KR20150143699A

KR20150143699A - L-아미노산을 생산하는 재조합균, 이의 구성 방법 및 l-아미노산 생산 방법

Info

Publication number: KR20150143699A
Application number: KR1020157032480A
Authority: KR
Inventors: 팅이 원; 시우링 샹; 윤 장; 슈웬 리우; 용 리앙; 유 장
Original assignee: 인스티튜트 오브 마이크로바이올로지, 차이니즈 아카데미 오브 사이언스즈
Priority date: 2014-02-14
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2035-02-04
Also published as: JP6188930B2; CN104845923B; CN104845923A; EP3009505B1; WO2015120775A1; KR101937682B1; US20160326556A1; US9796991B2; EP3009505A4; JP2016519946A; CN106459886B; EP3009505A1; CN106459886A

Abstract

본 발명에서는 L-아미노산을 생산하는 재조합균, 이의 구성 방법 및 L-아미노산 생산 방법을 제공한다. 본 발명에서 생산하는 L-아미노산의 재조합균은 시작균에 비하여 낮아진 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi의 발현과 향상된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 Zwf-OpcA의 발현을 가지며, 그 중에서 상기 시작균은 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주이다. 본 발명의 재조합균을 발효 배양하면서 중첩적으로 수율을 향상시키는 효과를 관찰하게 되었으며, L-아미노산의 수율을 크게 향상시킨다. 본 발명의 조합 개조 방식은 L-아미노산의 발효 수율을 향상새킬 수 있는 새로운 방법을 제시하였기 때문에, 실제적으로 세균 발효를 통하여 L-아미노산을 생산하는데 이용될 수 있다.

Description

L-아미노산을 생산하는 재조합균, 이의 구성 방법 및 L-아미노산 생산 방법{RECOMBINANT STRAIN PRODUCING L-AMINO ACIDS, CONSTRUCTING METHOD THEREFOR AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS}

본 발명은 미생물 발효 분야에 관한 것으로서, 특히 미생물 발효를 통하여 L-아미노산을 생산하는 방법 및 이의 전용 재조합균에 관한 것이다.

미생물 발효법을 통하여 L-아미노산을 생산하는 것은 현재 가장 널리 사용되고 있는 아미노산 생산 방법으로서, 아미노산 생산균의 발효 생산 성능은 발효법이 대규모 산업화 응용을 구현할 수 있을지 여부에 영향을 미치는 주요한 요소이다. 현재 여전히 소수의 아미노산 제품은 발효 성능이 훌륭한 생산 균주가 부족하기 때문에 발효법으로 생산을 구현하지 못하고 있다. 이미 발효법으로 생산을 구현한 아미노산 생산 균주는 생산 원가를 절감하기 위하여 이의 산 수율 수준과 당-산 전환율은 여전히 진일보로 제고되어야 한다. L-히스티딘을 예로 들면, L-히스티딘은 인간과 동물의 제9번째 필수 아미노산으로서, 인체 생장 발육, 산화 방지 및 면역 조절 등 중요한 생리 과정에 참여하고, 중요한 약용 아미노산이며 심장 질환, 빈혈, 위장 궤양 치료의 수액 제제에 이용될 수 있다. 현재 L-히스티딘 생산은 주로 돼지(소) 혈분을 원료로 하는 단백질 가수분해 추출법을 이용하는 바, 단백질 가수분해 추출법은 원료 원가가 높고 이용율이 낮으며, 추출 공정이 복잡하고 환경 오염등 큰 결함을 갖고 있어, L-히스티딘의 생산 원가가 높고 가격이 비싸게 된다. 미생물 발효법으로 L-히스티딘을 생산하는 것은 아직 대규모의 산업화 응용을 구현하지 못하고 있다. L-히스티딘의 생물 합성은 뉴클레오티드 합성과 전구체 물질을 경쟁하고, 대사 조절 제어 기전이 복잡하며 합성 과정 중에 에너지 수요가 높음 등의 특징을 가짐으로써, 이의 공정균의 산 수율과 전환율이 상대적으로 낮게 된다. L-히스티딘 생산 균주의 생산은 주로 다수 회의 전통적인 돌연변이 스크린을 선정하고, 돌연변이 균주의 기초 상에서 유전공학 개조를 진행하는 방법을 이용한다. 돌연변이 스크린을 통하여 취득한 균주는 대량의 부정효과 돌연변이를 누적하고 있기 때문에, 균주 생장이 느리고 환경 저항성이 떨어지며 영양 수요가 높아지는 문제를 가진다. 이러한 결함은 균주의 산업화 응용을 제약하고 있다. 현재 시스템 대사 공정을 통한 L-히스티딘 공정균의 개조 및 구성에 관한 연구는 단지 하나만 보도되어 있다 (Doroshenko, V. G., Lobanov, A. O., Fedorina, E. A., 2013. The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants. Appl Biochem Microbiol. 49, 130-135.). 해당 연구는 야생형 대장간균의 MG1655를 시작균으로 하여, hisG 유전자 중에 E271K 돌연변이를 도입하여, 히스티딘의 피드백 억제 조절을 약화시키며; 히스티딘 합성 오페론의 전사 감쇠 인자 hisL을 녹아웃시키고, 히스티딘 합성 오페론의 발현을 증가시키며; 아울러 purR 유전자를 녹아웃시키고, 히스티딘 합성 전구체 PRPP의 합성을 증가시켜 L-히스티딘을 생산하는 공정균을 구성하였다. 해당 연구에서는 단지 L-히스티딘 터미널 합성의 개조를 진행하였고, 이의 L-히스티딘의 수율은 단지 4.9 g/L로서, 산업화 응용을 구현하는 것과 비교적 큰 차이를 보이고 있다.

L-히스티딘 생물 합성의 주요한 커런트 캐링 경로는 펜토오스 포스페이트 경로이고, 글루코스를 카본 소스로할 때, 펜토오스 포스페이트 경로를 통하여 L-히스티딘 합성 전구체 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP)를 생성하고, PRPP가 동시에 뉴클레오티드 합성 경로와 L-히스티딘 합성 경로로 진입하여, 뉴클레오티드 합성 경로를 통하여 L-히스티딘 합성의 다른 한 전구체 ATP를 생성한다.

그리고, 펜토오스 포스페이트 경로는 또한 여러 가지 아미노산(예를 들면 L-라이신, L-발린, L-트레오닌, L-프롤린 및 L-히드록시프롤린 등) 합성에 필요한 보조 인자 NADPH의 주요한 생성 경로이며, 그 중에서 1 분자의 L-라이신을 합성하려면 4 분자의 NADPH를 소모하여야 하고, 1 분자의 L-트레오닌, L-프롤린 및 L-히드록시 프롤린을 합성하려면 3 분자의 NADPH를 소모하여야 하며, 1 분자의 L-발린을 합성하려면 2 분자의 NADPH를 소모하여야 한다.

불활성 당분해 경로의 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제를 통하여 카본 대사의 흐름을 펜토오스 포스페이트 경로로 가이드할 수 있지만, 균주의 생장과 글루코스 대사 능력이 약화되기 때문에 균주 발효 생산 중의 응용에 불리하다(Marx, A., Hans, S., Mockel, B., Bathe, B., de Graaf, A. A., McCormack, A. C., Stapleton, C., Burke, K., O'Donohue, M., Dunican, L. K., 2003. Metabolic phenotype of phosphoglucose isomerase mutants of Corynebacterium glutamicum. J Biotechnol. 104, 185-197.). 본 발명자의 전 단계의 연구 결과에 의하여 증명된데 의하면, 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 인코딩 유전자 pgi를 녹아웃시키면, 균주의 생장과 글루코스 대사 능력이 현저하게 낮아지며, 아울러 L-히스티딘 수율도 따라 낮아진다. 그리고, 본 발명자는 또한 단독으로 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제의 발현량을 향상시키는 것은 L-히스티딘 수율의 향상에 큰 영향을 미치지 못함을 발견하였다.

본 발명은 L-아미노산, 특히 펜토오스 포스페이트 경로에 의하여 전구체 물질 또는 보조 인자 NADPH를 제공하여 합성되는 L-아미노산, 예를 들면, L-히스티딘, L-라이신, L-발린, L-트레오닌, L-프롤린 및 L-히드록시프롤린 수율을 향상시킬 수 있는 재조합균, 이의 구성 방법 및 상기 재조합균을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이를 위하여, 본 발명의 일 방면에 의하면, L-아미노산을 생산하는 재조합균을 제공하는 바, 상기 재조합균은 시작균에 비하여 낮아진 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi의 발현과 향상된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 Zwf-OpcA의 발현을 가지며, 그 중에서 상기 시작균은 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주이다.

한 실시방식에 의하면, 원시균의 염색체에 대하여 돌연변이 또는 유전공학 개조를 진행하여 상기 시작균을 취득한다. 목표 아미노산을 취득하기 위하여, 상기 시작균은 종래의 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주일 수도 있고, 또는 적합한 원시균에 대하여 유전공학 개조를 진행해서 취득한 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주일 수도 있다. 높은 수율의 공정균을 취득하기 위하여, 목표 아미노산에 대하여 비교적 높은 수율을 가지는 균주를 시작균으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 언급되는 목표 아미노산은 펜토오스 포스페이트 경로에 의하여 전구체 물질 또는 보조 인자 NADPH를 제공하여 합성되는 L-아미노산이다. 바람직하게는, 상기 목표 아미노산은 L-히스티딘, L-라이신, L-발린, L-트레오닌, L-프롤린 또는 L-히드록시프롤린이다.

한 실시방식에 의하면, 상기 재조합균은 시작균에 비하여 pgi 유전자 발현을 약화시키고, 아울러 zwf - opcA 유전자의 향상된 발현을 가진다. 구체적으로 말하면, 상기 재조합균의 염색체 상의 pgi 유전자는 이미 불활성화, 바람직하게는 이미 녹아웃되거나, 또는 pgi 유전자의 조절 요소가 이미 낮은 전사 또는 낮은 발현 활성의 조절 요소로 교체되고, 아울러 상기 재조합균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 zwf - opcA 유전자를 가지거나, 또는 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터가 강한 프로모터로 교체되는 바, 예를 들면 원시균의 P _eftu 프로모터로 교체된다.

L-히스티딘을 생산하는 재조합균에 있어서, 이의 시작균은 원시균에 비하여 L-히시티딘 합성 오페론의 hisEG 유전자와 hisDCB 유전자의 향상된 발현을 가질 수 있다. 구체적으로 말하면, 강한 프로모터로 상기 유전자의 프로모터를 교체할 수 있다. 예를 들면, 원시균 염색체 상의 P _glyA 프로모터로 원시균의 염색체 상의 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 교체한다. 나아가, 바람직하게는 상기 시직균은 원시균에 비하여 또한 PRPP 합성 효소 PrsA의 향상된 발현을 가질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 prsA 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 prsA 유전자의 프로모터를 교체시키는 바, 예를 들면 원시균의 P _sod 프로모터로 prsA 유전자의 프로모터를 교체시킬 수 있다.

L-라이신을 생산하는 재조합균에 있어서, 이의 시작균은 원시균에 비하여 dapA 유전자(디히드로디피콜린산 합성 효소의 인코딩 유전자) 또는 lysC 유전자(아스파르토키나아제의 인코딩 유전자)의 향상된 발현을 가진다(Cremer, J., Eggeling, L., Sahm, H., 1991. Control of the lysine biosynthesis sequence in Corynebacterium glutamicum as analyzed by overexpression of the individual corresponding genes. Appl Environ Microbiol. 57, 1746-1752). 구체적으로 말하면, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 dapA 유전자 또는 lysC 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 dapA 유전자 또는 lysC 유전자의 프로모터를 교체시킬 수 있다.

L-발린을 생산하는 재조합균에 있어서, 이의 시작균은 원시균에 비하여 발린 합성 유전자 ilvBNCE의 향상된 발현을 가진다(Blombach, B., Schreiner, M. E., Holatko, J., Bartek, T., Oldiges, M., Eikmanns, B. J., 2007. l-Valine production with pyruvate dehydrogenase complex-deficient Corynebacterium glutamicum. Appl Environ Microbiol. 73, 2079-2084). 구체적으로 말하면, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 ilvBNCE 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 ilvBNCE 유전자의 프로모터를 교체시킬 수 있다.

L-트레오닌을 생산하는 재조합균에 있어서, 이의 시작균은 원시균에 비하여 트레오닌 합성 경로 유전자 hom과 thrB의 향상된 발현을 가진다(Reinscheid, D. J., Kronemeyer, W., Eggeling, L., Eikmanns, B. J., Sahm, H., 1994. Stable expression of hom -1- thrB in Corynebacterium glutamicum and its effect on the carbon flux to threonine and related amino acids. Appl Environ Microbiol. 60, 126-132). 구체적으로 말하면, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 hom과 thrB 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 각각 hom 유전자와 thrB 유전자의 프로모터를 교체시킬 수 있다.

L-프롤린을 생산하는 재조합균에 있어서, 이의 시작균은 원시균에 비하여 ocd 유전자(오르니틴 시클로데아미나아제 인코딩 유전자)의 향상된 발현을 가진다(Jensen, J. V. K., Wendisch, V., 2013. Ornithine cyclodeaminase-based proline production by Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 12, 63). 구체적으로 말하면, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 ocd 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 ocd 유전자의 프로모터를 교체시킬 수 있다.

L-히드록시프롤린을 생산하는 재조합균에 있어서, 이의 시작균은 원시균에 비하여 p4hD 유전자(프롤린히드록시화효소 인코딩 유전자)의 향상된 발현을 가진다(Yi, Y., Sheng, H., Li, Z., Ye, Q., 2014. Biosynthesis of trans-4-hydroxyproline by recombinant strains of Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli. BMC Biotechnol. 14, 44.). 구체적으로 말하면, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 p4hD 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 p4hD 유전자의 프로모터를 교체시킬 수 있다.

L-히스티딘을 생산하는 재조합균에 있어서, 하나의 바람직한 실시방식에 의하면, 상기 재조합균은 상기 시작균에 비하여 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제 PurH의 발현을 증가시킨다. 바람직하게는, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 purH 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 purH 유전자의 프로모터를 교체시키는 바, 예를 들면 원시균의 P _eftu 프로모터로 purH 유전자의 프로모터를 교체시킬 수 있다.

하나의 더욱 바람직한 실시방식에 의하면, 상기 재조합균은 상기 시작균에 비하여 약화된 아미도포스포리보실 전이효소 PurF의 발현을 가진다. 구체적으로 말하면, 약한 프로모터로 purF 유전자의 프로모터를 교체할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합균의 염색체 상에서 상기 원시균 중의 P _hom 프로모터로 purF 유전자의 프로모터를 교체시킨다.

상기 서로 다른 실시방식 중에서 강한 프로모터의 예시를 보여주기는 하였지만, 강한 프로모터에 대하여 본 명세서에서는 특별한 제한이 없으며, 유전자의 발현을 향상시킬수만 있으면 된다. 본 발명에 이용될 수 있는 강한 프로모터로는 원시균의 P _eftu , P _sod , P _glyA , P _pck , P _pgk 프로모터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 원시균은 코리네박테리움 속, 다이어리스터 속 또는 브레비박테리움 속으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 코리네박테리움 속의 세균은 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium pekinense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium aminogenes, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae 및 Corynebacterium herculis으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 다이어리스터 속의 세규은 Microbacterium ammoniaphilum으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 브레비박테리움 속의 세균은 Brevibacteriaceae flvum, Brevibacteriaceae lactofermentum 및 Brevibacteriaceae ammoniagenes으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다.

한 구체적인 실시방식에 의하면, 상기 원시균은 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC13032이다.

이러한 상황 하에서, L-히스티딘을 생산하는 재조합균에 있어서, 상기 시작균의 염색체 상에는 각각 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 교체로 하는 서열 7 중의 5’ 말단 제863-1038번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 P _glyA 프로모터 및 상기 시작균이 돌연변이를 발현할 수 있는 ATP-포스포리보실 전이효소를 갖고 있다.

상기 돌연변이된 ATP-포스포리보실 전이효소는 서열 6이 보여주는 ATP-포스포리보실 전이효소의 제215번의 아스파라진이 라이신으로 돌연변이되고, 제231번의 류신이 페닐알라닌으로 돌연변이되며, 제235번의 트레오닌이 알라닌으로 돌연변이된 효소이다. 바람직하게는, 상기 시작균의 염색체 상에는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 hisG 유전자를 교체로 하는 서열 4 중의 제1007-1852번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 hisG ^fbr 유전자를 가진다.

하나의 바람직한 실시방식에 의하면, 상기 시작균의 염색체 상에는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 교체로 하는 서열 11 중의 5' 말단 제656-847번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 P _sod 프로모터를 가진다.

다른 하나의 바람직한 실시방식에 의하면, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 prsA 유전자와 hisG ^fbr 유전자를 가진다. 상기 prsA 유전자는 인코딩 서열 5가 보여주는 PrsA의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 PrsA와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 PrsA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열표 중의 서열 4가 보여주는 제15-992번의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

본 발명의 재조합균에 있어서, 상기 pgi 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 14가 보여주는 Pgi의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 Pgi와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열 13이 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 zwf - opcA 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 3이 보여주는 zwf-opcA의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 zwf-opcA와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 zwf-opcA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열 2가 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 P _eftu 프로모터는 서열 12가 보여주는 5’ 말단 제635-834번의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 purH 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 16이 보여주는 purH의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 purH와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 purH 활성을 가지는 유전자 중의 하나이고, 상기 purH 유전자는 서열표 중의 서열 15가 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 P _hom 프로모터는 서열 18이 보여주는 5’ 말단 제736-865번의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

본 발명의 재조합균에 있어서, 어떠한 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 도입하여 해당 유전자의 카피 수량을 증가시킬 수 있고, 또한 직접 어떠한 유전자를 균주 염색체 상의 적합한 위치에 삽입할 수도 있다. 재조합 플라스미드를 구성하는 벡터에 대하여 제한이 없으며, 임의의 적합한 플라스미드일 수 있는 바, 예를 들면 pXMJ19이다.

본 발명의 두번째 방면에 의하면, L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법을 제공한다. 상기 방법에는 하기 단계가 포함되는 바, 즉 시작균 중의 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi의 발현을 낮추고, 또한 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 Zwf-OpcA의 발현을 향상시켜 상기 재조합균을 취득하는 바, 그 중에서 상기 시작균은 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주이다.

공지된 방법에 의하여 예를 들면 돌연변이 또는 유전공학 개조 등의 방법을 통하여 시작균을 취득하거나, 또는 기존의 목표 아미노산을 생산할 수 있는 균주를 시작균으로 채용할 수 있다. 바람직하게는 높은 수율의 균주를 사용하는 것이다.

본 발명의 목표 아미노산은 L-히스티딘, L-라이신, L-발린, L-트레오닌, L-프롤린 또는 L-히드록시프롤린 등인 것이 바람직하다.

하나의 실시방식에 의하면, 시작균 중의 Pgi의 발현을 낮추는 것은 하기 A) 또는 B) 방식을 통하여 구현한다.

A) 상기 시작균 염색체 상의 pgi 유전자를 불활성화시킨 것으로서, 상기 불활성화는 녹아웃인 것이 바람직하며;

B) 상기 시작균 중 pgi 유전자의 조절 요소를 낮은 전사 또는 낮은 발현 활성의 조절 요소로 교체한다.

상기 시작균 중 Zwf-OpcA의 발현을 향상시키는 것은 하기 C) 또는 D) 방식을 통하여 구현한다.

C) 상기 시작균 중 zwf - opcA 유전자의 카피 수량을 증가시키며;

D) 상기 시작균 염색체 상 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터을 강한 프로모터로 교체시키는 바, 예를 들면 상기 원시균 염색체 상의 P _eftu 프로모터이다.

L-히스티딘에 있어서, 한 실시방식에 의하면, 상기 시작균을 취득하는 것은 원시균 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 각각 강한 프로모터로 교체하는 것이 포함한다. 예를 들면 원시균 염색체 상의 P _glyA 프로모터인 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 바람직하게는 상기 시작균을 취득하는 것에는 더욱 상기 시작균 중 PRPP 합성 효소 PrsA의 발현을 향상시키는 단계를 포함할 수 있다. 더욱 바람작하게는, 상기 시작균 중 PrsA의 발현을 향상시키는 것은 하기 E) 또는 F) 방식을 통하여 구현한다.

E) 상기 시작균 중 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시키며;

F) 상기 시작균 염색체 상 prsA 유전자의 프로모터을 강한 프로모터로 교체시키는 바, 예를 들면 상기 원시균 염색체 상의 P _sod 프로모터이다.

L-라이신에 있어서, 한 실시방식에 의하면, dapA 유전자(디히드로디피콜린산 합성 효소의 인코딩 유전자) 또는 lysC 유전자(아스파르토키나아제의 인코딩 유전자)의 발현을 향상시키는 것을 통하여 L-라이신을 누적시킬 수 있는 시작균을 취득할 수 있다. 구체적으로 말하면, 상기 시작균 중의 dapA 유전자 또는 lysC 유전자의 카피 수량을 증가시키거나, 또는 강한 프로모터로 dapA 유전자 또는 lysC 유전자의 프로모터를 교체시킨다.

L-발린에 있어서, 한 실시방식에 의하면, 발린 합성 유전자 ilvBNCE의 발현을 향상시키는 것을 통하여 상기 시작균을 취득할 수 있다. 구체적으로 말하면, 상기 시작균 중의 ilvBNCE 유전자의 카피 수량을 증가시키거나, 또는 강한 프로모터로 ilvBNCE 유전자의 프로모터를 교체시킨다.

L-트레오닌에 있어서, 한 실시방식에 의하면, 상기 시작균을 취득하는 것에는 트레오닌 합성 경로 유전자 hom과 thrB의 발현을 향상시키는 단계가 포함된다. 구체적으로 말하면, 상기 시작균 중의 hom 유전자와 thrB 유전자의 카피 수량을 증가시키거나, 또는 강한 프로모터로 각각 hom과 thrB 유전자의 프로모터를 교체시킨다.

L-프롤린에 있어서, 한 실시방식에 의하면, 상기 시작균을 취득하는 것에는 ocd 유전자(오르니틴 시클로데아미나아제 인코딩 유전자)의 발현을 향상시키는 단계가 포함된다. 구체적으로 말하면, 상기 시작균 중의 ocd 유전자의 카피 수량을 증가시키거나, 또는 강한 프로모터로 ocd 유전자의 프로모터를 교체시킨다.

L-히드록시프롤린에 있어서, 한 실시방식에 의하면, 상기 시작균을 취득하는 것에는 p4hD 유전자(프롤린히드록시화효소 인코딩 유전자)의 발현을 향상시키는 단계가 포함된다. 구체적으로 말하면, 상기 시작균 중의 p4hD 유전자의 카피 수량을 증가시키거나, 또는 강한 프로모터로 p4hD 유전자의 프로모터를 교체시킨다. 한 바람직한 실시방식에 의하면, L-히스티딘에 있어서, 상기 방법에는 나아가 상기 재조합균 중의 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제 PurH의 발현을 향상시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합균 중의 PurH의 발현을 향상시키는 것은 하기 G) 또는 H) 방식을 통하여 구현할 수 있다.

G) 상기 시작균 중 purH 유전자의 카피 수량을 증가시키며;

H) 상기 시작균 염색체 상 purH 유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 교체시키는 바, 예를 들면 상기 원시균 염색체 상의 P _eftu 프로모터이다.

더욱 바람직한 실시방식에 의하면, L-히스티딘에 있어서, 상기 방법에는 나아가 상기 재조합균 중의 아미도포스포리보실 전이효소 PurF를 약화시키는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로 말하면, 약한 프로모터로 purF 유전자의 프로모터를 교체할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합균 중 PurF의 발현을 약화시키는 것은 상기 시작균 염색체 상의 purF 유전자의 프로모터를 상기 원시균 중 염색체 상의 P _hom 프로모터로 교체시키는 것을 통하여 구현한다.

마찬가지로, 강한 프로모터에 대하여 특별한 제한이 없으며, 유전자의 발현을 향상시킬수만 있으면 된다. 예를 들면 원시균의 P _eftu , P _sod , P _glyA , P _pck 또는 P _pgk 프로모터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 원시균으로 가능한 균주는 코리네박테리움 속, 다이어리스터 속 또는 브레비박테리움 속으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 코리네박테리움 속의 세균은 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium pekinense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium aminogenes, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae 및 Corynebacterium herculis으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 다이어리스터 속의 세균은 Microbacterium ammoniaphilum으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 브레비박테리움 속의 세균은 Brevibacteriaceae flvum, Brevibacteriaceae lactofermentum 및 Brevibacteriaceae ammoniagenes으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 가장 바람직하게는 Corynebacterium glutamicum 또는 Brevibacteriaceae flvum이다.

한 구체적인 실시방식에 의하면, 원시균은 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC13032이다.

상기 실시방식에 있어서, L-히스티딘을 생산하는 재조합균에 있어서, 상기 시작균은 상기 원시균에 대하여 하기 재조합을 진행하여 취득할 수 있다.

상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 염색체 상L-히스티딘 합성 오페론 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 각각 서열 7 중의 5’ 말단 제863-1038번 뉴클레오티드(또는 서열 8 중의 5’ 말단 제752-927번 뉴클레오티드)가 보여주는 P _glyA 프로모터로 교체하고,

상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 이 발현하는 서열 6이 보여주는ATP-포스포리보실 전이효소의 제215번의 아스파라진을 라이신으로 돌연변이시키고, 제231번의 류신을 페닐알라닌으로 돌연변이시키며, 제235번의 트레오닌을 알라닌으로 돌연변이시킨다. 상기 돌연변이된 유전자는 서열 4 중의 제1007-1852번 뉴클레오티드가 보여주는 hisG ^fbr 유전자이다.

하나의 바람직한 실시방식에 의하면, L-히스티딘 누적 효과가 더욱 좋은 시작균을 취득하기 위하여, 나아가 상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 염색체에 대하여 개조를 진행하여, 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 서열 11 중의 5’ 말단 제656-847번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 P _sod 프로모터로 교체시킨다.

다른 한 바람직한 실시방식에 의하면, 상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 중의 prsA 유전자의 카피 수량과 상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 중의 hisG ^fbr 유전자의 카피 수량을 증가시켜 L-히스티딘 누적 효과가 더욱 좋은 시작균을 취득할 수 있다.

상기 prsA 유전자는 인코딩 서열 5가 보여주는 PrsA의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 PrsA와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 PrsA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열표 중의 서열 4가 보여주는 제15-992번의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 pgi 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 14가 보여주는 Pgi의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 Pgi와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열 13이 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 P _eftu 프로모터는 서열 12가 보여주는 5’ 말단 제635-834번(또는 서열 20이 보여주는 5’ 말단 제634-833번)의 뉴클레오티드 서열이다.

상기 purH 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 16이 보여주는 purH의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 purH와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 purH 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열표 중의 서열 15가 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 P _hom 프로모터는 서열 18이 보여주는 5’ 말단 제736-865번의 뉴클레오티드 서열이다.

본 발명의 방법에 있어서, 어느 한 유전자의 카피 수량을 증가시키는 것은 해당 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 구성하고, 이어 재조합 플라스미드를 시작균/원시균 중에 도입하여 구현할 수 있다. 이러한 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이기 때문에 상세한 설명을 생략하도록 한다. 재조합 플라스미드를 구성하는 벡터에 대하여 제한이 없으며, 임의의 적합한 플라스미드일 수 있는 바, 예를 들면 pXMJ19이다.

본 발명의 재조합균은 상기 구성 방법을 통하여 취득한 재조합균일 수 있다.

본 발명의 세번째 방면에 의하면, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 바, 상기 재조합균을 발효 배양하는 단계가 포함된다. 바람직하게는, 상기 L-아미노산은 L-히스티딘, L-라이신, L-발린, L-트레오닌, L-프롤린 또는 L-히드록시프롤린이다.

본 발명에서 제공하는 재조합균을 구성하는 방법에는 하기 단계가 포함되는 바, 즉 시작균 중 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제의 발현을 낮추고, 또한 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제와 PRPP 합성 효소의 발현을 향상시켜 재조합균을 취득하는 것이다.

상기 방법 중에서, 상기 시작균 중 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제의 발현은 낮추는 것은 하기 A) 또는 B) 방식을 통하여 구현한다.

A) 상기 시작균 염색체 상의 pgi 유전자를 불활성화시킨 것으로서, 상기 불활성화는 구체적으로는 녹아웃이며;

B) 상기 시작균 중의 pgi 유전자의 조절 요소를 낮은 전사와 낮은 발현 활성의 조절 요소로 교체하여 구현하며;

상기 시작균 중의글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제와 PRPP 합성 효소의 발현을 향상시키는 것은 하기 C) 또는 D) 방식을 통하여 구현한다.

C) 상기 시작균 중 zwf - opcA 유전자와 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시키며;

D) 상기 시작균 염색체 상의 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터을 P _eftu 프로모터로 교체시키며, 또한 상기 염색체 상 prsA 유전자의 프로모터를 P _sod 프로모터로 교체한다.

상기 방법에 있어서, 상기 재조합균을 구성하는 방법은 하기 Ⅰ 또는 Ⅱ와 같다.

Ⅰ의 방법으로는 상기 시작균 염색체의 pgi 유전자를 녹아웃시키고, 또한 상기 시작균 중의 zwf - opcA 유전자와 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시켜 재조합균을 취득하며;

Ⅱ의 방법으로는 상기 시작균 염색체의 pgi 유전자를 녹아웃시키고, 상기 시작균 염색체 상의 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터를 P _eftu 프로모터로 교체시키며, 또한 상기 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 P _sod 프로모터로 교체한다.

상기 방법에 있어서,

상기 녹아웃은 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 세그먼트를 상기 시작균에 도입하여 상동 재조합을 진행하는 것이며;

상기 시작균 중의 zwf - opcA 유전자와 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시키는 것은 zwf - opcA 유전자와 prsA - hisG ^fbr 세그먼트를 재조합 벡터를 통하여 상기 시작균으로 도입하는 것이며;

상기 재조합 벡터는 zwf - opcA 유전자와 prsA - hisG ^fbr 세그먼트를 발현 벡터에 삽입시켜 취득한 재조합 벡터이며; 상기 발현 벡터는 IPTG 유발성 발현 벡터 pXMJ19일 수 있으며;

본 발명의 실시예2에 있어서, 재조합 벡터는 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr 로서, zwf - opcA 유전자(서열 2)을 pXMJ19의 Hind III과 Xba I 사이에 삽입하고, 또한 prsA-hisG ^fbr 세그먼트(서열 4)를 Xba I과 Sma I 사이에 삽입하여 취득한 벡터이다.

상기 시작균 염색체 상의 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터를 P _eftu 프로모터로 교체시키는 것은 P _eftu 프로모터가 포함된 세그먼트를 상기 시작균에 도입하여 상동 재조합을 진행하는 것이며;

상기 시작균 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 P _sod 프로모터로 교체시키는 것은 P _sod 프로모터가 포함된 세그먼트를 상기 시작균에 도입하여 상동 재조합을 진행하는 것이다.

상기 방법에 있어서,

상기 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 1이고, 그 중에서 서열 1의 5’ 말단 제1-834번 뉴클레오티드는 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업스트림 상동 암이고, 서열 1의 5’ 말단 제2835-1672번 뉴클레오티드는 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 다운스트림 상동 암이며; 유전자 pgi의 뉴클레오티드 서열은 서열 13이며;

상기 zwf - opcA 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 2이며;

상기 prsA - hisG ^fbr 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 4이며;

상기 재조합 벡터는 상기 zwf - opcA 유전자와 상기 prsA - hisG ^fbr 세그먼트를 발현 벡터에 삽입시켜 취득한 벡터이며;

상기 P _eftu 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 12의 5’ 말단 제635-834번 뉴클레오티드이며;

상기 P _eftu 프로모터의 세그먼트를 포함하는뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 12이며;

상기 P _sod 프로모터의 세그먼트를 포함하는뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 11이다.

상기 방법에 있어서, 상기 시작균은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되는 바, 즉 세균 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론의 프로모터를 P _glyA 프로모터로 교체시키고, 또한 상기 세균 염색체 상의 hisG 유전자를 점 돌연변이시켜 시작균을 취득하며;

상기 L-히스티딘 합성 오페론은 hisEG와 hisDCB이며;

상기 P _glyA 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중 서열 7의 제863-1038번 뉴클레오티드 또는 서열표 중 서열 8의 제752-927번 뉴클레오티드이며;

상기 점 돌연변이는 상기 세균 염색체의 hisG 유전자로 인코딩된 단백질의 제215번의 아스파라진을 라이신으로 돌연변이시키고, 제231번의 류신을 페닐알라닌으로 돌연변이시키며, 제235번의 트레오닌을 알라닌으로 돌연변이시킨 것이다.

상기 방법에 있어서, 상기 세균 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론의 프로모터를 P _glyA 프로모터로 교체시키는 것은 hisEG의 P _glyA 프로모터가 포함된 세그먼트와 hisDCB의 P _glyA 프로모터가 포함된 세그먼트를 세균 중에 도입하여 상동 재조합을 진행하는 것이며; 그 중에서 hisEG의 P _glyA 프로모터가 포함된 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 7이며; hisDCB의 P _glyA 프로모터가 포함된 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 8이다.

상기 방법에 있어서, 상기 세균 염색체 상의 hisG 유전자를 점 돌연변이시키는 것은 서열 9가 보여주는 뉴클레오티드 서열을 상기 세균 중에 도입하여 상동 재조합을 진행하고, 다시 서열 10이 보여주는 뉴클레오티드 서열을 중간균에 도입시켜 상동 재조합을 진행하기 위한 것이다.

상기 방법에 있어서, 상기 세균은 코리네박테리움 속 세균이고, 상기 코리네박테리움 속 세균은 구체적으로 Corynebacterium glutamicum이다.

상기 방법에 의하여 제조된 재조합균도 본 발명의 보호 범위에 속한다.

상기 재조합균의 L-히스티딘 제조 중의 응용도 본 발명의 보호 범위에 속한다.

본 발명에서는 또한 L-히스티딘을 제조하는 방법을 제공하는 바, 상기 재조합균을 발효 배양하여 L-히스티딘을 취득하는 단계가 포함된다.

본 발명의 상기 불활성화 세균의 pgi 유전자에 있어서, "불활성화"는 상응하게 개조된 객체에 변화가 발생하여 일정한 효과에 달하는 것을 말하는 바, 점 돌연변이, 삽입 불활성화 및/또는 녹아웃이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 이용되는 염색체 유전자 녹아웃, 삽입 불활성화, 녹인, 프로모터 교체와 점 돌연변이의 방법은 자살 벡터 pK18mobsacB가 개조 타켓 유전자의 상동 암을 휴대하고 상동 재조합을 발생하는 것을 통하여 구현한다.

본 발명의 상기 L-히스티딘 공정균에 있어서, 24 시간 발효시킨 L-히스티딘 생산 강도는 0.01~1 g/L/h이고, 발효 종료 시에 L-히스티딘 생산량은 1~60 g/L이며, 일반적으로 발효 수율이 2 g/L 이상에 달할 수 있다.

본 발명의 실험에 의해 증명된데 의하면, 종래의 L-히스티딘 공정균과 L-히스티딘 발효 생산법에 비하여, 본 발명은 하기 장점을 가진다.

(1) 본 발명에서 제공하는 재조합균은 pgi 유전자를 녹아웃시켜 업스트림 당분해 경로를 차단시킴과 아울러, zwf - opcA 유전자를 과도 발현시켜 펜토오스 포스페이트 경로의 대사 능력을 향상시키는 조합 개조 방식을 통하여, 공정균의 생장과 글루코스 소모 능력이 야생형 균주에 비하여 약화되는 것을 보이지 않고 L-아미노산 수율이 크게 향상되었다.

(2) 본 발명에서 제공하는 재조합균은 기본 배양지(플라스크 진탕 발효 실험용)에서 양호하게 생장하며, 영양물질 결핍형이 없어 산업화 제어에 유리하다.

(3) 본 발명에서 제공하는 재조합균의 발효 주기가 짧은 바, 발효 탱크 스케일업 실험에서 약 45-72 시간에 최대 누적량에 도달할 수 있어(허나 현재 보도된 가장 높은 수율의 L-히스티딘 공정균 발효 시간은 120 시간에 달함)(Mizukami, T., Hamu, A., Ikeda, M., Oka, T., Katsumata, R., 1994. Cloning of the ATP phosphoribosyl transferase gene of Corynebacterium glutamicum and application of the gene to l-histidine production. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 635-638.), 과정 및 원가 제어에 유리하다.

(4) 본 발명은 최초로 pgi 유전자가 결실된 기초 상에서, 아울러 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제의 발현을 향상시키는 조합 개조 방식을 제안하여, pgi 유전자 결실에 의하여 초래되는 균주 생장 및 글로코스 대사의 제한을 해제하고, 최대한으로 중심 카본 대사 유동을 펜토오스 포스페이트 경로로 유도할 수 있으며, 아울러 세균의 비교적 높은 생장 대사와 ATP 수준을 유지할 수 있으며, 아미노산 수율을 크게 향상시킴으로써 실천 상에서 세균 발효 산업화 생산에 이용될 수 있다.

(5) 본 발명에서는 또한 최초로 히스티딘 합성 경로와 뉴클레오티드 합성 경로를 커플링시키는 방안을 제안하여, 히스티딘 합성 부산물 AICAR를 이용하여 히스티딘의 전구체 ATP를 합성하여 L-히스티딘 수율을 크게 향상시킴으로써 실천 상에서 세균 발효 산업화 생산에 이용될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 유익한 효과라면, L-아미노산의 발효 수율을 향상시킬 수 있는 새로운 방법을 제안 및 증명하고, 또한 상응한 공정균을 구성하였으며, 중첩적으로 수율을 향상시킬 수 있는 효과를 발견하여 실천 상에서 세균 발효를 통하여 L-아미노산을 생산하는데 이용될 수 있어 보급에 유리하다.

아래, 이해를 돕기 위하여 구체적은 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 상세한 설명을 진행하도록 한다. 유의할 바로는 이러한 설명은 예시적인 것으로서, 본 발면의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본 명세서에 의한 설명에 의하면, 본 발명의 많은 변화, 수정은 당업계의 기술자들에 있어서는 자명한 것이다.

그리고 본 발명에서는 공개 문헌을 인용하였는바, 이러한 문헌은 더욱 명확하게 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 이들의 모든 내용은 모두 본 명세서에 참조되는 바, 이 모든 내용들이 본 명세서에서 중복 기술된 것과 같다.

본 발명에서 생산하는 L-아미노산의 재조합균은 시작균에 비하여 낮아진 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi의 발현과 향상된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 Zwf-OpcA의 발현을 가지며, 그 중에서 상기 시작균은 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주이다. 본 발명의 재조합균을 발효 배양하면서 중첩적으로 수율을 향상시키는 효과를 관찰하게 되었으며, L-아미노산의 수율을 크게 향상시킨다. 본 발명의 조합 개조 방식은 L-아미노산의 발효 수율을 향상새킬 수 있는 새로운 방법을 제시하였기 때문에, 실제적으로 세균 발효를 통하여 L-아미노산을 생산하는데 이용될 수 있다.

하기 도면을 참조하면, 본 발명의 방안 및 유익한 효과를 더욱 잘 이해하는데 도움이 된다.
도 1은 재조합 플라스미드 pXMJ19-prsA - hisG ^fbr 의 도면.
도 2는 CG161 균주(pgi 유전자가 녹아웃됨) 게놈 DNA의 PCR 검증 전기 이동도.
도 3은 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr 의 도면.
도 4는 L-히스티딘 공정균 CG171 발현 단백질의 SDS-PAGE 도면.
도 5는 L-히스티딘 공정균 CG171 중의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 효소 활성 측정도.
도 6은 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr - purH의 도면.
도 7은 CG328 균주가 플라스미드 DNA를 휴대한 PCR 검증 전기 이동도.
도 8은 CG353 균주(purF 유전자가 약화됨) 게놈 DNA의 PCR 검증 전기 이동도.

아래 첨부된 도면과 실시예를 통하여 본 발명의 구체적인 실시방식에 대하여 더욱 상세한 설명을 진행하여 본 발명의 방안 및 여러 가지 방면의 장점을 이해하는 것을 돕도록 한다. 하지만 하기 기술된 구체적인 실시방식과 실시예는 단지 설명을 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 구체적으로 말하면, 하기 기술은 모두 (야생형) Corynebacterium glutamicum을 예로 들어 공정균의 구성 및 L-히스티딘의 생산에 대하여 설명과 실험을 진행하지만, 당업계의 기술자들은 본 발명의 아미노산 대사 경로의 개조 방식이 기타 적합한 균주에 적용되어 L-히스티딘의 수율을 향상시키는 공정균을 구성할 수 있음을 이해하여야 할 것이다. 뿐만 아니라, 적합한 플러그인을 조합시키는 것을 통하여 유사한 대사 경로를 갖는 아미노산, 특히 L-라이신, L-발린, L-트레오닌, L-프롤린 또는 L-히드록시프롤린 등의 수율을 향상시키는데 이용될 수 있다.

배경기술 중에서 언급된 바와 같이, pgi 유전자로 인코딩된 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제는 당분해 경로의 핵심 효소이다. L-히스티딘 합성의 전구체 PRPP는 펜토오스 포스페이트 경로를 거쳐 합성된 것이기 때문에, pgi 유전자를 녹아웃시키면 당분해 경로의 대사 유동을 약화시키고, 중심 카본 대사 유동을 펜토오스 포스페이트 경로로 유도하여 L-히스티딘 합성 경로 대사 유동을 향상시킬 수 있다는 것을 추정할 수 있다.

pgi 유전자를 녹아웃시키는 것을 통하여 펜토오스 포스페이트 경로 대사 유동을 향상시키는 개조 방식은 문헌과 특허에 모두 보도된 바 있다(L-라이신, L-발린과 뉴클레오티드 등 생성물 생산. Marx, A., Hans, S., Mockel, B., Bathe, B., de Graaf, A. A., McCormack, A. C., Stapleton, C., Burke, K., O'Donohue, M., Dunican, L. K., 2003. Metabolic phenotype of phosphoglucose isomerase mutants of Corynebacterium glutamicum. J Biotechnol. 104, 185-197； Blombach, B., Schreiner, M. E., Bartek, T., Oldiges, M., Eikmanns, B. J., 2008. Corynebacterium glutamicum tailored for high-yield l-valine production. Appl Microbiol Biotechnol. 79, 471-479；Peifer, S., Barduhn, T., Zimmet, S., Volmer, D., Heinzle, E., Schneider, K., 2012. Metabolic engineering of the purine biosynthetic pathway in Corynebacterium glutamicum results in increased intracellular pool sizes of IMP and hypoxanthine. Microb Cell Fact. 11, 138；US6586214B1；EP1087015A2).

하지만 본 발명인은 실제상에서 pgi 유전자를 녹아웃시키면 당 대사 중간 대사물이 과도하게 누적되어 당대사 압력을 초래하며, 나아가 균체 글로코스 대사와 생장이 늦어짐을 발견하였다. 본 발명인은 또한 pgi 유전자를 녹아웃시킨 후, L-히스티딘을 생산하는 공정균의 L-히스티딘 수율이 증가되지 않을 뿐 아니라 오히려 크게 낮아짐을 발견하였다. 이의 주요한 원인으로는 히스티딘은 펜토오스 포스페이트 경로를 통하여 이의 분자 골격을 합성하는 전구체를 제공하지만, 라이신과 발린은 펜토오스 포스페이트 경로를 통하여 이의 합성 효소의 보조 인자 NADPH를 제공하기 때문이다. 그리고, 히스티딘 합성 과정에 대량의 에너지 벡터 ATP를 소모하기 때문에, pgi 유전자의 발현을 약화시키고 펜토오스 포스페이트 경로 대사 유동을 향상시키는 방식으로 히스티딘의 수율을 향상시키려면, 펜토오스 포스페이트 경로와 당대사 경로 대사 유동의 평형을 유지하여 이의 합성 전구체와 에너지 공급을 확보하여야 한다.

이러한 문제에 대하여, 본 발명에서는 실험을 통하여 zwf - opcA 유전자(해당 유전자는 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제를 인코딩하는 바, 펜토오스 포스페이트 경로의 햄심 속도 제한 효소이다)를 과도 발현시키는 것은 균체의 당 대사 능력을 향상시키고 당 대사 압력을 완화시킬 수 있으며, 균주의 글루코스 대사와 생장 능력을 회복시키고, 아울러 펜토오스 포스페이트 경로와 당대사 경로 대사 유동의 평형시키고, 히시티딘 합성 전구체 PRPP와 ATP공급을 평형시켜, 나아가 L-히스티딘 수율을 향상시키는 것을 발견하였다.

본 발명에 의하면, pgi 유전자를 약화(예를 들면 녹아웃)시킴과 아울러, zwf-opcA 유전자를 과도 발현시키는 개조 방식을 통하여, 이미 prsA 유전자와 L-히스티딘 합성 오페론 유전자 발현을 향상시킨 균주에 대하여 재조합 개조를 진행하여 취득한 균주의 L-히스티딘 수율은 크게 향상되었다.

마찬가지로, L-트레오닌, L-라이신, L-발린, L-프롤린 및 L-히드록시프롤린 등 기타 아미노산에 있어서, 이들은 펜토오스 포스페이트 경로를 통하여 이의 합성 효소의 NADPH를 제공하기 때문에, 본 발명의 pgi 유전자를 약화시킴과 아울러, zwf-opcA 유전자를 과도 발현시키는 개조 방식은 NADPH를 증가시킴과 아울러, 펜토오스 포스페이트 경로와 당대사 경로 대사 유동의 평형도 평형시키고, pgi 유전자 약화로 인하여 균체 글로코스 대사와 생장이 늦어지는 문제를 해결함으로써, 마찬가지로 나아가 이러한 아미노산의 수율을 향상시킨다.

이 기초 상에서, 본 발명에서는 나아가 L-히스티딘 합성 경로와 뉴클레오티드 합성 경로를 상호 커플링 시키는 방식을 제안하였다. L-히스티딘 합성 과정에 있어서, hisH와 hisF 유전자에 의하여 인코딩된 이미다졸글리세롤포스페이트 합성 효소가 이미다졸글리세롤포스페이트와5-포스포리보실-4-포름아미도-5-아미노이미다졸(AICAR)을 촉매 작용 및 생성하는 바, 그 중에서 이미다졸글리세롤포스페이트가 히스티딘 합성 경로를 따라 최종으로 L-히스티딘을 합성하고, AICAR는 퓨린 합성 경로로 진입하여 최종적으로 퓨린 뉴클레오티드(AMP, ATP 등)를 생성한다. ATP는 히스티딘 합성의 전구 물질 중의 하나이고, 아울러 히스티딘 합성을 위하여 에너지를 제공한다. purH 유전자에 의하여 인코딩되는 이중 기능 효소, AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제는 AICAR 생성되는 IMP의 두 단계 반응에 대하여 촉매 작용을 일으킨다. 본 발명인은 Corynebacterium glutamicum 중의 purH 유전자의 발현을 향상시키는 L-히스티딘 누적에 대하여 큰 촉진 작용을 가지며, 상기 개조 방식과 조합하면 더욱 효과를 향상시킬 수 있음을 발견하였다.

그리고, L-히스티딘 합성 경로와 퓨린 뉴클레오티드 합성 경로는 대사물 AICAR 위치에서 커플링되고, 아울러 두 경로가 전구체 물질 PRPP를 공용한다. 본 발명인은 퓨린 뉴클레오티드의 합성에 대하여 촉매 작용을 하는 제1 반응 단계의 효소(아미도포스포리보실 전이효소)의 인코딩 유전자 purF를 약화시키면, 뉴클레오티드 합성과 히스티딘 합성 경로에 대하여 대사 커플링을 진행할 수 있고, 히스티딘 합성 부산물 AICAR을 이용하여 뉴클레오티드를 합성하면 히스티딘 합성 전구체 물질 PRPP의 공급을 증가시킬 수 있을 뿐 아니라, 히스티딘 합성 경로 대사 유동을 증가시켜 L-히스티딘 누적을 촉진시키는 것을 발견하였다. 상기 유전자 개조는 마찬가지로 더욱 L-히스티딘의 수율을 향상시킬 수 있다.

이로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 히스티딘 합성 관련 경로 중의 다수의 타겟에 대하여 조합 개조를 진행하여 L-히스티딘의 누적을 효과적으로 구현하였다. 그리고, 히스티딘 합성 경로를 개조시킴과 아울러, 히스티딘 합성 경로와 뉴클레오티드 합성 경로를 커플링시켜, 히스티딘 합성과 뉴클레오티드 합성의 커플링 노드 AICAR을 효과적으로 이용하여 퓨린 뉴클레오티드의 경로를 생성하고 합성 전구체 PRPP을 절약함으로써, 히스티딘을 합성하기 위하여 더욱 많은 전구체 물질 PRPP와 ATP를 제공하여, 더욱 L-히스티딘의 누적을 증가시킨다.

정의:

본 명세서에서 언급되는 "시작균(starting bacteria)"(또는 본 명에서 기저균(base bacteria)라고도 함)은 본 발명의 유전자 개조 방식에 이용되는 초기 균주를 말한다. 상기 균주는 천연적으로 존재하는 균주일 수도 있고, 또는 돌연변이 또는 유전공학 개조 등 방식을 통하여 형성된 것일 수도 있다. 어떠한 L-아미노산(예를 들면 L-히스티딘)을 생산하는 공정균을 구성하기 위하여, 상기 시작균은 상기 L-아미노산(예를 들면 L-히스티딘)을 누적시킬 수 있는 균주인 것이 바람직하다.

본 명세서에서 언급되는 "원시균(original bacteria)"은 아무런 유전공학 개조도 거치지 않은 균주를 말하는 바, 자연계에 존재하는 균주일 수도 있고, 또는 인공 돌연변이를 통하여 형성된 균주일 수도 있다.

본 명세서에서 언급되는 "상동성(homology)"은 DNA의 뉴클레오티드 서열 또는 단백질의 아미노산 서열 사이의 유사도를 말하는 바, 아울러 본 명세서에서 말하는 (일정한 수준의) 상동성을 갖는 DNA에 의하여 인코딩된 단백질은 적어도 본 발명의 기능에 사용되는 방면에서 동일하거나 더욱 훌륭한 활성을 가지며, 마찬가지로 (일정한 수준의) 상동을 가지는 단백질은 본 발명의 기능에 사용되는 방면에서 동일하거나 더욱 훌륭한 활성을 가진다. 예를 들면, hisG 유전자와 세 돌연변이를 거친 hisGfbr 유전자는 높은 유사도를 가지며, 그 중에서 전자는 ATP-포스포리보실 전이효소를 인코딩하고, 후자는 히스티딘 피드백 억제 조절이 해제된 ATP-포스포리보실 전이효소를 인코딩하며, 이 두 효소는 전반적으로 보면 기능과 활성이 조금 다르지만, 본 발명의 "히스티딘 합성의 제1 단계 촉매 효소"의 기능 면에서는 양자가 동일하기 때문에, hisG 유전자와 hisG ^fbr 유전자 및 양자에 의하여 인코딩되는 효소는 각각 본 발명의 의미상의 상동성을 가지는 DNA와 단백질에 속한다. 이들은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다 하여야 할 것이다.

본 명세서에서 언급되는 방법 중의 각 단계의 실행 순서는 특별한 설명이 있는 것을 제외하고, 본 명세서에서의 순서에 제한되지 않는 바, 즉 각 단계의 실행 순서는 변화될 수 있고, 두 단계 사이에 수요에 따라 기타 단계를 증가시킬 수 있다.

아래, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 더욱 상세한 설명을 진행하도록 한다. 하기 실시예 중에 이용되는 실험 방법은 특수한 설명이 있는 것을 제외하고는 모두 일반적인 방법이다. 하기 실시예 중에 이용되는 재료, 시제 등은 특수한 설명이 있는 것을 제외하고 모두 상업 경로를 통하여 취득할 수 있다.

특별한 설명이 없는 한, 실시예 중에 이용되는 기술수단은 모두 당업계 기술자들이 숙지하고 있는 일반적인 수단인 바, "분자 클론 실험 지침(제3판)"(과학출판사), "미생물학 실험(제4판)"(고등교육출판사) 및 상응한 기기와 시제의 업체 설명서를 참조할 수 있다. 실시예 중에 이용되는 기기와 시제는 시중의 일반적인 기기와 시제이다. 아래 실시예 중의 정량적 실험은 모두 3번 중복 실험을 진행하고 결과는 평균치를 취한다.

실시예 1 : L-히스티딘 기저 공정균 CG160 의 취득

본 발명의 전단계 연구에 의하여, 본 실시예는 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC13032에 대하여 히스티딘 합성을 향상시키는 개조를 진행하여 본 발명의 상기 다수의 타겟의 개조를 진행하는 기저균을 취득한다. 우선, hisEG와 hisDCB(두 개의 히스티딘 합성 유전자 오페론)의 프로모터를 Corynebacterium glutamicum 내생성의 강한 프로모터 P _glyA (서열 7 중의 5’ 말단 제863-1038번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같거나, 또는 서열 8 중의 5’ 말단 제752-927번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같음)로 교체시키고(Zhang, Y., Shang, X., Lai, S., Zhang, G., Liang, Y., Wen, T., 2012. Development and application of an arabinose-inducible expression aystem by facilitating inducer uptake in Corynebacterium glutamicum. Appl Environ Microbiol. 78, 5831-5838.), 아울러 hisE와 hisD 유전자의 리보솜 결합 사이트(RBS)를 Corynebacterium glutamicum 높은 발현 유전자의 보수 RBS 서열(AAAGGAGGA)(서열 7 중의 5’ 말단 제1039-1047번 뉴클레오티드 서열이 보여주거나, 또는 서열 8 중의 5’ 말단 제928-936번 뉴클레오디트 서열이 보여주는 바와 같음)로 교체하여, 이 두 히스티딘 합성 유전자 오페론의 전사와 번역의 약화된 조절을 제거하고, hisE 유전자의 초기 코돈 GTG를 ATG(서열 7 중의 5’ 말단 제1053-1055번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같음)로 교체하여 이의 발현을 향상시킨다. 이어, 히스티딘 합성 경로의 핵심 속도 제한 효소와 ATP-포스포리보실 전이효소（HisG, 서열 6에서 보여주는 바와 같음)의 인코딩 유전자 hisG를 세 아미노산 돌연변이를 포함하는 hisG ^fbr 유전자(서열 4 중의 5’단 제1007-1852번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같음)로 교체하여, 히스티딘의 해당 효소에 대한 피드백 억제 조절을 제거함으로써 해당 효소의 촉매 활성을 향상시킨다(Zhang, Y., Shang, X., Deng, A., Chai, X., Lai, S., Zhang, G., Wen, T., 2012. Genetic and biochemical characterization of Corynebacterium glutamicum ATP phosphoribosyltransferase and its three mutants resistant to feedback inhibition by histidine. Biochimie. 94, 829-838.).

1. Corynebacterium glutamicum 야생형 ATCC13032 중의 L-히스티딘 합성 오 페론 프로모터를 강한 프로모터 P _glyA 로 교체

Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 hisEG 오페론 및 이의 업/다운 스트림 서열과 P _glyA 프로모터에 의하여 각각 프라이머를 디자인한다.

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P1과 P2를 프라이머로 하여 hisEG 오페론 프로모터 업 스트림 상동 암을 PCR 증폭시키며; P3과 P4를 프라이머로 하여 프로모터 P _glyA 를 증폭시키며; P5와 P6을 프라이머로 하여 hisEG 프로모터 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. 이어 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P1과 P6을 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1920 bp의 PCR 생성물 취득하여, 교체할 프로모터 P _glyA 및 교체될 프로모터 P _hisEG 를 포함하는 업/다운 스트림 상동 암의 세그먼트(서열 7)로 한다.

그 중에서, 서열 7의 5’ 말단 제1-862번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P _hisEG 의 업 스트림 상동 암이고, 서열 7의 5’ 말단 제863-1038번 뉴클레오티드는 프로모터 P _glyA 이며, 서열 7의 5’ 말단 제1053-1920번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P _hisEG 의 다운 스트림 상동 암이다.

상기 1920 bp의 PCR 생성물에 대해 Xba I과 BamH I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB(미국의 균주보관기관 ATCC로부터 구입, 상품 번호 87097)와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 2132 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I와 BamH I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1920 bp를 취득한다.

양성 플라스미드에 대하여 서열 측정을 진행하는 바, 결과적으로 해당 플라스미드는 서열표 중의 서열 7가 보여주는 뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 플라스미드이며, pK18mobsacB-P _glyA ::P _hisEG 라 명한다.

동일한 방법을 이용하여 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB - P _glyA ::P _hisDCB 를 구성하는 바, 구체적으로는 P7과 P8을 프라이머로 hisDCB 오페론 프로모터 업 스트림 상동 암을 증폭시키며; P9와 P10을 프라이머로 하여 프로모터 P _glyA 를 증폭시키며; P11과 P12를 프라이머로 하여 hisDCB의 프로모터의 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. P7과 P12를 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭시킨다. 취득한 1694 bp의 PCR 생성물은 교체할 프로모터 P _glyA 및 교체될 프로모터 P _hisDCB 를 포함하는 업/다운 스트림 상동 암의 긴 세그먼트(서열 8)이고, 그 중에서, 서열 8의 5’ 말단 제1-751번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P _hisDCB 의 업 스트림 상동 암이고, 서열 8의 5’ 말단 제752-927번 뉴클레오티드는 프로모터 P _glyA 이며, 서열 8의 5’ 말단 제942-1694번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P _hisDCB 의 다운 스트림 상동 암이다.

상기 1694 bp의 PCR 생성물에 대해 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 콜로니 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1906 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1694 bp를 취득한다. 양성 플라스미드에 대하여 서열 측정을 진행하는 바, 결과적으로 해당 플라스미드는 서열표 중의 서열 5가 보여주는 뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 플라스미드이며, pK18mobsacB-P _glyA ::P _hisDCB 라 명한다.

상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.

P1: GCTCTAGAGTATCGGCGTGGAGTTGTC(Xba I)(서열 21)

P2: TAGTGGAGTAGCTTTATTTTGCGACACCTGCC(서열 22)

P3: GTCGCA AAATAAAGCTACTCCACTAGTGTGATCG(서열 23)

P4: GGTTCCTCCTTTGCGTAAGACCTCACTCGC(서열 24)

P5: GAGGTCTTACGCAAAGGAGGAACCGAATGAAGACATTTGA(서열25)

P6: CGCGGATCCCAGGATCTGCTGCTCTGG(BamH I)(서열 26)

P7: CCCAAGCTTCGAGGAAACCGTTGAGGA(Hind III)(서열 27)

P8: TAGTGGAGTAGCTATGGATTTCACCTCTGTGAATG(서열 28)

P9: TCTCCACTTTAGGTAAGCTACTCCACTAGTGTGATCG(서열 29)

P10: CGATCCTCCTTTGCGTAAGACCTCACTCGC(서열 30)

P11: GAGGTCTTACGCAAAGGAGGATCGCCATGTTGAATGTC(서열 31)

P12: CGCGGATCCGGCAGAGGCATCAGCAAG(BamH I)(서열 32)

P13: ATGTGCTGCAAGGCGATTAA(서열 33)

P14: ATGCTTCCGGCTCGTATGT(서열 34)

P15: TTTTATATATGGGTATCGGCGGTCTATGCT(서열 35).

서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB - P _glyA ::P _hisEG 를 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 중에 전기적으로 전환한다. 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합한다. 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다. 양성 세균 집락에 대하여 P15와 P6을 프라이머로 하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 재조합균으로서의 948 bp를 취득하며, Corynebacterium glutamicum WT-P _glyA ::P _hisEG 로 명한다.

서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P _glyA ::P _hisDCB 를 Corynebacterium glutamicum WT-P _glyA ::P _hisEG 중에 전기적으로 전환한다. 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합한다. 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다. 양성 세균 집락에 대하여 P15와 P12를 프라이머로 하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 재조합균으로서의 833 bp를 취득하며, Corynebacterium glutamicum CG158(WT-P _glyA ::P _hisEG -P _glyA ::P _hisDCB )로 명한다.

재조합균의 게놈 DNA에 대하여 추출 및 서열 측정을 진행하면, 결과적으로 성공적으로 Corynebacterium glutamicum 야생형 ATCC13032 중의 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 모두 Corynebacterium glutamicum 내생성의 강한 프로모터 P _glyA 로 교체하였고, hisE와 hisD 유전자의 RBS를 Corynebacterium glutamicum 높은 발현 유전자의 보수 RBS 서열(AAAGGAGGA)로 교체하였으며, hisE 유전자의 초기 코돈 GTG을 높은 발현 강도의 ATG로 교체하였고, Corynebacterium glutamicum CG158(WT-P _glyA ::P _hisEG -P _glyA ::P _hisDCB ) 구성에 성공하였다.

2. 염색체 상의 유전자 hisG 의 부위 지정 돌연변이로 L-히스티딘 기저 공정 균 CG160 취득

염색체 hisG 유전자의 부위 지정 돌연변이는 두 단계 교체의 방법을 이용하여 동시에 상기 유전자의 3개 부위 지정 돌연변이를 구현하는 바, 우선 서열표 중의 서열 9가 보여주는 클로람페니콜 저항성 유전자 Cmr 및 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 긴 세그먼트와 CG158 상동 재조합시켜 재조합균 WT-P _glyA ::P _hisEG - Cmr::hisG-P _glyA ::P _hisDCB 를 취득하며; 다시 서열표 중의 서열 10이 보여주는 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자 말단 264 bp 세그먼트 및 업/다운 스트림 상동 암의 긴 세그먼트와 재조합균 WT-P _glyA ::P _hisEG - Cmr::hisG-P _glyA ::P _hisDCB 를 상동 재조합하여 CG160을 취득한다.

구체적으로 하기와 같다.

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P16과 P17을 프라이머로 하여 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트의 업 스트림 상동 암의 PCR 증폭을 진행하고, P18과 P19를 프라이머로 하여 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트의 다운링크 스트림 상동 암을 증폭시키며; P20과 P21을 프라이머로 하고, 플라스미드 pXMJ19(Biovector Science Lab,Inc로부터 구매함, 상품 번호 SMD1168H)를 템플릿으로 하여, 클로람페니콜 저항성 유전자 Cmr을 증폭시킨다. 다시 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P16과 P21을 프라이머로 하여, 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1689 bp의 클로람페니콜 저항성 유전자 Cmr 및 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 긴 세그먼트(서열 9)를 취득한다.

그 중에서, 서열 9의 5’ 말단 제1-420번 뉴클레오티드는 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트 업 스트림 상동 암이고, 서열 9의 5’ 말단 제421-1281번 뉴클레오티드는 클로람페니콜 저항성 유전자 Cmr이며, 서열 9의 5’ 말단 제1282-1689번 뉴클레오티드는 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트 다운 스트림 상동 암이다.

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P28과 P29를 프라이머로 하여 C645G(제215번의 아스파라진이 라이신으로 변함) 돌연변이 로커스가 포함된 hisG 유전자 세그먼트를 증폭시키고, P30과 P31을 프라이머로 하여 A693C와 A703G(제231번의 류신이 페닐알라닌으로 변하고, 제235번의 트레오닌이 알라닌으로 변함) 돌연변이 로커스가 포함된 hisG 세그먼트를 증폭시키며, 다시 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P28과 P31을 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 846 bp의 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자(서열 4의 5’ 말단 제1007-1852번 뉴클레오티드)를 취득한다. P16과 P22를 프라이머로 하여 hisG 유전자 부위 지정 돌연변이의 업 스트림 상동 암의 PCR 증폭을 진행하고, P25와 P21을 프라이머로 하여 hisG 유전자 부위 지정 돌연변이의 다운 스트림 상동 암을 증폭시키며; P23과 P24를 프라이머로 하고, 상기 취득한 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자를 템플릿으로 하여, 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자 말단 264 bp 세그먼트를 증폭시킨다. 다시 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P16과 P21을 프라이머로 하여, 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1092 bp의 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자 말단 264 bp 세그먼트 및 이의 업/다운 스트림 상동 암의 긴 세그먼트(서열 10)를 취득한다.

그 중에서, 서열 10의 5’ 말단 제1-420번 뉴클레오티드는 업 스트림 상동 암이고, 서열 10의 5’ 말단 제421-684번 뉴클레오티드는 세 점 돌연변이의 hisG 유전자 말단 264 bp 세그먼트이며, 서열 10의 5’ 말단 제685-1092번 뉴클레오티드는 다운 스트림 상동 암이다.

정제 회수되는 두 개의 PCR 생성물은 각각 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 거친 후, 각각 마찬가지의 이중 효소 절단을 거친 녹아웃 벡터 pK18mobsacB와 연결된다. 연결된 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1901 bp와 1304 bp인 각각 두 가지 재조합 플라스미드를 휴대하는 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 진행하여 각각 두 가지 재조합 플라스미드인 1689 bp와 1092 bp를 취득한다. 나아가 서열 측정 검증을 거쳐, 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-Cmr::hisG와 pK18mobsacB-hisG ^fbr ::Cmr의 구성에 성공한다.

pK18mobsacB-Cmr::hisG는 클로람페니콜 저항성 유전자 Cmr 및 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 긴 세그먼트(서열 9)를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 벡터이다.

pK18mobsacB-hisG ^fbr ::Cmr는 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자 말단 264 bp 세그먼트 및 이의 업/다운 스트림 상동 암의 긴 세그먼트(서열 10)을 벡트 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 벡터이다.

상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.

P16: CGCGGATCCATCTACGTTGCTGGTGGC(BamH I)(서열 36)

P17: ACGGGCAACAGCTGCTGCTCTGGGGTGAC(서열 37)

P18: CAGAGCAGCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGT(서열 38)

P19: GGTAGTTAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACT(서열 39)

P20: GCGGGGCGTAATTTTAACTACCCCCGAAAAT(서열 40)

P21: CCGGAATTCCGAATGAAATCTGGGACG(EcoR I)(서열 41)

P22: CGAAGCAGGATCTGCTGCTCTGGGGTGAC(서열 42)

P23: CAGAGCAGCAGATCCTGCTTCGCCGCATCCA(서열 43)

P24: GGTAGTTAAAACTAGATGCGGGCGATGCG(서열 44)

P25: CCCGCATCTAGTTTTAACTACCCCCGAAAAT(서열 45)

P26: TCCCAAACAAAGGCTCGC(서열 46)

P27: CAGTCGGCGGTTTGCTAA(서열 47)

P28: ATGTTGAAAATCGCTG(서열 48)

P29: TTACTGCAGTGGCAGCGTCCAGGTTGTCGCGGTCGACCTTGTAATCCAGCAT(서열 49)

P30: ACCTGGACGCTGCCACTGCAGTAACCCCAGGCTTCTCCGGCCCAGCGGTATC(서열 50)

P31: CTAGATGCGGGCGATGCGG(서열 51).

서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-Cmr::hisG를 Corynebacterium glutamicum CG158 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하고 염색체 상의 세균 집락에 통합한다. 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다.

P26과 P27을 프라이머로 하여 양성 균에 대하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 1872 bp의 재조합균 WT-P _glyA ::P _hisEG -Cmr::hisG-P _glyA ::P _hisDCB 를 취득한다.

서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-hisG ^fbr ::Cmr를 상기 구성된 재조합균 WT-P _glyA ::P _hisEG - Cmr::hisG-P _glyA ::P _hisDCB 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합한다. 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다.

P26과 P27을 프라이머로 하여 양성 균에 대하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 1275 bp의 재조합균을 취득하고, Corynebacterium glutamicum CG160(WT-P _glyA ::P _hisEG -hisG ^fbr -P _glyA ::P _hisDCB )으로 명한다.

재조합균의 게놈 DNA에 대하여 추출 및 서열 측정을 진행하면, 결과적으로 성공적으로 Corynebacterium glutamicum CG158의 염색체 hisG 유전자의 N215K/L231F/T235A 점 돌연변이에 성공하고, Corynebacterium glutamicum CG160(WT-P _glyA ::P _hisEG -hisG ^fbr -P _glyA ::P _hisDCB ) 구성에 성공하였다.

상기 hisG 유전자의 N215K/L231F/T235A 점 돌연변이는 hisG 유전자에 의하여 인코딩되는 ATP-포스포리보실 전이효소(HisG)의 제215번의 아스파라진을 라이신으로 돌연변이시키고, 제231번의 류신이 페닐알라닌으로 돌연변이시키며, 제235번의 트레오닌이 알라닌으로 돌연변이시키는 것이다.

실시예 2 : 플라스미드를 포함하는 높은 수율의 L-히스티딘의 재조합균 CG171의 구성

본 실시예에 있어서, 실시예1에서 취득한 프라이머리 공정균의 기초 상에서, 나아가 prsA 유전자를 과도 발현시킴과 아울러, hisG ^fbr 유전자(서열 4의 제1007-1852번 뉴클레오디드 서열)를 과도 발현시킨 후, pgi 유전자(서열 13)를 녹아웃하는 것과 zwf - opcA 유전자(서열 2)를 과도 발현시키는 개조를 조합시켜 높은 수율의 공정균 CG171를 취득한다.

1. L-히스티딘 프라이머리 공정균 CG176 의 구성

prsA 유전자는 PRPP 합성 효소(PrsA, 서열 5가 보여주는 바와 같으며, PRPP는 히스티딘 합성의 전구체 물질)를 인코딩하고, prsA 유전자의 발현을 향상시켜 히스티딘 합성 전구체 PRPP의 합성을 증가시키고, 히스티딘 합성을 위하여 더욱 많은 전구체 물질을 제공한다.

실시예1에서 취득한 기저 공정균 CG160의 기초 상에서, prsA 유전자(서열 4 중의 5’ 말단 제15-992번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같음)를 과도 발현시킴과 아울러, hisG ^fbr 유전자(서열 4 중의 5’ 말단 제1007-1852번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같음)를 과도 발현시켜 비교적 훌륭한 히스티딘 수율을 가지는 프라이머리 공정균 CG176를 취득하여 본 발명의 방식을 실시하여 더욱 훌륭한 효과를 얻도록 한다. 당업계의 기술자들은 본 발명의 개조 방식이 본 실시예에서 취득하는 프라이머리 공정균에 대하여 재조합 개조를 진행하는 것에 제한되지 않고, 기타 히스티딘 공정균 중에 이용될 수 있음을 이해하여야 할 것이다.

균주 CG160의 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, 각각 P32/P33과 P34/P35를 프라이머로 하여 prsA 유전자(992 bp)와 hisG ^fbr (860 bp)에 대하여 PCR 증폭을 진행한다. 중첩 확대 PCR를 이용하여 두 유전자를 연결시키고, 증폭된 hisG ^fbr 과 prsA 유전자를 템플릿으로 하며, P32와 P35를 프라이머로 하여 PCR 증폭을 진행하여 1852 bp의 PCR 새성물인 prsA-hisG ^fbr 세그먼트(서열 4)를 취득한다.

그 중에서, 서열 4의 5’ 말단 제15-992번 뉴클레오티드는 prsA이고, 서열 4의 5’ 말단 제1007-1852번 뉴클레오티드는 hisG ^fbr (세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자)이다.

상기 PCR 생성물에 대해 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 Corynebacterium glutamicum-대장간균 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 클로람페니콜(20 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P36과 P37을 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 2054 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1852 bp를 취득한다.

pXMJ19-prsA-hisG ^fbr 는 나아가 서열 측정 분석을 거치는 바, 해당 플라스미드는 prsA-hisG ^fbr 세그먼트(서열 4)를 플라스미드 pXMJ19의 Xba I과 Sma I 효소 사이트 사이에 삽입하여 벡터 pXMJ19-prsA-hisG ^fbr 를 취득하는 바, 재조합 플라스미드 pWYE 1230(도 1 참조)로 명한다.

플라스미드 pXMJ19-prsA-hisG ^fbr 을 상기 구성된 기저 공정균 CG160 중으로 전환시키고, P36과 P37을 프라이머로 하며, 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 2054 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하여 검증하여, 더욱 과도 발현 플라스미드를 성공적으로 공정균 중에 전환시켜 L-히스티딘 공정균 CG176(WT-P _glyA ::P _hisEG -hisG ^fbr -P _glyA ::P _hisDCB /pXMJ19-prsA-hisG ^fbr )의 구성에 성공하였다.

상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.

P32: GCTCTAGAAAAGGAGGATCCTCATGACTGCTCACTGG(Xba I)(서열 52)

P33: TTGTCCTCCTTTTTAGGCCTCGCCCTCGAA(서열 53)

P34: GGCGAGGCCTAAAAAGGAGGACAATCATGTTGAAAATCGCTG(서열 54)

P35: TCCCCCGGGCTAGATGCGGGCGATGCGG(Sma I)(서열 55)

P36: CAATTAATCATCGGCTCGTA(서열 56)

P37: ACCGCTTCTGCGTTCTGATT(서열 57).

2. L-히스티딘 프라이머리 공정균 CG161 와 CG172 의 취득

pgi 유전자는 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제(Pgi, 서열 14에서 보여주는 바와 같음)를 인코딩한다. 상기 취득한 기저균 160의 기초 상에서, pgi 유전자(서열 13)를 녹아웃시켜 프라이머리 공정균 CG161을 취득하며; CG161의 기초 상에서, prsA 유전자를 과도 발현시킴과 아울러, hisG ^fbr 유전자를 과도 발현시켜 pgi 유전자를 녹아웃시킨 공정균 CG172를 취득하였다.

프라이머리 공정균 CG161은 L-히스티딘 기저 공정균 CG160 중의 pgi 유전자(서열 13)를 녹아웃시켜 취득한 것으로서, 구체적으로는 하기와 같다.

우선, Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 pgi 유전자 및 이의 업/다운 스트림 서열에 의하여 각각 프라이머를 디자인한다.

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA을 템플릿으로 하고, P38과 P39를 프라이머로 하여 PCR을 통하여 pgi 유전자 업 스트림 상동 암을 증폭시키며; P40과 P41을 프라이머로 하여 pgi 유전자 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. 이어 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P38과 P41을 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1672 bp의 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 세그먼트(서열 1)를 취득한다.

그 중에서 서열 1의 5’ 말단 제1-834번 뉴클레오티드는 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업스트림 상동 암이고, 서열 1의 5’ 말단 제2835-1672번 뉴클레오티드는 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 다운스트림 상동 암이다.

정제 회수되는 PCR 생성물은 각각 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 거친 후, 마찬가지의 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결된다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 함유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 양성 형질전환체로서의 1884 bp를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 진행하여 양성인 1672 bp를 취득한다. 나아가 서열 측정 검증을 거쳐 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-Δpgi의 구성에 성공하는 바, 이는 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 세그먼트(서열 1)를 벡터 pK18mobsacB의 BamH I과 EcoR I 효소 절단 사이트 사이에 삽입하여 취득한 벡터이다.

상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.

P38: CGCGGATCCGCTCTTTCGGAGTGACCT(BamH I)(서열 58)

P39: TAAGCAAGCGAGAAAACTCCTTTATTGTCG(서열 59)

P40: TAAAGGAGTTTTCTCGCTTGCTTATAGGGTC(서열 60)

P41: CCGGAATTCTCGGGAAGCAGTTAGTGAAA(EcoR I)(서열 61)

P42: TTGACGACGCAAGAGCCA(서열 62)

P43: CACCATTACCGATGAGAAAC(서열 63).

서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-Δpgi를 Corynebacterium glutamicum CG160 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 통합하여 염색체 상의 세균 집락을 취득하며 자당 역방향 스크리닝을 통하여 제2회 상동 재조합이 발생한 세균 집락을 취득한다. P42와 P43을 프라이머로 하여 세균 집락에 대하여 게놈 DNA 추출 및 PCR 증폭 검증을 진행하여 양성인 1759 bp를 취득하고(도 2 참조), CG161(WT-P _glyA ::P _hisEG -hisG ^fbr -P _glyA ::P _hisDCB -Δpgi)로 명한다.

CG161(WT-P _glyA ::P _hisEG - hisG ^fbr - P _glyA ::P _hisDCB -Δpgi)는 나아가 서열 측정 분석을 진행하는 바, 결과적으로 L-히스티딘 기저 공정균 CG160의 염색체 pgi 유전자 녹아웃에 성공하고, CG161 구성에 성공하였다.

공정균 CG172은 플라스미드 pXMJ19-prsA-hisG ^fbr 을 공정균 CG161에 도입하여 취득한 재조합균(WT-P _glyA ::P _hisEG - hisG ^fbr - P _glyA ::P _hisDCB -Δpgi/pXMJ19-prsA-hisG ^fbr )이다. 구체적인 조작 방법은 일반적인 방법이기 때문에 여기에서는 설명을 생략하도록 한다.

3. L-히스티딘 높은 수율 공정균 CG171 및 대조로서의 공정균 CG173 의 구성

zwf - opcA 유전자는 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제(Zwf-OpcA, 서열 3에서 보여주는 바와 같으며, 그 중에서 5’ 말단 제1-514번 아미노산이 Zwf 서브 유닛을 구성하고, 제515-833번 아미노산 잔기가 OpcA 서브 유닛을 구성함)를 인코딩한다. pgi 유전자를 녹아웃시키는 것과 zwf - opcA 유전자(서열 2)를 과도 발현시키는 것을 조합하여 개조를 진행하여 높은 수율의인 공정균 CG171를 취득하였다. 대조로서, pgi 유전자를 녹아웃시키지 않았으나, zwf - opcA 유전자를 과도 발현시킨 공정균 CG173을 취득하였다.

Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 zwf - opcA 유전자 서열에 의하여 프라이머를 디자인하고, Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P44와 P45를 프라이머로 이용하고 PCR을 통하여 2519 bp의 zwf - opcA 세그먼트(zwf 유전자의 초기 코돈은 GTG로부터 ATG로 교체되어 이의 발현을 향상시킴)(서열 2)를 증폭시킨다. Hind III과 Xba I 이중 효소 절단을 거친 후, 우선 마찬가지로 이중 효소 절단 처리를 거친 발현 플라스미드 pXMJ19와 연결시켜 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA를 취득하며, pXMJ19-zwf - opcA는 다시 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 거친 후, 상기 제조된 플라스미드 pXMJ19-prsA - hisG ^fbr 이 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 거쳐 취득한 1852 bp의 prsA - hisG ^fbr 세그먼트와 연결된다.

zwf - opcA 세그먼트에 있어서 그 중의 서열 2의 5’ 말단 제1-1545번 뉴클레오티드는 zwf 유전자이고, 서열 2의 5’ 말단 제1560-2519번 뉴클레오티드는 opcA 유전자이다.

연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 클로람페니콜(20 μg/mL)이 함유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P36과 P37을 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 4587 bp의 양성 형질전환체를 취득한다. 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I/Sma I과 Hind III/Xba I 이중 효소 절단을 진행하여 각각 1852 bp와 2533 bp의 양성을 취득한다.

서열 측정을 통하여 검증을 거쳐 재조합 플라스미드는 pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG ^fbr 의 구성에 성공하고, pWYE 1229(도 3 참조)로 명하며, 이는zwf-opcA 유전자(서열 2)을 pXMJ19의 Hind III과 Xba I 사이에 삽입하고, 또한 prsA-hisG ^fbr 세그먼트(서열 4)를 Xba I과 Sma I 사이에 삽입하여 취득한 벡터이다.

P44: CCCAAGCTTAAAGGAGGACCATCATGAGCACAAACACGACCCCCT(Hind III)(서열 64)

P45: GCTCTAGATTAGACGGTTTCCAGCTTG(Xba I)(서열 65)

재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr 을 각각 pgi 결실되지 않은 공정균 CG160와 pgi 결실된 공정균 CG161 중으로 전기 전환한다. P36과 P37을 프라이머로 하고, 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 4587 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 정확하다고 검증된 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출한다.

서열 측정을 진행하고, L-히스티딘 공정균 CG173(WT-P _glyA ::P _hisEG -hisG ^fbr -P _glyA ::P _hisDCB / pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr )에는 플라스미드 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr 가 포함되고, 이는 재조합 프라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr 를 공정균 CG160에 도입하여 취득한 균이다.

CG171(WT-P _glyA ::P _hisEG - hisG ^fbr -P _glyA ::P _hisDCB -Δpgi/pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG ^fbr )에는 플라스미드 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG ^fbr 가 포함되고, 이는 재조합 프라스미드 pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG ^fbr 를 공정균 CG161에 도입하여 취득한 균이다.

나아가 과도 발현 플라스미드 휴대 유전자가 공정균 중에 발현 상황을 검증한다. CG171의 세포 용해액을 제고하여 SDS-PAGE 데스트를 진행하는 바, 결과는 도 4에 도시된 바와 같으며, 여기에서 레인 1과 2는 CG171의 세포 용해액이고, 레인 3은 대조를 위한 것으로서 ATCC13032/pXMJ19(pXMJ19 플라스미드를 ATCC13032 중에 도입하여 취득)의 세포 용해액이며, 과도 발현 플라스미드가 휴대하는 zwf(57.5 kDa), opcA(34.8 kDa) prsA(35.6 kDa)와 hisG ^fbr (30.2 kDa) 유전자는 공정균 중에서 성공적으로 발현된다.

나아가 공정균 CG171 중의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제(Zwf-opcA)의 비활성을 측정한다. 측정 반응계는 하기와 같은 바(0.5 mL), 즉 100 mmol/L Tris-HCl (pH 7.8), 200 mmol/L KCl, 1 mmol/L NADP, 10 mmol/L MgCl₂, 5 mmol/L 글루코스-6-포스페이트(G6P), 적당량의 세포 용해액이다. 30 ℃에서 5 min 동안 반응시킨다. 340 nm에서의 흡광도의 변화를 측정하는 것을 통하여 생성물 NADPH의 생성량을 반영한다. 효소 활성 단위(U)는 매 분 1 nmol의 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH)를 생성하는 필요한 효소의 량으로 정의된다. 결과는 도5에 도시된 바와 같으며, 야생형 균주에 비하여 플라스미트를 통하여 zwf - opcA를 과도 발현시키는 것을 통하여, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제의 비활성은 34배 향상된다.

실시예 3 : 플라스미드가 포함된 L-히스티딘 높은 수율 공정균 CG319 의 구성

상기 취득한 높은 수율 공정균 CG171의 기초 상에서, 나아가 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제(PurH, 서열 16이 보여주는 바와 같음)의 purH 유전자를 과도 발현시키기 위하여, 히스티딘 합성 경로가 향상되어 증가되는 부산물 AICAR을 더욱 많이 퓨린 뉴클레오티드 합성 경로로 가이드하여 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG ^fbr -purH를 구성하고, 또한 프라이머리 균 CG161 중에 도입하여 높은 수율 공정균 CG319를 취득한다.

Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 purH 유전자 서열에 의하여 프라이머를 디자인하고, ATCC13032 게놈 DNA을 템플릿으로 하고, P46과 P47을 프라이머로 하여 purH 유전자(563 bp)(서열 15)를 PCR 증폭시킨다.

상기 PCR 생성물에 대해 Sma I과 EcoR 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 Corynebacterium glutamicum-대장간균 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 클로람페니콜(20 μg/mL)이 함유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P52와 P53을 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1779 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 진행하여 1577 bp의 양성을 취득하고, 재조합 플라스미드 pXMJ19-purH로 명한다.

재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr 을 템플릿으로 하고, 각각 P48/P49와 P50/P51을 프라이머로 하여 zwf-opcA (2519 bp)와 prsA - hisG ^fbr 세그먼트(1852 bp) PCR 증폭시킨다. 중첩 확대 PCR를 이용하여 두 세그먼트를 연결시켜 4385 bp의 zwf-opcA-prsA-hisG ^fbr 세그먼트(서열 17)를 취득한다.

그 중에서, 서열 17의 5’ 말단 제15-2533번 뉴클레오티드는 zwf - opcA이고, 서열 17의 5’ 말단 제2534-4385번 뉴클레오티드는 prsA-hisG ^fbr 이다.

상기 PCR 생성물에 대해 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 재조합 pXMJ19-purH와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 클로람페니콜(20 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P52와 P53을 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 6164 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 진행하여 4385 bp의 양성을 취득하고, 재조합 플라스미드 pWYE1507（pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG ^fbr -purH)(도 6 참조)로 명한다.

pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr - purH 나아가 서열 측정 분석을 진행하는 바, 해당 플라스미드는 zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr 세그먼트(서열 17)을 플라스미드 pXMJ19의 Xba I과 Sma I 효소 절단 사이트 사이에 삽입하고, 아울러 purH를 플라스미드 pXMJ19의 Sma I과 EcoR I 효소 절단 사이트 사이에 삽입하여 취득한 벡터이다.

플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr - purH를 공정균 CG161 중으로 전환시키고, P52와 P53을 프라이머로 하며, 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 6164 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하여 검증하여, 더욱 과도 발현 플라스미드를 성공적으로 공정균 중에 전환시켜 L-히스티딘 공정균 CG319(WT-P _glyA ::P _hisEG - hisG ^fbr - P _glyA ::P _hisDCB -Δpgi/pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG ^fbr -purH)의 구성에 성공하였다.

상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.

P46: TCCCCCGGGAAAGGAGGACCTTCATGAGCGATGATCGTAAG(Sma I)(서열 66)

P47: CCGGAATTCTTAGTGAGCGAAGTGTCGCG(EcoR I)(서열 67)

P48: GCTCTAGAAAAGGAGGACCATCATGAGCACAAACACGACCC(Xba I)(서열 68)

P49: AGTCATGAGGATCCTCCTTTTTAGACGGTTTCCAGCTTG(서열 69)

P50: TCAAGCTGGAAACCGTCTAAAAAGGAGGATCCTCATGACTGCTCACTG(서열 70)

P51: TCCCCCGGGCTAGATGCGGGCGATGCGGATTTC(Sma I)(서열 71)

P52: CAATTAATCATCGGCTCGTA(서열 72)

P53: ACCGCTTCTGCGTTCTGATT(서열 73)

실시예 4 : 플라스미드가 포함된 L-히스티딘 높은 수율 공정균 CG328 의 구성

상기 CG319를 취득한 기초 상에서, 아미도포스포리보실 전이효소(PurF, 서열 19)를 인코딩하는 purF 유전자를 약화시키고, 히스티딘 합성 전구체 물질 PRPP의 히스티딘 합성 경로를 향한 유동을 증가시키기 위하여, 프라이머리 공정균 CG161 중의 purF의 프로모터를 P _hom 으로 교체시켜 CG327를 취득하고, 다시 플라스미드 pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG ^fbr -purH를 도입하여 높은 수율 공정균 CG328을 취득하였다.

프라이머리 공정균 CG161의 purF 유전자의 프로모터를 P _hom 으로 교체시켜 공정균 CG327를 취득하는 것은 구체적으로 하기와 같다.

우선, Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 purF 유전자 및 이의 업/다운 스트림 서열에 의하여 각각 프라이머를 디자인한다.

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA을 템플릿으로 하고, P54와 P55를 프라이머로 하여 PCR을 통하여 purF 유전자 업 스트림 상동 암을 증폭시키며; P56과 P57를 프라이머로 하여 purF 프로모터를 증폭시킨다. P58과 P59를 프라이머로 하여 purF 유전자 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. 이어 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P54와 P59를 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1654 bp의 P _hom 프로모터 및 purF 유전자 프로모터 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 세그먼트(서열 18)를 취득한다.

그 중에서, 서열 18의 5’ 말단 제1-735번 뉴클레오티드는 purF 유전자 업 스트림 상동 암이고, 서열 18의 5’ 말단 제736-865번 뉴클레오티드는 P _hom 프로모터이며, 서열 18의 5’ 말단 제866-1654번 뉴클레오티드는 purF 유전자 프로모터의 다운 스트림 상동 암이다.

정제 회수되는 PCR 생성물은 각각 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 거친 후, 마찬가지의 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결된다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 양성 형질전환체로서의 1866 bp를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1654 bp를 취득한다. 나아가 서열 측정 검증을 진행하는 바, 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P _hom ::P _purF 의 구성에 성공하였고, 이는 프로모터 P _hom 및 교체하고자 하는 프로모터를 포함하는 업/다운 스트림 상동 암의 세그먼트(서열 18)를 벡터 pK18mobsacB의 BamH I과 EcoR I 효소 절단 사이트 사이에 삽입하여 취득한 벡터이다.

상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.

P54: CGCGGATCCTCCGCAGAAAGCACCTCA(BamH I)(서열 74)

P55: TTTAGTTTTCAACGGCTAAAGTTTGACCACTGG(서열 75)

P56: GTGGTCAAACTTTAGCCGTTGAAAACTAAAAAGC(서열 76)

P57: TCCGGTCCTCCTTTTACTTTGTTTCGGCCACCC(서열 77)

P58: GGCCGAAACAAAGTAAAAGGAGGACCGGAATGACCCAGGTAAACCAC(서열 78)

P59: CCGGAATTCAACCTTTGCGGGTTGTCT(EcoR I)(서열 79)

서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P _hom ::P _purF 를 Corynebacterium glutamicum CG161 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합하며, 자당 역방향 스크리닝을 통하여 제2회 상동 재조합이 발생한 세균 집락을 취득한다. P56과 P59를 프라이머로 하여 세균 집락에 대하여 게놈 DNA 추출 및 PCR 증폭 검증을 진행하여 905 bp의 양성을 취득하고, CG327(WT-P _glyA ::P _hisEG -hisG ^fbr -P _glyA ::P _hisDCB -Δpgi::P _hom ::P _purF )로 명한다.

CG327(WT-P _glyA ::P _hisEG - hisG ^fbr - P _glyA ::P _hisDCB -Δpgi::P _hom ::P _purF )는 나아가 서열 측정 분석을 진행하는 바, 결과적으로 L-히스티딘 프라이머리 공정균 CG161의 염색체 purF 유전자 프로모터를 P _hom 으로 교체하고, CG327 구성에 성공하였다.

공정균 CG328는 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr - purH를 공정균 CG327 도입하여 취득한 재조합균(WT-P _glyA ::P _hisEG - hisG ^fbr - P _glyA ::P _hisDCB -Δpgi::P _hom ::P _purF /pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG ^fbr - purH)이다. 구체적인 조작 방법은 상기 공정균 CG319를 제조하는 것이고 일반적인 방법이기 때문에 여기에서는 설명을 생략하도록 한다. CG328 균주가 휴대한 플라스미드에 대하여 PCR 검증을 진행하는 바, P52와 P53을 프라이머로 하여 6164 bp 세그먼트(도 7 참조)를 취득하고, 이 DNA 세그먼트에 대하여 서열 측정을 진행한 결과로는 zwf - opcA - prsA - hisG ^fbr - purH 세그먼트로서, CG328 균주 구성에 성공하였다.

실시예 5 : 플라스미드가 없는 L-히스티딘 높은 수율 재조합균 CG351 의 구성

플라스미드를 휴대하면 공정균의 대사 부담을 증가시킬 뿐 아니라, 아울러 공정균의 산업화 발효 제어와 발효 제품의 안전성에 불리하다. 그러므로, 본 실시예에 있어서, 플라스미드 휴대 유전자를 염색체 상에서 발현을 향상시고, 플라스미드가 없는 히스티딘 공정균을 구성하여 공정균의 대사 부담을 줄이고 발효 기저물로부터 제품으로의 최대 전환을 구현한다.

본 실시예에 있어서, pgi 유전자를 녹아웃시킨 프라이머리 균 CG161의 기초 상에서 나아가 개조를 진행하는 바, P _sod 프로모터로 prsA 유전자의 프로모터를 교체시켜 PRPP 합성 효소(PrsA)의 발현을 향상시킴으로써, CG350을 취득하며; 나아가 P _eftu 프로모터로 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터를 교체시켜 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제(Zwf-OpcA)의 발현을 향상시켜 CG351을 취득한다.

Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 prsA 유전자 및 이의 업/다운 스트림 서열과 P _sod 프로모터에 의하여 각각 프라이머를 디자인한다.

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P60과 P61을 프라이머로 하여 prsA 프로모터 업 스트림 상동 암을 증폭시키며; P62와 P63을 프라이머로 하여 P _sod 프로모터를 증폭시키며; P64와 P65를 프라이머로 하여 prsA 프로모터 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. 이어 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P60과 P65를 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1455 bp의 PCR 생성물 취득하여, 교체할 프로모터 P _sod 및 교체될 프로모터 P _prsA 를 포함하는 업/다운 스트림 상동 암의 세그먼트(서열 11)로 한다.

그 중에서, 서열 11의 5’ 말단 제1-655번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P _prsA 의 업 스트림 상동 암이고, 서열 11의 5’ 말단 제656-847번 뉴클레오티드는 프로모터 P _sod 이며, 서열 11의 5’ 말단 제848-1455번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P _prsA 의 다운 스트림 상동 암이다.

상기 1455 bp의 PCR 생성물에 대해 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 콜로니 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1667 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1455 bp를 취득한다.

양성 플라스미드에 대하여 서열 측정을 진행하는 바, 결과적으로 해당 플라스미드는 서열표 중의 서열 11이 보여주는 뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 플라스미드이며, pK18mobsacB-P _sod ::P _prsA 라 명한다.

동일한 방법을 이용하여 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P _eftu ::P _tkt 를 구성하고, tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터를 강한 프로모터 P _eftu 로 교체시킨다. 구체적으로 말하면, P66과 P67을 프라이머로 하여 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론 프로모터 업 스트림 상동 암을 증폭시키며; P68과 P69를 프라이머로 하여 프로모터 P _eftu 를 증폭시키며; P70과 P71을 프라이머로 하여 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론 프로모터 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. P66과 P71을 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭시킨다. 취득한 1512 bp의 PCR 생성물은 교체할 프로모터 P _eftu 및 교체될 프로모터 P _tkt 를 포함하는 업/다운 스트림 상동 암의 긴 세그먼트(서열 12)이고, 그 중에서, 서열 12의 5’ 말단 제1-634번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P _tkt 의 업 스트림 상동 암이고, 서열 12의 5’ 말단 제635-834번 뉴클레오티드는 프로모터 P _eftu 이며, 서열 12의 5’ 말단 제835-1512번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P _tkt 의 다운 스트림 상동 암이다.

상기 1512 bp의 PCR 생성물을 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 콜로니 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1724 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1512 bp를 취득한다. 양성 플라스미드에 대하여 서열 측정을 진행하는 바, 결과적으로 해당 플라스미드는 서열표 중의 서열 12가 보여주는 뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 플라스미드이며, pK18mobsacB-P _eftu ::P _tkt 라 명한다.

상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.

P60: CCCAAGCTTTCCAGCAACCACCTGGAT (Hind III)(서열 80)

P61: AATTGGCAGCTATTAGCCTTCCTGGTTGTG(서열 81)

P62: CAGGAAGGCTAATAGCTGCCAATTATTCCG(서열 82)

P63: TTGTCCTCCTTTGGGTAAAAAATCCTTTCG(서열 83)

P64: GATTTTTTACCCAAAGGAGGACAACCATGACTGCTCACTGGAA(서열 84)

P65: CGCGGATCCCGCCATTGGGGCATCGCC(BamH I)(서열 85)

P66: CCCAAGCTTTCAACGATCACTGCCCAG(Hind III)(서열 86)

P67: GGGTAACGGCCAGTGTGTCTTAGAAAATG(서열 87)

P68: CTAAGACACACTGGCCGTTACCCTGCGAA(서열 88)

P69: TTGTCCTCCTTTTGTATGTCCTCCTGGACT(서열 89)

P70: GGAGGACATACAAAAGGAGGACAACCTTGACCACCTTGACGCTG(서열 90)

P71: CGCGGATCCAAGCGATCTCAGTGTTGT(BamH I)(서열 91)

P72: TGTGACCCGCTACCCGATAA(서열 92)

P73: CGTTACCCTGCGAATGTC(서열 93)

서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB - P _sod ::P _prsA 를 L-히스티딘 재조합균 CG161 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합하며, 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다. 양성 세균 집락을 P72와 P65를 프라이머로 하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 778 bp의 재조합균 WT-P _glyA ::P _hisEG - hisG ^fbr - P _glyA ::P _hisDCB - P _sod :: P _prsA -Δpgi를 취득하고, CG350으로 명한다.

서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB - P _eftu ::P _tkt 를 Corynebacterium glutamicum CG350 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합하며, 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다. 양성 세균 집락을 P73과 P71을 프라이머로 하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 874 bp의 재조합균 WT-P _glyA ::P _hisEG -hisG ^fbr -P _glyA ::P _hisDCB -P _eftu ::P _tkt -P _sod ::P _prsA -Δpgi를 취득하고, Corynebacterium glutamicum CG351로 명한다.

재조합균의 게놈 DNA에 대하여 추출 및 서열 측정을 진행하면, 결과적으로 성공적으로 L-히스티딘 재조합균 CG161 중의 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론과 prsA 유전자의 프로모터를 각각 Corynebacterium glutamicum 내생성 강한 프로모터 P _eftu 와 P _sod 로 교체하였고, 플라스미드가 없는 L-히스티딘 재조합균 CG351(WT-P _glyA ::P _hisEG -hisG ^fbr -P _glyA ::P _hisDCB -P _eftu ::P _tkt -P _sod ::P _prsA -Δpgi) 구성에 성공하였다.

실시예 6 : 플라스미드가 없는 L-히스티딘 높은 수율 재조합균 CG352 와 G353 의 구성

본 실시예에 있어서, 상기 실시예 5의 기초 상에서, 강한 프로모터 P _eftu 로 purH 유전자의 프로모터를 교체시켜 purH가 인코딩한 이중 기능 효소 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제(PurH, 서열 16)의 발현을 향상시킴으로써, 나아가 CG352를 구성하며; 그 후 P _hom 프로모터로 purF 유전자 프로모터를 교체하여 뉴클레오티드 합성 경로 중의 제1 효소, 아미도포스포리보실 전이효소(PurF, 서열 19)를 약화시켜 CG353을 구성한다.

상기 실시예 5에서와 동일한 방법을 이용하여 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P _eftu ::P _purH 를 구성하고, purH 유전자의 프로모터를 강한 프로모터 P _eftu 로 교체시킨다. Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 purH 유전자 업/다운 스트림 서열에 의하여 프라이머를 디자인한다. Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P74과 P75를 프라이머로 하여 증폭시켜 P _eftu 프로모터를 취득하고, P76과 P77을 프라이머로 하여 증폭시켜 업 스트림 상동 암을 취득하며, P78과 P79를 프라이머로 하여 증폭시켜 다운 스트림 상동 암을 취득하고, 다시 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P76과 P79를 프라이머로 하여, 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1473 bp의 업/다운 스트림 상동 암 및 프로모터 Peftu를 포함하는 세그먼트(서열 20)를 취득한다.

그 중에서, 서열 20의 5’ 말단 제1-633번 뉴클레오티드는 업 스트림 상동 암이고, 서열 20의 5’ 말단 제634-833번 뉴클레오티드는 P _eftu 이며, 서열 20의 5’ 말단 제834-1473번 뉴클레오티드는 다운 스트림 상동 암이다.

상기 1473 bp의 PCR 생성물에 대해 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1685 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1473 bp를 취득한다.

양성 플라스미드에 대하여 서열 측정을 진행하는 바, 결과적으로 해당 플라스미드는 서열표 중의 서열 20이 보여주는 뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 플라스미드이며, pK18mobsacB- P _eftu ::P _purH 라 명한다.

P74: CTGGAGAGGCTAATGGCCGTTACCCTGCGAA(서열 94)

P75: ATCATCGCTCATTGTATGTCCTCCTGGACT(서열 95)

P76: GCTCTAGAATGATGGTTCCGAGGCCG(Xba I)(서열 96)

P77: GGGTAACGGCCATTAGCCTCTCCAGTTGAG(서열 97)

P78: GGAGGACATACAATGAGCGATGATCGTAAG(서열 98)

P79: TCCCCCGGGTGGTGCCGATCCAACCTG(Sma I)(서열 99)

서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB - P _eftu ::P _purH 를 L-히스티딘 재조합균 공정균 CG351 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 통합하여 염색체 상의 세균 집락을 취득하며, 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다. 양성 세균 집락에서 게놈 DNA를 추출하고, 추출한 게놈 DAN를 템플릿으로 하고, P74와 P79를 프라이머로 하여 PCR 증폭을 진행하여 840 bp의 양성 클론을 취득하며, 서열 측정 검증에 의하면, 이미 성공적으로 L-히스티딘 재조합균 CG351 중의 purH 유전자의 프로모터를 Corynebacterium glutamicum 내생성 강한 프로모터 P _eftu 로 교체시키고, 플라스미드가 없는 L-히스티딘 재조합균 CG352(WT-P _glyA ::P _hisEG -hisG ^fbr -P _glyA ::P _hisDCB -P _eftu ::P _tkt -P _sod ::P _prsA -Δpgi-P _eftu ::P _purH )의 구성에 성공하였다.

실시예 4에서 제조한 서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P _hom ::P _purF 를 Corynebacterium glutamicum CG352 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합하며, 자당 역방향 스크리닝을 통하여 제2회 상동 재조합이 발생한 세균 집락을 취득한다. P56과 P59를 프라이머로 하여, 세균 집락에 대하여 게놈 DNA 추출 및 PCR 증폭 검증을 진행하여 905 bp의 양성을 취득하며(도 8 참조), CG353(WT-WT-P _glyA ::P _hisEG - hisG ^fbr - P _glyA ::P _hisDCB -P _eftu ::P _tkt -P _sod ::P _prsA -Δpgi-P _eftu ::P _purH -P _hom ::P _purF )로 명한다.

CG353에 대하여 나아가 서열 측정 분석을 진행하는 바, 결과로는 공정균 CG352의 염색체 purF 유전자 포로모터는 P _hom 으로 교체되고, CG353의 구성에 성공하였다.

실시예 7 : L-히스티딘 공정균의 L-히스티딘 생산 중의 응용

1. 플라스미드를 포함하는 높은 수율의 L-히스티딘의 재조합균의 발효

1) 플라스미드를 포함하는 높은 수율의 L-히스티딘의 공정균의 진탕 발효

진탕 발효에 이용되는 발효 배지는 구체적으로 하기와 같은 바, 즉 글루코스 40 g/L, (NH₄)₂SO₄ 20 g/L, KH₂PO₄ 0.5 g/L, K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.25 g/L, FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L, MnSO₄·H₂O 0.01 g/L, ZnSO₄·7H₂O 0.001 g/L, CuSO₄ 0.0002 g/L, NiCl₂·6H₂O 0.00002 g/L, 비오틴 0.0002 g/L, pH 7.0-7.2, CaCO₃ 20 g/L. 글루코스는 단독 멸균을 진행하며, 115 ℃ 하에서 고압 멸균을 15 min 진행한다. MgSO₄·7H₂O 및 무기염 이온은 단독 멸균을 진행하며, 121 ℃ 하에서 고압 멸균을 20 min 진행한다. 비오틴은 0.22μm 무균 필터링 필름을 이용하여 필터링시켜 세균을 제거한다. 나머지 성분은 121 ℃ 하에서 고압 멸균을 20 min 진행한다.

씨드 배지는 구체적으로 하기와 같은 바, 즉 글루코스 20 g/L, 황산암모늄 5 g/L, K₂HPO₄·3H₂O 1 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L, 비오틴 50 μg, 비타민 B₁ 1 mg, Angel Yeast 분말(FM802) 10 g/L, Angel peptone(FP318) 10 g/L.

(1) 종자액의 취득

상기 실시예 2에서 제조된 공정균 CG176, CG172, CG173과 CG171을 각각 종자 배지에 접종시키는 바, 종자액 배양 조건은 배양 온도 32℃, 쉐이커 회전 속도 220 r/min, 배양 시간 8 h, OD₆₀₀는 20이다.

(2) 발효

종자액을 체적 백분 함량 3%로 최종 농도가 10 μg/ml인 클로람페니콜이 포함된 발효 배지(500 mL 칸막이 플라스크 용액 투여량은 30 mL)에 접종시키고, 32 ℃, 220 r/min에서 72 h 배양시키며, 6 h 발효 배양시켰을 때 최종 농도가 1 mmol/L인 isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하여 목표 유전자의 유도 발현을 진행한다. 간헐적으로 짙은 암모니아수를 보충 첨가하여 발효액의 pH를 7.0-7.2 사이로 제어하고, 잔당 상황에 의하여 농도가 400 g/L인 글루코스 모액을 보충 첨가하여 발효액의 잔당을 5-10 g/L로 제어한다.

발효 생성물을 수집한 후 12000×g에서 5 min 동안 원심 분리시켜 상청액을 수집한다.

(3) L-히스티딘 함량의 측정

고효율 액상법(2,4-DNFB 프리 컬럼 파생 고효율 액상법)을 이용하는데, 구체적인 방법은 하기와 같은 바, 즉 2 mL의 원심관에 50 μL의 상기 상청액을 취하고, 200 μL NaHCO₃ 수용액(0.5 mol/L, pH 9.0)과 100 μL 1％의 2,4-DNFB-아세토나이트릴 용액(체적비)을 첨가하고, 60℃의 수욕 중에서 어두운 곳에서 일정한 온도로 60 min 가열시키며, 그 후 25℃까지 냉각시켜 650 μL KH₂PO₄ 수용액(0.01 mol/L, pH 7.2 ± 0.05, NaOH 수용액으로 pH 조절)을 첨가하고, 15 min 방치하고 필터링시킨 후 주입할 수 있는 바, 주입량은 15 μL이다.

사용되는 크로마토그래픽 컬럼은 C18 컬럼(ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6*150 mm, Agilent, USA); 컬럼 온도: 40℃; 자외선 탐지 파장: 360nm; 유동상 A는 0.04 mol/L KH2PO4 수용액(pH 7.2 ± 0.05, 40 g/L KOH 수용액으로 pH 조절)이고, 유동상 B는 55％ 아세토나이트릴 수용액(체적비)이며, 유동상의 유속은 1 mL/min이고 용출 과정은 하기 표 1에 표시된 바와 같다.

시간(min)	유동상 A(%)	유동상 B(%)
0	86	14
2	88	12
4	86	14
10	70	30
20	30	70
21	10	90
24	0	100

야생형 균주 C. glutamicum ATCC13032를 대조로 하여, 발효 과정인 글루코스 소모, OD₆₀₀ 및 최종의 L-히스티딘 수율을 측정한다. 결과는 하기 표 2에 표시된 바와 같다.

표 2는 진탕 발효 실험 중의 L-히스티딘 공정균 CG160, CG176, CG172, CG173과 CG171의 글루코스 소모, 최대 OD₆₀₀, 비성장 속도 및 L-히스티딘 수율을 보여준다.

균주	글루코스 소모량(g)	최대 OD₆₀₀	비성장 속도(h^-1)	L-히스티딘 수율(g/L)
CG160	3.8	62.67	0.131	0.03
CG176	3.8	60.97	0.127	1.18
CG172	1.2	46.67	0.073	0.77
CG173	3.8	59.07	0.120	1.50
CG171	1.8	53.83	0.108	2.40

진탕 발효 실험에 있어서, 72 h 발효시키고, 야생형 균주 C. glutamicum ATCC13032에서는 L-히스티딘의 누적이 검출되지 않았으며, 기저균 CG160의 L-히스티딘 수율은 0.03 g/L이다. 단지 L-히스티딘 터미널 대사 경로 개조를 진행한 기저 공정균 CG176의 L-히스티딘 수율은 1.18 g/L이다. 이 기초 상에서, 단지 pgi 유전자가 결실된 공정균 CG172의 L-히스티딘 수율은 0.77 g/L이며; 단지 zwf - opcA가 과도 발현된 공정균 CG173의 L-히스티딘 수율은 1.50 g/L이다. pgi 유전자가 결실됨과 아울러 zwf - opcA가 과도 발현된 공정균 CG171의 L-히스티딘 수율은 2.40 g/L로서, 단지 pgi 유전자가 결실된 공정균 CG172에 비햐여 수율이 2.1배 향상되고, 단지 zwf - opcA가 과도 발현된 균주 CG173에 비해서는 60% 향상되었으며, 단지 L-히스티딘 터미널 대사 경로 개조를 진행한 균주 CG176에 비해서는 102% 향상되었다.

2) L-히스티딘 공정균 CG171, CG319와 CG328 발효 탱크로 L-히스티딘 발효 생산

씨드 배지는 구체적으로 하기와 같은 바, 즉 글루코스 20 g/L, 황산암모늄 5 g/L, K₂HPO₄·3H₂O 1 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.9 g/L, 비오틴 50 μg, 비타민 B₁ 1 mg, Angel Yeast 분말(FM802) 2 g/L, Angel peptone(FP318) 2 g/L.

이용된 발효 배지는 구체적으로 하기와 같은 바, 즉 글루코스 20 g/L, 황산암모늄 5 g/L, KH₂PO₄ 0.5 g/L, K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.25 g/L, FeSO₄·7H₂O 10 mg/L, MnSO₄·H₂O 10 mg/L, 비타민 B₁ 0.5 mg/L, Angel Yeast 분말(FM802) 5 g/L.

(1) 종자액의 취득

공정균 CG171, CG319와 CG328를 종자 배지에 접종시키는 바, 종자액 배양 조건은 배양 온도 32℃, 쉐이커 회전 속도 220 r/min, 배양 시간 8 h, OD₆₀₀는 20이다.

(2) 발효

종자액을 체적 백분 함량 10%으로 최종 농도가 10 μg/ml인 클로람페니콜이 포함된 발효 배지에 접종시킨다.

이용되는 발효 탱크는 7.5 L 발효 탱크(BioFlo115, NBS)로서, 정속도 프로그램가능한 펌포가 내장되어 정속도로 내용물을 보충할 수 있다. 발효 과정에서 연동 펌프를 이용하여 600 g/L의 글루코스를 보충 첨가하여, 발효 시스템 중의 글루코스의 농도를 5～10 g/L로 제어하며, 아울러 10 g/L의 Angel Yeast 분말(FM802)을 드립시킨다. 가열 자켓 및 냉각수를 통하여 발효 온도를 제어하여 32 ℃로 유지하며; 공기를 통과시켜 용존 산소를 제공하고, 회전 속도와 용존 산소 신호를 연속 제어하여 용손 산소를 30%로 유지하며; 짙은 암모니아수를 보충 첨가하여 pH를 조절하여 약 6.9로 유지한다. 발효는 연속 52 h 진행한다. OD₆₀₀=4～5일 때, IPTG(isopropyl thiogalactopyranoside, 최종 농도는 0.5 mmol/L)를 첨가하여 재조합 플라스미드가 휴대한 유전자의 발현을 유도한다.

(3) L-히스티딘 함량의 측정

상기 1) 중의 (3)의 방법에 따라 상청액 중의 L-히스티딘 함량을 측정하는 바, 결과는 하기 표와 같으며, 공정균 CG171의 L-히스티딘 최고 함량은 10.87 g/L이고, 생산 강도는 0.21 g/L/h이며; 공정균 CG319의 L-히스티딘 최고 함량은 14.15 g/L이고, 생산 강도는 0.30 g/L/h이며; 공정균 CG328의 L-히스티딘 최고 함량은 15.96 g/L이고, 생산 강도는 0.32 g/L/h이다. 결과는 표 3에 표시된 바와 같다.

균주	히스티딘 수율(g/L)	발효 시간(h)
CG171	10.87	52
CG319	14.15	47
CG328	15.96	50

상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 발효 탱크 실험에서 CG171 균주가 아주 훌륭한 효과를 거두었는 바, 히스티딘 수율은 52 시간 발효시 10.87g/L에 달했다. 나아가 purH를 과도 발현시킨 공정균 CG319 및 나아가 동시에 purH를 과도 발현시키고 purF를 약화시킨 공정균 CG328은 CG171에 비하여, 발효 시간이 더욱 짧은 상황 하에서, 히스티딘 수율이 각각 약 30% 및 50% 향상되었다. 다시 말하면, pgi를 약화시키고 zwf - opcA를 과도 발현시킨 기초 상에서, 히스티딘 합성 경로와 뉴클레오티드 합성 경로를 커플링시켜, 히스티딘 합성 경로의 대사 유동을 증가시키고 나아가 히스티딘의 수율이 크게 향상되도록 하였다.

2. 플라스미드가 없는 L-히스티딘 공정균 CG350 , CG351 , CG352 및 CG353 진탕 발효로 L-히스티딘 생산

공정균 CG350, CG351, CG352 및 CG353 종자액의 취득과 진탕 발효 방법은 상기 1에서와 같으나, 다른 점이라면 발효 과정 중에 클로람페니콜와 유도제 IPTG를 첨가할 필요가 없는 것이다. L-히스티딘 함량 측정은 본 실시예의 제1항에서와 같다. 야생형 C. glutamicum ATCC13032를 대조로 한다.

진탕 발효 실험에 있어서, 72 h 발효시키고, 야생형 균주 C. glutamicum ATCC13032에서 L-히스티딘의 누적이 검출되지 않았으며, 단지 pgi 유전자가 결실된 것으로 구성된 공정균 CG350의 L-히스티딘 수율은 0.65 g/L이고, 이 기초 사에서 동시에 zwf - opcA의 발현량을 향상시켜 구성한 공정균 CG351의 L-히스티딘 수율은 1.86 g/L이며, 단지 pgi 유전자가 결실된 공정균 CG350에 비하여 186% 향상되었다. 나아가 purH 유전자 발현을 향상시킨 균주 CG352의 L-히스티딘 수율은 2.23 g/L이고, 더욱 나아가 purF 유전자 발현을 낮춘 균주 CG353의 L-히스티딘 수율은 2.34 g/L이다. 결과는 표 4에 표시된 바와 같다.

균주	히스티딘 수율(g/L)
야생형	---
CG350	0.65
CG351	1.86
CG352	2.23
CG353	2.34

<110> Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences <120> RECOMBINANT STRAIN PRODUCING L-AMINO ACIDS, CONSTRUCTING METHOD THEREFOR AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS <130> IP-2015-0123CN <150> CN 201410050868.2 <151> 2014-02-14 <160> 99 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 gctctttcgg agtgaccttc tccccagacg gaaccgccga aatcggagcc tccgtcgatg 60 ctgtggacgg gcacatcatc aacgacgccg tcacccaaca cgcgaagaaa aacgacctca 120 cctacggcga agctttcagc gacatccttc ggaacaatat ccaagtcaag gtagtcctca 180 acttgtacac cgccaaagac ctcgccaacg ccccagtgtg ggccagcgga atcggctggt 240 tggatgccaa gactggaaca ttctggtcag agaaagccaa caaagaacaa gacatggatg 300 cggctgccaa aatcagcacc gacaaacacg atcctccacc agcgttgcgt gacgcactca 360 ttggtcgtga tggcacctgc cgattccctg gctgttcagt cccagcgctc aaaacccaag 420 ccgaccaccg catcccctac gaagaaggcg gagaaacttg cctaggcgga atcggctgcc 480 tctgtcaaca ccaccacaac atgaaaaccg acggccgagt cacctacctt ctcgatccct 540 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tgttagatga atccagcctc 1380 ttccctacca acgaggaagt ggaactgagc tggaagattc tggatccaat tcttgaagca 1440 tgggatgccg atggagaacc agaggattac ccagcgggta cgtggggtcc aaagagcgct 1500 gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc tggcgcaggc cataatttag gggcaaaaaa 1560 tgatctttga acttccggat accaccaccc agcaaatttc caagacccta actcgactgc 1620 gtgaatcggg cacccaggtc accaccggcc gagtgctcac cctcatcgtg gtcactgact 1680 ccgaaagcga tgtcgctgca gttaccgagt ccaccaatga agcctcgcgc gagcacccat 1740 ctcgcgtgat cattttggtg gttggcgata aaactgcaga aaacaaagtt gacgcagaag 1800 tccgtatcgg tggcgacgct ggtgcttccg agatgatcat catgcatctc aacggacctg 1860 tcgctgacaa gctccagtat gtcgtcacac cactgttgct tcctgacacc cccatcgttg 1920 cttggtggcc aggtgaatca ccaaagaatc cttcccagga cccaattgga cgcatcgcac 1980 aacgacgcat cactgatgct ttgtacgacc gtgatgacgc actagaagat cgtgttgaga 2040 actatcaccc aggtgatacc gacatgacgt gggcgcgcct tacccagtgg cggggacttg 2100 ttgcctcctc attggatcac ccaccacaca gcgaaatcac ttccgtgagg ctgaccggtg 2160 caagcggcag tacctcggtg gatttggctg caggctggtt 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Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile 115 120 125 Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile 130 135 140 Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly 145 150 155 160 Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys 165 170 175 Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val 180 185 190 Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu 195 200 205 Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln 210 215 220 Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile 225 230 235 240 Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp 245 250 255 Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu 260 265 270 Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln 275 280 285 Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr 290 295 300 Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln 305 310 315 320 Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu 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Claims

L-아미노산을 생산하는 재조합균에 있어서, 상기 재조합균은 시작균에 비하여 낮아진 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi의 발현과 향상된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 Zwf-OpcA의 발현을 가지며, 그 중에서 상기 시작균은 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주이며, 바람직하게는, 상기 목표 아미노산은 L-히스티딘, L-라이신, L-발린, L-트레오닌, L-프롤린 또는 L-히드록시프롤린인 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제1항에 있어서, 상기 재조합균의 염색체 상의 pgi 유전자는 이미 불활성화되며 바람직하게는 이미 녹아웃되거나, 또는 pgi 유전자의 조절 요소가 이미 낮은 전사 또는 낮은 발현 활성의 조절 요소로 교체되고, 아울러 상기 재조합균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피한 zwf - opcA 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 상기 시작균 염색체 상의 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터를 교체하는 바, 바람직하게는, 상기 강한 프로모터는 원시균의 P _eftu 프로모터인 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제1항에 있어서, 상기 시작균은 원시균에 비하여 L-히시티딘 합성 오페론의 hisEG 유전자와 hisDCB 유전자의 향상된 발현을 가지며, 바람직하게는, 강한 프로모터로 상기 hisEG 유전자와 hisDCB 유전자의 프로모터를 교체시키고, 더욱 바람직하게는 상기 원시균 염색체 상의 P _glyA 프로모터로 각각 hisEG 유전자와 hisDCB 유전자의 프로모터를 교체시키며;
나아가 바람직하게는, 상기 시작균은 원시균에 비하여 향상된 PRPP 합성 효소 PrsA의 발현을 가지며, 더욱 바람직하게는, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 prsA 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 prsA 유전자의 프로모터를 교체하는 바, 바람직하게는 상기 프로모터는 상기 원시균의 P _sod 프로모터인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제1항에 있어서,
상기 시작균은 원시균에 비하여 향상된 dapA 유전자 또는 lysC 유전자의 발현을 가지거나; 또는
상기 시작균은 원시균에 비하여 향상된 발린 합성 유전자 ilvBNCE의 발현을 가지거나; 또는
상기 시작균은 원시균에 비하여 향상된 트레오닌 합성 유전자 hom 및 thrB의 발현을 가지거나; 또는
상기 시작균은 원시균에 비하여 향상된 ocd 유전자의 발현을 가지거나; 또는
상기 시작균은 원시균에 비하여 향상된 p4hD 유전자의 발현을 가지는; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제3항에 있어서, 상기 재조합균은 상기 시작균에 비하여 향상된 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제 PurH의 발현을 가지며;
바람직하게는, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 purH 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 purH 유전자의 프로모터를 교체시키는 바, 바람직하게는, 상기 프로모터는 상기 원시균의 P _eftu 프로모터인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제3항 또는 제5항에 있어서, 상기 재조합균은 상기 시작균에 비하여 약화된 아미도포스포리보실 전이효소 PurF의 발현을 가지며;
바람직하게는, 약한 프로모터로 purF 유전자의 프로모터를 교체하고, 더욱 바람직하게는, 상기 약한 프로모터는 상기 원시균 중의 P _hom 프로모터인인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제1항 내지 제6항의 임의 항에 있어서, 상기 원시균은 코리네박테리움 속, 다이어리스터 속 또는 브레비박테리움 속으로부터 선택되는 한 가지 세균주이며;
바람직하게는, 상기 코리네박테리움 속의 세균은 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium pekinense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium aminogenes, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae 및 Corynebacterium herculis으로부터 선택되는 한 가지 세균주이며;
상기 다이어리스터 속의 세규은 Microbacterium ammoniaphilum으로부터 선택되는 한 가지 세균주이며;
상기 브레비박테리움 속의 세균은 Brevibacteriaceae flvum, Brevibacteriaceae lactofermentum 및 Brevibacteriaceae ammoniagenes으로부터 선택되는 한 가지 세균주인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제7항에 있어서, 상기 원시균은 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC13032인 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제8항에 있어서, 상기 시작균의 염색체 상에는 각각 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 교체하는 서열 7 중의 5’ 말단 제863-1038번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 P _glyA 프로모터를 가지며;
상기 시작균은 돌연변이된 ATP-포스포리보실 전이효소를 발현할 수 있는 바, 상기 돌연변이된 ATP-포스포리보실 전이효소는 서열 6이 보여주는 ATP-포스포리보실 전이효소의 제215번의 아스파라진이 라이신으로 돌연변이되고, 제231번의 류신이 페닐알라닌으로 돌연변이되며, 제235번의 트레오닌이 알라닌으로 돌연변이된 효소이며, 바람직하게는, 상기 시작균의 염색체 상에는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 hisG 유전자를 교체하는 서열 4 중의 제1007-1852번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 hisG ^fbr 유전자를 가지며;
상기 시작균의 염색체 상에는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 교체하는 서열 11 중의 5' 말단 제656-847번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 P _sod 프로모터를 가지거나;
또는, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 prsA 유전자와 hisG ^fbr 유전자를 가지며;
그 중에서, 상기 prsA 유전자는 인코딩 서열 5가 보여주는 PrsA의 유전자에서 선택되며; 코드가 상기 PrsA와 비하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 PrsA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이고, 바람직하게는, 상기 prsA 유전자는 서열표 중의 서열 4가 보여주는 제15-992번 뉴클레오티드 서열인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제9항에 있어서, 상기 pgi 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 14가 보여주는 Pgi의 유전자에서 선택되며; 코드가 상기 Pgi와 비하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 활성을 가지는 유전자 중의 하나이고, 바람직하게는, 상기 pgi 유전자는 서열 13이 보여주는 뉴클레오티드 서열이며;
상기 zwf - opcA 유전자는 서열표 중의 인코딩 서열표 중의 서열 3이 보여주는 zwf-opcA의 유전자에서 선택되며; 코드가 상기 zwf-opcA와 비하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 zwf-opcA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이고, 바람직하게는, 상기 zwf - opcA 유전자는 서열 2가 보여주는 뉴클레오티드 서열이며;
상기 P _eftu 프로모터는 서열 12가 보여주는 5’ 말단 제635-834번의 뉴클레오티드 서열인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제10항에 있어서, 상기 purH 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 16이 보여주는 purH의 유전자에서 선택되며; 코드가 상기 purH와 비하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 purH 활성을 가지는 유전자 중의 하나이고, 상기 purH 유전자는 서열표 중의 서열 15가 보여주는 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
제11항에 있어서, 상기 P _hom 프로모터는 서열 18이 보여주는 5’ 말단 제736-865번의 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균.
L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법에 있어서, 하기 단계가 포함되는 바, 즉 시작균 중의 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi의 발현을 낮추고, 또한 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 Zwf-OpcA의 발현을 향상시켜 상기 재조합균을 취득하며;
그 중에서 상기 시작균은 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주이며, 더욱 바람직하게는, 상기 목표 아미노산은 L-히스티딘, L-라이신, L-발린, L-트레오닌, L-프롤린 또는 L-히드록시프롤린인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제13항에 있어서,
상기 시작균 중의 Pgi의 발현을 낮추는 것은 하기 A) 또는 B) 방식을 통하여 구현하는 바, 즉
A) 상기 시작균 염색체 상의 pgi 유전자를 불활성화시킨 것으로서, 상기 불활성화는 녹아웃인 것이 바람직하며;
B) 상기 시작균 중의 pgi 유전자의 조절 요소를 낮은 전사와 낮은 발현 활성의 조절 요소로 교체하여 구현하며;
상기 시작균 중의 Zwf - OpcA의 발현을 향상시키는 것은 하기 C) 또는 D) 방식을 통하여 구현한다.
C) 상기 시작균 중의 zwf - opcA 유전자의 카피 수량을 증가시키며;
D) 상기 시작균 염색체 상의 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터을 강한 프로모터로 교체시키는 바, 바람직하게는, 상기 강한 프로모터는 상기 원시균 염색체 상의 P _eftu 프로모터인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제13항에 있어서, 상기 시작균을 취득하는 것은 원시균 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 각각 강한 프로모터로 교체하는 단계가 포함되는 바, 바람직하게는, 상기 강한 프로모터는 상기 원시균 염색체 상의 P _glyA 프로모터이며;
바람직하게는 상기 시작균을 취득하는 것에는 더우기 상기 시작균 중의 PRPP 합성 효소 PrsA의 발현을 향상시키는 단계를 포함하며;
더욱 바람작하게는, 상기 시작균 중의 PrsA의 발현을 향상시키는 것은 하기 E) 또는 F) 방식을 통하여 구현한다.
E) 상기 시작균 중의 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시키며;
F) 상기 시작균 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터을 강한 프로모터로 교체시키는 바, 바람직하게는, 상기 강한 프로모터는 상기 원시균 염색체 상의 P _sod 프로모터인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제13항에 있어서, 상기 시작균을 취득하는 것에는,
dapA 유전자 또는 lysC 유전자의 발현을 향상시키는 단계; 또는
발린 합성 유전자 ilvBNCE의 발현을 향상시키는 단계; 또는
트레오닌 합성 경로 유전자 hom 및 thrB의 발현을 향상시키는 단계; 또는
ocd 유전자의 발현을 향상시키는 단계; 또는
p4hD 전자의 발현을 향상시키는 단계가 포함되는; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법에는 나아가 상기 재조합균 중의 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제 PurH의 발현을 향상시키는 단계를 포함하며;
바람직하게는, 상기 재조합균 중의 PurH의 발현을 향상시키는 것은 하기 G) 또는 H) 방식을 통하여 구현하는 바, 즉
G) 상기 시작균 중의 purH 유전자의 카피 수량을 증가시키며;
F) 상기 시작균 염색체 상의 purH 유전자의 프로모터을 강한 프로모터로 교체시키는 바, 바람직하게는, 상기 강한 프로모터는 상기 원시균 염색체 상의 P _eftu 프로모터인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제15항 또는 제17항에 있어서, 상기 방법에는 나아가 상기 재조합균 중의 아미도포스포리보실 전이효소 PurF의 발현을 약화시키는 단계가 포함되며;
상기 재조합균 중의 PurF의 발현을 약화시키는 것은 약한 프로모터로 purF 유전자의 프로모터를 교체시키는 방식으로 구현하며, 더욱 바람직하게는, 상기 시작균 염색체 상의 purF 유전자의 프로모터를 상기 원시균 중의 염색체 상의 P _hom 프로모터로 교체시키는 것을 통하여 구현하는; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제13항 내지 제18항의 임의 항에 있어서, 상기 시작균을 취득하기 위한 상기 원시균은 코리네박테리움 속, 다이어리스터 속 또는 브레비박테리움 속으로부터 선택되는 한 가지 세균주이며;
바람직하게는, 상기 코리네박테리움 속의 세균은 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium pekinense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium aminogenes, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae 및 Corynebacterium herculis으로부터 선택되는 한 가지 세균주이며;
상기 다이어리스터 속의 세규은 Microbacterium ammoniaphilum으로부터 선택되는 한 가지 세균주이며;
상기 브레비박테리움 속의 세균은 Brevibacteriaceae flvum, Brevibacteriaceae lactofermentum 및 Brevibacteriaceae ammoniagenes으로부터 선택되는 한 가지 세균주인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제19항에 있어서, 상기 원시균은 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC13032인 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제20항에 있어서, 상기 시작균을 취득하는 것에는 하기 단계가 포함되는 바, 즉
상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 각각 서열 7 중의 5’ 말단 제863-1038번 뉴클레오티드가 보여주는 P _glyA 프로모터로 교체하며;
상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 이 발현하는 서열 6이 보여주는 ATP-포스포리보실 전이효소는 서열 6이 보여주는 ATP-포스포리보실 전이효소의 제215번의 아스파라진을 라이신으로 돌연변이시키고, 제231번의 류신이 페닐알라닌으로 돌연변이시키며, 제235번의 트레오닌이 알라닌으로 돌연변이시키며; 바람직하게는, 상기 돌연변이를 진행하기 위한 유전자는 서열 4 중의 제1007-1852번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 hisG ^fbr 유전자이며;
바람직하게는, 상기 시작균을 취득하는 것에는 나아가 하기 단계가 포함되는 바, 즉
상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 염색체 상의 prsA 프로모터를 서열 11 중의 5’ 말단 제656-847번 뉴클레오티드가 보여주는 P _sod 프로모터로 교체하거나;
또는 나아가 하기 단계를 포함하는 바, 즉
상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 중의 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시키고,
상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 중의 hisG ^fbr 유전자의 카피 수량을 증가시키며;
그 중에서, 상기 prsA 유전자는 인코딩 서열 5가 보여주는 PrsA의 유전자에서 선택되며; 코드가 상기 PrsA와 비하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 PrsA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이고, 바람직하게는, 상기 prsA 유전자는 서열표 중의 서열 4가 보여주는 제15-992번 뉴클레오티드 서열인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제21항에 있어서, 상기 pgi 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 14가 보여주는 Pgi의 유전자에서 선택되며; 코드가 상기 Pgi와 비하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 또한 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 활성을 가지는 유전자 중의 하나이고, 바람직하게는, 상기 pgi 유전자는 서열 13이 보여주는 뉴클레오티드 서열이며;
상기 zwf - opcA 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 3이 보여주는 zwf-opcA의 유전자에서 선택되며; 코드가 상기 zwf-opcA와 비하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 zwf-opcA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이고, 바람직하게는, 상기 zwf - opcA 유전자는 서열 2가 보여주는 뉴클레오티드 서열이며;
상기 P _eftu 프로모터는 서열 12가 보여주는 5’ 말단 제635-834번의 뉴클레오티드 서열인; 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제22항에 있어서, 상기 purH 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 16이 보여주는 purH의 유전자에서 선택되며; 코드가 상기 purH와 비하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 purH 활성을 가지는 유전자 중의 하나이고, 상기 purH 유전자는 서열표 중의 서열 15가 보여주는 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
제23항에 있어서, 상기 P _hom 프로모터는 서열 18이 보여주는 5’ 말단 제736-865번의 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법.
L-아미노산을 생산하는 방법에 있어서, 청구항 1 내지 12의 재조합균을 발효 배양하는 단계를 포함하는 바, 상기 L-아미노산은 L-히스티딘, L-라이신, L-발린, L-트레오닌, L-프롤린 또는 L-히드록시프롤린이 바람직한 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 방법.