KR20170010862A

KR20170010862A - 우리딘과 n-아세틸-d-만노사민을 함유하는 배지

Info

Publication number: KR20170010862A
Application number: KR1020167036796A
Authority: KR
Inventors: 미로슬라프 마테브; 켄이치 타카하시; 신지 카키모토; 아야카 코타니
Original assignee: 니홍 케미칼 리써치 가부시키가이샤
Priority date: 2014-05-31
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2035-05-27
Also published as: JP2016005454A; US10273448B2; KR102247994B1; EP3150699A1; CN106459900A; DK3150699T3; EP3150699B1; US10557115B2; EP3150699B2; US20170073633A1; EP3150699A4; WO2015182792A1; US20190352599A1; JP6652334B2; CN106459900B; DK3150699T4

Abstract

세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위한 새로운 배지를 제공하는 것, 및 이러한 배지를 이용하여 세포를 배양함으로써 당단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것. 세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위해 사용하는 배지로서, 우리딘과 N-아세틸-D-만노사민을 함유하는 배지, 및 이러한 배지를 이용하여 당단백질을 코드하는 외래의 DNA에 의해 형질전환된 세포를 배양하여 당단백질을 제조하는 방법.

Description

우리딘과 N-아세틸-D-만노사민을 함유하는 배지{CULTURE MEDIUM CONTAINING URIDINE AND N-ACETYL-D-MANNOSAMINE}

본 발명은, 우리딘과 N-아세틸-D-만노사민을 함유하는 세포 배양용 배지, 및 이러한 배지를 이용하여 당단백질을 코드하는 외래의 DNA에 의해 형질전환된 세포를 배양하는 것을 포함하는 당단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

당단백질에 있어서의 단백질과 당쇄의 결합 양식으로는, 주된 것으로서, 단백질을 구성하는 아스파라긴에 N-아세틸-D-글루코사민이 공유결합된 N-글리코시드 결합(N-글리코시드 결합 당쇄), 및 세린 또는 트레오닌에 N-아세틸-D-갈락토사민이 공유결합된, 또는 히드록실린에 D-갈락토스가 결합된 O-글리코시드 결합(O-글리코시드 결합 당쇄)이 있다.

포유동물 세포 중에 당단백질의 N-글리코시드 결합 당쇄는 단백질이 RNA로부터 번역된 소포체 내강을 거쳐 골지체로 수송되는 과정에서 각종 효소가 관여하는 복잡한 경로를 거쳐 단백질의 아스파라긴 잔기에 부가된다. N-글리코시드 결합 당쇄의 중요한 것은 복합형 당쇄와 고 만노스형 당쇄이다. 복합형 당쇄는 다양한 유형의 것이 있지만, 비환원 말단이 시알산 잔기인 것을 특징으로 한다. 이의 한 예를 하기 구조식 1로 나타낸다.

[식 1]

포유동물 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포)를 이용하여 재조합 당단백질을 제조하는 경우, 이의 단백질의 당쇄 구조의 대부분은 복합형 당쇄가 되므로, 이와 같은 재조합 당단백질의 당쇄의 비환원 말단의 대부분은 시알산 잔기이다. 재조합 당단백질에 비환원 말단이 시알산 잔기인 복합형 당쇄가 부가되면 생체 내에 투여하는 때에 혈중에서의 안정성이 증가하는 것으로 알려져 있다(특허문헌 1). 따라서, 의약으로서 혈액 중에 순환하여 이의 효과를 발휘하는 재조합 당단백질을 제조하는 경우, 이의 혈중 반감기를 장기화시킴으로써 약효 등을 높일 수 있을 것으로 기대되므로, 당쇄의 비환원 말단의 다수가 시알산 잔기가 되는 CHO 세포를 이용한 제조법이 활용되고 있다. 에리트로포이에틴, 난소 자극 호르몬(FSH)이 이의 좋은 예이다(특허문헌 2, 3).

또한, 당 단백질의 당쇄에 의해 많은 시알산 잔기가 부가됨으로써 당단백질의 혈중 반감기를 보다 장기화할 수 있는 것이 기대될 수 있으므로, CHO 세포 등의 포유동물 세포를 이용하여 보다 많은 시알 잔기를 당단백질에 부가하는 것을 목적으로 한 여러 가지 방법이 보고되어 있다. 예를 들면, 당쇄의 말단에 시알산을 부가할 수 있는 시알릴 트랜스퍼라제로 형질전환을 행한 숙주 세포를 이용하여 재조합 당단백질을 제조하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 4). 또한, 당단백질을 코드하는 유전자에 의해 형질전환된 포유동물 세포를 단계적으로 저온에서 배양함으로써 더욱 많은 시알산 잔기가 부가된 재조합 당단백질을 얻을 수 있는 것으로 보고되어 있다(특허문헌 5).

또한, 당단백질의 당쇄에 의해 많은 시알산 잔기를 부가하기 위해 사용되는 세포 배양용 배지에 관한 보고가 몇 가지 존재한다. 예를 들면, 세포를 배양할 때에, 배지에 소정 농도의 부티르산 등의 알칸산 또는 이의 염을 첨가함에 의해 이의 세포가 발현되는 재조합 당단백질에 대한 시알산의 몰비가 조절될 수 있음이 보고되어 있다(특허문헌 6). 또한, 배지에 ManNAc, 아세틸화 ManNAc, 퍼아세틸화 ManNAc 또는 페투인(fetuin) 등의 시알산 전구체를 첨가함에 의해 특정 시알산 부가도를 갖는 재조합 당단백질이 제조될 수 있음이 보고되어 있다(특허문헌 7). 또한, 배지에 단당류를, 예를 들면, 글루코스, 만노스 및 갈락토스의 조합으로 첨가함에 의해 재조합 당단백질의 시알릴화의 레벨을 상승시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다(특허문헌 8).

특개 평 8-027181 공보 특표 2001-525342 공보 WO 2009/127826 특개 평 5-71934 공보 특표 2006-520186 공보 특표 평 11-507523 공보 특표 2007-522179 공보 특표 2001-525342 공보

상기 배경 하에, 본 발명의 목적의 하나는, 당단백질을 코드하는 유전자로 형질전환된 세포를 이용하여 발현된 당단백질의 시알산 함량을 높일 수 있는 소정 농도의 우리딘과 N-아세틸-D-만노사민을 함유하는 세포 배양용 배지를 제공하는 것이다.

상기 목적을 향한 연구에 있어서, 본 발명자들은 에리트로포이에틴을 코드하는 유전자로 형질전환된 포유동물 세포(CHO 세포)를, 우리딘과 N-아세틸-D-만노사민을 함유하는 배지에서 배양함에 의해 고도로 시알산이 부가된 에리트로포이에틴을 얻어지는 것을 발견하여 본 발명을 완성했다. 즉, 본 발명은 이하를 제공한다.

(1) 세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위해 사용하는 배지로서, 0.5 내지 10mM 농도의 우리딘과 1 내지 15mM 농도의 N-아세틸-D-만노사민을 함유하는, 배지.

(2) 상기 (1)에 있어서, 상기 우리딘의 농도가 1 내지 8mM이고, 상기 N-아세틸-D-만노사민의 농도가 4 내지 12mM인, 배지.

(3) 상기 (1)에 있어서, 상기 우리딘의 농도가 2 내지 5mM이고, 상기 N-아세틸-D-만노사민의 농도가 5 내지 10mM인, 배지.

(4) 상기 (1)에 있어서, 상기 우리딘의 농도가 약 3mM이고, 상기 N-아세틸-D-만노사민의 농도가 약 8mM인, 배지.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, L-알라닐-L글루타민을 추가로 함유하는 것인, 배지.

(6) 상기 (5)에 있어서, 상기 L-알라닐-L글루타민의 농도가 0.5 내지 5mM인, 배지.

(7) 상기 (5)에 있어서, 상기 L-알라닐-L글루타민의 농도가 1 내지 3mM인, 배지.

(8) 상기 (5)에 있어서, 상기 L-알라닐-L글루타민의 농도가 약 2mM인, 배지.

(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 혈청을 포함하지 않는 것인, 배지.

(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포, 식물 세포 및 곤충 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 배지.

(11) 상기 (10)에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포인, 배지.

(12) 상기 (11)에 있어서, 상기 포유동물 세포가 CHO 세포인, 배지.

(13) 당단백질을 코드하는 외래의 DNA에 의해 형질전환된 세포를 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 배지에서 배양하는 것을 포함하여 이루어지는, 상기 당단백질의 제조 방법.

(14) 상기 (13)에 있어서, 상기 당단백질을 코드하는 외래의 DNA가 형질전환된 상기 세포에 있어서 당단백질이 발현되도록 발현 벡터에 편입된 것인, 제조 방법.

(15) 상기 (13) 또는 (14)에 있어서, 상기 당단백질을 코드하는 외래의 DNA가 사람 유래의 DNA인, 제조 방법.

(16) 당단백질을 코드하는 외래의 DNA에 의해 형질전환된 포유동물 세포를 상기 (11) 또는 (12)에 기재된 배지에서 배양하는 것을 포함하여 이루어지는, 상기 당단백질의 제조 방법.

(17) 상기 (16)에 있어서, 상기 당단백질을 코드하는 외래의 DNA가 형질전환된 상기 포유동물 세포에 있어서 상기 당단백질이 발현되도록 발현 벡터에 편입된 것인, 제조 방법.

(18) 상기 (17)에 있어서, 상기 당단백질을 코드하는 외래의 DNA가 사람 유래의 DNA인, 제조 방법.

(19) 상기 (16) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유동물 세포가 36 내지 37℃의 온도에서 배양된 후, 30 내지 35℃의 온도에서 배양되는 것인, 제조 방법.

(20) 상기 (16) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유동물 세포가 36 내지 37℃의 온도에서 배양된 후, 31 내지 33℃의 온도에서 배양되는 것인, 제조 방법.

(21) 상기 (16) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유동물 세포가 36 내지 37℃의 온도에서 배양된 후, 약 32℃의 온도에서 배양되는 것인, 제조 방법.

(22) 상기 (13) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 상기 당단백질이 α-갈락토시다제 A, 산성 스핑고미엘리나제, 리소좀 산성 리파제, N-아세틸갈락토사민-4-설파타제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, α-만노시다제, 이두론산 2-설파타제, 글루코세레브로시다제, 갈설파제, α-L-이두로니다제, 시알리다제, 산성 α-글루코시다제 등의 리소좀 효소, 조직 플라스미노겐 액티베이터(t-PA), 혈액 응고 제VII 인자, 혈액 응고 제VIII 인자, 혈액 응고 제IX 인자 등의 혈액 응고 인자, 인터류킨 6 등의 림포카인, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF) 등의 성장 인자, 에리트로포이에틴, 인터페론, 트롬보모듈린, 난포 자극 호르몬, DNaseI, 갑상선 자극 호르몬(TSH), 마우스 항체, 사람화 마우스 항체, 사람·마우스 키메라 항체, 사람 항체, PD-1, PD-1 리간드 및 난포 자극 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법.

(23) 상기 (13) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 상기 당단백질이 에리트로포이에틴인, 제조 방법.

(24) 상기 (13) 내지 (23) 중 어느 하나에 있어서, 상기 당단백질이 당쇄에 시알산을 포함하는 것인, 제조 방법.

(25) 상기 (13) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, 배양 종료 후에 배양물을 회수하고, 이어서, 상기 회수된 배양물로부터 상기 동물 세포를 제거함에 의해 상기 당단백질을 함유하는 배양 상청을 조제하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조 방법.

본 발명에 의하면, 고도로 시알산이 부가된 당단백질을 제조할 수 있다. 고도로 시알산이 부가된 당단백질은, 예를 들면, 의약으로서 사람의 혈액에 투여했을 때에 일반적으로 장기의 혈중 반감기를 나타내므로, 이렇게 제조된 당단백질은 장기 안정성 의약으로서 공급될 수 있다.

(도 1) 도 1은 사람 에리트로포이에틴을 코드하는 DNA를 편입시키는 pCI-neo 벡터를 나타낸다.
(도 2) 도 2는 사람 에리트로포이에틴을 코드하는 DNA를 편입시키는 발현 벡터 pCI-neo(hEPO)를 나타낸다.
(도 3) 도 3은 재조합 사람 에리트로포이에틴 발현용 세포를 각종 배지에서 배양하여 얻은 재조합 사람 에리트로포이에틴에서 차지하는 이소폼(isoform) 1형 내지 3형의 각각의 비율을 나타내는 것이다. 세로축은 이의 비율(%)을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다(n = 4). (1)은 기초 배지에서 배양하여 얻은 것, (2)는 8mM의 N-아세틸-D-만노사민을 첨가한 기초 배지에서 배양하여 얻은 것, (3)은 3mM의 우리딘을 첨가한 기초 배지에서 배양하여 얻은 것, (4)는 8mM의 N-아세틸-D-만노사민 및 3mM의 우리딘을 첨가한 기초 배지에서 배양하여 얻은 것을 각각 나타낸다.
(도 4) 도 4는 재조합 사람 에리트로포이에틴 발현용 세포를 각종 배지에서 배양하여 얻은 재조합 사람 에리트로포이에틴에서 차지하는 이소폼 1형 내지 3형의 비율을 합한 비율을 나타내는 것이다. 세로축은 이의 비율(%)을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다(n = 4). (1)은 기초 배지에서 배양하여 얻은 것, (2)는 8mM의 N-아세틸-D-만노사민을 첨가한 기초 배지에서 배양하여 얻은 것, (3)은 3mM의 우리딘을 첨가한 기초 배지에서 배양하여 얻은 것, (4)는 8mM의 N-아세틸-D-만노사민과 3mM의 우리딘을 첨가한 기초 배지에서 배양하여 얻은 것을 각각 나타낸다.
(도 5) 도 5는 pE-neo 벡터의 구축 방법을 나타내는 흐름도이다.
(도 6) 도 6은 pE-hygr 벡터의 구축 방법을 나타내는 흐름도이다.
(도 7) 도 7은 사람 FSHα 쇄를 코드하는 DNA를 편입시키는 발현 벡터 pE-Neo(FSHα)를 나타낸다.
(도 8) 도 8은 사람 FSHβ 쇄를 코드하는 DNA를 편입시키는 발현 벡터 pE-hygr(FSHβ)을 나타낸다.
(도 9) 도 9는 재조합 사람 FSH 발현용 세포를 기초 배지에서 배양하여 얻은 재조합 사람 FSH의 시알산 함량을 100%로 했을 때의 각종 배지에서 배양하여 얻은 재조합 사람 FSH의 시알산 함량의 상대 값(%)을 나타낸다. (1)은 기초 배지에서 배양하여 얻은 것, (2)는 8mM의 N-아세틸-D-만노사민을 첨가한 기초 배지에서 배양하여 얻은 것, (3)은 3mM의 우리딘을 첨가한 기초 배지에서 배양하여 얻은 것, (4)는 8mM의 N-아세틸-D-만노사민과 3mM의 우리딘을 첨가한 기초 배지에서 배양하여 얻은 것을 각각 나타낸다.

본 발명에 있어서, 「당단백질」이라고 하는 것은 당과 단백질이 공유결합된 한 무리의 물질의 총칭을 말한다. 당과 단백질의 공유결합은 단백질을 구성하는 아스파라긴 잔기에 N-아세틸-D-글루코사민이 공유결합된 N-글리코시드 결합(N-글리코시드 결합 당쇄), 세린 또는 트레오닌 잔기에 N-아세틸-D-갈락토사민이 공유결합된 O-글리코시드 결합(O- 글리코시드 결합 당쇄) 등이 있지만, 본 발명의 당단백질에 있어서의 당과 단백질과 공유결합의 양식에 특별한 한정은 없고, N-글리코시드 결합 당쇄와 O-글리코시드 결합 당쇄 중 어느 한쪽 및 양쪽을 갖는 당단백질도 본 발명의 당단백질에 포함된다.

이와 같은 당단백질로서는 α-갈락토시다제 A, 산성 스핑고미엘리나제, 리소좀 산성 리파제, N-아세틸갈락토사민-4-설파타제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, α-만노시다제, 이두론산 2-설파타제, 글루코세레브로시다제, 갈설파제, α-L-이두로니다제, 시알리다제, 산성 α-글루코시다제 등의 리소좀 효소, 조직 플라스미노겐 액티베이터(t-PA), 혈액 응고 제VII 인자, 혈액 응고 제VIII 인자, 혈액 응고 제IX 인자 등의 혈액 응고 인자, 인터류킨 6 등의 림포카인, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF) 등의 성장 인자, 에리트로포이에틴, 인터페론, 트롬보모듈린, 난포 자극 호르몬, DNaseI, 갑상선 자극 호르몬(TSH) 또는 각종 항체 의약을 포함하는 마우스 항체, 사람화 마우스 항체, 사람·마우스 키메라 항체, 사람 항체, PD-1, PD-1 리간드 및 난포 자극 호르몬 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 당단백질은 바람직하게는 이의 당쇄에 시알산을 함유하는 것이다. 이 때 1분자의 당단백질에 포함된 시알산의 개수의 평균값은 바람직하게는 1개 이상이다.

또한, 본 발명에 있어서, 「당단백질을 코드하는 유전자」 또는 「당단백질을 코드하는 외래의 DNA」라고 하는 것은 이의 유전자 또는 외래의 DNA의 유래에 특별한 한정은 없지만, 바람직하게는 사람, 소, 말 등의 가축 및 개, 고양이 등의 애완동물을 포함하는 포유동물에서 유래한 것이고, 가장 실용적으로는 사람에서 유래한 것이다. 또한, 유전자 또는 외래의 DNA에 코드되는 당단백질의 발현량을 최적화하는 등의 목적으로, 이러한 유전자 또는 외래의 DNA에 변이를 도입한 것도 당단백질을 코드하는 유전자 또는 당단백질을 코드하는 외래의 DNA에 포함된다.

또한, 본 발명에 있어서 「당단백질」이라고 하는 것은 천연형 당단백질뿐만 아니라 천연형 당단백질을 구성하는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입, 부가시킨 천연형 당단백질의 유사물도 포함된다. 또한, 복수의 천연형 당단백질 또는 이의 유사체의 도메인을 연결시킨 키메라 단백질, 천연에 존재하지 않는 단백질 등도 이들이 당과 단백질이 공유결합된 것인 한, 본 발명의 당단백질에 포함된다.

본 발명에 있어서, 「재조합 당단백질」이라고 하는 것은 당단백질을 코드하는 유전자 또는 외래의 DNA를 강하게 발현하고, 이의 발현 상태를 유지하도록 인공적으로 작제한 세포를 이용하여 작성한 당단백질의 것을 말한다. 일반적으로, 강하게 발현하는 유전자 또는 외래의 DNA는 이의 유전자 또는 외래의 DNA가 편입된 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포 등의 숙주 세포를 형질전환시켜 도입한 것이다. 그러나, 이에 한정되지 않고, 강하게 발현되는 유전자는 강하게 발현되도록 인위적으로 수정된 내인성 유전자이어도 좋다. 인위적으로 내인성 유전자를 수정하기 위한 수단에 관한 예로서는 내인성 유전자 자체를 강하게 발현하도록 개변시키는 방법이 있지만, 이 방법에 한정되지 않는다. 예를 들면, 유전자의 강한 발현을 일으키는 프로모터를 내인성 유전자의 상류에 있는 내재성 프로모터로 치환하여 유전자의 강한 발현을 유도할 수도 있다. 이와 같은 방법은 몇 가지 특허문헌(예를 들면, WO94/12650 및 WO95/31560)에 제시되어 있다.

본 발명에 있어서, 당단백질을 코드하는 유전자 또는 외래의 DNA를 발현시키기 위한 발현 벡터로서는 강력한 유전자 발현을 유도하는 유전자 제어 부위, 예를 들면, 사이토메갈로 바이러스(CMV) 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터(SV40 인핸서/프로모터), 신장 인자 1α(EF-1α) 프로모터, 사람 유비퀴틴 C 프로모터 등의 하류에 소망의 단백질을 코드하는 유전자를 편입시킨 것을 사용하는 것이 일반적이다. 내인성 유전자 자체를 강하게 발현하도록 내재성 프로모터로 치환하여 유전자의 강한 발현을 유도하기 위해 이용한 프로모터로서는 예를 들면, 사이토메갈로 바이러스(CMV) 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터(SV40 인핸서/프로모터), 신장 인자 1α(EF-1α) 프로모터, 사람 유비퀴틴 C 프로모터 등이 열거된다.

당단백질을 코드하는 유전자 또는 외래의 DNA를 편입시킨 발현 벡터가 도입된 세포 또는 내인성 프로모터를 치환, 또는 내인성 유전자 자체를 개변시키는 등에 의해 내인성 유전자를 강하게 발현하도록 개변되는 세포로서는 통상 포유동물 세포가 사용되지만, 이 외의 식물 세포, 곤충 세포 또는 효모 등을 사용하는 것도 가능하다. 즉, 본 발명에 있어서, 단순히 「세포」라고 말하는 것은 널리 식물 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 효모 및 이 외의 진핵 세포가 포함되지만, 바람직하게는 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 효모이고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포, 식물 세포 및 곤충 세포이고, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포이다.

포유동물 세포의 사용에 관해서는 목적의 재조합 당체 단백질이 발현될 수 있는 한 특별한 제한은 없고, 생체로부터 취득한 장기, 근육 조직, 피부 조직, 결합 조직, 신경 조직, 혈액, 골수 등으로부터 취득한 세포의 초대 배양 세포, 계대 배양 세포, 및 계대 배양하여도 형질이 안정하도록 주화(株化)된 세포 중 어느 하나이어도 좋다. 또한, 세포는 정상 세포, 암화 세포 중 어느 하나이어도 좋다. 특히 바람직하게 사용할 수 있는 세포는 사람, 마우스 또는 햄스터 유래의 세포, 특히, 차이니즈 햄스터 난소 세포 유래의 CHO 세포, 마우스 골수종에서 유래한 NS/0 세포, 사람의 섬유아세포, 및 아프리카 녹색 원숭이의 신장 섬유아세포에서 유래한 COS 세포이다. CHO 세포를 이용하여 재조합 당단백질을 발현시킨 경우, 통상 N-글리코시드 결합 당쇄를 갖는 당단백질로서 재조합 당단백질이 얻어진다.

본 발명에 있어서, 세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위해 이용한 배지는 기초 배지에 우리딘과 N-아세틸-D-만노사민을 첨가한 것이다. 그러나, 소망에 따라 기초 배지에 우리딘을 첨가하지 않고 N-아세틸-D-만노사민을 첨가한 배지도 본 발명에 있어서의 세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위한 배지로서 사용할 수 있다. 기초 배지로서 사용될 수 있는 배지는, 세포를 배양하여 당단백질을 발현시켜 사용할 수 있는 것인 한 특별한 한정은 없지만, 혈청 배지를 바람직하게 사용할 수 있다.

상기 혈청 배지의 한 예는 아미노산 3 내지 700mg/L, 비타민류를 0.001 내지 50mg/L, 단당류를 0.3 내지 10g/L, 무기 염을 0.1 내지 10000mg/L, 미량 원소를 0.001 내지 0.1mg/L, 뉴클레오티드를 0.1 내지 50mg/L, 지방산을 0.001 내지 10mg/L, 비오틴 0.01 내지 1mg/L, 하이드로코티손을 0.1 내지 20μg/L, 인슐린을 0.1 내지 20mg/L, 비타민 B12를 0.1 내지 10mg/L, 푸트레신를 0.01 내지 1mg/L, 피루브산 나트륨을 10 내지 500mg/L, 및 수용성 철 화합물을 포함하는 것이다. 소망에 따라, 당해 배지에 관용의 pH 지시약 및 항생 물질을 첨가해도 좋고, 티미딘, 히포크산틴 등을 첨가해도 좋다.

무혈청 배지로서, DMEM/F12 배지(DMEM과 F12의 혼합 배지)를 기본 배지로서 사용하여도 좋고, 이 배지는 당업자에게 주지이다. 더욱이, 무혈청 배지로서, 탄산 수소 나트륨, L-글루타민, D-글루코스, 인슐린, 나트륨 세레나이트, 디아미노부탄, 하이드로코티손, 황산 철(II), 아스파라긴, 아스파라긴산, 세린 및 폴리 비닐 알콜로 이루어진 것인, DMEM(HG) HAM 개량형(R5) 배지를 사용하여도 좋다. 또한, 시판의 무혈청 배지, 예를 들면, CD OptiCHO^TM 배지, CHO-S-SFM II 배지 또는 CD CHO 배지(라이프테크놀로지스사), IS CHO-V^TM 배지(Irvine Scientific사), EX-CELL^TM 302 배지 또는 EX- CELL^TM 325-PF 배지(SAFC Biosciences사) 등을 기본 배지로서 사용할 수도 있다.

기초 배지로서 혈청(소 태아 혈청: FBS) 함유 배지를 사용하는 경우, 배지 중의 혈청의 농도는 바람직하게는 5 내지 20%(V/V)이고, 보다 바람직하게는 8 내지 12%(V/V)이다.

본 발명에 있어서, 기초 배지에 첨가되는 우리딘은 이의 염이어도 좋다. 기초 배지에 첨가되는 우리딘의 양은 사용하는 세포, 발현 벡터 및 발현시킬 당단백질의 종류에 따라 적당하게 조정되지만, 기초 배지 중에 있어서의 농도가 바람직하게는 0.5 내지 10mM, 보다 바람직하게는 1 내지 8mM, 더욱 바람직하게는 2 내지 5mM, 더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.5mM, 특히 바람직하게는 3mM이 되도록 첨가된다. 또한, 기초 배지에 첨가되는 N-아세틸-D-만노사민은 이의 염이어도 좋고, 또한, 기초 배지에 첨가되는 N-아세틸-D-만노사민의 양은 사용하는 세포, 발현 벡터 및 발현시킬 당단백질의 종류에 따라 적당하게 조정되지만, 기초 배지 중에 있어서의 농도가 바람직하게는 1 내지 15mM, 보다 바람직하게는 4 내지 12mM, 더욱 바람직하게는 5 내지 10mM, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 8mM, 특히 바람직하게는 8mM이 되도록 첨가된다.

또한, 기초 배지에는 우리딘과 N-아세틸-D-만노사민에 추가하여, L-알라닐-L-글루타민 또는 이의 염을 추가로 첨가해도 좋다. 기초 배지에 첨가되는 L-알라닐-L-글루타민의 양은 사용하는 세포, 발현 벡터 및 발현시킬 당단백질의 종류에 따라 적당하게 조정되지만, 기초 배지 중에 있어서의 농도가 바람직하게는 0.5 내지 5mM, 보다 바람직하게는 1 내지 3mM, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 2.5mM, 특히 바람직하게는 2mM이 되도록 첨가된다.

본 발명에 있어서, 당단백질을 코드하는 유전자 또는 외래의 DNA에 의해 형질전환된 포유동물 세포, 또는 내인성 유전자를 강하게 발현하도록 내재성 프로모터가 치환된 포유동물 세포를 배양하여 당단백질을 발현시킴으로써 재조합 당단백질을 제조하는 경우, 이의 배양 온도는 사용하는 포유동물 세포, 발현 벡터 및 발현시킬 당단백질의 종류에 따라 적당하게 조정되지만, 바람직하게는 30 내지 37℃, 보다 바람직하게는 36 내지 37℃의 온도이다. 또한, 배양 온도는 세포의 배양 기간 중에 일정해도 좋지만, 단계적으로 낮출 수 있다. 배양 기간 중에 배양 온도를 단계적으로 낮출 경우, 배양 온도는, 예를 들면, 배양 개시시에 36 내지 37℃로 설정되고, 이어서, 배양 기간의 도중에 바람직하게는 30 내지 35℃로, 보다 바람직하게는 31 내지 33℃로, 예를 들면 32℃로 낮춘다. 재조합 당단백질은 대체로 세포로부터 배지에 분비되므로, 배양 종료 후에 배양물을 회수하고, 이어서, 상기 회수된 배양물로부터 상기 동물 세포를 제거함으로써 재조합 당단백질을 함유하는 배양 상청을 얻을 수 있다. 이 배양 상청으로부터 컬럼 크로마토그래피 등의 수법에 의해 재조합 당단백질을 정제할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 의도되지 않는다.

〔사람 에리트로포이에틴용 발현 벡터의 구축〕

프라이머 세트, 프라이머 EPO-5'(서열번호 1) 및 프라이머 EPO-3'(서열번호 2)을 이용하여 사람 태아 간장 유래의 cDNA 라이브러리(Clontech사)로부터 PCR로 사람 에리트로포이에틴의 cDNA를 증폭시켰다.

서열번호 1의 서열에 있어서, 뉴클레오티드 3 내지 8은 EcoRI 부위에 대응하고, 뉴클레오티드 9 내지 28은 코드 영역의 최초 20개의 뉴클레오티드에 대응한다.

서열번호 2의 서열에 있어서, 이의 뉴클레오티드 12 내지 17은 BglII 부위에 대응하고, 뉴클레오티드 18 내지 30은 cDNA의 뉴클레오티드 774 내지 762에 대응한다.

PCR 반응은 변성 단계를 95℃에서 1분, 어닐링 단계를 60℃에서 1분, 신장 단계를 72℃에서 2분을 1사이클로 30사이클 실시했다. 증폭된 cDNA를 EcoRI 및 HindIII으로 절단한 후, pBluescript 벡터(pBS: Stratagene사)의 멀티클로닝 사이트의 EcoRI로부터 HindIII 사이트 사이로 서브클로닝했다. 얻어진 벡터를 제한 효소 BglII로 절단한 후, 수식 효소 T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화하고, 계속해서 제한 효소 EcoRI 소화에 의해 사람 에리트로포이에틴 유전자 단편을 취득했다. 얻어진 사람 에리트로포이에틴 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열 및 이를 코드하는 아미노산 서열을 서열번호 3 및 서열번호 4에 각각 나타낸다. 서열번호 3에 있어서, 염기 9 내지 587이 아미노산을 코드하는 영역에 대응하고, 염기 3 내지 8은 EcoRI 절단 부위, 염기 775 내지 780은 BglII 절단 부위에 대응한다. 얻어진 사람 에리트로포이에틴 유전자의 단편을 pCI-neo 벡터(Promega사)(도 1)의 EcoRI 부위와 SmaI 부위 사이에 DNA ligation kit ver. 2(다카라바이오사)를 이용하여 라이게이션하여 얻어진 도 2에 나타낸 재조합 벡터를 사람 에리트로포이에틴용 발현 벡터로서 이용한 pCI-neo(hEPO)로 하였다(도 2).

〔재조합 사람 에리트로포이에틴 발현용 세포의 수립〕

CHO 세포(CHO-K1)를 이화학 연구소에서 입수했다. 1 × 10⁷개의 CHO 세포를 Lipofectamine2000(Invitrogen사)을 이용하여 상기 사람 에리트로포이에틴 발현 벡터 20μg에 의해 관용의 방법으로 형질전환하고, 이어서, 10%의 소 태아 혈청(FBS)과 G418(SIGMA사)을 0.8mg/mL 포함하는 Ham-F12 배지(Invitrogen사)에서 선택 배양하여 네오마이신에 내성인 안정한 형질전환체를 얻었다. 이어서, 세포를 무혈청 배지에 순화시키기 위해 L-글루타민을 4mM, 히포크산틴을 10mg/L, 티미딘을 4mg/L, G418을 120mg/L 첨가한 시판의 혈청 불포함 EX-CELL302^TM 배지(JRH사) 중에 세포를 이동시켜 세포의 증식이 안정해질 때까지 연속적으로 배양하였다. 얻어진 세포를 10%의 FBS와 10%의 DMSO를 포함하는 Ham-F12 배지에 현탁시켜 액체 질소 중에 보존하여 종 세포로 하였다.

〔재조합 사람 에리트로포이에틴 발현용 세포의 배양〕

액체 질소 중에 보존된 상기 종 세포를 37℃ 항온조에서 빠르게 해동시키고, CD OptiCHO^TM 배지(라이프테크놀로지스사)에 2mM GlutaMAX(라이프테크놀로지스사) 및 1XHT 서플리먼트(라이프테크놀로지스사)를 첨가한 배지(기초 배지)에 현탁시킨 후, 원심분리하여 세포를 침전시켜 회수했다. 회수한 세포를 기초 배지에 현탁시켜 세포 현탁액으로 하여, 살아있는 세포 수를 측정했다. 살아있는 세포의 밀도가 2 × 10⁵개/mL가 되도록 세포 현탁액을 기초 배지에 희석하였다. 세포 현탁액을 120mL씩 배양 용기에 분주하여 4군으로 하여, 5% CO₂ 존재 하에 37℃에서 5일간 배양했다. 이 때의 배양은 Bio Jr. 8(100mL × 8 연속 배양 장치, AbleBiott사)을 이용하여 수행하여 배양 기간 동안은 배지의 pH를 6.9로 유지함과 동시에, 배양액 중의 용존 산소 농도(DO)를 40%로 유지했다. 또한, 이 때, 각 군(제1 군 내지 제4 군)에, 표 1에 나타낸 농도의 우리딘과 N-아세틸-D-만노사민을 각각 첨가하였다. 각 군 모두 배양은 4회 실시했다.

〔재조합 사람 에리트로포이에틴의 정제〕

상기 배양의 5일째에 10mL의 배양액을 원심관에 회수하고, 3000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상청을 회수하고, 회수한 배양 상청을 순수로 1.5배로 희석했다. 이어서, 20mM 트리스 완충액(pH 7.5)으로 미리 평형화한 멀티모달 음이온 교환 수지 Capto^TM adhere 컬럼(컬럼 체적: 1mL, GE 헬스케어 바이오사이언스사)에 이 희석된 배양 상청을 7.5mL 부하했다. 컬럼 부피 5배 용적의 20mM 트리스 완충액(pH 7.5)으로 컬럼을 세정한 후, 200mM의 NaCl을 포함하는 20mM 트리스 완충액(pH 7.5)으로 수지에 흡착시킨 재조합 사람 에리트로포이에틴을 용출시켜 용출 분획을 얻었다. 이 용출 분획을 Amicon Ultra-4 원심식 필터 유닛(분획 분자량: 3kDa, 밀리포어사)을 이용하여 액량이 100μL가 될 때까지 농축하였다.

〔재조합 사람 에리트로포이에틴의 분석〕

각 군의 농축액을 모세관 전기영동 시스템(P/ACE^TM 시스템 MDQ, 베크만쿨터사)에 장착된 Bare Fused-Silica Capillary(50μm ID, 375μm OD, 전장 50cm, 베크만쿨터사)를 이용하여 모세관 전기영동하였다. 이 때, 전기영동 버퍼로서 10mM 염화 나트륨, 500mM 아세트산 나트륨, 7M 요소 및 2.5mM 푸트레신을 함유하는 10mM 트리스 완충액(pH 4.5)을 이용하여 24μA의 일정한 전류로 50분간 전기영동을 하였다. 또한, UV 검출기를 이용하여 214nm의 파장을 모니터하고 전기영동된 재조합 사람 에리트로포이에틴을 검출했다.

〔재조합 사람 에리트로포이에틴의 분석 결과〕

상기 모세관 전기영동에서 검출된 등전점의 다른 이소폼의 중에서 가장 등전점이 낮은 이소폼을 1형으로 하고, 등전점이 낮은 순으로 2형, 3형으로 하였다. 검출된 모든 이소폼에서 차지하는 1형, 2형 및 3형의 비율을 산출하고, 각 군에서 비교했다. 각 군에 있어서 1형, 2형 및 3형의 비율을 도 3에 나타낸다. 기초 배지에서 세포를 배양하여 얻은 제1 군의 재조합 사람 에리트로포이에틴은 1형, 2형 및 3형의 비율이 각각 약 0.7%, 약 5% 및 약 15%였다(도 3).

이에 대하여, 기초 배지에 8mM의 N-아세틸-D-만노사민만을 첨가한 배지에서 세포를 배양하여 얻은 제2 군에서는 1형, 2형 및 3형의 비율이 각각 약 1.2%, 약 7% 및 약 20.7%였다(도 3). 재조합 사람 에리트로포이에틴의 이소폼의 등전점은 재조합 사람 에리트로포이에틴 1분자당 부가되는 시알산의 분자수가 증가함에 따라 저하된다. 따라서, 상기의 결과는 기초 배지에 8mM의 N-아세틸-D-만노사민을 첨가하여 얻은 제2 군에서는 재조합 사람 에리트로포이에틴 1분자당 부가되는 시알산의 분자수가 기초 배지에서 얻은 것에 비교하여 증가하는 것을 나타내는 것이다.

이에 대하여, 기초 배지에 3mM의 우리딘만을 첨가한 배지에서 세포를 배양하여 얻은 제3 군의 재조합 사람 에리트로포이에틴은 기초 배지에서 세포를 배양하여 얻은 제1 군의 것과 비교하여 1형, 2형 및 3형의 비율이 각각 약 0.3%, 약 3.5% 및 약 13%로 현저하게 저하되었다(도 3). 이 결과는 기초 배지에 3mM의 우리딘을 첨가하여 얻은 제3 군에서는 재조합 사람 에리트로포이에틴 1분자당 부가되는 시알산의 분자수가 기초 배지에서 얻은 것에 비교하여 감소되는 것을 나타내는 것이다.

또한, 기초 배지에 8mM의 N-아세틸-D-만노사민과 3mM의 우리딘을 첨가한 배지에서 세포를 배양하여 얻은 제4 군에서는 1형, 2형 및 3형의 비율이 각각 약 1.1%, 약 7% 및 약 21.5%였다(도 3). 1형, 2형 및 3형의 비율을 합한 비율을 제4 군과 제2 군에서 비교하면, 제4 군이 제2 군을 상회하고 있고, 8mM의 N-아세틸-D-만노사민을 3mM의 우리딘과 조합하여 배지에 첨가함에 의해 재조합 사람 에리트로포이에틴 1분자당 부가되는 시알산의 분자수를 더욱 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다(도 4). 이와 같은 N-아세틸-D-만노사민과 우리딘의 상승 효과는 3mM의 우리딘만을 배지에 첨가한 제3 군에서는 재조합 사람 에리트로포이에틴 1분자당 부가되는 시알산의 분자수가 기초 배지에서 얻은 것에 비교하여 감소한 것을 고려하면 놀라운 일이다.

〔기타 검토〕

상기의 분석 결과로부터, 배지에 8mM의 N-아세틸-D-만노사민을 첨가하여 또는 배지에 8mM의 N-아세틸-D-만노사민과 3mM의 우리딘을 첨가하여 재조합 사람 에리트로포이에틴 유전자를 도입한 세포를 배양함으로써 재조합 사람 에리트로포이에틴 1분자당 부가되는 시알산의 분자수를 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다. 재조합 사람 에리트로포이에틴 1분자당 부가되는 시알산의 분자수는 이러한 배지를 이용하여 세포를 배양하는 방법과 다른 방법, 예를 들면, 세포의 배양 기간 중에 배양 온도를 단계적으로 낮추는 등의 방법과 조합함으로써 더욱 증가시킬 수 있는 것으로 생각된다.

〔사람 FSH 발현용 벡터의 구축〕

pEF/myc/nuc 벡터(인비트로젠사)를 KpnI과 NcoI로 소화시키고, EF-1α 프로모터 및 이의 제1 인트론을 포함하는 영역을 잘라내어 T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화 처리했다. pCI-neo 벡터(인비트로젠사)를 BglII 및 EcoRI로 소화하여 CMV의 인핸서/프로모터 및 인트론을 포함하는 영역을 절제한 후에, T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화 처리했다. 이에 상기의 EF-1α 프로모터 및 이의 제1 인트론을 포함하는 영역을 삽입하여 pE-neo 벡터를 구축하였다(도 5).

pE-neo 벡터를 SfiI 및 BstXI로 소화시키고, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 약 1kbp의 영역을 절제하였다(도 6). pcDNA3.1/Hygro(+) 벡터(인비트로젠사)를 주형으로 하여 프라이머 Hyg-Sfi(서열번호 5) 및 프라이머 Hyg-BstX(서열번호 6)를 사용하여 PCR 반응에 의해 하이그로마이신 유전자를 증폭시켰다(도 6). 증폭된 하이그로마이신 유전자를 SfiI 및 BstXI 소화하고, 상기의 pE-neo 벡터에 삽입하여 pE-hygr 벡터를 구축하였다(도 6).

사람 태반 cDNA 라이브러리(다카라바이오)를 주형으로 하여 프라이머 HCG-A-F(서열번호 7) 및 프라이머 HCG-A-R(서열번호 8)을 이용하여 1차 PCR 반응을 실시했다. 또한, 얻어진 PCR 산물을 주형으로 1차 반응 프라이머 HCG-A-F보다 약간 3'측 하류 위치의 서열을 갖는 프라이머 HCGA-ORF-F(서열번호 9) 및 1차 반응 프라이머 HCG-A-R보다 약간 5'측 상류 위치의 서열을 갖는 프라이머 HCGA-ORF-R(서열번호 10)을 이용하여 2차 PCR 반응을 실시하여 사람 FSHα 쇄의 cDNA를 증폭시켰다. 또한, 마찬가지로 사람 뇌하수체 cDNA 라이브러리(다카라바이오)를 주형으로 하여 1차 프라이머 FSH-F(서열번호 11) 및 프라이머 FSH-R(서열번호 12)과 2차 프라이머 FSH-F2(서열번호 13) 및 프라이머 FSH-R2(서열번호 14)를 사용하여 PCR 반응에 의해 사람 FSH β 쇄의 cDNA를 증폭시켰다.

사람 FSHα 쇄의 1차 PCR 반응은 사람 태반 cDNA 라이브러리 100ng을 주형으로, (95℃/10초, 55℃/10초, 72℃/10초)를 1사이클로 하여 40사이클을 행하였다. 2차 PCR 반응은 1차 PCR 반응의 반응액 1μL를 주형으로, (95℃/10초, 60℃/10초, 72℃/10초)를 1사이클로 하여 30사이클 반응시켰다. 또한, 사람 FSHβ 쇄의 1차 PCR 반응은 사람 뇌하수체 cDNA 라이브러리 10ng를 주형으로, (98℃/2초, 60℃/10초, 72℃/10초)를 1사이클로 하여 40사이클 반응시켰다. 2차 PCR 반응은 1차 PCR 반응의 반응액 1μL를 주형으로, (98℃/2초, 60℃/10초, 72℃/10초)를 1사이클로 30사이클 반응시켰다.

증폭된 사람 FSHα 쇄 cDNA를 EcoRI로 절단한 후, EcoRI로 소화시킨 pBluescriptIISK(-)(pBS: Stratagene사)의 EcoRI 사이트에 삽입했다. 얻어진 플라스미드 DNA를 XbaI와 EcoRV로 소화시키고, 사람 FSHα 쇄 cDNA를 잘라내어 이것을 XbaI과 SmaI로 소화시킨 pE-neo 벡터에 삽입하고, 사람 FSHα 쇄 발현용 벡터 pE-neo(FSHα)로 하였다(도 7).

증폭시킨 사람 FSHβ 쇄 cDNA를 EcoRI 및 NotI으로 절단한 후, EcoRI와 NotI로 소화된 pBluescriptIISK(-)에 삽입했다. 얻어진 플라스미드 DNA를 EcoRI로 소화시키고, T4 DNA 폴리머라제에 의한 평활 말단화 처리를 한 후에, NotI로 소화시키고, 사람 FSHβ 쇄 cDNA를 잘라내었다. pE-hygr 벡터를 XbaI로 소화시키고, T4 DNA 폴리머라제에 의한 평활 말단화 처리를 한 후에 NotI로 소화시켰다. 이 pE-hygr 벡터에 사람 FSHβ 쇄 cDNA를 삽입하고 사람 FSHβ 쇄 발현용 벡터 pE-hygr(FSHβ)로 하였다(도 8).

〔재조합 사람 FSH 발현용 세포의 작성〕

CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection에서 구입)에, Lipofectamine2000(Invitrogen사)을 이용하여 상기 발현용 벡터 pE-neo(FSHα) 및 pE-hygr(FSHβ)을 하기의 방법으로 트랜스펙트하였다. 즉, 미리 트랜스펙션 전날에 컨플루언트(confluent)에 가까운 세포 밀도가 되도록 3.5cm 배양 접시에 CHO-K1 세포를 파종하여 하룻밤 5% 탄산 가스 통기 하에 37℃에서 배양하였다. 다음날, 세포를 PBS(-)로 2회 세정한 후, 1mL의 혈청을 포함하지 않는 D-MEM/F12 배지(인비트로젠사)를 배양 접시에 첨가하였다. 이어서, 배양 접시에 Opti-MEM I 배지(인비트로젠사)에 20배로 희석한 Lipofectamine2000 용액과 13.2μg/mL의 pE-neo(FSHα)와 6.6μg/mL의 pE-hygr(FSHβ)을 함유하는 플라스미드 DNA 용액의 등량 혼합액을 200μL 첨가하고, 37℃에서 5시간 트랜스펙션했다.

트랜스펙션 후, 배지를 5% FCS를 포함하는 D-MEM/F12(D-MEM/F12/5% FCS) 배지로 교환하고 5% 탄산 가스 통기 하에 37℃에서 2일간 세포를 배양하였다. 그 후, 0.6mg/ml G418 및 0.4mg/ml 하이그로마이신 B를 포함하는 배지(D-MEM/F12/5% FCS 배지)로 교환하고 5% 탄산 가스 통기 하에 37℃에서 선택 배양을 행하였다. 선택 배지 중에서 증식하는 세포를 몇 대 계대하였다.

이어서, 한계 희석법으로 96웰 플레이트에 1웰당 1개 이하의 세포가 파종되는 조건으로 세포를 파종하여 10일 정도 배양하여 단일 콜로니를 형성시켰다. 단일 콜로니를 형성한 웰의 배양 상청을 채취하여 ELISA로 사람 FSH 발현량을 조사하여 사람 FSH의 고발현주를 선택했다.

선택한 세포주를 무혈청 부유 세포에 순화시키기 위해, L-글루타민을 4mM, 히포크산틴을 10mg/L, 티미딘을 4mg/L, G418을 120mg/L, 하이그로마이신 B를 80mg/L 첨가한 시판의 혈청 배지 EX-CELL302 배지(JRH사)에서 세포의 증식이 안정될 때까지 계대 배양을 행하였다. 또한, 배지를 ISCHO-V-GS 배지로 전환하여 세포의 증식 속도가 안정될 때까지 배양을 계속하고, 이를 10%의 FCS 및 10%의 DMSO를 첨가한 IS CHO-V-GS 배지에 현탁시켜 액체 질소 중에 보존하여 종 세포로 하였다.

〔재조합 사람 FSH 발현용 세포의 배양〕

액체 질소 중에 보존된 상기 종 세포를 37℃ 항온조에서 빠르게 해동시키고, CD OptiCHO^TM 배지(라이프테크놀로지스사)에 2mM GlutaMAX(라이프테크놀로지스사) 및 1XHT 서플리먼트(라이프테크놀로지스사)를 첨가한 배지(기초 배지)에 현탁시킨 후, 원심분리하여 세포를 침전시켜 회수했다. 회수된 세포를 기초 배지에 현탁시켜 세포 현탁액으로 하여 살아있는 세포수를 측정했다. 살아있는 세포의 밀도가 2 × 10⁵개/mL가 되도록 세포 현탁액을 기초 배지에 희석하였다. 세포 현탁액을 120mL씩 배양 용기에 분주하여 4군으로 하고, 5% CO₂ 존재 하에 37℃에서 5일간 배양했다. 이 때의 배양은 Bio Jr. 8(100mL × 8 연속 배양 장치, AbleBiott사)을 이용하여 수행하고, 배양 기간 동안은 배지의 pH를 6.9로 유지함과 동시에, 배양액 중의 용존 산소 농도(DO)를 40%로 유지하였다. 또한, 이 때, 각 군(제1 내지 4군)에 표 2에 나타낸 농도의 우리딘과 N-아세틸-D-만노사민을 각각 첨가하였다. 각 군 모두 배양은 2회 실시했다.

〔재조합 사람 FSH의 정제〕

상기 배양의 5일째에, 10mL의 배양액을 원심관에 회수하고, 3000rpm에서 10 분간 원심분리한 후 상청을 회수했다. 이어서, PBS(pH 7.4)로 미리 평형화한 FSH 친화성 수지 CaptureSelect^TM FSH(컬럼 체적, 1mL; 라이프테크놀로지스)에 배양 상청을 20mL 부하했다. 컬럼 체적 5배 용적의 PBS(pH 7.4)로 컬럼을 세정한 후, 2M의 MgCl₂를 포함하는 20mM 트리스 완충액(pH 7.4)으로 수지에 흡착된 재조합 사람 FSH를 용출시켜 용출 분획을 얻었다. 이 용출 분획을 Amicon Ultra-4 원심식 필터 유닛(분획 분자량: 3kDa)을 이용하여 물로 희석/농축을 실시했다. 최종적으로 액량이 100μL가 될 때까지 농축하고, 각 군(1 내지 4군)의 각각에 대해 정제 재조합 사람 FSH 농축액을 얻었다. 정제 재조합 사람 FSH 농축액의 재조합 사람 FSH의 농도를 1mg/mL로 조정했다.

〔시알산 함량 측정〕

각 군의 정제 재조합 사람 FSH 농축액(50μL)을 37℃에서 30분 동안 0.3M 수산화 나트륨 알칼리 처리하고, 이어서, 80℃에서 60분 동안 0.05M 염산으로 처리함에 의해, 재조합 사람 FSH를 구성하는 당쇄를 단당으로까지 분해했다. 이어서, 형광 시약(9.6mM 1,2-디아미노-4,5-메틸렌디옥시벤젠, 24mM 하이드로설파이트나트륨 및 1M 2-메르캅토에탄올을 포함하는 수용액)을 첨가하여 50℃에서 150분간 가열하고, 가수분해하여 얻은 당을 형광 라벨하고, 이의 반응 용액을 샘플 용액으로 하였다. 이 때, 표준품으로서 시알산을 동일하게 처리하고, 형광 라벨된 시알산의 표준품을 얻었다. 이 표준품을 역상 컬럼으로서 COSMOSIL 5C₁₈-PAQ를 이용하여 HPLC 분석하고, 시알산의 피크가 얻어진 용출 시간을 측정했다. 이어서, 샘플 용액을 HPLC 분석하고, 시알산에 대응하는 피크 면적을 구했다.

기초 배지에서 세포를 배양한 제1 군에서 얻은 피크 면적을 100%로 하여, 제2 군 내지 제3 군의 피크 면적의 상대값(%)을 구하였다(도 9). 그 결과, 기초 배지에 8mM의 N-아세틸-D-만노사민을 첨가한 배지에서 세포를 배양한 제2 군에서는 피크 면적은 거의 100%였다. 한편, 3mM의 우리딘을 첨가한 배지에서 세포를 배양한 제3 군에서는 피크 면적은 약 112%가 되고, 기초 배지에서 세포를 배양하여 얻은 재조합 사람 FSH와 비교하여 3mM의 우리딘을 첨가한 배지에서 세포를 배양하여 얻은 재조합 사람 FSH에서는 1분자 중에 포함되는 시알산의 평균 분자수가 거의 10% 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 기초 배지에 8mM의 N-아세틸-D-만노사민과 3mM의 우리딘을 첨가한 배지에서 세포를 배양한 제3 군에서는 피크 면적은 약 121%가 되고, 기초 배지에서 세포를 배양하여 얻은 재조합 사람 FSH와 비교하여 8mM의 N-아세틸-D-만노사민과 3mM의 우리딘을 첨가한 배지에서 세포를 배양하여 얻은 재조합 사람 FSH에서는 1분자 중에 포함되는 시알산의 평균 분자수가 거의 20% 증가하는 것으로 나타났다.

재조합 사람 에리트로포이에틴의 경우, 3mM의 우리딘만을 배지에 첨가한 제3 군에서는 재조합 사람 에리트로포이에틴 1분자당 부가되는 시알산의 분자수가 기초 배지에서 배양하여 얻은 것에 비교하여 감소했지만, 재조합 사람 FSH의 경우, 3mM의 우리딘만을 배지에 첨가한 제3 군에서는 기초 배지에서 얻은 것에 비교하여 재조합 사람 FSH 1분자당 부가되는 시알산의 분자수는 증가했다. 이의 한편으로, 8mM의 N-아세틸-D-만노사민만을 배지에 첨가한 제2 군에서는 재조합 사람 FSH 1분자당 부가되는 시알산의 분자수는 기초 배지에서 배양하여 얻은 것과 동등했다.

그러나, 8mM의 N-아세틸-D-만노사민과 3mM의 우리딘을 포함하는 배지에서 세포를 배양하여 얻은 재조합 사람 에리트로포이에틴과 재조합 사람 FSH는 모두 기초 배지에서 얻은 것에 비교하여 시알산 함량이 많은 이 2가지 성분을 배지에 첨가한 배지에서 세포를 배양하여 재조합 당단백질을 제조함에 의해서 재조합 당단백질의 종류에 관계없이 1분자당에 부가되는 시알산의 분자수를 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.

〔기타 검토〕

상기의 분석 결과로부터, 배지에 8mM의 N-아세틸-D-만노사민과 3mM의 우리딘을 첨가하여 소망의 당단백질을 코드하는 유전자 또는 외래의 DNA를 도입한 세포를 배양함에 의해 재조합 당단백질 1분자당 부가되는 시알산의 분자수를 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. 재조합 당단백질 1분자당 부가되는 시알산의 분자수는 이러한 배지를 이용하여 세포를 배양하는 방법과 다른 방법, 예를 들면, 세포의 배양 기간 동안에 배양 온도를 단계적으로 낮추는 등의 방법과 조합함으로써 더욱 증가시킬 수 있는 것으로 생각된다.

산업상의 이용 가능성

본 발명에 의하면, 당단백질을 활성 성분으로 하여 포함하는 생체 내에 투여했을 때에 장기의 혈중 반감기를 나타내는 장기 안정성 의약을 제공할 수 있다.

서열목록 프리텍스트

서열번호 1: 프라이머 EPO-5', 합성 서열

서열번호 2: 프라이머 EPO-3', 합성 서열

서열번호 3: 프라이머 EPO-5'과 프라이머 EPO-3'을 이용하여 증폭시킨 PCR 산물

서열번호 5: 프라이머 Hyg-Sfi, 합성 서열

서열번호 6: 프라이머 Hyg-BstX, 합성 서열

서열번호 7: 프라이머 HCG-A-F, 합성 서열

서열번호 8: 프라이머 HCG-A-R, 합성 서열

서열번호 9: 프라이머 HCGA-ORF-F, 합성 서열

서열번호 10: 프라이머 HCGA-ORF-R, 합성 서열

서열번호 11: 프라이머 FSH-F, 합성 서열

서열번호 12: 프라이머 FSH-R, 합성 서열

서열번호 13: 프라이머 FSH-F2, 합성 서열

서열번호 14: 프라이머 FSH-R2, 합성 서열

서열목록

1195P

SEQUENCE LISTING <110> JCR PHARMACEUTICALS CO., LTD. <120> CULTURE MEDIUM CONTAINING URIDINE AND N-ACETYL-D-MANNOSAMINE <130> 1195P <150> JP 2014-124742 <151> 2014-05-31 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EPO-5', synthetic sequence <400> 1 ccgaattcat gggggtgcac gaatgtcc 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EPO-3', synthetic sequence <400> 2 tcaagcttct tagatctcag agttgctctc 30 <210> 3 <211> 791 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR product amplified by Primer EPO-5' and Primer EPO-3' <400> 3 ccgaattcat gggggtgcac gaatgtcctg cctggctgtg gcttctcctg tccctgctgt 60 cgctccctct gggcctccca gtcctgggcg ccccaccacg cctcatctgt gacagccgag 120 tcctggagag gtacctcttg gaggccaagg aggccgagaa tatcacgacg ggctgtgctg 180 aacactgcag cttgaatgag aatatcactg tcccagacac caaagttaat ttctatgcct 240 ggaagaggat ggaggtcggg cagcaggccg tagaagtctg gcagggcctg gccctgctgt 300 cggaagctgt cctgcggggc caggccctgt tggtcaactc ttcccagccg tgggagcccc 360 tgcagctgca tgtggataaa gccgtcagtg gccttcgcag cctcaccact ctgcttcggg 420 ctctgggagc ccagaaggaa gccatctccc ctccagatgc ggcctcagct gctccactcc 480 gaacaatcac tgctgacact ttccgcaaac tcttccgagt ctactccaat ttcctccggg 540 gaaagctgaa gctgtacaca ggggaggcct gcaggacagg ggacagatga ccaggtgtgt 600 ccacctgggc atatccacca cctccctcac caacattgct tgtgccacac cctcccccgc 660 cactcctgaa ccccgtcgag gggctctcag ctcagcgcca gcctgtccca tggacactcc 720 agtgccagca atgacatctc aggggccaga ggaactgtcc agagagcaac tctgagatct 780 aagaagcttg a 791 <210> 4 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Ser Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-Sfi, synthetic sequence <400> 5 gaggccgcct cggcctctga 20 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-BstX, synthetic sequence <400> 6 aaccatcgtg atgggtgcta ttcctttgc 29 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer HCG-A-F, synthetic sequence <400> 7 atcctgcaaa aagcccagag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer HCG-A-R, synthetic sequence <400> 8 cttgaagcgt gtcaaagtgg 20 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer HCGA-ORF-F, synthetic sequence <400> 9 gcgaattcgc caccatggat tactacagaa 30 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer HCGA-ORF-R, synthetic sequence <400> 10 gcgaattctt aagatttgtg ataat 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FSH-F, synthetic sequence <400> 11 gaccacaggt gagtcttggc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FSH-R, synthetic sequence <400> 12 tggtccttca ggacaagggt 20 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FSH-F2, synthetic sequence <400> 13 gcgaattcgc caccatgaag acactccagt 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FSH-R2, synthetic sequence <400> 14 taagaatgcg gccgcccact gatctttatt 30

Claims

세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위해 사용하는 배지로서, 0.5 내지 10mM 농도의 우리딘과 1 내지 15mM 농도의 N-아세틸-D-만노사민을 함유하는, 배지.
제1항에 있어서, 상기 우리딘의 농도가 1 내지 8mM이고, 상기 N-아세틸-D-만노사민의 농도가 4 내지 12mM인, 배지.
제1항에 있어서, 상기 우리딘의 농도가 2 내지 5mM이고, 상기 N-아세틸-D-만노사민의 농도가 5 내지 10mM인, 배지.
제1항에 있어서, 상기 우리딘의 농도가 약 3mM이고, 상기 N-아세틸-D-만노사민의 농도가 약 8mM인, 배지.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L-알라닐-L글루타민을 추가로 함유하는 것인, 배지.
제5항에 있어서, 상기 L-알라닐-L글루타민의 농도가 0.5 내지 5mM인, 배지.
제5항에 있어서, 상기 L-알라닐-L글루타민의 농도가 1 내지 3mM인, 배지.
제5항에 있어서, 상기 L-알라닐-L글루타민의 농도가 약 2mM인, 배지.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청을 포함하지 않는 것인, 배지.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포, 식물 세포 및 곤충 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 배지.
제10항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포인, 배지.
제11항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 CHO 세포인, 배지.
당단백질을 코드하는 외래의 DNA에 의해 형질전환된 세포, 또는 내인성 유전자를 강하게 발현하도록 개변된 세포를 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 배지에서 배양하는 것을 포함하여 이루어지는, 상기 당단백질의 제조 방법.
제13항에 있어서, 상기 당단백질을 코드하는 외래의 DNA가 형질전환된 상기 세포에 있어서 당단백질이 발현되도록 발현 벡터에 편입된 것인, 제조 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 당단백질을 코드하는 외래의 DNA가 사람 유래의 DNA인, 제조 방법.
당단백질을 코드하는 외래의 DNA에 의해 형질전환된 포유동물 세포, 또는 내인성 유전자를 강하게 발현하도록 개변된 세포를 제11항 또는 제12항에 기재된 배지에서 배양하는 것을 포함하여 이루어지는, 상기 당단백질의 제조 방법.
제16항에 있어서, 상기 당단백질을 코드하는 외래의 DNA가 형질전환된 상기 포유동물 세포에 있어서 상기 당단백질이 발현되도록 발현 벡터에 편입된 것인, 제조 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 당단백질을 코드하는 외래의 DNA가 사람 유래의 DNA인, 제조 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 36 내지 37℃의 온도에서 배양된 후, 30 내지 35℃의 온도에서 배양되는 것인, 제조 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 36 내지 37℃의 온도에서 배양된 후, 31 내지 33℃의 온도에서 배양되는 것인, 제조 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 36 내지 37℃의 온도에서 배양된 후, 약 32℃의 온도에서 배양되는 것인, 제조 방법.
제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당단백질이 α-갈락토시다제 A, 산성 스핑고미엘리나제, 리소좀 산성 리파제, N-아세틸갈락토사민-4-설파타제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, α-만노시다제, 이두론산 2-설파타제, 글루코세레브로시다제, 갈설파제, α-L-이두로니다제, 시알리다제, 산성 α-글루코시다제 등의 리소좀 효소, 조직 플라스미노겐 액티베이터(t-PA), 혈액 응고 제VII 인자, 혈액 응고 제VIII 인자, 혈액 응고 제IX 인자 등의 혈액 응고 인자, 인터류킨 6 등의 림포카인, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF) 등의 성장 인자, 에리트로포이에틴, 인터페론, 트롬보모듈린, 난포 자극 호르몬, DNaseI, 갑상선 자극 호르몬(TSH), 마우스 항체, 사람화 마우스 항체, 사람·마우스 키메라 항체, 사람 항체, PD-1, PD-1 리간드 및 난포 자극 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법.
제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당단백질이 에리트로포이에틴 또는 난포 자극 호르몬인, 제조 방법.
제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당단백질이 당쇄에 시알산을 포함하는 것인, 제조 방법.
제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 종료 후에 배양물을 회수하고, 이어서, 상기 회수된 배양물로부터 상기 동물 세포를 제거함에 의해 상기 당단백질을 함유하는 배양 상청을 조제하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조 방법.