KR20130103668A

KR20130103668A - 스쿠알렌을 제조하기 위한 개선된 방법

Info

Publication number: KR20130103668A
Application number: KR1020127031750A
Authority: KR
Inventors: 매닌더 호라
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2013-09-24
Anticipated expiration: 2031-05-12
Also published as: CA2798924A1; US9867877B2; EP3103784A1; EA027142B1; US10517947B2; US20170072053A1; SI2569267T1; PL2620423T3; EP3489211A1; ZA201208381B; CA2798924C; US9199897B2; US11077186B2; ES2597158T3; US20130209510A1; TR201905021T4; JP2013530941A; CN102892734B; MX352758B; EP2569267B2

Abstract

동물 공급원으로부터의 스쿠알렌을 포함하는 조성물로부터 스쿠알렌을 제조하는 방법으로서, (a) 온도 T₁에서 수행되는 정제 증류의 단계, 및 (b) 온도 T₂에서 수행되는 변성 증류의 단계를 포함하며, (a) 및 (b) 단계는 어느 순서로도 수행되고, T₁ 및T₂는 스쿠알렌을 비등하도록 하기에 충분하고; T₂는 T₁보다 높고; T₂는 200℃ 이상이다.

Description

스쿠알렌을 제조하기 위한 개선된 방법{IMPROVED METHODS FOR PREPARING SQUALENE}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2010년 5월 12일에 출원된 미국 가 특허출원 제61/395,448호의 이익을 주장하며, 그것의 전체적인 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참고자료로 포함된다.

기술분야

본 발명은 약학적 적용에 적합한 순도를 갖는 스쿠알렌의 제조 분야에 있다.

상어 간유는 스쿠알렌이라는 이름의 분기된 불포화 테르페노이드(C₃₀H₅₀;[(CH₃)₂C[=CHCH₂CH₂C(CH₃)]₂=CHCH₂-]₂; 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사-헥사엔; CAS RN 7683-64-9)를 함유한다. 스쿠알렌은 사람 백신의 수중유 에멀션, 예를 들어 인플루엔자 백신을 면역증강하기 위해 사용되는 MF59 에멀션에 사용하는 것으로 알려져 있다. 스쿠알렌은 또한 다른 약학적 제품(예를 들어, 연고, 좌약) 및 화장품에서도 사용된다.

스쿠알렌의 현재 공급원은 주로 어유, 및 특히 상어 간유이다. 특히 엄격한 제조 표준(Novartis에 의한 MF59의 제조 동안에 사용되는 것들과 같은 것)이 보유되지 않으면, 상어 간유로부터 추출한 스쿠알렌의 사용과 관련된 문제가 있을 수 있다. 예를 들어, 상어는 사람에 대해서도 감염성이거나 사람에게 해로운 물질을 생산하는 병원체에 의해 감염될 수 있고, TSE 또는 TSE-유사 상어 물질이 존재할 수 있다[예를 들어, 참고문헌 1 내지 3]. 더욱이, 상어는 카르차톡신과 같은 사람 독소를 함유할 수 있다. 게다가, 상어는 사람이 알레르기를 일으킬 수 있는 단백질을 함유할 수 있다. 사람이 알레르기를 일으키는 통상의 어류 단백질은 상어에게서 발견되는 파브알부민이다. 따라서 저렴한 낮은 등급의 스쿠알렌의 공급원은 사람의 약학적 용도에 적합하지 않다. 사람 수령인에 대한 피해 위험은, 정의에 의해, 보조제(adjuvant)가 불순물에 대해 원하지 않은 강한 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에, 스쿠알렌이 면역 보조제의 일부인 상황에서 고조될 수 있다.

약학적 사용에 적합한 스쿠알렌, 즉 규제 표준을 충족시키고, 사람에게 해로울 수 있는 오염물, 병원체, 바이러스, 사람 독소 또는 단백질을 함유하지 않는 제품을 제조하기 위해서, 더욱 개선된 방법을 찾는 것이 유용하다. 본 발명 방법은 상어 간유로부터 유도된 스쿠알렌의 정제에 특히 유용하다.

본 발명은 동물 공급원으로부터의 스쿠알렌을 포함하는 조성물로부터 스쿠알렌을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, (a) 온도 T₁에서 수행되는 정제 증류의 단계; 및 (b) 온도 T₂에서 수행되는 변성 증류의 단계를 포함하며; (a) 및 (b) 단계는 어느 순서로도 수행되고, T₁ 및T₂는 스쿠알렌을 비등하도록 하기에 충분하고; T₂는 T₁보다 높고; T₂는 200℃ 이상이다. 동물 공급원은 전형적으로 상어 간유(또는 그것의 추출물)와 같이 어류 공급원이고, 즉 본 발명은 상어 간유로부터 또는 상어 간유 추출물로부터 스쿠알렌을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 스쿠알렌-함유 조성물로부터 스쿠알렌을 제조하는 방법을 더 제공하고, (a) 온도 T₁에서 수행되는 정제 증류의 단계; 및 (b) 온도 T₂에서 수행되는 변성 증류의 단계를 포함하며; (a) 및 (b) 단계는 어느 순서로도 수행되고, T₁ 및T₂는 스쿠알렌을 비등하도록 하기에 충분하고; T₁은 140℃ 미만이고; T₂는 200℃ 이상이다. 스쿠알렌-함유 조성물은 유용하게 상어 간유 또는 그것의 추출물일 수 있다.

본 발명은 적어도 99%의 스쿠알렌을 포함하는 조성물의 재증류 방법을 더 제공하고, 상기 재증류는 200℃ 이상인 온도 T₂에서 수행되는 변성 증류이다. 이러한 재증류는 조성물의 수분 함량을, 예를 들어 0.01% 이하로 감소시킬 수 있다.

본 발명의 방법은 약학적 적용에 적합한 제품을 제조하는데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 사람에게 해로울 수 있는 오염물, 병원체, 바이러스, 사람 독소 또는 단백질, 특히 단백질 파브알부민을 함유하지 않는 정제된 스쿠알렌을 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 기술된 방법에 따라서 제조된 스쿠알렌을 사용하여 에멀션을 제조하는 단계를 포함하는, 수중유 에멀션의 제조 방법을 더 제공한다.

본 발명은 상기 기술된 바와 같이 에멀션을 제조하는 단계, 및 에멀션을 항원과 조합하는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조 방법을 더 제공한다.

본 발명은 상기 기술된 바와 같이 에멀션을 제조하는 단계, 및 에멀션을 항원 성분과 함께 키트 성분으로서 키트에 포장하는 단계를 포함하는 백신 키트의 제조 방법을 더 제공한다.

본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 스쿠알렌을 더 제공한다.

본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 스쿠알렌을 포함하는 수중유 에멀션을 더 제공한다.

본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 스쿠알렌을 포함하는 백신을 더 제공한다.

본 발명은 백신에 본 발명의 방법에 따라 제조된 스쿠알렌의 사용을 더 제공한다.

정제 증류

스쿠알렌을 포함하는 조성물은 어떤 적합한 공급원, 예를 들어 흑액 비누 스키밍(skimming); 톨유 비누; 미정제 톨유; 톨유 피치; 사탕수수 오일; 오일 및 지방의 추출, 탈검 및 정제로부터의 잔류물; 지방산 및 에스테르의 증류 잔류물; 식물성 오일의 탈취 증류액; 올리브 오일; 대두유; 미강유; 상어 간유; 우지; 커피 오일; 어유; 대구 간유; 밀배아유; 옥수수배아유; 팜유; 안디로바 오일; 및 토마토 잔류물로부터의 오일로부터 유도될 수 있다. 특히, 스쿠알렌을 포함하는 조성물은 상어 간유로부터 유도될 수 있다.

정제 증류는 스쿠알렌을 포함하는 조성물로부터 불순물을 제거하여, 정제된 조성물을 제조한다. 스쿠알렌을 포함하는 조성물은 일반적으로 액체이다. 정제 증류에 앞서, 스쿠알렌을 포함하는 조성물은 불순물, 예를 들어 스쿠알라민; 알킬글리세롤; 지방산(예를 들어, 오메가-3-지방산); 비타민 A 및 D; 프리스틴; 트리글리세리드; 글리세롤 에테르 및 지방 알콜을 함유할 수 있다.

정제 증류는 온도 T₁에서 수행되고, T₁은 스쿠알렌을 비등하기에 충분할 수 있고, 즉 T₁은 스쿠알렌의 비등점 이상일 수 있다. 스쿠알렌의 비등점은 760mm Hg(즉, 1 기압)에서 429 내지 430℃이다.

액체의 비등점은 화합물의 액체 상의 증기압이 액체의 표면에 작용하는 외부 압력과 동일한 온도이다. 그러므로, 스쿠알렌의 비등점과, 이와 같이 T₁의 하한은 스쿠알렌을 포함하는 조성물의 표면에 작용하는 외부 압력에 따를 것이다. 이 현상은 본 분야에 잘 알려져 있고, 당업자는 사용되는 주어진 증류 압력에서 관측되는 스쿠알렌의 비등점을 계산할 수 있다. 대안으로, 당업자는 원하는 관측된 스쿠알렌의 비등점에 기초하여 필요한 증류 압력을 계산할 수 있다. 이러한 계산은 노모그래프를 사용하여 수행될 수 있다.

한 구체예에서, 정제 증류는 적어도 70℃, 예를 들어 적어도 75℃, 또는 적어도 80℃의 온도에서 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 정제 증류는 140℃ 미만, 예를 들어 130℃ 미만, 120℃ 미만, 110℃ 미만, 100℃ 미만, 95℃ 미만, 90℃ 미만, 또는 85℃ 미만의 온도에서 수행될 수 있다.

한 구체예에서, 정제 증류는 거의 진공에서 수행될 수 있다. 특히, 정제 증류는 적어도 0.5㎛ Hg, 예를 들어 적어도 0.75㎛ Hg, 또는 적어도 1㎛ Hg의 압력에서 수행될 수 있다. 정제 증류는 5㎛ Hg 미만, 예를 들어 2.5㎛ Hg 미만, 또는 2㎛ Hg 미만의 압력에서 수행될 수 있다.

본 발명의 추가 구체예는 상기 열거된 최소 및 최대 온도와 최소 및 최대 압력의 조합을 포함한다.

정제 증류는 적어도 95%의 스쿠알렌, 예를 들어 적어도 96%의 스쿠알렌, 적어도 97%의 스쿠알렌, 적어도 98%의 스쿠알렌, 적어도 99%의 스쿠알렌, 적어도 99.5%의 스쿠알렌, 적어도 99.8%의 스쿠알렌, 적어도 99.9%의 스쿠알렌, 또는 심지어 100%의 스쿠알렌을 포함하는 조성물을 가져올 수 있다.

본원에 인용된 모든 백분율은 중량 퍼센트이고, 기체 크로마토그래피(GC)를 사용하여 측정될 수 있다. GC 기술은 헥산 중의 스쿠알렌의 샘플을 불꽃 이온화 검출기(FID)가 장치된 기체 크로마토그래프에 주입함으로써 수행될 수 있다. 분석은 200℃에서 2분 동안 유지된 30m × 0.32mm × 0.50mm 모세관 컬럼 상에서 수행되고, 그 다음 분당 12℃로 310℃까지 상승시키고, 거기서 9분 동안 유지된다. 주입구 및 FID는 각각 300℃ 및 320℃에서 유지된다. 스쿠알렌 피크의 동일성은 GC/MS(질량 선택 검출기를 사용하는 기체 크로마토그래피)를 사용하여 확립된다. 순도는 스쿠알렌 피크의 영역으로서, 크로마토그램에서 모든 피크 영역의 합계의 백분율로서 보고된다.

정제 증류는 변성 증류에 앞서 수행되어, 정제된 조성물을 가져올 수 있다. 대안으로, 정제 증류는 변성 증류 후에 수행되어, 변성되고 정제된 조성물을 가져올 수 있다.

변성 증류

상어 및 따라서 상어-간유로부터 유도된 스쿠알렌은 사람이 알레르기를 일으키는 단백질을 함유할 수 있다. 사람이 알레르기를 일으킬 수 있는 통상의 어류 단백질은 상어에게서 발견되는 파브알부민이다. 게다가, 오염 단백질 또는 재료는 스쿠알렌 조성물에, 예를 들어 정제 증류 후에 또는 스쿠알렌의 분해 생성물로서 도입될 수 있었다. 가능한 오염 단백질 또는 재료는 아세톤, 아세트알데히드, 포름알데히드, 및 물을 포함한다. 유익하게, 변성 증류 단계는 스쿠알렌을 포함하는 조성물로부터 단백질, 특히 파브알부민 및 어떤 오염 단백질을 변성하거나 및/또는 제거하여, 따라서 변성된 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법의 추가 이점은 변성 증류가 스쿠알렌을 포함하는 조성물에 존재하는 어떤 잠재적 바이러스도 정제된 조성물로부터 불활성화되거나 및/또는 제거되는 것을 보장할 수 있다는 것이다. 그러므로 변성된 조성물은 비변성된 조성물보다 사람에게 더 안전하다.

이론에 의해 한정되는 것을 원하지 않고, 스쿠알렌의 비등점은 스쿠알렌을 포함하는 조성물의 표면에 작용하는 외부 압력에 의존할 것이다. 그러나, 스쿠알렌을 포함하는 조성물에 존재하는 어떤 단백질도 변성될 온도는 일반적으로 스쿠알렌을 포함하는 조성물의 표면에 작용하는 외부 압력에 무관하다. 그러므로, 변성 증류는 증류가 수행되는 압력과 관계없이 특정 온도에서 수행될 수 있다. 특히, 변성 증류는 온도 T₂에서 수행될 수 있고, T₂는 200℃ 이상, 예를 들어 205℃ 이상, 210℃ 이상, 215℃ 이상, 220℃ 이상, 230℃ 이상, 240℃ 이상, 250℃ 이상, 또는 260℃ 이상일 수 있다.

변성 증류는 500℃ 미만, 예를 들어 480℃ 미만, 450℃ 미만, 420℃ 미만, 400℃ 미만, 350℃ 미만, 또는 300℃ 미만의 온도에서 수행될 수 있다.

변성 증류는 거의 진공에서 수행될 수 있다. 특히, 변성 증류는 적어도 0.5mm Hg, 예를 들어 적어도 0.6mm Hg, 적어도 0.7mm Hg, 또는 적어도 0.8mm Hg의 압력에서 수행될 수 있다. 변성 증류는 5mm Hg 미만, 예를 들어 4mm Hg 미만, 3mm Hg 미만, 2mm Hg 미만, 1.5mm Hg 미만, 1mm Hg 미만, 또는 0.9mm Hg 미만의 압력에서 수행될 수 있다.

이러한 고온에서 변성 증류를 수행하기 위해서, 스쿠알렌을 포함하는 조성물이 고온 표면과의 접촉을 가져오는 장치를 사용하는 것이 유익할 수 있다. 고온 표면은, 상기 정의된 바와 같이, 온도 T₂에서 유지될 수 있고, 고온 표면을 둘러싼 압력은 변성 증류를 위해 상기 정의된 압력일 수 있다. 고온 표면을 둘러싼 압력은 관측된 스쿠알렌의 비등점이 T₂ 이하인 것을 보장하도록 선택될 수 있다. 스쿠알렌을 포함하는 조성물이 고온 표면과 접촉함에 따라, 비등점이 고온 표면을 둘러싼 압력에서 T₂ 미만인, 스쿠알렌을 포함하는 조성물의 이들 성분은 기화할 것이다. 비휘발성 성분, 예를 들어 단백질은 고온 표면에 남고 변성되고 스쿠알렌으로부터 분리될 수 있다.

변성 증류에 앞서, 스쿠알렌을 포함하는 조성물은 85% 내지 99.9%의 스쿠알렌, 예를 들어 90% 내지 99.5%의 스쿠알렌, 95% 내지 99.5%의 스쿠알렌, 또는 97% 내지 99.5%의 스쿠알렌을 포함할 수 있다.

변성 증류는 높은 백분율의 스쿠알렌을 갖는 스쿠알렌 조성물을 제조할 수 있다. 특히, 변성 증류는 적어도 95%의 스쿠알렌, 예를 들어 적어도 99%의 스쿠알렌, 적어도 99.5%의 스쿠알렌, 적어도 99.9%의 스쿠알렌, 또는 심지어 100%의 스쿠알렌을 포함하는 변성된 조성물을 가져올 수 있다.

변성 증류는 0.5% 미만의 단백질, 예를 들어 0.1% 미만의 단백질, 0.01% 미만의 단백질, 또는 0%의 단백질을 포함하는 변성된 조성물을 가져올 수 있다. 그러므로, 본 발명은 0.5% 미만의 단백질, 예를 들어 0.1% 미만의 단백질, 0.01% 미만의 단백질, 또는 0%의 단백질을 포함하는 스쿠알렌을 제공한다.

한 구체예에서, 변성 증류는 정제 증류 후에 수행되어, 정제되고 변성된 조성물을 가져올 수 있다.

T₂는 T₁보다 높을 수 있다. 특히, T₂ - T₁은 10℃ 내지 300℃, 예를 들어 30℃ 내지 250℃, 50℃ 내지 200℃, 또는 80℃ 내지 150℃일 수 있다.

용매

스쿠알렌 조성물이 백신에 사용하는 것으로 의도된다면 특히 중요한, 스쿠알렌을 포함하는 조성물에 불순물의 도입을 피하기 위해서, 정제 및 변성 증류는 용매의 첨가 없이 수행될 수 있다.

비누화

스쿠알렌을 포함하는 조성물은 비누화를 시킬 수 있다. 비누화는 상기 논의된 (a) 및 (b)의 증류 단계에 앞서 보통 수행될 것이다. 대안으로, 비누화는 (a) 및 (b)의 증류 단계 사이에 그것들이 수행되는 어떤 순서로든 수행될 수 있다. 대안으로, 그러나 특이하게, 비누화는 (a) 및 (b)의 증류 단계 후에 수행될 수 있다. 비누화는 스쿠알렌을 포함하는 조성물에 존재하는 단백질을 파괴할 수 있다. 그러나, 비누화는 존재하는 모든 단백질을 제거하지 않을 수도 있다. 비누화 후 스쿠알렌을 포함하는 조성물에 남아있는 어떤 잔류 단백질도 변성 증류 단계를 통해 제거될 수 있다. 비누화와 변성 증류의 조합은 그것이 스쿠알렌이 어떤 단백질도 함유하지 않는 가능성을 개선시키기 때문에 유익하다.

비누화는 알콜 및 카르복시산의 염을 형성하기 위한 염기성 조건하에서의 에스테르의 가수분해이다. 스쿠알렌을 포함하는 조성물의 비누화 동안에, 염기(예를 들어, NaOH 또는 OH)가 조성물에 첨가되는데, 이것은 지방산 에스테르(예를 들어, 트리글리세리드)로 하여금 비누로 전환을 야기할 수 있다. 비누화는 그것이 비누화된 생성물의 비등점 및 비비누화된 생성물의 비등점 사이의 차이를 증가시켜, 증류, 예를 들어 정제 및/또는 변성 증류에 의한 분리를 더 효율적으로 만들기 때문에 유익할 수 있다. 대안으로, 비누화된 생성물은 다른 수단, 예를 들어 원심분리에 의해 제거될 수 있다.

비누화에 의한 지방산 에스테르의 제거는 스쿠알렌을 포함하는 비비누화된 조성물과 비교해 개선된 순도(즉, 더 높은 %의 스쿠알렌)일 수 있는, 스쿠알렌을 포함하는 비누화된 조성물을 가져올 수 있다.

스쿠알렌 특성화

본 발명의 방법에 의해 제조된 스쿠알렌은 4 mg/ml 미만, 예를 들어 3 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 또는 1 mg/ml 미만의 비누화 값을 가질 수 있다. 이러한 측정은 스쿠알렌에 존재하는 비누화할 수 있는 종의 양을 나타낸다. 비누화 값은, US Pharmacopeia (USP) <401>에 기술된 바와 같이, 수산화나트륨의 가수분해 및 중화 당량으로서 결정될 수 있다. NaOH를 사용하여 얻어진 비누화 값은 그것에 KOH 및 NaOH의 분자량의 비율(1.403)을 곱하여 KOH 값으로 전환될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 스쿠알렌은 1 mg KOH/g 이하, 예를 들어 0.8 mg KOH/g 이하, 0.6 mg KOH/g 이하, 0.5 mg KOH/g 이하, 0.4 mg KOH/g 이하, 0.2 mg KOH/g 이하, 0.1 mg KOH/g 이하, 0.05 mg KOH/g 이하, 0.03 mg KOH/g 이하, 0.02 mg KOH/g 이하, 또는 0.01 mg KOH/g 이하의 산가를 가질 수 있다. 산가는, USP <401>에 기술된 바와 같이, 스쿠알렌에 의해 소비된 수산화칼륨의 중화 당량으로서 결정될 수 있다.

수중유 에멀션

일단 스쿠알렌을 포함하는 조성물이 상기 기술된 바와 같이 제조되었으면, 그것은 하류 제품(downstream product) 예를 들어 약물, 수중유 에멀션 보조제, 등의 제조를 위해 사용될 수 있다.

오염을 피하기 위해서, 스쿠알렌이 증류 처리 후에 그리고 하류 제품의 제조에 앞서 멸균을 유지하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 하류 제품이 에멀션이라면, 증류 및 에멀션 장치는 폐쇄된 시스템을 형성하여, 에멀션의 형성에 앞서 스쿠알렌의 오염을 피할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 스쿠알렌은 하류 제품의 제조에 앞서 비활성 분위기, 예를 들어 질소 하에서 유지될 수 있다.

수중유 에멀션은 백신을 면역증강하는데에 사용하기에 특히 적합한 것으로 발견되었다. 본 발명에 따라 제조된 에멀션은 수성 성분에 더하여 스쿠알렌 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다. 에멀션은 추가 오일을 함유할 수 있다. 이상적으로, 오일(들) 및 계면활성제(들)는 생분해성(대사성) 및 생체 적합성이다.

스쿠알렌과 토코페롤의 오일 조합이 사용될 수 있다. 조성물이 토코페롤을 포함한 경우, α, β, γ, δ, ε 또는 ξ 토코페롤의 어떤 것도 사용될 수 있지만, α-토코페롤이 바람직하다. D-α-토코페롤 및 DL-α-토코페롤은 둘 다 사용될 수 있다. 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이다. 토코페롤은 여러 형태, 예를 들어 다른 염 및/또는 이성질체를 취할 수 있다. 염은 유기 염, 예를 들어 숙신산염, 아세트산염, 니코틴산염 등을 포함한다. 토코페롤의 염이 사용된다면, 바람직한 염은 숙신산염이다. 스쿠알렌과 토코페롤(예를 들어, DL-α-토코페롤)을 포함하는 오일 조합이 유용하다.

2 내지 20%(부피로)의 범위의 오일 함량이 전형적이다.

수성 성분은 맹물(예를 들어, 주사용수)일 수 있거나, 또는 추가 성분, 예를 들어 용질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그것은 염을 포함하여 완충액, 예를 들어 시트르산염 또는 인산염, 예를 들어 나트륨염을 형성할 수 있다. 전형적인 완충액은 인산염 완충액, 트리스 완충액, 붕산염 완충액, 숙신산염 완충액, 히스티딘 완충액, 또는 시트르산염 완충액을 포함한다. 완충액은 전형적으로 5 내지 20mM의 범위로 포함될 것이다.

계면활성제는 바람직하게는 생분해성(대사성) 및 생체 적합성이다. 계면활성제는 그것의 'HLB'(친수성/친유성 균형)에 의해 분류될 수 있는데, 이때 1 내지 10 범위의 HLB는 일반적으로 계면활성제가 물보다 오일에서 더 가용성인 것을 의미하고, 10 내지 20 범위의 HLB는 오일보다 물에서 더 가용성인 것을 의미한다. 에멀션은 바람직하게는 적어도 10, 예를 들어 적어도 15, 또는 바람직하게는 적어도 16의 HLB를 가지는 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.

본 발명은, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(통상 트윈으로 언급됨), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; DOWFAX™ 상표명으로 시판되는 산화에틸렌(EO), 산화프로필렌(PO), 및/또는 산화부틸렌(BO)의 공중합체, 예를 들어 선형 EO/PO 블록 공중합체; 반복된 에톡시(옥시-l,2-에탄디일)기의 수가 다양할 수 있는 옥토크시놀, 옥토크시놀-9(트리톤 X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)이 특히 관심이 있으며; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올(IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린(레시틴); 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르(Brij 계면활성제로 알려짐), 예를 들어 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르; 및 소르비탄 에스테르(통상 SPAN으로 알려짐), 예를 들어 소르비탄 트리올레이트(Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 계면활성제와 사용될 수 있다. 에멀션에 포함하기에 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 80(트윈 80; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트), Span 85(소르비탄 트리올레이트), 레시틴 및 트리톤 X-100이다.

계면활성제의 혼합물, 예를 들어 트윈 80/Span 85 혼합물, 또는 트윈 80/트리톤-X 100 혼합물이 에멀션에 포함될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(트윈 80)와 옥토크시놀, 예를 들어 t-옥틸페녹시-폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100)의 조합이 또한 적합하다. 다른 유용한 조합은 라우레스 9 더하기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥토크시놀을 포함한다. 유용한 혼합물은 HLB 값이 10 내지 20 범위에 있는 계면활성제(예를 들어, HLB가 15.0인 트윈 80) 및 HLB 값이 1 내지 10 범위에 있는 계면활성제(예를 들어, HLB가 1.8인 Span 85)를 포함할 수 있다.

바람직한 계면활성제의 양(중량%)은, 0.01 내지 2%의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예를 들어, 트윈 80); 0.001 내지 0.1%의 옥틸- 또는 논일페녹시 폴리옥시에탄올(예를 들어, 트리톤 X-100, 또는 다른 트리톤 시리즈 세정제); 0.1 내지 20%의 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들어, 라우레스 9)이다.

폴리소르베이트 80 계면활성제를 함유하는 스쿠알렌-함유 수중유 에멀션이 바람직하다.

수중유 에멀션은, (i) 예비 에멀션 또는 전-에멀션으로도 알려진 제 1 평균 오일 방울 크기를 갖는 제 1 에멀션을 제조하는 단계; (ii) 제 1 에멀션을 미세 액화(microfluidization)하여 제 1 평균 오일 방울 크기보다 작은 제 2 평균 오일 방울 크기를 갖는 제 2 에멀션을 형성하는 단계; 및 (iii) 제 2 에멀션을 여과하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 제 1 에멀션은 균질화를 통해 제조될 수 있다.

에멀션에서의 오일 방울은 일반적으로 직경이 5㎛ 미만이고, 심지어 미크론 아래의 직경을 가질 수 있고, 이러한 작은 크기는 미세 액화 장치(microfluidiser)로 편리하게 달성되어 안정한 에멀션을 제공한다. 220nm 미만의 크기를 갖는 방울은 필터 멸균을 시킬 수 있기 때문에 바람직하다.

본 발명에 따라 제조된 스쿠알렌을 사용하여 만들어질 수 있는 구체적 수중유 에멀션 보조제는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다:

* 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80(트윈 80), 및 소르비탄 트리올레이트(Span 85)의 에멀션. 에멀션의 부피 조성은 약 5%의 스쿠알렌, 약 0.5%의 폴리소르베이트 80 및 약 0.5%의 Span 85일 수 있다. 중량으로 이들 비율은 4.3%의 스쿠알렌, 0.5%의 폴리소르베이트 80 및 0.48%의 Span 85이다. 이 보조제는, 참고문헌 7의 10장 및 참고문헌 8의 12장에 더 자세히 기술된 바와 같이, 'MF59'[4 내지 6]로 알려져 있다. MF59 에멀션은 유익하게도 시트르산 이온, 예를 들어 10mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함한다.

* 스쿠알렌, 토코페롤(이상적으로 DL-α-토코페롤), 및 폴리소르베이트 80의 에멀션. 이들 에멀션은 (중량으로) 2 내지 10%의 스쿠알렌, 2 내지 10%의 토코페롤 및 0.3 내지 3%의 폴리소르베이트 80, 예를 들어 4.3%의 스쿠알렌, 4.7%의 토코페롤 및 1.9%의 폴리소르베이트 80을 가질 수 있다. 스쿠알렌:토코페롤의 중량비율은 바람직하게는 1 이하(예를 들어, 0.90)인데, 이것은 더 안정한 에멀션을 제공하기 때문이다. 스쿠알렌 및 폴리소르베이트 80은 약 5:2의 부피비로 또는 약 11:5의 중량비로 존재할 수 있다. 이러한 한 에멀션은 폴리소르베이트 80을 PBS에 2%의 용액으로 용해시키고, 그 다음 이 용액 90ml를 (5g의 DL-α-토코페롤 및 5ml의 스쿠알렌)의 혼합물과 혼합하고, 그 다음 혼합물을 미세 액화함으로써 만들어질 수 있다. 결과된 에멀션은 미크론 아래의 오일 방울, 예를 들어 100 내지 250nm, 바람직하게는 약 180nm의 평균 직경을 가진다. 에멀션은 또한 3-탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3d-MPL)를 포함할 수 있다. 이 형태의 다른 유용한 에멀션은 사람 투여량당 0.5 내지 10mg 스쿠알렌, 0.5 내지 11mg 토코페롤, 및 0.1 내지 4mg 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다[9].

* 스쿠알렌, 토코페롤, 및 트리톤 세정제(예를 들어, 트리톤 X-100)의 에멀션. 에멀션은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다. 에멀션은 인산염 완충액을 함유할 수 있다.

* 스쿠알렌, 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 80), 트리톤 세정제(예를 들어, 트리톤 X-100) 및 토코페롤(예를 들어, α-토코페롤 숙신산염)을 포함하는 에멀션. 에멀션은 이들 3가지 성분을 약 75:11:10의 중량비로(예를 들어, 750 μg/ml의 폴리소르베이트 80, 110 μg/ml의 트리톤 X-100 및 100 μg/ml의 α-토코페롤 숙신산염) 포함할 수 있고, 이들 농도는 항원으로부터 이들 성분의 어떤 기여를 포함해야 한다. 에멀션은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다. 에멀션은 또한 사포닌, 예를 들어 QS21을 포함할 수 있다. 수성 상은 인산염 완충액을 함유할 수도 있다.

* 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리옥시에틸렌(12) 세토스테아릴 에테르) 및 친유성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르, 예를 들어 소르비탄 모노올레에이트 또는 'Span 80')를 포함하는 에멀션. 에멀션은 바람직하게는 열가역성이거나 및/또는 크기가 200nm 미만인 오일 방울을 적어도 90%(부피로) 가진다[10]. 에멀션은 또한 하나 이상의: 알디톨; 동결 보호제(예를 들어, 당, 예를 들어 도데실말토시드 및/또는 수크로스); 및/또는 알킬폴리글리코시드를 포함할 수 있다. 에멀션은 TLR4 아고니스트를 포함할 수 있다[11]. 이러한 에멀션은 동결건조될 수 있다.

* 스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀션[12]. 면역증강된 백신에서 이들 성분의 최종 농도(중량)는 5%의 스쿠알렌, 4%의 폴록사머 105(플루로닉 폴리올) 및 2%의 Abil-Care 85(Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메치콘; 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드)이다.

상기에서 백분율로 표시된 이들 에멀션의 조성은 희석 또는 농축에 의해(예를 들어, 2 또는 3과 같이 정수로, 또는 2/3 또는 3/4과 같이 부분적으로) 변형될 수 있는데, 이때 그것들의 비율은 동일하게 유지된다. 예를 들어, 2배 농축된 MF59는 약 10%의 스쿠알렌, 약 1%의 폴리소르베이트 80 및 약 1%의 소르비탄 트리올레이트를 가진다. 농축된 형태는 희석되어(예를 들어, 항원 용액으로), 에멀션의 원하는 최종 농도가 얻어질 수 있다.

본 발명의 에멀션은 이상적으로는 2℃ 내지 8℃에서 보관된다. 그것은 냉동되어서는 안 된다. 그것은 이상적으로는 직사광선을 피해야 한다. 특히, 본 발명의 스쿠알렌-함유 에멀션 및 백신은 스쿠알렌의 광화학적 파괴를 피하도록 보호되어야 한다. 본 발명의 에멀션이 보관되는 경우, 이것은 비활성 분위기, 예를 들어 N₂ 또는아르곤 중에서 보관되는 것이 바람직하다.

백신

수중유 에멀션 보조제를 그 자체로 환자에게 투여하는 것(예를 들어, 환자에게 별도로 투여되었던 항원의 보조제 효과를 제공하기 위해서)이 가능하지만, 보조제를 투여에 앞서 항원과 혼합하여, 면역성 조성물, 예를 들어 백신을 형성하는 것이 보다 통상적이다. 에멀션과 항원의 혼합은 즉석에서 사용할 때 이루어질 수 있거나, 또는 백신의 제조 동안에 충전에 앞서 일어날 수 있다. 본 발명의 방법은 두 가지 상황에서 모두 적용될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 방법은 본 발명에 따라 제조된 스쿠알렌을 포함하는 에멀션을 항원 성분과 혼합하는 추가의 과정 단계를 포함할 수 있다. 대안으로서, 이것은 보조제를 항원 성분과 함께 키트 성분으로서 키트에 포장하는 추가 단계를 포함할 수 있다.

그러므로, 전체적으로, 본 발명은 혼합된 백신을 제조할 때, 또는 혼합을 위한 준비가 된 항원 및 보조제를 포함하는 키트를 제조할 때 사용될 수 있다. 혼합이 제조 동안에 일어나는 경우, 혼합되는 벌크 항원 및 에멀션의 부피는 전형적으로는 1리터보다 큰, 예를 들어 5리터 이상, 10리터 이상, 20리터 이상, 50리터 이상, 등일 것이다. 혼합이 사용 시점에서 이루어지는 경우, 혼합되는 부피는 전형적으로는 1밀리리터보다 작은, 예를 들어 0.6ml 이하, 0.5ml 이하, 0.4ml 이하, 0.3ml 이하, 0.2ml 이하, 등일 것이다. 두 가지 경우에 모두, 에멀션 및 항원 용액의 실질적으로 동일한 부피로, 즉 실질적으로 1:1(예를 들어, 1.1:1 내지 1:1.1, 바람직하게는 1.05:1 내지 1:1.05, 및 더 바람직하게는 1.025:1 내지 1:1.025)로 혼합되는 것이 통상적이다. 그러나, 일부 구체예에서, 에멀션의 과량 또는 항원의 과량이 사용될 수 있다[13]. 한 성분의 과잉 부피가 사용되는 경우, 과잉 량은 일반적으로 적어도 1.5:1, 예를 들어 ≥2:1, ≥2.5:1, ≥3:1, ≥4:1, ≥5:1, 등일 것이다.

항원 및 보조제가 키트 내에서 별도의 성분으로서 제공되는 경우, 그것들은 키트 내에서 물리적으로 서로 별개이고, 이러한 분리는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 성분들은 별도의 용기, 예를 들어 바이알에 있을 수 있다. 그 다음, 2개의 바이알의 내용물이 필요할 때, 예를 들어 한 바이알의 내용물을 제거하고 그것들을 다른 바이알에 첨가하거나, 또는 두 바이알 모두의 내용물을 별도로 제거하고 그것들을 세 번째 용기에 혼합함으로써 혼합될 수 있다.

다른 배치에서, 키트 성분 중 하나는 주사기에 있고, 다른 것은 바이알과 같은 용기에 있다. 주사기를 사용하여(예를 들어, 바늘로) 그것의 내용물을 혼합을 위해 바이알에 삽입하고, 그 다음 혼합물을 주사기 안으로 회수할 수 있다. 그 다음 주사기의 혼합된 내용물은 전형적으로는 새로운 멸균 바늘을 통해 환자에게 투여될 수 있다. 한 성분을 주사기에 채우는 것은 환자 투여를 위한 별도의 주사기 사용의 필요성을 제거한다.

다른 바람직한 배치에서, 2개의 키트 성분은 함께 보유되지만 동일한 주사기에 별도로, 예를 들어 참고문헌 14 내지 21 등에 기술된 바와 같이, 이중-챔버 주사기에 보유된다. 주사기를 가동하면(예를 들어, 환자에게 투여하는 동안), 두 챔버의 내용물이 혼합된다. 이 배치는 사용시 별도의 혼합 단계의 필요성을 피하게 한다.

다양한 키트 성분의 내용물은 일반적으로 모두 액체 형태일 것이다. 일부 배치에서, 성분(전형적으로 에멀션 성분보다는 항원 성분)은 건조 형태(예를 들어, 동결건조 형태)이고, 다른 성분은 액체 형태이다. 두 성분은 건조 성분을 재활성화시키기 위해 혼합될 수 있고, 환자에게 투여하기 위한 액체 조성물이 제공된다. 동결건조된 성분은 전형적으로 주사기보다는 바이알 내에 위치할 것이다. 건조된 성분은 안정화제, 예를 들어 락토스, 수크로스 또는 만니톨, 그뿐만 아니라 그것의 혼합물, 예를 들어 락토스/수크로스 혼합물, 수크로스/만니톨 혼합물, 등을 포함할 수 있다. 가능한 한 가지 배치는 미리 충전된 주사기 안의 액체 에멀션 성분, 그리고 바이알 안의 동결건조된 항원 성분을 사용한다.

백신이 에멀션 및 항원에 추가하여 성분들을 함유하는 경우, 이들 추가 성분들은 이들 두 키트 성분들과 하나로 포함되거나, 세 번째 키트 성분의 일부가 될 수 있다.

본 발명의 혼합 백신을 위한, 또는 개별적인 키트 성분을 위한, 적합한 용기는 바이알 및 일회용 주사기를 포함한다. 이들 용기는 멸균되어야 한다.

조성물/성분이 바이알에 위치하는 경우, 바이알은 바람직하게는 유리 또는 플라스틱 재료로 만들어진다. 바이알은 바람직하게는 조성물이 그것에 첨가되기 전에 멸균된다. 라텍스-민감성 환자와 같은 문제를 피하기 위해서, 바이알은 라텍스-없는 마개로 밀봉되는 것이 바람직하고, 모든 포장 재료에 라텍스가 없는 것이 바람직하다. 한 구체예에서, 바이알은 부틸 고무 마개를 가진다. 바이알은 단일 투여량의 백신/성분을 포함하거나, 또는 1회 이상의 투여량('다중투여' 바이알), 예를 들어 10회 투여량을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 바이알은 10 × 0.25ml 투여량의 에멀션을 포함한다. 바람직한 바이알은 무색의 유리로 만들어진다.

바이알은 맞춤식 뚜껑(예를 들어, 루어락)을 가짐으로써 미리-충전된 주사기가 뚜껑으로 삽입될 수 있고, 주사기의 내용물을 바이알 안으로 방출할 수 있고(예를 들어, 거기에 동결건조된 재료를 복원하도록), 바이알의 내용물은 주사기 안으로 다시 들어갈 수 있다. 주사기가 바이알으로부터 제거된 후, 그 다음 바늘을 부착하고, 조성물을 환자에게 투여할 수 있다. 뚜껑은 바람직하게는 시일 또는 커버 내부에 위치되어, 시일 또는 커버를 제거한 후 뚜껑에 접근할 수 있어야 한다.

조성물/성분이 주사기 안에 포장되는 경우, 주사기는 보통은 그것에 바늘이 부착되지 않겠지만, 별도의 바늘이 조립 및 사용을 위해 주사기와 함께 공급될 수 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 전형적이다. 주사기는 필오프 라벨을 구비하여, 거기에 로트 번호, 인플루엔자 계절 및 내용물의 유효기간이 인쇄되어 기록 유지를 용이하게 할 수 있다. 주사기의 플런저는 바람직하게는 마개가 있어서, 플런저가 흡인 동안에 사고로 제거되는 것을 방지한다. 주사기는 라텍스 고무 뚜껑 및/또는 플런저를 가질 수 있다. 1회용 주사기는 단일 투여량의 백신을 함유한다. 주사기는 일반적으로 바늘의 부착에 앞서 팁을 밀봉하기 위한 팁 뚜껑을 가질 것이고, 팁 뚜껑은 바람직하게는 부틸 고무로 만들어진다. 주사기 및 바늘이 별도로 포장되는 경우, 바늘은 부틸 고무 보호장치를 장착하는 것이 바람직하다.

에멀션은 바이알 또는 주사기 안에 포장하기에 앞서 완충액으로 희석될 수 있다. 전형적인 완충액은, 인산염 완충액; 트리스 완충액; 붕산염 완충액; 숙신산염 완충액; 히스티딘 완충액; 또는 시트르산염 완충액을 포함한다. 희석은 보조제의 성분들의 농도를 감소시킬 수 있는 반면 그것들의 상대적인 특성, 예컨대 "절반(half)-강도" 보조제를 제공하기 위해 상대적 비율은 유지된다.

용기는, 예를 들어 어린이에게 전달을 용이하게 하기 위해서 절반-투여량 부피를 나타내도록 표시될 수 있다. 예를 들어, 0.5ml 투여량을 함유하는 주사기 는 0.25ml 부피를 나타내는 표시를 가질 수 있다.

유리 용기(예를 들어, 주사기 또는 바이알)가 사용되는 경우, 소다 석회 유리보다는 붕규산염 유리로부터 제조된 용기를 사용하는 것이 바람직하다.

바이러스 항원, 예를 들어 바이러스 표면 단백질; 박테리아 항원, 예를 들어 단백질 및/또는 당 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러가지 항원이 수중유 에멀션과 사용될 수 있다. 본 발명은 특히 인플루엔자 바이러스, HIV, 십이지장충, B형 간염 바이러스, 단순 포진 바이러스, 광견병, 호흡기 합포체 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클라미디아, SARS 코로나바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneuniae), 나이지리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 엡스타인 바르 바이러스, 사람 유두종 바이러스, 등에 대한 백신에 유용하다. 예를 들어:

* 인플루엔자 바이러스 항원. 이것들은 살아있는(생) 바이러스 또는 불활성화된 바이러스의 형태를 취할 수 있다. 불활성화된 바이러스가 사용되는 경우, 백신은 전체 비리온, 분열된 비리온, 또는 정제된 표면 항원(헤마글루티닌을 포함하고, 보통, 뉴라미니다제를 포함하기도 함)을 포함할 수 있다. 인플루엔자 항원은 또한 비로좀의 형태로 존재할 수 있다. 항원은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 및/또는 H16으로부터 선택된, 어떤 헤마글루티닌 하위유형을 가질 수 있다. 백신은, 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는, 한가지 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상) 인플루엔자 바이러스 스트레인으로부터의 항원(들), 예를 들어 1가 A/H5N1 또는 A/H1N1 백신, 또는 3가 A/H1N1 + A/H3N2 + B 백신을 포함할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 재교배 스트레인일 수 있고, 역 유전자 기법에 의해 얻어질 수 있다[예를 들어, 22 내지 26]. 따라서 바이러스는 A/PR/8/34 바이러스로부터 한가지 이상의 RNA 절편(전형적으로 A/PR/8/34로부터 6개의 절편과, 백신 스트레인으로부터 HA 및 N 절편, 즉 6:2 재교배)을 포함할 수 있다. 항원의 공급원으로서 사용된 바이러스는 난(예를 들어, 발육된 계란)에서 또는 세포 배양물에서 성장될 수 있다. 세포 배양물이 사용되는 경우, 세포 기질은 전형적으로 포유류 셀라인, 예를 들어 MDCK; CHO; 293T; BHK; 베로; MRC-5; PER.C6; WI-38; 등일 것이다. 인플루엔자 바이러스를 성장시키기에 바람직한 포유류 셀라인은, Madin Darby 개 신장으로부터 유도된 MDCK 세포[27 내지 30]; 아프리카 녹색 원숭이 신장으로부터 유도된 베로 세포[31 내지 33]; 또는 사람 배아(embryonic) 망막모세포로부터 유도된 PER.C6 세포[34]를 포함한다. 바이러스가 포유류 셀라인 상에서 성장한 경우, 조성물은 유익하게 난단백질(예를 들어, 오브알부민 및 오보뮤코이드)과 닭의 DNA가 없어서, 이로써 알레르기 유발성이 감소된다. 백신의 단위 투여량은 전형적으로 헤마글루티닌(HA) 함량을 참조로 표준화되고, 전형적으로 SRID에 의해 측정된다. 기존의 백신은 전형적으로 스트레인 당 약 15μg의 HA를 함유하지만, 특히 보조제를 사용할 때, 더 낮은 투여량이 사용될 수 있다. 부분적인 투여량, 예를 들어 ½(즉, 스트레인 당 7.5μg의 HA), ¼ 및 ⅛이 사용될 수 있고[35,36], 더 높은 투여량(예를 들어, 3배 또는 9배 투여량[37,38])일 수 있다. 따라서 백신은 인플루엔자 스트레인 당 0.1 내지 150μg, 바람직하게는 0.1 내지 50μg 예를 들어 0.1 내지 20μg, 0.1 내지 15μg, 0.1 내지 10μg, 0.1 내지 7.5μg, 0.5 내지 5μg, 등의 HA를 포함할 수 있다. 특정 투여량은, 예를 들어 스트레인 당 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 3.75, 약 1.9, 약 1.5, 등을 포함한다.

* 사람 면역결핍 바이러스. HIV-1 및 HIV-2를 포함함. 항원은 전형적으로 엔벨로프 항원일 것이다.

* B형 간염 바이러스 표면 항원. 이 항원은 바람직하게는 재조합 DNA 방법, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 효모에서의 발현 후에 얻어진다. 천연 바이러스 HBsAg와 달리, 재조합 효모-발현된 항원은 글리코실화되어 있지 않다. 그것은 실질적으로-구형 입자(약 20nm의 평균 직경)의 형태일 수 있고, 인지질을 포함하는 지질 매트릭스를 포함한다. 천연 HBsAg 입자와 달리, 효모-발현된 입자는 포스파티딜이노시톨을 포함할 수 있다. HBsAg는 하위유형 ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq- 및 adrq+ 중 어떤 것으로부터 일 수 있다.

* 십이지장충. 특히 개에서 볼 수 있음(Ancylostoma caninum). 이 항원은 재조합 Ac-MTP-1(아스타신-유사 메탈로프로테아제) 및/또는 아스파르트산 헤모글로비나제(Ac-APR-1)일 수 있고, 이것은 분비된 단백질로서 배큘로바이러스/곤충 세포 시스템에서 발현될 수 있다[39,40].

* 단순 포진 바이러스 항원(HSV). 본 발명에 사용하기에 바람직한 HSV 항원은 막 당단백질 gD이다. HSV-2 스트레인으로부터의 gD('gD2' 항원)를 사용하는 것이 바람직하다. 조성물은 C-말단 막 앵커 영역이 결실되어 있는 gD의 형태[41], 예를 들어 C-말단에서 아스파라긴 및 글루타민이 첨가되어 있는 천연 단백질의 아미노산 1 내지 306을 포함하는 절단된 gD를 사용할 수 있다. 단백질의 이러한 형태는 절단되어 성숙한 283 아미노산 단백질을 생성하는 신호 펩티드를 포함한다. 앵커의 결실은 단백질이 가용성 형태로 제조되는 것을 허용한다.

* 사람 유두종 바이러스 항원(HPV). 본 발명에 사용하기에 바람직한 HPV 항원은 L1 캡시드 단백질로, 바이러스-유사 입자(VLP)로 알려진 구조를 형성하기 위해 조립될 수 있다. VLP는 효모 세포에서(예를 들어, S.cerevisiae에서) 또는 곤충 세포에서(예를 들어, 스포도프테라 세포, 예를 들어 에스.프루지페르다(S.frugiperda), 또는 드로조필라 세포에서) L1의 재조합 발현에 의해 생성될 수 있다. 효모 세포의 경우, 플라스미드 벡터가 L1 유전자(들)를 운반할 수 있고; 곤충 세포의 경우, 배귤로바이러스 벡터가 L1 유전자(들)를 운반할 수 있다. 더 바람직하게는, 조성물은 HPV-16 및 HPV-18 스트레인 둘 다로부터의 L1 VLP를 포함한다. 이러한 2가의 조합은 매우 효과적인 것으로 나타났다[42]. HPV-16 및 HPV-18 스트레인에 더하여, HPV-6 및 HPV-11 스트레인으로부터의 L1 VLP를 포함하는 것도 가능하다. 발암성 HPV 스트레인의 사용 또한 가능하다. 백신은 HPV 스트레인 당 20 내지 60 μg/ml(예를 들어, 약 40 μg/ml)의 L1을 포함할 수 있다.

* 탄저병 항원. 탄저병은 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)에 의해 유발된다. 적합한 바실루스 안트라시스(B. anthracis) 항원은 A-성분(치사 인자(LF) 및 부종 인자(EF))을 포함하고, 이들 둘 다는 보호성 항원(PA)으로서 알려져 있는 공통된 B-성분을 공유할 수 있다. 항원은 선택적으로 해독될 수 있다. 추가의 상세한 설명은 참고문헌[43 내지 45]에서 찾을 수 있다.

* 에스 . 아우레우스 (S. aureus ) 항원. 다양한 S. aureus 항원이 알려져 있다. 적합한 항원은 캡슐형 당류(예를 들어, 타입 5 및/또는 타입 8 스트레인으로부터) 및 단백질(예를 들어, IsdB, Hla, 등)을 포함한다. 캡슐형 당 항원은 이상적으로는 담체 단백질에 접합 되어있다.

* 에스 . 뉴모니아에 (S. pneumoniae ) 항원. 다양한 에스.뉴모니아에(S.pneumoniae) 항원이 알려져 있다. 적합한 항원은 캡슐형 당류(예를 들어, 한가지 이상의 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 및/또는 23F로부터) 및 단백질(예를 들어, 뉴모라이신, 해독된 뉴모라이신, 폴리히스티딘 트리애드 단백질 D(PhtD), 등)을 포함한다. 캡슐형 당 항원은 이상적으로는 담체 단백질에 접합 되어있다.

* 암 항원. 다양한 종양-특이적 항원이 알려져 있다. 본 발명은 폐암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 등에 대해 면역치료 반응을 유도하는 항원과 함께 사용될 수 있다.

항원의 용액은 보통 스쿠알렌-함유 에멀션과 예를 들어 1:1 부피비로 혼합될 것이다. 이 혼합은 백신 제조자에 의해 충전에 앞서 수행되거나, 의료계 종사자에 의해 사용 시점에서 수행될 수 있다.

약학적 조성물

본 발명의 방법을 사용하여 만들어진 조성물은 약학적으로 허용가능하다. 그것은 스쿠알렌-함유 에멀션 및 선택적인 항원에 더하여 성분들을 포함할 수 있다.

조성물은 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나, 백신은 실질적으로 수은 재료가 없어야 하는데, 예를 들어 티오메르살-없는 것(즉, 5 μg/ml 미만)이 바람직하다[46,47]. 수은을 함유하지 않은 백신 및 성분이 더 바람직하다.

조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1일 것이고, 더 전형적으로는 6.0 내지 8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.5이다. 그러므로, 본 발명의 방법은 포장에 앞서 백신의 pH를 조정하는 단계를 포함할 수 있다.

조성물은 바람직하게는 멸균된다. 조성물은 바람직하게는 발열원이 없어야 하고, 예를 들어 투여량 당 1 EU 미만(내독소 단위, 표준 측정치)을 함유하고, 바람직하게는 투여량 당 0.1 EU 미만이다. 조성물은 바람직하게는 글루텐이 없다.

조성물은 단일 면역화를 위한 재료를 포함할 수 있거나, 다중 면역화를 위한 재료(즉, '다중투여' 키트)를 포함할 수 있다. 보존제의 포함은 다중투여 배치에서 바람직하다.

백신은 전형적으로 약 0.5ml의 투여용량으로 투여되지만, 절반의 투여량(즉 약 0.25ml)이 어린이에게 투여될 수 있다.

처리 방법, 및 백신의 투여

본 발명은 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 키트 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 조성물은 사람 환자에게 투여하기에 적합하고, 본 발명은 이러한 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 면역 반응을 상승시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 약제로 사용하기 위한 이들 키트 및 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 환자의 면역 반응을 상승시키는 약제의 제조에서 (i) 항원의 수성 제제; 및 (ii) 본 발명에 따라 제조된 스쿠알렌을 포함하는 수중유 에멀션의 사용을 제공한다.

이들 방법 및 사용에 의해 상승된 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호성 항체 반응을 포함할 것이다.

조성물은 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 면역화 경로는 근육 내 주사에 의한 것(예를 들어, 팔 또는 다리에)이지만, 다른 이용가능한 경로는 피하 주사, 비강내[48 내지 50], 경구[51], 피내[52,53], 경피[54], 등을 포함한다. 본 발명에 따라 제조된 백신은 어린이 및 성인 모두를 치료하는데 사용될 수 있다. 환자는 1세 미만, 1 내지 5세, 5 내지 15세, 15 내지 55세, 또는 적어도 55세일 수 있다. 환자는 고령(예를 들어, 50세 이상, 바람직하게는 65세 이상), 어린이(예를 들어, 5세 이하), 입원 환자, 의료계 종사자, 군인 및 군 부대원, 임산부, 만성질환자, 면역결핍 환자, 및 해외 여행객일 수 있다. 백신은 오로지 이들 군을 위해서만 적합하지 않고, 집단에서는 더 일반적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 백신은 다른 백신과 실질적으로 동일시에(예를 들어, 동일한 의료 상담 동안에 또는 의료 전문가를 방문하여) 환자에게 투여될 수 있다.

일반

용어 "포함하는"은 "포함하는" 그뿐만 아니라 "구성되는"을 포함하고, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 X로만 구성되거나, 추가의 어떤 것, 예를 들어 X + Y를 포함할 수 있다.

숫치 x와 관련하여 용어 "약"은 선택적이며, 예를 들어 x±10%를 의미한다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.

구체적으로 언급되지 않는 한, 두 가지 이상의 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 과정은 혼합의 어떤 특정 순서를 필요로 하지 않는다. 따라서 성분은 어떤 순서로도 혼합될 수 있다. 3가지 성분이 있는 경우, 두 성분이 서로 조합되고, 그 다음 조합은 세 번째 성분 등과 조합될 수 있다.

방법의 여러 단계는, 동시에 또는 다른 시간에, 동일한 또는 다른 지리적 위치, 예를 들어 나라에서, 그리고 동일한 또는 다른 사람들 또는 단체에 의해서 수행될 수 있다.

본 발명의 수행을 위한 방법

실시예 1

도 1은 본 발명의 방법의 정제 및/또는 변성 증류 단계를 위해 사용될 수 있는 증류 장치의 개략도를 나타낸다. 도 1을 참고로 하여 기술된 방법은 스쿠알렌을 포함하는 조성물에 어떤 용매도 첨가하지 않고 수행될 수 있다. 도 1에 나타낸 구체예에서, 스쿠알렌을 포함하는 조성물을 질소로 덮여진 공급물 용기(1)에 위치시킨다. 입구 라인(3)의 한 단부는 폴리프로필렌 프리필터(prefilter)를 갖고, 공급물 용기에 위치되는 반면, 입구 라인의 다른 단부는 증류 장치(5)의 상부에 삽입되는 스테인리스강 바늘(19-게이지)을 갖는다. 증류 장치는 중앙을 통해 돌출하는 원통형 "고온 핑거"(9)를 갖는 튜브 같은 형태로 된 챔버(7)를 포함한다. 212℃의 비등점을 갖는 에틸 벤조에이트를 핑거 하부에서 가열하여 고온 핑거의 벽에 열을 제공한다. 에틸 벤조에이트가 이 구체예에서 사용되지만, 고온 핑거의 온도를 증가시키는데 더 높은 비등점을 갖는 용매를 사용할 수 있는 것이 명백하다. 증류 동안에, 증류 장치는 진공일 수 있다. 스쿠알렌을 포함하는 조성물은, 예를 들어 증류 장치 내의 더 낮은 압력을 사용하여, 스테인리스강 바늘을 통해 증류 장치로 이동되고, 고온 핑거의 가열된 벽으로 적하될 수 있다(11). 스쿠알렌을 포함하는 조성물이 가열됨에 따라, 증류 장치 내의 압력에서 비등점이 212℃ 아래인 이들 성분은 기화될 것이다. 도 1의 시스템을 사용하여 스쿠알렌을 기화시키기 위해서, 증류 장치 내의 압력은 스쿠알렌의 비등점을 212℃ 이하로 낮추도록 선택되어야 한다(예를 들어, 약 1.5mm Hg 이하). 기화된 성분은 챔버(7)의 외벽에 응축하는데 이것은 주변 공기에 의해 냉각되고, 수집 플라스크(13)로 벽을 타고 내려갈 것인데, 이것은 또한 진공하에서 일 수 있다. 비휘발성 성분, 예를 들어 단백질은 고온 핑거의 벽에 남고, 잔류물 플라스크(15)로 흐른다. 극히 휘발성 성분은 진공 라인을 통해 빠져나가 스쿠알렌 응축물에서 그것들의 수준을 감소시킬 수 있다.

이미 정제 증류를 시킨 스쿠알렌은 이 장치를 사용하여 증류되었다. 공급원에 상관없이, 최종 스쿠알렌은 규칙적으로 99.9% 이상의 순도, 0.03 mg KOH/g 미만의 산가, 그리고 2 mg/g 미만의 비누화 값을 가졌다. 변성 증류는 스쿠알렌의 수분 함량을, 예를 들어 0.022% 내지 0.010%, 0.006 내지 0.005%, 또는 0.010% 내지 0.006% 감소시켰다.

실시예 2 - 비누화 값의 측정.

비누화 값은 유리산을 중화하고 물질의 1.0g에 함유된 에스테르를 비누화하는데 필요한 수산화칼륨의 mg 수이다.

과정(USP <401>): 무게를 단 250ml 플라스크에 1.5g 내지 2g의 물질의 무게를 정확하게 달아 넣고, 25.0ml의 0.5N 알콜성 수산화칼륨을 첨가한다. 플라스크를 적합한 응축기 하에 스팀욕 상에서 가열하여, 내용물을 빈번히 회전하며 30분 동안 환류를 유지한다. 그 다음 1ml의 페놀프탈레인 TS를 첨가하고, 과량의 수산화칼륨을 0.5N 염산 VS로 적정한다. 바탕 측정을 동일한 조건하에서 수행한다. 실제 시험 및 바탕 시험에서 소비된 0.5N 염산의 ml 부피들 간의 차이에 56.1 및 0.5N 염산 VS의 정확한 노르말농도를 곱하고, 취한 시편의 g 중량으로 나눈 것이 비누화 값이다.

스쿠알렌의 공급원에 따라서, 1.4 mg/g 미만의 비누화 값을 얻을 수 있다.

실시예 3 - 산가의 측정.

지방 및 고정유의 산도는 10.0g의 물질에서의 유리산을 중화하는데 필요한 0.1N 알칼리의 ml 수로 표현될 수 있다. 산가는 10.0g의 물질에서의 유리산을 중화하는데 필요한 알칼리의 mg 수이다.

과정(USP <401>): 플라스크에 함유된 알콜 및 에테르의 동일한 부피의 혼합물 50ml(0.1N 수산화나트륨이 있는 페놀프탈레인으로 중화되었음)에 약 10.0g의 물질의 무게를 정확하게 달아 용해시킨다. 시험 시편이 저온 용매에서 용해되지 않으면, 플라스크를 적합한 응축기에 연결하여, 시편이 용해될 때까지 빈번히 진탕하여 천천히 가온한다. 1ml의 페놀프탈레인 TS를 첨가하고, 용액이 30초 동안 진탕 후에 희미한 분홍색이 남을 때까지, 0.1N 수산화나트륨 VS로 적정한다. 산가도 계산한다. 적정에 필요한 0.1N 알칼리 VS의 부피가 2ml 미만이면, 더 희석된 적정제를 사용하거나, 샘플 크기를 따라서 조정할 수 있다. 결과는 적정제의 부피 또는 0.1N 수산화나트륨의 동일한 부피에 의하여 표시될 수 있다.

스쿠알렌의 공급원에 따라서, 0.03 mg KOH/g의 산가를 얻을 수 있다.

실시예 4 - 스파이크( spiking ) 연구

수많은 스파이크 연구가 변성 증류의 효능을 증명하기 위해 수행되었다.

변성 증류에 의해 제거된 불순물의 수준을 결정하기 위해, 스쿠알렌 조성물을 명시된 양의 오염물(예를 들어, 물) 그뿐만 아니라 스쿠알렌의 가능한 분해 생성물(예를 들어, 포름알데히드, 아세트알데히드 및 아세톤)로 스파이크하였다. 스파이크된 용액을 본 발명에 따라 변성 증류하고, 스파이크된 종을 분석하였다.

4kg의 스쿠알렌 조성물을, 실시예 1에 기술된 바와 같은 변성 증류에 앞서, 예를 들어 0.3ml(0.2g)의 아세트알데히드(99.5% 이상의 순도), 0.3ml(0.2g)의 아세톤(99.9% 이상의 순도), 0.55ml의 37 wt% 포름알데히드(0.2g) 수용액 및 3.65g 물로 스파이크하였다. 증류액을 3부분으로 수집하고, 스파이크된 시작 재료와 함께 스파이크된 종을 분석하였다. 결과를 하기 표 1에 제공한다:

표 1의 결과는 아세톤, 아세트알데히드 및 포름알데히드의 농도가 변성 증류 후에 모두 감소한 것을 나타낸다.

본 발명은 실시예에 의해서만 기술되었고, 본 발명의 범위 및 개념 안에 있으면서 변형이 만들어질 수 있다는 것이 이해될 것이다.

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Claims

동물 공급원으로부터의 스쿠알렌을 포함하는 조성물로부터 스쿠알렌을 제조하는 방법으로서,
(a) 온도 T₁에서 수행되는 정제 증류의 단계, 및
(b) 온도 T₂에서 수행되는 변성 증류의 단계를 포함하며,
(a) 및 (b) 단계는 어느 순서로도 수행되고, T₁ 및T₂는 스쿠알렌을 비등하도록 하기에 충분하고; T₂는 T₁보다 높고; T₂는 200℃ 이상인 방법.
스쿠알렌-함유 조성물로부터 스쿠알렌을 제조하는 방법으로서,
(a) 온도 T₁에서 수행되는 정제 증류의 단계, 및
(b) 온도 T₂에서 수행되는 변성 증류의 단계를 포함하며,
(a) 및 (b) 단계는 어느 순서로도 수행되고, T₁ 및T₂는 스쿠알렌을 비등하도록 하기에 충분하고; T₁은 140℃ 미만이고; T₂는 200℃ 이상인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 조성물은 한가지 이상의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 조성물은 파브알부민을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 변성 증류는 0.5mm Hg 내지 5.0mm Hg의 압력에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 증류는 70 내지 100℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 증류는 0.5㎛ Hg 내지 5㎛ Hg의 압력에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 증류는 변성 증류에 앞서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 스쿠알렌을 포함하는 조성물은 비누화를 시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 비누화는 NaOH 또는 KOH을 스쿠알렌을 포함하는 조성물에 첨가하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
99% 이상의 스쿠알렌을 포함하는 조성물의 재증류 방법으로서, 상기 재증류는 200℃ 이상인 온도 T₂에서 수행되는 변성 증류인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따라서 제조되는 스쿠알렌을 사용하여 에멀션을 제조하는 단계를 포함하는 수중유 에멀션의 제조 방법.
제 12 항에 따라서 에멀션을 제조하는 단계, 및 에멀션을 항원과 조합하는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조 방법.
제 12 항에 따라서 에멀션을 제조하는 단계, 및 에멀션을 항원 성분과 함께 키트 성분으로서 키트에 포장하는 단계를 포함하는 백신 키트의 제조 방법.
제 14 항에 있어서, 키트 성분들은 별도의 바이알들에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 바이알은 붕규산염 유리로 만들어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 인플루엔자 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 에멀션과 항원의 조합은 백신 조성물을 형성하고, 백신 조성물은 인플루엔자 바이러스 스트레인 당 약 15μg, 약 10μg, 약 7.5μg, 약 5μg, 약 3.8μg, 약 3.75μg, 약 1.9μg, 또는 약 1.5μg의 헤마글루티닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 에멀션과 항원의 조합은 백신 조성물을 형성하고, 백신 조성물은 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올 보존제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되는 스쿠알렌.
제 20 항에 따른 스쿠알렌을 포함하는 수중유 에멀션.
제 20 항에 따른 스쿠알렌을 포함하는 백신.
보조제 및/또는 백신으로 제 20 항에 따른 스쿠알렌의 사용.