion tanto de C5a como de C5b mientras que al mismo tiempo permite la formacion de C3a y C3b, los cuales son beneficiosos para el receptor. Tales anticuerpos que son espedficos para el complemento en seres humanos son conocidos (patente U.S. 6.355.245). Estos anticuerpos descritos en la patente U.S. 6.355.245 incluyen un anticuerpo completo preferido (ahora denominado eculizumab). Un anticuerpo similar contra C5 de raton se denomina BB5.1 (Frei et al., Mol. Cell. Probes. 1:141-149 (1987)). Los anticuerpos que inhiben la actividad del complemento no tienen que ser anticuerpos monoclonales. Pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales. Adicionalmente pueden ser fragmentos de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo incluye, pero sin limitarse a ellos, un Fab, F(ab'), F(ab')2, anticuerpo monocatenario, y Fv. Ademas, es bien conocido por los expertos en la tecnica que los anticuerpos pueden ser humanizados (Jones et al., Nature 321:522-5 (1986)), quimerizados o desinmunizados. Los anticuerpos que se van a usar en la presente descripcion pueden ser cualquiera de estos. Es preferible usar anticuerpos humanizados.

En realizaciones espedficas, un agente terapeutico de la descripcion comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los anticuerpos y sus fragmentos se pueden obtener mediante cualquier metodo convencional, tales como los metodos descritos aqrn. Los anticuerpos se encuentran en muchas formas, por ejemplo IgA, IgG, IgM, etc. Adicionalmente, los anticuerpos pueden ser disenados de numerosas formas. Se pueden obtener como anticuerpos monocatenarios (incluyendo sustancias inmunofarmaceuticas modulares pequenas o SMIPS™), fragmentos Fab y F(ab')2, etc. Los anticuerpos pueden ser humanizados, quimerizados, desinmunizados, o totalmente humanos. Numerosas publicaciones presentan los muchos tipos de anticuerpos y los metodos para disenar tales anticuerpos. Por ejemplo, veanse las patentes U.S. nos 6.355.245; 6.180.370; 5.693.762; 6.407.213; 6.548.640; 5.565.332; 5.225.539; 6.103.889; y 5.260.203.

Esta invencion proporciona fragmentos de anticuerpos anti-C5, que pueden comprender una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la region de union al antfgeno o la region variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062 (1995)); moleculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespedficos formados de fragmentos de anticuerpos.

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La digestion de anticuerpos con papama produce dos fragmentos de union al antigeno identicos, denominados fragmentos “Fab”, cada uno con un unico sitio de union al antigeno, y un fragmento residual “Fc”, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse rapidamente. El tratamiento de un anticuerpo con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios que se combinan con el antigeno y que todavfa es capaz de reticular el antigeno.

“Fv” se refiere al fragmento de anticuerpo mmimo que contiene un sitio de reconocimiento y de union a antigeno complete. Esta region consiste en un dfmero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera, en asociacion estrecha, no covalente. Es en esta configuracion que las tres CDRs de cada dominio variable interactuan para definir un sitio de union al antfgeno en la superficie del dfmero Vh-Vl. Colectivamente, las seis CDRs le confieren al anticuerpo especificidad de union al antigeno. Sin embargo, aun un dominio variable solo (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDRs espedficas para un antfgeno) tiene la capacidad de reconocer un antfgeno y de unirse a el, si bien probablemente con una menor afinidad que todo el sitio de union completo.

El fragmento Fab tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos restos en el termino carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o mas cistemas de la region bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominacion aqu para Fab' en los cuales el resto o restos de cistema de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 fueron producidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cistemas bisagras entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos qmmicos de fragmentos de anticuerpos.

Los fragmentos de anticuerpo “Fv monocatenario” o “scFv” comprenden los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en el que estos dominios estan presentes en una cadena polipeptfdica simple. Preferiblemente, el polipeptido Fv comprende ademas un ligador polipeptfdico entre los dominios Vh y Vl que permite al scFv formar la estructura deseada para la union al antfgeno. Para un repaso de scFv, vease Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, eds. (Springer-Verlag: Nueva York, 1994), p. 269-315.

Los SMIPs son una clase de peptido monocatenario disenados para incluir una region de union a diana, dominio efector (dominios CH2 y CH3). Vease, por ejemplo, la publicacion de solicitud de patente U.S. n° 20050238646. La region de union a diana puede obtenerse de la region variable o CDRs de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo anti-C5 de la solicitud. Alternativamente, la region de union a diana se obtiene de una protema que se une a C5.

El termino “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpos pequenos con dos sitios de union a antfgeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptfdica (Vh-Vl). Con el uso de un ligador que sea demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de union al antfgeno. Los diacuerpos se describen mas completamente, por ejemplo, en el documento EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Es bien conocido que la union a una molecula (o a un patogeno) de anticuerpos con una region Fc ayuda al procesamiento y aclaramiento de la molecula (o patogeno). Las porciones de anticuerpos Fc son reconocidas por receptores especializados expresados por las celulas efectoras inmunitarias. Las porciones Fc de anticuerpos IgG1 e IgG3 son reconocidas por los receptores de Fc presentes en la superficie de celulas fagodticas, tales como macrofagos y neutrofilos, las cuales pueden unirse de esta forma y englobar a las moleculas o patogenos recubiertos con anticuerpos de estos isotipos (C. A. Janeway et al., Immunobiology 5a edicion, pagina 147, Garland Publishing (Nueva York, 2001)).

Esta descripcion tambien proporciona anticuerpos monoclonales anti-C5. Un anticuerpo monoclonal se puede obtener a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos, estando dirigidos contra un solo sitio antigenico. Ademas, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen tfpicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epttopos), cada anticuerpo monoclonal esta dirigido contra un solo determinante en el antfgeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque con frecuencia son sintetizados por el cultivo de hibridoma, no contaminados por otras inmunoglobulinas. Los anticuerpos monoclonales tambien se pueden producir en celulas transfectadas, tales como celulas CHO y celulas NSO. El modificador “monoclonal” indica el caracter del anticuerpo como obtenido a partir de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no requiere la produccion del anticuerpo por ningun metodo en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente descripcion se pueden obtener mediante el metodo de hibridoma, descrito primero por Kohler et al., Nature 256:495-497 (1975), o se pueden obtener mediante metodos de ADN recombinante (veanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 4.816.567 y 6.331.415). Los “anticuerpos monoclonales” tambien se pueden aislar a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.

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Una descripcion de la preparacion de un anticuerpo monoclonal anti-C5 humano de raton con caractensticas de union espedfica se presenta en la publicacion de solicitud de patente U.S. n° 20050226870. Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328-340 (1991), describen la preparacion de otros anticuerpos monoclonales anti-C5 humano de raton denominados N19-8 y N20-9.

Otros anticuerpos contemplados espedficamente son los anticuerpos “oligoclonales”. Como se usa aqm, la expresion “anticuerpos oligoclonales” se refiere a una mezcla predeterminada de distintos anticuerpos monoclonales. Veanse, por ejemplo, la publicacion PCT WO 95/20401; las patentes U.S. nos 5.789.208 y 6.335.163. En una realizacion, los anticuerpos oligoclonales que consisten en una mezcla predeterminada de anticuerpos contra uno o mas epftopos se generan en una sola celula. En otras realizaciones, los anticuerpos oligoclonales comprenden una pluralidad de cadenas pesadas capaces de aparearse con una cadena ligera comun para generar anticuerpos con multiples especificidades (por ejemplo, publicacion PCT WO 04/009618). Los anticuerpos oligoclonales son particularmente utiles cuando se desea dirigirse hacia multiples epftopos en una sola molecula diana (por ejemplo, C5). En vista de los ensayos y epftopos descritos aqm, los expertos en la tecnica pueden generar o seleccionar anticuerpos o mezclas de anticuerpos que son aplicables para un proposito pretendido y necesidad deseada.

En ciertas realizaciones que incluyen un anticuerpo humanizado y/o quimerico, una o mas de las CDRs se obtienen de un anticuerpo anti-C5 humano. En una realizacion espedfica, todas las CDRs se obtienen de un anticuerpo anti- C5 humano. En otra realizacion espedfica, las CDRs de mas de un anticuerpo anti-C5 humano se mezclan y se emparejan en un anticuerpo quimerico. Por ejemplo, un anticuerpo quimerico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo anti-C5 humano combinada con CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-C5 humano, y las CDRs de la cadena pesada se pueden obtener de un tercer anticuerpo anti-C5 humano. Ademas, las regiones del marco estructural se pueden obtener de uno de los mismos anticuerpos anti-C5 humano, de uno o mas anticuerpos diferentes, tales como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos humanos o humanizados son espedficos para la administracion a pacientes humanos.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos monocatenarios, y los anticuerpos quimericos, humanizados o primatizados (injertados con CDRs), asf como tambien anticuerpos monocatenarios quimericos o injertados con CDRs, que comprenden porciones obtenidas de diferentes especies, tambien estan englobados por la presente descripcion como fragmentos de union a antfgeno de un anticuerpo. Las diversas porciones de estos anticuerpos se pueden unir qmmicamente mediante tecnicas convencionales, o se pueden preparar como una protema contigua usando tecnicas de ingeniena genetica. Por ejemplo, se pueden expresar acidos nucleicos que codifican una cadena quimerica o humanizada para producir una protema contigua. Veanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 4.816.567 y 6.331.415; la patente U.S. n° 4.816.397; la patente europea n° 0.120.694; Wo 86/01533; la patente europea n° 0.194.276 B1; la patente U.S. n° 5.225.539; y la patente europea n° 0.239.400 B1. Vease tambien, Newman et al., BioTechnology 10:1455-1460 (1992), con respecto al anticuerpo primatizado. Veanse, por ejemplo, Ladner et al., patente U.S. n° 4.946.778; y Bird et al., Science 242:423-426 (1988), con respecto a los anticuerpos monocatenarios.

Ademas, tambien se pueden producir fragmentos funcionales de anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos quimericos, humanizados, primatizados o monocatenarios. Los fragmentos funcionales de los anticuerpos de la presente invencion retienen al menos una funcion de union y/o de modulacion del anticuerpo de longitud completa del cual provienen. Los fragmentos funcionales preferidos retienen una funcion de union al antfgeno de un anticuerpo de longitud completa correspondiente (tal como, por ejemplo, la capacidad del anticuerpo anti-C5 para unirse a C5).

Los metodos generales para la inmunizacion de animales (en este caso con C5 y/o C5b, etc.), el aislamiento de celulas productoras de anticuerpos, la fusion de tales celulas con celulas inmortales (por ejemplo, celulas de mieloma) para generar hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales, el cribado de sobrenadantes de hibridoma para determinar la reactividad de los anticuerpos monoclonales segregados con un antfgeno deseado (en este caso el inmunogeno o una molecula que contiene el inmunogeno), la preparacion de cantidades de tales anticuerpos en sobrenadantes de hibridoma o fluidos de ascitis, y para la purificacion y almacenamiento de tales anticuerpos monoclonales, se pueden encontrar en numerosas publicaciones. Estas incluyen: Coligan, et al., eds. Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1992; Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988; Liddell y Cryer, A Practical Guide To Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, Inglaterra, 1991 ; Montz et al., Cellular Immunol. 127:337351 (1990); Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328-340 (1991); y Mollnes et al., Scand. J. Immunol. 28:307-312 (1988).

Formulaciones farmaceuticas y usos

Los metodos de administracion de moleculas pequenas, protemas, y acidos nucleicos son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Los metodos de administracion de anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Para lograr la inhibicion deseada, los anticuerpos se pueden administrar en una variedad de formas de dosis unitaria. La dosis variara de acuerdo con el anticuerpo particular. Por ejemplo, diferentes anticuerpos pueden tener diferentes masas y/o afinidades, y de este modo pueden requerir diferentes niveles de dosificacion. Los anticuerpos preparados como fragmentos Fab tambien requeriran dosificaciones diferentes a las de las inmunoglobulinas

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intactas equivalentes, dado que son de masa considerablemente mas pequena que las inmunoglobulinas intactas, y de este modo requieren menores dosis para alcanzar los mismos niveles molares en la sangre del paciente. La dosis tambien variara dependiendo de la forma de administracion, los smtomas particulares del paciente que esta siendo tratado, la salud general, condicion, talla, y edad del paciente, y del criterio del medico que prescribe. Los niveles de dosis de los anticuerpos para sujetos humanos generalmente estan entre alrededor de 1 mg por kg y alrededor de 100 mg por kg por paciente por tratamiento, y preferiblemente entre alrededor de 5 mg por kg y alrededor de 50 mg por kg por paciente por tratamiento. En terminos de concentraciones en plasma, las concentraciones de anticuerpo preferiblemente estan en el intervalo de alrededor de 25 |ig/ml a alrededor de 500 |ig/ml. Sin embargo, se pueden requerir mayores cantidades para casos extremos, y pueden ser suficientes menores cantidades para casos mas leves.

La administracion de los anticuerpos anti-C5 generalmente se realizara por una via intravascular, por ejemplo por infusion intravenosa mediante inyeccion. Se pueden usar otras vfas de administracion si se desea, pero una via intravenosa sera la mas preferible. Las formulaciones apropiadas para inyeccion se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a ed. (1985). Estas formulaciones deben ser esteriles y no pirogenas, y generalmente incluiran un vehmulo farmaceuticamente efectivo, tal como disolucion salina, disolucion salina amortiguada (por ejemplo, amortiguada con fosfato), disolucion de Hank, disolucion de Ringer, dextrosa/disolucion salina, disoluciones de glucosa, y similares. Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables segun se requiera, tales como agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, agentes bactericidas, conservantes, estabilizantes, y similares.

La administracion de los anticuerpos capaces de inhibir el complemento, tales como un anticuerpo anti-C5, generalmente se realizara por via parenteral, comunmente mediante inyeccion, tal como una inyeccion intra-articular o intravascular (por ejemplo, infusion intravenosa) o inyeccion intramuscular. Se pueden usar otras vfas de administracion, por ejemplo oral (p.o.), si se desea y es practico para administrar el anticuerpo particular capaz de inhibir el complemento. Los anticuerpos capaces de inhibir el complemento, tales como un anticuerpo anti-C5, tambien se pueden administrar en una variedad de formas de dosis unitaria, y sus dosificaciones variaran tambien con el tamano, potencia y semivida in vivo del anticuerpo particular que esta siendo administrado capaz de inhibir el complemento. La dosis de anticuerpos capaces de inhibir el complemento, tales como un anticuerpo anti-C5, tambien variara dependiendo de la forma de administracion, los smtomas particulares del paciente que esta siendo tratado, la salud general, condicion, talla, y edad del paciente, y del criterio del medico que prescribe.

En ciertas realizaciones, un tratamiento terapeutico tfpico incluye una serie de dosis, que usualmente se administraran concurrentemente con el seguimiento de los criterios de valoracion clmicos con los niveles de dosificacion ajustados segun sea necesario para lograr el resultado clmico deseado. En ciertas realizaciones, el tratamiento se administra en multiples dosis durante al menos una semana. En ciertas realizaciones, el tratamiento se administra en multiples dosis durante al menos un mes. En ciertas realizaciones, el tratamiento se administra en multiples dosis durante al menos un ano. En ciertas realizaciones, el tratamiento se administra en multiples dosis durante el resto de la vida del paciente.

La frecuencia de administracion tambien se puede ajustar de acuerdo con diversos parametros. Estos incluyen la respuesta clmica, la semivida en plasma de la sustancia terapeutica de la descripcion, y los niveles del anticuerpo en un fluido corporal, tal como sangre, plasma, suero o fluido sinovial. Para guiar el ajuste de la frecuencia de administracion, se pueden monitorizar los niveles de la sustancia terapeutica de la descripcion en el fluido corporal en el transcurso del tratamiento.

En ciertas realizaciones, la frecuencia de administracion se puede ajustar de acuerdo con un ensayo que mide la capacidad de lisar celulas del complemento presente en uno o mas de los fluidos corporales del paciente. La capacidad de lisar celulas se puede medir como porcentaje de hemolisis en ensayos hemoltticos de los tipos descritos aqrn. Una reduccion de 10% o 25% o 50% en la capacidad de lisar celulas del complemento presente en un fluido corporal despues del tratamiento con el anticuerpo capaz de inhibir el complemento utilizado en la practica de la solicitud, significa que el porcentaje de hemolisis despues del tratamiento es 90, 75, o 50 por ciento, respectivamente, del porcentaje de hemolisis antes del tratamiento.

Para el tratamiento de neuropatfas mediadas por anticuerpos mediante administracion sistemica de un anticuerpo capaz de inhibir el complemento, tal como un anticuerpo anti-C5 (contrariamente a la administracion local), la administracion de una dosis inicial grande es espedfica, es decir, una sola dosis inicial suficiente para producir una reduccion sustancial, y mas preferiblemente una reduccion de al menos alrededor de 50%, en la actividad hemolftica del suero del paciente. Tal dosis inicial grande es seguida preferiblemente de la administracion repetida regularmente de dosis decrecientes segun sea necesario para mantener reducciones sustanciales de tttulo hemolttico en suero. En otra realizacion, la dosis inicial se administra tanto por via sistemica como local, seguido de la administracion sistemica repetida de dosis decrecientes como se describio anteriormente. Para la administracion de un anticuerpo anti-C5 a seres humanos, vease, por ejemplo, Hillmen et al, N. Engl. J. Med. 350:552-559 (2004). Los niveles de anticuerpo administrados en Hillmen et al. se basan en la semivida del anticuerpo y son relevantes para la administracion de un anticuerpo anti-C5 para otras indicaciones, tales como el tratamiento de neuropatfas.

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Las formulaciones particularmente utiles para agentes terapeuticos a base de anticuerpos tambien se describen en las publicaciones de solicitud de patente U.S. nos 20030202972, 20040091490 y 20050158316. En ciertas realizaciones, las formulaciones lfquidas de la solicitud estan sustancialmente libres de agente tensoactivo y/o sales inorganicas. En otra realizacion espedfica, las formulaciones lfquidas tienen un pH que oscila de alrededor de 5,0 a alrededor de 7,0. En todavfa otra realizacion espedfica, las formulaciones Kquidas comprenden histidina en una concentracion que oscila de alrededor de 1 mM a alrededor de 100 mM. Tambien se contempla que las formulaciones lfquidas pueden comprender ademas uno o mas excipientes, tal como un sacarido, un aminoacido (por ejemplo, arginina, lisina, y metionina) y un poliol. Se pueden encontrar otras descripciones y metodos para preparar y analizar formulaciones lfquidas, por ejemplo, en las publicaciones PCT WO 03/106644, WO 04/066957, y WO 04/091658.

En las composiciones farmaceuticas de la solicitud tambien pueden estar presentes agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, asf como tambien agentes colorantes, agentes de liberacion, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes.

En ciertas realizaciones, las formulaciones de los anticuerpos de la presente invencion son formulaciones libres de pirogenos que estan sustancialmente libres de endotoxinas y/o de sustancias pirogenas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que estan confinadas dentro de microorganismos y se liberan cuando los microorganismos se rompen o mueren. Las sustancias pirogenas tambien incluyen sustancias termoestables (glicoprotemas) inductoras de fiebre procedentes de la membrana exterior de bacterias y otros microorganismos. Ambas de estas sustancias pueden causar fiebre, hipotension y choque si se administran a seres humanos. Debido a los efectos daninos potenciales, es ventajoso eliminar cantidades incluso bajas de endotoxinas de las disoluciones de farmaco administradas por via intravenosa. La Food & Drug Administration (“FDA”) ha establecido un lfmite superior de 5 unidades de endotoxina (EU) por dosis por kilogramo de peso corporal en un solo penodo de una hora para aplicaciones de farmaco intravenoso (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Cuando se administran protemas terapeuticas en cantidades de varios cientos o miles de miligramos por kilogramo de peso corporal, como puede ser el caso con los anticuerpos monoclonales, es ventajoso eliminar cantidades incluso muy pequenas de endotoxina.

Las formulaciones de los anticuerpos de la presente invencion incluyen las que son apropiadas para administracion oral, dietetica, topica, parenteral (por ejemplo, inyeccion intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutanea), oftalmologica (por ejemplo, topica o intraocular), inhalacion (por ejemplo, inhalacion intrabronquial, intranasal u oral, gotas intranasales), administracion rectal, y/o intravaginal. Otros metodos de administracion apropiados tambien pueden incluir dispositivos recargables o biodegradables y dispositivos polimericos de liberacion controlada. Las endoprotesis, en particular, pueden estar recubiertas con un polfmero de liberacion controlada mezclado con un agente de la solicitud. Las composiciones farmaceuticas de esta descripcion tambien se pueden administrar como parte de una terapia de combinacion con otros agentes (ya sea en la misma formulacion o en una formulacion por separado).

La cantidad de la formulacion que sera terapeuticamente efectiva se puede determinar mediante tecnicas clmicas estandar. Ademas, opcionalmente se pueden emplear ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificacion optimos. La dosis precisa a emplear en la formulacion tambien dependera de la via de administracion y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y se debe decidir de acuerdo con el criterio del medico y con cada una de las circunstancias del paciente. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas de respuesta frente a la dosis obtenidas de sistemas de ensayo in vitro o de modelos de animales. La dosificacion de las composiciones que se van a administrar puede ser determinada por el tecnico entrenado sin experimentacion indebida, juntamente con estudios estandar de respuesta frente a la dosis. Las circunstancias relevantes que se deben considerar para realizar esas determinaciones incluyen la afeccion o afecciones que se van a tratar, la eleccion de la composicion que se va a administrar, la edad, peso y respuesta del paciente individual, y la intensidad de los smtomas del paciente. Por ejemplo, se puede usar el peso corporal real del paciente para calcular la dosis de las formulaciones en mililitros (ml) que se debe administrar. Puede no haber ajuste hacia abajo para el peso “ideal”. En tal situacion, se puede calcular una dosis apropiada mediante la siguiente formula: Dosis (ml) = [peso del paciente (kg) x nivel de dosis (mg/kg)/concentracion del farmaco (mg/ml)]

Para lograr los resultados del tratamiento deseados, se pueden administrar anticuerpos anti-C5 en una variedad de formas de dosis unitaria. La dosis variara de acuerdo con el anticuerpo particular. Por ejemplo, diferentes anticuerpos pueden tener diferentes masas y/o afinidades, y de este modo pueden requerir diferentes niveles de dosificacion. Los anticuerpos preparados como fragmentos Fab' o anticuerpos monocatenarios tambien requeriran dosis diferentes de aquellas de las inmunoglobulinas naturales equivalentes, dado que son de masa considerablemente mas pequena que las inmunoglobulinas naturales, y de este modo requieren dosis mas bajas para alcanzar los mismos niveles molares en la sangre del paciente.

Otros compuestos terapeuticos de la descripcion tambien se pueden administrar en una variedad de formas de dosis unitaria, y sus dosis tambien variaran con el tamano, potencia y semivida in vivo del compuesto terapeutico particular que esta siendo administrado.

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Las dosis de los compuestos terapeuticos de la descripcion tambien variaran dependiendo de la forma de administracion, los smtomas particulares del paciente que esta siendo tratado, la salud general, condicion, talla, y edad del paciente, y del criterio del medico que prescribe.

Las formulaciones de la solicitud pueden ser distribuidas como artmulos de fabricacion que comprenden material de envasado y un agente farmaceutico que comprende el anticuerpo capaz de inhibir el complemento y un vehmulo aceptable farmaceuticamente segun sea apropiado para el modo de administracion. El material de envasado puede incluir una etiqueta que indique que la formulacion es para uso en el tratamiento de neuropatfas mediadas por anticuerpos. Aunque se prefieren los anticuerpos, especialmente anticuerpos anti-C5 que ya han demostrado que son seguros y efectivos para disminuir la acumulacion de componentes del complemento aguas abajo en personas, el uso de otros inhibidores del complemento tambien esta contemplado por esta descripcion. Las formulaciones farmaceuticas y usos de la descripcion se pueden combinar con cualquier inhibidor del complemento conocido o tratamiento de neuropatfa mediada por anticuerpos conocida en la tecnica (mas arriba).

Los tratamientos de la solicitud se pueden usar en combinacion con otros tratamientos de la solicitud, o con tratamientos conocidos para neuropatfas mediadas por anticuerpos. Los tratamientos de la solicitud se pueden coadministrar con otros tratamientos que traten smtomas de neuropatfas mediadas por anticuerpos. La administracion de los compuestos terapeuticos de la descripcion generalmente se llevara a cabo por via parenteral, tfpicamente mediante inyeccion, tal como inyeccion intra-articular o intravascular (por ejemplo, infusion intravenosa) o inyeccion intramuscular. Otras vfas de administracion, por ejemplo oral (p.o.), se pueden usar si se desea y es practico para el anticuerpo particular capaz de inhibir el complemento que se va a administrar.

En caso de conflicto, regira la presente solicitud, incluyendo cualquier definicion en ella.

Los presentes metodos se describen con referencia a los siguientes Ejemplos, los cuales se ofrecen a tttulo de ilustracion y no pretenden limitar la descripcion en forma alguna. Se utilizan las tecnicas estandar bien conocidas en la tecnica o las tecnicas descritas espedficamente mas adelante.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1. ECULIZUMAB EVITA LESIONES ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES MEDIADAS POR EL COMPLEMENTO EN EL MODELO DE MFS IN VITRO

En el modelo de MFS in vitro, el tratamiento de preparaciones de nervio-musculo de diafragma con mAb anti-GQ1b CGM3 y suero humano normal (NHS), en presencia de un mAb con isotipo coincidente irrelevante (100 |ig/ml), que sirvio como control negativo para eculizumab, indujo la activacion del complemento en las NMJs. Esto se evidencio morfologicamente por la deposicion de C3c y de MAC (FIGs. 1A, 1B, 1D, 1E y 1F), asf como tambien por celulas de Schwann perisinapticas (pSC) y terminales nerviosos motores danados mostrados por tincion con homodfmero 1 de etidio (EthD-1) y perdida de tincion de neurofilamento (NF), respectivamente (FIGs. 1C, 1E y 1F). Estas caractensticas fueron identicas a las dadas a conocer anteriormente (Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708 (1999); Halstead et al. Brain 127:2109-2123 (2004); O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). La adicion de 100 |ig/ml de eculizumab al NHS como fuente de complemento evito completamente la deposicion de MAC (FIGs. 1B, 1D, 1E y 1F; p<0,001) y la perdida de NF axonal terminal (FIGs. 1C y 1F; p<0,001), mientras que la deposicion del componente del complemento mas temprano C3c no fue afectada (FIGs. 1A y 1D; p = 0,2). Ademas, se abolio el dano a las pSCs, ya que solamente 2% de las 1439 NMJs investigadas tuvo uno o mas nucleos positivos a EthD-1, en comparacion con 33% de 1529 NMJs investigadas en tejido tratado con mAb de control (FIG. 1E; p<0,001).

Estas observaciones immunohistologicas fueron paralelas a las observaciones electrofisiologicas y funcionales. En las NMJs preincubadas con CGM3, el NHS (40%) en presencia del mAb de control indujo un gran incremento en la frecuencia de los potenciales miniatura de terminal de placa (MEPPs, los sucesos postsinapticos que surgen a partir de la liberacion espontanea de cuantos de acetilcolina individuales del terminal nervioso motor presinaptico), como se observo previamente (Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708 (1999)). Este efecto se evito casi completamente mediante 100 |ig/ml de eculizumab. La frecuencia de MEPP fue alrededor de 0,7 s-1 antes y despues de la incubacion en 50 |ig/ml de CGM3, y se elevo hasta 34,0 ± 4,6 s-1 en presencia de NHS con 100 |ig/ml de mAb de control anadido. Por el contrario, la frecuencia de MEPP solo fue 3,1 ± 1,3 s-1 en presencia de NHS con 100 |ig/ml de eculizumab anadido (FIGs. 2A y 2B; n = 5 musculos; p<0,001).

Eculizumab no altero los tiempos de aumento y disminucion del potencial de membrana en reposo de la fibra muscular o amplitud de MEPP (no se muestran datos). Como se describio anteriormente (Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708 (1999); Plomp et al. Ann. Neurol. 45:189-199 (1999)), las sacudidas asmcronas de fibra muscular individual ocurren durante la incubacion de NHS (puntuacion visual de la mediana 4; n = 5 musculos). Eculizumab evito tal alto gado de sacudidas observandose solo una puntuacion de la mediana de 1 (FIG. 2C; n = 5 musculos, p<0,01, prueba de Mann-Whitney), lo que iguala los niveles basales bajos observados en los penodos de observacion antes y despues de la incubacion de CGM3.

El resultado final de dano presinaptico mediado por anti-CGM3/complemento es el bloqueo de la transmision sinaptica en la NMJ debido a la incapacidad para liberar acetilcolina (Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708

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(1999)). Eculizumab evito completamente este efecto. No se encontraron NMJs “silenciosas” (es dedr, ausencia de MEPPs y potenciales de accion muscular provocados por estimulacion nerviosa), mientras que en la condicion de mAb de control se observo que 19 ± 2,6% del numero total de NMJs muestreadas estaban silenciadas (FIG. 2D; n = 5 musculos). Ademas, se cuantifico el efecto protector de eculizumab sobre la paralisis muscular en el modelo de MFS in vitro. Eculizumab inhibio la perdida de fuerza de contraccion inducida por estimulacion nerviosa de preparaciones de hemi-diafragma de una manera dependiente de la concentracion despues del tratamiento con 200 |ig/ml de CGM3 y 33% de NHS (FIGs. 2E y 2F). En los experimentos de control sin eculizumab, NHS indujo perdida de fuerza de contraccion casi completa en un penodo de 90 min. La adicion de 3 o 6 |ig/ml de eculizumab al NHS ralentizo la tasa de perdida de fuerza de contraccion considerablemente (se observo 50% de perdida a 39 y 60 min, respectivamente, en comparacion con 27 min en la condicion de control; FIG. 2F). Mayores concentraciones de eculizumab de 9 y 12 |ig/ml fueron casi completamente protectoras (quedo >90% de la concentracion inicial despues de 90 min), mientras que 25, 50 y 100 |ig/ml evitaron completamente cualquier perdida de contraccion inducida por CGM3/NHS. Una curva sigmoidal de Boltzmann ajustada a traves de los puntos de datos de concentracion-efecto obtenidos produjo una EC50 de 7,1 |ig/ml para eculizumab en estas condiciones (FIG. 2G).

Estos analisis inmunohistologicos y funcionales muestran que eculizumab evita eficientemente los efectos patofisiologicos mediados por el complemento en el modelo de MFS in vitro.

EJEMPLO 2. CURVA DE RESPUESTA A LA DOSIS DE ECULIZUMAB IN VIVO

A continuacion se examinaron los beneficios del eculizumab in vivo en este modelo murino de smdrome de Guillain- Barre. Los ratones se inmunizaron pasivamente con anticuerpo anti-gangliosido o PBS (como control negativo), seguido de inyecciones concomitantes de NHS (intraperitoneal) y eculizumab (intravenoso) en cantidad de 0, 50, 100, 200, y 400 |ig/raton en PBS. El complemento C3 se deposito abundantemente en la NMJ de todos los ratones que recibieron anticuerpo anti-gangliosido. Una dosis creciente de eculizumab da como resultado una reduccion dependiente de la dosis en la deposicion de MAC en la NMJ (FIG. 3A). El examen de la senal de neurofilamento demuestra la conservacion de la integridad axonal en todas las dosis de eculizumab investigadas cuando se compara con control de lmea de base tratado con PBS. (n = 3 para cada dosis) (FIG. 3B).

EJEMPLO 3. ECULIZUMAB PROTEGE CONTRA NEUROPATA Y PARALISIS RESPIRATORIA EN UN MODELO DE MFS IN VIVO

Con el fin de determinar la eficacia in vivo de eculizumab, se genero un modelo de raton de MFS in vivo mediante inyeccion intraperitoneal de anticuerpo anti-GQ1b CGM3 y NHS como fuente de complemento. A 16 h despues de la inyeccion de CGM3, se administro sistemicamente una dosis de 200 |ig de eculizumab o mAb de control, por la vena de la cola, seguido de la inyeccion intraperitoneal de 0,5 ml de NHS). Se aplico el protocolo de diferentes vfas de inyeccion de eculizumab y NHS para evitar la inhibicion inmediata de C5 en el NHS por eculizumab dentro del confinamiento de la cavidad peritoneal. Los ratones tratados con CGM3, NHS y mAb de control (n = 10) desarrollaron un aspecto general debil, en algunos casos una hiperlordosis, flancos abdominales invaginados y dificultades para respirar (jadeo) en 2 h tras la inyeccion de NHS. La inyeccion intravenosa de eculizumab evito completamente el desarrollo de estos smtomas (n = 11). Se cuantifico la debilidad con la medida de la fuerza de agarre en los ratones tratados previamente con CGM3, antes y 2 h despues de la inyeccion de mAb de control o eculizumab y NHS (FIG. 4A). Los ratones del grupo de control (n = 5) tiraron con 56,0 ± 5,7 g justo antes de la inyeccion de mAb de control y NHS, mientras que los ratones del grupo de eculizumab (n = 5) tiraron con 54,3 ± 8,4 g (p = 0,87) en esta etapa. La fuerza de traccion 2 h despues de la inyeccion de mAb de control/NHS fue 22% menor (43,7 ± 4,5 g; p<0,005). Eculizumab mejoro tal efecto (8% de reduccion; p = 0,07). La perturbacion respiratoria se evaluo continuamente con pletismograffa de cuerpo entero despues de la inyeccion de mAb/NHS durante un penodo de 6 h (FIGs. 4B y 4C; n = 5 ratones por grupo). El volumen corriente antes de la inyeccion de CGM3 fue similar en ambos grupos (0,21 ± 0,01 y 0,22 ± 0,03 ml en el grupo de mAb de control y eculizumab, respectivamente). Se observo una reduccion de aproximadamente 50% (p<0,001) en el grupo de mAb de control a las 4 y 6 h despues de la inyeccion de NHS. Tal disminucion se evito en gran medida por eculizumab (solamente hubo una reduccion de 17% en estos puntos de tiempo, FIG. 4B). De manera similar, la frecuencia respiratoria se hundio en el grupo de mAb de control en aproximadamente 30% (p<0,01) a las 4 y 6 h despues de la inyeccion de NHS. En el grupo de eculizumab, esta reduccion fue solo 7% (FIG. 4C). Ambos grupos de tratamiento mostraron una reduccion inicial igual de alrededor de 40% de la frecuencia respiratoria cuando se midieron 2 h despues de mAb/NHS, en comparacion con la frecuencia antes de la inyeccion de GCM3, lo que aparentemente se debio al regimen de inyeccion intraperitoneal. Ejemplos de trazos de las senales respiratorias obtenidas se muestran en la FIG. 4D.

Las preparaciones de nervio frenico-hemidiafragma se disecaron a partir de ratones tratados con CGM3/NHS in vivo a las 4 h despues de la inyeccion de NHS, y se llevaron a cabo medidas electrofisiologicas a las NMJs, experimentos de contraccion muscular, y analisis inmunohistologicos detallados. La inspeccion visual indico que solamente una parte muy pequena de los musculos de los ratones tratados con mAb de control se contrajo con la estimulacion electrica supramaxima del nervio frenico, en comparacion con una contraccion completa de los musculos obtenidos de los ratones tratados con eculizumab. En los experimentos de contraccion in vitro en tejidos recolectados de inmunizaciones pasivas, este efecto se cuantifico (FIGs. 4E y 4F). La sacudida y la tension tetanica (40 Hz) fueron 0,07 ± 0,06 y 0,92 ± 0,61 g, respectivamente, en el grupo de mAb de control (n = 4), mientras que en el grupo de

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eculizumab (n = 4) estos fueron 1,36 ± 0,29 y 9,26 ± 0,65 g, respectivamente, igualando los valores de musculos de ratones con edad coincidente no tratados con NHS (no se muestran datos). Con el analisis electrofisiologico, analizamos si la paralisis era causada por disfuncion de las NMJs. En musculos disecados del grupo de mAb de control, 66 ± 7% de las NMJs muestreadas hadan sido “silenciadas”, es decir, no hada MEPPs detectables y ningun potencial de accion muscular con estimulaciones nerviosas. En el grupo de eculizumab, solamente 3 ± 2% hadan sido “silenciadas” (FIGs. 4G y 4H; p<0,001). El analisis inmunohistologico mostro que CGM3 se deposito igualmente en las NMJs de los dos grupos de tratamiento (no se muestran datos). Se identificaron depositos de C3c en las NMJs de ambos grupos, aunque con una intensidad un poco menor en el grupo de eculizumab (FIGs. 5A y 5D; p<0,001). El MAC se deposito claramente en las NMJs de musculos de ratones tratados con mAb de control, pero estuvo virtualmente ausente en el grupo tratado con eculizumab (FIGs. 5B, 5D y 5E). Eculizumab evito la perdida de integridad terminal en las NMJs de ratones tratados con mAb de control, como se evidencia por la intensidad de senal de NF y el patron que se extiende a la region del terminal de placa, es decir, la ramificacion axonal terminal claramente permanecio intacta (FIGs. 5C y 5E). Ademas, la microscopfa electronica mostro la presencia de una ultraestructura presinaptica bien conservada en las NMJs de ratones tratados con eculizumab en comparacion con la de los ratones tratados con mAb de control, las cuales presentaron hinchazon terminal caractenstica, agotamiento de vesfcula sinaptica y mitocondrias hinchadas (FIG. 5F) (O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). Estos datos electrofisiologicos, funcionales e inmunohistologicos muestran que la neuropatfa motora terminal mediada por el complemento ocurre en nuestro modelo de MFS in vivo, y que la paralisis del diafragma contribuye a los deficits respiratorios observados. Mucho mas importante, el tratamiento con eculizumab in vivo evito efectivamente estos defectos neuropatologicos in vivo.

EJEMPLO 4. METODOS

Ratones

Se obtuvieron ratones machos Balb/c (3-6 semanas de edad, 10-25 g) en Harlan (UK o NL). En algunos experimentos de contraccion muscular (vease mas adelante) se usaron ratones machos y hembras mutantes nulos en GM2/GD2 sintasa (Bullens et al. J. Neurosci. 22:6876-6884 (2002)) de 12-22 semanas de edad (19-37 g). Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Ministerio del Interior del Reino Unido (UK PPL60/3096), las leyes holandesas y de la Universidad de Glasgow y Leiden.

Anticuerpos monoclonales y suero humano normal

El mAb IgM anti-gangliosido GQ1b, CGM3, se obtuvo de ratones inoculados con un lipooligosacarido de Campylobacter jejuni portador de GT1a (Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708 (1999)). CGM3 reacciona con gangliosidos GQ1b, GD3 y GT1a que comparten todos la estructura de disialilgalactosa terminal. Estudios previos han demostrado que CGM3 tiene especificidad similar por gangliosidos, e indujo efectos patogenos identicos dependientes del complemento que los sueros con MFS humano (Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708 (1999)). La concentracion de CGM3 se midio usando ELISA cuantitativa (Bethyl Laboratories, Texas, USA). Se tomo suero humano normal (NHS) de un lote de un solo donante que hada sido congelado recientemente y almacenado en multiples alfcuotas a -70°C para conservar la actividad del complemento. Antes del uso experimental, CGM3 y NHS se dializaron durante 24 h a 4°C frente a disolucion de Ringer (116 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 1 mM de NaH2PO4, 23 mM de NaHCO3, 11 mM de glucosa, pH 7,4), pre-gasificado con 95% de 02/5% de CO2. El mAb anti-C5 humano humanizado eculizumab y un mAb de control con isotipo coincidente no espedfico ALXN3300 se obtuvieron de Alexion Pharmaceuticals (Cheshire, USA) y se almacenaron a 4°C.

Modelo de MFS in vitro

El modelo in vitro para MFS que usa CGM3 y NHS se ha descrito anteriormente (Goodyear et al. J Clin. Invest 104:697-708 (1999); O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). De manera resumida, se disecaron hemi-diafragmas de raton con nervio frenico adjunto (o musculo triangular del esternon en algunos casos para inmunohistologfa ilustrativa de NMJ), y se montaron en medio de Ringer a temperatura ambiente (20-22°C). Se retiraron secciones pequenas de control no tratadas de cada preparacion de musculo antes de cualquier incubacion, y se congelaron subitamente en hielo seco para analisis inmunohistologico de lmea de base posterior. Los musculos se incubaron con CGM3 (50 |ig/ml) durante 2-2,5 h a 32°C, despues durante 30 min a 4°C y despues se equilibraron durante 10 min a temperatura ambiente, se enjuagaron en medio de Ringer y posteriormente se expusieron a 33 o 40% de NHS en medio de Ringer durante 1 h a temperatura ambiente. Eculizumab (100 |ig/ml) o el mAb de control (100 |ig/ml) se mezclo con NHS 10 min antes de la incubacion de la preparacion de musculo. Las medidas electrofisiologicas in vitro en la NMJ (vease mas adelante) y la puntuacion de sacudidas de fibras musculares, una caractenstica distintiva de liberacion incontrolada de transmisor en las NMJs en este modelo (Jacobs et al. Muscle Nerve 25:549-558 (2002); O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)), se realizaron antes y despues de la incubacion de CGM3, y durante la incubacion de NHS de 1 h. Se congelaron tiras de musculo en hielo seco y se almacenaron a -20°C, tanto antes como despues de la incubacion con NHS. Las NMJs y los axones motores terminales se evaluaron para determinar los niveles de IgM, C3c, MAC, NF y para determinar la viabilidad de pSC (vease mas adelante).

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Se inyectaron intraperitonealmente ratones Balb/c (3-4 semanas de edad, 10-15 g) con 1,5 mg de CGM3, seguido 16 h despues de una inyeccion intraperitoneal de 0,5 ml de 100% de NHS. Los ratones se observaron durante otras 4-6 h y se analizaron con pletismograffa de cuerpo entero (vease mas adelante), y ensayo de fuerza de agarre como se describio anteriormente (Kaja et al. Eur J. Neurosci 25:2009-2020 (2007)). Los ratones se sacrificaron despues mediante asfixia con CO2 y se diseco el tejido muscular del hemi-diafragma y se analizo en experimentos electrofisiologicos y de contraccion muscular (vease mas adelante), o se proceso adicionalmente para analisis inmunohistologicos (vease mas adelante). El efecto de eculizumab sobre los smtomas in vivo y las lesiones electrofisiologicas, funcionales e histologicas analizadas posteriormente se sometieron a ensayo en este modelo inyectando 200 |ig de eculizumab o mAb de control en la vena de la cola, muy poco antes de la inyeccion intraperitoneal de NHS. Los experimentos iniciales para hallar el intervalo de dosis (no se muestran datos) indicaron que eculizumab en dosis de >50 |ig/raton protegio contra neuropatia.

Pletismograffa

Se empleo pletismograffa de cuerpo entero no invasiva (EMMS, Hants, UK) para demostrar los cambios en los parametros respiratorios en experimentos in vivo. Se recogieron datos de la lmea de base antes del comienzo del experimento. Se inyecto a los ratones con CGM3, seguido de NHS con eculizumab o mAb de control 16 h mas tarde (protocolo como anteriormente), y se vigilaron continuamente durante 6 h. Los parametros de ritmo respiratorio obtenidos del flujo y el volumen corriente se recogieron de 25 respiraciones aceptadas y se promediaron en penodos de 1 h.

Analisis electrofisiologico in vitro de NMJs y puntuacion visual de contractilidad muscular

Se disecaron hemi-diafragmas izquierdo y derecho con su nervio frenico adjunto y se clavaron en una capsula forrada de caucho de silicona en 1,5 ml de medio de Ringer a temperatura ambiente. Se obtuvieron registros intracelulares de potenciales miniatura de terminal de placa (MEPPs, los sucesos postsinapticos que surgen a partir de la liberacion espontanea de cuantos de acetilcolina individuales del terminal nervioso motor presinaptico) en las NMJs a 20-22°C. Las fibras musculares se empalaron cerca de la NMJ con un microelectrodo de vidrio de 10-20 MQ lleno de KCl 3 M, conectado a un amplificador GeneClamp 500B (Axon Instruments/Molecular Devices, Union City, CA, USA) para amplificar y filtrar (10 KHz paso bajo) la senal. Las senales fueron digitalizadas, almacenadas y analizadas (fuera de lmea) usando una interfaz Digidata 1322A, los programas Clampex 9.2 y Clampfit 9.2 (todos de Axon Instruments/Molecular Devices), Mini Analysis 6.0 (Synaptosoft, Fort Lee, USA) y rutinas programadas en Matlab (The Math Works Inc., Natick, MA, USA).

La aparicion de sacudidas asmcronas espontaneas de las fibras que son inducidas por una alta frecuencia de MEPP que resulta de dano presinaptico mediado por CGM3/complemento (Plomp et al. Ann. Neurol. 45:189-199 (1999)) se puntuo visualmente cada 5 min (O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). El tejido se puntuo 0 para ninguna actividad, 1 para la sacudida de <10 fibras, 2 para una cantidad menor de sacudidas a lo largo del tejido, 3 para una cantidad moderada, y 4 para una cantidad amplia. Se calculo la puntuacion promedio durante cada penodo de medicion. El resultado final del dano presinaptico mediado por CGM3/complemento es un silenciamiento de la transmision sinaptica en la NMJ. La cantidad de NMJs “silenciosas” (es decir, sin MEPPs detectables y aparicion de potenciales de accion muscular provocados por la estimulacion del nervio frenico) se expreso como porcentaje de la cantidad total de NMJs muestreadas (8-41) en un musculo en cada condicion experimental.

Experimentos de contraccion muscular

Se ensayo la eficacia protectora de eculizumab en la perdida inducida por CGM3/NHS in vitro de la fuerza de contraccion provocada por estimulacion del nervio de la preparacion de hemi-diafragma. Se uso diafragma de ratones mutantes nulos en GM2/GD2-sintasa debido a que estudios previos mostraron una sensibilidad un tanto mayor del musculo de esta raza a la perdida de contraccion inducida por CGM3/NHS (Bullens et al. J. Neurosci. 22:6876-6884 (2002)). Las preparaciones de hemi-diafragma/nervio frenico izquierdo y derecho que se habfan preincubado con 200 |ig/ml de CGM3 durante 3 h a 32°C se montaron en una capsula forrada con caucho de silicona que contiene 2,25 ml de medio de Ringer a temperatura ambiente (20-22°C), burbujeado continuamente con 95% de 02/5% de CO2. El lado de la caja toracica del musculo se fijo cuidadosamente al fondo de la capsula mediante multiples alfileres pequenos, y el tendon central se conecto por medio de un gancho metalico y una cuerda a un transductor de fuerza que se conecto a un equipo amplificador y digitalizador, tal como se describio anteriormente (Kaja et al. Eur J. Neurosci 25:2009-2020 (2007)). Los estfmulos supramaximos (usualmente ~10 V) de 100 |is de duracion se suministraron cada 5 min durante 3 s a 40 Hz desde un estimulador programable Master-8 (AMPI, Jerusalen, Israel). Se ajusto la tension basica con un control de vernier para obtener la fuerza maxima de contraccion tetanica estimulada (usualmente alrededor de 10 g). Se monitorizo durante 30-50 min la estabilidad de la contraccion producida. Posteriormente, el medio se reemplazo por NHS (33%), al cual se le habfa anadido eculizumab (3, 6, 9, 12, 25, 50 o 100 |ig/ml) y se mezclo durante ~10 min antes de la adicion y se monitorizo el efecto durante 100-200 min, bajo burbujeo suave continuo con 95% de 02/5% de CO2. En los experimentos de control sin eculizumab anadido, se anadieron 100 |ig/ml del mAb de control al NHS. La amplitud de las contracciones se midio fuera de lmea con el cursor en el programa Clampfit 9.0 (Axon Instruments/Molecular Devices, Union City, USA), a los 2 s despues del inicio de cada tren de estimulacion nerviosa.

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Tambien se midieron las fuerzas de contraccion tetanica y de sacudida con la estimulacion nerviosa in vitro de los musculos del hemi-diafragma izquierdo que se disecaron a partir de ratones que habfan sido sometidos al protocolo de MFS in vivo.

Analisis inmunohistologicos

Se montaron secciones de hemi-diafragma no fijadas en medio de montaje M-1 de Lipshaw (Pittsburgh, PA, USA), y se cortaron secciones criostaticas longitudinales (8-20 |im) en portaobjetos recubiertos con 3-

aminopropiltrietoxisilano, se secaron al aire, despues se almacenaron a -20°C. Para localizar las NMJs, se usaron TRITC y a-bungarotoxina marcada con Bodipy (a-BTx, diluida 1/750 hasta 1,3 |ig/ml; Molecular Probes, Eugene, Oregon). El componente del complemento intermedio C3c se detecto mediante incubacion con anti-C3c de conejo marcado con FITC (1/300; Dako, Ely, UK) durante 1 h a 4°C. El MAC se detecto usando anti-C5b-9 humano de raton (1/50; Dako) seguido de IgG anti-raton de cabra conjugado con FITC (1/300), ambos durante 1 h a 4°C.

Para la tincion de NF, secciones de tejido no fijado se preincubaron durante 1 h a 4°C con a-BTx conjugada con TRITC, se enjuagaron, se sumergieron en etanol a -20°C durante 20 min, despues se incubaron toda la noche a temperatura ambiente con el suero policlonal de conejo 1211 (1/750; reactivo con NF fosforilado; Affiniti Research Products Ltd. Exeter, UK) seguido de IgG anti-raton de cabra conjugado con FITC (1/300; Southern Biotechnology Associates) durante 3 h a 4°C. Todos los anticuerpos de deteccion se diluyeron con disolucion salina amortiguada con fosfato (PBS).

La viabilidad de pSC se evaluo usando EthD-1, un colorante no permeable de membrana que marca con fluorescencia roja los acidos nucleicos de las celulas con membrana permeabilizada (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). En resumen, las preparaciones nervio-musculo se expusieron a Ringer que contema 2 |iM de EthD-1. El tejido se incubo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h, se enjuago en disolucion de Ringer y se congelo para inmunohistologfa. Las NMJs se identificaron en secciones criostaticas de 15 |im tinendolas con a-BTx conjugada con Bodipy (1,3 |ig/ml), y se calculo el porcentaje de NMJs con nucleos positivos a EthD-1 en las NMJs.

Para ilustraciones, se incubaron musculos triangulares de esternon montados completos con CGM3 (50 |ig/ml) y a- BTx conjugada con fluorocromo (TRITC/FITC/CY5) (2 |ig/ml; 1:500), seguido de NHS mas eculizumab o mAb de control. Las preparaciones se incubaron con a-BTx conjugada fluorescentemente y diversas combinaciones de lo siguiente: anti-C5b-9 de raton (1:40; Dako), anti-C3c-FITC (1:200; Dako), o EthD-1 (2 |iM) en medio de Ringer durante 1 h a temperatura ambiente, se enjuagaron en medio de Ringer, seguido de fijacion durante 20 min en 4% de formaldehudo en PBS. Los grupos aldehfdo no reactivos se inactivaron, incubandolos con glicina 0,1 M durante 10 min. Los anticuerpos se volvieron a aplicar entonces en PBS y se agitaron toda la noche a temperatura ambiente. Para la tincion de antfgenos intracelulares, el musculo se fijo en 4% de formaldehudo durante 20 min, seguido de 10 min en glicina 0,1 M, y despues se incubo en una disolucion permeabilizante de 0,5% de Triton-X100 en PBS durante 30 min a temperatura ambiente, y anti-S100 de conejo (1:150; Dako) o anti-NF de conejo (1:150; Chemicon, Hampshire, UK) diluido en disolucion permeabilizante aplicada toda la noche a temperatura ambiente. El tejido se aclaro en PBS y, cuando fue necesario, se incubo en los siguientes anticuerpos conjugados fluorescentemente diluidos 1:300; IgG anti-conejo-FITC, IgG anti-raton-FITC o -TRITC, y se agito durante 7 h a temperatura ambiente en la oscuridad. El tejido se aclaro en PBS y se monto en medio de montaje Citifluor (Citifluor Products, Canterbury, UK).

Captura de imagenes, cuantificacion y analisis estadfstico

Las imagenes digitales se capturaron usando microscopio de barrido por laser confocal Zeiss Pascal y Zeiss Axio Imager Z1 con ApoTome. Las medidas del analisis de imagen se obtuvieron usando el software de analisis de imagen Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA). Para el analisis cuantitativo de IgM, C3c, MAC y NF, se llevaron a cabo 3 experimentos de tincion de cada marcador en tejido procedente de al menos 3 hemi- diafragmas individuales, y se cuantificaron como se describio previamente (O'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). Todos los estudios fueron desconocidos para el observador. Para el analisis inmunohistologico de datos no parametricos, se realizaron comparaciones estadfsticas usando la Prueba de Mann-Whitney empleando un nivel de significancia de 1%. Para la comparacion de pSC positivas a EthD-1 en la NMJ, se uso la prueba de chi-cuadrado con un nivel de significancia de 1%.

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Claims (14)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso en el tratamiento de una neuropatia mediada por anticuerpos anti-gangliosidos o anti-glicoKpidos en un mairnfero, en el que el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo se une a:

   (i) el componente del complemento C5 e inhibe la escision de C5 en fragmentos C5a y C5b; o

   (ii) C5b,

   en el que dicho anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo inhibe la formacion del complejo de ataque a membrana; y

   en el que dicha neuropatfa mediada por anticuerpos anti-gangliosidos o anti-glicolfpidos se selecciona del grupo que consiste en: neuropatfa axonal motora aguda, polineuropatfa desmienilizante inflamatoria aguda, encefalitis del tallo cerebral de Bickerstaff, oftalmoparesia aguda, smdrome de Guillain-Barre ataxico, debilidad farmgeo-cervical- braquial, smdromes de neuropatia cronica con anticuerpos anti-glicoKpidos, neuropatia paraproteinemica IgM antiMAG, neuropatfa ataxica sensorial cronica con anticuerpos anti-disialosilo, neuropatfa paraproteinemica IgM, IgG e IgA, neuropatfa motora con anticuerpos anti-GM1 y anti-GM2, neuropatia desmielinizante inflamatoria cronica (CIDP), neuropatfa motora multifocal (MMN), y neuropatia sensorial y motora desmielinizante multifocal adquirida (MADSAM).
2. 2. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho anticuerpo anti-gangliosido o anti-glicolfpido se une a un glicolfpido seleccionado del grupo que consiste en: GM1, GMI(NeuGc), GM1b, GalNAc-GM1b, GD1a, GalNAc-GD1a, GD1b, 9-O-acetil GD1b, GD3, GT1a, GT1b, GQ1b, GQ1ba, LM1, galactocerebrosido, y SGPG.
3. 3. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho mamffero es un ser humano.
4. 4. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo policlonal, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal, un diacuerpo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo quimerizado o quimerico, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano desinmunizado, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo totalmente humano, un anticuerpo monocatenario, un Fv, un Fab, un Fab', o un F(ab')2.
5. 5. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo inhibe la escision de C5 en los fragmentos C5a y C5b.
6. 6. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun la reivindicacion 5, en el que dicho anticuerpo es eculizumab.
7. 7. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun la reivindicacion 5, en el que dicho anticuerpo es pexelizumab.
8. 8. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun la reivindicacion 6, en el que dicho tratamiento es cronico.
9. 9. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun la reivindicacion 7, en el que dicho tratamiento comprende tratar un episodio agudo.
10. 10. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho tratamiento comprende administrar sistemicamente el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo a dicho mamnfero.
11. 11. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho tratamiento comprende administrar localmente el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo a dicho mamffero.
12. 12. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho tratamiento da como resultado:

    (a) una menor lesion neuronal en dicho mamffero; o

    (b) una menor cantidad y/o grado de condicion fisiologica indeseable resultante de lesion nerviosa excesiva.

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13. 13. El anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo para uso segun la reivindicacion 12, en el que dicha condicion fisiologica indeseable se selecciona del grupo que consiste en: oftalmoplejfa, ataxia, arreflexia, coordinacion muscular anormal, paralisis de los musculos oculares, dolor muscular constante, ausencia de los reflejos del tendon, entumecimiento y hormigueo en las extremidades inferiores, debilidad de los musculos distales de las extremidades inferiores, pie pendulo, debilidad que implica a todas las extremidades inferiores, debilidad que implica a las extremidades superiores, debilidad en los musculos de la respiracion, y muerte.
14. 14. El anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho tratamiento da como resultado:

    (a) una menor formacion del complejo de ataque a membrana (MAC) en las uniones neuromusculares presinapticas;

    (b) el restablecimiento de una frecuencia normal de potenciales miniatura de terminal de placa;

    (c) el restablecimiento de la transmision sinaptica en las uniones neuromusculares; o

    (d) la inhibicion de la perdida de integridad terminal en las uniones neuromusculares.