KR20170061182A - 인간 ｃｇｒｐ 수용체 결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

인간 CGRP 수용체 (CGRP R)에 결합하는 항원 결합 단백질이 제시된다. 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 벡터, 그리고 이들을 인코딩하는 세포 역시 제시된다. 이러한 항원 결합 단백질은 CGRP에 대한 CGRP R의 결합을 저해할 수 있고, 편두통의 치료 및/또는 예방을 비롯한 다수의 CGRP R 관련 질환에 유용하다.

Description

인간 ＣＧＲＰ 수용체 결합 단백질{HUMAN CGRP RECEPTOR BINDING PROTEINS}
본 출원은 EFS-Web을 통하여 제출되고 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 서열 목록을 포함한다. 2009년 12월 14일에 창작된 상기 ASCII 사본은 A1472PCT.txt로 명명되고, 그리고 312,447 바이트 크기이다.
펩티드의 칼시토닌 대집단은 적어도 5가지 공지된 구성원을 포함한다: 칼시토닌, 아밀린, 아드레노메듈린, 그리고 2개의 칼시토닌 유전자-관련된 펩티드 ("CGRP"), CGRP1 (일명, ctCGRP, 또는 CGRP) 및 CGRP2 (일명, βCGRP). CGRP는 중추신경계와 말초신경계 둘 모두에서 발현되는 37개 아미노산 혈관작용성 신경펩티드이고, 그리고 말초 내에서 강력한 혈관확장제인 것으로 밝혀졌는데, 여기서 CGRP-포함 뉴런은 혈관과 밀접하게 연관된다. CGRP-매개된 혈관확장 (vasodialation)은 또한, 혈장의 유출 (extravasation) 및 미세혈관구조 (microvasculature)의 혈관확장을 유발하고 편두통으로 나타나는 캐스케이드 현상의 일부로써, 신경성 염증과 연관된다. 아밀린 역시 CNS 내에서 특정한 결합 부위를 보유하고, 그리고 위 배출 (gastric emptying)을 조절하고 탄수화물 물질대사에서 일정한 역할을 하는 것으로 생각된다. 아드레노메듈린은 강력한 혈관확장제이다. 아드레노메듈린은 성상세포 상에서 특정한 수용체를 보유하고, 그리고 이의 메신저 RNA는 허혈에 종속되는 CNS 조직 내에서 상향 조절된다 (Zimmermann, et al., Identification of adrenomedullin receptors in cultured rat astrocytes and in neuroblastoma glioma hybrid cells (NG108-15), Brain Res., 724:238-245 (1996); Wang et al., Discovery of adrenomedullin in rat ischemic cortex and evidence for its role in exacerbating focal brain ischemic damage, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11480-11484 (1995)).
칼시토닌은 골 물질대사의 제어에 관련되고, 또한 중추신경계 (CNS)에서 활동성이다. CGRP의 생물학적 활성에는 신경근접합부 (neuromuscular junction), 면역계 내에서 항원 제시, 혈관 긴장도 (vascular tone), 그리고 감각 신경전달 (sensory neurotransmission)의 조절이 포함된다 (Poyner, D. R., Calcitonin gene-related peptide: multiple actions, multiplereceptors, Pharmacol. Ther., 56:23-51 (1992); Muff et al., Calcitonin, calcitonin gene related peptide, adrenomedullin and amylin: homologous peptides, separate receptors and overlapping biological actions, Eur. J. Endocrinol., 133: 17-20 (1995)). 3가지 칼시토닌 수용체 자극 펩티드 (CRSP) 역시 다수의 포유동물 종에서 확인되었다; 이들 CRSP는 CGRP 집단에서 새로운 하위집단을 형성할 수 있다 (Katafuchi, T and Minamino, N, Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides, novel members of the calcitonin gene-related peptide family, Peptides, 25(11):2039-2045 (2004)).
칼시토닌 대집단 펩티드는 7개의-막통과-도메인 G-단백질-결합된 수용체 (GPCR)를 통하여 기능한다. 칼시토닌 수용체 ("CT", "CTR" 또는 "CT 수용체") 및 CGRP 수용체는 유형 II ("집단 B") GPCR인데, 이러한 집단에는 조절 펩티드를 인식하는 다른 GPCR, 예를 들면, 세크레틴 (secretin), 글루카곤 (glucagon) 및 혈관작용성 장내 폴리펩티드 (VIP)가 포함된다. 인간 칼시토닌 수용체의 가장 특징화된 절단접합 변이체 (splice variant)는 첫 번째 세포내 루프 내에서 16개 아미노산의 존재 (이전에 CTRII + 또는 CTR1, 현재 CT(b)) 또는 부재 (주요한 절단접합 변이체, 이전에 CTRII - 또는 CTR2, 현재 CT(a))에 따라 달라진다 (Gornet al., Expression of two human skeletal calcitonin receptor isoforms cloned from a giant cell tumor of bone: the first intracellular domain modulates ligand binding and signal transduction, J. Clin. Invest., 95:2680-2691 (1995); Hay et al., Amylin receptors: molecular composition and pharmacology, Biochem. Soc. Trans., 32:865-867 (2004); Poyner et al., 2002). 적어도 2개의 CGRP 수용체 아류형의 존재가 다양한 생체내와 시험관내 생분석에서 차별적 길항약 친화성과 작동약 효능으로부터 제안되었다 (Dennis et al., CGRP8-37, A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor heterogeneity in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 254:123-128 (1990); Dennis et al., Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for multiplicity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251:718-725 (1989); Dumont et al., A potent and selective CGRP2 agonist, [Cys(Et)2,7]hCGRP: comparison in prototypical CGRP1 and CGRP2 in vitro assays, Can. J. Physiol. Pharmacol., 75:671-676 (1997)).
CGRP1 수용체 아류형은 길항약 단편 CGRP(8-37)에 민감한 것으로 밝혀졌다 (Chiba et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist humanCGRP-(8-37), Am. J. Physiol., 256:E331-E335 (1989); Dennis et al. (1990); Mimeault et al., Comparative affinities and antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 258:1084-1090 (1991)). 대조적으로, CGRP2 수용체는 위치 2와 7에서 시스테인 잔기가 유도체화된 (가령, 아세토아미노메틸 [Cys(ACM)2 ,7] 또는 에틸아미드 [Cys(Et)2 , 7]로) 선형 인간 CGRP (hCGRP) 유사체에 민감하지만, CGRP2 수용체는 단편 CGRP(8-37)에 둔감하였다 (Dennis et al. (1989); Dennis et al. (1990); Dumont et al. (1997)).
칼시토닌 수용체와 칼시토닌-유사 수용체 ("CL", "CLR" 또는 "CRLR")의 리간드 특이성은 수용체 활성 변경 단백질 (RAMP)로 불리는 보조 단백질의 집단의 구성원의 공동-발현에 의존한다. RAMP 집단에는 칼시토닌 집단 구성원에 대한 수용체의 리간드 특이성을 결정하는 수용체 조절자로서 기능하는 3가지 폴리펩티드 (RAMP1, RAMP2와 RAMP3)가 포함된다. RAMP는 짧은 세포질 C-말단, 1개의 막통과 도메인 및 특이성의 원인이 되는 큰 세포외 N-말단으로, 대략 30% 아미노산 서열 동일성 및 공통의 예측된 위상을 공유하는 유형 I 막통과 단백질이다 (McLatchie et al., (1998) RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-receptor-like receptor, Nature, 393:333-339 Fraser et al., (1999) The amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state and ligand binding of calcitonin receptor-like receptor, Molecular Pharmacology, 55:1054-1059).
1998년에, CGRP1 수용체가 신규한 단일 막통과 도메인 보조 단백질, 수용체 활성-변경 단백질 1 (RAMP1), 그리고 CRLR로 구성되는 이형이합체 (heterodimer)로서 확인되었다 (McLatchie et al., supra). 가교-연결 실험은 CGRP 수용체가 CRLR과 RAMP1의 1-대-1 화학량론적 배열 (stoichiometric arrangement)로 구성된다는 것을 암시하였고 (Hilairet et al. JBC 276, 42182-42190 (2001)), BRET와 BiFC와 같은 여러 방법을 이용한 더욱 최근의 연구는 기능적 CGRP 수용체 복합체가 CRLR의 비대칭적 동형-소중합체 및 RAMP1의 단량체로 구성될 수 있음을 증명하였다 (Heroux et al. JBC 282, 31610-31620 (2007)).
정제된 CRLR N-말단 도메인은 125I-CGRP에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌고 (Chauhan et al. Biochemistry 44, 782 (2005)), CRLR과 CGRP 리간드 사이에 중요하고 직접적인 상호작용을 확증하였다. 특히, CRLR의 Leu 24와 Leu 34가 CGRP의 C-말단 Phe37의 도킹 부위 (docking site)를 구성하는 것으로 생각된다 (Banerjee et al. BMC Pharmacol. 6, 9 (2006)). 더 나아가, Koller 등 (FEBS Lett. 531, 464-468 (2002))은 CRLR의 N-말단 18개 아미노산 잔기가 CGRP 또는 아드레노메듈린과의 선별적인 상호작용에 기여한다는 증거를 획득하였고, 그리고 Ittner 등 (Biochemistry 44, 5749-5754 (2005))은 CRLR의 N-말단 아미노산 잔기 23-60이 RAMP1과의 결합을 매개한다는 것을 암시하였다.
RAMP1의 구조-기능 분석에서, CRLR과의 상호작용에서 잠재적으로 중요한 "나선 3"에 상관하는 잔기 91-103 (Simms et al. Biophys. J. 91, 662 - 669 (2006)), 그리고 CGRP 수용체 복합체에 대한 결합과 관련하여 CGRP 리간드와 잠재적으로 상호작용하는 잔기 Trp74와 Phe92가 확인되었다. 인간/쥐 RAMP1 키메라를 이용한 리간드 결합 연구는 CGRP R의 일정한 소형 분자 저해물질 (가령, BIBN4096BS)에 대한 결합 부위가 RAMP1의 아미노산 66-102를 포함하는 영역 내에 위치한다는 것을 암시한다 (Mallee et al. JBC 277, 14294 - 14298 (2002)).
CRLR은 비록 막통과 도메인이 거의 80% 동일하긴 하지만, 전체적으로 CTR과 55% 아미노산 서열 동일성을 갖는다 (McLatchie et al. (1998); Poyner et al., International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin and calcitonin receptors, Pharmacol. Rev., 54:233-246 (2002)).
CRLR은 RAMP1과 결합될 때 CGRP에 대한 높은 친화성 수용체를 형성하거나, 또는 RAMP2 또는 RAMP3과 결합될 때 아드레노메듈린에 우선적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다 (McLatchie et al. (1998); Poyner et al., International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin and calcitonin receptors, Pharmacol. Rev., 54:233-246 (2002)). CRLR의 당화 상태는 이의 약리학과 연관된다. RAMP 1, 2, 그리고 3은 유사한 효율로 CRLR을 원형질 막으로 수송하긴 하지만, RAMP1은 말단 당화된 성숙 당단백질과 CGRP 수용체로서 CRLR을 제공하는 반면, RAMP 2와 3은 미성숙 중심 당화된 아드레노메듈린 수용체 ("AM" 또는 "AMR" 또는 "AM 수용체" (Fraser et al. (1999))로서 CRLR을 제공한다. 방사성리간드 결합 (방사성리간드로서 125I-아드레노메듈린), 기능적 분석 (cAMP 측정), 또는 생화학적 분석 (SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동)에 의한 HEK293T 세포 내에서 CRLR/RAMP2와 CRLR/RAMP3 수용체의 특성화에서, 이들은 비록 RAMP 2와 3이 단지 30% 아미노산 서열 동일성을 공유하긴 하지만, 구별할 수 없는 것으로 나타났다 (Fraser et al. 1999)). 하지만, RAMP 3과 대비하여 RAMP 2와 함께 발현된 CRLR에 대한 약리학에서 차이가 관찰되었다. CGRP와 CGRP8-37 둘 모두, 그리고 아드레노메듈린과 아드레노메듈린-유래된 펩티드 AM 22-52는 RAMP 3 이형이합체에서 활동성인데, 이는 상기 복합체가 CGRP와 AM 수용체 둘 모두로서 기능할 수 있음을 지시한다 (Howitt et al., British Journal of Pharmacology, 140:477-486 (2003); Muff et al., Hypertens. Res., 26:S3-S8 (2003)). 인간 CRLR의 쥐 RAMP1과의 공동-발현, 그리고 그 반대는 RAMP1 화학종이 조사된 여러 소형 분자 CGRP 수용체 길항약에 대하여 CRLR/RAMP1 복합체의 약리학적 특성을 결정한다는 것을 암시하였다 (Mallee et al., Receptor Activity-Modifying Protein 1 determines the species selectivity of non-peptide CGRP receptor antagonists, J. Biol. Chem., 277(16):14294-14298 (2002)). RAMP와 결합되지 않으면, CRLR은 임의의 내인성 리간드에 결합하지 않는 것으로 알려져 있다; 이는 현재, 이러한 방식으로 행동하는 것으로 생각되는 유일한 GPCR이다 (Conner et al., A key role for transmembrane prolines in calcitonin receptor-like agonist binding and signaling: implications for family B G-protein-coupled receptors, Molec. Pharmacol., 67(1):20-31 (2005)).
칼시토닌 수용체 (CT)는 또한, 아밀린 수용체 ("AMY", "AMY R" 또는 "AMY 수용체")로 알려져 있는 RAMP와 이형이합성 복합체를 형성하는 것으로 증명되었다. 일반적으로, CT/RAMP1 수용체 ("AMY1" 또는 "AMY1"로 지칭됨)는 연어 칼시토닌, 아밀린과 CGRP에 대한 더욱 높은 친화성, 그리고 포유동물 칼시토닌에 대한 더욱 낮은 친화성을 갖는다. CT/RAMP2 수용체 ("AMY2" 또는 "AMY2") 및 CT/RAMP3 수용체 ("AMY3" 또는 "AMY3")에 대하여, 비록 CGRP의 친화성이 더욱 낮고 생리학적으로 관련된 리간드 농도에서 유의하진 않지만, 대체로 유사한 패턴이 관찰되었다. 정확한 수용체 표현형은 세포 유형, 그리고 특히, RAMP2-산출된 아밀린 수용체에 대한 CTR 절단접합 변이체 (CT(a) 또는 CT(b))에 의존한다. 가령, 파골세포-유사 세포의 순수한 개체군은 보고된 바에 의하면, RAMP2, CTR, 그리고 CRLR을 발현하지만 RAMP1 또는 RAMP3을 발현하지 못하는 것으로 보고되었다 (Hay et al. (2004); Christopoulos et al., Multiple amylin receptors arise from receptor activity-modifying protein interaction with the calcitonin receptor gene product, Molecular Pharmacology, 56:235-242 (1999); Muff et al., An amylin receptor is revealed following co-transfection of a calcitonin receptor with receptor activity modifying proteins-1 or -3, Endocrinology, 140:2924-2927 (1999); Sexton et al. (2001); Leuthauser et al., Receptor-activity-modifying protein 1 forms heterodimers with two G-protein-coupled receptors to define ligand recognition, Biochem. J., 351:347-351 (2000); Tilakaratne et al., Amylin receptor phenotypes derived from human calcitonin receptor/RAMP co-expression exhibit pharmacological differences dependent on receptor isoform and host cell environment, J. Pharmacol. Exp. Ther., 294:61-72 (2000); Nakamura et al., Osteoclast-like cells express receptor activity modifying protein 2: application of laser capture microdissection, J. Molec. Endocrinol., 34:257-261 (2005)).
하기 표 1에서는 앞서 논의된 수용체 성분의 상관관계를 요약한다.
Figure pat00001
CGRP 길항약의 치료적 용도가 제안되었다. Noda 등은 혈소판 응집을 저해하고, 그리고 동맥경화증 또는 혈전증의 치료 또는 예방을 위한 CGRP 또는 CGRP 유도체의 용도를 기술하였다 (EP 0385712 B1). Liu 등은 운반제-접합된 펩티드, 예를 드면, 칼시토닌과 인간 αCGRP를 비롯하여, CTR의 활성을 조정하는 치료제를 개시하였다 (WO 01/83526 A2; US 2002/0090646 A1). 혈관작용성 CGRP 펩티드 길항약 및 CGRP 수용체에 CGRP 결합을 저해하는 방법에서 이들의 용도는 Smith 등에 의해 개시되었다; 이런 CGRP 펩티드 길항약은 관상동맥 막에 CGRP 결합을 저해하고 캡사이신-처리된 돼지 관상동맥을 이완시키는 것으로 밝혀졌다 (U.S. Pat. No. 6,268,474 B1; 그리고 U.S. Pat. No. 6,756,205 B2). Rist 등은 CGRP 수용체 길항약 활성을 갖는 펩티드 유사체, 그리고 다양한 질환의 치료와 예방을 위한 약물에서 이들의 용도를 개시하였다 (DE 19732944 A1).
CGRP는 다수의 혈관운동성 증상 (vasomotor symptom)의 병리, 예를 들면, 편두통 (전조가 있거나 없음)과 군발성 두통 (cluster headache)을 비롯한 모든 형태의 혈관성 두통 (vascular headache)에 관련되는 강력한 혈관확장제이다 (Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1 075, 2004). 편두통 병태생리는 CGRP가 집중되는 삼차신경절 (trigeminal ganglia)의 활성화를 수반하고, 그리고 CGRP 수준은 편두통 발생 동안 현저하게 증가한다. 이는 차례로, 두개골 혈관 확장 및 신경성 염증과 감작을 촉진한다 (Doods, H., Curr. Opin. Investig. Drugs, 2:1261-1268 (2001)). 게다가, 외경정맥 (external jugular vein) 내에서 CGRP의 혈청 수준이 편두통 동안 환자에서 증가된다 (Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990). 인간 ci-CGRP의 정맥내 투여는 전조가 없는 편두통을 앓는 환자에서 두통과 편두통을 유발하였는데, 이는 CGRP가 편두통에서 원인 역할을 한다는 견해를 뒷받침하였다 (Lassen et al, Cephalalgia 22:54-61, 2002).
편두통은 두통의 심한 일시적인 공격, 그리고 메스꺼움, 구토, 빛, 소리 또는 움직임에 대한 민감성을 포함하는 연관된 특징으로 특성화되는 복합적이고 일반적인 신경학적 장애이다. 일부 환자에서, 두통은 전조가 선행하거나 이를 동반한다. 두통은 일정한 환자에서 심각하고, 또한 한쪽에만 국한될 수 있다. 편두통 발생은 일상 생활을 파괴한다. 미국과 서유럽에서, 편두통 환자의 전체 이환율은 전체 인구의 11%이다 (6% 남성; 15-18% 여성). 게다가, 개체의 공격의 평균 빈도가 1.5회/월(month)이다. 증상을 완화시키거나 감소시키는데 이용가능한 다수의 치료제가 존재하긴 하지만, 월 3-4회 이상의 편두통이 발생하는 환자에는 예방적 요법이 권장된다 (Goadsby, et al. New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002). 일부 편두통 환자는 전압-의존성 나트륨 채널 및 일정한 글루타메이트 수용체 (AMPA-kainate)를 차단하고, GABA-A 수용체 활성을 강화시키고, 그리고 탄산탈수효소 (carbonic anhydrase)를 차단하는 항경련약인 토피라메이트 (topiramate)로 치료되었다. 일부 환자에서, 세로토닌 5HT-I B/ID 및/또는 5HT-1 수용체 작동약, 예를 들면, 수마트립탄 (sumatriptan)의 상대적으로 최근의 성공으로, 연구자들은 상기 질환의 세로토닌성 병인 (serotonergic etiology)을 제안하게 되었다. 안타깝게도, 일부 환자가 이러한 치료에 좋게 반응하긴 하지만, 다른 환자는 이의 효과에 상대적으로 내성이다.
편두통에서 가능한 CGRP 관련은 CGRP의 방출을 저해하는 (가령, sumatriptan), CGRP 수용체에서 반대로 작용하는 (가령, 디펩티드 유도체 BIBN4096BS (Boehringer Ingelheim); CGRP(8-37)), 또는 하나 이상의 수용체-연관된 단백질과 상호작용하는 (가령, RAMP1) 다수의 화합물의 개발과 시험을 위한 기초이었다 (Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002). 알파-2 아드레날린수용체 아류형 및 아데노신 Al 수용체 역시 CGRP 방출과 삼차신경 활성화를 제어한다 (저해한다) (Goadsby et al., Brain 125:1392- 401, 2002). 다른 한편, 신경성 염증 (가령, 타치키닌 NKI 수용체 길항약) 또는 삼차신경 활성화 (가령, 5HT10 수용체 작동약)를 배타적으로 저해하는 화합물로 치료는 편두통에 대한 단기 치료로서 상대적으로 무효한 것으로 생각되고, CGRP의 방출 저해가 효과적인 항-편두통 치료의 기초인 지에 관하여 의문이 제기되었다 (Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315-330, 2004).
비록 편두통의 정확한 병태생리가 아직 완전하게 이해되진 않았지만, CGRP 길항약과 CGRP-표적화 압타머 (aptamer)의 치료적 용도가 편두통과 다른 질환의 치료에 제안되었다 (가령, Olesen et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine, New Engl. J. Med.,350:1104-1110 (2004); Perspective: CGRP-receptor antagonists--a fresh approach to migraine, New Engl. J. Med., 350:1075 (2004); Vater et al., Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX, Nuc. Acids Res., 31(21 e130):1-7 (2003); WO 96/03993). 게다가, 강력한 소형-분자 CGRP 길항약은 최근의 임상 III기 시험에서, 편두통 통증과 편두통-연관된 증상을 비롯한 중등도 내지 중증도 편두통 발생을 완화시키는 것으로 밝혀졌다 (Connor, et al. Efficacy and Safety of telcagepant (MK-0974), a Novel Oral CGRP Receptor Antagonist, for Acute Migraine Attacks. Poster, European Headache and Migraine Trust International Congress, London, England, September 2008).
CGRP는 또한, 편두통 이외의 만성 통증 증상에 관련될 수 있다. 설치류에서, 수막강내 유래된 CGRP가 심한 통증을 유발하고, 그리고 CGRP 수준이 다수의 통증 모형에서 강화되었다. 이에 더하여, CGRP 길항약은 설치류에서 급성 췌장염에서 통각 (nociception)을 부분적으로 차단한다 (Wick, et al., (2006) Surgery, Volume 139, Issue 2, Pages 197-201). 종합하면, 이들 관찰 결과는 강력하고 선별적인 CGRP 수용체 길항약이 편두통을 비롯한 만성 통증의 치료를 위한 효과적인 치료제일 수 있음을 암시한다.
CGRP R, 특히 영장류 CGRP R, 예를 들면, 인간 CGRP R에 결합하는 분리된 항체, 이의 항원-결합 단편 및 다른 분리된 항원-결합 단백질이 본 명세서에서 제시된다. 이런 분리된 항원-결합 단백질은 영장류 CGRP R을 선별적으로 저해할 수 있고 (영장류 AM1, AM2, CT 또는 아밀린 수용체와 비교하여), 그리고 CGRP R의 CRLR과 RAMP1 성분 둘 모두에 결합할 수 있다. CGRP R 결합 단백질은 CGRP R에 관련된 생물학적 반응 중에서 적어도 한 가지를 저해하거나, 간섭하거나, 또는 조정하는 것으로 밝혀졌고, 따라서 CGRP R-관련된 질환 또는 장애의 효과를 개선하는데 유용하다. 이런 이유로, CGRP R에 일정한 항원-결합 단백질의 결합은 아래의 활성 중에서 하나 이상을 나타낼 수 있다: CGRP R의 저해, 간섭 또는 조정, 혈관확장 저해, 신경성 염증 감소, 그리고 만성적인 통증 또는 편두통 증상의 완화, 개선, 치료, 예방 또는 감소.
한 가지 예시적인 측면에서, 분리된 항원-결합 단백질은 인간 CGRP 수용체를 선별적으로 저해한다 (인간 AM1, AM2 또는 아밀린 수용체와 비교하여). 일부 구체예에서, 분리된 항원 결합 단백질은 50 또는 그 이상, 75 또는 그 이상, 100 또는 그 이상, 150 또는 그 이상, 200 또는 그 이상, 250 또는 그 이상, 300 또는 그 이상, 400 또는 그 이상, 500 또는 그 이상, 750 또는 그 이상, 또는 1,000 또는 그 이상의 선별성 비율 (selectivity ratio)로, 인간 CGRP 수용체를 선별적으로 저해한다. 선별적인 저해의 정도는 예로써, 하기 실시예에서 기술된 바와 같은 cAMP 분석법을 이용한 임의의 적절한 방법으로 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 분리된 항원 결합 단백질은 인간 CRLR과 인간 RAMP1 둘 모두에 특이적으로 결합하고, 그리고 인간 AM1, 인간 AM2 또는 인간 아밀린 수용체 (가령, AMY1 또는 AMY2)에 특이적으로 결합하지 않는다. 가령, 분리된 항원 결합 단백질은 KD ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, 또는 ≤5 nM로 인간 CGRP R에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 분리된 항원 결합 단백질은, FACS 결합 분석법을 이용하여 결정되고, 그리고 예로써, Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013에서 기술된 방법을 이용하여 분석된 바와 같이, KD ≤100 nM, ≤10 nM, 또는 ≤5 nM로 인간 CGRP R에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 분리된 항원 결합 단백질은 CGRP 결합 경쟁 분석법에서 ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM 또는 ≤0.1 nM의 Ki를 갖는다. 일부 구체예에서, 분리된 항원 결합 단백질은 인간 CGRP R을 발현하는 세포의 막에 대한 방사성표지된 125I-CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 본 명세서 실시예 5에서 기술된 분석법에서 ≤100 nM, ≤50 nM, ≤20 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM 또는 ≤0.1 nM의 Ki를 갖는다.
다른 예시적인 측면에서, 분리된 항원-결합 단백질은 서열 번호 158-170으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 137-153으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조물 항체와, 인간 CGRP R, 예를 들면, CGRP R의 세포외 부분에의 결합에 대하여 경쟁한다. 일부 구체예에서, 결합 경쟁은 비닝 (binning) 분석법, 예를 들면, 예로써 본 명세서 실시예 7에서 기술된 바와 같은 Biacore 분석을 이용하여 평가된다. 일부 구체예에서, 분리된 항원 결합 단백질은 참조물 항체와 인간 CGRP R에의 결합에 대하여 경쟁하고, 상기 참조물 항체는 (i) 서열 번호 161, 163, 164, 166과 168로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 (ii) 서열 번호 140, 143, 146, 148과 150으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일정한 구체예에서, 참조물 항체는 (i) 서열 번호 32, 34, 35, 37과 39로 구성된 군에서 선택되는 서열에 의해 정의된 중쇄; 그리고 (ii) 서열 번호 15, 18, 21, 23과 25로 구성된 군에서 선택되는 서열에 의해 정의된 경쇄를 포함한다. 더욱 특정한 구체예에서, 참조물 항체는 아래 서열 쌍 중에서 한 가지에 의해 정의된 중쇄와 경쇄를 포함한다: (i) 서열 번호 32와 서열 번호 15; (ii) 서열 번호 34와 서열 번호 18; (iii) 서열 번호 35와 서열 번호 21; (iv) 서열 번호 37과 서열 번호 23; 그리고 (v) 서열 번호 39와 서열 번호 25. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 참조물 항체는 서열 번호 32를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 15를 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 이와 같은 구체예에서, 참조물 항체는 서열 번호 34를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 18을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 이와 같은 구체예에서, 참조물 항체는 서열 번호 35를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 21을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 이와 같은 구체예에서, 참조물 항체는 서열 번호 37을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 23을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 이와 같은 구체예에서, 참조물 항체는 서열 번호 39를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 25를 포함하는 경쇄를 포함한다.
일정한 구체예에서, 인간 CGRP R에의 결합에 대하여 경쟁하는 분리된 항원-결합 단백질은 또한, 예로써 100 또는 그 이상, 250 또는 그 이상, 500 또는 그 이상, 750 또는 그 이상, 1,000 또는 그 이상, 2,500 또는 그 이상, 5,000 또는 그 이상, 또는 10,000 또는 그 이상의 선별성 비율로, 인간 CGRP 수용체를 선별적으로 저해하고, 그리고 이런 선별성은 예로써, 하기 실시예에서 기술된 바와 같은 cAMP 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 관련된 구체예에서, 인간 CGRP R에의 결합에 대하여 경쟁하는 분리된 항원 결합 단백질은, FACS 결합 분석법을 이용하여 결정되고, 그리고 예로써, Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013에서 기술된 방법을 이용하여 분석된 바와 같이, KD ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, 또는 ≤5 nM로 인간 CGRP R에 특이적으로 결합한다. 관련된 구체예에서, 인간 CGRP R에의 결합에 대하여 경쟁하는 분리된 항원-결합 단백질은 CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 인간 CGRP R을 발현하는 세포의 막에 대한 방사성표지된 125I-CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 본 명세서 실시예 5에서 기술된 분석법에서 ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM 또는 ≤0.1 nM의 Ki를 갖는다.
임의의 전술한 구체예에서, 인간 CGRP R에의 결합에 대하여 경쟁하는 분리된 항원-결합 단백질은 예로써, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 인간 (가령, 완전한 인간) 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중-특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편일 수 있다. 게다가, 인간 CGRP R에의 결합에 대하여 경쟁하는 분리된 항원-결합 단백질의 항체 단편은 Fab 단편, 그리고 Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디 또는 단일 사슬 항체 분자일 수 있다; 그리고, 예로써 인간 단일클론 항체, 예를 들면, IgG1-, IgG2-, IgG3-, 또는 IgG4-유형 항체일 수 있다. 일정한 구체예에서, 인간 CGRP R에의 결합에 대하여 경쟁하는 분리된 항원 결합 단백질은 중화 항원 결합 단백질일 수 있다.
일정한 예시적인 측면에서, 기술된 분리된 항원-결합 단백질, 예를 들면, 분리된 항체 또는 이들의 단편은 (A) (i) 서열 번호 134를 갖는 CDRH1; (ii) 서열 번호 135를 갖는 CDRH2; (iii) 서열 번호 136을 갖는 CDRH3; 그리고 선택적으로 (iv) 집합적으로 총계가 4개 이하의 아미노산인 하나 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRH로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDRH); (B) (i) 서열 번호 107, 111과 118로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 번호 108, 112와 119로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 번호 109, 113과 120으로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3; 그리고 선택적으로 (iv) 집합적으로 총계가 4개 이하의 아미노산인 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDRL); 또는 (C) (A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 (B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함한다.
일부 구체예에서, CDRH는 (i) 서열 번호 131을 갖는 CDRH1; (ii) 서열 번호 132를 갖는 CDRH2; (iii) 서열 번호 133을 갖는 CDRH3; 그리고 선택적으로 (iv) 집합적으로 총계가 3개 이하의 아미노산인 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRH로 구성된 군에서 더욱 선택된다. 관련된 구체예에서, CDRH는 (i) 서열 번호 76, 88, 100, 121, 125와 128로 구성된 군에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 번호 89, 101, 122, 124, 126, 그리고 129로 구성된 군에서 선택되는 CDRH2; (iii) 서열 번호 78, 90, 102, 123, 127, 그리고 130으로 구성된 군에서 선택되는 CDRH3; 그리고 선택적으로 (iv) 집합적으로 총계가 2개 이하의 아미노산인 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRH로 구성된 군에서 더욱 선택된다. 다른 관련된 구체예에서, CDRH는 (i) 서열 번호 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, 그리고 100으로 구성된 군에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 번호 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, 그리고 129로 구성된 군에서 선택되는 CDRH2; (iii) 서열 번호 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, 그리고 123으로 구성된 군에서 선택되는 CDRH3; 그리고 선택적으로 (iv) 집합적으로 총계가 2개 이하의 아미노산인 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRH로 구성된 군에서 더욱 선택된다. 일부 구체예에서, CDRL은 (i) 서열 번호 107, 111과 115로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 번호 108, 112와 116으로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 번호 109, 113과 117로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3; 그리고 선택적으로 (iv) 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRL로 구성된 군에서 더욱 선택된다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입은 CDRL에 대해 집합적으로 총계가 3개 이하의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 CDRL에 대해 집합적으로 총계가 2개 이하의 아미노산이다. 관련된 구체예에서, CDRL은 (i) 서열 번호 42, 45, 51, 57, 62, 69, 103, 그리고 110으로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 번호 43, 52, 55, 58, 63, 70, 104, 108, 그리고 114로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 번호 44, 47, 53, 56, 59, 64, 105, 그리고 106으로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3; 그리고 선택적으로 (iv) 집합적으로 총계가 2개 이하의 아미노산인 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRL로 구성된 군에서 더욱 선택된다. 추가의 관련된 구체예에서, CDRL은 (i) 서열 번호 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, 그리고 69로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 번호 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, 그리고 70으로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 번호 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, 그리고 72로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3; 그리고 선택적으로 (iv) 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRL로 구성된 군에서 더욱 선택된다. 한 구체예에서, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입의 총수는 CDR에 대해 2개 이하의 아미노산이다. 다른 구체예에서, 아미노산 치환은 보존성 치환이다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 임의의 전술한 (A)의 적어도 1개 또는 2개의 CDRH 및 임의의 전술한 (B)의 적어도 1개 또는 2개의 CDRL을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 임의의 전술한 (A)의 적어도 3개의 CDRH (여기서 이들 3개의 CDRH에는 CDRH1, CDRH2와 CDRH3이 포함된다), 그리고 (ii) 임의의 전술한 (B)의 3개의 CDRL (여기서 이들 3개의 CDRL에는 CDRL1, CDRL2와 CDRL3이 포함된다)을 포함한다. 추가의 구체예에서, 앞서 기술된 분리된 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 CDRH를 포함하는 첫 번째 아미노산 서열 및 적어도 하나의 CDRL을 포함하는 두 번째 아미노산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 아미노산 서열은 서로에 공유 결합된다.
다른 측면에서, 분리된 항원-결합 단백질은 CDRH1, CDRH2와 CDRH3을 포함한다. 한 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 73을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 74를 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 75를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 76을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 77을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 78을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 79를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 80을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 81을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 82를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 83을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 84를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 85를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 86을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 87을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 88를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 89를 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 90을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 76을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 91을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 78을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 92를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 93을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 94를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 76을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 95를 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 78을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 73을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 74를 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 96을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 97을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 98을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 99를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRH1은 서열 번호 100을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 101을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 102를 포함한다.
다른 측면에서, 분리된 항원-결합 단백질은 CDRL1 서열, CDRL2 서열과 CDRL3 서열을 포함한다. 한 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 42를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 43을 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 44를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 45를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 46을 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 47을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 48을 포함하고, CDRL2는 서열 번호 49를 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 50을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 51을 포함하고, CDRL2는 서열 번호 52를 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 53을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 54를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 55를 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 56을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 57을 포함하고, CDRL2는 서열 번호 58을 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 59를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 60을 포함하고, CDRL2는 서열 번호 55를 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 56을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 45를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 61을 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 47을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 62를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 63을 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 64를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 65를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 55를 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 56을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 66을 포함하고, CDRL2는 서열 번호 67을 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 68을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 69를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 70을 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 71을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 69를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 70을 포함하고, 그리고 CDRL3은 서열 번호 72를 포함한다.
다른 측면에서, 분리된 항원-결합 단백질은 CDRL1 서열, CDRL2 서열, CDRL3 서열, CDRH1 서열, CDRH2 서열과 CDRH3 서열을 포함한다. 한 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 42를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 43을 포함하고, CDRL3은 서열 번호 44를 포함하고, CDRH1은 서열 번호 73을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 74를 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 75를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 45를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 46을 포함하고, CDRL3은 서열 번호 47을 포함하고, CDRH1은 서열 번호 76을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 77를 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 78을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 48을 포함하고, CDRL2는 서열 번호 49를 포함하고, CDRL3은 서열 번호 50을 포함하고, CDRH1은 서열 번호 79를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 80을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 81을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 51을 포함하고, CDRL2는 서열 번호 52를 포함하고, CDRL3은 서열 번호 53을 포함하고, CDRH1은 서열 번호 82를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 83을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 84를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 54를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 55를 포함하고, CDRL3은 서열 번호 56을 포함하고, CDRH1은 서열 번호 85를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 86을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 87을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 57을 포함하고, CDRL2는 서열 번호 58을 포함하고, CDRL3은 서열 번호 59를 포함하고, CDRH1은 서열 번호 88을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 89를 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 90을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 60을 포함하고, CDRL2는 서열 번호 55를 포함하고, CDRL3은 서열 번호 56을 포함하고, CDRH1은 서열 번호 85를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 86을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 87을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 45를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 61을 포함하고, CDRL3은 서열 번호 47을 포함하고, CDRH1은 서열 번호 76을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 91을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 78을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 62를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 63을 포함하고, CDRL3은 서열 번호 64를 포함하고, CDRH1은 서열 번호 92를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 93을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 94를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 45를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 61을 포함하고, CDRL3은 서열 번호 47을 포함하고, CDRH1은 서열 번호 76을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 95를 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 78을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 65를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 55를 포함하고, CDRL3은 서열 번호 56을 포함하고, CDRH1은 서열 번호 85를 포함하고, CDRH2는 서열 번호 86을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 87을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 42를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 43을 포함하고, CDRL3은 서열 번호 44를 포함하고, CDRH1은 서열 번호 73을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 74를 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 96을 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 66을 포함하고, CDRL2는 서열 번호 67을 포함하고, CDRL3은 서열 번호 68을 포함하고, CDRH1은 서열 번호 97을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 98을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 99를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 69를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 70을 포함하고, CDRL3은 서열 번호 71을 포함하고, CDRH1은 서열 번호 100을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 101을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 102를 포함한다. 다른 구체예에서, CDRL1은 서열 번호 69를 포함하고, CDRL2는 서열 번호 70을 포함하고, CDRL3은 서열 번호 72를 포함하고, CDRH1은 서열 번호 100을 포함하고, CDRH2는 서열 번호 101을 포함하고, 그리고 CDRH3은 서열 번호 102를 포함한다.
임의의 전술한 서열-정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 예로써, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 인간 (가령, 완전한 인간) 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중-특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편일 수 있다. 게다가, 분리된 항원-결합 단백질의 항체 단편은 Fab 단편, 그리고 Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 단일 사슬 항체 분자일 수 있다. 가령, 분리된 항원 결합 단백질은 인간 단일클론 항체일 수 있고, 그리고 예로써, IgG1-, IgG2-, IgG3-, 또는 IgG4-유형 항체일 수 있다. 게다가, 분리된 항원 결합 단백질은 중화 항원 결합 단백질일 수 있다.
임의의 전술한 서열-정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 인간 CRLR과 인간 RAMP1 둘 모두에 특이적으로 결합하고, 그리고 AM1, AM2 또는 인간 아밀린 수용체 (가령, AMY1)에 특이적으로 결합하지 않는다, 가령, 분리된 항원 결합 단백질은, FACS 결합 분석법을 이용하여 결정되고, 그리고 예로써, Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013에서 기술된 방법을 이용하여 분석된 바와 같이, KD ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, 또는 ≤5 nM로 인간 CGRP R에 특이적으로 결합할 수 있다. 임의의 전술한 서열-정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 예로써, 100 또는 그 이상, 250 또는 그 이상, 500 또는 그 이상, 750 또는 그 이상, 1,000 또는 그 이상, 2,500 또는 그 이상, 5,000 또는 그 이상, 또는 10,000 또는 그 이상의 선별성 비율로, 인간 AM1, AM2 또는 AMY1 수용체에 비하여 인간 CGRP R을 선별적으로 저해할 수 있고, 여기서 선별적인 저해의 정도는 예로써, 하기 실시예에서 기술된 cAMP 분석을 이용한 임의의 적절한 방법으로 결정될 수 있다. 임의의 전술한 서열-정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 인간 CGRP R을 발현하는 세포의 막에 대한 방사성표지된 125I-CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 본 명세서 실시예 5에서 기술된 분석법에서 ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM 또는 ≤0.1 nM의 Ki를 가질 수 있다.
다른 일단의 구체예에는 하기에 기술된 공통 서열을 갖는 하나 또는 조합의 CDR을 포함하고, 그리고 선택적으로, 인간 CGRP R에 결합하는 분리된 항원-결합 단백질이 포함된다. 이들 공통 서열은 계통발생학적으로 관련된 CDR 서열로부터 유래된다. 한 측면에서, 다양한 그룹으로부터의 CDR이 혼합되고, 그리고 인간 CGRP R에 결합하는 임의의 특정 분리된 항원-결합 단백질에서 정합될 수 있다. 다른 측면에서, 항원 결합 단백질은 항체 클론의 동일한 계통발생학적으로-관련된 그룹으로부터 유래되는 중쇄와 경쇄 CDR을 포함한다. 예시적인 CDR 공통 서열은 아래와 같다:
K1 공통
CDR1 RASQGIRX1DLG (서열 번호 103), 여기서 X1은 N과 K로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1ASSLQS (서열 번호 104), 여기서 X1은 A와 G로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 LQYNX1X2PWT (서열 번호 105), 여기서 X1은 I와 S로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X2는 Y와 F로 구성된 군에서 선택된다.
K4 공통
CDR3 QQYGNSLX1R (서열 번호 106), 여기서 X1은 S와 C로 구성된 군에서 선택된다.
K1,4 공통
CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6 (서열 번호 107), 여기서 X1은 S와 G로 구성된 군에서 선택되고, X2는 V와 I로 구성된 군에서 선택되고, X3은 S와 R로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S, N과 K로 구성된 군에서 선택되고, X5는 Y와 D로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X6은 T와 G로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1ASSX2X3X4 (서열 번호 108), 여기서 X1은 G와 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 R과 L로 구성된 군에서 선택되고, X3은 A와 Q로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X4는 T와 S로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7 (서열 번호 109), 여기서 X1은 Q와 L로 구성된 군에서 선택되고, X2는 G와 N으로 구성된 군에서 선택되고, X3은 N과 T로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S, Y와 F로 구성된 군에서 선택되고, X5는 L과 P로 구성된 군에서 선택되고, X6은 C, W와 S로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X7은 R과 T로 구성된 군에서 선택된다.
K3 공통
CDR1 KSSQSLLHSX1GX2X3YLY (서열 번호 110), 여기서 X1은 D와 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 R과 K로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 N과 T로 구성된 군에서 선택된다.
K2,3 공통
CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5 (서열 번호 111), 여기서 X1은 R과 K로 구성된 군에서 선택되고, X2는 F, D와 A로 구성된 군에서 선택되고, X3은 Y, R과 K로 구성된 군에서 선택되고, X4는 N과 T로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X5는 D와 Y로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1X2SNRX3S (서열 번호 112), 여기서 X1은 L과 E로 구성된 군에서 선택되고, X2는 G와 V로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 A와 F로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 MQX1X2X3X4PX5T (서열 번호 113), 여기서 X1은 A와 S로 구성된 군에서 선택되고, X2는 L과 F로 구성된 군에서 선택되고, X3은 Q와 P로 구성된 군에서 선택되고, X4는 T와 L로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X5는 F와 L로 구성된 군에서 선택된다.
Lm3 공통
CDR2 RX1NQRPS (서열 번호 114), 여기서 X1은 N과 S로 구성된 군에서 선택된다.
Lm1,2,3 공통
CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3 (서열 번호 115), 여기서 X1은 N과 S로 구성된 군에서 선택되고, X2는 Y와 T로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 S, N과 Y로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1X2NX3RPS (서열 번호 116), 여기서 X1은 D, T와 R로 구성된 군에서 선택되고, X2는 N과 S로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 K와 Q로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3DX4X5LX6X7VV (서열 번호 117), 여기서 X1은 G와 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 T와 A로 구성된 군에서 선택되고, X3은 W와 R로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S와 D로 구성된 군에서 선택되고, X5는 R과 S로 구성된 군에서 선택되고, X6은 S와 N으로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X7은 A와 G로 구성된 군에서 선택된다.
LmAll 공통
CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11 (서열 번호 118), 여기서 X1은 S와 Q로 구성된 군에서 선택되고, X2는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, S이고, X3은 S와 D로 구성된 군에서 선택되고, X4는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, N이고, X5는 I와 L로 구성된 군에서 선택되고, X6은 G와 R로 구성된 군에서 선택되고, X7은 N과 S로 구성된 군에서 선택되고, X8은 N과 F로 구성된 군에서 선택되고, X9는 Y와 T로 구성된 군에서 선택되고, X10은 V와 A로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X11은 S, N과 Y로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1X2NX3RPS (서열 번호 119), 여기서 X1은 D, G, T와 R로 구성된 군에서 선택되고, X2는 N, K와 S로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 K, N과 Q로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V (서열 번호 120), 여기서 X1은 G, N과 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 T, S와 A로 구성된 군에서 선택되고, X3은 W와 R로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S와 D로 구성된 군에서 선택되고, X5는 R과 S로 구성된 군에서 선택되고, X6은 L과 V로 구성된 군에서 선택되고, X7은 S, Y와 N으로 구성된 군에서 선택되고, X8은 A, H와 G로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X9는 V와 L로 구성된 군에서 선택된다.
HC1 공통
CDR1 X1YYMX2 (서열 번호 121), 여기서 X1은 G와 D로 구성된 군에서 선택되고, X2는 H와 Y로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 WIX1PNSGGTNYAQKFQG (서열 번호 122), 여기서 X1은 N과 S로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (서열 번호 123), 여기서 X1은 D와 G로 구성된 군에서 선택되고, X2는 Q와 G로 구성된 군에서 선택되고, X3은 M과 Y로 구성된 군에서 선택되고, X4는 I와 G로 구성된 군에서 선택되고, X5는 I와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X6은 M과 A로 구성된 군에서 선택되고, X7은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, L이고, X8은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, R이고, X9는 V와 L로 구성된 군에서 선택되고, X10은 F와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X11은 P와 S로 구성된 군에서 선택되고, X12는 P와 H로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X13은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이다.
HC2 공통
CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (서열 번호 124), 여기서 X1은 K와 T로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X2는 T와 A로 구성된 군에서 선택된다.
HC3 공통
CDR1 X1YX2MX3 (서열 번호 125), 여기서 X1은 T와 S로 구성된 군에서 선택되고, X2는 S와 A로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 N과 S로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG (서열 번호 126), 여기서 X1은 S와 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 S와 G로 구성된 군에서 선택되고, X3은 S와 G로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S와 G로 구성된 군에서 선택되고, X5는 Y와 R로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X6은 R과 T로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV (서열 번호 127), 여기서 X1은 E와 D로 구성된 군에서 선택되고, X2는 G와 Q로 구성된 군에서 선택되고, X3은 V와 R로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S와 E로 구성된 군에서 선택되고, X5는 G와 V로 구성된 군에서 선택되고, X6은 S와 G로 구성된 군에서 선택되고, X7은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, S이고, X8은 I와 S로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X9는 S와 G로 구성된 군에서 선택된다.
HC4 공통
CDR1 SX1GMH (서열 번호 128), 여기서 X1은 F와 Y로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG (서열 번호 129), 여기서 X1은 F와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X2는 I와 H로 구성된 군에서 선택되고, X3은 S와 Y로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X4는 V와 A로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V (서열 번호 130), 여기서 X1은 D와 E로 구성된 군에서 선택되고, X2는 L과 K로 구성된 군에서 선택되고, X3은 N과 R로 구성된 군에서 선택되고, X4는 Y와 V로 구성된 군에서 선택되고, X5는 Y와 T로 구성된 군에서 선택되고, X6은 D와 M으로 구성된 군에서 선택되고, X7은 S와 T로 구성된 군에서 선택되고, X8은 G와 L로 구성된 군에서 선택되고, X9는 H와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X10은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이고, X11은 K와 F로 구성된 군에서 선택되고, X12는 M과 L로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X13은 A와 D로 구성된 군에서 선택된다.
HCA 공통
*CDR1 X1X2X3MX4 (서열 번호 131), 여기서 X1은 N과 S로 구성된 군에서 선택되고, X2는 A, Y와 F로 구성된 군에서 선택되고, X3은 W, A와 G로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X4는 S와 H로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (서열 번호 132), 여기서 X1은 R, A와 V로 구성된 군에서 선택되고, X2는 K, S와 W로 구성된 군에서 선택되고, X3은 S, G, F와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X4는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, K와 T로 구성된 군에서 선택되고, X5는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, T이고, X6은 D와 S로 구성된 군에서 선택되고, X7은 G와 S로 구성된 군에서 선택되고, X8은 T, R, I, N과 H로 구성된 군에서 선택되고, X9는 T와 K로 구성된 군에서 선택되고, X10은 D와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X11은 Y와 S로 구성된 군에서 선택되고, X12는 T, A와 V로 구성된 군에서 선택되고, X13은 A와 D로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X14는 P와 S로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V (서열 번호 133), 여기서 X1은 D, A와 E로 구성된 군에서 선택되고, X2는 R, Q와 G로 구성된 군에서 선택되고, X3은 T, R, L, G와 K로 구성된 군에서 선택되고, X4는 G, E, N, I와 R로 구성된 군에서 선택되고, X5는 Y, V와 A로 구성된 군에서 선택되고, X6은 S, G, Y, A와 T로 구성된 군에서 선택되고, X7은 I, P, D, A와 M으로 구성된 군에서 선택되고, X8은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, S와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X9는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, W, S와 T로 구성된 군에서 선택되고, X10은 S, G와 L로 구성된 군에서 선택되고, X11은 S, G, L과 Y로 구성된 군에서 선택되고, X12는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, W와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X13은 Y와 H로 구성된 군에서 선택되고, X14는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y와 D로 구성된 군에서 선택되고, X15는 Y, K와 F로 구성된 군에서 선택되고, X16은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이고, X17은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이고, X18은 M과 L로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X19는 D와 A로 구성된 군에서 선택된다.
HCB 공통
CDR1 X1X2X3X4X5 (서열 번호 134), 여기서 X1은 N, G, D, S와 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 A, F와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X3은 W, Y, A와 G로 구성된 군에서 선택되고, X4는 M과 L로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X5는 S와 H로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (서열 번호 135), 여기서 X1은 R, W, A, V, S와 F로 구성된 군에서 선택되고, X2는 K, N, S, W와 R로 구성된 군에서 선택되고, X3은 S, P, G, F와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X4는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, K, T와 R로 구성된 군에서 선택되고, X5는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, T와 A로 구성된 군에서 선택되고, X6은 D, N, H, S와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X7은 G와 S로 구성된 군에서 선택되고, X8은 G와 S로 구성된 군에서 선택되고, X9는 T, G, R, I, N, H와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X10은 T, K, R과 P로 구성된 군에서 선택되고, X11은 D, N, Y와 E로 구성된 군에서 선택되고, X12는 Y와 S로 구성된 군에서 선택되고, X13은 T, A와 V로 구성된 군에서 선택되고, X14는 A, Q와 D로 구성된 군에서 선택되고, X15는 P, K와 S로 구성된 군에서 선택되고, X16은 V와 F로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X17은 K와 Q로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V (서열 번호 136), 여기서 X1은 D, G, A와 E로 구성된 군에서 선택되고, X2는 R, G와 Q로 구성된 군에서 선택되고, X3은 T, M, Y, R, L, G와 K로 구성된 군에서 선택되고, X4는 G, S, E, N, I와 R로 구성된 군에서 선택되고, X5는 Y, I, G, V와 A로 구성된 군에서 선택되고, X6은 S, I, Y, G, A와 T로 구성된 군에서 선택되고, X7은 I, M, A, P와 D로 구성된 군에서 선택되고, X8은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, S, L과 Y로 구성된 군에서 선택되고, X9는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, W, R, S와 T로 구성된 군에서 선택되고, X10은 S, G와 L로 구성된 군에서 선택되고, X11은 S, V, L, G와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X12는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, F, Y와 W로 구성된 군에서 선택되고, X13은 Y, P, S와 H로 구성된 군에서 선택되고, X14는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y, P, D와 H로 구성된 군에서 선택되고, X15는 Y, K와 F로 구성된 군에서 선택되고, X16은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이고, X17은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이고, X18은 M과 L로 구성된 군에서 선택된다.
임의의 전술한 공통 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 예로써, AVIMER 폴리펩티드, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 인간 (가령, 완전한 인간) 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중-특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편일 수 있다. 게다가, 분리된 항원-결합 단백질의 항체 단편은 Fab 단편, 그리고 Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 단일 사슬 항체 분자일 수 있다. 가령, 분리된 항원 결합 단백질은 인간 단일클론 항체일 수 있고, 그리고 예로써, IgG1-, IgG2-, IgG3-, 또는 IgG4-유형 항체일 수 있다. 게다가, 분리된 항원 결합 단백질은 중화 항원 결합 단백질일 수 있다.
임의의 전술한 공통 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 인간 CRLR과 인간 RAMP1 둘 모두에 특이적으로 결합할 수 있고 AM1, AM2 또는 인간 아밀린 수용체 (가령, AMY1)에 특이적으로 결합하지 않을 수 있다, 가령, 분리된 항원 결합 단백질은, FACS 결합 분석법을 이용하여 결정되고, 그리고 예로써, Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013에서 기술된 방법을 이용하여 분석된 바와 같이, KD ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, 또는 ≤5 nM으로 인간 CGRP R에 특이적으로 결합할 수 있다. 임의의 전술한 공통 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 예로써, 100 또는 그 이상, 250 또는 그 이상, 500 또는 그 이상, 750 또는 그 이상, 1,000 또는 그 이상, 2,500 또는 그 이상, 5,000 또는 그 이상, 또는 10,000 또는 그 이상의 선별성 비율로, 인간 AM1, AM2 또는 AMY1 수용체에 비하여 인간 CGRP R을 선별적으로 저해할 수 있고, 여기서 선별적인 저해의 정도는 예로써, 하기 실시예에서 기술된 cAMP 분석을 이용한 임의의 적절한 방법으로 결정될 수 있다. 임의의 전술한 공통 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 인간 CGRP R을 발현하는 세포의 막에 대한 방사성표지된 125I-CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 본 명세서 실시예 5에서 기술된 분석법에서 ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM 또는 ≤0.1 nM의 Ki를 가질 수 있다.
기술된 분리된 항원-결합 단백질 중에서 일부는 서열 번호 158-170으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 서열을 포함한다. 기술된 분리된 항원-결합 단백질 중에서 일부는 서열 번호 137-153으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL) 서열을 포함한다. 기술된 분리된 항원-결합 단백질 중에서 일부는 서열 번호 158-170으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열, 그리고 서열 번호 137-153으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 일부 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 158-170으로 구성된 군에서 선택되거나, 또는 (ii) (i)에 의해 정의된 바와 같고 하나 이상 (가령, 5개, 10개, 15개 또는 20개)의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); (B) (iii) 서열 번호 137-153으로 구성된 군에서 선택되거나, 또는 (iv) (iii)에 의해 정의된 바와 같고 하나 이상 (가령, 5개, 10개, 15개 또는 20개)의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 서열을 포함하는 VL; 또는 (C) (A)의 VH 및 (B)의 VL을 포함한다. 일부 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 서열 번호 158-170으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 137-153으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
한 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 158, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 159, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 160, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 161, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 162, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 163, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 164, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 165, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 166, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 167, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 168, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 169, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 170, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
한 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 137, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 138, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 139, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 140, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 141, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 142, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 143, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 144, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 145, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 146, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 147, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 148, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 149, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 150, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 151, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 152, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (i) 서열 번호 153, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
임의의 전술한 VL과 VH 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 예로써, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 인간 (가령, 완전한 인간) 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중-특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편일 수 있다. 게다가, 분리된 항원-결합 단백질의 항체 단편은 Fab 단편, 그리고 Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 단일 사슬 항체 분자일 수 있다. 가령, 분리된 항원 결합 단백질은 인간 단일클론 항체일 수 있고, 그리고 예로써, IgG1-, IgG2-, IgG3-, 또는 IgG4-유형 항체일 수 있다. 게다가, 분리된 항원 결합 단백질은 중화 항원 결합 단백질일 수 있다.
임의의 전술한 VL과 VH 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 인간 CRLR과 인간 RAMP1 둘 모두에 특이적으로 결합할 수 있고 AM1, AM2 또는 인간 아밀린 수용체 (가령, AMY1)에 특이적으로 결합하지 않을 수 있다, 가령, 분리된 항원 결합 단백질은, FACS 결합 분석법을 이용하여 결정되고, 그리고 예로써, Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013에서 기술된 방법을 이용하여 분석된 바와 같이, KD ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, 또는 ≤5 nM으로 인간 CGRP R에 특이적으로 결합할 수 있다. 임의의 전술한 VL과 VH 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 예로써, 100 또는 그 이상, 250 또는 그 이상, 500 또는 그 이상, 750 또는 그 이상, 1,000 또는 그 이상, 2,500 또는 그 이상, 5,000 또는 그 이상, 또는 10,000 또는 그 이상의 선별성 비율로, 인간 AM1, AM2 또는 AMY1 수용체에 비하여 인간 CGRP R을 선별적으로 저해할 수 있고, 여기서 선별적인 저해의 정도는 예로써, 하기 실시예에서 기술된 cAMP 분석을 이용한 임의의 적절한 방법으로 결정될 수 있다. 임의의 전술한 VL와 VH 서열-정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 인간 CGRP R을 발현하는 세포의 막에 대한 방사성표지된 125I-CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 본 명세서 실시예 5에서 기술된 분석법에서 ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM 또는 ≤0.1 nM의 Ki를 가질 수 있다.
한 측면에서, 분리된 항원-결합 단백질은 서열 번호 29-41로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함한다. 기술된 분리된 항원-결합 단백질 중에서 일부는 서열 번호 12-28로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 서열을 포함한다. 분리된 항원-결합 단백질 중에서 일부는 서열 번호 29-41로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열, 그리고 서열 번호 12-28로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 29-41로 구성된 군에서 선택되거나, 또는 (ii) (i)에 의해 정의된 바와 같고 하나 이상 (가령, 5개, 10개, 15개 또는 20개)의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 서열을 포함하는 중쇄; (B) (iii) 서열 번호 12-28로 구성된 군에서 선택되거나, 또는 (iv) (iii)에 의해 정의된 바와 같고 하나 이상 (가령, 5개, 10개, 15개 또는 20개)의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 서열을 포함하는 경쇄; 또는 (C) (A)의 중쇄 및 (B)의 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 서열 번호 29-41로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 12-28로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 29, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 12, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 30, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 13, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 31, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 14, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 32, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 15, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 33, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 16, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
*다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 29, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 17, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 34, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 18, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 33, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 19, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 29, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 20, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 35, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 21, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 36, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 22, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 37, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 23, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
*다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 38, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 23, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 33, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 24, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 39, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 25, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 40, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 26, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 41, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 27, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 41, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 그리고 (B) (i) 서열 번호 28, (ii) (i)에 의해 정의된 서열에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열, 그리고 (iii) 최대 10개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 결실 또는 삽입을 보유하는 (i)에 의해 정의된 바와 같은 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
임의의 전술한 경쇄와 중쇄 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 특정된 중쇄 및/또는 경쇄 서열을 포함할 수 있지만 상이한 신호 펩티드를 보유하거나, 또는 신호 펩티드가 존재하지 않는다. 임의의 전술한 경쇄와 중쇄 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 예로써, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 인간 (가령, 완전한 인간) 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중-특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편일 수 있다. 게다가, 분리된 항원-결합 단백질의 항체 단편은 Fab 단편, 그리고 Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 단일 사슬 항체 분자일 수 있다. 가령, 분리된 항원 결합 단백질은 인간 단일클론 항체일 수 있고, 그리고 예로써, IgG1-, IgG2-, IgG3-, 또는 IgG4-유형 항체일 수 있다. 게다가, 분리된 항원 결합 단백질은 중화 항원 결합 단백질일 수 있다.
임의의 전술한 경쇄와 중쇄 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 인간 CRLR과 인간 RAMP1 둘 모두에 특이적으로 결합할 수 있고 AM1, AM2 또는 인간 아밀린 수용체 (가령, AMY1)에 특이적으로 결합하지 않을 수 있다, 가령, 분리된 항원 결합 단백질은, FACS 결합 분석법을 이용하여 결정되고, 그리고 예로써, Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013에서 기술된 방법을 이용하여 분석된 바와 같이, KD ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, 또는 ≤5 nM으로 인간 CGRP R에 특이적으로 결합할 수 있다. 임의의 전술한 경쇄와 중쇄 서열 정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 예로써, 100 또는 그 이상, 250 또는 그 이상, 500 또는 그 이상, 750 또는 그 이상, 1,000 또는 그 이상, 2,500 또는 그 이상, 5,000 또는 그 이상, 또는 10,000 또는 그 이상의 선별성 비율로, 인간 AM1, AM2 또는 AMY1 수용체에 비하여 인간 CGRP R을 선별적으로 저해할 수 있고, 여기서 선별적인 저해의 정도는 예로써, 하기 실시예에서 기술된 cAMP 분석을 이용하여 임의의 적절한 방법으로 결정될 수 있다. 임의의 전술한 경쇄와 중쇄 서열-정의된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 인간 CGRP R을 발현하는 세포의 막에 대한 방사성표지된 125I-CGRP 결합 경쟁 분석법, 예를 들면, 본 명세서 실시예 5에서 기술된 분석법에서 ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM 또는 ≤0.1 nM의 Ki를 가질 수 있다.
다른 측면에서, 앞서 요약된 임의의 CGRP R 항원-결합 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산 폴리뉴클레오티드 역시 제시된다. 한 구체예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 175, 176, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 186, 187, 188, 189, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209와 210으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 224-258로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에, 서열 번호 224-258로 구성된 군에서 선택되는 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 224-258로 구성된 군에서 선택되는 서열에 대략 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 분리된 핵산 분자는 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 관련된 구체예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내로 통합된다.
또한, 앞서 기술된 바와 같은 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 세포주가 제시된다. 관련된 측면에서, 앞서 기술된 CGRP R 항원-결합 단백질을 인코딩하는 전술한 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 그리고 이들 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포 역시 제시된다.
다른 측면에서, 항원-결합 단백질을 제조하는 방법 역시 제시되고, 상기 방법은 이러한 항원-결합 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터 항원 결합 단백질을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 가용성 CGRP 수용체를 포함하는 면역원을 이용하여 산출된다. 일부 구체예에서, 이런 가용성 CGRP 수용체는 인간 CRLR의 N-말단 세포외 도메인 (ECD) 및 인간 RAMP1의 ECD, 예를 들면, 본 명세서 실시예 1과 2에서 기술된 바와 같은 서열 번호 6을 포함하는 인간 CRLR의 ECD 및 서열 번호 8을 포함하는 RAMP1의 ECD를 공동-발현시키고 정제함으로써 획득된다.
또 다른 측면에서, 앞서 요약된 항원-결합 단백질 중에서 적어도 한 가지 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물이 제시된다. 한 구체예에서, 제약학적 조성물은 방사성동위원소, 방사성핵종, 독소, 또는 치료제 그룹과 화학치료제 그룹으로 구성된 군에서 선택되는 추가의 활성제를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 분리된 항원 결합 단백질은 환자에 투여될 때, 혈관확장을 저해하고/거나 신경성 염증을 감소시키는데 효과적이다. 한 구체예에서, 분리된 항원 결합 단백질은 두통, 예를 들면, 편두통의 빈도 및/또는 심각도를 감소시키는데 효과적이다. 가령, 항원 결합 단백질은 편두통의 단기 치료제로서, 및/또는 편두통 발생과 연관된 증상, 특히 통증 증상의 빈도 및/또는 심각도를 예방하거나 감소시키는 예방적 치료제로서 이용될 수 있다.
다른 측면에서는 환자에서 CGRP R과 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 더욱 제시하고, 상기 방법은 앞서 요약된 적어도 하나의 분리된 항원-결합 단백질의 효과량을 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 질환은 두통, 예를 들면, 편두통 또는 군발성 두통 또는 기타 유형의 통증, 예를 들면, 만성 통증이다; 다른 구체예에서, 이는 당뇨병 (유형 II)이다; 다른 구체예에서, 이는 염증, 특히 신경성 염증이다; 다른 구체예에서, 이는 심혈관 질환이다; 다른 구체예에서, 이는 내독소혈증 및 패혈증과 연관된 혈류 장애 (hemodynamic derangement)이다; 다른 구체예에서, 이는 혈관확장이다.
다른 측면에서, 환자에서 인간 CGRP R, 예를 들면, CGRP R의 세포외 부분에의 CGRP의 결합을 저해하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 본 명세서에서 제시된 및/또는 상기 요약된 적어도 하나의 항원-결합 단백질의 효과량을 투여하는 단계를 포함한다.
이들 및 기타 측면은 본 명세서에서 더욱 상세하게 기술될 것이다. 제시된 각 측면은 본 명세서에서 제공된 다양한 구체예를 포함할 수 있다. 이런 이유로, 한 가지 요소 또는 요소의 조합을 수반하는 이들 각 구체예는 기술된 각 측면 내에 포함될 수 있고, 그리고 상기 측면과 구체예의 이와 같은 모든 조합이 명백히 고려된다고 예상된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 그리고 이점은 아래의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
도 1에서는 인간, 필리핀 원숭이와 쥐로부터 RAMP-1 서열의 정렬을 도시한다.
도 2에서는 인간, 필리핀 원숭이와 쥐로부터 CRLR 서열의 정렬을 도시한다.
도 3A와 3B에서는 카파 경쇄를 갖는 지정된 항-CGRP 수용체 항체 클론, 그리고 일정한 상응하는 공통 서열로부터 경쇄 CDR의 계통발생학-기초된 서열 정렬을 도시한다.
도 4에서는 람다 경쇄를 갖는 지정된 항-CGRP 수용체 항체 클론, 그리고 일정한 상응하는 공통 서열로부터 경쇄 CDR의 계통발생학-기초된 서열 정렬을 도시한다.
도 5A, 5B, 5C, 5D와 5E에서는 지정된 항-CGRP 수용체 항체 클론, 그리고 일정한 상응하는 공통 서열로부터 중쇄 CDR의 계통발생학-기초된 서열 정렬을 도시한다.
도 5F에서는 본 명세서에서 제시된 예시적인 항-CGRP 수용체 항체 중쇄 CDR의 공통 서열을 도시한다.
도 6은 1092개 항-CGRP R 하이브리도마 상층액 (다이아몬드) 및 68개 음성 대조 상층액 (정사각형)에 의한 CGRP R에 표지된 리간드 결합의 저해 비율을 보여주는, 2회 실험으로부터 데이터의 플롯 (plot)이다.
도 7A-D에서는 3가지 지정된 항-CGRP R mAb에 대한, hCGRP 수용체 (도 7A), hAM1 (도 7B), hAM2 (도 7C)와 인간 아밀린 수용체 (도 7D)를 발현하는 세포로부터 예시적인 cAMP 분석 IC50 데이터를 도시한다.
도 8에서는 인간 CGRP 수용체에 mAb의 Ki를 결정하는데 이용될 수 있는 125I-CGRP 결합 데이터의 실례를 도시한다.
도 9A-D에서는 본 명세서에서 제시된 선택된 항체에 대한 Biacore 경쟁 데이터를 도시한다.
도 10에서는 mAb 12G8의 FACS Kd 결정을 도시한다.
도 11에서는 필리핀 원숭이, 인간, 인간 키메라, 쥐, 그리고 레서스 원숭이 RAMP1 서열의 정렬을 도시한다.
도 12A-B에서는 인간, 필리핀 원숭이, 레서스 원숭이, 쥐, 인간 키메라와 공통 CRLR 서열의 정렬을 도시한다.
도 13A-13C에서는 항-CGRP R 항체에 결합하는 상이한 키메라 CGRP 수용체의 대표적인 FACS 데이터를 도시한다.
도 14에서는 CGRP R 단독의 AspN 절단 (크로마토그램 A), 그리고 CGRP R 단일클론 항체 12G8을 보유하는 대조 시료의 절단 (크로마토그램 B)으로부터 유래된 펩티드 맵을 도시한다.
도 15에서는 상이한 농도의 CGRP R 중화 항체의 존재에서 CGRP R의 AspN 절단을 도시한다.
도 16에서는 상이한 농도의 CGRP R 중화 항체, 4E4의 존재에서 CGRP R의 AspN 절단을 도시한다.
도 17에서는 항체 32H7과 함께, 다양한 수용체 성분을 발현하는 세포의 면역조직화학 염색 강도를 도시한다.
상세한 설명
*본 명세서에서 섹션 헤드 (section heading)는 단순히 편성 목적을 위한 것으로, 기술된 요부 (subject matter)를 한정하는 것으로 간주되지 않는다.
달리 정의되지 않으면, 본 출원과 관련하여 이용된 과학 용어와 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가질 것이다. 게다가, 본문에서 달리 규정되지 않으면, 단수 용어는 복수형을 포함하고, 그리고 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다.
일반적으로, 본 명세서에서 제시된 세포와 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 그리고 단백질과 핵산 화학과 혼성화와 관련하여 이용되는 명명법, 그리고 이들 분야에서 기술은 당분야에 널리 공지되고 통상적으로 이용되는 것들이다. 본 출원의 방법과 기술은 일반적으로, 달리 지시되지 않으면 당분야에 널리 공지되고, 그리고 본 명세서 전반에서 인용되고 언급되는 다양한 포괄적 참고문헌과 더욱 특정적 참고문헌에서 기술된 바와 같은 전통적인 방법에 따라 수행된다 (참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 그리고 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), 이들은 본 발명에서 참조로서 편입됨). 효소 반응과 정제 기술은 당분야에서 통상적으로 달성되거나, 또는 본 명세서에서 제시된 바와 같이, 제조업체의 사용설명서에 따라 수행된다. 본 명세서에서 제시된 분석 화학, 합성 유기 화학, 그리고 의약과 제약 화학과 관련하여 이용된 전문용어, 그리고 이들 분야의 실험 절차와 기술은 당분야에 널리 공지되고 통상적으로 이용되는 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 의약품 제조, 제제화 (formulation)와 전달, 그리고 환자의 치료에 표준 기술이 이용될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에서 제시된 특정 방법, 프로토콜, 시약 등에 한정되지 않고, 따라서 변할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 이용된 전문용어는 단순히 특정 구체예를 기술하기 위한 것으로, 특허청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
작업 실시예를 제외하고, 또는 달리 지시되는 경우에, 본 명세서에서 이용된 성분 또는 반응 조건의 양을 표시하는 모든 숫자는 모든 경우에, 용어 "대략"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 비율과 관련하여 이용될 때 용어 "대략"은 ±1%를 의미한다.
정의
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 단일-가닥과 이중-가닥 뉴클레오티드 중합체 둘 모두를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 어느 한쪽 유형의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형에는 염기 변형, 예를 들면, 브로모우리딘과 이노신 유도체, 리보오스 변형, 예를 들면, 2',3'-디데옥시리보오스, 그리고 뉴클레오티드간 연쇄 변형, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐라데이트와 포스포로아미데이트가 포함된다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 200개 또는 그 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 10개 내지 60개 염기 길이를 갖는다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개 내지 40개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 올리고뉴클레오티드는 예로써, 돌연변이 유전자의 작제에 이용되는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 검출 분석법을 위한, 방사성라벨, 형광 라벨, 합텐 또는 항원성 라벨을 비롯한 라벨을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예로써, PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 이용될 수 있다.
"분리된 핵산 분자"는 이러한 분리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 관찰되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 결합되지 않거나, 또는 이러한 분리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결되는 게놈, mRNA, cDNA, 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 일부 조합을 의미한다. 본 명세서에서, 특정 뉴클레오티드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 본래 염색체를 포함하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 특정 핵산 서열을 "포함하는" 분리된 핵산 분자는 특정 서열 이외에, 최대 10개 또는 심지어 최대 20개의 다른 단백질 또는 이의 일부분에 대한 코딩 서열을 포함하거나, 또는 인용된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하거나, 및/또는 벡터 서열을 포함할 수 있다.
달리 명시되지 않으면, 본 명세서에서 제시된 임의의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼손 단부는 5' 단부이다; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼손 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 미성숙 RNA 전사체의 5'에서 3' 부가의 방향은 전사 방향으로 지칭된다; RNA 전사체의 5' 단부에 5'인, 상기 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상에서 서열 영역은 "상류 서열"로 지칭된다: RNA 전사체의 3' 단부에 3'인, 상기 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상에서 서열 영역은 "하류 서열"로 지칭된다.
용어 "제어 서열"은 결찰되는 코딩 서열의 발현과 가공에 영향을 줄 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이런 제어 서열의 성질은 숙주 생물체에 좌우될 수 있다. 특정 구체예에서, 원핵생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 그리고 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 가령, 진핵생물에 대한 제어 서열은 전사 인자에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터, 전사 인핸서 서열, 그리고 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. "제어 서열"은 리더 서열 및/또는 융합 상대 서열을 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 단백질 코딩 정보를 숙주 세포 내로 이동시키는데 이용되는 임의의 분자 또는 실체 (가령, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구조체"는 숙주 세포의 형질전환에 적합하고, 그리고 작동가능하게 연결된 하나 이상의 이종기원 코딩 영역의 발현을 주동하고 및/또는 제어하는 (숙주 세포와 협력하여) 핵산 서열을 보유하는 벡터를 지칭한다. 발현 구조체에는 전사와 번역에 영향을 주거나 이들을 제어하고, 그리고 인트론이 존재하면, 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 RNA 절단접합 (splicing)에 영향을 주는 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
*본 명세서에서, "작동가능하게 연결된"은 상기 용어가 적용되는 성분들이 적절한 조건 하에 그들의 고유한 기능을 수행할 수 있도록 하는 관계에 있음을 의미한다. 가령, 단백질 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 벡터 내에 제어 서열은 단백질 코딩 서열의 발현이 상기 제어 서열의 전사 활성과 양립하는 조건 하에 달성되도록 상기 단백질 코딩 서열에 결찰된다.
용어 "숙주 세포"는 핵산 서열로 형질전환되었거나, 또는 형질전환될 수 있고, 따라서 목적 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 상기 용어는 자손이 형태 또는 유전적 구성에서 최초 부모 세포에 동일한 지에 상관없이, 목적 유전자가 존재하기만 하면 부모 세포의 자손을 포함한다.
용어 "형질도입"은 통상적으로 박테리오파지에 의한, 한쪽 세균에서 다른 세균으로 유전자의 이동을 의미한다. "형질도입"은 또한, 복제 결함성 레트로바이러스에 의한 진핵 세포 서열의 획득과 이동을 지칭하다.
용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하고, 그리고 세포는 외인성 DNA가 세포 막 내로 도입될 때 "형질감염된다." 다수의 형질감염 기술은 당분야에 널리 공지되어 있고 본 명세서에서 제시된다 (참조: Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197). 이런 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적절한 숙주 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다.
용어 "형질전환"은 세포의 유전적 특징에서 변화를 지칭하고, 그리고 세포는 새로운 DNA 또는 RNA를 보유하도록 변형될 때 형질전환된다. 가령, 세포는 형질감염, 형질도입, 또는 기타 기술을 통해 새로운 유전 물질을 도입함으로써 고유 상태로부터 유전적으로 변형될 때 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 이후에, 형질전환 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합함으로써 상기 세포의 DNA와 재조합되거나, 또는 복제 없이 에피솜 요소 (episomal element)로서 일시적으로 유지되거나, 또는 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. 세포는 형질전환 DNA가 세포 분열과 함께 복제될 때, "안정적으로 형질전환된" 것으로 간주된다.
본 명세서에서, 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 동의어로서 이용된다. 상기 용어는 또한, 자연-발생 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연-발생 아미노산의 유사체 또는 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 상기 용어는 또한, 예로써 당단백질을 형성하기 위한 탄수화물 잔기의 부가에 의해 변형되거나, 또는 인산화된 아미노산 중합체를 포괄할 수 있다. 폴리펩티드와 단백질은 자연-발생 비-재조합 세포에 의해 생산될 수 있다; 또는 이들은 유전자-조작된 또는 재조합 세포에 의해 생산되고, 그리고 고유 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 고유 서열의 하나 이상의 아미노산에서 결실, 부가 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함한다. 용어 "폴리펩티드"와 "단백질"은 항원 결합 단백질, 예를 들면, CGRP R 항원-결합 단백질, CGRP R 결합 단백질, 항체, 또는 항원-결합 단백질의 하나 이상의 아미노산에서 결실, 부가 및/또는 치환을 갖는 서열을 특정하게 포함한다. 용어 "폴리펩티드 단편"은 전장 단백질과 비교하여 아미노-말단 결실, 카르복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 이들 단편은 또한, 전장 단백질과 비교하여 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 단편은 대략 5개 내지 500개 아미노산 길이를 갖는다. 가령, 단편은 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개 아미노산 길이를 가질 수 있다. 유용한 폴리펩티드 단편에는 결합 도메인을 비롯한, 항체의 면역학적으로 기능적 단편이 포함된다. CGRP R-결합 항체의 경우에, 유용한 단편에는 CDR 영역, 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 사슬의 일부분, 또는 2개의 CDR을 포함하는 이의 가변 도메인 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. "CGRP 수용체", 또는 "CGRP R"은 RAMP1과 CRLR을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "분리된 단백질" (가령, 분리된 항원 결합 단백질), "분리된 폴리펩티드" 또는 "분리된 항체"는 목적 단백질, 폴리펩티드 또는 항체가 (1) 정상적으로 함께 관찰되는 적어도 일부의 다른 단백질이 존재하지 않거나, (2) 동일한 출처, 예를 들면, 동일한 종으로부터 다른 단백질이 본질적으로 존재하지 않거나, (3) 상이한 종으로부터 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서 결합되는 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 기타 물질의 적어도 대략 50%로부터 분리되거나, (5) 자연에서 결합되지 않는 폴리펩티드와 작동가능하게 결합되거나 (공유 또는 비-공유 상호작용에 의해), 또는 (6) 자연에서 발생하지 않는다는 것을 의미한다. 전형적으로, "분리된 단백질", "분리된 폴리펩티드" 또는 "분리된 항체"는 소정의 시료의 적어도 대략 5%, 적어도 대략 10%, 적어도 대략 25%, 또는 적어도 대략 50%를 구성한다. 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 또는 합성 기원의 다른 RNA, 또는 이들의 임의의 조합이 이런 분리된 단백질을 인코딩할 수 있다. 바람직하게는, 분리된 단백질 폴리펩티드 또는 항체는 이의 치료적, 진단적, 예방적 연구 또는 다른 용도를 간섭하는 자연 환경에서 관찰되는 다른 단백질 또는 다른 폴리펩티드 또는 다른 오염물질이 실질적으로 존재하지 않는다.
폴리펩티드 (가령, 항원 결합 단백질, 또는 항체)의 "변이체"는 다른 폴리펩티드 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열 내에서 삽입되고, 결실되고 및/또는 치환되는 아미노산 서열을 포함한다. 변이체에는 융합 단백질이 포함된다.
폴리펩티드의 "유도체"는 예로써, 다른 화학적 모이어티에 접합 (conjugation)을 통해, 삽입, 결실, 또는 치환 변이체와 상이한 방식으로 화학적으로 변형된 폴리펩티드 (가령, 항원 결합 단백질, 또는 항체)이다.
본 명세서 전반에서, 생물학적 물질, 예를 들면, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 등과 관련하여 용어 "자연-발생"은 자연에서 관찰되는 물질을 지칭한다.
본 명세서에서, "항원 결합 단백질"은 특정 표적 항원, 예를 들면, CGRP R, 특히 영장류, 예를 들면, 인간 CGRP R에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미한다. CGRP R 항원 결합 단백질은 인간 CGRP 수용체에 특이적으로 결합한다.
항원 결합 단백질은 해리 상수 (dissociation constant, KD)가 ≤10-6 M일 때, 표적에 "특이적으로 결합한다"라고 일컬어진다. 항체는 KD가 ≤1x 10-8 M일 때, "높은 친화성"으로 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, 항체는 KD ≤5x 10-7로 CGRP R, 또는 인간 CGRP R에 결합할 것이다; 다른 구체예에서, 항체는 KD ≤1x 10-7로 결합할 것이다; 다른 구체예에서, 항체는 KD ≤5x 10-8로 결합할 것이다; 다른 구체예에서, 항체는 KD ≤1x 10-8로 결합할 것이다; 다른 구체예에서, 항체는 KD ≤5x 10-9로 결합할 것이다; 다른 구체예에서, 항체는 KD ≤1x 10-9로 결합할 것이다; 다른 구체예에서, 항체는 KD ≤5x 10-10으로 결합할 것이다; 다른 구체예에서, 항체는 KD ≤1x 10-10으로 결합할 것이다.
항체, 이들의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 단백질은 특정 수용체의 저해 분석에서 이러한 항체, 이들의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 단백질의 IC50이 다른 "참조물" 수용체의 저해 분석에서 IC50보다 적어도 50-배 낮으면, 다른 수용체에 비하여 특정 수용체를 "선별적으로 저해한다." "선별성 비율"은 특정 수용체의 IC50으로 나눗셈된 참조물 수용체의 IC50이다. 항체, 이들의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 단백질은 cAMP 분석, 예를 들면, 본 명세서 실시예 4에서 기술된 바와 같은 cAMP 저해 분석에서 이러한 항체, 이들의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 단백질의 IC50이 인간 AM1, AM2 또는 아밀린 수용체 (가령, AMY1)의 저해 분석에서 동일한 항체, 이들의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 단백질의 IC50보다 적어도 50-배 낮으면, 인간 CGRP 수용체를 선별적으로 저해한다. 무제한적 실례로써, hCGRP R의 cAMP 분석에서 특정 항-CGRP R 항체의 IC50이 예로써, 0.1 nM 내지 20 nM이고, 그리고 hAM1, hAM2 또는 인간 AMY1 수용체의 cAMP 분석에서 동일한 항체의 IC50이 1000 nM 또는 그 이상이면, 상기 항체는 hCGRP 수용체를 선별적으로 저해한다. 특정 수용체를 선별적으로 저해하는 항원 결합 단백질은 또한, 상기 수용체에 대하여 중화 항원 결합 단백질인 것으로 이해된다.
"항원 결합 영역"은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질, 또는 단백질의 일부분을 의미한다. 가령, 항원과 상호작용하고 상기 항원에 대한 특이성과 친화성을 항원 결합 단백질에 공여하는 아미노산 잔기를 보유하는 항원 결합 단백질의 일부분은 "항원 결합 영역"으로 지칭된다. 항원 결합 영역은 전형적으로, 하나 이상의 "상보성 결합 영역" ("CDR")을 포함한다. 일정한 항원 결합 영역은 또한, 하나 이상의 "골격" 영역을 포함한다. "CDR"은 항원 결합 특이성과 친화성의 원인이 되는 아미노산 서열이다, "골격" 영역은 이들 CDR의 적절한 배좌 (conformation)를 유지하는데 도움을 주고 항원 결합 영역과 항원 사이에 결합을 촉진할 수 있다.
일정한 측면에서, CGRP R 단백질, 또는 인간 CGRP R에 결합하는 재조합 항원 결합 단백질이 제시된다. 이러한 배경에서, "재조합 단백질"은 재조합 기술을 이용하여, 다시 말하면, 본 명세서에서 제시된 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통하여 만들어진 단백질이다. 재조합 단백질의 생산을 위한 방법과 기술은 당분야에 널리 공지되어 있다.
용어 "항체"는 임의의 아이소타입의 본래 면역글로불린, 또는 표적 항원에 특이적인 결합에 대하여 본래 항체와 경쟁할 수 있는 이들의 항원 결합 단편을 지칭하고, 그리고 예로써, 키메라, 인간화, 완전한 인간, 그리고 이중특이적 항체를 포함한다. 따라서 "항체"는 일종의 항원 결합 단백질이다. 본래 항체는 일반적으로, 적어도 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하지만, 일부 경우에 단지 중쇄만을 포함하는 카멜리드 (camelid)에서 자연적으로 발생하는 항체와 같이 더욱 작은 사슬을 포함할 수도 있다. 항체는 단일 출처로부터 단독으로 유래되거나, 또는 "키메라"일 수 있다, 다시 말하면, 항체의 서로 다른 부분이 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이 2개의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체, 또는 결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 본래 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 하이브리도마에서 생산될 수 있다. 달리 지시되지 않으면, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체 이외에, 이들의 유도체, 변이체, 단편, 그리고 돌연변이를 포함하고, 이들의 실례는 하기에 기술된다.
용어 "경쇄"는 결합 특이성을 공여할 만큼 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, VL, 그리고 불변 영역 도메인, CL을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 상기 폴리펩티드의 아미노-말단에 존재한다. 경쇄는 카파 사슬과 람다 사슬을 포함한다.
용어 "중쇄"는 결합 특이성을 공여할 만큼 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, VH, 그리고 3개의 불변 영역 도메인, CH1, CH2, 그리고 CH3을 포함한다. VH 도메인은 상기 폴리펩티드의 아미노-말단에 존재하고, 그리고 CH 도메인은 카르복실-말단에 존재하고, CH3이 상기 폴리펩티드의 카르복시-말단에 가장 가깝게 위치한다. 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3과 IgG4 아류형 포함), IgA (IgA1과 IgA2 아류형 포함), IgM과 IgE를 비롯한 임의의 아이소타입일 수 있다.
용어 "신호 서열", "리더 서열" 또는 "신호 펩티드"는 단백질의 수송을 주동하는 짧은 (3-60개 아미노산 길이) 펩티드 사슬을 지칭한다. 신호 펩티드는 또한, 표적화 신호, 신호 서열, 운반 펩티드, 또는 국지화 신호로 불린다. 일부 신호 펩티드는 단백질이 수송된 이후에 신호 펩티다아제 (signal peptidase)에 의해 단백질로부터 제거되고, 따라서 단백질 (가령, 본 명세서에서 제시된 바와 같은 항원 결합 단백질)의 생물학적 활성 형태는 절단된 더욱 짧은 형태이다. 따라서 항체가 특정한 확인된 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 갖는 것으로 특징되는 "중쇄…을 포함하는 항체", "경쇄…을 포함하는 항체"등과 같은 용어는 특정한 확인된 서열을 갖는 항체, 신호 서열이 다른 신호 서열로 대체되는 점을 제외하고 특정한 확인된 서열을 갖는 항체, 그리고 임의의 신호 서열이 없는 확인된 서열을 갖는 항체를 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서, 항체 또는 면역글로불린 사슬 (중쇄 또는 경쇄)의 용어 "항원 결합 단편" (또는 단순하게 "단편")은 전장 사슬 내에 존재하는 아미노산 중에서 적어도 일부가 부족하지만 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 일부분 (상기 부분이 어떻게 획득되거나 합성되는 지에 상관없이)을 포함한다. 이런 단편은 그들이 표적 항원에 특이적으로 결합하고, 그리고 소정의 에피토프에 특이적인 결합에 대하여 본래 항체를 비롯한 다른 항원 결합 단백질과 경쟁할 수 있다는 점에서 생물학적으로 활동성이다. 한 측면에서, 이런 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄 내에 존재하는 적어도 하나의 CDR을 유지할 것이고, 그리고 일부 구체예에서, 단일 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 일부분을 포함할 것이다. 이들 생물학적 활성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나, 또는 본래 항체를 비롯한 항원 결합 단백질의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 면역학적으로 기능적 면역글로불린 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체와 단일-사슬 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 그리고 이들은 인간, 생쥐, 쥐, 카멜리드 또는 토끼가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 포유동물 출처로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질의 기능적 일부분, 예를 들면, 하나 이상의 CDR은 체내에서 특정 표적을 지향하거나, 이중기능적 치료 특성을 소유하거나, 또는 연장된 혈청 반감기를 갖는 치료제를 산출하기 위하여 두 번째 단백질 또는 소형 분자에 공유 결합될 수 있는 것으로 더욱 고려된다.
"Fab 단편"은 1개의 경쇄, 그리고 1개의 중쇄의 CH1과 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1과 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 보유한다. 이들 2개의 중쇄 단편은 2개 또는 그 이상의 이황화 결합에 의해, 그리고 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 서로 묶여진다.
"Fab' 단편"은 1개의 경쇄, 그리고 VH 도메인과 CH1 도메인 및 CH1과 CH2 도메인 사이에 영역을 보유하는 1개의 중쇄의 일부분을 보유하고, 따라서 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 사슬간 이황화 결합이 형성되어 F(ab')2 분자가 형성될 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄, 그리고 CH1과 CH2 도메인 사이에 불변 영역의 일부분을 보유하는 2개의 중쇄를 보유하고, 따라서 2개의 중쇄 사이에 사슬간 이황화 결합이 형성된다. 따라서 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이에 이황화 결합에 의해 서로 묶여지는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
"Fv 영역"은 중쇄와 경쇄 둘 모두로부터 가변 영역을 포함하지만 불변 영역이 결핍된다.
"단일-사슬 항체"는 중쇄와 경쇄 가변 영역이 유연성 링커에 의해 연결되어 단일 폴리펩티드 사슬이 형성되고, 상기 사슬이 항원-결합 영역을 형성하는 Fv 분자이다. 단일 사슬 항체는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 88/01649 및 미국 특허 No. 4,946,778과 No. 5,260,203에서 상세하게 논의되고, 이들의 내용은 참조로서 편입된다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 포함하는 면역학적으로 기능적 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2개 또는 그 이상의 VH 영역이 펩티드 링커로 공유 결합되어 이가 도메인 항체가 산출된다. 이가 도메인 항체의 2개의 VH 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
"이가 항원 결합 단백질" 또는 "이가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 이들 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 이가 항원 결합 단백질 및 이가 항체는 이중특이적일 수 있다 (하기 참조).
"다중특이적 항원 결합 단백질" 또는 "다중특이적 항체"는 하나 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 항체이다.
"이중특이적," "이중-특이적" 또는 "이중기능적" 항원 결합 단백질 또는 항체는 각각, 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이중특이적 항원 결합 단백질과 항체는 일종의 다중특이적 항원 결합 단백질 또는 다중특이적 항체이고, 그리고 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다 (참조: Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin . Exp . Immunol . 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol . 148:1547-1553). 이중특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 이들 2개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적 상에 존재하는 2개의 서로 다른 에피토프에 결합할 것이다.
용어 "중화 항원 결합 단백질" 또는 "중화 항체"는 각각, 리간드에 결합하고, 결합 상대에 상기 리간드의 결합을 예방하고, 그리고 만약 그렇지 않으면 결합 상대에 리간드 결합에 기인하는 생물학적 반응을 방해하는 항원 결합 단백질 또는 항체를 지칭한다. 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 면역학적으로 기능적 항원 결합 단편의 결합과 특이성 평가에서, 항체 또는 단편은 과량의 항체가 리간드에 결합된 결합 상대의 양을 적어도 대략 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상 (in vitro 경쟁적 결합 분석에서 측정되는 경우에) 감소시킬 때, 결합 상대에 리간드의 결합을 실질적으로 저해할 것이다. CGRP R 결합 단백질의 경우에, 이런 중화 분자는 CGRP에 결합하는 CGRP R의 능력을 점감시킬 것이다.
표적 항원 상에서 동일한 영역에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질의 배경에서 이용될 때 용어 "경쟁한다"는 조사 중인 항원 결합 단백질 (가령, 항체 또는 이의 면역학적으로 기능적 항원 결합 단편)이 공통 항원 (가령, CGRP R 또는 이들의 항원 결합 단편)에 참조물 항원 결합 단백질 (가령, 리간드, 또는 참조물 항체)의 특이적인 결합을 예방하거나 저해하는 분석에 의해, 항원 결합 단백질 사이에 경쟁이 결정된다는 것을 의미한다. 임의의 다양한 경쟁적 결합 분석법, 예를 들면, 고형 상 직접 또는 간접 방사성면역분석법 (RIA), 고형 상 직접 또는 간접 효소 면역분석법 (EIA), 샌드위치 경쟁 분석법 (참조: Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); 고형 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (참조: Kirkland et al., 1986, J. Immunol . 137:3614-3619); 고형 상 직접 표지된 분석법, 고형 상 직접 표지된 샌드위치 분석법 (참조: Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); I-125 라벨을 이용한 고형 상 직접 라벨 RIA (참조: Morel et al., 1988, Molec . Immunol . 25:7-15); 고형 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (참조: Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); 그리고 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand . J. Immunol . 32:77-82)가 이용될 수 있다. 이런 분석은 표지되지 않은 검사 항원 결합 단백질 및 표지된 참조물 항원 결합 단백질 중에서 어느 한쪽을 보유하는 고형 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 이용을 수반할 수 있다. 경쟁적 저해는 검사 항원 결합 단백질의 존재에서 고형 표면 또는 세포에 결합된 라벨의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다. 경쟁 분석법에 의해 확인된 항원 결합 단백질 (경쟁하는 항원 결합 단백질)에는 참조물 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질, 그리고 입체 장애 (steric hindrance)가 발생할 만큼 참조물 항원 결합 단백질에 의해 결합된 에피토프에 충분히 가까운 인접 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질이 포함된다. 일반적으로, 경쟁하는 항원 결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 이는 공통 항원에 참조물 항원 결합 단백질의 특이적인 결합을 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 저해할 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 또는 그 이상 저해된다. 경쟁적 저해는 또한, 참조물 항원 결합 단백질을 기질 (substrate), 예를 들면, "센서 칩"에 고정시키고, 참조물 항체에 결합을 통해 상기 기질 상에서 항원을 포획하고, 그리고 상이한 항원 결합 단백질 (경쟁하는 항원 결합 단백질)이 상기 항원에 추가적으로 결합할 수 있는 지를 분석함으로써 측정될 수 있다. 후자 경쟁적 결합 분석법의 실례는 Biacore 분석을 이용하고, 그리고 본 명세서 실시예 7에서 기술된다.
용어 "항원" 또는 "면역원"은 선별적인 결합제, 예를 들면, 항원 결합 단백질 (예로써, 항체 또는 이의 면역학적으로 기능적 항원 결합 단편 포함)에 의해 결합될 수 있고, 또한 상기 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위하여 동물에서 이용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 지칭한다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 보유할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질 (가령, 항체)에 의해 결합되는 분자의 일부분이다. 상기 용어는 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자를 포함한다. 에피토프는 연속적 또는 비-연속적일 수 있다 (가령, (i) 단일-사슬 폴리펩티드에서, 폴리펩티드 서열 내에서 서로 연속적이지 않지만 분자의 배경에서 그러한 아미노산 잔기가 항원 결합 단백질에 의해 결합되거나, 또는 (ii) 다중결합 수용체, 예를 들면, 2개 또는 그 이상의 개별 성분, 예를 들면, RAMP1과 CRLR을 포함하는 CGRP R에서, 2개 또는 그 이상의 개별 성분 상에 존재하지만 다중결합 수용체의 배경에서 그러한 아미노산 잔기가 항원 결합 단백질에 의해 결합된다). 일정한 구체예에서, 에피토프는 그들이 항원 결합 단백질을 산출하는데 이용되는 에피토프와 유사한 3차원 구조를 포함하지만, 이러한 항원 결합 단백질을 산출하는데 이용되는 에피토프에서 관찰되지 않는 아미노산 잔기를 포함하지 않거나 일부만 포함한다는 점에서, 모방체일 수 있다. 가장 빈번하게는, 에피토프는 단백질 상에 존재하지만, 일부 경우에 다른 종류의 분자, 예를 들면, 핵산 상에 존재할 수 있다. 에피토프 결정인자는 분자, 예를 들면, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 기의 화학적 활성 표면 그룹을 포함할 수 있고, 그리고 특정한 3차원 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 내에서 표적 항원 상에 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
용어 "동일성"은 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정되는, 2개 또는 그 이상의 폴리펩티드 분자, 또는 2개 또는 그 이상의 핵산 분자의 서열 사이에 관계를 지칭한다. "동일성 비율"은 비교되는 분자 내에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이에 동일한 잔기의 비율을 의미하고, 그리고 비교되는 분자 중에서 최소의 크기에 기초하여 계산된다. 이들 계산을 위하여, 정렬 내에 갭 (존재하면)이 특정 수학 모형 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 처리되어야 한다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하는데 이용될 수 있는 방법에는 Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, PartI, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073에서 기술된 것들이 포함된다.
동일성 비율을 계산할 때, 비교되는 서열은 서열 사이에 최대 정합 (match)을 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성 비율을 결정하는데 이용되는 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지인데, 여기에는 GAP (Devereux et al., 1984, Nucl . Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)가 포함된다. 컴퓨터 프로그램 GAP은 서열 동일성 비율이 결정되는 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬하는데 이용된다. 이들 서열은 그들의 개별 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적 정합 (상기 알고리즘에 의한 결정에서 "정합된 전장 (matched span)")을 위하여 정렬된다. 갭 개방 페널티 (gap opening penalty) (이는 3x 평균 항 (average diagonal)으로서 계산되고, 여기서 "평균 항 (average diagonal)"은 이용되는 비교 매트릭스 (comparison matrix)의 항의 평균이다; "항"은 특정 비교 매트릭스에 의한 각각의 완전한 아미노산 정합에 배정된 스코어 또는 숫자이다) 및 갭 확장 페널티 (gap extension penalty) (이는 통상적으로, 갭 개방 페널티의 1/10배이다), 그리고 비교 매트릭스, 예를 들면, PAM 250 또는 BLOSUM 62가 상기 알고리즘과 함께 이용된다. 일정한 구체예에서, 표준 비교 매트릭스 (참조: PAM 250 비교 매트릭스의 경우에 Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352; BLOSUM 62 비교 매트릭스의 경우에 Henikoff et al.,1992, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 89:10915-10919) 역시 상기 알고리즘에 의해 이용된다.
GAP 프로그램을 이용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 비율을 결정하기 위한 권장되는 파라미터는 아래와 같다:
알고리즘: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;
비교 매트릭스: BLOSUM 62 (Henikoff et al., 1992, supra);
갭 페널티: 12 (하지만, 단부 갭에 대한 페널티 없음)
갭 길이 페널티: 4
유사성 역치: 0
2개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 일정한 정렬 설계는 이들 2개의 서열의 짧은 영역의 정합만을 산출할 수 있고, 그리고 비록 이들 2개의 전장 서열 사이에 유의한 관계가 없긴 하지만, 이러한 작은 정렬된 영역은 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서 선택된 정렬 방법 (GAP 프로그램)은 표적 폴리펩티드의 적어도 50개 연속적 아미노산에 걸쳐있는 정렬을 산출하기 위하여 이와 같이 요구되면 조정될 수 있다.
본 명세서에서, "실질적으로 순수한"은 기술된 종류의 분자가 존재하는 우세한 종류라는 것을 의미한다, 다시 말하면, 몰 기초에서, 이는 동일한 혼합물 내에서 임의의 다른 개별 종류보다 더욱 풍부하다. 일정한 구체예에서, 실질적으로 순수한 분자는 목적 종류가 존재하는 모든 거대분자 종류 중에서 적어도 50% (몰 기초에서)를 포함하는 조성물이다. 다른 구체예에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 내에 존재하는 모든 거대분자 종류 중에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%를 포함할 것이다. 다른 구체예에서, 목적 종류는 오염 종류가 전통적인 검출 방법에 의해 조성물 내에서 검출될 수 없고, 따라서 상기 조성물이 단일한 검출가능 거대분자 종류로 구성되는 본질적인 균질성 수준까지 정제된다.
용어 "치료하는"은 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터, 예를 들면, 증상 감소; 완화; 증상의 점감, 또는 손상, 병리 또는 장애를 환자에게 더욱 관용될 수 있도록 만듦; 변성 또는 감퇴의 속도 지연; 변성의 종점에서 덜 쇠약하게 만듦; 환자의 신체적 또는 정신적 복지 향상을 비롯한 손상, 병리 또는 장애의 치료 또는 개선에서 성공의 표시를 지칭한다. 증상의 치료 또는 개선은 신체 검사, 신경정신병적 검사 및/또는 정신병적 평가의 결과를 비롯한 객관적 또는 주관적 파라미터에 기초될 수 있다. 가령, 본 명세서에서 제공된 일정한 방법은 예방적으로 또는 단기 치료제로서 편두통을 성공적으로 치료하고, 편두통의 빈도를 감소시키고, 편두통의 심각도를 감소시키고 및/또는 편두통과 연관된 증상을 개선한다.
"효과량"은 일반적으로, 증상의 심각도 및/또는 빈도를 감소시키고, 증상 및/또는 근원적 원인을 제거하고, 증상 및/또는 이들의 근원적 원인의 발생을 예방하고 및/또는 편두통에 기인하거나 편두통과 연관된 손상을 향상시키거나 치료할 만큼 충분한 양을 지칭한다. 일부 구체예에서, 효과량은 치료 효과량 또는 예방 효과량이다. "치료 효과량"은 질환 상태 (가령, 편두통) 또는 증상, 특히 이러한 질환 상태와 연관된 상태 또는 증상을 치료하거나, 또는 임의의 방식으로, 이러한 질환 상태 또는 상기 질환과 연관된 임의의 다른 바람직하지 않은 증상을 예방하거나, 방해하거나, 지체시키거나, 또는 이의 진행을 반전시킬 만큼 충분한 양이다. "예방 효과량"은 개체에 투여될 때, 의도된 예방적 효과를 갖는, 예를 들면, 편두통의 발병 (또는 재발)을 예방하거나 지연시키고, 또는 편두통 또는 편두통 증상의 발생 (또는 재발)의 가능성을 감소시키는 제약학적 조성물의 양이다. 완전한 치료적 또는 예방적 효과는 1회 복용량의 투여에 의해 반드시 나타나지는 않고, 그리고 일련의 복용량의 투여 이후에만 나타날 수 있다. 따라서 치료 또는 예방 효과량은 1회 이상의 투여 동안 투여될 수 있다.
"아미노산"은 당분야에서 이의 정상적인 의미를 포함한다. 20개 자연-발생 아미노산 및 이들의 약어는 전통적인 어법을 따른다 (참조: Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991), 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 20개의 전통적인 아미노산의 입체이성질체 (가령, D-아미노산), 비-자연 아미노산, 예를 들면, α-,α-이중치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 그리고 다른 비-전통적인 아미노산 역시 폴리펩티드를 위한 적절한 성분일 수 있고, 그리고 구(句) "아미노산"에 포함된다. 비-전통적인 아미노산의 실례에는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 그리고 기타 유사한 아미노산과 이미노산 (가령, 4-히드록시프롤린)이 포함된다. 본 명세서에서 이용된 폴리펩티드 표시법에서, 표준 관례와 협정에 따라서, 왼손 방향은 아미노-말단 방향이고, 그리고 오른손 방향은 카르복실-말단 방향이다.
전반적인 개관
인간 CGRP R (hCGRP R) 단백질을 비롯한 CGRP R 단백질에 결합하는 항원-결합 단백질이 본 명세서에서 제시된다. 제시된 항원 결합 단백질은 본 명세서에서 제시된 바와 같이, 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)이 끼워 넣어지고 및/또는 결합되는 폴리펩티드이다. 일부 항원 결합 단백질에서, CDR이 "골격" 영역 내로 끼워 넣어지고, 상기 영역은 이들 CDR의 적절한 항원 결합 특성이 달성되도록 이들 CDR을 바른 위치에 놓는다. 일반적으로, 제시되는 항원 결합 단백질은 CGRP와 CGRP R 사이에 상호작용을 간섭하거나, 차단하거나, 감소시키거나, 또는 조정할 수 있다.
본 명세서에서 제시된 일정한 항원 결합 단백질은 항체이거나, 또는 항체로부터 유래된다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질의 폴리펩티드 구조는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (본 명세서에서, 때때로 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (본 명세서에서, 때때로 "항체 접합체"로 지칭됨), 그리고 이들의 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 항체에 기초된다. 다양한 구조가 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질은 CGRP R, 특히 인간 CGRP R에 결합하는 것으로 증명되었다. 하기 실시예에서 더욱 기술된 바와 같이, 일정한 항원 결합 단백질이 조사되었고, 그리고 CGRP R의 성분 중에서 한 가지 또는 나머지에 대한 다수의 다른 항체에 의해 결합된 것들과 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 제시된 항원 결합 단백질은 CGRP와 경쟁하고, 따라서 CGRP가 그의 수용체에 결합하는 것을 예방한다. 결과적으로, 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질은 CGRP R 활성을 저해할 수 있다. 특히, 이들 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질은 아래의 활성 중에서 한 가지 이상을 가질 수 있다: 특히, CGRP R 신호 전달 경로의 유도 저해, 혈관확장 저해, 혈관수축 유도, 염증, 예를 들면, 신경성 염증, 그리고 CGRP 결합 시에 CGRP R에 의해 유도되는 다른 생리학적 효과 감소.
본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질은 다양한 유용성을 갖는다. 가령, 이들 항원 결합 단백질 중에서 일부는 특이적인 결합 분석법, CGRP R, 특히 hCGRP R 또는 이의 리간드의 친화성 정제, 그리고 CGRP R 활성의 다른 길항약을 확인하는 스크리닝 분석법에서 유용하다. 이들 항원-결합 단백질 중에서 일부는 CGRP R에 CGRP의 결합을 저해하는데 유용하다.
이들 항원-결합 단백질은 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 다양한 치료 적용에 이용될 수 있다. 가령, 일정한 CGRP R 항원-결합 단백질은 CGRP R 매개된 신호전달과 연관된 장애를 치료하는, 예를 들면, 편두통의 빈도 및/또는 심각도를 감소, 완화 또는 치료하는, 군발성 두통을 감소, 완화 또는 치료하는, 만성 통증을 감소, 완화 또는 치료하는, 당뇨병 (유형 II)을 완화 또는 치료하는, 심혈관 질환을 감소, 완화 또는 치료하는, 그리고 환자에서 내독소혈증 및 패혈증과 연관된 혈류 장애를 감소, 완화 또는 치료하는데 유용하다. 이들 항원 결합 단백질의 다른 용도에는 예로써, CGRP R-연관된 질환 또는 장애의 진단, 그리고 CGRP R의 존재 또는 부재를 결정하는 스크리닝 분석법이 포함된다. 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질 중에서 일부는 CGRP R 활성과 연관된 결과, 증상 및/또는 병리를 치료하는데 유용하다. 이들에는 다양한 유형의 편두통이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
CGRP 수용체
본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질은 CGRP R, 특히 인간 CGRP R에 결합한다. CGRP R은 CRLR과 RAMP1을 모두 포함하는 다합체 (multimer)이다. 인간 CRLR의 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에서 서열 번호 1로서 제공된다. 인간 CRLR의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 2로서 제공된다. 인간 RAMP1의 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에서 서열 번호 3으로서 제공된다. 인간 RAMP1의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 4로서 제공된다. 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질은 CRLR과 RAMP1의 세포외 부분을 포함하는, CGRP R의 세포외 부분에의 결합한다. 인간 CRLR의 예시적인 세포외 도메인 ("ECD")은 서열 번호 5로서 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고, 그리고 서열 번호 6으로서 제공된 아미노산 서열을 갖는다. 상기 서열은 신호 펩티드를 포함한다; 예시적인 성숙 (신호 펩티드 없음) CRLR ECD는 서열 번호 10으로서 제공된 아미노산 서열을 갖는다. 인간 RAMP1의 예시적인 ECD는 서열 번호 7로서 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고, 그리고 서열 번호 8로서 제공된 아미노산 서열을 갖는다. 상기 서열은 신호 펩티드를 포함한다; 예시적인 성숙 (신호 펩티드 없음) RAMP1 ECD는 서열 번호 11로서 제공된 아미노산 서열을 갖는다. 하기에 기술된 바와 같이, CGRP R 단백질은 또한, 단편을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 이들 용어는 수용체, 특히 달리 명시되지 않으면, CGRP에 특이적으로 결합하는 인간 수용체를 의미하는 동의어로서 이용된다.
용어 CGRP R은 또한, CGRP R 아미노산 서열, 예를 들면, 가능한 N-연결된 당화 부위의 번역후 변형을 포함한다. 따라서 항원 결합 단백질은 이들 위치 중에서 하나 이상에서 당화된 단백질에 결합하거나, 또는 이들로부터 산출될 수 있다.
CGRP 수용체 결합 단백질
CGRP R의 활성을 조절하는데 유용한 다양한 선별적인 결합제가 제시된다. 이들 작용제에는 예로써, 항원 결합 도메인 (가령, 단일 사슬 항체, 도메인 항체, 면역접합체 (immunoadhesion), 그리고 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드)을 보유하고 CGRP R, 특히 인간 CGRP R에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이 포함된다. 이들 작용제 중에서 일부는 예로써, CGRP R에 CGRP의 결합을 저해하는데 유용하고, 따라서 CGRP R 신호전달과 연관된 한 가지 이상의 활성을 저해하거나, 간섭하거나, 또는 조정하는데 이용될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질은 전형적으로, 본 명세서에서 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR (가령, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)을 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 (a) 폴리펩티드 구조 및 (b) 이러한 폴리펩티드 구조 내로 삽입되고 및/또는 이러한 폴리펩티드 구조에 결합되는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 폴리펩티드 구조는 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 가령, 이는 자연-발생 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체의 골격이거나, 또는 이러한 골격을 포함할 수 있고, 또는 사실상 완전히 합성일 수 있다. 다양한 폴리펩티드 구조의 실례는 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질의 폴리펩티드 구조는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (본 명세서에서, 때때로 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 융합체 (본 명세서에서, 때때로 "항체 접합체"로 지칭됨), 그리고 이들 각각의 일부분 또는 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 항체이거나, 또는 항체로부터 유래된다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 항체의 면역학적 단편 (가령, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv)이다. 이들 다양한 구조는 본 명세서에서 더욱 기술되고 정의된다.
본 명세서에서 제시된 일정한 항원 결합 단백질은 인간 CGRP R에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 CRLR 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 인간 RAMP1을 포함하는 인간 CGRP R 단백질에 특이적으로 결합한다.
항원 결합 단백질이 치료적 적용에 이용되는 구체예에서, 항원 결합 단백질은 CGRP R의 한 가지 이상의 생물학적 활성을 저해하거나, 간섭하거나, 또는 조정할 수 있다. 이러한 경우에, 항원 결합 단백질은 특이적으로 결합하고 및/또는 CGRP에 인간 CGRP R의 결합을 실질적으로 저해하고, 이때 과량의 항체가 CGRP에 결합된 인간 CGRP R, 또는 그 반대의 양을 적어도 대략 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상 (가령, in vitro 경쟁적 결합 분석에서 결합을 측정함으로써) 감소시킨다.
자연-발생 항체 구조
본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질 중에서 일부는 전형적으로, 자연-발생 항체와 연관된 구조를 갖는다. 이들 항체의 구조 단위 (structural unit)는 전형적으로, 하나 이상의 사합체 (tetramer)를 포함하고, 이들 각각은 비록 일부 포유동물 종이 단일 중쇄만을 갖는 항체 역시 생산하긴 하지만, 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 한 쌍으로 구성된다. 전형적인 항체에서, 각각의 한 쌍은 1개의 전장 "경쇄" (일정한 구체예에서, 대략 25 kDa) 및 1개의 전장 "중쇄" (일정한 구체예에서, 대략 50-70 kDa)를 포함한다. 각각의 개별 면역글로불린 사슬은 여러 "면역글로불린 도메인"으로 구성되고, 이들 각각은 대충 90개 내지 110개의 아미노산으로 구성되고 특징적인 접힘 패턴 (folding pattern)을 나타낸다. 이들 도메인은 항체 폴리펩티드를 구성하는 기본 단위이다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 전형적으로, 항원 인식을 책임지는 가변 도메인을 포함한다. 카르복시-말단 부분은 상기 사슬의 다른 단부보다 진화적으로 더욱 보존되고, 그리고 "불변 영역" 또는 "C 영역"으로 지칭된다. 인간 경쇄는 일반적으로, 카파와 람다 경쇄로 분류되고, 그리고 이들 각각은 1개의 가변 도메인 및 1개의 불변 도메인을 보유한다. 중쇄는 전형적으로, 뮤 (mu), 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론 사슬로 분류되고, 그리고 이들은 항체의 아이소타입을 각각, IgM, IgD, IgG, IgA, 그리고 IgE로서 규정짓는다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 그리고 IgG4가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 여러 아류형을 갖는다. IgM 아류형에는 IgM1, 그리고 IgM2가 포함된다. IgA 아류형에는 IgA1과 IgA2가 포함된다. 인간에서, IgA와 IgD 아이소타입은 4개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 보유한다; IgG와 IgE 아이소타입은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 보유한다; 그리고 IgM 아이소타입은 5개의 중쇄 및 5개의 경쇄를 보유한다. 중쇄 C 영역은 전형적으로, 작동체 (effector) 기능을 책임지는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 중쇄 불변 영역 도메인의 숫자는 아이소타입에 좌우될 것이다. IgG 중쇄는 각각, 예로써 CH1, CH2와 CH3으로 알려져 있는 3개의 C 영역 도메인을 보유한다. 본 명세서에서 제시된 항체는 이들 아이소타입과 아류형 중에서 한 가지를 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, CGRP R 항체는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 아류형이다.
전장 경쇄와 중쇄에서, 가변과 불변 영역은 대략 12개 또는 그 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되고, 그리고 중쇄는 대략 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 또한 포함한다 (참조: Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로, 항원 결합 부위를 형성한다.
예시적인 CGRP R 단일클론 항체의 IgG2 중쇄 불변 도메인의 한 가지 실례는 아래의 아미노산 서열을 갖는다:
STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (상기 서열의 마지막 326개 잔기는 SEQ. ID NO:29로서 제시된다).
예시적인 CGRP R 단일클론 항체의 카파 경쇄 불변 도메인의 한 가지 실례는 아래의 아미노산 서열을 갖는다:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (상기 서열의 마지막 107개 잔기는 서열 번호 14로서 제시된다).
면역글로불린 사슬의 가변 영역은 일반적으로, "상보성 결정 영역" 또는 CDR으로 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 결합된 상대적으로 보존된 골격 영역 (FR)을 포함하는 동일한 전체 구조를 나타낸다, 앞서 언급된 각 중쇄/경쇄 쌍의 2개의 사슬로부터 CDR은 전형적으로, 골격 영역에 의해 정렬되어, 표적 단백질 (가령, CGRP R) 상에서 특정 에피토프와 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. N-말단에서 C-말단으로, 자연-발생 경쇄와 중쇄 가변 영역 둘 모두 전형적으로, 이들 요소의 아래의 순서를 따른다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3과 FR4. 이들 각 도메인 내에서 위치를 점유하는 아미노산에 번호를 지정하기 위한 넘버링 시스템이 고안되었다. 이러한 넘버링 시스템은 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD), 또는 Chothia & Lesk,J . Mol . Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883에서 규정된다.
본 명세서에서 제시된 다양한 중쇄와 경쇄 가변 영역은 표 3에서 서술된다. 이들 각 가변 영역은 상기 중쇄와 경쇄 불변 영역에 부착되어 각각, 완전한 항체 중쇄와 경쇄를 형성할 수 있다. 게다가, 이렇게 산출된 중쇄와 경쇄 서열 각각은 결합되어 완전한 항체 구조를 형성할 수 있다. 본 명세서에서 제시된 중쇄와 경쇄 가변 영역은 또한, 앞서 열거된 예시적인 서열과 상이한 서열을 갖는 다른 불변 도메인에 부착될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 제시된 항체의 전장 경쇄와 중쇄 중에서 일부, 그리고 이들의 상응하는 아미노산 서열의 특정한 실례는 표 2A와 2B에 요약된다. 표 2A에서는 예시적인 경쇄 서열을 제시하고, 그리고 표 2B에서는 예시적인 중쇄 서열을 제시한다.
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32H7과 32H7 CS를 제외하고, 표 2A에서 각 경쇄 서열의 첫 22개 아미노산은 신호 서열이다. 32H7와 32H7 CS의 경우에, 신호 서열은 20개 아미노산이다. 유사하게, 표 2B에서 각 중쇄 서열의 첫 22개 아미노산은 신호 서열이다. 신호 펩티드는 예로써, 일정한 숙주 세포 내에서 더욱 최적의 발현을 위하여, 상이한 서열을 갖는 신호 펩티드로 변경될 수 있다. 이런 이유로, 본 발명은 표 2A와 2B에서 제시된 바와 같은 경쇄 및/또는 중쇄 서열을 갖지만 신호 서열이 상이한 항체 역시 포함하는 것으로 이해될 것이다.
환언하면, 표 2B에 열거된 각각의 예시적인 중쇄 (H1, H2, H3 등)는 표 2A에 제시된 임의의 예시적인 경쇄와 결합되어 항체를 형성할 수 있다. 이런 조합의 실례에는 L1 내지 L17 중에서 한 가지와 결합된 H1; L1 내지 L17 중에서 한 가지와 결합된 H2; L1 내지 L17 중에서 한 가지와 결합된 H3 등이 포함된다. 일부 경우에, 이들 항체는 표 2A와 2B에 열거된 것들로부터 적어도 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 표 2A와 2B에 열거된 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄를 포함한다. 다른 경우에, 이들 항체는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄를 보유한다. 실례로써, 항체 또는 면역학적으로 기능적 단편은 2개의 H1 중쇄 및 2개의 L1 경쇄, 또는 2개의 H2 중쇄 및 2개의 L2 경쇄, 또는 2개의 H3 중쇄 및 2개의 L3 경쇄, 그리고 표 2A와 2B에 열거된 바와 같은 경쇄의 쌍 및 중쇄의 쌍의 다른 유사한 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제시된 다른 항원 결합 단백질은 표 2A와 2B에 제시된 중쇄와 경쇄의 조합에 의해 형성된 항체의 변이체이고, 그리고 이들 사슬의 아미노산 서열에 각각 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함한다. 일부 경우에, 이들 항체는 적어도 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함하는 반면, 다른 경우에 이들 변이체 형태는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄를 포함한다.
항체의 가변 도메인
또한, 하기 표 3에서 제시된 바와 같이, VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, 그리고 VH13으로 구성된 군에서 선택되는 항체 중쇄 가변 영역 및/또는 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, 그리고 VL17로 구성된 군에서 선택되는 항체 경쇄 가변 영역, 그리고 이들 경쇄와 중쇄 가변 영역의 면역학적으로 기능적 단편, 유도체, 뮤테인 (mutein)과 변이체를 보유하는 항원 결합 단백질이 제시된다.
다양한 중쇄와 경쇄 가변 영역의 서열 정렬은 각각, 도 1A와 1B에서 제시된다.
이러한 유형의 항원 결합 단백질은 일반적으로, "VHx/ VLy"로 표시될 수 있고, 여기서 "x"는 중쇄 가변 영역의 숫자에 해당하고 "y"는 경쇄 가변 영역의 숫자에 해당한다.
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표 3에 열거된 각각의 중쇄 가변 영역은 표 3에 제시된 임의의 경쇄 가변 영역과 결합되어 항원 결합 단백질을 형성할 수 있다. 이런 조합의 실례에는 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, 또는 VL17 중에서 한 가지와 결합된 VH1; VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, 또는 VL17 중에서 한 가지와 결합된 VH2; VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, 또는 VL17 중에서 한 가지와 결합된 VH3 등이 포함된다.
일부 경우에, 항원 결합 단백질은 표 3에 열거된 것들로부터 적어도 1개의 중쇄 가변 영역 및/또는 1개의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 표 3에 열거된 것들로부터 적어도 2개의 상이한 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이런 항원 결합 단백질의 실례는 (a) 1개의 VH1, 그리고 (b) VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, 또는 VH13 중에서 한 가지를 포함한다. 다른 실례는 (a) 1개의 VH2, 그리고 (b) VH1, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, 또는 VH13 중에서 한 가지를 포함한다. 또 다른 실례는 (a) 1개의 VH3, 그리고 (b) VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, 또는 VH13 중에서 한 가지 등을 포함한다. 이런 항원 결합 단백질의 또 다른 실례는 (a) 1개의 VL1, 그리고 (b) VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, 또는 VL17, VL18, VL19, VL20, 또는 VL21 중에서 한 가지를 포함한다. 이런 항원 결합 단백질의 또 다른 실례는 (a) 1개의 VL2, 그리고 (b) VL1, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, 또는 VL21 중에서 한 가지를 포함한다. 이런 항원 결합 단백질의 또 다른 실례는 (a) 1개의 VL3, 그리고 (b) VL1, VL2, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, 또는 VL21 중에서 한 가지 등을 포함한다.
중쇄 가변 영역의 다양한 조합이 경쇄 가변 영역의 임의의 다양한 조합과 결합될 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다.
다른 경우에, 항원 결합 단백질은 2개의 동일한 경쇄 가변 영역 및/또는 2개의 동일한 중쇄 가변 영역을 보유한다. 실례로써, 항원 결합 단백질은 표 3에 열거된 바와 같은 경쇄 가변 영역의 쌍 및 중쇄 가변 영역의 쌍과 공동으로, 2개의 경쇄 가변 영역 및 2개의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 면역학적으로 기능적 단편일 수 있다.
본 명세서에서 제시된 일부 항원 결합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 잔기에서만, VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, 그리고 VH13으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인의 서열과 상이한 아미노산의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 각각의 이런 서열 차이는 독립적으로, 1개 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환이고, 이들 결실, 삽입 및/또는 치환은 전술한 가변 도메인 서열과 비교하여 15개 이하의 아미노산 변화를 유발한다. 일부 항원 결합 단백질에서 중쇄 가변 영역은 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, 그리고 VH13의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함한다.
일정한 항원 결합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 잔기에서만, VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, 또는 VL17로부터 선택된 경쇄 가변 도메인의 서열과 상이한 아미노산의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 각각의 이런 서열 차이는 독립적으로, 1개 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환이고, 이들 결실, 삽입 및/또는 치환은 전술한 가변 도메인 서열과 비교하여 15개 이하의 아미노산 변화를 유발한다. 일부 항원 결합 단백질에서 경쇄 가변 영역은 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, 또는 VL17의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함한다.
추가의 경우에, 항원 결합 단백질은 경쇄와 중쇄 가변 도메인의 아래의 대합 (pairing)을 포함한다: VL1과 VH1, VL2와 VH2, VL3과 VH3, VL4와 VH4, VL5와 VH5, VL6과 VH1, VL7과 VH6, VL8과 VH5, VL9와 VH1, VL10과 VH7, VL11과 VH8, VL12와 VH9, VL12와 VH10, VL13과 VH5, VL14와 VH11, VL15와 VH12, VL16과 VH13, 그리고 VL17과 VH13. 일부 경우에, 이들 대합에서 항원 결합 단백질은 특정 가변 도메인과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체 또는 면역학적으로 기능적 단편에는 앞서 기술된 바와 같은 변이체 중쇄와 변이체 경쇄의 변이체 형태가 포함된다.
CDR
본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질은 하나 이상의 CDR이 합체되고, 삽입되고 및/또는 결합되는 폴리펩티드이다. 항원 결합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR을 보유할 수 있다. 따라서 항원 결합 단백질은 예로써, 1개의 중쇄 CDR1 ("CDRH1"), 및/또는 1개의 중쇄 CDR2 ("CDRH2"), 및/또는 1개의 중쇄 CDR3 ("CDRH3"), 및/또는 1개의 경쇄 CDR1 ("CDRL1"), 및/또는 1개의 경쇄 CDR2 ("CDRL2"), 및/또는 1개의 경쇄 CDR3 ("CDRL3")을 보유할 수 있다. 일부 항원 결합 단백질은 CDRH3과 CDRL3 둘 모두를 보유한다. 특정한 중쇄와 경쇄 CDR은 각각, 표 4A와 4B에서 확인된다.
소정의 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)과 골격 영역 (FR)은 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991에서 Kabat 등에 의해 기술된 시스템을 이용하여 확인될 수 있다. 본 명세서에서 제시된 일정한 항체는 표 4A (CDRH)와 표 4B (CDRL)에 제공된 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열에 동일하거나, 또는 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
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자연-발생 항체 내에서 CDR의 구조와 특성은 앞서 기술되었다. 간단히 말하면, 전통적인 항체에서, CDR은 중쇄와 경쇄 가변 영역에서 골격 내에 끼워 넣어지고, 여기서 이들은 항원 결합과 인식을 책임지는 영역을 구성한다. 가변 영역은 골격 영역 (Kabat et al., 1991, supra; 그리고 Chothia and Lesk, 1987, supra에 의해 지정된 골격 영역 1-4, FR1, FR2, FR3, 그리고 FR4) 내에 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다 (참조: Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; 그리고 Chothia and Lesk, 1987, J. Mol . Biol . 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883). 하지만, 본 명세서에서 제시된 CDR은 전통적인 항체 구조의 항원 결합 도메인을 정의하는데 이용될 뿐만 아니라, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 다양한 다른 폴리펩티드 구조에 끼워 넣어질 수 있다.
한 측면에서, 본 명세서에서 제시된 CDR은 (A) (i) 서열 번호 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, 그리고 100으로 구성된 군에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 번호 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, 그리고 129로 구성된 군에서 선택되는 CDRH2; (iii) 서열 번호 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, 그리고 123으로 구성된 군에서 선택되는 CDRH3; 그리고 (iv) 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 또는 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개 이하의 아미노산의 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRH로 구성된 군에서 선택되는 CDRH; (B) (i) 서열 번호 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, 그리고 69로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 번호 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, 그리고 70으로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 번호 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, 그리고 72로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3; 그리고 (iv) 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존성 아미노산 치환), 또는 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개 이하의 아미노산의 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRL로 구성된 군에서 선택되는 CDRL이다.
다른 측면에서, 항원 결합 단백질은 표 4A와 4B에 열거된 CDR 중에서 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 변이체 형태를 포함하고, 이들 각각은 표 4A와 4B에 열거된 CDR 서열에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 항원 결합 단백질은 표 4A와 4B에 열거된 CDR 중에서 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개를 포함하고, 이들 각각은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산에 의해, 이들 표에 열거된 CDR과 상이하다.
*또 다른 측면에서, 본 명세서에서 제시된 CDR은 관련된 단일클론 항체의 그룹으로부터 유래된 공통 서열을 포함한다. 본 명세서에서, "공통 서열"은 다수의 서열 간에 공통적인 보존된 아미노산, 그리고 소정의 아미노산 서열 내에서 변하는 가변 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 지칭한다. 제시된 CDR 공통 서열은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2와 CDRL3 각각에 상응하는 CDR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항원 결합 단백질은 CDRL1, CDRL2와 CDRL3의 아래의 조합을 포함한다: 서열 번호 42, 43, 그리고 44; 서열 번호 45, 46, 그리고 47; 서열 번호 48, 49, 그리고 50; 서열 번호 51, 52, 그리고 53; 서열 번호 54, 55, 그리고 56; 서열 번호 57, 58, 그리고 59; 서열 번호 60, 55, 그리고 56; 서열 번호 45, 61, 그리고 47; 서열 번호 62, 63, 그리고 64; 서열 번호 65, 55, 그리고 56; 서열 번호 66, 67, 그리고 68; 서열 번호 69, 70, 그리고 71; 그리고 서열 번호 69, 70, 그리고 72.
추가의 측면에서, 항원 결합 단백질은 CDRH1, CDRH2와 CDRH3의 아래의 조합을 포함한다: 서열 번호 73, 74, 그리고 75; 서열 번호 76, 77, 그리고 78; 서열 번호 79, 80, 그리고 81; 서열 번호 82, 83, 그리고 84; 서열 번호 85, 86, 그리고 87; 서열 번호 88, 89, 그리고 90; 서열 번호 76, 91, 그리고 78; 서열 번호 92, 93, 그리고 94; 서열 번호 76, 95, 그리고 78; 서열 번호 73, 74, 그리고 96; 서열 번호 97, 98, 그리고 99; 그리고 서열 번호 100, 101, 그리고 102.
다른 측면에서, 항원 결합 단백질은 CDRH1, CDRH2와 CDRH3과 함께 CDRL1, CDRL2와 CDRL3의 아래의 조합을 포함한다: 서열 번호 73, 74, 그리고 75와 함께 서열 번호 42, 43, 그리고 44; 서열 번호 76, 77, 그리고 78과 함께 서열 번호 45, 46, 그리고 47; 서열 번호 79, 80, 그리고 81과 함께 서열 번호 48, 49, 그리고 50; 서열 번호 82, 83, 그리고 84와 함께 서열 번호 51, 52, 그리고 53; 서열 번호 85, 86, 그리고 87과 함께 서열 번호 54, 55, 그리고 56; 서열 번호 88, 89, 그리고 90과 함께 서열 번호 57, 58, 그리고 59; 서열 번호 85, 86, 그리고 87과 함께 서열 번호 60, 55, 그리고 56; 서열 번호 76, 91, 그리고 78과 함께 서열 번호 45, 61, 그리고 47; 서열 번호 92, 93, 그리고 94와 함께 서열 번호 62, 63, 그리고 64; 서열 번호 76, 95, 그리고 78과 함께 서열 번호 45, 61, 그리고 47; 서열 번호 85, 86, 그리고 87과 함께 서열 번호 65, 55, 그리고 56; 서열 번호 73, 74, 그리고 96과 함께 서열 번호 42, 43, 그리고 44; 서열 번호 97, 98, 그리고 99와 함께 서열 번호 66, 67, 그리고 68; 서열 번호 100, 101, 그리고 102와 함께 서열 번호 69, 70, 그리고 71; 그리고 서열 번호 100, 101, 그리고 102와 함께 서열 번호 69, 70, 그리고 72.
공통 서열은 항-CGRP R 항체의 VH와 VL에 상응하는 CDR의 표준 종족 분석 (standard phylogenic analysis)을 이용하여 결정되었다. 공통 서열은 VH 또는 VL에 상응하는 동일한 서열 내에서 이들 CDR을 연속적으로 유지함으로써 결정되었다.
도 3A, 3B, 4, 5A, 5B, 5C, 5D와 5E에 예시된 바와 같이, 본 명세서에서 제시된 다양한 항원 결합 단백질의 계통 분석 (lineage analysis)에서, 경쇄 CDR 그룹 K1, K2, K3, 그리고 K4 (도 3A와 3B), 경쇄 CDR 그룹 L1, L2, L3, 그리고 L4 (도 4), 그리고 중쇄 CDR 그룹 HC1 (도 5A), HC2 (도 5B), HC3 (도 5C), HC4 (도 5C), HC5 (도 5D)와 HC6 (도 5E)으로서 명명된 관련된 서열의 그룹이 산출되었다. 상기 그룹 중에서 일부는 경쇄 CDR 그룹 K1,4 (도 3A), K2,3 (도 3B), L1,2,3 (도 4), 그리고 LAll (도 4), 그리고 중쇄 CDR 그룹 HCA와 HCB (도 5F)를 산출하기 위하여, 도 3A, 3B, 4, 그리고 5F에서 예시된 바와 같은 부가적 공통 서열을 산출하는데 이용되었다.
다양한 CDR 영역 그룹의 공통 서열은 하기에 제공된다:
K1 공통
CDR1 RASQGIRX1DLG (서열 번호 103), 여기서 X1은 N과 K로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1ASSLQS (서열 번호 104), 여기서 X1은 A와 G로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 LQYNX1X2PWT (서열 번호 105), 여기서 X1은 I와 S로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X2는 Y와 F로 구성된 군에서 선택된다.
K4 공통
CDR3 QQYGNSLX1R (서열 번호 106), 여기서 X1은 S와 C로 구성된 군에서 선택된다.
K1,4 공통
CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6 (서열 번호 107), 여기서 X1은 S와 G로 구성된 군에서 선택되고, X2는 V와 I로 구성된 군에서 선택되고, X3은 S와 R로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S, N과 K로 구성된 군에서 선택되고, X5는 Y와 D로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X6은 T와 G로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1ASSX2X3X4 (서열 번호 108), 여기서 X1은 G와 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 R과 L로 구성된 군에서 선택되고, X3은 A와 Q로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X4는 T와 S로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7 (서열 번호 109), 여기서 X1은 Q와 L로 구성된 군에서 선택되고, X2는 G와 N으로 구성된 군에서 선택되고, X3은 N과 T로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S, Y와 F로 구성된 군에서 선택되고, X5는 L과 P로 구성된 군에서 선택되고, X6은 C, W와 S로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X7은 R과 T로 구성된 군에서 선택된다.
K3 공통
CDR1 KSSQSLLHSX1GX2X3YLY (서열 번호 110), 여기서 X1은 D와 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 R과 K로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 N과 T로 구성된 군에서 선택된다.
K2,3 공통
CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5 (서열 번호 111), 여기서 X1은 R과 K로 구성된 군에서 선택되고, X2는 F, D와 A로 구성된 군에서 선택되고, X3은 Y, R과 K로 구성된 군에서 선택되고, X4는 N과 T로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X5는 D와 Y로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1X2SNRX3S (서열 번호 112), 여기서 X1은 L과 E로 구성된 군에서 선택되고, X2는 G와 V로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 A와 F로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 MQX1X2X3X4PX5T (서열 번호 113), 여기서 X1은 A와 S로 구성된 군에서 선택되고, X2는 L과 F로 구성된 군에서 선택되고, X3은 Q와 P로 구성된 군에서 선택되고, X4는 T와 L로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X5는 F와 L로 구성된 군에서 선택된다.
Lm3 공통
CDR2 RX1NQRPS (서열 번호 114), 여기서 X1은 N과 S로 구성된 군에서 선택된다.
Lm1 ,2,3 공통
CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3 (서열 번호 115), 여기서 X1은 N과 S로 구성된 군에서 선택되고, X2는 Y와 T로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 S, N과 Y로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1X2NX3RPS (서열 번호 116), 여기서 X1은 D, T와 R로 구성된 군에서 선택되고, X2는 N과 S로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 K와 Q로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3DX4X5LX6X7VV (서열 번호 117), 여기서 X1은 G와 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 T와 A로 구성된 군에서 선택되고, X3은 W와 R로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S와 D로 구성된 군에서 선택되고, X5는 R과 S로 구성된 군에서 선택되고, X6은 S와 N으로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X7은 A와 G로 구성된 군에서 선택된다.
LAll 공통
CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11 (서열 번호 118), 여기서 X1은 S와 Q로 구성된 군에서 선택되고, X2는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, S이고, X3은 S와 D로 구성된 군에서 선택되고, X4는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, N이고, X5는 I와 L로 구성된 군에서 선택되고, X6은 G와 R로 구성된 군에서 선택되고, X7은 N과 S로 구성된 군에서 선택되고, X8은 N과 F로 구성된 군에서 선택되고, X9는 Y와 T로 구성된 군에서 선택되고, X10은 V와 A로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X11은 S, N과 Y로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1X2NX3RPS (서열 번호 119), 여기서 X1은 D, G, T와 R로 구성된 군에서 선택되고, X2는 N, K와 S로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 K, N과 Q로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V (서열 번호 120), 여기서 X1은 G, N과 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 T, S와 A로 구성된 군에서 선택되고, X3은 W와 R로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S와 D로 구성된 군에서 선택되고, X5는 R과 S로 구성된 군에서 선택되고, X6은 L과 V로 구성된 군에서 선택되고, X7은 S, Y와 N으로 구성된 군에서 선택되고, X8은 A, H와 G로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X9는 V와 L로 구성된 군에서 선택된다.
HC1 공통
CDR1 X1YYMX2 (서열 번호 121), 여기서 X1은 G와 D로 구성된 군에서 선택되고, X2는 H와 Y로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 WIX1PNSGGTNYAQKFQG (서열 번호 122), 여기서 X1은 N과 S로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (서열 번호 123), 여기서 X1은 D와 G로 구성된 군에서 선택되고, X2는 Q와 G로 구성된 군에서 선택되고, X3은 M과 Y로 구성된 군에서 선택되고, X4는 I와 G로 구성된 군에서 선택되고, X5는 I와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X6은 M과 A로 구성된 군에서 선택되고, X7은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, L이고, X8은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, R이고, X9는 V와 L로 구성된 군에서 선택되고, X10은 F와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X11은 P와 S로 구성된 군에서 선택되고, X12는 P와 H로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X13은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이다.
HC2 공통
CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (서열 번호 124), 여기서 X1은 K와 T로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X2는 T와 A로 구성된 군에서 선택된다.
HC3 공통
CDR1 X1YX2MX3 (서열 번호 125), 여기서 X1은 T와 S로 구성된 군에서 선택되고, X2는 S와 A로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X3은 N과 S로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG (서열 번호 126), 여기서 X1은 S와 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 S와 G로 구성된 군에서 선택되고, X3은 S와 G로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S와 G로 구성된 군에서 선택되고, X5는 Y와 R로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X6은 R과 T로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV (서열 번호 127), 여기서 X1은 E와 D로 구성된 군에서 선택되고, X2는 G와 Q로 구성된 군에서 선택되고, X3은 V와 R로 구성된 군에서 선택되고, X4는 S와 E로 구성된 군에서 선택되고, X5는 G와 V로 구성된 군에서 선택되고, X6은 S와 G로 구성된 군에서 선택되고, X7은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, S이고, X8은 I와 S로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X9는 S와 G로 구성된 군에서 선택된다.
HC4 공통
CDR1 SX1GMH (서열 번호 128), 여기서 X1은 F와 Y로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG (서열 번호 129), 여기서 X1은 F와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X2는 I와 H로 구성된 군에서 선택되고, X3은 S와 Y로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X4는 V와 A로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V (서열 번호 130), 여기서 X1은 D와 E로 구성된 군에서 선택되고, X2는 L과 K로 구성된 군에서 선택되고, X3은 N과 R로 구성된 군에서 선택되고, X4는 Y와 V로 구성된 군에서 선택되고, X5는 Y와 T로 구성된 군에서 선택되고, X6은 D와 M으로 구성된 군에서 선택되고, X7은 S와 T로 구성된 군에서 선택되고, X8은 G와 L로 구성된 군에서 선택되고, X9는 H와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X10은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이고, X11은 K와 F로 구성된 군에서 선택되고, X12는 M과 L로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X13은 A와 D로 구성된 군에서 선택된다.
HCA 공통
CDR1 X1X2X3MX4 (서열 번호 131), 여기서 X1은 N과 S로 구성된 군에서 선택되고, X2은 A, Y와 F로 구성된 군에서 선택되고, X3은 W, A와 G로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X4는 S와 H로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (서열 번호 132), 여기서 X1은 R, A와 V로 구성된 군에서 선택되고, X2은 K, S와 W로 구성된 군에서 선택되고, X3은 S, G, F와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X4는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, K와 T로 구성된 군에서 선택되고, X5는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, T이고, X6은 D와 S로 구성된 군에서 선택되고, X7은 G와 S로 구성된 군에서 선택되고, X8은 T, R, I, N과 H로 구성된 군에서 선택되고, X9는 T와 K로 구성된 군에서 선택되고, X10은 D와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X11은 Y와 S로 구성된 군에서 선택되고, X12는 T, A와 V로 구성된 군에서 선택되고, X13은 A와 D로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X14는 P와 S로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V (서열 번호 133), 여기서 X1은 D, A와 E로 구성된 군에서 선택되고, X2는 R, Q와 G로 구성된 군에서 선택되고, X3은 T, R, L, G와 K로 구성된 군에서 선택되고, X4는 G, E, N, I와 R로 구성된 군에서 선택되고, X5는 Y, V와 A로 구성된 군에서 선택되고, X6은 S, G, Y, A와 T로 구성된 군에서 선택되고, X7은 I, P, D, A와 M으로 구성된 군에서 선택되고, X8은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, S와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X9는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, W, S와 T로 구성된 군에서 선택되고, X10은 S, G와 L로 구성된 군에서 선택되고, X11은 S, G, L과 Y로 구성된 군에서 선택되고, X12는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, W와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X13은 Y와 H로 구성된 군에서 선택되고, X14는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y와 D로 구성된 군에서 선택되고, X15는 Y, K와 F로 구성된 군에서 선택되고, X16은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이고, X17은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이고, X18은 M과 L로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X19는 D와 A로 구성된 군에서 선택된다.
HCB 공통
CDR1 X1X2X3X4X5 (서열 번호 134), 여기서 X1은 N, G, D, S와 A로 구성된 군에서 선택되고, X2는 A, F와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X3은 W, Y, A와 G로 구성된 군에서 선택되고, X4는 M과 L로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X5는 S와 H로 구성된 군에서 선택된다.
CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (서열 번호 135), 여기서 X1은 R, W, A, V, S와 F로 구성된 군에서 선택되고, X2는 K, N, S, W와 R로 구성된 군에서 선택되고, X3은 S, P, G, F와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X4는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, K, T와 R로 구성된 군에서 선택되고, X5는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, T와 A로 구성된 군에서 선택되고, X6은 D, N, H, S와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X7은 G와 S로 구성된 군에서 선택되고, X8은 G와 S로 구성된 군에서 선택되고, X9는 T, G, R, I, N, H와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X10은 T, K, R과 P로 구성된 군에서 선택되고, X11은 D, N, Y와 E로 구성된 군에서 선택되고, X12는 Y와 S로 구성된 군에서 선택되고, X13은 T, A와 V로 구성된 군에서 선택되고, X14는 A, Q와 D로 구성된 군에서 선택되고, X15는 P, K와 S로 구성된 군에서 선택되고, X16은 V와 F로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 X17은 K와 Q로 구성된 군에서 선택된다.
CDR3 X1X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V (서열 번호 136), 여기서 X1은 D, G, A와 E로 구성된 군에서 선택되고, X2는 R, G와 Q로 구성된 군에서 선택되고, X3은 T, M, Y, R, L, G와 K로 구성된 군에서 선택되고, X4는 G, S, E, N, I와 R로 구성된 군에서 선택되고, X5는 Y, I, G, V와 A로 구성된 군에서 선택되고, X6은 S, I, Y, G, A와 T로 구성된 군에서 선택되고, X7은 I, M, A, P와 D로 구성된 군에서 선택되고, X8은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, S, L과 Y로 구성된 군에서 선택되고, X9는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, W, R, S와 T로 구성된 군에서 선택되고, X10은 S, G와 L로 구성된 군에서 선택되고, X11은 S, V, L, G와 Y로 구성된 군에서 선택되고, X12는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, F, Y와 W로 구성된 군에서 선택되고, X13은 Y, P, S와 H로 구성된 군에서 선택되고, X14는 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y, P, D와 H로 구성된 군에서 선택되고, X15는 Y, K와 F로 구성된 군에서 선택되고, X16은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이고, X17은 존재하거나 부재하고, 그리고 존재하면, Y이고, 그리고 X18은 M과 L로 구성된 군에서 선택된다.
일부 경우에, 항원 결합 단백질은 상기 공통 서열 중에서 한 가지를 갖는 적어도 하나의 중쇄 CDR1, CDR2, 또는 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 상기 공통 서열 중에서 한 가지를 갖는 적어도 하나의 경쇄 CDR1, CDR2, 또는 CDR3을 포함한다. 다른 경우에, 항원 결합 단백질은 상기 공통 서열에 따른 적어도 2개의 중쇄 CDR 및/또는 상기 공통 서열에 따른 적어도 2개의 경쇄 CDR을 포함한다. 또 다른 경우에, 항원 결합 단백질은 상기 공통 서열에 따른 적어도 3개의 중쇄 CDR 및/또는 상기 공통 서열에 따른 적어도 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
예시적인 항원 결합 단백질
한 측면에 따라서, (A) (i) 서열 번호 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, 그리고 100으로 구성된 군에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 번호 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, 그리고 129로 구성된 군에서 선택되는 CDRH2; (iii) 서열 번호 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, 그리고 123으로 구성된 군에서 선택되는 CDRH3; 그리고 (iv) 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 또는 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개 이하의 아미노산의 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRH로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDRH); (B) (i) 서열 번호 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, 그리고 69로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 번호 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, 그리고 70으로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 번호 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, 그리고 72로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3; 그리고 (iv) 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 또는 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개 이하의 아미노산의 결실 또는 삽입을 보유하는 (i), (ii)와 (iii)의 CDRL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDRL); 또는 (C) (A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 (B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함하는, CGRP R에 결합하는 분리된 항원-결합 단백질이 제시된다.
또 다른 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) (i) 서열 번호 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, 그리고 100으로 구성된 군에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 번호 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, 그리고 129로 구성된 군에서 선택되는 CDRH2; 그리고 (iii) 서열 번호 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, 그리고 123으로 구성된 군에서 선택되는 CDRH3으로 구성된 군에서 선택되는 CDRH; (B) (i) 서열 번호 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, 그리고 69로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 번호 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, 그리고 70으로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2; 그리고 (iii) 서열 번호 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, 그리고 72로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3으로 구성된 군에서 선택되는 CDRL; 또는 (C) (A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 (B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질은 (A) 서열 번호 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, 그리고 100의 CDRH1, 서열 번호 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, 그리고 129의 CDRH2, 그리고 서열 번호 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, 그리고 123의 CDRH3, 그리고 (B) 서열 번호 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, 그리고 69의 CDRL1, 서열 번호 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, 그리고 70의 CDRL2, 그리고 서열 번호 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, 그리고 72의 CDRL3을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열 번호 158-170으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 및/또는 VL은 서열 번호 137-153으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 진전된 구체예에서, VH는 서열 번호 158-170으로 구성된 군에서 선택되고, 및/또는 VL은 서열 번호 137-153으로 구성된 군에서 선택된다.
다른 측면에서, CGRP R의 CRLR과 RAMP1 성분 둘 모두로부터 아미노산 잔기로 형성된 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항원 결합 단백질이 제시된다.
또 다른 구체예에서, 본 명세서에서 제시된 분리된 항원 결합 단백질은 본 명세서에서 제시된 CDRH 공통 서열 중에서 적어도 하나를 포함하는 첫 번째 아미노산 서열, 그리고 본 명세서에서 제시된 CDRL 공통 서열 중에서 적어도 하나를 포함하는 두 번째 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 첫 번째 아미노산 서열은 CDRH 공통 서열 중에서 적어도 2개를 포함하고, 및/또는 두 번째 아미노산 서열은 CDRL 공통 서열 중에서 적어도 2개를 포함한다.
일정한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 아미노산 서열은 서로에 공유 결합된다.
진전된 구체예에서, 분리된 항원-결합 단백질의 첫 번째 아미노산 서열은 서열 번호 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, 그리고 123의 CDRH3, 서열 번호 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, 그리고 129의 CDRH2, 그리고 서열 번호 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, 그리고 100의 CDRH1을 포함하고, 및/또는 분리된 항원 결합 단백질의 두 번째 아미노산 서열은 서열 번호 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, 그리고 72의 CDRL3, 서열 번호 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, 그리고 70의 CDRL2, 그리고 서열 번호 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, 그리고 69의 CDRL1을 포함한다.
진전된 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 5A에 제시된 바와 같이, 중쇄 서열 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, 또는 H13의 적어도 2개의CDRH 서열을 포함한다. 다른 진전된 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 5B에 도시된 바와 같이, 경쇄 서열 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, 또는 L17의 적어도 2개의 CDRL 서열을 포함한다. 다른 진전된 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 5A에 도시된 바와 같이, 중쇄 서열 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, 또는 H13의 적어도 2개의 CDRH 서열, 그리고 표 5B에 제시된 바와 같이, 경쇄 서열 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, 또는 L17의 적어도 2개의 CDRL을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 5A에 제시된 바와 같이, 중쇄 서열 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, 또는 H13의 CDRH1, CDRH2, 그리고 CDRH3 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 5B에 제시된 바와 같이, 경쇄 서열 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, 또는 L17의 CDRL1, CDRL2, 그리고 CDRL3 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 5A와 5B에서 제시된 바와 같이, L1과 H1, 또는 L2와 H2, 또는 L3과 H3, 또는 L4와 H4, 또는 L5와 H5, 또는 L6과 H1, 또는 L7과 H6, 또는 L8과 H5, 또는 L9와 H1, 또는 L10과 H7, 또는 L11과 H8, 또는 L12와 H9, 또는 L12와 H10, 또는 L13과 H5, 또는 L14와 H11, 또는 L15와 H12, 또는 L16과 H13, 또는 L17과 H13의 6개 CDR 모두를 포함한다.
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
Figure pat00024
한 측면에서, 본 명세서에서 제시된 분리된 항원-결합 단백질은 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 이들의 항체 항원 결합 단편일 수 있다.
다른 구체예에서, 본 명세서에 제시된 분리된 항원-결합 단백질의 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 단일 사슬 항체 분자일 수 있다.
진전된 구체예에서, 본 명세서에서 제시된 분리된 항원 결합 단백질은 인간 항체이고 IgG1-, IgG2- IgG3- 또는 IgG4-유형일 수 있다.
다른 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 5A-5B에서 열거된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 폴리펩티드만으로 구성된다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 5A-5B에서 열거된 것들과 같은 경쇄 가변 또는 중쇄 가변 도메인만으로 구성된다. 이런 항원 결합 단백질은 하나 이상의 PEG 분자로 페길화 (pegylation)될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서에 제시된 분리된 항원-결합 단백질은 표지화 기에 결합될 수 있고, 그리고 본 명세서에 제시된 분리된 항원-결합 단백질 중에서 한 가지의 항원 결합 단백질과, 인간 CGRP R의 세포외 부분에의 결합에 대하여 경쟁할 수 있다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 제시된 분리된 항원 결합 단백질은 환자에 투여될 때, 단핵구 주화성 (chemotaxis)을 감소시키거나, 종양 내로 단핵구 이동을 저해하거나, 또는 종양 내에서 종양 연관된 대식세포의 축적과 기능을 저해할 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 서술된 서열로부터 하나 이상의 CDR을 포함하는 임의의 항원 결합 단백질의 경우에, 서술된 서열로부터 독립적으로 선택되는 CDR의 임의의 조합이 유용하다. 따라서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 독립적으로 선택된 CDR을 포함하는 항원 결합 단백질이 산출될 수 있다. 하지만, 당업자가 인지하는 바와 같이, 특정 구체예는 일반적으로, 비-경쟁적인 CDR의 조합을 이용한다. 가령, 항원 결합 단백질은 일반적으로, 2개의 CDRH2 영역 등으로 만들어지지 않는다.
제시된 항원 결합 단백질 중에서 일부는 하기에 더욱 상세하게 논의된다.
항원 결합 단백질 및 결합 에피토프와 결합 도메인
항원 결합 단백질이 에피토프, 예를 들면, CGRP R, 예를 들면, CGRP R의 세포외 도메인의 한쪽 또는 양쪽 성분에 결합하는 것으로 일컬어질 때, 의미되는 것은 상기 항원 결합 단백질이 CRLR, RAMP1, 또는 CRLR과 RAMP1의 전장 부분 상에 존재할 수 있는 CGRP R의 특정 일부분에 특이적으로 결합한다는 것이다. 항원 결합 단백질이 CRLR에만 결합하는 경우에 (RAMP1에 결합하지 않음), 상기 항원 결합 단백질은 CGRP R에 선별적으로 결합할 것으로 예상되지 않는데, 그 이유는 CRLR이 특히, AM1 및 AM1 수용체와 공유되기 때문이다. 유사하게, 항원 결합 단백질이 RAMP1에만 결합하는 경우에 (CRLR에 결합하지 않음), 상기 항원 결합 단백질은 CGRP R에 선별적으로 결합할 것으로 예상되지 않는데, 그 이유는 RAMP1이 특히, AMY1 수용체와 공유되기 때문이다. 항원 결합 단백질이 CRLR과 RAMP1 둘 모두와 상호작용하는 경우에, 상기 항원 결합 단백질은 CRLR과 RAMP1 둘 모두에서 잔기, 또는 잔기의 서열, 또는 영역에 결합할 것으로 예상된다. 전술한 구체예 중에서 어느 것에서도 항원 결합 단백질이 CRLR 또는 RAMP1 내에서 모든 잔기에 접촉할 것으로 예상되지는 않는다. 유사하게, CRLR, RAMP1 또는 이들의 세포외 도메인 내에서 모든 아미노산 치환 또는 결실이 결합 친화성에 현저한 영향을 줄 것으로 예상되지 않는다.
예로써, 실시예 10에서 상술된 방법은 다중결합 수용체, 예를 들면, CGRP R의 어떤 영역이 선택된 항원 결합 단백질에 결합에 관여하는 지를 평가하는데 이용될 수 있다.
경쟁하는 항원 결합 단백질
다른 측면에서, CGRP R에 특이적인 결합에 대하여, 앞서 기술된 에피토프에 결합하는 예시된 또는 "참조물" 항체 또는 기능적 단편 중의 한 가지와 경쟁하는 항원 결합 단백질이 제시된다. 이런 항원 결합 단백질은 또한, 본 명세서에서 예시된 항원 결합 단백질 중의 한 가지와 동일한 에피토프, 또는 중복 에피토프에 결합할 수 있다. 예시된 또는 참조물 항원 결합 단백질과 경쟁하거나, 또는 이들 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질과 단편은 유사한 기능적 특성을 나타낼 것으로 예상된다. 이들 예시된 항원 결합 단백질과 단편에는 표 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 5A와 5B에 제시된 중쇄와 경쇄, 가변 영역 도메인 VL1-VL17와 VH1-VH13, 그리고 CDR을 포함하는 것들이 포함된다. 따라서 특정 실례로써, (a) 표 5A와 5B에 제시된 항체에 대하여 열거된 전체 6개의 CDR; (b) VL1-VL17 및 VH1-VH13에서 선택되고 표 5A와 5B에 제시된 항체에 대하여 열거된 VH와 VL; 또는 (c) 표 5A와 5B에 제시된 항체에 대하여 특정된 바와 같은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 항체와 경쟁하는 것들을 포함하는 항원 결합 단백질이 제시된다. 적절한 참조물 항체의 다른 실례에는 서열 번호 158-170으로서 확인된 임의의 서열에 상응하는 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 그리고 서열 번호 137-153으로서 확인된 임의의 서열에 상응하는 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 것들이 포함된다.
결합 경쟁은 예로써, 비닝 (Binning) 분석법, 예를 들면, 하기 실시예 7에서 기술된 Biacore 분석법을 이용하여 평가될 수 있다. 상기 실시예에서, 본 명세서에서 기술된 19개의 항체가 6개의 "참조물" 항체 -- 5개의 중화 항체 (11D11, 3B6, 4H6, 12G8, 그리고 9F5) 및 1개의 비-중화 항체 (34E3) 각각에 대하여 조사되었다. 표 13에 제시된 분석 결과는 조사된 중화 항체 (1E11, 1H7, 2E7, 3B6, 3C8, 4E4, 4H6, 5F5, 9D4, 9F5, 10E4, 11D11, 11H9, 12E8, 12G8, 13H2와 32H7) 전부가 조사된 비-중화 항체 (32H8, 33B5, 33E4와 34E3)에 의해 결합되는 CGRP R의 영역과 상이한, CGRP R의 본질적으로 동일한 영역에 결합한다는 것을 지시한다. 이들 데이터에 기초하여, 임의의 중화 항체, 특히 실시예 7에서 기술된 분석법에서 고정된 임의의 중화 항체 --- 11D11, 3B6, 4H6, 12G8, 그리고 9F5는 경쟁 분석법에서 예시적인 참조물 항원 결합 단백질을 만들어낼 것이다.
단일클론 항체
CGRP R에 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 항원 결합 단백질이 제시된다. 단일클론 항체는 예로써, 면역화 일정의 완결후 유전자도입 동물로부터 수확된 비장 세포를 영속화시킴으로써, 당분야에 공지된 임의의 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 비장 세포는 예로써, 이들을 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산함으로써, 당분야에 공지된 임의의 기술을 이용하여 영속화될 수 있다. 하이브리도마-생산 융합 절차에서 이용을 위한 골수종 세포는 바람직하게는, 비-항체-생산성이고, 높은 융합 효율을 갖고, 그리고 효소 결함성이며, 따라서 이들은 원하는 융합된 세포 (하이브리도마)만의 성장을 지원하는 일정한 선별적인 배지에서 성장할 수 없다. 생쥐 융합에 이용을 위한 적절한 세포주의 실례에는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7과 S194/5XXO Bul이 포함된다; 쥐 융합에 이용되는 세포주의 실례에는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F와 4B210이 포함된다. 세포 융합에 유용한 다른 세포주는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2와 UC729-6이다. 단일클론 항체를 제조하는 예시적인 방법은 하기 실시예 2에서 기술된다.
일부 경우에, 하이브리도마 세포주는 동물 (가령, 인간 면역글로불린 서열을 갖는 유전자도입 동물)을 CGRP R 면역원으로 면역화시키고; 면역화된 동물로부터 비장 세포를 수확하고; 수확된 비장 세포를 골수종 세포주에 융합하여 하이브리도마 세포를 산출하고; 하이브리도마 세포로부터 하이브리도마 세포주를 확립하고, 그리고 CGRP R에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인함으로써 생산된다 (가령, 하기 실시예 1-3에서 기술된 바와 같이). 이런 하이브리도마 세포주, 그리고 이들에 의해 생산된 항-CGRP R 단일클론 항체는 본 출원의 특징이다.
하이브리도마 세포주에 의해 분비된 단일클론 항체는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 정제될 수 있다. 하이브리도마 또는 mAb는 예로써, 하기에 기술된 바와 같은 cAMP 분석을 이용하여, 특정한 특성, 예를 들면, CGRP를 발현하는 세포에 결합하는 능력, CGRP 리간드 또는 CGRP8 -37 펩티드의 결합을 차단하거나 간섭하는 능력, 또는 수용체를 기능적으로 차단하는 능력을 갖는 mAb를 확인하기 위하여 더욱 스크리닝될 수 있다.
키메라와 인간화 항체
전술한 서열에 기초된 키메라와 인간화 항체 역시 제시된다. 치료제로서 이용을 위한 단일클론 항체는 이용에 앞서 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 한 가지 실례는 키메라 항체인데, 이는 기능적 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄, 또는 이들의 면역학적으로 기능적 일부분을 생산하기 위하여 공유 결합되는 상이한 항체로부터 단백질 조각으로 구성되는 항체이다. 일반적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정한 종으로부터 유래되거나, 또는 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 이러한 서열에 상동한 반면, 상기 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래되거나, 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 이러한 서열과 상동하다. 키메라 항체에 관련된 방법에 대하여, 예로써 미국 특허 No. 4,816,567; 그리고 Morrison et al., 1985, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855를 참조하고, 이들은 본 발명에 참조로서 편입된다. CDR 이식 (grafting)은 예로써, 미국 특허 No. 6,180,370, No. 5,693,762, No. 5,693,761, No. 5,585,089, 그리고 No. 5,530,101에서 기술된다.
일반적으로, 키메라 항체를 만드는 목적은 의도된 환자 종으로부터 다수의 아미노산이 극대화되는 키메라를 산출하는 것이다. 한 가지 실례는 "CDR-이식된" 항체인데, 여기서 상기 항체는 특정한 종으로부터, 또는 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하고, 상기 항체 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래되거나, 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 이러한 서열과 상동하다. 인간에서 이용을 위하여, 설치류 항체로부터 가변 영역 또는 선택된 CDR은 종종, 인간 항체 내로 이식되고, 인간 항체의 자연-발생 가변 영역 또는 CDR을 대체한다.
키메라 항체의 한 가지 유용한 유형은 "인간화" 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 동물에서 최초 생성된 단일클론 항체로부터 생산된다. 이러한 단일클론 항체에서, 전형적으로 상기 항체의 비-항원 인식 부분으로부터 일정한 아미노산 잔기가 상응하는 아이소타입의 인간 항체에서 상응하는 잔기에 상동하도록 변형된다. 인간화는 예로써, 설치류 가변 영역의 적어도 일부분을 인간 항체의 상응하는 영역으로 치환함으로써 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참조: 미국 특허 No. 5,585,089, 그리고 No. 5,693,762; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536),
한 측면에서, 본 명세서에 제시된 항체의 경쇄와 중쇄 가변 영역의 CDR (표 4 참조)은 동일하거나 상이한 계통발생적 종으로부터 항체로부터 골격 영역 (FR)에 이식된다. 가령, 중쇄와 경쇄 가변 영역 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, 그리고 VH13, 및/또는 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, 그리고 VL17의 CDR은 공통 인간 FR에 이식될 수 있다. 공통 인간 FR을 산출하기 위하여, 여러 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터 FR이 공통 아미노산 서열을 확인하기 위하여 정렬될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 명세서에서 제시된 중쇄 또는 경쇄의 FR은 상이한 중쇄 또는 경쇄로부터 FR로 대체된다. 한 측면에서, 항-CGRP R 항체의 중쇄와 경쇄의 FR 내에서 드물게 나타나는 아미노산은 대체되지 않는 반면, 이들 FR 아미노산 중에서 나머지가 대체된다. "드물게 나타나는 아미노산"은 특정한 아미노산이 FR 내에서 통상적으로 관찰되지 않는 위치에서 존재하는 특정한 아미노산이다. 대안으로, 본 명세서에서 제시된 바와 같은 특정 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역과 상이한 불변 영역과 함께, 이러한 중쇄 또는 경쇄로부터 이식된 가변 영역이 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 이식된 가변 영역은 단일 사슬 Fv 항체의 일부이다.
일정한 구체예에서, 인간 이외의 종으로부터 불변 영역은 하이브리드 항체를 생산하기 위하여 인간 가변 영역(들)과 함께 이용될 수 있다.
완전한 인간 항체
완전한 인간 항체 역시 제시된다. 인간을 항원에 노출시키지 않으면서 소정의 항원에 특이적인 완전한 인간 항체를 제조하는데 여러 방법이 가용하다 ("완전한 인간 항체"). 완전한 인간 항체의 생산을 수행하기 위하여 제공된 한 가지 특정한 수단은 생쥐 체액성 면역계의 "인간화"이다. 내인성 Ig 유전자가 비활성화된 생쥐 내로 인간 면역글로불린 (Ig) 좌위의 도입은 임의의 바람직한 항원으로 면역화될 수 있는 동물인 생쥐에서 완전한 인간 단일클론 항체 (mAb)를 생산하는 한 가지 수단이다. 완전한 인간 항체를 이용하면, 때때로 치료제로서 생쥐 또는 생쥐-유래된 mAb를 인간에 투여함으로써 유발될 수 있는 면역원성 반응과 알레르기 반응이 최소화될 수 있다.
완전한 인간 항체는 내인성 면역글로불린 생산의 부재에서 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자도입 동물 (통상적으로, 생쥐)을 면역화시킴으로써 생산될 수 있다. 이러한 목적을 위한 항원은 전형적으로, 6개 또는 그 이상의 연속적 아미노산을 갖고, 그리고 선택적으로 담체, 예를 들면, 합텐에 접합된다 (참조: Jakobovits et al., 1993, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; 그리고 Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33). 이런 방법의 한 가지 실례에서, 유전자도입 동물은 그 내부에 생쥐 중쇄와 경쇄 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 내인성 생쥐 면역글로불린 좌위를 무력화시키고, 그리고 인간 중쇄와 경쇄 단백질을 인코딩하는 인간 게놈 DNA 보유 좌위의 대형 단편을 생쥐 게놈 내로 삽입함으로써 생산된다. 인간 면역글로불린 좌위의 완전하지 않은 보체를 갖는 부분적으로 변형된 동물은 이후, 원하는 면역계 변형을 전부 갖는 동물을 획득하기 위하여 이종-교배된다. 면역원이 투여될 때, 이들 유전자도입 동물은 상기 면역원에 면역특이적이지만 가변 영역을 비롯하여 뮤린이 아닌 인간 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산한다. 이런 방법의 더욱 상세를 위하여, 예로써 WO96/33735와 WO94/02602를 참조한다. 인간 항체를 만들기 위한 유전자도입 생쥐에 관련된 부가적인 방법은 미국 특허 No. 5,545,807; No. 6,713,610; No. 6,673,986; No. 6,162,963; No. 5,545,807; No. 6,300,129; No. 6,255,458; No. 5,877,397; No. 5,874,299와 No. 5,545,806; PCT 공개 WO91/10741, WO90/04036, 그리고 EP 546073B1과 EP 546073A1에서 기술된다.
본 명세서에서 "HuMab" 생쥐로 지칭되는 앞서 기술된 유전자도입 생쥐는 내인성 [뮤]와 [카파] 사슬 좌위를 비활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 ([뮤]와 [감마])와 [카파] 경쇄 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니좌위 (minilocus)를 보유한다 (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). 따라서 상기 생쥐는 면역화에 응하여 생쥐 IgM 또는 [카파]의 감소된 발현을 나타내고, 그리고 도입된 인간 중쇄와 경쇄 도입유전자 (transgene)는 급의 전환 (class switching) 및 체세포 돌연변이 (somatic mutation)를 겪고 높은 친화성 인간 IgG [카파] 단일클론 항체를 산출한다 (Lonberg et al., supra.; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol . 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad . Sci. 764:536-546). HuMab 생쥐의 제조는 Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp . Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad . Sci . 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851에서 상세하게 기술된다; 전술한 참고문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 또한, 미국 특허 No. 5,545,806; No. 5,569,825; No. 5,625,126; No. 5,633,425; No. 5,789,650; No. 5,877,397; No. 5,661,016; No. 5,814,318; No. 5,874,299; 그리고 No. 5,770,429; 미국 특허 No. 5,545,807; 국제 공개 번호 WO 93/1227; WO 92/22646; 그리고 WO 92/03918을 참조하고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 이들 유전자도입 생쥐에서 인간 항체를 생산하는데 이용되는 기술은 WO 98/24893, 그리고 Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156에서도 기술되고, 이들은 본 발명에 참조로서 편입된다. 가령, HCo7과 HCo12 유전자도입 생쥐 혈통이 항-CGRP R 항체를 산출하는데 이용될 수 있다. 유전자도입 생쥐를 이용한 인간 항체의 생산에 관한 더욱 상세가 하기 실시예에 제공된다.
하이브리도마 기술을 이용하여, 원하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 mAb가 유전자도입 생쥐, 예를 들면, 앞서 기술된 것들로부터 생산되고 선택될 수 있다. 이런 항체는 적절한 벡터와 숙주 세포를 이용하여 클로닝되고 발현되거나, 또는 상기 항체는 배양된 하이브리도마 세포로부터 수확될 수 있다.
완전한 인간 항체 역시 파지-전시 라이브러리 (phage-display library)로부터 유래될 수 있다 (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol . Biol . 227:381; 그리고 Marks et al., 1991, J. Mol . Biol . 222:581에서 개시된 바와 같이). 파지 전시 기술은 섬유상 박테리오파지의 표면 상에서 항체 레퍼토리의 전시, 그리고 선택 항원에 결합에 의한 파지의 차후 선택을 통하여 면역 선택 (immune selection)을 모방한다. 이와 같은 한 가지 기술은 PCT 공개 No. WO 99/10494 (본 발명에 참조로서 편입됨)에서 기술되는데, 상기 문헌에서는 이런 접근법을 이용한, MPL-와 msk-수용체에 대한 높은 친화성과 기능적 작동약 항체의 분리를 기술한다.
이중특이적 또는 이중기능적 항원 결합 단백질
앞서 기술된 바와 같은 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체와 이중기능적 항체를 포함하는 항원 결합 단백질 역시 제시된다. 일부 경우에, 이중특이적 또는 이중기능적 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다 (참조: Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp . Immunol . 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol . 148:1547-1553).
다양한 다른 형태
본 명세서에서 제시되는 항원 결합 단백질 중에서 일부는 앞서 기술된 항원 결합 단백질 (가령, 표 2-5에 열거된 서열을 갖는 것들)의 변이체 형태이다. 가령, 항원 결합 단백질 중에서 일부는 표 2-5에 열거된 중쇄 또는 경쇄, 가변 영역 또는 CDR 중에서 하나 이상에서 하나 이상의 보존성 아미노산 치환을 갖는다.
자연-발생 아미노산은 공통 측쇄 특성에 기초된 부류로 분류될 수 있다:
1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) 산성: Asp, Glu;
4) 염기성: His, Lys, Arg;
5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 그리고
6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
보존성 아미노산 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원의 동일한 부류의 다른 구성원으로의 교체를 수반한다. 보존성 아미노산 치환은 비-자연-발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 이들 잔기는 전형적으로, 생물학적 체계에서 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 통합된다. 이들에는 펩티드모방체 및 아미노산 모이어티의 다른 뒤집히거나 역전된 형태가 포함된다.
비-보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원의 다른 부류의 구성원으로의 교체를 수반한다. 이런 치환된 잔기는 인간 항체와 상동성인 항체의 영역 내로, 또는 상기 분자의 비-상동성 영역 내로 도입될 수 있다.
이런 변화를 만들 때, 일정한 구체예에 따라서, 아미노산의 수치 지수 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질의 수치 프로필 (hydropathic profile)은 각 아미노산에 수치 값 ("수치 지수")을 지정하고, 이후 펩티드 사슬을 따라서 이들 값을 반복적으로 평균함으로써 계산된다. 각 아미노산은 소수성과 전하 특징에 기초하여 수치 지수가 지정된다. 이들은 아래와 같다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 그리고 아르기닌 (-4.5).
단백질에 상호작용 생물학적 기능의 공여에서 치수 프로필의 중요성은 당분야에서 이미 공지되어 있다 (참조: Kyte et al., 1982, J. Mol . Biol . 157:105-131). 일정한 아미노산은 유사한 수치 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산을 대체하고 유사한 생물학적 활성을 여전히 유지할 수 있는 것으로 알려져 있다. 수치 지수에 기초된 변화를 만들 때, 일정한 구체예에서, 수치 지수가 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다. 일부 측면에서, ±1 내에 있는 수치 지수가 포함되고, 그리고 다른 측면에서, ±0.5 내에서 수치 지수가 포함된다.
또한, 유사 아미노산의 치환은 특히, 이렇게 산출된 생물학적으로 기능적 단백질 또는 펩티드가 본 출원에서처럼 면역학적 구체예에서 이용 목적으로 의도되는 경우에, 친수성의 기초에서 효과적으로 달성될 수 있는 것으로 당분야에 공지되어 있다. 일정한 구체예에서, 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는, 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 이의 면역원성 및 항원-결합 또는 면역원성, 다시 말하면, 상기 단백질의 생물학적 특성과 상관한다.
아래의 친수성 값이 이들 아미노산 잔기에 지정된다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신(0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5)과 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값에 기초된 변화를 만들 때, 일정한 구체예에서, 친수성 값이 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함되고, 다른 구체예에서, ±1 내에 있는 친수성 값이 포함되고, 그리고 또 다른 구체예에서, ±0.5 내에 있는 친수성 값이 포함된다. 일부 경우에, 친수성의 기초에서 일차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수도 있다. 이들 영역은 "에피토프 코어 영역"으로 지칭된다. 예시적인 보존성 아미노산 치환은 표 6에 제시된다.
Figure pat00025
당업자는 널리 공지된 기술을 이용하여 본 명세서에 제시된 폴리펩티드의 적절한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 당업자는 활성에 중요한 것으로 생각되지 않는 영역을 표적으로 함으로써 활성을 파괴하지 않으면서 변화될 수 있는 분자의 적절한 구역을 확인할 수 있다. 당업자는 또한, 유사한 폴리펩티드 간에 보존되는 이들 분자의 잔기와 부분을 확인할 수 있을 것이다. 진전된 구체예에서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 구역도 생물학적 활성을 파괴하지 않으면서, 또는 폴리펩티드 구조에 부정적인 영향을 주지 않으면서 보존성 아미노산 치환에 종속될 수 있다.
추가적으로, 당업자는 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩티드에서 잔기를 확인하는 구조-기능 연구를 재검토할 수 있다. 이런 비교를 고려하여, 유사한 단백질에서 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 단백질에서 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자는 이런 예측된 중요한 아미노산 잔기에 대하여 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수도 있다.
당업자는 또한, 유사한 폴리펩티드에서 구조와 관련하여 3-차원 구조와 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 이런 정보를 고려하여, 당업자는 3차원 구조에 관하여 항체의 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 당업자는 단백질의 표면 상에 존재할 것으로 예측되는 아미노산 잔기에 근본적인 변화를 만들지 않기로 결정할 수도 있는데, 그 이유는 이런 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여할 수 있기 때문이다. 게다가, 당업자는 각각의 원하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 보유하는 검사 변이체를 산출할 수도 있다. 이들 변이체는 이후, CGRP R 중화 활성에 대한 분석법 (하기 실시예 참조)을 이용하여 스크리닝되고, 따라서 어떤 아미노산이 변화될 수 있고 어떤 아미노산이 변화되지 않아야 하는 지에 관한 정보가 산출될 수 있다. 다시 말하면, 이런 일과적인 실험으로부터 수집된 정보에 기초하여, 당업자는 단독으로 또는 다른 돌연변이와 공동으로 추가의 치환이 회피되어야 하는 아미노산 위치를 용이하게 결정할 수 있다.
다수의 과학 간행물이 2차 구조의 예측에 주목하였다 (참조: Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochem . 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv . Enzymol . Relat. Areas Mol . Biol . 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem . 47:251-276; and Chou et al., 1979, Biophys . J. 26:367-384). 게다가, 2차 구조를 예측하는데 도움을 주는 컴퓨터 프로그램이 현재 가용하다. 2차 구조를 예측하는 한 가지 방법은 상동성 모델링 (homology modeling)에 기초된다. 가령, 30% 이상의 서열 동일성, 또는 40% 이상의 유사성을 갖는 2개의 폴리펩티드 또는 단백질은 유사한 구조적 위상을 가질 수 있다. 단백질 구조 데이터베이스 (PDB)의 최근 성장은 폴리펩티드 또는 단백질의 구조 내에서 잠재적인 숫자의 접힘을 비롯한 2차 구조의 향상된 예측성을 제공하였다 (참조: Holm et al., 1999, Nucl . Acid. Res. 27:244-247). 소정의 폴리펩티드 또는 단백질 내에 제한된 숫자의 접힘이 존재하고, 그리고 임계적 숫자의 구조가 분석되면, 구조적 예측이 훨씬 정확해질 것으로 제안되었다 (Brenner et al., 1997, Curr . Op. Struct . Biol . 7:369-376).
2차 구조를 예측하는 부가적인 방법에는 "스레딩 (threading)" (Jones,Curr . Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "프로필 분석" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym . 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc . Nat. Acad . Sci . 84:4355-4358), 그리고 "진화적 연쇄 (evolutionary linkage)" (참조: Holm, 1999, supra; 그리고 Brenner, 1997, supra)가 포함된다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 (1) 단백분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변화시키고, (4) 리간드 또는 항원 결합 친화성을 변경하고, 및/또는 (4) 이런 폴리펩티드에 대한 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 공여하거나 변경하도록 만들어진다. 가령, 자연-발생 서열 내에서 단일 또는 복수 아미노산 치환 (일정한 구체예에서, 보존성 아미노산 치환)이 만들어질 수 있다. 분자가 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부에 위치하는 항체의 부분에서 치환이 만들어질 수 있다. 이런 구체예에서, 부모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 보존성 아미노산 치환 (가령, 부모 또는 고유 항원 결합 단백질을 특징짓는 2차 구조를 파괴하지 않는 하나 이상의 대체 아미노산)이 이용될 수 있다. 당분야에서 인정된 폴리펩티드 2차와 3차 구조의 실례는 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.),4, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; 그리고 Thornton et al.,1991, Nature 354:105에서 기술되고, 이들은 각각 본 발명에 참조로서 편입된다.
부가적인 선호되는 항체 변이체에는 부모 또는 고유 아미노산 서열 내에서 하나 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나, 또는 다른 아미노산 (가령, 세린)으로 치환되는 시스테인 변이체가 포함된다. 시스테인 변이체는 특히, 항체가 생물학적으로 활성 배좌로 재접힘되어야 할 때 유용하다. 시스테인 변이체는 고유 항체보다 적은 시스테인 잔기를 가질 수 있고, 그리고 전형적으로, 대합되지 않은 시스테인에 기인하는 상호작용을 최소화시키기 위하여 짝수를 갖는다.
제시된 중쇄와 경쇄, 가변 영역 도메인 및 CDR은 CGRP R에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 보유하는 폴리펩티드를 제조하는데 이용될 수 있다. 가령, 표 4와 5에 제시된 CDR 중에서 하나 이상이 분자 (가령, 폴리펩티드) 내로 공유적으로 또는 비-공유적으로 통합되어 면역접합체가 만들어질 수 있다. 면역접합체는 더욱 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 CDR(들)을 통합하거나, 다른 폴리펩티드 사슬에 CDR(들)을 공유적으로 연결하거나, 또는 CDR(들)을 비-공유적으로 통합할 수 있다. 이들 CDR(들)은 면역접합체가 특정한 목적 항원 (가령, CGRP R 또는 이의 에피토프)에 특이적으로 결합할 수 있도록 한다.
본 명세서에서 제시된 가변 영역 도메인과 CDR에 기초된 모방체 (가령, "펩티드 모방체" 또는 "펩티드모방체") 역시 제시된다. 이들 유사체는 펩티드, 비-펩티드, 또는 펩티드와 비-펩티드 영역의 조합일 수 있다 (Fauchere, 1986, Adv . Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; 그리고 Evans et al., 1987, J. Med . Chem . 30:1229, 이들은 본 발명에서 순전히 참조로서 편입됨). 치료적으로 유용한 펩티드에 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 유사한 치료적 또는 예방적 효과를 산출하는데 이용될 수 있다. 이들 화합물은 종종, 컴퓨터 분자 모델링 (computerized molecular modeling)의 도움을 받아 개발된다. 일반적으로, 펩티드모방체는 원하는 생물학적 활성, 예를 들면, CGRP R에 특이적으로 결합하는 능력을 나타내는 항체에 구조적으로 유사하지만, 하나 이상의 펩티드 연쇄가 당분야에 널리 공지된 방법에 의해, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(cis와 trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 그리고 -CH2SO-에서 선택되는 연쇄로 선택적으로 대체되는 단백질이다. 동일한 유형의 D-아미노산으로 공통 서열의 하나 이상의 아미노산의 체계적인 치환 (가령, L-리신 대신에 D-리신)이 더욱 안정한 단백질을 산출하기 위하여 일정한 구체예에서 이용될 수 있다. 이에 더하여, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변이를 포함하는 속박된 펩티드는 예로써, 이러한 펩티드를 순환시키는 분자내 이황화 가교를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가함으로써, 당분야에 공지된 방법에 의해 산출될 수 있다 (Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387, 이는 본 발명에 참조로서 편입됨).
본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질의 유도체 역시 제시된다. 유도체화된 항원 결합 단백질은 항체 또는 단편에 원하는 특성, 예를 들면, 특정 용도에서 증가된 반감기를 제공하는 임의의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 유도체화된 항원 결합 단백질은 예로써, 검출가능 (또는 표지화) 모이어티 (가령, 방사성, 비색성, 항원성 또는 효소성 분자, 검출가능 비드 (가령, 자석 또는 전자고밀도 (가령, 금) 비드), 또는 다른 분자 (가령, 비오틴 또는 스트렙타비딘)), 치료적 또는 진단적 모이어티 (가령, 방사성, 세포독성, 또는 제약학적으로 활성 모이어티)에 결합하는 분자, 또는 특정한 용도 (가령, 개체, 예를 들면, 인간 개체에 투여, 또는 기타 생체내 또는 시험관내 용도)를 위한 항원 결합 단백질의 적합성을 증가시키는 분자를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질을 유도체화시키는데 이용될 수 있는 분자의 실례에는 알부민 (가령, 인간 혈청 알부민)과 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다. 항원 결합 단백질의 알부민-연결된 및 페길화된 유도체는 당분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일정한 항원 결합 단백질에는 본 명세서에서 제시된 바와 같은 페길화된 단일 사슬 폴리펩티드가 포함된다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 트랜스타이레틴 (transthyretin, TTR) 또는 TTR 변이체에 접합되거나, 또는 달리 연결된다. TTR 또는 TTR 변이체는 예로써, 덱스트란, 폴리(n-비닐 피롤리돈), 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올과 폴리비닐 알코올로 구성된 군에서 선택되는 화학물질로 화학적으로 변형될 수 있다.
다른 유도체에는 예로써, CGRP R 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 이종기원 폴리펩티드를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현에 의한, CGRP R 결합 단백질의 다른 단백질 또는 폴리펩티드와의 공유 또는 집합 접합체가 포함된다. 가령, 접합된 펩티드는 이종기원 신호 (또는 리더) 폴리펩티드, 예를 들면, 효모 알파-인자 리더, 또는 펩티드, 예를 들면, 에피토프 태그일 수 있다. CGRP 항원 결합 단백질-보유 융합 단백질은 CGRP R 결합 단백질의 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위하여 부가된 펩티드 (가령, 폴리-His)를 포함할 수 있다. CGRP R 결합 단백질은 또한, Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204; 그리고 미국 특허 No. 5,011,912에서 기술된 바와 같이, FLAG 펩티드에 연결될 수 있다. FLAG 펩티드는 고도로 항원성이고, 그리고 특이적인 단일클론 항체 (mAb)에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하여 발현된 재조합 단백질의 신속한 분석과 용이한 정제를 가능하게 한다. FLAG 펩티드가 소정의 폴리펩티드에 융합되는 융합 단백질을 제조하는데 유용한 시약은 상업적으로 가용하다 (Sigma, St. Louis, MO).
하나 이상의 CGRP R 결합 단백질을 보유하는 소중합체가 CGRP R 길항약으로서 이용될 수 있다. 소중합체는 공유적으로-연결된 또는 비-공유적으로-연결된 이합체, 삼합체, 또는 더욱 높은 소중합체의 형태일 수 있다. 2개 또는 그 이상의 CGRP R 결합 단백질을 포함하는 소중합체가 이용에 고려되는데, 한 가지 실례는 동종이합체이다. 다른 소중합체에는 이형이합체, 동종삼합체, 이형삼합체, 동종사합체, 이형사합체 등이 포함된다.
한 가지 구체예는 CGRP R 결합 단백질에 융합된 펩티드 모이어티 사이에 공유 또는 비-공유 상호작용을 통해 결합된 복합 CGRP R-결합 폴리펩티드를 포함하는 소중합체에 관계한다. 이런 펩티드는 펩티드 링커 (스페이서)이거나, 또는 소중합화를 촉진하는 성질을 갖는 펩티드일 수 있다. 류신 지퍼 (leucine zipper) 및 항체로부터 유래된 일정한 폴리펩티드는 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 거기에 부착된 CGRP R 결합 단백질의 소중합화를 촉진할 수 있는 펩티드 중의 하나이다.
특정 구체예에서, 소중합체는 2개 내지 4개의 CGRP R 결합 단백질을 포함한다. 소중합체의 CGRP R 결합 단백질 모이어티는 앞서 기술된 임의의 형태, 예를 들면, 변이체 또는 단편일 수 있다. 바람직하게는, 이들 소중합체는 CGRP R 결합 활성을 갖는 CGRP R 결합 단백질을 포함한다.
한 구체예에서, 소중합체는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 이용하여 제조된다. 항체-유래된 폴리펩티드의 다양한 부분 (Fc 도메인 포함)에 융합된 일정한 이종기원 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는 예로써, Ashkenazi et al., 1991, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; 그리고 Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11에서 기술되었다.
한 가지 구체예는 항체의 Fc 영역에 CGRP R 결합 단백질을 융합함으로써 산출된 2개의 융합 단백질을 포함하는 이합체에 관계한다. 상기 이합체는 예로써, 융합 단백질을 인코딩하는 유전자 융합체를 적절한 발현 벡터 내로 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 내에서 유전자 융합체를 발현시키고, 그리고 발현된 융합 단백질이 항체 분자와 유사하게 조립할 수 있도록 함으로써 만들어질 수 있고, 여기서 사슬간 이황화 결합이 Fc 모이어티 사이에 형성되고 이합체가 산출된다.
본 명세서에서, 용어 "Fc 폴리펩티드"는 항체의 Fc 영역으로부터 유래된 폴리펩티드의 고유와 뮤테인 형태를 포함한다. 이합체화를 촉진하는 힌지 영역 (hinge region)을 보유하는 이런 폴리펩티드의 절두된 형태 역시 포함된다. Fc 모이어티를 포함하는 융합 단백질 (및 이들로부터 형성된 소중합체)은 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 위에서 친화성 크로마토그래피에 의한 용이한 정제의 이점을 제공한다.
PCT 출원 WO 93/10151 및 미국 특허 No. 5,426,048과 No. 5,262,522에서 기술된 한 가지 적절한 Fc 폴리펩티드는 N-말단 힌지 영역에서부터 인간 IgG1 항체의 Fc 영역의 고유 C-말단에 이르는 단일 사슬 폴리펩티드이다. 다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 미국 특허 No. 5,457,035, 그리고 Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001에서 기술된 Fc 뮤테인이다. 이러한 뮤테인의 아미노산 서열은 아미노산 19가 Leu에서 Ala로 변경되고, 아미노산 20이 Leu에서 Glu로 변경되고, 그리고 아미노산 22가 Gly에서 Ala으로 변경된 점을 제외하고, WO 93/10151에서 제공된 고유 Fc 서열의 아미노산 서열과 동일하다. 뮤테인은 Fc 수용체에 대한 감소된 친화성을 나타낸다.
다른 구체예에서, 본 명세서에서 제시된 바와 같은 CGRP R 결합 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부분이 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부분을 대체할 수 있다.
대안으로, 소중합체는 펩티드 링커 (스페이서 펩티드)를 포함하거나 포함하지 않는, 복합 CGRP R 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 적절한 펩티드 링커에는 미국 특허 No. 4,751,180과 No. 4,935,233에서 기술된 것들이 포함된다.
소중합성 CGRP R 결합 단백질 유도체를 제조하기 위한 다른 방법은 류신 지퍼의 이용을 수반한다. 류신 지퍼 도메인은 그들이 관찰되는 단백질의 소중합화를 촉진하는 펩티드이다. 류신 지퍼는 여러 DNA-결합 단백질에서 최초 확인되었고 (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), 그리고 그 이후에, 다수의 상이한 단백질에서 발견되었다. 공지된 류신 지퍼에는 이합체화 또는 삼합체화되는 자연-발생 펩티드 및 이들의 유도체가 포함된다. 가용성 소중합체성 단백질을 생산하는데 적합한 류신 지퍼 도메인의 실례는 PCT 출원 WO 94/10308에서 기술되고, 그리고 폐 계면활성제 단백질 D (SPD)로부터 유래된 류신 지퍼는 본 발명에 참조로서 편입되는 Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191에서 기술된다. 그것에 융합되는 이종기원 단백질의 안정적인 삼합체화를 가능하게 하는 변형된 류신 지퍼의 이용은 Fanslow et al., 1994, Semin . Immunol . 6:267-278에서 기술된다. 한 가지 접근법에서, 류신 지퍼 펩티드에 융합된 CGRP R 결합 단백질 단편 또는 유도체를 포함하는 재조합 융합 단백질은 적절한 숙주 세포에서 발현되고, 그리고 형성되는 가용성 소중합체성 CGRP R 결합 단백질 단편 또는 유도체는 배양 상층액으로부터 회수된다.
일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM 또는 50 nM 이하의 KD (평형 결합 친화성)를 갖는다.
다른 측면에서는 시험관내에서 또는 생체내에서 적어도 1일의 반감기를 갖는 항원-결합 단백질을 제시한다 (가령, 인간 개체에 투여될 때). 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 적어도 3일의 반감기를 갖는다. 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 일부분은 4일 이상의 반감기를 갖는다. 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 일부분은 8일 이상의 반감기를 갖는다. 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 유도체화되지 않거나 변형되지 않은 항체와 비교하여 더욱 긴 반감기를 갖도록 유도체화되거나 변형된다. 다른 구체예에서, 항원 결합 단백질은 예로써, 본 발명에 참조로서 편입되는 2000년 2월 24일 공개된 WO 00/09560에서 기술된 바와 같이 혈청 반감기를 증가시키기 위하여 점 돌연변이를 보유한다.
당화
항원-결합 단백질은 고유 종에서 관찰되는 것과 상이하거나 이로부터 변경된 당화 패턴을 가질 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 당화 패턴은 단백질의 서열 (가령, 하기에 논의된 바와 같이, 특정한 당화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 상기 단백질이 생산되는 숙주 세포 또는 생명체에 좌우될 수 있다. 특정한 발현 시스템은 하기에 논의된다.
폴리펩티드의 당화는 전형적으로, N-연결되거나 O-연결된다. "N-연결된"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트리-펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서 폴리펩티드 내에서 이들 트리-펩티드 서열 중에서 어느 하나의 존재는 잠재적인 당화 부위를 발생시킨다. O-연결된 당화는 비록 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신 역시 이용될 수 있긴 하지만, 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 또는 크실로오스 중에서 한 가지의 부착을 지칭한다.
항원 결합 단백질에 당화 부위의 부가는 아미노산 서열이 앞서-기술된 트리-펩티드 서열 중에서 하나 이상을 보유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편의하게 달성된다 (N-연결된 당화 부위의 경우에). 이러한 변경은 또한, 출발 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 또는 이들 잔기에 의한 치환에 의해 만들어질 수 있다 (O-연결된 당화 부위의 경우에). 편의를 위하여, 항원 결합 단백질 아미노산 서열은 특히, 원하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 산출되도록 미리 선택된 염기에서 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써, DNA 수준에서 변화를 통하여 변경될 수 있다.
항원 결합 단백질 상에서 탄수화물 모이어티의 숫자를 증가시키는 다른 수단은 상기 단백질에 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링이다. 이들 절차는 N-과 O-연결된 당화를 위한 당화 능력을 갖는 숙주 세포에서 이러한 단백질의 생산을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 이용된 커플링 양식에 따라서, 당(들)이 (a) 아르기닌과 히스티딘, (b) 유리 카르복실 기, (c) 유리 설피드릴 기, 예를 들면, 시스테인 기, (d) 유리 히드록실 기, 예를 들면, 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린 기, (e) 방향족 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330, 그리고 Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit . Rev, Biochem ., pp. 259306에서 기술된다.
출발 항원 결합 단백질 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화 (deglycosylation)는 화합물 트리플루오르메탄설폰산, 또는 등가의 화합물에 상기 단백질의 노출을 필요로 한다. 이러한 처리는 연결 당 (linking sugar) (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고 대부분 또는 모든 당의 제거를 유발하지만, 폴리펩티드는 본래 대로 존속한다. 화학적 탈당화는 Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem . Biophys. 259:52; 그리고 Edge et al., 1981, Anal. Biochem . 118:131에서 기술된다. 폴리펩티드 상에서 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al., 1987, Meth . Enzymol . 138:350에서 기술된 바와 같이, 다양한 엔도-와 엑소-글리코시다아제의 이용에 의해 달성될 수 있다. 잠재적인 당화 부위에서 당화는 Duskin et al., 1982, J. Biol . Chem . 257:3105에서 기술된 바와 같이, 화합물 투니카마이신 (tunicamycin)의 이용에 의해 예방될 수 있다. 투니카마이신은 단백질-N-글리코시드 연쇄의 형성을 차단한다.
따라서 항원 결합 단백질의 당화 변이체가 본 발명의 다른 측면에 포함되고, 여기서 당화 부위(들)의 숫자 및/또는 유형이 부모 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 변경된다. 일정한 구체예에서, 항체 단백질 변이체는 고유 항체보다 더욱 많은 또는 더욱 적은 숫자의 N-연결된 당화 부위를 포함한다. N-연결된 당화 부위는 서열: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr로 특징되고, 여기서 X로 명명된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 이러한 서열을 산출하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결된 탄수화물 사슬의 부가를 위한 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 대안으로, 이러한 서열을 제거하거나 변경하는 치환은 고유 폴리펩티드 내에 존재하는 N-연결된 탄수화물 사슬의 부가를 예방할 것이다. 가령, 당화는 Asn의 결실에 의해, 또는 상이한 아미노산으로 Asn을 치환함으로써 감소될 수 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 새로운 N-연결된 부위가 발생된다. 항체는 전형적으로, Fc 영역 내에서 N-연결된 당화 부위를 갖는다.
라벨과 작동체 기
일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 하나 이상의 라벨을 포함한다. 용어 "표지화 기" 또는 "라벨"은 임의의 검출가능 라벨을 의미한다. 적절한 표지화 기의 실례에는 방사성동위원소 또는 방사성핵종 (가령, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 기 (가령, FITC, 로다민, 란탄족 형광체), 효소 기 (가령, 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제), 화학발광 기, 비오티닐 기, 또는 이차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (가령, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 표지화 기는 잠재적인 입체 방해 (steric hindrance)를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 암 (arm)을 통해 항원 결합 단백질에 결합된다. 단백질을 표지화하기 위한 다양한 방법은 당분야에 공지되어 있고 적합하다고 생각될 때 이용될 수 있다.
용어 "작동체 기"는 세포독성제로서 기능하는 항원 결합 단백질에 결합된 임의의 기를 의미한다. 적절한 작동체 기의 실례는 방사성동위원소 또는 방사성핵종 (가령, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)이다. 다른 적절한 기에는 독소, 치료적 기, 또는 화학치료적 기가 포함된다. 적절한 기의 실례에는 칼리키아마이신 (calicheamicin), 아우리스타틴 (auristatin), 젤다나마이신 (geldanamycin)과 메이탄신 (maytansine)이 포함된다. 일부 구체예에서, 작동체 기는 잠재적인 입체 방해 (steric hindrance)를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 암 (arm)을 통해 항원 결합 단백질에 결합된다.
일반적으로, 라벨은 그들이 검출되는 분석법에 따라서, 다양한 부류에 속한다: a) 방사성 또는 무거운 동위원소일 수 있는 동위원소 라벨 ; b) 자석 라벨 (가령, 자석 입자); c) 산화환원 활성 모이어티; d) 광학 염료; 효소 기 (가령, 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제); e) 비오틴화된 기; 그리고 f) 이차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (가령, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등). 일부 구체예에서, 표지화 기는 잠재적인 입체 방해 (steric hindrance)를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 암 (arm)을 통해 항원 결합 단백질에 결합된다. 단백질을 표지화하기 위한 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있다.
특유한 라벨에는 발색단, 형광체와 형광단이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 광학 염료가 포함되고, 형광단이 많은 경우에 특유하다. 형광단은 "소형 분자" 형광단, 또는 단백질성 형광단일 수 있다.
"형광 라벨"은 고유의 형광 특성을 통해 검출될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 적절한 형광 라벨에는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, Lucifer Yellow, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon green, Alexa-Fluor 염료 (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow와 R-피로에리트린 (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, 로다민, 그리고 Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 형광단을 비롯한 적절한 광학 염료는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 Richard P. Haugland에 의한 Molecular Probes Handbook에 기술된다.
적절한 단백질성 형광 라벨에는 Renilla, Ptilosarcus, 또는 Aequorea 종류의 GFP를 비롯한 녹색 형광 단백질 (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Labs., Inc., Genbank Accession Number U55762), 청색 형광 단백질 (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canada; Stauber, 1998 Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr . Biol . 6:178-182), 강화된 황색 형광 단백질 (EYFP, Clontech Labs., Inc.), 루시페라아제 (Ichiki et al., 1993, J. Immunol . 150:5408-5417), β 갈락토시다아제 (Nolan et al., 1988, Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A . 85:2603-2607) 및 레닐라 (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, 미국 특허 No. 5292658, No. 5418155, No. 5683888, No. 5741668, No. 5777079, No. 5804387, No. 5874304, No. 5876995, No. 5925558) 역시 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
CGRP 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열
항체, 또는 이의 단편, 유도체, 뮤테인, 또는 변이체의 한쪽 또는 양쪽 사슬을 인코딩하는 핵산, 중쇄 가변 영역, 또는 CDR 만을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 혼성화 프로브로서 이용하기 충분한 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 확인하거나, 분석하거나, 돌연변이시키거나, 또는 증폭하기 위한 PCR 프라이머 또는 염기서열분석 프라이머, 폴리뉴클레오티드의 발현을 저해하기 위한 안티-센스 핵산, 그리고 전술한 것들의 상보성 서열을 비롯하여, 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 또는 이의 일부분 역시 제시된다. 이들 핵산은 임의의 길이를 가질 수 있다. 이들은 예로써, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있고, 및/또는 하나 이상의 추가 서열, 예를 들면, 조절 서열을 포함할 수 있고, 및/또는 더욱 큰 핵산, 예를 들면, 벡터의 일부일 수 있다. 이들 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 그리고 RNA 및/또는 DNA 뉴클레오티드, 그리고 이들의 인공 변이체 (가령, 펩티드 핵산)을 포함할 수 있다.
표 7에서는 IgG2 중쇄 불변 영역, 카파 경쇄 불변 영역 및 람다 hCL-1 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 예시적인 핵산 서열을 제시한다. 본 명세서에서 제시된 임의의 가변 영역이 완전한 중쇄와 경쇄 서열을 형성하기 위하여 이들 불변 영역에 부착될 수 있다. 하지만, 이들 불변 영역 서열은 단지 특정한 실례로서 제공되는 것으로 이해되어야 한다 -- 당업자는 IgG1 중쇄 불변 영역, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역, hCL-1, hCL-2, hCL-3과 hCL-7을 비롯한 7개 람다 경쇄 불변 영역 중에서 한 가지; 향상된 안정성, 발현, 제조용이성 (manufacturability) 또는 기타 바람직한 특징 등을 위하여 변형되는 불변 영역을 비롯한 다른 불변 영역을 이용할 수도 있다. 일부 구체예에서, 가변 영역 서열은 당분야에 공지된 다른 불변 영역 서열에 결합된다. 중쇄와 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 예시적인 핵산 서열은 표 8에 제시된다.
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표 8에서는 중쇄와 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 예시적인 핵산 서열을 제시하고, 여기에 다양한 CDRL1, CDRL2와 CDRL3, 또는 CDRH1, CDRH2와 CDRH3 서열이 끼워 넣어진다.
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표 9에서는 본 명세서에서 제시된 예시적인 분리된 항원-결합 단백질, 구체적으로 hCGRP R 결합 단백질의 완전한 중쇄와 경쇄, 그리고 중쇄와 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 예시적인 핵산 서열의 서열 번호을 제시한다.
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일정한 항원 결합 단백질, 또는 이들의 일부분 (가령, 전장 항체, 중쇄 또는 경쇄, 가변 도메인, 또는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3)을 인코딩하는 핵산은 예로써, 전장 CGRP R (CRLR과 RAMP1을 둘 모두 포함), CGRP R의 세포외 도메인 (CRLR과 RAMP1의 세포외 도메인 포함), CGRP R을 발현하는 전체 세포, CGRP R을 발현하는 세포로부터 준비된 막, 융합 단백질, 예를 들면, Fc에 융합된 CRLR, RAMP1 (또는 이들의 세포외 도메인)을 포함하는 Fc 융합체로 면역화시킴으로써, 그리고 예로써, 본 명세서 실시예 1-3에서 기술된 바와 같이 당분야에 공지된 다른 방법을 이용하여, CGRP R 또는 이의 면역원성 성분으로 면역화된 생쥐의 B-세포로부터 분리될 수 있다. 핵산은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 전통적인 절차에 의해 분리될 수 있다. 파지 전시 (Phage display)는 항체 및 다른 항원 결합 단백질의 유도체가 제조되는 공지된 기술의 다른 실례이다. 한 가지 접근법에서, 목적의 항원 결합 단백질의 성분인 폴리펩티드가 임의의 적절한 재조합 발현 시스템에서 발현되고, 그리고 발현된 폴리펩티드는 조합하여 항원 결합 단백질 분자를 형성하게 된다.
표 7-9에 제시된 핵산은 단지 예시이다. 유전자 코드 (genetic code)의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여, 표 2-5에 제시되거나, 또는 본 명세서에서 달리 서술된 각각의 폴리펩티드 서열은 또한, 제시된 것들 이외에, 다수의 다른 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 당업자는 본 출원이 각각의 항원 결합 단백질을 인코딩하는 각각의 축퇴성 뉴클레오티드 서열에 대한 적절한 서면으로 된 설명과 권능을 제공한다는 것을 인지할 것이다.
한 측면에서 특정한 혼성화 조건 하에, 다른 핵산 (가령, 표 7, 표 8, 표 9 및/또는 서열 번호 224-258에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산)에 혼성화되는 핵산을 더욱 제시한다. 핵산을 혼성화시키는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다 (참조: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6). 본 명세서에서, 중간으로 엄격한 혼성화 조건은 5x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC)을 포함하는 전세척 용액, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0); 대략 50% 포름아미드, 6x SSC, 그리고 55℃ 혼성화 온도의 혼성화 완충액 (또는 다른 유사한 혼성화 용액, 예를 들면, 대략 50% 포름아미드 및 42℃의 혼성화 온도를 보유하는 혼성화 용액), 그리고 0.5x SSC, 0.1% SDS에서 60℃의 세척 조건을 이용한다. 엄격한 혼성화 조건은 45℃에서 6x SSC, 그 이후에 68℃에서 0.1x SSC, 0.2% SDS에서 1회 이상의 세척에 의해 혼성화된다. 게다가, 당업자는 서로에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 전형적으로, 서로에 혼성화된 상태로 남아있도록 하기 위하여 혼성화의 엄격함이 증가 또는 감소하도록 혼성화 및/또는 세척 조건을 조작할 수 있다.
혼성화 조건의 선택에 영향을 주는 기본 파라미터 및 적절한 조건을 고안하기 위한 보도는 예로써, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., supra; 그리고 Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 섹션 2.10과 6.3-6.4)에서 기술되고, 그리고 예로써, 핵산의 길이 및/또는 염기 조성에 기초하여, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
변화는 핵산 내로 돌연변이에 의해 도입될 수 있고, 따라서 상기 핵산이 인코딩하는 폴리펩티드 (가령, 항체 또는 항체 유도체)의 아미노산 서열에서 변화가 발생될 수 있다. 돌연변이는 당분야에 공지된 임의의 기술을 이용하여 도입될 수 있다. 한 구체예에서, 예로써 특정 부위 돌연변이유발 (site-directed mutagenesis) 프로토콜을 이용하여 하나 이상의 특정한 아미노산 잔기가 변경된다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 무작위로 선택된 잔기가 예로써, 무작위 돌연변이유발 (random mutagenesis) 프로토콜을 이용하여 변경된다. 어떤 방식으로 만들어지던 간에, 돌연변이체 폴리펩티드는 발현되고 원하는 특성에 대하여 스크리닝될 수 있다.
핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 현저하게 변화시키지 않으면서, 돌연변이가 상기 핵산 내로 도입될 수 있다. 가령, 비-필수 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유발하는 뉴클레오티드 치환을 만들 수 있다. 대안으로, 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 선별적으로 변화시키는 하나 이상의 돌연변이가 상기 핵산 내로 도입될 수 있다. 가령, 돌연변이는 생물학적 활성을 정량적으로 또는 정성적으로 변화시킬 수 있다. 정량적 변화의 실례에는 활성의 증가, 감소 또는 소멸이 포함된다. 정성적 변화의 실례에는 항체의 항원 특이성 변화가 포함된다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 제시된 임의의 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산은 당분야에 널리 확립된 분자 생물학 기술을 이용하여, 아미노산 서열이 변경되도록 돌연변이될 수 있다.
다른 측면에서는 핵산 서열의 검출을 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 이용하기 적합한 핵산 분자를 제시한다. 핵산 분자는 전장 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 일부분, 예를 들면, 프로브 또는 프라이머로서 이용될 수 있는 단편 또는 폴리펩티드의 활성 부분 (가령, CGRP R 결합 부분)을 인코딩하는 단편만을 포함할 수 있다.
핵산 서열에 기초된 프로브는 핵산 또는 유사한 핵산, 예를 들면, 폴리펩티드를 인코딩하는 전사체를 검출하는데 이용될 수 있다. 프로브는 라벨 기, 예를 들면, 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조-인자를 포함할 수 있다. 이들 프로브는 이러한 폴리펩티드를 발현하는 세포를 확인하는데 이용될 수 있다.
다른 측면에서는 폴리펩티드 또는 이의 일부분 (가령, 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 가변 영역 도메인을 포함하는 단편)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제시한다. 벡터의 실례에는 플라스미드, 바이러스 벡터, 비-에피솜 포유동물 벡터 및 발현 벡터, 예를 들면, 재조합 발현 벡터가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 핵산을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 발현에 이용되는 숙주 세포에 기초하여 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 이들 조절 서열은 발현되는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 조절 서열에는 많은 유형의 숙주 세포 내에서 뉴클레오티드 서열의 구조성 발현을 주동하는 것들 (가령, SV40 초기 유전자 인핸서, 라우스 육종 (Rous sarcoma) 바이러스 프로모터와 사이토메갈로바이러스 프로모터), 일정한 숙주 세포 내에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 주동하는 것들 (가령, 조직-특이적 조절 서열; Voss et al., 1986, Trends Biochem . Sci . 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨), 그리고 특정한 처리 또는 조건에 응하여 뉴클레오티드 서열의 유도성 발현을 주동하는 것들 (가령, 포유동물 세포에서 메탈로티오닌 프로모터, 그리고 원핵과 진핵 생물체 둘 모두에서 tet-반응성 및/또는 스트렙토마이신 반응성 프로모터)이 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있다. 이들 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 따라서 본 명세서에서 제시된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩된 융합 단백질 또는 펩티드를 비롯한 단백질 또는 펩티드가 생산될 수 있다.
다른 측면에서는 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포를 제시한다. 숙주 세포는 임의의 원핵 세포 (가령, 대장균 (E. coli)) 또는 진핵 세포 (가령, 효모, 곤충, 또는 포유동물 세포 (가령, CHO 세포))일 수 있다. 벡터 DNA는 전통적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 포유동물 세포의 안정적인 형질감염을 위하여, 이용된 발현 벡터와 형질감염 기술에 따라서, 극히 일부의 세포만 그들의 게놈 내로 외래 DNA를 통합하는 것으로 알려져 있다. 이들 인터그란트 (integrant)를 확인하고 선별하기 위하여, 선별가능 마커 (가령, 항생제에 대한 내성)를 인코딩하는 유전자가 일반적으로, 목적 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 선호되는 선별가능 마커에는 약물, 예를 들면, G418, 히그로마이신과 메토트렉사트에 대한 내성을 공여하는 것들이 포함된다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포는 다른 방법 중에서, 약물 선별 (drug selection)에 의해 확인될 수 있다 (가령, 선별가능 마커 유전자를 통합하는 세포는 생존할 것이고, 그렇지 못한 세포는 사멸될 것이다).
항원 결합 단백질의 제조
예로써, 임의의 항체-생산 동물, 예를 들면, 생쥐, 쥐, 토끼, 염소, 당나귀, 또는 비-인간 영장류 (가령, 원숭이 (가령, 필리핀 원숭이 또는 레서스 원숭이) 또는 유인원 (가령, 침팬지))로부터 유래될 수 있는 비-인간 항체가 제시된다. 비-인간 항체는 가령, 시험관내 세포 배양 및 세포-배양 기초된 적용, 또는 항체에 대한 면역 반응 (immune response)이 발생하지 않거나 무의미하거나, 예방될 수 있거나, 관심 대상이 아니거나, 또는 요망되는 임의의 다른 적용에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 항체는 상기에서 및/또는 하기 실시예 1-3에서 기술된 바와 같이, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 동물을 면역화시킴으로써 생산될 수 있다. 이들 실시예에서는 3가지 상이한 면역원 제조물 - (i) CGRP R의 2가지 주요 성분 - RAMP1과 CRLR의 전장 이형을 발현하는 전체 세포; (ii) 이들 세포로부터 막 추출물; 그리고 (iii) CRLR과 RAMP1의 N-말단 세포외 도메인을 공동-발현시키고 정제함으로써 획득된 가용성 CGRP R을 이용한, 안티 CGRP R 항체의 산출을 기술한다. 항체는 다중클론이거나, 단일클론이거나, 또는 재조합 DNA를 발현함으로써 숙주 세포 내에서 합성될 수 있다. 완전한 인간 항체는 인간 면역글로불린 좌위를 보유하는 유전자도입 동물을 면역화시킴으로써, 또는 인간 항체의 레퍼토리를 발현하는 파지 전시 라이브러리 (phage display library)를 선택함으로써 앞서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
단일클론 항체 (mAb)는 전통적인 단일클론 항체 방법, 예를 들면, Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 대안으로, 단일클론 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 예를 들면, B-림프구의 바이러스 또는 종양발생 형질전환이 이용될 수 있다. 하이브리도마를 제조하는데 적합한 한 가지 동물 시스템은 뮤린 시스템인데, 이는 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 분리 기술은 당분야에 공지되어 있고, 그리고 예시적인 접근법은 하기 실시예에서 기술된다. 이런 절차를 위하여, 면역화된 생쥐로부터 B 세포가 전형적으로, 적절한 영속화된 융합 상대, 예를 들면, 뮤린 골수종 세포주와 융합된다. 원하는 경우에, 생쥐 대신에 쥐 또는 다른 포유동물이 면역화될 수 있고, 그리고 이들 동물로부터 B 세포가 뮤린 골수종 세포주와 융합되어 하이브리도마가 만들어질 수 있다. 대안으로, 생쥐 이외의 출처로부터 골수종 세포주가 이용될 수도 있다. 하이브리도마를 만들기 위한 융합 절차 역시 널리 공지되어 있다
본 명세서에서 제시되는 단일 사슬 항체는 아미노산 가교 (짧은 펩티드 링커)를 통해 중쇄와 경쇄 가변 도메인 (Fv 영역) 단편을 연결하여 단일 폴리펩티드 사슬을 산출함으로써 만들어질 수 있다. 이런 단일-사슬 Fv (scFv)는 2개의 가변 도메인 폴리펩티드 (VL과 VH)를 인코딩하는 DNA 사이에 펩티드 링커를 인코딩하는 DNA를 융합함으로써 만들어질 수 있다. 결과의 폴리펩티드는 스스로 본래 상태로 접힘되어 항원-결합 단량체를 형성하거나, 또는 이들은 2개의 가변 도메인 사이에 유연성 링커의 길이에 따라, 다합체 (가령, 이합체, 삼합체, 또는 사합체)를 형성할 수 있다 (Kortt et al., 1997, Prot . Eng . 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng . 18:95-108). 상이한 VL과 VH -포함 폴리펩티드를 결합함으로써, 상이한 에피토프에 결합하는 다중결합 scFv를 형성할 수 있다 (Kriangkum et al., 2001, Biomol . Eng . 18:31-40). 단일 사슬 항체의 생산을 위해 개발된 기술에는 U.S. Pat. No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A. 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol . 178:379-387에서 기술된 것들이 포함된다. 본 명세서에 제시된 항체로부터 유래된 단일 사슬 항체에는 표 3에 제시된 중쇄와 경쇄 가변 영역의 가변 도메인 조합을 포함하는 scFv, 또는 표 4A와 4B에 제시된 CDR을 포함하는 경쇄와 중쇄 가변 도메인의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
한 가지 하위부류인 본 명세서에서 제시된 항체는 하위부류 스위칭 방법을 이용하여, 상이한 하위부류의 항체로 변경될 수 있다. 따라서 IgG 항체는 예로써, IgM 항체로부터 유래될 수 있고, 그리고 그 반대일 수 있다. 이런 기술은 소정의 항체 (부모 항체)의 항원 결합 특성을 가질 뿐만 아니라 부모 항체와 상이한 항체 아이소타입 또는 하위부류와 연관된 생물학적 특성을 나타내는 새로운 항체의 제조를 가능하게 한다. 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 특정한 항체 폴리펩티드를 인코딩하는 클로닝된 DNA, 예를 들면, 원하는 아이소타입의 항체의 불변 도메인을 인코딩하는 DNA가 이런 절차에 이용될 수 있다 (참조: Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316).
따라서 본 명세서에 제시된 항체에는 예로써, 앞서 기술된 가변 도메인 조합을 포함하고 원하는 아이소타입을 갖는 것들 (가령, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, 그리고 IgD), 그리고 이들의 Fab 또는 F(ab')2 단편이 포함된다. 게다가, IgG4가 요망되면, IgG4 항체에서 이질 (heterogeneity)을 유발할 수 있는 H 사슬내 이황화 결합을 형성하는 성향을 경감시키기 위하여, Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407에서 기술된 바와 같이 힌지 영역 내에 점 돌연변이 (CPSCP->CPPCP)를 도입하는 것이 바람직할 수도 있다.
게다가, 상이한 특성을 갖는 항체 (즉, 그들이 결합하는 항원에 대하여 가변적인 친화성을 갖는 항체)를 유도하는 기술 역시 공지되어 있다. 사슬 셔플링 (chain shuffling)으로 지칭되는 이와 같은 기술은 종종, 파지 전시로 지칭되는 섬유상 박테리오파지의 표면 상에 면역글로불린 가변 도메인 유전자 레퍼토리를 전시하는 것을 수반한다. 사슬 셔플링은 Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779에서 기술된 바와 같이, 합텐 2-페닐옥사졸-5-원에 대한 높은 친화성 항체를 제조하는데 이용되고 있다.
일정한 바람직한 기능적 및 생화학적 특징을 갖는 CGRP R 결합 단백질을 생산하기 위하여, 표 3에서 기술된 중쇄와 경쇄 가변 영역, 또는 표 4A와 4B에 기술된 CDR에 보존성 변형 (및 인코딩 핵산에 상응하는 변형)이 만들어질 수 있다. 이런 변형을 달성하는 방법은 앞서 기술된다.
CGRP 항원 결합 단백질은 다양한 방식으로 더욱 변형될 수 있다. 가령, 이들이 치료 목적에 이용되면, 이들은 혈청 반감기를 연장시키거나, 또는 단백질 전달을 향상시키기 위하여 폴리에틸렌 글리콜과 접합 (페길화)될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 항체 또는 이들의 단편의 V 영역은 상이한 항체 분자의 Fc 영역과 융합될 수 있다. 이러한 목적에 이용되는 Fc 영역은 이러한 영역이 보체에 결합하지 않고, 따라서 융합 단백질이 치료제로서 이용될 때 환자 내에서 세포 용해 (cell lysis)를 유도하는 가능성이 감소하도록 변형될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 항체 또는 이들의 기능적 단편은 본 발명의 항체 또는 이들의 항원 결합 단편의 혈청 반감기를 향상시키기 위하여 인간 혈청 알부민과 접합될 수 있다. 항원 결합 단백질 또는 이들의 단편에 유용한 다른 융합 상대는 트랜스타이레틴 (TTR)이다. TTR은 사합체를 형성하는 능력을 갖고, 따라서 항체-TTR 융합 단백질은 그의 결합 친화력 (binding avidity)을 증가시키는 다가 항체 (multivalent antibody)를 형성할 수 있다.
대안으로, 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질의 기능적 및/또는 생화학적 특징에서 실질적인 변경은 예로써, (a) 시트 또는 나선 배좌로서 치환의 구역 내에서 분자 중추의 구조, (b) 표적 부위에서 상기 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 큰 부피를 유지하는 것에 대한 효과에서 현저하게 다른 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열 내에서 치환을 발생시킴으로써 달성될 수 있다. "보존성 아미노산 치환"은 상기 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 대한 효과가 거의 또는 전혀 없는 외래 잔기로 고유 아미노산 잔기의 치환을 수반할 수 있다 (상기 표 4 참조). 게다가, 폴리펩티드 내에서 임의의 고유 잔기 역시, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 (alanine scanning mutagenesis)에 대하여 앞서 기술된 바와 같이, 알라닌으로 치환될 수 있다.
본 발명의 항체의 아미노산 치환 (보존성 또는 비-보존성)은 일과적인 기술을 적용함으로써 당업자에 의해 수행될 수 있다. 아미노산 치환은 본 명세서에서 제시된 항체의 중요한 잔기를 확인하거나, 또는 인간 CGRP R에 대한 이들 항체의 친화성을 증가 또는 감소시키거나, 또는 본 명세서에서 제시된 다른 항원-결합 단백질의 결합 친화성을 변화시키는데 이용될 수 있다.
항원 결합 단백질을 발현하는 방법
앞서 기술된 바와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태로 발현 시스템과 구조체, 그리고 이런 발현 시스템 또는 구조체를 포함하는 숙주 세포 역시 본 명세서에서 제시된다.
본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질은 다수의 전통적인 기술 중에서 한 가지에 의해 제조될 수 있다. 가령, CGRP R 항원 결합 단백질은 당분야에 공지된 임의의 기술을 이용하여, 재조합 발현 시스템에 의해 생산될 수 있다 (참조: Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennetet al. (eds.) Plenum Press, New York (1980); 그리고 Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)).
항원 결합 단백질은 하이브리도마 세포주 (가령, 특히, 항체가 하이브리도마에서 발현될 수 있다), 또는 하이브리도마 이외의 세포주에서 발현될 수 있다. 이들 항체를 인코딩하는 발현 구조체는 포유동물, 곤충 또는 미생물 숙주 세포를 형질전환시키는데 이용될 수 있다. 형질전환은 예로써, 바이러스 또는 박테리오파지 내에서 폴리뉴클레오티드를 포장 (packaging)하고, 그리고 미국 특허 No. 4,399,216; No. 4,912,040; No. 4,740,461; No. 4,959,455에서 예시된 바와 같이, 당분야에 공지된 형질감염 절차에 의해 상기 구조체로 숙주 세포를 형질도입하는 것을 비롯하여, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 이용된 최적 형질전환 절차는 어떤 유형의 숙주 세포가 형질전환되는 지에 좌우될 것이다. 이종기원 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 그리고 여기에는 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 (polybrene) 매개된 형질감염, 원형질체 (protoplast) 융합, 전기천공 (electroporation), 리포좀 내에서 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 핵산과 양으로 하전된 지질의 혼합, 그리고 핵 내로 DNA의 직접적인 미세주입 (microinjection)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
재조합 발현 구조체는 전형적으로, 아래 중에서 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다: 본 명세서에서 제시된 하나 이상의 CDR; 경쇄 불변 영역; 경쇄 가변 영역; 중쇄 불변 영역 (가령, CH1, CH2 및/또는 CH3); 및/또는 CGRP R 항원 결합 단백질의 다른 스캐폴드 (scaffold) 부분. 이들 핵산 서열은 표준 결찰 기술을 이용하여 적절한 발현 벡터 내로 삽입된다. 한 구체예에서, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역은 항-CGRP R-특이적 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 C-말단에 부가되고 발현 벡터 내로 결찰된다. 벡터는 전형적으로, 이용되는 특정한 숙주 세포 내에서 기능하는 것으로 선택된다 (즉, 벡터는 숙주 세포 기구와 양립하고 유전자의 증폭 및/또는 발현이 발생할 수 있도록 한다). 일부 구체예에서, 단백질 리포터, 예를 들면, 디히드로엽산 환원효소 (dihydrofolate reductase)를 이용한 단백질-단편 상보성 (complementation) 분석법을 이용하는 벡터가 이용된다 (참조: U.S. Pat. No. 6,270,964, 이는 본 발명에 참조로서 편입됨). 적절한 발현 벡터는 예로써, Invitrogen Life Technologies 또는 BD Biosciences (이전에, "Clontech")로부터 구입될 수 있다. 이들 항체와 단편을 클로닝하고 발현하는데 유용한 다른 벡터에는 본 발명에 참조로서 편입되는 Bianchi and McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol . Bioeng. 84:439-44에서 기술된 것들이 포함된다. 추가의 적절한 발현 벡터는 예로써, Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press에서 논의된다.
전형적으로, 임의의 숙주 세포에 이용되는 발현 벡터는 플라스미드 유지, 그리고 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝과 발현을 위한 서열을 보유할 것이다. 일정한 구체예에서 "측면 서열 (flanking sequence)"로 지칭되는 이런 서열은 전형적으로, 아래의 뉴클레오티드 서열 중에서 하나 이상을 포함할 것이다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 기원, 전사 종결 서열, 공여자와 수용자 절단접합 부위 (splice site)를 보유하는 완전 인트론 서열, 폴리펩티드 분비를 위한 리더 서열을 인코딩하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 그리고 선별가능 마커 요소. 이들 각 서열은 하기에 논의된다.
선택적으로, 벡터는 CGRP R 결합 단백질 코딩 서열의 5′ 또는 3′ 단부에 위치된 "태그"-인코딩 서열, 즉, 올리고뉴클레오티드 분자를 보유할 수 있다; 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 polyHis (가령, hexaHis), 또는 상업적으로 가용한 항체가 존재하는 다른 "태그", 예를 들면, FLAG®, HA (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스), 또는 myc를 인코딩한다. 이러한 태그는 전형적으로, 폴리펩티드의 발현 시에 상기 폴리펩티드에 융합되고, 그리고 숙주 세포로부터 CGRP R 결합 단백질의 친화성 정제 또는 검출의 수단으로서 기능할 수 있다. 친화성 정제는 예로써, 친화성 매트릭스로서 태그에 대한 항체를 이용한 칼럼 크로마토그래피 (column chromatography)에 의해 달성될 수 있다. 선택적으로, 태그는 절단을 위한 일정한 펩티다아제의 이용과 같은 다양한 수단에 의해, 정제된 CGRP R 결합 단백질로부터 차후에 제거될 수 있다.
측면 서열은 상동성 (즉, 숙주 세포로서 동일한 종 및/또는 균주로부터), 이종기원 (즉, 숙주 세포 종 또는 균주와 상이한 종으로부터), 하이브리드 (즉, 한 가지 이상의 출처로부터 측면 서열의 조합), 합성 또는 고유일 수 있다. 따라서 측면 서열의 출처는 이러한 측면 서열이 숙주 세포 기구에서 기능적이고, 그리고 이러한 숙주 세포 기구에 의해 활성화될 수 있으면, 임의의 원핵 또는 진핵 생물체, 임의의 척추동물 또는 무척추동물, 또는 임의의 식물일 수 있다.
벡터에 유용한 측면 서열은 당분야에 널리 공지된 여러 방법 중에서 한 가지에 의해 획득될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 유용한 측면 서열은 맵핑 (mapping) 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 미리 확인되었고, 따라서 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 적절한 조직 출처로부터 분리될 수 있다. 일부 경우에, 측면 서열의 완전 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다. 여기서, 측면 서열은 핵산 합성 또는 클로닝을 위한 본 명세서에서 제시된 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
측면 서열의 전부 또는 일부만 알려져 있는 지에 상관없이, 이는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 및/또는 적절한 프로브, 예를 들면, 동일하거나 상이한 종으로부터 올리고뉴클레오티드 및/또는 측면 서열 단편으로 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 획득될 수 있다. 측면 서열이 알려져 있지 않으면, 측면 서열을 보유하는 DNA의 단편이 예로써, 코딩 서열 또는 심지어 다른 유전자(들)를 보유하는 DNA의 더욱 큰 조각으로부터 분리될 수 있다. 분리는 적절한 DNA 단편을 산출하는 제한 엔도뉴클레아제 절단, 그 이후에 아가로즈 겔 정제, Qiagen® 칼럼 크로마토그래피 (Chatsworth, CA), 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 이용한 분리에 의해 달성될 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위한 적절한 효소의 선택은 당업자에게 명백할 것이다.
복제 기원은 전형적으로, 상업적으로 구입된 원핵 발현 벡터의 일부이고, 그리고 숙주 세포 내에서 상기 벡터의 증폭을 보조한다. 선택되는 벡터가 복제 기원 부위를 보유하지 않으면, 이는 공지된 서열에 기초하여 화학적으로 합성되고, 그리고 벡터 내로 결찰될 수 있다. 가령, 플라스미드 pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA)로부터 복제 기원이 대부분의 그람-음성 세균에 적합하고, 그리고 다양한 바이러스 기원 (가령, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 또는 유두종바이러스, 예를 들면, HPV 또는 BPV)이 포유동물 세포 내에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기원 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (가령, SV40 기원은 바이러스 초기 프로모터 역시 보유하기 때문에, 종종 이용된다).
전사 종결 서열은 전형적으로, 폴리펩티드 코딩 영역의 단부에서 3′에 위치하고, 그리고 전사를 종결시키는 기능을 한다. 일반적으로, 원핵 세포에서 전사 종결 서열은 G-C 풍부한 단편, 그 이후에 폴리-T 서열이다. 전사 종결 서열이 라이브러리로부터 용이하게 클로닝되거나, 또는 심지어, 벡터의 일부로서 상업적으로 구입되긴 하지만, 이는 또한, 본 명세서에서 제시된 것들과 같은 핵산 합성을 위한 방법을 이용하여 용이하게 합성될 수 있다.
선별가능 마커 유전자는 선별적인 배양 배지에서 성장되는 숙주 세포의 생존과 성장을 위하여 필요한 단백질을 인코딩한다. 전형적인 선별 마커 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 원핵 숙주 세포의 경우에 암피실린, 테트라사이클린, 또는 카나마이신에 대한 내성을 공여하거나; (b) 세포의 영양요구성 결함 (auxotrophic deficiency)을 보완하거나; 또는 (c) 복합 배지 또는 규정 배지로부터 가용하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 인코딩한다. 특정한 선별가능 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 그리고 테트라사이클린 내성 유전자이다. 유리하게는, 네오마이신 내성 유전자 역시 원핵과 진핵 숙주 세포 둘 모두에서 선별에 이용될 수 있다.
다른 선별가능 유전자가 발현되는 유전자를 증폭하는데 이용될 수 있다. 증폭은 성장 또는 세포 생존에 중요한 단백질의 생산에 요구되는 유전자가 재조합 세포의 후세대의 염색체 내에서 직렬식으로 반복되는 과정이다. 포유동물 세포에 적합한 선별가능 마커의 실례에는 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 및 프로모터-없음 티미딘 키나아제 유전자가 포함된다. 포유동물 세포 형질전환체 (transformant)는 벡터 내에 존재하는 선별가능 유전자에 의하여 형질전환체만 유일하게 적응하고 생존하게 되는 도태 압력 (selection pressure) 하에 놓여진다. 도태 압력은 배지 내에서 선별 작인 (selection agent)의 농도가 연속적으로 증가되어 선별가능 유전자, 그리고 다른 유전자, 예를 들면, CGRP R에 결합하는 항원 결합 단백질을 인코딩하는 DNA 둘 모두의 증폭을 유발하는 조건 하에, 형질전환된 세포를 배양함으로써 강제된다. 결과적으로, 증가된 양의 폴리펩티드, 예를 들면, 항원 결합 단백질이 증폭된 DNA로부터 합성된다.
리보솜-결합 부위는 일반적으로, mRNA의 번역 개시에 필요하고 Shine-Dalgarno 서열 (원핵생물) 또는 Kozak 서열 (진핵생물)로 특징된다. 이러한 요소는 전형적으로, 프로모터의 3'에, 그리고 발현되는 폴리펩티드의 코딩 서열의 5'에 위치한다.
당화가 진핵 숙주 세포 발현 시스템에서 요망되는 경우와 같은 일부 경우에, 당화 또는 수율을 개선하기 위하여 다양한 프리 (pre)- 또는 프로 (pro)-서열이 조작될 수 있다. 가령, 특정한 신호 펩티드의 펩티다아제 절단 부위가 변경되거나, 또는 프로서열 (prosequence)이 추가되는데, 이것 역시 당화에 영향을 줄 수 있다. 최종 단백질 산물은 -1 위치 (성숙 단백질의 첫 번째 아미노산에 상대적인)에서, 발현에 부수되는 하나 이상의 추가적인 아미노산을 포함하고, 이들 아미노산은 완전하게 제거되지 않을 수도 있다. 가령, 최종 단백질 산물은 아미노-말단에 부착된, 펩티다아제 절단 부위에서 관찰되는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 대안으로, 일부 효소 절단 부위의 이용은 상기 효소가 성숙 폴리펩티드 내에서 이런 구역을 절단하면, 원하는 폴리펩티드의 약간 절두된 형태를 산출할 수 있다.
발현과 클로닝은 전형적으로, 숙주 생물체에 의해 인식되고 CGRP R 결합 단백질을 인코딩하는 분자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 수반한다. 프로모터는 구조 유전자의 전사를 제어하는 구조 유전자 (일반적으로, 대략 100 내지 1000 bp)의 시작 코돈 (start codon)의 상류 (즉, 5')에 위치하는 비-전사된 서열이다. 프로모터는 전통적으로, 2가지 부류: 유도성 프로모터와 구조성 프로모터 중에서 한 가지로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서 상당한 변화, 예를 들면, 영양분의 존재 또는 부재, 또는 온도에서 변화에 응하여 그들의 제어 하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 다른 한편, 구조성 프로모터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자를 일정하게, 다시 말하면, 유전자 발현에 대한 거의 또는 전혀 제어 없이 전사한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 알려져 있다. 적절한 프로모터는 제한 효소 절단으로 출처 DNA로부터 프로모터를 제거하고 원하는 프로모터 서열을 벡터 내로 삽입함으로써, CGRP R 결합 단백질을 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다.
효모 숙주에 이용하기 적합한 프로모터 역시 당분야에 널리 공지되어 있다. 유리하게는, 효모 인핸서가 효모 프로모터와 함께 이용된다. 포유동물 숙주 세포에 이용하기 적합한 프로모터는 널리 알려져 있고, 그리고 여기에는 바이러스, 예를 들면, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (가령, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 그리고 유인원 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 획득된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다른 적절한 포유동물 프로모터에는 이종기원 포유동물 프로모터, 예를 들면, 열-쇼크 프로모터 및 액틴 프로모터가 포함된다.
고려되는 추가의 프로모터에는 SV40 초기 프로모터 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); CMV 프로모터 (Thornsen et al., 1984, Proc . Natl . Acad. U.S.A . 81:659-663); 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복 (long terminal repeat)에 내포된 프로모터 (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터 (Wagner et al., 1981, Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A . 78:1444-1445); 메탈로티오닌 유전자로부터 프로모터와 조절 서열 (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 그리고 원핵 프로모터, 예를 들면, 베타-락타마아제 프로모터 (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 75:3727-3731); 또는 tac 프로모터 (DeBoer et al., 1983, Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A . 80:21-25)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 또한, 아래의 동물 전사 제어 영역이 고려되는데, 이들은 조직 특이성을 나타내고 유전자도입 동물에서 이용되고 있다: 췌장 샘꽈리 세포에서 활동성인 엘라스타아제 I 유전자 제어 영역 (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활동성인 인슐린 유전자 제어 영역 (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 림프계 세포에서 활동성인 면역글로불린 유전자 제어 영역 (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol . Cell. Biol . 7:1436-1444); 고환, 유방, 림프계와 비만 (mast) 세포에서 활동성인 생쥐 유선 종양 바이러스 제어 영역 (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); 간에서 활동성인 알부민 유전자 제어 영역 (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel . 1 :268-276); 간에서 활동성인 알파-페토-단백질 유전자 제어 영역 (Krumlauf et al., 1985, Mol . Cell. Biol . 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); 간에서 활동성인 알파 1-안티트립신 유전자 제어 영역 (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel . 1:161-171); 골수 세포에서 활동성 베타-글로빈 유전자 제어 영역 (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌 내에서 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte)에서 활동성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역 (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활동성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (Sani, 1985, Nature 314:283-286); 그리고 시상하부에서 활동성인 성선자극호르몬 방출 호르몬 유전자 제어 영역 (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
인핸서 서열은 고등 진핵생물에 의한, 인간 CGRP R 결합 단백질을 포함하는 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하는 DNA의 전사를 증가시키기 위하여 벡터 내로 삽입될 수 있다. 인핸서는 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키고 대략 10300 bp 길이를 갖는 DNA의 cis-작용 요소이다. 인핸서는 상대적으로, 배향과 위치 독립적이고 상기 전사 단위 (transcription unit)의 5'와 3' 위치 둘 모두에서 관찰된다. 포유동물 유전자로부터 가용한 여러 인핸서 서열이 알려져 있다 (가령, 글로빈, 엘라스타아제, 알부민, 알파-페토-단백질과 인슐린). 하지만, 전형적으로, 바이러스로부터 인핸서가 이용된다. SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 그리고 당분야에 공지된 아데노바이러스 인핸서는 진핵 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 향상 요소이다. 인핸서가 벡터 내에서 코딩 서열의 5' 또는 3' 에 배치될 수 있긴 하지만, 이는 전형적으로, 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다. 적절한 고유 또는 이종기원 신호 서열 (리더 서열 또는 신호 펩티드)을 인코딩하는 서열이 항체의 세포외 분비를 촉진하기 위하여, 발현 벡터 내로 통합될 수 있다. 신호 펩티드 또는 리더의 선택은 항체가 생산되는 숙주 세포의 유형에 좌우되고, 그리고 이종기원 신호 서열이 고유 신호 서열을 대체할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 기능적인 신호 펩티드의 실례에는 미국 특허 No. 4,965,195에서 기술된 인터류킨-7 (IL-7)에 대한 신호 서열; Cosman et al.,1984, Nature 312:768에서 기술된 인터류킨-2 수용체에 대한 신호 서열; EP 특허 No. 0367 566에서 기술된 인터류킨-4 수용체 신호 펩티드; U.S. 특허 No. 4,968,607에서 기술된 유형 I 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드; EP 특허 No. 0 460 846에서 기술된 유형 II 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드가 포함된다.
본 명세서에서 제시된 발현 벡터는 상업적으로 가용한 벡터와 같은 시작 벡터로부터 작제될 수 있다. 이런 벡터는 원하는 측면 서열의 전부를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 명세서에서 제시된 측면 서열 중에서 한 가지 이상이 벡터 내에 미리 존재하지 않는 경우에, 이들은 개별적으로 획득되고 벡터 내로 결찰될 수 있다. 각각의 측면 서열을 획득하는데 이용되는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
벡터가 작제되고, 그리고 경쇄, 중쇄, 또는 CGRP R 항원 결합 서열을 포함하는 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자가 상기 벡터의 적절한 부위 내로 삽입된 이후, 완전한 벡터는 증폭 및/또는 폴리펩티드 발현을 위하여 적절한 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 항원-결합 단백질에 대한 발현 벡터의 선택된 숙주 세포 내로의 형질전환은 형질감염, 감염, 인산칼슘 공동-침전, 전기천공, 미세주입, 리포펙션 (lipofection), DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 또는 다른 공지된 기술을 비롯한 널리 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로, 이용되는 숙주 세포의 유형의 함수일 것이다. 이들 방법 및 다른 적절한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 그리고 예로써, Sambrook et al., 2001, supra에서 기술된다.
숙주 세포는 적절한 조건 하에 배양될 때, 항원 결합 단백질을 합성하고, 이는 차후에, 배양 배지로부터 (숙주 세포가 항원 결합 단백질을 배지 내로 분비하면). 또는 이를 생산하는 숙주 세포로부터 직접적으로 (항원 결합 단백질이 분비되지 않으면) 수집될 수 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 다양한 인자, 예를 들면, 원하는 발현 수준, 활성을 위하여 바람직하거나 필수적인 폴리펩티드 변형 (가령, 당화 또는 포스포릴화), 그리고 생물학적으로 활성 분자로 접힘의 용이성에 좌우될 것이다.
발현을 위한 숙주로서 가용한 포유동물 세포주는 당분야에 널리 공지되어 있고, 그리고 여기에는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (가령, Hep G2), 그리고 다수의 기타 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 입수가능한 영속화된 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 세포주는 어떤 세포주가 높은 발현 수준을 갖고, 그리고 CGRP R 결합 특성을 갖는 항원 결합 단백질을 구조성으로 생산하는 지를 결정함으로써 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 자신의 항체를 만들지 못하지만 이종기원 항체를 만들고 분비하는 능력을 갖는 B 세포 계통의 세포주가 선택될 수 있다.
진단적 및 치료적 목적을 위한 인간 CGRP 항원 결합 단백질의 용도
항원 결합 단백질은 생물학적 시료에서 CGRP R의 검출 및 CGRP R을 생산하는 세포 또는 조직의 확인에 유용하다. 가령, CGRP R 항원 결합 단백질은 진단적 분석법, 예를 들면, 조직 또는 세포 내에서 발현된 CGRP R을 검출하고 및/또는 정량하는 결합 분석법에 이용될 수 있다. CGRP R에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 또한, 병든 환자에서 CGRP R에 관련된 질환의 치료에 이용될 수 있다. 이에 더하여, CGRP R 항원 결합 단백질은 CGRP R이 리간드 CGRP와 복합체를 형성하는 것을 저해하고, 따라서 세포 또는 조직 내에서 CGRP R의 생물학적 활성을 조정하는데 이용될 수 있다. 조정될 수 있는 활성의 실례에는 혈관확장 저해 및/또는 신경성 염증 감소가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 따라서 CGRP R에 결합하는 항원 결합 단백질은 다른 결합 화합물과의 상호작용을 조정하고 및/또는 차단할 수 있고, 그러므로 CGRP R에 관련된 질환을 개선하는데 치료적 효용을 갖는다.
징후
인간 CGRP R과 연관된 질환 또는 장애에는 환자에서 발병이 적어도 부분적으로, CGRP R과 이의 리간드, CGRP의 상호작용에 의해 유발되는 임의의 질환 또는 장애가 포함된다. 질환 또는 장애의 심각도 역시 CGRP R의 CGRP와의 상호작용에 의해 증가 또는 감소될 수 있다. 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질로 치료될 수 있는 질환과 이상의 실례에는 두통, 예를 들면, 군발성 두통, 편두통, 만성 통증, 유형 II 당뇨병, 염증, 예를 들면, 신경성 염증, 심혈관 질환, 그리고 내독소혈증과 패혈증과 연관된 혈류 장애가 포함된다.
특히, 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질은 편두통 발생이 시작된 이후 시작되는 단기 치료로서, 및/또는 편두통 발생과 연관된 증상, 예를 들면, 통증 증상의 빈도 및/또는 심각도를 예방 또는 감소시키기 위하여 예로써, 매일, 매주, 격주, 매월, 격월, 연2회 등으로 투여되는 예방적 치료로서 편두통을 치료하는데 이용될 수 있다.
진단적 방법
본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질은 CGRP R과 연관된 질환 및/또는 장애를 검출, 진단, 또는 모니터링하기 위한 진단적 목적에 이용될 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 고전적인 면역조직화학적 방법을 이용하여 시료 내에서 CGRP R의 존재의 검출을 위한 방법이 제시된다 (가령, Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol . 101:976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol . 105:3087-3096). CGRP R의 검출은 생체내에서 또는 시험관내에서 수행될 수 있다.
본 명세서에서 제시된 진단적 적용은 CGRP R의 발현 및 CGRP R에 이들 리간드의 결합을 검출하기 위한 항원 결합 단백질의 이용을 포함한다. CGRP R의 존재의 검출에 유용한 방법의 실례에는 면역분석법, 예를 들면, 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 및 방사성면역분석법 (RIA)이 포함된다.
진단적 적용을 위하여, 항원 결합 단백질은 전형적으로, 검출가능 표지화 기로 표지될 것이다. 적절한 표지화 기에는 방사성동위원소 또는 방사성핵종 (가령, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 기 (가령, FITC, 로다민, 란탄족 형광체), 효소 기 (가령, 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제), 화학발광 기, 비오티닐 기, 또는 이차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (가령, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 표지화 기는 잠재적인 입체 방해 (steric hindrance)를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 암 (arm)을 통해 항원 결합 단백질에 결합된다. 단백질을 표지화하기 위한 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있고 이용될 수 있다.
다른 측면에서, 항원 결합 단백질은 CGRP R을 발현하는 세포(들)을 확인하는데 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표지화 기로 표지되고, 그리고 CGRP R에 표지된 항원 결합 단백질의 결합이 검출된다. 더욱 특정한 구체예에서, CGRP R에 항원 결합 단백질의 결합은 생체내에서 검출된다. 더욱 특정한 구체예에서, CGRP R 항원 결합 단백질은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 분리되고 측정된다 (참조: Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 and periodic supplements); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons).
다른 측면에서는 CGRP R에의 결합에 대하여 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질과 경쟁하는 검사 분자의 존재를 검출하는 것을 제시한다. 이와 같은 한 가지 분석법의 실례는 검사 분자의 존재 또는 부재에서 일정한 양의 CGRP R을 내포하는 용액 내에서 유리 항원 결합 단백질의 양을 검출하는 단계를 수반할 것이다. 유리 항원 결합 단백질 (즉, CGRP R에 결합되지 않은 항원 결합 단백질)의 양에서 증가는 검사 분자가 CGRP R 결합에 대하여 항원 결합 단백질과 경쟁할 수 있음을 지시할 것이다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표지화 기로 표지된다. 대안으로, 검사 분자는 표지되고, 그리고 유리 검사 분자의 양은 항원 결합 단백질의 존재와 부재에서 모니터링된다.
치료 방법: 의약품 제제, 투여 경로
항원 결합 단백질을 이용하는 방법 역시 제시된다. 일부 방법에서, 항원 결합 단백질은 환자에 제공된다. 항원 결합 단백질은 인간 CGRP R에 CGRP의 결합을 저해한다.
하나 또는 복수의 항원 결합 단백질의 치료 효과량, 그리고 제약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 용해화제, 유화제, 보존제, 및/또는 어쥬번트를 포함하는 제약학적 조성물 역시 제시된다. 이에 더하여, 예로써, 이런 제약학적 조성물을 투여함으로써 편두통 환자를 치료하는 방법이 포함된다. 용어 "환자"는 인간 환자를 포함한다.
허용되는 제제 물질은 이용되는 용량과 농도에서 수용자에 비독성이다. 특정한 구체예에서, 치료 효과량의 인간 CGRP R 항원 결합 단백질을 포함하는 제약학적 조성물이 제시된다.
일정한 구체예에서, 허용되는 제제 물질은 바람직하게는, 이용되는 용량과 농도에서 수용자에 비독성이다. 일정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 예로써, 조성물의 pH, 오스몰농도, 점성도, 투명도, 색깔, 등장도, 향기, 무균성, 안정성, 용해 또는 방출의 속도, 흡수 또는 침투를 변경, 유지 또는 보존하기 위한 일정한 제제 물질을 포함할 수 있다. 이런 구체예에서, 적절한 제제 물질에는 아미노산 (가령, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신); 항미생물제; 항산화제 (가령, 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충액 (가령, 붕산염, 중탄산염, Tris-HCl, 구연산염, 인산염 또는 다른 유기산); 부피형성제 (가령, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트화제 (가령, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)); 착화제 (가령, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 그리고 기타 탄수화물 (가령, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린); 단백질 (가령, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 풍미제와 희석제; 유화제; 친수성 중합체 (가령, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온 (가령, 나트륨); 보존제 (가령, 벤잘코늄 염화물, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 수소 과산화물); 용제 (가령, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올 (가령, 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제 (가령, Pluronics, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예를 들면, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 티록사폴); 안정성 증진제 (가령, 수크로오스 또는 소르비톨); 강장 증진제 (가령, 알칼리성 금속 할로겐화합물, 바람직하게는, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨); 전달 운반제; 희석제; 부형제 및/또는 제약학적 어쥬번트가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다 (참조: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company).
일정한 구체예에서, 최적 제약학적 조성물은 예로서, 의도된 투여 경로, 전달 형식 및 원하는 용량에 따라서 당업자에 의해 결정될 것이다 (참조: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra). 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 본 명세서에서 제시된 항원 결합 단백질의 신체 상태, 안정성, 생체 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 줄 수 있다. 일정한 구체예에서, 제약학적 조성물에서 일차 운반제 또는 담체는 본성에서 수성 또는 비-수성일 수 있다. 가령, 적절한 운반제 또는 담체는 가능하게는, 비경구 투여를 위한 조성물에서 통상적인 다른 물질로 보충된 주사용수, 생리 염수 용액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성의 완충된 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수가 더욱 예시적인 운반제이다. 특정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 대략 pH 7.0-8.5의 Tris 완충액, 또는 대략 pH 4.0-5.5의 아세트산염 완충액을 포함하고, 그리고 소르비톨 또는 적절한 대체물을 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 인간 CGRP R 항원 결합 단백질 조성물은 동결건조된 덩어리 또는 수성 용액의 형태로, 원하는 정도의 순도를 갖는 선택된 조성물을 선택적 제제화 약물 (formulation agent) (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra)과 혼합함으로써 보관 목적으로 제조될 수 있다. 게다가, 일정한 구체예에서, 인간 CGRP R 항원 결합 단백질은 적절한 부형제, 예를 들면, 수크로오스를 이용하여 동결건조물 (lyophilizate)로서 제제화될 수 있다.
제약학적 조성물은 비경구 전달을 위하여 선택될 수 있다. 대안으로, 이들 조성물은 소화관 (digestive tract)을 통한 흡입 또는 전달, 예를 들면 경구 전달을 위하여 선택될 수 있다. 이런 제약학적으로 허용되는 조성물의 제조는 당분야의 평균적인 지식 내에 있다.
제제 성분은 바람직하게는, 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 일정한 구체예에서, 조성물을 생리 pH 또는 이보다 약간 낮은 pH에서, 전형적으로 대략 5 내지 대략 8의 pH 범위 내에 유지하기 위하여 완충액이 이용된다.
비경구 투여가 계획되면, 치료적 조성물은 제약학적으로 허용되는 운반제 내에서 원하는 인간 CGRP R 결합 단백질을 포함하는, 발열원-없는, 비경구에 허용되는 수성 용액의 형태로 제공될 수 있다. 비경구 주입에 특히 적합한 운반제는 무균 증류수이고, 여기서 인간 CGRP R 항원 결합 단백질은 적절하게 보존된 무균 등장성 용액으로 제제화된다. 일정한 구체예에서, 이러한 제조는 저장소 주입 (depot injection)을 통해 전달될 수 있는 산물의 제어된 방출 또는 지속된 방출을 제공할 수 있는 약물, 예를 들면, 주사가능 미소구체 (microsphere), 생체-부식성 입자, 중합체성 화합물 (가령, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀으로, 원하는 분자의 제제화를 수반할 수 있다. 일정한 구체예에서, 순환 (circulation)에서 존속 기간을 증진하는 효과를 갖는 히알루론산 역시 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 원하는 항원 결합 단백질을 도입하기 위하여 이식가능 약물 전달 장치 (implantable drug delivery device)가 이용될 수 있다.
일정한 제약학적 조성물은 저해를 목적으로 제제화된다. 일부 구체예에서, 인간 CGRP R 항원 결합 단백질은 건성 흡입가능 분말로서 제제화된다. 특정한 구체예에서, 인간 CGRP R 항원 결합 단백질 흡입 용액은 또한, 에어로졸 전달을 위한 추진제로 제제화될 수 있다. 일정한 구체예에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여 및 이에 따른 제제화 방법은 국제 특허 출원 No. PCT/US94/001875에서 더욱 기술되는데, 이는 참조로서 편입되고 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 기술한다. 일부 제제는 경구 투여될 수 있다. 이러한 방식으로 투여되는 인간 CGRP R 항원 결합 단백질은 고형 제형 (solid dosage form), 예를 들면, 정제와 캡슐의 배합 (compounding)에 관례적으로 이용되는 담체와 함께, 또는 이들 담체 없이 제제화될 수 있다. 일정한 구체예에서, 캡슐은 생체이용효율 (bioavailability)이 극대화되고 전신 순환전 분해 (pre-systemic degradation)가 최소화되는 위장관 내에 지점에서, 상기 제제의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 인간 CGRP R 항원 결합 단백질의 흡수를 조장하기 위한 추가의 약물이 포함될 수 있다. 희석제, 풍미제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제, 그리고 접합제 역시 이용될 수 있다.
일부 제약학적 조성물은 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와의 혼합물에서, 효과량의 하나 또는 복수의 인간 CGRP R 항원 결합 단백질을 포함한다. 무균수, 또는 다른 적절한 운반제에 정제를 용해시킴으로써, 용액이 단위-투약 형태 (unit-dose form)로 제조될 수 있다. 적절한 부형제에는 불활성 희석제, 예를 들면, 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토오스, 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예를 들면, 전분, 젤라틴, 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예를 들면, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 또는 활석이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
지속된- 또는 제어된-전달 제제에서 인간 CGRP R 항원 결합 단백질을 포함하는 제제를 비롯한 추가의 제약학적 조성물은 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 다른 지속된- 또는 제어된-전달 수단, 예를 들면, 리포좀 담체, 생물-부식성 마이크로입자 또는 다공성 비드, 그리고 저장소 주입물을 제제화하는 기술 역시 당업자에게 공지되어 있다. 예로써, 국제 특허 출원 No. PCT/US93/00829를 참조하고, 상기 문헌은 본 발명에 참조로서 편입되고 제약학적 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체성 마이크로입자의 제어된 방출을 기술한다. 지속된-방출 제조물은 성형된 물품, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태로 반투과성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 지속된 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드 (참조: U.S. 특허 No. 3,773,919 및 유럽 특허 출원 공개 No. EP 058481, 이들 각각은 본 발명에 참조로서 편입됨), L-글루타민산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), 폴리 (2-히드록시에틸-인에타크릴레이트) (Langer et al., 1981, J. Biomed . Mater. Res. 15:167-277; 그리고 Langer, 1982, Chem . Tech. 12:98-105), 에틸렌 비닐 아세트산염 (Langer et al., 1981, supra) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산 (유럽 특허 출원 공개 No. EP 133,988)을 포함할 수 있다. 지속된 방출 조성물은 또한, 당분야에 공지된 여러 방법 중에서 한 가지에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다 (참조: Eppstein et al., 1985, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 82:3688-3692; 유럽 특허 출원 공개 No. EP 036,676; EP 088,046과 EP 143,949, 이들은 본 발명에 참조로서 편입됨).
생체내 투여에 이용되는 제약학적 조성물은 전형적으로, 무균 제조물로서 제공된다. 살균은 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조될 때, 이러한 방법을 이용한 살균은 동결건조와 재구성 이전에 또는 이후에 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조된 형태 또는 용액으로 보관될 수 있다. 비경구 조성물은 일반적으로, 무균 접근 포트 (sterile access port), 예를 들면, 피하 주사 바늘 (hypodermic injection needle)에 의해 관통될 수 있는 마개가 달린 정맥내 용액 백 또는 바이알을 갖는 용기 내로 배치된다.
일정한 구체예에서, 본 명세서에서 제시된 바와 같은 재조합 항원 결합 단백질을 발현하는 세포는 전달을 위하여 캡슐화된다 (참조: Invest. Ophthalmol Vis Sci 43:3292-3298, 2002; 그리고 Proc. Natl. Acad. Sciences 103:3896-3901, 2006).
일정한 제제에서, 항원 결합 단백질은 적어도 10 ㎎/㎖, 20 ㎎/㎖, 30 ㎎/㎖, 40 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖, 60 ㎎/㎖, 70 ㎎/㎖, 80 ㎎/㎖, 90 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖ 또는 150 ㎎/㎖의 농도를 갖는다. 일부 제제는 완충액, 수크로오스 및 폴리소르베이트를 포함한다. 제제의 한 가지 실례는 50-100 ㎎/㎖의 항원 결합 단백질, 5-20 mM 아세트산나트륨, 5-10% w/v 수크로오스, 그리고 0.002 - 0.008% w/v 폴리소르베이트를 포함하는 것이다. 일정한 제제는 예로써, 9-11 mM 아세트산나트륨 완충액에서 65-75 ㎎/㎖의 항원 결합 단백질, 8-10% w/v 수크로오스, 그리고 0.005-0.006% w/v 폴리소르베이트를 포함한다. 일정한 이와 같은 제제의 pH는 4.5-6의 범위 내에 있다. 다른 제제는 5.0-5.5의 pH (가령, 5.0, 5.2 또는 5.4의 pH)를 갖는다.
일단 제약학적 조성물이 제제화되면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체, 결정, 또는 탈수되거나 동결건조된 분말로서 무균 바이알 내에 보관될 수 있다. 이런 제제는 즉석 (ready-to-use) 형태, 또는 투여 직전에 재구성되는 (가령, 동결건조된) 형태로 보관될 수 있다. 단일-투약 투여 단위를 생산하기 위한 키트 역시 제시된다. 일정한 키트는 건조된 단백질을 보유하는 첫 번째 용기 및 수성 제제를 보유하는 두 번째 용기를 포함한다. 일정한 구체예에서, 단일 및 복수-챔버가 있는 미리-충전된 주사기 (가령, 액상 주사기 및 리오시린지 (lyosyringe))를 포함하는 키트가 제시된다. 이용되는 인간 CGRP R 항원 결합 단백질-보유 제약학적 조성물의 치료 효과량은 예로써, 치료적 배경과 목적에 좌우될 것이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 치료를 위한 적절한 용량 수준은 부분적으로, 전달되는 분자, 인간 CGRP R 항원 결합 단백질이 이용되는 징후, 투여 경로, 그리고 환자의 크기 (체중, 체표면 또는 장기 크기) 및/또는 상태 (연령과 전반적인 건강)에 따라 달라질 것이다. 일정한 구체예에서, 임상의는 최적 치료 효과를 획득하기 위하여 용량을 적정하고 투여 경로를 변경할 수도 있다.
전형적인 용량은 앞서 언급된 인자에 따라, 대략 1 ㎍/kg 내지 대략 30 ㎎/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 특정한 구체예에서, 용량은 10 ㎍/kg 내지 대략 30 ㎎/kg, 선택적으로 0.1 ㎎/kg 내지 대략 30 ㎎/kg, 대안으로, 0.3 ㎎/kg 내지 대략 20 ㎎/kg의 범위일 수 있다. 일부 적용에서, 용량은 0.5 ㎎/kg 내지 20 ㎎/kg이다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 0.3 ㎎/kg, 0.5 ㎎/kg, 1 ㎎/kg, 3 ㎎/kg, 10 ㎎/kg, 또는 20 ㎎/kg으로 투약된다. 일부 치료 섭생 (treatment regime)에서 용량 스케줄은 0.3 ㎎/kg qW, 0.5 ㎎/kg qW, 1 ㎎/kg qW, 3 ㎎/kg qW, 10 ㎎/kg qW, 또는 20 ㎎/kg qW의 투약이다.
투약 빈도는 이용된 제제 내에서 특정한 인간 CGRP R 항원 결합 단백질의 약동학적 파라미터에 좌우될 것이다. 전형적으로, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 용량이 도달될 때까지 조성물을 투여한다. 이런 이유로, 조성물은 시간의 흐름에서 단일 복용량 (single dose), 또는 2회 또는 그 이상의 복용량 (이들은 원하는 분자의 동일한 양을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입액으로서 투여될 수 있다. 적절한 용량은 적절한 용량-반응 데이터의 이용을 통하여 확인될 수 있다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 연장된 기간에 걸쳐 환자에 투여될 수 있다. 항원 결합 단백질의 장기 투여는 완전한 인간인 아닌 항원 결합 단백질, 예를 들면, 비-인간 동물에서 인간 항원에 대하여 생성된 항체, 예를 들면, 비-인간 종에서 생산된 비-완전한 인간 항체 또는 비-인간 항체와 통상적으로 연관되는 유해한 면역 반응 또는 알레르기 반응을 최소화시킨다.
제약학적 조성물의 투여 경로는 공지된 방법에 따른다, 예를 들면, 경구 경로; 정맥내, 복막내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 근육내, 안구내, 동맥내, 문맥내, 또는 병소내 경로에 의한 주사; 지속된 방출 시스템 또는 이식 장치에 의해 달성된다. 일정한 구체예에서, 조성물은 일시 주사 (bolus injection)에 의해, 또는 주입 또는 이식 장치에 의해 연속적으로 투여될 수 있다.
조성물은 또한, 원하는 분자가 흡수되거나 내포되어 있는 막, 스펀지 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이식 장치가 이용되는 경우에, 상기 장치는 임의의 적절한 조직 또는 장기 내로 이식될 수 있고, 그리고 원하는 분자의 전달은 확산, 지연-방출 (timed-release bolus), 또는 연속 투여를 통해 달성될 수 있다.
또한, 탈체에서 인간 CGRP R 항원 결합 단백질 제약학적 조성물을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 경우에, 환자로부터 제거된 세포, 조직 또는 장기는 인간 CGRP R 항원 결합 단백질 제약학적 조성물에 노출되고, 이후 이들 세포, 조직 및/또는 장기는 환자 내로 되돌려 이식된다.
특히, 인간 CGRP R 항원 결합 단백질은 폴리펩티드를 발현하고 분비하기 위하여, 본 명세서에서 제시된 것들과 같은 방법을 이용하여, 유전자 조작된 일정한 세포를 이식함으로써 전달될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있고, 그리고 자가조직, 이종기원, 또는 이종일 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포는 영속화될 수 있다. 다른 구체예에서, 면역학적 반응의 가능성을 감소시키기 위하여, 세포는 주변 조직의 침투가 예방되도록 캡슐화될 수 있다. 진전된 구체예에서, 캡슐화 (encapsulation) 물질은 전형적으로, 단백질 산물(들)의 방출을 허용하지만 환자의 면역계에 의한, 또는 주변 조직으로부터 다른 유해 인자에 의한 세포의 파괴를 예방하는 생물적합성, 반-투과성 중합성 울타리 또는 막이다.
수행된 실험 및 달성된 결과를 비롯한 아래의 실시예는 예시의 목적으로만 제공되고 첨부된 특허청구범위의 범위를 한정하는 것으로 간주되지 않는다.
실시예 1
항원으로서 CGRP 수용체의 산출
A. 인간 CRLR과 RAMP1의 분자 클로닝
인간 CRLR cDNA (GenBank 수탁 번호 U17473; 서열 번호 1) 및 RAMP1 cDNA (GenBank 수탁 번호 AJ001014; 서열 번호 3)는 하기에 기술된 바와 같이 HEK 293EBNA 세포 (Invitrogen)의 형질감염을 위하여, 각각 포유동물 세포 발현 벡터 pcDNA3.1-Zeo와 pcDNA3.1-Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 클로닝되었다. hCRLR cDNA 및 hRAMP1 cDNA 역시 AM-1 CHO 세포 (U.S. 특허 No. 6,210,924)의 형질감염을 위하여, pDSRα24 벡터 내로 클로닝되었다 (Kim, H. Y. et al. J. Inv. Derm. Symp. Proc. (2007) 12: 48-49).
B. 안정적으로-형질감염된 세포주
1. 293EBNA 세포 내에서 인간 CGRP R의 안정적인 발현
HEK 293EBNA 세포 (ATCC 또는 Invitrogen로부터 가용함)는 100mm 접시당 1.5x106개 세포의 밀도로 접종되었다. 24시간후, 이들 세포는 Invitrogen에 의해 제공된 사용설명서에 따라서, FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, CA)과 함께 huRAMP1/pcDNA3.1-Hyg와 huCRLR/pcDNA3.1-Zeo의 6 ㎍ 선형화된 DNA로 공동-형질감염되었다. 2일후, 이들 세포는 트립신처리되고 400 ㎍/㎖ 히그로마이신 + 250 ㎍/㎖ 제오신을 포함하는 성장 배지 내로 계대배양되었다. 2일후, 결과의 약물 내성 콜로니는 트립신처리되고 풀 (pool)로 합동되었다. 이들 풀은 Alexa 647-표지된 CGRP8-37 펩티드 유사체 (하기에 기술됨)를 분류하는 FACS가 4회 수행되었다. 발현 세포의 최대 5%가 각 회에서 수집되었다.
2. AM-1 CHO 세포 내에서 인간 CGRP R의 안정적인 발현
AM-1 CHO 세포 (Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci. 77, 4216 (1980)에서 기술된 CHO DHFR-결함성 세포주로부터 혈청-없는 성장 배지-적응된 변이체)는 100mm 접시당 1.5x106개 세포로 접종되었다. 24시간후, 이들 세포는 Invitrogen에 의해 제공된 사용설명서에 따라서, FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, CA)과 함께 선형화된 4 ㎍ DNA 각각의 pDSRα24/huRAMP1과 pDSRα24/huCRLR로 공동-형질감염되었다. 이들 형질감염된 세포는 형질감염후 2일 시점에 트립신처리되고, 그리고 10% 투석된 FBS를 포함하고 히포크산틴/티미딘 보충이 없는 CHO DHFR 선별적인 성장 배지 내로 접종되었다. 2주후, 결과의 형질감염된 콜로니는 트립신처리되고 풀로 합동되었다. 이들 풀은 FACS 분류 분석에 종속되었다.
3. HEK 293EBNA 세포 내에서 인간 아드레노메듈린 (AM1)의 안정적인 발현
293EBNA 세포는 100mm 접시 내에 DMEM (고농도 글루코오스) + 5% FBS + 1% MEM 비-필수 아미노산 + 1% 나트륨 피부르산염에서 1.5x106개 세포/접시로 접종되었다. 익일에, 이들 세포는 pcDNA3.1/제오신/huCRLR + pcDNA3.1/히그로마이신/huRAMP2와 함께 FuGENE 6 형질감염 시약 (Roche)을 이용하여 공동-형질감염되었다. 양쪽 DNA 구조체는 FspI로 선형화되었다. 48시간후, 이들 세포는 200 ㎍/㎖ 제오신을 포함하는 성장 배지에서 3가지 세포 밀도 (8x105, 3.2x105, 그리고 8x104개 세포/접시)로 100mm 접시 내로 계대배양되었다. 배지는 주2회 교체되었다. 1주후, 이들 평판은 200 ㎍/㎖ 히그로마이신 + 200 ㎍/㎖ 제오신을 포함하는 배지가 공급되었다. 2주후, 클로닝 고리 (cloning ring)로 96개 콜로니가 분리되었다. 나머지 콜로니는 단일 풀 배양액 내로 수집되었다. 이들 클론과 풀은 수용체 작동약 또는 포스콜린 (forskolin)에 의한 자극에 대한 반응에 대하여 분석되었다. 여러 클론이 우수한 반응을 나타내고, 그리고 한 가지 클론이 차후 실험에서 이용을 위하여 선택되었다.
4. HEK 293EBNA 세포 내에서 cynoCGRP R의 안정적인 발현
293EBNA 세포는 100mm 접시에서 DMEM (고농도 글루코오스) + 5% FBS + 1% MEM 비-필수 아미노산 + 1% 피부르산나트륨 내에 1.5x106개 세포/접시로 접종되었다. 익일에, 이들 세포는 pcDNA3.1/제오신/cynoCRLR + pcDNA3.1/히그로마이신/cynoRAMP1과 함께 FuGENE 6을 이용하여 공동-형질감염되었다. 양쪽 구조체는 FspI로 선형화되었다. 48시간후, 이들 세포는 1:20, 1:40, 1:100, 그리고 1:200의 희석도 (dilution)에서, 200 ㎍/㎖ 제오신 + 400 ㎍/㎖ 히그로마이신을 포함하는 성장 배지 내로 계대배양되었다. 배지는 주2회 교체되었다. 2주후, 클로닝 고리 (cloning ring)를 이용하여 96개 형질감염된 콜로니가 분리되었다. 이들 클론은 CGRP 리간드에 의한 자극에 대한 반응에 대하여 분석되었다. 여러 클론이 유사한 높은 수준의 반응을 나타내고, 그리고 한 가지 클론이 차후 실험에서 이용을 위하여 선택되었다.
C. 높은-발현 CGRP 수용체 세포의 분리
하기 서열을 갖는 CGRP8 -37 펩티드 유사체가 합성되었다 (Midwest Bio-Tech Inc. Fishers, IN):
Ac-WVTHRLAGLLSRSGGVVRCNFVPTDVGPFAF-NH2 (서열 번호 9)
상기 펩티드는 제조업체의 사용설명서 (Molecular Probes, Inc. Cat A 2006)에 따라서 Alexa 647-NHS로 표지되었다. Alexa 647-표지된 CGRP8 -37은 CGRP 수용체 형질감염된 세포에서는 특이적인 염색을 나타내지만 비-형질감염된 부모 세포에서는 특이적인 염색을 나타내지 않고, 그리고 FACS 시약으로서 이용되었다.
huCGRP 수용체-형질감염된 293EBNA 및 AM-1 CHO 세포 풀 (상기와 같이 산출됨)은 Alexa 647-표지된 CGRP8 -37 펩티드를 포함하는 풀을 이용하여 최대 4회 반복적으로 분류되었다. 높은 발현 세포는 각 분류에서 수집되고, 확장되고, 그리고 최종 분류후 바이알 내로 동결되었다. AM-1 CHO/huCGRP R 세포는 하기에 기술된 바와 같이 면역화에 이용되고, 그리고 293EBNA/huCGRP R 세포는 면역화후 생쥐 혈청의 적정, 그리고 하이브리도마 상층액의 결합 스크린에 이용되었다.
D. 가용성 CGRP 수용체의 산출
인간 CRLR (서열 번호 6)과 인간 RAMP1 (서열 번호 8)의 N-말단 세포외 도메인 (ECD)을 보유하는 가용성 CGRP 수용체 폴리펩티드는 하기에 기술된 바와 같이, 상응하는 cDNA (서열 번호 5 또는 서열 번호 7)를 포함하는 벡터로 293 6E 세포 (Durocher, et al., Nucleic Acids Res. 30:E9 (2002))를 일시적으로 공동-형질감염시킴으로써 산출되었다. 분비 및/또는 차후 정제를 용이하게 하기 위하여, 통상적으로 이용되는 태그 (polyHis, Flag, HA 및/또는 Fc)가 이용되었다.
Fc에 융합된 가용성 이형이합체성 CGRP R ECD는 일시적인 발현 벡터 pTT5 내로, 적절한 프라이머로 PCR 클로닝에 의해 제조되었다 (Durocher, et al., supra). CRLR N-말단 ECD-Fc는 인간 IgG1 Fc에 융합된 CRLR의 N-말단 세포외 도메인 (서열 번호 6)으로 구성되었다. RAMP1 ECD-Fc는 인간 IgG1 Fc에 융합된 RAMP1의 세포외 도메인 (서열 번호 8)을 보유한다. 양쪽 경우에, ECD 도메인과 Fc 사이에 5개의 연속 글리신으로 구성되는 링커가 존재하였다.
가용성 이형이합체성 CGRP 수용체는 이들 2개의 구조체를 아래와 같이 공동-형질감염시킴으로써 발현되었다. 진탕 플라스크 내에서 1x106개 세포/㎖로 293-6E 세포는 FreeStyle 293 배지 (Invitrogen)에서 3㎖ PEI/mg DNA와 함께 0.5㎎/ℓ DNA (hCRLR N-ter ECD-Fc/pTT5 및 huRAMP1 ECD-Fc/pTT5)로 형질감염되었다. 세포는 0.1% Pluronic F68과 50 ㎍/㎖ Geneticin으로 보충된 FreeStyle 293 발현 배지 내에서 7일 동안 현탁 성장되고, 그리고 정제를 위하여 수확되었다.
조건 배지 ("CM")로부터 정제는 50mM Tris, 400mM 구연산나트륨의 첨가로 CM을 완충하고, 그리고 pH를 8.5로 조정함으로써 수행되었다. 이후, 완충된 CM은 50mM Tris, 400mM 구연산나트륨에서 평형화된 단백질 A 친화성 칼럼에 통과되고, 그리고 pH가 pH 8.5로 조정되었다. 단백질 A 칼럼은 PBS로 세척되고, 그리고 Fc 융합 단백질은 0.1 N HOAc로 용리되었다. 용리된 피크는 CRLR 또는 RAMP1에 특이적인 개별 항체를 이용한 웨스턴 블롯 (western blot)에 의한 검사에서, CRLR과 RAMP1 성분을 모두 포함하였다. 게다가, LC-MS와 N-말단 염기서열분석은 대략 (2:3) 비율로 CRLR:RAMP1 이형이합체와 CRLR:CRLR 동종이합체 둘 모두의 존재를 확증하였다. 이러한 "가용성 CGRP 수용체"는 비록 이러한 수용체가 Biacore 검사를 이용한 측정에서 CGRP 리간드에 결합하지 못했지만, FMAT 분석에서 CGRP 수용체 발현 재조합 세포에 대한 Alexa647 표지된 CGRP8 -37 결합에서 경쟁하는 것으로 밝혀졌다. 상기 물질은 특히, 이종 (heterogeneity) 및 CGRP 리간드 결합의 부재에도 불구하고, 실시예에서 기술된 바와 같이 면역원으로서 이용되었다.
E. 재조합 CGRP 수용체 발현 세포로부터 막 추출물의 산출
막 추출물은 Bosse, R. et al., Journal of Biomolecular Screening, 3(4): 285-292 (1998)에서 기술된 방법을 이용하여, CGRP 수용체 발현 세포로부터 만들어졌다. 간단히 말하면, 대략 5 g의 세포 페이스트 (cell past)는 4℃에서 10분 동안 50 ㎖의 PBS에서 3,000 rpm으로 펠릿으로 만들어지고, 그리고 30 ㎖의 차가운 용해 완충액 (25 mM HEPES, pH 7.4, 3 mM MgCl2 + 1개의 Roche 프로테아제 저해물질 칵테일 정제/50 ㎖)에서 재-현탁되었다. 용해물 (lysate)은 5,000 rpm으로 ~20회 스트로크 (stroke)에 의해 Glas-Col (Teflon-glass 균질화기)로 균질화되고, 그리고 4℃에서 15분 동안 JA21 회전자 (rotor)에서 20,000 rpm으로 회전되었다. 이러한 과정은 1회 더 반복되고, 그리고 최종 펠릿은 ~1-5 ㎖ '최종 펠릿' 완충액 (25 mM HEPES, pH 7.4, 3 mM MgCl2, 10 % (w/v) 수크로오스 + 1개의 Roche 프로테아제 저해물질 칵테일 정제/50 ㎖)에서 재-현탁되었다. 이들 막 추출물은 16 G와 25 G 바늘에 2-3회 통과시킴으로써 전단되었다. 총 막 단백질 농도는 Microplate BCA 단백질 분석 (Pierce)으로 결정되었다.
실시예 2
CGRP 수용체에 대한 항체의 산출
A. 면역화
면역화는 실시예 1에서 기술된 바와 같이 준비된, 아래 형태의 CGRP 수용체 항원을 이용하여 수행되었다:
(i) 서열 번호 2를 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 인간 전장 CRLR cDNA (서열 번호 1), 그리고 서열 번호 4를 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 RAMP1 cDNA (서열 번호 3)로 CHO 세포를 공동-형질감염시킴으로써 획득된, 전장 인간 CRLR과 RAMP1을 세포 표면에서 발현하는 AM-1 CHO 형질감염체 (transfectant);
(ii) 상기 (i)에서 기술된 세포로부터 막 추출물; 그리고
(iii) 실시예 1에서 기술된 바와 같이 CRLR의 N-말단 ECD (서열 번호 6) 및 RAMP1의 세포외 도메인 (ECD) (서열 번호 8)을 공동-발현하고 정제함으로써 획득된 가용성 CGRP 수용체.
이종생쥐 (xenomouse) 동물은 각각 10 ㎍/생쥐와 150 ㎍/생쥐의 용량을 이용하여 동일한 방식으로, CGRP R을 안정적으로 발현하는 AM-1 CHO 세포로부터 준비된 정제된 가용성 CGRP 수용체 단백질 및 정제된 CGRP R 막으로 면역화되었다. CGRP 막은 앞서 기술된 방법을 이용하여 준비되었다.
차후 부스트 (boost)가 10 ㎍/생쥐의 가용성 CGRP R 또는 75 ㎍의 정제된 CGRP R 막의 용량으로 투여되었다. 이종생쥐 동물은 또한, 3.4 x 106개 CGRP R 형질감염된 세포/생쥐의 용량을 이용하여 CGRP 수용체-발현 세포로 면역화되고, 그리고 차후 부스트 (boost)는 1.7 x 106개 CGRP R 형질감염된 세포/생쥐이었다. 이용된 주사 부위는 꼬리 기저부 (base-of-tail) 피하와 복막내의 조합이었다. 면역화는 2002년 2월 19일 제출된 U.S. 특허 No. 7,064,244에서 개시된 방법에 따라서 수행되었고, 이의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다. 어쥬번트 TiterMax Gold (Sigma; cat. # T2684), 명반 (E.M. Sergent Pulp and Chemical Co., Clifton, NJ, cat. # 1452-250)은 제조업체의 사용설명서에 따라 준비되고 어쥬번트 에멀젼 대(對) 항원 용액의 1:1 비율로 혼합되었다.
혈청은 첫 주사후 4 - 6주 시점에 수집되고, 그리고 비역가 (specific titer)는 재조합 CGRP 수용체-발현 293EBNA 세포의 FAC 염색에 의해 결정되었다.
생쥐는 대략 1개월 내지 3개월 반의 기간에 걸쳐 11 - 17회 범위의 면역화로, 전장 CGRP R 세포 또는 가용성 CGRP R 세포외 도메인을 발현하는 세포/막으로 면역화되었다. 최대 혈청 역가를 갖는 생쥐는 확인되고 하이브리도마 생산을 위하여 준비되었다. 이들 면역화는 복수, 전형적으로, 10 마리 생쥐의 군에서 수행되었다. 오금 (Popliteal)과 서혜 (inguinal) 림프절과 비장 조직이 전형적으로, 융합체를 산출하기 위하여 각 군으로부터 합동되었다.
B. 단일클론 항체의 준비
적절한 역가를 나타내는 동물은 확인되고, 그리고 림프구가 배수 림프절로부터 획득되고, 그리고 필요한 경우에, 각 무리에 대하여 합동되었다. 림프구는 조직으로부터 세포를 방출하기 위하여 적절한 배지 (가령, Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA) 내에서 림프계 조직으로부터 분리되고, 그리고 DMEM에서 현탁되었다. B 세포는 적절한 방법을 이용하여 선택되고 및/또는 확장되고, 그리고 적절한 융합 상대, 예를 들면, 비-분비성 골수종 P3X63Ag8.653 세포 (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550)와 융합되었다.
림프구는 1:4의 비율로 융합 상대 세포와 혼합되었다. 세포 혼합물은 4분 동안 400 x g로 원심분리에 의해 부드럽게 펠릿으로 만들어지고, 상층액은 버려지고, 그리고 세포 혼합물은 1 ㎖ 피펫을 이용함으로써 부드럽게 혼합되었다. 융합은 PEG/DMSO (폴리에틸렌 글리콜/디메틸 설폭시드; Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 백만 개의 림프구당 1 ㎖)로 유도되었다. PEG/DMSO는 부드러운 교반과 함께 1분 동안 천천히 첨가되고, 그 이후에 1분 동안 혼합되었다. 이후, IDMEM (글루타민이 없는 DMEM; 백만 개의 B 세포당 2 ㎖)이 부드러운 교반과 함께 2분 동안 첨가되고, 그 이후에 3분 동안 추가의 IDMEM (백만 개의 B 세포당 8 ㎖)이 첨가되었다.
융합된 세포는 부드럽게 펠릿으로 만들어지고 (400 x g 6분) 백만 개의 B 세포당 20 ㎖ 선별 배지 (가령, 아자세린과 히포크산틴 [HA], 그리고 필요한 경우에, 다른 보충 물질을 포함하는 DMEM)에서 재현탁되었다. 세포는 37℃에서 20-30분 동안 배양되고, 이후, 200 ㎖ 선별 배지에서 재현탁되고 96-웰 도말 (plating)에 앞서 T175 플라스크 내에서 3일 내지 4일 동안 배양되었다.
세포는 생성된 콜로니의 클론형성능 (clonality)을 극대화하기 위하여 표준 기술을 이용하여 96-웰 평판 내로 분배되었다. 수일간 배양후, 하이브리도마 상층액은 수집되고, 그리고 인간 CGRP 수용체에 결합의 확증, 리간드 결합 경쟁 분석법에 의한 차단 항체의 확인, 그리고 CGRP 수용체 (가령, 인간 아드레노메듈린 수용체)에 관련된 다른 수용체와의 교차-반응성의 평가를 비롯하여, 하기 실시예에서 상술된 바와 같은 스크리닝 분석법에 종속되었다. 양성 세포는 더욱 선택되고 표준 클로닝과 서브클로닝 기술에 종속되었다. 클론 계열 (clonal line)은 시험관내에서 확장되고, 그리고 분비된 인간 항체는 분석을 위하여 획득되었다.
C. 선택된 단일클론 항체의 서열 분석
선택된 서브클로닝된 단일클론 항체는 표준 RT-PCR 방법을 이용한 염기서열분석이 수행되었다. 표 2A에서는 본 명세서에서 제시된 예시적인 항체의 경쇄의 아미노산 서열을 제시한다. 표 2B에서는 본 명세서에서 제시된 예시적인 항체의 중쇄의 아미노산 서열을 제시한다.
염기서열분석된 항체의 CDR 영역에 상응하는 아미노산 서열이 정렬되고, 그리고 이들 정열은 유사성으로 클론을 분류하는데 이용되었다.
카파 경쇄를 갖는 클론으로부터 경쇄 CDR, 그리고 일정한 상응하는 공통 서열의 서열 정렬은 도 3A와 3B에 도시된다.
람다 경쇄를 갖는 클론으로부터 경쇄 CDR, 그리고 일정한 상응하는 공통 서열의 서열 정렬은 도 4에 도시된다.
본 명세서에서 제시된 예시적인 항체의 중쇄 CDR, 그리고 일정한 상응하는 공통 서열의 서열 정렬은 도 5A, 5B, 5C, 5D와 5E에 도시된다.
본 명세서에서 제시된 예시적인 중쇄 CDR의 일정한 공통 서열은 도 5F에 도시된다.
실시예 3
CGRP 수용체 특이적 항체의 확인
A. FMAT에 의한 CGRP 수용체 특이적인 결합 항체의 선택
14일간 배양후, 하이브리도마 상층액은 Fluorometric Microvolume 분석 기술 (FMAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA)에 의해 CGRP R-특이적 단일클론 항체에 대하여 스크리닝되었다. 이들 상층액은 인간 CGRP R로 형질감염된 AM-1 CHO huCGRP R 세포 또는 재조합 HEK 293 세포에 대하여 스크리닝되고, 그리고 부모 HEK293 세포 (실시예 1에서 기술된 바와 같이 준비됨)에 대하여 카운터-스크리닝 (counter-screening)되었다.
간단히 말하면, Freestyle 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내에서 세포는 안정적인 형질감염체의 경우에 대략 4000개 세포/웰의 밀도로, 그리고 부모 세포의 경우에 대략 16,000개 세포/웰의 밀도로, 50 ㎕/웰의 부피에서 384-웰 FMAT 평판 내로 접종되고, 그리고 세포는 37℃에서 하룻밤동안 배양되었다. 이후, 10 ㎕/웰의 상층액이 첨가되고, 그리고 평판은 4℃에서 대략 1시간 동안 배양되고, 이후 10 ㎕/웰의 항-인간 IgG-Cy5 이차 항체 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)가 2.8 ㎍/㎖의 농도 (400 ng/㎖ 최종 농도)로 첨가되었다. 평판은 이후, 4℃에서 1시간 동안 배양되고, 그리고 형광은 FMAT 대형 공초점 스캐너 (macroconfocal scanner) (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 판독되었다.
카운터 스크리닝을 위하여, 부모 AM-1 CHO 세포 또는 HEK 293 세포는 유사하게 접종되고, 그리고 상층액은 세포 단백질에 결합하지만 CGRP 수용체에 결합하지 않는 하이브리도마를 식별하고 배제하기 위하여 이들 세포 상에서 FMAT에 의해 동시에 스크리닝되었다.
B. FMAT를 통한 리간드 결합 경쟁 분석법에 의한 차단 항체의 확인
CGRP 수용체에 결합하고 CGRP 리간드 결합을 차단하는 항체 (하이브리도마 상층액에서)를 확인하기 위한 리간드 결합 경쟁 방법이 개발되었다. 384-웰 평판 (Corning Costar, Cat:#3712)은 각 웰에서 5,000개의 AM-1 huCGRP R Pool 2 세포 및 20,000개의 형질감염되지 않은 CHO-S 세포로 준비되었다. 20 ㎕의 항-CGRP R 하이브리도마 상층액이 각 웰에 첨가되고, 그리고 평판은 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 이후, 10 ㎕의 2.8 ㎍/㎖ Alexa647-CGRP8 -37 펩티드가 각 웰에 첨가되고, 그리고 평판은 실온에서 추가로 3시간 동안 배양되었다. 이들 세포에 결합된 Alexa647-CGRP8-37의 양은 FMAT 8200 세포 검출 시스템 (Applied Biosystems)에서 분석되었다. 출력 데이터는 신호 강도 (signal intensity)의 수치적 FL1 값 (더욱 높은 FL1 값은 더욱 높은 신호 강도를 지시한다) 및 이들 세포의 이미지 둘 모두이었다.
이들 실험에는 음성 대조 하이브리도마 상층액이 포함되었다. 이들 음성 대조 실험에서 관찰되는 평균 FL1 값은 분석을 위한 최대 가능 신호로서 채택되었다. 실험 상층액은 이러한 최대 신호와 비교되고, 그리고 저해 비율이 각 웰에 대하여 계산되었다 (% 저해 = (1-(항-CGRP R 하이브리도마 상층액의 FL1/최대 FL1 신호)).
데이터의 개요는 도 6에 도시된다. 이러한 실험에서, 1092개의 항-CGRP R 상층액이 수용체 리간드 분석을 이용하여 조사되었다. 데이터는 평균 저해 비율을 이용하여 순위 배열 (rank order)되었다. 90개 상층액은 >25% 평균 저해를 나타내고, 이들 중에서 31개는 >50% 평균 저해를 나타내고 7개는 >70% 평균 저해를 나타냈다.
요약된 데이터 세터는 하기 표 10에 제시된다. 시료 ID 번호 1-5는 CGRP 수용체에 Alexa647-CGRP8 -37 펩티드의 결합을 저해하는 항-CGRP R 하이브리도마 상층액의 실례를 예시하고, 그리고 시료 ID No 536 - 540은 CGRP 수용체에 Alexa647-CGRP8-37 펩티드의 결합을 저해하지 못하는 항-CGRP R 하이브리도마 상층액의 실례를 예시한다.
Figure pat00037
이들 결합 경쟁 분석법에 기초하여, 대략 30개의 상층액이 추가 특성화를 위하여 선택되었다.
실시예 4
cAMP 기능적 분석에서 CGRP 수용체 특이적 차단 단일클론 항체의 활성
A. CGRP 수용체 항체 활성.
선택된 CGRP 수용체 항체는 내재성 효능을 결정하기 위하여 시험관내 CGRP 수용체 매개된 cAMP 분석에서 스크리닝되었다. 이러한 시험관내 cAMP 분석에, ATCC (ATCC 번호 HTB-10; "HTB-10 세포")로부터 획득된 인간 신경아세포종-유래된 세포주 (SK-N-MC; Spengler, et al., (1973) In Vitro 8: 410)가 이용되었다. HTB-10 세포는 CRLR과 RAMP1을 발현하고, 이들은 CGRP 수용체를 형성한다 (L. M. McLatchie et al, 1998). 재조합 필리핀 원숭이 CGRP R을 발현하는 293EBNA 세포주는 실시예 1에서 기술된 바와 같이 산출되고, 그리고 쥐 CGRP 수용체를 발현하는 쥐 L6 세포주는 ATCC (CRL-1458)로부터 획득되었다.
LANCE cAMP 분석 키트 (PerkinElmer, Boston, MA)가 스크리닝에 이용되었다. 이들 분석법은 60 ㎕의 총 부피로 백색 96-웰 평판에서 수행되었다. 간단히 말하면, 분석 당일에, 동결된 HTB-10 세포는 37℃에서 해동되고, 세포는 분석 완충액으로 1회 세척되고, 그리고 Alexa-표지된 항-cAMP 항체와 혼합된 10000개의 세포를 포함하는 12 ㎕의 세포 현탁액이 96 절반-구역 백색 평판 내로 첨가되었다. 12 ㎕ CGRP 수용체 항체를 첨가한 이후, 혼합물은 실온에서 30분 동안 배양되었다. 이후, 12 ㎕ CGRP 수용체 작동약 인간 α-CGRP (1nM 최종 농도)가 첨가되고 실온에서 15분 동안 더욱 배양되었다. 인간 α-CGRP 자극후, 24 ㎕의 검출 혼합물이 첨가되고 실온에서 60분 동안 배양되고, 그리고 평판은 Em665nM에서 EnVision 기구 (PerkinElmer, Boston, MA)에서 판독되었다. 데이터는 처리되고 Prizm (GraphPad Software Inc.) 또는 ActivityBase (IDBS)에 의해 분석되었다.
도 7A에서는 3가지 항체 - 3C8, 13H2와 1E11에 대한 hCGRP 수용체-발현 세포주 HTB-10을 이용하여 앞서 기술된 바와 같이 획득된 예시적인 데이터를 도시한다. 이들 데이터는 항체 (3C8, 13H2 또는 1E11) 농도의 함수로서 대조 보다 높은 비율 (percentage over control, "POC")로서 플롯팅 (plotting)되고, 그리고 상기 도면의 아래쪽에 도시된 IC50 값을 산출하기 위하여 표준 비-선형 회귀 곡선 (regression curve)으로 맞춤된다.
*
B. 관련된 수용체에서 항체 활성의 결여
관련된 수용체 AM1 (hCRLR+hRAMP2를 발현하는 HEK 293 세포; D. R. Poyner, et al, Pharmacological review, 54:233-246, 2002), AM2 (hCRLR+hRAMP3을 발현하는 CHO 세포; D. R. Poyner, et al, Pharmacological review, 54:233-246, 2002), 또는 인간 아밀린 AMY1 수용체 (MCF-7 세포 hCTR+hRAMP1; Wen-Ji Chen, et al, Molecular pharmacology, 52: 1164-1175, 1997)를 발현하는 세포는 조사된 항체의 선택성 (selectivity)을 결정하는데 이용되었다. AM1-발현 HEK 293 세포주는 상기 실시예 1에서 기술된 바와 같이 산출되었다. AM2-발현 CHO 세포주는 EuroScreen (현재, PerkinElmer, Inc.)으로부터 구입되었다; 그리고 인간 아밀린 AMY1 수용체-발현 MCF-7 세포주 (Zimmermann, et al, Journal of Endocrinology, 423-431, 1997)는 ATCC (HTB-22)로부터 획득되었다. 앞서 기술된 바와 같이 플롯팅된 예시적인 결과는 도 7B (hAM1-HEK 세포), 7C (hAM2-CHO 세포)와 7D (hAMY-MCF-7 세포)에 도시된다. 조사된 항체 중에서 어느 것도 조사된 범위 내에서 hAM1, hAM2 또는 hAMY1 수용체에 대한 유의한 저해 활성을 나타내지 않았다는 점에 유의한다.
필리핀 원숭이 CGRP 수용체를 발현하는 재조합 HEK 세포 및 쥐 CGRP 수용체를 발현하는 쥐 L6 세포 (ATCC)를 이용하여 유사한 실험이 수행되었다. 이들 연구로부터 데이터, 그리고 본 실시예의 A 파트에서 기술된 바와 같이 획득된 추가의 IC50 데이터는 하기 표 11에서 "cAMP" 칼럼에 제시된다. 인간과 cyno CGRP 수용체에 대한 IC50 값은 나노몰 범위 내에 있지만, 칼시토닌을 발현하는 MCF7 세포 (데이터 제시되지 않음)뿐만 아니라 쥐 CGRP 수용체, 그리고 인간 AM1, AM2와 AMY1 수용체에 대한 활성은 모두 1 마이크로몰 (micromolar) 이상인 점에 유의한다. 인간 CGRP 수용체, 그리고 인간 AM1, AM2, 아밀린과 칼시토닌 수용체 사이에 IC50에서 차이는 동일한 수용체 성분의 일부에서 형성된 관련된 수용체에 비하여 CGRP 수용체에 대한 이들 항체의 높은 선택성을 예증한다. 인간과 필리핀 원숭이 CGRP 수용체를 이용하여 획득된 IC50은 유사한 반면, 이들 조사된 항체는 쥐 CGRP 수용체와 교차-반응하지 않는 것으로 나타났다.
Figure pat00038
실시예 5
수용체 차단 항체의 Ki 결정을 위한 방사성리간드 CGRP 결합 분석법
125I-표지된 CGRP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 및 HTB-10 세포 (PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts)로부터 세포 막은 상응하는 Ki 값을 결정하기 위하여, 다양한 농도의 조사 항체의 존재에서 방사성리간드 결합 실험에 이용되었다. CGRP 결합 분석은 110 ㎕ 결합 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH7.5, 5.0 mM MgSO4, 0.2% BSA (Sigma), 1 정제의 CompleteTM/50 ㎖ 완충액 (프로테아제 저해물질)); 20 ㎕ 조사 화합물 (10X); 20 ㎕ 125I-hαCGRP (Amersham Biosciences; 10X); 그리고 50 ㎕ 인간 신경아세포종 세포 (HTB-10) 막 현탁액 (웰당 10 ㎍, PerkinElmer)을 포함하는 96-웰 평판에서 실온에서 설정되었다. 이들 평판은 60 rpm에서 교반하면서 실온에서 2시간 동안 배양되고, 그리고 각 웰의 내용물은 0.5% 폴리에틸렌이민 (PEI)-처리된 (적어도 1시간 동안) GF/C 96-웰 필터 평판에서 여과되었다. GF/C 필터 평판은 얼음같이 차가운 50 mM Tris, pH 7.5로 6회 세척되고 55℃에서 1시간 동안 오븐에서 건조되었다. 이후, GF/C 평판의 밑부분이 밀봉되었다. 40 ㎕ MicroscintTM 20이 각 웰에 첨가되고, GF/C 평판의 윗부분이 TopSealTM-A (압박 점착성 밀봉 필름)로 밀봉되고, 그리고 이들 GF/C 평판은 TopCount NXT (Packard)로 계산되었다. 획득된 데이터는 Prizm (GraphPad Software Inc.)을 이용하여 분석되었다.
항체 3C8, 12H2와 1E11을 이용하여 획득된 예시적인 데이터 및 Ki 값은 도 8에 도시된다.
상기 표 11에서 가장 오른쪽 칼럼은 HTB-10 세포 막에 대한 방사성표지된 125I-CGRP 경쟁 결합 분석에서, 지정된 mAb의 Ki 값을 제시한다. 이들 데이터는 CGRP 수용체 항체가 CGRP 결합에 대하여 고도로 경쟁적 (모두 나노몰 하위 범위)임을 증명한다.
실시예 6
CGRP 수용체 차단 항체의 KD 결정을 위한 FACS 결합 분석
세포에서 발현된 CGRP 수용체에 대한 항-CGRP R mAb의 친화성은 FACS 방법을 이용하여 결정되었다. 간단히 말하면, 앞서 기술된 바와 같이 준비된 AM-1 CHO huCGRP R-발현 세포는 10%FBS, NEAA, PS, L Glut, NaPyr과 0.05% 아지드화나트륨을 포함하는 DMEM 배지에서 웰당 16,000개 또는 160,000개 세포의 밀도로 96-웰 평판에서 도말되었다. CGRP 수용체 항체는 동일한 배지 내에서 50 nM에서부터 1 pM까지 적정되고 세포와 함께 배양되었다. 평판 교반기에서 4℃에서 120 ㎕의 총 부피로 하룻밤 배양후, 이들 세포는 PBS+2%FBS로 2X 세척되고, 매번 원심분리되고 상층액이 버려졌다. 7AAD (5 ㎕/웰)를 포함하는 100 ㎕/웰의 G 항-Hu Fc Cy5 (5 ㎍/㎖; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA)가 첨가되고 4℃에서 40분 동안 배양되었다. 이들 세포는 PBS+2%FBS로 2X 세척되고, 매번 원심분리되고 상층액이 버려졌다. 이후, 100 ㎕ PBS+2%FBS 완충액이 첨가되고 결합 기하평균 (binding geomean)을 결정하기 위하여 FACS에 의해 분석되었다. Kd는 각 항체 농도에서 음의 기하평균을 현재 유리 Ab의 양으로 간주함으로써 KinExA 소프트웨어를 이용하여 계산되었다 (Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013). 2가지 상이한 세포 농도에서 획득된 데이터는 Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013에서 기술된 바와 같이, Kd를 결정하는 n-곡선 분석, 그리고 95% 신뢰 구간 (confidence interval)에 의해 분석되었다.
항체 12G8.2에 대하여 상응하는 곡선 맞춤 (curve fit)과 함께 예시적인 데이터가 도 10에 도시된다. 본 발명을 뒷받침하기 위하여 산출된 8개의 차단 항체의 데이터는 표 12에 제시된다. 이들 항체 중에서 한 가지 (3B6)는 2가지 상이한 일자에서 분석되었다. 16K 세포로 실험에서 획득된 0.9의 비율은 항원 농도가 0.9X Kd로 예측되고, 따라서 이러한 실험에 의해 획득된 곡선이 Kd 제어된 곡선이라는 것을 지시한다. 이러한 방식으로 획득된 Kd 값이 모든 조사된 항체에 대하여 낮은 한자릿수 나노몰 범위 내에 있었다는 것은 이해될 수 있다.
Figure pat00039
실시예 7
BICORE 결합 경쟁에 의한 CGRP 수용체 차단 항체의 비닝 (binning)
*Biacore 분석 (Karlsson, R. et al., Methods; A Companion to Methods in Enzymology, 6: 99-110 (1994))은 아래와 같이 수행되었다. CM5 센서 칩 표면에 항-CGRP 수용체 항체의 고정화 (immobilization)는 10mM HEPES, 0.15M NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005% P-20, pH 7.4 (HBS-EP 완충액)의 연속 흐름을 이용하여 제조업체의 사용설명서에 따라 수행되었다. 센서 칩 표면 상에서 카르복실 기는 0.2 M N-에틸-N' (디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)와 0.05 M N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 포함하는 60 ㎕의 혼합물을 주입함으로써 활성화되었다. 비표면 (specific surface)은 10 mM 아세트산염, pH 4.0에서 30 ㎍/㎖의 농도로 희석된 180 ㎕의 항-CGRP 수용체 항체를 주입함으로써 획득되었다. 이들 표면 상에서 과량의 반응 기는 60 ㎕의 1 M 에탄올아민을 주입함으로써 불활성화되었다. 개별 항체에 대한 최종 고정된 수준은 아래와 같았다:
항체 공명 단위 (RU)
11D11 ~5,900
3B6 ~7,200
4H6 ~8,000
12G8 ~7,800
9F5 ~6,600
34E3 ~3,700
비어 있는 가성 (mock)-결합된 참조물 표면 역시 센서 칩 상에서 준비되었다. 100 nM의 농도에서 가용성 huCGRP 수용체는 앞서 언급된 6개의 고정된 항체 (11D11, 3B6, 4H6, 12G8, 9F5 또는 34E3) 중에서 한 가지를 갖는 센서 칩 상에서 포획되었다. 이후, 20개의 조사 항-CGRP R 항체 각각이 포획된 huCGRP 수용체 위에 주입되었다. 주입된 항체가 고정된 항체에 의해 인식되는 에피토프와 상이한 에피토프를 인식하면, 두 번째 결합 사건이 관찰될 것이다. 이들 항체가 동일한 또는 매우 유사한 에피토프를 인식하면, huCGRP 수용체의 결합만 관찰될 것이다.
고정된 항체 3B6로 코팅된 센서 칩을 이용하여 획득된 예시적인 데이터는 도 9A에 도시된다. 4개의 자취는 주입된 용액에서 항체 1E11, 4E4, 2E7과 12G8을 이용하여 획득된 데이터이다. 실험 동안 사건은 대문자로 표시되는데, "A"는 huCGRP R-Fc의 주입에 상응하고, "B"는 huCGRP R-Fc 주입의 종결에 상응하고, "C"는 두 번째 mAb의 주입에 상응하고, 그리고 "D"는 두 번째 mAb의 주입의 종결과 완충액 세척의 시작에 상응한다. 고정된 항체 표면 상에서 임의의 주입된 항체로부터 임의의 결합 신호의 징조가 나타나지 않는다는 점에 주목하고, 이는 이들 4개의 주입된 항체가 고정된 항체와 동일하거나 매우 유사한 에피토프(들)를 명백하게 인식한다는 것을 지시한다. 5개의 고정된 중화 항체 표면 각각에서 세척된 모든 조사된 차단 항체로 본질적으로 동일한 결과가 관찰되었는데, 이는 모든 조사된 항-huCGRP 수용체 차단 항체가 동일하거나 매우 유사하고 강하게 중복되는 에피토프(들)를 인식하다는 것을 지시한다.
대조적으로, 도 9B, 9C와 9D에서 부분적으로 도시된 바와 같이, 4개의 조사된 비-차단, CGRP 수용체 특이적 항체 32H8, 33B5, 33E4와 34E3은 비록 34E3이 4H6 (도 9D)과 경쟁하고 32H7 (데이터 제시되지 않음)과 약하게 경쟁할 수 있긴 했지만, 11D11 (데이터 제시되지 않음), 3B6 (도 9B), 12G8 (도 9C)와 9F5 (데이터 제시되지 않음)와 경쟁하지 못하였다. 32H8은 3B6, 4H6, 12G8, 9F5 또는 비-차단 항체 34E3과 경쟁하지 못한 반면, 33B5와 33E4는 비-차단 항체 34E3과 경쟁할 수 있었다. 모든 차단과 비-차단 항체에 대한 데이터는 하기 표 13에 요약된다. "NB"는 결합 없음을 지시한다; "+"는 유의한 결합을 지시한다; 그리고 "약함"은 약한 결합을 지시한다.
Figure pat00040
이들 데이터로부터 확인되는 바와 같이, 모든 조사된 차단 또는 중화 항체는 5개의 고정된 차단 항체와 동일한 영역에 결합한다; 즉, 모든 조사된 중화 항체는 CGRP R 분자의 동일한 영역에 결합한다. 다른 한편, 비-차단 항체는 전반적으로, 이들 고정된 차단 항체와 경쟁하지 못하였는데, 이는 이들 비-차단 항체가 CGRP R의 상이한 영역에 일차적으로 결합한다는 것을 지시한다.
실시예 8
웨스턴 블롯에서 가용성 CGRP 수용체에 CGRP 수용체 항체의 결합
3개의 대표적인 CGRP 수용체 차단 항체가 가용성 CGRP 수용체-muFc 융합 단백질에 결합에 대하여 웨스턴 블롯을 이용하여 조사되었다.
100 ng의 정제된 CGRP R-muFc (생쥐 Fc가 이용되고, 그리고 RAMP1 또는 CRLR ECD와 muFc 사이에 링커가 "GGGGGVDGGGGGV" (서열 번호 213)으로 교체된 점을 제외하고, CGRP R-huFc에 대하여 앞서 기술된 바와 같이 생산되고 정제됨)는 13.3% 농도에서 (환원된) 베타-메르캅토에탄올 (βME)과 함께, 또는 (비-환원된) 베타-메르캅토에탄올 (βME) 없이, PAGE 시료 완충액을 포함하는 PBS에서 희석되었다. 이후, βME를 포함하는 시료는 4분 동안 끓여졌다. 환원된 시료와 비-환원된 시료는 CGRP R-Fc 단백질과 분자량 마커 (Invitrogen)의 엇갈리는 레인으로, 별도의 4-20% Tris-글리신 겔 (Invitrogen)로 적하되었다. 겔은 0.2㎛ 니트로셀룰로오스 필터 (Invitrogen) 상에 전기블롯팅 (electroblotting)되었다. 이들 블롯은 Tris-완충된 염수 + 1% Tween 20 (TBST)으로 세척되고, 이후 30분 동안 TBST + 5% 분말 우유로 차단되었다. 이들 블롯은 분자량 마커 레인을 따라서 스트립 (strip)으로 절단되었다. 환원된 및 비-환원된 CGRP R-muFc를 포함하는 각 스트립은 정제된 huCGRP R 항체 4E4, 9F5, 또는 3B6 (TBST + 5% 우유에서 1:500 희석), 염소 항-huRAMP1 N-20 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Inc), 토끼 항-생쥐 IgG-Fc-HRP (1:10,000) (Pierce), 또는 염소 항-인간 IgG-Fc-HRP (1:10,000) (Pierce)와 함께 항온처리되었다. 블롯은 이들 항체와 함께 1시간 동안 항온처리되고, 그 이후에 TBST + 1% 우유로 3x10분 세척되었다. huCGRP R 항체로 처리된 블롯은 이후, 염소 항-생쥐 IgG-Fc-HRP (TBST + 1% 우유에서 1:10,000)와 함께 항온처리되고, 그리고 항-huRAMP1 (N-20 항-RAMP1 염소 다중클론 항체, Santa Cruz Biotech, CA)로 처리된 블롯은 토끼 항-염소 IgG-Fc-HRP (1:10,000)와 함께 20분 동안 항온처리되었다. 블롯은 TBST로 3x15분 세척되었다. huCGRP R과 항-huRAMP1 항체 블롯은 Pierce Supersignal West Pico 검출 시약으로 처리되고, 그리고 항-생쥐와 항-인간 IgG-Fc-HRP 블롯은 Pierce 표준 검출 시약 (1 분)으로 처리되었다. 이후, 블롯은 Kodak Biomax MS X-레이 필름으로 노출되었다.
3가지 CGRP 수용체 항체, 4E4, 9F5와 3B6 모두 비-환원된 조건 하에 가용성 CGRP R-muFc (RAMP1-ECD 및 CRLR ECD를 포함)를 검출할 수 있지만 환원된 조건에서는 그러하지 못했는데, 이는 이들 CGRP R 항체의 결합 에피토프가 배좌적 (conformational)이고 이황화 연쇄 (RAMP1-ECD에서 3개의 쌍 및 CRLR N-ter ECD에서 3개의 쌍)에 민감하다는 것을 지시하였다. 대조적으로, 상업적 항-RAMP1 항체 N-20 (Santa Cruz Biotech)은 환원된 조건과 비-환원된 조건 둘 모두에서 RAMP1에 결합하였는데, 이는 N-20 항체에 대한 결합 부위가 일차적으로 선형이고 이황화 연쇄에 민감하지 않다는 것을 지시하였다.
실시예 9
키메라 수용체에 CGRP 수용체 차단 항체의 결합
고유 RAMP1과 키메라 CRLR로 형성된, 또는 고유 CRLR과 키메라 RAMP1로 형성된 CGRP 수용체는 항체 결합에 관여하는 CGRP 수용체 서열을 확인하는데 이용되었다. 조사된 모든 인간 CGRP 수용체 차단 항체가 쥐 CGRP 수용체에 대한 기능적 활성을 나타내지 못했기 때문에, 이들 키메라 성분은 인간 서열 배경에서 쥐 서열의 영역을 보유하였다. FACS에 의한 결합 분석을 위하여 아래의 키메라가 산출되었다:
RAMP1 키메라 #1 (Q28 내지 A34); 서열 번호 217
인간 RAMP1 내에서 아미노산 잔기 Q28 내지 A34는 쥐 RAMP1로부터 상응하는 서열로 대체되었다. 이러한 스트레치 (stretch)는 인간과 쥐 RAMP1 사이에 상이한 5개의 아미노산 잔기를 포함하였다.
RAMP1 키메라 #2 (Q43 내지 E53); 서열 번호 218
인간 RAMP1 내에서 아미노산 잔기 Q43 내지 E53은 쥐 RAMP1로부터 상응하는 서열로 대체되었다. 이러한 스트레치 (stretch)는 인간과 쥐 RAMP1 사이에 상이한 6개의 아미노산 잔기를 포함하였다.
RAMP1 키메라 #3 (R67 내지 E78); 서열 번호 219
인간 RAMP1 내에서 아미노산 잔기 R67 내지 E78은 쥐 RAMP1로부터 상응하는 서열로 대체되었다. 이러한 스트레치 (stretch)는 인간과 쥐 RAMP1 사이에 상이한 7개의 아미노산 잔기를 포함하였다.
CRLR 키메라 #1 (L24 내지 Q33); 서열 번호 223
인간 CRLR 내에서 아미노산 잔기 L24 내지 Q33은 쥐 CRLR로부터 상응하는 서열로 대체되었다. 이러한 스트레치 (stretch)는 인간과 쥐 CRLR 사이에 상이한 8개의 아미노산 잔기를 포함하였다.
도 11에서는 RAMP1 키메라 #1 (서열 번호 217), 키메라 #2 (서열 번호 218)와 키메라 #3 (서열 번호 219)의 서열과 함께, 필리핀 원숭이 (서열 번호 215), 인간 (서열 번호 4), 쥐 (서열 번호 214)와 레서스 원숭이 (서열 번호 216)로부터 RAMP1 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 도 12A와 12B에서는 CRLR 키메라 #1의 아미노산 서열 (서열 번호 223)뿐만 아니라 인간 (서열 번호 2), 필리핀 원숭이 (서열 번호 221), 레서스 원숭이 (서열 번호 222), 쥐 (서열 번호 220)로부터 CRLR 아미노산 서열의 정렬을 도시한다.
293-6E 세포는 CGRP R 키메라 DNA 구조체 (CRLR wt + RAMP1 Q28-A34; CRLR wt + RAMP1 Q43-E53; CRLR wt + RAMP1 R67-E78; CRLR L24-Q33 + RAMP wt; CRLR wt + RAMP1 wt; pTT5 벡터 대조)로 일시적으로 형질감염되었다. 세포는 72시간후 수확되고, PBS + 0.5% BSA로 세척되고, 그리고 계산되었다. 각 형질감염된 세포주는 100㎕ PBS/BSA당 5x105개 세포의 희석도로 재현탁되었다. 100㎕의 세포 현탁액은 96-웰 둥근-바닥 평판 (Falcon)에서 웰 (well)당 분취량 (aliquot)이었다. 이들 세포는 1200rpm에서 5분 동안 펠릿으로 만들어졌다. 상층액은 제거되고 0.5㎍ 정제된 huCGRP R 항체 1H7, 2E7, 3B6, 9F5, 4H6, 12G8, 3C8, 10E4, 11D11, 32H8, 또는 33B5를 포함하는 100㎕로 교체되었다. 대조 웰은 항-DNP huIgG2 (0.5㎍), Alexa647-CGRP 펩티드 (0.5㎍), 또는 PBS/BSA 단독으로 처리되었다. 세포는 얼음 위에서 1시간 동안 배양되고, 이후 PBS/BSA로 2회 세척되었다. 이들 세포는 항-hug-Fc-FITC (0.5 ㎍)를 포함하는 100 ㎕/웰 PBS/BSA에서 재현탁되었다 (Alexa647-CGRP 처리된 세포 제외). 세포는 어둠 하에 얼음 위에서 1시간 동안 배양되고, 이후 PBS/BSA로 2회 세척되었다. 세포는 200 ㎕ PBS/BSA에서 재현탁되고 FACS Calibur.를 이용하여 분석되었다.
10개의 대표적인 차단 항체 (3B6, 9F5, 4H6, 12G8, 3C8, 10E4, 32H7, 4E4, 11D11과 1H7) 및 2개의 비-차단 항체 (32H8과 33B5)가 조사되었다. 대표적인 데이터 (9F5 항체)는 도 13A, 13B와 13C에서 도시된다. 도 13A에서는 야생형 CGRP 수용체에 결합을 보여준다; 도 13B에서는 CRLR L24-Q33 키메라를 보유하는 CGRP 수용체에 결합을 보여준다; 그리고 도 13C에서는 RAMP1 Q28-A34 키메라를 보유하는 CGRP 수용체에 결합을 보여준다. 이러한 FACS 분석은 12가지 항체 모두 예상된 바와 같이, 야생형 인간 CGRP 수용체 대조에 결합한다는 것을 증명하였다. 12가지 항체 모두 3가지 RAMP1 키메라 RAMP1 (Q28-A34), (Q43-E53)과 (R67-E78) 중에서 한 가지에 현저하게 감소된 결합을 보였다. 이는 (1) 키메라 수용체의 발현 수준이 훨씬 낮고, (2) RAMP1 키메라가 인간 CRLR과의 접힘을 손상시키고 수용체 복합체의 배좌를 변경하고, 및/또는 (3) RAMP1 상에서 이들 3개의 선택된 영역이 CGRP 수용체에 이들 항체의 결합에 직접적으로 관여한다는 것으로부터 기인할 수 있다.
FACS 추적 (tracing)이 매우 작은 "발현" 세포 개체군을 포함하도록 개폐될 때, 비-차단 항체 33B5와 32H8은 차단 항체와 비교하여 적게 (더욱 낮은 Geo Means) RAMP1 Q43-E53 키메라에 지속적으로 결합하는 것으로 나타났는데, 이는 RAMP1 Q43-E53 영역에 결합이 비-차단 항체에서 더욱 중요할 수 있음을 암시한다. 다른 한편, 33B5와 32H8은 차단 항체보다 많이 RAMP1 R67-E78 키메라에 지속적으로 결합하였는데, 이는 RAMP1 R67-E78 서열이 차단 항체에서 더욱 중요할 수 있음을 암시한다.
조사된 모든 CGRP 수용체 항체는 CRLR 키메라 (L24-Q33)에 충분히 합리적으로 결합하였는데, 이는 상기 부위가 차단 항체의 결합에 필수적이지 않다는 것을 암시한다.
요약하면, 상기 데이터는 RAMP1 상에서 3개의 불연속 영역--(Q28-A34), (Q43 - E53)과 (R67-E78)--이 CGRP 수용체 항체 결합에 관여할 수 있고, (R67-E78)이 이들 차단 항체에 더욱 중요하다는 것을 증명한다. CRLR의 N-말단 서열 (L24-Q33)은 이러한 방법에 의해 분석될 때, CGRP 수용체 항체에 대한 결합에 결정적으로 관여하는 것으로 보이지 않았다. 이러한 접근법은 상기 분석에서 표적화되지 않은 인간과 쥐 CGRP 수용체 사이에 동일한 또는 유사한 서열을 공유하는 추가의 결합 부위를 배제하지 않는다.
실시예 10
프로테아제 보호 분석에 의한 항- CGRP R 중화 항체에 대한 인간 CGRP R 에피 토프의 확인
CRLR-Fc 융합 분자의 성숙 형태 (신호 펩티드가 제거됨; 본 명세서에서 서열 번호 10으로 제시됨)에서 CRLR 부분은 116개의 아미노산 (글리신 링커에 선행)을 포함하고, 그리고 3개의 이황화 결합의 형성에 의해 산출된 3개의 대형 루프 구조를 갖는다. CRLR 내에서 3개의 이황화 결합은 서열 위치 52에서 Cys3에 연결된 서열 위치 26에서 Cys1 (본 단락에서 열거된 모든 CRLR 서열 위치는 서열 번호 10으로 제시된 성숙 서열에 관계한다) (CRLR C1-C3으로 지칭됨), 서열 위치 83에서 Cys5에 연결된 서열 위치 43에서 Cys2 (CRLR C2-C5로 지칭됨), 서열 위치 105에서 Cys6에 연결된 서열 위치 66에서 Cys4 (CRLR C4-C6으로 지칭됨)이다. RAMP1-Fc 융합 분자의 성숙 형태에서 RAMP1 부분은 글리신 링커에 선행하는 91개 아미노산 (서열 번호 11)을 포함하고, 이는 또한, 3개의 분자내 이황화 결합을 형성한다. RAMP1 내에서 3개의 이황화 결합은 서열 위치 56에서 Cys5에 연결된 서열 위치 1에서 Cys1 (본 단락에서 열거된 모든 RAMP1 서열 위치는 서열 번호 11로 제시된 성숙 서열에 관계한다) (RAMP1 C1-C5로 지칭됨), 서열 위치 46에서 Cys4에 연결된 서열 위치 14에서 Cys2 (RAMP1 C2-C4로 지칭됨), 서열 위치 78에서 Cys6에 연결된 서열 위치 31에서 Cys3 (RAMP1 C3-C6으로 지칭됨)이다.
항-CGRP 중화 단일클론 항체에 의해 결합되는 인간 CGRP 수용체 단백질의 영역은 특정한 프로테아제로 h CGRP R을 펩티드로 단편화시키고, 그리고 결과의 h CGRP R 펩티드의 서열 (즉, CRLR과 RAMP1 부분에 대한 이황화-와 비-이황화-보유 펩티드 단편 둘 모두)을 결정함으로써 확인되었다. 이후, 결합 단일클론 항체의 존재에서 hCGRP R의 단백분해 절단을 결정하기 위하여 프로테아제 보호 분석이 수행되었다. 이러한 분석법에 대한 개략적인 원리는 CGRP R에 mAb의 결합이 일정한 특정 프로테아제 절단 부위의 보호를 유발할 수 있고, 그리고 이러한 정보가 상기 mAb가 결합하는 CGRP R의 영역 또는 일부분을 결정하는데 이용될 수 있다는 것이다.
간단히 말하면, 펩티드 절단체 (digest)는 HPLC 펩티드 맵핑에 종속되었다; 개별 피크는 수집되고, 그리고 이들 펩티드는 온-라인 전기분무 이온화 (on-line electrospray ionization) LC-MS (ESI-LC-MS) 분석 및/또는 N-말단 염기서열분석에 의해 확인되고 맵핑되었다. 이들 연구를 위한 모든 HPLC 분석은 오프-라인 분석의 경우에 Narrow bore 역상 C18 칼럼 (2.1 mm i.d. x 15 cm 길이; Zorbax 300SB, 5 ㎛, Agilent Technologies)을 이용하고, 그리고 LC-MS의 경우에 모세관 역상 C18 칼럼 (0.5mm i.d. x 25 cm Vydac C18 MS, 5 ㎛; The Separation Group)을 이용하여 수행되었다. HPLC 펩티드 맵핑은 0.05% 트리플루오르아세트산에서부터 0.05% 트리플루오르아세트산 (이동상 A)에서 90% 아세토니트릴로의 선형 농도차로 수행되었다. 칼럼은 오프-라인 또는 온-라인 LC-MS 분석을 위한 Narrow bore HPLC의 경우에 0.25 ㎖/min의 유속으로, 그리고 온-라인 LC-MS 분석을 위한 모세관 HPLC의 경우에 0.018 ㎖/min의 유속으로 90분에 걸쳐 전개되었다.
성숙 형태 인간 CGRP R은 2 ㎍의 AspN과 함께 37℃에서 20시간 동안, 0.1M 인산나트륨 (pH 6.5)에서 1.0 ㎎/㎖로 대략 100 ㎍의 CGRP R을 항온처리함으로써 AspN (이는 아미노 단부에서 아스파르트산 및 일부 글루타민산 잔기의 뒤를 절단한다)으로 절단되었다.
AspN 절단체의 HPLC 크로마토그래피는 도 14에서 도시된 바와 같은 펩티드 프로필 (각각 시료 30 ㎍ 주입됨)을 산출하는데, CGRP R 단독 (농도 1 ㎎/㎖)에 대한 크로마토그램은 A로 표지되고, 반면 유사한 양의 CGRP R 중화 항체, 클론 12G8로 대조 절단은 상기 항체가 AspN 엔도프로테이나아제 (B로 표지된 크로마토그램; CGRP R:항체 비율, 각각 중량비 (weight by weight) 100:2; 100:7; 100:20)에 본질적으로 내성이라는 것을 증명한다. 서열 분석은 HPLC로부터 회수된 펩티드 피크 상에서 온-라인 LC-MS/MS 및 Edman 염기서열분석에 의해 수행되었다. HPLC에 의해 분리된 펩티드의 정확한 질량과 서열을 결정하기 위하여, 펩티드 절단체의 온-라인 ESI LC-MS 분석이 수행되었다. 따라서 AspN 절단으로부터 펩티드 피크 내에 존재하는 여러 펩티드 (도 14에서 넘버링된 피크로서 표시됨)의 정체가 결정되었다. 하기 표 14에서는 hCGRP R의 상응하는 성분 (CRLR 또는 RAMP1) 내에서 이들 펩티드 서열의 위치를 제시한다. 숫자 또는 X가 뒤따르는 대문자 C는 CRLR 펩티드로서 확인된 펩티드를 나타낸다; 숫자 또는 X가 뒤따르는 대문자 R은 RAMP1 펩티드이고, 그리고 "Fc"는 CRLR-Fc와 RAMP1-Fc 융합 분자로부터 방출된 크고 절단되지 않은 Fc 단편을 나타낸다.
Figure pat00041
도 15에서는 CGRP R 단독 (A로 표지된 크로마토그램)으로 AspN 절단 실험 (각각 시료 30㎍ 주입됨) 및 중화 항체 12G8 (B로 표지된 크로마토그램)의 존재에서 수행된 동일한 실험의 비교를 보여준다. CGRP R:항체의 중량 비율은 1:1이었다. 여러 피크 (C5, C6, 그리고 C7)는 크로마토그램 A에 비하여 크로마토그램 B에서 피크 극치에서 감소를 나타내는 반면, 다른 2개의 피크 (C-X와 R-X)는 크로마토그램 A에 비하여 크로마토그램 B에서 피크 극치에서 증가를 나타낸다. 유사한 펩티드 맵 패턴이 C로 표지된 크로마토그램에서 관찰되는 바와 같이, 상이한 중화 항-CGRP R 항체 (10E4, 3B6, 3C8 또는 4E4)가 유사한 양으로 절단 시료 내에 존재하면 관찰되었다. C6과 C7 둘 모두 CRLR 분자의 주요 부분을 커버하는 이황화 연결된 펩티드인 반면, C5는 상기 분자의 N-말단 단부에 존재하는 CRLR 비-이황화-보유 펩티드이고 C7 이황화 펩티드의 끝에서 두 번째이다. 피크 C-X는 복수 서열과의 3개의 CRLR 이황화 결합을 보유하고, 이는 적어도 2개 내지 3개의 펩티드가 이황화 결합에 의해 서로 연결된다는 것을 지시한다. 피크 C-X가 CGRP 중화 항체의 존재에서 CGRP R 절단체에서 증가된 피크 극치를 갖는다는 사실은 상기 항체가 Glu25와 Asp55에 관련된 여러 절단 부위에서 AspN 절단으로부터 CGRP R을 보호한다는 것을 지시한다. 상기 항체는 펩티드 C2와 C4에 대한 피크 강도가 전혀 감소하지 않았기 때문에, Asp33과 Asp72에 별다른 보호 효과를 나타내지 못하는 것으로 생각된다. 이런 이유로, 상기 항체는 Cys53과 Cys66 사이에 루프 영역과 함께 CRLR C1-C3과 CRLR C4-C6 이황화 영역을 보유하는 CRLR의 영역에 결합하는 것으로 생각된다.
hCGRP R의 AspN 맵핑은 또한, RAMP1 이황화 펩티드 (R2) 및 RAMP1 비-이황화 펩티드 (R1)를 확인하였다 (표 14와 도 14 참조). 전술한 중화 항체 (12G8, 10E4, 4E4, 3B6 또는 3C8) 중에서 한 가지의 존재에서, 펩티드 R-X는 시료 내에 항체 없이 절단으로부터 획득되는 것보다 훨씬 높은 피크 강도로 회수되었다. 질량과 서열 분석은 R-x가 Cys1과 Arg86 사이에 RAMP1 서열에 상응하는 단일 폴리펩티드 사슬을 보유한다는 것을 증명하였다. 이들 실험은 CGRP R 중화 항체가 AspN 단백분해 절단으로부터 RAMP1의 중요한 영역을 보호할 수 있다는 것을 지시한다.
CGRP R AspN 단백분해의 보호 효과가 CGRP R-중화 (blocking) 항체 (항-CGRP R 비-중화 항체와 비교하여)에 특이적인 지를 평가하기 위하여, CGRP R 활성을 중화시키지 않는 관련 없는 대조 단일클론 항체의 존재에서 CGRP R의 AspN 절단이 수행되었다. 획득된 결과는 도 15에서 크로마토그램 D에 도시된다. 상기 비-중화 항체는 CGRP R AspN 단백분해에 대한 별다른 차단 효과를 나타내지 못한다; 실제로, 상기 펩티드 맵 프로필 (크로마토그램 D)은 관련된 측면에서, CGRP R 단독의 절단으로부터 유래된 프로필 (크로마토그램 A)과 거의 구별되지 않는다.
단백분해 보호 효과는 절단 시료에 첨가된 농도에 의존하였다. 도 16에서 확인되는 바와 같이, 가변하는 양의 항-CGRP R 중화 항체 4E4를 포함하는 시료 (100㎍) 내에서 고정된 CGRP R 양 (CGRP R:항체 비율 (microgram), 각각 중량비 (weight by weight) 100:2; 100:7; 100:20)이 Aspen 단백분해를 위하여 수행되었다. 보호 프로필이 관찰될 수 있고, 그리고 이러한 보호는 항체 농도-의존성이다.
종합하면, 이들 데이터는 본 명세서에서 제시된 차단 또는 중화 항-CGRP R 항체가 AspN 단백분해로부터 CGRP R (CRLR과 RAMP1 성분 둘 모두에서)을 차단할 수 있다는 것을 증명하고, 이들 차단 항체가 CGRP 수용체에 결합할 때 CRLR과 RAMP1 둘 모두에 결합한다는 것을 암시한다. 게다가, 이러한 보호 효과는 항체-농도 의존성이다. 이들 결과는 또한, CGRP R 중화 항체가 Asp N 절단 부위에 가까운, 인간 CGRP R 상에서 공통 영역에 결합한다는 것을 지시한다.
실시예 11
cAMP 기능적 분석에서 상업적으로 가용한 항- RAMP1과 항- CRLR 항체
인간 CGRP 수용체의 한쪽 또는 다른 쪽 성분 (RAMP1 또는 CRLR)에 대한 상업적으로 가용한 항체는 이들 항체가 생물학적 활성을 갖는 지를 결정하기 위하여, 상기 실시예 4에서 기술된 바와 같이 HTB-10 세포를 이용한 CGRP 수용체 매개된 cAMP 분석에서 스크리닝되었다. 획득된 데이터는 하기 표 15에 제시된다. 이들 항체는 본 명세서에서 제시된 예시적인 항체가 강한 생물학적 활성을 갖는 농도 범위에서, 검출 없음 ("ND"), 매우 약한 생물학적 활성 ("VW") 또는 약한 생물학적 활성 ("W")을 나타냈다.
Figure pat00042
Figure pat00043
실시예 12
상이한 수용체 성분을 발현하는 세포의 면역조직화학 염색
콜라 플러그 (colla plug) (Integra LifeSciences Co., Plainsboro, NJ) 마다 2-4x106개 세포가 주입되었다. 콜라 플러그는 OCT 배지 (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA)에 끼워 넣어지고, -20℃에서 동결되고, 그리고 저온 유지 장치 (cryostat)를 이용하여 20 ㎛ 절편으로 절단되었다. 절편은 실온 (RT)에서 1시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정되고, 이후 인산염-완충된 염수 (PBS)에서 세척되었다. 내인성 과산화효소는 3% H2O2/PBS로 15분 동안 차단되고, 그리고 절편은 차단 용액 (3% 정상 염소 혈청 (Vector Labs, Burlingame, CA) 및 0.3% triton X-100을 포함하는 PBS)에서 1시간 동안 배양되었다. 이후, 절편은 인간 항-CGRP 수용체 일차 항체 (32H7, 0.03 - 0.1 ㎍/㎖)에서 4℃에서 하룻밤동안 배양되고, PBS에서 세척되고, 그리고 1% 정상 염소 혈청/PBS에서 이차 항체 (비오틴화된 염소 항-인간 IgG Fc 단편, 1:800, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)에서 RT에서 1시간 동안 배양되었다. 면역반응성 (immunoreactivity)은 제조업체 (Vector Labs, Burlingame, CA)의 사용설명서에 따라 Vector Elite 키트를 이용하여 증폭되고, 염색은 3,3'-디아미노벤지딘-니켈을 색원체 (chromogen) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 이용하여 현색되었다. 절편은 자일렌으로 청소되고 Permount (Fisher Chemicals, Fair Lawn, NJ)로 커버슬립되었다. 면역반응성은 Nikon E-800 현미경 및 관련된 소프트웨어 (Nikon, Melville, NY)를 이용하여 분석되었다.
앞서 기술된 바와 같이 항체 32H7을 이용하여 상이한 수용체 성분을 발현하는 세포 (하기에 확인된 바와 같음)로부터 데이터는 재조합 인간 CGRP 수용체를 발현하는 CHO 세포 (CRLR+RAMP1; "CHO/CGRP R 세포")의 뚜렷한 염색, 그리고 CGRP 수용체를 내인성으로 발현하는 SK-N-MC 세포의 더욱 약한 염색 (훨씬 낮은 수용체 밀도에 기인)을 증명하였다. 부모 CHO 세포주, 관련 없는 재조합 단백질을 발현하는 CHO 세포 (TRPM8), 상응하는 32H7 항원으로 전흡착 (preadsorption)된 CHO/CGRP R 세포, 재조합 인간 아드레노메듈린 수용체 2를 발현하는 CHO 세포 (CRLR+RAMP3), 아밀린 수용체를 내인성으로 발현하는 MCF-7 세포, 재조합 인간 아드레노메듈린 수용체 1을 발현하는 HEK 세포 (CRLR+RAMP2), 또는 부모 HEK 세포에서는 염색이 관찰되지 않았다. 이들 실험으로부터 데이터는 하기 표 16에 요약된다.
Figure pat00044
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 다른 간행물은 예로써, 본 명세서에서 제시된 요부와 관련하여 이용될 수도 있는 이런 간행물에서 기술된 방법을 기술하고 개시하는 목적으로, 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원일에 앞서 그들의 개시를 위한 목적으로만 제공된다. 이와 관련하여, 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로, 본 발명자들이 이런 개시에 앞서는 권리를 갖지 못함을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 이들 문헌의 일자에 대한 모든 진술, 또는 이들 문헌의 내용에 관한 설명은 본 출원인에게 가용한 정보에 기초되고, 그리고 이들 문헌의 일자 또는 내용의 정확함에 관한 인정으로서 성립되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> HUMAN CGRP RECEPTOR BINDING PROTEINS <130> A-1472-WO-PCT <140> <141> <150> 61/264,622 <151> 2009-11-25 <150> 61/203,569 <151> 2008-12-23 <160> 261 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1419 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgttataca gcatatttca ttttggctta atgatggaga aaaagtgtac cctgtatttt 60 ctggttctct tgcctttttt tatgattctt gttacagcag aattagaaga gagtcctgag 120 gactcaattc agttgggagt tactagaaat aaaatcatga cagctcaata tgaatgttac 180 caaaagatta tgcaagaccc cattcaacaa gcagaaggcg tttactgcaa cagaacctgg 240 gatggatggc tctgctggaa cgatgttgca gcaggaactg aatcaatgca gctctgccct 300 gattactttc aggactttga tccatcagaa aaagttacaa agatctgtga ccaagatgga 360 aactggttta gacatccagc aagcaacaga acatggacaa attataccca gtgtaatgtt 420 aacacccacg agaaagtgaa gactgcacta aatttgtttt acctgaccat aattggacac 480 ggattgtcta ttgcatcact gcttatctcg cttggcatat tcttttattt caagagccta 540 agttgccaaa ggattacctt acacaaaaat ctgttcttct catttgtttg taactctgtt 600 gtaacaatca ttcacctcac 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Ala Leu Val Ala Thr Asn Pro Val Ser Cys Lys 210 215 220 Val Ser Gln Phe Ile His Leu Tyr Leu Met Gly Cys Asn Tyr Phe Trp 225 230 235 240 Met Leu Cys Glu Gly Ile Tyr Leu His Thr Leu Ile Val Val Ala Val 245 250 255 Phe Ala Glu Lys Gln His Leu Met Trp Tyr Tyr Phe Leu Gly Trp Gly 260 265 270 Phe Pro Leu Ile Pro Ala Cys Ile His Ala Ile Ala Arg Ser Leu Tyr 275 280 285 Tyr Asn Asp Asn Cys Trp Ile Ser Ser Asp Thr His Leu Leu Tyr Ile 290 295 300 Ile His Gly Pro Ile Cys Ala Ala Leu Leu Val Asn Leu Phe Phe Leu 305 310 315 320 Leu Asn Ile Val Arg Val Leu Ile Thr Lys Leu Lys Val Thr His Gln 325 330 335 Ala Glu Ser Asn Leu Tyr Met Lys Ala Val Arg Ala Thr Leu Ile Leu 340 345 350 Val Pro Leu Leu Gly Ile Glu Phe Val Leu Ile Pro Trp Arg Pro Glu 355 360 365 Gly Lys Ile Ala Glu Glu Val Tyr Asp Tyr Ile Met His Ile Leu Met 370 375 380 His Phe Gln Gly Leu Leu Val Ser Thr Ile Phe Cys Phe Phe Asn Gly 385 390 395 400 Glu Val Gln Ala Ile Leu Arg Arg Asn Trp Asn Gln Tyr Lys Ile Gln 405 410 415 Phe Gly Asn Ser Phe 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120 ctcacccagt tccaggtaga catggaggcc gtcggggaga cgctgtggtg tgactggggc 180 aggaccatca ggagctacag ggagctggcc gactgcacct ggcacatggc ggagaagctg 240 ggctgcttct ggcccaatgc agaggtggac aggttcttcc tggcagtgca tggccgctac 300 ttcaggagct gccccatctc aggcagggcc gtgcgggacc cgcccggcag c 351 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Arg Ala Leu Cys Arg Leu Pro Arg Arg Gly Leu Trp Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala His His Leu Phe Met Thr Thr Ala Cys Gln Glu Ala Asn Tyr 20 25 30 Gly Ala Leu Leu Arg Glu Leu Cys Leu Thr Gln Phe Gln Val Asp Met 35 40 45 Glu Ala Val Gly Glu Thr Leu Trp Cys Asp Trp Gly Arg Thr Ile Arg 50 55 60 Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Cys Thr Trp His Met Ala Glu Lys Leu 65 70 75 80 Gly Cys Phe Trp Pro Asn Ala Glu Val Asp Arg Phe Phe Leu Ala Val 85 90 95 His Gly Arg Tyr Phe Arg Ser Cys Pro Ile Ser Gly Arg Ala Val Arg 100 105 110 Asp Pro Pro Gly Ser 115 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Trp Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu Ser Arg Ser Gly Gly Val 1 5 10 15 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of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 75 Asp Arg Leu Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His Tyr Lys Tyr 1 5 10 15 Tyr Gly Met Ala Val 20 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 76 Asn Ala Trp Met Ser 1 5 <210> 77 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 77 Arg Ile Lys Ser Thr Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 78 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 78 Asp Arg Thr Gly Tyr Ser Ile Ser Trp Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 79 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 80 <211> 17 <212> 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annotations for said positions" <400> 118 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Gly" or "Thr" or "Arg" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Lys" or "Ser" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="Asn" or "Gln" <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> /note="Residue given in the sequence has no preference with respect to those in the annotations for said position" <400> 119 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Asp" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> /note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotation for said position" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace="Tyr" <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> /note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotation for said position" <400> 121 Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 122 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="Ser" <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> /note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotation for said position" <400> 122 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 123 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial 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said positions" <400> 134 Asn Ala Trp Met Ser 1 5 <210> 135 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Trp" or "Ala" or "Val" or "Ser" or "Phe" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> /note="Residue given in the sequence has no preference with respect to those in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="Asn" or "Ser" or "Trp" or "Arg" <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="Pro" or "Gly" or "Phe" or "Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace="Thr" or "Arg" or " " <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace="Ala" or " " <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="Asn" or "His" or "Ser" or "Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (8)..(9) <223> /replace="Ser" <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace="Gly" or "Arg" or "Ile" or "Asn" or "His" or "Tyr" <220> <221> 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 185 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtatttta gacagctcca acaatgataa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aaactgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttataatact 300 ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 339 <210> 186 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 186 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgaggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gccgcctgag tgctgtggtt 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 251 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60 cgctgtgagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttgg taaagcctgg ggggtccctt 120 agactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtaacg cctggatgag ctgggtccgc 180 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtt ggccgtatta aaagcaaaac tgatggtggg 240 acaacagact acactgcacc cgtgaaaggc agattcacca tctcaagaga tgattcaaaa 300 aacacgctgt atctgcaaat gaatagcctg aaagccgagg acacagccgt gtattactgt 360 accacagatc ggaccgggta tagcatcagc tggtctagtt actactacta ctacggtatg 420 gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctctagtg cctccaccaa gggcccatcg 480 gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc 540 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc 600 agcggcgtgc acaccttccc agctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 660 gtggtgaccg tgccctccag caacttcggc acccagacct acacctgcaa cgtagatcac 720 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgccca 780 ccgtgcccag 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ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttag 324 <210> 261 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 261 ggtcagccca aggccaaccc cactgtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagctccaa 60 gccaacaagg ccacactagt gtgtctgatc agtgacttct acccgggagc tgtgacagtg 120 gcctggaagg cagatggcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccaa accctccaaa 180 cagagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcccga gcagtggaag 240 tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300 gcccctacag aatgttcata g 321

Claims (16)

  1. 인간 AM1, AM2 또는 AMY1 수용체와 비교하여 인간 칼시토닌 유전자-관련된 펩티드(CGRP) 수용체를 선별적으로 저해하는 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 상기 인간 CGRP 수용체는 인간 CRLR 폴리펩티드 및 인간 RAMP1 폴리펩티드를 포함하고, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CRLR 및 RAMP1 폴리펩티드 둘 모두의 아미노산으로부터 형성된 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 에피토프가 각각의 CRLR 및 RAMP1 폴리펩티드 내에 AspN 프로테아제에 대한 절단 부위를 포함하는 것인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 에피토프가 서열 번호 10의 아미노산 E25 내지 Q32 및 D48 내지 N54로 정의되는 CRLR C1-C3 이황화 영역 및 서열 번호 10의 아미노산 D55 내지 P67 및 D86 내지 H110으로 정의되는 CRLR C4-C6 이황화 영역을 포함하는 것인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, FACS 결합 분석법에 의한 분석으로 KD ≤100 nM로 인간 CGRP 수용체에 특이적으로 결합하는 것인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, FACS 결합 분석법에 의한 분석으로 KD ≤10 nM로 인간 CGRP 수용체에 특이적으로 결합하는 것인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 참조물 항체와 인간 CGRP 수용체에의 결합에 대하여 경쟁하고, 상기 참조물 항체는 (i) 서열 번호 161, 163, 164, 166과 168로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 (ii) 서열 번호 140, 143, 146, 148과 150으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 인간 AM1, AM2 또는 AMY1 수용체와 비교하여, cAMP 억제 분석법에 의한 분석으로 100 이상의 선별성 비율(selectivity ratio)로 인간 CGRP 수용체를 선별적으로 저해하는 것인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인 것인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, 분리된 단일클론 항체가 IgG1-, IgG2-, IgG3-, 또는 IgG4-유형 항체인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간 CGRP 수용체에의 CGRP의 결합을 저해하는 것인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 효과량을 포함하는, 두통의 치료 또는 예방적 치료를 위한 제약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 효과량을 포함하는, 편두통의 치료 또는 예방적 치료를 위한 제약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 효과량을 포함하는, 군발성 두통의 치료 또는 예방적 치료를 위한 제약학적 조성물.
  14. 인간 AM1, AM2 또는 AMY1 수용체와 비교하여 인간 CGRP 수용체를 선별적으로 저해하는 항체의 제조 방법으로서,
    (i) 가용성 CGRP 수용체, 여기서 가용성 CGRP 수용체는 인간 CRLR의 N-말단 세포외 도메인(ECD) 및 인간 RAMP1의 ECD를 포함함,
    (ii) 인간 CRLR 및 인간 RAMP1 폴리펩티드의 전장을 발현하는 전체 세포, 또는
    (iii) 상기 (ii)의 세포로부터의 막 추출물
    을 포함하는 면역원을 동물에 투여하는 단계; 및
    면역화된 동물로부터 인간 CGRP 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 포함하는 것인, 항체의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 인간 CRLR의 ECD가 서열 번호 6를 포함하고, 인간 RAMP1의 ECD가 서열 번호 8을 포함하는 것인, 항체의 제조 방법.
  16. 제14항에 있어서, 동물은 인간 면역글로불린 좌위를 보유하는 형질전환 마우스인, 항체의 제조 방법.
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