KR20170132234A - 혈관 내피 증식 인자 수용체에 결합하는 핵산 앱타머 - Google Patents
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Abstract
[과제] 혈관 신생을 제어하는 VEGF와 그의 수용체에 관련하는 여러 가지 질환, 예를 들어 종양 혈관 신생, 당뇨병성 망막증 및 만성 관절 류머티즘 등의 질환의 진단 및 치료에 유용한, 혈관 내피 증식 인자 수용체에 대한 신규의 핵산 앱타머를 제공한다. [해결 수단] 서열 번호 1 내지 5에 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 인간 VEGF 수용체에 대하여 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 핵산 앱타머. 바람직한 형태에서는, 상기 핵산 앱타머는 검출을 용이하게 하기 위해서, 그의 5' 말단 또는 3' 말단에 프라이머 인식 서열, 형광 표지, 비오틴, 아비딘 혹은 스트렙트아비딘 또는 기타의 특이적 결합 태그 펩티드와 연결되어 있어도 된다.
Description
본 발명은 혈관 내피 증식 인자(VEGF) 수용체에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 및 그 핵산을 포함하는 조성물 등에 관한 것이다.
혈관 신생은, 생리적인 조건 하뿐만 아니라, 종양 혈관 신생, 당뇨병성 망막증 및 만성 관절 류머티즘 등의 질환에 관련하는 중요한 생물학적 과정이다. 혈관 신생에는, 혈관 내피 증식 인자(VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor)와 그의 수용체, 안지오포이에틴-Tie 수용체, 에프린-Eph4 수용체 등의 많은 시그널 전달계가 관여하는데, 특히 VEGF와 그의 수용체는, 혈관 내피 세포의 증식이나 혈관 투과성의 항진에 관여하는 중요한 역할을 한다.
VEGF는, 내피 세포 특이적 증식 인자이고, 분자량 약 20kDa의 서브 유닛에 의한 2량체가 형성된 34 내지 45kDa의 당단백질이며, 신맥관 형성의 촉진, 혈관 투과성의 증강 및 기타의 활성 등의 넓은 범위의 활성을 갖는다. VEGF는 성장 인자의 혈소판 유래 증식 인자(PDGF) 패밀리에 속하고 있고, PDGF의 A 및 B쇄와 아미노산 레벨로 약 18％의 호몰로지를 갖는다. 또한, VEGF는, PDGF 패밀리에 속하는 모든 성장 인자에 공통인 8개의 보존 시스테인 잔기를 포함한다.
VEGF는, 특정한 고친화성 세포 표면 리셉터에 결합함으로써, 혈관 내피 세포에 대한 그의 영향을 발휘한다. 내피 세포에 있어서는 150 및 130kDa의 리셉터가 동정되어 있다. VEGF 리셉터는, 보존된 세포질 촉매적 키나아제 도메인 및 친수성의 키나아제 서열을 특징으로 하는 리셉터 치로신키나제(RTKs)의 슈퍼 패밀리에 속한다. VEGF 리셉터의 세포외 도메인은, VEGF 결합 기능에 관여하고 있다고 생각되는 7개의 이뮤노글로불린 모양 도메인으로 구성된다.
VEGF의 2개의 가장 다량 또한 고친화성의 리셉터는, VEGFR1(Flt-1) 및 VEGFR2(KDR/Flk-1)이다. VEGFR1은, 시부야 등에 의해 처음으로 단리된 유전자로, 구조 유사성으로부터 fms 모양 치로신키나제(Flt-1)로 칭해진다(비특허문헌 1). 한편, VEGFR2는 VEGFR1에 비하여 VEGF와의 친화성은 낮지만 자기 인산화는 고레벨에서 발생하고, 키나아제 활성은 다른 대표적인 수용체 키나아제와 거의 동일 정도이다(비특허문헌 2). KDR의 쥐 호몰로그는, KDR과 85％의 아미노산 호몰로지를 갖고, flk-1(태아 간장 키나아제-1)이라고 칭해진다(비특허문헌 3). 내피 세포에서 발현하고, 병적 혈관 신생에 직접 관계되는 VEGFR2는, 염증성 질환의 진전에는 별로 강하게 관여하지 않고, 단구, 매크로파지계에 발현하는 VEGFR1이, 염증 세포의 동원이나 기능 활성화를 개재하여 염증에 깊게 관계되는 것이 시사되어 있다.
특허문헌 1에는, VEGF RNA를 표적으로 하는 어느 종류의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 VEGF 발현을 저해하는 것이 기재되어 있다. 비특허문헌 4에는, 특정한 VEGF 특이적 고친화성 RNA 앱타머를 사용하여 VEGF의 그의 리셉터로의 결합을 저해하는 것이 기재되어 있다. 특허문헌 2에는, 어느 종류의 항VEGF 수용체 모노클로날 항체를 사용하여 내피세포에 미치는 VEGF의 영향을 중화하는 것이 기재되어 있다. 그러나, VEGF 수용체에 대하여 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머의 염기 서열에 관한 보고는 없다.
단백질이나 세포에 대하여 특이적으로 흡착하는 신규 앱타머의 탐색에는 시험관 내 진화법(in vitro selection법)이 가장 유효한 수단으로서 사용되고 있다. 특히 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)법은 크게 나누어서 목적 핵산 분자의 선별로 선별된 앱타머 증폭의 2스텝이 있다(예를 들어, 특허문헌 3). 이 선별과 증폭을, 선택압을 높이면서 반복함으로써, 높은 친화성을 갖는 핵산 단편이 얻어진다. 또한, 최근에는 여러가지 개량이 더하여지고, 보다 적은 사이클 횟수로 앱타머를 회수할 수 있는, 효율·선택성에 있어서 우수한 방법 등이 보고되어 있다. 이들 앱타머는 종래 진단, 치료에 사용되어 온 항체의 특성이기도 한 타깃에 대한 고친화성이나 특이성은 말할 필요도 없고, 화학적으로 단시간에 합성하는 것이 가능하고, 또한 그 분자 수식도 저렴하게 행할 수 있고, 작용 기서가 단순하고, 면역원성도 거의 없다는, 항체에는 없는 여러 가지 이점이 있다.
Shibuya et al., 1990, Oncogene 5, 519
Sawano et al., 1996, Cell Growth Diff, 7, 213-221
Mathews et al., 1991, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 88, 9026
Jellinek et al., 1994, Biochemistry 33, 10450
이상과 같은 배경 하에, 본 발명은 혈관 신생을 제어하는 VEGF와 그의 수용체의 역할을 더욱 상세하게 해명하는 것, 예를 들어 VEGF 수용체의 다양한 세포에서의 발현량이나 그의 경시적인 모니터링을 통하여 생세포에 있어서의 그의 기능을 보다 정밀하게 검출하고, 이것에 관련하는 여러 가지 질환, 예를 들어 종양 혈관 신생, 당뇨병성 망막증 및 만성 관절 류머티즘 등의 질환의 진단 및 치료에 유용한, 혈관 내피 증식 인자 수용체에 대한 신규의 핵산 앱타머를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 행한 결과, 자성 미립자를 사용하는 SELEX법에 의해, VEGF 수용체에 대하여 특이적인 결합능을 갖는 뉴클레오티드 서열을 특정하고, 당해 특정한 서열을 갖는 핵산이 VEGF 수용체에 대한 특이적 앱타머로서 기능할 수 있는 것을 신규로 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하나의 형태에 있어서, 서열 번호 1 내지 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, VEGF 수용체에 대하여 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 핵산 앱타머를 제공한다. 여기서, 이들의 앱타머가 RNA인 경우에는, 서열 번호 1 내지 5의 염기 서열에 있어서 T(티민)는 U(우라실)이다. 본 발명의 바람직한 형태에서는, 상기 핵산 앱타머는, 검출을 용이하게 하기 위해서, 그의 5' 말단 또는 3' 말단에 프라이머 인식 서열, 형광 표지, 비오틴, 아비딘 혹은 스트렙트아비딘 또는 기타의 특이적 결합 태그 펩티드와 연결되어 있어도 된다.
본 발명의 다른 형태에서는, 상기 본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는, 인간 VEGF 수용체의 검출용 조성물, 검출용 키트 또는 검출 방법을 제공한다. 바람직한 형태에서는, 상기 핵산 앱타머를 인간 내피세포, 혈관 조직, 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어지는 군에서 선택되는 생체로부터 채취된 시료와 접촉시키는 공정 및 당해 시료와 본 발명의 핵산 앱타머와의 결합에 의한 응답을 관측함으로써 인간 VEGF 수용체의 존재를 검출하는 공정을 포함하는, 혈관 신생에 관련하는 질환의 진단 방법이다.
본 발명의 또 다른 형태에 있어서, 상기 본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는, 혈관 신생에 관련하는 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물, 그러한 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 본 발명의 핵산 앱타머의 사용, 또는 본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는, 혈관 신생에 관련하는 질환의 치료용 약물 수송계를 제공한다.
본 발명에 따르면, VEGF 수용체의 검출, 혈관 신생에 관련하는 질환의 진단을 가능하게 하기 위하여 유용한 신규의 재료로서의 핵산 앱타머를 제공할 수 있다. 즉, VEGF 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 신규 핵산 앱타머를 제공함으로써, VEGF 수용체와 VEGF와의 결합 부위의 탐색이나, 혈관 신생과 그의 제어 기구의 해석에 사용할 수 있다.
도 1은, 자성 미립자의 표면에 고정화한 VEGF 수용체(VEGFR1 및 VEGFR2)를 사용하여 SELEX법에 의한 앱타머의 선별 방법을 도시하는 모식도이다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대하여 설명한다. 본 발명의 범위는 이들의 설명에 구속되는 일은 없고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 손상시키지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다.
1. 핵산
앱타머
본 명세서에 있어서 「핵산 앱타머」란, 예를 들어 약 20 내지 200 염기장과 같은 짧은 서열을 갖는 핵산 분자이며, 타깃이 되는 분자나 물질을 특이적으로 인식할 수 있는 단일쇄 핵산 분자를 의미하고, 본 발명에 따른 핵산 앱타머는, VEGF 수용체에 대하여 특이적으로 결합하는 기능을 갖는 단일쇄 핵산 분자이다.
본 발명에 따른 핵산 앱타머의 결합 타깃으로서는, VEGF 수용체이고, 바람직하게는 인간 VEGF 수용체이고, 보다 바람직하게는 인간 VEGF 수용체 1(VEGFR1) 또는 인간 VEGF 수용체 2(VEGFR2)이다. VEGFR1 및 VEGFR2는, 예를 들어 재조합 DNA 기술을 사용하여 배양 세포 등에서 발현 가능하고, 또는 연구용 시약으로서 시판되고 있다. 전형적인 형태에 있어서, 본 발명에 따른 핵산 앱타머는, 이하에 나타내는 서열 번호 1 내지 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 본 명세서에 있어서는, 뉴클레오티드 서열은 5' 말단으로부터 3' 말단 방향으로 좌측으로부터 우측으로 기재한다. 또한, 당해 앱타머가 RNA인 경우에는, 상기 핵산 서열에 있어서 T는 U이다.
<서열 번호 1>
5'-GTGATGGTCGGAGATGGATGGGGCAGCTTAGGTC-3'
<서열 번호 2>
5'-GTCGTGGCGGGGTTTTGTTTTGGTCGGGGGGTG-3'
<서열 번호 3>
5'-GGGGGGTGGGGTCGGGTGTTGGTCGTGGGGGGCG-3'
<서열 번호 4>
5'-TAGGTGGGTTCGGGGGGTGCTGGTCGGGGGGTG-3'
<서열 번호 5>
5'-TGGGTTTAGGTTGGGTGGTTGGGTGGGGGGGGCG-3'
본 명세서에 있어서, 용어 「특이적」이란, VEGF 수용체에 대한 본 발명에 따른 핵산 앱타머의 선택적 결합을 가리킨다. 앱타머는, VEGF 수용체 단백질 또는 그것을 세포막 상에 발현하는 세포를, 소정의 조건 하에서, 무관계의 단백질 또는 세포에 대한 결합과 비교함으로써, 결합 특이성에 대하여 시험될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 앱타머는, VEGF 수용체에 대하여 무관계의 단백질 또는 세포에 대하여 보다도 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 7배, 바람직하게는 적어도 10배 결합하는 경우에, 그 앱타머는 특이적이라고 생각된다. 「무관계의 단백질」이란, VEGF 수용체 단백질과는 다른 단백질이고, 그의 구조 및 기능 등이 VEGF 수용체와 상이하면 된다. 특이적 결합의 결합 양식은 특별히 한정되지 않고, 공유 결합, 이온 결합, 수소 결합, 정전적 또는 소수적인 상호 작용 등이 포함된다.
본 발명에 따른 핵산 앱타머는, 인간 VEGF 수용체에 대하여 특이적으로 결합한다는 기능을 갖는 한, 상기 서열 번호 1 내지 5로 표시되는 서열에 있어서의 1 또는 복수의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 또는 부가된 서열이어도 된다. 바람직하게는, 당해 치환, 결실, 또는 부가되는 뉴클레오티드는 1 내지 3개이고, 보다 바람직하게는 1 또는 2개이고, 더욱 바람직하게는 1개이다.
또한, 이러한 뉴클레오티드의 치환, 결실, 또는 부가가 존재하는 경우, 본 발명에 따른 핵산 앱타머의 서열은, 상기 서열 번호 1 내지 5의 각각과 90％ 이상, 바람직하게는 93％ 이상, 더욱 바람직하게는 96％ 이상의 동일성을 갖는 서열(이하, 「상동체」라고 하는 경우가 있음)일 수 있다. 여기서, 본 명세서에서 사용하는 경우, 용어 「서열 동일성」은, 당해 기술 분야에서 일반적으로 인정된 의미를 나타낸다. 해당 용어는, 전형적으로는 서열 해석 프로그램에 의해(예를 들어, Karlin and Altschul, 1990, PNAS 87:2264-2268; Karlin and Altschul, 1993, PNAS 90:5873-5877) 또는 목시 검사에 의해 조사했을 때, 참조 핵산 서열이 동일한 뉴클레오티드에 매치한 주제의 핵산 서열의 뉴클레오티드 수를 말한다.
1 또는 복수의 뉴클레오티드가 치환되는 경우, 당해 치환은 유니버셜 염기에 의해 이루어질 수 있다. 용어 「유니버셜 염기」는, 당해 기술 분야에서 일반적으로 인정된 그 의미를 나타낸다. 즉, 해당 용어는 일반적으로, 표준 DNA/RNA의 각 염기와 대부분 구별 없이 염기대를 형성하고, 세포 내 효소에 의해 인식되는 뉴클레오티드 염기 유사체를 말한다(예를 들어, Loakes et al., 1997, J. Mol. Bio. 270: 426-435). 유니버셜 염기의 비한정적인 예로서는, C-페닐, C-나프틸 및 다른 방향족의 유도체, 이노신, 아졸카르보자미드(carbozamide), 및 니트로아졸 유도체(3'-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌 및 6-니트로인돌 등)를 들 수 있다(Loakes, 2001, Nucleic Acids Res. 29: 2437).
또한, 본 발명에 따른 핵산 앱타머는, 인간 VEGF 수용체에 대하여 특이적으로 결합한다는 기능을 갖는 한, 그 길이에 상한은 없다. 그러나, 합성의 용이함이나 항원성의 문제 등을 고려하면, 본 실시 형태에 있어서의 핵산 앱타머의 길이는, 상한으로서는 예를 들어 200 염기 이하, 바람직하게는 150 염기 이하, 보다 바람직하게는 100 염기 이하이다.
전 염기의 수가 적은 경우, 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에 있어서의 장점도 크다. 또한, 화학 수식도 용이하고 생체 내의 안전성도 높고, 독성도 낮아진다. 하한으로서는, 상기 서열 번호 1 내지 5에 있어서의 염기수 이상, 즉 34 염기 이상이다. 핵산 앱타머는 단일쇄(ssDNA)인 것이 바람직하지만, 헤어핀 루프형의 구조를 취함으로써 부분적으로 2개쇄 구조를 형성하는 경우여도, 그 핵산 앱타머의 길이는 단일쇄의 길이로서 계산하는 것으로 한다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 핵산 앱타머는, 상기 서열 번호 1 내지 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것의 서열, 및 그의 5' 및 3' 말단측에 각각 프라이머 인식 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 즉, 이 경우, 당해 핵산 앱타머는,
5'-P1-X-P2-3'
으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 여기서, X는, 서열 번호 1 내지 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 그것들의 서열에 있어서 1 내지 3개의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 또는 부가를 포함하는 서열이다. P1 및 P2는, PCR 증폭을 위하여 도입된 제1 및 제2 프라이머 인식 서열이다. 바람직하게는, P1은 GCCTGTTGTGAGCCTCCT(서열 번호 6)이고, 및 P2는 CGCTTATTCTTGTCTCCC(서열 번호 7)이다.
본 발명에 따른 핵산 앱타머는, 생체 내에 있어서의 안정성의 증대를 위해서, 화학 수식되어 있어도 된다. 그러한 화학 수식의 비한정적인 예로서는, 당쇄 부분에서의 화학적 치환(예를 들어, 2'-0 메틸화), 인산 에스테르 부분에서의 화학적 치환(예를 들어, 포스포로티오에이트화, 아미노기, 저급 알킬아미노기, 아세틸기 등) 및 염기 부분에서의 화학적 치환을 들 수 있다. 마찬가지로, 5' 또는 3' 말단에 부가적인 염기를 가질 수도 있다. 해당 부가적 염기의 길이는 통상 5 염기 이하이다. 해당 부가적 염기는, DNA여도 RNA여도 되지만, DNA를 사용하면 앱타머의 안정성을 향상시킬 수 있는 경우가 있다. 이러한 부가적 염기의 서열로서는, 예를 들어 ug-3', uu-3', tg-3', tt-3', ggg-3', guuu-3', gttt-3', ttttt-3', uuuuu-3' 등의 서열을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 앱타머는, 후술하는 VEGF 수용체의 검출 방법 또는 당해 검출용 키트에 있어서 사용하기 위해서, 예를 들어 5' 말단 또는 3' 말단에 연결한 검출 표지를 가질 수 있다. 이러한 검출 표지로서는, 형광 표지가 바람직하지만, 라만 산란 표지, 효소 표지, 또한 적외선 표지를 사용해도 된다.
형광 표지는, 당해 기술 분야에 있어서 관용되고 있는 형광 표지제를 사용할 수 있지만, 예를 들어 그린 플루오레센트 프로틴(GFP), 형광 단백질, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 6-카르복시플루오로세인-아미노헥실, 플루오레세인 유도체, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 750, 로다민, 6-카르복시테트라메틸로다민, TAMRA(등록 상표), 피코에리트린(PE), 피코시아닌(PC), PC5, PC7, Cy 색소, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TexasRed, 알로피코시아닌(APC), 아미노메틸쿠마린아세테이트(AMCA), Marina Blue, Cascade Blue, Cascade Yellow, Pacific Blue, SPRD, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(TRITC), R110, mC1B, CellTracker 색소, CFSE, JC-1, PKH, DCFH-DA, DHR, FDA, Calcein AM, 니트로벤조옥사디아졸(NBD)기, 디메틸아미노술포닐벤조옥사디아졸기, acridine(Acd), dansyl(Dns), 7-디메틸아미노쿠마린-4-아세틱아시드(DMACA), 5-((2-아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-술포닉아시드(EDANS), 나프탈렌, 안트라센 및 프로토포르피린 9 등 시판되고 있는 올리고뉴클레오티드 고상합성 서비스로 도입할 수 있는 형광단을 들 수 있다.
또한, 형광 물질의 근방에 해당 형광 물질이 발하는 형광 에너지를 흡수하는 ??쳐(소광 물질)가 추가로 결합되어 있어도 된다. 이러한 실시 형태에 있어서는, 검출 반응 시에 형광 물질과 ??쳐가 분리하여 형광이 검출된다.
효소 표지의 예로서는, β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산 탈수소 효소 등을 들 수 있다. 또한, 발광 기질로서, 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등을 표지제로서 사용해도 된다.
라만 산란 표지에 대해서는, 상기한 형광 표지된 앱타머의 예를 들어 5' 말단 또는 3' 말단에 금속 표면과 결합능을 갖는 치환기로서 특별히 한정되는 것은 아니지만, 티올(SH)기, 알킬아미노기, 방향족 아미노기, 카르복실기를 도입하고, 이것을 예를 들어, 금 나노 입자 표면에 흡착시킴으로써 당해 앱타머 흡착 금속 입자로부터 발해지는 증강 라만 산란광을 검출함으로써 세포 인식을 행하는 것이다. 이 경우, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 금속 나노 입자로서, 금, 은, 구리, 철, 규소, 양자 도트 등을 사용할 수 있다.
2. 핵산
앱타머의
선별
본 발명의 핵산 앱타머는, 당해 기술 분야에 있어서 주지의 인비트로 셀렉션법을 사용하여 선별 및 취득할 수 있다. 그러한 방법의 바람직한 예로서, 시험관 내 진화법(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment: SELEX법)이 사용된다.
당해 SELEX법은, 타깃 물질에 결합하는 핵산 리간드(앱타머)의 선별과, PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의한 지수 함수적인 증폭을 복수회 반복함으로써, 타깃 물질에 친화성을 갖는 핵산 분자(단일쇄 DNA, RNA)를 얻는다는 것이다.
또한, 이들 이외에도 당해 기술 분야에 있어서 주지의 방법을 사용하여 본 발명의 핵산 앱타머를 선별 및 취득할 수도 있다.
상술한 바와 같이, 「인비트로 셀렉션법」은, 랜덤한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 풀(예를 들어, DNA풀)로부터 표적 분자나 세포에 대하여 친화성을 갖는 앱타머 분자를 선택하고, 친화성을 갖지 않는 분자를 배제하는 방법이다. 당해 선택된 앱타머 분자만을 PCR법 등에서 증폭하고, 추가로 친화성에 의한 선택을 한다는 사이클을 반복함으로써, 강한 결합능을 갖는 앱타머 분자를 농축할 수 있다.
구체적으로는 먼저, 20 내지 300 염기, 바람직하게는 30 내지 150, 보다 바람직하게는 30 내지 100 염기 정도의 랜덤한 뉴클레오티드 서열(염기 서열) 영역을 포함하는 단일쇄 핵산 프래그먼트를 제조한다. 랜더마이즈된 단일쇄 핵산 프래그먼트군의 제조는, 화학적 핵산 합성법, 자동 핵산 합성기를 이용한 합성법, PCR법 등의 증폭을 이용한 합성법, 이들의 조합 등에 의해 행할 수 있다. DNA로부터 RNA의 제조를 위해서, 이중쇄 DNA 라이브러리를 주형으로 하여 예를 들어 T7RNA 포리메라제 등의 RNA 포리메라제에 의한 인비트로 전사에 의해 단일쇄 RNA 라이브러리를 제조할 수도 있다. 이들의 단일쇄 핵산 프래그먼트는, PCR 증폭을 가능하게 하기 위해서, 그 양단에 프라이머가 되어야 하는 염기 서열을 갖는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
프라이머 인식 서열 부분은, PCR 증폭 후에 프라이머 부분을 제한 효소에 의해 절제할 수 있도록 적당한 제한 효소 사이트를 갖게 해도 된다. 사용하는 프라이머 인식 서열 부분의 길이는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 약 20 내지 50, 바람직하게는 20 내지 30 염기 정도이다. 또한, PCR 증폭 후의 단일쇄 DNA를 전기 영동 등으로 분리 가능하게 하기 위해서, 5'측 말단에, 방사 표지, 형광 표지 등에 의한 표지를 행해도 된다.
이어서, 상기에서 얻어진 랜덤한 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 프래그먼트(라이브러리 풀)와, 자성 미립자 등의 담체에 고정화한 표적 분자를 적당한 농도비로 혼합하고, 적당한 조건 하에서 인큐베이트 한다. 인큐베이트 후, 혼합물을 원심기에 걸쳐서, 핵산 프래그먼트-표적 분자 복합체와 유리 핵산 프래그먼트를 분리한다. 분리 용액의 상청 부분을 제거하고, 얻어진 복합체로부터 회수한 단일쇄 핵산 프래그먼트를 사용하여 PCR 반응을 행함으로써 표적 분자 결합성 핵산 서열의 증폭을 행한다. 이 후, 표적 분자와 복합체를 형성할 수 있는 핵산 프래그먼트를 당해 기술 분야에 있어서 주지의 방법을 따라서 단일쇄화한다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 스트렙트아비딘 고정화 자성 입자와 비오틴의 결합을 이용하는 분리를 들 수 있다. 이에 의해, 증폭한 핵산 2중쇄 중 세포 결합능을 갖는 ssDNA를 분리할 수 있고, 또한 DNA 폴리메라아제 등의 PCR 반응 용액 중에 포함되는 불필요한 공존 물질을 제거할 수 있다. 그 후, 회수된 ssDNA를 라이브러리 풀로서 사용하여 동일한 조작을 행한다.
상술한 핵산 프래그먼트와 표적 분자의 혼합, 표적 분자와 결합한 핵산 프래그먼트의 분리, PCR 증폭, 증폭된 핵산 프래그먼트를 다시 표적 분자와의 결합에 사용할 때까지의 일련의 조작은 수 라운드를 행한다. 라운드를 반복하여 행함으로써, 보다 특이적으로 타깃 세포와 결합하는 핵산 분자를 선별할 수 있다. 얻어진 핵산 프래그먼트는, 당해 기술 분야에 있어서 주지의 방법에 의해 그 서열 해석을 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 앱타머 선별(스크리닝) 방법은, 상기 표적 분자가, 패밀리를 구성하는 복수종의 단백질 등의 분자를 포함하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, VEGF 수용체뿐만 아니라, 혈소판 유래 증식 인자(PDGF) 패밀리, 태반 증식 인자(PlGF) 등도 포함하는데 이들에 한정되지 않는다. 그 때, 그 패밀리를 구성하는 각 분자를 교대로 사용하여 상기 라운드를 반복하는 것이 바람직하다. 이러한 조작을 행함으로써, 각각의 패밀리 단백질에 공통되는 입체 구조 부분에 결합하는 핵산 앱타머를 취득할 수 있을 가능성이 있고, 비특이적인 결합을 억제하여, 본래의 각 단백질 패밀리의 기능을 담당하는 구조 부분에 결합할 수 있다고 생각된다.
따라서, 본 발명의 1개의 실시 형태에서는, 이하의 공정을 포함하는 핵산 앱타머의 스크리닝 방법이 제공되고, 당해 방법은,
(a) 표적 분자와 복수종의 단일쇄 핵산 프래그먼트를 접촉시켜, 표적 분자와 단일쇄 핵산 프래그먼트와의 복합체를 형성시키고,
(b) 상기 복합체를 형성하고 있지 않은 단일쇄 핵산 프래그먼트를 제거하고,
(c) 상기 복합체를 해리시켜서 얻어지는 단일쇄 핵산 프래그먼트를 포함하는 후보 핵산 프래그먼트 군을 취득하고,
(d) 상기 후보 핵산 프래그먼트 군을 증폭하고,
(e) 상기 (a) 내지 (d)의 공정을 복수회 반복하고,
(f) 소정의 횟수 반복한 후의 후보 핵산 프래그먼트 군의 염기 서열을 결정하고, 중복하여 검출되는 염기 서열을 포함하는 중복성 핵산 프래그먼트를 특정하고,
(g) 상기 공정 (e)에 있어서의 반복수의 증가에 수반하여, 존재 빈도가 증가하는 상기 중복성 핵산 프래그먼트를 선택하는 공정을 포함하고, 상기 표적 분자가, 패밀리를 구성하는 복수종의 분자의 하나이고, 그 각 분자를 교대로 사용하여 상기 공정 (e)를 반복하는 것을 특징으로 한다.
상기 복합체가, 담체에 고정화된 표적 분자를 사용하여 형성되고, 상기 공정 (e)에서 얻어진 후보 핵산 프래그먼트 군과, 표적 분자가 고정화되어 있지 않은 담체를 접촉시켜서 당해 담체와 복합체를 형성하지 않는 후보 핵산 프래그먼트를 추가로 선택하는 대항 선택 공정을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 중복성 핵산 프래그먼트의 염기 서열은, 상기 표적 분자가 고정화되어 있지 않은 담체에만 결합하는 핵산 프래그먼트의 염기 서열을 포함하지 않는 것이 더욱 바람직하다.
3.
VEGF
수용체의 검출용 조성물, 검출 방법 및
키트
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 앱타머는, VEGF 수용체에 대하여 특이적으로 결합하는 기능을 갖는 점에서, 당해 VEGF 수용체의 검출에 있어서 적합하게 사용할 수 있고, 본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는 검출용 조성물은, VEGF 수용체를 발현하는 세포에 대한 검출 마커로서도 사용할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는 검출용 조성물을 내피세포, 혈관 조직, 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어지는 군에서 선택되는 생체로부터 채취된 시료와 접촉시키고, 그 후, 당해 시료와 핵산 앱타머의 결합에 의한 응답(시그널의 유무)을 관측함으로써 VEGF 수용체의 존재를 검출한다.
당해 생체로부터 채취된 시료는, 동물로부터 채취한 것이며, 최소 침습으로 확보 가능한 시료 또는 분비 체액, 인비트로 세포 배양액 성분 시료 등이면, 그 형태는 특별히 한정되지 않는다.
또한, VEGF 수용체의 존재를 검출하기 위한 「응답」은, 형광 응답 또는 라만 산란 응답인 것이 바람직하고, 그 때문에 상기에서 설명한 대로, 형광 응답에 있어서는 핵산 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 TAMRA(등록 상표), FITC 등의 형광 표지제를 연결시키는 것이 바람직하다. 또한 라만 산란 응답에 있어서는 핵산 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 Cy3.5(등록 상표), TAMRA(등록 상표), FITC 등의 형광 표지제를 연결시켜, 추가로 상기한 티올(SH)기, 알킬아미노기, 방향족 아미노기, 카르복실기를 도입하고, 이것을 예를 들어, 금 나노 입자 표면에 흡착시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 VEGF 수용체의 검출용 조성물은, 그의 간편성이나 휴대성을 높이기 위하여 핵산 앱타머를 포함하는 키트로서 제공할 수도 있다. 당해 키트에 있어서 핵산 앱타머는 통상, 적당한 농도가 되도록 용해된 수용액의 형태로, 또는 해당 핵산 앱타머가 고상 담체 상에 고정된 DNA 어레이의 형태로 제공될 수 있다.
예를 들어, 핵산 앱타머의 말단에 비오틴을 결합시켜서 복합체를 형성하고, 고상 담체의 표면에 스트렙트아비딘을 고정화시켜서, 비오틴과 스트렙트아비딘의 상호 작용에 의해 핵산 앱타머를 고상 담체 표면에 고정화할 수 있다. 당해 키트에는, 필요에 따라서 다른 시약 등을 적절히 함유하고 있어도 되고, 예를 들어 첨가제로서, 용해 보조제, pH 조절제, 완충제, 등장화제 등의 첨가제를 사용할 수 있고, 이들의 배합량은 당업자에게 적절히 선택 가능하다.
4. 의약 조성물 및 DDS
별도의 형태에 있어서, 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 함유하는, VEGF 수용체의 검출, 진단 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 당해 의약 조성물은, 핵산 앱타머에 첨가하여, 유효량의 VEGF 수용체의 검출, 진단 또는 치료를 위한 의약 화합물(유효 성분) 및 의약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물 중에 포함되는 기타의 유효 성분은, 혈관 신생에 관련하는 질환, 예를 들어 종양 혈관 신생, 당뇨병성 망막증 또는 관절 류머티즘 등의 예방 또는 치료에 유효한 것이면, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 기타의 혈관 신생 저해제이다. 이러한 혈관 신생 저해제의 예로서는, 매트릭스 메탈로프로테아제 저해제, 프로테인키나제 C-β 저해제, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 저해제, 염기성 FGF 결합 분자, 파클리탁셀, 라파마이신, 푸마길린, 독소루비신 및 다수의 다른 약제 등을 들 수 있다.
아테로마성 동맥 경화증을 회피하기 위하여 일반적으로 사용되는 약제의 클래스는, 콜레스테롤 수치를 컨트롤하는 능력을 갖는 점에서 스타틴류로 총칭된다. 이들은, 부가적 특성으로서 혈관 신생 저해능을 갖는 점에서, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 기타의 의약 화합물로서도 유용하다.
따라서, 본 발명의 의약 조성물은 아트로바스타틴, 심바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴, 메바스타틴 등의 스타틴류를 포함할 수 있다. 전형적으로는, 본 발명의 의약 조성물은 경구 투여되지만, 비경구 투여를 채용할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 기타의 약제는, 코엔자임 Q 등의 항산화제, 호모 시스테인 농도를 내리는 엽산, 비타민 B6 및 B12 등의 특정한 비타민 B, 니코틴산 치료, 클로피브레이트, 겜피브로질 및 페노피브레이트 등의 피브린산 유도체, 프로부콜 등의 콜레스테롤 수송 저해제, 콜레스티라민 및 콜레스티폴 등의 비흡수성 수지 등을 포함한다.
본 발명의 의약 조성물 중에 포함되는 의약상 허용되는 담체로서는, 예를 들어 자당, 전분 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 등의 결합제, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 에어로질 등의 활제, 시트르산, 멘톨 등의 방향제, 벤조산나트륨, 아황산수소나트륨 등의 보존제, 시트르산, 시트르산나트륨 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제, 계면 활성제 등의 분산제, 물, 생리 식염수 등의 희석제, 베이스 왁스 등을 들 수 있지만, 그들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 의약 조성물의 표적 부위로의 송달을 촉진하기 위해서, 당해 조성물에는, 추가로 핵산 도입용 시약을 포함할 수도 있다. 해당 핵산 도입용 시약으로서는 아텔로콜라겐, 리포솜, 나노 파티클, 리포펙틴, 리포펙타민, DOGS(트랜스펙탐), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDEAB, HDEAB, 폴리부텐, 또는 폴리에틸렌이민 등의 양이온성 지질 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 예를 들어 포유 동물(예를 들어, 인간, 래트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등)에 대하여 투여할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 다양한 제제 형태, 예를 들어 캡슐제, 정제, 액제 등의 제형을 취할 수 있고, 한정은 하지 않지만, 보다 일반적으로는 액제화되어, 주사제로 되거나, 또는 경구제로 되거나, 또는 서방제로 된다.
당해 주사제는, 당해 기술 분야에 있어서의 주지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 완충액, 생리 식염수 등의 적절한 용매에 용해한 후, 필터 등으로 여과하여 멸균하고, 계속해서 무균적인 용기에 충전함으로써 제조할 수 있다.
경구제로서는, 예를 들어 정제, 과립제, 세립제, 산제, 연(軟) 또는 경캡슐제, 액제, 유제, 현탁제, 시럽제 등의 제형으로 제제화된다.
서방제로서는, 예를 들어 정제, 과립제, 세립제, 산제, 연 또는 경캡슐제, 마이크로 캡슐 등의 제형으로 제제화된다. 제제화하는 경우에는, 바람직하게는 예를 들어 알부민, 글로불린, 젤라틴, 만니톨, 글루코오스, 덱스트란, 에틸렌글리콜 등의 안정화제가 첨가될 수 있다.
또한, 본 발명의 의약 조성물의 제제화에 있어서는, 예를 들어 부형제, 용해 보조제, 산화 방지제, 무통화제, 등장화제 등의 필요한 보조 첨가물을 포함해도 된다.
액상 제재로 한 경우에는, 동결 보존 또는 동결 건조 등에 의해 수분을 제거하여 보존하는 것이 바람직하다. 동결 건조제는, 사용 시에 주사용 증류수 등을 첨가하고, 재용해하여 사용된다.
또한, 서방제로 한 경우, 서방용 담체로서 예를 들어, 가용성 콜라겐 또는 가용성 콜라겐 유도체, 젤라틴 등의 단백질, 세라믹스 다공체, 폴리아미노산, 폴리락트산, 키틴 또는 키틴 유도체, 수 팽윤성 고분자 겔 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 그 형태에 따른 적절한 투여경로에 의해 투여될 수 있다. 경구적으로 또는 비경구적 투여하는 것이 가능하지만, 비경구적으로 투여하는 경우에는, 예를 들어 주사제의 형태로서 정맥, 동맥, 피하, 근육 내 등에 투여할 수 있다. 또한, 서방제의 형태로서 생체 내, 예를 들어 환부, 피하, 근육 내 등에 매립함으로써 투여할 수 있다.
투여량 및 투여 횟수 등은, 투여의 목적, 투여 방법, 암의 종류, 크기, 투여 대상의 상황(성별, 연령, 체중 등)에 따라 상이하지만, 기본적으로는 상기 유효 성분에 있어서의 바람직한 투여 형태를 따른다.
또한, 본 발명의 핵산 앱타머를 리포솜이나 나노 입자 등의 수송 재료의 표면에 부착 또는 내포시킴으로써 당해 수송 재료 중에 포함되는 의약 성분을 VEGF 수용체에 선택적으로 수송할 수 있다. 따라서, 추가적인 형태에 있어서, 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 함유하는, 혈관 신생에 관련하는 질환의 예방 또는 치료용 약물 수송계를 제공하는 것이다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 앱타머의 선별
SELEX법을 사용하여, 34 염기의 랜덤한 서열을 갖는 DNA풀로부터 VEGFR1 및 VEGFR2에 대하여 특이적으로 결합하는 앱타머의 선별을 행하였다. 도 1은, 자성 입자를 사용하는 SELEX법의 공정을 나타낸다. 상세는 이하와 같다. 사용하는 랜덤 DNA는 단일쇄인데, 이것을 이후 센스쇄로 한다. 표적 분자인 VEGFR1 및 VEGFR2는, R&D 시스템즈사에서 구입하고, Pierce사제의 자성 입자 표면에 고정화하여, 이것을 사용하였다.
DNA 풀(도 1에 있어서의 단일쇄 DNA 라이브러리)은, 이하의 서열을 갖는 전체 길이가 70 염기로 랜덤 서열 부분(N)이 34 염기의 올리고 DNA를 사용하였다.
DNA 풀 랜덤 34(니혼 이덴시 겐큐쇼사제)
서열: 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCT(N34)CGCTTATTCTTGTCTCCC-3'(서열 번호 8)
길이: 70 염기(랜덤 서열은 중앙의 34 염기)
분자량: 21391.3g/mol
몰 흡광 계수: 630475L/mol·cm
랜덤 서열의 양쪽 말단의 염기 서열은 PCR 시에 사용하는 프라이머 서열이다.
자성 입자 표면으로의 VEGFR1 및 R2의 고정화는, 자성 입자에 첨부해 있는 설명서를 따라 행하였다.
자성 입자를 사용하는 SELEX의 실시예
단백질 고정화 자성 입자를 17μL 취하고, 자석을 사용하면서 버퍼 I(인산 버퍼, pH7.4, Ca, Mg 프리, 2mM EDTA, 0.1％ HSA)로 잘 세정한 뒤, 10μM 농도로 조정한 DNA 풀 20μL를 첨가하고, 30분간 실온에서 혼합한다. 그 후, 자석을 사용하면서 버퍼 I에서 세정을 3회 행함으로써 타깃 결합성 DNA와 비결합성 DNA를 분리하였다. 최종적으로 용액을 50μL의 TE 버퍼로 치환한 뒤, 95℃에서 10분 가열하고, 단백질 고정화 자성 입자에 흡착한 DNA를 떼었다. 회수한 상청액에는 단백질 결합능을 갖는 센스쇄 DNA가 포함되어 있으므로, 이것을, PCR법을 사용하여 증폭하였다. 증폭한 DNA는 2중쇄 구조를 하고 있고, 안티센스쇄를 형성하는 프라이머 서열에는 비오틴이 수식되어 있기 때문에, 이 2중쇄로부터 목적으로 하는 센스쇄만을 스트렙트아비딘 고정화 자성 입자를 사용하여 정제·회수하였다. 이 회수한 단일쇄 DNA를 다시 단백질 고정화 자성 입자와 혼합하고, 상기 수순을 반복하였다. 도 1에 도시한 바와 같이, 먼저 VEGFR1 고정화 자성 입자에 대하여 상기 수순을 행하고, 그 후 VEGFR2 고정화 자성 입자에 대하여 상기 조작을 행하였다. 이것을 1 사이클로 하고, 계 4 사이클 및 5 사이클 행한 곳에서 얻어진 DNA를, 차세대 시퀀서(Ion Torrent PGM)를 사용하여 해석하였다. 이 해석에 의해 얻어진 시퀀스 데이터를 R1-4R, R1-5R, R2-4R, R2-5R로 한다.
또한, 상기 5 사이클 행한 곳에서 얻어진 단일쇄 DNA를 VEGFR1 또는 VEGFR2를 수식하고 있지 않은 자성 입자와 혼합하고, 먼저 상청을 회수하였다. 그 후, 버퍼 I에서 세정을 3회 행하고, 최종적으로 용액을 50μL의 TE 버퍼에 치환한 뒤, 95℃에서 10분 가열하고, 미수식 자성 입자에 대하여 높은 친화성을 갖는 DNA를 회수하였다. 여기에서 얻어진 DNA를 차세대 시퀀서(Ion Torrent PGM)를 사용하여 해석하였다. 이 해석에 의해 얻어진 시퀀스 데이터를 네거티브로 한다. 또한, 상기 조작에서 회수한 상청(자성 입자에 대한 친화성이 낮은 단일쇄 DNA를 포함하는 용액)을 VEGFR1 고정화 자성 입자와 혼합하고, 상기와 동일한 세정·가열 회수·증폭·단일쇄화의 조작을 행하였다. 여기에서 얻어진 DNA를 차세대 시퀀서를 사용하여 해석하였다. 이 해석에 의해 얻어진 시퀀스 데이터를 R1-6R로 한다. 또한, 여기에서 얻어진 단일쇄 DNA를 미수식 자성 입자와 혼합하고, 먼저 상청을 회수하였다. 그 후 버퍼 I에서 세정을 3회 행하고, 최종적으로 용액을 50μL의 TE 버퍼로 치환한 뒤, 95℃에서 10분 가열하고, 미수식 자성 입자에 대하여 높은 친화성을 갖는 DNA를 회수하였다. 여기에서 얻어진 DNA를 차세대 시퀀서(Ion Torrent PGM)를 사용하여 해석하였다. 이 해석에 의해 얻어진 시퀀스 데이터를 네거티브로 한다. 또한, 상기 조작에서 회수한 상청(자성 입자에 대한 친화성이 낮은 단일쇄 DNA를 포함하는 용액)을 VEGFR2 고정화 자성 입자와 혼합하고, 상기와 동일한 세정·가열 회수·증폭·단일쇄화의 조작을 행하였다. 여기에서 얻어진 DNA를 차세대 시퀀서를 사용하여 해석하였다. 이 해석에 의해 얻어진 시퀀스 데이터를 R2-6R으로 하였다.
시퀀스 데이터 해석의 실시예
얻어진 시퀀스 데이터, R1-4R, R1-5R, R2-4R, R2-5R, negative(×2), R1-6R, R2-6R에서 얻어진 각 서열의 수를 소프트웨어(CLC)를 사용하여 해석하였다. 또한, 이들 시퀀스 데이터를 익스포트 후, 하나로 혼합한 파일을 작성하고, 소프트웨어(ClustalX 등)를 사용하여 얼라인먼트를 행하였다. 얻어진 해석 결과로부터, negative의 서열을 포함하지 않고, 또한 4R로부터 6R이 됨에 따라서 존재 비율이 증대하고 있는 서열을 골라 내었다. 이와 같이 하여 선택된 DNA 앱타머의 염기 서열은 이하와 같다.
<No. 11(서열 번호 1)>
5'-GTGATGGTCGGAGATGGATGGGGCAGCTTAGGTC-3'
<No. 17(서열 번호 2)>
5'-GTCGTGGCGGGGTTTTGTTTTGGTCGGGGGGTG-3'
<No. 18(서열 번호 3)>
5'-GGGGGGTGGGGTCGGGTGTTGGTCGTGGGGGGCG-3'
<No. 22(서열 번호 4)>
5'-TAGGTGGGTTCGGGGGGTGCTGGTCGGGGGGTG-3'
<No. 23(서열 번호 5)>
5'-TGGGTTTAGGTTGGGTGGTTGGGTGGGGGGGGCG-3'
<No. 24(서열 번호 9)>
5'-GGGGGAGTGATGTTGGGGTTGGGGGGTGGGGGCG-3'
표면 플라즈몬 공명 센서를 사용하는 결합 정수의 산출
표면 플라즈몬 공명 센서(biacoreX)를 사용하여, 얻어진 핵산 앱타머와 VEGFR1 및 VEGFR2에 대한 결합능을 평가하였다. 먼저, 설명서에 기재되어 있는 조작을 참조하여, 핵산 앱타머를 센서 칩 표면에 고정화하였다. 그 후, 농도가 다른 VEGFR1 또는 VEGFR2 단백질을 인젝트하여 센서 그램을 얻었다. 이 센서 그램을, 소프트웨어(bia-evaluation)를 사용하여 single cycle analysis에 의해 해석을 행함으로써, 표 1에 도시한 바와 같은 해리 상수를 산출할 수 있었다.
또한 1 내지 3 사이클째의 시퀀스 데이터를 사용하여 0072와 동일한 해석을 행하였다. 선발한 염기 서열은 이하와 같다.
<No.01(서열 번호 10)>
5'-GTCGTGTTTGTTGTTGTTTTCATTTTTGCGGCCC-3'
<No.02(서열 번호 11)>
5'-GCTGATAGGATGGGTTGTAGGTCTAGGGGGGGGCC-3'
표면 플라즈몬 공명 센서(biacoreX)를 사용하여, 얻어진 핵산 앱타머와 VEGFR1 및 VEGFR2에 대한 결합능을 평가하였다. 먼저, 설명서에 기재되어 있는 조작을 참조하고, VEGFR1과 핵산 앱타머 간의 결합을 평가하는 경우에는 VEGFR1을 센서 칩 표면에 고정화하였다. 한편, VEGFR1과 핵산 앱타머 간의 결합을 평가하는 경우에는 핵산 앱타머를 센서 칩 표면에 고정화하였다. 그 후, 표 2에 나타낸 농도가 다른 핵산 앱타머 또는 VEGFR2 단백질을 인젝트하여 센서 그램을 얻었다. 이 센서 그램을, 소프트웨어(bia-evaluation)를 사용하여 single cycle analysis에 의해 해석을 행함으로써, 표 2에 도시한 바와 같은 해리 상수를 산출할 수 있었다.
이들 결과로부터 명백해진 바와 같이, 상기 어느 DNA 앱타머도 VEGFR1 및 VEGFR2의 양쪽에 결합한다는 흥미 깊은 결합 거동을 나타내지만, 모든 DNA 앱타머는, VEGFR2보다도 VEGFR1에 의해 강하게 결합하는 것을 알 수 있었다. 이 이유는 명백하지 않으나, 천연의 VEGF(VEGF-A)에 대해서도, VEGFR2보다도 VEGFR1에 의해 강하게 결합하는 것이 알려져 있다. 즉, 본 발명의 DNA 앱타머는, 천연의 리간드와 동일한 결합 거동을 나타내는 점에서, VEGF의 저해제로서 기능하는 것이 시사된다.
본 발명의 핵산 앱타머는, 형광 표지 등, 검출 수단에 맞춘 화학 수식이 용이하기 때문에, VEGF 수용체의 검출 키트를 제조하는 데 항체를 이용하는 것보다도 유리하고, 또한, 혈관 신생 저해제 등의 약물을 콘쥬게이트 시킴으로써, 당해 약제를 타깃 부위에 확실하게 작용시키는 것이 가능하다. 또한, 화학 합성이 용이한 점에서, 항체와 같은 대규모의 배양 장치를 필요로 하지 않고, 제조를 위한 수고나 비용을 억제할 수 있다는 이점도 있어, 그의 산업상의 이용 가치는 매우 크다.
SEQUENCE LISTING
<110> The University of Tokyo
Nissan Chemical Industries, Ltd.
<120> Nucleic acid aptamers that bind to VEGF receptors
<130> KP-15377
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer directed to VEGFR1 and VEGFR2
<400> 1
gtgatggtcg gagatggatg gggcagctta ggtc 34
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer directed to VEGFR1 and VEGFR2
<400> 2
gtcgtggcgg ggttttgttt tggtcggggg gtg 33
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer directed to VEGFR1 and VEGFR2
<400> 3
ggggggtggg gtcgggtgtt ggtcgtgggg ggcg 34
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer directed to VEGFR1 and VEGFR2
<400> 4
taggtgggtt cggggggtgc tggtcggggg gtg 33
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer directed to VEGFR1 and VEGFR2
<400> 5
tgggtttagg ttgggtggtt gggtgggggg ggcg 34
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First primer binding sequence
<400> 6
gcctgttgtg agcctcct 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Second primer binding sequence
<400> 7
cgcttattct tgtctccc 18
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA pool Random 34
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(52)
<223> n is a, g, c or t
<400> 8
gcctgttgtg agcctcctnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncgcttatt 60
cttgtctccc 70
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer directed to VEGFR1 and VEGFR2
<400> 9
gggggagtga tgttggggtt ggggggtggg ggcg 34
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer directed to VEGFR1 and VEGFR2
<400> 10
gtcgtgtttg ttgttgtttt catttttgcg gccc 34
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer directed to VEGFR1 and VEGFR2
<400> 11
gctgatagga tgggttgtag gtctaggggg gggcc 35
Claims (18)
- 서열 번호 1 내지 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하고, 혈관 내피 증식 인자(VEGF) 수용체에 대하여 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 핵산 앱타머이며, 상기 앱타머가 RNA인 경우에는, 상기 핵산 서열에 있어서 T는 U인 것을 특징으로 하는 핵산 앱타머.
- 제1항에 있어서, 상기 VEGF 수용체가 VEGFR1 및 VEGFR2 중 어느 한쪽 또는 양쪽인, 핵산 앱타머.
- 제1항에 있어서, VEGFR1 및 VEGFR2의 양쪽에 대하여 특이적으로 결합하는, 핵산 앱타머.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 앱타머인, 핵산 앱타머.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 수용체가 인간 VEGF 수용체인, 핵산 앱타머.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 당쇄 부분에서의 화학적 치환, 인산 에스테르 부분에서의 화학적 치환 및 핵산 염기 부분에서의 화학적 치환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화학 수식을 포함하는, 핵산 앱타머.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단 또는 3' 말단에 형광 표지를 갖는, 핵산 앱타머.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 앱타머가 형광 발광할 수 있는 금속 나노 입자(양자 도트) 표면에 흡착되어 있는, 핵산 앱타머.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단 또는 3' 말단에 형광 표지를 갖는 핵산 앱타머가 라만 산란 활성을 갖는 금속인 금, 은, 구리, 철 및 규소로부터 선택되는 1종 이상의 입자에 흡착되어 있는, 핵산 앱타머.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단 또는 3' 말단이 비오틴, 아비딘 혹은 스트렙트아비딘 또는 기타의 특이적 결합 태그 펩티드와 연결되는, 핵산 앱타머.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 앱타머를 포함하는, 인간 VEGF 수용체의 검출용 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 앱타머를 포함하는, 인간 VEGF 수용체의 검출용 키트.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 앱타머를 사용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생에 관련하는 질환의 진단 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 핵산 앱타머를 내피세포, 혈관 조직, 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어지는 군에서 선택되는 생체로부터 채취된 시료와 접촉시키는 공정 및 당해 시료와 핵산 앱타머의 결합에 의한 응답을 관측함으로써 VEGF 수용체의 존재를 검출하는 공정을 포함하는 진단 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 응답이 형광 응답인 진단 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 앱타머를 함유하는, 혈관 신생에 관련하는 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 혈관 신생에 관련하는 질환이 종양 혈관 신생, 당뇨병성 망막증 또는 만성 관절 류머티즘인 의약 조성물.
- 표적 분자에 대하여 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머의 스크리닝 방법이며,
(a) 표적 분자와 복수종의 단일쇄 핵산 프래그먼트를 접촉시켜서, 표적 분자와 단일쇄 핵산 프래그먼트와의 복합체를 형성시키고,
(b) 상기 복합체를 형성하고 있지 않은 단일쇄 핵산 프래그먼트를 제거하고,
(c) 상기 복합체를 해리시켜서 얻어지는 단일쇄 핵산 프래그먼트를 포함하는 후보 핵산 프래그먼트 군을 취득하고,
(d) 상기 후보 핵산 프래그먼트 군을 증폭하고,
(e) 상기 (a) 내지 (d)의 공정을 복수회 반복하고,
(f) 소정의 횟수 반복한 후의 후보 핵산 프래그먼트 군의 염기 서열을 결정하고, 중복하여 검출되는 염기 서열을 포함하는 중복성 핵산 프래그먼트를 특정하고,
(g) 상기 공정 (e)에 있어서의 반복수의 증가에 수반하여, 존재 빈도가 증가하는 상기 중복성 핵산 프래그먼트를 선택하는,
공정을 포함하는 핵산 앱타머의 스크리닝 방법이며,
상기 표적 분자가, 패밀리를 구성하는 복수종의 분자 중 하나이고, 그 각 분자를 교대로 사용하여 상기 공정 (e)를 반복하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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