KR20170020527A - 배양된 포유동물 윤부 줄기세포, 이를 생성하는 방법, 및 이의 용도 - Google Patents

배양된 포유동물 윤부 줄기세포, 이를 생성하는 방법, 및 이의 용도 Download PDF

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루이 호우
후이민 카이
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Abstract

본 발명은 염색체 내로 통합되거나, 또는 대안적으로, 통합되지 않고 염색체외 유전적 물질로 잔존하는 PAX6을 인코딩하는 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산을 포함하는 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC) 집단 또는 LSC-유사 집단 및 이의 용도를 제공하고, 여기서 분리된 LSC 집단은 비-LSC 세포가 실질적으로 없거나, 또는 LSC-유사 집단은 비-LSC-유사 세포가 실질적으로 없거나, 또는 분리된 LSC 또는 LSC-유사 집단은 비-LSC 및 비-LSC-유사 세포가 실질적으로 없다.

Description

배양된 포유동물 윤부 줄기세포, 이를 생성하는 방법, 및 이의 용도{CULTURED MAMMALIAN LIMBAL STEM CELLS, METHODS FOR GENERATING THE SAME, AND USES THEREOF}
본 출원은, 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 2014년 6월 27일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/018,396호의 우선권 이익을 주장한다.
본 출원 전체에서 다양한 공개물이 참조된다. 이들 공개물의 개시는 이 발명이 속하는 기술 분야의 수준을 더욱 상세히 기술하기 위해 이에 본 출원 내에 참조로서 그 전체가 포함된다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 안과적 장애, 질환 및 손상을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 분야는 각막 및 안구 표면의 장애, 질환, 결함 및 손상을 치료하기 위한 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 개시는 각막 윤부 조직으로부터 유래한 배양된 포유동물 윤부 줄기세포 (limbal stem cell)의 제조에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 윤부 줄기 세포주는 자가-재생 (self-renewing)이고 각막 상피 조직으로 분화하는 능력을 갖는다. 윤부 줄기 세포주를 배양하는 방법 및 이의 사용 방법 및 조성물이 또한 기술된다.
성체 줄기세포가 눈의 각공막 윤부 (corneoscleral limbus)에 존재하는 것으로 알려져 있다. 이들 세포는 각막 표면의 동적 평형 (dynamic equilibrium)에 참여하고 눈-깜빡임 동안에 떨어지고 벗겨져 나가는 표재의 (superficial) 상피세포를 대체한다. 화학적 또는 열적 화상, 콘텍트 렌즈, 중증의 미생물 감염, 다중 외과적 과정, 냉동요법 (cryotherapy), 또는 스티븐-존슨 증후군 (Steven-Johnson syndrome) 또는 안구 반흔성 유사천포창 (ocular cicatrical pemphigoid)과 같은 질환으로부터의 윤부 줄기세포의 심각한 손상은 비정상적 각막 표면, 광선공포증 및 시력 감소를 초래할 수 있는 윤부 줄기세포의 파괴 및 윤부 줄기세포 결핍을 초래할 수 있다 (Anderson et al., (2001) Br. J. Opthalmol. 85: 567-575). 이 손상은 윤부 줄기세포 공급원의 재-도입 없이는 복구될 수 없다 (Tseng et al., (1998) Arch. Opthalmol. 116: 431-41; Tsai et al., (2000) N. Engl. J. Med. 343: 86-93; Henderson et al., (2001) Br. J. Opthalmol. 85: 604-609). 따라서, 높은 증식능을 갖는 윤부 줄기세포는 각막 표면의 평형을 유지하는데 필수적인 각막 상피세포의 연속적인 공급을 제공하기 때문에, 이들은 생육가능 (viable) 안구 표면의 유지에 명백히 결정적이다 (Tseng, (1996) Mol. Biol. Rep. 23: 47-58).
여러 접근법이 각막 표면 손상 후 정상 시력을 복구하기 위해 시도되었으나, 이들 접근법은 일반적으로 윤부 줄기세포의 손실과 관련되거나 그로부터 초래된 손상을 복구하기에 충분하지 않았다. 하나의 통상적인 접근법은 개체의 눈의 표면 위에 직접적으로 양막 (amniotic membrane)을 이식함으로써 손상된 각막 표면을 복구하는 것이다 (Anderson et al., (2001) Br J. Opthalmol. 85: 567-575). 양막 이식은 상피화 (epithelization)를 촉진하고, 정상적 상피 표현형을 유지하며, 염증을 감소시키고, 흉터형성을 축소시키며, 조직의 부착을 감소시키고, 눈에서 혈관신생을 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나, 양막 이식은 종종 환자의 출발 시점과 그리 다르지 않은 최종 결과로, 균일하게 성공적이지 않다는 단점을 갖는다 (Prabhasawat et al., (1997) Arch. Ophthalmol 115: 1360-67). 인간 양막 상피세포를 분리하고 이들을 각막 표면 상피로 분화시키는 방법이 또한 Hu 등 (WO 00/73421)에 의해 기술된다.
각막 손상을 치료하는 다른 접근법은 각막 이식을 포함한다 (Lindstrom, (1986) N. Engl. J. Med. 315: 57-59). 윤부 줄기세포 결핍을 치료하는 또 다른 접근법은 공여자 눈으로부터의 윤부 이식편을 수용자 눈 내로 이식하는 것이다.
살아있는 공여자로부터 거대 윤부 생검을 분리하는 결점을 감안하여, 건강한 눈으로부터 윤부 상피의 단지 작은 생검의 제거에만 의존하는 윤부 줄기세포 결핍을 치료하기 위한 다른 방법이 개발되었다 (Pellegrini et al., (1997) Lancet 349:990-993), (Koizumi et al., (2000) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41: 2506-2513; Koizumi et al., (2000) Cornea 19: 65-71; Dua et al., (2000) Surv. Ophthalmol. 44: 415-425; Jun Shimazaki et al., (2002) Opthalmol. 109: 1285-1290). 양막을 이용하는 또 다른 접근법이 미국특허공개 제20030208266호에 개시되어 있는데, 이는 생체 외 배양된 상피 줄기세포를 특이적으로 처리된 양막 위에 이식하는 것을 기술하고 있다.
이식편 제조를 위한 다른 접근법이 EP 특허 제0572364호에 개시되어 있는데, 이는 생검이 눈의 윤부 및/또는 윤부경유 영역 (perlimbus area), 또는 눈의 포린스 (forrinx) 및/또는 결막 영역으로부터 유래하는, 인간 눈 표면 상피의 생검을 시험관 내 성장시키는 방법을 기술하고 있다. 또 다른 특허출원, WO 03/030959는 윤부 줄기세포의 배양을 위한 변형된 표면을 갖는 콘텍트 렌즈를 사용하는 각막 병소를 치료하기 위한 각막 복구 장치를 기술한다.
유사하게, 미국특허공개 제20020039788호는 손상되거나 이환된 각막 상피 표면의 치료를 위한 생체공학적 복합체 (bioengineered composite) 이식편을 기술하고 있으며, 이 복합체 이식편은 분화된 상피세포의 다층 상피를 포함한다. 미국특허 제6,610,538호는 안구 손상을 갖는 환자를 위한 이식편으로 사용하기 위해 윤부 줄기세포의 배양으로부터 인간 상피 각막 (comeae)의 박층 (laminae)을 시험관 내 재구성하는 방법을 기술한다. WO 03/093457는 또한, 둘 모두 분화 클러스터 (differentiation cluster: CD)에 속하는, 막 단백질 마커 CD34 또는 CD133을 발현하는 줄기세포를 선별함으로써 각막 조직으로부터 줄기세포를 동정 및 분리하는 방법을 기술한다.
임의의 윤부 세포 이식의 안정성 및 성공은 안구 표면을 재증식하기 (repopulating) 위한 생육가능 윤부 줄기세포를 지속적으로 재생하는 이의 능력에 좌우된다. 현재 윤부 줄기세포 결핍을 치료하는데 사용되는 이식물 (transplant) 또는 이식편 (graft)은 일반적으로 윤부 줄기세포보다 더 높은 백분율의 분화된 각막 상피세포를 함유하는데, 이는 단지 제한된 양으로만 존재할 수 있다. 이러한 이식물 또는 이식편에서 공여자 상피는 일반적으로 윤부 줄기세포의 제한적인 공급으로 인해 단기간 동안에만 생존할 것이다. 대안적으로, 이식물은 투명한 각막 상피를 양산하지만, 충분한 윤부 줄기세포의 결여는 비정상적 상피 표면 및 불량한 치유를 초래하고, 이는 안구 표면을 복구하고 시력을 개선하는데 실패를 초래한다. 따라서, 윤부 줄기세포 결핍을 갖는 눈에 윤부 줄기세포의 공급을 의도하는 이들 접근법은 심각한 제약을 가지며, 이는 이식물 또는 이식편에 존재하는 자가-재생능을 갖는 미분화된 윤부 줄기세포의 제한된 공급에 기인할 수 있다. 따라서, 눈에 윤부 줄기세포를 재생하고 이를 지속적으로 공급하는 능력을 갖는 윤부 줄기세포의 충분한 집단을 공급함으로써 안구 표면 손상을 복구하고 재구성하는데 더욱 성공적일 것인 이식물 또는 이식편을 제공하는 것이 바람직하다.
현재까지, 이의 일부 또는 전부가 환자가 정상 또는 거의 정상의 시력 기능을 복구하도록 도울 수 있는, 각막 상피 손상을 완전히 개선하거나, 또는 손상되거나 죽은 세포를 대체하기 위해 새로운 각막 상피세포 또는 윤부 줄기세포의 성장 및 발달을 유도할 수 있는 치료적 선택은 존재하지 않는다. 따라서, 안과적 장애, 질환 및 손상, 특히, 각막 장애, 질환 및 손상을 앓고 있는 환자에 대해 이러한 치료적 선택을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명은 비-배아 조직, 바람직하게는 각막 윤부 조직으로부터 유래한 포유동물 윤부 줄기세포 (LSC)의 배양을 기술한다. 구체적으로, 본 발명은 배양된 포유동물 LSC, 및 배양된 포유동물 LSC를 생성하는 방법을 제공하고, LSC는: (i) 각공막 윤부 (corneoscleral limbus)로부터 분리되고, (ii) 시험관 내 배양으로 증대되고, (iii) 시험관 내 배양 또는 이를 필요로 하는 개체의 눈에서 치료학적으로 계통-위임된 (lineage-committed) 각막 상피세포로 분화하는 능력을 유지한다.
특정 실시양태에서, LSC는, 적어도 최소 필수 배지와 함께 성장 인자, 혈청, 하나 이상의 가용성 인자와 같은 선택적 제제를 포함하는 세포 배지가 추가로 보충된, 세포외 기질 상의 피더-비함유 (feeder-free) 배양 배지에서 배양된 세포이다.
본 발명의 윤부 줄기세포는 임의의 적합한 포유동물로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 윤부 줄기세포는 수용자가 아닌 공여자로부터 분리될 수 있다. 이러한 공여자는 개체와 생체적합성인 시체 또는 장기 제공자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 윤부 줄기세포는 또한 수용자인 공여자로부터 분리될 수 있으며, 그로써 수용자 및 공여자가 동일한 개인 또는 개체일 수 있다.
윤부 줄기세포의 분리는 배양 및 증대 전에, 그 동안에 또는 그후에 이루어질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 해리된 조직은 그 후에 증대되는 본 발명의 LSC를 분리하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 윤부 줄기세포는 윤부 줄기세포의 성장 및 증대를 지지하는 배양 배지에서 배양될 수 있다. 분리된 LSC는 다수의 계대 동안에 시험관 내 배양에서 실질적으로 미분화된 상태로 남는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 윤부 줄기세포는 세포외 기질 또는 생체코팅된 (biocoated) 표면, 예를 들어, 세포외 기질 담체 또는 생체코팅된 렌즈와 같은 적합한 지지 재료 (support material) 상에서 배양된다. 표면 재료는 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 부착 인자로 생체코팅된 임의의 지지체일 수 있다.
본 발명의 윤부 줄기세포는 다양한 치료적 방식으로, 예를 들어, 환자에 분리된 LSC 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 안과적 장애, 질환 또는 손상을 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자, 또는 윤부 줄기세포 결핍을 갖는 환자에서 각막 상피세포의 증식 또는 재생을 촉진하는 방법을 고려한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 세포외 기질 또는 생체코팅된 표면과 같은 적합한 지지 재료 상의 본 발명의 LSC 세포가 개체에 제공된다. 지지 재료는 드 노보 (de novo)일 수 있거나 또는 본 발명의 LSC를 배양하는데 사용된 지지 재료일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 예시는 생체코팅된 렌즈 키트 상에 배양된 LSC를 포함한다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 LSC는 배양 배지로부터 분리되고 이를 필요로 하는 개체에, 세포외 기질, 배지 및 다른 재료와 함께 제공된다. 유사하게, 배지 및 기타 인자는 배양 배지로부터 유래할 수 있다. 일 예시에서, 본 발명의 LSC는 다른 제제 또는 치료 기법과 조합하여 투여될 수 있다. 보다 특이적 실시양태에서, 다른 제제는 활성제이다. 또한 가장 특이적 실시양태에서, 활성제에는 성장 인자, 사이토카인, 억제제, 면역억제제, 스테로이드, 케모카인, 항체, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 마이토마이신 C, 또는 다른 세포 유형이 포함된다. 다른 특이적 실시양태는 다른 치료 기법이 콘텍트 렌즈, 점안약, 및 LSC를 전달하기 위한 다른 안과적 수단을 포함하는 것이다.
본 발명은 LSC 및 각막 복구용 재료를 제조하는 재료를 제공하고, 이는 (1) 윤부 줄기세포 현탁액로부터 윤부 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하고; (2) 상기 단계 (1)은 현탁액으로부터 윤부 줄기세포를 수득하고 윤부 줄기세포의 각막 상피세포로의 분화를 촉진하도록 유도 배양 배지 중에 놓인 스캐폴드에 이를 접종하는 것을 포함한다.
상기 단계 (1)에서, 일 실시양태에서는, 윤부 줄기세포가 하기 방법에 의해 수득될 수 있다: 신선한 윤부 조직을 세정하고, 작은 조각으로 절단하고, 37℃에서 2-4시간 동안 0.2% 콜라게나제 IV로 처리하여 세포 덩어리를 분해한다. 윤부 조직을 1-3% Matrigel® 코팅된 배양 접시에서 37℃에서 단일 세포 현탁액으로 10 내지 20분간 0.25% 트립신 및 1 mM EDTA로 추가 분해할 수 있다.
바람직하게는, 다른 실시양태에서, 콜라게나제 IV 분해 시간은 3시간이었고; 0.25% 트립신 및 1 mM EDTA 분해 시간은 15분이었고; Matrigel® 농도는 2%이었다.
나아가, 또 다른 실시양태에서, 윤부 줄기세포 현탁액에서, 세포 농도는 약 2×102 ~ 8×102/μl일 수 있다.
추가적으로, 발명의 실시양태에서, 단계 (2)에서, 스캐폴드는 생물학적 기원의 재료, 또는 무세포 렌즈일 수 있다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 단계 (2)에서, 생물학적 재료는 세포-유래 콜라겐 또는 Matrigel® 양막일 수 있다.
추가적으로, 일 실시양태에서, 단계 (2)에서, 유도에 사용된 배지는 상피세포 배양 배지 CnT-30이다.
추가의 실시양태에서, 단계 (2)에서, 유도 배양을 위한 배양 시간은 약 3 내지 18일일 수 있다. 바람직하게는, 단계 (2)에서, 배양 시간은 약 14 ~ 18일이다.
본 발명은 또한 각막 손상용 약제의 제조를 위한 각막 복구 재료의 상기 처리를 제공한다.
발명의 다른 특징 및 이점은 첨부의 명세서, 실시예 및 청구범위로부터 자명할 것이다. 이 출원 전체에 걸쳐서 인용된 모든 참고문헌, 계류 중인 특허 출원 및 등록된 특허의 내용은 본원에 참조로서 명백히 포함된다.
도 1a-d. 각막 상피의 정상 및 병리학적 변화, 및 이의 피부와의 비교. a , 정상 각막-윤부 연접 (junction). K19 및 P63에 의해 동정된 윤부 (또한 도 2e 참조) 및 K12에 의한 각막. b , 기저층에서 p63 및 K5/K14에 의해 동정되고 (도 2a, b 참조) K3/K12 부재인 정상 피부 표피. c , K3/K12에 의해 표지되고 p63 및 K1/K10 부재인 정상 중심 각막 (또한 도 2c, d, f 참조). d , K3/K12 부재 (a') 및 피부 상피 마커 p63 (b') 및 K5/K1/K10 (c'-e')의 존재를 나타내는 비정상적 표피 분화를 갖는 각막. H&E 염색, 좌측 패널. 눈금 막대: 100 μm.
도 2a-j. 케라틴 발현 프로파일 및 LSC 및 SESC의 세포 배양/3-D 분화. a -f, 인간 윤부, 각막 및 피부 표피에서의 케라틴 발현 프로파일. a , b, 윤부 및 피부의 기저 세포층에서 양성 K5 (a) 및 K14 (b) 발현을 보이는 말초 각막-윤부 연접 및 피부 조직, 및 중심 각막 상피에서 이들의 부재. c -d, 양성 K1 (c) 및 K10 (d) 발현을 보이는 피부 표피 및 각막 및 윤부에서 이들의 부재. e -f, 윤부에서 양성 및 중심 각막 상피 및 피부 (e)에서 음성인 K19, 및 각막에서만 양성 및 윤부 및 피부 (f)에서 음성인 K3/K12를 나타내는 말초 각막-윤부 연접. g -j, 줄기/전구세포와 배양된 LSC 및 계대 12회에서의 SESC 특성 및 3-D 분화 시스템의 확인. g , p63 (a') 및 Ki67 (b')의 양성 줄기세포 시그널 및 음성 분화된 CEC 시그널, K3/12 (c')를 나타내는 LSC의 면역형광 염색, 상 대조 사진 (d'); (h) LSC와 비교하여 3-D 분화 분석으로부터의 CEC에서 K3/K12 상향-조절 및 K19 하향-조절을 나타내는 qPCR 분석; i, SESC와 비교하여 3-D 분화 분석으로부터의 SEC에서 K1/K10 상향-조절 (c), 모두 n=3, p<0.01. j , 양성 p63 (a') 및 윤부 줄기세포 마커, K19 (b') 및 성숙 피부 상피 마커 K1/K10 (c', d')에 대한 음성 시그널을 나타내는 배양된 SESC의 면역형광 염색. 눈금 막대, 100 μm.
도 3a-f. 윤부 및 각막에서 WNT7A 및 PAX6의 독점적 발현. a -d, 배양된 LSC 및 SESC와 3-D 분화된 CEC 및 SEC의 면역형광 염색. 좌측 패널, 상 대조 사진; LSC에서 p63, K19 및 Ki67의 염색 (a), SESC에서 p63, K5 및 Ki67의 염색 (c), 3-D 배양 스피어 (culture sphere) 내 CEC (b) 및 SEC (d)에서 K3/12, K1, K5, K10 및 K14의 염색. e , LSC, CEC 및 SESC 사이를 비교한 감별 유전자 발현을 나타내는 히트맵 (Heatmap). *는 WNT7A 및 PAX6을 나타낸다. f , 윤부, 각막 및 피부에서 WNT7A 및 PAX6의 면역형광 염색 (a'- d'). 배양된 LSC (e', g') 및 3-D CEC 스피어 (f', h')에서 WNT7A 및 PAX6의 발현. 약어: LSC: 윤부 줄기/전구세포, SESC, 피부 상피 줄기세포, CEC, 각막 상피세포, SEC, 피부 상피세포. 눈금 막대, 100 μm.
도 4a-i. 유전자 발현 분석. a -c, LSC, CEC 및 SESC의 전장 유전체 (Genome wide) 유전자 발현 마이크로어레이. a , SESC에 대한 LSC/CEC의 비교로부터 상위 100개의 중요한 유전자. b , 강력한 상관관계를 나타내는 qPCR 분석을 이용한 마이크로어레이 데이터의 검증. c , SESC 대비 LSC 및 CEC에서 WNT7A 및 PAX6 발현의 qPCR 분석, 모두 n=3, p<0.05. d , 1세의 인간 유아의 각막 및 윤부에서 WNT7A 및 PAX6의 발현. H&E 염색 (a'), 박스 표시된 영역이 WNT7A (b'), PAX6 (c') 및 K3/12 (d')의 면역형광 염색으로 연속 절편 (b'-d')에서 나타남. 눈금 막대, 100 μm
도 5a-c. WNT7A 및 PAX6가 각막 세포 운명의 유지에 필수적임. a , 인간 각막 편평상피 화생. 적색 박스 (한 쌍의 좌측 박스; 또는 a'에서 단일 거대 박스)는 화생 영역을 나타내고, 청색 박스 (한 쌍의 우측 박스)는 상대적으로 정상인 각막 영역을 나타낸다; 상부 패널: 기저층에서 양성 p63을 갖는 전형적인 피부 표피 형상을 나타내는 H&E 염색 (상부 패널) (a', 화살촉이 p63 염색을 나타냄), WNT7A (b') 및 PAX6 (c')의 손실은 각막 K3/K12 (d')의 부재를 수반하였다. 상부 패널에서 적색 및 청색으로 표시된 영역들의 연속 절편을 하부 패널에 나타내었다. b , WNT7A 또는 PAX6 넉다운 (knockdown)을 갖는 3-D 분화된 세포의 면역형광; K1 및 K5, 좌측 패널; PAX6 및 K10, 중간 패널; K3/12, 우측 패널; c, WNT7A 또는 PAX6 넉다운을 갖는 3-D 분화된 세포에서 각막 또는 피부 상피 마커의 유전자 발현 변화의 정량적 PCR 분석 (모두 n=3, p<0.05). 데이터는 평균 + s.d로 표시된다. 눈금 막대, 100 μm.
도 6a-e. 인간 각막 질환에서 각막 마커의 손실과 함께 피부 표피 마커의 출 현. 스티븐-존슨 증후군 (a, b), 안구 유사천포창 (c), 외상 손상 (d) 및 알칼리 화상 (e)을 갖는 환자의 각막에서 각막 마커 K3/12, PAX6 및 WNT7A의 손실과 함께 피부 표피 마커 p63, K5 및 K10의 출현. 모든 이미지의 경우, 각막 상피 편평 화생의 병소에 대해 H&E 염색을 수행하였다 (a'). b'-f', 기저위 (suprabasal) 층에서 증가된 p63 (b', d') 및 K5 (c', d') 및 K10 (e')를 나타내는 연속 절편 내 동일한 지역의 병소, WNT7A 부재 (e'), K3/12 또는 PAX6은 이 영역에서 검출될 수 있다 (f'). 눈금 막대, 100 μm.
도 7a-f. LSC에서 PAX6 발현에 대한 WNT7A / FZD5 효과. a -c, LSC에서 PAX6 발현에 대한 WNT7A 넉다운의 효과. a , LSC 및 이들의 3-D 분화 스피어에서 WNT7A 및 PAX6 넉다운 (shWNT7A 및 shPAX6)의 효과를 나타내는 위상 대조 사진. b , LSC에서 WNT7A 및 PAX6의 유전자 발현 변화의 qPCR 분석. WNT7A 넉다운은 PAX6 발현을 감소시키고 (n=3, p<0.01); PAX6 넉다운에서 WNT7A 발현은 유의미한 변화를 보이지 않음. c , 웨스턴 블롯 분석에 의한 LSC에서 WNT7A 및 PAX6의 넉다운 효능의 검증. d-f, WNT7A 및 FZD5는 PAX6 발현의 상향 조절자로 작용하였다. d , LSC및 3-D 분화 스피어에서 FZD5 (shFZD5)의 넉다운의 세포 형상을 나타내는 위상 대조 사진. e, LSC에서 WNT7A 및 FZD5의 동시-면역침전. f, FZD5 넉다운을 갖는 LSC의 3-D 분화된 세포 (3-D shFZD5 LSC)에서 각막 및 피부 상피 마커 내 유전자 발현 변화의 qPCR 분석. FZD5 넉다운은 WNT7A 발현에 영향을 미치지 않았다; 다른 모든 것들, n=3, p<0.05. 눈금 막대, 100 μm.
도 8a-c. SESC에서 PAX6 형질도입의 효과. a , PAX6 형질도입 (PAX6+)을 갖는 SESC 및 3-D 분화 스피어의 위상 대조 사진. b , 웨스턴 블롯 분석에 의한 3-D 분화 스피어에서 K12 및 PAX6 발현의 검증. c , PAX6 형질도입을 갖는 SESC의 3-D 분화 (3-D PAX6+ SESC)에서 피부-특이적 케라틴, K1/K10의 손실. 눈금 막대, 100 μm.
도 9a-e. PAX6 형질도입에 의한 SESC의 각막 상피-유사 세포로의 전환. a, 형질감염된 SESC에서 PAX6 및 p63의 이중 면역형광 염색, K19는 PAX6-형질도입된 (PAX6+) SESC에서 양성이었다. b, 3-D 분화 조건에서 K3/12 및 PAX6+ SESC의 면역형광 염색. c , PAX6+ SESC에서 케라틴의 유전자 발현의 qPCR 분석 (모두 n=3, p<0.05). 데이터는 평균 + s.d로 나타내었다. d , CEC, PAX6 넉다운을 갖는 분화된 LSC (3-D shPAX6 LSC), SEC 및 PAX6 형질도입을 갖는 분화된 SESC (3-D PAX6+ SESC) 중에서 계층 클러스터 (hierachical cluster) 분석. e , CEC로의 정상적인 LSC 분화를 나타내는 도식적 다이어그램 (a') 및 LSC에서 WNT7A/PAX6의 손실이 각막 표면 상피세포 질환에서 비정상적 피부 표피-유사 분화를 초래한다는 제안된 기전 (b'). 눈금 막대, 100 μm.
도 10a-c. RNA- seq 데이터의 정량적 정보. a , RNA-seq 샘플의 통계학적 분석: 각 샘플의 미가공 판독값 (raw reads), 맵핑 (mapping) 판독값 및 맵핑 비율이 포함된다. b, 중복의 생물학적 샘플의 쌍 (Pairwise) 비교. c, SEC와 3-D PAX6+ SESC, CEC 및 3-D shPAX6 LSC 사이의 차이, 모두 FDR < 0.001. a, PAX6 형질도입을 갖는 토끼 SESC (Rb PAX6+ SESC) 또는 PAX6 넉다운을 갖는 LSC (Rb shPAX6 LSC)에서 PAX6 발현의 qPCR 분석 (모두 n=3, p<0.05). 본 발명자들은 히트맵에서 약간의 사소한 차이를 확인하였는데, 이는 일부 실험적 변화에서 비롯되거나 또는, PAX6 발현이 본 연구에서 입증된 바와 같이, 유전자 발현 및 기능적 수준 둘 모두에서 SESC로부터 CEC로의 세포 운명 전환을 주로 담당한다고 하더라도, 이 단일 전사 인자가 CEC와 완전히 동일한 세포를 생성하기에 충분하지 않을 수 있다는 가능성에 기인하였다.
도 11a-f. PAX6의 조작된 (engineered) 발현 및 토끼 LSC 결핍 모델. a -e, 토끼 SESC 및 PAX6 넉다운 LSC에서 PAX6의 조작된 발현의 정량 및 배양. a , PAX6 형질도입을 갖는 토끼 SESC (Rb PAX6+ SESC) 또는 PAX6 넉다운을 갖는 LSC (Rb shPAX6 LSC)에서 PAX6 발현의 qPCR 분석 (모두 n=3, p<0.05). b , p63의 양성 염색 및 PAX6의 음성 염색을 갖는 토끼 SESC. 죄측 패널, 위상 대조 사진. c , 상단, PAX6 형질도입을 갖는 토끼 SESC에서 PAX6 및 p63의 이중 면역형광 염색. 상부 좌측 패널, 위상 대조 사진. 하단, 토끼 PAX6+ SESC를 이식용 GFP로 추가 표지하였다. d , p63 및 PAX6의 양성 염색을 갖는 토끼 LSC. 상부 좌측 패널, 위상 대조 사진. e , PAX6 넉다운을 갖는 GFP-표지된 토끼 LSC의 배양. f , a', 결막 윤부결막절개술 (peritomy)을 수행하고 2 mm 전방 윤부 결막의 주위 스트립 (circumferential strip)을 제거하였다. b '-d', 전방 각막 간질 평면을 따라 LSC 및 각막 상피를 완전히 제거하기 위한 층판 공막 및 각막 절개. 절단된 캡 (Dissected cap)이 (d', 화살표)에 나타남. e '-f', 노출된 각막 간질상을 인간 양막 (e') 및 봉합 (f')으로 피복하였다. (n=3). 눈금 막대, 100 μm.
도 12a-d. 토끼 LSC 결핍 모델에 이식된 GFP -표지 PAX6 + SESC에 의한 각막 상피 재생 및 복구. a , 각막 상피 결함 복구의 시간의 경과. 이식 15일 후: 각막 표면의 플루오레세인 염색에 의해 입증된 전체 각막 상피 결함과 함께 감소된 각막 투명도; 이식 30일 후, 향상된 각막 투명도 및 각막 상피 결함의 감소된 플루오레세인 염색; 이식 45일 및 90일 후: 각막 투명도의 복원 및 유지. b -c, 각막 상피 결함의 완전한 복구 및 재-상피화 (re-epithelization)를 나타내는 GFP-표지된 PAX6+ SESC의 이식 90일 후 토끼 각막 상피 표면의 재생 및 복구의 다른 2종의 예시. a -c, 좌측으로부터의 패널들: 각막 상피의 백색광 현미경 사진, 세극등 (slit-lamp) 현미경 사진 및 플루오레세인 염색 (주목: 각막 표면 위의 밝은 점은 카메라 빛 반사에 의한 것으로, 이들은 상피 결함이 아니었음). (n=5). d , 온전한 각막 상피 병리를 나타내는 GFP-표지된 PAX6+ SESC의 이식 90일 후 각각의 3마리 토끼에서 각막 상피 표면의 재생 및 복구의 H&E 염색.
도 13a-c. 토끼 LSC 결핍 모델에서 이식에 의한 각막 상피 재생. a , GFP-표지된 PAX6+ SESC로의 이식 후 토끼 LSC 결핍 모델에서 각막 상피 재생 및 복구의 시간의 경과. 상부 패널, 이식 3일 후. 좌측, 흐릿한 각막을 나타내는 광 현미경 사진; 우측, 윤부 영역 (limbus region)에서 GFP+ 공여자 세포 (화살표). 하부 패널, 이식 20일 후. 좌측, 부분적 투명도를 갖는 각막을 나타내는 광 현미경 사진; 우측, 투명한 영역에 동시-위치한 GFP+ 공여자 (화살표). 눈금 막대, 1 mm. 본 발명자들은 오로지 윤부 영역으로부터 이식된 세포만이 생존하고, 증식하여 각막 표면 상피를 재생할 수 있음을 관찰하였고, 이는 줄기세포 적소 (niche)에 함유된 윤부가 줄기세포 생존 및 성장에 유리함을 제안한다. b , GFP-표지된 PAX6+ SESC로의 이식 90일 후 토끼 수용자 눈의 윤부 영역으로부터의 재프로그래밍된 공여자 GFP-표지된 PAX6+ SESC 상피세포의 배양 및 재-분리. 상부 패널, PAX6 및 GFP의 이중 면역형광 염색; 하부 패널, PAX6-형질도입된 토끼 SESC에서 p63 및 GFP의 이중 면역형광 염색. 눈금 막대, 100 μm. c , GFP-표지된 PAX6+ SESC가 이식된 각막에서 반복적 각막 상피 손상의 복구 및 회복. 상부 패널, 본 발명자들은 의원성으로 (iatrogenically) 공여자-유래 각막 상피세포를 긁어내고 제거하였으며 PAX6+ SESC의 초기 이식 3개월 후 거대한 각막 표면 상피 결함 (화살표)을 만들었다. 하부 패널, 치유된 상피 결함을 갖는 완전한 복구 및 회복이 72시간 이내에 관찰되었다 (n=3). 좌측 패널, 광 현미경 사진; 중간 패널, 세극등 현미경 사진; 우측 패널, 플루오레세인 염색.
도 14a-g. 토끼 윤부 줄기세포 결핍 모델에 대한 세포 이식 및 각막 상피 복구. a , 이식 2개월 후 토끼 각막의 면역형광 염색. 상부 패널, 각막 표면 상에서 각막 상피 마커 K3 및 K12의 양성 GFP 시그널 및 발현을 나타내는, GFP-표지된 PAX6+ SESC가 이식된 각막. 하부 패널, 피부 표피 상피 마커 K10의 양성 GFP 시그널 및 발현을 나타내는, GFP-표지된 shPAX6-LSC가 이식된 각막. 눈금 막대, 100 μm. b -f, 세포 이식 2개월 후 토끼 각막 (좌측 패널, H&E 염색; 중앙의 2개 패널, 백색광 현미경 사진 및 세극등 현미경 사진; 좌측 패널, 각막 상피 표면의 플루오레세인 염료 염색). 눈금 막대, 100 μm. b , 전형적 각막 상피 병리를 갖는 정상적 각막 및 상피 결함이 없는 온전한 각막 표면. c , 상피 화생의 병리 및 혈관화를 갖는 불투명한 각막을 나타내는, 단지 인간 양막으로만 덮어진 벗겨진 (Denuded) 각막 (n=4). d -e, 각막 상피 병리, 상피 결함이 없는 치유된 온전한 각막 표면을 나타내는, GFP-표지된 LSC (d, n = 3) 및 GFP-표지된 PAX6+ SESC (e, n = 5)가 이식된 각막. f, 상피 화생의 병리, 상피 결함을 갖는 불투명하고 혈관화된 각막 표면을 나타내는, GFP-표지된, shPAX6-처리된 LSC가 이식된 각막 (n=4). g , GFP-표지된 PAX6+ SESC의 이식 3개월 후 토끼 각막: 양성 GFP 시그널을 갖는 (두 번째 패널, 눈금 막대, 1 mm) 부드럽고, 투명한 각막 (상부 패널). 두 번째 패널에서 테두리 영역은 GFP (중간 패널), PAX6 (네 번째 패널) 및 GFP-PAX6 둘 모두 (하부 패널)의 발현을 나타내도록 확대된다. 눈금 막대, 100 μm.
도 15a-e. 상이한 배아 단계에서 마우스 각막의 Pax6 및 p63 발현 패턴. A , 마우스 각막의 E12.5에서 양성 PAX6. p63은 검출 가능하지 않음. 더 높은 배율 (좌측 패널)은 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색된 각막-윤부-결막 접합 영역 (적색 박스)을 나타낸다. B , PAX6 발현은 안구 영역 (결막, 윤부 및 각막 조직, 백색 화살표)에서 표시된 반면, p63은 E14.5에서 눈꺼풀 피부, 윤부 및 각막에서 양성이었다. 좌측 패널은 H&E 염색을 나타낸다. C 및 D, E16.5 (C) 및 E18.5 (D)에서 마우스 각막 내 PAX6 및 p63 발현. 우측 상부 패널, H&E 염색에서 적색 박스로 표시된 영역의 PAX6 및 p63 염색 (좌측 패널)은 모든 안구 조직에서 PAX6 발현 및 각막 조직에서 p63 발현을 나타낸다; 우측 하부 패널, 노란색 박스로 더 높은 배율의 테두리 쳐진 영역. E , ROSAmT / mG의 각막 상피에서 PAX6의 계통 추적; P1 및 P60에서 PAX6-GFPcre 마우스, ROSAmT / mG를 대조군으로 제공함. 눈금 막대 = 100 μm.
도 16a-b. 인간 각막 및 피부 상피의 특성화. A, PAX6 및 K3/12에 의해 동정되고 p63, K5, K1 및 K10 부재인 각막. B , p63, K5, K1 및 K10에 의해 동정되고 PAX6 및 K3/12 부재인 피부 표피. 좌측 상부 패널, H&E 염색. 눈금 막대 = 100 μm.
도 17a-c. 인간 윤부 영역 및 배양된 인간 LSC 및 SESC의 면역형광 염색. A, PAX 및 p63에 의해 동정된 인간 윤부 영역. 좌측 상부 패널, 각막-윤부 연접의 H&E 염색 (화살표). B , PAX6 및 p63으로 염색된 배양된 LSC. 좌측 패널, 위상 대조. C , p63 및 K5로 염색된 배양된 SESC. 좌측 패널, 위상 대조. 눈금 막대 = 100 μm.
도 18a-b. PAX6은 각막 세포 운명의 유지에 필수적임. A , 인간 LSC 및 이들의 분화된 세포에서 세포 형상 및 PAX6 넉다운의 Ki67 염색을 나타내는 위상 대조. B , 분화된 LSC 대비 분화된 PAX6 shRNA LSC (shPAX6 - LSC)에서 각막 또는 피부 상피 마커에서 유전자 발현 변화의 정량적 PCR 분석 (n = 3, p < 0.05). 데이터를 평균 ± S.D로 나타낸다. 눈금 막대 = 100 μm.
도 19a-b. 각막- 윤부 유피낭 ( dermoid )을 갖는 환자에서 각막 마커의 손실과 함께 피부 표피 마커의 출현. A , 전형적인 각막 윤부 유피낭을 갖는 환자 (패널 a) 및 H&E 염색 (패널 b). B , 기저위 층에서 증가된 p63 (패널 a) 및 K5 (패널 b) 및 K10 (패널 c)을 나타내는 연속 절편. 어떠한 K3/12 또는 PAX6도 검출되지 않았다 (패널 d). 눈금 막대 = 100 μm.
도 20a-c. LSC 및 SESC에 관여하는 확인된 신호 경로. A , LSC 및 SESC의 비교를 통한 Wnt, Notch 및 TGF-β 경로에서 유전자 발현 데이터의 히트 맵. 히트 맵에서 각 유전자에 대해, 적색 및 청색은 각각 모든 샘플에서의 평균 발현 수준에 대한 고 발현 및 저 발현을 나타낸다. B, Wnt 및 Notch 경로에 속하는 유전자들 사이의 유전적 상호작용의 그래프 표시. 2종의 독립적 LSC 및 SESC 제조물에서의 평균 발현값 사이의 배수 차이를 각 유전자를 개별적으로 색별 (color-code)하는데 사용하였다 (적색, LSC에서 더 높은 발현; 청색, SESC에서 더 높음). Notch 및 Wnt 경로와 연관된 유전자의 아집단을 선별하였다.
정의
용어 "배양 배지", "세포 배양 배지" 또는 "세포 배지"는 세포, 예를 들어, 줄기세포, 전구세포, 또는 분화된 세포가 성장하는 세포 성장 배지를 지칭하는데 사용된다. 배양 배지는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 적어도 최소 필수 배지와 함께, 성장 인자 (예컨대, 섬유아세포 성장 인자, 바람직하게는 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 및 표피 성장 인자 (EGF) 포함), 사이토카인 (예컨대, 백혈병 억제 인자 (LIF)), 호르몬 (예컨대, 글루코코르티코이드 (예컨대, 히드로코르티손) 및 갑상선 호르몬 (예컨대, 3,3',5-트리요오도-L-티로닌)), 글루코스, 비-필수 아미노산, 글루타민, 인슐린, 트랜스페린, 베타 머캅토에탄올, ROCK 억제제, 콜레라 독소, 및 당해 분야에 잘 알려진 기타 제제와 같은 선택적 제제를 포함한다. 이러한 배지에는 DMEM/F12 (1:1)와 같은 상업적으로 이용가능한 배지가 포함되고, 이는 L-글루타민, 넉아웃 혈청 대체물 (KSR), 소 태아 혈청 (FBS), 비-필수 아미노산, 백혈병 억제 인자 (LIF), 표피 성장 인자 (EGF), 베타-머캅토에탄올, 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 히드로코르티손, 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, ROCK 억제제, 항생제, B27 배지 보충물 및/또는 기타 배지 보충물의 하나 이상으로 보충될 수 있다. 본 발명에 유용한 세포 배지는 상업적으로 이용가능하고 다수의 다른 상업적 공급원 중에서, Invitrogen Corp. (GIBCO) 및 Biological Industries (Beth HaEmek, Israel 소재)로부터 이용가능한, 상업적으로 이용가능한 성분들로 보충될 수 있다.
"LSC 배양 배지" 또는 "LSC 유지 배지"는 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC) 또는 LSC-유사 세포의 시험관 내 및 안정한 증식을 위해 조제된 배양 배지이다.
"분화 배지"는 줄기세포 또는 전구세포의 특정 세포 계통의 세포로의 시험관 내 분화를 위해 조제화된 배양 배지 또는 세포 배양 배지이다. 예를 들어, "LSC 분화 배지"는 윤부 줄기세포 또는 전구세포 또는 LSC-유사 세포의 각막 상피세포 (CEC) 또는 CEC-유사 세포로의 시험관 내 분화를 위해 조제화된 배양 배지일 수 있다.
"피더-비함유 (feeder-free) 배양 배지"는 관심 세포, 즉 LSC 또는 SECS를 배양하는데 사용된 배양 배지가 이 세포의 안정한 증식을 허용하기 위해 피더 세포를 필요로 하지 않는다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 아무런 피더 세포 층도 배양액 중에 존재하지 않는 "피더-비함유 배양 배지"에서 배양된 LSC 세포는 LSC로 분열되고 이로서 유지될 수 있다.
"혈청-비함유 (serum-free)"는 동물 또는 인간으로부터 수득된 정화된 혈액 산물인, 혈청의 결여를 지칭한다.
"혈청-비함유" 배양 배지는 혈청이 결여된 배양 배지이다. 이는, 예를 들어, 혈청 대체제 또는 혈청 대체물을 함유할 수 있다.
"화학적으로 규명된 (chemically defined)" 배지 또는 "화학적으로 규명된" 배양 배지는 그의 성분이 화학적으로 규명된 배양 배지이다. 따라서, 이는 화학적으로 규명되지 않은, 혈청을 결여한다. 혈청을 필요로 하는 세포 또는 조직의 배양을 위해, "화학적으로 규명된" 배지는 전형적으로 혈청 대신에 혈청 대체제 또는 혈청 대체물을 함유한다. "화학적으로 규명된" 배지가 동물 유래 산물 또는 외래 동물 유래 산물을 함유하지 않는다면 이는 "이종-비함유 (xeno-free)"이다. 이는 또한 인간-유래 산물이 결여될 수 있다. 이는 동물- 또는 인간-유래 산물을 이전에 동물 접촉 또는 노출이 없는 재조합적으로 생산된 물질, 화학적으로 합성된 물질, 또는 효소적으로 합성된 물질로 대체하는 것이 일반적으로 바람직하다.
"줄기세포"는 자가-재생능을 나타내고, 전구세포를 초래하는 세포로서, 이는 증식하여 최종적으로 분화된 세포로 분화할 수 있으며, 이는 유사분열 후 (post-mitotic)이다. 예를 들어, 윤부 줄기세포는 윤부 줄기세포뿐만 아니라 전구세포를 생산하도록 분열할 수 있다. 전구세포는, 예컨대, 각막 상피세포 (CEC)로 (적합한 조건하에서 시험관 내 배양을 통해) 분화를 거치도록 지시될 수 있다.
"윤부 줄기세포 또는 전구세포" 또는 "LSC"에는, 예컨대, 눈의 각막과 결막 사이의 영역인, 윤부로부터 분리된 줄기세포가 포함된다. LSC는 증식하여 각막 상피세포 (CEC)를 초래하도록 분화할 수 있다. 구체적으로, LSC는 윤부 내부의 LSC 적소 (niche)에 존재하는 것으로 생각된다. LSC는 눈의 각막 윤부를 포함하는 윤부 영역, 각막과 결막 사이의 마진(margin), 각막과 공막의 경계(border), 각공막 윤부, 윤부 상피의 기저층의 움 영역 (crypt region), 울타리간 그물 능선 (interpalisade rete ridge)을 포함하는 영역, 또는 포그트의 울타리 (Palisades of Vogt)를 포함하는 영역으로부터 분리될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, "분리된 (isolated)"은 그의 최초 환경으로부터 제거되어 그로써 그의 천연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변경된 물질을 지칭한다.
"분리된 윤부 줄기세포 또는 전구세포"는 개인으로부터 분리되고 생체 외 또는 시험관 내 배양 중에 있는 LSC를 포함한다. 전형적으로, 조직 생검 내 분리된 LSC가 단일 세포를 수득하도록 해리될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "농축된 (enriched)"은 혼합물로부터 원치 않는 재료의 제거 또는 바람직한 재료의 선택 및 분리 (즉, 집단 내 모든 세포가 특정 세포 마커를 발현하지 않는 이종의 세포 집단으로부터 그 마커를 갖는 세포의 분리)에 의해 하나 이상의 물질의 양을 선택적으로 농축하거나 또는 증가시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전능성 (totipotent) 세포"는 하기 의미를 가질 것이다. 포유동물에서, 전능성 세포는 성인 몸체에서 임의의 세포 유형; 배아외 막 (예컨대, 태반)의 임의의 세포 유형(들)이 될 수 있는 능력을 갖는다. 전능성 세포에는 수정란 및 이의 분열에 의해 생산된 대략 처음 4개 세포가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "만능성 (pluripotent) 줄기세포"는 하기 의미를 가질 것이다. 만능성 줄기세포는 몸체에서 임의의 분화된 세포를 만들 수 있는 능력을 갖는 진성 (true) 줄기세포이지만, 영약막으로부터 유래된 배아외 막의 성분을 만드는데 기여하지는 않는다. 양막은 영약막이 아닌, 외배엽 (epiblast)으로부터 발생한다. 3가지 유형의 만능성 줄기세포가 현재까지 확인되어 있다: 배아 줄기 (ES) 세포 (영장류에서는 또한 전능성일 수 있음), 배아 생식 (EG) 세포, 및 배아 암종 (EC) 세포. 이들 EC 세포는 태아의 생식샘에서 종종 발생하는 기형암종 (teratocarcinoma)인, 종양으로부터 분리될 수 있다. 다른 2가지 유형과 달리, 이들은 일반적으로 이수배수체 (aneuploidy)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다능성 (multipotent) 줄기세포"는 진성 줄기세포이지만 단지 제한된 수의 유형으로 분화할 수 있다. 예를 들어, 골수는 혈액의 모든 세포를 초래하지만 다른 세포 유형으로 분화할 수는 없는 다능성 줄기세포를 함유한다.
본원에 기술된 특정 조성물, 성장 조건, 배양 배지 등을 인용하는 경우, 용어 "동물-비함유 (animal-free)"는 소 혈청, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산, 비타민 등과 같은 비-인간 동물-유래 재료가 특정 조성물 또는 방법의 제조, 성장, 배양, 증대, 저장 또는 제형에 전혀 사용되지 않음을 의미한다. "비-인간 동물-유래 재료 비함유"는 재료가 비-인간 동물 몸체 또는 물질 내이거나 또는 이와 접촉된 적이 없고, 그로써 이들은 이종-오염되지 않은 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "피더 세포 (feeder cells)"는, 보조제로서 역할을 담당하는 추가적인 세포를 의미하는 것으로 의도되고, 이는 예를 들어, 증식 또는 분화되는 표적 만능성 줄기세포를 위해, 배양 조건을 조정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 피더 세포, 특히 마우스-유래 일차 배양된 섬유아세포와 같은 동물 피더 세포는 세포 부착을 위한 스캐폴드의 제공 및 줄기세포에 필요한 성장 인자의 공급을 책임지고 있다. 따라서, "피더 비함유" 또는 피더 세포의 "결여"는 피더 세포가 특정 조성물 또는 방법의 제조, 성장, 배양, 증대, 저장 또는 제형에 전혀 사용되지 않음을 의미한다.
세포 조성물에 관해서, 용어 "증대된 (expanded)"은 세포 집단이 이전 방법을 이용하여 수득되는 것보다 유의미하게 더 높은 세포 농도를 구성함을 의미한다. 예를 들어, "증대된" 집단은 이전 방법에 비해 그램당 세포 수에 있어서 적어도 2배, 및 최대 10배의 개선을 갖는다. 용어 "증대된"은 사람이 세포의 수를 증가시키기 위해 개입한 그러한 상황만을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "계대 (passage)"는 조직 배양 용기에서 융합성 (confluence)을 달성하였거나 융합성에 근접한 배양액 중에서 성장하는 세포가 용기로부터 제거되고, 신선한 배양 배지로 희석되고 (예컨대, 1:5로 희석됨) 새로운 조직 배양 용기에 두어 이들의 지속된 성장 및 생존을 허용하는 세포 배양 기법을 의미한다. 예를 들어, 윤부로부터 분리된 LSC는 일차 세포로서 언급된다. 이러한 세포는 본원에 기술된 성장 배지에서 성장됨으로써 배양 중에 증대된다. 이러한 일차 세포가 2차 배양되는 (subcultured) 경우, 2차 배양의 각 회차가 계대로서 지칭된다. 본원에 사용된 바와 같이, "일차 배양"은 개체로부터 새로 분리된 세포 집단을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분화"는 그에 의해 세포가 점진적으로 더욱 전문화되는 과정을 의미한다. 만능성 줄기세포를 기술하기 위해 본원에 사용되는 경우, 용어 "분화"는 만능성 줄기세포가 이들의 분화 전능성 (즉, 모든 조직으로 분화하는 잠재적 능력)을 상실하고 특정 조직을 구성하는 세포로서의 특징을 갖도록 야기하는 변화를 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "생리학적 수준"은 생물계 내 물질이 발견되고 생화학적 및/또는 생물학적 과정의 적절한 작동과 연관된 수준을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "풀링된 (pooled)"은 비-풀링된 조성물에 비해 더 일정하거나 일관된 특성을 갖는 새로운 조성물을 생성하도록 조합되어 있는 다수의 조성물을 의미한다.
용어 "치료적 유효량"은 바람직한 생리학적 효과 (예를 들어, 각막 치유의 복구 또는 촉진)를 달성하는데 필요한 치료제의 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "용해물"은 세포, 예를 들어, LSC가 용해되고 선택적으로 세포 잔여물 (예컨대, 세포막)이 제거되는 경우 수득되는 조성물을 지칭한다. 이는 기계적 수단에 의해, 동결 및 해동에 의해, 초음파처리에 의해, 계면활성제, 예컨대 EDTA의 사용에 의해, 또는 예를 들어, 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제, 히알루로니다제, 디스파제, 프로테아제, 및 뉴클리아제뿐만 아니라 Stem Pro Accutase와 같은 상업적 제품을 사용한 효소적 분해에 의해 달성될 수 있다. 일부 경우에는, 세포를 용해하고 세포막 부분을 보유하고 용해된 세포의 나머지 부분은 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 치료제에 추가적으로, 제제를 포함하는 성분들이 본 발명에 따라서 치료되는 환자에 투여하기에 적합한 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조직"은 특별한 기능의 실행에 연합된 유사하게 전문화된 세포들의 집합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이식 (transplantation)"은 미분화되거나, 부분적으로 분화되거나, 또는 완전히 분화된 것 중 하나의 형태인, 세포 현탁액 또는 기질 또는 조직 내로 도입된 세포를 비롯한, 세포를 포함하는 조성물을 인간 또는 다른 동물 내로 투여하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보조의 (adjunctive)"는 함께, 더하여, 추가로, 공동으로 등을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동시-투여하다"는 2개 이상의 제제의 동시 또는 연속 투여를 포함할 수 있다.
용어 "개체" 및 "개인"은 호환적으로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 두 용어는 임의의 동물, 예컨대 인간 및/또는 비-인간을 비롯한 포유동물을 의미한다. 용어 환자, 개체, 및 개인은 호환적으로 사용된다. 이들 용어 중 어느 것도 전문 의료인 (예컨대, 의사, 간호사, 의사 보조원, 간호조무사, 호스피스 작업자)의 관리를 요구하는 것으로 해석되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 및/또는 병태 증상을 경감하고, 완화하고/하거나 개선하고, 추가적인 증상을 예방하고, 증상의 근원적인 대사 원인을 개선하고/하거나 예방하고, 질환 및/또는 병태를 억제하고, 예컨대, 질환 및/또는 병태의 발생을 저지하고, 질환 및/또는 병태를 해소하고, 질환 및/또는 병태의 퇴행을 야기하고, 질환 및/또는 병태에 의해 야기된 상태를 해소하고/하거나, 질환 및/또는 병태의 증상을 예방적으로 또는 치료적으로 중지시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 제제, 조성물 또는 성분과 관련하여 용어 "안과적으로 허용가능한"은 치료된 눈 또는 이의 기능, 또는 치료되는 개체의 일반적인 건강상태에 실질적으로 유해한 어떠한 지속적인 효과도 갖지 않는 것을 의미한다. 경미한 자극 또는 "따가움 (stinging)" 감각과 같은 일시적 효과가 약물의 국소적 안과 투여에 일반적이고 이러한 일시적 효과의 존재가 본원에 정의된 바와 같은 당해의 제제, 조성물 또는 성분들과 모순되는 것은 아님을 인식할 것이다. 그러나, 바람직한 제제, 조성물 및 성분은 심지어 일시적인 특성인, 실질적인 유해한 효과를 야기하지 않는 것들이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기질 (matrix)"은 그에 윤부 줄기세포 및/또는 이의 전구체가 부착할 수 있고 그로써 피더 세포의 세포 부착 기능을 대체하거나, 또는 부착 인자와 같이 이의 부착을 지지할 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 기저막 유래의 세포외 기질 성분 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링 (couplings)의 일부를 형성하는 세포외 기질 성분이 본 발명에 사용하기에 특히 적합하다. 본 발명의 이 측면의 방법에 의해 사용될 수 있는 적합한 기질의 비-제한적인 예시에는 포유동물 양막 (예컨대, 인간 양막), 콜라겐 (예컨대, 콜라겐 IV), 피브리노겐, 페르리칸 (perlecan), 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 프로콜라겐, 히알루론산, 엔탁틴, 헤파란 설페이트, 테나신 (tenascin), 폴리-L-리신, 젤라틴, 폴리-L-오르니틴 및 기타 등등, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 대안적으로, 세포외 기질은 상업적으로 이용가능하다. 상업적으로 이용가능한 세포외 기질의 예시는 세포외 기질 단백질 (Fischer 또는 Life Tech), 피브리노겐 및 트롬빈 시트 (Reliance Life), 및 Matrigel®™ (BD Biosciences) 및 이들의 등가물이다. 완벽한 동물-비함유 배양 조건이 요구되는 경우에, 기질은 인간 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기법을 이용하여 합성된다. 이러한 기질에는, 예를 들어, 인간 양막, 인간-유래 피브로넥틴, Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 입수될 수 있거나 공지의 재조합 DNA 기법을 이용하여 생산될 수 있는 (예를 들어, 미국특허 제6,152,142호, 및 Tseng et al., (1997) Am. J. Ophthalmol. 124: 765-774 참조, 각각이 본원에 참조로서 포함됨) 재조합 피브로넥틴 기질이 포함된다.
본 발명에 따라서 당해 분야의 기술 내인 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기법이 사용될 수 있다. 이러한 기법은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al, 2001, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; Ausubel, ed., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III; Celis, ed., 1994, "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III; Coligan, ed., 1994, "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III; Gait ed., 1984, "Oligonucleotide Synthesis"; Hames & Higgins eds., 1985, "Nucleic Acid Hybridization"; Hames & Higgins, eds., 1984, "Transcription And Translation"; Freshney, ed., 1986, "Animal Cell Culture"; IRL Press, 1986, "Immobilized Cells And Enzymes"; Perbal, 1984, "A Practical Guide To Molecular Cloning"]을 참고한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 각각의 사이 값은 그 범위의 상한치와 하한치 사이에서, 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 하한치의 단위의 1/10이고, 그 언급된 범위 내 임의의 다른 언급되거나 사이 값이 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들의 더 적은 범위의 상한치 및 하한치는 더 적은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 또한 본 발명 내에 포함되고, 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 적용된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 그렇게 포함된 한계들 중 하나를 배제하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 수치 지정, 예컨대, 온도, 시간, 양, 농도 및, 범위를 포함하는 기타 다른 것들 앞에 사용되는 경우, 용어 "약"은 (+) 또는 (-) 10%, 5% 또는 1%씩 달라질 수 있는 근삿값을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 없는 (substantially free)"은 소정의 물질 또는 세포 유형이 없거나 또는 물질 또는 세포 유형이 거의 없는, 소정의 물질 또는 세포 유형의 약 1% 미만을 갖는 것을 포함한다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "and" 및 "the"는 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함하는 것에 유의해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 조성물 및 방법이 언급된 요소들을 포함하지만 다른 것들을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우 "필수적으로 이루어진"은 언급된 목적을 위한 조합에 대해 임의의 필수적 유의성의 다른 요소들을 배제하는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소들로 필수적으로 이루어진 조성물은 본 발명 개시의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 재료 또는 단계를 배제하지 않을 것이다. "이루어진"은 다른 성분들의 미량 원소 및 실질적인 방법 단계 이상을 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 접속 (transition) 용어의 각각에 의해 정의된 실시양태는 본 발명 개시의 범위 내이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속하는 분야의 숙련자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 또한 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이하에 기술된다.
본 발명의 조성물
본 발명은 염색체 내로 통합되거나, 또는 대안적으로, 통합되지 않고 염색체외 (extrachromosomal) 유전적 물질로서 잔존하는 PAX6을 인코딩하는 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산을 포함하는 분리된 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC) 집단 또는 LSC-유사 집단을 제공하고, 여기서 분리된 LSC 집단은 실질적으로 비-LSC 세포가 없거나 또는 LSC-유사 집단은 실질적으로 비-LSC-유사 세포가 없거나, 또는 분리된 LSC 또는 LSC-유사 집단은 실질적으로 비-LSC 및 비-LSC-유사 세포가 없다. LSC 집단 또는 LSC-유사 집단은 인간과 같은 포유동물로부터일 수 있다. LSC 집단 또는 LSC-유사 집단은 유전적으로 변형될 수 있다. 또한, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단은 LSC 또는 LSC-유사 세포 운명인 상태로 잔존하거나 이 상태로 유지될 수 있다.
발명의 일 실시형태에서, 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산은 PAX6 또는 이의 단편을 발현할 수 있다. PAX6 또는 이의 단편은 LSC 또는 LSC-유사 상태를 유지하거나 또는 줄기세포 또는 전구세포를 LSC 또는 LSC-유사 상태로 지시할 수 있다. 또한, LSC 또는 LSC-유사 상태는 세포 집단을 각막 상피세포 (CEC)를 초래하는 분화 경로로 제한할 수 있다. 다른 실시양태에서, PAX6 또는 이의 단편은 LSC 또는 LSC-유사 상태를 유지하거나 줄기세포 또는 전구세포를 LSC 또는 LSC-유사 상태로 지시하고, 나아가 LSC 또는 LSC-유사 상태는 각막 상피세포를 초래하는 분화 경로로 세포 집단을 제한한다.
발명의 추가 실시양태에서, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단의 90-95%가 p63, PAX6, K19 및 Ki67을 발현한다. 다른 실시양태에서, LSC 집단의 5% 미만이 K5 및 K14를 발현한다. 또 다른 실시양태에서, LSC 집단의 95% 초과가 WNT7A 및 FZD5를 발현한다. 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, LSC-유사 집단의 5% 미만이 WNT7A를 발현한다.
발명의 다른 실시양태에서, 각막 상피세포는 PAX6 및 각막 상피 마커인 K3 및 K12를 발현한다.
일 실시양태에서, 분리된 LSC는 WNT7A, FZD5, PAX6, p63, 케라틴 5 (K5), 케라틴 14 (K14), 케라틴 19 (K19), 및 Ki67을 포함하는 한 세트의 마커를 발현한다. 다른 실시양태에서, LSC의 90-95%가 p63, PAX6, K19 및 Ki67을 발현한다. 또 다른 실시양태에서, LSC의 95% 초과가 WNT7A 및 FZD5를 발현한다. 다른 실시양태에서, LSC의 5% 미만이 K5 및 K14를 발현한다. 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, LSC의 90-95%가 p63, PAX6, K19 및 Ki67을 발현하고, LSC의 95% 초과가 WNT7A 및 FZD5를 발현하고, LSC의 5% 미만이 K5 및 K14을 발현한다.
예를 들어, 윤부 줄기세포 또는 전구세포-유사 세포 또는 LSC-유사 세포는, 충분한 양으로 PAX6의 과발현 시 "LSC-유사" 상태로 스위칭(switch)하거나 이를 채택하는, 비-LSC 줄기세포, 예컨대, 피부 상피 줄기세포 (SESC)이다. 일 실시양태에서, "LSC-유사" 상태로 스위칭된 줄기세포는 핵 내에서 p63 및 PAX6 둘 모두의 발현과 동시에 K19 발현을 유도하였다. 다른 실시양태에서, "LSC-유사" 세포가 LSC 분화 배지의 존재하에서 3-차원 배양 (감소된 성장 인자 Matrigel® 내에 포매됨) 중에 놓이는 경우, "LSC-유사" 세포는 증가된 각막 K3 및 K12 발현과 동시에 감소된 피부 K1 및 K10 발현을 갖는 "CEC-유사" 세포로 분화한다. 예를 들어, 각막 K3 발현은 PAX6을 과발현하지 않지만 비슷하게 시험된 SESC보다 PAX6-과발현된 SESC의 3D 분화에 의해 생산된 CEC-유사 세포 (이는 위임된 SESC로 잔존하는 것이 아니라 LSC 계통으로 전환됨)에서 약 9.4배 더 높을 수 있다.
본 발명은 또한 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단의 다수 세포를 포함하는 규명된 세포 집단을 제공한다. 규명된 세포 집단은 동종이거나 이종일 수 있다. 규명된 세포 집단은 클론성이거나 단일 세포로부터 유래할 수 있다. 본 발명은 또한 각막 상피세포로 발생하도록 위임된, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단의 전구세포를 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 또한 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단의 세포로 구성된 조직을 제공한다.
본 발명은 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단 및 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 발명의 일 실시형태에서, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단은 CEC로의 분화 없이 적어도 17회 계대 동안 배양될 수 있다. 추가적으로, 발명의 다른 실시양태에서, 계대 3회에서 PAX6 및 p63을 발현하는 세포의 백분율은 계대 17회에서의 백분율과 동일하다. 발명의 추가 실시양태에서, 계대 3회에서 K19 및 Ki67을 발현하는 세포의 백분율은 계대 17회 또는 그 이후에서의 백분율보다 약간 더 높다. 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 본 발명의 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단은 CEC로의 분화 없이 40-60 세대 동안 안정하게 증식될 수 있는 세포를 포함한다. 나아가, 발명의 일 실시형태에서, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단은 각막 상피세포 집단으로 분화할 수 있다.
부가적으로, 본 발명은 또한 본 발명의 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단의 세포로 구성된 조직을 제공한다. 또한, 본 발명은 개체에서 각막 상피세포를 형성하기에 충분한 양으로 상기 개체 내로 또는 그 위에 본 발명의 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단의 전구세포를 도입하는 것을 포함하는, 개체에서 조직을 형성하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 염색체 내로 통합되거나, 또는 대안적으로, 통합되지 않고 염색체외 유전적 물질로서 잔존하는 PAX6을 인코딩하는 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산을 포함하는 분리된 피부 상피 줄기세포 (SESC) 집단 또는 SESC-유사 집단을 제공하고, 여기서 분리된 SESC 집단은 실질적으로 비-SESC 세포가 없다. 또한, SESC-유사 집단은 실질적으로 비-SESC-유사 세포가 없거나, 또는 분리된 SESC 또는 SESC-유사 집단은 실질적으로 비-SESC 및 비-SESC-유사 세포가 없거나, 또는 추가로 여전히 분리된 SESC 또는 SESC-유사 집단은 실질적으로 비-SESC, 비-SESC-유사, 비-LSC 및 비-LSC-유사 세포가 없다. 추가적으로, 발명의 일 실시형태에서, 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산은 PAX6 또는 이의 단편을 발현할 수 있고, 이는 LSC 또는 LSC-유사 상태를 유지할 수 있거나 또는 줄기세포 또는 전구세포를 LSC 또는 LSC-유사 상태로 지시할 수 있으며, 이는, 차례로, 각막 상피세포를 초래하는 분화 경로로 세포 집단을 제한할 수 있다. 발명의 다른 실시양태에서, 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산은 PAX6 또는 이의 단편을 발현하고, 이는 SESC 또는 SESC-유사 세포를 LSC 또는 LSC-유사 상태로 지시하고, 이는, 차례로, 각막 상피세포를 초래하는 분화 경로로 세포 집단을 제한한다. SESC 집단 또는 SESC-유사 집단은 인간과 같은 포유동물로부터일 수 있다. SESC 집단 또는 SESC-유사 집단은 유전적으로 변형될 수 있다. 나아가, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단은 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명을 LSC 또는 LSC-유사 세포 운명으로 전환할 수 있다.
일 실시양태에서, 세포 집단의 약 90-95%는 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명 상태로 잔존하면서 p63, K5 및 Ki67을 발현한다. 다른 실시양태에서, 대략 K3 또는 K12 발현은 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명 상태로 잔존하는 세포에서는 검출되지 않는다. 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, WNT7A는 LSC 세포에서의 수준보다 약 4-5배 더 낮은 수준으로 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명 상태로 잔존하는 세포에서 발현된다. 또 다른 실시양태에서, PAX6은 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명 상태로 잔존하는 세포에서 발현되지 않거나 LSC 세포에서의 수준의 약 1/8 미만인 수준으로 발현된다. 추가의 실시양태에서, WNT7A는 SESC-유사 운명 상태로 잔존하는 세포의 70% 초과에서 발현된다. 또 다른 추가 실시양태에서, LSC 또는 LSC-유사 세포 운명으로 스위칭된 집단 내 세포의 90-95%가 p63, PAX6, K19 및 Ki67을 발현한다. 추가적으로, 발명의 실시양태에서, 피부 표피세포는 피부 표피 분화 마커인 K1 및 K10을 발현한다.
부가적으로, 본 발명은 또한 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단 및 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단은 피부 표피세포 또는 각막 상피세포로 분화하지 않으면서 적어도 17회 계대 동안 배양될 수 있다. 일 실시양태에서, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단은 피부 표피세포 또는 각막 상피세포로 분화하지 않으면서 40-60 세대 동안 안정하게 증식될 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단은 세포 운명이 LSC 또는 LSC-유사 세포 운명으로 스위칭되어 있는 SESC 또는 SESC-유사 세포를 포함할 수 있다. 나아가, 일 실시양태에서, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단은 LSC 또는 LSC-유사 세포 운명을 채택하고 있고 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명은 부재한다. SESC 집단 또는 SESC-유사 집단은 각막 상피세포로 분화할 수 있다. 일 실시양태에서, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단은 각막 상피세포로 분화할 수 있고, 이는 실질적으로 피부 표피세포가 없다.
본 발명은 또한 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단의 다수의 세포를 포함하는 규명된 세포 집단을 포함한다. 규명된 세포 집단은 동종이거나 이종일 수 있다. 규명된 세포 집단은 클론성이거나 단일 세포로부터 유래할 수 있다. 본 발명은 또한 각막 상피세포로 발생하도록 위임된, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단의 전구세포를 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 또한 본 발명의 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단의 세포로 구성된 조직을 제공한다. 나아가, 본 발명은 또한 개체에서 각막 상피세포를 형성하기에 충분한 양으로 상기 개체 내로 또는 그 위에 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단의 전구세포를 도입하는 것을 포함하는, 개체에서 조직을 형성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법
발명의 일 실시형태에서, 본 발명은 포유동물 윤부 줄기세포 (LSC)의 배양에 관한 것이다. 윤부 줄기세포는 인간 공여자로부터의 각공막 또는 각막 윤부 조직으로부터 유래된다. 구체적으로, 본 발명은 자가-재생하는 윤부 줄기세포를 이용한 시스템이고, LSC의 거대 집단, 예를 들어 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 윤부 줄기세포를 포함할 수 있다. 각막 윤부 조직을 분리하는 전형적인 과정은 공여자 눈의 각막 표면의 상위 (superior) 또는 측두 (temporal) 사분역으로부터 0.8-3 mm2의 윤부 조직으로 구성된 작은 생검을 외과적으로 제거하는 것이다. 예를 들어, 층판 각막절제술 (lamellar keratectomy)에 의해 각막 윤부로부터 이러한 생검을 수득하는 과정은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 윤부 줄기세포를 생성하기 위해 사용된 윤부 조직 생검의 공여자는 또한 조직 시스템 이식물, 임플란트, 또는 이식편 (즉, 자가 조직 시스템)의 수용자일 수 있다. 대안적으로, 윤부 조직 생검의 공여자가 수용자가 아닌 경우, 공여자는 예를 들어 생체-적합성 공여자, 예를 들어, 이식물 또는 이식편의 수용자의 가까운 친척이거나, 또는 생체-적합성 (예컨대, 조직적합성) 시체 (즉, 동종이형 조직 시스템)로부터일 수 있다. 이식된 세포 또는 조직은 조직 거부로 인한 문제를 회피하기 위하여 이식편의 수용자와 유전적으로 적합하거나 이와 동일한 것이 일반적으로 바람직하다.
본 발명의 LSC는 각막 상피세포로 분화하는 능력을 갖는 미분화되거나 실질적으로 미분화된 세포이다. 미분화된 세포의 형태학적 특징은 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 이 기술분야에서의 숙련자는, 각막 상피의 윤부 줄기세포와 같이 본 발명의 실시양태에 유용한 세포가 이들이 그로부터 수득되는 생체 내 부위와 같은 다수의 보체 인자, 및/또는 이들의 형태 또는 크기 (예컨대, 평균 직경), 뿐만 아니라 ATP-결합 카세트 서브패밀리 G 멤버 2 (ABCG2), 전사 인자 p63, Bmi-1, Notch-1, 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA4), 단계-특이적 배아 항원-3 (SSEA3), N-캐드헤린, CD73, CD105, CD54, CD117, Oct-4, Ki67, Nanog, Rex1, Sox2, Tra-1-60, Tra-1-81, 줄기세포 인자, 및 사이토케라틴 (K), 예컨대 K1, K3, K5, K10, K12, K14 또는 K15, K19 및 데스모글레인 (Desmoglein)-3 (예컨대, Nakatsu et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science 2011; 52: 4734-4741; Truong et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 52: 6315-6320; Dua et al.,Surv Ophthalmol. 2000 Mar-Apr;44(5): 415-25; Watson et al., Curr Eye Res. 2013 Apr 10; Meyer-Blazejewska et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 Feb;51(2): 765-74; and Rama et al., N Engl J Med 2010; 363: 147-55; Thomson et al., (Science 282: 1145-1147, 1998), Reubinoff et al. (Nature Biotech. 18: 399-403, 2000) 참조)와 같은 바이오마커의 존재, 부재 및/또는 발현 수준에 의해 특징 분석되는 것임을 이해한다. 발명의 예시적인 실시양태에서, 인간 윤부 줄기세포는 ATP-결합 카세트 서브패밀리 G 멤버 2 (ABCG2), -전사 인자 p63α, 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA4), N-캐드헤린, 및 사이토케라틴 (K), 예컨대 K1, K3, K5, K10, K12, K14 또는 K15의 하나 이상의 발현을 조사함으로써 특징 분석된 발현 프로파일을 나타낸다. 발명의 실시양태에서, 인간 윤부 줄기세포 또는 피더 세포의 다른 특징, 예를 들어 세포 크기 또는 형태가 또한 확인되거나 또는 특징 분석된다.
예를 들어, 일단 생검이 공여자로부터 제거되면, 이는 윤부 조직 생검의 충분한 부분이 윤부 줄기세포의 분리를 허용하기 위해 생육가능한 상태로 존재하는 그러한 방식으로 관리되어야 한다. 일 실시양태에서, 윤부 조직 생검은 생검의 생존력을 지지하는 배지로 운반되거나 그 안에 보관된다. 생검의 보관 또는 운반을 위한 배지의 예시는 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagles Medium: DMEM) 및 Ham's F-12 (비율 1:1), DMSO (0.1-0.5%), 재조합 인간 표피 성장 인자 (rhEGF; 0.5-2 ng/ml), 인슐린 (0.5-5 μg/ml), 트랜스페린 (0.5-5 μg/ml), 소디움 셀레나이트 (0.5-5 μg/ml), 히드로코르티손 (0.1-0.5 μg/ml), 콜레라 독소 A (0.01-0.1 μmol/l), 겐타마이신 (10-50 μg/ml), 및 암포테리신 B (0.5-1.25 μg/ml)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 배지는 기능적으로 등가인 성분 또는 상이한 항생제가 보충될 수 있다. 배지는 인간 제대혈 혈청 (3-5%)이 추가로 보충될 수 있다. 윤부 세포 생검은 공여자로부터 외과적 제거의 48시간 이내에 배양 중에 놓일 수 있다.
윤부 줄기세포는 운반 전에 또는 그에 뒤이어 조직 생검으로부터 직접적으로 정제될 수 있다. 윤부 조직 생검은 온전한 체외이식편 (explant)으로서 배양될 수 있거나, 또는 배양되기 전에 단일 (또는 감소된) 세포 현탁액으로 해리될 수 있다. 예를 들어, 조직은 증가된 생물학적 활성을 갖는 특정 집단에 대해 정제될 수 있다. 정제는 당해 분야에 공지된 수단을 사용하여 수행될 수 있거나, 또는 본원에 기술된 바와 같은 LSC 마커에 대한 양성 선택에 의해 달성될 수 있다. 발명의 일 실시형태에서, 윤부 줄기세포는 살균 방식으로 기계적으로 분해되고 수집된 조직으로부터 세포의 해리를 허용하도록 효소로 처리된다. 이러한 효소에는 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 히알루로니다제 및/또는 Stem Pro Accutase (Fischer)와 같은 상업적 제품이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 윤부 줄기세포의 현탁액은 이어서 세척되고, 생존력에 대해 평가되고, 본 발명의 실시를 위해 직접적으로 사용되거나 또는 증대를 위해 배양될 수 있다. 일부 상황에서는, 조건화 배지에 의한 생성에 사용하기 전에 세포를 증대시키는 것이 바람직할 것이다. 증대는 본원에 기술된 바와 같은 특정 인자와 함께 생체 외 배양에 의해 수행될 수 있다.
윤부 조직이 공여자로부터 생검된 후, 이를 배양 배지를 이용해, 일 실시양태에서는 세포외 기질 또는 생체코팅된 표면, 예를 들어 세포외 기질 담체 또는 생체코팅된 페트리 디쉬와 같은 적합한 지지 기질을 이용해 배양 중에 놓이게 된다. 일 실시양태에서, 지지 기질의 존재는 조직 배양 플레이트 또는 용기에 대한 생검 내 윤부 줄기세포의 결합을 촉진하고, 그로써 윤부 줄기세포의 성장을 촉진한다. 이식편은 배양 중에 놓이기 전에 작은 조각으로 절단될 수 있다.
인간 양막은 동결-해동, 효소적 분해, 및 기계적 스크래핑 (scraping)에 의해 내인성 양막 상피세포를 제거하고, 이어서 성장 인자, 세포외 기질 화합물, 및/또는 부착-증강 분자로 표면을 처리함으로써 윤부 줄기세포의 성장을 증강시키도록 준비될 수 있다. 일 실시양태에서, 기저막 또는 간질을 위로한 채 (side up), 양막은 LSC 배양을 위한 배양 플레이트 상에 부드럽게 부착된다.
시험관 내에서 LSC를 지지할 수 있는 임의의 배지가 LSC를 배양하는데 사용될 수 있다. LSC의 성장을 지지할 수 있는 배지 제제는 최소 필수 배지 Eagle, ADC-1, LPM (소 혈청 알부민-비함유), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지 (Fitton-Jackson 변형 존재 및 부재), 기저 배지 Eagle (BME-Earle 염 염기의 첨가 포함), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM-혈청 비함유), Yamane, IMEM-20, 글래스고 (Glasgow) 변형 이글 배지 (GMEM), Leibovitz L-15 배지, McCoy's 5A 배지, 배지 M199 (M199E-Earle 염 염기의 첨가 포함), 배지 M199 (M199H-Hank 염 염기 포함), 최소 필수 배지 Eagle (MEM-E-Earle 염 염기 포함), 최소 필수 배지 Eagle (MEM-H-Hank 염 염기 포함) 및 최소 필수 배지 Eagle (비-필수 아미노산 함유 MEM-NAA), 알파 변형된 최소 필수 배지 (αMEM), 및 로스웰 팍 연구소 (Roswell Park Memorial Institute) 배지 1640 (RPMI 배지 1640), 상피세포용 EPILIFE® 배양 배지 (Cascade Biologicals), OPTI-PRO™ 혈청-비함유 배양 배지, VP-SFM 혈청-비함유 배지, IMDM 고도 농축 기본 배지, KNOCKOUT™ DMEM 저 오스몰농도 배지, 293 SFM II 정의된 혈청-비함유 배지 (모두 Gibco에 의해 제조됨; Invitrogen), HPGM 조혈 전구체 성장 배지, Pro 293S-CDM 혈청-비함유 배지, Pro 293A-CDM 혈청-비함유 배지, UltraMDCK™ 혈청-비함유 배지 (모두 Cambrex에 의해 제조됨), STEMLINE® T-세포 증대 배지 및 STEMLINE® II 조혈 줄기세포 증대 배지 (둘 모두 Sigma-Aldrich에 의해 제조됨), DMEM 배양 배지, DMEM/F-12 영양분 혼합 성장 배지 (둘 모두 Gibco에 의해 제조됨), Ham's F-12 영양분 성장 배지, M199 기본 배양 배지 (둘 모두 Sigma-Aldrich에 의해 제조됨), 및 다른 상응가능한 기본 배지 등을 포함하고; 다수의 많은 것들 중에서 특히, 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713. DM 145, Williams'G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 배지는 DMEM이다. 이들 및 다른 유용한 배지가 그중에서도 특히 GIBCO (Grand Island, N.Y., USA) 및 Biological Industries (Bet HaEmek, Israel)로부터 이용가능하다. 다수의 이들 배지가 문헌 [Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62-72, edited by William B. Jakoby and Ira H. Pastan, published by Academic Press, Inc.]에 요약되어 있다.
본 발명의 방법에 유용한 배지의 추가적인 비-제한적 예시는 소의 태아 혈청, 송아지 혈청 또는 다른 종의 혈청을 적어도 1% 내지 약 30%, 적어도 약 5% 내지 15%, 예컨대, 약 10%의 농도로 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 인간 혈청을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 사용된 배지는 피더-비함유, 혈청-비함유 및 이종-비함유 배지이다. 예를 들어, 윤부 조직 생검을 운반하는데 사용되는 배지, 생검을 배양하는데 사용되는 배지, 윤부 줄기세포를 배양하는데 사용된 농축 배지, 및 조직 시스템을 운반하는데 사용되는 배지를 포함하는, 조직 시스템을 제조하는데 사용되는 배지는 동물 기원의 임의의 혈청 또는 다른 인자를 함유하지 않는다. 이는 이종발생 성분으로 조직 시스템이 오염될 임의의 위험성을 최소화하고, 그로써 인간 투여에 안전한 조직 시스템을 만드는데 도움이 될 것이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 피더-비함유, 혈청-비함유 및 이종-비함유 배지는 배지 내 모든 성분들이 화학적으로 규명되고, 규명되지 않은 동물-유래 또는 인간-유래 산물은 함유하지 않는 화학적으로 규명된 배지이다.
LSC의 배양에 적용될 수 있는, 세포 배양 및 줄기세포를 배양하는 것과 관련된 일반적 기법의 경우, 실무자는 표준 교과서 및 리뷰, 예를 들어, 본원에 각각이 참조로서 포함되는 문헌 [E. J. Robertson, "Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach" ed., IRL Press Ltd. 1987; Hu and Aunins (1997), Curr. Opin. Biotechnol. 8: 148-153; Kitano (1991), Biotechnology 17: 73-106; Spier (1991), Curr. Opin. Biotechnol. 2: 375-79; Birch and Arathoon (1990), Bioprocess Technol. 10: 251-70; Xu et al. (2001), Nat. Biotechnol. 19(10): 971-4; and Lebkowski et al. (2001) Cancer J. 7 Suppl. 2: S83-93]을 참조할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태는 ROCK (Rho-연관 단백질 키나제) 억제제를 포함하는 배양 배지를 포함한다. ROCK 억제제의 첨가는, 특히 줄기세포를 베양할 때 아노이키스 (anoikis)를 예방하는 것으로 나타났다. ROCK 억제제는 당해 분야에 공지되어 있으며, 일 예로서, R)-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드 모노하이드레이트 (Y-27632; Sigma-Aldrich), 5-(1,4-디아제판-1-일설포닐) 이소퀴놀린 (파수딜 또는 HA 1077; Cayman Chemical), H-1152, H-1152P, (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]호모피페라진, 2HCl, ROCK 억제제, 디메틸파수딜 (diMF, H-1152P), N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아, Y-39983, Wf-536, SNJ-1656, 및 (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀 디히드로클로라이드 (H-1152; Tocris Bioscience), 및 이의 유도체 및 유사체로부터 선택된다. 현재 Rho-키나제 억제제를 개발하고 있는 회사에는 Senju Pharmaceuticals (Osaka, Japan), Novartis (Basel, Switzerland), Kowa Pharmaceutical (Nagoya, Japan), Santen (Ube Industries와 협업함) (Tokyo, Japan), 및 Inspire Pharmaceuticals (Durham, N.C.)이 포함된다. - 온라인 저널과 연관된 온라인 뉴스레터에 2009년 3월 20일자로 공개된 Lama Al-Aswad에 의한 Rho-키나제 억제제에 대한 리뷰에서 더 많이 확인된다 [Review of Opthalmology Online at: http://www.revophth.com/content/d/glaucoma_management/d/1222/p/23008/c/22947/#sthash.H16F1ABU.dpuf]. 추가적인 ROCK 억제제에는 이미다졸-함유 벤조디아제핀 및 유사체가 포함된다 (에컨대, WO 97/30992 참조). 기타에는, 예를 들어 국제특허공개 WO 01/56988; WO 02/100833; WO 03/059913; WO 02/076976; WO 04/029045; WO 03/064397; WO 04/039796; WO 05/003101; WO 02/085909; WO 03/082808; WO 03/080610; WO 04/112719; WO 03/062225; 및 WO 03/062227에 기술된 것들이 포함된다. 이들 경우의 일부에서, 억제제 내 모티프는 인다졸 코어; 2-아미노피리딘/피리미딘 코어; 9-데아자구아닌 유도체; 벤즈아미드-포함; 아미노퓨라잔-포함; 및/또는 이들의 조합을 포함한다.
Rock 억제제는 또한 작은 GTP-결합 단백질 (예컨대, Gem, RhoE, 및 Rad)와 같은 ROCK 활성화의 음성 조절인자를 포함하는데, 이들은 ROCK 활성을 약화시킬 수 있다. 본 명세서의 특정 실시양태에서, ROCK1이 ROCK2 대신에 표적되고, 예를 들어, WO 03/080610은 ROCK 억제제와 같은 키나제 억제제로서 이미다조피리딘 유도체, 및 ROCK1 및/또는 ROCK2의 효과를 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기에 언급된 출원의 개시는 본원에 참조로서 포함된다. Rho 억제제는 또한 ROCK (Rho-활성화 키나제)와의 상호작용에 의해 하류에 작용하여 Rho의 억제를 초래할 수 있다. 이러한 억제제가 미국특허 제6,642,263호에 기술되어 있다 (이의 개시는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다). 사용될 수 있는 다른 Rho 억제제가 미국특허 제6,642,263호 및 제6,451,825호에 기술되어 있다. 이러한 억제제는, 예컨대, 미국특허 제6,620,591호 (이들 모두 그 전체가 참조로서 본원에 포함됨)에 기술된 통상적인 세포 스크리닝 분석을 이용하여 동정될 수 있다.
배양 배지는 또한 배지 중에 적합한 농도로 LSC를 배양하는데 필요한 성장 인자, 사이토카인, 및 호르몬을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 배지는 또한, 이들로 제한되는 것은 아니지만, LSC의 배양에 유용한 항생제, 함염증제, 항바이러스제, 또는 분열촉진 또는 분화 화합물을 포함하는, 하나 이상의 관심 화합물을 함유할 수 있다. 세포는 하나의 비-제한적인 실시양태에서는 약 27℃ 내지 40℃ 사이의 온도, 다른 비-제한적인 실시양태에서는 약 31℃ 내지 37℃에서, 또 다른 비-제한적인 실시양태에서는 가습 인큐베이터 내에서 성장될 수 있다. 이산화탄소 함량은 약 2% 내지 10% 사이로 유지될 수 있고 산소 함량은 약 1%과 22% 사이로 유지될 수 있지만; 본 발명이 어떠한 방식으로도 LSC를 분리하고 배양하는 임의의 하나의 방법으로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 그보다, LSC를 분리하고 배양하는 모든 방법이 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
배지는 또한 성장 인자로 보충될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "성장 인자"는 세포 증식 및/또는 분화를 활성화하는 일차적 결과를 갖는 세포 표면 상의 수용체에 결합하는 단백질을 지칭한다. 윤부 조직을 배양하는데 사용되는 성장 인자는, 예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 백혈병 억제 인자 (LIF), 신경 성장 인자 (NGF), 인슐린 성장 인자 (IGF), TGF-베타, 간세포 성장 인자, 각막세포 성장 인자, 인슐린, 소디움 셀레나이트, 인간 트랜스페린, 또는 인간 백혈병 억제 인자 (hLIF), 소 뇌하수체 추출물 및 기타 등등뿐만 아니라, 이들의 조합으로부터 선택된다. 그러나, 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적합한 배양 배지가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 윤부 세포는 LSC가 바람직하게는 배양액 중에서 증식하도록 유도하는 사이토카인 또는 다른 성장 인자로 처리된다. 윤부 세포의 배양에 사용되는 다른 인자는 DMSO 및 히드로코르티손, 글루코스, L-글루타민, 엽산, 소디움 바이카보네이트, 아데닌, CaCl2, 프로게스테론, 에탄올아민, 트리요오도티로닌, 포스포릴에탄올아민 및 기타 등등으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항생제는 마크롤라이드 (예컨대, 토브라마이신 (TOBI®)), 세팔로스포린 (예컨대, 세팔렉신 (KEFLEX®)), 세프라딘 (VELOSEF®)), 세프록심 (CEFTIN®, 세프로질 (CEFZIL®), 세파클로르 (CECLOR®), 세픽심 (SUPRAX® 또는 세파드록실 (DURICEF®), 클라리트로마이신 (예컨대, 클라리트로마이신 (Biaxin)), 에리트로마이신 (예컨대, 에리트로마이신 (EMYCIN®)), 페니실린 (예컨대, 페니실린 V (V-CILLINK® 또는 PEN VEEK®)) 또는 퀴놀론 (예컨대, 오플록사신 (FLOXIN®), 시프로플록사신 (CIPRO®), 오르노르플록사신 (NOROXIN®)), 아미노글리코시드 항생제 (예컨대, 아프라마이신, 아르베카신, 밤베르마이신, 부티로신, 디베카신, 네오마이신, 네오마이신, 운데실레네이트, 네틸미신, 파로모마이신, 리보스타마이신, 시소마이신, 및 스펙티노마이신), 암페니콜 항생제 (예컨대, 아지담페니콜, 클로람페니콜, 플로르페니콜, 및 티암페니콜), 안세마이신 항생제 (예컨대, 리파마이드 및 리팜핀), 카르바세펨 (예컨대, 로라카르베프), 카르바페넴 (예컨대, 비파페넴 및 이미페넴), 세팔로스포린 (예컨대, 세파클로르, 세포드록실, 세파만돌, 세파트리진, 세파제돈, 세포조프란, 세프피미졸, 세프피라미드, 및 세프피롬), 세파마이신 (예컨대, 세프부페라존, 세피네타졸, 및 세프미녹스), 모노박탐 (예컨대, 아즈트레오남, 카루모남, 및 티게모남), 옥사세팜 (예컨대, 플로목세프, 및 목살락탐), 페니실린 (예컨대, 암디노실린, 암디노실린 피복실, 아목시실린, 바캄피실린, 벤질페니실린산, 벤질페니실린 소디움, 에피실린, 펜베니실린, 플록사실린, 페남실린, 페네타메이트 히드리오디드, 페니실린 o-베네타민, 페니실린 0, 페니실린 V, 페니실린 V 벤자틴, 페니실린 V 히드라바민, 페니메피실린, 및 펜시히실린 포타슘), 리노코사미드 (예컨대, 클린다마이신, 및 린코마이신), 마크롤라이드 (예컨대, 아지트로마이신, 카르보마이신, 클라리토마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 및 에리트로마이신 아시스트레이트), 암포마이신, 바시트라신, 카프레오마이신, 콜리스틴, 엔듀라시딘, 엔비오마이신, 테트라사이클린 (예컨대, 아피사이클린, 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린, 및 데메클로사이클린), 2,4-디아미노피리미딘 (예컨대, 브로디모프림), 니트로퓨란 (예컨대, 퓨랄타돈, 및 퓨라졸리움 클로라이드), 퀴놀론 및 이의 유사체 (예컨대, 시녹사신, 시프로플록사신, 클리나플록사신, 플루메퀸, 및 그레파글록사신), 설폰아미드 (예컨대, 아세틸 설파메톡시피라진, 벤질설파미드, 노프릴설파미드, 프탈릴설파세타미드, 설파크리소이딘, 및 설파사이틴), 설폰 (예컨대, 디아티모설폰, 글루코설폰 소디움, 및 솔라설폰), 시클로세린, 뮤피로신 및 튜베린이다.
유용한 항염증제에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 비-스테로이드성 함염증 약물, 예컨대 살리실산, 아세틸살리실산, 메틸 살리실레이트, 디플루니살, 살살레이트, 올살라진, 설파살라진, 아세트아미노펜, 인도메타신, 술린닥, 에토돌락, 메페남산, 메클로페나메이트 소디움, 톨메틴, 케토롤락, 디클로페낙, 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 소디움, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루르빈프로펜, 옥사프로진, 피록시캄, 멜록시캄, 암피록시캄, 드록시캄, 비복시캄, 테녹시캄, 나부메톰, 페닐부타존, 옥시펜부타존, 안티피린, 아미노피린, 아파존 및 니메술리드; 이들로 제한되는 것은 아니지만, 질레우톤, 아우로티오글루코스, 골드 소디움 티오말레이트 및 아우라노핀을 비롯한 류코트리엔 길항제; 및 이들로 제한되는 것은 아니지만, 메토트렉세이트, 콜치친, 알로퓨리놀, 프로베네시드, 설핀피라존 및 벤즈브로마론을 비롯한 다른 항염증 제제가 포함된다.
유용한 항바이러스제에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 지도부딘, 아시클로비르, 강시클로비르, 비다라빈, 이독수리딘, 트리플루리딘, 및 리바비린와 같은 뉴클레오시드 유사체, 뿐만 아니라 포스카르넷, 아만타딘, 리만타딘, 사퀴나비르, 인디나비르, 리토나비르, 및 알파-인터페론이 포함된다.
일 실시양태에서, LSC의 분리된 집단은, 예를 들어 불활성화된 인간 배아 섬유아세포로부터 수득된 조건화 배지로 농축된 배양 배지, 인간 백혈병 억제 인자로 농축된 배양 배지, 또는 디메틸 설폭사이드, 재조합 인간 표피 성장 인자, 인슐린, 소디움 셀레나이트, 트랜스페린, 프로게스테론, 퓨트레신, 셀레나이트 염, 히드로코르티손, 및 염기성 섬유아세포 성장 인자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 가용성 인자로 보충된 배양 배지에서, 실질적으로 분화하지 않으면서 이 세포의 증대를 허용할 배지에서 배양된다. 대안적으로, LSC는, 예를 들어, 특정 성장 인자 또는 배지, 예컨대 각막 상피 배양 배지 CnT-30 (CELLnTEC, Zen-Bio) 또는 화학적으로 규명된 이종-비함유 배양 배지, RegES (Regea 06/015, Regea 07/046, 및 Regea 08/013; Rajala et al., 2010, PLOS One 5(4): e10246)를 사용하여, 이 세포가 각막 상피세포로 분화하도록 허용할 배지에서 배양된다.
윤부 조직 생검을 배양하는 예시적인 방법은 세포외 기질 또는 생체코팅된 배양 플레이트 위에 체외이식편을 놓기 전 또는 그 후 중 하나에서, 체외이식편을 수분간 건식 인큐베이션에 적용하는 것이다. 그 후에 체외이식편이 세포외 기질 또는 생체코팅된 조직 배양 표면에 부착하도록 소량의 배양 배지가 체외이식편에 첨가된다. 수 시간 내지 하루 후, 추가적인 배지를 부드럽게 첨가하고 체외이식편을 수일간 37℃, CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하고, 격일로 배지를 교환한다. 이러한 예시에서, 바람직하게는 줄기세포가 배양액 중에서 증식하기 시작한 후 최초 윤부 조직 생검의 조각을 배양액으로부터 제거한다.
다른 실시양태에서, 증대 전에, 윤부 조직 생검을 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 사용할 수 있고, 이는 이어서 본원에 기술된 조직 시스템을 생성하도록 배양된다. 예를 들어, 윤부 조직 생검을 세척한 후 예를 들어, 트립신-EDTA (예컨대, 약 0.25%로 20-30분간) 또는 디스파제 (예컨대, 4℃에서 밤새)를 이용해 효소적으로 처리하여, LSC를 포함하는 단일 세포 현탁액을 생성한다. 효소적 처리는 상피의 분리를 허용하고; 따라서, 간질 또는 중간엽 세포가 단일 세포 현탁액 중에 감소되거나 부재할 수 있다.
윤부 조직을 수일간, 예를 들어 세포가 융합성이 될 때까지, 배양한 후, LSC를 배양액으로부터 분리할 수 있다. 이 예시에서, 바람직하게는 윤부 조직 배양은 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 융합성이 될 때까지 성장하도록 허용된다. 일 실시양태에서, 윤부 세포를 먼저, 예를 들어, 트립신-EDTA 또는 디스파제 용액을 사용한, 예를 들어, 효소적 분해를 통해, 세포외 기질 또는 생체코팅된 조직 배양 플레이트로부터 해리된다. LSC는 또한 면역표지 (immunolabeling) 및 형광 분류 (fluorescence sorting), 예를 들어, 고상 흡착, 형광-활성화 세포 분류 (fluorescence-activated cell sorting: FACS), 자기-친화성 세포 분류 (magnetic-affinity cell sorting: MACS) 등과 같이, 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다양한 방법을 이용하여 배양액 중에서 다른 세포로부터 분리될 수 있다. 특정 실시양태에서, LSC는 분류, 예를 들어, 특정 세포-표면 마커의 면역형광 분류를 통해 분리된다. 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려진 2종의 바람직한 분류 방법이 MACS 및 FACS이다.
분류 기법은 LSC를 배양액 중의 다른 세포로부터 분리하기 위해 적합한 줄기세포 마커의 사용을 포함할 수 있다. LSC는 마커와 특이적으로 상호작용하는 하나 이상의 표지된-항체 또는 인자를 사용하여 하나 이상의 특정 표면 마커에 의해 식별되고, FACS의 경우 형광 표지 또는 MACS의 경우 상자성 (paramagnetic) 물질과 같은 표지의 존재를 근거로 분류될 수 있다. 배양된 윤부 세포로부터 LSC를 분리하는데 사용될 수 있는 적합한 줄기세포 특이적 표면 마커에는 ABCG2, 전사 인자 p63, SSEA4, SSEA3, N-캐드헤린, CD73, CD105, CD54, CD117, Oct-4, Nanog, TDGF, UTX-1, FGF-4, Rex1, Sox2, Tra-1-60, Tra-1-81, 줄기세포 인자, 및 Kl, K3, K10, K12, K14 또는 K15, K19가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이 수단에 의해서, LSC에 양성인 세포-표면 마커의 농축된 집단이 윤부 조직 생검으로부터 배양된 세포의 혼합 집단으로부터 수득된다. 대안적으로, 세포는 LSC에서는 발견되지 않는 세포-표면 마커에 대한 선별에 의해 바람직하지 않은 세포를 제거하도록 분류될 수 있다. 윤부 조직으로부터 분리된 LSC의 경우에, LSC는 하기 세포-표면 마커에 대해 음성이다: CD34, CD45, CD14, CD133, CD106, CD11c, CD123, 및 HLA-DR.
분류에 의해 수득된 농축된 윤부 세포 배양액은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% LSC를 갖는다. 대안적 실시양태에서, 윤부 세포를 함유하는 혼합 세포 배양액은 특정 유전자 마커의 발현에 대한 스크리닝에 의해 LSC의 존재에 대해 스크리닝된다. 혼합 윤부 세포 배양액의 경우에, LSC의 집단은 ABCG2, 전사 인자 p63, SSEA4, SSEA3, N-캐드헤린, CD73, CD105, CD54, CD117, Oct-4, Nanog, TDGF, UTX-1, FGF-4, Rex1, Sox2, Tra-1-60, Tra-1-81, 줄기세포 인자, 및 K1, K3, K10, K12, K14 또는 K15, K19와 같은 유전자 마커뿐만 아니라 미분화된 세포의 다른 유전자 마커, 또는 이들의 조합의 발현에 의해 동정될 수 있다.
LSC에 대해 농축된 윤부 세포의 집단을 상기 방법 중 하나를 이용하여 분리한 후, 분리된 세포는 바람직하게는 손상되거나 이환된 눈 위에 이식하거나, 임플란팅하거나, 또는 그라프팅하기 위한 LSC의 성장 및 조직 시스템의 발달을 지지하는 조건 및 배지 중에서 배양된다. 바람직하게는, 이들 조건에서 배양된 조직 시스템은 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% LSC를 포함할 것이다. 일 실시양태에서, 분리된 LSC는 LSC를 이용한 조직 시스템의 발달용 농축된 배지의 존재하에서 조직 기제 (base) 상에서 배양된다. 다양한 인자가 성장 또는 증대의 다양한 단계에서 첨가될 수 있다. 예를 들어, ROCK 억제제가 수회 계대의 증대 후에 첨가될 수 있다. 조직 기제는 천연 안구 표면과 가까운 특징, 예를 들어 투명하고, 얇고, 탄력이 있고, 생체적합성이며, 비-혈관 및 비-항원성인 것과 같은 특징을 가질 수 있고, 또한 LSC의 성장뿐만 아니라 이식, 임플란트, 또는 그라프트 후의 정상적인 분화를 지지할 수 있다.
LSC를 포함하는 윤부 세포를 LSC가 실질적으로 미분화된 상태로 잔존하는 것을 허용하도록 적합한 배지에서 배양 또는 계대된다. 비록 집단 내부의 LSC의 콜로니가 분화되는 이웃하는 세포에 인접할 수 있지만, LSC의 배양은, 집단이 적합한 조건하에서 배양 또는 계대되는 경우, 그럼에도 불구하고 실질적으로 미분화된 상태로 잔존할 것이고, 개별적 LSC는 세포 집단의 실질적인 부분을 구성한다. 실질적으로 미분화된, 미분화된 줄기세포 배양액은 적어도 약 20% 미분화된 LSC를 함유하고, 적어도 약 40%, 60%, 80%, 또는 90% LSC를 함유할 수 있다. 예를 들어, 배양액 중의 LSC는 약 104/cm2의 적합한 세포 밀도로 유지되어야 하고, 세포가 분화하는 것을 방지하기 위해 배양 배지를 자주 교환하면서, 2차 배양된다 (subcultured). 장기간 배양에서, 세포가 약 70-90% 융합성에서 계대되는 경우, 이들은 작은 클러스터 내로 또는 단일-세포 현탁액 내로 분산될 수 있다. 전형적으로, 세포의 단일 세포 현탁액이 달성되고 나서 계대 후 약 15-20% 융합성을 달성하도록 또 다른 조직 배양 등급의 플라스틱 디쉬 상에 접종된다.
배양액은 LSC가 실질적으로 분화하지 않으면서, 적어도 10, 20, 40, 60, 80, 100회 또는 그 이상의 계대 동안 연속적으로 계대될 수 있다. LSC를 포함하는 윤부 세포 배양액은, 바람직하게는, 이러한 경우에, 인간 제대혈로부터 수집된 약 10-90% 열 불활성화 혈청 및 약 5-10% DMSO와 함께 배양 배지를 포함하는 동결 배지에서, 분화능의 손실 없이 다양한 시점에서 추가 사용을 위해 저온보존될 수 있다. 대안적으로, 동결 배지는 혈청-비함유, 이종-비함유 및 피더-비함유인 화학적으로 규명된 것일 수 있는 것으로 예상된다. 윤부 세포 배양액은, 예를 들어 저온보존에 의해, 매 계대 후 보존된, LSC를 포함할 수 있고, 그로써 추가적 또는 다중 조직 시스템이 단일 윤부 조직 생검으로부터 생성될 수 있게 한다. 이들 저온보존된 배양액은 또한 임의의 소정의 시점에서 추가 사용을 위한 미분화된, 자가-재생, 및 생육가능한 윤부 줄기세포의 풀 (pool)로서 제공할 것이다. 예를 들어, 이들 저온보존된 배양액은, 면역억제, 이전 수술로부터의 합병증, 감염 등으로 인해 수용자 내 조직 시스템이 실패하는 경우 자가 용도를 위한 추가적인 조직 시스템을 생성하는데 사용될 수 있다. 이들 저온보존된 배양액은 또한 생체적합성 환자를 위한 추가적인 조직 시스템을 생성하는데 사용될 수 있다. 이들 저온보존된 배양액의 이용가능성은 또한, 조직 시스템이 실패하는 경우에 공여자로부터 추가적인 윤부 조직을 제거할 필요성을 회피하고, 그로써 장래에 자가 윤부 줄기세포의 공급원의 고갈 위험을 예방할 것이다.
본원에 기술된 조직 시스템이 생성된 후, 이는 이식, 임플란트, 또는 그라프트를 위해 수용자의 위치에 운반될 수 있다. 조직 시스템을 운반하는데 사용되는 수단은 운반 후 이식물, 임플란트, 또는 이식편으로서 여전히 유용한 조직 시스템의 생존력을 충분히 유지할 수 있다. 조직 시스템은, LSC를 포함하는 조직 시스템을 배양하는데 사용되는 농축 배지 또는 성장 인자 없이 운반하는 동안 조직 시스템을 완충하기에 충분한 대체 배지일 수 있는, 운반 배지를 함유하는 용기 (receptacle) 내에서 운반된다. 대안적으로, 수용자는 본원에 기술된 조직 시스템을 보유하는 시설로 옮겨질 수 있고, 그로써 운반 배지에의 필요성을 회피한다.
본원에 기술된 LSC를 포함하는 조직 시스템은 치료적 적용, 예를 들어, 한쪽 또는 양쪽 눈에 윤부 줄기세포 결핍을 갖는 개체를 위한 이식물, 임플란트 또는 이식편으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 조직 시스템은, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 인간, 영장류, 및 가축, 농장 동물, 애완 동물, 또는 경기용 동물, 예컨대, 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소, 마우스 등을 포함하는, 치료를 필요로 하는 임의의 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적", "치료적으로", "치료하기 위해", "치료", 또는 "요법"은 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 대책을 지칭한다. 치료적 처치는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 특정 질환, 병태, 손상 또는 장애의 증상을 감소 또는 제거하거나, 기존 질환 또는 장애의 진행을 지연 또는 약화시키거나 이를 치료하는 것을 포함한다. 이러한 요법을 필요로 하는 개체는 기능을 복구 또는 재생하기 위해 치료적 유효량의 조직 시스템으로 처리될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 조직 시스템의 "치료적 유효량"은 윤부 줄기세포의 손실, 손상, 기능부전, 또는 퇴행에 의해 야기된 개체에서의 생리학적 효과를 정지 또는 약화시키기에 충분한 양이다. 사용된 세포 또는 조직의 치료적 유효량은 개체의 필요, 개체의 연령, 생리학적 상태 및 건강, 목적하는 치료적 효과, 요법에 대해 표적된 조직 영역의 크기, 임플란트 부위, 병리학의 정도, 전달의 선택된 경로, 및 치료 전략에 의존할 것이다. 조직 시스템은 조직 시스템이 의도된 부위에 그라프트하게 하고 기능적 결손 영역을 재구성 또는 재생하는 방식으로 환자에 투여되는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조직 시스템은 안구 손상 또는 질환, 특정 안구 표면 손실을 갖는 개체를 치료적으로 치료하는데 사용된다. 대안적으로, 기술된 조직 시스템은 윤부 조직으로부터 유래된 미분화된 줄기세포의 공급원으로부터 치료적으로 이익을 보게 될 다른 질환 또는 손상을 치료하기 위해, 예를 들어, 화상을 입은 피부 영역을 복구하기 위해 사용될 수 있다. 기술된 조직 시스템은 무홍채증, 다발성-내분비-결핍-연관 각막염, 윤부염, 및 특발증과 같은 유전적 병태에 의해 야기될 수 있는, 일차 윤부 줄기세포 결핍을 갖는 개체, 또는 스티븐-존슨 증후군, 감염 (예컨대, 중증 미생물 각막염), 안구 표면 종양, 화학적 또는 열적 손상 또는 자외선 노출에 의해 야기된 윤부 줄기세포의 외상성 파괴, 다발성 수술 또는 냉동요법, 각막 상피내 종양, 말초 궤양성 또는 염증성 각막염, 허혈성 각막염, 각막병증, 콘텍트 렌즈 또는 렌즈 세정액에 의해 유도된 독성 효과, 면역학적 상태, 안구 반흔성 유사천포창, 익상편, 위익상편 및 기타 등등과 같은 후천적 병태로부터 야기될 수 있는, 이차 윤부 줄기세포 손실을 갖는 개체를 치료하는데 특히 잘 적합하다. 특정 실시양태에서, 조직 시스템은 개체에 이식되고, 임플란트되고, 또는 그라프트되고, 예를 들어, 개체의 손상되거나 이환된 눈에 안정한 윤부 줄기세포 집단을 제공함으로써, 개체에서 안구 손상 또는 질환을 복구할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조직 시스템의 이식은 상피화를 촉진하고, 정상적인 상피 표현형을 유지하고, 염증을 감소시키고, 흉터형성을 감소시키고, 조직의 부착을 감소시키고, 혈관화를 감소시키고, 눈의 시력을 개선한다.
예를 들어, 조직 시스템은 손상된 각막을 복구하도록 이식되고, 임플란트되고, 또는 그라프트될 수 있다. 다수의 이러한 방법이 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있지만, 하나의 이러한 방법은 윤부에서의 각막주위절개술 (periotomy)을 포함하고, 이어서 공막 노출을 위해 윤부주위 각질하 흉터 및 염증성 조직의 제거를 포함한다. 각막의 섬유혈관성 조직은 층판 각막절제술에 의해 제거될 수 있다. 조직 시스템은 수용자 눈의 크기에 따라서 스케일링되고, 상응하는 수용자 윤부 영역에 이식되거나 그라프트될 수 있다. 대안적으로, 조직 시스템은 전체 층판 각막 조직으로 사용될 수 있고, 전체 영역을 커버하도록 표층 각막이식으로서 이식되거나 그라프트될 수 있다. 이식된, 임플란트된, 또는 그라프트된 조직 시스템은 그 후에, 예를 들어, 봉합 또는 당해 분야의 숙련자에 공지된 임의의 다른 수단을 이용하여, 손상된 부위에 고정된다.
본 발명은 또한 본 발명의 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단 또는 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단의 세포를 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 개체 내로 또는 그 위에 도입하는 것을 포함하는, 개체에서 조직을 재생 또는 복구하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 재생 또는 복구된 조직은 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC) 및 각막 상피세포를 포함하는 각막 상피세포 계통의 조직을 포함한다.
본 발명은 개체의 피부 상피 줄기세포 (SESC)로부터 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포를 수득하는 방법을 추가적으로 제공한다. 발명의 실시양태에서, 방법은 SESC를 LSC-유사 세포로 전환하기에 충분한 수준으로 SESC에서 PAX6 단백질을 증가시키기 위해, SESC에서 PAX6 유전자를 도입하거나 PAX6 유전자 발현을 상향-조절하여, 그로써 개체의 SESC로부터 LSC-유사 세포를 수득한다. 일 실시양태에서, 개체의 피부 상피 줄기세포 (SESC)로부터 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포를 수득하기 위한 SESC 내 PAX6 유전자의 도입 또는 PAX6 유전자 발현의 상향-조절은 (a) 개체로부터 SESC를 수득하는 단계; (b) SESC를 피더-비함유 세포 배양액에서 시험관 내 또는 생체 외 배양하는 단계; (c) SESC를 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포로 전환하기에 충분한 양으로 SESC에서 PAX6 단백질을 증가시기 위해 SESC에 적어도 하나의 PAX6 유전자를 도입하거나 SESC에서 PAX6 유전자 발현을 상향-조절하는 단계로, 그로써 개체로부터의 피부 상피 줄기세포 (SESC)로부터 포유동물 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시에 따라서, 방법은 시험관 내 방법, 생체 외 방법이거나 또는 인 시츄 (in situ) 또는 직접적으로 개체에 적용될 수 있다.
일 실시양태에서, 개체는 PAX6 단백질을 인코딩하는 핵산을 도입하고, PAX6 유전자 발현을 상향-조절하고, 또는 PAX6 활성을 증가시키는 제제로 처리된다. 이 제제의 적합한 예시에는 유전자요법 벡터, 바이러스 입자, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 재조합 핵산, 재조합 단백질, PAX6 단백질, PAX6 발현의 소분자 조절인자, PAX6 발현의 음성 조절인자의 억제제, PAX 활성의 음성 조절인자의 소분자 억제제, PAX6 활성의 소분자 증강인자, 또는 이들의 조합이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
PAX6 유전자의 예시에는 PAX6a 유전자, PAX6b 유전자, 조작된 PAX6a 유전자, 조작된 PAXb 유전자, PAX6 유전자 패밀리의 임의의 멤버, PAX6a 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산, PAX6b 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산, 및 PAX6 또는 PAX6-유사 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 임의의 핵산이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 발명의 일 실시형태에서, PAX6 단백질은 PAX6a 단백질, PAX6b 단백질, PAX6 패밀리 단백질의 임의의 멤버, 및 임의의 PAX6 또는 PAX6-유사 활성을 갖는 단백질 중 하나이다. 발명의 실시양태에서, PAX6 또는 PAX6-유사 활성은 내인성 K19의 증가된 발현을 야기할 수 있는 임의의 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 K19 상향-조절된 SECS는 K3 및 K12 유전자의 증가된 발현 및 K1 및 K10 유전자의 감소된 발현을 갖는 각막 상피세포 (CEC) 또는 CEC-유사 세포로 분화할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 본 발명의 LSC-유사 세포로부터 각막 상피세포 (CEC)-유사 세포를 수득하고, 추가로 LSC-유사 세포를 CEC-유사 세포로 전환하기 위해 (c)의 세포를 피더-비함유 LSC 분화 배지에서 분화시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
발명의 실시양태에서, 피더-비함유 LSC 분화 배지는 화학적으로 규명될 수 있다. 발명의 다른 실시양태에서, 배지는 이종-비함유이거나 또는 배양된 세포와 동일한 종으로부터 유래된 성분이 아닌 성분을 함유하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 배지는 혈청-비함유일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 배지는 임의의 동물 또는 인간 산물이 결여될 수 있다.
예를 들어, 이종-비함유 배지 또는 이종-비함유 배양 배지는 배지가 외래 동물-유래 산물 또는 물질을 함유하지 않는 것이다. 특히, 배양 배지 내 어떠한 산물 또는 물질도 외래 동물 세포에서 생산되거나 외래 동물 세포와 접촉되지 않는다. 소 태아 혈청을 포함하는 배양 배지는 혈청이 소로부터 유래될 것이기 때문에 소 세포가 아닌 인간 세포 또는 임의의 동물 세포를 배양하는데 사용되는 경우에는 이종-비함유인 것으로 고려되지 않을 것이고; 반면, 임의의 동물-유래 산물 또는 물질의 부재하에서 인간 혈청을 포함하는 배양 배지는 인간 세포를 배양하는 경우 이종-비함유로 고려될 것이다. 예를 들어, 이종-비함유 배지는 세균 또는 효모와 같은, 미생물로부터 생산되거나 수득된 산물 또는 물질을 함유할 수 있다. 이종-비함유 배지는 또한 "동물-비함유" 배지로 고려될 수 있다. 이 예시에서, 이종-비함유는 외래 동물-유래 산물 또는 물질의 부재를 지칭한다.
본 발명은 또한 피부 상피 줄기세포 (SESC)로부터 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포를 수득하는 방법을 제공한다. 방법은 (a) 개체로부터 SESC를 수득하는 단계; (b) SESC를 피더-비함유 세포 배양액에서 시험관 내 배양하는 단계; (c) SESC를 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포로 전환하기에 충분한 수준으로 SESC에서 PAX6 단백질을 증가시키기 위해 SESC에서 PAX6 유전자 발현을 상향-조절하는 제제와 접촉시키는 단계로, 그로써 개체로부터의 피부 상피 줄기세포 (SESC)로부터 포유동물 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
적합한 제제의 예시에는 PAX6 유전자를 포함하는 핵산, 유전자요법 벡터, 바이러스 입자, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 재조합 단백질, PAX6 단백질, PAX6 발현의 소분자 조절인자, PAX6 발현의 음성 조절인자의 억제제, PAX 활성의 음성 조절인자의 소분자 억제제, PAX6 활성의 소분자 증강인자, 및 이들의 조합이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
적합한 PAX6 유전자의 예시에는 PAX6a 유전자, PAX6b 유전자, 조작된 PAX6a 유전자, 조작된 PAXb 유전자, PAX6 유전자 패밀리의 임의의 멤버, PAX6a 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산, PAX6b 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산, 및 PAX6 또는 PAX6-유사 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 임의의 핵산이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
발명의 실시에 따라서, PAX6 단백질은 PAX6a 단백질, PAX6b 단백질, PAX6 패밀리 단백질의 임의의 멤버, 또는 임의의 PAX6 또는 PAX6-유사 활성을 갖는 단백질 및 이의 단편 중 하나일 수 있다.
본 발명은 또한 개체로부터 포유동물 LSC를 수득하는 시험관 내 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 방법은 (a) 개체로부터의 눈의 윤부 영역으로부터 샘플을 수득하는 단계; (b) 단일 세포를 수득하기 위해 조직을 해리하는 단계; 및 (c) LSC의 증식을 허용하도록 (b)의 단일 세포를 피더-비함유 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 증식된 LSC는 각막 상피세포 (CEC)로 분화하는 능력을 가지고, 그로써 시험관 내에서 개체로부터 포유동물 LSC를 수득한다. 일 실시양태에서, 윤부 영역은 눈의 각막 윤부을 포함한다. 발명의 실시양태에서, (b)에서 조직을 해리하는 단계는 조직을 더 작은 덩어리 및/또는 단일 세포로 기계적으로 해리하기 위해 장비 또는 도구 (예컨대, 레이저)를 통해 기계적 또는 물리적 해리를 포함한다. 다른 실시양태에서, 해리는 효소, 프로테아제, 화학물질, 금속 킬레이트제, 또는 이들의 조합과 같은 제제 또는 제제들의 사용을 포함한다. 조직을 해리하는 다른 방법이, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 단일 LSC를 수득하기 위해 사용될 수 있다.
발명의 실시양태에서, 피더-비함유 세포 배양 배지는 rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제 또는 백혈병 억제 인자 (LIF) 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. ROCK 억제제의 예시는 Y-27632 (4-[(1R)-1-아미노에틸]-N-4-피리디닐-트랜스-시클로헥산카르복사미드, 디히드로클로라이드)이다.
발명의 다른 실시양태에서, 방법은 기질 또는 세포외 기질 위에 배양함으로써 LSC 또는 LSC-유사 세포를 CEC-유사 세포로 전환하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 피더-비함유 LSC 배양 배지에서 개체로부터 포유동물 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)를 시험관 내에서 수득하고/하거나 증대시키는 방법을 또한 제공한다. 일 실시양태에서, 방법은 (a) 개체로부터의 눈의 윤부 영역으로부터 조직의 샘플을 수득하는 단계; (b) 단일 세포를 수득하기 위해 조직을 해리하는 단계; 및 (c) LSC의 증식을 허용하도록 (b)의 단일 세포를 피더-비함유 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 증식된 LSC는 각막 상피세포 (CEC)로 분화하는 능력을 가지고, 그로써 개체로부터 포유동물 윤부 줄기세포를 시험관 내에서 수득하고 증대시킨다. 발명의 실시양태에서, 방법의 단계 (c)에서, 단일 세포는 기질 또는 세포외 기질 상에서 배양된다.
발명의 실시에 따라서, 기질 또는 세포외 기질은 Matrigel® 또는 그의 등가물, 성장 인자 감소된 Matrigel® 또는 그의 등가물, 콜라겐, 콜라겐 IV, 콜라겐 IV 시트, 포유동물 양막, 인간 양막, 피브리노겐, 트롬빈, 페르리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 재조합 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 프로콜라겐, 히알루론산, 엔탁틴, 헤파란 설페이트, 테나신, 폴리-L-리신, 젤라틴, 폴리-L-오르니틴, 세포외 기질 단백질 (Fischer 또는 Life Tech), 트롬빈 시트 (Fibrin Sealant, Reliseal™, Reliance Life Sciences), 피브리노겐 및 트롬빈 시트 (Reliance Life), 및 이들의 임의의 조합 중 하나일 수 있다.
다른 실시양태에서, 방법은 증식된 LSC 또는 LSC-유사 세포가 계대 전 약 70-90% 융합성 및 계대 후 약 15-20%에서 계대되는 단계 (d)를 추가로 포함한다. 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 증식된 LSC 또는 LSC-유사 세포가 LSC 또는 LSC-유사 세포로서 안정하게 계대될 수 있는 횟수는 약 17회 이상의 계대이다. 다른 실시양태에서, LSC는 약 16-20시간의 세대 시간으로 증식할 수 있다. 또한, LSC 또는 LSC 유사 세포는 CEC로 분화하지 않으면서 약 40-60 세대 동안 안정하게 계대될 수 있다. 발명의 실시양태에서, 피더-비함유 LSC 배양 배지는 이틀에 1회 교환될 수 있다.
발명의 실시에 따라서, 윤부 영역은 눈의 각막 윤부, 각막과 결막 사이의 마진, 각막과 공막의 경계, 각공막 윤부, 울타리간 그물 능선을 포함하는 영역, 또는 포그트의 울타리를 포함하는 영역을 포함할 수 있다.
단계 b에서, 방법은, 일 실시양태에서, 조직을 해리 제제 또는 제제들로 처리하거나 이들과 접촉시킴으로써 조직을 해리하는 단계를 추가로 제공하고, 여기서 해리 제제 또는 제제들은 효소, 프로테아제, 화학물질, 금속 킬레이트제, 또는 이들의 조합이다. 다른 실시양태에서, 해리는 조직을 더 작은 덩어리 및 단일 세포로 기계적으로 해리하기 위해 장비 또는 도구를 통한 기계적 또는 물리적 파괴에 의해 달성된다.
일 실시양태에서, 프로테아제는 트립신, 콜라게나제 IV, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 금속 킬레이트제는 EDTA, EGTA, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
발명의 실시양태에서, 피더-비함유 세포 배양 배지는 최소 필수 배지, 성장 인자, 호르몬, 및 가용성 인자를 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 피더-비함유 세포 배양 배지는 혈청, 바람직하게는 그로부터 LSC가 수득되고 증대되는 종으로부터의 혈청, 또는 혈청 대체제를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 피더-비함유 세포 배양 배지는 더 나아가 rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제를 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 피더-비함유 세포 배양 배지는 추가적으로 백혈병 억제 인자 (LIF)를 포함한다.
ROCK 억제제의 적합한 예시에는 (R)-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드 모노하이드레이트 (Y-27632), 5-(1,4-디아제판-1-일설포닐) 이소퀴놀린 (파수딜 또는 HA 1077), H-1152, H-1152P, (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]호모피페라진 디히드로클로라이드, 디메틸파수딜 (diMF; H-1152P), N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아, Y-39983, Wf-536, SNJ-1656, 및 (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀 디히드로클로라이드 (H-1152), 이미다졸-함유 벤조디아제핀, 이미다조피리딘 유도체, 인다졸 코어, 2-아미노피리딘/피리미딘 코어, 9-데아자구아닌 유도체, 벤즈아미드, 또는 아미노퓨라잔을 포함하는 화합물, 및 이들의 유도체 및 유사체, 및 이들의 조합이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
발명의 실시양태에서, ROCK 억제제는 LSC의 약 계대 4회 후에 피더-비함유 세포 배양 배지에 첨가되고, 그 후에 개체로부터 LSC의 분리가 이어진다.
일 실시양태에서, LIF는 LSC의 약 계대 4회 후에 피더-비함유 세포 배양 배지에 첨가되고, 그 후에 개체로부터 LSC의 분리가 이어진다.
발명의 특정 실시양태에서, 피더-비함유 세포 배양 배지는 DMEM/F12 배지, DMEM, 페니실린-스트렙토마이신, 혈청, EGF, 인슐린, 히드로코르티손, 콜레라 독소, 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 또는 이들의 조합을 포함한다. 혈청은 소 태아 혈청일 수 있지만, 바람직하게는 배양되는 LSC와 동일한 종으로부터의 혈청 또는 혈청 대체제일 수 있다. 피더-비함유 세포 배양 배지는 ROCK 억제제인 Y-27632를 추가로 포함할 수 있다. ROCK 억제제인 Y-27632는 약 세포 계대 4회 후에 피더-비함유 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 피더-비함유 세포 배양 배지는 백혈병 억제 인자 (LIF)를 추가로 포함한다. LIF는 LSC의 약 계대 4회 후에 피더-비함유 세포 배양 배지에 첨가되고, 그 후에 개체로부터 LSC의 분리가 이어진다.
발명의 일 실시형태에서, 그렇게 수득되고/되거나 증대된 LSC는 WNT7A, FZD5, PAX6, p63, 케라틴 5 (K5), 케라틴 14 (K14), 케라틴 19 (K19) 및 Ki67을 포함하는 한 세트의 마커를 발현할 수 있다. 다른 실시양태에서, 그렇게 수득되고/되거나 증대된 LSC의 약 90-95%는 p63, PAX6, K19 및 Ki67을 발현한다. 또 다른 실시양태에서, LSC의 약 5% 미만은 K5 및 K14를 발현한다. 추가의 실시양태에서, LSC의 약 95% 초과는 WNT7A 및 FZD5를 발현한다. 추가의 실시양태에서, CEC는 LSC에 비해 통계학적으로 유의미하게 더 높은 K3 및 K12의 발현 및 LSC에 비해 통계학적으로 유의미하게 더 낮은 K19의 발현과 함께, WNT7A, FZD5, PAX6, 케라틴 3 (K3), 및 케라틴 12 (K12)를 포함하는 한 세트의 마커를 발현한다. 다른 실시양태에서, CEC는 p63을 발현하지 않거나 LSC보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 이를 발현하고 케라틴 1 (K1) 및 케라틴 10 (K10)을 발현하지 않거나 피부 또는 표피세포보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 이들을 발현한다.
본 발명은 또한 분리된 LSC를 각막 상피세포 (CEC)로 시험관 내 분화시키는 방법을 제공한다. 방법은 바람직하게는, 원래 개체로부터 유래한, 단일 세포 상태로 해리된, 앞서 배양된 LSC를 수득하는 단계; (b) 분리된 LSC를 기질 또는 세포외 기질 내 및/또는 그 위에 놓아 두어 분화에 적합한 3차원 세포 배양을 형성하거나 이의 형성을 가능케 하는 단계; 및 (c) 분리된 LSC를 CEC로의 시험관 내 분화를 허용하도록 LSC를 LSC 분화 배지에서 배양하고, 그로써 분리된 LSC를 각막 상피세포로 시험관 내 분화시키는 단계를 포함할 수 있다.
발명의 실시에 따라서, 기질 또는 세포외 기질은 Matrigel® 또는 그의 등가물, 성장 인자 감소된 Matrigel® 또는 그의 등가물, 콜라겐, 콜라겐 IV, 콜라겐 IV 시트, 포유동물 양막, 인간 양막, 피브리노겐, 트롬빈, 페르리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 재조합 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 프로콜라겐, 히알루론산, 엔탁틴, 헤파란 설페이트, 테나신, 폴리-L-리신, 젤라틴, 폴리-L-오르니틴, 세포외 기질 단백질 (Fischer 또는 Life Tech), 트롬빈 시트 (Fibrin Sealant, Reliseal™, Reliance Life Sciences), 피브리노겐 및 트롬빈 시트 (Reliance Life), 및 이들의 임의의 조합 중 하나일 수 있다.
일 실시양태에서, 기질 또는 세포외 기질은 성장 인자 감소된 Matrigel® 또는 그의 등가물, 또는 콜라겐을 포함한다. 다른 실시양태에서, 윤부 줄기세포 분화 배지는 피더-비함유 및 화학적으로 규명된 배지이다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 피더-비함유 및 화학적으로 규명된 배지는 CnT-30 배지 (Cellntec Advanced Cell Systems AG, Bern, Switzerland), CnT-02 (Cellntec), CnT-02-3DP5 (Cellntec) 또는 기능적 등가물을 포함할 수 있고, 이 배지는 LSC의 CEC로의 분화를 촉진한다.
추가의 실시양태에서, CEC는 따라서 LSC에 비해 통계학적으로 유의미하게 더 높은 K3 및 K12의 발현 및 LSC에 비해 통계학적으로 유의미하게 더 낮은 K19의 발현으로, WNT7A, FZD5, PAX6, 케라틴 3 (K3), 및 케라틴 12 (K12)를 포함하는 한 세트의 마커를 발현한다.
발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 그렇게 생산되고, 수득되고, 또는 증대된 CEC는 p63을 발현하지 않거나 LSC보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 이를 발현하고 케라틴 1 (K1) 및 케라틴 10 (K10)을 발현하지 않거나 피부 또는 표피세포보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 이들을 발현한다.
본 발명의 방법의 일 실시양태에서, LSC 분화 배지는 격일로 교환된다.
본 발명은 또한 본 발명의 청구항의 피더-비함유 세포 배양 배지에서 분리된 SESC 피부를 배양하는 것을 포함하는 피더-비함유 세포 배양 배지에서 SESC를 시험관 내에서 수득하고 증대시키는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, SESC는 모낭간 (interfollicular) 표피로부터 분리될 수 있다. 다른 실시양태에서, SESC는 인간 또는 동물에서 SESC를 포함하는 임의의 SESC 적소로부터 분리된다.
본 발명은 추가적으로: (a) LSC로부터 SESC 운명으로 세포 운명을 전환하기에 충분하게 WNT7A 또는 PAX6 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 넉-다운 (knocking down)하여, 그로써 LSC 세포로부터 SESC 또는 SESC-유사 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 윤부 줄기세포 (LSC)로부터 상피 줄기세포 (SESC) 또는 SESC-유사 세포를 수득하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, LSC가 SESC 또는 SESC-유사 세포로 전환하도록 WNT7A 또는 PAX6의 발현을 충분히 감소시키기 위해, LSC는 WNT7A 또는 PAX6에 지시된 shRNA와 접촉될 수 있거나, 또는 대안적으로, LSC는 WNT7A 또는 PAX6에 지시된 shRNA, RNAi 또는 안티-센스 RNA를 생산하는 도입된 유전자를 발현한다.
본 발명은 또한 개체로부터 피부 상피 줄기세포 (SESC)를 피더-비함유 세포 배양 배지에서 시험관 내에서 수득하고 증대하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서 방법은: (a) 모낭간 표피 또는 개체에서 SESC를 포함하는 임의의 SESC 줄기세포 적소로부터 조직의 샘플을 수득하는 단계; (b) 단일 세포를 수득하기 위해 조직을 해리하는 단계; 및 (c) SESC의 증식을 허용하도록 (b)의 단일 세포를 피더-비함유 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 증식된 SESC는 피부 표피세포로 분화하는 능력을 가지고, 그로써 개체로부터 피부 상피 줄기세포를 시험관 내에서 수득하고 증대시킨다. 다른 실시양태에서, SESC는 본 발명의 피더-비함유 세포 배양 배지에서 시험관 내 배양될 수 있다.
본 발명은 또한 SESC 또는 SESC-유사 세포의 피부 표피세포 또는 피부 표피-유사 세포로의 분화를 지지하는 화학적으로 규명된 분화 배지에서 분리된 SESC 또는 SESC-유사 세포를 배양하여, 그로써 시험관 내에서 SESC 또는 SESC-유사 세포로부터 피부 표피세포 또는 피부 표피-유사 세포를 수득하는 단계를 포함하는, SESC 또는 SESC-유사 세포로부터 피부 표피세포 또는 피부 표피 유사 세포를 시험관 내 수득하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 화학적으로 규명된 분화 배지는 CnT-02 (CellnTec) 또는 이의 상응하는 배지일 수 있다.
본 발명은 더 나아가 새포운 피부를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 예컨대 개체의 SESC 세포 집단 또는 피부 표피세포 집단을 재증식시키고 개체에 새로운 피부를 제공하여, 그로써 새로운 피부를 필요로 하는 개체를 치료하기 위해, 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 또는 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되고 증대된 SESC 세포, SESC-유사 세포, 피부 표피세포 또는 피부 표피-유사 세포를 개체에 투여하는 것을 포함한다.
일 실시양태에서, 피부를 필요로 하는 개체는 피부 이상증 (dystrophy), 피부 질환, 피부 감염, 화상 손상, 피부 궤양, 찰과상, 흑색종, 암종, 상처, 노화, 피부의 유전적 장애, 피부 생검, 수술, 미용적 결함, 또는 피부에 영향을 미치는 재건 수술로 고통 받을 수 있다. 대안적으로, 피부를 필요로 하는 개체는 피부 대체를 필요로 하거나 미용적 수술 또는 피부에 영향을 미치는 재건 수술을 받는 개체일 수 있다.
본 발명은 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC) 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키는 방법을 추가적으로 제공한다. 방법은 LSC 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키도록 충분하게 LSC에서 WNT7A 또는 PAX6 유전자의 발현을 하향-조절하고, 그로써 LSC 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 LSC-유사 세포 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키는 방법을 제공한다. 방법은 LSC-유사 세포 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키도록 충분하게 LSC에서 WNT7A 또는 PAX6 유전자의 발현을 하향-조절하고, 그로써 LSC-유사 세포 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키는 것을 포함한다.
본 발명은 피부 상피 줄기세포 (SESC) 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키는 방법을 제공한다. 방법은 SESC 세포 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키도록 충분하게 SESC에서 PAX6 또는 WNT7A를 상향-조절 또는 과발현시키고, 그로써 SESC 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키는 것을 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 SESC-유사 세포 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키는 방법을 제공한다. 방법은 SESC-유사 세포 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키도록 충분하게 SESC-유사 세포에서 PAX6 또는 WNT7A를 상향-조절 또는 과발현시키고, 그로써 SESC-유사 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키는 것을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 임의의 방법으로부터 유래되거나 생산된 분리된 윤부 줄기세포 (LSC) 또는 LSC-유사 세포의 집단을 제공한다. 일 실시양태에서, LSC는 WNT7A, FZD5, PAX6, p63, 케라틴 5 (K5), 케라틴 14 (K14), 케라틴 19 (K19), 및 Ki67을 포함하는 한 세트의 마커를 발현한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법으로부터 유래된 분리된 각막 상피세포 (CEC)의 집단을 제공한다. 일 실시양태에서, CEC는 (i) LSC 보다 통계학적으로 유의미하게 더 높은 K3 및 K12의 발현과 LSC 보다 통계학적으로 유의미하게 더 낮은 K19의 발현으로, WNT7A, FZD5, PAX6, 케라틴 3 (K3) 및 케라틴 12 (K12)를 포함하는 한 세트의 마커를 발현하고, (ii) p63을 발현하지 않거나 LSC 보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 이를 발현하고 케라틴 1 (K1) 및 케라틴 10 (K10)을 발현하지 않거나 피부 또는 표피세포보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 이들을 발현한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사 세포, 또는 CEC, 또는 상기 세포의 조합, 패키징 재료 및 사용 설명서를 포함하는 각막 조직 복구용 키트를 제공한다. 일 실시양태에서, 키트는 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 인간 또는 동물 눈의 만곡 (curvature)과 같은 만곡에서 세포 부착 또는 성장을 지지하는데 사용되는 콘텍트 렌즈 또는 이의 등가물일 수 있다. 다른 실시양태에서, 키트는 인간 양막 또는 동물 양막을 추가로 포함한다.
본 발명은 추가적으로 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사 세포, 또는 CEC, 또는 상기 세포의 조합의 유효량, 및 적합한 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 LSC 집단을 유지하기 위한 세포 배양 배지를 포함하는 본 발명의 LSC 또는 LSC-유사 집단 또는 본 발명의 SESC 또는 SESC-유사 집단을 성장 및 유지하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 배지는 본질적으로 피더-비함유이다. 일 실시양태에서, 키트의 성분은 본질적으로 이종-비함유이다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 LSC 또는 LSC-유사 집단을 CEC 또는 CEC-유사 집단으로 분화시키기 위한 LSC 분화 배지를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 키트의 성분은 본질적으로 혈청-비함유이다. 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 성분은 본질적으로 동물 산물이 없거나, 예컨대 본질적으로 인간 산물이 없다. 추가의 실시양태에서, 키트의 성분은 화학적으로 규명된다.
본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사 세포, 또는 CEC, 또는 상기 세포의 조합, 패키징 재료 및 사용 설명서를 포함하는 각막 조직 복구용 키트가 또한 제공된다. 키트는 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 인간 또는 동물 눈의 만곡과 같은 만곡에서 세포 부착 또는 성장을 지지하는데 사용되는 콘텍트 렌즈 또는 이의 등가물일 수 있다. 추가적으로, 키트는 인간 양막 또는 동물 양막을 또한 포함한다.
치료적 용도
본 발명은 윤부 줄기세포 또는 각막 상피세포의 기능부전과 연관된 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 방법은: (a) 본 발명의 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포, 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 이들을 개체의 이환된 눈에 이식하는 것을 포함하고, 여기서 이식된 세포는 개체의 이환된 눈의 각막 또는 윤부를 정착시키고 (populate) 정상적인 각막 선명도 및 투명도를 회복시키며, 그로써 윤부 줄기세포 또는 전구세포 또는 각막 상피세포의 기능부전과 연관된 질환을 갖는 개체를 치료한다.
질환 또는 병태의 예시에는 윤부 줄기세포 또는 전구세포의 결핍, 각막 상피세포의 결핍, 각막 윤부에의 손상, 눈의 각막에의 손상, 윤부 줄기세포에의 손상, 각막 상피세포에의 손상, 각막 발생 또는 기능에 영향을 미치는 선천성 결함, 각막 발생 또는 기능에 영향을 미치는 후천성 결함, 각막을 피부 계통으로 스위칭시키는 세포 운명 결정에 영향을 미치는 선천성 결함, 각막을 피부 계통으로 스위칭시키는 세포 운명 결정에 영향을 미치는 후천성 결함, 비정상적 표피 분화, 스티븐스-존슨 증후군 (Stevens-Johnson syndrome), 무홍채증, 재발 익상편 (recurrent pterygium), 각막 질환, 각막 편평상피 화생 (corneal epithelium squamous metaplasia), 염증성 각막병증, 외상, 화학적 화상, 알칼리 화상 (alkaline burn), 부분 실명, 또는 완전 실명을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시양태에서, 질환 또는 병태는 부분 실명, 완전 실명, 각막 표면 질환, 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 또는 알칼리 화상이다.
본 발명은 또한 부분 실명, 완전 실명, 각막 표면 질환, 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 또는 알칼리 화상을 갖는 개체의 정상 각막 선명도 및 투명도를 회복시키는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 방법은 (a) 본 발명의 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 이들을 개체의 눈에 이식하는 것을 포함하고, 여기서 이식된 세포는 개체의 이환된 눈의 각막 또는 윤부를 정착시키고 정상적인 각막 선명도 및 투명도를 회복시키며, 그로써 부분 실명, 완전 실명, 각막 표면 질환, 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 또는 알칼리 화상을 갖는 개체의 정상적인 각막 선명도 및 투명도를 회복시킨다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포 집단 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 이들을 각막 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 개체 내로 도입하는 것을 포함하는, 개체에서 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 세포는 개체가 아닌 개인으로부터 유래한다. 다른 실시양태에서, 세포는 상기 방법에 의해 생산된 세포로 처리되는 개체로부터 유래한다.
일 실시양태에서, 개체는 포유동물이다. 포유동물의 예시에는 인간, 래트, 개, 고양이, 돼지, 말, 토끼, 소, 원숭이 또는 마우스가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 안구 화생 (ocular metaplasia)을 갖는 환자가 PAX6 유전자 또는 유전자 산물로의 처리로부터 이익을 볼 수 있는지를 결정하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 방법은 화생 영역에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 유전자 발현 또는 단백질 수준을 평가하는 것을 포함하고, 화생 영역에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 부재는 안구 화생을 갖는 환자가 본 발명의 PAX6 유전자 또는 유전자 산물 또는 세포로의 처리로부터 이익을 볼 수 있음을 나타낸다.
추가적으로, 본 발명은 또한 안구 화생을 갖는 환자가 WNT7A 유전자 또는 유전자 산물로의 처리로부터 이익을 볼 수 있는지를 결정하는 방법을 제공한다. 발명의 실시양태에서, 방법은 화생 영역에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 유전자 발현 또는 단백질 수준을 평가하는 것을 포함하고, 화생 영역에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 부재는 안구 화생을 갖는 환자가 WNT7A 유전자 또는 유전자 산물로의 처리로부터 이익을 볼 수 있음을 나타낸다.
또한, 본 발명은 안구 화생을 갖는 환자가 두 WNT7A 및 PAX6 유전자 또는 유전자 산물로의 처리로부터 이익을 볼 수 있는지를 결정하는 방법을 추가로 제공한다. 일 실시양태에서, 방법은 화생 영역에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 유전자 발현 또는 단백질 수준을 평가하는 것을 포함하고, 화생 영역에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 부재는 안구 화생을 갖는 환자가 두 WNT7A 및 PAX6 유전자 또는 유전자 산물로의 처리로부터 이익을 볼 수 있음을 나타낸다.
나아가, 본 발명은 안구 화생을 갖는 환자가 PAX6 유전자 또는 유전자 산물 또는 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 세포로의 처리로부터 이익을 볼 수 있는지를 결정하는 방법을 제공하고, 방법은 화생 영역에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 유전자 발현 또는 단백질 수준을 평가하는 것으로 포함하고, 화생 영역에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 부재는 안구 화생을 갖는 환자가 PAX6 유전자 또는 유전자 산물 또는 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 세포로의 처리로부터 이익을 볼 수 있음을 나타낸다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 LSC 집단을 각막 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 개체에 도입하는 것을 포함하는, 개체에서 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법을 제공한다. 개체는 포유동물 개체일 수 있다. 예시에는 인간, 래트, 개, 고양이, 돼지, 말, 토끼, 소, 원숭이 또는 마우스가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
나아가, 본 발명은, 본 발명의 분리된 LSC 또는 LSC-유사 집단이 CEC 또는 CEC-유사 세포로의 분화를 허용하는 LSC 또는 LSC-유사 상태를 생산하거나 유지하기에 충분한 양으로 PAX6를 생산 또는 과발현하도록, 본 발명의 분리된 LSC 또는 LSC-유사 집단 또는 본 발명의 SESC 또는 SESC-유사 집단을 개체에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 눈 질환을 치료하는 방법을 추가적으로 제공한다. 일 실시양태에서, 눈 질환은 인간 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 및 알칼리 화상이다. 발명의 실시에 따라서, 눈 질환은 인간의 눈 질환일 수 있다.
개체의 각막 조직, 각막 조직의 추정적 위치 또는 눈의 전방 표면을 각막 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 PAX6와 접촉시키는 것을 포함하는, 개체에서 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법이 추가적으로 제공된다.
본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포 또는 상기 세포의 조합을 각막 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 각막 또는 눈의 전방 표면 위에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법이 추가적으로 제공된다.
개체의 각막 조직, 각막 조직의 추정적 위치 또는 눈의 전방 표면 위에 각막 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 PAX6을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법이 추가적으로 제공된다.
개체에서 각막 또는 각막 기능에 영향을 미치는 눈 질환이 발생할 위험성을 평가하는 방법이 또한 제공된다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 (a) LSC 또는 각막 상피세포에서 WNTZ7A, FZD5 및 PAX6 또는 이들의 조합의 활성을 평가하는 단계를 포함하고, 여기서 WNTZ7A, FZD5 및 PAX6 또는 이들의 조합의 더 낮은 활성 또는 활성 부재는 개체에서 각막 또는 각막 기능에 영향을 미치는 눈 질환이 발병할 더 높은 위험성을 나타내고, 그로써 개체에서 각막 또는 각막 기능에 영향을 미치는 눈 질환이 발병할 위험성을 평가한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포, 또는 상기 세포의 조합을 이용한 세포-이식, 또는 PAX6 단백질 또는 PAX6-인코딩 핵산으로의 처리에 적합한 환자 집단을 동정하는 방법을 제공하고, 여기서 환자 집단은 각막 내 비정상적 피부 표피-유사 세포 및 연관된 상피화 및 WNTZ7A, FZD5 및 PAX6 유전자 또는 상기 유전자(들)의 조합의 발현 손실 또는 감소된 발현을 갖는다.
본 발명은 또한 윤부 줄기세포의 결핍을 갖는 개체에서 LSC 또는 LSC-유사 세포로 윤부를 재증식시키는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 방법은 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 LSC 또는 LSC-유사 세포를 개체의 눈의 전방 표면에 투여하고 세포의 LSC 적소로의 이동을 허용하고, 그로써 개체에서 LSC 또는 LSC-유사 세포로 윤부를 증식시키는는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 개체의 눈의 표면 위에 LSC 또는 LSC-유사 세포의 시트 또는 시트들을 그라프팅하거나, 또는 대안적으로, LSC 또는 LSC-유사 세포를 포함하는 세포 또는 조직 현탁액을 투여하는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 개체의 눈에 LSC 또는 LSC-유사 세포를 투여한 후, LSC 또는 LSC-유사 세포는 양막, 바람직하게는 인간 양막으로 덮어질 수 있다.
본 발명은 추가적으로 윤부로 이동 시 개체에서 LSC 또는 LSC-유사 세포를 이용해 윤부를 재증식시키는, 결막, 추정 각막 위치, 눈 또는 눈꺼풀 내 피부 상피 줄기세포 (SESC)를 LSC 또는 LSC-유사 세포로 전환시키기 위해, 개체의 결막, 추정 각막 위치, 눈 또는 눈꺼풀의 영역에 PAX6 활성 또는 발현을 증가시키는 제제를 투여하고, 그로써 개체에서 LSC 또는 LSC-유사 세포를 이용해 윤부를 재증식시키는 것을 포함하는 윤부 줄기세포의 결핍을 갖는 개체에서 LSC 또는 LSC-유사 세포로 윤부를 재증식시키는 방법을 제공한다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은, 예컨대, 시각계 (visual system) 및 다른 기관 손상 또는 질환을 치료하기 위한 본 발명의 윤부 줄기세포의 공급에 관한 것이다. 본 발명의 치료적 조성물이 치료하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 시각계 손상 또는 질환은 하기와 같다: 윤부 줄기세포 결핍을 갖는 환자에서 안구 표면의 재건 (Tseng et al., 1998); 일반적으로 시각계 연령-관련 질환의 치료; 각막 지속성 상피 결함을 갖는 환자 내 안구 표면의 재건 (Tseng et al., 1998); 굴절교정 레이저 각막절제술 (photorefractive keratectomy) 후 각막 상피 치유 및 각막 간질 리모델링과 연무 형성의 회피 (Woo et al., 2001); 스티븐스 존슨 증후군 및 OCP와 관련된 안구 표면 손상에 수반되는 치유 과정을 촉진하고 지지할 수 있는 물질 (Tsubota et al., 1996); 건성안 (dry eye), 쇼그렌 증후군, 열적 및 화학적 화상, 및 급성 및 만성 염증을 비롯한 기타 눈 전방 표면 질환에 있어 치유 지지 및 치료적 접근법; 및 전체 및 부분적 상피 줄기세포 결핍의 원인을 치료할 수 있는 다양한 화합물. 예시적인 전체 상피 줄기세포 결핍에는 화학적 및 열적 손상, 스티븐스 존슨 증후군, 윤부 영역에서 다중-수술 (multi-surgery) 효과, 콘텍트 렌즈 과다-마모 (over-wear) 및 중증의 미생물 감염이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적인 부분적 상피 줄기세포 결핍에는 신경영양 각막염, 허혈성 각막염, 말초 궤양 및 염증성 각막염, 윤부염, 무홍채증, 익상편 (pterigium), 위익상편 (pseudopterigium) 및 다발 내분비샘 결핍 (Tseng et al., 1998; Uchida et al., 2000)이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물의 다른 예시적인 용도는 피부 이상증, 화상 손상 및 피부 궤양을 위한 치료 (Trelford et al., 1979); 케미오쎄라픽 (chemiotheraphic) 구내염을 위한 요법; 자가면역 질환에서의 면역조절자; 자가-, 동종- 및 이종-이식물의 처리에서의 내성 증가; 유도 골 재생을 위한 골유도적 특성 물질 (Gomes et al., 2001); 세균 및 다른 단순 유기체의 시험관 내 또는 생체 내 배양을 위해 현재 사용되는 실제 하드웨어에 도입될 수 있는 물질; 현재 사용 중인 세포 배양 전용 장치, 예컨대 배양 접시, 3차원 기질 또는 겔 내에 도입될 수 있는 물질 (Uchida et al., 2000); 인간 세포의 저장 또는 배양 배지; 양막의 모든 이로운 효과의 원격 방출을 위한, 접근가능 부위로부터 필요로 하는 부위로 효과적인 화합물을 운반할 통합된 전달 시스템의 일부; 골 및 조직 항-염증성 약물; 신경변성 또는 염증성 질환에 사용하기 위한 인자 및 수용체의 공급원; 및 글루코스 운반을 매개하는 수용체의 공급원으로서이다.
방법의 다른 실시양태에서, 상기 안구 외과적 과정은 각막의 모양을 변화시키거나 굴절 수술이다. 특정 실시양태에서, 상기 안구 외과적 과정은 굴절교정 레이저 각막절제술 (PRK), 레이저-연관 상피하 각막절제술 (LASEK) 또는 레이저-연관 인 시츄 각막절삭성형술 (in situ keratomileusis)(LASIK)이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 안구 외과적 과정은 자동화 표층 각막이식 (ALK), 레이저 열적 각막이식술 (LTK), 또눈 유도성 각막이식술 (CK)이다.
D. 표적 질환 및 병태
본 발명은 본원에 기술된 윤부 줄기세포의 치료적 양을 개체에의 전달에 적합한 치료적 제조물로서 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 눈 질환 또는 병태를 갖는 개체를 치료하는 방법을 고려한다. 각막 손상은 병태생리학에서 역할을 담당하는 것으로 관련되어 있는 임의의 손상, 병태 또는 질환일 수 있다.
1. 각막 손상
각막 상처는 안구 표면에의 손상이고 열적 (즉, 화상), 화학적 (즉, 산), 물리적 (즉, 찰과상) 또는 외과적 (즉, 각막 이식) 상처 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 각막 상처를 치료하는데 효과적일 수 있다.
a. 이물질 (Foreign Bodies)
모든 각막 손상의 약 25%는 각막의 표면에 이물질을 포함한다. 만약 손상이 각막 상피에만 영향을 미친다면 어떠한 흉터형성 (scarring)도 일어나지 않을 것이지만; 만약 보우만 구역 (Bowman zone)에 영향을 미친다면, 흉터형성이 가능하다. 이물질의 제거 후, 눈을 설폰아미드 또는 항생제로 처리하고, 만약 섬모체 울혈 및 눈부심 (photophobia)이 있거나, 또는 이물질의 제거가 어려운 경우에는, 눈을 약 5% 호마트로핀과 같은 조절마비제 (cycloplegic)로 처리한다. 일부 경우에, 본 발명의 치료적 조성물은 이물질에 의해 야기된 손상의 치유를 촉진하고, 감염을 예방하며, 임상 결과를 향상시키도록 고안된다.
b. 화학적 화상
화학적 화상은 먼저 눈을 액체로 씻어 냄으로써 화학물질을 희석하고, 그 후에 국소 항상제의 사용을 통해 감염을 예방함으로써 치료된다.
안구내 압력은 티몰롤, 에피네프린, 아세타졸아미드, 또는 다른 유사 제제의 적용에 의해 감소될 수 있다. 만약 각막의 상피화가 1주일 후에 불완전하다면, 감염의 위험성에 추가로 간질성 괴사의 우려가 있다. 따라서 치유가 이들 위험성을 감소하도록 촉진되는 것이 중요하다.
몇몇 흉터형성은 화학적 화상의 또 다른 일반적 결과이다. 본 발명의 치료적 조성물은 화학적 화상에 의해 야기된 각막 까짐 (corneal erosion)의 치유를 촉진하고, 간질성 괴사 및 눈의 감염을 예방하고, 각막 흉터형성을 감소시켜, 그로써 각막 투명도를 복구/보존하도록 고안된다.
예상외로, 본 발명의 조성물은 흉터 형성을 예방 또는 감소시키면서 동시에 안구 치유, 상처 복구를 증강시키고 각막 투명도를 유지할 수 있다. 임의의 특정 작용 기전에 구속되는 것을 원치 않지만, 이들 유리한 효과는 조성물의 항-염증성 작용에 기인해 달성될 수 있는 것으로 보인다. 일부 경우에, 유리한 효과는 본 발명의 조성물의 항-염증성 및 항-아폽토시스 작용의 조합에 기인해 수득될 수 있다.
c. 열상 (Lacerations)
각막의 열상은 홍채 탈출 (prolapsed)을 수반하고, 이는 손상을 폐쇄한다. 모든 눈 손상에서와 같이, 감염의 위험성이 있다. 열상은 또한 공막으로 확대할 수 있는데, 이는 훨씬 더 심각한 손상이다. 이러한 경우에, 손상된 영역으로부터 탈출된 포도막 조직 (prolapsed uveal tissue)을 제거하기 위해 수술이 요구되고, 공막은 봉합에 의해 폐쇄된다. 본 발명의 치료적 조성물은 열상의 치유를 촉진하고 감염을 예방하도록 고안된다.
염증성 병태
각막염은 각막의 염증을 지칭한다. 원인에는 아메바성, 세균성, 진균성 또는 바이러스성 감염, 광각막염, 노출 (눈꺼풀 기능부전), 화학적 손상, 외상, 수술 (LASIK, PRK, 백내장, 각막 이식, 익상편 수술), 또는 원추각막, 푹스 디스트로피 (Fuchs' dystrophy), 또는 건성 각막결막염과 같은 선천적 원인이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 눈의 다른 염증-매개 병태에는 포도막염, 황반 부종, 연령-관련 황반 퇴행, 망막 박리, 안구 종양, 다초점 맥락막염, 당뇨병성 포도막염, 증식성 유리체망막병증 (PVR), 교감눈염증, 포그트 고야나기-하라다 (Vogt Koyanagi-Harada: VKH) 증후군, 히스토플라스마증, 및 포도막 확산이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
각막의 표면이 어떤 방식으로든 손상되거나 저하되는 경우 각막 궤양이 형성된다. 궤양은 무균이거나 감염될 수 있고 치료 과정을 결정한다. 세균 감염된 궤양은 매우 고통스러운 경향이 있고 전형적으로 각막의 최외층인, 상피에서의 파괴와 연관된다. 특정 유형의 세균, 예컨대, 슈도모나스 (Pseudomonas)는 매우 공격적이며 치료되지 않은 상태로 놔두는 경우 24-48시간 이내에 심각한 손상 및 심지어 실명을 야기할 수 있다. 무균 궤양은 임의의 통증이라도 거의 야기하지 않는다. 이들은 종종 각막의 말초 마진부 근처에서 발견되고 각막의 상피층에서의 파열을 필수적으로 수반하지는 않는다. 각막 궤양에는 다수의 원인이 존재한다. 콘텍트 렌즈 착용자가 자신의 렌즈 및 케이스의 세정, 취급 및 소독을 소홀히 한다면 이들은 각막 궤양의 증가된 위험성을 갖는다. 세균 감염된 궤양은 또한, 유기체가 각막을 감염시킬 기회의 창을 만드는, 각막 표면을 손상시키는 질환과 연관된다. 눈깜박임에 어려움을 갖거나, 또는 스스로 관리가 불가능한, 심각한 건성안을 갖는 환자가 또는 위험하다. 궤양의 다른 원인에는 허피스 심플렉스 바이러스 감염, 염증성 질환, 각막 찰과상 또는 손상, 및 기타 전신 질환이 포함된다. 본 발명의 조성물 및 방법은 각막 궤양을 치료하는데 효과적일 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 각막 염증을 치료하는데 효과적일 수 있다. 마이크로스피어의 현탁액은 눈의 항-염증성 요법으로서, 특히 눈 부속기관, 눈꺼풀 또는 숨뇌 (bulbar) 결막, 각막 및 안구 (globe)의 전방 분절의 염증성 병태를 치료하는데 사용될 수 있다. 마이크로스피어의 항-염증성 현탁액의 일반적 치료적 적용에는 바이러스, 알러지 결막염, 여드름 장미증, 홍채염 및 홍채섬모채염이 포함된다. 마이크로스피어는 또한 화학적 또는 열적 손상에 기인한 각막 손상, 또는 이물질의 침투와 연관된 염증을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 병태는 눈에의 수술, 손상, 알러지 또는 감염으로부터 초래될 수 있고 심각한 불편을 초래할 수 있다.
특히, 마이크로스피어는 NSAI 제제 및 코르티코스테로이드의 만연한 국소적 안구 사용에 비해, 염증 반응을 감소시키는데 상당한 치료적 이점을 갖는다. 국소적 스테로이드의 사용은 후방 피막하 백내장 형성, 안압 (intraocular pressure)의 상승, 이차 안구 감염, 각막 상처 치유의 지연, 포도막염, 동공확대, 일시적 안구 불편 및 안검하수를 비롯해, 다수의 합병증과 연관이 있다. 다양한 전신 합병증이 또한 코르티코스테로이드의 국소적 안구 적용으로부터 발생할 수 있다. 이들 합병증에는 부신 부전, 쿠싱 증후군, 소화성 궤양화, 골다공증, 고혈압, 근육 약화 또는 위축증, 성장 억제, 당뇨병, 감염 활성화, 기분 변화 및 지연된 상처 치유가 포함된다.
3. 안구 외과적 적용
본 발명에 따른 마이크로스피어의 조성물은 또한 안구 수술과 연관된 염증을 개선하는데 사용될 수 있고, 이 맥락에서 예방적 기법뿐만 아니라 상기에 기술된 바와 같은 치유를 촉진하고 흉터형성을 감소시키는데 특히 유용하다.
본 발명의 조성물의 사용은: 굴절교정 레이저 각막절제술 (PRK), 레이저-연관 상피하 각막절제술 (LASEK), 레이저-연관 인 시츄 각막절삭성형술 (LASIK), 자동화 표층 각막이식 (ALK), 레이저 열적 각막이식술 (LTK), 유도성 각막이식술 (CK), 섬유주절제술 (trabeculectomy) 후 (여과 수술); 익상편 수술 후; 눈 부속기관 외상 및 수술 후; 안구내 수술 후 및 특히: 수정체절제술 후, 유리체절제술 후, 망막 박리 수술 후, 및 망막앞막 (epiretinal) 및 망막하막 (subretinal) 박피술 후에 특히 적합하다.
치료될 수 있는 다른 각막 병리학에는 치료적 광각막절제술 (일명 치료적레이저 각막절제술 (PTK))이 포함되고, 이는 레이스-뷰에클러 이영양증 (Reis-Bueckler's dystrophia), 그뢰노이 재발 (Groenouw's palindromia), 각막백반, 치료후 각막염, 익상편, 각막 이물질, 몇몇 각막병증, 각막이식술후 결절, 각막 까짐, 알칼리 화상, 방사상 각막이식술 및 PRK 후 뿐만 아니라, 각막 흉터와 관련된 시각 손상 또는 자극 증상, 혼탁, 또는 상피층을 벗어난 디스트로피 (예컨대, 전방 간질 디스트로피로부터의 지속적 상피 결함), 재발성 각막 까짐, 피상적 각막 디스트로피, 상피막 디스트로피, 각막 융해, 각막 궤양 및 잘쯔만 결절 (Salzmann's nodular) 퇴행 또는 원추각막 결절에 기인한 비규칙적 각막 표면의 치료에 기인한 합병증을 포함한다.
이들이 본 발명의 조성물 및 방법이 유용한 만연한 수술적 과정의 비-제한적인 예시로 제공될 것으로 의도됨이 숙련자에게 인식될 것이다.
4. 기타 전방 안구 병태
전방 안구 병태는 수정체낭 또는 섬모체근의 후방 벽에 대해 전방에 위치한 전방 (즉, 눈의 앞쪽) 안구 영역 또는 부위, 예컨대 안구주의 근육, 눈꺼풀 또는 안구 (eyeball) 조직 또는 유체에 영향을 미치거나 이를 포함하는 질환, 괴로움 또는 병태이다. 따라서, 전방 안구 병태는 주로 결막, 각막, 전방 챔버 (anterior chamber), 홍채, 후방 챔버 (홍채의 뒤쪽이지만 수정체낭의 후방 벽의 앞쪽), 수정체 또는 수정체낭 및 전방 안구 영역 또는 부위를 혈관화하거나 신경이 통하게 하는 혈관 및 신경에 주로 영향을 미치거나 이들을 포함한다.
따라서, 전방 안구 병태에는, 예를 들어, 무수정체증; 인공수정체눈 (pseudophakia); 난시; 눈꺼풀연축; `백내장; 결막 질환; 결막염, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 아토피성 각막결막염; 각막 손상 포함, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 각막 간질 영역에 대한 손상 포함; 각막 질환; 각막 궤양; 건성안 증후군; 눈꺼풀 질환; 눈물 기관 질환; 눈말관 폐쇄; 근시; 노안; 동공 장애; 굴절 장애 및 사시와 같은 질환, 괴로움 또는 병태가 포함될 수 있다. 녹내장 치료의 임상적 목표가 눈의 전방 챔버 내 방수 (aqueous fluid)의 압력을 감소 (즉, 안압 감소)시키는 것일 수 있기 때문에 녹내장이 또한 전방 안구 병태인 것으로 고려될 수 있다.
본 발명에 따라서 치료될 수 있는 눈의 다른 질환 또는 장애에는 안구 반흔성 유사천포창 (OCP), 스티븐스 존슨 증후군 및 백내장이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
건성안 증후군은 안과의에 치료되는 가장 일반적인 문제 중 하나이다. 이는 보통 눈을 매끄럽게 하는 눈물막의 양과 관련된 문제에 의해 야기된다. 눈물은 3개 층으로 이루어진다. 근육층은 각막을 코팅하여, 눈물막이 눈에 부착할 수 있도록 기저를 형성하고, 중간 수성층은 수분을 제공하고 산소 및 다른 중요한 영양분을 각막에 공급하며, 외부 지질층은 눈 위에 눈물막을 밀봉하고 증발 방지를 보조하는 유성 필름이다. 눈물은 눈 주변의 몇몇 샘 (gland)에서 형성된다. 수층은 위 눈꺼풀 아래 위치한 눈물샘 내에서 생산되고 눈꺼풀 내 몇몇 더 작은 샘은 유성 및 점액층을 만든다. 각각의 눈깜박임으로, 눈꺼풀은 눈물을 눈 전체로 확산시킨다. 과량의 눈물은 코에 의해 눈의 구석에 있는 2개의 아주 작은 배출관 내로 흘러간다. 이들 관은 비관 (nasal passage)을 연결하는 아주 작은 도관을 초래한다. 건성안 증후군은 다수의 원인을 갖는다. 건조증의 가장 일반적인 이유는 정상적인 노화 과정이다. 많은 다른 인자들, 예컨대 뜨겁고, 건조하거나 바람이 부는 기후, 높은 고도, 냉난방 및 담배 흡연이 또한 건성안을 야기한다. 많은 사람들이 또한 자신의 눈이 독서 또는 컴퓨터 작업을 하는 경우 자극되는 것을 발견한다. 콘텍트 렌즈 착용자는 또한, 콘텍트가 눈물막을 흡수하여 단백질이 렌즈의 표면 위에 형성되도록 야기하기 때문에, 건조증으로부터 고통 받을 수 있다. 특정 약물치료, 갑상샘 상태, 비타민 A 결핍, 폐경 및 파킨슨 및 쇼그렌과 같은 질환이 또한 건조증을 유발할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 건성안 증후군을 치료하는데 효과적일 수 있다.
제제, 투여량 및 투여
윤부 줄기세포를 포함하는 조성물은 다양한 세포 또는 조직 기능을 제공하기 위해, 예를 들어, 외상, 수술, 유전적 질환 등에 기인한 안과적 장애를 치료하기 위해 개체에 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "개체"는 인간 또는 비-인간 동물 중 하나를 의미할 수 있다.
이러한 조성물은 선택적으로 부형제 및 보조제를 포함하는, 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 임의의 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 적합한 제제는 선택된 투여 경로에 좌우된다. 조성물은 안과적 장애를 치료하거나 치료학적으로 중요한 대사 기능을 복구하는데 이들의 사용을 위한 서면 지침서와 함께 포장될 수 있다. 조성물은 또한 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 중에서 수용자에게 투여될 수 있다.
치료 키트 - 본 발명은 또한 포장 재료 및 포장 재료 내부에 함유된 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 제조 물품을 제공하고, 상기 약제학적 조성물은 단독으로 또는 담체와 조합하여 LSC를 포함한다. 포장 재료는 안과적 장애, 예를 들어, 각막 장애/질환/손상을 치료하는데 사용될 수 있음을 지시하는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 LSC가 로우딩된 연질 일회용 콘텍트 렌즈를 포함하는 콘텍트 렌즈 제품과 같은 담체를 제공한다. 일 실시양태에서, 콘텍트 렌즈는 생체적합성 격자일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생체적합성 격자 (biocompatible lattice)"는 조직 발생에 도움이 되는 3차원 구조로의 형성을 촉진할 수 있는 기질을 지칭하는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 세포는 LSC 성장 또는 부착을 지지하도록 세포외 기질 재료를 포함하거나 생체코팅된 것과 같이, 그러한 생체적합성 격자 위에서 배양되거나 그 위에 접종될 수 있다. 격자는 조직 유형의 발생을 촉진하기 위해 원하는 모양으로 성형될 수 있다. 또한, 적어도 세포 배양 동안의 초기 단계에서, 배지 및/또는 기질은 적합한 조직 유형 및 구조의 발생을 촉진하는 인자 (예컨대, 성장 인자, 사이토카인, 세포외 기질 재료 등)가 보충된다. LSC는 수용자에 이식하기 전에 렌즈 위에서 증대되거나 그 위에 놓일 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하여 연질 콘텍트 렌즈를 형성하기에 적합한 재료에는, 제한 없이, 실리콘 엘라스토머, 제한 없이, 본원에 참조로서 그 전체가 포함되는 미국특허 제5,371,147호, 제5,314,960호, 및 제5,057,578호에 기재된 것들을 포함하는 실리콘-함유 마크로머, 하이드로겔, 실리콘-함유 하이드로겔 및 기타 등등과 이들의 조합을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 렌즈는, 제한 없이, 폴리디메틸 실록산 마크로머, 메타크릴옥시프로필 폴리알킬 실록산, 및 이들의 혼합물, 실리콘 하이드로겔 또는 히드록시기, 카르복실기, 또는 이들 모두를 함유하는 단량체로 만들어진 하이드로겔 및 이들의 조합을 포함하는, 실록산 기능성 (functionality)을 함유하는 재료로 만들어진다. 연질 콘텍트 랜즈의 제조를 위한 재료는 잘 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 렌즈 재료는 아쿠아필콘 (acquafilcon), 에타필콘, 젠필콘, 렌필콘, 로트라필콘, 또는 갈리필콘 (galyfilcon)이다. 렌즈는 포장 용액 중의 첨가제를 사용함으로써 더욱 증강될 수 있다. 이러한 첨가제의 예시는 폴리비닐피롤리돈이다. 적합한 렌즈 재료는 폴리메틸 메타크릴레이트이다. 그러나, 다른 재료, 예컨대 가스 투과성 재료 (실리콘, 폴리메틸 메타크릴레이트 및 실리콘의 조합, 및 셀룰로스 아세테이트 부티레이트 포함)가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 콘텍트 렌즈는 투명 (즉, 적어도 약 20%의 가시광선의 투과를 가짐), 불투명 또는 이 둘 모두의 조합일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 발명의 콘텍트 렌즈는 투명할 수 있고, 이 경우 콘텍트 렌즈는 한쪽 또는 양쪽 눈에 대한 시력 교정을 제공하거나 제공하지 않을 수 있다.
본 발명의 콘텍트 렌즈는 연질, 가요성 (flexible) 재료를 포함하거나, 또는 경질, 가스 투과성 재료를 포함할 수 있다. 연질 가요성 재료의 예시는 하나 이상의 폴리머, 예컨대 실리콘, 실리콘 하이드로겔 또는 다른 하이드로겔 재료 (예컨대, 둘 이상의 하이드로겔 단량체의 호모폴리머 또는 코폴리머를 함유하는 재료, 예컨대 2-히드록시 에틸 메타크릴레이트, 1-비닐-2-피롤리돈, 메타크릴산 등)와 같은 폴리머의 조합을 사용하여 형성될 수 있다. 경질 재료의 예시에는 실리콘 아크릴레이트 (S/A) 코폴리머, 플루오로실리콘 아크릴레이트 (F-S/A) 코폴리머, 및 폴리(메틸 메타크릴레이트) (PMMA)가 포함된다.
렌즈는 각막의 천연 만곡과 일치하도록 만곡을 가질 수 있고 표준 핏 (standard fit)을 제공할 수 있다. 연질 콘텍트 렌즈의 경우에, 이는 하나의 크기일 수 있다. 예를 들어, 콘텍트 렌즈는 표준 각막 만곡의 범위 (예컨대, 다른 값들 중에서 특히, 8 mm 내지 10 mm의 범위의 기저 곡선 (base curve))로 제공될 수 있고 환자에게 편안하고 안전한 핏을 제공하도록 일 범위의 직경 (예컨대, 다른 값들 중에서 특히, 8 mm 내지 18 mm 범위의 직경)을 가질 수 있다. 연질 콘텍트 렌즈에 대한 이상적 크기는 다른 값들 중에서 특히, 8.8 mm의 기저 곡선 및 14 mm의 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 환자를 치료하는데 유용한 키트에 관한 것이다. 키트는 본 발명에 따라서 환자를 치료하는데 유용한 모든 성분들의 전부 또는 아집단을 포함할 수 있다. 키트는, 예를 들어: (a) 본 발명에 따른 하나 이상의 콘텍트 렌즈, (b) 본 발명의 배양된 LSC의 치료적 양, (c) 콘텍트 렌즈 위에 생체코팅되거나 되지 않을 수 있는, 본 발명의 LSC의 성장을 지지하기 위한 제제 중의 세포외 기질, (d) 선택적으로, 본 발명의 LSC의 성장을 지속하거나 운반 도중 LSC를 완충하기 위한 배지, (e) 환자의 눈에 본 발명의 조성물을 투여하고/하거나 콘텍트 렌즈를 착용하기 (fitting) 위한 설명서, 및 (f) 세포 요법 산물, 조제약 및/또는 의료 기기를 규제하는 정부 감독기관에 의해 요구되는 바와 같은 패키징 및 정보를 포함한다. 추가적으로, 본 발명의 키트는 본 발명의 렌즈로부터 과량의 배지를 세척하기 위해 적합한 액체 담체 (예컨대, 주사용 멸균수, 생리적 식염수, 인산염 완충제, 인산염 완충된 식염수 등)의 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 키트의 성분들은 건강 관리 전문가에 의한 편리한 사용을 위해 단일 무균 패키지 내에 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 기질은 포유동물 양막, Matrigel® (Matrigel™) 및 이의 등가물, 라미닌, 테나신, 엔탁틴, 히알루론, 피브리노겐, 트롬빈, 콜라겐-IV, 콜라겐-IV 시트, 폴리-L-리신, 젤라틴, 폴리-L-오르니틴, 피브로넥틴, 트롬빈 시트 (Fibrin Sealant, Reliseal™, Reliance Life Sciences) 및 기타 등등, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
본원에 기술된 조직 시스템을 생성하는데 사용하기 위한 조직 기재 (tissue base)의 일 예시는 인간 양막이고, 이는 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 양막은 상피 표면을 갖는 온전한 상태 또는 상피세포가 벗겨진 (denuded) 상태일 수 있다. 인간 양막을 제조하는 바람직한 방법은 하기 실시예에 기술된다. 다른 실시양태에서, 조직 기재는 추가적인 지지 재료, 예를 들어 조직 기재 위에 LSC의 결합을 촉진하는 재료로 생체코팅된다. 사용될 수 있는 추가적인 지지 재료는 피브리노겐, 라미닌, 콜라겐 IV, 테나신, 피브로넥틴, 콜라겐, 소 뇌하수체 추출물, EGF, 간세포 성장 인자, 각막세포 성장 인자, 히드로코르티손, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 비-제한적인 실시양태에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 점안약의 형태와 같이, 국소적으로 눈에 투여될 수 있다. 추가의 비-제한적인 실시양태에서, 점안약은 본 발명의 LSC를 포함하고, 이는 각막의 질환 또는 장애를 치료하기 위해 각막에 투여될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 용액, 현탁액 또는 둘 모두로 본 발명의 iLSC를 포함하는 액체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 액체 조성물은 겔을 포함한다.
다른 실시양태에서, 조직 기재는 콜라겐 겔 또는 피브린 겔이고, 이 겔은, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 섬유아세포, 예컨대 각막 간질성 섬유아세포, 중간엽 조직의 유도체, 및 상피세포, 예컨대 각막 상피세포를 포함하는 조직 시스템을 생성하기 위한 다른 바람직한 세포 유형을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 조직 기재는 하이드로겔, 예를 들어 합성 하이드로겔, 연질 하이드로겔 콘텍트 렌즈 또는 폴리-HEMA 기질이다. 특정 실시양태에서, 조직 기재는 조직 시스템의 이식, 임플란트 또는 그라프트 후 생체 내에서 서서히 재흡수될 것이다. 또한, 조직 기재는 바람직하게는 비-항원성이고, 유의미한 섬유혈관성 성장 없이 상피화를 촉진한다.
본원에서 용어 "현탁액"은 본 발명의 LSC가 세포외 기질 및 배지와 조합하여 용액 중에 존재하는 액체 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 상이한 성분을 분리할 수 있는데, 배지 함유 현탁액 중의 LSC 및 별도로 세포외 기질 함유 제2 용액이 제공되고, 두 현탁액 및 용액은 별도로 또는 조합하여 도입되는 것 (예컨대, 전달 전에 예혼합됨) 중 하나로, 처리 시점에 조합된다.
바람직한 실시양태에서, 기질은 포유동물 양막, Matrigel®™ 및 이의 등가물, 라미닌, 테나신, 엔탁틴, 히알루론, 피브리노겐, 트롬빈, 콜라겐-IV, 콜라겐-IV 시트, 폴리-L-리신, 젤라틴, 폴리-L-오르니틴, 피브로넥틴, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 트롬빈 시트 (Fibrin Sealant, Reliseal™, Reliance Life Sciences) 및 기타 등등, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
본원에 기술된 조직 시스템의 생성에 사용하기 위한 조직 기재의 일 예시는 인간 양막이고, 이는 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 인간 양막은 상피 표면을 갖는 온전한 상태 또는 상피세포가 제거된 상태일 수 있다. 인간 양막을 제조하는 바람직한 방법이 하기 실시예에 기술된다. 다른 실시양태에서, 조직 기재는 추가적인 지지 재료, 예를 들어 조직 기재 위에 LSC의 결합을 촉진하는 재료로 생체코팅된다. 사용될 수 있는 추가적인 지지 재료는 피브리노겐, 라미닌, 콜라겐 IV, 테나신, 피브로넥틴, 콜라겐, 소 뇌하수체 추출물, EGF, 간세포 성장 인자, 각막세포 성장 인자, 히드로코르티손, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는 액체 조성물은 수성이다. 대안적으로, 조성물은 연고의 형태를 취할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 인 시츄 겔화가능 수성 조성물, 예를 들어 인 시츄 겔화가능 수성 용액이다. 이러한 조성물은 눈 또는 눈 외부의 누액과 접촉 시 겔화를 촉진하기에 효과적인 농도로 겔화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 수성 조성물은 안과적으로 적합한 pH 및 오스몰농도 (osmolality)를 갖는다. 이들 조성물은, 예를 들어 무균 상태에서의 제조 및 패키징을 통해 및/또는 안과적으로 허용가능한 방부제의 항미생물적 유효량을 통해, 미생물 성장을 억제하는 수단을 도입할 수 있다. 적합한 방부제는 비-제한적으로 페닐수은 (phenylmercuric) 염 (예컨대, 페닐수은 아세트산염, 붕산염 및 질산염) 및 티메로살과 같은 구리-함유 물질; 안정화된 이산화염소; 벤잘코늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 및 세틸피리디늄 클로라이드; 이미다졸리디닐 우레아와 같은 사차 암모늄 화합물; 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤 및 부틸파라벤, 및 이들의 염과 같은 파라벤; 페녹시에탄올; 클로로페녹시에탄올; 페녹시프로판올; 클로로부탄올; 클로로크레졸; 페닐에틸 알코올; 디소디움 EDTA; 및 소르브산 및 이의 염을 포함한다.
적합한 겔화제에는 비-제한적으로 열경화성 폴리머, 예컨대 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드의 테트라-치환된 에틸렌 디아민 블록 코폴리머 (예컨대, 폴록사민 1307); 폴리카르보필; 및 다당류, 예컨대 겔란 (gellan), 카라기난 (예컨대, 카파-카라기난 및 이오타-카라기난), 키토산 및 알지네이트 검이 포함된다. 어구 "인 시츄 겔화가능 (in situ gelable)"은 눈과 또는 눈 외부의 누액과 접촉 시 겔을 형성할 수 있는 낮은 점도의 액체뿐만 아니라, 눈 또는 눈 주변 영역에 투여 시 실질적으로 증가된 점도 또는 겔 강성 (stiffness)을 나타내는 반-유동성 및 요변성 (thixotropic) 겔과 같이 더욱 점성인 액체를 포함한다.
당해 분야의 숙련자는 특정 목적을 위한 본 발명의 적합한 농도, 또는 투여량을 용이하게 결정할 수 있다. 숙련자는 바람직한 용량이 이를 필요로 하는 환자에서 각막 상처 치유와 같은 치료 효과를 양산하는 것임을 인식할 것이다. 물론, LSC의 적합한 용량은, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 치료되는 질환, 손상, 장애 또는 병태의 중증도 및 유형; 환자 연령, 체중, 성별, 건강; 환자에 투여되는 다른 약물 및 처리; 및 기타를 포함하는 몇몇 변수에 근거하여 사용 시점에 실증적 결정을 요구할 것이다. 당해 분야의 숙련자는, 투여되는 다수의 투여량 (투여 요법)이 또한, 예를 들어, 치료되는 질환, 손상, 장애 또는 병태의 중증도 및 유형에 근거하여 실증적으로 결정될 필요가 있음을 또한 인식할 것이다. 일 실시양태에서, 1회 용량이 충분하다. 다른 실시양태는 2, 3, 4회 이상 용량을 고려한다. 다른 실시양태에서, 본 발명 조성물은 콘텍트 렌즈의 내부 표면 위에 코팅될 수 있고 이는 그 후에 눈에 놓여지며, 그로써 안구 표면에 직접적으로 LSC의 전달을 허용한다. 콘텍트 렌즈의 코팅에 사용된 LSC는 액체, 겔 또는 다른 적합한 안과적으로 적합한 담체 중에 제제화될 수 있다.
본 발명의 배지
본 발명은 또한 최소 필수 배지, 성장 인자, 호르몬, 가용성 인자, 및 혈청 또는 혈청 대체제를 포함하는, LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포의 단기간 시험관 내 배양을 위한 피더-비함유 세포 배양 배지를 제공한다. 일 실시양태에서, 더 짧은 기간의 시험관 내 배양은 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포의 약 0 내지 약 4회 계대를 계대하는데 사용된다.
발명의 실시양태에서, 배지는 DMEM/F12 배지, DMEM, 페니실린-스트렙토마이신, 소 태아 혈청, EGF, 인슐린, 히드로코르티손, 콜레라 독소, 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌을 포함하고, 상기 소 태아 혈청은 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있으며, EGF 및 인슐린은 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, 각각의 성분은 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 기능적 등가 성분으로 대체될 수 있다.
다른 실시양태에서, 배지는 약 10-20% 범위의 소 태아 혈청 또는 약 10-20% 범위의 혈청용 혈청 대체제, 10-20 ng/ml 범위의 EGF, 5-10 μg/ml 범위의 인슐린, 0.2-0.8 μg/ml 범위의 히드로코르티손, 5×10-11 내지 5×10-10 M 범위의 콜레라 독소 및 10-9 M 내지 4×10-9 M 범위의 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 함유 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)을 포함하고, 상기 EGF 및 인슐린은 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, 각각의 성분은 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 기능적 등가 성분으로 대체될 수 있다.
발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 배지는 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청, 10 ng/ml EGF, 5 μg/ml 인슐린, 0.4 μg/ml 히드로코르티손, 10-10 M 콜레라 독소 및 2×10-9 M 3,3',5-트리요오도-L-티로닌을 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)을 포함하고, 상기 소 태아 혈청은 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고, EGF 및 인슐린은 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, 각각의 성분은 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 기능적 등가 성분으로 대체될 수 있다.
본 발명은 또한 최소 필수 배지, 성장 인자, 호르몬, 가용성 인자, 혈청 또는 혈청 대체제, 및 rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제롤 포함하는, LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포의 장기간 시험관 내 배양을 위한 피더-비함유 세포 배양 배지를 제공한다. 발명의 실시양태에서, 장기간 시험관 내 배양은 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포의 약 17회 이상의 계대를 계대하는데 사용된다.
일 실시양태에서, 배지는 DMEM/F12 배지, DMEM, 페니실린-스트렙토마이신, 소 태아 혈청, EGF, 인슐린, 히드로코르티손, 콜레라 독소, 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 및 Y-27632를 포함하고, 상기 소 태아 혈청은 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고, EGF 및 인슐린은 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, Y-27632는 다른 ROCK 억제제로 대체될 수 있고, 각각의 성분은 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 기능적 등가 성분으로 대체될 수 있다.
다른 실시양태에서, 배지는 약 10-20% 범위의 소 태아 혈청 또는 약 10-20% 범위의 혈청용 혈청 대체제, 약 10-20 ng/ml 범위의 EGF, 약 5-10 μg/ml 범위의 인슐린, 약 0.2-0.8 μg/ml 범위의 히드로코르티손, 약 5×10-11 내지 5×10-10 M 범위의 콜레라 독소, 약 10-9 M 내지 4×10-9 M 범위의 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 및 약 1-10 μM 범위의 Y-27632를 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)를 포함하고, 상기 EGF 및 인슐린은 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, Y-27632는 다른 ROCK 억제제로 대체될 수 있고, 각각의 성분은 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 기능적 등가물로 대체될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 배지는 약 100 U/ml 페니실린, 약 100 μg/ml 스트렙토마이신, 약 10% 소 태아 혈청, 약 10 ng/ml EGF, 약 5 μg/ml 인슐린, 약 0.4 μg/ml 히드로코르티손, 약 10-10 M 콜레라 독소, 약 2×10-9 M 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 및 약 1 μM Y-27632를 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)을 포함하고, 상기 소 태아 혈청은 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고, EGF 및 인슐린은 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있다. Y-27632는 다른 ROCK 억제제로 대체될 수 있다. 또한, 각각의 성분은 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 기능적 등가물로 대체될 수 있다.
본 발명은 추가적으로 최소 필수 배지, 성장 인자, 호르몬, 가용성 인자, 혈청 또는 혈청 대체제, rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제 및 백혈병 억제 인자 (LIF)를 포함하는, LSC 또는 LSC-유사 세포의 장기간 시험관 내 배양을 위한 피더-비함유 세포 배양 배지를 제공한다. 장기간 시험관 내 배양은 LSC 또는 LSC-유사 세포의 약 17회 이상의 계대를 계대하는데 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 배지는 DMEM/F12 배지, DMEM, 페니실린-스트렙토마이신, 소 태아 혈청, EGF, 인슐린, 히드로코르티손, 콜레라 독소, 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, Y-27632, 및 LIF를 포함하고, 상기 소 태아 혈청은 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고, EGF, 인슐린, 및 LIF는 각각 재조합 EGF, 재조합 인슐린, 및/또는 재조합 LIF, 바람직하게는 재조합 인간 EGF, 재조합 인간 인슐린, 및 재조합 인간 LIF일 수 있고, Y-27632는 다른 ROCK 억제제로 대체될 수 있고, 각각의 성분은 LSC 또는 LSC-유사 세포가 증식하고 CEC로 분화하지 않는 한 기능적 등가 성분으로 대체될 수 있다.
다른 실시양태에서, 배지는 약 10-20% 범위의 소 태아 혈청 또는 약 10-20% 범위의 혈청용 혈청 대체제, 약 10-20 ng/ml 범위의 EGF, 약 5-10 μg/ml 범위의 인슐린, 약 0.2-0.8 μg/ml 범위의 히드로코르티손, 약 5×10-11 내지 5×10-10 M의 콜레라 독소, 약 10-9 M 내지 4×10-9 M 범위의 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 약 1-10 μM 범위의 Y-27632, 약 5-20 ng/ml LIF를 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)를 포함한다. 또한, EGF, 인슐린, 및 LIF는 각각 재조합 EGF, 재조합 인슐린, 및/또는 재조합 LIF일 수 있다. 바람직하게는 재조합 인간 EGF, 재조합 인간 인슐린, 및 재조합 인간 LIF가 사용된다. 나아가, Y-27632는 다른 ROCK 억제제로 대체될 수 있다. 또한, 각각의 성분은 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC로 분화하지 않는 한 기능적 등가물로 대체될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 배지는 약 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청, 10 ng/ml EGF, 5 μg/ml 인슐린, 0.4 μg/ml 히드로코르티손, 10-10 M 콜레라 독소, 2×10-9 M 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 1 μM Y-27632 및 10 ng/ml LIF를 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)을 포함한다. 소 태아 혈청은 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고; EGF, 인슐린, 및 LIF는 각각 재조합 EGF, 재조합 인슐린, 및/또는 재조합 LIF, 바람직하게는 재조합 인간 EGF, 재조합 인간 인슐린, 및 재조합 인간 LIF일 수 있다. Y-27632는 다른 ROCK 억제제로 대체될 수 있다. 추가적으로, 다른 실시양태에서, 각각의 성분은 LSC 또는 LSC-유사 세포가 증식하고 CEC로 분화하지 않는 한 기능적 등가물로 대체될 수 있다.
적합한 ROCK 억제제의 예시에는 (R)-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드 모노하이드레이트 (Y-27632; Sigma-Aldrich), 5-(1,4-디아제판-1-일설포닐) 이소퀴놀린 (파수딜 또는 HA 1077; Cayman Chemical), H-1152, H-1152P, (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]호모피페라진 디히드로클로라이드, 디메틸파수딜 (diMF; H-1152P), N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아, Y-39983, Wf-536, SNJ-1656, 및 (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀 디히드로클로라이드 (H-1152; Tocris Bioscience), 이미다졸-함유 벤조디아제핀, 이미다조피리딘 유도체, 인다졸 코어, 2-아미노피리딘/피리미딘 코어, 9-데아자구아닌 유도체, 벤즈아미드, 또는 아미노퓨라잔을 포함하는 화합물, 및 이들의 유도체 및 유사체, 및 이들의 조합이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
발명의 실시에 따라서, 소 태아 혈청은 인간 혈청 또는 다른 혈청 대체제로 대체될 수 있다 (그렇게 수득되고/되거나 증대된 줄기세포의 포유동물 기원에 좌우됨). 예를 들어, 줄기세포는 인간, 래트, 개, 고양이, 돼지, 말, 토끼, 소, 원숭이 또는 마우스와 같은 포유동물 유래일 수 있다.
일 실시양태에서, EGF, 인슐린 또는 LIF는 각각 재조합 EGF, 재조합 인슐린 또는 재조합 LIF이다. 예를 들어, EGF는 재조합 인간 EGF일 수 있다. 단지 예시로서, 인슐린은 재조합 인간 인슐린일 수 있다. 다른 예시에서, LIF는 재조합 인간 LIF일 수 있다.
실시양태에서, 본 발명은 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3)의 억제제 및/또는 전환 성장 인자 β (TGF-β)의 억제제 없이 상기에 기술된 임의의 실시양태의 성분들을 갖는 본 발명의 배양 배지를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에 기술된 임의의 실시양태의 성분들로 필수적으로 이루어진 본 발명의 배양 배지를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용된 호르몬에는 글루코코르티코이드, 히드로코르티손, 글루코코르티코이드 수용체 작용제, 갑상샘 호르몬, 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 또는 T3, 갑상샘 수용체 작용제, 및 인슐린이 포함된다. 호르몬은 자연계에서 발견된 호르몬의 구조를 반영하도록 합성될 수 있거나 또는 자연계에서 발견되지는 않지만 특정 호르몬 수용체, 예컨대 글루코코르티코이드 수용체, 갑상샘 수용체 또는 인슐린 수용체의 활성을 조정할 수 있는 합성적/인공적 호르몬일 수 있다.
하기 실시예는 본 발명 개시의 바람직한 실시양태를 입증하도록 포함된다. 수반되는 실시예에 기술된 기법이 발명의 실시에 있어서 발명자들에 의해 잘 기능하는 것으로 발견된 기법을 나타내고, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있음이 당해 분야의 숙련자에게 인식되어야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련자는, 본 발명의 개시에 비추어, 다양한 변화가 기술된 특정 실시양태에 이루어질 수 있고 발명의 요지 및 범주를 벗어나지 않으면서 같거나 유사한 결과를 여전히 달성할 수 있음을 인식한다.
실시예
하기 실시예는 당해 분야의 숙련자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 이용하는 방법의 완벽한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되는 것으로, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자 (예컨대, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만 일부 실험적 오류 및 편차가 이에 대해 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부 (parts)는 중량부 (parts by weight)이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 그에 가깝다.
실시예 1
재료 및 방법
인간 병리학 샘플
각막 편평상피 화생 및 모든 다른 조직을 신원이 은닉된 (de-identified) 외과적 표본으로서 수득하고, 5% 포르말린에 고정하고, 파라핀 내로 포매하고, 절편화하여 면역형광 연구를 위해 염색하였다.
윤부 줄기세포 및 피부 표피 줄기세포의 분리 및 배양
사후 인간 안구 (eyeball)를 안구 은행으로부터 수득한 후 윤부 영역을 취하여 100 IU 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 함유 냉각 PBS 중에 세척하고, 작은 조각으로 절단하였다. 세포 클러스터를 37℃에서 2시간 동안 0.2% 콜라게나제 IV 분해에 의해 수득하고, 37℃에서 15분간 0.25% 트립신-EDTA으로의 추가 분해하여 단일 세포를 수득하였다. 일차 세포를 2% 성장 인자 감소된 Matrigel® (354230, BD Biosciences, Inc.)로 코팅된 플라스틱 플레이트 상에 접종하였다. GFP-표지된 래트 및 토끼로부터의 윤부 줄기세포를 분리하고 인간 LSC에서와 동일한 방법을 이용하여 배양하였다.
인간 표피를 눈꺼풀의 공여자 피부 생검으로부터 수득하고, 모낭을 현미경하에서 제거하였다. 일차 인간 및 토끼 표피 줄기세포를 인간 윤부 줄기세포에 대해 기술된 바와 동일한 방법을 이용하여 모낭간 표피로부터 분리하였다. 배양 배지는 하기와 같다: 1/100 Pen-Strep, 10% 소 태아 혈청, 10 ng/ml EGF, 5 μg/ml 인슐린, 0.4 μg/ml 히드로코르티손, 10-10 M 콜레라 독소 및 2×10-9 M 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 함유 DMEM/F12 및 DMEM (1:1).
이 실시예 1에 사용된 모든 세포는 본 발명자의 실험실에서 만들어진 일차 배양된 세포로부터 유래한다. 미코플라스마 오염 검사를 일상적으로 수행하였고 이는 음성이었다.
시험관 내 3차원 (3-D) 분화 프로토콜
3-D 분화를 24-웰 플레이트 또는 8-웰 챔버 상에서 수행하였다. 간략히는, 해리된 단일 줄기세포를 2×104 세포/50 μl 겔로 Matrigel® 내에 포매하였다. 분화 배지 CnT-30 (윤부 줄기세포 분화) 또는 CnT-02 (피부 표피 줄기세포 분화) (CellnTec, Inc.)에서 14-18일의 배양 후 3-D 구조가 형성되었다.
면역형광 및 레이저 공초점 현미경
배양된 세포 내 단백질의 위치를 검출하기 위하여, 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정한 후, 0.3% 트리톤 X-100-PBS로 5분간 2회 투과시키고, 5% 소 혈청 알부민 및 0.3% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 용액 중에서 차단하고, 이어서 4℃에서 일차 항체와 밤새 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 이차 항체와 인큐베이션하였다. 세포 핵을 DAPI로 대비 염색하였다. 파라핀-포매된 조직 절편의 면역형광을 위해, 탈파라핀화를 수행하고, 이어서 상기에 기술된 동일한 면역형광 프로토콜을 수행하였다.
하기 항체가 사용되었다: 마우스 항-P63 모노클로날 항체, 토끼 항-K5 모노클로날 항체, 마우스 항-K10 모노클로날 항체, 비오틴 표지된 마우스 항-K14 모노클로날 항체, 마우스 항-K19 모노클로날 항체, (MA1-21871, RM2106S0, MS611P0, MS115B0, MS1902P0, Thermo Fisher Scientific, Inc.), 토끼 항-PAX6 폴리클로날 항체 (PRB-278P, Covance, Inc.), 마우스 항-K1 모노클로날 항체 (sc-376224, Santa Cruz, Inc.), 토끼 항-WNT7A 폴리클로날 항체, 마우스 항-K3/12 모노클로날 항체, 토끼 항-K12 모노클로날 항체 (ab100792, ab68260, ab124975, Abcam, Inc.), 마우스 항-Ki67 모노클로날 항체 (550609, BD Sciences, Inc), 항-GFP 토끼 모노클로날 항체 및 항-GFP 마우스 모노클로날 항체 (G10362, A11120, Invitrogen, Inc). 이차 항체, Alexa Fluor 488 또는 568-접합된 항-마우스 또는 토끼 면역글로불린 G (IgG) (Invitrogen, Inc.)를 1:500의 희석으로 사용하였다. 올림푸스 FV1000 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 수득하였다.
실시간 PCR (Q- PCR )
RNA를 RNeasy 키트 (Qiagen, Inc.)를 사용하여 분리하고 칼럼 DNase 분해에 적용하였다. 제조사 (Invitrogen, Inc.)의 지침에 따라서 Superscript III 역전사 키트를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 정량적 PCR을 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Inc.) 상에서 유전자 특이적 프라이머 (표 1) 및 Power SYBR Green PCR Master Mix를 사용하여 40 사이클 증폭으로 수행하였다. 측정을 3회 반복 수행하고 내인성 GAPDH 수준에 대해 표준화하였다. 발현에 있어서의 상대적 배수 변화를 ΔΔCT 방법 (CT 값 < 30)을 사용하여 계산하였다. 데이터를 3회 반복에 근거하여 평균 ± SD로 나타내었다.
프라이머 서열
유전자 (인간) 정방향 프라이머 역방향 프라이머
CASZ1 GTTCTACGGACAGAAGACCACG TCTTGAAGCCGTCCTTGGCGTA
FGFR3 AGTGGAGCCTGGTCATGGAA GGATGCTGCCAAACTTGTTCTC
FZD5 TGGAACGCTTCCGCTATCCTGA GGTCTCGTAGTGGATGTGGTTG
GAPDH GAGTCAACGGATTTGGTCGT GACAAGCTTCCCGTTCTCAG
ID2 TTGTCAGCCTGCATCACCAGAG AGCCACACAGTGCTTTGCTGTC
K1 CAGCATCATTGCTGAGGTCAAGG CATGTCTGCCAGCAGTGATCTG
K3 ACGTGACTACCAGGAGCTGATG ATGCTGACAGCACTCGGACACT
K5 GCTGCCTACATGAACAAGGTGG ATGGAGAGGACCACTGAGGTGT
K10 CCTGCTTCAGATCGACAATGCC ATCTCCAGGTCAGCCTTGGTCA
K12 AGCAGAATCGGAAGGACGCTGA ACCTCGCTCTTGCTGGACTGAA
K14 TGCCGAGGAATGGTTCTTCACC GCAGCTCAATCTCCAGGTTCTG
K15 AGGACTGACCTGGAGATGCAGA TGCGTCCATCTCCACATTGACC
K19 AGCTAGAGGTGAAGATCCGCGA GCAGGACAATCCTGGAGTTCTC
MEIS1 AAGCAGTTGGCACAAGACACGG CTGCTCGGTTGGACTGGTCTAT
MMP9 GCCACTACTGTGCCTTTGAGTC CCCTCAGAGAATCGCCAGTACT
MMP10 TCCAGGCTGTATGAAGGAGAGG GGTAGGCATGAGCCAAACTGTG
NR2F2 TGCACGTTGACTCAGCCGAGTA AAGCACACTGAGACTTTTCCTGC
NOTCH1 GGTGAACTGCTCTGAGGAGATC GGATTGCAGTCGTCCACGTTGA
NOTCH3 TACTGGTAGCCACTGTGAGCAG CAGTTATCACCATTGTAGCCAGG
ODZ3 GGACAAGGCTATCACAGTGGAC TTCTGAGGGAGCCGTCATAACC
PAX6 TGTCCAACGGATGTGTGAGT TTTCCCAAGCAAAGATGGAC
PDGFA CAGCGACTCCTGGAGATAGACT CGATGCTTCTCTTCCTCCGAATG
PPARG AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTG GGCTTCACATTCAGCAAACCTGG
PRDM8 CTGTGTCCTGAGCCATACTTCC CCTTCTGAGGAACCATTTGCTGC
TGFBI AGGACTGACGGAGACCCTCAAC TCCGCTAACCAGGATTTCATCAC
WNT7A TGCCCGGACTCTCATGAAC GTGTGGTCCAGCACGTCTTG
유전자 (토끼) 정방향 프라이머 역방향 프라이머
GAPDH GCGAGATCCCGCCAACATCAAGT AGGATGCGTTGCTGACAATC
PAX6 GTATTCTTGCTTCAGGTAGAT GAGGCTCAAATGCGACTTCAGCT
PAX6 이식에 사용된 프라이머
PAX6 InF ttcccgaattctgcagacccatgcagatgcaaaagtccaagtgctggacaatcaaaacgtgtccaacggatgtg
PAX6 InR cacatccgttggacacgttttgattgtccagcacttggacttttgcatctgcatgggtctgcagaattcgggaa
게놈 와이드 (Genome wide) 유전자 발현 마이크로어레이 및 데이터 분석
총 RNA를 3-D 분화 분석으로부터 LSC, SESC 및 분화된 CEC로부터 분리하였다. 유전자 발현 마이크로어레이 분석을, 생물학적 복제인 각 샘플을 이용해, 일루미나 (Illumina) 인간 유전체 마이크로어레이 시스템을 사용해 수행하였다 (n = 2/그룹; 인간 HT-12 v4 발현 BeadChip; Illumina, San Diego, CA). 미가공 데이터를 GEO 데이터베이스에 등재 번호 GSE32145로서 기탁하였다. 발현 수준 데이터를 일루미나 BeadStudio 버전 3.4.0에 의해 생성하였고 4분위수 (quartile) 표준화를 이용하여 표준화하였다. 그의 발현 수준이 적어도 하나의 샘플에서 64의 역치를 초과하는 프로브를 검출된 것으로 간주하였다. log2 발현 수준의 분포 플롯으로부터의 검증에 의해 역치를 확인하였다. 검출된 프로브를 이들의 q-값에 따라서 분류하였고, 이는 프로브가 유의미하다고 불리는 가장 작은 위 발견율 (false discovery rate: FDR)이다. FDR을 마이크로어레이의 유의성 분석 및 공인된 통계학적 패키지 sam19에서 이의 실행을 이용하여 평가하였다. 비정상적으로 미미한 가변성으로 인한 위양성 세포를 회피하기 위하여, 규정화된 t-통계에서 교환성 인자 (exchangeability factor) s0에 대해 사용된 표준 편차값의 백분수를 50으로 설정하였다. 본 발명자들은 LESC 및 CEC 샘플을 한 그룹의 4개 샘플 내로 조합하였고, 이 그룹과 SESC 샘플 사이에서 차등적으로 발현된 유전자를 조사하였다. 이 비교에서 상의 100개의 유의미한 유전자를 도 4에 나타내었다. 이 도면에서의 모든 유전자는 0.01 이하의 FDR 수준에서 유의미하였다. 히트맵을 사내 (in-house) 계층 클로스터링 소프트웨어를 사용하여 작성하였고, 색깔은 정량적으로 배수 변화에 상응한다.
RNA- seq 및 계층 클러스터 분석
총 RNA를 Picropure RNA 분리 키트 (Life Technology)로 정제하였다. RNA-seq를 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다20. 간략히는, 600 ng의 총 RNA를 먼저 프라이머 비오틴-B-T를 사용해 superscript III 제1 가닥 합성 키트에 의해 cDNA로 전환하였다. 유리 프라이머 및 효소를 제거하기 위해 cDNA를 NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-Up 키트 칼럼 (Clontech)으로 정제하였다. 그 후에, 말단 트랜스퍼라제 (NEB)를 cDNA 3' 단부의 말단을 차단하기 위해 적용하였다. 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 (Life Technology)를 cDNA를 분리하기 위해 추가로 적용하였다. 수산화나트륨에 의해 RNA 분해 후, 제2 가닥 cDNA를 프라이머 A-N8을 이용한 랜덤 프라이밍으로 합성하였다. 제2 가닥 cDNA를 열 변성에 의해 비드로부터 용출하였다. cDNA를 그 후에 바코드 프라이머 및 프라이머 PB를 이용한 증폭에 의해 라이브러리를 구축하기 위한 주형으로 사용하였다. Hiseq 2000 시스템 상에서 서열분석을 수행하였다.
클러스터 및 Java TreeView21를 사용하여 계층 클러스터 분석을 수행하였다. 미가공 데이터를 클러스터 프로그램에 의해 제공된 디폴트 매개변수를 사용하여 먼저 필터링하였고, 필터링된 데이터를 로그 변환, 중간값의 중심 유전자 및 어레이로 추가 조정하였으며, 그 후에 Euclidean 및 평균 연결법 (average linkage)으로 유전자 및 어레이 둘 모두를 계층적으로 클러스터링하였다. 계층 트리 및 유전자 매트릭스를 시각화하고 Java Treeview로 생성하였다.
렌티바이러스 RNAi 및 PAX6 형질도입
PAX6, WNT7A, 및 FZD5 유전자를 표적하는 렌티바이러스 shRNAs를 AgeI과 EcoRI 사이의 pLKO.1 플라스미드 내로 클로닝하거나 Sigma로부터 직접 구매하였다. 유전자 특이적 넉다운을 위한 ShRNAs-표적 서열은 다음과 같다: PAX6, CGTCCATCTTTGCTTGGGAAA 및 AGTTTGAGAGAACCCATTATC; WNT7A, CGTGCTCAAGGACAAGTACAA 및 GCGTTCACCTACGCCATCATT; FZD5, CGCGAGCCCTTCGTGCCCATT 및 TCCTAAGGTTGGCGTTGTAAT. 본 발명자들은 모든 유전자 넉다운 실험에서 음성 대조군으로서 임의의 종 유래의 어떠한 공지된 유전자도 표적하지 않는 shRNA를 인코딩하는 렌티바이러스 pLKO.1-puro 비-표적 shRNA 대조군 플라스미드 (Sigma, Inc.)를 사용하였다.
렌티바이러스 shRNA 입자를 이전에 기술된 프로토콜22에 따라서 제조하였다. 간략히는 복제-불완전 렌티바이러스 입자를 shRNA 컨스트럭트 (construct)와 패키징 믹스 (9:1 백분율로 pCMV-dR8.2 및 pCMV-VSVG)의 동시-형질감염에 의해 293T 세포 내에 패키징하였다. 바이러스를 형질감염 48시간 및 72시간 후에 2회 수확하였다.
형질도입 후, PAX6a ORF를 Thermo Scientific (MHS6278-202756612)으로부터 구입한 cDNA로부터 PCR 증폭하고 BamH1과 BsrG1 사이의 pLenti CMV-GFP Puro 벡터 내로 삽입하였다. PAX6b를 프라이머 PAX6 InF 및 PAX6 InR (표 1)을 사용한 PCR 매개 점 돌연변이 전략에 의해 생성하였다. GFP-표지를 위해, Addgene으로부터 구입한 pLenti CMV-GFP Hygro (656-4)를 사용하였다. 렌티바이러스 입자를 패키징 플라스미드 psPax2 및 pMD2.G와 함께 동시-형질감염에 의해 패키징하였다.
렌티바이러스 감염의 경우, 세포를 16-20시간 동안 개별적 바이러스 및 8 μg/ml 농도의 폴리브렌을 함유하는 신선한 배지로 감염시켰다. 감염된 세포를 48시간 동안 2 μg/ml 퓨로마이신 또는 72시간 동안 200 μg/ml 하이그로마이신으로 추가 선별하였다.
웨스턴 블롯 및 동시-면역침전 (Co-IP)
웨스턴 블롯팅을 위해, 세포를 PBS로 1회 세척한 후 세포 용해 완충제 (50 mM Tris-HCl, pH 6.8; 2% SDS; 10% 글리세롤; 100 mM DTT) 중에 수집하였다. 단백질 농도를 나노드롭 (Nanodrop)으로 정량하고 브로모페놀 블루를 0.1%의 최종 농도로 첨가한 후, 25 μg의 총 용해물을 4-12% NUPAGE 겔 (Life Technology, Inc) 상에 옮겼다. 단백질을 100V에서 1시간 동안 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 5% 우유로 차단하고 관련 항체 및 마우스 항-β-액틴 모노클로날 항체 (A5316, Sigma, Inc.)로 탐침하였다.
FZD5와 WNT7A 사이의 상호작용을 검출하기 위하여, 90% 융합성의 윤부 줄기세포의 10-cm 접시를 수집하고; 세포 펠렛을 700 μl의 Co-IP 완충제 (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 1X 단백분해효소 억제제) 중에 재현탁하고 20분간 얼음 중에 인큐베이션한 후, 4℃에서 20분간 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 600 μl의 상청액을 2개의 미리-냉각된 에펜도르프 튜브에 분주하고, 5 μg의 토끼 항-FZD5 모노클로날 항체 (#5266, 세포 시그널링, Inc.) 또는 WNT7A 항체를 각 튜브에 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 μl의 단백질 A/G 자기 비드 (Thermo Fisher, Inc.)를 각 튜브에 첨가하고, 2시간 동안 4℃에서 인큐베이션하고, Co-IP 완충제로 세척하고 70℃에서 1× SDS 샘플 완충제 (Life Technology, Inc.)에 용출하였다. 투입 및 용출을 4-12% NUPAGE 겔 상에 분획화하고 FZD5 및 WNT7A 항체로 블롯팅하였다.
세포 이식
모든 동물 연구를 안과 및 시력 연구에 있어 동물의 사용을 위한 ARVO 성명에 따라서 수행하였고 동물관리 위원회 (Institutional Animal Care Committees)의 승인을 얻었다.
뉴질랜드 흰토끼 (2.0 kg-2.5 kg, 수컷)를 이 연구에 사용하였다. 토끼를 자일라진 염산염 (2.5 mg/mL) 및 케타민 염산염 (37.5 mg/mL)의 근육내 주사로 마취시켰다. 윤부 줄기세포 결핍 모델을 만들기 위하여 (도 11f), 각막 및 윤부 상피를, 전방 공막 및 각막 간질 조직, 윤부로부터 각막의 중심쪽으로 2 mm 후방을 제거하기 위하여 360도 결막 윤부결막절개술 (peritomy) 및 층판 박리에 의해 제거하였다. 이 박리는 LSC 및 전체 각막 상피의 제거를 보증하였다. 5×105 토끼 GFP-표지된 LSC, PAX6+ SESC 또는 shPAX6 LSC 세포를 피브린 (25 mg/ml) 및 트롬빈 (25 U/ml)과 혼합하고 수용자 각막 및 윤부 영역의 노출된 간질 바탕 (interstitial bed) 위에 접종하고; 그 후에 표면을 10.0 VICRYL 봉합사 (ETHICON, USA)로 확보된 인간 양막 (Bio-조직, Inc. USA)으로 덮었다 (표 2).
토끼 이식 결과의 요약
토끼 수
GFP-표지된 공여자 세포 재생 및 재-상피화 불투명 및 혈관화된
각막 표면		 전신 감염 또는 비관련
합병증으로 인한 사망
LSC 3 0 0
PAX6+ SESC 5 0 2
shPAX6 LSC 0 4 1
음성 대조군으로서, 단지 양막만이 벗겨진 각막 (denuded cornea)에 적용되었다. 항생제 (레보플록사신) 및 스테로이드 (베타메타손)를 세포 이식 과정 후 즉시 두 눈에 적용하였고, 2주간 1일 3회 투여하였다. 동물을 무작위로 각 실험군에 배정하였다. 세포 이식을 수행한 조사자는 사용된 세포의 신원을 알지 못하였다. 또 다른 조사자는 토끼에서 각막 상피 복구의 효과를 평가하기 위해 이용되었고 이식에 사용된 세포의 신원을 알지 못하였다. 분석을 위해, 본 발명자들은 이들이 세포 이식 효과의 평가를 위해 종료점에 도달하지 못하였기 때문에 감염과 같은 수술-후 합병증으로 죽은 동물만을 배제하였고; 이 기준은 미리-확립된다.
결과 및 논의
각막 및 피부 상피는 계층화된 상피의 전형적 형상 및 윤부 및 표피 내 케라틴5/케라틴14+ (K5/K14) 기저 세포층에서 p63에 의한 이들의 줄기세포의 유지를 비롯해, 다수의 유사성을 공유한다4 -8 (도 1a, 1b, 2a 및 2b). 그러나, 이들 사이에 눈에 띄는 차이가 있다. 피부 상피 줄기세포 (SESC)는 분화 도중 심부로부터 초기저층들로 수직으로 상향 이동하는데9 ,10, 여기서 K5 및 K14는 피부 특이적 K1/K10로 대체된다 (참조 11; 도 2c 및 2d). 반대로, LSC (윤부에서 K19에 의해 정의됨12, 도 1a 및 2e 참조)는 중심 각막으로 수 밀리미터 구심적으로 이동하고 그동안에 LSC는 분화를 거치고 K5/K14가 각막 특이적 K3 및 K12로 대체된다 (참조 13, 14; 도 1c 및 2f).
CEC에 의해 유지된 선명하고, 투명한 각막은 시력에 필수적이다. 케라틴 발현에서 형태학적 변화 및 스위칭에 의해 지시된 바와 같이 (예컨대, 기저층에서 K5 양성 세포와 함께 피부 특이적 K1/K10에 의한 각막 특이적 K3/K12의 대체, 도 1d 참고), 피부-유사 상피세포로 CEC의 병리학적 전환은 각막에서 투명성 상실을 초래하고 세계적으로 수백만 명의 사람들이 부분 또는 완전 실명이 되도록 야기하지만3, 근본적인 기전은 여전히 대부분 알려지지 않은 상태이다.
잠재적인 질환 기전을 규명하기 위하여, 본 발명자들은 인간 공여자로부터 LSC를 증대하는 피더-비함유 세포 배양 프로토콜을 성공적으로 개발하였고, 이는 본 발명자들이 LSC 세포 운명 결정 및 CEC 분화를 제어하는데 관여하는 핵심 인자를 파악하도록 동종의 세포 집단의 생성을 가능케 하였다. 증식하는 LSC는 고 백분율의 유사분열 마커 Ki67과 함께 양성 p63 및 K19를 특징으로 하였다 (도 2g 및 3a). 본 발명자들은 이어서 CEC 특이적 마커 K3/K12의 강력한 발현에 의해 입증되는 바와 같이, 14-18일 이내에 단일 LSC로부터 3-D CEC 스피어 (sphere) 구조를 확립하기 위해 3차원 (3-D) LSC 분화 프로토콜을 확립하였다 (도 3b). 3-D 분화 스피어는 또한 LSC와 CEC 사이의 유전자 발현에 있어 중요한 차이를 특징으로 하는데, 여기서 후자는 K3 (↑31.2배) 및 K12 (↑24.7배)의 증가된 발현 및 K19의 동시 감소된 발현 (↓6.2x, 모두 p<0.01; 도 2h 참고)을 나타내었다. 본 발명자들은 SESC를 증대하기 위해 유사한 전략을 취하였고 배양된 SESC에서 전형적인 SESC 마커 P63 및 K5의 강력한 발현을 관찰하였다 (도 3c). 예상한 바와 같이, 본 발명자들은 SESC에 비해 3-D 분화된 피부 상피세포 (SEC)에서 표피 분화 마커 K1 (↑16.6배) 및 K10 (↑225.8배)의 증가된 발현을 검출하였다 (도 2i, 2j 및 3d).
LSC, CEC 및 SESC에서 독특하게 발현되는 추가적인 유전자를 동정하기 위하여, 본 발명자들은 게놈-와이드 유전자 발현 분석을 수행하였다 (도 3e, 4a 및 4b). 차등적으로 발현되었던 유전자들 중에서, 본 발명자들은 세포 운명 결정 및 분화에 있어 이들의 중심적인 역할로 인해 시그널링 분자 및 전사 인자에 집중하였다. 본 발명자들은 SESC와 비교할 때 LSC 및 CEC에서 높게 발현되었던 WNT7A 및 PAX6을 동정하였다 (PAX6, LSC에서 ↑8.8배 및 CEC에서 ↑12.3배, p< 0.001; WNT7A, LSC에서 ↑4.5배, CEC에서 ↑6.0배, p<0.001) (도 3e 및 4c). 본 발명자들은 WNT7A 발현이 시험관 내 LSC 및 CEC 배양액, 및 유아기부터 성인까지 각막 및 윤부의 생체 내 상피층에서 PAX6의 발현 패턴을 정확하게 반영하는 반면, 이들 유전자 둘 모두는 피부 표피에서 검출 가능하지 않음을 관찰하였다 (도 3f 및 4d).
LSC 및 CEC에서 WNT7A 및 PAX6 발현의 임상적 관련성을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 여러 유형의 인간 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 및 알칼리 화상을 조사하였다. 본 발명자들은 기저층에서 p63 및 K5의 국소적 발현 (도 5a 및 6)과, 초기저층에서 K10의 발현 (도 1d 및 6)을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 WNT7A/PAX6 및 K3/12 발현이 화생 부위에서는 두드러지게 부재한 반면, 이들은 각막 상피 주변에서 양성이었음 (도 5a 및 6)을 확인하였다. 이들 결과는 각막 상피세포가 이들 질환 병태를 갖는 환자 조직에서 피부-유사 상피세포로 스위칭되었음을 제안한다.
Wnt 분자는 세포 운명 결정 및 조직 특성화를 제어하는데 결정적 역할을 하는 분비 시그널링 단백질이다15. PAX6은 또한 눈 발생 및 질환에 대한 잘 알려진 제어 유전자이다16. 그러나, PAX6의 상실이 안구 표면 질환에서 비정상적 피부 표피 분화의 원인 또는 결과인지는 여전히 명확하지 않다.
WNT7A 및 PAX6이 LSC 및 CEC 세포 운명 결정 및 분화에 필수적임을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 LSC에서 이들을 특이적으로 넉다운시키기 위해 렌티바이러스 shRNAs를 사용하였다. WNT7A 또는 PAX6 중 하나의 넉다운을 갖는 LSC는 증식 및 형태학적 특성이 변화되지 않는 반면 (도 7a), 이들 처리는 3-D 분화 조건하에서 각막 K3/K12의 발현을 유의미하게 감소시켰고 (WNT7A 넉다운: K3에서 ↓24.7배, K12에서 ↓22.6배; PAX6 넉다운: K3에서 ↓20.8배, K12에서 ↓21.4배; 모두 P<0.05), 동시에, 더 많은 피부-유사 분화를 나타내는 피부-특이적 K1/K10의 발현은 더욱 두드러졌다 (WNT7A 넉다운: K1에서 ↑3.9배 및 K10에서 ↑5.7배; PAX6 넉다운: K1에서 ↑3.1배 및 K10에서 ↑6.1배; 모두 P<0.05) (도 5b 및 5c). 나아가, WNT7A의 넉다운은 LSC에서 PAX6 발현을 감소시켰는데 (↓1.8배, p<0.001); 이러한 억제적 효과는 분화된 CEC에서 훨씬 더 강력하였다 (↓8.0배, p<0.01). 반면, PAX6이 LSC 또는 CEC 중 하나에서 넉다운된 경우 WNT7A 발현에는 어떠한 유의미한 차이도 없었다 (도 5c, 7b 및 7c). 이들 결과는 WNT7A가 CEC 분화 동안 PAX6의 상류에서 작용함을 암시한다.
각막 운명 결정 및 분화에서 Wnt 시그널링 경로의 역할을 더욱 연구하기 위하여, 본 발명자들은 동시-면역침전을 토대로 WNT7A 시그널링과 상호작용하고 이를 변환하는 것으로 나타난, Frizzled 수용체 (FZD)의 기능적 요건을 조사하였다17. 본 발명자들은 WNT7A가 LSC에서 FZD5와 강력하게 상호작용하였고 (도 7d 및 7e), 예상되는 바와 같이, LSC에서 FZD5의 넉다운이 또한 PAX6 발현의 감소를 초래하였음 (LSC에서 ↓1.7배 및 분화된 CEC에서 ↓3.0배 (p < 0.001)을 발견하였다 (도 7f). 종합하면, 이들 데이터는 WNT7A 또는 PAX6의 손실이 각막 상피세포의 피부-유사 표피세포로의 스위칭을 초래하였고 WNT7A/FZD5가 각막 분화에서 PAX6 발현의 상류 조절자로서 작용하였음을 입증하였다.
눈 발생에 있어 PAX6의 중추적 역할을 감안하여16, 본 발명자들은 이어서 PAX6의 조작된 (engineered) 발현이 SESC를 LSC-유사 세포로 전환할 수 있을지 모르는 가능성을 검사하였다 (도 8a). 실제로, 본 발명자들은 핵내에서 P63 및 PAX6 둘 모두의 발현과 동시에, 표면에서 유도된 K19 발현에 의해 입증된 바와 같이, SESC에서 PAX6a 또는 PAX6b 중 하나의 발현이 이들을 LSC-유사 세포로 전환하는데 충분하였음을 확인하였다 (도 9a). 3-D 배양 상태에 놓이는 경우, PAX6-형질도입된 SESC는 피부 K1/K10 발현에서의 동시 감소 (↓20.8배 및 ↓20.0배, 모두 p<0.01)와 함께 각막 K3/K12 발현에서의 극적인 증가 (↑9.4배 및 ↑72.7배, 모두 p<0.05)를 나타내었다 (도 8b, 8c, 9b 및 9c). 성공적인 세포 운명 전환에 대한 포괄적 증거를 입수하기 위해, 본 발명자들은 PAX6의 넉다운 후 CEC, SEC, 및 LSC와, 3-D 분화 시 PAX6로 형질도입된 SESC에 대해 RNA-seq에 의한 유전자 발현 프로파일링을 수행하였다18. 본 발명자들은 Refseq 데이터베이스에 독특하게 맵핑되었던 각 생물학적 샘플로부터 3백만 내지 7백만 개의 판독값을 생성하였다 (도 10a). 페어-와이즈 (Pair-wise) 비교는 이 데이터가 동일한 그룹의 샘플에서 매우 재현가능하였음 (도 10b)을 입증한 반면, 다른 운명을 갖는 세포들을 비교하는 경우, 이 데이터는 FDR <0.001의 통계학적 컷-오프를 기준으로 주목할만한 차이를 입증하였다 (도 10c). 본 발명자들은 다양한 세포 유형에서 >10,000개 유전자의 발현을 기록한 전체 데이터세트를 표시하였고 (도 9d), 이는 유도된 (적색) 및 억제된 (녹색) 유전자들 모두 CEC와 PAX6+ SESC 사이 및 shPAX6-처리된 LSC와 SEC 사이에서 명확하게 동시-분리되었음을 증명한다. 따라서 이들 데이터는 SESC에서 CEC로의 세포 운명 전환에 있어 WNT7A/PAX6 축의 역할에 대한 포괄적 증거를 제공하였다. 요컨대, 이들 데이터는 각막 상피 분화에서 WNT7 및 PAX6 축의 중요성을 결정하기 위해 추가의 연구가 수행될 필요가 있지만, WNT7A/PAX6 축에서의 결함이 인간의 각막 질환에서 각막 세포의 피부 표피-유사 세포로의 화생적 전환을 담당할 가능성이 있음을 제안한다 (도 9e에 나타남).
마지막으로, 본 발명자들은 PAX6의 조작된 발현을 갖는 SESC (도 11a, 11b 및 11c)가 인간에서 통상의 각막 질환 병태를 모사하는 토끼 LSC 결핍 모델에서 각막 상피 결함을 치료하고 복구하는데 사용될 수 있을지 모를 가능성을 시험하였다 (도 11f). 본 발명자들은 PAX6 형질도입을 갖는 토끼 SESC가 각막 특이적 K3/12의 양성 염색을 갖는 상피세포의 연속적 시트를 형성하였고 (도 14a) 3개월에 걸쳐서 정상적인 각막 선명도 및 투명도를 회복하고 유지하도록 전체 각막 표면의 상피 결함을 성공적으로 복구하였음 (도 14b-14g 및 12)을 나타내었다. GFP-표지된 PAX6+ SESC를 사용하여 각막 상피 표면 복구의 경과를 추적함으로써, 본 발명자들은 이들 PAX6-재프로그래밍된 SESC가 초기에는 윤부 영역에만 위치하다가 그 후에 복구된 각막 투명도의 상응하는 영역을 갖는 중앙 각막 쪽으로 점진적으로 이동하였음을 관찰하였다 (도 13a). 중요하게도 이들 그라프트된 세포는 윤부 영역 유래 PAX6+ SESC의 배양 및 재-분리에 의해 입증되는 바와 같이 윤부를 재증식시킬 수 있었다 (도 13b). 놀랍게도, 이들 재프로그래밍된 SESC는 반복된 각막 상피 찰과 (scraping) 후 거대 각막 상피 결함을 복구할 수 있었다 (도 13c). 정반대로, 벗겨진 각막 표면 위에 PAX6 넉다운을 갖는 토끼 LSC (도 11a, 11d 및 11e)의 이식은 불투명 및 혈관화와 함께 K10 양성 피부-유사 상피를 초래하였다 (도 14f). 요컨대, 이들 데이터는 PAX6 발현을 갖는 SESC가 각막-유사 상피 내로 이식-분화 (transdifferentiate)할 수 있고 각막 표면 결함을 복구할 수 있음을 입증한다.
요약하면, 본 연구는 피더-비함유 조건하에서 LSC를 증대시키는 타당성 및 이의 치료적 가능성을 확립하고, 각막 계통 특수화에 있어 WNT7A 및 PAX6의 핵심 역할을 입증한다. 중요하게는, PAX6 발현에 의해 각막 운명으로 전환된 SESC 또는 다른 세포 유형은 특히 총 LSC 결핍을 갖는 환자에서 각막 표면 복구 및 재생을 위한 잠재적 공급원으로 제공될 수 있다. 이는 이식을 위해 환자 자신의 LSC를 사용하는데 있어서의 주된 타당성 문제를 극복할 것이고, 그로써 인간의 다수의 일반적인 각막 질환을 치료하기 위한 잠재적 치료적 전략을 가리킨다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 2
재료 및 방법
방법
ROSAmT / mG 마우스는 이전에 기술되어 있고 (PMID: 17868096; 28) 동형접합체로서 유지하였다. Pax6 P0 인핸서의 제어하에서 EGFP-Cre 재조합효소 (recombinase) 융합 단백질을 발현하는, P0-3.9-GFPCre 마우스를 FVB 배경 상에 유지하였고 기술된 바와 같이 PCR 유전자형 분석하였다 (29).
계통 추적 (Lineage tracing)
동형접합 GFP 리포터 마우스 (ROSAmT / mG)를, Cre 발현이 마우스 Pax6 외배엽 인핸서의 제어하에 있는 수정체 특이적 Cre 형질전환 마우스 (P0-3.9-GFPCre)와 교배시킴으로써 계통 추적 실험을 수행하였다. 눈을 생후 1일 (P1) 및 P60에 해부하고 4% 포름알데히드에 밤새 고정하였다. 그 후에 조직을 10% 수크로스에 인큐베이션하고 동결절단 (cryosectioning)을 위해 최적 절단 온도 배지에 포매하였다. 냉동 절편을 PBS로 세척하고 Zeiss Axio Imager 형광 현미경 상에서 이미지화하였다.
인간 LSC 및 피부 표피 줄기세포 (SESC)의 분리 및 배양
사후 인간 안구를 안구 운행으로부터 입수하고; 인간 표피를 눈꺼풀의 공여자 피부 생검으로부터 수득하였다. 윤부 영역을 잘라내고 100 IU/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 함유 냉각 PBS로 세척하였다. 윤부 영역을 작은 조각으로 절단한 후, 세포 클러스터를 37℃에서 2시간 동안의 0.2% 콜라게나제 IV 분해에 의해 수득하였다. 이어서 37℃에서 15분간 0.25% 트립신/EDTA로 추가 분해를 실시하여 단일 세포를 수득하였다. 일차 세포를 2% 성장 인자-감소된 Matrigel® (354230, BD Biosciences, Inc.)로 코팅된 플라스틱 플레이트 상에 접종하였다. 일차 인간 SESC를 동일한 처리를 이용하여 모낭간 표피로부터 분리하였다.
윤부 줄기세포 (LSC) 및 피부 표피 줄기세포 (SESC) 모두를 위한 배양 배지는 100 IU/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청, 10 ng/ml 표피 성장 인자 (EGF), 5 μg/ml 인슐린, 0.4 μg/ml 히드로코르티손, 10-10 M 콜레라 독소, 및 2×10-9 M 3,3',5-트리요오도-L-티로닌과 함께 DMEM/영양분 혼합물 F-12 및 DMEM (1:1)을 함유하였다. LSC를 분화시키기 위해, 세포를 8-12일간 CnT-30 (Cellntec, Inc.)에서 배양하였다.
실시간 정량적 PCR ( qPCR )
RNA를 분리하기 위해 RNeasy 키트 (Qiagen, Inc.)를 사용하였다. 온-칼럼 (On-column) DNase 분해를 수행하였다. 제조사의 지침에 따라서 cDNA 합성을 위해 Superscript III 역전사효소 키트 (Invitrogen, Inc.)를 사용하였다. 정량적 PCR을 수행하기 위해 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, Inc.)을 사용하였다. 유전자 특이적 프라이머 (표 3) 및 Power SYBR Green PCR Master Mix를 사용하여 40 사이클의 증폭을 실시하였다. 측정은 3중 반복으로 수행하였고 내인성 GAPDH 수준에 대해 표준화하였다. 발현에 있어 상대적 배수 변화를 ΔΔC T 방법 (C T 값 < 30)을 이용하여 계산하였다. 데이터를 3 반복값을 기준으로 평균 ± S.D로 나타내었다.
실시간 PCR에 사용된 프라이머
유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
GAPDH GAGTCAACGGATTTGGTCGT GACAAGCTTCCCGTTCTCAG
K1 CAGCATCATTGCTGAGGTCAAGG CATGTCTGCCAGCAGTGATCTG
K3 ACGTGACTACCAGGAGCTGATG ATGCTGACAGCACTCGGACACT
K10 CCTGCTTCAGATCGACAATGCC ATCTCCAGGTCAGCCTTGGTCA
K12 AGCAGAATCGGAAGGACGCTGA ACCTCGCTCTTGCTGGACTGAA
PAX6 TGTCCAACGGATGTGTGAGT TTTCCCAAGCAAAGATGGAC
렌티바이러스 RNAi
PAX6 유전자를 AgeI과 EcoRI 사이의 pLKO.1 플라스미드 내로 클로닝된 렌티바이러스 shRNAs를 사용하여 표적하였다. 유전자-특이적 넉다운을 위한 shRNA 표적화 서열은 5'-CGTCCATCTTTGCTTGGGAAA-3' 및 5'-AGTTTGAGAGAACCCATTATC-3'이었다. 모든 유전자 넉다운 실험에서, 본 발명자들은 음성 대조군으로서 임의의 종 유래의 어떠한 공지의 유전자도 표적하지 않는 shRNA를 인코딩하는 렌티바이러스 pLKO.1-puro 비-표적 shRNA 대조군 플라스미드 (Sigma, Inc.)를 사용하였다. 렌티바이러스 shRNA 입자의 제조를 위해, 복제-불능 렌티바이러스 입자를 패키징 혼합물 (9:1 백분율로 pCMV-dR8.2 및 pCMV-VSVG)과 함께 shRNA 컨스트럭트의 동시-형질감염에 의해 293T 세포 내로 패키징하였다. 바이러스를 형질감염하고 48시간 및 72시간 후에 2회 수확하였다. 세포를 각각의 바이러스 및 8 μg/ml 최종 농도의 폴리브렌을 함유하는 신선한 배지로 16-20시간 동안 렌티바이러스로 감염시켰다. 감염된 세포를 48시간 동안 2 μg/ml 퓨로마이신으로 추가 선별하였다.
면역형광 및 공초점 현미경
세포를 4% 파라포름알데히드로 15분간 실온에서 고정하고, 0.3% Triton X-100 함유 인산염 완충 식염수 (PBS)로 투과시키고, 5% 소 혈청 알부민 및 0.3% Triton X-100 함유 PBS로 차단하였다. 세포를 4℃에서 18시간 동안 일차 항체와 인큐베이션하고, PBS로 3회 세척하고, 1시간 동안 이차 항체와 인큐베이션하였다. 세포 핵을 DAPI로 대비 염색하였다. 파라핀-포매된 조직 절편의 면역형광을 표준 탈-파라핀화에 의해 달성하고, 이어서 상기에 기술된 바와 동일한 면역형광 프로토콜을 수행하였다.
하기 항체를 사용하였다: 마우스 항-p63 모노클로날 항체, 토끼 항-K5 모노클로날 항체, 및 마우스 항-K10 모노클로날 항체 (MA1-21871, RM2106S0, 및 MS611P0, Thermo Fisher Scientific, Inc.); 토끼 항-PAX6 폴리클로날 항체 (PRB-278P, Covance, Inc.); 마우스 항-K1 모노클로날 항체 (sc-376224, Santa Cruz Biotechnology, Inc.); 및 마우스 항-K3/12 모노클로날 항체 및 토끼 항-K12 모노클로날 항체 (ab68260 및 ab124975, Abcam, Inc.). 이차 항체, Alexa Fluor 488 또는 568-접합된 항-마우스 또는 토끼 면역글로불린 G (IgG) (Invitrogen, Inc.)를 1:500의 희석으로 사용하였다. Olympus FV1000 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 입수하였다.
마이크로어레이 데이터 분석
총 RNA를 본 발명자들의 이전 연구 (15)에서와 같이 LSC 및 SESC로부터 분리하였다. 미가공 데이터를 유전자 발현 옴니버스 (Gene Expression Omnibus: GEO) 데이터베이스에 등재번호 GSE32145로 기탁하였다. 본 연구에서 생성된 마이크로어레이-기반 유전자 발현 데이터를 샘플에 걸쳐서 표준화하고 Cluster 3.0/Tree View 소프트웨어 패키지를 사용하여 평균 연결 계층 클러스터링에 적용하였다 (16). 이전 연구에 근거하여 Wnt 및 Notch 경로에 속하는 유전자의 선별을 수행하였다. 발현 값을 Cytoscape 3용 Reactome Functional Interaction (FI) plugin (18)을 이용한 Reactome 네트워크 (17)를 위한 유전자세트 분석 도구를 사용하여 생성된 네트워크에 중첩하였다.
결과
마우스에서 안구 발달 동안 PAX6 및 p63 발현
각막 발달 동안 PAX6 및 p63의 기능을 규명하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 마우스 배아에서 배아일 (embryonic day, E) 12.5 내지 E18.5에서 이들의 발현 프로파일을 연구하였다. E12.5에서, 강력한 PAX6 발현을 눈 영역 및 특히 조기 각막 상피에서 검출한 반면, p63 발현은 음성이었다 (도 15A). 반면, p63-양성 세포가 안구 표면에서 나타나고 이후에 E14.5에서 윤부 및 각막으로 확대하였으며, 눈꺼풀의 발달 및 융합을 수반하였다 (도 15B). PAX6 발현은 안구 발달 동안 눈 영역에 제한되었다 (도 15A-D). 또한, 본 발명자들은 Pax6 프로모터 구동 GFP 리포터를 사용하여 계통 추적 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 ROSAmT / mG의 각막 상피; P1 및 P60에서 PAX6-GFPCre 마우스에서 집중적인 GFP를 관찰하였다 (도 15E). 이들 결과는 조기 발달 단계부터 성인기까지 윤부 줄기세포 및 각막 상피에서 PAX6의 중추적 역할을 제안한다.
인간 각막 및 피부 상피에서 PAX6 및 P63 발현
본 발명자들은 편평 상피세포 발달의 주요한 조절자인, p63이 윤부 및 피부 표피 둘 모두의 기저층에서 주로 발현됨을 관찰하였고, 이는 이들 두 상피세포 유형의 유사성을 제안한다. 그러나, PAX6은 각막의 상피층에서 고도로 발현되었지만, 성인 인간의 피부 표피에서 검출 가능하지 않았다 (도 16). 피부 표피 상피 및 각막 상피의 추가적인 특성화를 위해, 본 발명자들은 조직-특이적 케라틴에 대한 면역염색을 수행하였다. LSC는 각막 특이적 마커로서 K3 및 K12를 나타내며, 분화 시 중앙 각막으로 이동하는 반면 (도 16A), 피부 표피-특이적 케라틴인 K1 및 K10은 기저위 표피층에서 발현되고 (도 16B), PAX6 및 p63은 각막 윤부에 동시-국소화된다 (도 17A). 본 발명자들은 추가로 LSC 및 피부 표피 줄기세포 (SESC)를 분리하고 시험관 내 배양하였다. LSC는 증대되고 PAX6 및 p63 발현으로 동정될 수 있고 (도 17B), SESC는 p63 및 K5 발현으로 동정될 수 있다 (도 17C).
PAX6은 각막 세포 운명 결정에 필수적임
각막 세포 운명을 결정하는데 있어 PAX6의 역할을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 인간 LSC에서 렌티바이러스-매개 PAX6 넉다운을 사용하였다. 본 발명자들은 퓨로마이신 선별에 의해 PAX6 shRNA LSC를 정제하였다. RNA를 줄기세포 및 분화된 세포 둘 모두로부터 추출하고; 관련된 유전자의 발현 수준을 정량적 PCR로 비교하였다. PAX6에 대해 2종의 상이한 shRNAs를 사용하였고 유사한 결과를 나타내었다. LSC에서 PAX6의 4.5-배 넉다운이 활성 Ki67 발현과 함께 증식 결함을 야기하지 않았다고 하더라도 (도 18A), 각막-특이적 마커 K3 및 K12는 대조군에 비해 분화 시 각각 17.7-배 및 14.5-배씩 유의미하게 하향-조절되었다 (p<0.05). 반면, 피부-특이적 K1 및 K10 발현은 각각 4.1-배 및 4.4-배씩 상향-조절되었다 (p<0.05) (도 18B). 이들 결과는 LSC에서 PAX6의 손실이 피부-유사 분화를 초래함을 나타낸다.
인간 선천적 윤부 유피낭 조직에서 PAX6의 손실
LSC 및 각막 상피세포 (CEC)에서 PAX6 발현의 임상적 관련성을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 간질에서 혈관화되고 무질서한 세포를 갖는 피부 표피 병리를 나타내는 인간 각막 윤부 유피낭을 연구하였다 (도 19A). 본 발명자들은 PAX6 발현이 각막 유피낭의 영역에 완전히 부재하였음을 발견하였다 (도 19B). 또한, 본 발명자들은 기저층에서 p63 및 K5 (도 19B), 및 기저위 층에서 피부-특이적 케라틴 K1 및 K10의 국소화된 발현을 관찰하였다 (도 19B). 이들 결과는 발달 동안 환자 조직에서 각막 상피세포의 피부-유사 상피세포로의 전환을 제안하고 각막 상피세포-운명 결정에 있어 PAX6의 필수적인 역할을 강력히 지지한다.
LSC 운명 결정에서의 시그널링 경로
각막 세포-운명 위임을 제어하는 기능적 특징을 추가로 결정하기 위하여, 본 발명자들은 LSC 및 SESC에서 차등적으로 활성될 수도 있는 시그널링 경로의 동정을 시도하였다. 본 발명자들은 LSC 및 SESC에 대해 마이크로어레이를 사용하여 RNA 발현 분석을 수행하고, 이어서 DAVID를 사용한 유전자 온톨로지 (ontology) 및 경로 분석을 수행하였다 (19, 20). 본 발명자들은 LSC와 SESC 사이에서 적어도 2배 발현 차이를 나타낸 유전자의 아집단을 동정하였고, 이는 총 1185개 유전자에 달하였다. 이 분석은 다수의 세포 및 대사 경로에 영향을 미치는 수많은 GO 기간 및 시그널링 경로를 동정하였다. 그러나, 특히 Notch, Wnt 및 TGF-베타 경로는 이 분석으로부터 중요한 경로로 대두하였고, 이는 상피를 포함하는 다양한 조직으로부터 줄기세포의 자가-재생 및 계통 위임에 있어 이들의 핵심적 역할과 일치한다 (21-23). 이들 경로의 별개의 멤버들의 발현 변화의 그래프 표시가 도 20에 제공된다.
논의
선명하고, 투명한 각막은 LSC의 자가-재생 및 이들의 CEC로의 분화에 의해 유지된다 (24, 25). 이들 두 과정은 각막 상피의 통합성 및 항상성을 유지하기 위해 고도로 조직화되어야 한다. LSC에서의 병리학적 변화는 각막의 투명성 손실을 초래할 수 있고 부분 또는 완전 실명을 야기할 수 있다 (2, 15). 이 연구에서, 본 발명자들은 PAX6이 LSC 특징 유지 및 CEC 계통으로의 이들의 추가 위임에 필수적임을 발견하였다. 중요하게도, p63이 각막, 표피 및 전립선에서의 것과 같은 통상의 편평 상피를 위한 자가-재생 및 분화의 주요 유전자로 잘 문서화되어 있다고 하더라도 (4-6), 본 발명자들은 p63이 PAX6 후에 발현되었음을 관찰하였고, 이는 PAX6 발현이 각막 세포-운명 제어에 있어 중심적 사건임을 의미한다.
배양 중의 PAX6-결핍 LSC는 분화 시 케라틴 발현에 있어서의 스위칭, 특히 각막-특이적 K3/K12의 피부-특이적 K1/K10로의 대체에 의해 지시된 바와 같이 피부-유사 상피세포 운명을 나타낸다. 또한, PAX6은 각막을 피부 계통으로 스위칭하는 선천적 기형종인 각막 유피낭 조직으로부터 부재한다. 이는 최근에 스티븐스-존슨 증후군, 화학적 화상, 무홍채증 및 재발 익상편에서 나타난 바와 같이, 비정상적 표피 분화에서 PAX6 하향-조절의 발견과 일치한다 (2).
Wnt 및 Notch 시그널링은 배아형성에 있어 상피세포 및 다양한 조직으로부터의 줄기세포의 자가-재생 및 계통 위임에 중요한 것으로 나타난 바 있다 (21-23). 두 시그널링 경로 모두는 상이한 수용체, 리간드, 동시-활성인자 및 억제성 단백질을 갖는, 복잡한 경로이다. 예를 들어, Notch1은 손상된 마우스 각막에서 복구 동안 각막 상피세포 운명의 유지를 보조한다 (26). 안구 표면 발달에 대한 Wnt 시그널링의 영향이 또한 광범위하게 보고되어 있다. Wnt4는 인간 태아 각막 및 성인 기저 LSC에서 발현된다 (27). 정규 (canonical) Wnt 시그널링의 길항제인, Dkk2는 Wnt/β-카테닌 활성의 조절에 의해 마우스에서 안구 표면 상피의 정확한 발달에 필요하다 (14). 또한, 본 발명자들의 이전 연구는 SESC가 PAX6의 과발현에 의해 LSC-유사 세포로 전환될 수 있다는, 각막 상피세포 운명 결정에 있어서 Wnt7A-PAX6 축의 중추적 역할을 제안하고 있다 (15). 본 연구에서, 본 발명자들은 LSC와 SESC 사이의 유전자 프로파일을 비교함으로써 Wnt 및 Notch 시그널링 경로의 중요성에 대한 추가 증거를 제공하고 있다. 각막 상피 전문화 (specification)에서 이들 유전자의 기능을 정의하기 위한 추가 조사는 본 발명자들이 각막 질환을 보다 잘 이해하고 다루게 할 수 있을 것이다.
종합하면, 본 발명의 데이터는 LSC 및 각막 상피 운명 결정에서 PAX6의 핵심적 역할을 나타낸다. 나아가, 본 발명자들은 각막 상피 표현형의 결정에 있어 PAX6의 결정적 역할을 확인하였다. PAX6가 각막 세포 운명을 제어하는 방법에 대한 이해는 각막 항상성 및 질환에 대한 중요한 식견을 제공하고 일반적인 각막 질환의 치료를 위한 새로운 치료적 전략을 개발하는데 도움이 될 것이다.
참고문헌
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 3
공여자 각막 복구 재료의 제조 방법
1. 재료
윤부 줄기세포 배양 배지 또는 윤부 줄기세포 유지 배지: 하기가 보충된 DMEM/영양분 혼합물 F-12 (DMEM:F-12의 부피:부피, 3:1 비율) 기본 배지: 10% 소 태아 혈청, 0.4 μg/ml 히드로코르티손, 10-10 M 콜레라 독소, 5 μg/ml 트랜스페린, 2×10-9 M 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 5 μg/ml 인슐린, 10 ng/ml 표피 성장 인자 (EGF), 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신. 세포 계대 4회 후, LSC를 증식성 상태로 유지하기 위해, 1 μM Y-27632의 첨가와 같이, 윤부 줄기세포 배양 배지에 ROCK 억제제를 첨가한다. 상기 성분들 중 DMEM, F12 배지 및 소 태아 혈청은 GIBCO (Life Technologies)로부터 구매하고, 나머지 성분들은 Sigma (USA)로부터 구매한다.
윤부 줄기세포 분화 배지: CnT-30 또는 등가물 (CellnTec Advanced Cell Systems AG, Bern, Switzerland). CnT-30 대신에 사용될 수 있는 다른 윤부 줄기세포 분화 배지는 CnT-02, CnT-02-3DP5, RegES (Regea 06/015, Regea 07/046, 및 Regea 08/013; Rajala et al., 2010, PLOS One 5(4):e10246)이다.
안구: 공여자로부터 제공.
2. 방법
윤부 줄기세포 분리 및 증대: 윤부의 표본을 안구로부터 분리하고, 100 IU/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 함유 PBS로 세척하고, 작은 조각으로 잘게 썰고 (대략 2×2 mm2 조직 크기), 37℃에서 1시간 동안 0.2% 콜라게나제 IV로 분해하였다. 그 후에, 0.25% 트립신 및 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)으로 37℃에서 15분간 추가 처리에 의해 단일 세포를 수득한다. 일차 세포를 2% 성장 인자 감소된 (GFR) Matrigel® 기질 (BD Biosciences catalog no. 354230)로 코팅된 플라스틱 접시 위에 접종하였다. 세포를 피더 세포 부재 (피더-비함유)인 윤부 줄기세포 배양 배지에서 배양하고 70-90% 융합성에서 계대 후 15-20% 융합성으로 계대하였다.
이식용 각막 복구 재료: 2×104 세포로 배양된 윤부 줄기세포 (인간 각막 줄기세포로도 불림)의 계대 3회 (P3) 세대의 현탁액을 50 μl 최종 부피로 Matrigel®과 혼합하여 3차원 세포 배양을 형성하고, Matrigel®-포매된 각막 줄기세포를 분화-유도 배지 CnT-30 (CellnTec Advanced Cell Systems AG, Bern, Switzerland)에서 14일간 배양하여 이식용 공여자 세포로서 각막 상피세포로 분화시켰다.
실시예 4
공여자 각막 복구 재료의 제조 방법
1. 재료
실시예 3과 동일함.
2. 방법
윤부 줄기세포 분리 및 증대: 윤부의 표본을 안구로부터 분리하고, 100 IU/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 함유 PBS로 세척하고, 작은 조각으로 잘게 썰고 (대략 2×2 mm2 조직 크기), 37℃에서 2시간 동안 0.2% 콜라게나제 IV로 분해하였다. 그 후에, 0.25% 트립신 및 1 mM EDTA으로 37℃에서 15분간 추가 처리에 의해 단일 세포를 수득한다. 일차 세포를 2% 성장 인자 감소된 (GFR) Matrigel® 기질 (BD Biosciences catalog no. 354230)로 코팅된 플라스틱 접시 위에 접종하였다. 세포를 피더 세포 부재 (피더-비함유)인 윤부 줄기세포 배양 배지에서 배양하고 70-90% 융합성에서 계대 후 15-20% 융합성으로 계대하였다.
이식용 세포 공급원의 제조: 4×104 세포로 배양된 인간 LSC의 계대 3회 (P3) 세대의 현탁액을 50 μl 최종 부피로 Matrigel®과 혼합하고, 포매된 LSC를 각막 상피 분화-유도 배지 CnT-30 (CellnTec Advanced Cell Systems AG, Bern, Switzerland)에서 3일간 배양하여 이식 공여자 세포를 수득하였다.
실시예 5
공여자 각막 복구 재료의 제조 방법
1. 재료
실시예 3과 동일함.
2. 방법
윤부 줄기세포 분리 및 증대: 윤부 조직을 안구로부터 절단하고, 100 IU/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 함유 PBS로 세척하였다. 윤부 조직을 2 mm × 2 mm 크기로 절단하고 37℃에서 2.5시간 동안 0.2% 콜라게나제 IV로 분해한 후, 0.25% 트립신 및 1 mM EDTA으로 37℃에서 20분간 처리하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이들 분해된 일차 세포를 그 후에 Matrigel®-코팅된 접시 (성장 인자 감소된 Matrigel®; BD Biosciences catalog no. 354230)에 접종하였다. 세포를 피더 세포 부재 (피더-비함유)인 윤부 줄기세포 배양 배지에서 배양하여 LSC를 증대시키고 70-90% 융합성에서 계대 후 15-20% 융합성으로 계대하였다.
이식용 세포 공급원의 제조: 1×104 세포로 3회 계대 배양된 인간 각막 줄기세포의 현탁액을 50 μl 최종 부피로 CnT-30 배지 (CellnTec Advanced Cell Systems AG, Bern, Switzerland) 중의 콜라겐과 혼합하고, 콜라겐-내재된 각막 줄기세포를 분화-유도 배지 CnT-30 (CellnTec Advanced Cell Systems AG, Bern, Switzerland)에서 18일간 인큐베이션하여 공여자 각막 복구 재료를 수득하였다.
실시예 6
공여자 각막 복구 재료의 제조 방법
1. 재료
실시예 3과 동일함.
2. 방법
윤부 줄기세포 분리 및 증대: 윤부의 표본을 안구로부터 분리하고, 100 IU/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 함유 PBS로 세척하고, 작은 조각으로 잘게 썰고 (대략 2×2 mm2 조직 크기), 37℃에서 3.5시간 동안 0.2% 콜라게나제 IV로 분해하였다. 그 후에, 세포 및 세포 덩어리를 0.25% 트립신 및 1 mM EDTA으로 37℃에서 10분간 추가 처리하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 단일 일차 세포를 그 후에 2% 성장 인자 감소된 Matrigel® (BD Biosciences catalog no. 354230)로 코팅된 접시에서 배양한다. 세포를 피더 세포 부재 (피더-비함유)인 윤부 줄기세포 배양 배지에서 배양하여 LSC를 증대시키고 70-90% 융합성에서 계대 후 15-20% 융합성으로 계대하였다. 전형적으로, ROCK 억제제인, Y-27632가 LSC 증식을 유지하기 위해 P4 후에 LSC 배양 배지에 첨가된다.
이식용 세포 공급원의 제조: 3×104 세포로 3회 계대 배양된 인간 각막 줄기세포의 현탁액을 50 μl 최종 부피로 CnT-30 배지 (CellnTec Advanced Cell Systems AG, Bern, Switzerland) 중의 양막과 혼합하였다. 양막-처리된 인간 각막 줄기세포를 분화-유도 배지 CnT-30에서 14일간 배양 중에 놓이게 하여 공여자 각막 복구 재료를 수득하였다.
3회 계대 (P3) LSC가 실시예 3-6에 사용된다고 하더라도, 다른 LSC 계대가 또한 사용될 수 있다. 계대 4회 후 수득된 LSC의 경우, 이들 LSC는 1 μM Y-27632의 농도로 사용되는 Y-27632와 같은, ROCK 억제제가 보충된 LSC 배양 배지 또는 유지 배지에서 유지되었을 수 있을 것이다.
배양된 LSC의 3-D 분화: 플라스틱 플레이트를 LSC 세포의 접종 전에 2% 성장 인자 감소된 Matrigel® (354230, BD Biosciences, Inc.)로 37℃에서 30분간 코팅하여 처리한다. LSC 배양 배지 또는 유지 배지는 하기이다: 1/100 Pen-Strep, 10% 소 태아 혈청, 10 ng/ml EGF, 5 μg/ml 인슐린, 0.4 μg/ml 히드로코르티손, 10-10 M 콜레라 독소 및 2×10-9 M 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 함유 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)으로, LSC 세포가 느리게 성장하는 경우에만 여기에 1 μM Y-27632를 첨가함. 세포를 70-90% 융합성에서 성장 인자 감소된 Matrigel®-코팅된 접시에서 연속 배양을 위해 계대하고, 계대 직후 세포 융합성은 약 15-20% 융합성이다. LSC를 시험관 내 분화시키기 위해, LSC를 해리하여 단일 세포 현탁액을 수득하고 개별적 LSC를 2×104 세포/50 μl 겔로 Matrigel®에 포매시킨다. 분화 배지 CnT-30 (CellnTec Advanced Cell Systems AG, Bern, Switzerland) 또는 LSC의 CEC로의 분화를 지지하는 등가 분화 배지에서 14-18일간의 배양 후 3-D 구조가 형성되었다.
본 발명은 요지 또는 이의 본질적 특성으로부터 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 임의의 등가 실시양태가 본 발명의 범주 내인 것으로 의도된다. 실제로, 본원에 나타내고 기술된 것들에 추가로 본 발명의 다양한 변형이 전술한 명세서로부터 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
명세서 전체에서 다양한 공개물이 참조되어 있다. 이는 각각의 공개물이 그 전체로서 본 명세서에 참고로 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (196)

  1. 염색체 내로 통합되거나, 또는 대안적으로, 통합되지 않고 염색체외 (extrachromosomal) 유전적 물질로서 잔존하는, PAX6을 인코딩하는 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산을 포함하는 분리된 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC) 집단 또는 LSC-유사 집단으로서, 분리된 LSC 집단이 실질적으로 비-LSC 세포가 없거나, 또는 LSC-유사 집단이 실질적으로 비-LSC-유사 세포가 없거나, 또는 분리된 LSC 또는 LSC-유사 집단이 실질적으로 비-LSC 및 비-LSC-유사 세포가 없는 것인, 분리된 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  2. 제1항에 있어서, 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산이 PAX6 또는 이의 단편을 발현할 수 있고, PAX6 또는 이의 단편이 LSC 또는 LSC-유사 상태를 유지할 수 있거나 줄기세포 또는 전구세포를 LSC 또는 LSC-유사 상태로 지시할 수 있으며, LSC 또는 LSC-유사 상태가 세포 집단을 각막 상피세포 (CEC)를 초래하는 분화 경로로 제한하는 것인, 분리된 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  3. 제2항에 있어서, 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산이 PAX6 또는 이의 단편을 발현하고, PAX6 또는 이의 단편이 LSC 또는 LSC-유사 상태를 유지하거나 줄기세포 또는 전구세포를 LSC 또는 LSC-유사 상태로 지시하고, LSC 또는 LSC-유사 상태가 세포 집단을 각막 상피세포를 초래하는 분화 경로로 제한하는 것인, 분리된 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  4. 염색체 내로 통합되거나, 또는 대안적으로, 통합되지 않고 염색체외 유전적 물질로서 잔존하는, PAX6을 인코딩하는 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산을 포함하는 분리된 피부 상피 줄기세포 (SESC) 집단 또는 SESC-유사 집단으로서, 분리된 SESC 집단이 실질적으로 비-SESC 세포가 없거나, 또는 SESC-유사 집단이 실질적으로 비-SESC-유사 세포가 없거나, 또는 분리된 SESC 또는 SESC-유사 집단이 실질적으로 비-SESC 및 비-SESC-유사 세포가 없거나, 또는 분리된 SESC 또는 SESC-유사 집단이 실질적으로 비-SESC, 비-SESC-유사, 비-LSC 및 비-LSC-유사 세포가 없는 것인, 분리된 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  5. 제4항에 있어서, 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산이 PAX6 또는 이의 단편을 발현할 수 있고, PAX6 또는 이의 단편이 LSC 또는 LSC-유사 상태를 유지할 수 있거나 줄기세포 또는 전구세포를 LSC 또는 LSC-유사 상태로 지시할 수 있으며, LSC 또는 LSC-유사 상태가 세포 집단을 각막 상피세포를 초래하는 분화 경로로 제한하는 것인, 분리된 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  6. 제5항에 있어서, 화학적으로 합성되거나, 재조합 또는 분리된 핵산이 PAX6 또는 이의 단편을 발현하고, PAX6 또는 이의 단편이 SESC 또는 SESC-유사 세포를 LSC 또는 LSC-유사 상태로 지시하며, LSC 또는 LSC-유사 상태가 세포 집단을 각막 상피세포를 초래하는 분화 경로로 제한하는 것인, 분리된 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  7. 제1항의 LSC 집단 또는 LSC-유사 집단 및 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 제4항의 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단 및 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, CEC로의 분화 없이 적어도 17회 계대 동안 배양될 수 있는, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  10. 제1항에 있어서, 계대 3에서 PAX6 및 p63을 발현하는 세포의 백분율이 계대 17회에서의 백분율과 동일한 것인, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  11. 계대 3회에서 K19 및 Ki67을 발현하는 세포의 백분율이 계대 17회 또는 그 이후에서의 백분율보다 약간 더 높은 것인, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  12. 제1항에 있어서, CEC로의 분화 없이 40-60 세대 동안 안정하게 증식될 수 있는 세포를 포함하는, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  13. 제1항에 있어서, 각막 상피세포 집단으로 분화하는, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  14. 제4항에 있어서, 피부 표피세포 또는 각막 상피세포로의 분화 없이 적어도 17회 계대 동안 배양될 수 있는, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  15. 제4항에 있어서, 피부 표피세포 또는 각막 상피세포로의 분화 없이 40-60 세대 동안 안정하게 증식될 수 있는 세포를 포함하는, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  16. 제4항에 있어서, 세포 운명이 LSC 또는 LSC-유사 세포 운명으로 스위칭된 SESC 또는 SESC-유사 세포를 포함하는, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  17. 제16항에 있어서, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단이 LSC 또는 LSC-유사 세포 운명을 채택하고 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명이 부재한 것인, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  18. 제4항, 제16항 또는 제17항에 있어서, 각막 상피세포로 분화하는 SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  19. 제18항에 있어서, 실질적으로 피부 표피세포가 없는, 각막 상피세포로 분화하는, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  20. 제1항에 있어서, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단의 90-95%가 p63, PAX6, K19 및 Ki67을 발현하는 것인, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  21. 제1항에 있어서, LSC 집단의 5% 미만이 K5 및 K14를 발현하는 것인, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  22. 제1항에 있어서, LSC 집단의 95% 초과가 WNT7A 및 FZD5를 발현하는 것인, LSC 집단.
  23. 제1항에 있어서, LSC-유사 집단의 5% 미만이 WNT7A를 발현하는 것인, LSC-유사 집단.
  24. 제4항에 있어서, 세포 집단의 90-95%가 p63, K5 및 Ki67을 발현하지만 여전히 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명인 것인, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  25. 제4항에 있어서, K3 또는 K12 발현이 여전히 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명인 세포에서 검출되지 않는 것인, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  26. 제4항에 있어서, WNT7A가 여전히 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명인 세포에서 LSC 세포에서의 수준보다 약 4-5배 낮은 수준으로 발현되는 것인, SESC 집단.
  27. 제4항에 있어서, PAX6이 여전히 SESC 또는 SESC-유사 세포 운명인 세포에서 발현되지 않거나 LSC 세포에서의 수준의 약 1/8 수준 미만의 수준으로 발현되는 것인, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  28. 제4항에 있어서, WNT7A가 여전히 SESC-유사 운명인 세포의 70% 초과에서 발현되는 것인, SESC-유사 집단.
  29. 제16항에 있어서, LSC 또는 LSC-유사 세포 운명으로 스위칭된 집단 내 세포의 90-95%가 p63, PAX6, K19 및 Ki67을 발현하는 것인, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  30. 제2항 또는 제18항에 있어서, 각막 상피세포가 PAX6 및 각막 상피 마커인 K3 및 K12를 발현하는 것인, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  31. 제19항에 있어서, 피부 표피세포가 피부 표피 분화 마커인 K1 및 K10을 발현하는 것인, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  32. 제1항에 있어서, 인간인, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  33. 제4항에 있어서, 인간인, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  34. 제1항에 있어서, 유전적으로 변형된, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  35. 제4항에 있어서, 유전적으로 변형된, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  36. 제1항에 있어서, 여전히 LSC 또는 LSC-유사 세포 운명이거나 이로서 유지되는, LSC 집단 또는 LSC-유사 집단.
  37. 제4항에 있어서, SESC 또는 SESC-유사 세포 운명에서 LSC 또는 LSC-유사 세포 운명으로 스위칭된, SESC 집단 또는 SESC-유사 집단.
  38. 제1항 또는 제4항의 다수의 세포를 포함하는 규명된 세포 집단.
  39. 제38항에 있어서, 동종인, 규명된 세포 집단.
  40. 제38항에 있어서, 이종인, 규명된 세포 집단.
  41. 제38항에 있어서, 클론성이거나 단일 세포로부터 유래되는, 규명된 세포 집단.
  42. 각막 상피세포로의 발달에 위임된 (committed), 제38항의 줄기세포의 전구세포.
  43. 제38항의 세포로 구성된 조직.
  44. 제42항의 전구세포를 개체에서 각막 상피세포를 형성하기에 충분한 양으로 상기 개체 내로 또는 개체 상에 도입하는 것을 포함하는, 개체에서 조직을 형성하는 방법.
  45. 제1항 또는 제4항의 세포를 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 개체 내로 또는 개체 상에 도입하는 것을 포함하는, 개체에서 조직을 재생 또는 복구하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 재생되거나 복구된 조직이 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC) 및 각막 상피세포를 포함하는 각막 상피세포 계통의 조직을 포함하는 것인, 방법.
  47. 개체의 피부 상피 줄기세포 (SESC)로부터 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포를 수득하는 방법으로서, SESC를 LSC-유사 세포로 전환하기에 충분한 수준으로 SESC에서 PAX6 단백질을 증가시키기 위해 SESC에서 PAX6 유전자를 도입하거나 PAX6 유전자 발현을 상향-조절하여 그로써 개체의 SESC로부터 LSC-유사 세포를 수득하는 것을 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 피부 상피 줄기세포 (SESC)로부터 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포를 수득하기 위한 SESC 내 PAX6 유전자의 도입 또는 PAX6 유전자 발현의 상향-조절이 하기를 포함하는 것인, 방법:
    (a) 개체로부터 SESC를 수득하는 단계;
    (b) SESC를 피더-비함유 (feeder-free) 세포 배양액에서 시험관 내 또는 생체 외 배양하는 단계;
    (c) SESC를 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포로 전환하기에 충분한 수준으로 SESC에서 PAX6 단백질을 증가시키기 위해 SESC에서 적어도 하나의 PAX6 유전자를 도입하거나 PAX6 유전자 발현을 상향-조절하여, 개체로부터의 상피 줄기세포 (SESC)로부터 포유동물 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포를 수득하는 단계.
  49. 제47항에 있어서, 방법이 시험관 내 방법, 생체 외 방법, 또는 인 시츄 (in situ) 또는 개체에 직접적으로 적용되는 것인, 방법.
  50. 제47항에 있어서, 개체가 PAX6 단백질을 인코딩하는 핵산을 도입하거나, PAX6 유전자 발현을 상향-조절하거나, 또는 PAX6 활성을 증가시키는 제제로 처리되는 것인, 방법.
  51. 제47항에 있어서, 제제가 유전자요법 벡터, 바이러스 입자, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 재조합 핵산, 재조합 단백질, PAX6 단백질, PAX6 발현의 소분자 조절인자, PAX6 발현의 음성 조절인자의 억제제, PAX 활성의 음성 조절인자의 소분자 억제제, PAX6 활성의 소분자 증강인자, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  52. 제47항 또는 제48항에 있어서, PAX6 유전자가 PAX6a 유전자, PAX6b 유전자, 조작된 (engineered) PAX6a 유전자, 조작된 PAXb 유전자, PAX6 유전자 패밀리의 임의의 멤버, PAX6a 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산, PAX6b 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산, 및 PAX6 또는 PAX6-유사 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 임의의 핵산의 세트로부터 선택되는 것인, 방법.
  53. 제47항 또는 제48항에 있어서, PAX6 단백질이 PAX6a 단백질, PAX6b 단백질, PAX6 단백질 패밀리의 임의의 멤버, 및 PAX6 또는 PAX6-유사 활성을 갖는 임의의 단백질의 세트로부터 선택되는 것인, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, PAX6 또는 PAX6-유사 활성을 갖는 단백질이 내인성 K19의 증가된 발현을 초래할 수 있는 임의의 단백질이고, K19가 상향조절된 SECS가 K3 및 K12 유전자의 증가된 발현 및 K1 및 K10 유전자의 감소된 발현을 갖는 각막 상피세포 (CEC) 또는 CEC-유사 세포로 분화할 수 있는 것인, 방법.
  55. 제48항의 LSC-유사 세포로부터 각막 상피세포 (CEC)-유사 세포를 수득하는 방법으로서, LSC-유사 세포를 CEC-유사 세포로 전환하기 위해 피더-비함유 LSC 분화 배지에서 (c)의 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 피더-비함유 LSC 분화 배지가 화학적으로 규명된 것인, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 배지가 이종-비함유 (xeno-free)이거나 배양된 세포와 동일한 종으로부터 유래된 성분 이외의 성분이 없는 것인, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 배지가 혈청-비함유 배지인 것인, 방법.
  59. 제56항에 있어서, 배지가 임의의 동물 또는 인간 산물이 없는 것인, 방법.
  60. 하기 단계를 포함하는, 피부 상피 줄기세포 (SESC)로부터 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포를 수득하는 방법:
    (a) 개체로부터 SESC를 수득하는 단계;
    (b) SESC를 피더-비함유 세포 배양액에서 시험관 내 배양하는 단계;
    (c) SESC를 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포로 전환하기에 충분한 수준으로 SESC에서 PAX6 단백질을 증가시키기 위해, SESC에서 PAX6 유전자를 상향-조절하는 제제와 SESC를 접촉시켜, 그로써 개체로부터의 피부 상피 줄기세포 (SESC)로부터 포유동물 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)-유사 세포를 수득하는 단계.
  61. 제60항에 있어서, 제제가 PAX6 유전자를 포함하는 핵산, 유전자요법 벡터, 바이러스 입자, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 재조합 단백질, PAX6 단백질, PAX6 발현의 소분자 조절인자, PAX6 발현의 음성 조절인자의 억제제, PAX 활성의 음성 조절인자의 소분자 억제제, PAX6 활성의 소분자 증강인자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, PAX6 유전자가 PAX6a 유전자, PAX6b 유전자, 조작된 PAX6a 유전자, 조작된 PAXb 유전자, PAX6 유전자 패밀리의 임의의 멤버, PAX6a 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산, PAX6b 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산, 및 PAX6 또는 PAX6-유사 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 임의의 핵산의 세트로부터 선택되는 것인, 방법.
  63. 제61항에 있어서, PAX6 단백질이 PAX6a 단백질, PAX6b 단백질, PAX6 단백질 패밀리의 임의의 멤버, 및 PAX6 또는 PAX6-유사 활성을 갖는 임의의 단백질 및 이들의 단편의 세트로부터 선택되는 것인, 방법.
  64. 하기 단계를 포함하는, 개체로부터 포유동물 LSC를 수득하는 시험관 내 방법:
    (a) 개체로부터 눈의 윤부 영역 (limbus region)으로부터 조직 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 단일 세포를 수득하기 위해 조직을 해리하는 단계; 및
    (c) LSC의 증식을 허용하도록 (b)의 단일 세포를 피더-비함유 세포 배양 배지에서 배양하는 단계로, 증식된 LSC가 각막 상피세포 (CEC)로 분화하는 능력을 가지며, 그로써 개체로부터 포유동물 LSC를 시험관 내에서 수득하는 단계.
  65. 제64항에 있어서, 윤부 영역이 눈의 각막 윤부를 포함하는 것인, 방법.
  66. 제64항에 있어서, (b)에서 조직의 해리가 해리 제제 또는 제제들로의 처리를 포함하고, 해리 제제 또는 제제들이 조직을 더 작은 덩어리 및 단일 세포로 기계적으로 해리하기 위한 장비 또는 도구, 효소, 프로테아제, 화학물질, 금속 킬레이트제, 레이저 또는 이들의 조합인 것인, 방법.
  67. 제60항 또는 제64항에 있어서, 피더-비함유 세포 배양 배지가 rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제 또는 백혈병 억제 인자 (LIF) 또는 둘 모두를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  68. 제67항에 있어서, ROCK 억제제가 Y-27632 (4-[(1R)-1-아미노에틸]-N-4-피리디닐-트랜스-시클로헥산카르복사미드, 디히드로클로라이드)인 것인, 방법.
  69. 제60항 또는 제64항에 있어서, 기질 (matrix) 또는 세포외 기질 상에서 배양함으로써 LSC 또는 LSC-유사 세포를 CEC-유사 세포로 전환하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  70. 하기 단계를 포함하는, 피더-비함유 LSC 배양 배지에서 개체로부터의 포유동물 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC)를 시험관 내에서 수득하고 증대시키는 방법:
    (a) 개체로부터의 눈의 윤부 영역으로부터 조직 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 단일 세포를 수득하기 위해 조직을 해리하는 단계; 및
    (c) LSC의 증식을 허용하도록 (b)의 단일 세포를 피더-비함유 세포 배양 배지에서 배양하는 단계로, 증식된 LSC가 각막 상피세포 (CEC)로 분화하는 능력을 가지며, 그로써 개체로부터 포유동물 윤부 줄기세포를 시험관 내에서 수득하고 증대시키는 단계.
  71. 제48항 또는 제70항에 있어서, (c)에서, 단일 세포가 기질 또는 세포외 기질 상에서 배양되는 것인, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 기질 또는 세포외 기질이 Matrigel® 또는 그의 등가물, 성장인자 감소된 Matrigel® 또는 그의 등가물, 콜라겐, 콜라겐 IV, 콜라겐 IV 시트, 포유동물 양막 (amniotic membrane), 인간 양막, 피브리노겐, 트롬빈, 페르리칸 (perlecan), 라미닌, 피브로넥틴, 재조합 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 프로콜라겐, 히알루론산, 엔탁틴, 헤파란 설페이트, 테나신 (tenascin), 폴리-L-리신, 젤라틴, 폴리-L-오르니틴, 세포외 기질 단백질, 트롬빈 시트, 피브리노겐 및 트롬빈 시트, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  73. 제70항에 있어서, 증식된 LSC 또는 LSC-유사 세포가 계대 전에 70-90% 융합성(confluence) 및 계대 후에 15-20% 융합성에서 계대되는, 단계 (d)를 추가로 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 증식된 LSC 또는 LSC-유사 세포가 LSC 또는 LSC-유사 세포로서 안정하게 계대될 수 있는 횟수가 17회 이상 계대인 것인, 방법.
  75. 제73항에 있어서, LSC가 약 16-20시간의 세대 시간으로 증식하는 것인, 방법.
  76. 제73항에 있어서, LSC 또는 LSC 유사 세포가 CEC로의 분화 없이 40-60 세대 동안 안정하게 증식하는 것인, 방법.
  77. 제70항에 있어서, 피더-비함유 LSC 배양 배지가 격일로 교체되는 것인, 방법.
  78. 제70항에 있어서, 윤부 영역이 눈의 각막 윤부, 각막과 결막 사이의 마진(margin), 각막과 공막의 경계(border), 각공막 윤부, 울타리간 그물 능선 (interpalisade rete ridge)을 포함하는 영역, 또는 포그트 울타리 (Palisades of Vogt)를 포함하는 영역을 포함하는 것인, 방법.
  79. 제70항에 있어서, (b)에서 조직의 해리가 해리 제제 또는 제제들로의 처리를 포함하고, 해리 제제 또는 제제들이 조직을 더 작은 덩어리 및 단일 세포로 기계적으로 해리하기 위한 장비 또는 도구, 효소, 프로테아제, 화학물질, 금속 킬레이트제, 레이저 또는 이들의 조합인 것인, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 프로테아제가 트립신, 콜라게나제 IV, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  81. 제79항에 있어서, 금속 킬레이트제가 EDTA, EGTA, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  82. 제70항에 있어서, 피더-비함유 세포 배양 배지가 최소 필수 배지, 성장 인자, 호르몬, 및 가용성 인자를 포함하는 것인, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 피더-비함유 세포 배양 배지가 혈청, 바람직하게는 LSC가 수득되고 증대되는 종으로부터의 혈청 또는 혈청 대체제를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  84. 제82항에 있어서, 피더-비함유 세포 배양 배지가 rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  85. 제84항에 있어서, ROCK 억제제가 (R)-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드 모노하이드레이트 (Y-27632), 5-(1,4-디아제판-1-일설포닐) 이소퀴놀린 (파수딜 또는 HA 1077), H-1152, H-1152P, (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]호모피페라진 디히드로클로라이드, 디메틸파수딜 (diMF; H-1152P), N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아, Y-39983, Wf-536, SNJ-1656, 및 (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀 디히드로클로라이드 (H-1152), 이미다졸-함유 벤조디아제핀, 이미다조피리딘 유도체, 인다졸 코어를 포함하는 화합물, 2-아미노피리딘/피리미딘 코어, 9-데아자구아닌 유도체, 벤즈아미드, 또는 아미노퓨라잔, 및 이들의 유도체 및 유사체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  86. 제84항에 있어서, ROCK 억제제가 개체로부터 LSC의 분리에 이어서, LSC의 계대 4회 후에 피더-비함유 세포 배양 배지에 첨가되는 것인, 방법.
  87. 제82항에 있어서, 피더-비함유 세포 배양 배지가 백혈병 억제 인자 (LIF)를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  88. 제87항에 있어서, LIF가 개체로부터 LSC의 분리에 이어서, LSC의 계대 4회 후에 피더-비함유 세포 배양 배지에 첨가되는 것인, 방법.
  89. 제70항에 있어서, 피더-비함유 세포 배양 배지가 DMEM/F12 배지, DMEM, 페니실린-스트렙토마이신, 혈청, EGF, 인슐린, 히드로코르티손, 콜레라 독소, 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 또는 이들의 조합을 포함하고, 혈청이 소 태아 혈청이지만 바람직하게는 배양되는 LSC와 동일한 종 유래의 혈청 또는 혈청 대체제일 수 있는 것인, 방법.
  90. 제70항에 있어서, 피더-비함유 세포 배양 배지가 DMEM/F12 배지, DMEM, 페니실린-스트렙토마이신, 혈청, EGF, 인슐린, 히드로코르티손, 콜레라 독소, 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌을 포함하고, 혈청이 소 태아 혈청이지만 바람직하게는 배양되는 LSC와 동일한 종 유래의 혈청 또는 혈청 대체제일 수 있는 것인, 방법.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 피더-비함유 세포 배양 배지가 ROCK 억제제인 Y-27632를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  92. 제91항에 있어서, ROCK 억제제인 Y-27632가 세포 계대 4회 이후에 피더-비함유 세포 배양 배지에 첨가되는 것인, 방법.
  93. 제89항 또는 제90항에 있어서, 피더-비함유 세포 배양 배지가 백혈병 억제 인자 (LIF)를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  94. 제93항에 있어서, LIF가 개체로부터 LSC의 분리에 이어서, LSC의 계대 4회 후에 피더-비함유 세포 배양 배지에 첨가되는 것인, 방법.
  95. 제70항에 있어서, LSC가 WNT7A, FZD5, PAX6, p63, 케라틴 5 (K5), 케라틴 14 (K14), 케라틴 19 (K19) 및 Ki67을 포함하는 한 세트의 마커를 발현하는 것인, 방법.
  96. 제70항에 있어서, LSC의 90-95%가 p63, PAX6, K19 및 Ki67을 발현하는 것인, 방법.
  97. 제70항에 있어서, LSC의 5% 미만이 K5 및 K14를 발현하는 것인, 방법.
  98. 제70항에 있어서, LSC의 95% 초과가 WNT7A 및 FZD5를 발현하는 것인, 방법.
  99. 제70항에 있어서, CEC가, LSC에 비해 통계학적으로 유의미하게 더 높은 K3 및 K12의 발현 및 LSC에 비해 통계학적으로 유의미하게 더 낮은 K19의 발현과 함께, WNT7A, FZD5, PAX6, 케라틴 3 (K3), 및 케라틴 12 (K12)를 포함하는 한 세트의 마커를 발현하는 것인, 방법.
  100. 제70항에 있어서, CEC가 p63을 발현하지 않거나 LSC보다 유의미하게 더 낮은 수준의 p63을 발현하고 케라틴 1 (K1) 및 케라틴 10 (K10)을 발현하지 않거나 피부 또는 표피세포보다 더 낮은 수준으로 이들을 발현하는 것인, 방법.
  101. 하기를 포함하는, 분리된 LSC를 각막 상피세포 (CEC)로 시험관 내에서 분화시키는 방법:
    (a) 원래 개체로부터 유래된, 미리 배양된, 바람직하게는 단일 세포 상태로 해리된, LSC를 수득하는 단계;
    (b) 분리된 LSC를 기질 또는 세포외 기질 내 및/또는 그 위에 배치하여 분화에 적합한 3차원 세포 배양을 형성하거나 또는 이의 형성을 가능케 하는 단계; 및
    (c) 분리된 LSC의 CEC로의 시험관 내 분화를 허용하도록 LSC 분화 배지에서 LSC를 배양하고, 그로써 분리된 LSC를 각막 상피세포로 시험관 내 분화시키는 단계.
  102. 제101항에 있어서, 기질 또는 세포외 기질이 Matrigel® 또는 그의 등가물, 성장 인자 감소된 Matrigel® 또는 그의 등가물, 콜라겐, 콜라겐 IV, 콜라겐 IV 시트, 포유동물 양막, 인간 양막, 피브리노겐, 트롬빈, 페르리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 재조합 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 프로콜라겐, 히알루론산, 엔탁틴, 헤파란 설페이트, 테나신, 폴리-L-리신, 젤라틴, 폴리-L-오르니틴, 세포외 기질 단백질 (Fischer 또는 Life Tech), 트롬빈 시트 (Fibrin Sealant, Reliseal™, Reliance Life Sciences), 피브리노겐 및 트롬빈 시트 (Reliance Life), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  103. 제101항에 있어서, 기질 또는 세포외 기질이 성장 인자 감소된 Matrigel® 또는 그의 등가물, 또는 콜라겐을 포함하는 것인, 방법.
  104. 제101항에 있어서, 윤부 줄기세포 분화 배지가 피더-비함유 및 화학적으로 규명된 배지인 것인, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 피더-비함유 및 화학적으로 규명된 배지가 CnT-30 배지 (Cellntec Advanced Cell Systems AG, Bern, Switzerland), CnT-02 (Cellntec), CnT-02-3DP5 (Cellntec) 또는 기능적 등가물을 포함하고, 배지가 LSC의 CEC로의 분화를 촉진시키는 것인, 방법.
  106. 제101항에 있어서, CEC가 LSC에 비해 통계학적으로 유의미하게 더 높은 K3 및 K12의 발현 및 LSC에 비해 통계학적으로 유의미하게 더 낮은 K19의 발현과 함께, WNT7A, FZD5, PAX6, 케라틴 3 (K3), 및 케라틴 12 (K12)를 포함하는 한 세트의 마커를 발현하는 것인, 방법.
  107. 제106항에 있어서, CEC가 p63을 발현하지 않거나 LSC보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 이를 발현하고 케라틴 1 (K1) 및 케라틴 10 (K10)을 발현하지 않거나 피부 또는 표피세포보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 이들을 발현하는 것인, 방법.
  108. 제101항에 있어서, LSC 분화 배지가 격일로 교체되는 것인, 방법.
  109. 제60항 또는 제64항의 방법으로부터 유래한 분리된 윤부 줄기세포 (LSC) 또는 LSC-유사 세포의 집단.
  110. 제109항에 있어서, LSC가 WNT7A, FZD5, PAX6, p63, 케라틴 5 (K5), 케라틴 14 (K14), 케라틴 19 (K19), 및 Ki67을 포함하는 한 세트의 마커를 발현하는 것인, 집단.
  111. 제101항의 방법으로부터 유래한 분리된 각막 상피세포 (CEC)의 집단.
  112. 제111항에 있어서, CEC가 (i) LSC에 비해 통계학적으로 유의미하게 더 높은 K3 및 K12의 발현 및 LSC에 비해 통계학적으로 유의미하게 더 낮은 K19의 발현과 함께, WNT7A, FZD5, PAX6, 케라틴 3 (K3) 및 케라틴 12 (K12)를 포함하는 한 세트의 마커를 발현하고, (ii) p63을 발현하지 않거나 LSC보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 이를 발현하고 케라틴 1 (K1) 및 케라틴 10 (K10)을 발현하지 않거나 피부 또는 표피세포보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 이들을 발현하는 것인, 세포.
  113. 제60항, 제64항 또는 제101항의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사 세포, 또는 CEC, 또는 이들 상기 세포의 조합, 패키징 재료 및 사용 지침서를 포함하는 각막 조직 복구용 키트.
  114. 제113항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 키트.
  115. 제114항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체가 인간 또는 동물 눈의 만곡 (curvature)과 같은 만곡 내 세포 부착 또는 성장을 지지하기 위해 사용되는 콘텍트 렌즈 또는 이의 등가물인 것인, 키트.
  116. 제115항에 있어서, 인간 양막 또는 동물 양막을 추가로 포함하는, 키트.
  117. 하기 단계를 포함하는, 윤부 줄기세포 또는 각막 상피세포의 기능부전과 연관된 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법:
    (a) 제1항, 제6항, 제7항 또는 제8항의 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포를 개체의 이환된 눈에 이식하는 단계로, 이식된 세포가 개체의 이환된 눈의 각막 또는 윤부에 정착하고 정상적 각막 선명도 및 투명도를 회복하여, 그로써 윤부 줄기세포 또는 전구세포 또는 각막 상피세포의 기능부전과 연관된 질환을 갖는 개체를 치료하는 단계.
  118. 하기 단계를 포함하는, 윤부 줄기세포 또는 각막 상피세포의 기능부전과 연관된 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법:
    (a) 제47항, 제48항, 제55항, 제60항, 제64항, 제70항, 또는 제101항의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포를 개체의 이환된 눈에 이식하는 단계로, 이식된 세포가 개체의 이환된 눈의 각막 또는 윤부에 정착하고 정상적 각막 선명도 및 투명도를 회복하여, 그로써 윤부 줄기세포 또는 전구세포 또는 각막 상피세포의 기능부전과 연관된 질환을 갖는 개체를 치료하는 단계.
  119. 제117항 또는 제118항에 있어서, 질환 또는 병태가 윤부 줄기세포 또는 전구세포의 결핍, 각막 상피세포의 결핍, 각막 윤부에의 손상, 눈의 각막에의 손상, 윤부 줄기세포에의 손상, 각막 상피세포에의 손상, 각막 발달 또는 기능에 영향을 미치는 선천성 결함, 각막 발달 또는 기능에 영향을 미치는 후천성 결함, 각막을 피부 계통으로 스위칭하는 세포 운명 결정에 영향을 미치는 선천성 결함, 각막을 피부 계통으로 스위칭하는 세포 운명 결정에 영향을 미치는 후천성 결함, 비정상적 표피 분화, 스티븐스-존슨 증후군 (Stevens-Johnson syndrome), 무홍채증, 재발 익상편 (recurrent pterygium), 각막 질환, 각막 편평상피 화생 (corneal epithelium squamous metaplasia), 염증성 각막병증, 외상, 화학적 화상, 알칼리 화상 (alkaline burn), 부분 실명, 또는 완전 실명인 것인, 방법.
  120. 제117항 또는 제118항에 있어서, 질환 또는 병태가 부분 실명, 완전 실명, 각막 표면 질환, 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 또는 알칼리 화상인 것인, 방법.
  121. 하기 단계를 포함하는, 부분 실명, 완전 실명, 각막 표면 질환, 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 또는 알칼리 화상을 갖는 개체의 정상적 각막 선명도 및 투명도를 회복하는 방법:
    (a) 제1항, 제6항, 제7항, 또는 제8항의 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포를 개체의 이환된 눈에 이식하는 단계로, 이식된 세포가 개체의 이환된 눈의 각막 또는 윤부에 정착하고 정상적 각막 선명도 및 투명도를 회복하여, 그로써 부분 실명, 완전 실명, 각막 표면 질환, 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 또는 알칼리 화상을 갖는 개체의 정상적 각막 선명도 및 투명도를 회복하는 단계.
  122. 하기 단계를 포함하는, 부분 실명, 완전 실명, 각막 표면 질환, 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 또는 알칼리 화상을 갖는 개체의 정상적 각막 선명도 및 투명도를 회복하는 방법:
    (a) 제47항, 제48항, 제55항, 제60항, 제64항, 제70항, 또는 제101항의 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포를 개체의 이환된 눈에 이식하는 단계로, 이식된 세포가 개체의 이환된 눈의 각막 또는 윤부에 정착하고 정상적 각막 선명도 및 투명도를 회복하여, 그로써 부분 실명, 완전 실명, 각막 표면 질환, 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 또는 알칼리 화상을 갖는 개체의 정상적 각막 선명도 및 투명도를 회복하는 단계.
  123. 제1항, 제6항, 제7항, 또는 제8항의 분리된 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포 집단을 각막 조직을 재생하거나 복구하기에 충분한 양으로 개체 내로 도입하는 것을 포함하는, 개체에서 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법.
  124. 제47항, 제48항, 제55항, 제60항, 제64항, 제70항, 또는 제101항의 분리된 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포 집단을 각막 조직을 재생하거나 복구하기에 충분한 양으로 개체 내로 도입하는 것을 포함하는, 개체에서 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법.
  125. 제121항, 제122항, 제123항, 또는 제124항에 있어서, 세포가 상기 개체가 아닌 개체로부터의 것인, 방법.
  126. 제121항, 제122항, 제123항, 또는 제124항에 있어서, 세포가 상기 방법에 의해 생산된 세포로 처리되는 개체로부터의 것인, 방법.
  127. 제121항, 제122항, 제123항, 또는 제124항에 있어서, 개체가 포유동물인 것인, 방법.
  128. 제127항에 있어서, 포유동물이 인간, 래트, 개, 고양이, 돼지, 말, 토끼, 소, 원숭이 또는 마우스인 것인, 방법.
  129. 안구 화생 (ocular metaplasia)을 갖는 환자가 PAX6 유전자 또는 유전자 산물로의 처리로부터 이익을 볼 수 있는지 여부를 결정하는 방법으로서, 화생 부위에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 유전자 발현 또는 단백질 수준을 평가하는 것을 포함하고, 화생 부위에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 부재가 PAX6 유전자 또는 유전자 산물 또는 제1항 또는 제4항의 세포로의 처리로부터 안구 화생을 갖는 환자가 이익을 볼 수 있음을 나타내는 것인, 방법.
  130. 안구 화생을 갖는 개체가 WNT7A 유전자 또는 유전자 산물로의 처리로부터 이익을 볼 수 있는지 여부를 결정하는 방법으로서, 화생 부위에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 유전자 발현 또는 단백질 수준을 평가하는 것을 포함하고, 화생 부위에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 부재가 WNT7A 유전자 또는 유전자 산물로의 처리로부터 안구 화생을 갖는 환자가 이익을 볼 수 있음을 나타내는 것인, 방법.
  131. 안구 화생을 갖는 개체가 WNT7A 및 PAX6 유전자 또는 유전자 산물 둘 모두로의 처리로부터 이익을 볼 수 있는지 여부를 결정하는 방법으로서, 화생 부위에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 유전자 발현 또는 단백질 수준을 평가하는 것을 포함하고, 화생 부위에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 부재가 안구 화생을 갖는 환자가 WNT7A 및 PAX6 유전자 또는 유전자 산물 둘 모두로의 처리로부터 이익을 볼 수 있음을 나타내는 것인, 방법.
  132. 안구 화생을 갖는 개체가 PAX6 유전자 또는 유전자 산물 또는 제47항, 제48항, 제55항, 제60항, 제64항, 제70항, 또는 제101항의 방법에 의해 생산된 세포로의 처리로부터 이익을 볼 수 있는지 여부를 결정하는 방법으로서, 화생 부위에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 유전자 발현 또는 단백질 수준을 평가하는 것을 포함하고, 화생 부위에서 WNT7A, PAX6, K3 및/또는 K12의 부재가 안구 화생을 갖는 환자가 PAX6 유전자 또는 유전자 산물 또는 제47항, 제48항, 제55항, 제60항, 제64항, 제70항, 또는 제101항의 방법에 의해 생산된 세포로의 처리로부터 이익을 볼 수 있음을 나타내는 것인, 방법.
  133. 제1항, 제64항 또는 제70항의 분리된 LSC 집단을 각막 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 개체에 도입하는 것을 포함하는, 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법.
  134. 제133항에 있어서, 개체가 포유동물인 것인, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 포유동물이 인간, 래트, 개, 고양이, 돼지, 말, 토끼, 소, 원숭이 또는 마우스인 것인, 방법.
  136. 제47항, 제48항, 제55항, 제60항, 제64항, 제70항, 또는 제101항의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포, 이들 상기 세포의 조합의 유효량, 및 적합한 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  137. 제1항의 분리된 LSC 또는 LSC-유사 집단 또는 제4항의 SESC 또는 SESC-유사 집단을, 제1항 또는 제4항의 분리된 LSC 또는 LSC-유사 집단이 CEC 또는 CEC-유사 세포로의 분화를 허용하는 LSC 또는 LSC-유사 상태를 생산 또는 유지하기에 충분한 양으로 PAX6을 생산 또는 과발현하게 하는 충분한 양으로 개체에 투여하여, 그로써 눈 질환을 치료하는 것을 포함하는, 눈 질환을 치료하는 방법.
  138. 제137항에 있어서, 눈 질환이 인간 각막 질환, 각막 편평상피 화생, 염증성 각막병증, 외상 및 알칼리 화상인 것인, 방법.
  139. 제137항에 있어서, 눈 질환이 인간 눈 질환인 것인, 방법.
  140. 개체의 각막 조직, 각막 조직의 추정적 위치 또는 눈의 전방 표면을 각막 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 PAX6와 접촉하는 것을 포함하는, 개체에서 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법.
  141. 제47항, 제48항, 제55항, 제60항, 제64항, 제70항, 또는 제101항의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포, 또는 이들 상기 세포의 조합을 각막 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 각막 또는 눈의 전방 표면에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법.
  142. PAX6 단백질을 각막 조직, 각막 조직의 추정적 위치 또는 눈의 전방 표면에 각막 조직을 재생 또는 복구하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 각막 조직을 재생 또는 복구하는 방법.
  143. 본질적으로 피더-비함유인, LSC 집단을 유지하기 위한 세포 배양 배지를 포함하는, 제1항 또는 제6항의 LSC 또는 LSC-유사 집단을 성장시키고 유지하기 위한 키트.
  144. 본질적으로 피더-비함유인, LSC 집단을 유지하기 위한 세포 배양 배지를 포함하는, 제4항의 SESC 또는 SESC-유사 집단의 LSC 또는 LSC-유사 집단을 성장시키고 유지하기 위한 키트.
  145. 제143항 또는 제144항에 있어서, 배지가 본질적으로 이종-비함유인 것인, 키트.
  146. 제143항 또는 제144항에 있어서, LSC 또는 LSC-유사 집단을 CEC 또는 CEC-유사 집단으로 분화하기 위한 LSC 분화 배지를 추가로 포함하는, 키트.
  147. 제143항 또는 제144항에 있어서, 배지가 본질적으로 혈청-비함유인 것인, 키트.
  148. 제143항 또는 제144항에 있어서, 배지가 본질적으로 동물 산물 비함유인 것인, 키트.
  149. 제143항 또는 제144항에 있어서, 배지가 본질적으로 인간 산물 비함유인 것인, 키트.
  150. 제143항 또는 제144항에 있어서, 배지가 화학적으로 규명된 것인, 키트.
  151. 제47항, 제48항, 제55항, 제60항, 제64항, 제70항, 또는 제101항의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포, 또는 이들 상기 세포의 조합, 패키징 재료 및 사용 지침서를 포함하는, 각막 조직 복구용 키트.
  152. 제151항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 키트.
  153. 제152항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체가 인간 또는 동물 눈의 만곡과 같은 만곡에서 세포 부착 또는 성장을 지지하는데 사용되는 콘텍트 렌즈 또는 이의 등가물인 것인, 키트.
  154. 제153항에 있어서, 인간 양막 또는 동물 양막을 추가로 포함하는, 키트.
  155. 개체에서 각막 또는 각막 기능에 영향을 미치는 눈 질환이 발병할 위험성을 평가하는 방법으로서, 상기 방법이 (a) LSC 또는 각막 상피세포에서 WNTZ7A, FZD5 및 PAX6 또는 이들의 조합의 활성을 평가하는 단계를 포함하고, WNTZ7A, FZD5 및 PAX6 또는 이들의 조합의 더 낮은 활성 또는 활성 부재가 개체에서 각막 또는 각막 기능에 영향을 미치는 눈 질환이 발병할 더 높은 위험성을 나타내고, 그로써 개체에서 각막 또는 각막 기능에 영향을 미치는 눈 질환이 발병할 위험성을 평가하는 것인, 방법.
  156. 제47항, 제48항, 제55항, 제60항, 제64항, 제70항, 또는 제101항의 방법에 의해 생산된 LSC, LSC-유사, CEC 또는 CEC-유사 세포, 또는 이들 상기 세포의 조합을 이용한 세포-이식, 또는 PAX6 단백질 또는 PAX6-인코딩 핵산을 이용한 치료에 적합한 환자 집단을 동정하는 방법으로서, 환자 집단이 각막에 비정상적 피부 표피-유사 세포 및 연관된 각질화 및 WNTZ7A, FZD5 및 PAX6 유전자 또는 이들 유전자(들)의 조합의 발현 손실 또는 감소된 발현을 갖는 것인, 방법.
  157. 윤부 줄기세포의 결핍을 갖는 개체에서 LSC 또는 LSC-유사 세포를 이용해 윤부를 재증식시키는 (repopulating) 방법으로서, 제47항, 제48항, 제64항 또는 제70항의 방법에 의해 생산된 LSC 또는 LSC-유사 세포를 개체의 눈의 전방 표면에 투여하고 이들 세포의 LSC 적소 (niche)로의 이동을 허용하고, 그로써 개체 내 LSC 또는 LSC-유사 세포를 이용해 윤부를 재증식시키는 단계를 포함하는, 방법.
  158. 제157항에 있어서, LSC 또는 LSC-유사 세포의 투여가 LSC 또는 LSC-유사 세포의 시트 또는 시트들을 개체의 눈의 표면에 그라프트하는 것을 포함하거나, 또는 대안적으로, LSC 또는 LSC-유사 세포를 포함하는 세포 또는 조직 현탁액을 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  159. 제158항에 있어서, 개체의 눈에 LSC 또는 LSC-유사 세포를 투여한 후, LSC 또는 LSC-유사 세포가 양막, 바람직하게는 인간 양막으로 피복되는 것인, 방법.
  160. 윤부 줄기세포의 결핍을 갖는 개체에서 LSC 또는 LSC-유사 세포를 이용해 윤부를 재증식시키는 방법으로서, 결막, 추정 각막 위치, 눈 또는 눈꺼풀 내 피부 상피 줄기세포 (SESC)를 LSC 또는 LSC-유사 세포로 전환시켜 개체 내 결막, 추정 각막 위치, 눈 또는 눈꺼풀의 영역에 PAX6 활성 또는 발현을 증가시키는 제제를 투여하는 것을 포함하고, 윤부로의 이동 시 개체에서 LSC 또는 LSC-유사 세포를 이용해 윤부를 재증식시키고, 그로써 개체에서 LSC 또는 LSC-유사 세포를 이용해 윤부를 재증식시키는 것인, 방법.
  161. 최소 필수 배지, 성장 인자, 호르몬, 가용성 인자, 및 혈청 또는 혈청 대체제를 포함하는 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사의 단기간 시험관 내 배양용 피더-비함유 세포 배양 배지.
  162. 제161항에 있어서, 단기간의 시험관 내 배양이 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포의 계대 0회 내지 계대 약 4회인 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  163. 제161항에 있어서, 배지가 DMEM/F12 배지, DMEM, 페니실린-스트렙토마이신, 소 태아 혈청, EGF, 인슐린, 히드로코르티손, 콜레라 독소, 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌을 포함하고, 소 태아 혈청이 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고, EGF 및 인슐린이 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 이들 성분 각각이 기능적 등가물로 교체될 수 있는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  164. 제161항에 있어서, 배지가 10-20% 범위의 소 태아 혈청 또는 10-20% 범위의 혈청용 혈청 대체제, 10-20 ng/ml 범위의 EGF, 5-10 μg/ml 범위의 인슐린, 0.2-0.8 μg/ml 범위의 히드로코르티손, 5×10-11 내지 5×10-10 M 범위의 콜레라 독소 및 10-9 M 내지 4×10-9 M 범위의 3,3',5-트리요오도-L-티로닌을 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)을 포함하고, EGF 및 인슐린이 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 이들 성분 각각이 기능적 등가물로 교체될 수 있는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  165. 제161항에 있어서, 배지가 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청, 10 ng/ml EGF, 5 μg/ml 인슐린, 0.4 μg/ml 히드로코르티손, 10-10 M 콜레라 독소 및 2×10-9 M 3,3',5-트리요오도-L-티로닌을 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)을 포함하고, 소 태아 혈청이 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고, EGF 및 인슐린이 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 이들 성분 각각이 기능적 등가물로 교체될 수 있는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  166. 최소 필수 배지, 성장 인자, 호르몬, 가용성 인자, 혈청 또는 혈청 대체제, 및 rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제를 포함하는, LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포의 장기간 시험관 내 배양용 피더-비함유 세포 배양 배지.
  167. 제166항에 있어서, 장기간 시험관 내 배양이 LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포의 계대 17회 또는 그 이상의 계대인 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  168. 제166항에 있어서, 배지가 DMEM/F12 배지, DMEM, 페니실린-스트렙토마이신, 소 태아 혈청, EGF, 인슐린, 히드로코르티손, 콜레라 독소, 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 및 Y-27632를 포함하고, 소 태아 혈청이 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고, EGF 및 인슐린이 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, Y-27632가 다른 ROCK 억제제로 교체될 수 있고, LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 이들 성분 각각이 기능적 등가물로 교체될 수 있는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  169. 제166항에 있어서, 배지가 10-20% 범위의 소 태아 혈청 또는 10-20% 범위의 혈청용 혈청 대체제, 10-20 ng/ml 범위의 EGF, 5-10 μg/ml 범위의 인슐린, 0.2-0.8 μg/ml 범위의 히드로코르티손, 5×10-11 내지 5×10-10 M 범위의 콜레라 독소, 10-9 M 내지 4×10-9 M 범위의 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 및 1-10 μM 범위의 Y-27632를 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)를 포함하고, EGF 및 인슐린이 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, Y-27632가 다른 ROCK 억제제로 교체될 수 있고, LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 이들 성분 각각이 기능적 등가물로 교체될 수 있는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  170. 제166항에 있어서, 배지가 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청, 10 ng/ml EGF, 5 μg/ml 인슐린, 0.4 μg/ml 히드로코르티손, 10-10 M 콜레라 독소, 2×10-9 M 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 및 1 μM Y-27632를 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)을 포함하고, 소 태아 혈청이 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고, EGF 및 인슐린이 각각 재조합 EGF 및/또는 재조합 인슐린, 바람직하게는 재조합 인간 EGF 및 재조합 인간 인슐린일 수 있고, Y-27632가 다른 ROCK 억제제로 교체될 수 있고, LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC 또는 피부 표피세포로 분화하지 않는 한 이들 성분 각각이 기능적 등가물로 교체될 수 있는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  171. 최소 필수 배지, 성장 인자, 호르몬, 가용성 인자, 혈청 또는 혈청 대체제, rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제 및 백혈병 억제 인자 (LIF)를 포함하는, LSC 또는 LSC-유사 세포의 장기간 시험관 내 배양용 피더-비함유 세포 배양 배지.
  172. 제171항에 있어서, 장기간 시험관 내 배양이 LSC 또는 LSC-유사 세포의 계대 17회 또는 그 이상의 계대인 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  173. 제171항에 있어서, 배지가 DMEM/F12 배지, DMEM, 페니실린-스트렙토마이신, 소 태아 혈청, EGF, 인슐린, 히드로코르티손, 콜레라 독소, 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, Y-27632, 및 LIF를 포함하고, 소 태아 혈청이 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고, EGF, 인슐린, 및 LIF가 각각 재조합 EGF, 재조합 인슐린, 및/또는 재조합 LIF, 바람직하게는 재조합 인간 EGF, 재조합 인간 인슐린, 및 재조합 인간 LIF일 수 있고, Y-27632가 다른 ROCK 억제제로 교체될 수 있고, LSC 또는 LSC-유사 세포가 증식하고 CEC로 분화하지 않는 한 이들 성분 각각이 기능적 등가물로 교체될 수 있는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  174. 제161항에 있어서, 배지가 10-20% 범위의 소 태아 혈청 또는 10-20% 범위의 혈청을 위한 혈청 대체제, 10-20 ng/ml 범위의 EGF, 5-10 μg/ml 범위의 인슐린, 0.2-0.8 μg/ml 범위의 히드로코르티손, 5×10-11 내지 5×10-10 M 범위의 콜레라 독소, 10-9 M 내지 4×10-9 M 범위의 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 1-10 μM 범위의 Y-27632, 및 5-20 ng/ml LIF를 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)을 포함하고, EGF, 인슐린, 및 LIF가 각각 재조합 EGF, 재조합 인슐린, 및/또는 재조합 LIF, 바람직하게는 재조합 인간 EGF, 재조합 인간 인슐린, 및 재조합 인간 LIF일 수 있고, Y-27632가 다른 ROCK 억제제로 교체될 수 있고, LSC, LSC-유사, SESC 또는 SESC-유사 세포가 증식하고 CEC로 분화하지 않는 한 이들 성분 각각이 기능적 등가물로 교체될 수 있는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  175. 제161항에 있어서, 배지가 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청, 10 ng/ml EGF, 5 μg/ml 인슐린, 0.4 μg/ml 히드로코르티손, 10-10 M 콜레라 독소, 2×10-9 M 3,3',5-트리요오도-L-티로닌, 1 μM Y-27632 및 10 ng/ml LIF를 갖는 DMEM/F12 및 DMEM (1:1)을 포함하고, 소 태아 혈청이 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체될 수 있고, EGF, 인슐린, 및 LIF가 각각 재조합 EGF, 재조합 인슐린, 및/또는 재조합 LIF, 바람직하게는 재조합 인간 EGF, 재조합 인간 인슐린, 및 재조합 인간 LIF일 수 있고, Y-27632가 다른 ROCK 억제제로 교체될 수 있고, LSC 또는 LSC-유사 세포가 증식하고 CEC로 분화하지 않는 한 이들 성분 각각이 기능적 등가물로 교체될 수 있는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  176. 제166항 또는 제171항에 있어서, ROCK 억제제가 (R)-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드 모노하이드레이트 (Y-27632; Sigma-Aldrich), 5-(1,4-디아제판-1-일설포닐) 이소퀴놀린 (파수딜 또는 HA 1077; Cayman Chemical), H-1152, H-1152P, (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]호모피페라진 디히드로클로라이드, 디메틸파수딜 (diMF; H-1152P), N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아, Y-39983, Wf-536, SNJ-1656, 및 (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀 디히드로클로라이드, 이미다졸-함유 벤조디아제핀, 이미다조피리딘 유도체, 인다졸 코어, 2-아미노피리딘/피리미딘 코어, 9-데아자구아닌 유도체, 벤즈아미드, 또는 아미노퓨라잔을 포함하는 화합물, 및 이들의 유도체 및 유사체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  177. 제163항, 제164항, 제165항, 제168항, 제169항, 제170항, 제173항, 제174항, 또는 제175항에 있어서, 소 태아 혈청이 인간 혈청 또는 혈청 대체제로 대체되는 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  178. 제163항, 제164항, 제165항, 제168항, 제169항, 제170항, 제173항, 제174항, 또는 제175항에 있어서, EGF, 인슐린 또는 LIF가 각각 재조합 EGF, 재조합 인슐린 또는 재조합 LIF인 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  179. 제178항에 있어서, EGF가 재조합 인간 EGF인 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  180. 제178항에 있어서, 인슐린이 재조합 인간 인슐린인 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  181. 제178항에 있어서, LIF가 재조합 인간 LIF인 것인, 피더-비함유 세포 배양 배지.
  182. 제161항 또는 제166항의 피더-비함유 세포 배양 배지에서 분리된 SESC 피부를 배양하는 것을 포함하는, 피더-비함유 세포 배양 배지에서 SESC를 시험관 내에서 수득하고 증대시키는 방법.
  183. 제102항에 있어서, SESC가 모낭간 (interfollicular) 표피로부터 분리되는 것인, 방법.
  184. 제102항에 있어서, SESC가 인간 또는 동물에서 SESC를 보유하는 임의의 SESC 적소로부터 분리되는 것인, 방법.
  185. 하기를 포함하는, 윤부 줄기세포 (LSC)로부터 상피 줄기세포 (SESC) 또는 SESC-유사 세포를 수득하는 방법: (a) 세포 운명을 LSC에서 SESC 운명으로 변경하기에 충분하도록 WNT7A 또는 PAX6 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 넉다운 (knocking down)시켜, 그로써 LSC 세포로부터 SESC 또는 SESC-유사 세포를 수득하는 단계.
  186. 제185항에 있어서, LSC를 SESC 또는 SESC-유사 세포로 전환하기 위해 WNT7A 또는 PAX6의 발현을 충분히 감소시키도록 LSC가 WNT7A 또는 PAX6에 대해 지시된 shRNA와 접촉되거나, 또는 대안적으로, LSC가 WNT7A 또는 PAX6 유전자에 대해 지시된 shRNA, RNAi 또는 안티-센스 RNA를 생산하는 도입된 유전자를 발현하는 것인, 방법.
  187. 하기를 포함하는, 피더-비함유 세포 배양 배지에서 개체로부터 피부 상피 줄기세포 (SESC)를 시험관 내에서 수득하고 증대시키는 방법:
    (a) 개체에서 모낭간 표피 또는 SESC를 보유하는 임의의 SESC 줄기세포 적소로부터 조직 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 조직을 해리하여 단일 세포를 수득하는 단계; 및
    (c) SESC의 증식을 허용하도록 (b)의 단일 세포를 피더-비함유 세포 배양 배지에서 배양하는 단계로, 증식된 SESC가 피부 표피세포로 분화하는 능력을 가지고, 그로써 개체로부터 피부 상피 줄기세포를 시험관 내에서 수득하고 증대시키는 단계.
  188. 제185항에 있어서, SESC가 제161항, 제163항, 제164항, 제165항, 제166항, 제168항, 제169항 또는 제170항의 피더-비함유 세포 배양 배지에서 시험관 내 배양되는 것인, 방법.
  189. SESC 또는 SESC-유사 세포의 피부 표피세포 또는 피부 표피-유사 세포로의 분화를 지지하는 화학적으로 규명된 분화 배지에서 분리된 SESC 또는 SESC-유사 세포를 배양하고, 그로써 SESC 또는 SESC-유사 세포로부터 피부 표피세포 또는 피부 표피-유사 세포를 시험관 내에서 수득하는 것을 포함하는, SESC 또는 SESC-유사 세포로부터 피부 표피세포 또는 피부 표피-유사 세포를 시험관 내에서 수득하는 방법.
  190. 제189항에 있어서, 화학적으로 규명된 분화 배지가 CnT-02 (CellnTec) 또는 등가 배지인 것인, 방법.
  191. 새로운 피부를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법으로서, 제185항의 방법에 의해 수득되거나 또는 제182항, 제187항 또는 제189항의 방법에 의해 수득되고 증대된 SESC 세포, SESC-유사 세포, 피부 표피세포 또는 피부 표피-유사 세포를, 개체의 SESC 세포 집단 또는 피부 표피세포 집단을 재증식시키고 개체에 새로운 피부를 제공하도록 개체에 투여하여, 그로써 새로운 피부를 필요로 하는 개체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  192. 제191항에 있어서, 피부를 필요로 하는 개체가 피부 이상증 (dystrophy), 피부 질환, 피부 감염, 화상 손상, 피부 궤양, 찰과상, 흑색종, 암종, 상처, 노화, 피부의 유전적 장애, 피부 생검, 수술, 미용적 결함, 또는 피부에 영향을 미치는 재건 수술로 고통 받거나 또는 피부를 필요로 하는 개체가 피부 대체를 요구하거나 피부에 영향을 미치는 미용적 수술 또는 재건 수술을 받는 개체인 것인, 방법.
  193. 윤부 줄기세포 또는 전구세포 (LSC) 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키는 방법으로서, LSC 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키기에 충분하도록 LSC에서 WNT7A 또는 PAX6 유전자의 발현을 하향-조절하고, 그로써 LSC 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키는 것을 포함하는, 방법.
  194. LSC-유사 세포 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키는 방법으로서, LSC-유사 세포 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키기에 충분하도록 LSC-유사 세포에서 WNT7A 또는 PAX6 유전자의 발현을 하향-조절하고, 그로써 LSC-유사 세포 및/또는 그의 자손을 SESC 또는 SESC-유사 세포로 변화시키는 것을 포함하는, 방법.
  195. 피부 상피 줄기세포 (SESC) 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키는 방법으로서, SESC 세포 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키기에 충분하도록 SESC에서 PAX6 또는 WNT7A를 상향-조절하거나 과발현하고, 그로써 SESC 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키는 것을 포함하는, 방법.
  196. SESC-유사 세포 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키는 방법으로서, SESC-유사 세포 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키기에 충분하도록 SESC-유사 세포에서 PAX6 또는 WNT7A를 상향-조절하거나 과발현하고, 그로써 SESC-유사 및/또는 그의 자손을 LSC 또는 LSC-유사 세포로 변화시키는 것을 포함하는, 방법.
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