RS64233B1 - Rekombinantne virusne čestice sa modifikovanim tropizmom i njihove upotrebe za ciljano uvođenje genetičkog materijala u humane ćelije - Google Patents

Rekombinantne virusne čestice sa modifikovanim tropizmom i njihove upotrebe za ciljano uvođenje genetičkog materijala u humane ćelije

Info

Publication number
RS64233B1
RS64233B1 RS20230411A RSP20230411A RS64233B1 RS 64233 B1 RS64233 B1 RS 64233B1 RS 20230411 A RS20230411 A RS 20230411A RS P20230411 A RSP20230411 A RS P20230411A RS 64233 B1 RS64233 B1 RS 64233B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
protein
capsid protein
viral capsid
capsid
targeting ligand
Prior art date
Application number
RS20230411A
Other languages
English (en)
Inventor
Leah Sabin
Christopher Schoenherr
Aris N Economides
Christos Kyratsous
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=63080488&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS64233(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS64233B1 publication Critical patent/RS64233B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
REFERENCA NA LISTU SEKVENCI KOJA JE PODNETA KAO TEKSTUALNI DOKUMENT PREKO EFS MREŽE
[0001] Specifikacija obuhvata listu sekvenci koja je napisana u dokumentu 10359WO01_ST25.txt veličine 183 kilobajta, koji je kreiran 27. juna, 2018.
OBLAST TEHNIKE
[0002] Ovo izlaganje se generalno odnosi na rekombinantne virusne čestice sa izmenjenim tropizmom, i kompozicije koje sadrže iste, koji su korisne za ciljano uvođenje genetičkog materijala u ćelije. Naročito, ovaj pronalazak se odnosi na rekombinantni virusni kapsid, virusni kapsid koji ih sadrži, rekombinantnu virusnu česticu koja sadrzi nukleotid od interesa inkapsuliran od strane rekombinantnog proteina virusnog kapsida, i različitih povezanih aspekata.
STANJE TEHNIKE
[0003] Isporuka gena u određene ciljne ćelije je postala jedna od najvažnijih tehnologija u modernoj medicini za potencijalno lečenje različitih hroničnih i genetičkih oboljenja. Do sada, progres u kliničkoj primeni genske terapije je bio ograničen zbog lišenosti idealnih nosača za isporuku gena. Da bi se postigao terapeutski uspeh, nosači za isporuku gena moraju da budu sposobni za trandukciju ciljnih ćelija dok se izbegava transdukcija neciljnih ćelija. Određenije, kada nativni tropizam virusa ne ispunjava željena terapeutska tkiva ili ćelijske tipove, postoji potreba za rekombinantnim virusnim cesticama u kojima je prirodni tropizam uklonjen ili smanjen i željeni tropizam je uspešno modifikovan (Buchholz et al.,)
[0004] U poslednjih nekoliko godina, najveći napredak u razvoju vektora je postignut upotrebom virusa koji ne sadrže omotač (npr., virusi koji sadrže kapsid koji je obrazovan od strane proteina virusnog kapsida bez omotača (npr., lipidnog dvosloja)) kao sto su adenopovezani virusi (AAVs) i adenovirusi (Ads), kao i virusi sa omotačem (npr. virusi kod kojih je kapsid okružen sa lipidnim dvoslojem) kao što su retrovirusi, lentivirusi, i virus herpes simpleks. Vektori koji su zasnovani na AAV su bili u fokusu mnogih istraživanja, s obzirom na to da su AAV-I samo slabo imunogeni i nisu sposobni za transdukciju u širokom opsegu vrsta i tkiva in vivo bez dokaza o toksičnosti.
[0005] AAV-i su mali, bez omotača, jednolančani DNK virusi. Genom AAV je 4,7 kb i karakteriše se sa dva invertovana terminalna ponovka (ITR) i dva otvorena okvira čitanja koji kodiraju Rep proteine i Cap proteine, tim redom. Dva ITR su jedini cis elementi koji su esencijalni za replikaciju i inkapsidaciju AAV. Otvoreni okvir čitanja Rep kodira četiri proteina molekularne težine 78 kD, 68 kD, 52 kD I 40 kD. Ovi proteini uglavnom funkcionišu u regulaciji transkripcije i replikacije genoma AAV. Region okvira za čitanje Cap kodira tri strukturna (kapsid) virusna proteina (VP-a) koji imaju molekulske težine od 83-85 kD (VP 1), 72-73 kD (VP2) i 61-62 kD (VP3). Više od 80% ukupnih proteina u virionu AAV sadrže VP3; u zrelim virionima VP1, VP2 i VP3 se mogu naći u relativnoj zastupljenosti od približno 1:1:10. In vitro, tri proteina se spontano sklapaju u strukture koje su slične virionu, npr., virusne kapside. Izgleda, prema tome, da obrazovanje virusnih kapsida u inficiranim celijama nastavlja nezavisno od sinteze virusne DNK (pregled od strane Kotin et al. (1994) Hum. Gene Ther.5:793).
[0006] Među svim poznatim serotipovima AAV, ААV2 je možda najbolje dobro-okarakterisani serotip, zbog toga sto je njegov infektivni klon je prvo napravljen. (Samulski et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2077-2081). Naknadno, sekvence za nekoliko serotipova AAV je takođe odredjeno. (videti, npr., Rutledge et al. (1998) J. Virol., 72:309-319; Gao et al. (2005) Curr. Gen. Ther.5(3)285-97; Chiorini et al. (1997) J. Virol., 71:6823-6833; S. Muramatsu et al., (1996) Virol., 221:208-217). Generalno, svi AAVs imaju više od 80% identifikovane nukleotidne sekvence.
[0007] ААV je obecavajući vektor za humanu gensku terapiju od, za razliku od drugih virusnih vektora, nije pokazano da su AAV povezani sa bilo kojom poznatom humanom bolesti i generalno se ne smatraju patogenim. (Muzyczka, et al. (1992) Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:97-129). Osim toga, ААV stabilno transdukuje postmitoticka tkiva sa relativno niskom imunogenosti, i iako se virus povremeno može integrisati u hromozome domaćina, to ne radi tako učestalo u lokus bezbedne luke humanog hromozoma 19, i samo kada su Rep proteini dostupni in trans. Genomi AAV se brzo cirkularizuju i spajaju se u inficiranim ćelijama, i postoje u stabilnom, epizomalnom stanju u inficiranim ćelijama da bi se obezbedila dugotrajna stabilna ekspresija njihovih opterećenja.
[0008] Brojni virusi, uključujući ААV, inficiraju ćelije preko interakcije virus/ligand:ćelija/receptor što ultimativno dovodi do endocitoze virusa od strane inficirane ćelije. Ova interakcija ligand:receptor je u fokusu velikog broja istraživanja virusnih vektora, i može se manipulisati kako bi se preusmerio prirodni tropizam virusa od ćelije koja je prirodno permisivna za infekciju virusom divljeg tipa ka nenativnoj ciljnoj ćeliji, npr., preko receptora kojeg eksprimuje ciljna ćelija.
[0009] Teorijski, ponovno ciljanje vektora prema bilo kom proteinu ćelijske površine ili markeru treba da rezultuje u infekciji, s obzirom da većina receptora ćelijske površine je uključena u putevima endocitoze, ili konstitutivne (npr., za recikliranje) ili indukovane ligandom (npr. posredovana receptorom). Ovi klasteri (grupacije) receptora u jamama obloženim klatrinom, ulaze u ćeliju preko vezikula obloženih klatrinom, prolaze kroz zakišeljeni endozom u kome su sortirani receptori, i nakon toga se ili recikliraju na površini ćelije, bivaju skladišteni intracelularno, ili su degradirani u lizozomima. Kao takve, platforme za ponovno ciljanje virusnih vektora često imaju za cilj da ukinu prirodni tropizam virusnog vektora i preusmere virusni vektor na receptor ili marker koji je eksprimovan zasebno ili primarno od strane ciljne ćelije. Mnoge prednosti u ciljanoj genskoj terapiji upotrebom virusnih vektora mogu se sažeto prikazani kao nerekombinatorna (negenetička) ili rekombinatorna (genetička) modifikacija virusnog vektora, koja rezultuje u pseudotipizaciji, proširenju, i/ili ponovnom ciljanju prirodnog tropizma virusnog vektora. (Pregled u Nicklin i Baker (2002) Curr. Gene Ther.2:273-93; Verheiji i Rottier (2012) Advances Virol 2012:1-15).
[0010] Najpopularniji pristup je rekombinatorna genetička modifikacija virusnih proteina kapsida, i prema tome, površine virusnog kapsida. Sa druge strane, u indirektnim rekombinatornim pristupima, virusni kapsid je modifikovan sa heterolognom “skelom”, koja zatim služi kao adapter. Adapter se veže za skelu i za ciljnu ćeliju. U pristupu direktnog rekombinatornog ciljanja, ciljajuci ligand je direktno insertovan u, ili je spojen sa, virusnim kapsidom, tj., proteini virusnih kapsida su modifikovani da eksprimuju heterologni ligand. Ligand zatim preusmerava., npr., veže, receptor ili marker koji je preferencijalno ili ekskluzivno eksprimovan na ciljnoj celiji.
[0011] Svaki od pristupa ima prednosti i nedostatke. Sposobnost genetičkog modifikovanja virusa zahteva zadržavanje strukture kapsida, a da ligand za ciljanje ili skela budu postavljeni na poziciju unutar kapsidnog proteina koja će tolerisati i na odgovarajući način prikazati ligand za ciljanje ili skelu. Na primer, ligand za ciljanje ili skela uvedena u virusni protein moraće da ispuni ograničenja veličine kako ne bi ometala strukturu modifikovanog kapsida, što otvara mogućnost da direktni ligand ili skela možda neće biti pravilno predstavljeni kapsidom i/ili ograničava spektar prirodno postojećih molekula dostupnih za upotrebu kao ligand za ciljanje ili skele. Dodatno, upotreba ciljanih liganada insertovanih direktno u kapsid virusa nije modularna i mora se rekonstruisati za svaku metu. Iako platforma skele ima prednost u fleksibilnosti i modularnoj prirodi korišćenog adaptera, skela na čestici virusa i adapteru interaguju jonski i ostaju dva odvojena entiteta, a inherentna nestabilnost njihovih interakcija može ograničiti njihovu korisnost in vivo. Optimalne efikasnosti transdukcije se mogu teško postići sa ovakvim sistemima koji se sastoje iz dve komponente.
[0012] Jasno je da, ostaje potreba za virusnim vektorskim sistemima koji održavaju integritet modifikovane strukture virusa dok ostaju prilagodljivi za ciljani transfer nukleinskih kiselina od interesa u različite ciljne ćelije.
[0013] Takođe su naznačena sledeća dokumenta:
• Santiago-Ortiz et al (2016) Journal of Controlled Release, 240: 287-301 koji se odnosi na vektore Adeno-povezanih virusa (AAV) u genskoj terapiji raka;
• WO 2016/112921 koji se odnosi na čestice slične virusu sa efikasnim prikazom epitopa;
• Reid et al (2002) Journal of Virology, 76(9): 4559-4566 koji se odnose na vektore Adeno-povezanih virusnih kapsida koje ispoljavaju domene za vezivanje imunoglobulina;
• Veggiani et al (2014) TIBS, 32(10): 506-512 koje se odnose na superlepak iz bakterija; i
• Veggiani et al (2016) PNAS USA, 113(5): 1202-1207 koji se odnosi na programabilne izgrađene poliproteame korišćenjem dvostrukih peptidnih superlepkova.
SUŠTINA
Pronalazak
[0014] Ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantni protein virusnog kapsida koji je genetički modifikovan da prikaže heterolognu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži prvi član vezujućeg para protein: protein ubačen u virusni protein kapsida,
pri čemu je virusni protein kapsida dobijen iz cap gena adeno-povezanog virusa (AAV) koji kodira AAV VP1, VP2 i/ili VP3 protein kapsida; u čemu:
(a) prvi član vezujućeg para protein:protein je peptidni tag i sposoban je da obrazuje izopeptidnu vezu sa drugim srodnim članom vezujućeg para protein:protein; ili
(b) prvi član vezujućeg para protein:protein je peptidni tag i virusni protein kapsida dalje obuhvata drugi srodan član vezujućeg para protein:protein, pri čemu su prvi član i drugi srodni član vezani izopeptidnom vezom.
[0015] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantni virusni kapsid koji sadrži protein virusnog kapsida iz ovog pronalaska.
[0016] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje rekombinantnu virusnu česticu koja sadrži nukleotid od interesa inkapsuliran virusnim kapsidnim proteinom iz ovog pronalaska.
[0017] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži: (a) protein virusnog kapsida ili virusnu česticu iz ovog pronalaska; i (b) farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0018] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje virusnu česticu ili kompoziciju iz ovog pronalaska za upotrebu u postupku isporuke nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koji obuhvata kontakt ciljne ćelije sa navedenom virusnom česticom ili pomenutom kompozicijom, pri čemu protein virusnog kapsida sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje protein eksprimiran na površini ciljne ćelije.
[0019] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za isporuku nukleotida od interesa u in vitro ciljnu ćeliju koji se sastoji od dovođenja u kontakt ciljne ćelije sa virusnom česticom ili kompozicijom ovog pronalaska, pri čemu protein virusnog kapsida sadrži ligand za ciljanje koji se specifično vezuje za protein eksprimiran na površini ciljne ćelije.
[0020] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantni vektor koji kodira protein virusnog kapsida iz ovog pronalaska.
[0021] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje AAV cap gen koji kodira rekombinantni protein virusnog kapsida iz ovog pronalaska.
Specifična izvođenja i tehnički detalji
[0022] Tehničko izlaganje koje je prestavljeno u tekstu ispod može u nekim aspektima prevazići obim pronalaska, koji je definisan priloženim patentnim zahtevima. Elementi izlaganja koji ne spadaju u obim patentnih zahteva obezbeđeni su za informisanje, odnosno da bi se stvarni pronalazak za koji se traži zaštita smesti u širi tehnički kontekst.
[0023] Ovde je opisana strategija ponovnog ciljanja virusa koja rešava probleme inherentne u prethodnim strategijama ponovnog ciljanja korišćenjem prvog člana i drugog srodnog člana specifičnog vezujućeg para, pri čemu prvi član i drugi srodni član specifično interaguju da bi obrazovali izopeptidnu vezu. Prvi član, kada je prikazan na kapsidnom proteinu, deluje kao skela za bilo koji ligand za ciljanje fuzionisan sa drugim srodnim članom, ali nakon vezivanja prvog člana i drugog srodnog člana, obrazuju se izopeptidne veze, a rekombinantna virusna čestica deluje vektor ciljanja koji se sastoji iz jedne komponente.
[0024] Ovde je obezbeđena rekombinantna virusna čestica (npr. rekombinantni virusni kapsidni protein, rekombinantni virusni kapsid koji sadrži rekombinantni virusni protein kapsida, i/ili rekombinantni virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid koji inkapsulira nukleotid od interesa) koji je genetički modifikovan da prikaže heterolognu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži prvi član specifičnog vezujućeg para, peptidni tag, pri čemu je aminokiselinska sekvenca manja od 50 aminokiselina u dužini, i gde rekombinantni virusni kapsid/protein čestica pokazuje smanjeni do uklonjeni prirodni tropizam. Prvi član para vezujućeg para protein:protein je peptidni tag i sposoban je da formira izopeptidnu vezu sa drugim srodnim članom vezujueg para protein:protein. Tropizam rekombinantnog virusnog kapsidnog proteina/kapsida/vektora može biti obnovljen i/ili preusmeren nakon formiranja izopeptidne veze sa srodnim drugim članom specifičnog vezujućeg para, koji je srodni drugi član fuzionisan sa ciljanim ligandom koji specifično vezuje ciljna ćelija. Takvo vezivanje dovodi do toga da rekombinantni virusni kapsid protein/kapsid/vektor prikazuje ligand za ciljanje. Efikasnost i specifičnosti transdukcije su iznenađujuće poboljšane kada se ligand za ciljanje prikazuje pomoću rekombinantnog virusnog kapsida/vektora preko linkera i/ili u ograničenim količinama na površini virusnog kapsida. Ovde su obezbeđene takve virusne čestice, kompozicije koje ih sadrže i postupci za pravljenje i korišćenje istih.
[0025] Shodno tome, ovde je opisan rekombinantni protein virusnog kapsida koji sadrži peptidni tag ubačen u kapsidni protein, pri čemu je protein virusnog kapsida dobijen iz gena cap adeno-povezanog koji kodira AAV VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidni protein, i pri čemu je peptidni tag prvi član specifičnog vezujućeg para koji obrazuje izopeptidnu vezu sa drugim srodnim članom specifičnog vezujućeg para. Naročito, ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantni protein virusnog kapsida koji je genetički modifikovan da eksprimuje heterolognu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži prvi protein:protein vezujući član koji je insertovan u virusni kapsidni protein, pri čemu je protein virusnog kapsida izveden iz gena cap adenopovezanog virusa (AAV) koji kodira AAV VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidni protein; pri čemu: (a) prvi član vezujućeg para protein:protein je peptidni tag i sposoban je da obrazuje izopeptidnu vezu sa drugim srodnim članom vezujućeg para protein:protein; ili (b) prvi član vezujućeg para protein:protein je peptidni tag i protein virusnog kapsida dalje sadrži drugi srodni član vezujućeg para protein:protein, pri čemu su prvi član i drugi srodni član vezani izopeptidnom vezom. U nekim izvođenjima, rekombinantni kapsidni protein dalje sadrži drugi srodni član vezujućeg para protein:protein, pri čemu su prvi član i drugi srodni član vezani izopeptidnom vezom. U nekim izvođenjima, rekombinantni kapsidni protein sadrži drugi srodni član specifičnog vezujućeg para kovalentno vezan za prvi član, pri čemu je drugi srodni član specifičnog vezujućeg para operativno povezan sa ligandome za ciljanje koji specifično vezuje marker ćelijske površine (na primer, oligosaharid površine ćelije, receptor ćelijske površine i/ili marker ćelijske površine, itd.) na ciljnoj ćeliji. Ovde su takođe opisani virusni kapsidi koji sadrže rekombinantne virusne kapsidne proteine, i virusni vektori koji sadrže nukleotid od interesa inkapsuliran ovde opisanom virusnim kapsidima. Takođe su opisane kompozicije koje sadrže ovde opisane čestice rekombinantnog virusa (npr. rekombinantne virusne kapsidne proteine, rekombinantne virusne kapside i/ili rekombinantne virusne vektore), postupke upotebe istih za ciljanu in vitro isporuku nukleotida od interesa, postupke pravljenja istih, kao i čestice virusa i kompozicije za upotrebu u postupku za isporuku nukleotida od interesa.
[0026] U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član specifičnog vezujućeg para) se ubacuje u kapsidni protein preko prvog ili drugog linkera, na primer, aminokiselinske grupe za razdvajanje koja je dužine najmanje jedne aminokiseline. U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član) je bočno sa obe strane sa prvim i/ili drugim linkerom, npr., prvom i/ili drugom aminokiselinskom grupom za razdvajanje, od kojih je svaka grupa za razdvajanje dužine najmanje jedne aminokiseline.
[0027] U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linkeri nisu identični. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker je svaki nezavisno jedan ili dva aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker je svaki nezavisno jedan, dva ili tri aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker je svaki nezavisno jedan, dva, tri ili četiri aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker je svaki nezavisno jedan, dva, tri, četiri ili pet aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker su svaki nezavisno jedan, dva, tri, četiri ili pet aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker je svaki nezavisno jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker je svaki nezavisno jedan, dva, tri, četiri, pet, šest ili sedam aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker je svaki nezavisno jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker je svaki nezavisno jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam ili devet aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker su svaki nezavisno jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i/ili drugi linker su svaki nezavisno jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više aminokiselina u dužini.
[0028] U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su identični po sekvenci i/ili dužini, i svaki je po dužini od jedne aminokiseline. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linker su identične dužine, i svaki je dužine jedne aminokiseline. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su identične dužine, i svaki su po dužini dve aminokiseline. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su identične dužine, i svaki ima tri aminokiseline. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linker su identične dužine, i svaki ima četiri aminokiseline po dužini, npr., linker je GLSG (SEQ ID NO:40). U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su identične dužine, i svaki ima po pet aminokiselina. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linker su identične dužine, i svaki je dužine šest aminokiselina, npr., svaki prvi i drugi linker sadrže sekvencu GLSGSG (SEQ ID NO:41). U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su identične dužine, i svaki ima po sedam aminokiselina. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linker su identične dužine i svaki je dužine osam aminokiselina, npr., svaki prvi i drugi linker sadrže sekvencu GLSGLSGS (SEQ ID NO:42). U nekim izvođenjima, prvi i drugi linker su identične dužine i svaki je dužine devet aminokiselina. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su identične dužine i svaki je po deset aminokiselina, na primer, svaki prvi i drugi linker sadrže sekvencu GLSGLSGLSG (SEQ ID NO:43) ili GLSGGSGLSG (SEQ ID NO: 55). U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su identične dužine i svaki je više dužine više od deset aminokiselina.
[0029] Generalno, peptidni tag i opciono jedan ili više linkera kao što je ovde opisano, npr., peptidni tag po sebi ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je, između oko 5 aminokiselina do oko 50 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je bar 5 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 6 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 7 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 8 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 9 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 10 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 11 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 12 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 13 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 14 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptide tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 15 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 16 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 17 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 18 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 19 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 20 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 21 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 22 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 23 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 24 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 25 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 26 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptide tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 27 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 28 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 29 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 30 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 31 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 32 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 33 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 34 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptide tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 35 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 36 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 37 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 38 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 39 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je 40 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptidni tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je više od 40 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, peptide tag zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera je ne više od 50 aminokiselina u dužini.
[0030] Rekombinantni protein virusnog kapsida iz ovog pronalaska je dobijen iz cap gena adenopovezanog virusa (AAV) koji kodira AAV VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida. Stoga ovde opisani rekombinantni protein virusnog kapsida je dobijen od AAV gena kapsida koji kodira VP1, VP2, i/ili VP3 proteine kapsida iz AAV (ili porcije VP1, VP2, i/ili VP3 proteine kapsida), npr., kodiran je od strane cap gena koji je modifikovan da kodira genetički modifikovani adeno-povezani virus (AAV) VP1, VP2 i/ili VP3 protein kapsida, npr., genetički modifikovani protein kapsida AAV serotipa koji inficira humana bića koji su odabrani iz grupe koja se sastoji iz AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9. U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je dobijen od AAV2 ili AAV9 gena kapsida koji respektivno kodira AAV2 VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida ili AAV9 VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida npr., kodiran je od strane AAV2 ili AAV9 cap gena koji je modifikovan da respektivno kodira genetički modifikovani AAV2 VP1, VP2 i/ili VP3 protein kapsida ili genetički modifikovani AAV9 VP1, VP2 i/ili VP3 protein kapsida. U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je izveden iz gena za AAV6 kapsid, npr., kodiran je sa AAV6 cap genom modifikovanim da kodira genetički modifikovani AAV6 VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida, sekvenca aminokiselina divljeg tipa od koje je AAV6 VP1 protein kapsida prikazan respektivno kao SEQ ID NO:51. U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je dobijen od gena AAV2 kapsida, npr., kodiran je AAV2 cap genom modifikovanim da kodira genetički modifikovani VP1, VP2 i/ili VP3 protein kapsida AAV2, sekvenca aminokiselina divljeg tipa od koje AAV2 VP1 protein kapsida je predstavljen respektivno kao SEQ ID NO:9. U nekim izvođenjima rekombinantni protein virusnog kapsida je dobijen od gena AAV9 kapsida, npr., kodiran je AAV9 cap genom modifikovanim da kodira genetički modifikovani AAV9 VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida, sekvenca aminokiselina divljeg tipa od koje je AAV9 VP1 protein kapsida predstavljen redom kao SEQ ID NO:31.
[0031] U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je izveden iz (kodiran od) himernog gena AAV kapsida, pri čemu himerni kapsidni gen obuhvata mnoštvo sekvenci nukleinskih kiselina, pri čemu svaka od mnoštva sekvenci nukleinskih kiselina kodira deo proteina kapsida različitog AAV serotipa, i gde mnoštvo sekvenci nukleinskih kiselina zajedno kodira himerni proten AAV kapsida. U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je dobije iz gena himernog AAV2 kapsida. U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je dobijen iz gena himernog AAV6 kapsida. U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je dobijen iz gena himernog AAV9 kapsida.
[0032] Rekombinantni virusni kapsidni protein iz ovog pronalaska je rekombinantni protein virusnog kapsida koji je genetički modifikovan da prikaže heterolognu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži prvi član vezujućeg para protein:protein insertovan u virusni kapsid protein. Generalno, rekombinantni protein virusnog kapsida kako je ovde opisan je modifikovan tako da sadrži peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) operativno povezan (insertovan u), opciono preko linkera, sa rekombinantnim kapsidnim proteinom, kao što je peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i sam opcioni linker smanjuje i/ili ukida prirodni tropizam rekombinantnog kapsidnog proteina ili kapsida koji ga sadrži, u poređenju sa referentnim kapsidnim proteinom kojem nedostaje peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker ili kapsid koji sadrži referentni kapsidni kapsid, tim redom. U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) je operativno povezan (npr., insertovan u i/ili prikazan od strane), opciono preko linkera, sa regionom kapsidnog proteina koji je uključen u prirodni tropizam referentnog kapsidnog proteina divljeg tipa, npr. region kapsidnog proteina uključen u ciljanje ćelije. U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker je operativno povezan (npr., insertovan u i/ili prikazan od strane), opciono preko linkera, sa domenom dugmeta (eng. knob) proteina Ad vlakna. U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) je operativno povezan (npr., insertovan u i/ili prikazan), opciono preko linkera, sa HI petljom proteina Ad vlakna. U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) je operativno povezan (npr., insertovan u i/ili prikazan), opciono preko linkera, sa izloženom promenljivom petljom u AAV kapsidnom proteinu. U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član para koji vezuje protein:protein) je operativno povezan (npr., insertovan u i/ili prikazan), opciono preko linkera, sa izloženom varijabilnom petljom AAV2 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) je operativno povezan (npr., insertovan u i/ili prikazan), opciono preko linkera, sa izloženom varijabilnom petljom AAV9 kapsidnog proteina.
[0033] U nekim izvođenjima (i) protein virusnog kapsida je dobijen od gena AAV2 kapsida koji kodira AAV2 VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidni protein i peptidni tag je operativno povezan (npr. insertovan u i/ili prikazan od strane), opciono preko linkera, aminokiseline na poziciji I453 ili 1587 kapsidnog proteina AAV2 VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina kodiranih iz istog gena za kapsid, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2 i/ ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV-a koji inficira ljude, npr. AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9); (ii) protein virusnog kapsida je dobijen od AAV6 kapsidnog gena i peptidnog tag-a (prvi član vezujućeg para protein:protein) je operativno povezan (npr., insertovan u i/ili prikazan od strane), opciono preko linkera, aminokiselina na poziciji 1585 kapsidnog proteina AAV6 VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina kodiranih iz istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina drugog AAV-a koji inficira ljude, npr. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8 i AAV9); ili (iii) protein virusnog kapsida je dobijen od AAV9 kapsidnog gena koji kodira AAV9 VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidni protein i peptidni tag je operativno povezan (npr., insertovan u i/ili prikazan od strane), opciono preko linkera, aminokiselina na poziciji I453 ili 1589 AAV9 VP1 kapsida (ili odgovarajućim pozicijama VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina kodiranih iz istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina različitih AAV koji inficiraju ljude, na primer, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 i AAV8).
[0034] U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) je operativno povezan, opciono preko linkera, sa aminokiselinom na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji iz 453 AAV2 kapsidnog proteina VP1, 587 AAV2 kapsidnog proteina VP1, 585 AAV6 kapsidnog proteina VP1, 453 AAV9 kapsidnog proteina VP1 i 589 AAV9 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajuće pozicije VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina kodiranih iz istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV-a koji inficira ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9), npr. fuzionisan je sa C-terminusom amino kiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine 453 AAV2 kapsidnog proteina VP1, 587 AAV2 kapsidnog proteina VP1, 585 AAV6 kapsidnog proteina VP1, 453 AAV9 kapsidnog proteina VP1 i 589 AAV9 kapsidnog proteina VP1 (odgovarajući položaji VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina kodiranih iz istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV-a koji inficira ljude, npr. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9). U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker se ubacuju odmah nakon (npr., fuzionisan je sa C-terminusom) aminokiseline na poziciji 453 AAV2 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajućeg pozicije VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina kodiranih iz istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV-a koji inficira ljude, npr. AAV1, AAV3, AAV4, AAV5 , AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9). U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker se ubacuju odmah nakon (npr., fuzionisan je sa C-terminusom) aminokiseline na poziciji 587 AAV2 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajuće pozicije VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina kodiranih iz istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV-a koji inficira ljude, npr. AAV1, AAV3, AAV4, AAV5 , AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9). U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker je insertovan odmah nakon (npr. spojen je sa C-terminusom) aminokiseline na poziciji 585 AAV6 proteina kapsida VP1 (ili odgovarajućim pozicijama VP2 i/ili VP3 proteina kapsida koji su kodirani sa istog gena kapsida, ili odgovarajuće aminokiseline VP1, VP2, i/ili VP3 proteina kapsida različitog AAV koji inficira ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, i AAV9). U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker je insertovan odmah nakon (npr. spojen je sa C-terminusom) aminokiselina na poziciji 453 AAV9 proteina kapsida VP1 (ili odgovarajućim pozicijama VP2 i/ili VP3 proteinima kapsida koji su kodirani sa istog gena kapsida, ili odgovarajućim aminokiselinama VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV-a koji inficira ljude, npr. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 i AAV8). U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker je insertovan odmah nakon (npr., spojen sa C-terminusom) aminokiselina na poziciji 589 AAV9 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajućim pozicijama VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućim aminokiselinama VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV koji inficira ljue, npr., AAV1, AAV2 AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, i AAV8). U nekim izvođenjima, peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker je insertovan i/ili prikazan između pozicija 587 i 588 AAV2 VP1 kapsidnog proteina (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina kodirani iz istog kapsidnog gena ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV-a koji inficira ljude, npr. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 i AAV8).
[0035] U nekim izvođenjima, rekombinantni protein kapsida kao što je ovde opisan obuhvata (drugu i različitu) mutaciju, što može biti pored peptidnog tag-a (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcionog linkera. U nekim izvođenjima, (druga i različita mutacija) sadržo inserciju heterolognog peptida u protein kapsida, supstituciju jedne ili više aminokiselina proteina kapsida sa jednom ili više heterolognih aminokiselina, delecije jedne ili više aminokiselina proteina kapsida, ili njihova kombinacija. Na primer, u nekom izvođenju, rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano može se dobiti od gena AAV2 kapsida (npr., je genetički modifikovan AAV2 VP1, VP2 i/ili VP3 proteina kapsida), sadrži peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker i dodatno može sadržati mutraciju, npr., R585A i/ili R588A mutaciju u VP1 proteinu kapsida AAV2 (ili odgovarajuću mutaciju u VP2 i/ili VP3 proteinima kapsida koji su kodirani sa istog gena AAV2 kapsida). U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je dobijen iz gena AAV2 kapsida, npr., je genetički modifikovani AAV2 VP1, VP2 i/ili VP3 protein kapsida, sadrži peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker insertovan odmah nakon (npr., spojen sa C-terminusom) aminokiseline na poziciji 453 VP1 proteina AAV2 (ili aminokiseline na odgovarajućim pozicijama VP2 i/ili VP3 proteina kapsida AAV2 kodiranih iz istog gena AAV2 kapsida), i dalje sadrži mutaciju koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz R585A i/ili R588A (ili odgovarajuće mutacije u VP2 i/ili VP3 proteinima kapsida kodiranim od strane istog gena AAV2 kapsida). U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je dobijen od gena AAV2 kapsida, npr., je genetički modifikovani VP1, VP2 i/ili VP3 protein kapsida AAV2, sadrži peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker insertovan odmah nakon (npr., spojen sa C-terminusom) aminokiseline na poziciji 587 proteina VP1 kapsida AAV2 (ili aminokiselinama na odgovarajućim pozicijama VP2 i/i VP3 proteinima kapsida AAV2 koji su kodirani sa istog gena AAV2 kapsida), i dodatno sadrži mutaciju koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz R585A, R588A i/ili odgovarajućim mutacijama u VP2 i/ili VP3 proteinima kapsida koji su kodirani iz istog gena kapsida AAV2.
[0036] U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je dobijen od gena AAV9 kapsida, npr., je genetički modifikovani VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida AAV9, koji sadrži peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker insertovan odmah nakon (npr., spojen sa C-terminusom) aminokiseline na poziciji 453 AAV9 VP1 proteina (ili aminokiseline na odgovarajućim pozicijama VP2 ili VP3 protein kapsida AAV9 koji su kodirani iz istog gena AAV9 kapsida), i dodatno sadrži W503A mutaciju (ili odgovarajuću mutaciju u VP2 i/ili VP3 proteinima kapsida koji su kodirani sa istog gena AAV2 kapsida). U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida je dobijen od gena AAV9 kapsida, npr.,je genetički modifikovani VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida AAV9, sadrži peptidni tag (prvi član vezujućeg para protein:protein) i opcioni linker koji je insertovan odmah nakon (npr., spojen sa C-terminusom) aminokiseline na poziciji 589 proteina AAV9 VP (ili aminokiselina na odgovarajućim pozicijama VP2 i/ili VP3 proteina kapsida AAV9 koji su kodirani sa istog gena AAV9 kapsida), i dodatno sadrži mutaciju W503A (ili odgovarajuću mutaciju u VP2 i/ili VP3 proteinima kapsida koji su kodirani sa istog gena AAV2 kapsida).
[0037] U nekim izvođenjima, vezujući par protein:protein može biti odabran iz grupe koja se sastoji iz SpyTag: SpyCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002, SpyTag:KTag, Izopeptag:pilin-C, i SnoopTag:SnoopCatcher. U nekim izvođenjima, gde je peptidni tag (prvi član) SpyTag (ili njegov biološki aktivni deo) i protein (drugi srodni član) je SpyCatcher (ili njegov biološki aktivni deo). U nekim izvođenjima, gde peptidni tag (prvi član) je SpyTag (ili njegov biološki aktivni deo) i protein (drugi srodni član) is KTag (ili njegov biološki aktivni deo). U nekim izvođenjima, gde peptidni tag (prvi član) je KTag (ili njegov biološki aktivni deo) i protein (drugi srodni član) je SpyTag (ili njegov biološki aktivni deo ). U nekim izvođenjima, gde peptidni tag (prvi član) je SnoopTag (ili njegov biološki aktivni deo) i protein (drugi srodni član) je SnoopCatcher (ili njegov biološki aktivni deo). U nekim izvođenjima, gde peptidni tag (prvi član) je Izopeptag (ili njegov biološki aktivni deo) i protein (drugi srodni član) je Pilin-C (ili njegov biološki aktivni deo). U nekim izvođenjima, gde peptidni tag (prvi član) je SpyTag002 (ili njegov biološki aktivni deo) i protein (drugi srodni član) je SpyCatcher002 (ili njegov biološki aktivni deo).
[0038] U nekim izvođenjima, rekombinantni protein virusnog kapsida sadrži SpyTag. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, rekombinantni virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid ili virusni vektor sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u bilo kojoj SEQ ID NO navedenih u Tabeli 1 kao aminokiselinska sekvenca rekombinantnog proteina kapsida virusa. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 13. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 15. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 17. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:19. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 21. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:23. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:25. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:27. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:29. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:35. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 37. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid , i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:39.
[0039] U nekim izvođenjima, ovde opisani rekombinantni protein virusnog kapsida sadrži prvi član specifičnog vezujućeg para (peptidni tag) u kovalentnoj vezi sa drugim srodnim proteinskim članom specifičnog vezujućeg para izopeptidnom vezom. U nekim izvođenjima ovde opisani rekombinantni protein virusnog kapsida sadrži peptidni tag (prvi član) u kovalentnoj vezi sa polipeptidom adaptorom koji sadrži srodni protein (drugi član) operativno spojen sa ligandom za ciljanje. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje je operativno spojen sa proteinom (drugi član), npr., spojen sa proteinom, opciono preko linkera. Generalno, ligand za ciljanje može biti ostatak za vezivanje, npr., prirodni ligand, antitelo, multispecifični molekul za vezivanje, itd. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje je antitelo ili njegov deo.
U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje je antitelo koje sadrži varijabilni domen koji veže protein ćelijske površine na ciljnoj ćeliji i konstantni domen teškog lanca. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje je antitelo koje sadrži varijabilni domen koji veže protein ćelijske površine na ciljnoj ćeliji i konstantni domen teškog lanca IgG. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje je antitelo koje sadrži varijabilni domen koji veže protein ćelijske površine na ciljnoj ćeliji i konstantni domen teškog lanca IgG, gde konstantni domen teškog lanca IgG je operativno vezan, npr., preko linksera, za protein (npr., drugi član vezujućeg para protein:protein) koji obrazuje izopeptidnu kovalentnu vezu sa peptidnim tag-om. U nekim izvođenjima, ovde opisani rekombinantni protein kapsida sadrži SpyTag operativno u vezi sa proteinom virusa kapsida, i kovalentno u vezi sa SpyTag, polipeptidom adaptorom koji sadrži SpyCatcher vezan za ligand za ciljanje koji sadrži varijabilni domen antitela i domen teškog lanca IgG, gde SpyCatcher i domen teškog lanca IgG domain su vezani preko aminokiselinskog linkera, npr., GSGESG (SEQ ID NO:48). U nekim izvođenjima, polipeptid adaptor sadrži set sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO:46, koja sadrži sadrži deo teškog lanca humanog IgG4, pomenuti IgG4 deo ima sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO:49, spojenu pomoću linkera (SEQ ID NO:48) sa SpyCatcher (SEQ ID NO:3).
[0040] U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži SpyTag kovalentno vezan sa SpyCatcher spojenim za ligand za ciljanje. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u bilo kojoj SEQ ID NO navedeno u Tabeli 1 kao kodirajući rekombinantni protein virusnog kapsida i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid , i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 13 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 15 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 17 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:19 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 21 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:23 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:25 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:27 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:29 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:35 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 37 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:39 i adaptor polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:46.
[0041] Generalno, ligand za ciljanje specifično veže molekul ćelijske površine, npr., oligosaharid, receptor, marker ćelijske površine, itd., koji je eksprimiran na površini sisarske (npr., humane) eukariotske ćelije, npr., ciljne ćelije. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže (humanu) ćeliju jetre, (humanu) ćeliju mozga, (humanu) T ćeliju, (humanu) ćeliju bubrega, (humanu) ćeliju creva, (humanu) ćeliju pluća, (humanu) kanceroznu ćeliju, ili (humanu) ćeliju koja je inficirana sa heterolognim patogenom.
[0042] U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže receptor koji je eksprimiran od strane (humane) ćelije jetre, npr., asialoglikoproteinski receptor, npr., hASGR1. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže molekul koji je eksprimiran od strane (humane) neuronske ćelije, npr., GABA, transferin, itd. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže molekul eksprimiran od strane (humane) T ćelije, npr., CD3, npr., CD3ε. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže CD63. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže molekul eksprimiran od strane (humane) hematopoetske matične ćelije, npr, CD34. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže molekul eksprimiran od strane (humane) ćelije bubrega. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže molekule eksprimiran od strane (humane) mišićne ćelije, npr., integrin. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže molekule eksprimiran od strane (humane) ćelije kancera, npr., tumorski povezani antigen, npr., adipofilin, AIM-2, ALDH1A1, alfa-aktinin-4, alfa-fetoprotein ("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCR-ABL fuzioni protein b3a2, betakatenin, BING-4, CA-125, CALCA, karcinoembrionalni antigen ("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciklin D1, Ciklin-A1, dek-can fuzioni protein, DKK1, EFTUD2, faktor 2 elongacije, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, epitelijelni tumorski antigen ("ETA"), ETV6AML1 fuzioni protein, EZH2, E6, E7, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipikan-3, GnTV, gp100/Pme117, GPNMB, HAUS3, Hepsin, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, Intestinalna karboksilna esteraza, K-ras, Kalikrein 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KMHN-1, KMHN1 takođe poznat kao CCDC110, LAGE-1, LDLR-fukoziltransferazni AS fuzioni protein, Lengsin, M-CSF, MAGEA1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, malatni enzim, mamaglobin-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midkin, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucin, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miozin, klasa I Miozin, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P polipeptid, p53, PAP, PAX5, PBF, pml-RARalfa fuzioni protein, polimorfni epitelijelni mucin ("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernin 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX4, STEAP1, survivin, SYT-SSX1 ili -SSX2 fuzioni protein, TAG-1, TAG-2, Telomeraza, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosefosfatna izomeraza, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirozinaza, tirozinaza ("TYR"), VEGF, WT1, XAGElb/GAGED2a, Kras, NY-ESO1, MAGE-A3, HPV E2, HPV E6, HPV E7, WT-1 antigen (u limfomu i drugim solidnim tumorima), ErbB receptori, Melan A [MART1], gp 100, tirozinaza, TRP-1/gp 75, i TRP-2 (u melanomu); MAGE-1 i MAGE-3 (u bešici, glavi i vratu, i nesitnoćelijskom karcinomu); HPV EG i E7 proteini (u kanceru cerviksa); Mucin [MUC-1] (u dojci, pankreasu, debelom crevu, i kancerima prostate); antigen specifičan za prostatu [PSA] (u kanceru prostate); karcinoembrionalni antigen [CEA] (u debelom crevu, dojki, i gastroinstestinalnim kancerima), i takvi zajednički tumor-specifični antigeni kao što su MAGE-2, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE-1,2,8, CAGE-3 TO 7, LAGE-1, NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2-INT2, itd. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže E6 i/ili E7. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže Her2. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže CD63. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže humani receptor glukagona (hGCGR). U nekim izvođenjima, ligand za ponovno ciljanje veže humanu ektonukleozid trifosfat difosfohidrolazu 3 (hENTPD3).
[0043] Generalno, virusni kapsid koji sadrži ovde opisani rekombinantni protein virusnog kapsida nije sposoban da inficira ciljnu ćeliju u odsustvu liganda za ciljanje, npr., drugog člana u operativnoj vezi sa ligandom za ciljanje. Generalno, u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisanoin ima smanjeni ili ukinuti prirodni tropizam, npr., ima smanjeni kapacitet ili nije sposoban da cilja i da vezuje referentnu ćeliju prirodno permisivnu za transdukciju u poređenju sa referentnim kapsidom virusa, npr., kapsidom koji sadrži referentni protein kapsida virusa, npr., diivlji tip kontrolni protein virusnog kapsida ili protein virusnog kapsida koji bi bio identičan rekombinantnom proteinu virusnog kapsida ali za odsustvo liganda za ciljanje, i opciono jedan ili oba člana vezujućeg para protein:protein. U nekim izvođenjima, efikasnost transdukcije rekombinantnog proteina virusnog kapsida koji sadrži SpyTag je smanjena ili je ukinuta u poređenju sa kontrolnim divljim tipom proteina kapsida virusa.
[0044] U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 10% smanjenje u efikasnosti transdukcije, u poređenju sa odgovarajućim kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 20% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa odgovarajućim kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisanoin, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 30% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa odgovarajućim kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano u, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 40% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 50% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 60% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 70% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži a rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 75% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 80% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisanoin, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 85% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisanoin, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 90% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 95% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, pokazuje bar 99% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa kontrolnim kapsidom virusa divljeg tipa, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje, transdukcija kontrolne ćeliji virusnim kapsidom koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano se ukida, npr., nedetektabilna je, npr., korišćenjem postupaka kojima se meri ekspresija nukleotida od interesa, npr., reporterski testovi, itd.
[0045] Nasuprot tome, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kapsid koji sadrži peptidni tag kovalentno vezan za odgovarajući polipeptid adaptor, npr., srodni protein u operativnoj vezi sa ligandom za ciljanje, je sposoban da inficira ciljnu ćeliju, npr., ili delom ili u potpunosti obnovljen kapacitet za ciljanje i da vezuje referentnu ćeliju prirodno permisivnu za transdukciju u poređenju sa onom kod referentnog virusnog kapsida, npr., kapsida koji sadrži referentni protein kapsida virusa, npr., divlji tip kontrolni virusni protein kapsida. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 10% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 20% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 30% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 40% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 50% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 60% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1 U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 70% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 75% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 80% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 85% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 90% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 95% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je bar 99% efikasnosti transdukcije odgovarajuće kontrole divljeg tipa virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje identičnu efikasnost transdukcije sa odgovarajućom kontrolom divljeg tipa kapsida virusa, npr., navedeno u Tabeli 1.
[0046] Slično, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kapsid koji sadrži peptidni tag kovalentno vezan sa za odgovarajući polipeptid adaptor, npr., srodni protein u operativnoj vezi sa ligandom za ciljanje, je sposoban da inficira ćeliju, npr., ima pojačanu sposobnost za ciljanje i vezuje referentnu ćeliju koja je prirodno permisivna za transdukciju u poređenju sa referentnim kapsidom virusa koji je identičan rekombinantnom proteinu virusnog kapsida osim kada mu nedostaje jedan ili oba člana vezujućeg para protein:protein, npr., sadrži referentni protein kapsida. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 10% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 20% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 30% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 40% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 50% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 60% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 70% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 75% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 80% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 85% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 90% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 95% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1. U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, npr., navedeno u Tabeli 1, u kovalentnoj vezi sa odgovarajućim polipeptidom adaptorom pokazuje efikasnost transdukcije koja je 99% veća od efikasnosti transdukcije odgovarajućeg kontrolnog referentnog virusnog kapsida, npr., navedeno u Tabeli 1.
[0047] U nekim izvođenjima, virusni kapsid koji sadrži rekombinantni virusni kapsid protein kao što je ovde opisan je mozaični kapsid, na primer, sadrži najmanje dva seta proteina VP1, VP2 i/ili VP3, pri čemu je svaki set kodiran različitim genom cap, npr. sadrži rekombinantni virusni kapsid protein koji sadrži peptidni tag i referentni kapsidni protein koji ne sadrži peptidni tag u određenom odnosu. U nekim izvođenjima, referentni kapsidni protein je referentni kapsidni protein divljeg tipa u tome što sadrži aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa kapsidnog proteina sa istim serotipom kao rekombinantni virusni kapsidni protein. U nekim izvođenjima, referentni kapsidni protein je kontrolni referentni kapsidni protein po tome što sadrži aminokiselinsku sekvencu rekombinantnog virusnog kapsidnog proteina osim što kontrolnom referentnom kapsidnom proteinu nedostaje peptidni tag. U nekim izvođenjima, referentni kapsidni protein je mutirani referentni protein divljeg tipa po tome što sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski identičnu onoj od kapsidnog proteina divljeg tipa koji ima isti serotip kao rekombinantni virusni kapsidni protein, ali za mutaciju (npr., deleciju sekvence aminokiselina, umetanje aminokiselinske sekvence, himerizacija, itd.) koja smanjuje tropizam divljeg tipa kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, ovde opisana kompozicija sadrži, ili ovde opisani postupak kombinuje, rekombinantni protein virusnog kapsida i referentni kapsidni protein u odnosu koji je u opsegu od 1:1 do 1:15. U nekim izvođenjima, odnos je 1:2. U nekim izvođenjima odnos je 1:3. U nekim izvođenjima, odnos je 1:4. U nekim izvođenjima, odnos je 1:5. U nekim izvođenjima, odnos je 1:6. U nekim izvođenjima, odnos je 1:7. U nekim izvođenjima, odnos je 1:8. U nekim izvođenjima, odnos je 1:9. U nekim izvođenjima, odnos je 1:10. U nekim izvođenjima, odnos je 1:11. U nekim izvođenjima, odnos je 1:12. U nekim izvođenjima, odnos je 1:13. U nekim izvođenjima, odnos je 1:14. U nekim izvođenjima, odnos je 1:15.
[0048] U nekim izvođenjima, ovde opisana kompozicija sadrži, ili postupak koji je ovde opisan kombinuje rekombinantni protein virusnog kapsida naveden u Tabeli 1 i njegov referentni kapsidni protein (ili kombinaciju njegovih referentnih kapsidnih protina), takođe prikazanih Tabeli 1, u odnosu (rekombinantni kapsidni protein:referentni kapsidni protein(i)) u odnosu 1:1 prema 1:15. U nekim izvođenjima, odnos je 1:2. U nekim izvođenjima, odnos je 1:3. U nekim izvođenjima, odnos je 1:4. U nekim izvođenjima, odnos je 1:5. U nekim izvođenjima, odnos je 1:6.U nekim izvođenjima, odnos je 1:7. U nekim izvođenjima, odnos je 1:8. U nekim izvođenjima, odnos je 1:9. U nekim izvođenjima, odnos je 1:10. U nekim izvođenjima, odnos je 1:11. U nekim izvođenjima, odnos je 1:12. U nekim izvođenjima, odnos je 1:13. U nekim izvođenjima, odnos je 1:14. U nekim izvođenjima, odnos je 1:15.
[0049] Tabela 1 obezbeđuje brojeve identifikatore sekvenci (SEQ ID NOs) izlažući sekvence aminokiselina (1) primera i neograničavajućih rekombinantnih virusnih kapsidnih proteina koji sadrže ovde opisani peptidni tag, (2) primere i neograničavajuće primere odgovarajućih kontrolnih (C) divljih tipova virusnih kapsidnih proteina koji se po potrebi mogu koristiti kao referenca za određivanje smanjenja ili ukidanja efikasnosti transdukcije rekombinantnog kapsidnog proteina koji sadrži kovalentni proteinski tag u odsustvu vektora za ciljanje, i (3) primere i neograničavajuće primere odgovarajućih referentnih virusnih kapsidnih proteina za proizvodnju mozaičnih kapsida i/ili upotrebu kao referencu za određivanje uspostavljavljanja efikasnosti transdukcije rekombinantnog kapsidnog proteina koji sadrži vezujući par protein:protein i ligand za ciljanje.
Tabela 1
(nastavak)
[0050] Generalno, rekombinantni virusni vektori kao što su ovde opisani sadrže virusni kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano, uključujući kapside mozaičnih virusa, pri čemu virusni kapsid inkapsulira nukleotid od interesa. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje rekombinantnu virusnu česticu koja sadrži nukleotid od interesa koji je inkapsuliran sa rekombinantnim proteinom kapsida iz ovog pronalaska. U nekim izvođenjima, nukleotid od interesa je pod kontrolom promotora koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz virusnog promotora, bakterijskog promotora, sisarskog promotora, ptičjeg promotora, ribljeg promotora, promotora insekta, i bilo kojom njihovom kombinacijom. U nekim izvođenjima, nukleotid od interesa je pod kontrolom nehumanog promotora. U nekim izvođenjima, promotor je citomegalovirusni (CMV) promotor. U nekim izvođenjima, promotor je EF1α promotor. U nekim izvođenjima, promotor je CAGG promotor. U nekim izvođenjima, promotor je Ubikvitin C (UbC) promotor.
[0051] Generalno, nukleotid od interesa može biti jedan ili više gena, koji mogu kodirati detektabilni marker, npr. reporter ili terapeutski polipeptid. U nekim izvođenjima, nukleotid od interesa je reporterski gen. U nekim izvođenjima, nukleotid od interesa je reporterski gen koji kodira detektabilni marker izabran iz grupe koju čine zeleni fluorescentni protein, luciferaza, b-galaktozidaza itd. U nekim izvođenjima, detektabilni marker je zeleni fluorescentni protein. U drugim izvođenjima, nukleotid od interesa je izabran iz grupe koju čine samoubilački gen, nukleotid koji kodira antitelo ili njegov fragment, nukleotid koji kodira CRISPR/Cas sistem ili njegov deo(love), nukleotid koji kodira antisens RNK, a nukleotid koji kodira siRNK, izlučeni enzim, gen koji kodira terapeutski protein, itd. U jednom aspektu, nukleotid od interesa kodira multidomenski terapeutik, npr. protein koji sadrži najmanje dva domena koji obezbeđuju dve različite funkcije.
[0052] Kompozicije koje su ovde opisane generalno sadrže virusni vektor koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisan, npr. sadrži kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida (uključujući mozaični kapsid), pri čemu kapsid inkapsulira nukleotid od interesa. U nekim izvođenjima, ovde opisana kompozicija sadrži (1) virusni vektor koji ima kapsid koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida koji je opisan ovde, i (2)) farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži: (a) virusni protein kapsida ili virusnu česticu ovog pronalaska; i (b) farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0053] Ovde su takođe opisani postupci za pravljenje i korišćenje rekombinantnih virusnih kapsidnih proteina, virusnih vektora koji ih sadrže, kompozicija, itd. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje virusnu česticu ili kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u postupku isporuke nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koja sadrži kontakt ciljne ćelije sa navedenom virusnom česticom ili pomenutom kompozicijom, pri čemu virusni kapsid protein sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje protein eksprimiran na površini ciljne ćelije. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje metod za isporuku nukleotida od interesa u in vitro ciljnu ćeliju koji se sastoji u dovođenju u kontakt ciljne ćelije sa virusnom česticom ili kompozicijom ovog pronalaska, pri čemu virusni kapsid protein sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje eksprimirani protein na površini ciljne ćelije U nekim izvođenjima, in vitro metode preusmeravanja virusa, npr. adenovirusa, adeno-povezanog virusa, itd.; isporuka dijagnostičkog/terapeutskog tereta ciljnoj ćeliji, itd. obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa rekombinantnim virusnim vektorom koji sadrži rekombinantni virusni kapsid protein ovog pronalaska, pri čemu virusni kapsid ili virusni vektor sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje eksprimirani protein na površini ciljna ćelija. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje virus ovog pronalaska za upotrebu u postupcima preusmeravanja virusa, npr., adenovirus, adeno-povezan virus, itd.; isporuku dijagnostičkog/terapeutskog tereta ciljnoj ćeliji, itd. koji obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa rekombinantnim virusnim vektorom koji sadrži rekombinantni virusni kapsid protein ovog pronalaska, pri čemu virusni kapsid ili virusni vektor sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje eksprimirani protein na površini ciljna ćelija. Takve metode mogu uključivati, virusni vektori ovog pronalaska mogu biti za upotrebu u postupcima koje uključuju, kao prvi korak, proizvodnju rekombinantnog virusnog vektora, npr. kultivisanje ćelije za pakovanje u uslovima dovoljnim za proizvodnju virusnih vektora, pri čemu pakovanje ćelija sadrži plazmid koji kodira kapsid protein koji sadrži peptidni tag (prvi član) u odsustvu ili prisustvu plazmida koji kodira referentni kapsidni protein, inkubirajući rekombinantni kapsidni protein sa drugim srodnim članom koji je operativno povezan sa ciljanim ligandom, itd. U nekim izvođenjima, ciljna ćelija je (humana) ćelija jetre, (mozaični) rekombinantni virusni vektor sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje asijaloglikoproteinski receptor, npr. (h)ASGR1. U nekim izvođenjima, ciljna ćelija je (humana) neuronska ćelija, (mozaični) rekombinantni virusni vektor sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje GABA, transferin receptor itd. U nekim izvođenjima, ciljna ćelija je (humana) T ćelija, (mozaični) rekombinantni virusni vektor sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje CD3, npr., CD3e. U nekim izvođenjima, ciljna ćelija je (humana) hematopoetska matična ćelija, (mozaični) rekombinantni virusni vektor sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje CD34. U nekim izvođenjima, ciljna ćelija je (humana) ćelija bubrega. U nekim izvođenjima, ciljna ćelija je (humana) mišićna ćelija, (mozaični) rekombinantni virusni vektor sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje integrin. U nekim izvođenjima, ciljna ćelija je (humana) ćelija kancera, (mozaični) rekombinantni virusni vektor sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje antigen povezan sa tumorom, npr. E6 i E7, Her2, itd. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje humani receptor glukagona (hGCGR).
[0054] Ovde su takođe opisani postupci inaktivacije virusnog kapsida i/ili proizvodnje virusnih vektora, postupci generalno obuhvataju (a) umetanje nukleinske kiseline koja kodira heterologni protein u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein virusnog kapsida da bi se formirala nukleotidna sekvenca koja kodira genetički modifikovani protein kapsida koji sadrži peptidni tag (u odsustvu ili prisustvu plazmida koji kodira referentni protein kapsida) i/ili (b) kultivisanje paketa ćelija pod uslovima dovoljnim za proizvodnju virusnih vektora, pri čemu paket ćelija sadrži nukleotidnu sekvencu. U nekim realizacijama, ćelijski paket dalje sadrži pomoćni plazmid i/ili transfer plazmid koji sadrži nukleotid od interesa. U nekim izvođenjima, postupci dalje obuhvataju izolovanje samokomplementarnih adeno-povezanih virusnih vektora iz supernatanta kulture. U nekim izvođenjima, postupci dalje obuhvataju liziranje ćelije za pakovanje i izolovanje jednolančanih adeno-povezanih virusnih vektora iz ćelijskog lizata. U nekim izvođenjima, postupci dalje obuhvataju (a) čišćenje ćelijskog debrisa, (b) tretiranje supernatanta koji sadrži virusne vektore sa nukleazama, npr. Dnaza I u prisustvu MgCl2, (c) koncentriranje virusnih vektora, (d) prečišćavanje virusnih vektora, i (e) bilo koja kombinacija (a)-(d). Ovde su takođe obezbeđeni virusni vektori napravljeni u skladu sa postupkom koji je ovde opisan, i ćelije za pakovanje korisne za proizvodnju virusnog vektora kao što je ovde opisano, npr. ćelije za pakovanje koje sadrže plazmid koji kodira opisani rekombinantni kapsidni protein.
KRATAK OPIS NACRTA
[0055] Patent ili datoteka prijave sadrži bar jedan nacrt koji je izveden u boji. Kopije ovog patenta ili objave prijave patenta sa nacrtom(ima) u boji će biti obezbeđeni Kancelariji po zahtevu i uplati neophodne takse.
Slika 1 predstavlja dijagrame rasejanja dobijene fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) koji procenjuju ekspresiju zelenog fluorescentnog proteina (GFP) pomoću HER2-pozitivnih (+) 293 hErbB2 ili HER2-negativnih (-) 293 parentalnih ćelija, bilo "neinficiranih" ili ćelija inficiranih sa "AAV2 N587-SpyTag" česticama ili ćelijama zaraženim "AAV2 N587-SpyTag C6.5-SpyC" česticama. Kapsidi oba virusa sadrže sledeće mutacije: R585A, delR588 i umetanje peptida SpyTag (SEK ID NO:1) direktno posle sledećeg ostatka N587 (SEQ ID NO:13). C6.5-SpyC čestice su konjugovane sa anti-HER2 scFv (C6.5) fuzionisane sa SpyCatcher (SEQ ID NO: 3) preko SpyTag. Virusi eksprimiraju GFP kao marker transdukcije.
Slika 2 predstavlja dijagrame rasejanja dobijene fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) koji procenjuju ekspresiju zelenog fluorescentnog proteina (GFP) pomoću HER2-pozitivnih (+) 293 hErbB2 ili HER2-negativnih (-) 293 parentalih ćelija ili „neinficiranih“ ili ćelija inficiranih sa "AAV2 N587-SpyTag" česticama ili ćelijama zaraženim "AAV2 N587-SpyTag SpyC-anti-HER2" česticama. Kapsidi oba virusa sadrže sledeće mutacije: R585A, delR588 i umetanje peptida SpyTag (SEQ ID NO:1) direktno posle ostatka N587 (SEQ ID NO:13). SpyC-anti-HER2 čestice su konjugovane sa anti-HER2 antitelom (HERCEPTIN®) spojenim sa SpyCatcher-om (SEQ ID NO: 3) preko SpyTag-a. Virusi eksprimiraju GFP kao marker transdukcije.
Slika 3 predstavlja dijagrame rasejanja dobijene fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) koji procenjuju ekspresiju zelenog fluorescentnog proteina (GFP) pomoću HER2-pozitivnih (+) 293 hErbB2 ili HER2-negativnih (-) 293 parentalnih ćelija inficiranih česticama ili ćelijama "AAV2 divljeg tipa" inficiran sa "AAV2 G453-SpiTag SpyC-anti-HER2" česticama. Kapsidi "AAV2 divljeg tipa" nemaju mutacije ili modifikacije (SEQ ID NO: 9), dok je kapsid "AAV2 G453-SpyTag" mozaična virusna čestica koja se sastoji od 1:7 odnosa između "SpyTag" kapsidnih proteina u koji je insertovan SpyTag direktno posle ostatka G453 linkerom od 10 aminokiselina bočno sa obe strane (SEQ ID NO:29) i kapsida "AAV2 HBM" bez SpyTag, ali koji sadrže mutacije R585A i R588A (SEQ ID NO:11). Čestice mozaika AAV2 G453-SpyTag su konjugovane sa anti-HER2 antitelom (HERCEPTIN®) spojenim sa SpyCatcher-om (SEQ ID NO:3) preko SpyTag-a. Virusi izražavaju GFP kao marker transdukcije.
Slika 4A predstavlja Western blot korišćenjem B1 antitela, koje prepoznaje linearni epitop koji dele AAV2 VP1, VP2 i VP3 kapsidni proteini, analizirajući reakciju između anti-HER2 scFv fuzionisanog sa SpyCatcher-om "SpyC-anti¬Her2 scFv", i panela virusnih čestica AAV2 koji se sastoji od kapsida sa sledećim mutacijama: R585A, delR588 i umetanjem peptida SpyTag direktno nakon ostatka N587, okružen linkerima aminokiselina različitih dužina (Linker 1, Linker 2, Linker 4, Linker 6, Linker 8 i Linker 10) (SEQ ID NO:13,15,17,19,21,23,25).
Slika 4B predstavlja procenat HER2+ ćelija (siva, y-osa) koje eksprimiraju GFP u odnosu na procenat HER2-ćelija koje eksprimiraju GFP (crne, y-osa) 5 dana nakon infekcije virusnim česticama AAV2 koje se sastoje od kapsida sa sledećim mutacijama: R585A, delR588 i N587-SpyTag sa aminokiselinskim linkerima naznačene dužine (Linker 1, Linker 2, Linker 4, Linker 6, Linker 8 i Linker 10) (SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19 , 21, 23 i 25, tim redom) (x-osa). AAV2 N587 SpyTag čestice su konjugovane na anti-HER2 scFv spojenim sa SpyCatcher (SEQ ID NO:3).
Slika 5A predstavlja Western blot korišćenjem B1 antitela, koje prepoznaje linearni epitop koji dele AAV2 VP1, VP2 i VP3 kapsidni proteini, analizirajući reakciju između anti-HER2 antitela (HERCEPTIN®) fuzionisanog sa Spy-Catcher-om "SpyC- anti-Her2 antitelo", i panelom AAV2 virusnih čestica koje se sastoje od kapsida sa sledećim mutacijama: R585A, delR588 i umetanjem SpyTag peptida direktno posle sledećeg ostatka N587, flanked by aminokiselinskim linkerima različite dužine (bez linkera, Linker 1 , Liinker 2, Linker 4, Linker 6, Linker 8 i Linker 10) (SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, 23 i 25, tim redom)
Slika 5B predstavlja procenat HER2+ ćelija (siva, y-osa) koje eksprimiraju GFP u odnosu na procenat HER2-ćelija koje eksprimiraju GFP (crna, y-osa) 5 dana nakon infekcije divljim (wt) AAV2 česticama ili AAV2 virusom čestice koje se sastoje od kapsida sa sledećim mutacijama: R585A, delR588 i N587-SpyTag sa aminokiselinskim linkerima naznačene dužine (bez linkera, linker 1, linker 2, linker 4, linker 6, linker 8 i linker 10) (SEQ ID NO.: 13, 15, 17, 19, 21, 23 i 25, tim redom) (x-osa). AAV2 N587 SpyTag čestice su konjugovane sa anti-HER2 antitelom (HERCEPTIN®) spojenim sa SpyCatcher-om (SEQ ID NO:3).
Slika 6A obezbeđuje western blot upotrebom B1 antitela, koje prepoznaje linearni epitope koji dele AAV2 VP1, VP2, i VP3 proteini kapsida, analizirajući reakciju između anti-HER2 scFv C6.5 spojenog sa SpyCatcher (SEQ ID NO:3) "SpyC-anti-HER2 scFv" i panelom mozaičnih AAV2 virusnih čestica koje se sastoje iz smeša između "SpyTag" proteina kapsid koji sadrži mutacije R585A, delR588, i N587-linker 10-SpyTag (SEQ ID NO:25), i "HBM" proteina kapsida koji sadrži mutacije R585A i R588A, ali ne SpyTag (SEQ ID NO:11). "SpyTag" i "HBM" proteini kapsida su pomešani u različitim odnosima (1:0, 1:1, i 1:3).
Slika 6B obezbeđuje procenat HER2+ 293 hErbB2 ćelija (sivi stubići) i HER2-293 parentalne ćelije (crni stubići) koje eksprimiraju GFP (y-osa) 5 dana nakon infekcije sa mozaičnim AAV2 virusnim česticama (x-osa) koja sadrži smeše između "Linkera 10" proteina kapsida koji sadrže mutacije R585A, delR588, i N587-linker 10-SpyTag (SEQ ID NO:25), i "HBM" proteina kapsida koji sadrži mutacije R585A i R588A, ali ne SpyTag (SEQ ID NO:11). "Linker 10" i "HBM" proteini kapsida su pomešani u različitim odnosima (1:0, 3:1, 1:1, i 1:3), i konjugovani su sa anti-HER2 scFv spojenim sa SpyCatcher (SEQ ID NO:3).
Slika 7A obezbeđuje “western blot” upotrebom B1 antitela, koje prepoznaje linearni epitop koji dele AAV2 VP1, VP2, i VP3 proteini kapsida, analizirajući reakciju između anti-HER2 antitela (HERCEPTIN<®>) spojenog sa Spy-Catcher (SEQ ID NO:3) "SpyC-anti-HER2 antitelo" i panelom mozaika AAV2 čestica virusa koji sadrži smešu između "SpyTag" proteine kapsida koji sadrže mutacije R585A, delR588, i N587-linker 10-SpyTag (SEQ ID NO:25), i "HBM" proteine kapsida koji sadrže mutacije R585A i R588A, ali bez SpyTag (SEQ ID NO:11). "SpyTag" i "HBM" proteini kapsida su pomešani u različitim odnosima (1:0, 3:1, 1:1, i 1:3).
Slika 7B obezbeđuje procenat HER2+ 293 hErbB2 ćelija (sive kolone) i HER2-293 parentalne ćelije (crne kolone) koji eksprimiraju GFP (y-osa) 5 dana nakon infekcije sa mozaičnim česticama virusa AAV2 (xosa) koji sadrži smešu između "Linkera 10" proteina kapsida koji sadrži mutacije R585A, delR588, i N587-linker 10-SpyTag (SEQ ID NO:25), i "HBM" proteina kapsida koji sadrži mutacije R585A i R588A, ali ne SpyTag (SEQ ID NO:11). "Linker 10" i "HBM" proteini kapsida su pomešani u različitim odnosima (1:0, 3:1, 1:1, i 1:3), i konjugovani su sa anti-HER2 antitelom (HERCEPTIN<®>) spojenim sa SpyCatcher (SEQ ID NO:3).
Slika 8A obezbeđuje “western blot” upotrebom B1 antitela, koje prepoznaje linearni epitop koji dele AAV2 VP1, VP2, i VP3 proteini kapsida, analiziranjem reakcije između anti-HER2 antitela (HERCEPTIN<®>) spojenog sa Spy-Catcher (SEQ ID NO:3) "SpyC-anti-HER2 antitelo" i panelom mozaka čestica virusa AAV2 koji se nalaze u smeši između "SpyTag" proteina kapsida i "HBM" proteina kapsida koji sadrži mutacije R585A i R588A, ali ne SpyTag (SEQ ID NO:11). "SpyTag" proteini kapsida uključuju "G453 SpyTag", koji sadrži mutacije R585A, R588A i insercija SpyTag peptida direktno nakon ostatka G453 (SEQ ID NO:27), i "G453 Linker10 SpyTag", koji sadrži mutacije R585A, R588A i insercija SpyTag peptida direktno nakon ostatka G453 i bočno sa obe strane linkerom od 10 aminokiselina (SEQ ID NO:29). Naznačeni "G453 SpyTag" i "G453 Linker10 SpyTag" kapsidi su pomešani sa "HBM" kapsidima u različitim odnosima (1:0, 1:3, i 1:7).
Slika 8B obezbeđuje procenat HER2+ 293 hErbB2 ćelija (sivi stubići) i HER2-293 parentalnih ćelija (crni stubići) koji eksprimiraju GFP (y-osa) 5 dana nakon infekcije sa divljim tipom "wt" ili mozaikom AAV2 čestica virusa (x-osa) koji sadrži smešu između "G453 SpyTag" proteina kapsida koji sadrži mutacije R585A, R588A, i inserciju SpyTag peptida direktno nakon ostatka G453 (SEQ ID NO:27), ili "G453 Linker 10 SpyTag" proteine kapsida koji sadrže mutacije R585A, R588A, i inserciju SpyTag peptida direktno nakon ostatka G453 i bočno u odnosu na obe strane 10 linker aminokiselina (SEQ ID NO:29), i "HBM" proteine kapsida koji sadrže mutacije R585A i R588A, ali ne SpyTag (SEQ ID NO:11). "G453 SpyTag" ili "G453 Linker10 SpyTag" i "HBM" kapsidi su pomešani u različitim odnosima (1:0 "čist", 1:3, i 1:7), i konjugovani su sa anti-HER2 antitelom (HERCEPTIN<®>) spojenim sa SpyCatcher (SEQ ID NO:3).
Slika 9 obezbeđuje grafikone rasejanja dobijene iz sortiranja ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS) ispitivanjem eskpresije zelenog fluorescentnog proteina (GFP) od strane ćelija koje su pozitivne (+) za ASGR1 ekspresiju nakon infekcije sa "AAV2 wt" česticama, "AAV2 SpyTag bez antitela" česticama, ili "AAV2 SpyTag Anti-ASGR1" česticama. "AAV2 wt" kapsidi su divljeg tipa bez mutacija ili modifikacija (SEQ ID NO:9), dok "AAV2 SpyTag" kapsid sadrži sledeće mutacije: R585A, delR588, i inserciju SpyTag peptida direktno u sledeći ostatak N587 (SEQ ID NO:13). "AAV2 SpyTag Anti-ASGR1" čestice su konjugovane za SpyCatcher-spojeno antitelo koje specifično vezuje ASGR1. Takođe su prikazani grafikoni rasejanja koji su dobijeni iz sortiranja ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS) ispitivanjem ekspresije zelenog fluorescentnog proteina (GFP) od strane ćelija koje su pozitivne (+) za CD63 nakon infekcije sa"AAV2 divlji tip" česticama, "AAV2 SpyTag bez antitela" česticama, ili "AAV2 SpyTag Anti-CD63" česticama. "AAV2 divlji tip" kapsidi su divljeg tipa bez mutacija ili modifikacija (SEQ ID NO:9), dok "AAV2 SpyTag" kapsid sadrži sledeće mutacije: R585A, delR588, i inserciju SpyTag peptida direktno nakon ostatka N587 (SEQ ID NO:13). "AAV2 SpyTag Anti-CD63" čestice su konjugovane za SpyCatcherspojeno antitelo koje specifično vezuje CD63. Virusi eksprimiraju GFP kao marker transdukcije. Takođe su poznati grafikoni rasejanja koji su dobijeni iz sortiranja ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS) ekspresije zelenog fluorescentnog proteina (GFP) od strane ćelija koje su pozitivne (+) za PTPRN nakon infekcije sa"AAV9 divlji tip" česticama, "AAV2 SpyTag Irelevantno Antitelo" česticama, ili "AAV2 SpyTag Anti-PTPRN" česticama. "AAV9 divlji tip" kapsidi su divljeg tipa bez mutacija ili modifikacija (SEQ ID NO:31), dok "AAV2 SpyTag" kapsidi su mozaici virusnih čestica koje se sastoje iz 1:7 odnosa između "SpyTag" proteina kapsida pri čemu je SpyTag insertovan direktno nakon ostatka G453 bočno sa obe strana 10 aminokiselinski linker (SEQ ID NO:29) i između kapsida bez SpyTag ali koji sadrži Myc tag aminokiselinsku sekvencu insertovanu direktno nakon ostatka N587 (SEQ ID NO:53) koja smanjuje prirodno vezivanje receptora. "AAV2 SpyTag Irelevantno Antitelo" čestice su konjugovane za SpyCatcher-spojeno antitelo koje ne vezuje PTPRN. "AAV2 SpyTag Anti-PTPRN" čestice su konjugovane za SpyCatcher-spojeno antitelo koje specifično vezuje PTPRN. Virusi eksprimiraju GFP kao marker transdukcije. Takođe su prikazani rezultati luciferaznog testa kojim se procenjuje ekspresija luciferaze svica od strane ćelija koje su pozitivne (+) za hENTPD3 nakon infekcije sa"AAV2 divlji tip" česticama, "AAV2 irelevantno mAt" česticama, "AAV2 Anti-ENTPD3" česticama, i "AAV2 Anti-hCD20" česticama. "AAV2 divlji tip" kapsidi su divljeg tipa bez mutacija ili modifikacija (SEQ ID NO:9), dok "AAV2 antitelo" kapsidi sadrže sledeće mutacije: R585A, delR588, i inserciju SpyTag peptida koja direktno prati N587 (SEQ ID NO: 13). "AAV2 irelevantno mAt" čestice su konjugovane za SpyCatcher-spojeno antitelo koje ne vezuje hENTPD3. "AAV2 anti-hCD20" čestice su konjugovane za SpyCatcher-spojeno antitelo koje specifično vezuje hCD20, koje nije ekspimirano na hENTPD3+ ćelijama i služi kao dodatna negativna kontrola. "AAV2 anti-ENTPD3" čestice su konjugovane za SpyCatcher-spojeno antitelo koje specifično vezuje hENTPD3. Virusi eksprimiraju luciferazu svica kao marker transdukcije. Takođe su prikazani rezultati luciferaznog testa kojim se procenje ekspresija luciferase svica u ćelijama koje su pozitivne (+) za hCD20 nakon infekcije sa "AAV2 divlji tip" česticama, "AAV2 irelevantno mAt" česticama, "AAV2 Anti-ENTPD3" česticama, i "AAV2 Anti-hCD20" česticama. "AAV2 divlji tip" kapsidi su divljeg tipa bez mutacija ili modifikacija (SEQ ID NO:9), dok "AAV2 antitelo" kapsidi sadrže sledeće mutacije: R585A, delR588, i inserciju SpyTag peptida direktno nakon ostatka N587 (SEQ ID NO:13). "AAV2 irelevantno mAt" čestice su konjugovane za SpyCatcher-spojeno antitelo koje ne vezuje hENTPD3. "AAV2 anti-ENTPD3" čestice su konjugovane za SpyCatcher-spojeno antitelo koje specifično vezuje hENTPD3, koji nije eksprimiran na hCD20+ ćelijama i služi kao dodatna negativna kontrola. "AAV2 anti-hCD20" čestice su konjugovane za Spy-Catcher-spojeno antitelo koje specifično veže hCD20. Virusi eksprimiraju luciferazu svica kao marker transdukcije.
Slika 10A obezbeđuje “western blot” upotrebom B1 antitela, koji prepoznaje linearni epitop koji dele AAV9 VP1, VP2, i VP3 proteini kapsida, analiziranjem reakcije između anti-HER2 antitela (HERCEPTIN<®>) spojenog sa SpyCatcher (SEQ ID NO:3) "SpyC-Herceptin" i panelom AAV9 virusnih čestica. Ove AAV9 virusne čestice se sastoje iz kapsida koji sadrži mutaciju W503A, što smanjuje vezivanje receptora, i insercija SpyTag peptida direktno posle ostatka A589 ili G453 bez linkera ili je bočno sa obe strane linkerom 10 aminokiselina, ili mozaične AAV9 čestice virusa koji sadrži 1:7 odnos između "SpyTag" proteine kapsida koje sadrže mutacije W503A i ili A589-Linker10-SpyTag ili G453-Linker10-SpyTag, sa "W503A" proteinima kapsida koji sadrže mutaciju W503A, ali bez SpyTag.
Slika 10B obezbeđuje procenat HER2+ 293 hErbB2 ćelija (sivi stubići) i HER2-293 parentalnih ćelija (crni stubići) (y-osa) koje eksprimiraju GFP pet dana nakon infekcije sa AAV9 česticama virusa konjugovanim za anti-HER2 antitelo (HERCEPTIN<®>) spojenim sa SpyCatcher (x-osa). Ove AAV9 čestice virusa se sastoje iz kapsida koji sadrže mutaciju W503A, koja smanjuje vezivanje receptora, i inserciju SpyTag peptida direktno nakon ostatka A589 (ili G453) bez linkera ili bočno sa strana 10 aminokiselinskim linkerom, ili mozaičnim AAV9 virusnim česticama koje sadrže u 1:7 odnosu između "SpyTag" proteina kapsida koji sadrži mutacije W503A ii li A589-Linker10-SpyTag ili G453-Linker10-SpyTag, sa "W503A" proteinima kapsida koji sadrže mutaciju W503A, ali bez SpyTag. Virusi eksprimiraju GFP kao marker transdukcije.
Slika 11 obezbeđuje immunofluorescentske mikroskopske slike uzoraka jetre uzzetih iz C57BL/6 miševa transgene modifikovanih da eksprimiraju humani ASGR1 na ćelijama jetre. Uzorci su sakupljeni deset dana nakon intravenozne injekcije sa fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) ili sa 2.5x10<11>virusnim genomom (vg)/ životinja SpyTagged AAV2 čestica koje nose CAGG eGFP nukleotid od interesa i modifikovanim sa (1) SpyCatcher-anti-human CD3 antitelom (AAV SpyT-anti-hCD3 CAGG eGFP) ili (2) SpyCatcher-anti-human ASGR1 antitelom (AAV SpyT-anti-hASGR1 CAGG eGFP). Miševi su žrtvovani i transkardijalno perfuzionisani sa 4% PFA. Organi jetre, bubrega i srca su sakupljeni i dehidratisani u 15% saharozi zatim u 30% saharozi. Zatim su organi krio-presečeni na pločicama i obojeni sa kokošjim anti-EGFP antitelom (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) i Alexa-488 konjugovanim antikokošjim sekundarnim antitelom (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA). Svaka slika predstavlja jednog miša. "SpyTagged AAV2" kapsid sadrži sledeće mutacije: R585A, delR588, i inserciju SpyTag peptida direktno nakon ostatka N587 (SEQ ID NO:13). Virusi eksprimiraju eGFP kao marker transdukcije.
Slika 12 obezbeđuje snimke luminiscencije pojedinačnih miševa koji ne eksprimiraju humani ASGR1 na ćelijama jetre (Kontrola) i genetički modifikovani miševi koji eksprimiraju humani ASGR1 na ćelijama jetre (ASGR1 Humanizovani miševi) 14 dana nakon intravenozne injekcije sa fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) ili sa 3.0x10<11>virusnim genomima (vg)/ životinje divljeg tipa (divlji tip) AAV2 čestice, ili SpyTagged AAV2 čestice koje nose nukleotid od interesa luciferase svica i koji su modifikovani sa (1) SpyCatcher-anti-humanim CD63 antitelom ili (2) SpyCatcher-anti-humanim ASGR1 antitelom. Ove AAV2 virusne čestice su mozaične virusne čestice koje sadrže 1:7 odnos između "SpyTag" proteina kapsida pri čemu SpyTag je insertovan direktno nakon ostatka G453 bočno na stranama 10 aminokiselinskog linkera (SEQ ID NO:29) i između kapsida bez SpyTag ali koji sadrži Myc tag aminokiselinsku sekvencu insertovanu direktno nakon ostatka N587 (SEQ ID NO:53) koja smanjuje vezivanje prirodnog receptora. Virusi eksprimiraju luciferazu svica kao marker transdukcije. Miševi su anestezirani korišćenjem izoflurana, ubrizgan im je supstrat luciferin i snimani su 10 minuta kasnije upotrebom IVIS Spektra In Vivo Sistema za snimanje (PerkinElmer).
Slika 13 obezbeđuje snimke luminiscencije uzoraka jetre i pankreasa uzetih iz C57BL/6 miševa 4 nedelja nakon intravenozne injekcije sa fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) ili sa 1.0x10<12>virusnim genomom (vg)/ životinja divljeg tipa (wt) AAV9 čestica, ili sa 1.0x10<13>virusnim genomom (vg)/ životinja SpyTagged AAV2 čestica koje nose CMV eGFP nukleotid od interesa i modifikovanim sa (1) SpyCatcher-anti-human ASGR1 antitelom (AAV2 SpyTag irelevantno mAt) ili (2) SpyCatcher-antihuman ENTPD3 antitelo antitelo (AAV2 SpyTag anti-ENTPD3). Miševi su žrtvovani i jetra i pankreas su sakupljeni i fiksirani u 10% neutralnom puferisanom formalinu. Zatim su organi postavljeni i kriopresečeni na pločicama i obojeni su sa anti-GFP antitelima. Svaka slika predstavlja jednog miša. Ove čestice virusa AAV2 su mozaične virusne čestice koje sadrže odnos 1:7 između "SpyTag" proteina kapsida pri čemu je SpyTag insertovan direktno u sledeći ostatak G453 bočno u odnosu na obe strane sa linkerom 10 aminokiselina (SEQ ID NO:29) i između kapsida bez SpyTag ali koji sadrži Myc tag aminokiselinsku sekvencu insertovanu direktno nakon ostatka N587 (SEQ ID NO:53) koja smanjuje vezivanje prirodnog receptora. Virusi eksprimiraju eGFP kao marker transdukcije. ENTPD3 je prijavljen da se eksprimuje u ćelijama pankreasnih ostrvaca i u jeziku, među ostalim ćelijskim tipovima, ali ne u jetri. SpyTagged AAV2 čestice su detargetirane sa jetre; eGFP ekspresija nije uočena u jetrama miševa kojima su ubrizgani "AAV2 SpyTag irelevantno mAt" ili "AAV2 SpyTag anti-ENTPD3" čestice. Pozitivno bojenje u ostrvcima pankreasa je detektovano u uzorku pankreasa jednog od miševa kome su ubrizgane "AAV2 SpyTag anti-ENTPD3" čestice.
Slika 14 prikazuje imunohistohemijske slike uzoraka jetre i jezika uzetih od miševa C57BL/614 dana nakon intravenske injekcije sa sa fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) ili sa 2,0X10<12>virusnog genoma (vg)/životinja divljeg tipa (wt) AAV9 čestica, ili SpyTagged AAV2, koji nosi CMV eGFP nukleinsku kiselinu od interesa i modifikovan je (1) SpyCatcher-anti-humanim ASGR1 antitelom (AAV2 SpiTag irelevantno mAt) ili (2) SpyCatcher-anti-humanim ENTPD3 antitelom, koje se vezuje za mišji ENTPD3 (AAV2 anti-humano ENTPD3 antitelo)-ENTPD3). Miševi su žrtvovani, a jetra i jezici su sakupljeni i fiksirani u 10% neutralnom puferisanom formalinu. Zatim su organi ugrađeni i ciropresečeni na stakalcima i obojeni anti-GFP antitelima. Svaka slika predstavlja jednog miša; tri miša su ubrizgana i analizirana iz grupa "AAV2 SpyTag irelevantna mAt" i "AAV2 SpyTag anti-ENTPD3" i svi su pokazali slične obrasce ekspresije GFP-a. Ove AAV2 virusne čestice su mozaične virusne čestice koje se sastoje od odnosa 1:7 između "SpyTag" kapsidnih proteina pri čemu je SpyTag insertovan direktno posle ostatka G453 okruženog linkerom od 10 aminokiselina (SEQ ID NO:29) i između kapsida bez SpyTag ali koji sadrži Myc tag aminokiselinsku sekvencu insertovanu direktno posle ostatka N587 (SEQ ID NO: 52) koja smanjuje prirodno vezivanje receptora. Virusi izražavaju eGFP kao marker transdukcije. Izveštava se da je ENTPD3 izražen na jeziku miša, ali ne i u jetri (podaci izvučeni iz javnih baza podataka GenePaint.org http://vvv.informatics.jak.org/assay/MGI:5423021 i Riken FANTOM5 projekat, skup podataka za odraslog miša). Ekspresija eGFP-a nije primećena u jetri miševa kojima je ubrizgan "AAV2 SpyTag irelevantno mAt" ili "AAV2 SpyTag anti-ENTPD3" čestice, ali je otkrivena na jeziku sva tri miša kojima su ubrizgane "AAV2 SpyTag anti-ENTPD3" čestice.
DETALJAN OPIS
[0056] Tehnički izlaganje koje je predstavljeno u tekstu ispod može u nekim aspektima prevazići obim pronalaska, koji se definiše priloženim patentnim zahtevima. Elementi iz izlaganja koji nisu obuhvaćeni obimom patentnih zahteva su obezbeđeni za informisanje, odnosno da bi se stvarni pronalazak za koji se traži zaštita postavio u širi tehnički kontekst.
[0057] WO2016112921 opisuje upotrebu specifičnog vezujućeg para (SpyCatcher:SpyTag) da bi se dobile čestice slične virusu (VLP) iz modifikovanog bakteriofaga AP205 koji prikazuju imunogene antigene u visokoj gustini na AP205 kapsidu za svrhe vakcinacije. Teorijski, za potrebe ponovnog ciljanja virusnog vektora, takav visok stepen modifikacije virusnog kapsida može biti poželjan kako bi se osiguralo da je prirodni tropizam virusnog vektora u suštini smanjen ili je uklonjen. Međutim, takvo prikazivanje ciljanih liganada u visokoj gustini na površini virusa može ometati efikasnosti transdukcija. Videti, Primere 4 i 5. Da bi se postigla optimalna efikasnost transdukcija, otkriveno je da se optimalna efikasnost transdukcija javlja kada se smanji stepen modifikacije virusne površine sa članom. Kao takve, ovde su obezbeđene genetički modifikovane čestice virusa, kompozicije koje ih sadrže, i postupci za njihovo dobijanje i upotrebu.
[0058] Osim ukoliko nije definisano drugačije, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kako to uobičajeno razume osoba koja je uobičajeno verzirana u oblast tehnike u koju ovaj pronalazak pripada.
[0059] Oblici u jednini uključuju pozivanja (reference) na množinu osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Prema tome, na primer, referenca na "postupak" uključuje jedan ili više postupaka, i/ili koraka ovde opisanog tipa i/ili koji će postati očigledni stručnjacima iz oblasti tehnike nakon čitanja ovog izlaganja.
[0060] Izraz "antitelo" uključuje molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki težak lanac sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i konstantni region teškog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca sadrži najmanje tri domena, CH1, CH2, CH3 i opciono CH4. Svaki laki lanac sadrži varijabilni domen lakog lanca (CH) i konstantni regon lakog lanca (CL). Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca mogu dalje biti podeljeni u regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), koji su rasejani među regionima koji su konzervisaniji, koji su pozanti kao regioni okvira (FR). Svaki varijabilni domen teškog i lakog lanca sadrži tri CDRs i četiri FRs, uređena od amino-kraja ka karboksi-kraju u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDRs teškog lanca mogu biti skraćeni kao HCDR1, HCDR2 i HCDR3; CDRs lakog lanca mogu biti skraćeni kao LCDR1, LCDR2 i LCDR3. Uobičajene strukture tetramera antitela sadrže dva identična domena za vezicanje antigena, od kojih je svaki obrazovan povezivanjem domena VHi VL, i od kojih svaki zajedno sa odgovarajućim CHi CLdomenima obrazuje region Fv antitela. Antitela sa pojedinačnim domenom sadrže pojedinačni antigen-vezujući domen, npr., VHili VL.Antigen-vezujući domen antitela, npr., dela antitela koji prepoznaje i veže se za prvi član specifičnog vezujućeg para antigena, je takođe označen kao "paratop." To je mali region (od 5 do 10 aminokiselina) Fv regiona antitela, dela fragmenta antigen-vezujućeg (Fab regiona), i može sadržati delove teških i/ili lakih lanaca antitela. Paratop se specifično veže za prvi član specifičnog para koji se vezuje kada se paratop veže za prvi član specifičnog vezujućeg para sa visokim afinitetom. Termin "visoki afinitet" antitela se odnosi na antitelo koji ima KDu odnosu na njegovu metu prvog člana specifičnog vezujućeg para oko 10<-9>M ili niže (npr., oko 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, ili oko 1 x 10<-12>M). U jednom izvođenju, KDje izmerena površinskom plazmonskom rezonancom, npr., BIACORE<™>; u drugom izvođenju, KDje merena testom ELISA.
[0061] Fraza „region koji određuje komplementarnost“ ili termin „CDR“ uključuje aminokiselinsku sekvencu kodiranu sekvencom nukleinske kiseline gena imunoglobulina organizma koja se normalno (tj. kod životinje divljeg tipa) pojavljuje između dva okvira regiona u varijabilni region lakog ili teškog lanca molekula imunoglobulina (npr. antitelo ili receptor T ćelija). CDR može biti kodiran, na primer, sekvencom germinativne linije ili rearаnžiranom ili nerearanžiranom sekvencom, i, na primer, naivnom ili zrelom B ćelijom ili T ćelijom. CDR može biti somatski mutiran (npr. varira od sekvence kodirane u germinativnog liniji životinje), humanizovan i/ili modifikovan supstitucijama, adicijama ili delecijama aminokiselina. U nekim okolnostima (npr., za CDR3), CDR-ovi mogu biti kodirani sa dve ili više sekvenci (npr. sekvence zametne linije) koje nisu susedne (npr. u neuređenoj sekvenci nukleinske kiseline), ali su susedne u nukleinskoj kiselini sekvence B ćelije, npr., kao rezultat spajanja ili povezivanja sekvenci (npr. V-D-J rekombinacija da se formira CDR3 teškog lanca).
[0062] Fraza "Invertovani terminalni ponovak" ili "ITR" uključuje simetrične sekvence nukleinske kiseline u genomu adeno-povezanih virusa koji su neophodni za efikasnu replikaciju. ITR sekvence su locirane na svakom kraju DNK genoma AAV. ITRs služe kao počeci replikacije za sintezu virusne DNK i esencijalne su cis komponente za generisanje vektora AAV.
[0063] Izraz "laki lanac" uključuje sekvencu imunoglobulina lakog lanca iz bilo kog organizma, i osim ukoliko nije drugačije naznačeno uključuje humane κ i λ lake lance i VpreB, kao i surogat lake lance. Varijabilni domeni lakog lanca obično uključuju CDRs tri laka lanca i četiri regiona okvira (FR), osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac pune dužine obuhvata, od amino kraja ka karboksil kraju, varijabilni domen koji uključuje FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, i konstantni regon lakog lanca. Varijabilni domen lakog lanca je kodira sekvencom gena varijabilnog regiona lakog lanca, koja generalno sadrži segmente VLi JL, koji su izvedeni iz repertoara segmenata V i J prisutnih u germinativnog liniji. Sekvence, položaji i nomenklatura segmenata V i J lakog lanca za različite organizme mogu se pronaći u IMGT bazi podataka, www.imgt.org. Laki lanci uključuju one koje, npr., koji ne vezuju selektivno ili za prvi ili drugi član specifičnog vezujućeg para selektivno vezanog sa prvim članom specifičnog vezujućeg paravezujućeg proteina u kome se pojavljuju. Laki lanci takođe uključuju one koji vezuju i prepoznaju, ili asistiraju teškom lancu ili drugom lakom lancu sa vezivanjem i prepoznavanjem, jednog ili više od prvog člana specifičnih vezujućih parova selektivno vezanih prvim članim specifičnog vezujućeg para-vezujućeg proteina u kojima se pojavljuju. Zajednički ili univerzalni laki lanci uključuju one koji su dobijeni iz humanog Vκ1-39Jκ gena ili humanog Vκ3-20Jκ gena, i uključuju somatski mutirane (npr., afinitetno sazrele) verzije istih. Primeri humanih VLsegmenata uključuju humani Vκ1-39 genski segment, humani Vκ3-20 genski segment, humani Vλ1-40 genski segment, humani Vλ1-44 genski segment, humani Vλ2-8 genski segment, humani Vλ2-14 genski segment, i humani Vλ3-21 genski segment, i uključuju somatski mutirane (npr., afinitetno sazrele) verzije istih. Mogu se dobiti laki lanci koji sadrži varijabilni domen iz jednog organizma (npr., humanog bića ili čoveka, npr., pacova ili miša; ili ptice, npr., pile) i konstantni region iz istog ili različitog organizma (npr., humano biće ili glodar, npr., pacov ili miš; ili ptica, npr., pile).
[0064] Izraz „oko“ ili „približno“ uključuje postojanje vrednosti unutar statistički značajnog opsega. Takav opseg može biti unutar reda veličine, poželjno unutar 50%, poželjnije unutar 20%, još poželjnije unutar 10%, a još poželjnije unutar 5% date vrednosti ili opsega. Dozvoljene varijacije obuhvaćene terminom "oko" ili "približno" zavise od određenog sistema koji se proučava, i mogu se lako proceniti od strane prosečnog stručnjaka iz oblasti tehnike.
[0065] Termin "protein kapsida" obuhvata protein koji je deo kapsida virusa. Za adeno-povezane viruse, proteini kapsida su generalno označeni sa VP1, VP2 i/ili VP3, i kodira ih jedan cap gen. Za AAV, tri AAV proteina kapsida su proizvedena na preklapajući način iz cap otvorenog okvira čitanja (ORF) alternativnim spajanjem iRNK i/ili upotrebom alternativnog start kodona translacije, iako sva tri proteina koriste zajednički stop kodon. Warrington et al. (2004) J. Virol.78:6595. VP1 AAV2 se generalno translatira sa ATG start kodona (aminokiselina M1) na 2.4-kb iRNK, dok VP2 i VP3 AAV2 nastaju iz manje 2.3-kb iRNK, upotrebom slabijeg ACG start kodona za proizvodnju VP2 (aminokiselina T138) i očitavanje translacije do sledećeg ATG kodona (aminokiselina M203) za proizvodnju najzastupljenijeg proteina kapsida, VP3. Warrington, supra; Rutledge et al. (1998) J. Virol.72:309-19. Aminokiselinske sekvence proteina kapsida adeno-povezanih virusa su dobro poznate u oblasti tehnike i generalno su sačuvane, naročito u dependoparvovirusima. Videti, Rutledge et al., supra. Na primer, Rutledge et al. (1998), supra, prikazuje na Slici 4B poravnanja u aminokiselinskoj sekvenci za VP1, VP2, i VP3 proteine kapsida AAV2, AAV3, AAV4 i AAV6, pri čemu su start mesta VP1, VP2, i VP3 proteina kapsida označena strelicama i varijabilni domeni su u kvadratima. Prema tome, iako ovde obezbeđene pozicije aminokiselina mogu biti obezbeđene u vezi sa VP1 proteinom kapsida AAV, ovde obezbeđene pozicije aminokiselina koje dalje nisu određene odnose se na AAV2 sekvencu glavnog proteina omotača VP1 prikazanu u SEQ ID NO:1, stručnjak iz oblasti tehnike je sposoban da jasno i brzo odredi poziciju iste aminokiseline u VP2 i/ili VP3 proteinu kapsida AAV, i odgovarajuće pozicije aminokiselina kod različitih serotipova. Prema tome, iako ovde obezbeđene pozicije aminokiselina mogu biti obezbeđene u vezi sa VP1 proteinom kapsida AAV, ovde obezbeđene pozicije aminokiselina koje dalje nisu specifikovane se odnose na AAV-2 sekvencu glavnog proteina omotača VP1 koja je prikazana u SEQ ID NO: 9, stručnjak iz oblasti tehnike je sposoban da jasno i brzo odredi poziciju iste aminokiseline u VP2 i/ili VP3 proteinu kapsida AAV, i odgovarajuću aminokiselinu i poziciju između različitih AAV serotipova. Dodatno, stručnjak iz oblasti tehnike bi mogao da zameni domene između proteina kapsida različitih AAV serotipova za obrazovanje "himernog proteina kapsida."
[0066] Zamena domena između konstrukta dva proteina kapsida AAV za dobijanje "himernog proteina kapsida AAV" je opisana, videti, npr., Shen et al. (2007) Mol. Therapy 15(11):1955-1962. "himerno AAV protein kapsida" obuhvata protein kapsida AAV koji sadrži sekvence aminokiselina, npr., domene, iz dva ili više različita serotipa AAV i koji je sposoban za obrazovanje i/ili obrazuje AAV-sličan virusni kapsid/česticu virusa. Himerni protein kapsida AAV je kodiran himernim genom kapsida AAV, npr., nukleotid koji sadrži veći broj, npr., bar dve, sekvence nukleinskih kiselina, od kojih je svako mnoštvo identično delu gena kapsida koji kodira protein kapsida različitih AAV serotipa, i gde veći broj zajedno kodira funkcionalni himerni protein kapsida AAV. Pozivanje na himerni protein kapsida u vezi sa specifičnim AAV serotipom ukazuje da protein kapsida sadrži jedan ili više domena iz proteina kapsida tog serotipa i jedan ili više domena iz proteina kapsida različitog serotipa. Na primer, AAV2 himerni kapsidni protein uključuje protein kapsida koji sadrži jedan ili više domena AAV2 VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida i jedan ili više domena VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida različitog AAV.
[0067] "Mozaički kapsid" sadrži bar dva seta VP1, VP2, i/ili VP3 proteina, svaki set je kodiran različitim genom cap.
[0068] U nekim izvođenjima, mozaični kapsid koji je ovde opisan sadrži rekombinantne VP1, VP2, i/ili VP3 proteine kodirane cap genom genetički modifikovanim sa insercijom sekvence nukleinske kiseline koja kodira heterologni epitop, i dalje sadrži VP1, VP2, i/ili VP3 proteine kodirane referentnim genom cap, npr., referencom divljeg tipa cap gena koji kodira divlji tip VP1, VP2, i/ili VP3 proteina istog AAV serotipa kao rekombinantnih VP1, VP2, i/ili VP3 proteina, kontrolni referentni cap gen koji kodira VP1, VP2, i VP3 proteine identične rekombinantnim VP1, VP2, i/ili VP3 proteinima ali za odsustvo heterolognog epitopa, mutirani referentni divlji tip cap gena koji kodira suštinski divlji tip VP1, VP2, i/ili VP3 proteina istog AAV serotipa kao rekombinantnih VP1, VP2, i/ili VP3 proteina ali za mutaciju (npr., inserciju, supstituciju, deleciju), pri čemu mutacija poželjno smanjuje tropizam divljeg tipa VP1, VP2, i VP3 proteina. U nekim izvođenjima, referentni cap gen kodira himerni VP1, VP2, i/ili VP3 protein.
[0069] Izraz "težak lanac," ili "težak lanac imunoglobulina" uključuje sekvencu teškog lanca imunoglobulina, uključujući sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, iz bilo kog organizma. Varijabilni domeni teškog lanca uključuju tri CDRs teškog lanca i četiri regiona FR, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Fragmenti teškog lanca uključuju CDRs, CDRs i FRs, i njihove kombinacije. Uobičajeni težak lanac ima, počev od varijabilnog domena (od N-kraja ka C-kraju), CH1 domen, zglob, CH2 domen, i CH3 domen. Funkcionalni fragment teškog lanca uključuje fragment koji je sposoban da specifično prepozna prvi član specifičnog vezujućeg para (npr., prepoznaje prvi član specifičnog vezujućeg para sa KDu mikromolarnom, nanomolarnom, ili pikomolarnom opsegu), koji je sposoban da eksprimira i luči iz ćelije, i koji sadrži bar jedan CDR. Varijabilni domeni teškog lanca su kodirani sekvencom nukleotida varijabilnog regiona, koja generalno sadrži VH, DH, i JHsegmente koji su dobijeni iz repertoara VH, DH, i JHsegmenata prisutnih u zametnoj liniji. Sekvence, položaji i nomenklatura za segmente V, D, i J teškog lanca za različite organizme se može pronaći u bazi podataka IMGT, kojoj se može pristupiti preko interneta na svetskoj mreži (www) na URL "imgt.org."
[0070] Termin "samo težak lanac antitela," "samo težak lanac proteina za vezivanje antigena," "pojedinačni domen proteina za vezivanje antigena," "protein za vezivanje jednog domena" ili slično se odnosi na monomere ili homodimere molekula imunoglobulina koji sadrži lanac sličan imunoglobulinu koji sadrži varijabilni domen operativno povezan sa konstantnim regionom teškog lanca, koji nije sposoban da se veže sa lakim lancem zbog toga što konstantnom regionu teškog lanca obično nedostaje funkcionalni CH1 domen. Prema tome, termin " samo težak lanac antitela," " samo težak lanac proteina za vezivanje antigena," "pojedinačni domen proteina za vezivanje antigena," "pojedinačni domen proteina za vezivanje" ili slično obuhvata oba (i) monomerni protein koji se vezuje za antigen sa jednim domenom koji sadrži jedan od lanca sličnih imunoglobulinu koji sadrži varijabilni domen operativno povezan sa konstantnim regionom teškog lanca kome nedostaje funkcionalni CH1 domen, ili (ii) homodimerni protein za vezivanje antigena sa jednim domenom koji sadrži dva lanca slična imunoglobulina, od kojih svaki sadrži varijabilni domen operativno povezan sa konstantnim regionom teškog lanca kome nedostaje funkcionalni CH1 domen. U različitim aspektima, homodimerni protein za vezivanje antigena sa jednim domenom sadrži dva identična lanca slična imunoglobulinu, od kojih svaki sadrži identični varijabilni domen operativno povean sa identičnim konstantnim regionom teškog lanca kome nedostaje funkcionalni CH1 domen. Dоdatno, svaki lanac sličan imunoglobulinu proteina za vezivanje antigena sa pojedinačnim domenom sadrži varijabilni domen, koji se može dobiti iz segmenata gena varijabilnog regiona teškog lanca (npr., VH, DH, JH), segmenata gena lakog lanca (npr., VL, JL), ili njihovom kombinacijom, spojenih za sekvencu gena konstantnog regiona teškog lanca (CH) koji sadrži deleciju ili inaktivirajuću mutaciju u CH1 kodirajućoj sekvenci (i, po potrebi, region zgloba) gen konstantnog regiona teškog lanca, npr., IgG, IgA, IgE, IgD, ili njihova kombinacija. Protein za vezivanje antigena sa jednim domenom sadrži varijabilni domen dobijen iz segmenata gena teškog lanca mogu se označiti kao "VH-antitelo jednog domena" ili "VH-proteina koji se vezuje za antigen jednog domena", videti, npr., U.S. Patent No.8,754,287; U.S. Patent objava br.-i.
20140289876; 20150197553; 20150197554; 20150197555; 20150196015; 20150197556 i 20150197557. Protein koji vezuje antigen sa jednim domenom koji sadrži varijabilni domen koji je dobijen iz segmenata gena lakog lanca mogu se označiti sa ili "VL-protein koji se vezuje za antigen jednog domena," videti, npr., U.S. Objava Br.20150289489.
[0071] Izraz "laki lanac" uključuje sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, i osim nije drugačije naznačeno uključuje humane kapa (κ) i lambda (λ) lake lance i VpreB, kao i surogat lake lance. Varijabilni domeni lakog lanca obično uključuju CDR-a tri laka lanca i četiri regiona okvira (FR), osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac pune dužine uključuje, od amino kraja prema karboksil kraju, varijabilni domen koji uključuje FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, i aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca. Varijabilni domeni lakog lanca su kodirani nukleotidnom sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca, koja generalno sadrži segmente gena VLlakog lanca i segmente gena JLlakog lanca, koji su dobijeni iz repertoara segmenata gena V i J lakog lanca prisutnih u zametnoj sekvenci. Sekvenci, pozicija i nomenklatura za segmente V i J lakih gena za različite organizme može se pronaći u bazi podataka IMGT, kojoj se može pristupiti putem interneta u svetskog mreži (eng. world wide web) (www) na URL "imgt.org." Laki lanci uključuju one, npr., koji selektivno ne vezuju ili prvi ili drugi član specifičnog vezujućeg para selektivno u vezi sa prvim članom proteina za vezivanje specifičnog vezujućeg para u kome se pojavljuju. Laki lanci takođe uključuju one koji vežu i prepoznaju, ili pomažu teškom lancu sa vezivanjem i prepoznavanjem, jednog ili više prvog člana specifičnih vezujućih parova selektivno u vezi sa prvim članom proteina za vezivanje specifičnog vezujućeg para u kome se pojavljuju. Laki lanci takođe uključuju one koji vežu i prepoznaju, ili pomažu teškom lancu sa vezivanjem i prepoznavanjem, jednog ili više prvog člana specifičnih vezujućih parova koji su selektivno vezani sa prvim članom proteina za vezivanje specifičnog vezujućeg para u kome se pojavljuju. Zajednički ili univerzalni laki lanci uključuju one koji su dobijeni iz human ogVκ1-39Jκ5 gena ili humanog Vκ3-20Jκ1 gena, i uključuju somatski mutirane (npr., afinitetno sazrele) verzije istog.
[0072] Fraza "operativno povezan", kao što se ovde korisiti, uključuje fizičko suprostavljanje (npr., u tridimenzionom prostoru) komponenata ili elemenata koji interaguju, direktno ili indirektno jedan sa drugim, ili drugačije koordinišu jedni sa drugima da učestvuju u biološkom događaju, gde suprostavljanje postiže ili dozvoljava takvu interakciju i/ili koordinaciju. Za navođenje jednog primera, kontrolna sekvenca (npr., ekspresija kontrolne sekvence) u nukleotidnoj sekvenci je pomenuta da bude "operativno povezana" sa kodirajućom sekvencom kada se nalazi u odnosu na kodirajuću sekvencu tako da njeno prisustvo ili odsustvo ima uticaj na ekspresiju i/ili aktivnost kodirajuće sekvence. U mnogim izvođenjima, "operativna veza" uključuje kovalentnu vezu relevantnih komponenti ili elemenata jednih sa drugim. Osoba koja je verzirana u stanje tehnike će razumeti da, u nekim izvođenjima, kovalentna veza nije potrebna da bi se postigla efektivna operativna veza. Na primer, u nekim izvođenjima, kontrolne sekvence nukleinske kiseline koje su operativno povezane sa kodirajućim sekvencama koje one kontrolišu su u blizini nukleotida od interesa. Altenativno ili dodatno, u nekim izvođenjima, jedna ili više takvih kontrolnih sekvenci deluje in trans ili na distanci da kontroliše kodirajuću sekvencu od interesa. U nekim izvođenjima, termin "ekspresija kontrolne sekvence" kao što se ovde koristi se odnosi na sekvence polinukleotida koje su neophodne i/ili dovoljno da se utiče na ekspresiju i obradu kodirajućuh sekvenci sa kojima su u vezi. U nekim izvođenjima, kontrolne sekvence za ekspresiju mogu biti ili sadržati odgovarajuće sekvence inicijacije transkripcije, terminacije, promotora i/ili sekvenci pojačivača; signale za efikasnu obradu RNK kao što su signali za spajanje i poliadenilaciju; sekvence koje stabilizuju iRNK u citoplazmi; sekvence koje pojačavaju efikasnost translacije (npr., Kozak konsenzusna sekvenca); sekvence koje pojačavaju stabilnost proteina; i/ili, u nekim izvođenjima, sekvence koje pojačavaju lučenje proteina. U nekim izvođenjima, jedna ili više kontrolnih sekvenci su preferencijalno ili ekskluzivno aktivne u određenoj ćeliji domaćinu ili organizmu, ili njegovom tipu. Kao primer, kod prokariota, kontrolne sekvence obično uključuju promotor, mesto za vezivanje ribozoma, i sekvencu za terminaciju transkripcije; kod eukariota, u mnogim izvođenjima, kontrolne sekvence obično uključuju promotore, pojačivače, i/ili sekvence za terminaciju transkripcije. Osobi koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike će biti jasno iz konteksta da, u mnogim izvođenjima, termin "kontrolne sekvence" se odnosi na komponente čije prisustvo je esencijalno za ekspresiju i obradu, i u nekim izvođenjima uključuje komponente čije prisustvo je od prednosti za ekspresiju (uključujući, na primer, vodeće sekvence, sekvence za ciljanje, i/ili spojene partner sekvence).
[0073] Termin "rekombinantni kapsidni protein" uključuje kapsidni protein koji ima najmanje jednu mutaciju u poređenju sa odgovarajućim kapsidnim proteinom virusa divljeg tipa, gde divlji tip može biti referentni i/ili kontrolni virus za uporedno proučavanje. Rekombinantni kapsidni protein uključuje kapsidni protein koji sadrži heterolognu aminokiselinsku sekvencu, koja može biti insertovana u i/ili prikazana kapsidnim proteinom. "Heterologni" u ovom kontekstu znači heterologni u poređenju sa virusom, iz kojeg je izveden kapsidni protein. Insertovane aminokiseline se jednostavno mogu ubaciti između dve date aminokiseline kapsidnog proteina. Insercija tj. umetanje aminokiselina takođe može da ide zajedno sa delecijom datih aminokiselina kapsidnog proteina na mestu umetanja, npr. 1 ili više aminokiselina kapsidnog proteina supstituisano je sa 5 ili više heterolognih aminokiselina).
[0074] "Ponovno ciljanje“ ili „ponovno usmeravanje “ može uključiti scenario u kojem vektor divljeg tipa cilja nekoliko ćelija unutar tkiva i/ili nekoliko organa unutar organizma, pri čemu se opšte ciljanje tkiva ili organa svodi na ukidanje umetanjem heterolognog epitopa, pri čemu preusmeravanje ka specifičnijoj ćeliji u tkivu ili određenom organu u organizmu se postiže ligandom za ciljanje koji vezuje marker koji je eksprimovan od strane specifične ćelije. Takvo ponovno ciljanje ili ponovno usmeravanje može takođe uključiti scenario u kojem vektor divljeg tipa cilja tkivo, pri čemu se ciljanje tkiva svodi na ukidanje umetanjem heterolognog epitopa, a ponovno ciljanje na potpuno drugačije tkivo postiže se ligandom za ciljanje.
[0075] "Specifični vezujući par," "protein:protein vezujući par" i slično obuhvata dva proteina (npr., prvi član (npr., prvi polipeptid) i drugi srodni član (npr., drugi polipeptid)) koji interaguje da se obrazuje kovalentna izopeptidna veza vezana pod uslovima koji omogućuju ili olakšavaju obrazovanje izopeptidne veze, pri čemu termin "srodan" se odnosi na komponente koje funkcionišu zajedno, tj. zajedno reaguju da bi se obrazovala izopeptidna veza. Prema tome, dva proteina koja zajedno reaguju efikasno da bi se obrazovala izopeptidna veza pod uslovima koji omogućavaju ili olakšavaju obrazovanje izopeptidne veze mogu se takođe označiti kao "komplementarni" par peptidnih linkera. Specifični vezujući parovi koji su sposobni za interakciju za obrazovanje kovalentne izopeptidne veze su navedeni u Veggiani et al. (2014) Trends Biotechnol. 32:506, i uključuju peptid:peptid vezujuće parove kao što su SpyTag: SpyCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002; SpyTag:KTag; izopeptag:pilin C, SnoopTag:SnoopCatcher, etc. Generalno, peptidni tag se odnosi na član protein:protein vezujućeg para koji je generalno dužine manje of 30 aminokiselina, i koji obrazuje kovalentnu izopeptidnu vezu sa drugim srodnim proteinom, pri čemu je drugi srodni protein generalno veći, ali takođe može biti dužine manje od 30 aminokiselina kao što je u SpyTag:KTag sistemu.
[0076] Izraz "izopeptidna veza" odnosi se na amidnu vezu između karboksilne ili karboksamidne grupe i amino grupe od kojih najmanje jedna nije izvedena iz glavnog lanca proteina ili alternativno gledano nije deo okosnice proteina. Izopeptidna veza se može obrazovati unutar jednog proteina ili se može pojaviti između dva peptida ili peptida i proteina. Stoga, izopeptidna veza može da se obrazuje intramolekularno unutar jednog proteina ili intermolekularno, tj. između dva molekula peptida/proteina, npr. između dva peptidna linkera. Uobičajeno, izopeptidna veza se može javiti između ostatka lizina i ostatka asparagina, asparaginske kiseline, glutamina ili glutaminske kiseline ili terminalne karboksilne grupe proteina ili peptidnog lanca ili se može pojaviti između alfa-amino terminusa proteina ili peptidnog lanca i asparagina, asparaginske kiseline, glutamina ili glutaminske kiseline. Svaki ostatak para koji je uključen u izopeptidnu vezu se ovde pominje kao reaktivni ostatak. U poželjnim izvođenjima pronalaska, izopeptidna veza može se obrazovato između ostatka lizina i ostatka asparagina ili između ostatka lizina i ostatka asparaginske kiseline. Posebno, izopeptidne veze se mogu pojaviti između bočnog lanca amina lizina i karboksamidne grupe asparagina ili karboksilne grupe aspartata.
[0077] SpyTag:SpyCatcher sistem je opisan u U.S. Patent No. 9,547,003 i Zakeri et al. (2012) PNAS 109:E690-E697, i dobijen je iz CnaB2 domena Streptococcus pyogenes fibronektin-vezujućeg proteina FbaB. Cepanjem domena, Zakeri et al. dobili su peptid "SpyTag" koji ima sekvencu AHIVMVDAYKPTK (SEQ ID NO:1) koji obrazuje amidnu vezu sa svojim srodnim proteinom "SpyCatcher," i polipeptidnom dužine 112 aminokiselina koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO:3. (Zakeri (2012), supra). Dodatni specifični vezujući par koji je dobijen iz domena CnaB2 je SpyTag:KTag, koji obrazuje izopeptidnu vezu u prisustvu SpyLigase. (Fierer (2014) PNAS 111:E1176-1181) SpyLigase je modifikovan cepanjem β lanca iz SpyCatcher koji sadrži reaktivni lizin, pri čemu se dobija KTag, peptidni tag od 10 ostataka aminokiselinske sekvence ATHIKFSKRD (SEQ ID NO:2). SpyTag002:SpyCatcher002 sistem je opisan u Keeble et al (2017) Angew Chem Int Ed Engl 56:16521-25. SpyTag002 ima aminokiselinsku sekvencu VPTIVMVDAYKRYK, predstavljenu u SEQ ID NO:54, i veže SpyCatcher002 (SEQ ID NO:55).
[0078] SnoopTag:SnoopCatcher sistem je opisan kod Veggiani (2016) PNAS 113 :1202-07. D4 Ig-sličan domen RrgA, adhezija od Streptococcus pneumoniae, je podeljena da se obrazuje SnoopTag (ostaci 734-745; SEQ ID NO:5) i SnoopCatcher (ostaci 749-860). Inkubacija SnoopTag i SnoopCatcher rezultuje u spontanoj izopeptidnoj vezi koja je specifična između komplementarnih proteina. Veggiani (2016)), supra.
[0079] Izopeptag:pilin-C specifični vezujući par je dobijen od glavnog pilin proteina Spy0128 iz Streptococcus pyogenes. (Zakeir i Howarth (2010) J. Am. Chem. Soc. 132:4526-27). Izopeptag ima aminokiselinsku sekvencu TDKDMTITFTNKKDAE, koja je predstavljena kao SEQ ID NO:7, i veže pilin-C (ostaci 18-299 Spy0128). Inkubacija SnoopTag i SnoopCatcher rezultuje spontanom izopeptidnom vezom koja je specifična između komplementarnih proteina. Zakeir i Howarth (2010), supra.
[0080] Izraz "peptidni tag" uključuje polipeptide koji su (1) heterologni za protein koji je obeležen sa peptidnim tag-om, (2) član specifičnog protein:protein vezujućeg para koji je sposoban za obrazovanje izopeptidne veze, i (3) ne više od dužine od 50 aminokiselina.
[0081] Termin "ciljne ćelije" obuhvata sve ćelije u kojima je poželjna ekspresija nukleotida od interesa. Poželjno, ciljne ćelije pokazuju receptor na svojoj površini koji omogućava da se ćelija cilja sa ciljanim ligandom, kao što je opisano u nastavku.
[0082] Izraz "transdukcija" ili "infekcija" ili slično se odnosi na uvođenje nukleinske kiseline u jedro ciljne ćelije pomoću virusnog vektora. Termin efikasnost u odnosu na transdukciju ili slično, npr., "efikasnost transdukcije" odnosi se na frakciju (npr., procenat) ćelija koje eksprimiraju nukleotid od interesa nakon inkubacije sa određenim brojem virusnih vektora koji sadrže nukleotid od interesa. Dobro poznate metode određivanja efikasnosti transdukcije uključuju fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija transdukovanih fluorescentnim reporterskim genom, PCR za ekspresiju nukleotida od interesa, itd.
[0083] Termin "divlji tip", kako se ovde koristi, uključuje entitet koji ima strukturu i/ili aktivnost kakva se nalazi u prirodi u "normalnom" (u suprotnosti sa mutantnim, bolesnim, izmenjenim, itd.) stanju ili kontekstu. Stručnjaci će razumeti da se vektori divljeg tipa virusa, npr., kapsidni proteini divljeg tipa, mogu koristiti kao referentni virusni vektor u uporednim studijama. Generalno, referentni virusni kapsid protein/kapsid/vektor je identičan testiranom virusnom kapsidnom proteinu/kapsidu/vektoru, ali za promenu za koju treba da se testira efekat. Na primer, da bi se odredio efekat, na primer, na efikasnost transdukcije, ubacivanja prvog člana specifičnog vezujućeg para u test virusni vektor, efikasnost transdukcije test virusnog vektora (u odsustvu ili prisustvu odgovarajućeg liganda za ciljanje) može se uporediti sa efikasnošću transdukcije referentnog virusnog vektora (u odsustvu ili prisustvu odgovarajućeg ciljanog ligana ako je potrebno) koji je identičan testiranom virusnom vektoru u svakom slučaju (npr. dodatne mutacije, nukleotid od interesa, broj virusnih vektori i ciljne ćelije itd.) osim prisustva prvog člana specifičnog vezujućeg para.
[0084] Strategija ponovnog ciljanja koja je ovde opisana pruža prednosti i skela i direktnog rekombinatornog pristupa opisanog iznad, kao i rešava mnoge nedostatke svojstvene oba. Strategija koristi specifičan vezujući par, pri čemu se prvi član i drugi srodni član specifično vezuju jedan za drugog, a nakon vezivanja formiraju kovalentnu vezu koja trajno povezuje virusnu česticu sa bilo kojim ciljanim ligandom koji je fuzionisan sa srodnim članom. Sa takvom genetski modifikovanom virusnom česticom, tropizam se održava sve dok virusni kapsid ostaje netaknut, na primer, jedna prednost sistema koji je ovde dat u poređenju sa drugim pristupima skelama je trajnost sa kojom „adaptor“, npr., ligand za ciljanje, je vezan za rekombinantnu virusnu česticu slično direktnom rekombinatornom pristupu. Međutim, za razliku od direktnog rekombinatornog pristupa, sistem opisan ovde održava fleksibilnost pristupa adaptera skele u tome što rekombinantna virusna čestica može ostati konstantna sa varijabilnosti koja se nalazi u adapteru, npr. srodni član može biti spojen sa različitim ciljane ligande i različite fuzione proteine koji se zatim spajaju na virusnu česticu u skladu sa ciljnom ćelijom.
Rekombinantni virusni kapsidni proteini i virusni vektori i nukleinske kiseline
[0085] Ovde je data rekombinantna virusna čestica (npr. protein virusnog kapsida i rekombinantni virusni kapsid i/ili rekombinantni virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid protein) koja je genetički modifikovana da prikaže heterolognu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži prvi član specifičnog vezujućeg para, gde je aminokiselinska sekvenca manja od 50 aminokiselina u dužini, i gde rekombinantni virusni kapsid/protein čestica ispoljava svedene na ukinuti prirodni tropizam. U nekim izvođenjima, virusna čestica dalje sadrži drugi srodni član specifičnog vezujućeg para, pri čemu su prvi i drugi član kovalentno povezani izopeptidnom vezom, i gde je drugi član fuzionisan sa ciljanim ligandom.
[0086] U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca se sastoji od prvog člana specifičnog vezujućeg para i jednog ili više linkera. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca se sastoji od prvog člana specifičnog vezujućeg para bočno sa obe strane sa linkerom, npr. heterologna aminokiselinska sekvenca se sastoji od N-terminusa do C-kraja prvog linkera, prvog člana specifičnog vezujućeg para i drugi linker. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linker su svaki nezavisno najmanje po jednu aminokiselinu u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su identični.
[0087] Generalno, heterologna aminokiselinska sekvenca kao što je ovde opisana, npr., sadrži prvi član specifičnog vezujujćeg para samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera, je između oko 5 aminokiselina do oko 50 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je bar 5 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 6 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 7 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 8 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 9 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 10 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 11 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 12 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 13 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 14 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 15 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 16 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 17 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 18 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 19 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 20 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 21 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 22 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 23 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 24 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 25 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 26 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 27 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 28 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 29 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 30 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 31 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 32 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 33 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 34 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 35 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 36 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 37 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 38 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 39 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 40 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 41 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 42 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 43 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 44 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 45 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 46 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 47 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 48 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 49 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je 50 aminokiselina u dužini.
[0088] U nekim izvođenjima, specifični vezujući par je SpyTag:SpyCatcher vezujući par, gde je prvi član SpyTag, i gde je drugi srodan član SpyCatcher. U nekim izvođenjima, specifičan vezujući par je SpyTag:KTag, gde je prvi član SpyTag i gde je drugi srodan član KTag. U nekim izvođenjima, specifičan vezujući par je SpyTag:KTag, gde je prvi član KTag i gde je drugi srodan član SpyTag. U nekim izvođenjima, specifičan vezujući par je izopeptag:pilin-C, gde je prvi član izopeptag, i gde je drugi srodan član pilin-C, ili njegov deo. U nekim izvođenjima, specifičan vezujući par je SnoopTag:SnoopCatcher, i prvi član je SnoopTag, i drugi srodan član je Snoop-Catcher.
[0089] U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni protein kapsida kao što je ovde opisano je Ad protein kapsida npr., protein kapsida Ad serotipa koji je odabran iz grupe koja obuhvata Ad1, Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, i Ad7. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni protein kapsida je dobijen od gena Ad2 kapsida . U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni protein kapsida je dobijen od gena Ad5 kapsida. U nekim izvođenjima, rekombinantni protein Ad kapsida virusa kao što je ovde opisano sadrži prvi član specifičnog vezujućeg para u domenu proteina vlakna, npr., na karboksi terminusu proteina vlakna, dugme (eng. knob) vlakna, i/ili HI petlji dugmeta vlakna.
[0090] Protein virusa kapsida iz ovog pronalaska je izveden iz gena cap adeno-povezanog virusa (AAV) koji kodira AAV VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida. U nekim izvođenjima, rekombinantni protein kapsida virusa je dobijen od gena kapsidnog proteina adeno-povezanog virusa (AAV), npr., kapsidnog gena AAV serotipa odabranog iz grupe koja se sastoji iz AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9. U nekim izvođenjima, rekombinantni protein kapsida virusa je dobijen od AAV2 gena kapsida ili AAV9 gena kapsida. U nekim izvođenjima, rekombinantni protein kapsida virusa je genetički modifikovani AAV2 VP1 kapsidni protein, sekvence aminokiselina divljeg tipa koja je predstavljena u SEQ ID NO:9. U nekim izvođenjima rekombinantni protein virusnog kapsida je genetički modifikovani AAV9 VP1 kapsidni proten, sekvence aminokiselina divljeg tipa koja je predstavljena u SEQ ID NO:31.
[0091] Generalno, rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisan sadrži prvi član specifičnog vezujućeg para koji je insertovan u kapsidni protein tako da prvi član specifičnog vezujućeg para smanjuje i/ili ukida prirodni tropizam proteina kapsida ili kapsida koji ga sadrži. U nekim izvođenjima, prvi član specifičnog vezujućeg para je insertovan u region proteina kapsida uključenog u prirodni tropizam referentnog proteina kapsida divljeg tipa, npr., region proteina kapsida koji je uključen u ćelijski receptor. U nekim izvođenjima, prvi član specifičnog vezujućeg para je insertovan u (npr. ispoljen) od strane domena dugmeta Ad proteina filamenta. U nekim izvođenjima, prvi član specifičnog vezujućeg para je insertovan u (npr. prikazan) od strane HI petlje Ad proteina filamenta. U nekim izvođenjima, prvi član specifičnog vezujućeg para je insertovan nakon pozicije aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz G453 AAV2 proteina kapsida VP1, N587 of AAV2 proteina kapsida VP1, G453 of AAV9 proteina kapsida VP1, i A589 AAV9 proteina kapsida VP1. U nekim izvođenjima, prvi član specifičnog vezujućeg para je insertovan (npr. ispoljen) između aminokiselina N587 i R588 AAV2 VP1 kapsida. U nekim izvođenjima, rekombinantni virusni kapsid, virusni vektor koji sadrži rekombinantni virusni kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni virusni kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prestavljena u SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 35, 37, ili 39. Dodatna pogodna mesta za inserciju su identifikovana upotrebom AAV2 dobro su poznata u oblasti tehnike (Wu etal. (2000)J. Virol.74:8635-8647) i uključuju I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713 i I-716. Rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisan može biti protein kapsida AAV2 koji sadrži prvi član specifičnog vezujućeg para koji je insertovan u poziciju koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713, I-716, i njihova kombinacija. Dodatna pogodna mesta insercije koja su identifikovana upotrebom dodatnih AAV serotipova su dobro poznata i uključuju I-587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4), i I-585 (AAV5). U nekim izvođenjima, rekombinantni protein vrusnog kapsida kao što je ovde opisan može biti protein kapsida AAV2 koji sadrži prvi član specifičnog vezujućeg para insertovanog u poziciju koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz I-587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4), I-585 (AAV5), i njihove kombinacije.
[0092] Ovde korišćena nomenklatura I-### odnosi se na mesto insercije ### imenovanjem broja aminokiselina u odnosu na VP1 protein proteina kapsida AAV, međutim takva insercija može biti locirana direktno na N-ili C-kraju, poželjno C-kraju aminokiseline u sekvenci od 5 aminokiselina N-ili C-kraju date aminokiseline, poželjno 3, poželjnije 2, naročito 1 aminokiselina(e) N-ili C-kraja u datoj aminokiselini. Dodatno, pozicije koje su ovde naznačene su relativne u odnosu na VP1 protein kodiran sa genom AAV kapsida, i odgovarajućim pozicijama (i njihovim mutacijama) mogu se lako identifikovati za VP2 i VP3 proteine kapsida koji su kodirani genom za kapsid izvođenjem poravnanja u sekvenci VP1, VP2 i VP3 proteina koji su kodirani od strane referentnog gena AAV kapsida.
[0093] Prema tome, insercija u odgovarajuću poziciju kodirajuće nukleinske kiseline jednom od ovih mesta cap gena dovodi do insercije u VP1, VP2 i/ili VP3, kao što su proteini kapsida kodirani preklapajućim okvirima čitanja istog gena sa raspoređenim početnim kodonima. Prema tome, za AAV2, na primer, prema ovoj nomenklaturi insercije između aminokiselina 1 i 138 su insertovane samo u VP1, insercije između 138 i 203 su insertovane između VP1 i VP2, i insercije između 203 i C-terminusa su insertovane u VP1, VP2 i VP3, što je naravno takođe slučaj za mesto insercije I-587. Prema tome, ovaj pronalazak obuhvata strukturalne gene AAV sa odgovarajućim insercijama u VP1, VP2 i/ili VP3 proteinima.
[0094] Dodatno, zbog velike konzervisanosti bar velikih poteza i velikog broja blisko srodnog člana familije, odgovarajuća mesta insercije AAV osim nabrojanih AAV mogu se identifikovati izvođenjem aminokiselinskog poravnanja ili poređenjem struktura kapsida. Videti, npr., Rutledge et al. (1998) J. Virol.
72:309-19 i U.S. Patent No.9,624,274 za primere poravnanja različitih proteina kapsida AAV.
[0095] U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje ili uklanja prirodni tropizam virusnog vektora, npr., transdukcijom ćelije koja je prirodno permisivna za infekciju sa referentnim virusnim vektorima divljeg tipa i/ili ciljna ćelija nije detektabilna u odsustvu kovalentne veze sa drugim srodnim članom vezujućeg para, koji je spojen sa odgovarajućim ligandom za ciljanje. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora, npr., u poređenju sa transdukcijom ćelije koja je prirodno permisivna na infekciju referentnim virusnim vektorima divljeg tipa. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 5%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 5%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 10%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 20%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 30%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 40%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 50%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 60%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 70%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 80%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 90%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 95%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para smanjuje prirodni tropizam virusnog vektora za najmanje 90%. U izvođenjima gde insercija (prikaz) prvog člana specifičnog vezujućeg para ne ukida u potpunosti prirodni tropizam rekombinantnih virusnih kapsida, prirodni tropizam takvih rekombinantnih virusnih kapsida može biti dodatno smanjen drugom i različitom mutacijom. Na primer, u jednom izvođenju, rekombinantni protein virusnog kapsida kao što je ovde opisan može biti izveden iz AAV9 serotipa, i može sadržati prvi član specifičnog vezujućeg para, i može dodatno sadržati mutaciju, npr., mutaciju W503A.
[0096] Ovo detargetiranje virusa od njegove prirodne ćelije domaćina je važno posebno ako se namerava sistemska u odnosu na lokalnu ili loko-regionalnu primenu virusnih vektora, s obzirom na to da uzimanje virusnih vektora od strane prirodnih ćelija domaćina ograničava efektivnu dozu virusnih vektora. U slučaju AAV2 i AAV6, prijavljeno je da je HSPG primarni receptor za unos virusa u veliki broj ćelija, posebno ćelije jetre. Za AAV2 aktivnost vezivanja HSPG zavisi od grupe od 5 osnovnih aminokiselina, R484, R487, R585, R588 i K532 (Kern et al., (2003) J Virol.77(20): 11072-81). Shodno tome, poželjne tačkaste mutacije su one koje smanjuju aktivnost transdukcije virusnog vektora za datu ciljnu ćeliju posredovanu prirodnim receptorom za najmanje 50%, poželjno najmanje 80%, posebno najmanje 95%, u slučaju HSPG kao primarni receptor za vezivanje virusnih vektora za ciljne ćelije.
[0097] Shodno tome, dalje mutacije poželjnije za virusne vektore koji se vezuju za HSPG su one mutacije koje brišu ili zamenjuju baznu amino kiselinu kao što je R, K ili H, poželjno R ili K koja je uključena u HSPG vezivanje odgovarajućeg virusa, nebaznim aminokiselina kao što su A, D, G, Q, S i T, poželjno A ili aminokiselina koja je prisutna na odgovarajućoj poziciji različitog, ali visoko konzerviranog AAV serotipa kome nedostaje takva bazna amino kiselina na ovoj poziciji. Shodno tome, poželjne supstitucije aminokiselina su R484A, R487A, R487G, K532A, K532D, R585A, R585S, R585Q, R585A ili R588T, posebno R585A i/ili R588A za AAVE2 ili K531A. Jedno posebno poželjno izvođenje pronalaska su takvi mutanti kapsidnog proteina AAV2 koji dodatno sadrže dve tačkaste mutacije R585A i R588A, pošto su ove dve tačkaste mutacije dovoljne da u velikoj meri uklone aktivnost vezivanja HSPG. Ove tačkaste mutacije omogućavaju efikasno detargetiranje od ćelija koje eksprimiraju HSPG, što - u svrhu ciljanja - povećava specifičnost odgovarajućeg mutiranog virusa za njegovu novu ciljnu ćeliju.
Ciljni ligandi
[0098] Ovde opisana virusna čestica može dalje da sadrži drugi član para specifičnog vezivanja koji specifično formira kovalentnu izopeptidnu vezu sa prvim članom para specifičnog vezivanja koji je insertovan u rekombinantni virusni kapsid protein, pri čemu je drugi član fuzionisan sa ciljanim ligandom. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran na površini ćelije, npr., protein površine ćelije na (humanoj) eukariotskoj ćeliji, npr., ciljnoj ćeliji. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr. isključivo) u (humanim) ćelijama jetre. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr. isključivo) u (humanim) moždanim ćelijama. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr. isključivo) pomoću (humanih) limfocita. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr. isključivo) pomoću (humanih) T ćelija. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr. isključivo) preko (humanih) B ćelija. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr. isključivo) pomoću (humanih) dendritičnih ćelija. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr. isključivo) pomoću (humanih) makrofaga. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr. isključivo) pomoću (humanih) NK ćelija. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr. isključivo) u (humanim) ćelijama bubrega. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr., isključivo) pomoću (humane) ćelije kancera. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje vezuje receptor eksprimiran prvenstveno (npr. isključivo) u (humanih) ćeliji inficiranoj heterolognim patogenom.
[0099] Postoji veliki broj proteina ćelijske površine, npr., receptora ćelijske površine, pogodnih koji mogu biti ligand za ciljanjeom za ciljanje, i za koje su ligand za ciljanje, npr., antitela ili njihovi delovi, već dostupni. Takve strukture uključuju, ali nisu ograničene na: glavne antigene histokompatibilnosti klase I i klase II; receptore za različite citokine (npr. receptore za IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, itd.), hormone rasta specifične za ćelijski tip, neurotrofni faktor iz mozga (BDNF), cilijarni neurotrofni faktor (CTNF), faktori rasta koji stimulišu kolonije, faktori rasta endotela, epidermalni faktori rasta, faktori rasta fibroblasta, neurotrofični faktor koji potiče od glija, faktori rasta glija, gro-beta/mip 2, rast hepatocita faktori, faktor rasta sličan insulinu, interferoni (a-IFN, b-IFN, gIFN, konsenzusni IFN), interleukini (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14), faktor rasta keratinocita, inhibitorni faktori leukemije, hemotaktički aktivirajući faktor makrofaga/monocita, faktor rasta neurona, protein koji aktivira neutrofile 2, faktor rasta izveden iz trombocita, faktor matičnih ćelija, transformišući faktor rasta, faktori tumorske nekroze. vaskularni endotijalni faktor rasta, lipoproteini, uključujući dodatne ili druge transmembranske receptore tipa 1, kao što su PRLR, G-protein spregnute receptore kao što je GCGR, jonske kanale kao što su Nav1.7, ASIC1 ili ASIC2; molekuli ćelijske adhezije; transportne molekule za metabolite kao što su aminokiseline; receptori antigena B- i T-limfocita (npr. receptori B ćelija i povezani proteini (npr. CD19, CD20, itd.) i receptori T ćelija i povezani proteini (npr. CD3, CD4, CD8, itd.); tetraspanin protein (npr., CD63). Rekombinantni virusni kapsid koji je ovde opisan omogućava specifičnu infekciju tipa ćelije upotrebom liganda za ciljanje koji vezuje antigene na površini ćelije diferencijacije kao mete za virusni vektorski kompleks.
[0100] U nekim izvođenjima ligand za ciljanje veže protein koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od (humanim) ćelijama jetre, tj., marker koji je specifičan za jetru. U nekim izvođenjima ligand za ciljanje veže protein koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od (humanih) ćelija mozga, marker koji je specifičan za ćelije mozga. U nekim izvođenjima ligand za ciljanje veže protein koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od (humanih) hematopoetskih ćelija, tj., marker koji je specifičan za hematopoetske ćelije. U nekim izvođenjima ligand za ciljanje veže protein koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od (humanih) T ćelija, tj., marker koji je specifičan za T-ćelije. U nekim izvođenjima ligand za ciljanje veže protein koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od (humanih) B ćelija, tj., marker koji je specifičan za B ćeliju. U nekim izvođenjima ligand za ciljanje veže protein koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od (humanih) dendritičnih ćelija, tj., marker koji je specifičan za dendritične ćelije. U nekim izvođenjima ligand za ciljanje veže protein koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od (humanih) makrofaga, tj., marker koji je specifičan za makrofage. U nekim izvođenjima ligand za ciljanje veže protein koji je eksprimiran primarno (npr., jedinom) od (humanih) NK ćelija, tj., marker koji je specifičan za NK ćeliju. U nekim izvođenjima ligand za ciljanje veže protein koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od (humanih) ćelija bubrega, tj., marker koji je specifičan za bubreg. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže receptor koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od strane (humanih) ćelija pankreasa, tj., markerom specifičnim za pankreas. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje veže receptor koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od strane (humanih) ćelija creva, tj., markerom koji je specifičan za creva. U nekim izvođenjima ligand za ciljanje se veže za protein koji je primarno eksprimovan (npr., jedino) od strane (humanih) kancerozne ćelije, tj., antigenom koji je povezan sa tumorom. U nekim izvođenjima ligand za ciljanje se veže za protein koji je eksprimiran primarno (npr., jedino) od strane (humane) ćelije inficirane sa heterolognim patogenom. Proteini koji (1) su specifično eksprimirani od, ili za koje je ekspresija obogaćena u, ćeliji/tkivu/organu, i (2) prepoznati od strane antigen-vezujućeg proteina korisnog kao ciljajućeg liganda kao što je ovde opisano su dobro poznati i mogu se takođe naći u www.proteinatlas.org; videti takođe Uhlen et al. (2010) Nat. Biotech. 28:1248-50. Tabela 2 ispod obezbeđuje primer i neograničavajuće markere koji su specifični za organ za koje antigen-vezujući proteini, koji mogu biti korisni kao ligand za ciljanjei, su dostupni i ćelije/tkivo/organ koji eksprimuje takve markere.
Tabela 2 : Primeri markera specifičnih za tkivo
[0101] U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje se veže za receptor koji je eksprimiran od strane (humane) ćelije jetre, npr., asijaloglikoproteinski receptor, npr., hASGR1. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje se veže za receptor koji je eksprimiran od strane (humane) ćelije mozga. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje se veže za receptor koji je eksprimiran od strane (humane) T ćelije, npr., CD3, npr., CD3ε. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje se veže za receptor koji je eksprimiran od strane (humane) ćelije bubrega, npr., . U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje se veže za receptor koji je eksprimiran od strane (humane) mišićne ćelije, npr., integrin. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje se veže za receptor koji je eksprimiran od strane (humane) kancerozne ćelije, npr., antigen koji je povezan sa tumorom, npr., E6 i E7. U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje se veže za humani receptor glukagona (hGCGR).
[0102] U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje se veže za antigen koji je povezan sa tumorom koji je eksprimiran od strane tumorske ćelije. Neograničavajući primeri specifičnih antigena koji su povezani sa tumorom uključuju, npr., AFP, ALK, BAGE proteine, β-katenin, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, karbonatna dehidrataza IX, kaspaza-8, CCR5, CD19, CD20, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciklin-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGE protein (npr.,GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipikan-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, MAGE proteini (npr., MAGE-1, -2, -3, -4, -6, i -12), MART-1, mezoteln, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE proteini, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, survivin, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, tirozinaza, i uroplakin-3.
[0103] U nekim izvođenjima, ligand za ciljanje se veže se markere CD koji su povezani sa imunim odgovorom, npr., CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, itd.
[0104] Jedno izvođenje iz ovog pronalaska je struktura multimera koji sadrži rekombinantni protein virusnog kapsida iz ovog pronalaska. Struktura multimera sadrži bar 5, poželjno bar 10, poželjnije bar 30, najpoželjnije bar 60 rekombinantnih proteina virusnih kapsida koji se sastoje iz prvog člana specifičnog vezujućeg para kao što je ovde opisano. Oni mogu obrazovati regularne virusne kapside (prazne virusne čestice) ili virusne vektore (kapsidi koji inkapsuliraju nukleotid od interesa). Obrazovane virusnih vektora koji su sposobni za pakovanje virusnog genoma je visoko poželjna karakteristika za upotrebu rekombinantnih virusnih kapsida koji su ovde opisani kao virusni vektori.
[0105] Jedno izvođenje iz ovog pronalaska je nukleinska kiselina koja kodira protein kapsida kao što je gore opisano. Nukleinska kiselina je poželjno vektor koji sadrži nukleinsku. Nukleinske kiseline, posebno vektori su neophodni da bi se rekombinantno eksprimovali proteini kapsida iz ovog pronalaska.
[0106] Takođe pomenuta je upotreba bar jednog rekombinantnog proteina virusnog kapsida i/ili nukleinske kiseline koja isti kodira, poželjno bar jedne structure multimera (npr., virusni vektor) za dobijanje i upotrebu kao vektor genskog transfera.
Postupci upotrebe i dobijanje
[0107] Drugo izvođenje rekombinantnih proteina virusnih kapsida koje je ovde opisano je njihova upotreba za isporuku nukleotida od interesa, npr., reporterskog gena ili terapeutskog gena, u ciljnu ćeliju. Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje virusnu česticu ili kompoziciju iz ovog pronalaska za upotrebu u postupku isporuke nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koji sadrži dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa pomenutom virusnom česticom ili pomenutom kompozicijom, pri čemu protein virusnog kapsida sadrži ligand za ciljanje koji se specifično veže za protein koji je eksprimiran na površini ćelije. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za isporuku nukleotida od interesa u in vitro ciljnoj ćeliji koja obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa virusnom česticom prema zahtevu 18 ili kompozicija prema zahtevu 19, pri čemu protein virusnog kapsida sadrži ligand za ciljanje koji se specifično veže za protein koji je eksprimiran na površini ciljne ćelije. Generalno, nukleotid od intreresa može biti plazmid za transfer, koji može generisati 5’ i 3’ sekvence invertovanih terminalnih ponovaka (ITR) koje ograničavaju reporterske gen(e) ili terapeutske gen(e) (koje mogu biti pod kontrolom virusnog ili ne-virusnog promotora, kada su obuhvaćeni AAV vektorom. U jednom izvođenju, nukleotid od interesa plazmid za transfer koji sadrži od 5’ do 3’: 5’ ITR, promoter, gen (npr, reporter i/ili terapijski gen) i 3’ITR.
[0108] Neograničavajući primeri korisnih promotora uključuju, npr., citomegalovirusni (CMV)-promotor, promotor virusa koji obrazuje fokus u slezini (SFFV), faktor elongacije 1 alfa (EF1a)-promotor (1.2 kb EFlapromotor ili 0.2 kb EFla-promotor), himerniEF 1 a/IF4-promotor, i fosfo-glicerat kinazni (PGK)-promotor. Unutrašnji pojačivač se može takođe nalaziti u virusnom konstruktu da bi se povećala ekspresija gena od interesa. Na primer, CMV pojačivač (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169:13) se može koristiti. U nekim izvođenjima, CMV pojačivač se može korisiti u kombinaciji sa pomotorom kokošjeg β-aktina.
[0109] Različiti reporterski geni (ili ostaci koji se mogu detektovati) mogu biti inkapsulirani u multimernoj strukturi koja sadrži ovde opisane rekombinantne proteine kapsida virusa. Primeri reporterskih gena uključuju, na primer, β-galaktozidazu (kodiranu lacZ genom), Zeleni Fluorescentni Protein (GFP), pojačani Zeleni Fluorescentni Protein (eGFP), MmGFP, plavi fluorescentni protein (BFP), pojačani plavi fluorescentni protein (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, žuti fluorescentni protein (YFP), pojačani žuti fluorescentni protein (eYFP), Emerald, CyPet, cijano fluorescentni protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferazu, alkalnu fosfatazu, ili njihovu kombinaciju. Ovde opisani postupci pokazuju konstrukciju vektora za ciljanje koji koriste upotrebu reporterskog gena koji kodira zeleni fluorescentni protein, međutim, osobama iz oblasti tehnike će nakon čitanja ovog izlaganja biti jasno da se ovde opisane nehumane životinje mogu dobiti u odsustvu reporterskog gena ili sa bilo kojim reporterskim genom koji je poznat iz oblasti tehnike.
[0110] Različiti terapeutski geni se takođe mogu inkapsulirati u mogu biti inkapsulirani u multimernoj strukturi koja sadrži ovde opisane rekombinantne proteine kapsida virusa, npr., kao dela vektora za transfer. Neograničavajući primeri terapeutskog gena uključuju one koji kodiraju toksin (npr., gen za samoubistvo), terapeutsko antitelo ili njegov fragment, i CRISPR/Cas sistem ili njegove deo(love), antisens RNK, siRNK, shRNK, itd.
[0111] Dalje izvođenje ovog pronalaska je postupak za dobijanje rekombinantnog proteina kapsida, postupak obuhvata korake:
a) ekspresije nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni protein kapsida pod pogodnim uslovima, i
b) izolovanje eksprimiranog proteina kapsida iz koraka a).
[0112] U nekim izvođenjima, virusna čestica kao što je ovde opisana obuhvata mozaični kapsid, npr., kapsid koji sadrži proteine koji su genetički modifikovani kao što je ovde opisano (u odsustvu ili prisustvu kovalentne veze sa ligandom za ciljanje) u određenom odnosu sa referentnim proteinima kapsida. Postupak za dobijanje takve mozaične čestice virusa sadrži
a) ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni protein kapsida i nukleotid koji kodira referentni protein kapsida u odnosu (mas/mas) 1:1 i 10:1 pod pogodnim uslovima, i
b) izolovanje eksprimiranog proteina kapsida iz koraka a).
[0113] Uopšteno govoreći, smatraće se da mozaični kapsid koji je obrazovan u skladu sa postupkom da ima odnos modifikovanog proteina kapsida:referentni protein kapsida sličan odnosu (mas:mas) nukleinskih kiselina koje kodiraju isti koji je korišćen za proizvodnju mozaičnog kapsida. Prema tome, u nekim izvođenjima, ovde opisana kompozicija sadrži, ili postupak koji je ovde opisan kombinuje, rekombinantni protein virusnog kapsida i referentni protein kapsida (ili kombinacija proteina referentnog kapsida) u odnosu koji je u opsegu od 1:1 do 1:15. U nekim izvođenjima, odnos je 1:2. U nekim izvođenjima, odnos je 1:3. U nekim izvođenjima, odnos je 1:4. U nekim izvođenjima, odnos je 1:5. U nekim izvođenjima, odnos je 1:6. U nekim izvođenjima, odnos je 1:7. U nekim izvođenjima, odnos je 1:8. U nekim izvođenjima, odnos je 1:9. U nekim izvođenjima, odnos je 1:10. U nekim izvođenjima, odnos je 1:11. U nekim izvođenjima, odnos je 1:12. U nekim izvođenjima, odnos je 1:13. U nekim izvođenjima, odnos je 1:14. U nekim izvođenjima, odnos je 1:15.
[0114] Dalja izvođenja iz ovog pronalaska je postupak za izmenu tropizma virusa, postupak obuhvata korake: (a) insertovanja nukleinske kiseline koja kodira heterolognu aminokiselinsku sekvenvcu koja je prvi član protein:protein vezujućeg para kao što je ovde opisano u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira za virusni protein kapsida kao što je ovde opisano da bi se obrazovala nukleotidna sekvenca koja kodira rekombinantni virusni protein kapsida iz predmetnog pronalaska i/ili (b) kultivisanje pakovanja ćelija u uslovima koji su dovoljni za proizvodnju virusnih vektora, pri čemu pakovanje ćelija sadrži nukleinsku kiselinu. Dalje izvođenje iz ovog pronalaska je postupak za prikaz liganda za ciljanje na površini proteina kapsida, postupak obuhvata korake: (a) ekspresije nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni protein virusnog kapsida iz ovog pronalaska (i po potrebi nukleotid koji kodira referentni protein kapsida) u odgovarajućim uslovima, pri čemu nukleinska kiselina kodira protein kapsida iz ovog pronalaska koji sadrži prvi član specifičnog vezujućeg para, (b) izolovanje eksprimiranog proteina kapsida iz ovog pronalaska koji sadrži prvi član specifičnog para vezivanja (a) ili kapsid koji sadrži isti, i (c) inkubiranje proteina kapsida ili kapsida iz ovog pronalaska sa drugim srodnim članom specifičnog vezujućeg para pod uslovima koji su pogodni za i omogućavaju obrazovanje izopeptidne veze između prvog i drugog člana, gde je drugi srodni član specifičnog vezujućeg para spojen sa ligandom za ciljanje.
[0115] U nekim izvođenjima, ćelija za pakovanje dalje sadrži pomoćni plazmid i/ili transfer plazmid koji sadrži nukleotid od interesa. U nekim izvođenjima, postupci dalje obuhvataju izolovanje samokomplementarnih adeno-povezanih virusnih vektora iz supernatanta kulture. U nekim izvođenjima, postupci dalje obuhvataju liziranje ćelije za pakovanje i izolovanje jednolančanih adeno-povezanih virusnih vektora iz ćelijskog lizata. U nekim izvođenjima, metode dalje obuhvataju (a) čišćenje ćelijskog debrisa, (b) tretiranje supernatanta koji sadrži virusne vektore nukleazama, npr. Dnaza I i MgCl2, (c) koncentrisanje virusnih vektora, (d) prečišćavanje virusnih vektora i (e) bilo koju kombinaciju od (a)-(d).
[0116] Ćelije za pakovanje korisne za proizvodnju virusnih vektora koji su ovde opisani uključuju, npr., životinjske ćelije koje su permisivne za virus, ili ćelije modifikovane tako da budu permisivne za virus; ili konstrukt ćelije za pakovanje, na primer, uz upotrebu agensa za transformaciju kao što je kalcijum fosfat. Neograničavajući primeri ćelijskih linija za pakovanje korisnih za proizvodnju virusnih vektora koji su ovde opisani uključuju, na primer, ćelije ljudskog embrionalnog bubrega 293 (HEK-293) (npr., American Type Culture Collection [ATCC] No. CRL-1573), HEK-293 ćelije koji sadrže SV40 veliki T-antigen (HEK-293T ili 293T), ćelije HEK293T/17, ćelijsku liniju humanog sarkoma HT-1080 (CCL-121), ćelijsku liniju slična limfoblastu Raji (CCL-86), epitel glioblastoma-astrocitoma ćelijska linija poput U87-MG (HTB-14), ćelijska linija T-limfoma HuT78 (TIB-161), ćelije NIH/3T3, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) (npr. ATCC br. CRL9618, CCL61, CRL9096), HeLa ćelije (npr. ATCC br. CCL-2), Vero ćelije, NIH 3T3 ćelije (npr. ATCC br. CRL-1658), Huh-7 ćelije, BHK ćelije (npr. ATCC br. CCL10), PC12 ćelije (ATCC br. CRL1721), COS ćelije, COS-7 ćelije (ATCC br. CRL1651), RATI ćelije, mišje L ćelije (ATCC br. CCLI.3), HLHepG2 ćelije, CAP ćelije, CAP-T ćelije i slično.
[0117] L929 ćelije, FLY virusni sistem ćelija za pakovanje opisan u Cosset et al (1995) J Virol 69,7430-7436, ćelije NS0 (mijeloma miša), ćelije amniocita (npr. CAP, CAP-T), ćelije kvasca (uključujući, ali ne ograničavajući se na, S. cerevisiae, Pichia pastoris), biljne ćelije (uključujući, ali ne ograničavajući se na, NTl duvana, BI-2), ćelije insekata (uključujući ali ne ograničavajući se na SF9, S2, SF21, Tni (npr. High 5)) ili bakterijske ćelije (uključujući, ali ne ograničavajući se na, E. coli).
[0118] Za dodatne ćelije i sisteme za pakovanje, tehnike pakovanja i vektore za pakovanje genoma nukleinske kiseline u pseudotipovani virusni vektor videti, na primer, Polo, et al, Proc Natl Acad Sci USA, (1999) 96:4598-4603. Postupci pakovanja uključuju upotrebu ćelija za pakovanje koje trajno eksprimiraju virusne komponente, ili prolaznu transfekciju ćelija plazmidima.
[0119] Dalja izvođenja obuhvataju postupke preusmeravanja virusa i/ili isporuke reporterskog ili terapeutskog gena u ciljnu ćeliju, postupak koji sadrži postupak za transdukciju ćelija in vitro, postupak koji sadrži korake: dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa virusnim vektorom koji sadrži kapsid koji je ovde opisan, pri čemu kapsid sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje receptor eksprimiran u ciljnoj ćeliji. Dalja izvođenja takođe uključuju virusne čestice i kompozicije ovog pronalaska za upotrebu u postupcima preusmeravanja virusa i/ili isporučivanja reporterskog ili terapeutskog gena u ciljnu ćeliju, postupak koji sadrži postupak za transdukciju ćelija in vivo, postupak koji obuhvata korake: dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa virusnim vektorom koji sadrži kapsid koji je ovde opisan, pri čemu kapsid sadrži ligand za ciljanje koji specifično vezuje receptor eksprimiran u ciljnoj ćeliji. U drugim izvođenjima, ciljna ćelija je in vivo u humanom subjektu.
Ciljne ćelije
[0120] Širok spektar ćelija može biti ciljan da bi se isporučio nukleotid od interesa korišćenjem rekombinantnog virusnog vektora kako je ovde otkriveno. Ciljne ćelije će se generalno birati na osnovu nukleotida od interesa i željenog efekta.
[0121] U nekim izvođenjima, nukleotid od interesa može biti isporučen kako bi se omogućilo ciljnoj ćeliji da proizvede protein koji nadoknađuje nedostatak u organizmu, kao što je enzimski nedostatak, ili imuni nedostatak, kao što je X-vezana teška kombinovana imunodeficijencija. Stoga, u nekim izvođenjima, ciljane ćelije koje bi normalno proizvodile protein u životinji. U drugim izvođenjima, ciljane su ćelije u oblasti u kojoj bi protein bio najkorisniji.
[0122] U drugim izvođenjima, nukleotid od interesa, kao što je gen koji kodira siRNK, može inhibirati ekspresiju određenog gena u ciljnoj ćeliji. Nukleotid od interesa može, na primer, inhibirati ekspresiju gena uključenog u životni ciklus patogena. Prema tome, ćelije podložne infekciji od patogena ili inficirane patogenom mogu biti ciljane. U drugim izvođenjima, nukleotid od interesa može inhibirati ekspresiju gena koji je odgovoran za proizvodnju toksina u ciljnoj ćeliji.
[0123] U drugim izvođenjima, nukleotid od interesa može da kodira toksični protein koji ubija ćelije u kojima je eksprimiran. U ovom slučaju, tumorske ćelije ili druge neželjene ćelije mogu biti ciljane.
[0124] U još drugim izvođenjima nukleotid od interesa koji kodira terapeutski protein.
[0125] Kada se jednom identifikuje određena populacija ciljnih ćelija u kojoj je poželjna ekspresija nukleotida od interesa, selektuje se ciljni receptor koji je specifično eksprimiran na toj populaciji ciljnih ćelija. Ciljni receptor može biti eksprimiran isključivo na toj populaciji ćelija ili u većoj meri na toj populaciji ćelija nego na drugim populacijama ćelija. Što je ekspresija specifičnija, to konkretnije isporuka može biti usmerena na ciljne ćelije. U zavisnosti od konteksta, željena količina specifičnosti markera (a samim tim i isporuke gena) može da se razlikuje. Na primer, za uvođenje toksičnog gena, visoka specifičnost je najpoželjnija da bi se izbeglo ubijanje neciljanih ćelija. Za ekspresiju proteina za sakupljanje ili ekspresiju izlučenog proizvoda gde je poželjan globalni uticaj, može biti potrebno manja specifičnost markera.
[0126] Kao što je gore diskutovano, ciljni receptor može biti bilo koji receptor za koji se ligand za ciljanje može identifikovati ili kreirati. Poželjno, ciljni receptor je peptid ili polipeptid, kao što je receptor.
Međutim, u drugim izvođenjima ciljni receptor može biti ugljeni hidrat ili drugi molekul koji partner za vezivanje može prepoznati. Ako je partner za vezivanje, na primer, ligand, za ciljni receptor već poznat, on se može koristiti kao afinitetni molekul. Međutim, ako vezujući molekul nije poznat, antitela na ciljni receptor se mogu generisati upotrebom standardnih postupaka. Antitela se zatim mogu koristiti kao ligand za ciljanje.
[0127] Prema tome, ciljne ćelije mogu biti izabrane na osnovu različitih faktora, uključujući, na primer, (1) određenu primenu (npr. terapiju, ekspresiju proteina koji treba da se prikupi i pružanje otpornosti na bolesti) i (2) ekspresiju markera sa željenom količinom specifičnosti.
Farmaceutske kompozicije, dozni oblici i davanje
[0128] Dalje izvođenje obezbeđuje lek koji sadrži bar jedan rekombinantni virusni protein kapsida i odgovarajući ligand za ciljanje prema ovom pronalasku i/ili nukleinsku kiselinu prema ovom pronalasku. Poželjno takav lek je koristan kao čestica za transfer gena.
[0129] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže virusne čestice ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijens. Pored toga, ovde su obezbeđeni farmaceutski dozni oblici koji sadrže virusnu česticu koja je ovde opisana.
[0130] Kao što je ovde diskutovano, ovde opisane virusne čestice mogu se koristiti za različite terapeutske primene (in vivo i ex vivo) i kao istraživački alati.
[0131] Farmaceutske kompozicije zasnovane na virusnim česticama ovog pronalaska mogu se formulisati na bilo koji konvencionalni način upotrebom jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača i/ili ekscipijenasa. Virusne čestice se mogu formulisati za primenu, na primer, injekcijom, inhalacijom ili insulacijom (bilo kroz usta ili nos) ili oralnom, bukalnom, parenteralnom ili rektnom primenom, ili primenom direktno na tumor.
[0132] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane za različite načine davanja, uključujući sistemsko, lokalno ili lokalizovano davanje. Postupci i formulacije mogu se pronaći u, na primer, Remrnington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Za sistemsko davanje, injekcija je poželjna, uključujući intramuskularnu, intravenoznu, intraperitonealnu, i subkutanoznu. Za svrhe davanja injekcijom, farmaceutske kompozicije mogu se formulisati u tečnim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što je Henkov rastvor ili Ringerov rastvor. Dodatno, farmaceutske kompozicije se mogu formulisati u čvrstom obliku i ponovo rastvoriti ili suspendovati neposredno pre upotrebe. Takođe su pogodni liofilizovani oblici farmaceutske kompozicije.
[0133] Za oralnu primenu, farmaceutske kompozicije mogu biti u obliku, na primer, tableta ili kapsula pripremljenih na uobičajen način sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima kao što su vezivna sredstva (npr. preželatinizovani kukuruzni skrob, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza); punila (npr. laktoza, mikrokristalna celuloza ili kalcijum hidrogen fosfat); lubrikante (npr. magnezijum stearat, talk ili silicijum dioksid); dezintegrante (npr. krompirov skrob ili natrijum skrob glikolat); ili sredstva za vlaženje (npr. natrijum lauril sulfat). Tablete se takođe mogu obložiti postupcima dobro poznatim u oblasti tehnike. Tečni preparati za oralnu primenu mogu biti u obliku, na primer, rastvora, sirupa ili suspenzija, ili mogu biti predstavljeni kao suvi proizvod za konstituisanje sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Takvi tečni preparati se mogu pripremiti na konvencionalne načine sa farmaceutski prihvatljivim aditivima kao što su sredstva za suspendovanje (npr. sorbitol sirup, derivati celuloze ili hidrogenizovane jestive masti); emulgatori (npr. lecitin ili bagrem); nevodeni nosači (npr. ationd ulje, uljni estri, etil-alkohol ili frakcionisana biljna ulja); i konzervansi (npr. metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati takođe mogu da sadrže puferske soli, arome, boje i zaslađivače po potrebi.
[0134] Farmaceutske kompozicije se mogu formulisati za parenteralnu primenu injekcijom, npr. bolusnom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Formulacije za injekcije mogu biti predstavljene u obliku jedinične doze, npr. u ampulama ili u višedoznim kontejnerima, sa opcionim dodatkom konzervansa. Farmaceutske kompozicije se dalje mogu formulisati kao suspenzije, rastvori ili emulzije u uljnim ili vodenim nosačima, i mogu sadržati druga sredstva uključujući sredstva za suspenziju, stabilizaciju i/ili disperziju.
[0135] Pored toga, farmaceutske kompozicije se takođe mogu formulisati kao depo preparati. Ove formulacije dugog dejstva mogu se davati implantacijom (npr. subkutanozno ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Tako, na primer, jedinjenja mogu biti formulisana sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (npr. kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili smolama za izmenu jona, ili kao slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljiva so. Drugi pogodni sistemi za isporuku uključuju mikrosfere, koje nude mogućnost lokalne neinvazivne isporuke lekova tokom dužeg vremenskog perioda. Ova tehnologija može uključiti mikrosfere prekapilarne veličine, koje se mogu ubrizgati preko koronarnog katetera u bilo koji odabrani deo organa bez izazivanja inflamacije ili ishemije. Primenjeni terapeutik se zatim polako oslobađa iz mikrosfera i apsorbuje od okolnih ćelija prisutnih u odabranom tkivu.
[0136] Sistemska primena može biti i transmukoznim ili transdermalnim putem. Za transmukoznu ili transdermalnu primenu, u formulaciji se koriste penetranti koji odgovaraju barijeri koja se penetrira. Takvi penetranti su generalno poznati u oblasti tehnike i uključuju, na primer, za transmukoznu primenu, žučne soli i derivate fuzidinske kiseline. Pored toga, deterdženti se mogu koristiti za olakšavanje prodiranja. Transmukozna primena se može desiti korišćenjem nazalnih sprejeva ili supozitorija. Za lokalnu primenu, virusne čestice koje su ovde opisane mogu se formulisati u masti, meleme, gelove ili kreme kao što je opšte poznato u tehnici. Rastvor za pranje se takođe može koristiti lokalno za lečenje povrede ili upale kako bi se ubrzalo zarastanje.
[0137] Farmaceutski oblici pogodni za injekcionu upotrebu mogu uključivati sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije uključujući susamovo ulje, ulje od kikirikija ili vodeni rastvor propilen glikola; i sterilni praškovi za ekstemporanu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti tečan. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i određenim parametrima skladištenja (npr. hlađenje i zamrzavanje) i mora biti zaštićen od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice.
[0138] Ako se formulacije koje su ovde otkrivene koriste kao terapeutici za jačanje imunološkog odgovora kod subjekta, terapeutski agens se može formulisati u kompoziciju u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele adicione soli (formirane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje se formiraju sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama kao što su sirćetna, oksalna, vinska, bademova kiselina, i slično. Soli koje su obrazovane sa slobodnim karboksilnim grupama takođe mogu biti izvedene iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksidi, i takvih organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slično.
[0139] Nosač takođe može biti rastvarač ili medijum za disperziju koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), njihove pogodne smeše i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost se može održati, na primer, upotrebom premaza, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići raznim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima poznatim oblasti tehnike. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za injektiranje može se postići upotrebom u kompozicijama sredstava koja odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.
[0140] Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti ugradnjom aktivnih jedinjenja ili konstrukata u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa raznim drugim sastojcima koji su gore nabrojani, prema potrebi, nakon čega sledi sterilizacija ceđenjem.
[0141] Nakon formulacije, rastvori se mogu davati na način koji je kompatibilan sa formulacijom doze i u takvoj količini koja je terapeutski efikasna. Formulacije se lako daju u različitim doznim oblicima, kao što je tip rastvora za injektiranje opisan gore, ali se takođe mogu koristiti kapsule sa sporim oslobađanjem ili mikročestice i mikrosfere i slično.
[0142] Za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, na primer, rastvor treba da bude odgovarajuće puferovan ako je potrebno, a tečni razblaživač prvo treba da se učini izotoničnim sa dovoljno fiziološkog rastvora ili glukoze. Ovi posebni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravenoznu, intratumoralnu, intramuskularnu, subkutanoznu i intraperitonealnu primenu. U ovom kontekstu, sterilni vodeni medijumi koji se mogu koristiti biće poznati stručnjacima u ovoj oblasti u svetlu ovog izlaganja. Na primer, jedna doza se može rastvoriti u 1 ml izotoničnog rastvora NaCl i dodati u 1000 ml tečnosti za hipodermoklizu ili ubrizgati na predloženo mesto infuzije.
[0143] Osoba odgovorna za primenu će, u svakom slučaju, odrediti odgovarajuću dozu za pojedinačnog subjekta. Na primer, subjektu se mogu davati virusne čestice opisane ovde na dnevnoj ili nedeljnoj bazi tokom određenog vremenskog perioda ili na mesečnom, dvogodišnjem ili godišnjem nivou u zavisnosti od potrebe ili izloženosti patogenom organizmu ili stanju kod subjekta (npr. kancer).
[0144] Pored jedinjenja formulisanih za parenteralnu primenu, kao što je intravenozna, intratumoralna, intradermalna ili intramuskularna injekcija, drugi farmaceutski prihvatljivi oblici uključuju, npr. tablete ili druge čvrste supstance za oralnu primenu; lipozomalne formulacije; kapsule sa oslobađanjem u vremenu; biorazgradivi i bilo koji drugi oblik koji se trenutno koristi.
[0145] Takođe se mogu koristiti intranazalni ili inhalacioni rastvori ili sprejevi, aerosoli ili inhalanti. Nazalni rastvori mogu biti vodeni rastvori dizajnirani da se daju u nazalne prolaze u obliku kapi ili spreja. Nazalni rastvori se mogu pripremiti tako da su po mnogo čemu slični nazalnim sekretima. Stoga, vodeni rastvori za nos su obično izotonični i malo puferovani da bi se održao pH od 5,5 do 7,5. Pored toga, antimikrobni konzervansi, slični onima koji se koriste u oftalmološkim preparatima, i odgovarajući stabilizatori leka, ako je potrebno, mogu biti uključeni u formulaciju. Poznati su različiti komercijalni preparati za nos koji mogu uključivati, na primer, antibiotike i antihistaminike i koriste se za profilaksu astme.
[0146] Oralne formulacije mogu uključivati ekscipijente kao što su, na primer, farmaceutske klase manitola, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat i slično. Ove kompozicije imaju oblik rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, formulacija sa produženim oslobađanjem ili prahova. U određenim definisanim izvođenjima, oralne farmaceutske kompozicije će uključivati inertni razblaživač ili jestivi nosač koji se može asimilirati, ili mogu biti zatvorene u želatinske kapsule od tvrdog ili mekog omotača, ili mogu biti komprimovane u tablete, ili mogu biti ugrađene direktno u hranu ishrane. Za oralnu terapijsku primenu, aktivna jedinjenja mogu biti ugrađena sa ekscipijensima i korišćena u obliku tableta za gutanje, bukalnih tableta, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafla i slično.
[0147] Tablete, pastile, pilule, kapsule i slično mogu takođe da sadrže sledeće: vezivo, kao tragakant guma, bagrem, kukuruzni skrob ili želatin; ekscipijenti, kao što je dikalcijum fosfat; sredstvo za dezintegraciju, kao što je kukuruzni skrob, krompirov skrob, alginska kiselina i slično; lubrikant, kao što je magnezijum stearat; i može se dodati zaslađivač, kao što je saharoza, laktoza ili saharin ili sredstvo za aromu, kao što je pepermint, ulje zimzelena ili aroma trešnje. Kada je jedinični oblik doze kapsula, ona može sadržati, pored materijala gore navedenog tipa, tečni nosač. Različiti drugi materijali mogu biti prisutni kao obloge ili da na drugi način modifikuju fizički oblik jedinice doze. Na primer, tablete, pilule ili kapsule mogu biti obložene šelakom, šećerom ili sa oba. Sirup eliksira može da sadrži aktivna jedinjenja saharozu kao zaslađivač metil i propilparabene kao konzervanse, boju i aromu, kao što je ukus trešnje ili pomorandže.
[0148] Dalja ovde prikazana izvođenja mogu se odnositi na kitove za upotrebu sa postupcima i kompozicijama. Kitovi mogu takođe uključiti pogodan kontejner, na primer, bočice, epruvete, mini-ili epruvete za mikrocentrifugu, epruvete za ispitivanje, balon, bocu, špric ili drugi kontejner. Gde je obezbeđena dodatna komponenta ili sredstvo, kit mogu sadržati jedan ili više dodatnih kontejnera u kojima se mogu postaviti ovo sredstvo ili komponenta. Ovde navedeni kitovi će takođe obično obuhvatiti sredstva za održavanje virusnih čestica i bilo kog drugog reagensa kontejnera u tesnoj zatvorenosti za komercijalnu prodaju. Takvi kontejneri mogu uključivati plastične kontejnere za injekcije ili livene duvanjem u koje se zadržavaju željene bočice. Opciono, jedan ili više dodatnih aktivnih sredstava kao što su, na primer, anti-inflamatorna sredstva, antivirusna sredstva, anti-gljivična ili anti-bakterijska sredstva ili anti-tumorska sredstva mogu biti potrebna za opisane kompozicije.
[0149] Ovde prikazane kompozicije se mogu davati bilo kojim postupkom koji je poznat iz oblasti tehnike. Na primer, kompozicije mogu uključiti davanje subjektu intravenozno, intratumoralno, intradermalno, intraarterijski, intraperitonealno, intralezionalno, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatički, intrapleurarno, intratekalno, intranazalno, intravitrealno, intravaginalno, intrarektalno, topikalno, intratumoralno, intramuskularno, intratekalno, subkutanozno, subkonjuktivalno, intravezikularno, mukozalno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, oralno, lokalno, inhalacijom, injekcijom, infuzijom, kontinuiranom infuzijom, lokalizovanom perfuzijom, preko katetera, lavažom, u kremu, ili u lipidnoj kompoziciji.
[0150] Može se koristiti bilo koji postupak koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike za proizvodnju u velikim razmerama ovde opisanih čestica virusa, pakovanja ćelija i konstrukata čestica. Na primer, master i radni štokovi za sejanje mogu se pripremiti pod GMP uslovima u kvalifikovanim primarnim CEFs ili drugim postupcima. Ćelije za pakovanje mogu biti zasejane u bocama velike površine, gajene skoro do konfluentnosti i prečišćene virusne čestice. Ćelije mogu biti sakupljene i oslobođene čestive virusa u medijumu kulture koje su su izolovane i prečišćene, ili su intraćelijske čestice virusa oslobođene mehaničkim razaranjem (ćelijski debris (ostaci) se može ukloniti filtracijom velikih pora i DNK ćelije domaćina je digestirana endonukleazom). Virusne čestice se naknadno mogu prečistiti i koncentrovati filtracijom tangencijalnog protoka, zatim sledi dijafiltracija. Dobijena koncentrovana masa se može formulisati razblaženjem sa puferom koji sadrži stabilizatore, koji su napunjeni u bočice, i liofilizovani. Kompozicije i formulacije se mogu skladištiti za kasniju upotrebu. Za upotrebu, liofilizovane čestice virusa mogu se rekonstituisati dodavanjem razblaživača.
[0151] Određena dodatna sredstva koja su korišćena u kombinovanim terapijama mogu se formulisati i primeniti na bilo koji način koji je poznat u oblasti tehnike.
[0152] Kompozicije kao što su ovde prikazane mogu takođe uključiti adjuvanse kao što soli aluminijuma i drugi mineralni adjuvansi, tenzoaktivna sredstva, bakterijske derivate, nosače i citokine. Adjuvansi takođe mogu imati imunomodulatorna svojstva. Na primer, adjuvansi mogu stimulisati imunittet Th1 ili Th2. Kompozicije i postupci kao što su ovde prikazani mogu takođe uključiti pomoćnu terapiju.
PRIMERI
[0153] Sledeći primeri su dati samo za ilustrativne svrhe i nisu namenjeni da ograniče obim pronalaska. Materijali i postupci
Ćelijske linije i antitela
[0154] Sve 293 ćelijske linije su održavane u DMEM-u dopunjenom sa 10% FBS, 1% Pen/Strep, i 1% L-glutaminom. 293 hErbB2 i 293hASGR1/2 ćelijske linije su generisane lentiviralnom transdukcijom parentalne 293 ćelijske linije sa vektorom koji eksprimira odgovarajuću cDNK. Sve ćelijske linije su dobijene od Regeneron TC jedinice koja obezbeđuje opremu za istraživanja. B1 antitelo prepoznaje linearni epitop koji dele AAV VP1, VP2 i VP3.
AA V konstrukti proteina kapsida
[0155] GeneBlocks koji kodira željene SpyTag insercije, linker aminokiseline bočnih strana, i dodatne mutacije su kupljeni od IDT i klonirani su u BsiWI i XcmI-digestirani pAAV2-CAP divlji tip ili pAAV9-CAP divlji tip upotrebom Gibson Assembly u skladu sa protokolom dobijenim od proizvođača (NEB).
Fuzija “SpyCatcher” sa antitelima
[0156] GeneBlocks koji kodiraju SpyCatcher su kupljeni od IDT, i Gibson Assembly je korišćen za kloniranje kodirajuće sekvence u okviru u ekspresione plazmide za scFv ili teške lance antitela na C terminusu svakog konstrukta, koji je odvojen sa fleksibilnim GSGESG aminokiselinskim linkerom (SEQ ID NO:48) .
Priprema AA V virusnih vektora
[0157] Virus je generisan transfekcijom 293T pakovanja ćelija upotrebom PEI Pro sa sledećim plazmidima: pAd Pomoćnik, plazmidom koji sadrži AAV2 ITR koji kodira reporterski protein, i pAAV-CAP plazmid koji kodira gene AAV Rep i Cap, sa ili bez dodatnih plazmida koji kodiraju ili scFv ili teške i lake lance antitela. scFv i konstrukti teškog lanca antitela su svi spojeni sa SpyCatcher na njihovom C terminusu kao što je gore opisano. Transfekcija je sprovedena u OptiMEM, i medijum je promenjen u DMEM dopunjenim sa sa 10% FBS, 1% Pen/Strep, i 1% L-Glut nakon 8 h.
[0158] Transfektovane ćelije za pakovanje su inkubirane 3 dana na 37°C, zatim je virus sakupljen iz lizata ćelija korišćenjem standardnog smrzavanje-otapanje protokola. Ukratko, ćelije za pakovanje su podignute struganjem i peletirane su. Supernatant je uklonjen, i ćelije su resuspendovane u rastvoru 50mM Tris-HCl; 150mM NaCl; i 2 mM MgCl2 [pH 8.0]. Intraćelijske čestice virusa su oslobođene indukcijom lize ćelija pomoću tri uzastopna ciklusa smrzavanja-otapanja, koji se sastoji od promene suspenzije ćelija između suvog leda/kupatila etanola i 37°C vodenog kupatila uz snažno vrtložno mešanje. Viskozitet je smanjen tretiranjem lizata sa EMD Millipore Benzonazom (50 U/ml ćelijskog lizata) tokom 60 min na 37°C, uz povremeno mešanje. Debris je zatim peletovan centrifugiranjem, i dobijeni supernatant je proceđen kroz 0.22 μm PVDF Millex-GV Filter, direktno u gornju komoru Amicon Ultra-15 Centrifugalne Filter jedinice sa Ultracel-100 membranom (100 KDa MWCO) filter kertridžom. Jedinica filtera je centrifugirana na 5-10 minutnim intervalima sve dok željena zapremina nije dobijena u gornjoj komori, nakon čega je koncentrovani sirovi virus pipetiran u epruvetu sa niskim vezivanjem proteina i skladišten je na 4C. Titar (genomi virusa po mililitru vg/mL) je određivan qPCR korišćenjem standardne krive virusa poznate koncentracije.
Infekcija ćlija/Transdukcija i protočna citometrijska analiza
[0159] Da bi se ćelije inficirale, čestice virusa su dodavane direktno u medijum ćelija u kulturi, i smeša je inkubirana preko noći na 37°C. U svakom bunariću medijum je zamenjen 24 h kasnije, i ćelije su inkubirane u trajanju od 5 dana. U 5 danu od infekcije, ćelije su izložene dejstvu tripsina, resuspendovane u PBS-u sa 2% FBS, i procenat ćelija GFP+ je sakupljen na BD FACSCanto protočnom citometru i analiziran korišćenjem FlowJo softvera.
Analiza “Western” blot
[0160] Reakcija između SpyTagged AAV proteina VP1, VP2 i VP3 i SpyCatcher-obeleženih antitela ili scFvs je praćena analizom “Western” blot. Novex<®>Tris-Glicin SDS pufer uzorka sa redukujućim sredstvom je dodavan u jednakim zapreminama preparatima neobrađenog virusa, i uzorci su zagrevani do 85°C u trajanju od 5 minuta, nakon čega su ohlađeni do sobne temperature i naliveni su na prethodno sklopljeni 4-12% Tris-Glicin gel (Invitrogen). Proteini su razdvojni SDS-PAGE pod redukujućim uslovima i preneti su na PVDF upotrebom vlažnog transfera. Membrane su blokirane sa Li-Cor Odyssey TBS puferom za blokiranje i ispitane su sa mišjim monoklonskim B1 antitelom (ARP American Research Products, Inc.) razblaženim 1:100 u TBST preko noći na 4°C. Blotovi su isprani u TBST, ispitani sa infracrvenokonjugovanim anti-mišjim sekundarnim antitelom, i snimljeni su na Li-Cor Odyssey.
PRIMERI
Primer 1 Konjugacija scFv sa peptidom insertovanim u kapsid AAV2 na ostatku N587 usmerava ciljanje specifično za antigen
[0161] Svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom jedne ploče od 15 cm od 293T pakovanja ćelija sa sledećim plazmidima i količinama:
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4ug
SA ili BEZ
pCMV-C6.5-SpyCatcher 4ug
[0162] Ćelije inkubirane sa česticama virusa kao što je gore opisano procenjene su protočnom citometrijskom analizom za infekciju.
[0163] AAV2 koji nosi heparin vezujuće mutacije (HBM) R585A i R588A, kao i peptid SpyTag na poziciji kapsida N587, proizveden je u prisustvu ili odsustvu C6.5-SpyCatcher, scFv koji vezuje HER2 i fuzionisan je za SpyCatcher na svom C-terminusu. AAV2 konjugovan sa HER2-ciljanim scFv specifično inficira HER2+ ćelije i pokazuje vrlo malo pozadinske infekcije HER2-ćelija. Slika 1.
Primer 2 Konjugacija antitela sa peptidom insertovanim u kapsid AAV2 na ostatku N587 usmerava ciljanje specifično za antigen
[0164] Svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom jedne ploče od 15 cm od 293T ćelija za pakovanje sa sledećim plazmidima i količinama:
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
(nastavak)
pAAV2-CAP divljeg tipa 4ug
ILI
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4ug
SA ili BEZ
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
[0165] AAV2 divljeg tipa i AAV2 koji nose mutacije vezivanja heparina (HBM) R585A i R588A, kao i peptid SpyTag na poziciji kapsida N587, proizveden je u prisustvu ili odsustvu teških i lakih lanaca antitela koji kodiraju SpyCatcher-Herceptin antitelo koje vezuje HER2 i fuzionisano je za SpyCatcher na C-terminusu teškog lanca. Ćelije inficirane virusnim česticama kao što je gore opisano procenjene su protočnom citometrijskom analizom za praćenje transdukcije. AAV2 konjugovan sa HER2-ciljnim antitelom specifično inficira HER2+ ćelije i pokazuje vrlo malo pozadinske infekcije HER2- ćelija. Slika 2.
Primer 3 Konjugacija antitela sa peptidom insertovanim u kapsid AAV2 na ostatku G453 usmerava ciljanje specifično za antigen
[0166] Svaki od ostataka N587 i G453 leže na izloženim regionima AAV2 kapsida koji obrazuju proteinske spajkove koji se protežu sa površine viriona. Ostaci leže na dva različita spajka, pa je ispitivano da li bi SpyTag insertovan posle ostatka G453 funkcionisao na isti način kao SpyTag insertovan posle ostatka N587. Svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom jedne ploče od 15 cm od 293T pakovanja ćelija sa sledećim plazmidima i količinama:
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAAV2-CAP G453 SpyTag HBM 0.5ug
pAAV2-CAP R585A R588A HBM 3.5ug
ILI
pAAV2-CAP divljeg tipa 4ug
SA ili BEZ
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
[0167] AAV2 i AAV2 divljeg tipa koji nose mutacije vezivanja heparina (HBM) R585A i R588A, kao i peptid SpyTag na poziciji kapsida G453, proizveden je u prisustvu ili odsustvu teških i lakih lanaca antitela koji kodiraju SpyCatcher-Herceptin, antitela koje veže HER2 i fuzionisan je sa SpyCatcher na C-terminusu teškog lanca. Virus je proizveden kao mozaik mešanjem kapsida koji eksprimiraju SpyTag sa kapsidima HBM. Ćelije inficirane virusnim česticama kao što je gore opisano procenjene su protočnom citometrijskom analizom za praćenje transdukcije. AAV2 konjugovan sa HER2-ciljanim antitelom specifično inficira HER2+ ćelije i pokazuje vrlo malo pozadinske infekcije HER2-ćelija. Slika 3.
Primer 4 Povećanje modifikacije viriona AAV sa scFv-a smanjuje njihovu infektivnost
[0168] U nastojanju da se optimizuje efikasnost reakcije SpyTag-SpyCatcher, dostupnost SpyTag-a na površini virusa je poboljšana tako što je peptidni tag bočno u odnosu na obe strane sa fleksibilnim linker aminokiselinama. Generisan je panel N587 SpyTag bočno u odnosu na obe strane sa insercionim mutanataima sa rastućih dužina linkera i pripremljen virus upotrebom ovih AAV2 Rep-Cap konstrukata u prisustvu ili odsustvu C6.5-SpyCatcher, scFv koji vezuje HER2 i fuzionisan je sa SpyCatcher na svom C -terminusu. Reakcija između SpyTagged AAV2 proteina VP1, VP2 i VP3 i SpyCatcher-obeležnog C6.5 je praćena “Western” blot analizom; SpyTagged proteini kapsida koji su reagovali sa scFv obeleženim SpyCatcher pokazuju povećanje u veličini pomoću SDS-PAGE. Ćelije inficirane česticama virusa kao što je gore opisano procenjene su protočnom citometrijskom analizom da bi se izmerila transdukcija.
[0169] Svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom jedne ploče od 15 cm od 293T pakovanja ćelija sa sledećim plazmidima i količinama:
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
pAAV2-CAP N587 LinkerX SpyTag 4ug
[0170] pAAV2-CAP N587 Linker SpyTag konstrukti uključuju:
pAAV2-CAP N587 Linker1 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker2 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker4 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker6 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker8 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker10 SpyTag HBM
[0171] Kada SpyTag nije imao bočno sa obe strane linker aminokiseline, kompleksi VP-SpyTag-SpiCatcherscFv nisu bili detektovani “Western” blot analizom, virusi su postigli niske nivoe specifične transdukcije HER2+ ćelija. Slika 4. Kako se dužina linkera povećavala (1-6 aminokiselina), VP-SpyTag-SpiCatcher-scFv kompleksi su počeli da se detektuju pomoću “Western” blota, efikasnost transdukcije virusa je porasla.
Slika 4. Međutim, kada je SpyTag bio bočno sa obe strane sa dva najduža linkera (8-10 aminokiselina), skoro svaki od proteina VP su reagovali sa SpyCatcher-Vh “Western” blotom, ali ovi potpuno dekorisani virusi više nisu efikasno transdukovali ćelije. Slika 4. Stoga, činilo se da je prekomerna modifikacija čestica AAV pomoću scFvs štetna za njihovu sposobnost transdukcije ciljnih ćelija, i da je potreban samo mali broj konjugovanih scFv kako bi se virus ponovo usmerio na ciljne ćelije.
Primer 5 Povećanje modifikacije AAV viriona antitelima smanjuje njihovu infektivnost
[0172] Koristeći panel N587 SpyTag insercionih mutanata bočno sa obe strane sa rastućim dužinama linkera, virus je pripremljen korišćenjem ovih AAV2 Rep-Cap konstrukata u prisustvu ili odsustvu teških i lakih lanaca antitela koji kodiraju SpyCatcher-Herceptin, antitela koje vezuje HER2 i spaja se sa SpyCatcher na C-terminusu teškog lanca. Reakcija između SpyTagged AAV proteina VP1, VP2 i VP3 i SpyCatcheroznačenog teškog lanca herceptina (Vh) praćena je “Western” blot analizom; SpyTagged proteini kapsida koji su reagovali sa antitelima označenim sa SpyCatcher će pokazati promenu u veličini za SDS-PAGE.
[0173] Svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom jedne ploče od 15 cm od 293T pakovanja ćelija sa sledećim plazmidima i količinama:
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
pAAV2-CAP N587 LinkerX SpyTag 4ug
[0174] pAAV2-CAP N587 Linker SpyTag konstrukti uključuju:
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker1 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker2 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker4 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker6 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker8 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Linker10 SpyTag HBM
[0175] Kada SpyTag nije imao bočno sa obe strane linker aminokiseline ili je bio bočno sa obe strane sa veoma kratkim aminokiselinama, VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh kompleksi nisu detektovani “Western” blot analizom, ali su virusi specifično inficirali HER2+ ćelije sa efikasnošću koja se približava nivoima kod divljeg tipa. Slika 5. Nasuprot tome, kada je SpyTag bio bočno sa obe strane sa dužim linkerima (6 aminokiselina ili više), skoro svi VP proteini su reagovali sa SpyCatcher-Vh “Western” blotom, ali ovi potpuno dekorisani virusi više nisu bili infektivni. Slika 5. Povećana modifikacija čestica AAV antitelima je bila štetna za njihovu sposobnost transdukcije ciljnih ćelija, i bio je potreban samo mali broj konjugovanih antitela kako bi se virus ponovo usmerio na ciljne ćelije.
Primer 6 Mozaicizam modulira efikasnost transdukcije virusnih čestica
[0176] S obzirom da dugi, fleksibilni linkeri omogućavaju efikasnu reakciju SpyTagged AAV kapsida sa scFvs spojenim sa SpyCatcher-om, ali prekomerna modifikacija AAV čestica pomoću scFvs je štetna za njihovu sposobnost transdukcije ciljnih ćelija, broj SpyTag na svakom virionu je smanjen dok je pristupačnost SpyTag i efikasna reaktivnost zadržana generisanjem mozaika AAV čestica koje su mešavina različitih odnosa visoko reaktivnih SpyTagged konstrukata sa ne-SpyTagged konstruktima kapsida, a svi nose R585A R588A mutaciju vezivanja heparina (HBM). Svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom jedne ploče od 15 cm od 293T pakovanja ćelija sa sledećim plazmidima i količinama:
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pCMV-C6.5-SpyCatcher 4ug
[0177] SA RAZLIČITIM ODNOSIMA :
pAAV2-CAP N587 Linker10 SpyTag HBM Xug
pAAV2-CAP R585A R588A Xug
ili
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
[0178] SA RAZLIČITIM ODNOSIMA :
pAAV2-CAP N587 Linker10 SpyTag HBM Xug
pAAV2-CAP R585A R588A Xug
ili
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
[0179] SA RAZLIČITIM ODNOSIMA :
pAAV2-CAP G453 LinkerX SpyTag HBM Xug
pAAV2-CAP R585A R588A Xug
[0180] Odnos između pAAV2-CAP N587 Linker10 SpyTag HBM i pAAV2-CAP R585A R588A plazmida bio je ili 1:0 (4ug:0ug) što predstavlja čist pAAV2-CAP N587 Linker10 SpyTag HBM3 virioni,1:1u (1:1ug 1 (2ug:2ug) ili 1:3 (1ug:3ug) u mešavini za transfekciju. Odnos između plazmida pAAV2-CAP G453 Linker10 SpyTag HBM i pAAV2-CAP R585A R588A plazmida bio je ili 1:0 (4ug:0ug) što predstavlja čisti pAAV2-CAP G453 Linker10 SpyTag HBM, ili 1:13 viriona (1:13). :7 (0,5 ug:3,5 ug) u mešavini za transfekciju. Reakcija između SpyTagged AAV proteina VP1, VP2 i VP3 i SpyCatcher-obeleženog anti-HER scFv ili SpyCatcherobeleženog herceptina teškog lanca (Vh) praćena je “Western” blot analizom; SpyTagged proteini kapsida koji su reagovali sa scFvs ili antitelima obeleženim SpyCatcher pokazaće promenu veličine pomoću SDS-PAGE. Reakcija N587 SpyTag linker panela sa SpyCatcher-anti-HER2 scFv je prikazana na Slici 6. Reakcija N587 SpyTag linker panela sa SpyCatcher-anti-HER2 antitelom je prikazana na Slici 7. Gore opisane ćelije inficirane mozaikom čestica virusa su procenjene protočnom citometrijskom analizom za merenje transdukcije Slika 6-7. Kako je količina visoko reaktivnih SpyTag kapsida bočno sa strana sa Linker10 smanjena, broj ne-SpyTagged kapsida povećan, smanjenje u količini VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv kompleksa primećeno je “Western” blot analizom, zajedno sa povećanjem u efikasnosti transdukcije virusa Slike 6-7. Pokazana je inverzna veza između broja antitela koji dekorišu virion i efikasnosti transdukcije sa ponovo usmerenim virusom.
[0181] Reakcija G453 SpyTag HBM i G453 Linker10 SpiTag HBM sa SpyCatcher-anti-HER2 antitelom je prikazana na Slici 8. Obe SpyTag insercije na G453, bilo SpyTag zasebno ili SpyTag uz Linker10, reagovale su veoma efikasno sa SpyCatcher-om označenim kao što je mereno “Western” blotom, što sugeriše da je mesto umetanja G453 prirodno pristupačnije od N587, koje ne reaguje brzo osim ukoliko ima bočno sa obe strane aminokiseline linkera. Kao što je primećeno na panelu linkera N587, kada su virusi bili intenzivno modifikovani pomoću SpyCatcher-Herceptin antitela, virusi više nisu bili infektivni. Stoga, deluje da su visoki nivoi modifikacije čestica AAV antitelima štetni za njihovu sposobnost transdukcije ciljnih ćelija, i zaključuje se da je SpyTag insertiovan nakon G453 prirodno pristupačniji od SpyTag koji je insertovan na N587.
Primer 7 Sistem SpyTag-SpiCatcher se može koristiti sa dodatnim parovima antitelo-meta da bi se postiglo specifično ponovno usmeravanje in vitro
[0182] Ispitana je sposobnost pristupa SpyTag-SpiCatcher da ponovo usmeri AAV na druge mete osim HER2. SpyCatcher-obeležena antitela koja ciljaju na dodatne proteine na površini ćelije su klonirana i ispitivana je sposobnost ovih antitela da ponovo usmeravaju SpyTagged AAV na tipove ćelija koje eksprimiraju ove dodatne mete. Za eksperimente usmerene na ASGR1 i CD63, svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom jedne ploče od 15 cm sa 293T pakovanjem ćelija sledećim plazmidima i količinama:
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAAV2-CAP N587 Linker10 SpyTag HBM 0.5ug
pAAV2-CAP R585A R588A 3.5ug
[0183] SA ILI BEZ
SpyCatcher-spojeni Vh težak lanac plazmid 1.5ug
Vk laki lanac plazmid 3ug
[0184] Za eksperimente usmerene na PTPRN, svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom jedne ploče od 15 cm od 293T pakovanja ćelija sa sledećim plazmidima i količinama:
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-eGFP 4ug
pAAV2-CAP G453 Linker 10 SpyTag HBMx5 0.5ug
pAAV2-CAP N587 Myc 3.5ug
[0185] SA ILI BEZ
SpyCatcher-spojeni Vh težak lanac plazmid 15ug
Vk laki lanac plazmid 3ug
[0186] Za eksperimente usmerene na ENTPD3 i CD20, svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom jedne ploče od 15 cm 293T pakovanja ćelija sa sledećim plazmidima i količinama:
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-luciferaza svica 4ug
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4ug
[0187] SA ILI BEZ
SpyCatcher-spojeni Vh težak lanac plazmid 1.5ug
Vk laki lanac plazmid 3ug
[0188] Ispitivani su plazmidi SpyCatcher-Vh i Vk koji kodiraju teške i lake lance antitela koji prepoznaju humane proteine ASGR1, CD63, PTPRN, ENTPD3 i CD20. Da bi se generisali mozaici AAV čestica sa malim brojem izloženih SpyTag-ova, SpyTag i ne-SpyTagged plazmidi su bili prisutni u odnosu 1:7 u mešavini transfekcije, za koju je prethodno utvrđeno da je idealan odnos SpyTag-a i ne-SpyTag kapsida za ponovno usmeravanje AAV pomoću antitela. Ćelije koje eksprimiraju ASGR1, CD63 ili PTPRN su inficirane mozaicima čestica AAV2 opisanim gore, a transdukcija je merena protočnom citometrijom. AAV2 konjugovan sa ASGR1, CD63 i PTPRN-specifičnim antitelima, bio je u stanju da specifično inficira srodne ciljne ćelije koje eksprimiraju ASGR1, CD63 i PTPRN, tim redom, i pokazao je veoma nisku pozadinsku infekciju u odsustvu antitela. Ćelije koje eksprimiraju ENTPD3 ili CD20 su inficirane gore opisanim česticama AAV2, a transdukcija je merena luciferaznim testom upotrebom standardnih protokola. AAV2 konjugovan sa ENTPD3 i CD20-specifičnim antitelima, bio je u stanju da specifično inficira srodne ciljne ćelije koje eksprimiraju ENTPD3 i CD20, tim redom, i pokazao je veoma nisku pozadinsku infekciju u odsustvu antitela.
Slika 9
Primer 8 Sistem SpyTag-SpyCatcher se može prilagoditi za ponovno usmeravanje na AAV9
[0189] Ispitana je prilagodljivost SpyTag-SpiCatcher sistema drugim serotipovima AAV. AAV9 je široko korišćen serotip koji generiše visoki virusni titar i veoma je efikasan u transdukciji mišjih tkiva. Ostaci važni za vezivanje za receptor razlikuju se između AAV2 i AAV9, s obzirom na to da AAV2 vezuje heparin sulfat proteoglikane, a AAV9 vezuje galaktozu. Ostaci za koje se zna da su važni u vezivanju receptora određeni su iz dostupne literature (Bell, C.L., Gurda, B.L., Van Vliet, K., Agbandje-McKenna, M., & Wilson, J.M. (2012). Identification of the galactose binding domain of the adeno-associated virus serotype 9 capsid.
Journal of Virology, 86(13), 7326-7333. ht-tp://doi.org/10.1128/JVI.00448-12), i uključuje N470, D271, N272, Y446, i W503. Mutacija W503A je izabrana kao mutacija za vezivanje za receptor za upotrebu u generisanju mutiranih konstrukata, s obzirom da je ova mutacija jedne aminokiseline snažno smanjila vezivanje receptora. Takođe su identifikovani regioni kapsida AAV9 koji su ortologni dvema projekcijama (varijabilnim petljama) unutar kojih su položaji AAV2 N587 i G453 takođe identifikovani; odgovarajući ostaci u AAV9 su A589 i G453. SpyTag je insertovan u ova dva mesta unutar kapsida AAV9, sa i bez aminokiselinskih linkera bočno sa strana, i u kombinaciji sa mutacijom vezivanja receptora W503A.
[0190] Svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom jedne ploče od 15 cm od 293T ćelija za pakovanje sa sledećim plazmidima i količinama:
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-eGFP 4ug
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
pAAV9 RC plazmid 4ug ukupne DNK
[0191] Za AAV9 divlji tip, AAV9-CAP A589SpyT_W503A, AAV9-CAP A589Linker10SpyT_W503A, i AAV9-CAP G453Linker10SpyT_W503A, 4ug svakog plazmida je korišćeno za svaku transfekciju.
[0192] Za mozaik viruse, 3.5ug pAAV9-CAP W503A i 0.5ug ili pAAV9-CAP A589Linker10SpyT_W503A ili pAAV9-CAP G453Linker10SpyT_W503A je korišćeno za svaku transfekciju da se postigne odnos 1:7 SpyTag prema ne-SpyTagged Rep-Cap plazmidima.
[0193] Transdukcija ćelija, protočna citometrijska analiza i “Western” blot analiza su izvedene kao što je gore opisano.
[0194] Insercije AAV9 RC A589 i G453 SpyTag podržavale su reakciju sa SpyCatcher-Herceptinom i posredovale specifičnom transdukcijom HER2+ ćelija. Slika 10. Slično sa AAV2, SpyTag insertovan u AAV9 RC A589 bez linkera bočno u odnosu na strane nije bio veoma dostupan i slabo je reagovao sa SpyCatcherom. Slika 10. Suprotno tome, dodavanj linkera aminokiselina sa jedne i druge strane SpyTag-a omogućilo je robusnu reaktivnost na SpyCatcher, a čestice mozaika sa nekoliko visoko reaktivnih SpyTag-ova bile su veoma efikasne u transdukciji ciljnih ćelija. Slika 10.
Primer 9: Ponovno usmeravanje SpyTagged AAV kompleksa čestica-SpyCatcher-Vh in vivo
[0195] Da bi se utvrdilo da li se VP-SpyTag-SpiCatcher-Vh može ponovo usmeriti na ćelije jetre koje eksprimiraju hASGR1 in vivo, miševi su genetički modifikovani tako da njihove ćelije jetre eksprimiraju hASGR1 na pozadini C57BL/6, a kontrolnim miševima divljeg tipa je intravaskularno ubirzgan samo divlji tip AAV ili čestice virusa VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh (kao čiste ili mozaik čestice, i sa ili bez linkera aminokiselina) koje nose reporterski gen, npr. zeleni fluorescentni protein ili luciferazu svica. Kontrole obuhvataju miševe kojima je ubrizgan fiziološki rastvor fosfatnog pufera (PBS). Da bi se utvrdilo da li se VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh može ukloniti sa jetre i ponovo usmeriti na druge organe, miševima divljeg tipa ubrizgano je intravaskularno samo divlji tip AAV ili VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh virusne čestice (kao čestice mozaika) koje nose reporterski gen, na primer, zeleni fluorescentni protein. Da bi se demonstriralo detargetiranje sa jetre i ponovno usmeravanje na drugi organ, izabran je protein ENTPD3, jer nije poznato da se eksprimuje u jetri, ali se eksprimuje u drugim organima, kao što su ćelije ostrvaca pankreasa (Syed et al.2013, Am J Physiol Endocrinol Metab 305: E1319-E1326, 2013) i jezika, u skladu sa javno dostupnim bazama podataka (podaci izvučeni sa GenePaint.org http://vvv.informatics.jak.org/assay/MGI:5423021 i projekta Riken FANTOM5, skup podataka adulta miša).
[0196] Antitela označena SpyCatcher-om koja ciljaju humani CD3, humani CD63, humani ASGR1 (od kojih nijedno nije eksprimirano kod miševa divljeg tipa) ili humani ENTPD3 (koji takođe prepoznaje mišji protein) su klonirana i ispitana je sposobnost ovih antitela da ponovo ciljaju SpyTagged AAV2 noseći bilo ispitivan eGFP ili luciferazu svica in vivo. Svaki virus je generisan kao što je gore opisano transfekcijom ploča od 15 cm 293T pakovanja ćelija sa sledećim plazmidima i količinama:
Anti-Humani CD3/ anti-Humani ASGR1 GFP
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CAGG eGFP 4ug
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4ug
SA ILI BEZ
pAnti-CD3 ili Anti-ASGR1 SpyCatcher Vh 1.5ug
pAnti-CD3 ili Anti-ASGR1 Vk 3ug
Anti-Humani CD63/ anti-Humana ASGR1 Luciferaza
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-UbC-Luciferaza svica 4ug
pAAV2-CAP G453 Linker 10 SpyTag HBMx5 0.5ug
pAAV2-CAP N587 Myc 3.5ug
SA ILI BEZ
pAnti-CD63 ili Anti-ASGR1 SpyCatcher Vh 1.5ug
pAnti-CD63 ili Anti-ASGR1 Vk 3ug
Anti-Humani ENTPD3/ anti-Humani ASGR1 GFP
pAd Pomoćni 8ug
pAAV-CMV-eGFP 4ug
pAAV2-CAP G453 Linker 10 SpyTag HBMx5 0.5ug
pAAV2-CAP N587 Myc 3.5ug
SA ILI BEZ
pAnti-ENTPD3 ili Anti-ASGR1 SpyCatcherVh 1.5ug
pAnti-ENTPD3 ili Anti-ASGR1 Vk 3ug
[0197] SpyCatcher-Vh i Vk plazmidi koji kodiraju teške i lake lance antitela koji prepoznaju humane proteine ASGR1, CD3 ili CD63, ispitivani su na miševima koji su genetički modifikovani tako da njihove ćelije jetre eksprimiraju hASGR1 na pozadini C57BL/6. SpyCatcher-Vh i Vk plazmidi koji kodiraju antitelo koje prepoznaje humani protein ASGR1 (kao neciljanu kontrolu) ili mišji i humani protein ENTPD3 ispitivani su na miševima divljeg tipa. Deset dana nakon infekcije, miševi su žrtvovani i ekspresija reporterskog gena je ispitana; jetra, slezina i bubrezi su fiksirani i obojeni pilećim anti-EGFP antitelom (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) i Alexa-488 konjugovanim anti-kokošjim sekundarnim antitelom (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA). Da bi se testirala luminiscencija životinja, 14 dana nakon infekcije, žive životinje su anestezirane upotrebom izoflurana, ubrizgan im je supstrat Luciferina i snimljene 10 minuta kasnije korišćenjem IVIS Spectrum In vivo Sistema za snimanje (PerkinElmer). Slike 11 i 12 pokazuju da je infekcija kompleksima AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh otkrivena samo u jetri miševa koji eksprimiraju hASGR1 i kojima je ubrizgan AAV ponovo usmerenim hASGR1 i nije otkrivena u jetri divljih miševa, koji ne eksprimiraju hASGR1. U drugim organima nije otkriven pozitivan EGF (podaci nisu prikazani).
[0198] Slika 13 pokazuje imunohemijsko bojenje za ekspresiju eGFP u jetri i pankreasu kod miševa divljeg tipa nakon ubrizgavanja AAVs konjugovanih za antitela koja ciljaju ENTPD3 ili hASGR1 kao neciljnu kontrolu, s obzirom da hASGR1 nije eksprimiran kod miševa divljeg tipa. Četiri nedelje nakon infekcije, organi su sakupljeni iz inficiranih životinja i fiksirani su u 10% neutralnom puferovanom fromalinu u trajanju od 48 h, zatim su imunohistohemijski bojeni za eGFP. Slika 13 pokazuje da su kompleksi AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh detargetirani sa jetre miševa divljeg tipa; svi miševi kojima je ubrizgano AAVs konjugovano sa antitelima koja ciljaju ENTPD3 i hASGR1 pokazali su sličan nedostatak ekspresije eGFP u jetri. Miš kome je ubrizgano AAVs koji su konjugovani sa antitelima koja ciljaju ENTPD3 imali su ćelije koje eksprimuju eGFP u pankreasnim ostrvcima, pri čemu se smatra da je ENTPD3 eksprimiran.
[0199] Slika 14 pokazuje imunohistohemijsko bojenje za ekspresiju eGFP u jetri i jeziku miševa divljeg tipa koje sledi nakon injekcije AAVs konjugovanih sa antitelima koja ciljaju ENTPD3 ili hASGR1 kao neciljnom kontrolom, s obzirom da hASGR1 nije eksprimiran kod miševa divljeg tipa.14 dana nakon infekcije, organi su sakupljeni iz inficiranih životinja i fiksirani su u 10% neutralnom puferovanom formalinu u trajanju od 48 h, nakon čega su imunohistohemijski bojeni za eGFP. Slika 14 pokazuje da su kompleksi AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh detargetirani sa jetre miševa divljeg tipa; svi miševi kojima je ubrizgano AAVs konjugovanim sa antitelima koja ciljaju ENTPD3 i hASGR1 pokazali su sličan nedostatak ekspresije eGFP u jetri. Sva tri miša kojima su ubrizgani sa AAVs konjugovani sa neciljajućim irelevantnim antitelom (anti-ASGR1) nisu pokazali bojenje u jeziku, dok sva tri miša kojma je ubrizgano AAVs konjugovanim sa anti-ENTPD3 su pokazali ćelije koje ekspreimiraju eGFP u jeziku, pri čemu se smatra da je ENTPD3 eksprimiran.
Primer 10: Isporuka gena za suicid ćelijama koje eksprimiraju ligand za ciljanje
[0200] Takođe je opisana sposobnost VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh kompleksa da specifično isporuče terapeutski teret, kao što su jedan ili više gena za suicid, biološki terapeutik (npr., antitelo), CRISPR/Cas sistem za editovanje gena, shRNK, itd., u ciljni ćelijski tip.
[0201] Da bi se ispitala sposobnost VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh kompleksa da isporuče gen za suicid u specifičnoj ćeliji, korišćen je ksenograft golog modela miša HER2<+>kancer dojke kao što je opisano od strane Wang et al. ((2010) Cancer Gene Therapy 17:559-570).
[0202] VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh kompleksi koji nose gen za suicif (SG) generisani su slično onima koji se opisuju u Materijalima i Postupcima.
[0203] Linije ćelija: BT474 kancer dojke, SK-BR-3 kancer dojke i ćelijske linije Calu-3 kancera pluća su linije ćelija humanog tumora koji je pozitivan na HER2 (Bunn P.A. et al., (2001) Clin Cancer Res.7:3239-3250; Pegram M, et al. (1999) Oncogene 18:2241-2251; Spiridon CI, et al., (2002) Clin Cancer Res.8:1720-1730). A-673 rabdomiosarkom i HeLa kancer cerviksa su linije ćelija humanog tumora koji je negativan na HER2 i BEAS-2b je imortalizovana ćelijska linija epitela bronhija negativna na HER2 (Jia LT et al. (2003) Cancer Res.
63:3257-3262; Kern JA, et al., (1993) Am J Respir Cell Mol Biol 9:448-454; Martinez-Ramirez A, et al., (2003) Cancer Genet Cytogenet.2003;141:138-142). Svaka od navedenih ćelijskih linija je dobijena od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) i održavane su u medijumu preporučenom od strane ATCC.
[0204] Miševi: Ženski goli miševi, starosti 6 do 8 nedelja su dobijeni i gajeni su u specifičnim uslovima bez prisustva patogena. Dana 0, miševima je istrovremeno (1) ubrizgano subkutanozno u desni bok 10<7>BT474, SK-BR-3, Calu-3, A-673 ili HeLa ćelija tumora i (2) tretirani su intravenozno sa VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh kompleksima koji nose reporter (npr., EGFP) ili genom za suicid. Kao kontrole su služile netretirane životinje (životinje kojima su ubrizgane samo ćelije tumora), životinje kojima su ubrizgane čestice AAV divljeg tipa koje nose samo reporterski ili gen za suicid, životinje kojima su ubrizgane čestice samo SpyTagvirusa, itd. Sve životinje su tretirane sa pro-lekom 1 dan nakon injekcije i tretmana. Veličina svakog tumora je merena upotrebom kalipera 2 puta nedeljno, i zapremina tumora je izračunata kao dužinaXširina<2>X0.52. Nakon morbiditeta, ulceracije tumora, prečnika tumora od 15 mm, ili zapremine tumora od 1000 mm<3>, miševi su žrtvovani, i podaci o žrtvovanju su zabeleženi kao datum smrti. Jetre, slezine, bubrezi i tumori životinja kojima su ubrizgane čestice virusa koje nose reporterski gen su fiksirani i ekspresija reporterskog gena je vizuelizovana.
[0205] Iako je opisana ciljana isporuka gena koji indukuju suicide (Zarogoulidis P., et al. (2013) J. Genet. Syndr. Gene Ther. 4:16849), ovaj primer opisuje isporuku gena za suicid u ćeliju koja eksprimira ciljani HER2 ligand upotrebom ovde opisanih čestica virusa. U dodatnim eksperimentima, gen za suicid je isporučen drugom ćelijskom tipu koji eksprimira jedan ili više drugih ciljnih liganada korišćenjem ovde opisane čestice virusa u primerima i neograničavajućim primerima receptora koji su pogodni za ciljanje uključuju one receptore koji posreduju endocitozi čestice virusa, npr., karcino-embrionalnog antigena (CEA) (Qiu Y, et al. (2012) Cancer Lett. 316:31-38) i receptora vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGFR) (Leng A, et al. (2013) Tumour Biol.32:1103-1111; Liu T, et al. (2011) ExpMolPathol.91:745-752). Dodatni receptori koji se mogu ciljati uključuju: receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) (Heimberger AB, et al. (2009) Expert Opin Biol Ther.9:1087-1098), klasteri diferencijacije 44 (CD44s) (Heider KH, et al. (2004) Cancer Immunol Immunother.53:567-579), klaster diferencijacije 133 (CD133 tj. AC133) (Zhang SS, et al. (2012) BMC Med. ;10:85), folatni receptor (FR) (Duarte S, et al., (2011) J Control Release 149(3):264-72), receptor transferina (TfR) ili klaster diferencijacije 71 (CD71) (Habashy HO, et al., Breast Cancer Res Treat.119(2):283-93), mucin (Torres MP, et al., (2012) Curr Pharm Des.2012; 18(17):2472-81), stadijum specifični embrionalni antigen 4 (SSEA-4) (Malecki M., et al., (2012) J Stem Cell Res Ther.2(5)), antigen tumorske rezistencije 1-60 (TRA-1-60) (Malecki M., et al., (2013) J Stem Cell Res Ther.3:134).
[0206] Prethodni primeri ilustruju aspekte pronalaska, ali ne ograničavaju njegov obim, koji se definiše patentnim zahtevima.
[0207] Iako se bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili ispitivanju ovog pronalaska, sada su opisani neki poželjni postupci i materijali. Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koje se ovde koriste imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada.

Claims (28)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantni virusni protein kapsida koji je genetički modifikovan da ispolji heterolognu sekvencu aminokiselina koja sadrži prvi član vezujućeg para protein:protein insertovan u protein virusnog kapsida , pri čemu je protein virusnog kapsida dobijen iz cap gena adeno-povezanog virusa (AAV) koji kodira AAV VP1, VP2, i/ili VP3 protein kapsida; pri čemu:
(a) prvi član vezujućeg para protein:protein je peptidni tag i sposoban je za obrazovanje izopeptidne veze sa drugim srodnim članom protein:protein vezujućeg para; ili
(b) prvi član vezujućeg para protein:protein je peptidni tag i protein virusa kapsida dalje sadrži drugi srodni član vezujućg para protein:protein, pri čemu prvi član i drugi srodni član su vezani izopeptidnom vezom.
2. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema zahtevu 1, pri čemu protein virusa kapsida dalje sadrži drugi srodni član vezujućeg para protein:protein, pri čemu su prvi član i drugi srodni član vezani izopeptidnom vezom.
3. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, pri čemu je protein virusnog kapsida dobijen iz himernog AAV cap gena.
4. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde virusni protein kapsida dalje sadrži mutaciju pored prvog člana vezujućeg para protein:protein.
5. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu:
(a) prvi član smanjuje ili ukida prirodni tropizam proteina kapsida; i/ili
(b) virusni protein kapsida dalje sadrži mutaciju pored prvog člana vezujućeg para protein:protein, koja smanjuje ili ukida prirodni tropizam proteina kapsida.
6. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu:
(a) bočno sa obe strane prvog i člana je prvi i/ili drugi linker koji spaja prvi član sa proteinom kapsida virusa, i gde je prvi i/ili drugi linker svaki nezavisno dužine bar jedne aminokiseline;
(b) protein virusnog kapsida koji dalje sadrži mutaciju na poziciji aminokiseline uključenu u vezivanje proteina virusa kapsida sa njegovim prirodnim receptorom, pri čemu mutacija sadrži inserciju heterolognog peptida u protein kapsida, zamenu jedne ili više aminokiselina u proteinu kapsida sa heterolognim peptidom, deleciju jedne ili više aminokiselina u proteinu kapsida, ili njihovu kombinaciju;
(c) AAV je odabran iz grupe koja se sastoji iz AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9;
(d) vezujući par protein:protein je:
(i) SpyTag: SpyCatcher,
(ii) SpyTag:KTag,
(iii) Izopeptag:pilin-C,
(iv) SnoopTag: SnoopCatcher,
(v) SpyTag002:SpyCatcher002; ili
(e) bilo koja kombinacija (a)-(d).
7. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema zahtevu 5 ili 6, pri čemu je tropizam proteina virusnog kapsida:
(a) obnovljen;
(b) preusmeren; ili
(c) obnovljen i preusmeren,
nakon obrazovanja izopeptidne veze sa drugim srodnim članom, pri čemu je drugi srodni član spojen sa ligandom za ciljanje koji specifično veže ciljnu ćeliju.
8. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema bilo kom od zahteva 2-7, pri čemu:
(a) prvi član je SpyTag i drugi srodni član je SpyCatcher ili KTag;
(b) prvi član je KTag i drugi srodni član je SpyTag;
(c) prvi član je SnoopTag i drugi srodni član je SnoopCatcher;
(d) prvi član je isopeptag i drugi srodni član je Pilin-C; ili
(e) prvi član je SpyTag002 i drugi srodni član je SpyCatcher002.
9. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema bilo kom od zahteva 2-7, pri čemu je drugi srodni član vezan sa ligandom za ciljanje.
10. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema zahtevu 9, gde:
(a) ligand za ciljanje je ostatak za vezivanje;
(b) ligand za ciljanje je antitelo, ili njegov deo;
(c) ligandom za ciljanje sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:46;
(d) ligandom za ciljanje specifično veže molekul ćelijske površine; ili
(e) bilo koja kombinacija pod (a)-(d).
11. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema zahtevu 10, pri čemu je ostatak za vezivanje antitelo, ili njegov deo, gde:
(a) antitelo, ili njegov deo, je spojeno sa SpyCatcher;
(b) antitelo, ili njegov deo, je spojeno sa SpyCatcher, pri čemu antitelo, ili njegov deo, je spojeno sa linkerom na C-terminusu, i linker je spojen sa SpyCatcher na C-kraju linkera; ili
(c) antitelo, ili njegov deo, je spojen sa SpyCatcher, pri čemu antitelo, ili njegov deo, je spojen sa linkerom na C-kraju, i linker je spojen sa SpyCatcher na C-kraju linkera, pri čemu linker sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:48 (GSGESG).
12. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema zahtevu 10, pri čemu ligand za ciljanje specifično veže molekul ćelijske površine koji je:
(i) asijaloglikoprotein 1 (ASGR1),
(ii) humana ektonukleozid trifosfat difosfohidrolaza 3 (ENTPD3),
(iii) PTPRN,
(iv) CD20,
(v) CD63,
(vi) Her2; ili
(vii) receptor 2 transferina.
13. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema zahtevu 10, pri čemu:
(a) ligand za ciljanje specifično vezuje molekul koji eksprimira neuronska ćelija; ili
(b) ligand za ciljanje specifično veže receptor transferina koji eksprimira neuronska ćelija.
14. Rekombinantni protein virusnog kapsida prema zahtevu 10, pri čemu ligand za ciljanje specifično veže molekul koji eksprimira mišićna ćelija.
15. Rekombinantni virusni kapsid koji sadrži protein virusnog kapsida prema bilo kom od zahteva 1-14.
16. Rekombinantni virusni kapsid prema zahtevu 15, pri čemu protein virusnog kapsida dalje sadrži referentni protein virusnog kapsida kome nedostaje bilo koji član specifičnog vezujućeg para.
17. Rekombinantni virusni kapsid prema zahtevu 16, koji sadrži protein virusnog kapsida i referentni protein virusnog kapsida u odnosu između 1: 1 i 1: 15.
18. Rekombinantna virusna čestica koja sadrži nukleotid od interesa inkapsuliran virusnim kapsidnim proteinom prema bilo kom od zahteva 15-17.
19. Kompozicija koja sadrži: (a) protein virusnog kapsida prema bilo kom od zahteva 15-17 ili česticu virusa prema zahtevu 18; i (b) farmaceutski prihvatljiv nosač.
20. Čestica virusa prema zahtevu 18 ili kompozicija prema zahtevu 19 za upotrebu u postupku isporuke nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koji obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa pomenutom česticom virusa ili pomenutom kompozicijom, pri čemu protein virusnog kapsida sadrži ligand za ciljanje koji specifično veže protein eksprimiran na površini ciljne ćelije.
21. Čestica virusa ili kompozicija za upotrebu u postupku prema zahtevu 20, pri čemu:
(a) ciljna ćelija je in vivo u subjektu;
(b) ciljna ćelija je in vivo u humanom subjektu; i/ili
(c) ciljna ćelija je humana ciljna ćelija.
22. Čestica virusa ili kompozicija za upotrebu u postupku prema zahtevu 21, pri čemu:
(i) ciljna ćelija je humana ćelija jetre, i pri čemu se ligand za ciljanje veže za humani asialoglikoproteinski receptor (ASGR1);
(ii) ciljna ćelija je humana neuronska ćelija, i pri čemu ligand za ciljanje veže GABA;
(iii) ciljna ćelija je humana T ćelija, i pri čemu ligand za ciljanje veže CD3;
(iv) ciljna ćelija je humana T ćelija, i pri čemu ligand za ciljanje veže CD3ε;
(v) ciljna ćelija je humana hematopoetska ćelija, i pri čemu ligand za ciljanje veže CD34;
(vi) ciljna ćelija je humana ćelija bubrega;
(vii) ciljna ćelija je humana ćelija kancera, i pri čemu ligand za ciljanje veže antigen povezan sa tumorom; ili
(viii) ciljna ćelija je humana ćelija kancera, i pri čemu ligand za ciljanje veže antigen povezan sa tumorom, u kome je tumorski antigen E6, E7 ili Her2.
23. Čestica virusa ili kompozicija za upotrebu u postupku prema zahtevu 21, pri čemu:
(i) ligand za ciljanje veže PTPRN (Receptor protein tirozin fosfataze tipa N);
(ii) ligand za ciljanje veže CD20;
(iii) ligand za ciljanje veže za humani glukagonski receptor; ili
(iv) ligand za ciljanje specifično veže CD63 ili humanu ektonukleozid trifosfat difosfohidrolazu 3 (hENTPD3).
24. Postupak za isporuku nukleotida od interesa u in vitro ciljnu ćeliju koji obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa česticom virusa iz zahteva 18 ili kompozicije iz zahteva 19, pri čemu protein virusnog kapsida sadrži ligand za ciljanje koji specifično veže protein eksprimiran na površini ciljne ćelije.
25. Postupak prema zahtevu 24, u kome:
(i) ciljna ćelija je humana ćelija jetre, i pri čemu se ligand za ciljanje veže za humani asialoglikoproteinski receptor (ASGR1);
(ii) ciljna ćelija je humana neuronska ćelija, i pri čemu se ligand za ciljanje veže za GABA;
(iii) ciljna ćelija je humana T ćelija, i pri čemu se ligand za ciljanje veže za CD3;
(iv) ciljna ćelija je humana T ćelija, i pri čemu se ligand za ciljanje veže za CD3ε;
(v) ciljna ćelija je humana hematopoetska ćelija, i pri čemu se ligand za ciljanje veže za CD34;
(vi) ciljna ćelija je humana ćelija bubrega;
(vii) ciljna ćelija je humana ćelija kancera, i pri čemu ligand za ciljanje veže antigen povezan sa tumorom; ili
(viii) ciljna ćelija je humana ćelija kancera, i pri čemu ligand za ciljanje veže antigen povezan sa tumorom, u kome je tumorski antigen E6, E7 ili Her2.
26. Postupak prema zahtevu 24, u kome:
(i) ligand za ciljanje veže PTPRN;
(ii) ligand za ciljanje veže CD20;
(iii) ligand za ciljanje veže humani receptor glukagona; ili
(iv) ligand za ciljanje specifično veže CD63hENTPD3; ili
(v) ligand za ciljanje specifično veže receptor 2 transferina.
27. Rekombinantni vektor koji kodira protein virusnog kapsida prema bilo kom od zahteva 1-14.
28. Gen cap AAV koji kodira rekombinantni protein virusnog kapsida prema bilo kom od zahteva 1-14.
RS20230411A 2017-06-27 2018-06-27 Rekombinantne virusne čestice sa modifikovanim tropizmom i njihove upotrebe za ciljano uvođenje genetičkog materijala u humane ćelije RS64233B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762525708P 2017-06-27 2017-06-27
EP18749636.9A EP3645553B1 (en) 2017-06-27 2018-06-27 Tropism-modified recombinant viral particles and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
PCT/US2018/039878 WO2019006046A2 (en) 2017-06-27 2018-06-27 RECOMBINANT VIRAL PARTICLES WITH MODIFIED TROPISM AND USES THEREOF FOR TARGETED INTRODUCTION OF GENETIC MATERIAL INTO HUMAN CELLS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64233B1 true RS64233B1 (sr) 2023-06-30

Family

ID=63080488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230411A RS64233B1 (sr) 2017-06-27 2018-06-27 Rekombinantne virusne čestice sa modifikovanim tropizmom i njihove upotrebe za ciljano uvođenje genetičkog materijala u humane ćelije

Country Status (30)

Country Link
US (1) US20200140492A1 (sr)
EP (4) EP4706688A2 (sr)
JP (4) JP2020525020A (sr)
KR (3) KR20200021987A (sr)
CN (2) CN110997699A (sr)
AU (4) AU2018290885B2 (sr)
BR (1) BR112019027866A2 (sr)
CA (1) CA3066950A1 (sr)
CL (3) CL2019003843A1 (sr)
CO (1) CO2019014684A2 (sr)
CY (1) CY1126149T1 (sr)
DK (1) DK3645553T5 (sr)
ES (1) ES2943020T3 (sr)
FI (1) FI3645553T3 (sr)
HR (1) HRP20230538T1 (sr)
HU (1) HUE061908T2 (sr)
IL (2) IL318395A (sr)
LT (1) LT3645553T (sr)
MA (1) MA49514B1 (sr)
MD (1) MD3645553T2 (sr)
MX (2) MX2020000246A (sr)
PE (2) PE20251541A1 (sr)
PH (1) PH12019550269B1 (sr)
PL (1) PL3645553T3 (sr)
PT (1) PT3645553T (sr)
RS (1) RS64233B1 (sr)
SG (1) SG11201911614XA (sr)
SI (1) SI3645553T1 (sr)
SM (1) SMT202300168T1 (sr)
WO (1) WO2019006046A2 (sr)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3151866B1 (en) 2014-06-09 2023-03-08 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
AU2019227910B2 (en) * 2018-02-28 2025-07-17 The Regents Of The University Of California A modular system for gene and protein delivery based on AAV
EP3774926A1 (en) 2018-04-05 2021-02-17 Bio-Rad ABD Serotec GmbH Display systems for proteins of interest
GB201903479D0 (en) * 2019-03-14 2019-05-01 Univ Oxford Innovation Ltd Polypeptide with enchanced rate of spontaneous isopeptide bond formation with it's peptide tag partner and uses thereof
EP3942079A1 (en) 2019-03-18 2022-01-26 Bio-Rad ABD Serotec GmbH Protection of spytag-containing periplasmic fusion proteins from protease tsp and ompt degradation
JP2022533438A (ja) 2019-05-24 2022-07-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 改変ウイルス粒子およびその使用
EP3983117A4 (en) * 2019-06-11 2023-06-21 Chevron U.S.A. Inc. MEMBRANES FOR REMOVAL OF POLLUTION FROM NATURAL GAS AND METHODS OF USE THEREOF
CN120441704A (zh) * 2019-06-26 2025-08-08 圆祥生技股份有限公司 T细胞活化抗体
GB201915905D0 (en) * 2019-11-01 2019-12-18 Spybiotech Ltd Viruses with modified capsid proteins
WO2021092298A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 President And Fellows Of Harvard College Viral capsid polypeptides
WO2021092300A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 President And Fellows Of Harvard College Viral capsid polypeptides
CN114634578B (zh) * 2020-12-15 2024-04-02 榕森生物科技(北京)有限公司 针对新型冠状病毒感染的疫苗组合物
CN114632148B (zh) * 2020-12-15 2024-08-09 榕森生物科技(北京)有限公司 病原样抗原疫苗及其制备方法
JP2024540181A (ja) 2021-11-04 2024-10-31 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 骨格筋に再標的化されたウイルス粒子
CN114213505B (zh) * 2021-12-10 2022-09-20 和元生物技术（上海）股份有限公司 一种适用于特异感染u87-mg细胞的腺相关病毒突变体
US12584145B2 (en) 2022-04-15 2026-03-24 Washington University Conjugate systems and methods of use thereof
US20250302998A1 (en) 2022-05-09 2025-10-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
EP4536836A1 (en) 2022-06-07 2025-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pseudotyped viral particles for targeting tcr-expressing cells
CA3263388A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VIRAL PARTICLES RETRIBUTED TO TRANSFERRIN RECEPTOR 1
KR20250116795A (ko) 2022-11-14 2025-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 별아교세포로의 섬유아세포 성장 인자 수용체 3-매개된 전달을 위한 조성물 및 방법
WO2024107452A1 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for detecting and determining protein structures and stability in fluids, including biological fluids
WO2024124019A2 (en) * 2022-12-07 2024-06-13 Ginkgo Bioworks, Inc. Aav vectors targeting hematopoietic stem cells
CN115819628A (zh) * 2022-12-28 2023-03-21 河南赛诺特生物技术有限公司 一种高免疫原性与反应性的cd47膜蛋白及其制备方法和应用
EP4665764A1 (en) 2023-02-13 2025-12-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of muscle related disorders with anti-human cacng1 antibodies
WO2024229105A1 (en) 2023-05-02 2024-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human m-cadherin (cdh15) antibodies, conjugates, and uses thereof for delivery of genetic payloads to muscle cells
WO2024263705A2 (en) 2023-06-20 2024-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for purifying filled adeno-associated virus capsids
WO2025018388A1 (ja) * 2023-07-20 2025-01-23 学校法人自治医科大学 抗菌カプシド、治療用組成物、殺菌剤、細菌除去方法、殺菌方法、動物治療方法、遺伝子導入方法、細菌機能追加方法、抗菌カプシドの製造方法、抗菌カプシドの標識方法、及び抗菌カプシドの細胞内送達方法
WO2025044353A1 (zh) * 2023-09-01 2025-03-06 北京昌平实验室 靶向性基因编辑酶工程化的腺相关病毒及其药物组合物
TW202528546A (zh) 2023-09-07 2025-07-16 美商再生元醫藥公司 經共價表面修飾之腺相關病毒的生產及純化
WO2025097030A1 (en) * 2023-11-02 2025-05-08 Oregon State University Virus-like particles displaying neisseria gonorrhoeae antigens and use thereof for immunization against gonorrhea
TW202540433A (zh) 2023-11-21 2025-10-16 美商再生元醫藥公司 藉由活體外接合產生共價表面修飾之腺相關病毒及共價表面修飾的腺相關病毒之純化
WO2025151796A1 (en) 2024-01-11 2025-07-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Viral particles retargeted to nervous system tissues
WO2025155923A1 (en) 2024-01-17 2025-07-24 The Broad Institute, Inc. Aav capsid modifications that enable improved cns-wide gene delivery through interactions with the transferrin receptor
US20250242018A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
CN117723749B (zh) * 2024-02-07 2024-06-04 南昌大学 基于分子粘合剂的动态光散射免疫传感检测方法
WO2025184603A2 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. The use of cd40 inhibitors for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025217174A1 (en) 2024-04-08 2025-10-16 The Broad Institute, Inc. Aav capsid modifications that enable improved cns-wide gene delivery through interactions with carbonic anhydrase iv
WO2025217163A2 (en) 2024-04-08 2025-10-16 The Broad Institute, Inc. Novel aav capsids binding to human cd59
WO2026025058A1 (en) 2024-07-25 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aav viral particles retargeted to egfr-expressing cancer cells
WO2026039325A2 (en) 2024-08-12 2026-02-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified mtm1 genes and uses thereof
WO2026050618A1 (en) 2024-08-29 2026-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide constructs and cell lines for recombinant aav production
CN119529113A (zh) * 2024-11-28 2025-02-28 浙江大学 一种基于PCV2 VLPs的纳米抗原展示平台及制备方法和应用
CN120519522B (zh) * 2025-07-23 2025-11-18 南昌大学第一附属医院 基于双向负载模块的通用工程外泌体构建方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1286981C (zh) 2004-11-30 2006-11-29 华中科技大学同济医学院附属同济医院 表达人类cyp2j2反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法
ES2602610T3 (es) 2007-05-31 2017-02-21 Medigene Ag Proteína estructural mutada de un parvovirus
ES2724975T3 (es) 2009-12-10 2019-09-18 Regeneron Pharma Ratones que producen anticuerpos de cadena pesada
GB201002362D0 (en) 2010-02-11 2010-03-31 Isis Innovation Peptide tag systems that spontaneously form an irreversible link to protein partners via isopeptide bonds
AR094403A1 (es) 2013-01-11 2015-07-29 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos anti-her3
CA3124228C (en) 2014-03-21 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
US20160018835A1 (en) 2014-07-18 2016-01-21 Retroficiency, Inc. System and method for virtual energy assessment of facilities
WO2016112921A1 (en) * 2015-01-15 2016-07-21 University Of Copenhagen Virus-like particle with efficient epitope display
EP3262063B1 (en) 2015-02-26 2021-09-22 Var2 Pharmaceuticals ApS Immunotherapeutic targeting of placental-like chondroitin sulfate using chimeric antigen receptors (cars) and immunotherapeutic targeting of cancer using cars with split-protein binding systems
EP3141600A1 (en) 2015-09-11 2017-03-15 Institut National de la Recherche Agronomique Nepovirus coat protein fusion polypeptides and their use
IL315358A (en) * 2016-08-18 2024-11-01 Univ California CRISPR-CAS genome engineering using a modular AAV delivery system
AU2019227910B2 (en) * 2018-02-28 2025-07-17 The Regents Of The University Of California A modular system for gene and protein delivery based on AAV

Also Published As

Publication number Publication date
DK3645553T5 (da) 2024-08-26
HUE061908T2 (hu) 2023-09-28
IL271570B1 (en) 2026-01-01
US20200140492A1 (en) 2020-05-07
WO2019006046A3 (en) 2019-02-14
DK3645553T3 (da) 2023-05-22
AU2018290885B2 (en) 2023-07-27
EP4706687A2 (en) 2026-03-11
AU2023204611A1 (en) 2023-08-03
CO2019014684A2 (es) 2020-01-17
KR20200021987A (ko) 2020-03-02
FI3645553T3 (fi) 2023-05-22
EP3645553A2 (en) 2020-05-06
CY1126149T1 (el) 2023-11-15
CL2025002293A1 (es) 2025-11-14
MA49514B1 (fr) 2023-06-28
JP2025129257A (ja) 2025-09-04
WO2019006046A2 (en) 2019-01-03
HRP20230538T1 (hr) 2023-08-04
EP4219529A1 (en) 2023-08-02
AU2023204611B2 (en) 2025-10-30
JP2024071769A (ja) 2024-05-24
EP3645553B1 (en) 2023-03-15
SG11201911614XA (en) 2020-01-30
AU2026200717A1 (en) 2026-02-19
PH12019550269A1 (en) 2021-01-11
AU2026200716A1 (en) 2026-02-19
JP2020525020A (ja) 2020-08-27
PH12019550269B1 (en) 2024-05-22
LT3645553T (lt) 2023-04-25
IL271570A (en) 2020-02-27
RU2020101596A3 (sr) 2022-03-22
PL3645553T3 (pl) 2023-07-17
AU2018290885A1 (en) 2020-01-16
EP4706688A2 (en) 2026-03-11
SI3645553T1 (sl) 2023-06-30
BR112019027866A2 (pt) 2020-07-07
PE20200895A1 (es) 2020-09-08
KR20260039813A (ko) 2026-03-20
CL2019003843A1 (es) 2020-07-24
CN116891534A (zh) 2023-10-17
PE20251541A1 (es) 2025-06-05
MA49514A (fr) 2020-05-06
SMT202300168T1 (it) 2023-07-20
MX2023009051A (es) 2023-08-10
MX2020000246A (es) 2020-08-10
CL2020003438A1 (es) 2021-07-23
JP2022186991A (ja) 2022-12-15
IL318395A (en) 2025-03-01
CN110997699A (zh) 2020-04-10
PT3645553T (pt) 2023-05-08
MD3645553T2 (ro) 2023-07-31
CA3066950A1 (en) 2019-01-03
KR20250091321A (ko) 2025-06-20
ES2943020T3 (es) 2023-06-08
RU2020101596A (ru) 2021-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3645553B1 (en) Tropism-modified recombinant viral particles and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
EP3645551B1 (en) Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
HK40097450A (en) Tropism-modified recombinant viral particles and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
RU2811426C2 (ru) Рекомбинантные вирусные частицы с модифицированным тропизмом и пути их применения для нацеленного введения генетического материала в клетки человека
HK40018459A (en) Tropism-modified recombinant viral particles and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
HK40018459B (en) Tropism-modified recombinant viral particles and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
BR122024026259A2 (pt) Métodos de produção de um ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo de vírus adenoassociado (aav) recombinante, de produção de uma proteína capsídica aav recombinante, de produção de um capsídeo aav recombinante compreendendo uma proteína de capsídeo aav recombinante, de produção de uma partícula de aav, de produção de um capsídeo de aav em mosaico recombinante, de produção de uma partícula de aav em mosaico, de distribuição de um nucleotídeo de interesse a uma célula alvo in vitro, acido nucleico, célula de empacotamento, composição, proteína do capsídeo de aav recombinante, capsídeo de avv recombinante em mosaico, partícula de avv, uso, gene cap de aav geneticamente modificado e vetor recombinante
HK40112774A (en) Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
BR122023021213B1 (pt) Composição para o redirecionamento de proteínas do capsídeo viral
BR122024025144A2 (pt) Ácido nucleico isolado, método de produção de um vetor aav, vetor aav, molécula de ligação, e, composição
HK40018460B (en) Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
HK40018460A (en) Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells