KR20200021987A - 유전 물질을 인간 세포 내로 표적화하여 도입하기 위한 향성-변형 재조합 바이러스 입자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원에서, 캡시드 단백질 상에 표적화 리간드를 제시하기 위해 공유(예를 들어, 이소펩티드) 결합을 형성하는 특이적 단백질:단백질 결합 쌍을 통한 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 재유도하기 위한 조성물 및 방법이 제공되며, 표적화 리간드는 관심 세포 상에 발현되는 세포 표면 마커와 특이적으로 결합한다.

Description

유전 물질을 인간 세포 내로 표적화하여 도입하기 위한 향성-변형 재조합 바이러스 입자 및 이의 용도
서열 목록에 대한 참조
EFS 웹을 통해 텍스트 파일로 제출됨
10359WO01_ST25.txt 파일에 기록된 서열 목록은 183킬로바이트이고, 2018년 6월 27일에 생성되었으며, 본원에 참조로서 통합된다.
기술 분야
본원의 개시는 일반적으로, 유전 물질을 세포 내로 표적화하여 도입하는 데 유용한, 향성 변형된 재조합 바이러스 입자 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특정 표적 세포 내로 유전자를 전달하는 것은 다양한 만성 유전적 질환의 잠재적인 치료를 위한 현대 의약에 있어서 가장 중요한 기술 중 하나가 되었다. 지금까지, 유전자 치료를 임상에 적용함에 있어서의 진전은 이상적인 유전자 전달 비히클의 결여로 인해 제한되어 왔다. 성공적인 치료를 달성하기 위해서는, 유전자 전달 비히클이 비표적 세포를 형질도입하지 않으면서 표적 세포를 형질도입할 수 있어야 한다. 구체적으로, 바이러스의 자연 향성이 원하는 치료 목표 조직 또는 세포 유형을 충족시키지 못할 때, 자연 향성이 제거되거나 감소되고 원하는 향성이 성공적으로 조작되는 재조합 바이러스 입자가 필요하다(Buchholz 등).
최근에, 벡터 개발에 있어서의 대부분의 진전은 아데노-연관 바이러스(AAV) 및 아데노바이러스(Ad)와 같은 외피가 없는 바이러스(예를 들어, 바이러스 캡시드 단백질에 의해 형성된 캡시드를 포함하며 외피(예: 지질 이중층)가 없는 바이러스)뿐만 아니라 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 단순 포진 바이러스와 같은 외피형 바이러스(예: 캡시드가 지질 이중층으로 둘러싸인 바이러스)를 사용해 이루어져 왔다. AAV는 많은 연구의 초점이 되어 왔는데, 이는 AAV가 단지 약간의 면역원성을 가지고, 광범위한 종 및 생체 내 조직을 형질도입할 수 있고, 독성이 밝혀진 바가 없기 때문이다.
AAV는 작은 비외피형 단일-가닥 DNA 바이러스이다. AAV 게놈은 4.7 kb이며, Rep 단백질 및 Cap 단백질을 각각 암호화하는 2개의 개방 해독 프레임과 2개의 역위 말단 반복(ITR)을 특징으로 한다. 2개의 ITR은 AAV 복제, 캡시드화에 필수적인 유일한 시스(cis) 요소이다. Rep 해독 프레임은 분자량 78 kD, 68 kD, 52 kD 및 40 kD의 4개의 단백질을 암호화한다. 이들 단백질은 주로 AAV 게놈의 전사 및 복제를 조절하는 작용을 한다. Cap 해독 프레임은 83~85 kD(VP1), 72~73 kD(VP2) 및 61~62 kD(VP3)의 분자량을 갖는 3개의 구조(캡시드) 바이러스 단백질(VP)을 암호화한다. AAV 비리온에서는 총 단백질 중 80%가 넘는 단백질에 VP3가 포함되어 있고; 성숙한 비리온에서는 VP1, VP2 및 VP3이 상대적으로 대략 1:1:10의 비율로 존재하는 것으로 알려졌다. 시험관 내에서, 3개의 단백질은 자발적으로 비리온-유사 구조, 예를 들어, 바이러스 캡시드로 조립된다. 따라서, 감염된 세포에서의 바이러스 캡시드 형성은 바이러스 DNA 합성과 독립적으로 진행되는 것으로 보인다(Kotin 등 (1994) Hum. Gene Ther. 5:793 참조).
모든 공지된 AAV 혈청형들 중에서, 특성 분석이 가장 잘 된 혈청형은 AAV2일텐데, 이는 이의 감염성 클론이 처음 만들어졌기 때문이다. (Samulski 등 (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2077-2081). 이어서, 몇몇 AAV 혈청형에 대한 전체 서열이 또한 결정되었다(예를 들어, Rutledge 등 (1998) J. Virol., 72:309-319; Gao 등 (2005) Curr. Gen. Ther. 5(3)285-97; Chiorini 등 (1997) J. Virol., 71:6823-6833; S. Muramatsu 등, (1996) Virol., 221:208-217 참조). 일반적으로, 모든 AAV는 뉴클레오티드 서열에서 80%가 넘는 동일성을 공유한다.
AAV는 인간 유전자 치료에 대한 유망한 벡터인데, 이는 다른 바이러스 벡터와는 달리, AAV가 임의의 알려진 인간 질환과 연관되는 것으로 나타나지 않았고 일반적으로는 병원성으로 간주되지 않기 때문이다. (Muzyczka 등 (1992) Current Topics in Microbiology 및 Immunology, 158:97-129). 게다가, AAV는 유사분열 후 조직을 비교적 낮은 면역원성으로 안전하게 형질도입하고, 바이러스가 가끔씩 숙주 염색체에 통합되더라도 이를 인간 염색체 19의 세이프 하버(safe-harbor) 유전자좌 내로 매우 드물게 형질도입하며, Rep 단백질이 트랜스로 공급될 때에 한해서도 그러하다. AAV 게놈은 감염된 세포에서 신속하게 순환하고 연쇄체화(concatemerize)되며 감염된 세포에서 안정한 에피솜 상태로 존재하여 이들의 페이로드(payload)를 장기적으로 안정하게 발현한다.
AAV를 포함하는 다수의 바이러스는 바이러스/리간드:세포/수용체 상호작용을 통해 세포를 감염시키고, 궁극적으로는 감염된 세포에 의해 바이러스의 내포작용(endocytosis)을 유발한다. 이러한 리간드:수용체 상호작용은 바이러스 벡터에 관한 많은 연구의 주 대상으로서, 예를 들어, 야생형 바이러스에 의한 감염을 허용하는 성질을 가진 세포로부터 표적 세포로 (예를 들어, 표적 세포에 의해 발현된 수용체를 통해) 바이러스의 향성을 재유도하도록 조작될 수 있다.
이론적으로는, 대부분의 세포 표면 수용체가 구성성(예: 재순환) 내포작용 또는 리간드 유도성(예: 수용체-매개) 내포작용의 경로에 관여하므로, 임의의 세포 표면 단백질 또는 마커를 향해 재표적화한 벡터는 감염을 야기하게 된다. 클라트린-코팅된 피트 내의 이들 수용체 클러스터는 클라트린-코팅된 소포를 통해 세포로 들어가서, 수용체가 분류되는 산성화된 엔도솜을 통과한 다음, 세포 표면으로 재순환되거나, 세포 내 저장되거나, 리소좀에서 분해된다. 이와 같이, 바이러스 벡터를 재표적화하기 위한 플랫폼은 종종 바이러스 벡터의 자연적인 향성을 제거하고, 단독으로 발현되거나 주로 표적 세포에 의해 발현되는 수용체 또는 마커에 대해 바이러스 벡터를 재유도하는 것을 목표로 한다. 바이러스 벡터를 사용한 표적화된 유전자 치료의 진전은 바이러스 벡터의 비-재조합(비-유전자) 또는 재조합(유전자) 변형으로서 요약될 수 있으며, 이는 바이러스 벡터의 위형화, 증식, 및/또는 바이러스 벡터의 자연 향성의 재표적화로 이어진다. (Nicklin 및 Baker (2002) Curr. Gene Ther. 2:273-93; Verheiji 및 Rottier (2012) Advances Virol 2012:1-15에서 검토됨).
가장 대중적인 접근법은 바이러스 캡시드 단백질, 즉 바이러스 캡시드 표면의 재조합 유전자 변형이다. 반면에, 간접적인 재조합 접근법에서, 바이러스 캡시드는 이종 "스캐폴드(scaffold)"를 사용해 변형되고, 이어서 어댑터에 연결된다. 어댑터는 스캐폴드와 표적 셀에 결합한다. 직접적인 재조합 표적화 접근법에서, 표적화 리간드는 바이러스 캡시드에 직접 삽입되거나, 바이러스 캡시드에 결합되는, 즉, 단백질 바이러스 캡시드는 이종 리간드를 발현하도록 변형된다. 그런 다음, 리간드는 표적 세포 상에서 우선적으로 또는 배타적으로 발현되는 수용체 또는 마커를 재유도(예를 들어 이에 결합)한다.
각각의 접근법은 장점과 단점을 갖는다. 바이러스를 유전적으로 변형시키는 능력을 위해서는, 캡시드의 구조가 유지되어야 하고; 표적화 리간드 또는 스캐폴드에 내성을 가지고 이들을 적절하게 제시하게 될 캡시드 단백질 내의 위치에 표적화 리간드 또는 스캐폴드가 위치되어야 한다. 예를 들어, 바이러스 단백질 내로 도입된 표적화 리간드 또는 스캐폴드는 변형된 캡시드의 구조를 간섭하지 않기 위해서 크기 제한을 충족해야만 하는데, 그렇지 않을 경우, 직접 리간드 또는 스캐폴드가 캡시드에 의해 정확하게 제시되지 않을 가능성을 열어주게 되고/되거나 표적화 리간드 또는 스캐폴드로서 사용하기 위해 이용 가능한 자연적으로 존재하는 분자의 스펙트럼을 제한하게 된다. 또한, 바이러스 캡시드 내에 직접 삽입된 표적화 리간드를 사용하는 것은 모듈식이 아니며 모든 타겟에 대해 재조작되어야 한다. 스캐폴드 플랫폼은 사용된 어댑터의 유연성 및 모듈화 속성에는 유리하지만, 바이러스 입자 상의 스캐폴드와 어댑터는 이온적으로 상호작용하고, 두 개의 개별적인 엔티티로 남게 되며, 그 상호작용의 본질적인 불안정성은 생체 내에서 그들의 유용성을 제한할 수 있다. 최적의 형질도입 효율을 이러한 2개 구성 요소 시스템으로 달성하기는 어려울 것이다.
명백하게, 다양한 표적 세포로 관심있는 핵산의 표적화된 전달에 적합한 상태를 유지하면서 변형된 바이러스 구조의 무결성을 유지하는 바이러스 벡터 시스템에 대한 필요성이 남아 있다.
특이적 결합 쌍의 제1 구성원 및 제2 동족 구성원(제1 구성원과 제2 동족 구성원이 특이적으로 상호작용하여 화학 결합, 바람직하게는 공유 결합을 형성함) 을 사용해 이전의 재표적화 전략에서 내재하는 문제를 해결하는 바이러스 재표적화 전략이 본원에 기술된다. 제1 구성원은, 캡시드 단백질 상에서 제시될 때, 제2 동족 구성원에 융합된 임의의 표적화 리간드에 대한 스캐폴드로서 작용하지만, 제1 구성원 및 제2 동족 구성원의 결합 시, 이소펩티드 결합이 형성되고, 재조합 바이러스 입자는 단일 성분 표적화 벡터로서 작용한다.
특이적 결합 쌍(예를 들어, 펩티드 태그)의 제1 구성원을 포함하는 이종 아미노산 서열을 제시하도록 유전적으로 변형된 재조합 바이러스 입자(예를 들어, 재조합 바이러스 캡시드 단백질, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 캡시드, 및/또는 관심 핵산을 캡슐화하는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터)가 본원에 제공되며, 여기서 아미노산 서열은 50개 미만의 아미노산 길이이고, 재조합 바이러스 캡시드/입자 단백질은 감소 내지 제거된 자연 향성을 나타낸다. 재조합 바이러스 캡시드 단백질/캡시드/벡터의 향성은 특이적 결합 쌍의 동족 제2 구성원과의 이소펩티드 결합이 형성될 때, 즉 동족 제2 구성원이 표적 세포에 특이적으로 결합하는 표적화 리간드와 융합될 때 회복되고/되거나 재유도될 수 있다. 이러한 결합의 결과 재조합 바이러스 캡시드 단백질/캡시드/벡터가 표적화 리간드를 제시한다. 형질도입 효율 및 특이성은 표적화 리간드가 재조합 바이러스 캡시드/벡터에 의해 링커를 통해 제시되고/되거나 바이러스 캡시드의 표면에서 제한된 양으로 제시될 때 놀랍게도 향상된다. 이러한 바이러스 입자, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 제조 및 사용하는 방법을 본원에서 제공한다.
따라서, 캡시드 단백질에 작동 가능하게 연결된(예를 들어, 공유 결합으로 연결된) 펩티드 태그를 포함하는 재조합 바이러스 캡시드 단백질이 본원에 기술되며, 바이러스 캡시드 단백질은 진핵 세포를 감염시키는 바이러스의 캡시드 유전자로부터 유도되고, 펩티드 태그는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원이며 특이적 결합 쌍의 제2 동족 구성원과 이소펩티드 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 (진핵 세포를 감염하는 바이러스의 캡시드 유전자로부터 유도된, 예를 들어, 진핵 세포를 감염하는 바이러스의 유전적으로 변형된 캡시드 단백질인) 재조합 캡시드 단백질은 캡시드 단백질에 작동 가능하게 연결된 특이적인 결합 쌍(예를 들어, 펩티드 태그)의 제1 구성원을 포함하고, 특이적인 결합 쌍의 제2 동족 구성원을 추가로 포함하며, 특이적인 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원은 공유(이소펩티드) 결합에 의해 결합된다(예를 들어, 캡시드 단백질은 캡시드 단백질에 작동 가능하게 연결된 제1 구성원을 포함하고 제1 구성원에 공유적으로 결합된 특이적인 결합 쌍의 제2 동족 구성원을 추가로 포함함). 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 (진핵 세포를 감염하는 바이러스의 캡시드 유전자로부터 유도될 수 있는, 예를 들어, 진핵 세포를 감염하는 바이러스의 유전적으로 변형된 캡시드 단백질인) 재조합 캡시드 단백질은, 캡시드 단백질에 작동 가능하게 연결된, 특이적인 결합 쌍(예를 들어, 펩티드 태그)의 제1 구성원을 포함하며, 표적화 리간드와 융합된 특이적은 결합 쌍의 제2 동족 구성원을 추가로 포함하고, 특이적인 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원은 공유(이소펩티드) 결합에 의해 결합된다(예를 들어, 캡시드 단백질은 캡시드 단백질에 작동 가능하게 연결된 특이적인 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하고 제1 구성원에 공유적으로 결합된 특이적인 결합 쌍의 제2 동족 구성원을 추가로 포함하며, 특이적인 결합 쌍의 제2 동족 구성원은 표적 세포 상에 세포 표면 마커(예를 들어, 세포 표면 올리고당, 세포 표면 수용체 및/또는 세포 표면 마커 등)에 특이적으로 결합한 표적화 리간드에 작동 가능하게 연결되어 있음). 또한, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드, 및 본원에서 기술된 바이러스 캡시드에 의해 캡슐화되는 관심 뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터가 본원에 기술된다. 또한, 본원에 기술된 재조합 바이러스 입자를 포함하는 조성물(예를 들어, 재조합 바이러스 캡시드 단백질, 재조합 바이러스 캡시드, 및/또는 재조합 바이러스 벡터), 관심 뉴클레오티드의 표적화된 전달을 위해 이를 사용하는 방법, 및 이를 제조하는 방법이 기술된다.
일부 구현예에서, 펩티드 태그(특이적인 결합 쌍의 제1 구성원)는 제1 또는 제2 링커(예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 길이인 아미노산 스페이서)를 통해 캡시드 단백질에 작동 가능하게 연결되고/되거나, 캡시드 단백질과 함께 프레임 내 번역되고/되거나, 캡시드 단백질에 화학적으로 부착되고/되거나 캡시드 단백질에 의해 제시된다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(제1 구성원)는 제1 및/또는 제2 링커(각각의 스페이서는 적어도 하나의 아미노산 길이인, 제1 및/또는 제2 아미노산 스페이서)의 측면으로 위치한다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 동일하지 않다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1 또는 2개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1, 2, 또는 3개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 서열 및/또는 길이가 동일하고, 각각의 1개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각의 1개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각의 2개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각의 3개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각의 4개의 아미노산 길이이다(예를 들어, 링커는 GLSG(서열 번호 40)). 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각의 5개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각의 5개의 아미노산 길이이다(예를 들어, 제1 및 제2 링커는 GLSGSG(서열 번호 41)의 서열을 각각 포함함). 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각의 7개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각의 8 개의 아미노산 길이이다(예를 들어, 제1 및 제2 링커는 GLSGLSGS(서열 번호 42)의 서열을 각각 포함함). 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각의 9개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각의 10개의 아미노산 길이이다(예를 들어, 제1 및 제2 링커는 GLSGLSGLSG(서열 번호 43) 또는 GLSGGSGLSG(서열 번호 55)의 서열을 각각 포함함). 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 길이가 동일하고, 각각 10개 초과의 아미노산 길이이다.
일반적으로, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 링커(예를 들어, 펩티드 태그 그 자체 또는 하나 이상의 링커와의 조합된 펩티드 태그)는 약 5개 아미노산 내지 약 50개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 적어도 5개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 6개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 7개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 8개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 9개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 10개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 11개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 12개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 13개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 14개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 15개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 16개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 17개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 18개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 19개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 20개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 21개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 22개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 23개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 24개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 25개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 26개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 27개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 28개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 29개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 30개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 31개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 32개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 33개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 34개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 35개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 36개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 37개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 38개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 39개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 40개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 40개 이상 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 그 자체로서 또는 하나 이상의 링커와 조합될 때 50개 이하 아미노산의 길이이다.
일반적으로, 본원에 기술된 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 비외피형 바이러스의 캡시드 유전자로부터 유래되되(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 cap 유전자에 의해 암호화되어 비외피형 바이러스의 유전적으로 변형된 캡시드 단백질을 발현하도록 변형됨), 비외피형 바이러스는 인간 세포를 감염시키거나, 일반적으로 인간 세포를 감염시키는 비외피형 바이러스(예를 들어 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스)의 혈청형이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV의 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질(또는 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 일부분)을 암호화하는 AAV 캡시드 유전자로부터 유도된다(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 cap 유전자에 의해 암호화되어 유전적으로 변형된 아데노-연관 바이러스(AAV) VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV9로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간을 감염시키는 AAV 혈청형의 유전적으로 변형된 캡시드 단백질)을 암호화하도록 변형됨). 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV2 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질 또는 AAV9 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 개별적으로 암호화하는 AAV2 또는 AAV9 캡시드 유전자로부터 유도된다(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV2 또는 AAV9 cap 유전자에 의해 암호화되어, 유전적으로 변형된 AAV2 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질 또는 유전적으로 변형된 AAV9 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 개별적으로 암호화하도록 변형됨). 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV6 캡시드 유전자로부터 유래된다(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV6 cap 유전자에 의해 암호화되어, 유전적으로 변형된 AAV6 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 암호화하도록 변형되되, AAV6 VP1 캡시드 단백질의 야생형 아미노산 서열은 서열번호 51로서 각각 제시됨). 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 유전자로부터 유래된다(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV2 cap 유전자에 의해 암호화되어, 유전적으로 변형된 AAV2 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 암호화하도록 변형되되, AAV2 VP1 캡시드 단백질의 야생형 아미노산 서열은 서열번호 9로서 각각 제시됨). 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 유전자로부터 유래된다(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV9 cap 유전자에 의해 암호화되어, 유전적으로 변형된 AAV9 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 암호화하도록 변형되되, AAV9 VP1 캡시드 단백질의 야생형 아미노산 서열은 서열번호 31로서 각각 제시됨).
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 키메라 AAV 캡시드 유전자에 의해　유도(암호화)되되, 키메라 캡시드 유전자는 복수의 핵산 서열을 포함하고, 복수의 핵산 서열 각각은 상이한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 일부를 암호화하며, 복수의 핵산 서열은 함께 키메라 AAV 캡시드 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 키메라 AAV2 캡시드 유전자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 키메라 AAV6 캡시드 유전자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 키메라 AAV9 캡시드 유전자로부터 유래된다.
일반적으로, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원)가 결여된 기준 캡시드 단백질 및 임의로 링커 또는 기준캡시드 캡시드를 포함하는 캡시드 각각과 비교해볼 때, 본원에 기술된 바와 같이 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커 그 자체가 이를 포함하는 재조합 캡시드 단백질 또는 캡시드의 자연 향성을 감소시키고/감소시키거나 제거하도록 재조합 캡시드 단백질에, 임의로 링커를 통하여, 작동 가능하게 연결되고/연결되거나, 예를 들어, 재조합 캡시드 단백질 내에 삽입되고/되거나 재조합 캡시드 단백질에 의해 제시되는 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원)를 포함하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원)는, 임의로 링커를 통해서, 야생형 기준 캡시드 단백질의 자연 향성과 관련된 캡시드 단백질의 영역(예를 들어, 세포 표적화와 관련된 캡시드 단백질의 영역)에 작동 가능하게 연결되고/되거나, 예를 들어, 캡시드 단백질의 영역 내에 삽입되고/삽입되거나 캡시드 단백질의 영역에 의해 제시된다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커는, 임의로는 링커를 통해서, Ad 섬유 단백질의 노브(knob) 도메인에 작동 가능하게 연결되고/연결되거나, 예를 들어, 노브 도메인 내에 삽입되고/삽입되거나 노브 도메인에 의해 제시된다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원)는, 임의로는 링커를 통해서, Ad 섬유 단백질의 HI 루프에 작동 가능하게 연결되고/연결되거나, 예를 들어, HI 루프 내에 삽입되고/삽입되거나 HI 루프에 의해 제시된다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원)는, 임의로는 링커를 통해서, AAV 캡시드 단백질 내 노출된 가변 루프에 작동 가능하게 연결되고/연결되거나, 예를 들어, 노출된 가변 루프 내에 삽입되고/삽입되거나 노출된 가변 루프에 의해 제시된다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원)는, 임의로는 링커를 통해서, AAV2 캡시드 단백질의 노출된 가변 루프에 작동 가능하게 연결되고/연결되거나, 예를 들어, 노출된 가변 루프 내에 삽입되고/삽입되거나 노출된 가변 루프에 의해 제시된다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원)는, 임의로는 링커를 통해서, AAV9 캡시드 단백질의 노출된 가변 루프에 작동 가능하게 연결되고/연결되거나, 예를 들어, 노출된 가변 루프 내에 삽입되고/삽입되거나 노출된 가변 루프에 의해 제시된다.
일부 구현예에서, (i) 바이러스 캡시드 단백질은 AAV2 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 암호화하는 AAV2 캡시드 유전자로부터 유도되고, 펩티드 태그는, 임의로는 링커를 통해서, AAV2 VP1 캡시드 단백질의 I453 또는 I587 자리(또는 동일한 캡시드 유전자로부터 암호화되는 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9)의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산)에서 아미노산에 작동 가능하게 연결되고/연결되거나, 예를 들어, 아미노산 내에 삽입되고/삽입되거나 아미노산에 의해 제시되고/제시되거나, (ii) 바이러스 캡시드 단백질은 AAV6 캡시드 유전자로부터 유도되고, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원)은, 임의로는 링커를 통해서, AAV6 VP1 캡시드 단백질의 I585 위치(또는 동일한 캡시드 유전자로부터 암호화되는 VP2 및/또는 VP3캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9)의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산)에서 아미노산에 작동 가능하게 연결되고/연결되거나, 예를 들어, 아미노산 내에 삽입되고/삽입되거나 아미노산에 의해 제시되고/제시되거나; 또는 (iii) 바이러스 캡시드 단백질은 AAV9 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 암호화하는 AAV9 캡시드 유전자로부터 유도되고, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원)은, 임의로는 링커를 통해서, AAV9 VP1 캡시드의 I453 또는 I589 위치(또는 동일한 캡시드 유전자로부터 암호화되는 VP2 및/또는 VP3캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, 및 AAV8)의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산)에서 아미노산에 작동 가능하게 연결되고/연결되거나, 예를 들어, 아미노산 내에 삽입되고/삽입되거나 아미노산에 의해 제시되고/제시된다.
일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원)는, 임의로는 링커를 통해서, AAV2 캡시드 단백질 VP1의 453, AAV2 캡시드 단백질 VP1의 587, AAV6 캡시드 단백질 VP1의 585, AAV9 캡시드 단백질 VP1의 453, 및 AAV9 캡시드 단백질 VP1의 589로 구성되는 군으로부터 선택되는 위치(또는 동일한 캡시드 유전자를 암호화하는 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9)의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응한 아미노산)에서 아미노산에 작동 가능하게 연결되는, 예를 들어, AAV2 캡시드 단백질 VP1의 453, AAV2 캡시드 단백질 VP1의 587, AAV6 캡시드 단백질 VP1의 585, AAV9 캡시드 단백질 VP1의 453, 및 AAV9 캡시드 단백질 VP1의 589로 구성되는 군으로부터 선택되는 위치(또는 동일한 캡시드 유전자를 암호화하는 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9)의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응한 아미노산)에서 아미노산의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커는 AAV2 캡시드 단백질 VP1의 453 위치에서 아미노산 (또는 동일한 캡시드 유전자에 의해 암호화된 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9)의 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산) 바로 다음에 삽입된다(예를 들어, 이의 C-말단에 융합된다). 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커는 AAV2 캡시드 단백질 VP1의 587 위치에서 아미노산 (또는 동일한 캡시드 유전자에 의해 암호화된 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9)의 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산) 바로 다음에 삽입된다(예를 들어, 이의 C-말단에 융합된다). 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커는 AAV6 캡시드 단백질 VP1의 585 위치에서 아미노산 (또는 동일한 캡시드 유전자에 의해 암호화된 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, 및 AAV9)의 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산) 바로 다음에 삽입된다(예를 들어, 이의 C-말단에 융합된다). 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커는 AAV9 캡시드 단백질 VP1의 453 위치에서 아미노산 (또는 동일한 캡시드 유전자에 의해 암호화된 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, 및 AAV8)의 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산) 바로 다음에 삽입된다(예를 들어, 이의 C-말단에 융합된다). 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커는 AAV9 캡시드 단백질 VP1의 589 위치에서 아미노산 (또는 동일한 캡시드 유전자에 의해 암호화된 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, 및 AAV8)의 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산) 바로 다음에 삽입된다(예를 들어, 이의 C-말단에 융합된다). 일부 구현예에서, 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커는 AAV2 VP1 캡시드 단백질의 587 내지 588 위치(또는 동일한 캡시드 유전자에 의해 암호화된 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치, 또는 인간을 감염시키는 상이한 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, 및 AAV8)의 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산)에서 삽입되고/삽입되거나 제시된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 재조합 캡시드 단백질은 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커에 추가될 수 있는 (제2 및 상이한) 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, (제2 및 상이한 돌연변이는) 캡시드 단백질 내로 이종 펩티드의 삽입, 하나 이상의 아미노산과 하나 이상의 이종 아미노산과 함께 캡시드 단백질의 치환, 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 유전자로부터 유도될 수 있으며(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 유전적으로 변형된 AAV2 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질임), 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커를 포함하고, 돌연변이(예를 들어, AAV2 VP1 캡시드 단백질에서 R585A 및/또는 R588A 돌연변이(또는 동일한 AAV2 캡시드 유전자로부터 암호화되는 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질에서 상응하는 돌연변이))를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 유전자로부터 유도되며(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 유전적으로 변형된 AAV2 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질임), AAV2 VP1 단백질의 453 위치에서 아미노산 (또는 AAV2 캡시드 유전자에 의해 암호화되는 AAV2 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치에서 아미노산) 바로 다음에 삽입되는(예를 들어, 이의 C-말단에 융합되는) 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커를 포함하고, R585A 및/또는 R588A로 구성되는 군으로부터 선택되는 돌연변이(또는 동일한 AAV2 캡시드 유전자로부터 암호화되는 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질에서 상응하는 돌연변이)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 유전자로부터 유도되며(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 유전적으로 변형된 AAV2 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질임), AAV2 VP1 캡시드 단백질의 587 위치에서 아미노산 (또는 동일한 AAV2 캡시드 유전자로부터 암호화되는 AAV2 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치에서 아미노산) 바로 다음에 삽입되는(예를 들어, 이의 C-말단에 융합되는) 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커를 포함하고, R585A, R588A 및/또는 동일한 AAV2 캡시드 유전자로부터 암호화되는 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질에서 상응하는 돌연변이로 구성되는 군으로부터 선택되는 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 유전자로부터 유도되며(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 유전적으로 변형된 AAV9 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질임), AAV9 VP1 단백질의 453 위치에서 아미노산 (또는 동일한 AAV9 캡시드 유전자로부터 암호화되는 AAV9 VP2 또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치에서 아미노산) 바로 다음에 삽입되는(예를 들어, 이의 C-말단에 융합되는) 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커를 포함하고, W503A 돌연변이(또는 동일한 AAV2 캡시드 유전자로부터 암호화되는 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질에서 상응하는 돌연변이)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 유전자로부터 유도되며(예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 유전적으로 변형된 AAV9 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질임), AAV9 VP1 단백질의 589 위치에서 아미노산 (또는 동일한 AAV9 캡시드 유전자로부터 암호화되는 AAV9 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 상응하는 위치에서 아미노산) 바로 다음에 삽입되는(예를 들어, 이의 C-말단에 융합되는) 펩티드 태그(단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원) 및 임의의 링커를 포함하고, W503A 돌연변이(또는 동일한 AAV2 캡시드 유전자로부터 암호화되는 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질에서 상응하는 돌연변이)를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질:단백질 결합 쌍은 SpyTag:SpyCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002, SpyTag:KTag, Isopeptag:pilin-C, 및 SnoopTag:SnoopCatcher로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(제1 구성원)는 SpyTag(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이고 단백질(제2 동족 구성원)은 SpyCatcher(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(제1 구성원)는 SpyTag(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이고 단백질(제2 동족 구성원)은 KTag(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(제1 구성원)는 KTag(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이고 단백질(제2 동족 구성원)은 SpyTag(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(제1 구성원)는 SnoopTag(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이고 단백질(제2 동족 구성원)은 SnoopCatcher(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(제1 구성원)는 Isopeptag(또는 이의 생물학적 활성 부분)이고 단백질(제2 동족 구성원)은 Pilin-C(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그(제1 구성원)는 SpyTag002(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이고 단백질(제2 동족 구성원)은 SpyCatcher002(또는 그의 생물학적으로 활성인 부분)이다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 SpyTag를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물, 또는 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 캡시드 단백질의 아미노산 서열로서 표 1에 열거된 임의의 서열 번호로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 13으로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 15로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 17로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 19로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 21로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 23으로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 25로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 27로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 29로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 35로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 37로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열번호 39로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 특이적 결합 쌍의 제2 동족 단백질 구성원에 공유적으로 결합된 특이적 결합 쌍의 제1 구성원(예를 들어, 펩티드 태그)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된 펩티드 태그(제1 구성원)를 포함하며, 상기 어댑터 폴리펩티드는 표적화 리간드에 작동 가능하게 연결된 동족 단백질(제2 구성원)을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 단백질(제2 구성원)에 작동 가능하게 연결되고, 예를 들어, 임의로 링커를 통해서, 단백질에 융합된다. 일반적으로, 표적화 리간드는 결합 모이어티(예를 들어, 자연적인 리간드, 항체, 다 특이적 결합 분자 등)일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 항체 또는 이의 일부분이다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 가변 도메인을 포함하는 항체이며, 상기 가변 도메인은 표적 세포 상에 세포 표면 단백질 및 중쇄 불변 도메인과 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 가변 도메인을 포함하는 항체이며, 상기 가변 도메인은 표적 세포 상에 세포 표면 단백질 및 IgG 중쇄 불변 도메인과 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 가변 도메인을 포함하는 항체이며, 상기 가변 도메인은 표적 세포 상 세포 표면 단백질 및 IgG 중쇄 불변 도메인과 결합하고, IgG 중쇄 불변 도메인은, 예를 들어, 링커를 통해, 펩티드 태그와 이소펩티드 공유 결합을 형성하는 단백질(단백질:단백질 결합 쌍의 제2 구성원)에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 캡시드 단백질은 SpyTag에 공유적으로 연결되고, SpyTag와 어댑터 폴리펩티드를 포함하되, SpyTag는 바이러스 캡시드 단백질에 작동 가능하게 연결되고, 어댑터 폴리펩티드는 항체 가변 도메인 및 IgG 중쇄 도메인을 포함하는 표적화 리간드에 연결되는 SpyCatcher를 포함하며, SpyCatcher 및 IgG 중쇄 도메인은 아미노산 링커(예를 들어, GSGESG(서열 번호 48))를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 어댑터 폴리펩티드는 인간 IgG4 중쇄의 일부분을 포함하는 서열 번호 46으로 제시된 서열을 포함하고, 상기 IgG4 부분은 서열 번호 49로 제시된 서열을 가지며, 링커(서열 번호 48)를 통해 SpyCatcher(서열 번호 3)에 연결된다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 표적화 리간드와 융합된 SpyCatcher에 공유적으로 연결된 SpyTag를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 것으로 표 1에 열거된 임의의 서열 번호로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 재조합 바이러스 캡시드를 포함하고 서열 번호 13으로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 15로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 17로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 19로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 21로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 23으로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 25로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 27로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 29로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 35로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 37로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 39로 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 어댑터를 포함한다.
일반적으로, 표적화 리간드는 포유류(예를 들어, 인간) 진핵 세포, 예컨대 표적 세포의 표면에서 발현되는 세포 표면 분자, 예를 들어, 올리고당, 수용체, 세포 표면 마커 등에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 간 세포, (인간) 뇌 세포, (인간) T 세포, (인간) 신장 세포, (인간) 장 세포, (인간) 폐 세포, (인간) 암세포, 또는 이종 병원균으로 감염된 (인간) 세포에 결합한다.
일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 간 세포에 의해 발현된 수용체, 예를 들어, 아시알로당단백질 수용체(예: hASGR1)에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 신경세포 세포, 예를 들어, GABA, 트랜스페린 등에 의해 발현된 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) T 세포, 예를 들어, CD3(예: CD3ε)에 의해 발현된 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 CD63에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 조혈줄기세포, 예를 들어, CD34에 의해 발현된 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 신장 세포에 의해 발현된 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 근 세포, 예를 들어, 인테그린에 의해 발현된 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 다음과 같은 (인간) 암세포, 예를 들어, 종양 관련 항원에 의해 발현된 분자에 결합한다: 아디포필린, AIM-2, ALDH1A1, 알파-액티닌-4, 알파-태아단백질("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCR-ABL 융합 단백질 b3a2, 베타-카테닌, BING-4, CA-125, CALCA, 암배아 항원("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, 사이클린 D1, 사이클린-A1, dek-can 융합 단백질, DKK1, EFTUD2, 연장 인자 2, ENAH(hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, 상피성 종양 항원("ETA"), ETV6-AML1 융합 단백질, EZH2, E6, E7, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, 글리피칸-3, GnTV, gp100/Pme117, GPNMB, HAUS3, 헵신, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, 장 카복실 에스테라아제, K-ras, 칼리크레인 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1(CCDC110으로도 알려짐), LAGE-1, LDLR-푸코실트랜스퍼라아제AS 융합 단백질, 렝신, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, 말산 효소, 맘마글로빈-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, 멜로에, 미드카인, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, 뮤신, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신, 미오신 클래스 I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P 폴리펩티드, p53, PAP, PAX5, PBF, pml-RAR알파 융합 단백질, 다형성 상피 뮤신("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, 세세르닌 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, 서바이빈, SYT-SSX1 또는 -SSX2 융합 단백질, TAG-1, TAG-2, 텔로머라아제, TGF-베타RII, TPBG, TRAG-3, 삼탄당인산 이성질화효소, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, 티로시나아제, 티로시나아제("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-lb/GAGED2a, Kras, NY-ESO1, MAGE-A3, HPV E2, HPV E6, HPV E7, WT-1 항원(림프종 및 다른 고형 종양의 경우), ErbB 수용체, 멜란 A[MART1], gp 100, 티로시나아제, TRP-1/gp 75 및 TRP-2(흑색종의 경우); MAGE-1 및 MAGE-3(방광, 두경부, 및 비소 세포 암종의 경우); HPV EG 및 E7 단백질(자궁 경부암의 경우); 뮤신[MUC-1](유방암, 췌장암, 결장암, 및 전립선암의 경우); 전립선-특이적 항원[PSA](전립선암의 경우); 암배아 항원[CEA](결장암, 유방암, 및 위암의 경우), 및 공통의 종양-특이적 항원, 예컨대, MAGE-2, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE-1,2,8, CAGE-3 TO 7, LAGE-1, NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2-INT2 등. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 E6 및/또는 E7에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 Her2에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 CD63에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 인간 글루카곤 수용체(hGCGR)에 결합한다. 일부 구현예에서, 재표적화 리간드는 인간 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포가수분해효소 3(hENTPD3)에 결합한다.
일반적으로, 본원에서 기술된 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는 표적화 리간드, 예컨대, 표적화 리간드에 작동 가능하게 연결된 제2 구성원의 부재 시 표적 세포를 감염시킬 수 없다. 일반적으로, 적절한 표적화 리간드가 없는 경우, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는 기준 바이러스 캡시드(예를 들어, 기준 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드, 예를 들어, 표적화 리간드, 및 임의로 단백질:단백질 결합 쌍의 하나 또는 두 구성원이 결여된 것을 제외하고는 재조합 바이러스 캡시드 단백질과 동일한 야생형 대조군 바이러스 캡시드 단백질 또는 바이러스 캡시드 단백질)와 비교해 감소 내지는 제거된 자연 향성을 갖는다(예를 들어, 감소된 효능을 갖거나, 형질도입을 허용하는 성질을 가진 기준 세포를 표적화하여 결합할 수 없다). 일부 구현예에서, SpyTag을 포함하는 재조합 바이러스 캡시드 단백질의 형질도입 효율은 대조군 야생형 바이러스 캡시드 단백질과 비교하여 감소되거나 제거된다.
일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 10%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 20%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 30%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 40%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 50%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 60%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 70%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 75%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 80%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 85%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 90%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 95%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 대조군 야생형 바이러스 캡시드와 비교하여 형질도입 효율에서 적어도 99%의 감소를 나타낸다. 일부 구현예 및 적절한 표적화 리간드의 부재시에, 본원에 기술된 바와 같은, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드에 의한 대조군 세포의 형질도입은 제거된다(예를 들어, 감지되지 않음, 예를 들어, 리포터 분석 등, 관심 뉴클레오티드의 발현 측정 방법을 통해).
반대로, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 연결된 펩티드 태그, 예를 들어, 표적화 리간드에 작동 가능하게 연결된 동족 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 캡시드 단백질, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는 표적 세포를 감염시킬 수 있으며, 예를 들어, 부분적으로 또는 완전히 기준 바이러스 캡시드(예를 들어, 기준 바이러스 캡시드 단백질, 예를 들어, 야생형 대조군 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드)와 비교하여 형질 도입에 자연적으로 허용되는 기준 세포를 표적으로 하여 결합하는 능력을 회복시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 10%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 20%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 30%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 40%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 50%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 60%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 70%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 75%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 80%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 85%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 90%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 95%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 적어도 99%의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 야생형 바이러스 캡시의 동일한 형질도입 효율을 나타낸다.
유사하게, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 연결된 펩티드 태그, 예를 들어, 표적화 리간드에 작동 가능하게 연결된 동족 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 캡시드 단백질, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는 표적 세포를 감염시킬 수 있으며, 예를 들어, 단백질:단백질 결합 쌍(예를 들어, 기준 캡시드 단백질을 포함함)의 하나 또는 두 구성원이 결여된다는 것을 제외하고, 재조합 바이러스 캡시드 단백질과 동일한 기준 바이러스 캡시드와 비교하여 형질 도입에 자연적으로 허용되는 기준 세포를 표적으로 하여 결합하는 능력을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 10% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 20% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 30% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 40% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 50% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 60% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 70% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 75% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 80% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 85% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 90% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 95% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 적절한 어댑터 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 바이러스 캡시드는, 예컨대, 표 1에 나열되어 있는, 적절한 대조군 기준 바이러스 캡시드의 형질도입 효율은 99% 초과의 형질도입 효율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는 모자이크 캡시드이며, 예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 단백질의 적어도 두 세트를 포함하며, 각각의 세트는 상이한 cap 유전자에 의해 암호화된다(예를 들어, 특정 비율로 펩티드 태그를 포함하지 않는 펩티드 태그 및 기준 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함함). 일부 구현예에서, 기준 캡시드 단백질은, 재조합 바이러스 캡시드 단백질과 동일한 혈청형을 갖는 야생형 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 포함한다는 점에서 야생형 기준 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 기준 캡시드 단백질은, 대조군 기준 캡시드 단백질이 펩티드 태그가 결여한다는 점을 제외하고는 재조합 바이러스 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 포함한다는 점에서 대조군 기준 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 기준 캡시드 단백질은, 야생형 캡시드 단백질의 향성을 감소시키는 돌연변이(예를 들어, 아미노산 서열의 결실, 아미노산 서열의 삽입, 키메라화 등)를 제외하고는 재조합 바이러스 캡시드 단백질과 동일한 혈청형을 갖는 야생형 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다는 점에서 돌연변이된 야생형 기준 단백질이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 재조합 바이러스 캡시드 단백질 및 기준 캡시드 단백질을 1:1 내지 1:15 범위의 비율로 포함하거나, 본원에 기술된 방법은 재조합 바이러스 캡시드 단백질 및 기준 캡시드 단백질을 1:1 내지 1:15 범위의 비율로 조합한다. 일부 구현예에서, 비율은 1:2이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:3이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:4이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:5이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:6이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:7이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:8이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:9이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:10이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:11이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:12이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:13이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:14이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:15이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물, 또는 본원에 기술된 방법은 표 1에 열거된 재조합 바이러스 캡시드 단백질 및 이의 적절한 기준 캡시드 단백질(또는 이의 기준 캡시드 단백질의 조합)을 조합하고, 또한 표 1에 나열된, 1:1 내지 1:15의 범위인 (재조합 캡시드 단백질:기준 캡시드 단백질(들)) 비율로 결합한다. 일부 구현예에서, 비율은 1:2이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:3이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:4이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:5이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:6이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:7이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:8이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:9이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:10이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:11이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:12이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:13이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:14이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:15이다.
표 1은 (1) 본원에 기술된 펩티드 태그를 포함하는 예시 및 비제한 재조합 바이러스 캡시드 단백질, (2) 표적화 벡터의 결여 시 공유 단백질 태그를 포함하는 재조합 캡시드 단백질의 감소 내지 제거된 형질도입 효율을 결정하기 위한 기준으로서 임의로 사용될 수 있는 대조군(C) 야생형 바이러스 캡시드 단백질과 상응하는 예시 및 비제한 실시예, 및 (3) 모자이크 캡시드를 생성하기 위한 기준 바이러스 캡시드 단백질에 상응하고/상응하거나 단백질:단백질 결합 쌍 및 표적화 리간드를 포함하는 재조합 캡시드 단백질의 형질도입 효율의 회복을 결정하기 위한 기준으로서 사용의 예시 및 비제한 실시예의 아미노산 서열을 제시하는 서열 식별 번호 (서열 번호)를 제공한다.
SpyTag를　포함하는　재조합　바이러스
캡시드　단백질(서열　번호)		 기준　바이러스　캡시드　단백질:
야생형(W)　기준　캡시드　단백질(서열
번호)
대조군(C)　기준　캡시드　단백질
(들)(서열　번호)
돌연변이된(M)　기준　캡시드　단백질
(들)
AAV2-CAP　N587　SpyTag　HBM
(서열　번호　13)		 (W)　AAV2-CAP(서열　번호　9)
(C)　AAV2-CAP　R585A　R588A
HBM
(서열　번호　11)
(M)　AAV2-CAP　N587　Myc(서열
번호　53)
AAV2-CAP　N587　링커　1　SpyTagHBM(서열　번호　15) (W)　AAV2-CAP(서열　번호　9)
(C)　AAV2-CAP　R585A　R588A
HBM
(서열　번호　11)
(M)　AAV2-CAP　N587　Myc(서열
번호　53)
AAV2-CAP　N587　링커　2　SpyTag　HBM(서열　번호　17) (W)　AAV2-CAP(서열　번호　9)
(C)　AAV2-CAP　R585A　R588A
HBM
(서열　번호　11)
(M)　AAV2-CAP　N587　Myc(서열
번호　53)
AAV2-CAP　N587　링커　4　SpyTag　HBM(서열　번호　19) (W)　AAV2-CAP(서열　번호　9)
(C)　AAV2-CAP　R585A　R588A
HBM
(서열　번호　11)
(M)　AAV2-CAP　N587　Myc(서열
번호　53)
AAV2-CAP　N587　링커　6　SpyTag　HBM(서열　번호　21) (W)　AAV2-CAP(서열　번호　9)
(C)　AAV2-CAP　R585A　R588A
HBM
(서열　번호　11)
(M)　AAV2-CAP　N587　Myc(서열
번호　53)
AAV2-CAP　N587　링커　8　SpyTag　HBM
(서열　번호　23)		 (W)　AAV2-CAP(서열　번호　9)
(C)　AAV2-CAP　R585A　R588A
HBM
(서열　번호　11)
(M)　AAV2-CAP　N587　Myc(서열
번호　53)
AAV2-CAP　N587　링커　10　SpyTag
HBM
(서열　번호　25)		 (W)　AAV2-CAP(서열　번호　9)
(C)　AAV2-CAP　R585A　R588A
HBM
(서열　번호　11)
(M)　AAV2-CAP　N587　Myc(서열
번호　53)
AAV2-CAP　G453　SpyTag　HBM(서열　번호　27) (W)　AAV2-CAP(서열　번호　9)
(C)　AAV2-CAP　R585A　R588A
HBM
(서열　번호　11)
(M)　AAV2-CAP　N587　Myc(서열
번호　53)
AAV2-CAP　G453　링커　10　SpyTagHBM(서열　번호　29) (W)　AAV2-CAP(서열　번호　9)
(C)　AAV2-CAP　R585A　R588A
HBM
(서열　번호　11)
(M)　AAV2-CAP　N587　Myc(서열
번호　53)
AAV9-CAP　A589　SpyTag　W503A
(서열　번호　35)		 (W)　AAV9-CAP　wt(서열　번호　31)
(C)　AAV9-CAP　W503A(서열　번호
33)
AAV9-CAP　A589　링커　10　SpyTagW503A(서열　번호　37) (W)　AAV9-CAP　wt(서열　번호　31)
(C)　AAV9-CAP　W503A(서열　번호
33)
AAV9-CAP　G453　링커　10　SpyTagW503A(서열　번호　39) (W)　AAV9-CAP　wt(서열　번호　31)
(C)　AAV9-CAP　W503A(서열　번호
33)
일반적으로, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 바이러스 벡터는 본원에 기술된 바와 같은 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드를 포함하며, 모자이크 바이러스 캡시드를 포함하고, 여기서 바이러스 캡시드는 관심 뉴클레오티드를 캡슐화한다. 일부 구현예에 있어서, 관심 뉴클레오티드는 바이러스 프로모터, 박테리아 프로모터, 포유류 프로모터, 조류 프로모터, 어류 프로모터, 곤충 프로모터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 비인간 프로모터에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1α 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CAGG 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터이다.
일반적으로, 관심 뉴클레오티드는 검출 가능한 마커, 예컨대 리포터 또는 치료 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 하나 이상의 유전자일 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 리포터 유전자이다. 일부 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 녹색 형광 단백질, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 암호화하는 리포터 유전자이다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 마커는 녹색 형광 단백질이다. 다른 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 자살 유전자, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드, CRISPR/Cas 시스템 또는 이의 일부분(들)을 암호화하는 뉴클레오티드, 안티센스 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드, siRNA 암호화 뉴클레오티드, 분비된 효소, 치료 단백질을 암호화하는 유전자 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 다중 도메인 치료제, 예를 들어, 2개의 구별되는 기능을 제공하는 적어도 2개의 도메인을 포함하는 단백질을 암호화한다.
본원에 기술된 조성물은 일반적으로, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 예를 들어, (모자이크 캡시드를 포함하는) 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하며, 여기서 캡시드는 관심 뉴클레오티드를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 (1) 본원에 기술된 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 갖는 바이러스 벡터, 및 (2) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
또한, 재조합 바이러스 캡시드 단백질, 이를 포함하는 바이러스 벡터, 조성물 등의 제조 방법 및 사용 방법이 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 바이러스, 예를 들어, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스 등을 재유도하는 방법; 진단성/치료적 카고(cargo)를 표적 세포 등에 전달하는 단계는 (시험관 내에서 또는 생체 내에서(예를 들어, 인간에서) 될 수 있는) 표적 세포에 본원에 기술된 바와 같이 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 접촉하는 단계를 포함하고, 바이러스 캡시드 또는 바이러스 벡터는 표적 세포 표면에 발현된 단백질과 특이적으로 결합하는 표적화 리간드를 포함한다. 이러한 방법은 재조합 바이러스 벡터를 생산하는 첫 번째 단계로서, 예를 들어, 바이러스 벡터의 생산에 충분한 조건에서 포장 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 기준 캡시드 단백질을 암호화하는 플라스미드의 결여 또는 존재 시에, 포장 세포는 캡시드 단백질을 암호화하는 플라스미드를 포함하고, 상기 캡시드 단백질은 펩티드 태그(제1 구성원)를 포함하며, 표적화 리간드 등에 작동 가능하게 연결된 제2 동족 구성원과 재조합 캡시드 단백질을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 (인간) 간 세포이고, (모자이크) 재조합 바이러스 벡터는 아시아당단백질 수용체, 예를 들어, (h)ASGR1과 특이적으로 결합한 표적화 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 (인간) 신경 세포이고, (모자이크) 재조합 바이러스 벡터는 GABA, 트랜스페린 수용체 등과 특이적으로 결합한 표적화 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 (인간) T 세포이고, (모자이크) 재조합 바이러스 벡터는 CD3, 예를 들어, CD3ε과 특이적으로 결합한 표적화 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 (인간) 조혈줄기세포이고, (모자이크) 재조합 바이러스 벡터는 CD34와 특이적으로 결합한 표적화 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 (인간) 신장 세포이다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 (인간) 근 세포이고, (모자이크) 재조합 바이러스 벡터는 인테그린과 특이적으로 결합한 표적화 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 (인간) 암 세포이고, (모자이크) 재조합 바이러스 벡터는 암 연관 항원, 예를 들어, E6 및 E7, Her2 등과 특이적으로 결합한 표적화 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 인간 글루카곤 수용체(hGCGR)에 결합한다.
또한, 바이러스 캡시드의 불활성화하고/하거나 바이러스 벡터를 생산하는 방법이 본원에 기술되며, 상기 방법은 일반적으로 (a) (기준 캡시드 단백질을 암호화하는 플라스미드의 결여 또는 존재 시) 펩티드 태그를 암호화하는 핵산을 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 삽입하여 이종 단백질을 포함하는 유전적으로 변형된 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 형성하는 단계 및/또는 (b) 바이러스 벡터를 생산하기에 충분한 조건으로 포장 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 여기서 포장 세포는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 포장 세포는 관심 뉴클레오티드를 포함하는 헬퍼 플라스미드 및/또는 전달 플라스미드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 배양 상청액으로부터 자기-상보성 아데노-연관 바이러스 벡터를 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 포장 세포를 용해시키고 세포 용해물로부터 단일-가닥 아데노-연관 바이러스 벡터를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 세포 찌꺼기를 제거하는 단계, (b) 바이러스 벡터를 함유하는 상청액을 핵산 분해 효소, 예를 들어, MgCl2 존재 시에 DNase I으로 처리하는 단계, (c) 바이러스 벡터를 농축시키는 단계, (d) 바이러스 벡터를 정제하는 단계, 및 (e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 또한, 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 바이러스 벡터 및 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터를 생산하는 데 유용한 포장 세포, 예를 들어, 기술된 재조합 캡시드 단백질을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 포장 세포가 본원에 제공된다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작업된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 시 필요한 수수료를 납부하면 특허청에서 제공될 것이다.
도 1은 "미감염된" 또는 "AAV2 N587-SpyTag" 입자에 감염된 세포인 HER2-양성(+) 293 hErbB2 또는 HER2-음성(-) 293 모세포 또는 "AAV2 N587-SpyTag + C6. 5-SpyC" 입자로 감염된 세포에 의해 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 평가하는 형광 활성 세포 분류(FACS)로부터 얻은 산포도를 제공한다. 두 바이러스의 캡시드는 다음 돌연변이를 포함한다: R585A, delR588, 및 잔기 N587(서열 번호 13) 바로 뒤에 SpyTag 펩티드(서열 번호 1)의 삽입을 포함한다. C6. 5-SpyC 입자는 SpyTag를 통해서 SpyCatcher(서열 번호 3)와 융합된 항-HER2 scFv(C6. 5)에 컨쥬게이션시켰다. 바이러스는 GFP를 형질도입의 마커로서 발현한다.
도 2는 "미감염된" 또는 "AAV2 N587-SpyTag" 입자에 감염된 세포인 HER2-양성(+) 293 hErbB2 또는 HER2-음성(-) 293 모세포 또는 "AAV2 N587-SpyTag + SpyC-항-HER2" 입자로 감염된 세포에 의해 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 평가하는 형광 활성 세포 분류(FACS)로부터 얻은 산포도를 제공한다. 두 바이러스의 캡시드는 다음 돌연변이를 포함한다: R585A, delR588, 및 잔기 N587(서열 번호 13) 바로 뒤에 SpyTag 펩티드(서열 번호 1)의 삽입을 포함한다. SpyC-항-HER2 입자는 SpyTag를 통해서 SpyCatcher(서열 번호 3)와 융합된 항-HER2 항체(허셉틴®)에 컨쥬게이션시켰다. 바이러스는 GFP를 형질도입의 마커로서 발현한다.
도 3은 "AAV2 야생형" 입자로 감염된 HER2-양성(+) 293 hErbB2 또는 HER2-음성(-) 293 모세포 또는 "AAV2 G453-SpyTag + SpyC-항-HER2" 입자로 감염된 세포에 의해 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 평가하는 형광 활성 세포 분류(FACS)로부터 얻은 산포도를 제공한다. "AAV2 야생형" 캡시드는 돌연변이 또는 변형(서열 번호 9)을 가지지 않지만, "AAV2 G453-SpyTag" 캡시드는 "SpyTag" 캡시드 단백질 사이에서 1:7의 비율로 포함되는 모자이크 바이러스 단백질이며, SpyTag는 잔기 G453 바로 다음에 삽입되고, 돌연변이 R585A 및 R588A(서열 번호 11)를 함유하지만 SpyTag는 없이 10개 아미노산 링커(서열 번호 29) 및 "AAV2 HBM" 캡시드의 측면으로 위치한다. AAV2 G453-SpyTag 모자이크 입자는 SpyTag를 통해서 SpyCatcher(서열 번호 3)와 융합된 항-HER2 항체(허셉틴®)에 컨쥬게이션시켰다. 바이러스는 GFP를 형질도입의 마커로서 발현한다.
도 4a는 AAV2 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질에 의해 공유되는 선형 에피토프를 인식하고, SpyCatcher "SpyC-항-Her2 scFv"와 융합된 항-HER2 scFv와 다음 돌연변이를 갖는 캡시드로 구성된 AAV2 바이러스 입자의 패널 사이의 반응을 분석하는 B1 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 제공한다: R585A, delR588, 및 다양한 길이의 아미노산 링커(링커 1, 링커 2, 링커 4, 링커 6, 링커 8 및 링커 10)(서열 번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25)가 측면으로 위치하는 잔기 N587 바로 다음에 SpyTag 펩티드의 삽입. 도 4b는 GFP를 발현하는 HER2+ 세포(회색, y축)의 백분율 대 다음의 돌연변이가 있는 캡시드로 구성되는 AAV2 바이러스 입자로 감염 5일 후 GFP를 발현하는 HER2- 세포(흑색, y축)의 백분율을 제공한다: R585A, delR588, 및 지시된 길이의 아미노산 링커(링커 1, 링커 2, 링커 4, 링커 6, 링커 8 및 링커 10)(서열 번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 및 25, 각각)가 측면으로 위치하는 N587-SpyTag(x축). AAV2 N587 SpyTag 입자는 SpyCatcher(서열 번호 3)와 융합된 항-HER2 scFv에 컨쥬게이션시켰다.
도 5a는 AAV2 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질에 의해 공유되는 선형 에피토프를 인식하는 B1 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 제공하고, SpyCatcher "SpyC-항-Her2 항체"와 융합된 항-HER2 항체(허셉틴®)와 다음 돌연변이를 갖는 캡시드로 구성된 AAV2 바이러스 입자의 패널 사이의 반응을 분석하는 단계를 제공한다: R585A, delR588, 및 다양한 길이의 아미노산 링커(링커 없음, 링커 1, 링커 2, 링커 4, 링커 6, 링커 8 및 링커 10)(서열 번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 및 25, 각각)가 측면으로 위치하는 잔기 N587 바로 다음에 SpyTag 펩티드의 삽입. 도 5b는 GFP를 발현하는 HER2+ 세포(회색, y축)의 백분율 대 다음의 돌연변이가 있는 캡시드로 구성되는 야생형(wt) AAV2 바이러스 입자로 감염 5일 후 GFP를 발현하는 HER2- 세포(흑색, y축)의 백분율을 제공한다: R585A, delR588, 및 지시된 길이의 아미노산 링커(링커 없음, 링커 1, 링커 2, 링커 4, 링커 6, 링커 8 및 링커 10)(서열 번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 및 25, 각각)가 측면으로 위치하는 N587-SpyTag(x축). AAV2 N587 SpyTag 입자는 SpyCatcher(서열 번호 3)와 융합된 항-HER2 항체(허셉틴®)에 컨쥬게이션시켰다.
도 6a는 AAV2 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질에 의해 공유되는 선형 에피토프를 인식하는 B1 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 제공하고, SpyCatcher(서열 번호 3) "SpyC-항-Her2 scFv"와 융합된 항-HER2 scFv C6. 5와 혼합물로 구성된 모자이크 AAV2 바이러스 입자의 패널 사이의 반응을 분석하는 단계를 제공하되, 상기 혼합물은 돌연변이 R585A, delR588, 및 N587-링커 10-SpyTag를 함유하는 "SpyTag" 캡시드 단백질(서열 번호 25)과 돌연변이 R585A 및 R588는 함유하지만, SpyTag는 함유하지 않는 "HBM" 캡시드 단백질(서열 번호 11) 사이이다. "SpyTag" 및 "HBM" 캡시드 단백질을 다양한 비율로 혼합하였다(1:0, 1:1, 및 1:3). 도 6b는 돌연변이 R585A, delR588, 및 N587-링커 10-SpyTag를 함유하는 "링커 10" 캡시드 단백질(서열 번호 25)과 돌연변이 R585A 및 R588A를 함유하나, SpyTag는 함유하지 않는 "HBM" 캡시드 단백질(서열 번호 11) 사이의 혼합물이 포함된 모자이크 AAV2 바이러스 입자(x축)로 감염 5일 후 GFP(y축)를 발현하는 HER2+ 293 hErbB2 세포(회색 막대) 및 HER2- 293 모세포(검은색 막대)의 백분율을 제공한다. "링커 10" 및 "HBM" 캡시드 단백질을 다양한 비율(1:0, 3:1, 1:1, 및 1:3)로 혼합하고, SpyCatcher(서열번호 3)와 융합된 항-HER2 scFv에 콘쥬게이션시켰다.
도 7a는 AAV2 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질에 의해 공유되는 선형 에피토프를 인식하는 B1 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 제공하고, SpyCatcher(서열 번호 3) "SpyC-항-Her2 항체"와 융합된 항-HER2 항체(허셉틴®)와 혼합물로 구성된 모자이크 AAV2 바이러스 입자의 패널 사이의 반응을 분석하는 단계를 제공하되, 상기 혼합물은 돌연변이 R585A, delR588, 및 N587-링커 10-SpyTag를 함유하는 "SpyTag" 캡시드 단백질(서열 번호 25)과 돌연변이 R585A 및 R588는 함유하지만, SpyTag는 함유하지 않는 "HBM" 캡시드 단백질(서열 번호 11) 사이이다. "SpyTag" 및 "HBM" 캡시드 단백질을 다양한 비율로 혼합하였다(1:0, 3:1, 1:1, 및 1:3). 도 7b는 돌연변이 R585A, delR588, 및 N587-링커 10-SpyTag를 함유하는 "링커 10" 캡시드 단백질(서열 번호 25)과 돌연변이 R585A 및 R588A를 함유하나, SpyTag는 함유하지 않는 "HBM" 캡시드 단백질(서열 번호 11) 사이의 혼합물이 포함된 모자이크 AAV2 바이러스 입자(x축)로 감염 5일 후 GFP(y축)를 발현하는 HER2+ 293 hErbB2 세포(회색 막대) 및 HER2- 293 모세포(검은색 막대)의 백분율을 제공한다. "링커 10" 및 "HBM" 캡시드 단백질을 다양한 비율(1:0, 3:1, 1:1, 및 1:3)로 혼합하고, SpyCatcher(서열번호 3)와 융합된 항-HER2 항체(허셉틴®)에 콘쥬게이션시켰다.
도 8a는 AAV2 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질에 의해 공유되는 선형 에피토프를 인식하는 B1 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 제공하고, SpyCatcher(서열 번호 3) "SpyC-항-Her2 항체"와 융합된 항-HER2 항체(허셉틴®)와 혼합물로 구성된 모자이크 AAV2 바이러스 입자의 패널 사이의 반응을 분석하는 단계를 제공하되, 상기 혼합물은 "SpyTag" 캡시드 단백질과 돌연변이 R585A 및 R588는 함유하지만, SpyTag는 함유하지 않는 "HBM" 캡시드 단백질(서열 번호 11) 사이이다. "SpyTag" 캡시드 단백질은 "G453 SpyTag"를 포함하되, 돌연변이 R585A, R588A 및 잔기 G453(서열 번호 27) 바로 뒤에 SpyTag 펩티드의 삽입, 및 "G453 링커 10 SpyTag"를 함유하고, 돌연변이 R585A, R588A 및 잔기 G453 바로 뒤에 SpyTag 펩티드의 삽입을 함유하며, 잔기 G453은 10개 링커 아미노산(서열 번호 29)의 양쪽에 측면으로 위치한다. 표시된 "G453 SpyTag" 및 "G453 링커 10 SpyTag" 캡시드는 "HBM" 캡시드와 다양한 비율(1:0, 1:3, 및 1:7)로 혼합된다. 도 8b는 야생형 "wt" 또는 모자이크 AAV2 바이러스 입자(x축)로 감염 5일 후 GFP(y축)를 발현하는 HER2+ 293 hErbB2 세포(회색 막대) 및 HER2- 293 모세포(검은색 막대)의 백분율을 제공하되, 상기 혼합물은 돌연변이 R585A, R588A, 및 잔기 G453 바로 다음에 SpyTag 펩티드의 삽입을 함유하는 "G453 SpyTag" 캡시드 단백질(서열 번호 27), 또는 돌연변이 R585A, R588A, 잔기 G453 바로 다음에 SpyTag의 삽입을 함유하며, 10개 링커 아미노산(서열 번호 29)의 양쪽에 위치하는 "G453 링커 10 SpyTag"이며, 돌연변이 R585A, 및 R588A을 함유하되, SpyTag는 함유하지 않는 "HBM" 캡시드 단백질(서열 번호 11) 사이이다. "G453 SpyTag" 또는 "G453 링커 10 SpyTag" 및 "HBM" 캡시드는 다양한 비율(1:0 "순수", 1:3, 및 1:7)로 혼합되고, SpyCatcher(서열 번호 3)와 융합된 항-HER2 항체(허셉틴®)에 콘쥬게이션되었다.
도 9는 "AAV2 wt" 입자, "AAV2 SpyTag 항체 없음" 입자, 또는 "AAV2 SpyTag 항-ASGR1" 입자로 감염 후 ASGR1 발현을 위한 양성(+) 세포에 의해 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 평가하는 형광 활성 세포 분류(FACS)로부터 얻은 산포도를 제공한다. "AAV2 wt" 캡시드는 돌연변이나 변형이 없는 야생형(서열 번호 9)인 반면에, "AAV2 SpyTag" 캡시드는 다음의 돌연변이를 함유한다: R585A, delR588, 및 잔기 N587(서열 번호 13) 바로 뒤에 SpyTag 펩티드의 삽입을 포함한다. "AAV2 SpyTag 항-ASGR1" 입자는 ASGR1에 특이적으로 결합한 SpyCatcher 융합 항체에 콘쥬게이션된다. 또한 "AAV2 wt" 입자, "AAV2 SpyTag 항체 없음" 입자, 또는 "AAV2 SpyTag 항-CD63" 입자로 감염 후 CD63 발현을 위한 양성(+) 세포에 의해 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 평가하는 형광 활성 세포 분류(FACS)로부터 얻은 산포도를 보여준다. "AAV2 wt" 캡시드는 돌연변이나 변형이 없는 야생형(서열 번호 9)인 반면에, "AAV2 SpyTag" 캡시드는 다음의 돌연변이를 함유한다: R585A, delR588, 및 잔기 N587(서열 번호 13) 바로 뒤에 SpyTag 펩티드의 삽입을 포함한다. "AAV2 SpyTag 항-CD63" 입자는 CD63에 특이적으로 결합한 SpyCatcher 융합 항체에 콘쥬게이션된다. 바이러스는 GFP를 형질도입의 마커로서 발현한다. 또한 "AAV9 wt" 입자, "AAV2 SpyTag 항체 무관" 입자, 또는 "AAV2 SpyTag 항-PTPRN" 입자로 감염 후 PTPRN 발현을 위한 양성(+) 세포에 의해 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 평가하는 형광 활성 세포 분류(FACS)로부터 얻은 산포도를 보여준다. "AAV9 wt" 캡시드는 돌연변이 또는 변형을 가지지 않는 야생형(서열 번호 31)이지만, "AAV2 SpyTag" 캡시드는 "SpyTag" 캡시드 단백질 사이에서 1:7의 비율로 포함되는 모자이크 바이러스 단백질이며, SpyTag는 잔기 G453 바로 다음에 삽입되고, 10개 아미노산 링커(서열 번호 29) 및 자연 수용체 결합을 감소시키는 잔기 N587 바로 다음에 삽입되는 Myc 태그 아미노산 서열을 함유하지만 SpyTag는 없는 캡시드(서열 번호 53) 사이에 측면으로 위치한다. "AAV2 SpyTag 항체 무관" 입자는 PTPRN과 결합하지 않는 SpyCatcher 융합 항체에 콘쥬게이션된다. "AAV2 SpyTag 항-PTPRN" 입자는 PTPRN에 특이적으로 결합한 SpyCatcher 융합 항체에 콘쥬게이션된다. 바이러스는 GFP를 형질도입의 마커로서 발현한다. 또한 "AAV2 wt" 입자, "AAV2 + mAb 무관" 입자, "AAV2 + 항-ENTPD3" 입자, 및 "AAV2 + 항-hCD20" 입자로 감염 후 hENTPD3에 대한 양성(+) 세포에 의한 반딧불 루시퍼라제 발현을 평가하는 루시퍼라제 분석의 결과를 보여준다. "AAV2 wt" 캡시드는 돌연변이나 변형이 없는 야생형(서열 번호 9)인 반면에, "AAV2 + 항체" 캡시드는 다음의 돌연변이를 함유한다: R585A, delR588, 및 잔기 N587(서열 번호 13) 바로 뒤에 SpyTag 펩티드의 삽입을 포함한다. "AAV2 + mAb 무관" 입자는 hENTPD3과 결합하지 않는 SpyCatcher 융합 항체에 콘쥬게이션된다. "AAV2 + 항-hCD20" 입자는 hCD20에 특이적으로 결합하는 SpyCatcher 융합 항체에 콘쥬게이션 되고, hENTPD3+ 세포에서 발현되지 않으며 추가적인 음성 대조군으로서 작용한다. "AAV2 + 항-ENTPD3" 입자는 hENTPD3에 특이적으로 결합한 SpyCatcher 융합 항체에 콘쥬게이션된다. 바이러스는 반딧불 루시퍼라제를 형질도입의 마커로서 발현한다. 또한 "AAV2 wt" 입자, "AAV2 + mAb 무관" 입자, "AAV2 + 항-ENTPD3" 입자, 및 "AAV2 + 항-hCD20" 입자로 감염 후 hCD20에 대한 양성(+) 세포에 의한 반딧불 루시퍼라제 발현을 평가하는 루시퍼라제 분석의 결과를 보여준다. "AAV2 wt" 캡시드는 돌연변이나 변형이 없는 야생형(서열 번호 9)인 반면에, "AAV2 + 항체" 캡시드는 다음의 돌연변이를 함유한다: R585A, delR588, 및 잔기 N587(서열 번호 13) 바로 뒤에 SpyTag 펩티드의 삽입을 포함한다. "AAV2 + mAb 무관" 입자는 hENTPD3과 결합하지 않는 SpyCatcher 융합 항체에 콘쥬게이션된다. "AAV2 + 항-ENTPD3" 입자는 hENTPD3에 특이적으로 결합하는 SpyCatcher 융합 항체에 콘쥬게이션 되고, hCD20+ 세포에서 발현되지 않으며 추가적인 음성 대조군으로서 작용한다. "AAV2 + 항-hCD20" 입자는 hCD20에 특이적으로 결합한 SpyCatcher 융합 항체에 콘쥬게이션된다. 바이러스는 반딧불 루시퍼라제를 형질도입의 마커로서 발현한다.
도 10a는 AAV9 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질에 의해 공유되는 선형 에피토프를 인식하는 B1 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 제공하고, SpyCatcher(서열 번호 3) "SpyC-허셉틴"과 융합된 항-HER2 항체(허셉틴®)와 AAV9 바이러스 입자의 패널 사이의 반응을 분석하는 단계를 제공한다: 이들 AAV9 바이러스 입자는 수용체 결합, 및 잔기 A589 또는 G453 바로 다음에 SpyTag 펩티드의 삽입을 감소시키는 돌연변이 W503A를 함유하는 캡시드로 구성되며, 상기 삽입은 링커 없이 또는 1:7 비율로 구성되는 10개 아미노산 링커 또는 모자이크 AAV9 바이러스 입자의 측면에 위치하며, 상기 1:7의 비율은 돌연변이 W503A 및 돌연변이 W503A를 함유하나, SpyTag는 함유하지 않는 "W503A" 캡시드 단백질과 함께 A589-링커 10-SpyTag 또는 G453-링커 10-SpyTag를 함유하는 "SpyTag" 캡시드 단백질 사이의 비율이다. 도 10b는 SpyCatcher(x축)와 융합된 항-HER2 항체(허셉틴®)에 콘쥬게이션된 AAV9 바이러스 입자로 감염 5일 후에 GFP를 발현하는 HER2+ 293 hErbB2 세포(회색 막대) 및 HER2- 293 모세포(검은색 막대) (y축)의 비율을 제공한다. 이들 AAV9 바이러스 입자는 수용체 결합, 및 잔기 A589 (또는 G453) 바로 다음에 SpyTag 펩티드의 삽입을 감소시키는 돌연변이 W503A를 함유하는 캡시드로 구성되며, 상기 삽입은 링커 없이 또는 1:7 비율로 구성되는 10개 아미노산 링커 또는 모자이크 AAV9 바이러스 입자의 측면에 위치하며, 상기 1:7의 비율은 돌연변이 W503A 및 돌연변이 W503A를 함유하나, SpyTag는 함유하지 않는 "W503A" 캡시드 단백질과 함께 A589-링커 10-SpyTag 또는 G453-링커 10-SpyTag를 함유하는 "SpyTag" 캡시드 단백질 사이의 비율이다. 바이러스는 GFP를 형질도입의 마커로서 발현한다.
도 11은 간 세포에서 인간 ASGR1을 발현하도록 형질 전환 변형된 C57BL/6 마우스로부터 얻은 간 시료의 면역형광 현미경 이미지를 제공한다. 인산염 완충 식염수(PBS)와 함께 또는 관심 CAGG eGFP 뉴클레오티드를 운반하는 SpyTagged AAV2 입자의 2. 5x1011 바이러스 게놈(vg)/동물과 함께 정맥 내 주사 후 10일 동안 시료를 수집하였고, (1) SpyCatcher-항-인간 CD3 항체(AAV SpyT-항-hCD3 CAGG eGFP) 또는 (2) SpyCatcher-항-인간 ASGR1 항체(AAV SpyT-항-hASGR1 CAGG eGFP)에 의해 변형되었다. 마우스를 희생시키고 4% PFA로 경심 관류시켰다. 간, 신장, 및 심장의 기관을 채취하여 15% 수크로스에 이어서 30% 수크로오스로 탈수하였다. 그런 다음, 기관을 슬라이드 상에서 동결 절단하고 닭 항-EGFP 항체(Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. 펜실베니아주 웨스트그로브 소재) 및 알렉사-488 콘쥬게이션된 항-닭 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. 상동)로 염색하였다. 각각의 이미지는 하나의 마우스를 나타낸다. "SpyTagged AAV2" 캡시드는 다음 돌연변이를 포함한다: R585A, delR588, 및 잔기 N587(서열 번호 13) 바로 뒤에 SpyTag 펩티드의 삽입을 포함한다. 바이러스는 eGFP를 형질도입의 마커로서 발현한다.
도 12는 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 야생형(wt) AAV2 입자의　3. 0x1011 바이러스 게놈(vg)/동물, 또는 (1) SpyCatcher-항-인간 CD63 항체 또는 (2) SpyCatcher-항-인간 ASGR1 항체에 의해 변형되는 관심 반딧불 루시퍼라제 뉴클레오디트를 운반하는 SpyTagged AAV2 입자를 정맥 내 주사 14일 후 간 세포에서 인간 ASGR1을 발현하지 않는 개별 마우스(대조군) 및 간 세포에서 인간 ASGR1을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스(ASGR1 인간화 마우스)의 발광 이미지를 제공한다. AAV2 바이러스 입자는 "SpyTag" 캡시드 단백질 사이에서 1:7의 비율로 포함되는 모자이크 바이러스 단백질이며, SpyTag는 잔기 G453 바로 다음에 삽입되고, 10개 아미노산 링커(서열 번호 29) 및 자연 수용체 결합을 감소시키는 잔기 N587 바로 다음에 삽입되는 Myc 태그 아미노산 서열을 함유하지만 SpyTag는 없는 캡시드(서열 번호 53) 사이에 측면으로 위치한다. 바이러스는 반딧불 루시퍼라제를 형질도입의 마커로서 발현한다. 마우스를 이소플루란을 사용하여 마취시키고, 루시페린 기재를 주입하고, IVIS 스펙트럼을 생체 내 이미징 시스템(PerkinElmer)을 사용하여 10분 후에 촬영하였다.
도 13은 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 야생형(wt) AAV9 입자의 1. 0x1012　바이러스 게놈(vg)/동물, 또는 (1) SpyCatcher-항-인간 ASGR1 항체(AAV2 SpyTag + mAb 무관) 또는 (2) SpyCatcher-항-인간 ENTPD3 항체 항체(AAV2 SpyTag + 항-ENTPD3)에 의해 변형되는 관심 CMV eGFP 뉴클레오티드를 운반하는 SpyTagged AAV2 입자의 1. 0x1013 바이러스 게놈(vg)/동물을 정맥 내 주사하고 4주 후 C57BL/6 마우스로부터 얻은 간 및 췌장 샘플의 면역조직화학 이미지를 제공한다. 마우스를 희생시키고 간 및 췌장을 수집하고 10% 중성 완충 포르말린으로 고정시켰다. 그런 다음 장기를 슬라이드에 삽입하고 절개하였고, 항-GFP 항체로 염색하였다. 각각의 이미지는 하나의 마우스를 나타낸다. AAV2 바이러스 입자는 "SpyTag" 캡시드 단백질 사이에서 1:7의 비율로 포함되는 모자이크 바이러스 단백질이며, SpyTag는 잔기 G453 바로 다음에 삽입되고, 10개 아미노산 링커(서열 번호 29) 및 자연 수용체 결합을 감소시키는 잔기 N587 바로 다음에 삽입되는 Myc 태그 아미노산 서열을 함유하지만 SpyTag는 없는 캡시드(서열 번호 53) 사이에 측면으로 위치한다. 바이러스는 eGFP를 형질도입의 마커로서 발현한다. ENTPD3은 간이 아닌 다른 세포 유형 중에서 췌장 섬 세포 및 현에서 발현되는 것으로 보고되어 있다. SpyTagged AAV2 입자는 간으로부터 표적화되지 않으며; eGFP 발현은 "AAV2 SpyTag + mAb 무관" 또는 "AAV2 SpyTag + 항-ENTPD3" 입자가 주입된 마우스의 간에서는 관찰되지 않았다. 췌장 섬에서의 양성 염색이 "AAV2 SpyTag + 항-ENTPD3"입자가 주사 된 마우스 중 하나의 췌장 샘플에서 검출되었다.
도 14는 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 야생형(wt) AAV9 입자의 2. 0x1012 바이러스 게놈(vg)/동물, 또는 (1) SpyCatcher-항-인간 ASGR1 항체(AAV2 SpyTag + mAb 무관) 또는 (2) 마우스 ENTPD3에 결합되는 SpyCatcher-항-인간 ENTPD3 항체(AAV2 SpyTag + 항-ENTPD3)에 의해 변형되는 관심 CMV eGFP 핵산을 운반하는 SpyTagged AAV2 입자를 정맥 내 주사하고 14일 후 C57BL/6 마우스로부터 얻은 간 및 혀 샘플의 면역조직화학 이미지를 제공한다. 마우스를 희생시키고 간 및 혀를 수집하고 10% 중성 완충 포르말린으로 고정시켰다. 그런 다음 장기를 슬라이드에 삽입하고 절개하였고, 항-GFP 항체로 염색하였다. 각각의 이미지는 하나의 마우스를 나타내고; 3마리 마우스는 "AAV2 SpyTag + mAb 무관" 및 "AAV2 SpyTag + 항-ENTPD3" 군으로부터 주입되고 분석되었으며 모두 유사한 GFP 발현 패턴을 나타내었다. AAV2 바이러스 입자는 "SpyTag" 캡시드 단백질 사이에서 1:7의 비율로 포함되는 모자이크 바이러스 단백질이며, SpyTag는 잔기 G453 바로 다음에 삽입되고, 10개 아미노산 링커(서열 번호 29) 및 자연 수용체 결합을 감소시키는 잔기 N587 바로 다음에 삽입되는 Myc 태그 아미노산 서열을 함유하지만 SpyTag는 없는 캡시드(서열 번호 52) 사이에 측면으로 위치한다. 바이러스는 eGFP를 형질도입의 마커로서 발현한다. ENTPD3은 간이 아닌 마우스의 혀에서 발현되는 것으로 보고되어 있다(공용 데이터베이스 GenePaint.org http://www.informatics.jax.org/assay/MGI:5423021 및 Riken FANTOM5 project, adult mouse dataset로부터 추출된 데이터). eGFP 발현은 "AAV2 SpyTag + mAb 무관" 또는 "AAV2 SpyTag + 항-ENTPD3" 입자가 주입된 마우스의 간에서 관찰되지는 않으나, "AAV2 SpyTag + 항-ENTPD3" 입자가 주입된 모든 3마리 마우스의 혀에서는 검출될었다.
WO201611291은 백신접종을 목적으로 AP205 캡시드 상에서 고밀도로 면역원성 항원을 제시하는 변형된 박테리오파지 AP205로부터 바이러스 유사 입자(VLP)를 생성하기 위한 특이적 결합 쌍(SpyCatcher:SpyTag)의 활용을 기술한다. 이론적으로, 바이러스 벡터를 재표적화하기 위한 목적으로, 바이러스 캡시드의 이러한 높은 수준의 변형은 바이러스 벡터의 자연 향성이 실질적으로 감소되거나 제거되도록 보장하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 바이러스 표면에 고밀도로 표적화 리간드를 제시하는 것은 형질도입 효율을 방해할 수 있다. 실시예 4 및 5 참조. 최적의 형질도입 효율을 달성하기 위해, 구성원의 바이러스 표면의 변형도가 감소될 때, 최적의 형질도입 효율이 발생한다는 것이 발견되었다. 이와 같이, 유전적으로 변형된 바이러스 입자, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 제조 및 사용하는 방법을 본원에서 제공한다 .
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥상 명시적으로 달리 언급하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 참조는 하나 이상의 방법 및/또는 본 발명에서 설명 및/또는 본 명세서를 읽으면 당업자에게 명백해질 종류의 단계를 포함한다.
용어 "항체(antibody)"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(V­H) 및 중쇄 불변 영역(CH). )을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 적어도 3개의 도메인 CH1, CH2, CH3 및 임의로 CH4. 를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(CH) 및 경쇄 불변 영역(CL). )을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존적인 영역이 사이 사이에 배치되는 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 다시 나눠질 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단 방향으로 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로 약칭될 수도 있고; 경쇄 CDR는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 약칭될 수도 있다. 전형적인 사량체 항체 구조는 2개의 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는데, 이들 각각은 VH 및 VL 도메인과의 결합에 의해 형성되고, 이들 각각은 CH 및 CL 도메인과 항체 Fv 영역을 형성한다. 단일 도메인 항체는 단일 항원 결합 도메인, 예를 들어, VH 또는 VL을 포함한다. 항체의 항원 결합 도메인, 예를 들어 항원의 특이적인 결합 쌍의 제1 구성원을 인식하고 이에 결합하는 항체의 일부분은 "파라토프(paratope)"로도 지칭된다. 이는 항체 Fv 영역의 중 (5 내지 10개 아미노산으로 이루어진) 작은 영역으로, 단편의 단편 결합(Fab 영역)의 일부이며, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분을 함유할 수 있다. 파라토프는 파라토프가 특이적 결합 쌍의 제1 구성원에 높은 친화도로 결합할 때 특이적 결합 쌍의 제1 구성원에 특이적으로 결합한다. 용어 "높은 친화도(high affinity)" 항체는 이의 표적 특이적인 결합 쌍의 제1 구성원에 대해 약 10-9 M 이하(예: 약 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 또는 약 1 x 10-12 M)의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, KD는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™에 의해 측정되고; 다른 구현예에서, KD는 ELISA에 의해 측정된다.
문구 "상보성 결정 영역", 또는 용어 "CDR"은 보통 (즉, 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자 (예, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역의 2개의 프레임워크 영역 사이에 나타나는, 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들어, 생식계열 서열 또는 재배열되거나 재배열되지 않은 서열에 의해 암호화될 수 있으며, 예를 들어, 미처리 B 세포 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. CDR은 체세포 돌연변이 (예를 들어, 동물의 생식선에서 암호화되는 서열에 따라 달라짐), 인간화, 및/또는 아미노산 치환, 부가, 또는 결실로 변형될 수 있다. 일부 경우에(예: CDR3의 경우), CDR은, (예컨대, 재배열되지 않은 핵산 서열에서는) 서로 인접하지 않지만 B 세포 핵산 서열 내에서는 인접하는 2개 이상의 서열(예: 생식계열 서열)에 의해, 예를 들어 서열의 접합 또는 연결(예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합)의 결과로서 암호화될 수 있다.
문구 "역위 말단 반복(inverted terminal repeat)" 또는 "ITR"은 효율적인 복제에 요구되는 아데노-연관 바이러스의 게놈에서의 대칭 핵산 서열을 포함한다. ITR 서열은 AAV DNA 게놈의 각 말단에 위치한다. ITR은 바이러스 DNA 합성을 위한 복제 기원으로서 작용하며, AAV 벡터를 생성하기 위한 필수 시스 성분이다.
"경쇄(light chain)"라는 문구는 임의의 유기체의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하며, 달리 명시되지 않는 한 인간 κ 및 λ 경쇄 및 VpreB, 및 대용(surrogate) 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 달리 명시되지 않는 한, 일반적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 아미노 말단에서 카르복실 말단까지, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인, 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은, 생식선에 존재하는 V 및 J 분절의 레파토리로부터 유래된 VL 및 JL 분절을 일반적으로 포함하는 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 암호화된다. 다양한 유기체에 대한 V 및 J 경쇄 분절에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스인 www.imgt.org에서 찾을 수 있다. 경쇄는 예를 들어 이들이 나타나는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 특이적 결합 쌍의 제1 또는 제2의 제1 구성원 중 어느 하나에 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다. 경쇄는 또한 이들이 나타나는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 이상의 특이적 결합 쌍의 제1 구성원에 결합하고 인식하는 것들을 포함하거나, 중쇄 또는 또 다른 경쇄가 상기 하나 이상의 특이적 결합 쌍의 제1 구성원에 결합하고 인식하는 것을 돕는다. 공통 경쇄 또는 범용 경쇄는 인간 Vκ1-39Jκ 유전자 또는 인간 Vκ3-20Jκ 유전자로부터 유래된 것들을 포함하고, 이들의 체세포 돌연변이된(예를 들어, 친화도 성숙된) 버전을 포함한다. 예시적인 인간 VL 분절은 인간 Vκ1-39 유전자 분절, 인간 Vκ3-20 유전자 분절, 인간 Vλ1-40 유전자 분절, 인간 Vλ1-44 유전자 분절, 인간 Vλ2-8 유전자 분절, 인간 Vλ2-14 유전자 분절, 및 인간 Vλ3-21개 유전자 분절을 포함하고, 이들의 체세포 돌연변이된(예를 들어, 성숙된 친화도) 버전을 포함한다. 하나의 유기체(예를 들어, 인간 또는 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스; 또는 조류, 예컨대 닭) 유래의 가변 도메인 및 동일하거나 상이한 유기체(예를 들어, 인간 또는 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스; 예컨대 닭) 유래의 불변 영역을 포함하는 경쇄를 제조할 수 있다.
용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 통계학적으로 유의미한 값의 범위 내에 있는 것을 포함한다. 이러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 크기 몇 배 이내, 바람직하게는 50% 이내, 더 바람직하게는 20% 이내, 더욱 더 바람직하게는 10% 이내, 및 보다 더 바람직하게는 5% 이내일 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포함된 허용가능한 편차는 연구 중인 특정 시스템에 따라 달라지며, 당업자에 의해 쉽게 이해될 수 있다.
용어 "캡시드 단백질(capsid protein)"은 바이러스의 캡시드의 일부분인 단백질을 포함한다. 아데노-연관 바이러스의 경우, 캡시드 단백질은 VP1, VP2 및/또는 VP3으로 일반적으로 지칭되며, 단일 cap 유전자에 의해 암호화된다. AAV의 경우, 3개의 단백질이 공통 정지 코돈을 사용함에도 불구하고, 대안적인 mRNA 스플라이싱 및/또는 대안적인 번역 정지 코돈의 사용을 통해 cap 개방 해독 프레임(ORF)으로부터 3개의 AAV 캡시드 단백질이 중첩하는 방식으로 생산된다. Warrington 등 (2004) J. Virol. 78:6595를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. AAV2의 VP1은 2. 4-kb mRNA를 이용해 ATG 시작 코돈(아미노산 M1)으로부터 번역되는 반면, AAV2의 VP2 및 VP3은 더 적은 2. 3-kb mRNA에서 생성되는데, VP2 생산의 경우 더 약한 ACG 시작 코돈(아미노산 T138)을 사용하고, 가장 풍부한 캡시드 단백질인 VP3의 경우 다음으로 이용 가능한 ATG 코돈(아미노산 M203)에 대한 번역초과 번역을 사용해 생성된다. Warrington, 전술한 문헌; Rutledge 등의. (1998) J. Virol. . 72:309-19를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 아데노-연관 바이러스의 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있고, 특히 데펜도파보바이러스(dependoparvovirus)를 이용해 일반적으로 보존된다. Rutledge 등의 전술한 문헌 참조. 예를 들어, Rutledge 등의 전술한 (1998) 문헌은 AAV2, AAV3, AAV4 및 AAV6의 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질에 대한 아미노산 서열을 도 4b에서 제공하며, 여기서 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질 각각에 대한 시작 부위는 화살표로 표시되고 가변 도메인들은 박스로 표시된다. 따라서, 본원에서 제공된 아미노산 위치가 AAV 단백질의 VP1 캡시드 단백질과 관련하여 제공될 수 있고, 본원에서 제공되는 아미노산 위치가 서열번호 1로 제시된 주요 코팅 단백질 VP1의 AAV2 서열을 참조하여 추가로 구체화되지 않더라도, 당업자는 AAV의 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질 내에서 해당하는 동일한 아미노산의 위치 및 상이한 혈청형 중 아미노산의 상응하는 위치를 각각 그리고 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 따라서, 본원에서 제공된 아미노산 위치가 AAV 단백질의 VP1 캡시드 단백질과 관련하여 제공될 수 있고, 본원에서 제공되는 아미노산 위치가 서열번호 9로 제시된 주요 코팅 단백질 VP1의 AAV-2 서열을 참조하여 추가로 구체화되지 않더라도, 당업자는 AAV의 VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질 내에서 해당하는 동일한 아미노산의 위치 및 상이한 AAV 혈청형 중 상응하는 아미노산의 위치를 각각 그리고 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 또한, 당업자는 "키메라 캡시드 단백질"의 형성을 위해 상이한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 간에 도메인을 교환할 수 있다.
"키메라 AAV 캡시드 단백질"을 생성하기 위한 2개의 AAV 캡시드 단백질 작제물 간의 도메인 교환이 기술되었으며, 이에 관해서는 예를 들어, Shen 등의 (2007) Mol. Therapy 15(11):1955-1962를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. "키메라 AAV 캡시드 단백질"은, 2개 이상의 상이한 AAV 혈청형 유래의 아미노산 서열, 예를 들어 도메인을 포함하고 AAV-유사 바이러스 캡시드/바이러스 입자를 형성하고/하거나 형성할 수 있는 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 키메라 AAV 캡시드 단백질은 예를 들어 복수의, 예를 들어, 적어도 2개의 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드와 같은 키메라 AAV 캡시드 유전자에 의해 암호화되며, 상기 복수의 핵산 서열 각각은 구별되는 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 암호화하는 캡시드 유전자의 일부분과 동일하며, 상기 복수의 핵산 서열은 기능성 키메라 AAV 캡시드 단백질을 함께 암호화한다. 특이적 AAV 혈청형과 관련하여 키메라 캡시드 단백질을 참조하는 것은, 캡시드 단백질이 해당 혈청형의 캡시드 단백질 유래의 하나 이상의 도메인 및 상이한 혈청형의 캡시드 단백질 유래의 하나 이상의 도메인을 포함한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, AAV2 키메라 캡시드 단백질은, AAV2 VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 하나 이상의 도메인 및 상이한 AAV의 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질의 하나 이상의 도메인을 포함하는 캡시드 단백질을 포함한다.
"모자이크 캡시드"는 적어도 2개 세트의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 단백질을 포함하며, 각각의 세트는 상이한 cap 유전자에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 모자이크 캡시드는 이종 에피토프를 암호화하는 핵산 서열의 삽입에 의해 유전적으로 변형된 cap 유전자에 의해 암호화된 재조합 VP1, VP2, 및/또는 VP3 단백질을 포함하고; 추가로, 기준 cap 유전자, 예를 들어, 재조합 VP1, VP2, 및/또는 VP3 단백질과 동일한 AAV 혈청형의 야생형 VP1, VP2 및/또는 VP3 단백질을 암호화하는 야생형 기준 cap 유전자에 의해 암호화된 VP1, VP2, 및/또는 VP3 단백질; 이종 에피토프를 제외하고는 재조합 VP1, VP2, 및/또는 VP3 단백질과 동일한 VP1, VP2, 및 VP3을 암호화하는 대조군 기준 cap 유전자; 야생형 VP1, VP2, 및 VP3 단백질의 향성을 바람직하게 감소시키는 돌연변이(예: 삽입, 치환, 결실)를 제외하고는 재조합 VP1, VP2, 및/또는 VP3 단백질과 동일한 AAV 혈청형의 실질적인 야생형 VP1, VP2, 및/또는 VP3 단백질을 암호화하는 돌연변이된 야생형 기준 cap 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 기준 cap 유전자는 키메라 VP1, VP2 및/또는 VP3 단백질을 암호화한다.
"중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"라는 문구는 임의의 유기체의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하여, 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 달리 명시되지 않는 한, 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편에는 CDR, CDR 및 FR 및 이들의 조합이 포함된다. 일반적인 중쇄는, (N 말단에서 C 말단까지) 가변 도메인에 이어서, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능성 단편은 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 특이적으로 인식할 수 있고 (예, 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD로 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 인식함), 세포로부터 발현 및 분비가 가능하고, 적어도 하나의 CDR을 포함하는, 단편을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은, 생식선에 존재하는 VH, DH, 및 JH 분절의 레파토리로부터 유래된 VH, DH, 및 JH 분절을 일반적으로 포함하는 가변 영역 유전자 서열에 의해 암호화된다. 다양한 유기체에 대한 V, D 및 J 중쇄 분절에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스에서 찾을 수 있으며, 인터넷을 통해 "www.imgt.org" URL에 접속할 수 있다.
용어 "중쇄만의 항체(heavy chain only antibody)", "중쇄만의 항원 결합 단백질(heavy chain only antigen binding protein)", "단일 도메인 항원 결합 단백질(single domain antigen binding protein)", "단일 도메인 결합 단백질(single domain binding protein)" 등은 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린-유사 사슬을 포함하는 단량체 또는 동종이량체 면역글로불린 분자를 지칭한다(상기 가변 도메인은 중쇄 불변 영역에 일반적으로 기능성 CH1 도메인이 없기 때문에 경쇄와 결합할 수 없음). 따라서, 용어 "중쇄만의 항체", "중쇄만의 항원 결합 단백질", "단일 도메인 항원 결합 단백질", "단일 도메인 결합 단백질" 등은 기능성 CH1이 없는 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 유사 사슬 중 하나를 포함하는 단량체 단일 도메인 항원 결합 단백질, 또는 (ii) 기능성 CH1이 없는 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 가변 도메인을 각각 포함하는 2개의 면역글로불린 유사 사슬을 포함하는 동종이량체 단일 도메인 항원 결합 단백질 모두를 포함한다. 다양한 양태에서, 동종이량체 단일 도메인 항원 결합 단백질은 2개의 동일한 면역글로불린 유사 사슬을 포함하며, 이들 각각은 기능성 CH1이 없는 동일한 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 동일한 가변 도메인을 포함한다. 추가적으로, 단일 도메인 항원 결합 단백질의 각 면역글로불린 유사 사슬은, 중쇄 가변 영역 유전자 분절(예: VH, DHJH), 경쇄 유전자 분절 (예를 들어, VLJL), 또는 이들의 조합으로부터 유래될 수 있고 중쇄 불변 영역 유전자, 예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgD, 또는 이들의 조합의 CH1 암호화 서열(및 임의로는 힌지 영역)에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역(CH) 유전자 서열에 연결될 수 있는 가변 도메인을 포함한다. 중쇄 유전자 분절으로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 단일 도메인 항원 결합 단백질은 "VH-단일 도메인 항체" 또는 "VH-단일 도메인 항원 결합 단백질"로서 지칭될 수 있으며, 이에 관해서는, 예를 들어, 미국 특허 제8,754,287호; 미국 특허 공개 제20140289876호; 제20150197553호; 제20150197554호; 제20150197555호; 제20150196015호; 제20150197556호 및 제20150197557호를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 경쇄 유전자 분절으로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 단일 도메인 항원 결합 단백질은 "VL-단일 도메인 항원 결합 단백질"로서 지칭될 수 있으며, 이에 관해서는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제20150289489호를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다.
"경쇄(light chain)"라는 문구는 임의의 유기체의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하며, 달리 명시되지 않는 한 인간 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄 및 VpreB, 및 대용 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 달리 명시되지 않는 한, 일반적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 아미노 말단에서 카르복실 말단까지, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인, 및 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은, 생식선에 존재하는 V 및 J 유전자 분절의 레파토리로부터 유래된 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절을 일반적으로 포함하는, 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 다양한 유기체에 대한 V 및 J 유전자 분절에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스에서 찾을 수 있으며, 인터넷을 통해 "www.imgt.org" URL에 접속할 수 있다. 경쇄는, 예를 들어, 이들이 나타나는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 특이적 결합 쌍의 제1 또는 제2의 제1 구성원 중 어느 하나에 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다. 경쇄는 또한 이들이 나타나는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 이상의 특이적 결합 쌍의 제1 구성원에 결합하고 인식하는 것들을 포함하거나, 중쇄가 상기 하나 이상의 특이적 결합 쌍의 제1 구성원에 결합하고 인식하는 것을 돕는다. 경쇄는 또한 이들이 나타나는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 이상의 특이적 결합 쌍의 제1 구성원에 결합하고 인식하는 것들을 포함하거나, 중쇄가 상기 하나 이상의 특이적 결합 쌍의 제1 구성원에 결합하고 인식하는 것을 돕는다. 공통 경쇄 또는 범용 경쇄는 인간 Vκ1-39Jκ5 유전자 또는 인간 Vκ3-20Jκ1 유전자로부터 유래된 것들을 포함하고, 이들의 체세포 돌연변이된(예를 들어, 친화도 성숙된) 버전을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된(operably linked)"이라는 어구는, 서로 직접적으로 또는 간접적으로 상호 작용하거나, 달리 서로 협력하여 생물학적 이벤트에 참여하는 구성 요소 또는 성분의 (예를 들어, 3차원 공간에서의) 물리적 병치를 포함하며, 이러한 이러한 상호 작용 및/또는 협력은 병치에 의해 달성하거나 허용된다. 예를 하나 들자면, 핵산 내의 조절 서열(예를 들어, 발현 조절 서열)은, 이 서열의 존재 또는 부재가 코딩 서열의 발현 및/또는 활성에 영향을 미치도록 코딩 서열에 대해 상대적으로 위치되는 경우, 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 일컬어진다. 많은 구현예에서, "작동 가능한 연결"은 관련 구성 요소 또는 성분들 서로 간의 공유 연결을 포함한다. 당업자는, 일부 구현예에서, 효과적인 작동 가능한 연결을 달성하는 데 공유 연결이 필요한 것은 아니라는 것을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조절 대상 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되는 핵산 조절 서열은 관심 뉴클레오티드와 인접한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 하나 이상의 이러한 조절 서열은 트랜스에서 작용하거나 관심 코딩 서열의 조절 거리에서 작용한다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 조절 서열(expression control sequence)"은 발현 조절 서열이 연결되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱을 수행하는 데 필요하고/하거나 충분한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 발현 조절 서열은 다음이거나 이를 포함할 수 있다: 적절한 전사 개시 서열, 종결 서열, 프로모터 서열 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 증진하는 서열(예: Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 증진하는 서열; 및/또는, 일부 구현예에서는, 단백질 분비를 증진하는 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 조절 서열은 특정 숙주 세포 또는 유기체에서 또는 조절 서열의 유형에서 우선적으로 또는 배타적으로 활성이다. 예를 하나 들자면, 원핵생물에서, 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵생물의 경우, 많은 구현예에서, 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 인핸서, 및/또는 전사 종결 서열을 포함한다. 당업자는, 많은 구현예에서, "조절 서열"이란 용어가 발현과 프로세싱에 필수적으로 존재해야 하는 성분을 지칭하고, 일부 구현예에서는, 존재하는 것이 발현에 유리한 성분(예를 들어, 리더 서열, 표적화 서열, 및/또는 융합 파트너 서열을 포함함)을 포함한다는 것을 맥락 상 이해할 것이다.
용어 "재조합 캡시드 단백질"은 야생형 바이러스(야생형은 비교 연구를 위한 기준 및/또는 대조군 바이러스일 수 있음)의 상응하는 캡시드 단백질과 비교해 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. 재조합 캡시드 단백질은 캡시드 단백질에 삽입되고/되거나 이에 의해 제시될 수 있는 이종 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 포함한다. 이러한 맥락에서 "이종(heterologous)"은 캡시드 단백질이 유래되는 바이러스와 비교해 이종인 것을 의미한다. 삽입된 아미노산은 캡시드 단백질의 2개의 주어진 아미노산들 사이에 단순히 삽입될 수 있다. 아미노산의 삽입은, 삽입 부위에서 캡시드 단백질의 주어진 아미노산을 결실하는 것과 병행할 수도 있다(예를 들어, 하나 이상의 캡시드 단백질 아미노산은 5개 이상의 이종 아미노산으로 치환된다).
"재표적화(retargeting)" 또는 "재유도(redirecting)"는, 야생형 벡터가 조직 내의 여러 개의 세포 및/또는 유기체 내의 여러 개의 기관를 표적화하고, 조직 또는 기관의 일반적인 표적화는 이종 에피토프의 삽입에 의해 감소 내지는 제거되며, 조직 내의 보다 특이적인 세포 또는 유기체 내의 특이적인 기관에 대한 재표적화는 특이적 세포에 의해 발현되는 마커와 결합하는 표적화 리간드로 달성된다는 시나리오를 포함할 수 있다. 이러한 재표적화 또는 재유도는, 야생형 벡터가 조직을 표적화하고, 조직을 표적화하는 것은 이종 에피토프의 삽입에 의해 감소 내지는 제거되고, 완전히 다른 조직에 대한 재표적화는 표적화 리간드로 달성된다는 시나리오를 포함할 수도 있다.
"특이적 결합 쌍", "단백질:단백질 결합 쌍" 등은 상호작용하여 이소펩티드 결합 형성을 가능하게 하거나 용이하게 하는 조건 하에서의 공유 이소펩티드 결합을 형성하는 두 개의 단백질(예를 들어, 제1 구성원(예: 제1 폴리펩티드) 및 제2 동족 구성원(예: 제2 폴리펩티드)) 및 제2 동족 구성원을 포함하되, 용어 "동족"은 함께 작용하는, 즉 함께 반응하여 이소펩티드 결합을 형성하는 성분을 지칭한다. 따라서, 이소펩티드 결합 형성을 가능하게 하거나 용이하게 하는 조건 하에서 함께 효율적으로 상호작용하여 이소펩티드 결합을 형성하는 두 개의 단백질은 펩티드 링커의 "상보적인" 쌍이 되는 것으로 또한 지칭될 수 있다. 공유 이소펩티드 결합을 형성하기 위해 상호 작용할 수 있는 특이적 결합 쌍은 Veggiani 등 (2014) Trends Biotechnol. 32:506을 참조하고, SpyTag:SpyCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002; SpyTag:KTag; isopeptag:pilin C, SnoopTag:SnoopCatcher 등과 같은 단백질:단백질 결합 쌍을 포함한다. 일반적으로, 펩티드 태그는 단백질:단백질 결합 쌍의 구성원을 지칭하고, 일반적으로 30개의 아미노산 길이 미만이며, 제2 동족 단백질과 공유 이소펩티드 결합을 형성하되, 제2 동족 단백질은 일반적으로 크지만, SpyTag:KTag sytem에서와 같이 30개 아미노산 길이 미만일 수도 있다.
용어 "이소펩티드 결합"은 카르복실 또는 카르복사미드기 및 아미노기 사이의 아미드 결합을 지칭하며, 이들 중 적어도 하나는 단백질 주사슬로부터 유래되지 않거나 대안적으로 볼 때 단백질 골격의 일부가 아니다. 이소펩티드 결합은 단일 단백질 내에서 형성할 수 있거나 두 개 펩티드 또는 펩티드와 단백질 사이에서 생길 수 있다. 따라서, 이소펩티드 결합은 단일 단백질 내 분자 내에서 형성할 수 있거나, 분자 간에서, 즉, 두 펩티드/단백질 분자 사이에서, 예를 들어, 두 펩티드 링커 사이에서 형성할 수 있다. 통상적으로, 이소펩티드 결합은 리신 잔기와 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 또는 글루탐산 잔기 또는 단백질 또는 펩티드 사슬의 말단 카르복실기 사이에서 생길 수 있거나, 단백질 또는 펩티드 사슬의 알파-아미노 말단과 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민 또는 글루탐산 사이에서 생길 수 있다. 이소펩타이드 결합에 관련된 쌍의 각각의 잔기는 본원에서 반응성 잔기로서 지칭된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 이소펩티드 결합은 리신 잔기와 아스파라긴 잔기 사이 또는 리신 잔기와 아스파르트산 잔기 사이에 형성될 수 있다. 구체적으로, 이소펩타이드 결합은 리신의 측쇄 아민과 아스파라긴의 카르복사미기또는 아스파르트산염의 카르복실기 사이에서 생길 수 있다.
SpyTag:SpyCatcher 시스템은 미국 특허 제9,547,003호 및 Zakeri 등 (2012) PNAS 109:E690-E697에 기술되어 있고, 각각 그 전체는 참조로서 본원에 통합되며, Streptococcus pyogenes 피브로넥팅 결합 단백질 FbaB의 CnaB2 도메인으로부터 유도된다. 도메인을 분할함으로써, Zakeri 등은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가진 112개의 아미노산 폴리펩티드인 그 동족 단백질 "SpyCatcher"에 아미드 결합을 형성하는 AHIVMVDAYKPTK(서열 번호 1) 서열을 가진 펩티드 "SpyTag"를 수득하였다. (전술한 문헌 Zakeri (2012)). CnAb2 도메인으로부터 유도된 추가의 특이적 결합 쌍은 SpyTag:KTag이며, SpyLigase의 존재 하에 이소펩타이드 결합을 형성한다. (Fierer (2014) PNAS 111:E1176-1181) SpyLigase는 반응성 리신을 함유하는 SpyCatcher로부터 β가닥을 잘라내고, 아미노산 서열 ATHIKFSKRD(서열 번호 2)를 갖는 10개 잔기 펩티드 태그인 KTag를 생성함으로써 조작되었다. SpyTag002:SpyCatcher002 시스템은 Keeble 등(2017) Angew Chem Int Ed Engl 56:16521-25에 기술되어 있고, 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. SpyTag002는 서열 번호 54에 제시된 아미노산 서열 VPTIVMVDAYKRYK을 가지며, SpyCatcher002(서열 번호 55)와 결합한다.
SnoopTag:SnoopCatcher 시스템은 Veggiani(2016) PNAS 113:1202-07에 기술되어 있다. Streptococcus pneumoniae의 부착부인, RrgA의 D4 Ig 유사 도메인은 분할되어 SnoopTag(잔기 734~745, 서열 번호 5) 및 SnoopCatcher(잔기 749~860)을 형성한다. SnoopTag 및 SnoopCatcher의 인큐베이션은 상보적 단백질들 사이에 특이적인 자발적인 이소펩티드 결합을 초래한다. 전술한 문헌 Veggiani(2016).
isopeptag:pilin-C 특이적 결합 쌍은 Streptococcus pyogenes의 주요 필린 단백질 Spy0128로부터 유도된다. (Zakeir 및 Howarth(2010) J. Am. Chem. Soc. 132:4526-27). Isopeptag는 서열 번호 7로 제시된 아미노산 서열 TDKDMTITFTNKKDAE를 가지며, pilin-C(Spy0128의 잔기 18-299)에 결합한다. SnoopTag 및 SnoopCatcher의 인큐베이션은 상보적 단백질들 사이에 특이적인 자발적인 이소펩티드 결합을 초래한다. 전술한 문헌 Zakeir 및 Howarth(2010).
용어 "펩티드 태그"는 (1) 펩티드 태그에 태그된 단백질에 이종성이고, (2) 이소펩티드 결합을 형성할 수 있는 특이적 단백질:단백질 결합 쌍의 구성원이며, (3) 50개 이하의 아미노산 길이인 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "표적 세포"는 관심 뉴클레오티드의 발현이 필요한 임의의 세포를 포함한다. 바람직하게는, 표적 세포는 그 표면에서 수용체를 나타내는데, 이는 후술하는 바와 같이, 표적화 리간드를 사용해 세포를 표적화할 수 있게 한다.
용어 "형질도입" 또는 "감염" 등은 바이러스 벡터에 의해 표적 세포 내로 핵산을 도입하는 것을 지칭한다. 형질도입 등과 관련된 용어 효율(efficiency), 예를 들어, "형질도입 효율(transduction efficiency)"은 관심 뉴클레오티드를 포함하는 설정된 개수의 바이러스 벡터로 인큐베이션한 후 관심 뉴클레오티드를 발현하는 세포의 분획(예: 백분율)을 의미한다. 형질전환 효율을 결정하는 잘 알려진 방법은, 형광 리포터 유전자를 이용한 형질도입 세포의 형광 활성화 세포 분류, 관심 뉴클레오티드의 발현에 대한 PCR 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "야생형"이라는 용어는 "정상"(돌연변이, 질환, 변형 등과 대조됨) 상태로 자연계에서 발견되는 것과 동일하거나 그러한 맥락의 구조 및/또는 활성을 가진 엔티티를 포함한다. 당업자는 야생형 바이러스 벡터, 예컨대 야생-형 캡시드 단백질이 비교 연구에서 기준 바이러스 벡터로서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 기준 바이러스 캡시드 단백질/캡시드/벡터는 시험 대상인 효과가 변한다는 것 외에는 시험 바이러스 캡시드 단백질/캡시드/벡터와 동일하다. 예를 들어, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 시험 바이러스 벡터에 삽입하는 것의 효과(예: 형질도입 효율)를 결정하기 위해, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원이 존재하는 것 외에는 모든 경우(예컨대, 추가 돌연변이, 관심 뉴클레오티드, 바이러스 벡터 및 타겟 세포의 개수 등)에 있어서 시험 바이러스 벡터와 동일한 기준 바이러스 벡터(필요에 따라, 적절한 표적화 리간드가 존재하거나 부재할 수 있음)의 형질도입 효율과 시험 바이러스 벡터(적절한 표적화 리간드가 존재하거나 부재할 수 있음)의 형질도입 효율을 비교할 수 있다.
본원에 기술된 재표적화 전략은 전술된 스캐폴드 및 직접적인 재조합적 접근법의 이점을 제공하며, 둘 다에 내재된 많은 단점을 해결한다. 전략은 특이적 결합 쌍을 사용하며, 제1 구성원 및 제2 동족 구성원은 서로에 특이적으로 결합하고, 결합시, 바이러스 입자와 동족 구성원에 융합된 임의의 표적화 리간드에 영구적으로 연결하는 공유 결합을 형성한다. 이러한 유전적으로 변형된 바이러스 입자의 경우, 바이러스 캡시드가 온전하게 유지되는 한, 방성이 유지되는데, 예를 들어, 다른 스캐폴드 접근법과 비교하여 본원에서 제공되는 시스템의 한 가지 장점은 "어댑터"(예를 들어, 표적화 리간드)가 직접적인 재조합적 접근법과 유사한 재조합 바이러스 입자에 결합되는 것이 영구성이다. 그러나, 직접 재조합적 접근법과는 대조적으로, 본원에 기술된 시스템은 재조합 바이러스 입자가 어댑터에서 발견되는 가변성으로 일정하게 유지될 수 있다는 점에서 스캐폴드 어댑터 접근법의 유연성을 유지하는데, 예를 들어, 동족 구성원은 상이한 표적화 리간드 및 상이한 융합 단백질에 융합될 수 있고, 그런 다음 표적 세포에 따라 바이러스 입자에 결합될 수 있다.
재조합 바이러스 캡시드 단백질 및 바이러스 벡터 및 핵산
본원에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하는 이종 아미노산 서열을 제시하기 위해 유전적으로 변형된 재조합 바이러스 입자(예를 들어, 바이러스 캡시드 단백질, 및 재조합 바이러스 캡시드, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 벡터)를 제공하며, 아미노산 서열은 50개 미만의 아미노산 길이이고, 재조합 바이러스 캡시드/입자 단백질은 감소 내지 제거된 자연 향성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 특이적 결합 쌍의 제2 동족 구성원을 추가로 포함하되, 제1 및 제2 구성원은 공유적으로 결합되고, 제2 구성원은 표적화 리간드에 융합된다.
일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 특이적 결합 쌍의 제1 구성원 및 하나 이상의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 링커의 측면으로 위치한 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하는데, 예를 들어, 이종 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단까지 제1 링커, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원, 제2 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 각각 독립적으로 적어도 1개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 링커는 동일하다.
일반적으로, 본원에 기술된 바와 같은 (예를 들어, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원 그 자체 또는 하나 이상의 링커와의 조합된 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하는) 이종 아미노산 서열은 약 5개 아미노산 내지 약 50개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 5개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 6개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 7개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 8개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 9개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 10개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 11개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 12개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 13개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 14개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 15개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 16개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 17개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 18개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 19개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 20개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 21개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 22개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 23개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 24개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 25개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 26개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 27개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 28개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 29개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 30개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 31개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 32개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 33개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 34개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 35개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 36개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 37개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 38개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 39개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 40개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 41개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 42개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 43개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 44개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 45개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 46개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 47개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 48개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 49개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 적어도 50개 아미노산의 길이이다.
일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍은 SpyTag:SpyCatcher 결합 쌍이되, 제1 구성원은 SpyTag이고, 제2 동족 구성원은 SpyCatcher이다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍은 SpyTag:KTag이고, 여기서 제1 구성원은 SpyTag이고, 제2 동족 구성원은 KTag이다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍은 SpyTag:KTag이되, 제1 구성원은 KTag이고, 제2 동족 구성원은 SpyTag이다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍은 isopeptag:pilin-C이되, 제1 구성원은 isopeptag이고, 제2 동족 구성원은 pilin-C이다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍은 SnoopTag:SnoopCatcher이되, 제1 구성원은 SnoopTag이고, 제2 동족 구성원은 SnoopCatcher이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 Ad 캡시드 단백질, 예를 들어, Ad1, Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, 및 Ad7로 이루어진 군으로부터 선택된 Ad 혈청형의 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 Ad2 캡시드 유전자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 Ad5 캡시드 유전자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 Ad 바이러스 캡시드 단백질은 섬유 단백질 도메인 내에, 예를 들어, 섬유 단백질의 카복시 말단에, 섬유 노브에, 및/또는 섬유 노브의 HI 루프에 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 아데노-연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질 유전자로부터 유래되며, 예를 들어, 상기 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV9로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 혈청형의 캡시드 유전자이다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 유전자 또는 AAV9 캡시드 유전자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 유전적으로 변형된 AAV2 VP1 캡시드 단백질이며, 이의 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 9로서 제시된다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 유전적으로 변형된 AAV9 VP1 캡시드 단백질이며, 이의 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 31로서 제시된다.
일반적으로, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 바이러스 캡시드 단백질은, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원이 캡시드 단백질 또는 이를 포함하는 캡시드의 자연 향성을 감소시키고/시키거나 제거하도록 재조합 캡시드 단백질에 삽입되고/삽입되거나 이에 의해 제시되는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함한다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원은 야생형 기준 캡시드 단백질의 자연 향성에 관여하는 캡시드 단백질의 영역, 예를 들어, 세포 수용체에 관여하는 캡시드 단백질의 영역에 삽입된다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원은 Ad 섬유 단백질의 노브 도메인에 삽입되고/되거나 그에 의해 제시된다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원은 Ad 섬유 단백질의 HI 루프에 삽입되고/되거나 그에 의해 제시된다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원은 AAV2 캡시드 단백질 VP1의 G453, AAV2 캡시드 단백질 VP1의 N587, AAV9 캡시드 단백질 VP1의 G453, 및 AAV9 캡시드 단백질 VP1의 A589로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치 다음에 삽입된다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원은 AAV2 VP1 캡시드의 아미노산 N587 및 R588 사이에 삽입되고/되거나 그에 의해 제시된다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드, 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터, 및/또는 재조합 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물은 서열 번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 35, 37, 또는 39로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. AAV2를 사용하여 식별된 적절한 추가 삽입 부위는 당업계에 잘 알려져 있으며(Wu 등 (2000) J. Virol. 74:8635-8647) I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713 및 I-716. 을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713, I-716, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 삽입된 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하는 AAV2 캡시드 단백질일 수 있다. 추가의 AAV 혈청형을 사용하여 식별된 적절한 추가 삽입 부위는 잘 알려져 있으며 I-587(AAV1), I-589(AAV1), I-585(AAV3), I-585(AAV4), 및 I-585(AAV5)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 I-587(AAV1), I-589(AAV1), I-585(AAV3), I-585(AAV4), I-585(AAV5), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 삽입된 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하는 AAV2 캡시드 단백질일 수 있다.
본원에 사용된 명명법 I-###은 삽입 부위를 지칭하고, ###은 AAV 캡시드 단백질의 VP1 단백질에 대해 상대적인 아미노산 수를 명명하는 것이지만, 이러한 삽입은 바로 N- 또는 C-말단에 위치하거나, 주어진 아미노산 중 N- 또는 C- 말단의 5개 아미노산 서열에서 C-말단으로부터 1개 아미노산의 위치, 바람직하게는 3개, 더 바람직하게는 2개, 특히 주어진 아미노산의 N- 또는 C-말단으로부터 1개 아미노산의 위치에 위치할 수 있다. 또한, 본원에서 언급되는 위치는 AAV 캡시드 유전자에 의해 암호화된 VP1 단백질에 상대적인 것이며, 상응하는 위치(및 이의 돌연변이)는 기준 AAV 캡시드 유전자에 의해 암호화되는 VP1, VP2 및 VP3 단백질의 서열 정렬을 수행함으로써 캡시드 유전자에 의해 암호화되는 VP2 및 VP3 캡시드 단백질에 대해 쉽게 식별될 수 있다.
따라서, 캡 유전자를 이들 부위 중 하나의 코딩 핵산의 상응하는 위치에 삽입하는 것은 VP1, VP2, 및/또는 VP3에 삽입하는 결과를 초래하는데, 이는 캡시드 단백질이 엇갈린 시작 코돈과 동일한 유전자의 중첩 해독 프레임에 의해 암호화되기 때문이다. 그러므로, 예를 들어 본 명명법에 따른 AAV2의 경우, 아미노산 1과 138 사이에서의 삽입은 VP1에만 삽입되고, 138과 203 사이에서의 삽입은 VP1 및 VP2에 삽입되며, 203과 C-말단 사이에서의 삽입은 VP1, VP2, 및 VP3에 삽입되는데, 이는 삽입 부위 I-587에도 당연히 적용되는 경우이다. 따라서, 본 발명은 VP1, VP2 및/또는 VP3 단백질에 상응하는 삽입을 갖는 AAV의 구조적 유전자를 포함한다.
추가적으로, 적어도 큰 스트레치의 보존과 밀접하게 관련된 가족 구성원의 큰 구성원로 인해, 열거된 AAV를 제외한 AAV에 대한 상응하는 삽입 부위는 아미노산 정렬을 수행하거나 캡시드 구조를 비교함으로써 식별될 수 있다. 예를 들어, Rutledge 등 (1998) J. Virol. 72:309-19 및 미국 특허 제9,624,274호를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)는 바이러스 벡터의 자연 향성을 감소시키거나 제거하는데, 예를 들어, 야생형 기준 바이러스 벡터 및/또는 표적 세포에 의해 자연적으로 감염될 수 있는 세포의 형질도입은 적절한 표적화 리간드에 융합되어 있는 결합 쌍의 제2 동족 구성원과 공유 결합의 부재 시 감지할 수 없다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은, 예컨대 야생형 기준 바이러스 벡터에 의한 감염을 허용하는 성질을 가진 세포의 형질도입과 비교하여, 바이러스 벡터의 자연 향성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 5%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 5%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 10%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 20%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 30%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 40%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 50%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 60%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 70%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 80%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 90%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 95%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)은 바이러스 벡터의 자연 향성을 적어도 90%만큼 감소시킨다. 구현예에서, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원의 삽입(제시)이 재조합 바이러스 캡시드의 자연 향성을 완벽히 제거하지 않는 이들 구현예에서, 이러한 재조합 바이러스 캡시드의 자연 향성은 제2의 다른 돌연변이에 의해 추가로 감소될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 AAV9 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함할 수 있으며, 돌연변이, 예를 들어, W503A 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
바이러스의 국소 투여나 국소 영역 투여와 대조적으로 바이러스의 전신 투여가 의도되는 경우, 바이러스를 이의 천연 숙주 세포로부터 탈표적화degargeting)하는 것이 특히 중요한데, 이는 천연 숙주 세포에 의한 바이러스 벡터의 흡수가 바이러스 벡터의 유효 투약량을 제한하기 때문이다. AAV2 및 AAV6의 경우, HSPG가 다수의 세포, 특히 간 세포에서의 바이러스 흡수를 위한 일차 수용체인 것으로 보고된다. AAV2 HSPG-결합 활성은 5개의 염기성 아미노산, R484, R487, R585, R588 및 K532의 군에 달려있다(Kern 등, (2003) J Virol. 77(20):11072-81). 따라서, 바람직한 점 돌연변이는 천연 수용체에 의해 매개된 주어진 표적 세포에 대한 바이러스 벡터의 형질도입 활성을(표적 세포에 바이러스 벡터의 결합을 위한 1차 수용체가 HSPG인 경우) 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80%, 특히 적어도 95%만큼 감소시키는 것들이다.
결과적으로, HSPG-결합 바이러스 벡터를 위해 바람직한 추가 돌연변이는 A, D, G, Q, S, 및 T와 같은 비염기성 아미노산, 바람직하게는 A 또는 상이하지만 고도로 보존된 AAV 혈청형의 상응하는 위치에 존재하는 아미노산에 의해(상기 AAV 혈청형은 이 위치에서 염기성 아미노산이 없음) 염기성 아미노산, 예컨대 R, K, 또는 H, 바람직하게는 각 바이러스의 HSPG 결합에 관여하는 R 또는 K를 삭제시키거나 대체하는 그런 돌연변이들이다. 결과적으로, 바람직한 아미노산 치환은 R484A, R487A, R487G, K532A, K532D, R585A, R585S, R585Q, R585A 또는 R588T이고, 특히 AAV2의 경우 R585A 및/또는 R588A이고, AAV6의 경우 K531A 또는 K531E이다. 본 발명의 하나의 특히 바람직한 구현예는, 2개의 점 돌연변이 R585A 및 R588A를 추가로 함유하는 AAV2의 이러한 캡시드 단백질 돌연변이체들인데, 이러한 2개의 점 돌연변이가 HSPG 결합 활성을 상당한 정도로 절단하기에 충분하기 때문이다. 이들 점 돌연변이는 HSPG-발현 세포로부터의 효율적인 탈표적화를 가능하게 하는데, 이는 표적화를 위해 각 돌연변이체 바이러스의 새로운 표적 세포에 대한 특이성을 증가시킨다.
표적화 리간드
본원에 기술된 바이러스 입자는 재조합 바이러스 캡시드 단백질 내에 삽입되거나그에 의해 제시되는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원과 공유 결합을 특이적으로 형성하는 특이적 결합 쌍의 제2 구성원을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 제2 구성원은 표적화 리간드에 융합된다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 세포 표면에서 발현된 수용체, 예를 들어, (인간) 진핵 세포(예: 표적 세포) 상의 세포 표면 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 간 세포에 의해 주로(예를 들어, 단독으로) 발현되는 수용체와 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 뇌 세포에 의해 주로(예를 들어, 단독으로) 발현되는 수용체와 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 림프구에 의해 주로(예를 들어, 단독으로) 발현되는 수용체와 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) T 세포에 의해 주로(예를 들어, 단독으로) 발현되는 수용체와 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) B 세포에 의해 주로(예를 들어, 단독으로) 발현되는 수용체와 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 수지상세포에 의해 주로(예를 들어, 단독으로) 발현되는 수용체와 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 대식 세포에 의해 주로(예를 들어, 단독으로) 발현되는 수용체와 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) NK 세포에 의해 주로(예를 들어, 단독으로) 발현되는 수용체와 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 신장 세포에 의해 주로(예를 들어, 단독으로) 발현되는 수용체와 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 암세포에 의해 주로(예를 들어, 단독으로) 발현되는 수용체와 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 이종 병원균으로 감염된 (인간) 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 수용체에 결합한다.
표적화 리간드에 의해 적절하게 표적화될 수 있고, 이에 이용할 수 있는 표적화 리간드(예: 항체 또는 이의 일부분)가 이미 존재하는, 다수의 세포 표면 단백질, 예를 들어, 세포 표면 수용체가 있다. 이러한 구조는 다음을 포함하되 이들로 한정되지 않는다: 클래스 I 및 클래스 II 주요 조직적합성 항원; 다양한 사이토카인(예: IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33 등에 대한 수용체), 세포-유형 특이적 성장 호르몬, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 섬모체 신경성 인자(CTNF), 콜로니 자극 성장 인자, 내피 성장 인자, 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 교질 유래 신경영양 인자, 교질 성장 인자, gro-베타/mip 2, 간세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 인터페론(α-IFN, β-IFN, γIFN, 공통 IFN), 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14), 각질세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 대식세포/단핵구 화학주성 활성화 인자, 신경 성장 인자, 호중성 활성화 인자 2, 혈소판 유래 성장 인자, 줄기 세포 인자, 형질변환 성장 인자, 종양 괴사 인자. 혈관 내피 성장 인자, 및 지질 단백질에 대한 수용체로서, PRLR과 같은 추가 막관통 수용체 또는 다른 1형의 막관통 수용체, GCGR과 같은 G-단백질 결합된 수용체, Nav1. 7, ASIC1 또는 ASIC2와 같은 이온 채널을 포함하는, 수용체; 세포 접착 분자; 아미노산과 같은 대사 산물의 수송 분자; B- 및 T-림프구의 항원 수용체(예: B 세포 수용체 및 결합 단백질(예: CD19, CD20 등) 및 T 세포 수용체 및 결합 단백질(예: CD3, CD4, CD8 등)); 테트라스패닌 단백질(예: CD63). 본원에 기술된 재조합 바이러스 캡시드는, 바이러스 벡터 복합체로서의 분화 세포 표면 항원에 결합하는 표적화 리간드를 사용함으로써 세포 유형의 특이적 감염을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 간 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 간 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 뇌 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 뇌 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 조혈 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 조혈 세포 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) T 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 T 세포 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) B 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 B 세포 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 수지상 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 수지상 세포 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 대식 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉, 대식 세포 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) NK 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 NK 세포 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 신장 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 신장 세포 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 췌장 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 췌장 세포 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 장 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 장 세포 특이적 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 암세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질, 즉 종양 관련 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 이종 병원균으로 감염된 (인간) 세포에 의해 주로(예를 들어, 전적으로) 발현되는 단백질에 결합한다. 단백질로서, (1) 세포/조직/기관에 의해 특이적으로 발현되거나, 세포/조직/기관에서 발현이 풍부해지는 단백질, 및 (2) 본원에 기술된 바와 같은 표적화 리간드로서 유용한 항원 결합 단백질에 의해 인식되는 단백질은 잘 알려져 있고, www.proteinatlas.org에서도 찾아볼 수 있으며; 이에 관해서는 Uhlen 등 (2010) Nat. Biotech. 28:1248-50을 또한 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 하기 표 2는, 표적화 리간드로서 유용할 수 있는 항원 결합 단백질을 이용할 수 있는 예시적이고 비-제한적인 조직 특이적 마커 및 이러한 마커를 발현하는 세포/조직/기관을 제공한다.
예시적인 조직 특이적 마커
조직 조직　특이적　마커
간 ATP　결합　카세트　하위군　B;　구성원　11　(ABCB11)
알라닌-글리옥실레이트　아미노전이효소(AGXT)
알코올　탈수소효소　1A,　클래스　I(ADH1A)
알코올　탈수소효소　4　(클래스　II)　pi　폴리펩티드(ADH4)
아밀로이드　P　성분,　혈청(APCS)
안지오포이에틴　유사　3(ANGPTL3)
아포지단백질;　C1,　C2(APOC1,　APOC2)
APOC4-APOC2
아시알로당단백질　수용체　1(ASGR1)
아시알로당단백질　수용체　2(ASGR2)
담즙산-CoA:　아미노산　N-아세틸트랜스퍼라아제(BAAT)
보체　C8　베타　사슬(C8B)
응고　인자　II,　트롬빈(F2)
시토크롬　P450　패밀리　1　서브　패밀리　A　멤버　2　CYP1A2
만노오스　결합　렉틴　2(MBL2)
가용성　담체　유기　음이온　수송체　패밀리　구성원　1B3(SLCO1B3)
파라옥소나아제　3(PON3)
트랜스페린　수용체　2(TFR2)
우로카닌산　수화효소　1(UROC　1)
장 지방산　결합　단백질　6(FABP6)
췌장 CUB　및　투명대　유사　도메인　1(CUZD1)
프로테아제,　세린　2(PRSS2)
프로테아제,　세린　3(PRSS3)
일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 간 세포에 의해 발현된 수용체, 예를 들어, 아시알로당단백질 수용체(예: hASGR1)에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 뇌 세포에 의해 발현된 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) T 세포, 예를 들어, CD3(예: CD3ε)에 의해 발현된 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 신장 세포에 의해 발현된 수용체에 결합한다. 예시. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 근 세포, 예를 들어, 인테그린에 의해 발현된 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 (인간) 암세포, 예를 들어, E6 및 E7과 같은 종양 관련 항원에 의해 발현된 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 인간 글루카곤 수용체(hGCGR)에 결합한다.
일부 구현예에서, 표적화 리간드는 종양 세포에 의해 발현된 종양-관련 항원에 결합한다. 특이적인 종양 관련 항원의 비 제한적인 예로는, 예를 들어, AFP, ALK, BAGE 단백질, β-카테닌, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, 탄산무수화효소 IX, 카스파제-8, CCR5, CD19, CD20, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, cyclin-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGEE 단백질(예컨대 GAGE-1, GAGE-2), GD2, GD3, GloboH, 글리피칸-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, MAGE 단백질(예컨대, MAGE-1 , MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-6, 및 MAGE-12), MART-1, 메소텔린, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE 단백질, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, 서바이빈, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 및 유로플라킨-3이 포함된다.
일부 구현예에서, 표적화 리간드는 면역 반응과 관련된 CD 마커, 예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 등에 결합한다.
본 발명의 일 구현예는 본 발명의 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 다량체 구조이다. 다량체 구조는 본원에 기술된 바와 같은 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 10개, 더 바람직하게는 적어도 30개, 가장 바람직하게는 적어도 60개의 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함한다. 이들은 규칙적인 바이러스 캡시드(공 바이러스 입자) 또는 바이러스 벡터(관심 뉴클레오티드를 캡슐화하는 캡시드)를 형성할 수 있다. 바이러스 게놈을 포장할 수 있는 바이러스 벡터를 형성하는 것은 본원에 기술된 재조합 바이러스 캡시드를 바이러스 벡터로서 사용하기 위해 매우 바람직한 특징이다.
본 발명의 일 구현예는 전술한 바와 같은 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산이다. 핵산은 바람직하게는 청구된 핵을 포함하는 벡터이다. 핵산, 특히 벡터는 본 발명의 캡시드 단백질을 재조합적에 의해 발현시키는데 필수적이다.
본 발명의 추가 구현예는 적어도 하나의 재조합 바이러스 캡시드 단백질 및/또는 이를 암호화하는 핵산의 용도, 바람직하게는 유전자 전달 벡터를 제조하기 위한, 그리고 유전자 전달 벡터로서 사용하기 위한 적어도 하나의 다량체 구조(예를 들어, 바이러스 벡터)의 용도이다.
사용 방법 및 제조 방법
본원에 기술된 재조합 바이러스 캡시드 단백질의 추가 구현예는, 관심 뉴클레오티드(예: 리포터 유전자 또는 치료 유전자)를 표적 세포에 전달하기 위한 이들의 용도이다. 일반적으로, 관심 뉴클레오티드는 전달 플라스미드일 수 있고, AAV 벡터 내에 포함될 때 바이러스 또는 비-바이러스 프로모터에 의해 조절될 수 있는 리포터 유전자(들) 또는 치료적 유전자(들)의 측면에 위치하는 5' 및 3' 역위 말단 반복(ITR) 서열을 일반적으로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 5'에서 3'까지 5' ITR, 프로모터, 유전자(예: 리포터 및/또는 치료 유전자) 및 3' ITR을 포함하는 전달 플라스미드이다.
유용한 프로모터의 비-제한적인 실시예는, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV)-프로모터, 비장 병소 형성 바이러스(SFFV)-프로모터, 전사 신장 인자 1 알파(EF1a)-프로모터(1. 2 kb EFla-프로모터 또는 0. 2 kb EFla-프로모터), 키메라 EF 1 a/IF4-프로모터, 및 포스포-글리세린산 키나아제(PGK)-프로모터를 포함한다. 관심 유전자의 발현을 증가시키기 위해 바이러스 작제물 내에 내부 인핸서가 존재할 수도 있다. 예를 들어, CMV 인핸서(Karasuyama 등 1989. J. Exp. Med. 169:13 참조; 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CMV 인핸서는 닭 β-액틴 프로모터와 조합하여 사용될 수 있다.
다양한 리포터 유전자(또는 검출 가능한 모이어티)는 본원에 기술된 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 다량체 구조 내에 캡슐화될 수 있다. 예시적인 리포터 유전자는, 예를 들어, -갈락토시다아제(암호화된 lacZ 유전자), 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP), MmGFP, 청색 형광 단백질(BFP), 강화된 청색 형광 단백질(eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, 황색 형광 단백질(YFP), 강화된 황색 형광 단백질(eYFP), 에머랄드(Emerald), CyPet, 홍색 형광 단백질(CFP), 진청색(Cerulean), T-Sapphire, 루시퍼라제(luciferase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 기술된 방법은, 녹색 형광 단백질을 암호화하는 리포터 유전자를 사용해 표적화 벡터를 작제하는 것을 보여주지만, 본 개시를 읽음으로써 당업자는 본원에 기술된 비인간 동물이 리포터 유전자 없이 또는 당업계에 알려진 임의의 리포터 유전자를 사용해 생성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
또한, 다양한 치료 유전자가 본원에 기술된 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 다량체 구조에, 예를 들어 전달 벡터의 일부로서 캡슐화될 수 있다. 치료 유전자의 비-제한적인 실시예는 독소(예를 들어, 자살 유전자), 치료 항체 또는 이의 단편, CRISPR/Cas 시스템 또는 이의 일부분(들), 안티센스 RNA, siRNA, shRNA 등을 암호화하는 것들을 포함한다.
본 발명의 추가 구현예는 재조합 캡시드 단백질의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
a) 적절한 조건 하에서 재조합 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계, 및
b) 단계 a)의 발현되는 캡시드 단백질을 단리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 입자는 모자이크 캡시드, 예를들어, 본원에 기술된 바와 같이 유전적으로 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 (표적화 리간드와 공유 결합의 부재 또는 존재 시) 기준 캡시드 단백질과 함께 특정 비율로 포함한다. 이러한 모자이크 바이러스 입자를 제조하는 방법은
a) 적절한 조건 하에서 1:1 및 10:1의 비율(wt/wt)로 재조합 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산과 기준 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드를 발현하는 단계, 및
b) 단계 a)의 발현되는 캡시드 단백질을 단리하는 단계를 포함한다.
일반적으로 말하면, 방법에 따라 형성된 모자이크 캡시드는 변형된 캡시드 단백질:기준 캡시드 단백질 비율을 갖는 것으로 간주되며, 상기 비율은 모자이크 캡시드를 생성하는데 사용된 것과 동일하게 암호화하는 핵산의 비율과 유사하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 재조합 바이러스 캡시드 단백질 및 기준 캡시드 단백질을 1:1 내지 1:15 범위의 비율로 포함하거나, 본원에 기술된 방법은 재조합 바이러스 캡시드 단백질 및 기준 캡시드 단백질(또는 기준 캡시드 단백질의 조합)을 1:1 내지 1:15 범위의 비율로 조합한다. 일부 구현예에서, 비율은 1:2이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:3이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:4이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:5이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:6이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:7이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:8이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:9이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:10이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:11이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:12이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:13이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:14이다. 일부 구현예에서, 비율은 1:15이다.
본 발명의 추가 구현예는 바이러스의 향성을 변경시키는 방법으로서, 상기 방법은: (a) 이종 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 삽입하여 이종 아미노산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 형성하는 단계 및/또는 (b) 바이러스 벡터를 생산하기에 충분한 조건에서 포장 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 여기서 포장 세포는 핵산을 포함한다. 본 발명의 추가 구현예는 캡시드 단백질의 표면에 표적 리간드를 제시하는 방법으로서, 상기 방법은: (a) 적합한 조건 하에서 본원에 기술된 바와 같이 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산(및 임의로는 기준 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드)을 발현시키는 단계(여기서 핵산은 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하는 캡시드 단백질을 암호화함), (b) 단계 (a)의 특이적 결합 쌍의 제1 구성원 또는 그를 포함하는 캡시드를 포함하는 발현된 캡시드 단백질을 단리하는 단계, 및 (c) 제1 및 제2 구성원 사이에 이소펩티드 결합의 형성을 허용하는 적절한 조건 하에서 특이적 결합 쌍의 제2 동족 구성원을 가진 캡시드 단백질 또는 캡시드를 인큐베이팅하는 단계를 포함하며, 여기서 특이적 결합 쌍의 제2 동족 구성원은 표적화 리간드와 융합된다.
일부 구현예에서, 포장 세포는 관심 뉴클레오티드를 포함하는 헬퍼 플라스미드 및/또는 전달 플라스미드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 배양 상청액으로부터 자기-상보성 아데노-연관 바이러스 벡터를 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 포장 세포를 용해시키고 세포 용해물로부터 단일-가닥 아데노-연관 바이러스 벡터를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 세포 찌꺼기를 제거하는 단계, (b) 바이러스 벡터를 함유하는 상청액을 핵산 분해 효소(예를 들어, DNase I) 및 MgCl2로 처리하는 단계, (c) 바이러스 벡터를 농축시키는 단계, (d) 바이러스 벡터를 정제하는 단계, 및 (e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합을 추가로 포함한다.
본원에 기술된 바이러스 벡터의 생산에 유용한 포장 세포는, 예를 들어, 바이러스를 허용하는 동물 세포, 또는 바이러스를 허용하도록 변형된 세포; 또는, 예를 들어, 인산칼슘과 같은 형질전환제를 사용하는 포장 세포 작제물을 포함한다. 본원에 기술된 바이러스 벡터를 생산하는 데 유용한 포장 세포주의 비-제한적인 실시예는, 예를 들어, 인간 배아 신장 293(HEK-293) 세포(예를 들어, American Type Culture Collection[ATCC] 번호 CRL-1573), SV40 큰 T-항원을 함유하는 HEK-293 세포(HEK-293T 또는 293T), HEK293T/17 세포, 인간 육종 세포주 HT-1080(CCL-121), 림프아세포-유사 세포주 Raji(CCL-86), 교아세포종-성상세포종 상피-유사 세포주 U87-MG(HTB-14), T-림프종 세포주 HuT78(TIB-161), NIH/3T3 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)(예: ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), HeLa 세포(예: ATCC 번호 CCL-2), 베로 세포, NIH 3T3 세포(예: ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포(예: ATCC 번호 CCL10), PC12 세포(ATCC 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포(ATCC 번호 CRL1651), RATI 세포, 마우스 L 세포(ATCC 번호 CCLI. 3), HLHepG2 세포, CAP 세포, CAP-T 세포 등을 포함한다.
Cosset 등의 (1995) J Virol 69,7430-7436에서 개략적으로 서술된 FLY 바이러스 포장 세포 시스템인 L929 세포는 NS0 (쥐 골수종) 세포, 인간 양수 세포(예: CAP, CAP-T), 효모 세포(S. 세레비시애, 피히시아 파스토스), 식물 세포(예를 들어, 이에 한정되지 않지만, S. 세레비시에, 피치아 파스토리스를 포함하되 이들로 한정되지 않음), 식물 세포(담배 NTI, BY-2를 포함하되 이들로 한정되지 않음), 곤충 세포(SF9, S2, SF21, Tni (예: High 5)를 포함하되 이들르 한정되지 않음), 또는 박테리아 세포(대장균을 포함하되 이들로 한정되지 않음)를 포함한다.
추가적인 포장 세포 및 시스템, 핵산 게놈을 위형화된 바이러스 벡터 내에 포장하기 위한 포장 기술 및 벡터에 대해서는, 예를 들어, Polo 등의 Proc Natl Acad Sci USA, (1999) 96:4598-4603을 참조한다. 포장 방법은 바이러스 성분을 영구적으로 발현하는 포장 세포를 사용하는 단계, 또는 세포를 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키는 단계를 포함한다.
추가의 구현예는 표적 세포에 바이러스를 재유도하고/하거나 리포터 또는 치료 유전자를 표적 세포에 전달하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 세포를 시험관 내에서 또는 생체 내에서 형질도입하는 방법을 포함하고, 상기 방법은: 본원에 기술된 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터와 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 캡시드는 표적 세포에 의해 발현된 수용체에 특이적으로 결합하는 표적화 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 시험관 내에 있다. 다른 구현예에서, 표적 세포는 대상체, 예를 들어, 인간의 생체 내에 있다.
표적 세포
매우 다양한 세포가 본원에 개시된 바와 같은 재조합 바이러스 벡터를 사용해 관심 뉴클레오티드를 전달하기 위해 표적화될 수 있다. 표적 세포는 일반적으로 관심 뉴클레오티드 및 원하는 효과를 기준으로 선택되게 된다.
일부 구현예에서, 관심 뉴클레오티드가 전달되어 표적 세포가 효소 결핍이나 면역 결핍(예: X-염색체 관련 중증 복합 면역결핍)과 같은 결핍을 보전하기 위한 단백질을 유기체에서 생산하게 할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 동물에서 단백질을 정상적으로 생산하게 되는 세포가 표적화된다. 다른 구현예에서, 단백질이 가장 유익한 영역 내의 세포가 표적화된다.
다른 구현예에서, siRNA를 암호화하는 유전자와 같은 관심 뉴클레오티드는 표적 세포에서 특정 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 관심 뉴클레오티드는, 예를 들어, 병원체 수명 주기에 관여하는 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 따라서, 병원균에 쉽게 감염될 수 있는 세포 또는 병원균에 감염된 세포가 표적화될 수 있다. 다른 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 표적 세포에서 독소의 생산을 담당하는 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
다른 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 독성 단백질을 발현한 세포를 죽이는 독성 단백질을 암호화할 수 있다. 이 경우, 종양 세포 또는 다른 원하지 않는 세포가 표적화될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 치료 단백질을 암호화하는 관심 뉴클레오티드가 있다.
관심 뉴클레오티드의 발현이 요구되는 표적 세포의 특정 집단이 식별된 경우, 표적 세포의 해당 집단에서 특이적으로 발현되는 표적 수용체가 선택된다. 표적 수용체는 해당 세포 집단에서만 배타적으로 발현되거나, 다른 세포 집단에서보다 더 큰 정도로 해당 세포에서 발현될 수 있다. 발현이 더 특이적일수록, 더 특이적인 전달이 표적 세포로 유도될 수 있다. 상황에 따라, 마커의 원하는 특이성의 양(따라서, 원하는 유전자 전달의 양)은 달라질 수 있다. 예를 들어, 독성 유전자를 도입하는 경우, 비-표적화된 세포를 죽이지 않도록 높은 특이성이 가장 바람직하다. 전체적인 충격이 요구되는 수확용 단백질의 발현 또는 분비 산물의 발현의 경우, 더 낮은 마커 특이성이 필요할 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 표적 수용체는 표적화 리간드가 식별되거나 생성될 수 있는 임의의 수용체일 수 있다. 바람직하게는 표적 수용체는 수용체와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 그러나, 다른 구현예에서, 표적 수용체는 결합 파트너에 의해 인식될 수 있는 탄수화물 또는 다른 분자일 수 있다. 표적 수용체의 결합 파트너(예: 리간드)가 이미 알려져 있는 경우, 이를 친화도 분자로서 사용할 수 있다. 그러나, 결합 분자가 알려지지 않은 경우, 표준 절차를 사용해 표적 수용체에 대한 항체를 생성할 수 있다. 이어서, 항체는 표적화 리간드로서 사용될 수 있다.
따라서, 표적 세포는, 예를 들어, (1) 특정 응용 분야(예: 치료, 수집될 단백질의 발현, 및 질병 내성의 부여) 및 (2) 원하는 양의 특이성을 갖는 마커의 발현을 포함하여, 다양한 인자를 기준으로 선택될 수 있다.
표적 세포는 어떤 식으로도 제한되지 않으며, 생식선 세포와 세포주 및 체세포와 세포주 둘 다를 포함한다. 표적 세포는 둘 중 어느 하나의 기원으로부터 유래된 줄기 세포일 수 있다. 표적 세포가 생식선 세포인 경우, 표적 세포는 바람직하게는 단일 세포 배아 및 배아 줄기 세포(ES)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
약학적 조성물, 투약 형태 및 투여
추가적인 실시예는 본 발명에 따른 적어도 하나의 재조합 바이러스 캡시드 단백질 및 적절한 표적화 리간드 및/또는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 약제를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 약물은 유용한 유전자 전달 입자이다.
본원에 기술된 바이러스 입자를 포함하는 약제학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제가 또한 본원에 개시된다. 또한, 본원에 기술된 바이러스 입자를 포함하는 약학적 투약 형태가 본원에 개시된다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본원에 기술된 바이러스 입자는 다양한 치료 용도(생체 내 및 생체 외)에 사용될 수 있고 연구 도구로서 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바이러스 입자에 기초한 약학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 사용해 임의의 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 바이러스 입자는, 예를 들어, 주입, 흡입 또는 (입이나 코를 통한) 흡인 투여용으로 제형화되거나, 경구, 구강, 비경구, 또는 직장 투여용으로 제형화되거나, 종양에 대한 직접 투여용으로 제형화될 수 있다.
약학적 조성물은 전신, 국소 또는 국지화 투여를 포함하는 다양한 투여 모드에 맞게 제형화될 수 있다. 기술 및 제형에 대해서는, 예를 들어 Remrning's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa에서 확인할 수 있다. 전신 투여의 경우, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 및 피하 주사를 포함하는 주사가 바람직하다. 주사의 목적으로, 약학적 조성물은 액체 용액으로, 바람직하게는 생리학적으로 양립 가능한 완충액, 예컨대 행크액(Hank's solution) 또는 링거액(Ringer's solution)으로 제형화될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 고체 형태로 제형화되어 사용 직전에 재용해하거나 현탁할 수 있다. 약학적 조성물의 동결건조된 형태도 적합하다.
경구 투여의 경우, 약학적 조성물은, 예를 들어, 결합제(예: 미리 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 필러(예: 락토오스, 미정질 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예: 스테아린산마그네슘, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예: 감자 전분 또는 전분 글리콜산나트륨); 또는 습윤제(예: 라우릴황산나트륨)와 같은 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 종래 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 코팅될 수도 있다. 경구 투여용 액체 제제는, 예를 들어, 용액, 시럽, 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 사용 전에 물이나 다른 적합한 비히클과 섞을 수 있도록 건조 제품으로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 약제학적으로 허용 가능한 첨가제, 예컨대 현탁제(예: 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체, 또는 수소화 식용 지방); 유화제(예: 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예: 아티온드 오일(ationd oil), 유성 에스테르, 에틸 알코올, 또는 분획된 식물성 오일); 및 보존제(예: 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 함께 종래 수단에 의해 제조될 수 있다. 상기 제제는 적당량의 완충염, 향미제, 착색제, 및 감미제를 함유할 수도 있다.
약학적 조성물은 주사에 의한 비경구 투여, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투약 형태로, 예를 들어 앰플로 제공되거나 임의로 첨가되는 보존제와 함께 다중 투약 용기에 제공될 수 있다. 약학적 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 또는 유화액으로서 추가로 제형화될 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함하는 다른 제제를 함유할 수 있다.
또한, 약학적 조성물은 데포 제제로서 제형화될 수도 있다. 이러한 장기 작용성 제형은 이식(예: 피하 이식 또는 근육 내 이식)에 의하거나 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적절한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용 가능한 오일 내의 유화액), 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화 되거나, 난용성(sparingly soluble) 유도체로서, 예를 들어, 낭용성 염으로서 제형화될 수 있다. 다른 적절한 전달 시스템은 연장된 기간에 걸쳐 약물의 비침습적 국소 전달을 가능하게 하는 미소구체를 포함한다. 이러한 기술은 전모세관 크기를 갖는 미소구체를 포함할 수 있는데, 이는 염증이나 허혈을 일으키지 않고 관상 동맥 카테터를 통해 기관의 임의의 선택된 부분 내에 주입될 수 있다. 투여된 치료제는 미소구체로부터 서방출되어 선택된 조직에 존재하는 주변 세포에 의해 흡수된다.
전신 투여는 또한 점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 점막 또는 경피 투여의 경우, 침투 대상 장벽에 적합한 침투제가 제제에 사용한다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어, 점막 투여의 경우, 담즙염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 또한, 투과를 용이하게 하는 세제가 사용될 수 있다. 점막 투여는 비강 분무나 좌제를 사용하여 이뤄질 수 있다. 국소 투여의 경우, 본원에 기술된 바이러스 입자는 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같은 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 치유를 가속화하기 위해 부상이나 염증을 치료하기 위한 세척액이 국소적으로 사용될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 형태는: 멸균 수용액이나 분산액; 참기름, 땅콩유, 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사 용액이나 분산액을 즉석에서 제조하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에, 이러한 형태는 반드시 멸균 상태여야 하고 반드시 유체여야 한다. 이는 제조 및 특정 저장 파라미터(예: 냉장 및 냉동)의 조건 하에서 반드시 안정적이어야 하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대항하도록 보존되어야만 한다.
본원에 개시된 제형이 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 치료제로서 사용되는 경우, 치료제는 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노기와 함께 형성됨)을 포함하고, 예를 들어, 염산이나 인산과 같은 무기산과 함께 형성되거나, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성된다. 유리 카복실기와 함께 형성된 염은, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화제이철과 같은 무기 염기로부터 유도될 수도 되고, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수도 있다.
담체는 용매일 수도 있고, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 분산 매질일 수도 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입자의 크기를 유지함으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물의 작용을 방지하는 것은 당업계에 공지된 다양한 항박테리아제 및 항진균제에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 당이나 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사식 조성물의 장시간 흡수는 스테아린산 알루미늄 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 조성물에 사용함으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사액은, 필요량의 활성 화합물 또는 작제물을, 필요에 따라, 위에서 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 혼입한 다음, 멸균 여과함으로써 제조할 수 있다.
제형화 시, 용액은 투약식 제형과 비슷한 방식으로, 및 치료적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 제형은 전술한 주사액의 유형과 같은 다양한 투약 형태로 쉽게 투여되지만, 서방성 캡슐이나 극미립자 및 미소구체 등도 사용될 수 있다.
예를 들어, 수용액을 비경구 투여하는 경우, 필요 시, 용액을 적절히 완충해야만 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 포도당으로 등장화시켜야 한다. 이들 특정 수용액은 정맥 내, 종양 내, 근육 내, 피하, 및 복강 내 투여에 특히 적합하다. 이러한 맥락에서, 사용할 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 1회 투약량을 용해시킨 다음, 1000 ml의 피하주입용 유체에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주입할 수 있다.
모든 경우에 있어서, 개별 대상체에게 적절한 투여량은 투여 담당의가 결정하게 된다. 예를 들어, 병원성 유기체에 대한 노출의 필요성 또는 대상체의 병태(예를 들어 암)에 따라, 대상체에게는 본원에 기술된 바이러스 입자가 일정 기간 동안 매일, 주별로 투여되거나, 월별로 투여되거나, 2년에 한 번 또는 매년 투여될 수 있다.
정맥 내, 종양 내, 피 내, 또는 근육 내 주사와 같은 비경구 투여용으로 제형화된 화합물 이외에, 약학적으로 허용 가능한 다른 형태는, 예를 들어, 경구 투여용 정제 또는 기타 고형분; 리포솜 제형; 지속 방출 캡슐; 생분해성 형태 및 현재 사용되는 임의의 다른 형태를 포함한다.
비강내 투약식 또는 흡입식 용액이나 분무제, 에어로졸 또는 흡입제를 사용할 수도 있다. 비강 용액은 비강 통로에 점적 또는 분무에 의해 투여되도록 설계된 수용액일 수 있다. 비강 용액은 많은 부분에서 비강 분비물과 유사하도록 제조될 수 있다. 따라서, 수성 비강 용액은 일반적으로 등장성이며 5. 5 내지 7. 5의 pH를 유지하도록 약간 완충된다. 또한, 안과 제제에 사용되는 것들과 유사한 항균 보존제, 및 필요에 따라 적절한 약물 안정화제가 제형에 포함될 수 있다. 다양한 상업적 비강 제제가 알려져 있고, 예를 들어, 항생제 및 항히스타민제를 포함할 수 있으며, 이들은 천식 예방에 사용된다.
경구 제형은 부형제를, 예를 들어, 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등으로서 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방성 제형, 또는 분말의 형태를 취한다. 정의된 특정 구현예에서, 경구용 약학적 조성물은 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체를 포함하게 되거나, 경질 또는 연질-쉘의 젤라틴 캡슐에 둘러싸이거나, 압착되어 정제로 만들어지거나, 식단의 음식과 함께 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료제의 투여를 위해, 활성 화합물을 부형제와 혼입하여 섭취 가능한 정제, 구강용 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다.
정제, 트로키, 알약, 캡슐 등은 다음을 함유할 수도 있다: 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산이칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제; 및 수크로오스, 락토오스 또는 사카린과 같은 감미제. 이 외에도 페페민트, 윈터그린 오일 또는 체리향과 같은 향미제를 첨가할 수도 있다. 투약 단위 형태가 캡슐일 때, 전술한 유형의 물질에 추가로 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅제로서 존재하거나, 투약 단위의 물리적 형태를 달리 변경할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 셸락, 당 또는 둘 모두로 코팅될 수 있다. 엘릭서 시럽은 활성 화합물을 함유할 수 있는데, 예를 들어, 감미제로서 수크로오스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라멘, 체리향 또는 오렌지향과 같은 염색 및 향미제를 함유할 수 있다.
본원에 개시된 추가 구현예는 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 키트를 포함할 수 있다. 키트는 적절한 용기, 예를 들어, 바이알, 튜브, 미니- 또는 마이크로퓨지 튜브, 시험 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기를 포함할 수도 있다. 추가의 성분이나 제제가 제공되는 경우, 키트는 이러한 제제 또는 성분이 배치될 수 있는 하나 이상의 추가 용기를 포함할 수 있다. 본원의 키트는 또한 일반적으로 바이러스 입자를 담기 위한 수단 및 상업적 판매를 위한 밀폐식 시약 용기를 포함할 것이다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 유지되는 사출식 용기 또는 취입 성형식 용기를 포함할 수 있다. 임의로는, 예를 들어, 항염증제, 항바이러스제, 항진균제나 항세균제, 또는 항-종양제와 같은 하나 이상의 추가 활성제가 기술된 조성물에 필요할 수도 있다.
본원에 개시된 조성물은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 정맥 내, 종양 내, 피 내, 동맥 내, 복강 내, 병소 내, 두개 내, 관절 내, 전립선 내, 흉막 내, 기관 내, 비강 내, 유리체 내, 질 내, 직장 내, 국부적으로, 종양 내, 근육 내, 경막 내, 피하, 결막 하, 소포 내, 점막, 심막 내, 배꼽 내, 안구 내, 경구, 국소적으로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 주입에 이해, 연속 주입에 의해, 국소 관류에 의해, 카테터를 통해, 세척을 통해, 크림으로, 또는 지질 조성물로 대상체에게 투여되는 것을 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 임의의 방법이 본원에 기술된 바이러스 입자, 포장 세포 및 입자 작제물의 대규모 생산에 사용될 수 있다. 예를 들어, 마스터 시드 스톡 및 작업용 시드 스톡은 GMP 조건 하에, 검정된 일차 CEF에서 제조되거나 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 포장 세포는 큰 표면적의 플라스크에 도말되어, 증식에 가깝게 성장될 수 있고, 바이러스 입자가 정제될 수 있다. 세포를 수확하여, 바이러스 입자를 단리되고 정제된 배양 배지 내로 방출할 수 있거나, 세포 내 바이러스 입자를 기계적으로 파괴하여 방출할 수 있다(세포 찌꺼기는 큰 기공 심층 여과(large-pore depth filtration)로 제거하고, 숙주 세포 DNA는 엔도뉴클레아제로 소화함). 바이러스 입자를 후속하여 정제하고, 접선 유동 여과에 이어서 투석 여과에 의해 농축할 수 있다. 생성된 농축된 벌크를 안정화제가 포함된 완충액으로 희석시켜 제형화하고, 바이알로 채우고, 동결 건조시킬 수 있다. 조성물 및 제형은 추후 사용을 위해 저장할 수 있다. 사용하기 위해, 동결 건조된 바이러스 입자에 희석제를 첨가하여 이를 재구성할 수 있다.
병용 요법에 사용되는 특정 추가 제제를 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 제형화하여 투여할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물은 알루미늄염 및 기타 광물 보조제, 텐소액티브제(tensoactive agent), 박테리아 유도체, 비히클 및 사이토카인과 같은 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 길항성 면역 조절 특성을 가질 수도 있다. 예를 들어, 보조제는 Th1 또는 Th2 면역성을 자극할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 조성물 및 방법은 보조제 요법을 포함할 수도 있다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시를 위해 제공되며 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않는다.
재료 및 방법
세포주 및 항체
모든 293 세포주를 10% FBS, 1% Pen/Strep, 및 1% L-글루타민을 보충한 DMEM에 유지하였다. 293 hErbB2 및 293hASGR1/2 세포주를 상응하는 cDNA를 발현하는 벡터를 가진 293 모세포주를 렌티 바이러스에 형질도입하여 만들어냈다. 모든 세포주는 Regeneron TC core facility로부터 수득하였다. B1 항체는 AAV VP1, VP2 및 VP3에 의해 공유되는 선형 에피토프를 인식한다.
AAV 캡시드 단백질 구성물
원하는 SpyTag 삽입을 암호화하고, 링커 아미노산 및 추가적인 돌연변이에 측면으로 위치하는 GeneBlock을 IDT로부터 구입하였고, 제조업자의 프로토콜(NEB)에 따른 Gibson Assembly를 사용하여 pAAV2-CAP wt 또는 pAAV9-CAP wt를 소화시킨 BsiWI 및 XcmI 내에 복제하였다.
SpyCatcher와 항체의 융합
SpyCatcher를 암호화하는 GeneBlock을 IDT로부터 구매하였고, Gibson Assembly를 사용하여 유연한 아미노산 링커 GSGESG(서열 번호 48)에 의해 분리되는, 각 구성물의 C 말단에서 scFv 또는 항체 중쇄에 대한 발현 플라스미드 내에서 암호화한 프레임 내 서열을 복제하였다.
AAV 바이러스 벡터의 제조
바이러스를 다음의 플라스미드(scFv 또는 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 추가적인 플라스미드와 함께 또는 플라스미드 없이 pAd Helper, 리포터 단백질을 암호화하는 AAV2 ITR 함유 게놈 플라스미드, 및 AAV Rep와 Cap 유전자를 암호화하는 pAAV-CAP 플라스미드)로 PEI Pro를 사용한 293T 포장 세포를 형질감염시킴으로써 만들어냈다. scFv 및 항체 중쇄 구성물을 전술한 C 말단에서 SpyCatcher에 모두 융합한다. 형질감염을 OptiMEM에서 수행하였고, 배지를 10% FBS, 1% Pen/Strep, 및 1% L-Glut를 보충한 DMEM으로 8시간 후에 변경하였다.
형질감염된 포장 세포를 3일 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, 표준 동결-융해 프로토콜을 사용한 세포 용해물로부터 수집하였다. 간단히 말해서, 포장 세포를 긁어내고 펠릿으로 들어 올렸다. 상등액을 제거하고, 세포를 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 및 2 mM MgCl2[pH 8. 0]의 용액에 재현탁시켰다. 3회의 연속 동결-융해 사이클을 통해 세포 용해를 유도함으로써 세포 내 바이러스 입자들을 방출시켰으며, 상기 동결-융해 사이클은 드라이 아이스/에탄올 조와 격렬하게 와류가 있는 37℃수조 사이의 세포 현탁액을 왕복하는 것으로 이루어진다. 점도를 60분 동안 37℃에서, 간헐적으로 혼합하며 EMD Millipore Benzonase(세포 용해물 50 U/ml)로 용해물을 처리함으로써 감소시켰다. 그런 다음 파편을 원심분리에 의해 펠렛화하고, Ultracel-100 membrane(100 KDa MWCO) 필터 카트리지가 있는 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit의 상부 챔버 내로 직접, 생성된 상층액을 0. 22 μm PVDF Millex-GV 필터를 통해 여과하였다. 필터 유닛을 상부 챔버에서 원하는 부피가 될 때까지 5~10분 간격으로 원심분리하였고, 그런 다음 농축된 조(crude) 바이러스를 저 단백질 결합 튜브 내로 피펫팅하고, 4℃에서 보관하였다. 알려진 농도의 바이러스의 표준 곡선을 사용하여 qPCR에 의해 역가(밀리리터당 바이러스 게놈, vg/mL)를 결정하였다.
세포 감염/형질도입 및 유동 세포 측정 분석법
세포, 바이러스 입자를 감염시키기 위해, 배양 중인 세포 배지에 직접적으로 추가하였고, 혼합물을 37
Figure pct00001
에서 밤새 배양하였다. 각 웰에서의 배지를 24시간 후에 교체하였고, 세포를 5일 동안 배양하였다. 감염 후 5일 째에, 세포를 트립신 처리하고, 2% FBS가 있는 PBS에 재현탁시키고, GFP+ cells의 백분율을 BD FACSCanto 유동 세포 측정기에서 수집하고, FlowJo 소프트웨워를 사용하여 분석하였다.
웨스턴 블롯 분석법
SpyTagged AAV 단백질 VP1, VP2 및 VP3와 SpyCatcher가 태그된 항체 또는 scFv 사이의 반응을 웨스턴 블롯 분석법으로 관찰하였다. 환원제가 있는 Novex® Tris-Glycine SDS 시료 완충액을 동일한 부피의 조 바이러스 제조물에 첨가하고, 시료를 85℃에서 5분 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시키고 프리-캐스트 4~12% Tris-글리신 겔(Invitrogen)에 로딩하였다. 단백질을 환원 SDS-PAGE로 분리하였고, 습식 전사를 통해 PVDF 상에 블롯팅하였다. 멤브래인을 Li-Cor Odyssey TBS Blocking 완충액으로 차단하고, 4℃에서 밤새 TBST에서 1:100으로 희석시킨 마우스 단클론 B1 항체(ARP American Research Products, Inc. )로 탐지하였다. 블롯을 TBST로 세척하고, 적외선 영역이 콘쥬게이션된 항-마우스 이차 항체로 탐지하고, Li-Cor Odyssey 상에서 촬영하였다.
실시예 1 잔기 N587에서 AAV2 캡시드 내로 삽입된 펩티드에 scFv의 콘쥬게이션은 항원 특이적 표적화를 유도한다.
각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트 1개에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-hrGFP 4 ug
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4 ug
유무
pCMV-C6. 5-SpyCatcher 4 ug
전술한 바와 같이 바이러스 입자로 배양한 세포를 감염에 대한 유동 세포 측정 분석법에 의해 평가하였다.
헤파린 결합 돌연변이(HBM) R585A 및 R588A 뿐만 아니라, 캡시드 위치 N587에서 SpyTag 펩티드를 지니는 AAV2를 C6. 5-SpyCatcher의 존재 또는 부재 시에 생산하였으며, HER2에 결합한 scFv를 이러한 C-말단에서 SpyCatcher에 융합한다. HER2 표적화 scFv에 콘쥬게이션된 AAV2는 HER2+ 세포를 특이적으로 감염시키고, HER2- 세포의 배경 감염은 매우 적게 나타난다. 도 1.
실시예 2 잔기 N587에서 AAV2 캡시드 내로 삽입된 펩티드에 항체의 콘쥬게이션은 항원 특이적 표적화를 유도한다.
각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트 1개에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-hrGFP 4 ug
pAAV2-CAP wt 4 ug
또는
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4 ug
유무
p항-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5 ug
p항-HER2 Vk 3 ug
헤파린 결합 돌연변이(HBM) R585A 및 R588A 뿐만 아니라, 캡시드 위치 N587에서 SpyTag 펩티드를 지니는 야생형 AAV2 및 AAV2를 SpyCatcher-허셉틴을 암호화하는 항체 중쇄 및 경쇄의 존재 또는 부재 시에 생산하였으며, HER2에 결합한 항체를 중쇄의 C-말단에서 SpyCatcher에 융합한다. 전술한 바와 같이 바이러스 입자로 감염시킨 세포를 유동 세포 측정 분석법에 의해 평가하여 형질도입을 관찰하였다. HER2 표적화 항체에 콘쥬게이션된 AAV2는 HER2+ 세포를 특이적으로 감염시키고, HER2- 세포의 배경 감염은 매우 적게 나타난다. 도 2.
실시예 3 잔기 G453에서 AAV2 캡시드 내로 삽입된 펩티드에 항체의 콘쥬게이션은 항원 특이적 표적화를 유도한다.
잔기 N587 및 G453 각각을 비리온 표면으로부터 멀리 연장되는 단백질 스파이크를 형성하는 AAV2 캡시드의 노출 영역에 놓는다. 잔기를 두개의 상이한 스파이크에 놓아두면서, 잔기 G453 후에 삽입된 SpyTag가 잔기N587 후에 삽입된 SpyTag와 같은 방식으로 기능하는지 여부를 조사하였다. 각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트 1개에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-hrGFP 4 ug
pAAV2-CAP G453 SpyTag HBM 0.5 ug
pAAV2-CAP R585A R588A HBM 3.5 ug
또는
pAAV2-CAP wt 4 ug
유무
p항-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5 ug
p항-HER2 Vk 3 ug
헤파린 결합 돌연변이(HBM) R585A 및 R588A 뿐만 아니라 캡시드 위치 G453에서 SpyTag 펩티드를 지니는 야생형 AAV2 및 AAV2를 SpyCatcher-허셉틴을 암호화하는 항체 중쇄 및 경쇄의 존재 또는 부재 시에 생산하였으며, HER2에 결합한 항체를 중쇄의 C-말단에서 SpyCatcher에 융합한다. 바이러스를 SpyTag 발현 캡시드와 HBM 캡시드를 혼합함으로써 모자이크로 생산하였다. 전술한 바와 같이 바이러스 입자로 감염시킨 세포를 유동 세포 측정 분석법에 의해 평가하여 형질도입을 관찰하였다. HER2 표적화 항체에 콘쥬게이션된 AAV2는 HER2+ 세포를 특이적으로 감염시키고, HER2- 세포의 배경 감염은 매우 적게 나타난다. 도 3
실시예 4 scFv에 의해 AAV 비리온의 증가된 변형은 그들의 감염성을 감소시킨다.
SpyTag-SpyCatcher 반응의 효율을 최적화하기 위한 노력으로, 바이러스의 표면에서 SpyTag의 접근성을 각 측면에 유연한 링커 아미노산을 가진 펩티드 태그를 측면으로 위치시킴으로써 향상시켰다. 링커 길이를 증가시킴으로써 측면으로 위치시킨 N587 SpyTag 삽입 돌연변이체의 패널을 만들어 냈고, C6. 5-SpyCatcher의 존재 또는 부재 시 이 AAV2 Rep-Cap 구성물을 사용하여 바이러스를 제조하였으며, HER2와 결합한 scFv를 그의 C-말단에서 SpyCatcher에 융합시켰다. SpyTag된 AAV2 단백질 VP1, VP2, 및 VP3와 SpyCatcher가 태그된 C6. 5 사이의 반응을 웨스턴 블롯에 의해 관찰하였으며, SpyCatcher가 태그된 scFv와 반응하는 SpyTag된 캡시드 단백질은 SDS-PAGE에 의해 크기의 증가를 나타낸다. 전술한 바와 같이 바이러스 입자로 감염시킨 세포를 유동 세포 측정 분석법에 의해 평가하여 형질도입을 측정하였다.
각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트 1개에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-hrGFP 4 ug
p항-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5 ug
p항-HER2 Vk 3 ug
pAAV2-CAP N587 링커 X SpyTag 4 ug
pAAV2-CAP N587 링커 SpyTag 구성물은 다음을 포함한다:
pAAV2-CAP N587 링커 1 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 2 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 4 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 6 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 8 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 10 SpyTag HBM
SpyTag가 링커 아미노산의 측면으로 위치하지 않을 때, VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv 복합체를 웨스턴 블롯에 의해 감지할 수 없으며, 바이러스는 HER2+ 세포의 낮은 수준의 특이적 형질도입을 달성하였다. 도 4. 링커 길이가 증가함에 따라(1~6개 아미노산), VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv 복합체는 웨스턴 블롯팅을 통해 검출되기 시작하였고, 바이러스의 형질도입 효율은 증가하였다. 도 4. 그러나, SpyTag가 두 개의 가장 긴 링커(8~10개 아미노산)의 측면으로 위치할 때, 거의 모든 VP 단백질이 SpyCatcher-Vh와 웨스턴 블롯팅에 의해 반응하였지만, 이러한 완전하게 장식된 바이러스는 더 이상 세포를 효율적으로 형질도입시키지 않았다. 도 4. 그러므로, scFv에 의한 AAV 입자의 과변형은 표적 세포를 형질도입하는 그들의 능력에 유해하고, 콘쥬게이션된 scFv의 오직 적은 수만 표적 세포에 바이러스를 재표적하기 위해 요구되는 것으로 보였다.
실시예 5 항체에 의해 AAV 비리온의 증가된 변형은 그들의 감염성을 감소시킨다.
링커 길이를 증가시킴으로써 측면으로 위치시킨 N587 SpyTag 삽입 돌연변이체의 패널을 사용하여, 바이러스를 HER2와 결합하고, 중쇄의 C-말단에서 SpyCatcher에 융합된 항체인 SpyCatcher-허셉틴을 암호화하는 항체 중쇄 및 경쇄의 존재 및 부재 시 이 AAV2 Rep-Cap 구성물을 사용하여 제조하였다. SpyTag된 AAV 단백질 VP1, VP2, 및 VP3와 SpyCatcher가 태그된 허셉틴 중쇄(Vh) 사이의 반응을 웨스턴 블롯에 의해 관찰하였으며, SpyCatcher가 태그된 항체와 반응하는 SpyTag된 캡시드 단백질은 SDS-PAGE에 의해 크기 이동을 나타낼 것이다.
각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트 1개에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-hrGFP 4 ug
p항-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5 ug
p항-HER2 Vk 3 ug
pAAV2-CAP N587 링커 X SpyTag 4 ug
pAAV2-CAP N587 링커 SpyTag 구성물은 다음을 포함한다:
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 1 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 2 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 4 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 6 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 8 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 링커 10 SpyTag HBM
SpyTag를 링커 아미노산의 측면으로 위치시키지 않거나 매우 짧은 아미노산의 측면으로 위치시키지 않을 때, VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh 복합체를 웨스턴 블롯팅에 의해 감지할 수 없었으나, 바이러스는 야생형 수준에 근접하는 효율로 HER2+ 세포를 특이적으로 감염시켰다. 도 5. 그러나, SpyTag가 더 긴 링커(6개 아미노산 또는 그 이상)의 측면으로 위치할 때, 거의 모든 VP 단백질이 SpyCatcher-Vh와 웨스턴 블롯팅에 의해 반응하였지만, 이러한 완전하게 장식된 바이러스는 더 이상 감염되지 않았다. 도 5. 항체에 의한 AAV 입자의 변형이 증가하는 것은 표적 세포를 형질도입하는 그들의 능력에 유해하고, 콘쥬게이션된 항체의 오직 적은 수만 표적 세포에 바이러스를 재표적하기 위해 요구된다.
실시예 6 모자이크 현상은 바이러스 입자의 형질도입 효율을 조절한다.
길고, 유연한 링커는 SpyCatcher가 융합된 scFv와 SpyTag된 AAV 캡시드의 효율적인 반응을 하도록 하지만, scFv에 의한 AAV 입자의 과변형은 표적 세포를 형질도입시키는 그들의 능력에 유해하며, 각 비리온 상 SpyTag의 수를 감소시키는 반면, SpyTag 접근성 및 효율적인 반응성을 (모두 R585A R588A 헤파린 결합 돌연변이(HBM)를 지니고 있는) 비-SpyTag된 캡시드 구성물과 고반응성 SpyTag된 구성물의 상이한 비율의 혼합물인 모자이크 AAV 입자를 만들어 냄으로써 유지하였다. 각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트 1개에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-hrGFP 4 ug
pCMV-C6. 5-SpyCatcher 4 ug
다양한 비율의:
pAAV2-CAP N587 링커 10 SpyTag HBM X ug
pAAV2-CAP R585A R588A X ug
또는
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-hrGFP 4 ug
p항-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5 ug
p항-HER2 Vk 3 ug
다양한 비율의:
pAAV2-CAP N587 링커 10 SpyTag HBM X ug
pAAV2-CAP R585A R588A X ug
또는
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-hrGFP 4 ug
p항-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5 ug
p항-HER2 Vk 3 ug
다양한 비율의:
pAAV2-CAP G453 링커 X SpyTag HBM X ug
pAAV2-CAP R585A R588A X ug
pAAV2-CAP N587 링커 10 SpyTag HBM과 pAAV2-CAP R585A R588A 플라스미드 사이의 비율은 형질감염 혼합물에서 순수 pAAV2-CAP N587 링커 10 SpyTag HBM 비리온을 나타내는 1:0(4 ug:0 ug)이거나, 3:1(3 ug:1 ug), 1:1(2 ug:2 ug), 또는 1:3(1 ug:3 ug)이었다. pAAV2-CAP G453 링커 10 SpyTag HBM와 pAAV2-CAP R585A R588A 플라스미드 사이의 비율은 형질감염 혼합물에서 순수 pAAV2-CAP G453 링커 10 SpyTag HBM 비리온을 나타내는 1:0(4 ug:0 ug)이거나, 1:3(1 ug:3 ug), 또는 1:7(0. 5 ug:3. 5 ug)이었다. SpyTag된 AAV 단백질 VP1, VP2, 및 VP3와 SpyCatcher가 태그된 항-HER scFv 또는 SpyCatcher가 태그된 허셉틴 중쇄(Vh) 사이의 반응을 웨스턴 블롯에 의해 관찰하였으며, SpyCatcher가 태그된 scFv 또는 항체와 반응하는 SpyTag된 캡시드 단백질은 SDS-PAGE에 의해 크기 이동을 나타낼 것이다. SpyCatcher-항-HER2 scFv와 N587 SpyTag 링커 패널의 반응은 도 6에 나타나있다. SpyCatcher-항-HER2 항체와 N587 SpyTag 링커 패널의 반응은 도 7에 나타나있다. 전술한 모자이크 바이러스 입자로 감염시킨 세포를 유동 세포 측정 분석법에 의해 평가하여 형질도입을 측정하였다. 도 6~7. 고반응성 링커 10의 측면으로 위치하는 SpyTag 캡시드의 양이 감소할 때, 비-SpyTag된 캡시드의 수가 증가하였고, VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv 복합체의 양에서 감소를 웨스턴 블롯팅에 의해 관찰하였고, 감소는 바이러스의 형질도입 효율에서 증가와 결합되었다. 도 6~7. 비리온을 장식하는 항체 수와 재표적화된 바이러스를 갖는 형질도입 효율 사이의 반비례 관계를 입증하였다.
SpyCatcher-항-HER2 항체와 G453 SpyTag HBM 및 G453 링커 10 SpyTag HBM의 반응은 도 8에 나타나있다. G453에서 SpyTag 단독 또는 링커10에 의해 측면으로 위치한 SpyTag인 SpyTag 삽입은, 웨스턴 블롯팅에 의해 측정되는 SpyCatcher가 태그된 허셉틴과 매우 효율적으로 반응하였고, G453 삽입 부위는 링커 아미노산에 의해 측면으로 위치하지 않는 한 쉽게 반응하지 않는 N587보다 자연적으로 더 접근하기 쉽다. N587 링커 패널에서 관찰된 바와 같이, 바이러스가 SpyCatcher-허셉틴 항체에 의해 크게 변형되었을 때, 바이러스는 더 이상 감염되지 않았다. 따라서, 항체에 의한 AAV 입자의 변형은 타겟 세포를 형질도입하는 능력에 유해한 것으로 보이며, G453 이후에 삽입된 SpyTag는 N587에 삽입된 SpyTag보다 자연적으로 더 접근 가능하다는 결론을 내렸다.
실시예 7 SpyTag-SpyCatcher 시스템은 추가적인 항체 표적 쌍과 함께 사용되어 시험관 내 에서 특이적인 재표적화를 달성할 수 있다.
Her2 이외의 표적으로 AAV를 재표적화하는 SpyTag-SpyCatcher 접근법의 능력을 조사하였다. 추가적인 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 SpyCatcher가 태그된 항체를 복제하고, SpyTag된 AAV를 재이러한 추가적인 표적을 발현하는 세포 유형에 재표적하기 위한 이들 항체의 능력을 검사하였다. ASGR1 및 CD63을 표적화하는 실험을 위해, 각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트 1개에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-hrGFP 4 ug
pAAV2-CAP N587 링커 10 SpyTag HBM 0.5 ug
pAAV2-CAP R585A R588A 3.5 ug
다음의 유무와 무관함
SpyCatcher가 융합된 Vh 중쇄 플라스미드 1.5 ug
Vk 경쇄 플라스미드 3 ug
PTPRN을 표적화하는 실험을 위해, 각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트 1개에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-eGFP 4 ug
pAAV2-CAP G453 링커 10 SpyTag HBMx5 0.5 ug
pAAV2-CAP N587 Myc 3.5 ug
다음의 유무와 무관함
SpyCatcher가 융합된 Vh 중쇄 플라스미드 1.5 ug
Vk 경쇄 플라스미드 3 ug
ENTPD3 및 CD20을 표적화하는 실험을 위해, 각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트 1개에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-반딧불 루시퍼라제 4 ug
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4 ug
다음의 유무와 무관함
SpyCatcher가 융합된 Vh 중쇄 플라스미드 1.5 ug
Vk 경쇄 플라스미드 3 ug
인간 단백질 ASGR1, CD63, PTPRN, ENTPD3, 및 CD20을 인식하는 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 SpyCatcher-Vh 및 Vk 플라스미드를 시험하였다. 노출된 SpyTag의 수가 적은 모자이크 AAV 입자들을 만들어 내기 위해, SpyTag 및 비-SpyTag된 플라스미드는 항체를 사용하여 AAV 재표적화를 위한 비-SpyTag 캡시드에 SpyTag의 이상적인 비율로 사전에 검사된 형질감염 혼합물에서 1:7의 비율로 존재하였다. ASGR1, CD63 또는 PTPRN을 발현하는 세포를 전술한 모자이크 AAV2 입자로 감염시키고, 유동 세포 측정에 의해 형질도입을 측정하였다. ASGR1, CD63 및 PTPRN-특이적 항체에 콘쥬게이션된 AAV2는, ASGR1, CD63 및 PTPRN을, 각각 발현하는 동족 표적 세포를 특이적으로 감염시킬 수 있고, 항체가 없는 경우 매우 낮은 배경 감염을 나타냈다. ENTPD3 또는 CD20을 발현하는 세포를 전술한 AAV2 입자로 감염시키고, 표준 프로토콜을 사용하여 루시페라아제 분석에 의해 형질도입을 측정하였다. ENTPD3 및 CD20-특이적 항체에 콘쥬게이션된 AAV2는, ENTPD3 및 CD20을, 각각 발현하는 동족 표적 세포를 특이적으로 감염시킬 수 있고, 항체가 없는 경우 매우 낮은 배경 감염을 나타냈다. 도 9
실시예 8 SpyTag-SpyCatcher 시스템은 AAV9를 재표적화하기에 적합할 수 있다.
다른 AAV 혈청형에 대한 SpyTag-SpyCatcher 시스템의 적응성을 검사하였다. AAV9는 높은 역가 바이러스를 생성하는 널리 사용되는 혈청형이며 마우스 조직을 형질도입하는데 매우 효율적이다. AAV2가 헤파린 황산염 프로테오글리칸과 결합하고 AAV9가 갈락토오스와 결합하기 때문에, 수용체 결합에 중요한 잔기는 AAV2와 AAV9 사이에서 다르다. 수용체 결합에 중요한 것으로 알려진 잔기를 이용 가능한 문헌(Bell, C.L., Gurda, B.L., Van Vliet, K., Agbandje-McKenna, M., & Wilson, J.M.(2012). Identification of the galactose binding domain of the adeno-associated virus serotype 9 capsid. Journal of Virology, 86(13), 7326-7333. http://doi.org/10.1128/JVI.00448-12)으로부터 결정하였고, N470, D271, N272, Y446, 및 W503을 포함하였다. 이러한 단일 아미노산 돌연변이가 수용체 결합을 강력하게 감소시키기 때문에, W503A 돌연변이를 돌연변이체 구성물을 만들어 내는데 사용하기 위한 수용체 결합 돌연변이로서 선택하였다. AAV2 N587 및 G453을 놓아두는 것 내의 2개의 돌기(가변 루프)에 대해 이종상동성인 AAV9 캡시드의 영역도 식별하였으며, AAV9에서 상응하는 잔기는 A589 및 G453이다. 측면에 위치한 링커 아미노산, 및 수용체 결합 돌연변이 W503의 조합과 함께, 그리고 없이, SpyTag를 AAV9 캡시드 내의 이들 두 위치 내로 삽입하였다.
각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트 1개에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-eGFP 4 ug
p항-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5 ug
p항-HER2 Vk 3 ug
pAAV9 RC 플라스미드 총 DNA 4 ug
AAV9 wt, AAV9-CAP A589SpyT_W503A, AAV9-CAP A589링커10SpyT_W503A, 및 AAV9-CAP G453링커10SpyT_W503A에 대해, 각 플라스미드의 4 ug을 각각을 형질감염시키기 위해 사용하였다.
모자이크 바이러스의 경우, 3.5 ug의 pAAV9-CAP W503A 및 0.5 ug의 pAAV9-CAP A589링커10SpyT_W503A 또는 pAAV9-CAP G453링커10SpyT_W503A를 각각을 형질감염시키기 위해 사용하여 SpyTag 대 비-SpyTag된 Rep-Cap 플라스미드의 1:7 비율을 달성하였다.
세포 형질도입, 유동 세포 측정 분석법, 및 웨스턴 블롯 분석법을 전술한 바와 같이 수행하였다.
AAV9 RC A589 및 G453 SpyTag 삽입은 SpyCatcher-허셉틴과 반응을 지지하고 Her2+ 세포의 특이적 형질도입을 중재하였다. 도 10. AAV2와 유사하게, 측면으로 위치한 링커 없이 AAV9 RC A589에 삽입된 SpyTag는 매우 접근하기 쉽지 않았고 SpyCatcher와 잘 반응하지 않았다. 도 10. 그러나, SpyTag의 양편에 아미노산 링커의 추가는 SpyCatcher에 더욱 강력한 반응성을 허용하였으며, 약간의 고반응성 SpyTag를 가진 모자이크 입자가 표적 세포를 형질도입하는데 매우 효율적이었다. 도 10.
실시예 9: 생체 내 SpyTag된 AAV 입자- SpyCatcher-Vh 복합체의 재표적화
VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh가 생체 내에서 hASGR1을 발현하는 간 세포로 재표적화될 수 있는지 유무를 결정하기 위해, 마우스 간 세포가 C57BL/6 배경 및 대조군 야생형 마우스에서 hASGR1을 발현하도록 유전적으로 변형된 마우스한테 수용체 유전자(예: 녹색 형광 당백질 또는 반딧불 루시퍼라제)를 운반하는 야생형 AAV 단독 또는 VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh 바이러스 입자(순수 또는 모자이크 입자로, 그리고 아미노산 링커가 있거나 없이)를 정맥 내 주입하였다. 대조군은 인산염 완충 식염수(PBS)를 주입한 마우스를 포함한다. VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh가 간에 의해 탈표적화되고 다른 기관으로 재표적화될 수 있는지 유무를 결정하기 위해, 야생형 마우스에게 야생형 AAV 단독 또는 리포터 유전자, 예를 들어, 녹색 형광 단백질을 운반하는 VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh 바이러스 입자(모자이크 입자로서)를 정맥 내 주사하였다. 간에 의해 탈표화되고 다른 기관으로 재표적화되는 것을 입증하기 위해, 단백질 ENTP3을 선택하였는데, 이는 간에서 발현되는 것으로 알려져 있지 않지만, 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에 따르면(GenePaint.org http://www.informatics.jax.org/assay/MGI:5423021 및 Riken FANTOM5 프로젝트, 성체 마우스 데이터 세트로부터 추출된 데이터), 췌장 섬 세포(Syed 등 2013, Am J Physiol Endocrinol Metab 305: E1319-E1326, 2013) 및 혀와 같은, 다른 기관에서 발현되기 때문이다.
인간 CD3, 인간 CD63, 인간 ASGR1을 표적으로 하는 SpyCatcher가 태그된 항체(야생형 마우스에서 전혀 발현되지 않음) 또는 인간 ENTPD3(마우스 단백질을 또한 인식함)을 복제하였고, 생체 내에서 eGFP 또는 반딧불 루시페라제를 운반하는 SpyTag된 AAV2를 재표적화하는 이들 항체의 능력 조사하였다. 각각의 바이러스를 전술한 바와 같이 다음의 플라스미드와 다음의 양으로 293T 포장 세포의 15 cm 플레이트에 형질감염시킴으로써 만들어냈다:
항-인간 CD3/항-인간 ASGR1 GFP
pAd Helper 8 ug
pAAV-CAGG eGFP 4 ug
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4 ug
다음의 유무와 무관함
p항-CD3 또는 항-ASGR1 SpyCatcher Vh 1.5 ug
p항-CD3 또는 항-ASGR1 Vk 3 ug
항-인간 CD63/항-인간 ASGR1 루시페라제
pAd Helper 8 ug
pAAV-UbC- 반딧불 루시퍼라제 4 ug
pAAV2-CAP G453 링커 10 SpyTag HBMx5 0.5 ug
pAAV2-CAP N587 Myc 3.5 ug
다음의 유무와 무관함
p항-CD63 또는 항-ASGR1 SpyCatcher Vh 1.5 ug
p항-CD63 또는 항-ASGR1 Vk 3 ug
항-인간 ENTPD3/항-인간 ASGR1 GFP
pAd Helper 8 ug
pAAV-CMV-eGFP 4 ug
pAAV2-CAP G453 링커 10 SpyTag HBMx5 0.5 ug
pAAV2-CAP N587 Myc 3.5 ug
다음의 유무와 무관함
p항-ENTPD3 또는 항-ASGR1 SpyCatcher Vh 1.5 ug
p항-ENTPD3 또는 항-ASGR1 Vk 3 ug
인간 단백질 ASGR1, CD3, 또는 CD63을 인식하는 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 SpyCatcher-Vh 및 Vk 플라스미드를, 그들의 간 세포가 C57BL/6 배경에서 hASGR1을 발현하도록 유전적으로 변형된 마우스에서 시험하였다. 인간 단백질 ASGR1(비-표적화 대조군으로) 또는 마우스 및 인간 단백질 ENTPD3을 인식하는 항체를 암호화하는 SpyCatcher-Vh 및 Vk 플라스미드를 야생형 마우스에서 시험하였다. 감염 10일 후, 마우스를 희생시키고 리포터 유전자의 발현을 조사하였다; 간, 비장 및 신장을 고정하고 닭의 항-EGFP 항체(Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) 및 항-닭 이차 항체가 콘쥬게이션된 Alexa-488(Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA)로 염색하였다. 동물의 발광을 시험하기 위해서, 감염 14일 후, 살아있는 동물을 이소플루란을 사용하여 마취시키고, 루시페린 기재를 주입하고, IVIS 스펙트럼을 생체 내 이미징 시스템(PerkinElmer)을 사용하여 10분 후에 촬영하였다. 도 11 및 도 12는 AAV2 -SpyTag-SpyCatcher-Vh 복합체로의 감염을 hASGR1이 재표적화된 AAV를 주입하는 hASGR1 발현 마우스의 간에서만 검출하였고, hASGR1을 발현하지　않는 야생형 마우스의 간에서는 검출되지 않았음을 보여준다. 다른 장기에서 양성 EGF가 검출되지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
도 13은 야생형 마우스에서 hASGR1이 발현되지 않기 때문에, 비-표적화 대조군으로서 ENTPD3 또는 hASGR1을 표적으로 하는 항체에 콘쥬게이션된 AAV의 주입 다음 야생형 마우스의 간 및 췌장에서 eGFP 발현에 대한 면역조직화학 염색을 보여준다. 감염 4주 후, 감염된 동물로부터 장기를 수확하고, 48시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시킨 다음, 면역조직화학을 통해 eGFP를 염색하였다. 도 13은 AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh 복합체를 야생형 마우스 간으로부터 검출하였으며; 간에서 eGFP 발현의 유사한 결여를 나타내는 ENTPD3 및 hASGR1을 표적으로 하는 항체에 콘쥬게이션된 AAV를 모든 마우스에게 주입하였다. ENTPD3을 표적으로 하는 항체에 콘쥬게이션된 AAV를 주입한 마우스는, ENTPD3가 발현되는 것으로 여겨지는, 췌장 섬에서 eGFP를 발현하는 세포를 가졌다.
도 14는 hASGR1이 야생형 마우스에서 발현되지 않기 때문에, 비-표적화 대조군으로서 ENTPD3 또는 hASGR1을 표적으로 하는 항체에 콘쥬게이션된 AAV의 주입 다음 야생형 마우스의 간 및 혀에서 eGFP 발현에 대해 면역조직화학 염색을 보여준다. 감염 14일 후, 감염된 동물로부터 장기를 수확하고, 48시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시킨 다음, 면역조직화학을 통해 eGFP를 염색하였다. 도 14는 AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh 복합체를 야생형 마우스 간으로부터 검출하였으며; 간에서 eGFP 발현의 유사한 결여를 나타내는 ENTPD3 및 hASGR1을 표적으로 하는 항체에 콘쥬게이션된 AAV를 모든 마우스에게 주입하였다. 비-표적화 무관 항체(항-ASGR1)에 콘쥬게이션된 AAV가 주입된 모든 3마리 마우스는 혀에서 염색을 나타내지 않았지만, 항-ENTPD3에 콘쥬게이션된 AAV가 주입된 모든 3마리 마우스는 혀에서 eGFP 발현 세포를 나타냈으며, 여기서 ENTPD3은 발현되는 것으로 여겨진다.
실시예 10: 표적 리간드를 발현하는 세포에게 자살 유전자의 전달
또한, 표적화된 세포 유형에게 하나 이상의 자살 유전자, 생물학적 치료제(예: 항체), CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템, shRNA 등과 같은 치료 화물을 특이적으로 전달하는 VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh 복합체의 능력에 대해 설명한다.
특이적 세포에 자살 유전자를 전달하는 VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh 복합체의 능력을 시험하기 위해, Wang 등에 의해 기술된 HER2+ 유방암의 이종 이식 누드 마우스 모델을 사용한다(Wang 등 (2010) Cancer Gene Therapy 17:559-570 참조).
자살유전자(SG)를 운반하는 VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh 복합체를 재료 및 방법에 기술된 것과 유사하게 만들어 낸다.
세포주: BT474 유방암, SK-BR-3 유방암 및 Calu-3 폐암 세포주는 HER2 양성 인간 종양 세포주이다(Bunn P. A. 등 (2001) Clin Cancer Res. 7:3239-3250; Pegram M 등 (1999) Oncogene 18:2241-2251; Spiridon CI 등 (2002) Clin Cancer Res. 8:1720-1730). A-673 횡문근육종 및 HeLa 자궁경부암은 HER2 음성 인간 종양 세포주이고, BEAS-2b는 불멸화된 기관지 상피 HER2 음성 세포주이다(Jia LT 등의 (2003) Cancer Res. 63:3257-3262; Kern JA 등의 (1993) Am J Respir Cell Mol Biol 9:448-454; Martinez-Ramirez A 등의 (2003) Cancer Genet Cytogenet. 2003;141:138-142). 이들 세포주 모두는 American Type Culture Collection(ATCC, 버지니아주 머내서스 소재)로부터 얻어고, ATCC가 추천하는 배지에 유지한다.
마우스. 6 내지 8주령의 암컷 누드 마우스를 얻어, 특정 병원체 없는 조건 하에 수용한다. 0일차에, 마우스에게 (1) 107개의 BT474, SK-BR-3, Calu-3, A-673 또는 HeLa 종양 세포를 옆구리에 피하 주입하고, (2) 리포터 유전자(예: EGFP) 또는 자살 유전자를 운반하는 VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh 복합체를 정맥 내 주입하여 치료하였다. 대조군으로 작용하는 것은 치료받지 않은 동물(종양 세포만 주입하는 동물), 리포터 유전자 또는 자살 유전자를 운반하는 야생형 AAV 입자가 주입된 동물, SpyTag-바이러스 입자만 주입된 동물 등이다. 접종 및 치료 후 1일차에, 모든 동물을 적절한 프로-드러그 1로 치료한다. 각 종양의 크기는 캘리퍼스를 사용해 주 2회 측정하고, 종양 부피는 길이Х폭2 x 0. 52로 계산한다. 사망, 종양 궤양화, 종양 직경 15 mm, 또는 종양 부피 1000 mm3인 경우, 마우스를 희생시키고, 희생 날짜를 사망일로서 기록한다. 리포터 유전자를 운반하는 바이러스 입자를 주입한 동물의 간, 비장, 신장 및 종양의 종양을 고정시키고 리포터 유전자 발현을 시각화한다.
자살 유도 유전자의 표적화된 전달이 기술되었지만(Zarogoulidis P. 등의 (2013) J. Genet. Syndr. Gene Ther. 4:16849), 본 실시예는, 본원에 기술된 바이러스 입자를 사용해, 표적화된 HER2 리간드를 발현하는 세포에게 자살 유전자를 전달하는 것을 기술한다. 추가적인 실험에서, 자살 유전자는 본원에서 기술된 바이러스 입자를 사용하여 하나 이상의 다른 표적 리간드를 발현하는 또 다른 세포 유형으로 전달되며, 표적화에 적합한 수용체의 예시적이고 비-제한적인 실시예는, 바이러스 입자의 내포작용을 매개하는 수용체, 예를 들어, 암종 배아 항원(CEA)(Qiu Y 등의 (2012) Cancer Lett. 316:31-38) 및 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR)를 포함한다(Leng A 등 (2013) Tumour Biol. 32:1103-1111; Liu T 등의 (2011) Exp Mol Pathol. 91:745-752). 표적화될 수 있는 추가의 수용체는 다음을 포함한다: 표피 성장 인자 수용체(EGFR)(Heimberger AB 등의 (2009) Expert Opin Biol Ther. 9:1087-1098), 분화 클러스터 44s(CD44s)(Heider KH 등의 (2004) Cancer Immunol Immunother. 53:567-579), 분화 클러스터 133(AC133으로도 알려진 CD133)(Zhang SS 등 (2012) BMC Med.;10:85), 엽산염 수용체(FR)(Duarte S 등의 (2011) J Control Release 149(3):264-72), 트랜스페린 수용체(TfR) 또는 분화 클러스터 71(CD71)(Habashy HO 등의 Breast Cancer Res Treat. 119(2):283-93), 뮤신(Torres MP 등의 (2012) Curr Pharm Des. 2012; 18(17):2472-81), 단계 특이적 배아 항원 4(SSEA-4)(Malecki M. 등의 (2012) J Stem Cell Res Ther. 2(5)), 종양 내성 항원 1-60(TRA-1-60)(Malecki M. 등의 (2013) J Stem Cell Res Ther. 3:134).
본 발명은 다수의 실시예를 참조하여 특히 도시되고 기술되었지만, 당업자는 본 명세서에 개시된 다양한 실시예들의 형태 및 세부 사항에 있어서의 변경이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있고, 본원에 개시된 다양한 구현예들이 청구범위의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본원에 기재된 방법 및 재료와 유사 또는 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있으며, 몇몇 바람직한 방법 및 재료를 지금부터 설명한다. 본원에 인용된 모든 공개문헌은 그 전체가 본원에 참고로 원용되어 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sabin, Leah Schoenherr, Christopher Economides, Aris N Kyratsous, Christos Murphy, Andrew J <120> Tropism-Modified Recombinant Viral Particles And Uses Thereof For The Targeted Introduction Of Genetic Material Into Human Cells <130> 009108.359WO1/10359WO01 <150> 62525708 <151> 2017-06-27 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyTag <400> 1 Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KTag <400> 2 Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spycatcher <400> 3 Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp 1 5 10 15 Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg 20 25 30 Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp 35 40 45 Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys 50 55 60 Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala 65 70 75 80 Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu 85 90 95 Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His 100 105 110 Ile <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyLigase <400> 4 Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Gly Gln Ser 1 5 10 15 Gly Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser 20 25 30 Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp 35 40 45 Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro 50 55 60 Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln 65 70 75 80 Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Gly Ser Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Gly Ser Gly Glu Asp Ser Ala Thr His Ile 100 105 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SnoopTag <400> 5 Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SnoopCatcher <400> 6 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Lys Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln 20 25 30 Lys Gln His Pro Asp Tyr Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn 35 40 45 Gly Thr Tyr Gln Asn Val Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe 50 55 60 Lys Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu Pro 65 70 75 80 Ala Gly Tyr Lys Pro Val Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln Ile 85 90 95 Val Asn Gly Glu Val Arg Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln Asp Ile 100 105 110 Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asn Gly Lys His Tyr Ile Thr Asn Glu 115 120 125 Pro Ile Pro Pro Lys 130 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isopeptag <400> 7 Thr Asp Lys Asp Met Thr Ile Thr Phe Thr Asn Lys Lys Asp Ala Glu 1 5 10 15 <210> 8 <211> 2208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAAV2-CAP wt DNA <400> 8 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60 cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg 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Claims (72)

  1. 재조합 바이러스 캡시드 단백질로서, 캡시드 단백질에 작동 가능하게 연결된 단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하되, 임의로 제1 구성원은 펩티드 태그이고, 임의로 제1 구성원 및/또는 돌연변이는 캡시드 단백질의 자연 향성(natural tropism)을 감소시키거나 제거하는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 단백질:단백질 결합 쌍의 제2 동족 구성원을 추가로 포함하되, 제1 및 제2 구성원은 공유결합으로 결합되는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 공유 결합은 이소펩타이드 결합인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  4. 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 구성원은 표적화 리간드에 작동 가능하게 연결되고, 임의로 표적화 리간드는 결합 모이어티인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 구성원의 측면에는 제1 구성원을 캡시드 단백질에 연결시키는 제1 및/또는 제2 링커가 위치하며, 제1 및/또는 제2 링커는 각각 독립적으로 적어도 하나의 아미노산 길이인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 제1 및 제2 링커는 동일하지 않은, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  7. 제5항에 있어서, 제1 및 제2 링커는 동일하고, 10개의 아미노산 길이인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 캡시드 단백질이 그 자연 수용체에 결합하는 것에 관여하는 아미노산 위치에 돌연변이를 추가로 포함하며, 돌연변이는 캡시드 단백질 내 이종 펩티드의 삽입, 이종 펩티드와 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산의 치환, 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실, 또는 이들의 조합인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질의 형질 도입 효율은 아래와 같은, 재조합 바이러스 캡시드 단백질:
    (i) 10% 감소,
    (ii) 20% 감소,
    (iii) 30% 감소,
    (iv) 40% 감소,
    (v) 50% 감소,
    (vi) 60% 감소,
    (vii) 70% 감소,
    (viii) 80% 감소,
    (ix) 90% 감소, 또는
    (x) 제거
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 캡시드 단백질은 아데노-연관 바이러스(AAV)의 캡시드 유전자로부터 유래되고, 캡시드 유전자는 AAV VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 암호화하고, 임의로 캡시드의 결합과 관련된 아미노산 위치에서의 돌연변이를 추가로 포함하는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  11. 제10항에 있어서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV9로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  12. 제10항에 있어서, 아데노-연관 바이러스는 AAV2인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  13. 제10항에 있어서, 아데노-연관 바이러스는 AAV9인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질:단백질 결합 쌍은:
    (i) SpyTag:SpyCatcher,
    (ii) SpyTag:KTag,
    (iii) Isopeptag:pilin-C,
    (iv) SnoopTag:SnoopCatcher, 또는
    (v) SpyTag002:SpyCatcher002인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 구성원 및 임의의 링커는 함께 약 50개 이하의 아미노산 길이인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 구성원은 SpyTag인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 동족 구성원은 SpyCatcher인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  18. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 동족 구성원은 KTag인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  19. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 구성원은 KTag이고 제2 동족 구성원은 SpyTag인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  20. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 구성원은 SnoopTag이고 제2 동족 구성원은 SnoopCatcher인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  21. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 구성원은 isopeptag이고 제2 동족 구성원은 Pilin-C인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  22. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 구성원은 SpyTag002이고 제2 동족 구성원은 SpyCatcher002인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질 또는 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드는 적절한 표적화 리간드의 부재 시 적절한 표적화 리간드를 포함하는 바이러스 캡시드 단백질 또는 캡시드와 비교하여 표적 세포를 감염시키는 능력이 감소 내지 제거되는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  24. 제4항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티는 항체 또는 그의 일부분인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 항체 또는 그의 일부는 SpyCatcher에 융합되는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  26. 제25항에 있어서, 항체 또는 그의 일부는 C-말단에서 링커에 융합되고, 링커는 링커의 C-말단에서 SpyCatcher에 융합되는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 링커는 서열 번호 48(GSGESG)로 제시된 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  28. 제4항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드는 서열 번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  29. 제4항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드는 세포 표면 분자와 특이적으로 결합하며, 임의로 세포 표면 마커는:
    (i) 아시알로당단백질 1(ASGR1),
    (ii) ENTPD3,
    (iii) PTPRN,
    (iv) CD20,
    (v) CD63, 또는
    (vi) Her2인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  30. 제29항에 있어서, 세포 표면 분자는 아시알로당단백질 1(ASGR1)인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  31. 제29항에 있어서, 세포 표면 분자는 CD63인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  32. 제29항에 있어서, 세포 표면 분자는 ENTDP3인, 재조합 바이러스 캡시드 단백질.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 캡시드.
  34. 제33항에 있어서, 특이적 결합 쌍 중 임의의 구성원이 결여된 기준 바이러스 캡시드 단백질을 추가로 포함하는, 재조합 바이러스 캡시드.
  35. 제34항에 있어서, 재조합 바이러스 캡시드 단백질 및 기준 바이러스 캡시드 단백질은 바이러스 입자가 그의 자연 리간드에 결합하는 것에 관여하는 적어도 하나의 잔기의 돌연변이를 포함하는, 재조합 바이러스 캡시드.
  36. 제34항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 1:1 내지 1:15의 비율로 재조합 바이러스 캡시드 단백질 및 기준 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는, 재조합 바이러스 캡시드.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스 캡시드에 의해 캡슐화된 관심 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터.
  38. 제37항에 있어서, 관심 뉴클레오티드는 바이러스 프로모터, 박테리아 프로모터, 포유류 프로모터, 조류 프로모터, 어류 프로모터, 곤충 프로모터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터에 의해 조절되는, 재조합 바이러스 입자.
  39. 제37항에 있어서, 관심 뉴클레오티드는 인간 프로모터에 의해 조절되는, 재조합 바이러스 입자.
  40. 제37항에 있어서, 관심 뉴클레오티드는 비인간 프로모터에 의해 조절되는, 재조합 바이러스 입자.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 뉴클레오티드는 리포터 유전자인, 재조합 바이러스 입자.
  42. 제41항에 있어서, 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질을 암호화하는, 재조합 바이러스 입자.
  43. 제41항에 있어서, 리포터 유전자는, 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다아제(암호화된 lacZ 유전자), 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP), MmGFP, 청색 형광 단백질(BFP), 강화된 청색 형광 단백질(eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, 황색 형광 단백질(YFP), 강화된 황색 형광 단백질(eYFP), 에머랄드(Emerald), CyPet, 홍색 형광 단백질(CFP), 진청색(Cerulean), T-Sapphire, 루시퍼라제(luciferase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 또는 이들의 조합을 암호화하는, 재조합 바이러스 입자.
  44. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 뉴클레오티드는 치료 단백질을 암호화하는 유전자, 자살 유전자, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드, CRISPR/Cas 시스템 또는 이의 일부분(들)을 암호화하는 뉴클레오티드, 안티센스 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드, shRNA 암호화 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 바이러스 입자.
  45. (a) 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항의 바이러스 캡시드 또는 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  46. 표적 세포에 관심 뉴클레오티드를 전달하는 방법으로서, 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항의 바이러스 입자 또는 제45항의 조성물과 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함하되, 바이러스 캡시드는 표적 세포 표면에서 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 표적화 리간드를 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 표적 세포는 시험관 내에 있는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 표적 세포는 대상체의 생체 내에 있는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포는 인간 세포인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 표적 세포는 인간 간 세포이고, 표적화 리간드는 인간 아시알로당단백질 수용체(ASGR1)에 결합하는, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 표적 세포는 인간 신경세포이고, 표적화 리간드는 GABA에 결합하는, 방법.
  53. 제50항에 있어서, 표적 세포는 인간 T세포이고, 표적화 리간드는 CD3에 결합하고, CD3ε에 임의로 결합하는, 방법.
  54. 제50항에 있어서, 표적화 리간드는 PTPRN에 결합하는, 방법.
  55. 제50항에 있어서, 표적 세포는 인간 조혈세포이고, 표적화 리간드는 CD34에 결합하는, 방법.
  56. 제50항에 있어서, 표적 세포는 인간 신장 세포인, 방법.
  57. 제50항에 있어서, 표적 세포는 인간 암세포이고, 표적화 리간드는 종양 관련 항원에 결합하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 종양 항원은 E6, E7 또는 Her2인, 방법.
  59. 제50항에 있어서, 표적화 리간드는 CD20에 결합하는, 방법.
  60. 제50항에 있어서, 표적화 리간드는 인간 글루카곤 수용체에 결합하는, 방법.
  61. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드는 CD63에 특이적으로 결합하는, 방법.
  62. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드는 인간 엑토뉴클레오시드 삼인산 이인산가수분해효소 3(hENTPD3)에 특이적으로 결합하는, 방법.
  63. 스캐폴드 및/또는 어댑터를 사용해 바이러스 캡시드 단백질을 제공하는 방법으로서,
    (a) 특이적 단백질:단백질 결합 쌍의 제 1구성원을 암호화하는 핵산 및 임의로 링커를 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 삽입하여, 특이적 결합 쌍의 제1 구성원 및 임의로 링커를 포함하는 유전적으로 변형된 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 형성하는 단계, 및
    (b) 바이러스 입자의 생산에 충분한 조건에서 포장 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 포장 세포는 핵산을 포함하는, 방법.
  64. 바이러스 입자를 생산하는 방법으로서, 바이러스 입자를 생산하기에 충분한 조건에서 포장 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 포장 세포는 유전적으로 변형된 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 유전적으로 변형된 캡시드 단백질은 특이적 단백질:단백질 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하고 임의로 제1 구성원을 캡시드 단백질에 연결시키는 아미노산 링커를 포함하는, 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 포장 세포는 관심 뉴클레오티드를 포함하는 헬퍼 플라스미드 및/또는 전달 플라스미드를 추가로 포함하는, 방법.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 포장 세포는 기준 모자이크 캡시드를 암호화하는 플라스미드를 추가로 포함하는, 방법.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 포장 세포를 용해시키고 세포 용해물로부터 아데노-연관 바이러스 벡터를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    a. 세포 찌꺼기를 제거하는 단계,
    b. 바이러스 입자를 함유하는 상청액을 핵산 분해 효소로 처리하는 단계,
    c. 바이러스 입자를 농축시키는 단계,
    d. 바이러스 입자를 정제하는 단계, 및
    e. a 내지 d의 임의의 조합.
  69. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 변형된 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 캡시드 단백질의 자연 향성에 관여하는 위치에 아미노산의 돌연변이를 추가로 포함하며, 돌연변이는 캡시드 단백질 내 이종 펩티드의 삽입, 이종 펩티드와 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산의 치환, 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실, 또는 이들의 조합인, 방법.
  70. 제63항 내지 제69항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 바이러스 입자.
  71. 바이러스 입자를 생산하기 위한 포장 세포로서, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 포장 세포.
  72. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 재조합 벡터.
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