KR20170053636A

KR20170053636A - 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제의 이용방법

Info

Publication number: KR20170053636A
Application number: KR1020177007069A
Authority: KR
Inventors: 타카시 우에모리; 요시즈미 이시노; 타케히로 사가라; 소노코 이시노; 타케시 야마가미; 츠요시 시라이
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤; 각코호진 간사이 분리 소고가쿠엔; 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠
Priority date: 2014-09-11
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2017-05-16
Also published as: JPWO2016039377A1; JP6550649B2; CN107002067A; US20170253909A1; US10975415B2; WO2016039377A1; EP3192868A4; EP3192868A1

Abstract

미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 당해 폴리펩티드를 사용한 미스매치 특이적 절단반응, 당해 폴리펩티드를 이용한 핵산 증폭 반응에 있어서의 에러의 제거방법, 핵산 증폭 반응 중에 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법, 및 그 억제방법을 이용한 단일 염기 다형 변이를 가지는 핵산을 검출하는 방법.

Description

내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제의 이용방법{METHODS OF UTILIZING THERMOSTABLE MISMATCH ENDONUCLEASE}

본 발명은 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 염기쌍을 인식해서 절단하는 내열성의 신규 미스매치 엔도뉴클레아제, 당해 미스매치 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물, 및 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용한 방법에 관한 것이다.

최근의 돌연변이 해석방법의 발전은 놀랍고, 농작물의 개량이나 유용 미생물의 분리, 제작뿐만 아니라, 인간의 유전자 진단 등에 이용되게 되었고, 일반생활 상에도 커다란 은혜를 제공하고 있다.

이것들의 돌연변이의 해석법은 게놈 배열을 직접 해석하는 방법이 주류이지만, 그 외에 미스매치 염기쌍을 인식하는 효소군을 이용하는 방법이 수행되어왔다. 돌연변이형과 야생형의 DNA를 짝짓기시켜서 형성된 미스매치 염기쌍에 대해서, 미스매치 염기쌍에 특이적 결합 능력이 있는 인자를 결합시켜서 검출하는 해석방법이 그 하나이고, 대표적인 예로서는 대장균의 MutS, MutT, MutL 복합체를 이용한 변이 부위의 검색을 들 수 있다(특허문헌 1).

또, 미스매치 부위를 특이적으로 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제를 이용하는 방법도 수행되고 있다. 이 경우에는, 미스매치 엔도뉴클레아제를 이용하고, 미스매치 염기쌍 부근에서 절단된 DNA 단편을 해석함으로서, 돌연변이의 유무나 그 위치를 검출한다.

대표적인 예로서는 셀러리 유래의 Cell 유전자 산물을 이용하는 방법이 알려지고 있고(특허문헌 2), 실제로 돌연변이 염기의 해석에 이용되고 있다. 그러나, 이 효소는 내열성을 가지지 않고, PCR법 등 고온의 반응과정을 포함하는 수법에는 직접 사용할 수 없다. 이 때문에, 돌연변이 염기의 검출을 실시할 때에도, 증폭, 미스매치 형성, 미스매치 절단, 검출의 4스텝이 필요하게 된다.

최근, 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제가 개발되고, 그 이용이 기대되고 있다. 당해 미스매치 엔도뉴클레아제는 G-G, G-T, T-G, T-T의 미스매치 부위를 인식해서 그 주변에서 DNA의 양쪽 스트랜드를 절단하는 것을 특징으로 한다(특허문헌 3).

또, 돌연변이 해석에도 큰 영향을 끼치고 있는 생물 공학적 기술로서는 핵산 증폭 기술을 들 수 있다.

이 핵산 증폭 기술 중에서 대표적인 기술인 폴리머라아제 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)법은 시험관 내에 있어서 간편하게 소망하는 핵산 단편을 증폭하는 기술이고, 유전자에 관한 연구뿐만 아니라, 생물학, 의학, 농업 등의 폭넓은 분야에 있어서 불가결의 실험 수법이 되고 있다. PCR법은 돌연변이형 유전자의 검출이나, DNA의 메틸화의 해석에도 응용되고 있다.

또, 등온 핵산 증폭 방법의 LAMP법이나 ICAN법 등은 특별한 기기를 필요로 하지 않기 때문에, 보다 저렴한 핵산검출법으로서 사용되고 있다.

또한 최근 들어 수행되게 된 게놈 전체의 구조해석에 있어서는 특히 희소인 시료로부터의 해석을 실시한 후에, 전체 게놈 증폭법은 중요한 기술이다.

이것들의 핵산 증폭법의 문제점으로서, 일정 확률로 틀린 염기의 합입을 일으키는 것을 들 수 있다. 폴리머라아제의 개량 등을 통해서 이 확률은 저감되어 왔지만, 여전히 정밀한 해석의 시에는 장애가 되고 있다.

또, 게놈 라이브러리나 cDNA 라이브러리의 구축 등에 있어서, 핵산 증폭법에서는 함유율이 높은 DNA 분자가 우선적으로 증폭되고, 다양한 종류의 DNA의 해석이나 스크리닝의 장애가 되는 경우가 있다.

그 문제를 해결하기 위해서, 자기 하이브리다이제이션을 이용한 정규화(normalization)에 의해 함유율이 높은 DNA의 비율의 저감이 수행되고 있다(비특허문헌 1). 또 PCR법과 자기 하이브리다이제이션을 조합시킨 SSH-PCR법도 사용되고 있지(비특허문헌 2)만, 함유율이 높은 DNA와 상동성을 가지는 DNA도 제거되는 위험성도 존재하고 있다.

또, 핵산 증폭법에 의한 DNA의 검출에 있어서는 검출 대상의 DNA의 증폭과, 검출 대상이 아닌 DNA의 증폭이 경합하는 경우가 있다. 즉, 검출 대상 이외의 DNA도 동시에 증폭되고, 대상의 DNA의 검출이 곤란한 경우이다. 사이클링 프로브나 TaqMan 프로브 등의 프로브를 사용한 리얼타임 PCR에 의해 검출 대상의 DNA의 증폭만을 검출해서 상기한 문제를 해소할 수 있는 경우도 있지만, 검출 대상이 아닌 DNA가 검출 대상의 DNA에 대해서 대 과잉으로 존재하는 경우에는 다수의 유사 DNA의 존재에 의한 위양성 반응 때문에, 검출 대상의 DNA의 정확한 검출은 곤란하게 된다.

이러한 문제는, 예를 들면 정상대립 유전자의 존재 하에 있어서의 소수의 돌연변이 대립유전자의 검출(혈중 순환 종양 DNA의 검출 등), 에피제네틱 어세이에서의 소수의 메틸화 혹은 비메틸화 대립유전자의 검출, 모친의 혈액 중에 순환하는 소량의 태아 DNA 서열의 검출 등의 실시에 있어서 일어날 수 있다.

상기의 문제를 해결하기 위해서, Restriction endonuclease-mediated selective polymerase chain reaction(REMS PCR)이라 불리는 방법이 개발되었다(비특허문헌 3). 이 방법은 내열성의 제한효소를 이용하고, 예를 들면 주형이 정상형의 염기 서열을 가지는 경우에만 이 제한효소에 의한 절단이 일어나게 설계한 프라이머를 사용하고, 돌연변이형의 염기서열을 가지는 DNA만을 선택적으로 검출하는 방법이다. 그렇지만, 검출하려고 하는 DNA에 따라서는 REMS PCR에 의한 선택적 검출에 적합한 인식 서열을 가지는 내열성의 제한효소가 존재하지 않을 경우도 있어, 범용성이 나쁘다.

이상과 같이, 핵산 증폭 방법을 따르는 돌연변이 검출방법에 있어서는 검출 대상이 아닌 DNA가 검출 대상의 DNA에 대해서 대 과잉으로 존재하는 경우에도, 다수의 유사 DNA의 존재에 의한 위양성 반응을 회피하는 방법이 요구되고 있다.

미국특허 제5922539호 명세서 국제공개 제01/062974호 팸플릿 국제공개 제2014/142261호 팸플릿

"Nucleic Acids Research", 2004년 2월, 제32권, 3호, e37 "Methodsin Molecula rBiology", 2009년, 제496권, 2호, p. 223-243 "American Society for Investigative Pathology", 1998년8월, 제153권, 2호, p. 373-379

본 발명의 목적은 신규 미스매치 엔도뉴클레아제, 당해 미스매치 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물, 및 미스매치 엔도뉴클레아제의 용도를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기의 사정을 감안해서 예의 노력한 결과, 복제 기구에 1인자로 생각되고 있었던 Thermococci kodakarensis 유래의 폴리펩티드가 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제의 효소활성을 가지는 것을 발견했다. 이후, 당해 효소활성을 가지는 폴리펩티드를 TKO NucS라고 부른다.

또, 이 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제를 기초로 해서, 천연형과 다른 염기특이성을 향상시킨 돌연변이형 미스매치 엔도뉴클레아제의 창제에 성공하고, 당해 돌연변이형 미스매치 엔도뉴클레아제 및/또는 천연형 미스매치 엔도뉴클레아제를 단독 혹은 조합시켜서 사용함으로서, 특정한 미스매치 염기쌍 이외의 절단이 억제되고, 보다 특이적인 증폭 억제가 가능한 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명의 제1 발명은 더블-스트랜드 핵산의 절단방법이며, 하기 (i)∼(iii)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 일종의 폴리펩티드를 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산에 작용시키고, 당해 더블-스트랜드 핵산의 양쪽 스트랜드를 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치 염기쌍 부위에서 인식해서 절단하는 것을 특징으로 하는 방법:

(i) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

(ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및

(iii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 제2 발명은 하기 (a)∼(c)를 포함하는 조성물:

(a) DNA 폴리머라아제;

(b) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및

(c) 하기 (i)∼(iii)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 일종의 폴리펩티드:

본 발명의 제3 발명은 핵산의 증폭 방법으로서, 하기 (a)∼(b)의 공정을 포함하는 방법:

(a) 본 발명의 제2 발명의 조성물과 주형이 되는 핵산분자를 포함하는 조성물을 조제하는 공정; 및

(b) 공정(a)에 의해 수득된 조성물을 적절한 조건하에서 반응시키고, 핵산 증폭을 실시하는 공정에 관한 것이다.

본 발명의 제4 발명은 하기 (a)∼(C)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 폴리펩티드:(A) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드,

(B) 상기 (a)의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 47번째 및 76번째의 아미노산 잔기를 제외하는 1 내지 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및

(C) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 대해서 90% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 47번째의 세린 및 76번째의 아스파라긴에 대응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 제5 발명은 하기 (a)∼(c)를 포함하는 조성물:

(a) DNA 폴리머라아제;

(b) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및

(i) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

(ii) 상기 (i)의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 47번째 및 76번째의 아미노산 잔기를 제외하는 1 내지 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및

(iii) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 대해서 90% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 47번째의 세린 및 76번째의 아스파라긴에 대응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 제6 발명은 핵산의 증폭 방법으로서, 하기 (a)∼(b)의 공정을 포함하는 방법:

(a) 본 발명의 제5 발명의 조성물과 주형이 되는 핵산분자를 포함하는 조성물을 조제하는 공정; 및

본 발명의 제7 발명은 핵산 증폭 반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법으로서, 하기의 (a)∼(d)의 존재 하에서 핵산 증폭 반응을 실시하는 공정을 포함하는 방법:

(a) 상기 특정의 염기서열을 가지는 핵산 또는 그 상보 스트랜드와 하이브리드화시켰을 때에 1개 혹은 수개의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시리보뉴클레오티드;

(b) DNA 폴리머라아제;

(c) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및

(d) 본 발명의 제1 발명에서 사용하는 폴리펩티드 및/또는 제4 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 제7 발명의 방법에 있어서, 사용하는 미스매치 엔도뉴클레아제는 본 발명의 제1 발명에서 사용하는 폴리펩티드 또는 제4 발명의 폴리펩티드와 동등한 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 별도의 내열성균 유래의 것으로 치환할 수도 있다.

본 발명의 제8 발명은 표적 핵산을 우선적으로 증폭하는 방법으로서, 당해 표적 핵산과 1개 혹은 수개의 염기가 다른 염기서열의 핵산 증폭을 본 발명의 제7 발명 의 방법에서 억제하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제8 발명의 방법에 있어서, 추가로 내열성균 유래의 증식세포 핵항원(PCNA) 혹은 그 호모로그의 존재 하에서 증폭할 수도 있다.

본 발명의 제9 발명은 본 발명의 제1 발명에서 사용하는 폴리펩티드 및/또는 제4 발명의 폴리펩티드를 사용한 표적 핵산의 돌연변이 검출방법에 관한 것이다. 당해 방법에 있어서, 사용하는 미스매치 엔도뉴클레아제는 본 발명의 제1 발명에서 사용하는 폴리펩티드 또는 제4 발명의 폴리펩티드와 동등한 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 별도의 내열성균 유래의 것과 치환할 수도 있다.

본 발명에 의해, 생물 공학상 이용가치가 높은 미스매치 인식 서열이 다른 미스매치 엔도뉴클레아제, 당해 미스매치 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물, 및 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용한 방법이 제공된다.

도 1은 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 정제 결과를 나타내는 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성측정에서 사용한 기질 DNA 일람이다.
도 3은 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 미스매치 DNA 절단활성을 나타내는 Native-PAGE 결과와 그래프이다.
도 4는 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 미스매치 DNA 절단반응에 대한pH의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 미스매치 DNA 절단반응에 대한 염화나트륨, 염화칼륨, 및 글루타민산칼륨의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 미스매치 DNA 절단반응에 대한 염화 마그네슘의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 미스매치 DNA 절단반응에 대한 염화 망간의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 미스매치 DNA 절단반응 온도의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제가 다양한 미스매치 DNA에 대한 절단활성을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 DNA결합활성 측정에서 사용한 프로브 DNA의 일람이다.
도 11은 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 DNA 결합 활성 측정을 나타내는 Native-PAGE의 결과이다.
도 12는 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 내열성을 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 TKO 유래 PCNA1 존재 하 미스매치 DNA 절단활성을 나타내는 Native-PAGE 결과와 그래프이다.
도 14는 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 A-A 미스매치 DNA에 대한 절단활성을 나타내는 Native-PAGE의 결과이다.

이하에 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서 「미스매치」란 더블-스트랜드 핵산 중에 존재하는 Watson-Crick 염기쌍과는 다른 염기 짝짓기, 즉 G(구아닌 염기)-C(사이토신 염기), A(아데닌 염기)-T(티민 염기) 또는 U(우라실 염기)의 염기쌍 결합 이외의 조합의 염기결합을 나타낸다.

(1) 본 발명의 내열성 미스매치 엔도뉴클레아제 및 그 돌연변이체

본 명세서에 있어서, 「미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드(미스매치 엔도뉴클레아제와 기재하는 경우가 있다)」란 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 부위를 절단하는 활성을 가지는 뉴클레아제를 말한다. 상기의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성은 미스매치 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드에 인접하는 인산이에스터르 결합을 절단하는 활성 외에, 미스매치 염기쌍으로부터 1∼5염기쌍, 바람직하게는 1∼3염기쌍 떨어진 뉴클레오티드에 인접하는 인산이에스터르 결합을 절단하는 활성을 포함한다. 본 발명에 있어서 미스매치 엔도뉴클레아제는 특정한 미스매치 염기쌍을 특이적으로 인식해서 더블-스트랜드 핵산을 절단하는 활성을 가지는 것이 바람직하고, 예를 들면, 적어도 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제를 들 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 G- G미스매치만, G-T미스매치만, 혹은 T-T 미스매치만을 인식ㆍ절단하는 것일 수도 있다. 또 G-G미스매치, G-T미스매치 및 T-T 미스매치 가운데 어느 2개의 미스매치를 인식ㆍ절단하는 것일 수도 있다. 또 G-G 미스매치, G-T 미스매치 및 T-T 미스매치의 전부를 인식ㆍ절단하는 것일 수도 있다.

또 본 발명에 있어서 추가로 별도의 미스매치 엔도뉴클레아제가 예시된다. 예를 들면, 적어도 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제를 들 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 A-A 미스매치만, A-C 미스매치만, 혹은 C-C 미스매치만을 인식ㆍ절단하는 것일 수도 있다. 또 A-A 미스매치, A-C 미스매치 및 C-C 미스매치 가운데 어느 2개의 미스매치를 인식ㆍ절단하는 것일 수도 있다. 또 A-A 미스매치, A-C 미스매치 및 C-C 미스매치의 전부를 인식ㆍ절단하는 것일 수도 있다.

이것들의 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 부위를 절단하는 활성의 이외에, 싱글-스트랜드 DNA, 싱글-스트랜드 핵산과 더블-스트랜드 핵산의 정션 부분, 더블플랩 구조, 복제분기점구조, D-루프 구조, 및/또는 닉(nick)이 들어 간 홀리데이 정션 구조를 인식해서 핵산을 절단하는 활성을 가질 수도 있다. 또, 본 명세서에 있어서 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제는 40℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상, 더욱 바람직하게는 60℃ 이상의 온도에 있어서 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 부위를 절단하는 활성을 나타내는 뉴클레아제가 바람직하다.

본 발명을 특별하게 한정하나 것은 아니지만, 본 발명에 사용되는 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제로서는 Thermococcus kodakarensis(혹은 Thermococcus kodakaraensis) 유래의 내열성 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드가 예시된다. 본 발명자들은 Thermococcus kodakarensis 유래의 폴리펩티드(서열목록의 서열번호 1)가 내열성의 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제인 것을 발견했다. 게다가, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 호모 로그, 예를 들면, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개, 예를 들면, 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 9개, 더 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 및 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드도 본 발명에 있어서의 내열성의 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제로서 호적하다. 또 예를 들면, 서열목록의 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 상기 엔도뉴클레아제가 호적하게 사용될 수 있다.

또, 본 발명자들은 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 가운데, 47번째의 세린 잔기 및 76번째의 아스파라긴 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 47번째가 알라닌으로, 76번째가 알라닌으로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 돌연변이형 폴리펩티드가 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 특이적으로 인식하는 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제인 것을 발견했다. 따라서 이렇게 해서 작성된 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 및 그 호모로그는 본 발명의 1형태이다. 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 호모로그로서는 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 47번째 및 76번째의 아미노산 잔기를 제외하는 1 내지 수개, 예를 들면, 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 9개, 더 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로서, A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 47번째의 알라닌 잔기 및 76번째의 알라닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 이루어지는 폴리펩티드로서, A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 당해 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 47번째 및 76번째의 아미노산 잔기를 제외하는 1 내지 수개, 예를 들면, 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 9개, 더 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로서, A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 대해서 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이며, 또 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 47번째의 알라닌 잔기에 대응하는 아미노산 잔기가 세린 이외의 아미노산 잔기이며, 또 76번째의 알라닌 잔기에 대응하는 아미노산 잔기가 아스파라긴 이외의 아미노산 잔기이며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드가 예시된다. 추가로 예를 들면, 서열목록의 서열번호 4기재의 염기서열을 가지는 상기 엔도뉴클레아제가 호적하게 사용할 수 있다. 이것들의 미스매치 엔도뉴클레아제는 후술하는 여러 용도, 예를 들면 특이적 DNA서열을 함유하는 DNA를 배제해하고, 기타의 DNA를 증폭, 검출하는 방법에 호적하다.

본 발명에 있어서, 당해 미스매치 엔도뉴클레아제의 활성은 미스매치 염기쌍을 함유하는 더블-스트랜드 핵산을 기질로 해서 측정할 수 있다. 구체적으로는 미스매치 염기쌍을 함유하는 더블-스트랜드 핵산을 조제한 후, 미스매치 엔도뉴클레아제에 대해서 과잉량의 당해 더블-스트랜드 핵산을 미스매치 엔도뉴클레아제와 반응시키고, 단위 시간당의 절단 핵산량을 측정하는 것으로 활성측정이 실시된다. 절단된 더블-스트랜드 핵산은 전기영동 등에 의해 절단을 받지 않은 핵산과 분리해서 정량하는 것이 가능하다. 절단을 받았을 경우에만 형광강도의 증가가 검출될 수 있도록 형광시료와 소광물질로 이중으로 표지한 더블-스트랜드 핵산을 사용하면, 반응용액 중의 형광강도를 적당한 시간별로 측정하는 것에 의해 활성을 간편하게 측정할 수 있다. 또, 기질이 되는 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 염기쌍의 염기를 바꿈으로서, 특정한 미스매치 염기쌍에 대한 절단활성을 조사하는 것도 가능하다.

(2) 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용한 더블-스트랜드 핵산의 절단방법

본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법은 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산에 서열목록의 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 또는 그 호모로그를 작용시킴으로서 수행된다. 서열목록의 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 호모로그로서는 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 서열목록의 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개, 예를 들면, 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 9개, 더 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및 서열목록의 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 대해서 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드가 예시된다. 예를 들면, 상기 「(1)본 발명의 내열성 미스매치 엔도뉴클레아제 및 그 돌연변이체」의 섹션에서 예시된 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 호모로그를 들 수 있다.

또, 본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법은 내열성균 유래의 증식세포 핵항원(PCNA)의 존재 하에 수행할 수도 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, Pyrococcus속, Thermococcus속, Methanopyrus속, 및 Methanococcus속 유래의 PCNA나 그것들의 호모로그를 사용 할 수 있다. PCNA의 공존 하에서 미스매치를 가지는 더블-스트랜드 핵산의 절단을 실시하는 것에　의해, 절단의 효율이 향상한다.

본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법에 있어서의 미스매치 염기쌍은 더블-스트랜드 핵산의 내부(통상의 염 기짝짓기를 실시하는 2개의 염기쌍의 사이)에 존재하는 것이라면 더블-스트랜드 핵산 중에 1개의 미스매치 염기쌍이 존재하는 것에 한정되지 않고, 미스매치 염기쌍이 간격을 두고 복수 개 존재하는 것 일 수도 있고, 2 이상의 연속하는 미스매치 염기쌍이 존재할 수도 있다. 본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법에 있어서의 미스매치 염기쌍으로서는 바람직하게는 더블-스트랜드 핵산의 내부에 존재하는 1 또는 8 이하의 연속하는 미스매치 염기쌍, 더 바람직하게는 1 또는 4 이하의 연속하는 미스매치 염기쌍, 또 더 바람직하게는 2개의 연속하는 미스매치 염기쌍 또는 1개의 미스매치 염기쌍이 예시된다. 본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법에 있어서 더블-스트랜드 핵산 중에 복수의 미스매치 염기쌍이 존재하는 경우에는 해당 복수의 미스매치 염기쌍은 동종의 미스매치 염기쌍일 수도 있고, 또는 다른 종류의 미스매치 염기쌍일 수도 있다.

당해 미스매치 엔도뉴클레아제의 타깃이 되는 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산으로서는 PCR 산물, 게놈 DNA나 그 단편 등의 생물 시료 유래의 핵산, 및 합성 핵산 등이 예시된다. 또, 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산은 복수의 생물 시료 유래의 혼합물 또는 생물 시료 유래의 핵산과 합성 핵산과의 혼합물을 융해, 재어닐링시켜서 생성된 핵산 혼합물 일 수도 있다. 예를 들면, 돌연변이를 가지는 핵산과 야생형의 핵산을 혼합하고, 융해, 재어닐링했을 경우, 미스매치 염기쌍이 형성되고, 이 부위에서 미스매치 엔도뉴클레아제의 절단을 받는다. 이렇게 해서 발생한 미스매치 엔도뉴클레아제에 의한 절단 후의 핵산 단편의 크기를 관찰함으로서, 돌연변이의 유무, 위치를 검증할 수 있다.

(3) 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용한 핵산의 증폭 방법

본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제를 이용하는 것에　의해, PCR법 등의 핵산 증폭법의 반응액에 이 미스매치 엔도뉴클레아제를 첨가만 하는 1단계의 반응에서 돌연변이 해석을 실시하는 것이 가능하다. PCR법에 있어서는 그 사이클 수가 있는 문턱값을 넘으면, 반응산물이 증가하지 않음이 알려져 있다. 첨가되고 있는 dNTP의 고갈이나, 프라이머와 반응 산물의 어닐링 경합이 그 주원인이지만, 이 때에는 반응 산물끼리의 어닐링이 일어나고 있으며, 돌연변이를 가지는 주형과 야생형의 주형이 혼재하고 있으면, 이들로부터 증폭한 반응 산물끼리의 어닐링에 의해 변이 부위에 미스매치 염기쌍이 발생하게 된다. 따라서 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 공존 하에서의 PCR을 통상보다도 증가시킨 사이클 수로 실시하는 것만으로, 돌연변이 해석이 가능하게 된다. 즉, 본 발명은 서열목록의 서열번호 1 및/또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그를 더블-스트랜드 핵산에 작용시키는 것을 포함하는 돌연변이 해석방법을 제공한다.

또, 핵산 증폭 반응의 과정에서도 본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법을 실시할 수 있다. 핵산 증폭의 반응액에 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제를 첨가함으로서, 증폭 과정이 잘못된 뉴클레오티드의 합입으로 발생한 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산이 절단된다. 이 결과, 반응 개시 전의 주형 핵산과는 다른 서열의 핵산 증폭이 억제된다. 이렇게 해서, 에러율이 저감된 핵산 증폭이 가능하게 된다. 즉, 본 발명은 서열목록의 서열번호 1 및/또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그를 사용해서 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산을 절단하는 공정을 포함하는, 핵산 증폭 방법을 제공한다. 또, DNA 폴리머라아제, 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 서열목록의 서열번호 1 및/또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그를 포함하는 조성물과, 주형이 되는 핵산분자를 포함하는 조성물을 조제하는 공정, 및 수득된 이 조성물을 적절한 조건하에서 반응시키고, 핵산 증폭을 실시하는 공정을 포함하는 핵산의 증폭 방법도 본 발명에 1형태이다.

상기의 핵산의 증폭법으로서는 본 발명을 특별하게 한정하나 것은 아니지만, DNA를 증폭하는 방법이 예시된다. DNA를 증폭하는 방법으로서는 예를 들면 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)법, MDA(Multiple displacement amplification)법, 및 ICAN법이나 LAMP법 등의 등온 핵산 증폭법을 들 수 있다.

본 발명의 핵산 증폭 방법에 있어서는, 내열성균 유래의 증식세포 핵항원(PCNA)을 조합시킬 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, Pyrococcus속, Thermococcus속, Methanopyrus속, 및 Methanococcus속 유래의 PCNA나 그것들의 호모로그를 사용할 수 있다. PCNA의 공존 하에서 미스매치를 가지는 더블-스트랜드 핵산의 절단을 실시하는 것에　의해, 절단의 효율이 향상한다.

(4) 본 발명의 조성물

본 발명의 조성물은 DNA 폴리머라아제, 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 서열목록의 서열번호 1 및/또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그를 포함하고, 핵산의 증폭 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 사용하는 조성물은 DNA 폴리머라아제, 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 서열목록의 서열번호 1 및/또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그 이외에, 추가로 반응 완충제, 2가의 금속이온, 데옥시리보뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 프로브, 및 인터칼레이팅 색소로부터 선택되는 적어도 1종을 포함할 수도 있다. 또, 상기의 조성물을 핵산 증폭 반응에 사용하는 경우, 상기의 조성물은 추가로 핵산 증폭 반응의 주형이 되는 핵산을 포함할 수도 있다. 본 발명에 사용되는 반응 완충제로서는 예를 들면 Tris-HCl, HEPES-KOH 등의 굳버퍼나 인산 나트륨 버퍼 등의 인산 버퍼를 들 수 있다. 특별하게 한정은 없지만, pH6∼11의 인산 나트륨 버퍼 혹은 Tris-HCl 완충액이 바람직하다. 또, 2가의 금속이온으로서는 예를 들면 마그네슘이온, 망간이온, 아연이온, 및 코발트이온을 들 수 있다. 2가의 금속이온은 염화물, 황산염, 또는 아세트산염 등의 염 형태로 공급될 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 마그네슘이온은 최종농도로 0.5∼50mM의 범위, 망간이온은 최종농도로 0.5∼15mM의 범위이다. 여기에서, 최종농도란 핵산 증폭 반응에 적용하는 반응액 중의 농도를 의미한다(이하, 동일). 또, 본 발명의 조성물에 있어서는 Bovine serum albumin(BSA), 계면활성제, 무기염을 포함할 수도 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 BSA는 최종농도로 0∼0.2mg/㎖의 범위이다. 계면활성제로서는, Twee n20, Triton X-100, 및 NP-40을 들 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 계면활성제는 최종농도로 0∼0.2%의 범위이다. 무기염으로서는 예를 들면 염화나트륨, 염화칼륨, 글루타민산칼륨, 및 황산암모늄을 들 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 염화나트륨은 최종농도로 0∼0.3M의 범위, 염화칼륨은 최종농도로 0∼0.2M의 범위, 글루타민산칼륨은 최종농도로 0∼0.6M의 범위, 황산암모늄은 최종농도로 0∼0.05M의 범위이다. 추가로, 내열성 균 유래의 PCNA를 포함할 수도 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, Pyrococcus속, Thermococcus속, Methanopyrus속, 및 Methanococcus속 유래의 PCNA가 호적하다.

상기의 핵산 증폭 반응용의 조성물 중의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 농도는 적당하게 각각의 반응계에서 DNA의 증폭 반응을 저해하지 않는 농도나 미스매치 염기쌍의 절단에 유효한 농도를 검정해서 결정할 수 있다.

상기의 핵산 증폭 반응용의 조성물에 사용되는 적어도 1쌍의 프라이머로서는 각종 핵산 증폭법에 적합한 2개 이상의 프라이머가 선택된다. 이것들은, 소망의 증폭이 발생하는 것이라면 DNA, RNA 외에, DNA의 일부가 RNA에 치환되고 있는 소위 키메라 프라이머일 수도 있다. 또, 공지의 핵산 아날로그를 포함하는 프라이머나 검출 등을 목적으로 한 형광 염료 등에 의해 표지된 프라이머일 수도 있다.

(5) 본 발명의 특정서열 핵산의 증폭 억제방법 및 돌연변이 검출방법

또, 본 발명자들은 본 발명의 기질 특이성이 서로 다른 미스매치 엔도뉴클레아제와 적절하게 설계된 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 이용해서, 핵산 증폭 반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제 가능한 것을 찾아냈다. 따라서(a) 상기 특정의 염기서열을 가지는 핵산과 하이브리드화시켰을 때에 1개 혹은 수개의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시리보뉴클레오티드,(b) DNA 폴리머라아제,(c) 적어도 한 쌍의 프라이머, 및(d) 적어도 1종류의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 존재 하에서 핵산 증폭 반응을 실시하는 공정을 포함하는, 핵산 증폭 반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법도, 본 발명에 1형태이다. 또, 이 방법을 사용해서 표적 핵산의 염기서열과 1개 혹은 수개의 염기가 서로 다른 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 것에　의해서， 표적 핵산을 우선적으로 증폭하는 방법도 본 발명에 1형태이다.

상기 (a)의 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 특정한 염기서열을 가지는 핵산과 하이브리드화시켰을 때에 1개 혹은 수개의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시리보뉴클레오티드라면 특별하게 한정은 없고, DNA의 일부가 RNA로 치환되고 있는 소위 키메라올리고데욕시 리보뉴클레오티드일 수도 있다. 또, 본 발명을 특별하게 한정하나 것은 아니지만, 이 올리고데옥시리보뉴클레오티드에 3’말단은 이 올리고데옥시리보뉴클레오티드로부터의 DNA 폴리머라아제에 의한 신장 반응을 억제하기 위한 수식(modification)이 실시될 수도 있다. 예를 들면, 아미노화 등의 수식이 예시된다. 또, 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 이 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 결합하는 핵산이 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 절단을 받는 한에 있어서, 포스포로 티오에이트화나 기타의 수식에 의해 데옥시리보 뉴클레아제로부터의 절단으로부터 보호될 수도 있다. 또, 검출 등을 목적으로 한 형광 염료나 소광물질 등에 의해 표지될 수도 있다.

상기 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 스트랜드 길이는 실시되는 반응의 조건 하에서 상기 특정의 염기서열을 가지는 핵산과 이 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 하이브리드화할 수 있도록, 적당하게 결정할 수 있다. 또, 특정한 염기서열을 가지는 핵산과 하이브리드화시켰을 때에 미스매치를 발생하는 위치는 이 올리고데옥시리보뉴클레오티드에 5’말단, 3’말단의 양쪽으로부터 적어도 3뉴클레오티드 이상 떨어져 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 핵산 증폭 반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법에는 미스매치 부위를 특이적으로 절단하는 활성을 가지는 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용할 수 있다. 예를 들면, 핵산 증폭법으로서 고온에서의 반응을 포함하는 PCR법과 같은 방법으로 내열성 DNA 폴리머라아제를 사용하는 경우에는, 미스매치 엔도뉴클레아제도 내열성을 가지는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명을 특별하게 한정하나 것은 아니지만, 이러한 경우에는 상기의 내열성의 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제, 즉, (i) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, (ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개, 예를 들면, 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 9개, 더 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, (iii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및/또는 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제, 즉, (iv) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, (V) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개, 예를 들면, 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 9개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, (vi) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 대해서 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 사용하는 것이 호적하다.

본 발명의 핵산 증폭 반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법에는 특정한 미스매치 염기쌍을 포함하는 더블-스트랜드 핵산만을 특이적으로 절단하는 활성을 가지는 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 이 경우, 증폭 억제하는 염기서열을 1종류로 한정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 서열목록의 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 혹은 그 호모로그를 사용했을 경우, G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치 혹은, A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 인식해서 절단하기 위해서, 이들 특정한 미스매치 이외의 미스매치 염기쌍을 포함하는 더블-스트랜드 핵산은 절단되지 않고, 증폭 억제를 받는 경우이 없다. 따라서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법이 호적하다. 이들의 미스매치 엔도뉴클레아제는 증폭을 억제하고 싶은 염기서열에 따라서, 단독 혹은 조합해서 사용할 수 있다.

본 발명의 핵산 증폭 반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법에 있어서, 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 농도는 적당하게 각각의 반응계에서 DNA의 증폭 반응을 저해하지 않는 농도나 미스매치 염기쌍의 절단에 유효한 농도를 검정해서 결정할 수 있다. (a)의 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 농도는 주형량이나 목적 DNA의 증폭 효율을 감안해서 사용 농도를 최적화하고, 결정할 수 있다. 예를 들면 증폭 반응에 사용되는 프라이머의 농도 0.1배∼10배의 농도로 실시가능하다.

본 발명의 핵산 증폭 반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법은 임의의 핵산 증폭법에 있어서 실시할 수 있다. 본 발명을 특별하게 한정하나 것은 아니지만, DNA를 증폭하는 방법이 특히 호적하다. 예를 들면 PCR법, MDA법, 및 ICAN법이나 LAMP법 등의 등온 핵산 증폭법 등으로 본 발명을 실시할 수 있다.

본 발명의 핵산 증폭 반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법은 임의의 핵산을 대상으로 해서 실시할 수 있다. DNA를 증폭 대상으로 하는 경우에는, 인공적으로 제작된 DNA 혼합물, 환경 유래 시료나 생물 유래의 시료, 또는 그 시료로 조제된 DNA 혼합물 중에 존재하는 DNA가 예시된다. 본 발명을 특별하게 한정하나 것은 아니지만, 생물 유래의 시료로서는 인간 등의 포유류 유래의 시료가 예시된다. 또, 본 발명을 특별하게 한정하나 것은 아니지만, DNA 혼합물로서는 단편화된 게놈 DNA 혼합물, mRNA에서 역전사 반응에 의해 발생한 cDNA 혼합물, 복수의 PCR산물의 혼합물 등이 예시된다. 증폭이 억제되는 특정한 염기서열을 가지는 DNA로서는 분리되지 않고 남는 rRNA 유래의 역전사 산물이나, 프라이머끼리의 짝짓기에 의해 발생하는 저분자 DNA 등이 예시된다. 나중에 기능적 스크리닝을 실시하는 유전자 라이브러리를 증폭하는 경우에는, 양성을 나타내는 기지의 유전자 서열을 가지는 DNA의 증폭을 억제함으로서, 보다 효율적으로 미지 유전자를 탐색할 수 있는 라이브러리의 제작도 가능하게 된다.

본 발명의 표적 핵산을 우선적으로 증폭하는 방법에 있어서는, 추가로 증폭된 표적 핵산을 검출하는 공정을 포함할 수도 있다. 본 명세서에 있어서는 본 발명의 이 형태를 「본 발명의 검출 방법」으로 기재하는 경우가 있다. 예를 들면, DNA를 검출 대상으로 하는 본 발명의 검출 방법에 의하면, 검출 대상이 아닌 DNA(특정의 염기서열을 가지는 DNA)가 검출 대상의 DNA(표적 DNA)에 대해서 대 과잉으로 존재하는 경우에 있어서도, 본 발명의 핵산 증폭 반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법에 있어서의(a)의 올리고데옥시리보뉴클레오티드와(d)의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드에 의해서 검출 대상이 아닌 DNA를 주형으로 한 DNA의 증폭이 억제되기 때문에, 검출 대상의 DNA의 검출을 실시하는 것이 가능하게 된다.

또, 본 발명의 검출 방법은 예를 들면 돌연변이의 존재가 알려져 있는 유전자에 대응하는 핵산에 대해서, 야생형과 돌연변이형을 구별해서 검출하는 것을 가능하게 한다. 특정한 염기서열을 가지는 핵산으로서 야생형의 염기서열을 함유하는 DNA를 설정해서 본 발명의 검출 방법을 실시하는 것에　의해 대 과잉의 정상 대립 유전자(즉 야생형의 염기서열을 가지는 DNA)의 존재 하에서의 소수의 돌연변이 대립 유전자의 검출이 가능하게 된다. 예를 들면 혈중 순환 종양 DNA의 검출이나 모친의 혈액 중에 함유되어 있는 소량의 태아 DNA 서열의 검출에 본 발명의 방법은 유용하다. 따라서 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용한 돌연변이 검출방법 역시 발명의 1형태이다. 당해 돌연변이로서는 미소 결실 및 점돌연변이가 예시된다. 또, 점돌연변이에 의해 발생한 다형은 단일 염기 다형(SNPs)이라 불린다. 본 명세서에 있어서는 SNPs 가운데 돌연변이형의 염기서열을 가지는 DNA를 단일 염기 다형 변이를 가지는 DNA라고 기재하는 경우가 있다.

본 발명을 특별하게 한정하나 것은 아니지만, 본 발명의 검출 방법을 이용할 수 있는 핵산으로서는 종양 마커로서 이용되는 단일 염기 다형 변이, 암 치료용 약제에 의한 치료효과와 상관하는 단일 염기 다형 변이, 및 세포의 암화와의 상관이 알려져 있는 단일 염기 다형 변이로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1개의 단일 염기 다형 변이를 포함하는 핵산이 바람직하다. SNPs에는 종양세포에 고빈도로 인정되는 것이나, 암 치료용 약제에 의한 치료효과나 발암과의 상관이 알려져 있는 것이 있다. 이러한 SNPs로서는 K-ras 유전자, B-raf 유전자, 표피 성장인자 수용체(EGFR) 유전자의 SNPs가 예시된다. K-ras 유전자의 체세포 돌연변이는 결장 직장암, 폐선암, 갑상선암 등에 있어서 고빈도로 인정된다. B-raf 유전자의 체세포 돌연변이는 결장 직장암, 악성 흑색종, 갑상선 유두암, 비소 세포 폐암, 폐선암 등에 있어서 고빈도로 인정된다. 또, EGFR 유전자의 체세포 돌연변이는 여러가지 고형 종양에 있어서 고빈도로 인정된다. 게피티닙이나 엘로티닙 등의 EGFR 저해제에 의한 암의 치료는 암 조직의 EGFR 유전자가 특정한 단일 염기 다형 변이를 가지는 경우에 유효할 가능성이 높은 것이 알려져 있다. 한편, 암조직의 K-ras 유전자가 단일 염기 다형 변이를 가지는 경우에는 EGFR 저해제로의 저항성을 나타낼 가능성이 높은 것이 알려져 있다.

본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제는 돌연변이 검출방법에 이용할 수 있다. 본 발명의 검출 방법은 예를 들면, 생물 유래 시료로부터 추출한 메틸화 DNA를 포함하는 조성물을 아황산수소염 처리한 후에 수득된 DNA를 재료로 해서 실시할 수도 있다. 본 발명의 검출 방법에 의하면, 대과잉의 비메틸화 대립 유전자의 존재 하에서의 소수의 메틸화 대립 유전자의 검출, 혹은 대과잉의 메틸화 대립 유전자의 존재 하에서의 소수의 비메틸화 대립 유전자의 검출을 실시할 수 있다.

상기의 아황산 수소염에 의한 처리로서 메틸화 DNA의 검출에 사용할 수 있는 공지의 아황산 수소염법(바이설파이트법)을 이용할 수 있다. 당해 처리에 의해 비메틸화 사이토신은 우라실로 변환되지만, 메틸화 사이토신은 변화되지 않는다. 추가로, 이 바이설파이트 처리 완료의 반응액을 PCR법으로 증폭하면, 우라실은 타이민으로 변환되고, 메틸화 사이토신은 사이토신이 된다. 즉 특정한 부위에서의 대과잉의 비메틸화 대립 유전자의 존재 하에서의 소수의 메틸화 대립 유전자의 검출, 혹은 대과잉의 메틸화 대립 유전자의 존재 하에서의 소수의 비메틸화 대립 유전자의 검출은 각각 대 과잉의 타이민 중의 사이토신 존재, 또는 대과잉의 사이토신 중의 타이민 존재를 검증하는 것이다. 여기에서 대 과잉으로 존재하는 타이민 혹은 사이토신을 함유하는 DNA로부터의 증폭을 억제할 수 있으면, 소수의 메틸화 대립 유전자 혹은 비메틸화 대립 유전자의 존재는 간단하게 검증할 수 있다.

본 발명의 검출 방법에 있어서의 표적 핵산을 검출하는 공정에는 전기영동, 염기서열해석, 사이클링 프로브나 TaqMan 프로브 등의 프로브를 사용한 리얼타임 PCR을 이용할 수 있다. 이것들의 검정방법은 일반적인 수법을 그대로 사용하는 것이 가능하다. 특히 HRM(High Resolution Melting) 해석법을 사용했을 경우, 목적 DNA의 증폭과 검출을 1단계로 실시할 수 있고, 신속 또한 간편한 목적 DNA의 검증이 가능하게 된다.

본 발명의 특정서열핵산의 증폭 억제방법 및 돌연변이 검출방법에 있어서는 내열성균 유래의 PCNA를 조합시킬 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, Pyrococcus속, Thermococcus속, Methanopyrus속, 및 Methanococcus속 유래의 PCNA나 그 호모로그를 사용 할 수 있다.

또, (a) 특정한 염기서열을 가지는 핵산과 하이브리드화시켰을 때에 1개 혹은 수개의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시리보뉴클레오티드,(b) DNA 폴리머라아제,(c) 적어도 한 쌍의 프라이머, 및(d) 적어도 1종류의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 핵산 증폭 반응용 조성물도 역시 본 발명에 1형태이다. 상기 조성물은 추가로, 반응 완충제, 2가의 금속이온, 데옥시리보뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 프로브, 및 인터칼레이팅 색소로부터 선택되는 적어도 1종을 포함할 수 있다. 상기의 조성물을 핵산 증폭 반응에 사용하는 경우, 상기의 조성물은 추가로 핵산 증폭 반응의 주형이 되는 핵산을 포함할 수도 있다. 상기 조성물은 Bovine serum albumin(BSA), 계면활성제, 무기염을 포함할 수도 있다. 또, 내열성균 유래의 PCNA를 포함할 수도 있다.

실시예

이하에 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

조제예 1: 게놈 DNA의 조제

Thermococcus kodakarensis KOD1주(JCM 12380T, 이하, 'TKO'라 부른다)는 교토대학 공학 연구과의 아토미 하루유키 교수로부터 분여되었다. 본 주를 이하의 방법으로 배양했다. 즉, 피루브산 나트륨(Nacalai Tesque, Inc.) 5g를 첨가한 artificial seawater(이하, 'ASW'라 부른다) -YT 배지(0.8×ASW, 5g/ℓ 농도의 Bacto Yeast Extract(DIFCO사), 5g/ℓ 농도의 Bacto Trypton(Becton Dickinson사), 0.1% resazurin(Nacalai Tesque, Inc.) 1ℓ에 배지가 무색이 될 때까지 황화나트륨을 첨가했다. 그 후에 상기 KOD1주를 접종하고, 85℃에서 16시간 혐기 배양한 후, 집균하고, 이후의 실험에 사용했다. 또, ASW-YT 배지 중에 포함되는 0.8×ASW의 조성은 16g/ℓ 농도의 NaCl, 2.4g/ℓ 농도의 MgCl₂ㆍ6H₂O, 4.8g/ℓ 농도의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.8g/ℓ 농도의 (NH₄)₂SO₄, 0.16g/ℓ 농도의 NaHCO₃, 0.24g/ℓ 농도의 CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.4g/ℓ 농도의 KCl, 0.336g/ℓ 농도의 KH₂PO₄, 0.04g/ℓ 농도의 NaBr, 0.016g/ℓ 농도의 SrCl₂ㆍ6H₂O, 0.008g/ℓ 농도의 Fe(NH₄)citrate다. 상기의 배양에서 얻은 약 2g의 균체를 완충액 L(10mM 트리스-염산(pH8.0), 1mM EDTA, 100mM NaCl) 100㎖에 현탁하고, 10% SDS를 1㎖ 첨가했다. 이 균체 현탁액을 교반한 후, 20mg/㎖ 농도의 프로테이나제 K(TAKARA BIO INC.)를 1㎖ 첨가하고, 55℃에서 60분 스탠딩했다. 프로테이나제 K 처리 후의 균체 현탁액에 차례로 페놀 추출, 페놀/클로로포름 추출, 클로로포름 추출을 실시한 후, 수득된 수층에 에탄올을 첨가해서 DNA를 침전시켰다.

회수한 DNA를 100㎖의 TE액(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)에 용해하고,0.75mg의 RNaseA(Nacalai Tesque, Inc.)를 첨가해서 37℃에서 60분 반응시켰다. 그 후 반응액에 페놀 추출, 페놀/클로로포름 추출, 클로로포름 추출을 차례로 실시해서 수득된 수층에서, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수했다. 최종적으로 7.5mg의 DNA가 수득되었다.

실시예 1: TKO NucS의 조제

(1) TKO NucS의 발현용 플라스미드의 제작

서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 즉 TKO nucS 유전자의 클로닝은 이하의 방법으로 실시했다. 우선, 조제예 1에서 조제한 TKO 게놈 DNA 100ng를 주형으로 해서, 서열목록의 서열번호 5에 기재된 염기서열을 가지는 TK1898-F 및 서열목록의 서열번호 6에 기재된 염기서열을 가지는 TK1898-R을 프라이머로 사용해서 PCR을 실시했다. 또, TK1898-F는 제한효소 NdeI의 인식서열을 가지고, TK1898-R은 제한효소 NotI의 인식서열을 갖는. 반응액 조성은 각 프라이머 농도는 0.5㎛, 2.5mM dNTP, 1.5mM MgCl2, 1U의 KOD-Plus-NeoDNA 폴리머라아제(TOYOBO사)를 사용해서 50㎕의 반응 용량이다. PCR 조건은 98℃ 10초, 55℃ 30초, 68℃ 1분을 1사이클로 하는 30사이클 반응으로 실시했다.

반응액을 아가로오스 전기영동하고, TKO nucS 유전자에 상당하는 약 800bp의 밴드를 잘라내고, 여기서부터 통상의 방법으로 DNA를 정제했다. 이 DNA를 제한효소 NdeI 및 NotI(모두, TAKARA BIO INC.)로 소화하고, 재차 아가로오스 전기영동과 겔로부터의 DNA 단편 정제를 실시했다. 이 DNA 단편을 미리 NdeI 및 NotI로 소화한 pET21a(Novagen사)과 혼합하고, 라이게이션 반응 후, JM109 대장균에 도입해서 제작한 형질 전환체를 암피실린 함유 LB 한천 배지 상에서 배양했다. 그 후 발생한 콜로니를 암피실린 함유 LB 배지에서 배양해서 수득된 균체에서 Pure LinkR Hi Pure Plasmid Midiprep Kit(Life Technologies Corporation.)을 사용해서 플라스미드를 정제했다. 이 플라스미드의 삽입 단편 염기서열을 통상의 방법에 의해 해독하고, 올바르게 TKO nucS 유전자가 클로닝되고 있는 것을 확인했다. 이 TKO nucS 유전자 함유 플라스미드를 pET21a-TKONucS라고 명명했다.

(2) TKO NucS의 발현

TKO NucS의 발현 플라스미드인 pET21a-TKONucS는 상기 실시예 1(1)에서 제작된 것을 이용했다. 재조합 단백질의 생산에는 Novagen사의 대장균 재조합 단백질 발현 시스템(pET system)을 이용했다. 우선, pET21a-TKONucS를 사용해서 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL주(Agilent Technologies)를 설명서 기재된 방법으로 형질전환했다. 형질전환된 균체는 50㎍/㎖ 농도의 암피실린 및 34㎍/㎖ 농도의 클로람페니콜을 포함하는 LB 배지 100ml에서 포화할 때까지 배양했다. 이렇게 해서 수득된 배양액을, 50㎍/㎖ 농도의 암피실린 및 34㎍/㎖ 농도의 클로람페니콜을 포함하는 LB배지 1ℓ에 OD₆₀₀이 0.01가 되도록 접종 하고, OD₆₀₀이 0.4가 될 때까지 37℃에서 진탕배양한 후, IPTG을 첨가(최종농도 1mM)함으로서, 목적 단백질의 생산 유도를 실시했다. IPTG 첨가 후, 25℃에서 16시간 진탕 배양해서 얻은 배양액을 원심분리(5,000×g, 10분간, 4℃)해서 균체를 회수했다.

회수한 균체를 0.5M 염화나트륨, 1mM PMSF를 포함하는 용액 A(50mM Tris-HCl(pH8.0), 0.5mM DTT, 0.1mM EDTA, 10% glycerol) 25㎖에 현탁하고, 얼음 상에서 초음파 파쇄(10초간 on/10초간 off로 계 10분간)를 실시했다. 이 초음파 파쇄액을 원심분리(24,000×g, 10분간, 4℃)해서 얻은 상청액에 열처리(80℃, 30분간)를 하고, 이어서, 원심(24,000×g, 10분간, 4℃)하는 것에　의해, 열변성한 대장균 유래의 단백질을 제거했다.

(3) TKO NucS의 정제

상기(2)에서 취득한 열처리, 원심분리 후의 상청액에 포함되는 TKO NucS 단백질을 정제하기 위해서, 우선 최종농도 0.15%의 폴리에틸렌이민을 이 상청액에 첨가해서 혼입하고 있는 핵산을 불용화했다. 원심(24,000×g, 10분간, 4℃)에 의해 핵산을 제거하고, 상청액을 얻었다. 이 상청액 에 대해서, 80% 포화가 되도록 (NH₄) ₂SO₄를 첨가하고, 4도로 밤새 교반하고, 목적 단백질을 염석 했다. 이 용액을 원심분리(24,000×g, 10분간, 4℃)해서, 수득된 침전을 1.5M (NH₄)₂SO₄를 포함하는 용액 A 20㎖에 용해시키고, AKTA purifier시스템(GE healthcare사)을 사용하고, 소수성 상호작용 칼럼 크로마트그래피 칼럼 HiTrap Phenyl HP 5㎖(GE healthcare사)에 적용했다. 1.5M으로부터 0M의 (NH₄)₂SO₄의 농도구배에 의해 단백질을 용출하고, 1.4∼0.73M (NH₄)₂SO₄에 상당하는 용출 분획을 모았다. 이 분획을 0.3M 염화나트륨을 포함하는 용액 A에서 하룻밤 투석했다. 투석 후의 용액을 원심분리(23,708×g, 10분간, 4℃)해서 수득된 상청액을 어피니티 크로마토그래피 칼럼 HisTrap Heparin HP 1ml(GE healthcare사)에 적용했다. 0.3M으로부터 1M의 염화나트륨의 농도구배에 의해 단백질을 용출하고, 0.58∼0.8M 염화나트륨에 상당하는 용출 분획을 모았다. 이 분획을 0.35M 염화나트륨을 포함하는 용액 A에서 하룻밤 투석했다. 투석 후의 용액을 원심분리(24,000×g, 10분간, 4℃)해서 수득된 상청액을 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼 HiTrap SP HP 1ml(GE healthcare사)에 적용했다. 0.35M으로부터 1M의 염화나트륨의 농도구배에 의해 단백질을 용출하고, 용출 분획을 최종 정제분획으로 했다. 이 최종정제 산물에 대해서 12% SDS-PAGE에 의해 순도를 확인했다. 그 결과를 도 1에 나타낸다. 정제 단백질의 농도는 ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)에서 수득된 몰흡광계수 ε280=12950M^-1cm^-1을 사용하고, 정제 단백질에 280nm에 있어서의 흡광도로부터 산출했다.

실시예 2: TKO NucS의 효소학적 성질

(1) 미스매치 DNA 절단반응용 기질의 조제

TKO NucS의 미스매치 절단활성에 대해서 실험을 실시했다. 본 실시예에서 사용한 올리고뉴클레오티드와 그것들의 염기서열은 서열목록의 서열번호 7∼16에 나타낸다. 또, 서열목록의 서열번호 7∼9은, 5’말단에 Cy5 형광표지를 가지는 올리고뉴클레오티드이다.

도 2 에 나타나 있는 바와 같이, 서열목록의 서열번호 7∼16에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 조합시킴으로서, 45bp의 미스매치를 포함하지 않는 더블-스트랜드 DNA(all match dsDNA)과, 각각이 1개소의 미스매치를 포함하는 8종류의 더블-스트랜드 DNA기질(아데닌과 아데닌의 미스매치를 포함하는 더블-스트랜드 DNA(A-A dsDNA), 아데닌과 사이토신의 미스매치를 포함하는 더블-스트랜드 DNA(A-C dsDNA), 아데닌과 구아닌의 미스매치를 포함하는 더블-스트랜드 DNA(A-G dsDNA), 구아닌과 타이민의 미스매치를 포함하는 더블-스트랜드 DNA(G-T dsDNA), 구아닌과 구아닌의 미스매치를 포함하는 더블-스트랜드 DNA(G-G dsDNA), 타이민과 사이토신의 미스매치를 포함하는 더블-스트랜드 DNA(T-C dsDNA), 타이민과 타이민의 미스매치를 포함하는 더블-스트랜드 DNA(T-T dsDNA), 사이토신과 사이토신의 미스매치를 포함하는 더블-스트랜드 DNA(C-C dsDNA))를 조제했다. Cy5로 형광표지된 올리고뉴클레오타이드와 비표지의 올리고뉴클레오타이드를 1대1.6의 비로 포함하는 어닐링 용액 A(20mM Tris-HCl(pH8.0), 6mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgCl₂) 50㎕ 중에서 전술한 미스매치 올리고뉴클레오타이드를 어닐링시켜서, 50nM의 농도로 형광표지된 DNA를 포함하는 기질용액을 조제했다.

어닐링 조건은 98℃ 5분간, 80℃ 30초간, 80℃에서 60℃가 될 때까지 30분간, 60℃에서 30초간, 60℃에서 40℃가 될 때까지 30분간, 25℃에 30초간의 조건으로 실시했다. 또, 이가 금속 이온을 포함하지 않는 기질 DNA 용액은 상기의 표지 및 비표지 올리고뉴클레오타이드의 맞추기, 어닐링 조건에서 어닐링 용액 B(20mM Tris-HCl(pH8.0), 100mM NaCl, 6mM (NH₄)₂SO₄) 50㎕ 중에서 올리고뉴클레오타이드의 어닐링을 실시하고, 50nM의 농도의 형광표지된 DNA 기질용액을 조제했다.

(2) 미스매치 DNA 절단활성 측정

반응 용액(20mM Tris-HCl(pH8.0), 100mM NaCl, 6mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.1mg/㎖ 농도의 BSA) 20㎕ 중에서 각 농도의 TKO NucS(단량체로서 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50 및 100nM)와 5nM의 기질(G-T dsDNA)을 55℃, 5분간 반응시킨 후, 0.5M EDTA 1㎕을 첨가해서 반응을 정지시켰다. 반응정지 후, 반응액에 5mg/㎖ 농도의 프로테이나제 K를 0.5㎕ 첨가하고, 30분간 처리함으로서 단백질의 분해를 실시했다. 프로테이나제 K 처리 후의 반응액에, 겔로딩 버퍼(15% Ficoll, 10mM Tris-HCl(pH8.0), 0.1% Orange G) 4㎕를 첨가하고, 이 용액을 10% 폴리아크릴아마이드젤에 적용하고, 1×TBE 중, 25mA에서 30분간의 전기영동을 실시했다. 그 결과를 도 3-A에 나타낸다. 도 3-A에 있어서 레인(lane)1∼8은 각각 TKO NucS의 0∼100nM에 상당한다. 추가로, 전기영동 후의 겔에 대해서, Typhoon Trio+imager(GE healthcare사)를 사용해서 반응생성물의 검출을 실시하고, Image Quant TL로 절단된 올리고뉴클레오티드에 상당하는 밴드의 정량을 실시했다. 그 결과를 도 3-B에 나타낸다. 도 3-B에 있어서 종축은 절단 효율(%)이고, 횡축은 TKO NucS의 농도이다.

(3) TKO NucS의 미스매치 DNA 절단반응에 있어서의 최적 pH의 검토

TKO NucS의 미스매치 DNA 절단반응에 있어서의 최적 pH의 검토는 아래와 같이 수행했다. 즉, 20mM Glycine-HCl 완충액(pH3.0), 20mM CH₃COOH-CH₃COONa 완충액(pH4.0 및, pH5.0), 20mM MES-HCl 완충액(pH6.0), 20mM Bis-Tris-HCl 완충액(pH7.0), 20mM Tris-HCl 완충액(pH8.0), 20mM Glycine-NaOH 완충액(pH9.0 및 pH10.0), 20mM CAPS-NaOH 완충액(pH11.0), 20mM Phosphate-NaOH 완충액(pH12.0)의 각 완충액 및 0.1M NaOH의 용액(pH13.0)에, 40mM NaCl, 10mM KCl, 6mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.1mg/㎖ 농도의 BSA가 되도록 첨가한 것에, 추가로 TKO NucS 2nM과, 도 2에 나타낸 G-T dsDNA(서열목록의 서열번호 8에 기재된 염기서열을 가지는 Cy5-45-mismatch 올리고뉴클레오티드와 서열목록의 서열번호 10에 기재된 염기서열을 가지는 temp45-normal 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 더블-스트랜드 DNA) 5nM을 첨가해서 55℃에서 5분간 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 반응액을 프로테이나제 K 처리하고, 그 후 전기영동에 적용해 절단활성을 측정했다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 즉, 도 4는 반응 최적 pH를 나타내는 도면이고, 종축은 상대활성을 나타내고, 횡축은 pH를 나타낸다.

(4) 염의 종류와 농도가 TKO NucS의 미스매치 DNA 절단반응에 제공하는 영향

염의 종류와 농도가 TKO NucS의 미스매치 DNA 절단반응에 제공하는 영향을 검토했다. 우선, 20mM Tris-HCl 완충액(pH8.0), 6mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.1mg/㎖ 농도의 BSA에 대해서, 0, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 600, 800 및 1000mM의 NaCl, KCl 혹은 K-Glu(글루타민산 칼륨)을 포함하는 반응액을 조제하고, 거기에 TKO NucS 2nM과 G-T dsDNA 5nM을 첨가해서 55℃에서 5분간 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 반응액을 프로테이나제 K 처리하고, 그 후 전기영동에 적용해서 절단활성을 측정했다. 그 결과를 도 5에 나타낸다. 즉, 도5(A)는 염화나트륨 농도의 영향을 나타내는 도면이고, 종축은 상대활성을 나타내고, 횡축은 염농도를 나타내고, 도 5(B)는 염화칼륨 농도의 영향을 나타내는 도면이고, 종축은 상대활성을 나타내고, 횡축은 염농도를 나타내고, 도 5(C)는 글루타민산 칼륨 농도의 영향을 나타내는 도면이고, 종축은 상대활성을 나타내고, 횡축은 염 농도를 나타낸다.

(5) 이가금속 이온이 TKO NucS의 미스매치 DNA 절단반응에 미치는 영향

이가금속 이온이 TKO NucS의 미스매치 DNA 절단반응에 미치는 영향을 검토했다. 반응액은 20mM Tris-HCl 완충액(pH8.0), 6mM (NH₄)₂SO₄, 200mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.1mg/㎖ 농도의 BSA에 대해서, 0,0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 및 200mM의 MgCl₂, 혹은 0, 0.5, 1, 2, 5, 10 및 20mM의 MnCl₂를 포함하는 반응액을 조제하고, 거기에 TKO NucS 2nM과 G-T dsDNA 5nM을 첨가해서 55℃에서 5분간 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 반응액을 프로테이나제 K 처리하고, 그 후 전기영동에 적용해서 절단활성을 측정했다. 그 결과를 도 6, 및 도 7에 나타낸다. 즉, 도 6은 염화마그네슘 농도의 영향을 나타내는 도면이고, 종축은 상대활성을 나타내고, (A)의 횡축은 0∼200mM의 농도를 나타내고, (B)의 횡축은 0∼20mM 농도를 나타낸다. 동일하게 도 7은, 염화망간의 영향을 나타내는 도면이고, 종축은 상대활성을 나타내고, 횡축은 염화망간 농도를 나타낸다.

(6) TKO NucS의 미스매치 DNA 절단반응에 있어서의 최적온도의 검토

TKO NucS의 미스매치 DNA 절단반응에 있어서의 최적 온도의 검토는 아래와 같이 수행했다. 즉, 20mM Tris-HCl 완충액(pH8.0), 6mM (NH₄)₂SO₄, 100mM NaCl, 2mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.1mg/㎖ 농도의 BSA를 포함하는 반응액을 조제하고, 거기에 TKO NucS 2nM과 G-T dsDNA 5nM을 첨가해서 30℃에서 95℃의 반응온도에서 5분간 인큐베이션시켰다. 인큐베이션후, 반응액을 프로테이나제 K 처리하고, 그 후 전기영동에 적용해 절단활성을 측정했다. 그 결과를 도 8에 나타낸다. 즉, 도 8은 최적온도를 나타내는 도면이고, 종축은 상대활성을 나타내고, 횡축은 반응온도를 나타낸다.

실시예 3: TKO NucS의 미스매치 절단활성의 확인

(1) 다양한 미스매치 DNA에 대한 절단활성

실시예 2(1)에서 어닐링해서 제작한 45bp의 미스매치를 포함하지 않는 더블-스트랜드 DNA(all match dsDNA)와, 각각이 1개소의 미스매치를 포함하는 8종류의 더블-스트랜드 DNA기질을 사용해서, TKO NucS가 다양한 미스매치 DNA에 대한 절단활성을 검토했다. 즉, 반응 용액(20mM Tris-HCl(pH8.0), 100mM NaCl, 6mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100,0.1mg/㎖ 농도의 BSA) 20㎕ 중에서 각 농도의 TKO NucS(단량체로서 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50 및 100nM)와 5nM의 기질(all match dsDNA, A-A dsDNA, A-C dsDNA, A-G dsDNA, G-T dsDNA, G-G dsDNA, T-C dsDNA, T-T dsDNA, 및 C-C dsDNA)을 55℃, 5분간 반응시킨 후, 0.5M EDTA 1㎕을 첨가해 반응을 정지시켰다. 반응 정지후, 반응액에 5mg/㎖ 농도의 프로테이나제 K를 0.5㎕ 첨가하고, 30분간 처리함으로서 단백질의 분해를 실시했다. 프로테이나제 K 처리 후의 반응액에 겔로딩버퍼 4㎕을 첨가하고, 이 용액을 10% 폴리아크릴아마이드젤에 적용하고, 1×TBE 중, 25mA에서 30분간의 전기영동을 실시했다. 전기영동 후의 겔에 대해서, Typhoon Trio+imager(GE healthcare사)를 사용해서 반응생성물의 검출을 실시하고, Image Quant TL로 절단된 올리고뉴클레오티드에 상당하는 밴드의 정량을 실시했다. 그 결과를 도 9에 나타낸다. 도 9에 있어서 종축은 절단 효율(%)이고, 횡축은 TKO NucS의 농도이다. 각각의 미스매치 기질의 절단 효율을 범례에 나타나 있는 바와 같은 다른 마커로 나타내서 그래프로 나타냈다. 도 9로부터, TKO NucS는 G-T dsDNA, G-G dsDNA, T-T dsDNA, T-C dsDNA 및 A-G dsDNA를 절단하는 것을 확인할 수 있었다.

(2) TKO NucS의 DNA결합활성의 측정

TKO NucS의 DNA결합활성에 대해서 검토했다. 우선 기질특이성을 조사하기 위해서, 결합 용액(20mM Tris-HCl(pH8.0), 100mM NaCl, 6mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.1mg/㎖ 농도의 BSA, 1mM DTT) 20㎕ 중에서 각 농도의 TKO NucS(단량체로서 0, 1, 2, 5, 10 및 20nM)와 서열목록의 서열번호 17에 기재된 염기서열을 가지고, 그 5’말단에 Cy5 형광표지를 가지는 Cy5-15 binding 올리고뉴클레오티드와 서열목록의 서열번호 18∼26에 기재된 염기서열을 가지는 각 15binding 올리고뉴클레오티드를 도 10에 나타낸 조합으로 조제한 프로브 DNA(ssDNA(Cy5-15binding), all match(15bp)dsDNA, A-A(15bp)dsDNA, A-C(15bp)dsDNA, A-G(15bp)dsDNA, G-T(15bp)dsDNA, G-G(15bp)dsDNA, T-C(15bp)dsDNA, T-T(15bp)dsDNA 및 C-C(15bp)dsDNA)의 5nM을 37℃에서 5분간 보온했다. 보온 종료 후의 반응액에 겔로딩버퍼 4㎕을 첨가하고, 이 용액을 8% 폴리아크릴아마이드젤에 적용하고,0.5×TBE 중, 25mA에서 30분간의 전기영동을 실시했다. 전기영동 후, Typhoon Trio+imager를 사용해서 결합활성의 검출을 실시했다. 그 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11에 있어서 레인 1∼6 및 레인 7∼12는 각각 TKO NucS의 0∼20nM에 상당한다. 도 11로부터, TKO NucS는 G-T(15bp)dsDNA, G-G(15bp)dsDNA 및 T-T(15bp)dsDNA에 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

(3) TKO NucS의 내열성 검토

내열성의 검토는 아래와 같이 수행했다. 즉, 실시예 3(2)의 기재에 따라서, 단량체로서 2nM TKO NucS를 포함하며, 또 기질을 포함하지 않는 반응액 18μl을 조제했다. 이 반응액을 각 온도(50, 60, 70, 80, 85, 90 및 95℃)에서 30분간 처리한 후에 5nM의 기질(G-T 미스매치 dsDNA)을 첨가하고, 55℃, 5분간 반응시킨 후, 0.5M EDTA 1μl을 첨가해 반응을 정지시켰다.

반응 정지후, 반응액에 5mg/㎖ 농도의 프로테이나제 K 0.5㎕를 첨가하고, 30분간 처리함으로서 단백질의 분해를 실시했다. 프로테이나제 K 처리후의 반응액에 겔로딩버퍼 4㎕을 첨가하고, 이 용액을 10% 폴리아크릴아미드 겔에 적용하고, 1×TBE 중, 25mA에서 30분간의 전기영동을 실시했다. 전기영동 후의 겔에 대해서 Typhoon Trio+imager를 사용해서 반응생성물의 검출을 실시하고, Image Quant TLfh 절단된 올리고뉴클레오타이드에 상당하는 밴드의 정량을 실시했다. 그 결과를 도 12에 나타낸다.

즉, 도 12는 내열성을 나타내는 도면이고, 종축은 잔존활성을 나타내고, 횡축은 처리 온도를 나타낸다. 도 12로부터, TKO NucS는 80℃에서 30분간 처리해도 약 80%의 미스매치 절단활성이 남아 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: Thermococci kodakarensis 유래 PCNA1에 의한 TKO NucS의 절단활성의 촉진

T.kodakarensis 유래의 PCNA1(Genes to Cells, 2012년, 제11권, 2호, p. 923-937, 이하, 'TKO PCNA'라 부른다)에 의한 TKO NucS의 미스매치 DNA 절단반응에의 영향을 검토했다. 즉, 염화나트륨 400mM을 포함하는 절단반응용액C의 20㎕ 중에서, 이량체로서 2.5nM의 야생형 TKO NucS, 5nM의 기질 DNA(G-T dsDNA), 및 각 농도의 TKO PCNA(3량체로서 0, 5, 10, 25, 50, 125, 250, 500, 및 1250nM)를 55℃에서 5분간 반응시킨 후, 0.5M EDTA 1㎕을 첨가해서 반응을 정지시켰다. 반응 정지후, 반응액에 5mg/㎖ 농도의 프로테이나제 K 1㎕및 10% SDS 1㎕을 첨가하고, 50℃에서 1시간 반응시키는 것으로 단백질의 분해를 실시했다.

프로테이나제 K/SDS 처리 후의 반응액에 겔로딩버퍼를 4.5㎕ 첨가하고, 이 용액을 10% 폴리아크릴아마이드젤에 적용하고, 1×TBE 중, 25mA에서 20분간의 전기영동을 실시했다.

전기영동 후의 겔에 대해서 Typhoon Trio+imager를 사용해서 반응생성물의 검출을 실시하고, Image Quant TL로 절단된 올리고뉴클레오티드에 상당하는 밴드의 정량을 실시했다. 그 결과를 도 13에 나타낸다. 도 13 중, (A)는 native-PAGE 사진을 나타낸다. 또, (B)는 Image Quant TL로기질과 절단 산물의 밴드강도를 정량화한 것으로, 종축은 상대활성을 나타내고, PCNA를 포함하지 않을 때의 활성을 1로 했을 때가 다양한 농도의 PCNA 첨가 후의 상대활성이다. 도 13에 나타나 있는 바와 같이 반응 저해가 일어나는 400mM NaCl 존재 하에서도, TKO PCNA가 존재하면, 미스매치 절단활성이 촉진되는 것임을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 돌연변이형 TKO NucS의 조제

(1) 돌연변이형 TKO NucS의 발현용 플라스미드의 제작

TKO NucS의 각종 부위 특이적 돌연변이체 발현용 플라스미드를 구축하기 위해서, 서열목록의 서열번호 27∼30에 기재된 염기서열을 가지는 프라이머를 제작했다. 다음에, 돌연변이형 TKO NucS 생산용 플라스미드를 구축하기 위해서, PCR를 이용한 돌연변이 도입법을 사용했다.

47번째의 잔기로의 돌연변이도입 및 76번째의 잔기로의 돌연변이 도입을 위해서, 이하의 방법을 2회 반복했다. 2개의 1×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo(TOYOBO사),0.2mM each dNTP, 1.5mM 마그네슘이온, 0.02U/㎕의 KOD-Plus-Neo를 포함하는 25μl의 반응 용액 중에, 주형으로서 1회째는 TKO NucS 발현 플라스미드(pET21a-Tko NucS) 25ng를, 계속해서 2회째는 1회째에 제작한 플라스미드 25ng를 사용하고, 1회째에는 각각 7.5pmol의 서열번호 27 및 28의 프라이머를, 2회째에는 각각 7.5pmol의 서열번호 29 및 30의 프라이머를 첨가했다. 반응조건은 98℃ 1분 후, 98℃ 10초, 55℃ 30초, 68℃ 5분을 1사이클로 하는 14사이클 반응, 68℃ 5분, 25℃ 5초로 실시했다.

PCR 후, 용액에 20U/㎕의 DpnI(TAKARA BIO INC.)를 0.5㎕ 첨가하고, 37℃에 1시간 반응시켰다. DpnI 처리 후의 반응 용액을 사용해서 대장균 JM109주를 형질전환했다. 이 균체를 50㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 LB배지 25㎖에서 진탕배양한 후, 플라스미드 추출을 PureLink(등록상표)HiPure Plasmid Midiprep Kit를 사용해서 실시했다. 추출한 플라스미드의 TKO NucS가 코딩되고 있는 염기서열을 통상의 방법으로 해독하고, 돌연변이형 TKO NucS 단백질 생산용 플라스미드가 조제될 수 있음을 확인했다. 제작한 플라스미드는 pET21a-TKO NucS_S47A/N76A라고 명명했다. 또, 돌연변이형 TKO NucS S47A/N76A의 발현ㆍ정제는 실시예 1(2) 및(3)에 기재된 방법으로 실시했다.

실시예 6: 돌연변이형 TKO NucS S47A / N76A의 미스매치 DNA 절단활성

돌연변이형 TKO NucS S47A/N76A의 미스매치 DNA 절단활성을 해석했다. 즉, 반응 용액(20mM Tris-HCl(pH8.0), 100mM NaCl, 6mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.1mg/㎖ 농도의 BSA) 20㎕ 중에서 5nM의 기질(A-A dsDNA)과 각각 야생형 TKO NucS 및 돌연변이형 TKO NucS S47A/N76A를 이량체로 해서 50nM 첨가하고, 55℃, 5분간 반응시켰다. 그 후에 0.5M EDTA 1㎕를 첨가해 반응을 정지시켰다. 반응 정지후, 반응액에 5mg/㎖ 농도의 프로테이나제 K를 0.5㎕ 첨가하고, 30분간 처리함으로서 단백질의 분해를 실시했다. 프로테이나제 K 처리 후의 반응액에 겔로딩버퍼 4㎕를 첨가하고, 이 용액을 10% 폴리아크릴아마이드젤에 적용하고, 1×TBE 중, 25mA에서 30분간의 전기영동을 실시했다.

그 결과를 도 14에 나타낸다. 도 14에 있어서 레인(lane)1∼3은 각각 TKO NucS 단백질을 포함하지 않는 반응액, 야생형 TKO NucS, 및 돌연변이형 TKO NucS S47A/N76A에 상당한다. 그 결과, 돌연변이형 TKO NucS S47A/N76A가 A-A 미스매치를 인식해 절단하는 것임을 확인할 수 있었다. 이것으로부터, G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제와 적어도 A-A 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제의 양쪽을 제작할 수 있었다.

(산업상의 이용가능성)

본 발명은 유전자공학, 생물학, 의학, 농학등이 폭넓은 분야에 있어서 유용하다.

서열표의 프리텍스트

SEQ ID NO: 1: amino acid sequence of wild type endonuclease NucS from Thermococcus kodakarensis

SEQ ID NO: 2: nucleotide sequence of wild type endonuclease NucS from Thermococcus kodakarensis

SEQ ID NO: 3: amino acid sequence of mutant endonuclease NucS from Thermococcus kodakarensis

SEQ ID NO: 4: nucleotide sequence of mutant endonuclease NucS from Thermococcus kodakarensis

SEQ ID NO: 5: TK1898-F primer

SEQ ID NO: 6: TK1898-R primer

SEQ ID NO: 7: Substrate for TKO NucS, named as Cy5-45-nondamaged. "5'-end is labeled with Cy5"

SEQ ID NO: 8: Substrate for TKO NucS, named as Cy5-45-mismatch. "5'-end is labeled with Cy5"

SEQ ID NO: 9: Substrate for TKO NucS, named as Cy5-temp45. "5'-end is labeled with Cy5"

SEQ ID NO: 10: Substrate for TKO NucS, named as temp45-normal.

SEQ ID NO: 11: Substrate for TKO NucS, named as temp45-21A.

SEQ ID NO: 12: Substrate for TKO NucS, named as temp45-21C.

SEQ ID NO: 13: Substrate for TKO NucS, named as temp45-21G.

SEQ ID NO: 14: Substrate for TKO NucS, named as 45-mismatch25C.

SEQ ID NO: 15: Substrate for TKO NucS, named as 45-mismatch25T.

SEQ ID NO: 16: Substrate for TKO NucS, named as nondamaged-22C.

SEQ ID NO: 17: Substrate for TKO NucS, named as Cy5-15binding. "5'-end is labeled with Cy5"

SEQ ID NO: 18: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_AT.

SEQ ID NO: 19: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_AA.

SEQ ID NO: 20: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_CA.

SEQ ID NO: 21: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_GA.

SEQ ID NO: 22: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_GT.

SEQ ID NO: 23: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_GG.

SEQ ID NO: 24: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_CT.

SEQ ID NO: 25: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_TT.

SEQ ID NO: 26: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_CC.

SEQ ID NO: 27: A47-F primer

SEQ ID NO: 28: A47-R primer

SEQ ID NO: 29: A76-F primer

SEQ ID NO: 30: A76-R primer

SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. Kyushu University Educational Corporation Kansai Bunri Sougougakuen <120> A utilizing method of novel mismatch endonuclease <130> 672543 <150> JP 2014-184934 <151> 2014-9-11 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> Thermococcus kodakarensis <400> 1 Met Ser Lys Asp Lys Val Thr Val Ile Thr Ser Pro Ser Thr Glu Glu 1 5 10 15 Leu Val Ser Leu Val Asn Ser Ala Leu Leu Glu Glu Ala Met Leu Thr 20 25 30 Ile Phe Ala Arg Cys Lys Val His Tyr Asp Gly Arg Ala Lys Ser Glu 35 40 45 Leu Gly Ser Gly Asp Arg Val Ile Ile Val Lys Pro Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Leu Ile His Gln Ser Lys Lys Arg Glu Pro Val Asn Trp Gln Pro Pro 65 70 75 80 Gly Ser Arg Val Arg Leu Glu Leu Arg Glu Asn Pro Val Leu Val Ser 85 90 95 Ile Arg Arg Lys Pro Arg Glu Thr Leu Glu Val Glu Leu Glu Glu Val 100 105 110 Tyr Met Val Ser Val Phe Arg Ala Glu Asp Tyr Glu Glu Leu Ala Leu 115 120 125 Thr Gly Ser Glu Ala Glu Met Ala Glu Leu Ile Phe Glu Asn Pro Glu 130 135 140 Val Ile Glu Pro Gly Phe Lys Pro Leu Phe Arg Glu Lys Ala Ile Gly 145 150 155 160 Thr Gly Ile Val Asp Val Leu Gly Arg Asp Ser Asp Gly Asn Ile Val 165 170 175 Val Leu Glu Leu Lys Arg Arg Arg Ala Glu Leu His Ala Val Arg Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Tyr Val Glu Ile Leu Arg Glu Glu Tyr Gly Asp Lys Val 195 200 205 Arg Gly Ile Leu Val Ala Pro Ser Leu Thr Ser Gly Ala Lys Arg Leu 210 215 220 Leu Glu Lys Glu Gly Leu Glu Phe Arg Lys Leu Glu Pro Pro Lys Arg 225 230 235 240 Asp Ser Lys Lys Lys Gly Arg Gln Lys Thr Leu Phe 245 250 <210> 2 <211> 759 <212> DNA <213> Thermococcus kodakarensis <400> 2 atgtccaagg ataaggtaac ggtcatcacg tcgccatcaa ccgaagaact cgtttcgcta 60 gtcaattcag ctctcttaga agaggccatg ctgacgattt ttgcccgctg taaggtccac 120 tacgatggaa gggcaaagag cgagctcggc tccggcgata gggtcatcat agtcaagccc 180 gacggctctt ttctcatcca ccagagcaag aagcgcgagc ccgtgaactg gcagccaccg 240 ggtagcagag tgaggctgga gctgagggag aacccagttc tcgtctcgat aaggagaaag 300 ccgagggaga cccttgaggt cgagctcgaa gaggtctaca tggtctccgt cttccgagct 360 gaggactacg aggagctcgc ccttacgggg agcgaggccg agatggcgga gcttatcttt 420 gaaaatccag aggtcataga gcctggcttc aagccgctgt tcagggagaa ggcgatagga 480 actggaatcg ttgatgtcct tggaagggac agtgatggga atatagttgt ccttgagctt 540 aagcgcagga gggcggaact ccatgccgtt agacagctca agagctacgt cgagattctg 600 agagaggagt acggcgataa agtccgtgga attctcgttg ctccctcgct cacttctggg 660 gcaaaaagac tcctggaaaa ggagggcctc gagttcagga agctcgaacc gcctaaaaga 720 gactccaaaa agaagggcag acagaagaca ctgttttag 759 <210> 3 <211> 252 <212> PRT <213> Thermococcus kodakarensis <400> 3 Met Ser Lys Asp Lys Val Thr Val Ile Thr Ser Pro Ser Thr Glu Glu 1 5 10 15 Leu Val Ser Leu Val Asn Ser Ala Leu Leu Glu Glu Ala Met Leu Thr 20 25 30 Ile Phe Ala Arg Cys Lys Val His Tyr Asp Gly Arg Ala Lys Ala Glu 35 40 45 Leu Gly Ser Gly Asp Arg Val Ile Ile Val Lys Pro Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Leu Ile His Gln Ser Lys Lys Arg Glu Pro Val Ala Trp Gln Pro Pro 65 70 75 80 Gly Ser Arg Val Arg Leu Glu Leu Arg Glu Asn Pro Val Leu Val Ser 85 90 95 Ile Arg Arg Lys Pro Arg Glu Thr Leu Glu Val Glu Leu Glu Glu Val 100 105 110 Tyr Met Val Ser Val Phe Arg Ala Glu Asp Tyr Glu Glu Leu Ala Leu 115 120 125 Thr Gly Ser Glu Ala Glu Met Ala Glu Leu Ile Phe Glu Asn Pro Glu 130 135 140 Val Ile Glu Pro Gly Phe Lys Pro Leu Phe Arg Glu Lys Ala Ile Gly 145 150 155 160 Thr Gly Ile Val Asp Val Leu Gly Arg Asp Ser Asp Gly Asn Ile Val 165 170 175 Val Leu Glu Leu Lys Arg Arg Arg Ala Glu Leu His Ala Val Arg Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Tyr Val Glu Ile Leu Arg Glu Glu Tyr Gly Asp Lys Val 195 200 205 Arg Gly Ile Leu Val Ala Pro Ser Leu Thr Ser Gly Ala Lys Arg Leu 210 215 220 Leu Glu Lys Glu Gly Leu Glu Phe Arg Lys Leu Glu Pro Pro Lys Arg 225 230 235 240 Asp Ser Lys Lys Lys Gly Arg Gln Lys Thr Leu Phe 245 250 <210> 4 <211> 759 <212> DNA <213> Thermococcus kodakarensis <400> 4 atgtccaagg ataaggtaac ggtcatcacg tcgccatcaa ccgaagaact cgtttcgcta 60 gtcaattcag ctctcttaga agaggccatg ctgacgattt ttgcccgctg taaggtccac 120 tacgatggaa gggcaaaggc cgagctcggc tccggcgata gggtcatcat agtcaagccc 180 gacggctctt ttctcatcca ccagagcaag aagcgcgagc ccgtggcctg gcagccaccg 240 ggtagcagag tgaggctgga gctgagggag aacccagttc tcgtctcgat aaggagaaag 300 ccgagggaga cccttgaggt cgagctcgaa gaggtctaca tggtctccgt cttccgagct 360 gaggactacg aggagctcgc ccttacgggg agcgaggccg agatggcgga gcttatcttt 420 gaaaatccag aggtcataga gcctggcttc aagccgctgt tcagggagaa ggcgatagga 480 actggaatcg ttgatgtcct tggaagggac agtgatggga atatagttgt ccttgagctt 540 aagcgcagga gggcggaact ccatgccgtt agacagctca agagctacgt cgagattctg 600 agagaggagt acggcgataa agtccgtgga attctcgttg ctccctcgct cacttctggg 660 gcaaaaagac tcctggaaaa ggagggcctc gagttcagga agctcgaacc gcctaaaaga 720 gactccaaaa agaagggcag acagaagaca ctgttttag 759 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK1898-F primer <400> 5 cgcgcatatg tccaaggata aggtaacggt catc 34 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK1898-R primer <400> 6 ggggcggccg ctcaaaacag tgtcttctgt ctgcccttc 39 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as Cy5-45-nondamaged. "5'-end is labeled with Cy5" <400> 7 cgaactgcct ggaatcctga cgacatgtag cgaacgatca cctca 45 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as Cy5-45-mismatch. "5'-end is labeled with Cy5" <400> 8 cgaactgcct ggaatcctga cgacgtgtag cgaacgatca cctca 45 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as Cy5-temp45. "5'-end is labeled with Cy5" <400> 9 tgaggtgatc gttcgctaca tgtcgtcagg attccaggca gttcg 45 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as temp45-normal. <400> 10 tgaggtgatc gttcgctaca tgtcgtcagg attccaggca gttcg 45 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as temp45-21A. <400> 11 tgaggtgatc gttcgctaca agtcgtcagg attccaggca gttcg 45 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as temp45-21C. <400> 12 tgaggtgatc gttcgctaca cgtcgtcagg attccaggca gttcg 45 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as temp45-21G. <400> 13 tgaggtgatc gttcgctaca ggtcgtcagg attccaggca gttcg 45 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 45-mismatch25C. <400> 14 cgaactgcct ggaatcctga cgacctgtag cgaacgatca cctca 45 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 45-mismatch25T. <400> 15 cgaactgcct ggaatcctga cgacttgtag cgaacgatca cctca 45 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as nondamaged-22C. <400> 16 cgaactgcct ggaatcctga ccacatgtag cgaacgatca cctca 45 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as Cy5-15binding. "5'-end is labeled with Cy5" <400> 17 cgctacatgt cgtcc 15 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 15binding_AT. <400> 18 ggacgacatg tagcg 15 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 15binding_AA. <400> 19 ggacgacaag tagcg 15 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 15binding_CA. <400> 20 ggacgacacg tagcg 15 <210> 21 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 15binding_GA. <400> 21 ggacgacagg tagcg 15 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 15binding_GT. <400> 22 ggacgacgtg tagcg 15 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 15binding_GG. <400> 23 ggacgagatg tagcg 15 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 15binding_CT. <400> 24 ggacgacctg tagcg 15 <210> 25 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 15binding_TT. <400> 25 ggacgacttg tagcg 15 <210> 26 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for TKO NucS, named as 15binding_CC. <400> 26 ggacgacatc tagcg 15 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A47-F primer <400> 27 cgatggaagg gcaaaggccg agctcggctc cgg 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A47-R primer <400> 28 ccggagccga gctcggcctt tgcccttcca tcg 33 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A76-F primer <400> 29 gaagcgcgag cccgtggcct ggcagccacc ggg 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A76-R primer <400> 30 cccggtggct gccaggccac gggctcgcgc ttc 33

Claims

더블-스트랜드 핵산의 절단방법으로서, 하기 (i)∼(iii)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종의 폴리펩티드를 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산에 작용시키고, 당해 더블-스트랜드 핵산의 양쪽 스트랜드를 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치 염기쌍부위에서 인식해서 절단하는 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;
(ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
(iii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드.
하기 (a)∼(c)를 포함하는 조성물:
(a) DNA 폴리머라아제;
(b) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및
(c) 하기 (i)∼(iii)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 일종의 폴리펩티드:
(i) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;
(ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
(iii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 G-G, G-T 혹은 T-T 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드.
핵산의 증폭 방법으로서, 하기 (a)∼(b)의 공정을 포함하는 방법:
(a) 제2 항에 기재된 조성물과 주형이 되는 핵산분자를 포함하는 조성물을 조제하는 공정; 및
(b) 공정(a)에 의해 수득된 조성물을 적절한 조건하에서 반응시키고, 핵산 증폭을 실시하는 공정.
하기 (a)∼(C)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 폴리펩티드:
(A) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드,
(B) 상기 (a)의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 47번째와 76번째의 아미노산 잔기를 제외하는 1 내지 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
(C) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 대해서 90% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 47번째의 세린과 76번째의 아스파라긴에 대응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드.
하기 (a)∼(c)를 포함하는 조성물:
(a) DNA 폴리머라아제;
(b) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및
(c) 하기 (i)∼(iii)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종의 폴리펩티드:
(i) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;
(ii) 상기 (i)의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 47번째와 76번째의 아미노산 잔기를 제외하는 1 내지 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
(iii) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 대해서 90% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 아미노산 서열에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 47번째의 세린과 76번째의 아스파라긴에 대응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 A-A, A-C 혹은 C-C 미스매치를 인식해서 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드.
핵산의 증폭 방법으로서, 하기 (a)∼(b)의 공정을 포함하는 방법:
(a) 제5 항에 기재된 조성물과 주형이 되는 핵산분자를 포함하는 조성물을 조제하는 공정; 및
(b) 공정(a)에 의해 수득된 조성물을 적절한 조건하에서 반응시키고, 핵산 증폭을 실시하는 공정.
핵산 증폭 반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법으로서, 하기 (a)∼(d)의 존재 하에서 핵산 증폭 반응을 실시하는 공정을 포함하는 방법:
(a) 상기 특정의 염기서열을 가지는 핵산 또는 그 상보 스트랜드와 하이브리드화시켰을 때에 1개 혹은 수개의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시리보뉴클레오티드;
(b) DNA 폴리머라아제;
(c) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및
(d) 제1 항에 기재된 방법에서 사용하는 폴리펩티드 및/또는 제4 항에 기재된 폴리펩티드.
표적 핵산을 우선적으로 증폭하는 방법으로서, 당해 표적 핵산과 1개 혹은 수개의 염기가 다른 염기서열의 핵산 증폭을 제7 항에 기재된 방법에서 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8 항에 기재된 방법으로서, 추가로 내열성균 유래의 증식세포 핵항원(PCNA) 혹은 그 호모로그의 존재 하에서 표적 핵산의 증폭을 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 기재된 방법에서 사용하는 폴리펩티드 및/또는 제4 항에 기재된 폴리펩티드를 사용한 표적 핵산의 돌연변이 검출방법.