KR20200051708A - 비-바이러스성 캡시드-비함유 dna 벡터의 지질 나노입자 제형 - Google Patents
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Abstract
공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-비함유 DNA 벡터 및 이온화가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자 제형이 본원에 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2017년 9월 8일에 출원된 미국 가출원 번호: 제62/556,334호; 2017년 9월 8일에 출원된 제62/556,333호; 2017년 9월 9일에 출원된 제62/556,381호; 2018년 5월 23일에 출원된 제62/675,317호; 2018년 5월 23일에 출원된 제62/675,322호, 2018년 5월 23일에 출원된 제62/675,324호 및 2018년 5월 23일에 출원된 제62/675,327호의 35 U.S.C.§ 119(e) 하의 이점을 청구하며, 이들은 각각 전문이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자제출된 서열목록을 포함하며, 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 2018년 9월 7일에 작성된 ASCII 사본의 명칭은 080170-090660WOPT_SL.txt이며, 크기는 63,790 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 비-바이러스성 캡시드-비함유 DNA 벡터의 지질 나노입자(LNP) 제형 및, 외인성 DNA 서열을 표적 세포, 조직, 장기 또는 유기체에 전달하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
최근에, AAV 2 ITR에 의해 측접된 이식유전자를 함유하는 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-비함유 DNA 벡터가 보고되었다. 그러나, 시험관내 및 생체내에서 이들 DNA 벡터의 세포로의 표적화된 전달은 여전히 도전적이다. 따라서, 당해 분야에서는 이들 과제를 해결하는 제형이 여전히 요구되고 있다.
개요
일 양태에서, 이온화가능한 지질 및 캡시드 비함유, 비-바이러스성 벡터(ceDNA)를 포함하는 신규 지질 제형이 본원에 제공된다. 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터는 5' 역전된 말단 반복(ITR) 서열 및 서로에 대해 상이하거나 비대칭인 3' ITR 서열을 포함하는, 공유적으로-폐쇄된 말단(선형, 연속적 및 비-캡시드화된 구조)을 갖는 상보성 DNA의 연속 가닥으로부터 형성된 캡시드-비함유 선형 듀플렉스 DNA 분자이다. 일 양태에서, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-비함유 DNA 벡터는 바람직하게는 선형 듀플렉스 분자이고, 2개의 상이한 역전된 말단 반복 서열(ITR)(예를 들어, AAV ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하는 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 얻을 수 있으며, 여기서 ITR 중 적어도 하나는 말단 분할 부위 및 복제 단백질 결합 부위(RPS)(때로는 복제 단백질 결합 부위로 지칭됨), 예를 들어 Rep 결합 부위를 포함하고, 및 ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 즉, ITR 중 하나는 다른 ITR에 비해 비대칭이다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 AAV ITR, 예를 들어 야생형 AAV ITR 또는 변형된 AAV ITR이다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 다른 ITR에 비해 변형된 ITR이다 - 즉, ceDNA는 서로 비대칭인 ITR을 포함한다.
일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 비-기능성 ITR이다.
일부 구현예에서, ITR 중 하나 이상은 야생형 ITR이 아니다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화되고 천연 및 변성 겔 전기영동 둘다에 의해 분석될 때 ceDNA 벡터는 선형 및 비-연속적 DNA 대조군과 비교하여, 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드를 나타낸다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 비대칭 ITR 서열 중 하나 이상이 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 비대칭 ITR이 상이한 바이러스 혈청형으로부터 유래된다. 예를 들어, 하나 이상의 비대칭 ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 비대칭 ITR 서열 중 하나 이상이 합성이다.
일부 구현예에서, 비대칭 ITR 중 적어도 하나(예를 들어, 하나 또는 둘 모두)가 A, A', B, B', C, C', D, 및 D'로부터 선택된 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 (a) 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 및 (b) 서열번호: 2 및 서열번호: 51로부터 선택된 적어도 2개의 비대칭 ITR을 포함한다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 (a) 적어도 하나의 Rep 단백질의 존재하에, ceDNA 발현 작제물을 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 ceDNA 발현 작제물이 곤충세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 ceDNA 벡터를 암호화하는 단계; 및 (b) 곤충세포로부터 ceDNA 벡터를 단리하는 단계를 포함하는 방법으로부터 수득된다. 제한없이, ceDNA 발현 작제물은 ceDNA 플라스미드, ceDNA 백미드, 또는 ceDNA 배큘로바이러스일 수 있다.
일반적으로, 곤충 세포 곤충 세포가 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현한다. 적어도 하나의 Rep 단백질은 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래된다. 예를 들어, 적어도 하나의 Rep 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 표 1에 열거된 공보에 기재된 지질이다.
본원에 개시된 다양한 양태의 일부 구현예에서, ceDNA의 존재는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 변성 및 비-변성 겔상에서 소화된 DNA 물질을 분석하여 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 벡터는 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득되며, 여기서 벡터 폴리뉴클레오타이드는 2개의 역 말단 반복 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하며, 여기서 2개의 ITS는 서로 상이하며(비대칭), ITR 중 적어도 하나는 기능적 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는 기능성 ITR이고, ITR 중 하나는 기능적 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고; Rep 단백질의 존재는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도한다.
일부 구현예에서, DNA 벡터의 생성은 곤충 세포에서 이루어진다. 예를 들어, DNA 벡터는: (a) 곤충 세포 내에서 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA 벡터의 생성을 유도하는데 효과적인 조건하에 및 충분한 시간 동안, Rep 단백질의 존재하에 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여되어 있는 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 벡터의 부재하에 곤충 세포가 곤충 세포 내에서 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA의 생성을 포함하지 않는 단계; 및 (b) 곤충 세포로부터 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA를 수확 및 단리하는 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하다. 일부 추가의 구현예에서, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA의 존재가 확인될 수 있다. 예를 들어, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화시키고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔상에서 분석하여, 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 확인함으로써, 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 벡터는 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득된다. 예를 들어, DNA 벡터는 서열번호: 1 또는 서열번호: 51의 상응하는 AAV2 야생형 ITR에 대해 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 결실, 삽입 또는 치환을 갖는 ITR 중 적어도 하나와 함께 제1 및 제2 AAV2 역전된 말단 반복 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하여, Rep 단백질의 존재하에 곤충 세포에서 DNA 벡터의 복제를 유도하는 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득된다. 이의 일부 추가 구현예에서, DNA 벡터는 (a) 곤충 세포내에서 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 생산을 유도하는데 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재 하에서 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여된 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 곤충 세포가 바이러스 캡시드 암호화 서열을 포함하지 않는 단계; 및 (b) 곤충 세포로부터 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA를 수확하고 단리하는 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하다. 일부 추가의 구현예에서, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비-함유, 비-바이러스성 DNA의 존재가 확인될 수 있다. 예를 들어, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화하고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하여, 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 비-양이온성 지질, PEG 콘주게이팅된 지질, 스테롤 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 비-양이온성 지질을 추가로 포함하고, 여기서 비-이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 라이소레시틴, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티디카시드, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 라이소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린 및 예를 들어, WO2017/099823 또는 US2018/0028664에 기재된 비-양이온성 지질로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 지질 입자는 콘주게이팅된 지질을 추가로 포함하며, 콘주게이팅된 지질은 PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라마이드(Cer), 페길화된 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 석시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸) 부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카밤, N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, 및 표 2에 기재된 것들로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 지질 입자는 PCT 공개 WO2009/127060 또는 미국 특허 공개 US2010/0130588에 기재된 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 입자는 이온화가능한 지질, 비-양이온성 지질, 입자의 응집을 억제하는 콘주게이팅된 지질 및 스테롤을 포함한다. 이온화가능한 지질, 비-양이온성 지질, 입자의 응집을 억제하는 콘주게이팅된 지질 및 스테롤의 양은 독립적으로 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 90 mol%의 양으로 이온화가능한 지질, 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 30 mol%의 양으로 비-양이온성 지질, 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol% 내지 약 20 mol%의 양으로 입자의 응집을 억제하는 콘주게이팅된 지질, 및 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 50 mol%의 양으로 스테롤을 포함한다
총 지질 대 DNA 벡터의 비는 원하는대로 변할 수 있다. 예를 들어, 총 지질 대 DNA 벡터(질량 또는 중량) 비는 약 10:1 내지 약 30:1일 수 있다.
본 발명은 또한 제1 지질 나노입자 및 추가의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 제1 지질 나노입자는 이온화가능한 지질 및 제1 캡시드 비함유, 비-바이러스성 벡터를 포함한다. DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때의 캡시드 비함유 비-바이러스성 벡터는 비-변성 겔 상에서 분석될 때의 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 갖는다.
일부 구현예에서, 추가의 화합물은 제2 지질 나노입자에 포함된다. 제1 및 제2 지질 나노입자는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 지질 나노입자 및 제2 지질 나노입자는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 지질 나노입자 및 제2 지질 나노입자는 동일하며, 즉 추가 화합물은 제1 지질 나노입자에 포함된다.
추가의 화합물로서 임의의 원하는 분자가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 화합물은 제2 캡시드 비함유, 비-바이러스성 벡터이다. 제1 및 제2 캡시드 비함유, 비-바이러스성 벡터는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 캡시드 비함유 비-바이러스성 벡터는 상이하다.
일부 구현예에서, 추가의 화합물은 치료제이다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 이하에 더 상세히 설명된다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 요청하고 필요한 요금을 지불하면 사무국에서 컬러 도면(들)과 함께 본 특허 또는 특허 출원 공보 사본을 제공받을 것이다.
도 1a는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이 구현예에서, 예시적인 ceDNA 벡터는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 루시퍼라제 이식유전자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위(R3/R4)에 삽입된다. 발현 카세트는 2개의 역전된 말단 반복부(ITR), 즉 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 야생형 AAV2 ITR 및 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR에 의해 측접되며, 따라서 발현 카세트에 측접하는 2개의 ITR은 서로에 대해 비대칭이다.
도 1b는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 갖는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 루시퍼라제 이식유전자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입된다. 발현 카세트는 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR 및 다운스트림(3'-말단)에 있는 야생형 ITR인, 2개의 역전된 말단 반복(ITR)에 의해 측접된다.
도 1c는 향상제/프로모터를 포함하는 발현 카세트, 이식유전자의 삽입을 위한 오픈 리딩 프레임(ORF), 전사후 요소(WPRE) 및 폴리A 신호를 갖는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 오픈 리딩 프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 이식유전자의 삽입을 허용한다. 발현 카세트는 서로에 대해 비대칭인 2개의 역전된 말단 반복부(ITR), 즉 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR 및 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR에 의해 측접되고; 5' ITR 및 3' ITR은 모두 변형된 ITR이지만 상이한 변형을 갖는다(즉, 동일한 변형을 갖지 않음).
도 2a는 A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE') 및 말단 분할 부위(trs)의 확인과 함께 AAV2의 야생형 ITR의 T-형상화된 스템-루프 구조를 제공한다. RBE는 Rep 78 또는 Rep 68과 상호작용하는 것으로 여겨지는 일련의 4개의 듀플렉스 사량체를 함유한다. 또한, RBE'는 또한 작제물내 야생형 ITR 또는 돌연변이된 ITR 상에 조립된 Rep 복합체와 상호작용하는 것으로 여겨진다. D 및 D' 영역은 전사 인자 결합 부위 및 다른 보존된 구조를 함유한다. 도 2b는 A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE') 및 말단 분할 부위(trs)의 확인과 함께, AAV2의 야생형 좌측 ITR의 T-형상화된 스템-루프 구조, 및 여러 전사 인자 결합 부위 및 다른 보존된 구조를 포함하는 D 및 D' 영역을 포함하는, 도 2a의 야생형 ITR에서의 제안된 Rep 촉매접촉된 닉킹 및 결찰 활성을 도시한다.
도 3a는 야생형 좌측 AAV2 ITR(서열번호: 540)의 A-A' 아암, C-C' 및 B-B' 아암의 RBE-함유 부분의 일차 구조(폴리뉴클레오타이드 서열)(좌측) 및 이차 구조(우측)를 제공한다. 도 3b는 좌측 ITR에 대한 예시적인 돌연변이된 ITR(또한 변형된 ITR이라고도 함) 서열을 나타낸다. 예시적인 돌연변이된 좌측 ITR(ITR-1, 좌측)(서열번호: 113)의 A-A' 아암, C 아암 및 B-B' 아암의 RBE 부분의 일차 구조(좌측) 및 예상된 이차 구조(우측)가 도시되어 있다. 도 3c는 A-A' 루프의 RBE-함유 부분의 일차 구조(좌측) 및 이차 구조(우측), 및 야생형 우측 AAV2 ITR(서열번호: 541)의 B-B' 및 C-C' 아암을 나타낸다. 도 3d는 예시적인 우측 변형된 ITR을 나타낸다. 예시적인 돌연변이체 우측 ITR(ITR-1, 우측)(서열번호: 114)의 A-A' 아암, B-B' 및 C 아암의 RBE 함유 부분의 일차 구조(좌측) 및 예상된 이차 구조(우측)가 도시되어 있다. 좌측 ITR이 비대칭이거나 우측 ITR과 상이한 경우, 좌측 및 우측 ITR(예를 들어, AAV2 ITR 또는 다른 바이러스 혈청형 또는 합성 ITR)의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 각각의 도 3a~3d 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같이 ceDNA를 생산하는데 사용된 플라스미드 또는 백미드/배큘로바이러스 게놈에 사용된 서열을 지칭한다. 또한, 플라스미드 또는 백미드/배큘로바이러스 게놈의 ceDNA 벡터 배치형태 및 예상된 깁스 자유 에너지 값으로부터 추론된 상응하는 ceDNA 이차 구조가 각각의 도 3a~3d에 포함된다.
도 4a는 도 4b의 개략도에 기술된 공정에서 ceDNA의 생산에 유용한 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 제조하기 위한 업스트림 공정을 도시한 개략도이다. 도 4c는 ceDNA 벡터 생산을 확인하기 위한 생화학적 방법 및 공정을 설명한다. 도 4d 및 도 4e는 도 4b의 ceDNA 생산 공정 동안 수득된 세포 펠릿으로부터 수확된 DNA에서 ceDNA의 존재를 확인하기 위한 공정을 설명하는 개략도이다. 도 4e는 비-연속적 구조를 갖는 DNA를 도시한다. ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 중성 및 변성 조건 모두에서 상이한 크기(1kb 및 2kb)를 갖는 2개의 DNA 단편을 생산한다. 도 4e는 또한 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA를 나타낸다. ceDNA 벡터는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 중성 조건에서 1kb 및 2kb로 이동하는 2개의 DNA 단편을 생산하지만, 변성 조건에서 스탠드는 연결된 상태로 유지되고 2kb 및 4kb로 이동하는 단일 가닥을 생산한다. 도 4d는 제한 엔도뉴클레아제로 절단 또는 소화되지 않은채, 천연 겔 또는 변성 겔상에서 전기영동된 예시적인 ceDNA에 대한 개략적인 예상 밴드를 나타낸다. 가장 좌측의 도식은 천연 겔이며, 듀플렉스 및 절단되지 않은 형태로 ceDNA가 적어도 단량체 및 이합체 상태로 존재하며, 더 빠르게 이동하는 더 작은 단량체 및 단량체의 두 배 크기인, 더 느리게 이동하는 이량체로서 보여짐을 시사하는 다중 밴드를 나타낸다. 좌측에서 두 번째인 도식은 ceDNA가 제한 엔도뉴클레아제로 절단될 때, 원래 밴드가 사라지고 절단 후 남은 예상 단편 크기에 해당하는 더 빠르게 이동하는 (예를 들어, 더 작은) 밴드가 나타나는 것을 보여준다. 변성 조건 하에서, 원래의 듀플렉스 DNA는 단일-가닥이고, 상보성 가닥이 공유결합되어 있기 때문에 천연 겔에서 관측된 것보다 2배 큰 종으로 이동한다. 따라서 우측에서 두 번째 도식에서, 소화된 ceDNA는 천연 겔에서 관측된 것과 유사한 밴딩 분포를 나타내지만, 밴드는 천연 겔 대응물의 크기의 두 배 크기의 단편으로 이동한다. 가장 우측 개략도는 변성 조건 하에서 절단되지 않은 ceDNA가 단일-가닥 개방된 원으로서 이동하므로 관측된 밴드는 원이 개방되지 않은 기본 조건 하에서 관측된 것보다 두 배 크기라는 것을 보여준다. 이 도면에서, "kb"는 문맥에 따라, 뉴클레오타이드 사슬 길이(예를 들어, 변성 조건에서 관측된 단일가닥 분자의 경우) 또는 염기쌍의 수(예를 들어, 기본 조건에서 관측된 이중-가닥 분자의 경우)에 기초하여 뉴클레오타이드 분자의 상대 크기를 나타내는데 사용된다.
도 5는 엔도뉴클레아제(ceDNA 작제물 1 및 2에 대한 EcoRI; ceDNA 작제물 3 및 4에 대한 BamH1; ceDNA 작제물 5 및 6에 대한 SpeI; 및 ceDNA 작제물 7 및 8에 대한 XhoI)에 의해(+)소화된, 또는 (-)소화되지 않은 ceDNA 벡터의 변성 겔 실행 예의 예시적 사진이다. 별표로 강조 표시된 밴드의 크기를 결정하고 사진의 하단에 제공했다.
도 6a는 Rep 단백질 Rep52 및 Rep78에 대한 핵산 서열을 포함하는 pFBDLSR 플라스미드에서의 예시적인 Rep-백미드이다. 이 예시적인 Rep-백미드는 하기를 포함한다: IE1 프로모터 단편(서열번호: 66); 코작(Kozak) 서열(서열번호: 67)을 포함하는 Rep78 뉴클레오타이드 서열, Rep52에 대한 다면체 프로모터 서열(서열번호: 68) 및 코작 서열 gccgccacc로 시작하는 Rep58 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 69). 도 6b는 wt-L ITR, CAG 프로모터, 루시퍼라제 이식유전자, WPRE 및 폴리아데닐화 서열, 및 mod-R ITR을 갖는 예시적인 ceDNA-플라스미드-1의 개략도이다.
도 7a는 x-축 상에서 확인된 작제물(작제물-1, 작제물-3, 작제물-5, 작제물-7(실시예 1의 표 5)의 400 ng(흑색), 200 ng(회색) 또는 100 ng(백색)의 형질감염후 48시간 후에 HEK293 세포에서 루시퍼라제 활성(y-축, RQ(Luc))을 측정하는 시험관내 단백질 발현 검정의 결과를 보여준다. 도 7b는 x-축 상에서 확인된 작제물(작제물-2, 작제물-4, 작제물-6, 작제물-8)(표 5)의 400ng(흑색), 200ng(회색) 또는 100ng(백색)의 형질감염후 48시간 후에 HEK293 세포에서 측정된 루시퍼라제 활성(y-축, RQ(Luc))을 나타낸다. 임의의 플라스미드없이 푸진(Fugene)으로 처리된 HEK293 세포("푸진") 또는 미처리 HEK293 세포("미처리")에서 측정된 루시퍼라제 활성도 제공된다.
도 8a는 x-축 상에서 확인된 작제물(작제물-1, 작제물-3, 작제물-5, 작제물-7)의 400 ng(흑색), 200 ng(회색) 또는 100 ng(백색)의 형질감염후 48시간 후에 HEK293 세포의 생존율(y-축)을 나타낸다. 도 8b는 x-축 상에서 확인된 작제물(작제물-2, 작제물-4, 작제물-6, 작제물-8)의 400ng(흑색), 200ng(회색) 또는 100ng(백색)의 형질감염후 48시간 후에 HEK293 세포의 생존율(y-축)을 나타낸다.
도 9~11은 일정한 N/P 비율(도 9) 또는 다양한 N/P 비율(도 10 및 11)의 상이한 염을 포함하는 완충액으로 제조된 일부 예시적인 지질 나노입자의 평균 지질 나노입자 크기 및 ceDNA 캡슐화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 12는 예시적인 지질 나노입자에서의 캡슐화에 대한 혈청/BSA의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 13은 디올레오일포스파티딜세린(DOPS) 리포좀의 존재하에 예시적인 지질 나노입자로부터 ceDNA의 방출을 나타내는 막대 그래프이다.
도 14는 예시적인 지질 나노입자에서의 캡슐화에 대한 혈청/BSA의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 15는 디올레오일포스파티딜세린(DOPS) 리포좀의 존재하에 예시적인 지질 나노입자로부터 ceDNA의 방출을 나타내는 막대 그래프이다.
도 16은 일부 예시적인 지질 나노입자의 ApoE 결합을 나타낸다.
도 16은 예시적인 ceDNA의 HEK293 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 18은 예시적인 ceDNA의 HEK293 발현을 나타내는 겔 전기영동 사진이다.
도 19는 예시적인 ceDNA의 HEK293 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 20은 실시예 10에 기재된 화학식 I 및 화학식 II의 일부 예시적인 화합물을 나타낸다.
도 21은 실시예 10에 개시된 화학식 I 및 II의 화합물의 합성을 위한 일반적인 합성 반응식이다.
도 22는 실시예 10에 개시된 화학식 I 및 II의 화합물의 합성을 위한 일반적인 합성 반응식이다.
도 23은 실시예 11에 기재된 화학식 III의 일부 예시적인 화합물을 나타낸다.
도 24는 실시예 11에 기재된 화학식 III, 화학식 IV 및 화학식 V의 화합물의 합성을 위한 일반적인 합성 계획을 도시한다.
도 1a는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이 구현예에서, 예시적인 ceDNA 벡터는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 루시퍼라제 이식유전자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위(R3/R4)에 삽입된다. 발현 카세트는 2개의 역전된 말단 반복부(ITR), 즉 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 야생형 AAV2 ITR 및 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR에 의해 측접되며, 따라서 발현 카세트에 측접하는 2개의 ITR은 서로에 대해 비대칭이다.
도 1b는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 갖는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 루시퍼라제 이식유전자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입된다. 발현 카세트는 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR 및 다운스트림(3'-말단)에 있는 야생형 ITR인, 2개의 역전된 말단 반복(ITR)에 의해 측접된다.
도 1c는 향상제/프로모터를 포함하는 발현 카세트, 이식유전자의 삽입을 위한 오픈 리딩 프레임(ORF), 전사후 요소(WPRE) 및 폴리A 신호를 갖는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 오픈 리딩 프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 이식유전자의 삽입을 허용한다. 발현 카세트는 서로에 대해 비대칭인 2개의 역전된 말단 반복부(ITR), 즉 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR 및 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR에 의해 측접되고; 5' ITR 및 3' ITR은 모두 변형된 ITR이지만 상이한 변형을 갖는다(즉, 동일한 변형을 갖지 않음).
도 2a는 A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE') 및 말단 분할 부위(trs)의 확인과 함께 AAV2의 야생형 ITR의 T-형상화된 스템-루프 구조를 제공한다. RBE는 Rep 78 또는 Rep 68과 상호작용하는 것으로 여겨지는 일련의 4개의 듀플렉스 사량체를 함유한다. 또한, RBE'는 또한 작제물내 야생형 ITR 또는 돌연변이된 ITR 상에 조립된 Rep 복합체와 상호작용하는 것으로 여겨진다. D 및 D' 영역은 전사 인자 결합 부위 및 다른 보존된 구조를 함유한다. 도 2b는 A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE') 및 말단 분할 부위(trs)의 확인과 함께, AAV2의 야생형 좌측 ITR의 T-형상화된 스템-루프 구조, 및 여러 전사 인자 결합 부위 및 다른 보존된 구조를 포함하는 D 및 D' 영역을 포함하는, 도 2a의 야생형 ITR에서의 제안된 Rep 촉매접촉된 닉킹 및 결찰 활성을 도시한다.
도 3a는 야생형 좌측 AAV2 ITR(서열번호: 540)의 A-A' 아암, C-C' 및 B-B' 아암의 RBE-함유 부분의 일차 구조(폴리뉴클레오타이드 서열)(좌측) 및 이차 구조(우측)를 제공한다. 도 3b는 좌측 ITR에 대한 예시적인 돌연변이된 ITR(또한 변형된 ITR이라고도 함) 서열을 나타낸다. 예시적인 돌연변이된 좌측 ITR(ITR-1, 좌측)(서열번호: 113)의 A-A' 아암, C 아암 및 B-B' 아암의 RBE 부분의 일차 구조(좌측) 및 예상된 이차 구조(우측)가 도시되어 있다. 도 3c는 A-A' 루프의 RBE-함유 부분의 일차 구조(좌측) 및 이차 구조(우측), 및 야생형 우측 AAV2 ITR(서열번호: 541)의 B-B' 및 C-C' 아암을 나타낸다. 도 3d는 예시적인 우측 변형된 ITR을 나타낸다. 예시적인 돌연변이체 우측 ITR(ITR-1, 우측)(서열번호: 114)의 A-A' 아암, B-B' 및 C 아암의 RBE 함유 부분의 일차 구조(좌측) 및 예상된 이차 구조(우측)가 도시되어 있다. 좌측 ITR이 비대칭이거나 우측 ITR과 상이한 경우, 좌측 및 우측 ITR(예를 들어, AAV2 ITR 또는 다른 바이러스 혈청형 또는 합성 ITR)의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 각각의 도 3a~3d 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같이 ceDNA를 생산하는데 사용된 플라스미드 또는 백미드/배큘로바이러스 게놈에 사용된 서열을 지칭한다. 또한, 플라스미드 또는 백미드/배큘로바이러스 게놈의 ceDNA 벡터 배치형태 및 예상된 깁스 자유 에너지 값으로부터 추론된 상응하는 ceDNA 이차 구조가 각각의 도 3a~3d에 포함된다.
도 4a는 도 4b의 개략도에 기술된 공정에서 ceDNA의 생산에 유용한 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 제조하기 위한 업스트림 공정을 도시한 개략도이다. 도 4c는 ceDNA 벡터 생산을 확인하기 위한 생화학적 방법 및 공정을 설명한다. 도 4d 및 도 4e는 도 4b의 ceDNA 생산 공정 동안 수득된 세포 펠릿으로부터 수확된 DNA에서 ceDNA의 존재를 확인하기 위한 공정을 설명하는 개략도이다. 도 4e는 비-연속적 구조를 갖는 DNA를 도시한다. ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 중성 및 변성 조건 모두에서 상이한 크기(1kb 및 2kb)를 갖는 2개의 DNA 단편을 생산한다. 도 4e는 또한 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA를 나타낸다. ceDNA 벡터는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 중성 조건에서 1kb 및 2kb로 이동하는 2개의 DNA 단편을 생산하지만, 변성 조건에서 스탠드는 연결된 상태로 유지되고 2kb 및 4kb로 이동하는 단일 가닥을 생산한다. 도 4d는 제한 엔도뉴클레아제로 절단 또는 소화되지 않은채, 천연 겔 또는 변성 겔상에서 전기영동된 예시적인 ceDNA에 대한 개략적인 예상 밴드를 나타낸다. 가장 좌측의 도식은 천연 겔이며, 듀플렉스 및 절단되지 않은 형태로 ceDNA가 적어도 단량체 및 이합체 상태로 존재하며, 더 빠르게 이동하는 더 작은 단량체 및 단량체의 두 배 크기인, 더 느리게 이동하는 이량체로서 보여짐을 시사하는 다중 밴드를 나타낸다. 좌측에서 두 번째인 도식은 ceDNA가 제한 엔도뉴클레아제로 절단될 때, 원래 밴드가 사라지고 절단 후 남은 예상 단편 크기에 해당하는 더 빠르게 이동하는 (예를 들어, 더 작은) 밴드가 나타나는 것을 보여준다. 변성 조건 하에서, 원래의 듀플렉스 DNA는 단일-가닥이고, 상보성 가닥이 공유결합되어 있기 때문에 천연 겔에서 관측된 것보다 2배 큰 종으로 이동한다. 따라서 우측에서 두 번째 도식에서, 소화된 ceDNA는 천연 겔에서 관측된 것과 유사한 밴딩 분포를 나타내지만, 밴드는 천연 겔 대응물의 크기의 두 배 크기의 단편으로 이동한다. 가장 우측 개략도는 변성 조건 하에서 절단되지 않은 ceDNA가 단일-가닥 개방된 원으로서 이동하므로 관측된 밴드는 원이 개방되지 않은 기본 조건 하에서 관측된 것보다 두 배 크기라는 것을 보여준다. 이 도면에서, "kb"는 문맥에 따라, 뉴클레오타이드 사슬 길이(예를 들어, 변성 조건에서 관측된 단일가닥 분자의 경우) 또는 염기쌍의 수(예를 들어, 기본 조건에서 관측된 이중-가닥 분자의 경우)에 기초하여 뉴클레오타이드 분자의 상대 크기를 나타내는데 사용된다.
도 5는 엔도뉴클레아제(ceDNA 작제물 1 및 2에 대한 EcoRI; ceDNA 작제물 3 및 4에 대한 BamH1; ceDNA 작제물 5 및 6에 대한 SpeI; 및 ceDNA 작제물 7 및 8에 대한 XhoI)에 의해(+)소화된, 또는 (-)소화되지 않은 ceDNA 벡터의 변성 겔 실행 예의 예시적 사진이다. 별표로 강조 표시된 밴드의 크기를 결정하고 사진의 하단에 제공했다.
도 6a는 Rep 단백질 Rep52 및 Rep78에 대한 핵산 서열을 포함하는 pFBDLSR 플라스미드에서의 예시적인 Rep-백미드이다. 이 예시적인 Rep-백미드는 하기를 포함한다: IE1 프로모터 단편(서열번호: 66); 코작(Kozak) 서열(서열번호: 67)을 포함하는 Rep78 뉴클레오타이드 서열, Rep52에 대한 다면체 프로모터 서열(서열번호: 68) 및 코작 서열 gccgccacc로 시작하는 Rep58 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 69). 도 6b는 wt-L ITR, CAG 프로모터, 루시퍼라제 이식유전자, WPRE 및 폴리아데닐화 서열, 및 mod-R ITR을 갖는 예시적인 ceDNA-플라스미드-1의 개략도이다.
도 7a는 x-축 상에서 확인된 작제물(작제물-1, 작제물-3, 작제물-5, 작제물-7(실시예 1의 표 5)의 400 ng(흑색), 200 ng(회색) 또는 100 ng(백색)의 형질감염후 48시간 후에 HEK293 세포에서 루시퍼라제 활성(y-축, RQ(Luc))을 측정하는 시험관내 단백질 발현 검정의 결과를 보여준다. 도 7b는 x-축 상에서 확인된 작제물(작제물-2, 작제물-4, 작제물-6, 작제물-8)(표 5)의 400ng(흑색), 200ng(회색) 또는 100ng(백색)의 형질감염후 48시간 후에 HEK293 세포에서 측정된 루시퍼라제 활성(y-축, RQ(Luc))을 나타낸다. 임의의 플라스미드없이 푸진(Fugene)으로 처리된 HEK293 세포("푸진") 또는 미처리 HEK293 세포("미처리")에서 측정된 루시퍼라제 활성도 제공된다.
도 8a는 x-축 상에서 확인된 작제물(작제물-1, 작제물-3, 작제물-5, 작제물-7)의 400 ng(흑색), 200 ng(회색) 또는 100 ng(백색)의 형질감염후 48시간 후에 HEK293 세포의 생존율(y-축)을 나타낸다. 도 8b는 x-축 상에서 확인된 작제물(작제물-2, 작제물-4, 작제물-6, 작제물-8)의 400ng(흑색), 200ng(회색) 또는 100ng(백색)의 형질감염후 48시간 후에 HEK293 세포의 생존율(y-축)을 나타낸다.
도 9~11은 일정한 N/P 비율(도 9) 또는 다양한 N/P 비율(도 10 및 11)의 상이한 염을 포함하는 완충액으로 제조된 일부 예시적인 지질 나노입자의 평균 지질 나노입자 크기 및 ceDNA 캡슐화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 12는 예시적인 지질 나노입자에서의 캡슐화에 대한 혈청/BSA의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 13은 디올레오일포스파티딜세린(DOPS) 리포좀의 존재하에 예시적인 지질 나노입자로부터 ceDNA의 방출을 나타내는 막대 그래프이다.
도 14는 예시적인 지질 나노입자에서의 캡슐화에 대한 혈청/BSA의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 15는 디올레오일포스파티딜세린(DOPS) 리포좀의 존재하에 예시적인 지질 나노입자로부터 ceDNA의 방출을 나타내는 막대 그래프이다.
도 16은 일부 예시적인 지질 나노입자의 ApoE 결합을 나타낸다.
도 16은 예시적인 ceDNA의 HEK293 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 18은 예시적인 ceDNA의 HEK293 발현을 나타내는 겔 전기영동 사진이다.
도 19는 예시적인 ceDNA의 HEK293 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 20은 실시예 10에 기재된 화학식 I 및 화학식 II의 일부 예시적인 화합물을 나타낸다.
도 21은 실시예 10에 개시된 화학식 I 및 II의 화합물의 합성을 위한 일반적인 합성 반응식이다.
도 22는 실시예 10에 개시된 화학식 I 및 II의 화합물의 합성을 위한 일반적인 합성 반응식이다.
도 23은 실시예 11에 기재된 화학식 III의 일부 예시적인 화합물을 나타낸다.
도 24는 실시예 11에 기재된 화학식 III, 화학식 IV 및 화학식 V의 화합물의 합성을 위한 일반적인 합성 계획을 도시한다.
정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며, 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적으로 사용된 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 정의된다. 면역학 및 분자 생물학에서 공통 용어들의 정의는 하기에서 찾아볼 수 있으며, 이들의 전문은 본원에 참고로 포함된다: 진단 및 요법의 Merck 매뉴얼, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011(ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al.(eds.), Fields Virology, 6th Edition, published by Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA(2013), Knipe, D.M. and Howley, P.M.(ed.), 분자 세포 생물학 및 분자 의학의 백과사전, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012(ISBN 9783527600908); and Robert A. Meyers(ed.), 분자 생물학 및 생명공학: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995(ISBN 1-56081-569-8); 면역학 by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver(eds.), Taylor & Francis Limited, 2014(ISBN 0815345305, 9780815345305); 루인의 유전자(Lewin's Genes) XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014(ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, 분자 클로닝: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA(2012)(ISBN 1936113414); Davis et al., 분자 생물학에서 기본적인 방법, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA(2012)(ISBN 044460149X); 효소학에서 실험실 방법: DNA, Jon Lorsch(ed.) Elsevier, 2013(ISBN 0124199542); 분자 생물학에서 현 프로토콜(CPMB), Frederick M. Ausubel(ed.), John Wiley and Sons, 2014(ISBN 047150338X, 9780471503385), 단백질 과학에서 현 프로토콜(CPPS), John E. Coligan(ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; 및 면역학에서 현 프로토콜(CPI)(John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003(ISBN 0471142735, 9780471142737).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "지질 나노입자"는 하나 이상의 지질 성분에 의해 형성된 소포를 지칭한다. 지질 나노입자는 전형적으로 약제학적 개발의 맥락에서 핵산 전달을 위한 담체로서 사용된다. 그들은 세포막과 융합하고, 그의 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약제학적 성분(API)을 전달함으로써 작동한다. 일반적으로, 이러한 전달을 위한 지질 나노입자 조성물은 합성 이온성 또는 양이온성 지질, 인지질(특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물), 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 지질로 구성되고; 그러나, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다. 지질의 합 조성은 전형적으로 생물학적 시스템에서 표면 특성 및 따라서 단백질(옵소닌화) 함량을 지시하여 생체 분포 및 세포 흡수 특성을 유도한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "리포좀"은 수성 외부로부터 분리된 내부 수성 부피를 캡슐화하는 구형 구성으로 조립된 지질 분자를 지칭한다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 소포이다. 리포좀은 전형적으로 약제학적 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 사용된다. 그들은 세포막과 융합하고, 그의 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약제학적 성분을 전달함으로써 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 전형적으로 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이온화가능한 지질"은 적어도 하나의 양성자성 또는 탈양성자성 기를 갖는 지질을 지칭하며, 지질이 생리적 pH 또는 그 미만의 pH(예를 들어, pH 7.4)에서 양으로 하전되고, 제2 pH, 바람직하게는 생리적 pH 또는 그 이상에서 중성이다. pH의 함수로서 양성자의 첨가 또는 제거는 평형 과정이며, 하전된 또는 중성 지질에 대한 언급은 우세한 종의 성질을 의미하며, 모든 지질이 하전 또는 중성 형태로 존재할 것을 요구하지는 않는다는 것을 당해 분야의 숙련가라면 이해할 것이다. 일반적으로, 이온화가능한 지질은 약 4 내지 약 7 범위의 양성자성 기의 pKa를 갖는다. 이온화가능한 지질은 또한 본 명세서에서 양이온성 지질로 지칭된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "비-양이온성 지질"은 임의의 양친매성 지질뿐만 아니라 임의의 다른 중성 지질 또는 음이온성 지질을 지칭한다. 따라서, 비-양이온성 지질은 중성 하전되지 않은, 양쪽이온성 또는 음이온성 지질일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "콘주게이팅된 지질"은 비-지질 분자, 예컨대 PEG, 폴리옥사졸린, 폴리아미드 또는 중합체(예를 들어, 양이온성 중합체)와 콘주게이팅된 지질 분자를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 투여 형태를 제조할 때 제형을 벌크 업 및/또는 안정화시키기 위해 API, 예를 들어 ceDNA 및/또는 지질 나노입자와 함께 제형에 포함된 약리학적 불활성 성분을 지칭한다. 부형제의 일반적인 카테고리는 예를 들어, 증량제, 충전제, 희석제, 접착방지제, 결합제, 코팅제, 붕해제, 향미제, 착색제, 윤활제, 활택제, 흡착제, 방부제, 감미료 및 약물 흡수 또는 용해를 촉진하기 위해, 또는 다른 약동학적 고려사항을 위해 사용되는 제품을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어들 "이종성 뉴클레오타이드 서열" 및 "이식유전자"는 상호교환적으로 사용되며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 의해 편입되어, 전달 및 발현될 수 있는 관심 핵산(캡시드 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 이외)을 지칭한다. 관심의 이식유전자는 폴리펩타이드, 바람직하게는 치료적(예를 들어, 의료, 진단 또는 수의적 용도를 위한) 또는 면역원성 폴리펩타이드(예를 들어, 백신을 위한)를 암호화하는 핵산을 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 핵산은 치료적 RNA로 전사되는 핵산을 포함한다. 본 발명의 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된 이식유전자는 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 압타머, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAis, miRNA, lncRNA, 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편 또는 이들의 임의의 조합을 발현 또는 암호화하는 것들을 비제한적으로 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "발현 카세트" 및 "전사 카세트"는 상호교환적으로 사용되며, 이식유전자의 직접적인 전사에 충분한 하나 이상의 프로모터 또는 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이식유전자를 포함하지만, 캡시드-암호화 서열, 다른 벡터 서열 또는 역전된 말단 반복 영역을 포함하지 않는 선형 스트레치 핵산을 지칭한다. 발현 카세트는 하나 이상의 시스-작용 서열(예를 들어, 프로모터, 향상제 또는 억제인자), 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 전사후 조절 인자를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "말단 반복" 또는 "TR"은 적어도 하나의 필요한 최소 복제 기점 및 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는 임의의 바이러스 말단 반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열("RBS") 및 말단 분할 부위("TRS")는 함께 "최소 요구된 복제 기점"을 구성하므로, TR은 적어도 하나의 RBS 및 하나 이상의 TRS를 포함한다. 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열의 스트레치 내에서 서로의 역 보체인 TR은 전형적으로 각각 "역전된 말단 반복" 또는 "ITR"로 지칭된다. 바이러스와 연관하여, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 구출을 중재한다. 본 발명에서 예상외로 발견된 바와 같이, 전장에 걸쳐 역 보체가 아닌 TR은 여전히 ITR의 전통적인 기능을 수행할 수 있으므로, ITR이라는 용어는 본원에서 ceDNA 벡터의 복제를 매개할 수 있는, ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터내 TR을 지칭하기 위해 사용된다. 복잡한 ceDNA 구성에서 2개 이상의 ITR 또는 비대칭 ITR 쌍이 존재할 수 있음을 당해 분야의 숙련가는 이해할 것이다. ITR은 AAV ITR 또는 비-AAV ITR일 수 있거나, AAV ITR 또는 비-AAV ITR로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, ITR은 파보바이러스 및 데펜도바이러스(예를 들어, 갯과 파보바이러스, 소 파보바이러스, 마우스 파보바이러스, 돼지 파보바이러스, 인간 파보바이러스 B-19)를 포함하는 파보비리다에(Parvoviridae) 계열로부터 유래될 수 있으며, 또는 SV40 복제의 기점으로서 제공하는 SV40 헤어핀은 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가에 의해 추가로 변형될 수 있는 ITR로 사용될 수 있다. 파보비리다에 계열 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파보비리내(Parvovirinae)와 무척추동물을 감염시키는 덴소비리내(Densovirinae)의 2개의 아과로 구성된다. 데펜도파보바이러스는 인간, 영장류, 소과, 갯과, 말 및 양 종을 비제한적으로 포함하는 척추동물 숙주에서 복제할 수 있는 아데노-연관된 바이러스(AAV)의 바이러스 계열을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "비대칭 ITR"은 전장에 걸쳐 역 상보적이지 않은 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 한 쌍의 ITR을 지칭한다. 2개의 ITR 사이의 서열 차이는 뉴클레오타이드 첨가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이에 기인할 수 있다. 일 구현예에서, 쌍의 하나의 ITR은 야생형 AAV 서열일 수 있고 다른 하나는 비-야생형 또는 합성 서열일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 쌍의 ITR은 야생형 AAV 서열이 아니며, 2개의 ITR은 서로 순서가 상이하다. 본원의 편의상, ceDNA 벡터에서 5' 내지 발현 카세트(의 업스트림)에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터에서 3' 내지 발현 카세트(의 다운스트림)에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA 게놈"은 적어도 하나의 역전된 말단 반복 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 지칭한다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 듀플렉스 폴리뉴클레오타이드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 통합된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA 스페이서 영역"은 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 게놈에서 기능적 요소를 분리하는 개재 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 최적의 기능성을 위해 2개의 기능성 요소를 원하는 거리로 유지한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 예를 들어 플라스미드 또는 배큘로바이러스 내에서 ceDNA 게놈의 유전자 안정성을 제공하거나 추가한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 클로닝 부위 등을 위한 편리한 위치를 제공함으로써 ceDNA 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 몇몇 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 "폴리링커", 또는 공지된 단백질(예를 들어, 전사 인자) 결합 부위를 갖지 않도록 설계된 비-오픈 리딩 프레임 서열은 ceDNA 게놈에 위치하여 시스-작용 인자를 단리하여, 예를 들어, 말단 분할 부위와 업스트림 전사 조절 인자 사이에 6mer, 12mer, 18mer, 24mer, 48mer, 86mer, 176mer 등을 삽입할 수 있다. 유사하게, 스페이서는 폴리아데닐화 신호 서열과 3'-말단 분할 부위 사이에 통합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "Rep 결합 부위, "Rep 결합 요소, "RBE" 및 "RBS"는 상호교환적으로 사용되며, Rep 단백질에 의한 결합시, Rep 단백질이 RBS를 포함하는 서열에서 그의 부위-특이적 엔도뉴클레아제 활성을 수행할 수 있게 하는, Rep 단백질(예를 들어, AAV Rep 78 또는 AAV Rep 68)에 대한 결합 부위를 지칭한다. RBS 서열 및 그의 역 보체는 함께 단일 RBS를 형성한다. RBS 서열은 당해 기술에 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2에서 확인된 RBS 서열인 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호: 531)을 포함한다. 다른 알려진 AAV RBS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 RBS 서열을 포함하여, 임의의 공지된 RBS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다. 이론에 의한 구속됨 없이, Rep 단백질의 뉴클레아제 도메인은 듀플렉스 뉴클레오타이드 서열 GCTC에 결합하고, 따라서 2개의 공지된 AAV Rep 단백질은 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드, 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'(서열번호: 531)에 직접 결합하고 안정적으로 조립된다고 생각된다. 또한, 가용성 응집된 이형태체(즉, 정의되지 않은 수의 상호-연관된 Rep 단백질)는 해리되어, Rep 결합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드에 결합한다. 각각의 Rep 단백질은 각각의 가닥에서 질소 염기 및 포스포디에스테르 백본 둘 다와 상호작용한다. 질소 염기와의 상호작용은 서열 특이성을 제공하는 반면, 포스포디에스테르 백본과의 상호작용은 서열 특이적이지 않거나 약간 서열 특이적이며, 단백질-DNA 복합체를 안정화시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "말단 분할 부위" 및 "TRS"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, Rep가 5' 티미딘과 티로신-포스포디에스테르 결합을 형성하는 영역을 지칭하며, 세포 DNA 중합 효소, 예를 들어 DNA 폴 델타 또는 DNA 폴 엡실론을 통한 DNA 연장을 위한 기질의 역할을 하는 3' OH를 생산한다. 대안적으로, Rep-티미딘 복합체는 배위된 결찰 반응에 참여할 수 있다. 일부 구현예에서, TRS는 비-염기 쌍을 이루는 티미딘을 최소로 포괄한다. 일부 구현예에서, TRS의 닉킹 효율은 RBS로부터의 동일한 분자 내에서의 거리에 의해 적어도 부분적으로 제어될 수 있다. 수용체 기질이 상보성 ITR인 경우, 수득된 생산물은 분자내 듀플렉스이다. TRS 서열은 당해 기술에 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2에서 확인된 헥사 뉴클레오타이드 서열인 5'-GGTTGA-3'(서열번호: 45)을 포함한다. 다른 공지된 AAV TRS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 TRS 서열, 예컨대 AGTT(서열번호: 46), GGTTGG(서열번호: 47), AGTTGG(서열번호: 48), AGTTGA(서열번호: 49), 및 다른 모티프 예컨대 RRTTRR(서열번호: 50)을 포함하는 임의의 공지된 TRS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA-플라스미드"는 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 플라스미드를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA-백미드"는 이. 콜라이(E.coli)에서 플라스미드로서 전파될 수 있어서, 따라서 배큘로바이러스를 위한 셔틀 벡터로서 작동할 수 있는 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 배큘로바이러스 게놈을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA-배큘로바이러스"는 배큘로바이러스 게놈 내의 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 배큘로바이러스를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA-배큘로바이러스 감염된 곤충 세포" 및 "ceDNA-BIIC"는 상호교환적으로 사용되며, ceDNA-배큘로바이러스에 감염된 무척추동물 숙주세포(곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)를 비제한적으로 포함)를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폐쇄-종결된 DNA 벡터", "ceDNA 벡터" 및 "ceDNA"는 상호교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-비함유 DNA 벡터(즉, 분자내 듀플렉스)를 지칭한다. 일부 구현예에서, ceDNA는 2개의 공유적으로-폐쇄된 말단을 포함한다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, "리포터"는 해독가능한 판독을 제공하기 위해 사용될 수 있는 단백질을 지칭한다. 리포터는 일반적으로 형광, 색상 또는 발광과 같은 측정가능한 신호를 생성한다. 리포터 단백질 암호화 서열은 세포 또는 유기체에서의 존재가 쉽게 관측되는 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 일으키고, 루시퍼라제는 세포가 빛을 생성하는 반응을 촉매하게 하며, β-갈락토시다아제와 같은 효소는 기질을 유색 생산물로 전환시킨다. 실험 또는 진단 목적에 유용한 예시적인 리포터 폴리펩타이드는 β-락타마제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타제(AP), 티미딘 키나제(TK), 녹색 형광 단백질(GFP) 및 다른 형광 단백질, 클로르암페니콜 아세틸전달효소(CAT), 루시퍼라제 및 기타 당 업계에 잘 알려진 것들을 비제한적으로 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "효과기 단백질"은 예를 들어 리포터 폴리펩타이드로서 또는 보다 적절하게는 세포를 사멸시키는 폴리펩타이드, 예를 들어 세포를 사멸시키는 폴리펩타이드, 예를 들어 독소, 또는 선택된 제제로 세포를 사멸에 민감해지거나 또는 그의 결핍으로 만드는 제제로서 검출가능한 판독을 제공하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 효과기 단백질은 숙주세포의 DNA 및/또는 RNA를 직접 표적화하거나 손상시키는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 효과기 단백질은 (게놈 또는 염색체외 요소에 관계없이) 숙주세포 DNA 서열을 표적화하는 제한 엔도뉴클레아제, 세포 생존에 필요한 폴리펩타이드 표적을 분해하는 프로테아제, DNA 자이라제 억제제 및 리보뉴클레아제-타입 독소를 비제한적으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 합성 생물학적 회로에 의해 제어되는 효과기 단백질의 발현은 다른 합성 생물학적 회로의 인자로서 참여하여 그에 의해 생물학적 회로 시스템의 반응성의 범위 및 복잡성을 확장시킬 수 있다.
전사 조절인자는 관심 유전자의 전사를 활성화 또는 억제하는 전사 활성제 및 억제제를 지칭한다. 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 핵산의 영역이다. 전사 활성제는 전형적으로 전사 프로모터에 결합하고 전사를 직접 개시하기 위해 RNA 중합효소를 동원한다. 억제제는 전사 프로모터에 결합하고, RNA 중합효소에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절인자는 이들이 결합하는 위치 및 세포 및 환경 조건에 따라 활성제 또는 억제제로서 작용할 수 있다. 전사 조절인자 부류의 비-제한적인 예는 호메오도메인 단백질, 아연-핑거 단백질, 윙-헬릭스(포크헤드) 단백질 및 류신-지퍼 단백질을 비제한적으로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "억제인자 단백질" 또는 "유발제 단백질"은 조절 서열 요소에 결합하고 조절 서열 요소에 작동가능하게 연결된 서열의 전사를 각각 억제하거나 활성화시키는 단백질이다. 본 명세서에 기재된 바람직한 억제인자 및 유발제 단백질은 적어도 하나의 투입 제제 또는 환경 투입의 존재 또는 부재에 민감하다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은 예를 들어 분리가능한 DNA-결합 및 투입 제제-결합 또는 반응 인자 또는 도메인을 포함하는 모듈 형태이다.
본원에 사용된 바와 같이, "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 비히클, 코팅물, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 잘 알려져있다. 보충의 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 어구 "약제학적으로-허용가능한"은 숙주에 투여될 때 독성, 알러지성 또는 유사한 유해한 반응을 일으키지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "투입 제제 반응성 도메인"은 연결된 DNA 결합 융합 도메인이 조건 또는 투입의 존재에 반응하도록 하는 방식으로 상태 또는 투입 제제에 결합하거나 달리 반응하는 전사 인자의 도메인이다. 일 구현예에서, 조건 또는 투입의 존재는 전사 인자의 전사-조절 활성을 변형시키는 투입 제제 반응성 도메인 또는 융합된 단백질에서 구조적 변화를 초래한다.
용어 "생체내"는 유기체, 예컨대 다세포 동물에서 또는 내에서 발생하는 분석 또는 과정을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 일부 양태에서, 박테리아와 같은 단세포 유기체가 사용될 때 방법 또는 용도가 "생체내"에서 발생한다고 말할 수 있다. 용어 "생체외"는 다세포 동물 또는 식물의 본체 외부에 온전한 막을 갖는 살아있는 세포, 예를 들어, 외식편, 일차 세포 및 세포주를 포함하는 배양 세포, 형질전환된 세포주, 및 추출된 조직 또는 혈구를 포함하는 세포를 사용하여 수행되는 방법 및 용도를 지칭한다. 용어 "시험관내"는 세포 추출물과 같은 온전한 막을 갖는 세포의 존재를 필요로 하지 않는 분석 및 방법을 지칭하고, 비-세포 시스템, 예컨대 세포 또는 세포 시스템, 예컨대 세포 추출물을 포함하지 않는 배지에서 프로그래밍가능한 합성 생물학적 회로의 도입을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 단백질 또는 RNA를 암호화하는 이종성 표적 유전자일 수 있는 핵산 서열의 전사를 유도함으로써 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직-특이적, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 개시 및 전사 속도가 제어되는 핵산 서열의 조절 영역이다. 프로모터는 또한 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 인자, 예컨대 RNA 중합효소 및 다른 전사 인자를 함유할 수 있다. 본 명세서에 기재된 양태의 일부 구현예에서, 프로모터는 프로모터 자체의 발현을 조절하는 전사 인자 또는 본 명세서에 기재된 합성 생물학적 회로의 다른 모듈 성분에 사용되는 다른 프로모터의 발현을 유도할 수 있다. 프로모터 서열 내에서 전사 개시 부위뿐만 아니라 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 발견될 것이다. 진핵 프로모터는 종종 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 포함하지만, 항상 그런 것은 아니다. 유도성 프로모터를 포함하는 다양한 프로모터를 사용하여 본원에 개시된 ceDNA 벡터에서 이식유전자의 발현을 유도할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "향상제"는 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키기 위해 하나 이상의 단백질(예를 들어, 활성제 단백질 또는 전사 인자)에 결합하는 시스-작용 조절 서열(예를 들어, 50~1,500개의 염기 쌍)을 지칭한다. 향상제는 유전자 개시 부위의 업스트림 또는 이들이 조절하는 유전자 개시 부위의 다운스트림에서 최대 1,000,000개의 염기 파스에 배치될 수 있다. 향상제는 인트론 영역 또는 관련없는 유전자의 엑손 영역 내에 배치될 수 있다.
프로모터는 그것이 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다고 말할 수 있다. "작동가능하게 연결된", "작동가능하게 배치된", "작동가능하게 연결된", "제어 중" 및 "전사 제어 중"이라는 어구는 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하도록 조절하는, 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및/또는 배향에 있음을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "역전된 프로모터"는 핵산 서열이 역방향으로 있어, 암호화 가닥이 이제 비-암호화 가닥이 되고, 그 반대인 프로모터를 지칭한다. 역전된 프로모터 서열은 스위치의 상태를 조절하기 위해 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. 또한, 다양한 구현예에서, 프로모터는 향상제와 함께 사용될 수 있다.
프로모터는 암호화 세그먼트의 업스트림에 위치한 5' 비-암호화 서열 및/또는 주어진 유전자 또는 서열의 엑손을 분리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관되는 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, 향상제는 그 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 연관되는 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 암호화 핵산 세그먼트는 "재조합 프로모터" 또는 "이종성 프로모터"의 제어하에 배치되며, 둘 모두는 그의 천연 환경과 작동가능하게 연결된 암호화된 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않은 프로모터를 지칭한다. 재조합 또는 이종성 향상제는 그의 천연 환경에서 주어진 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않은 향상제를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 향상제는 다른 유전자의 프로모터 또는 향상제; 임의의 다른 원핵, 바이러스 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 향상제; 및 "자연 발생"하지 않는 합성 프로모터 또는 향상제, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 당해 기술에 공지된 유전공학 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. 프로모터 및 향상제의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것에 더하여, 프로모터 서열은 본 명세서에 개시된 합성 생물학적 회로 및 모듈과 관련하여, PCR을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호 참고, 각각 본 명세서에 참고로 포함됨). 게다가, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열도 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "유도성 프로모터"는 유발제 또는 유도제의 존재, 영향을 받거나 이에 의해 접촉될 때 전사 활성을 개시 또는 향상시키는 것을 특징으로 하는 것이다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, "유발제" 또는 "유도제"는 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는데 활동적인 방식으로 투여되는 내인성, 또는 정상적으로 외인성 화합물 또는 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 유발제 또는 유도제, 즉 화학 물질, 화합물 또는 단백질 자체는 핵산 서열의 전사 또는 발현의 결과일 수 있어서(즉, 유발제가 다른 성분 또는 모듈에 의해 발현된 유발제 단백질일 수 있어서) 그 자체가 제어 또는 유도성 프로모터하에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 특정 제제, 예를 들어 억제인자의 부재하에 유도된다. 유도성 프로모터의 예는 테트라사이클린, 메탈로티오닌, 엑디손, 포유동물 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 마우스 유선 종양 바이러스 긴 말단 반복(MMTV-LTR)) 및 다른 스테로이드-반응성 프로모터, 라파마이신 반응성 프로모터 등을 비제한적으로 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 예방적 치료를 포함하여 본 발명에 따른 ceDNA 벡터에 의한 치료가 제공되는 인간 또는 동물을 지칭한다. 일반적으로 동물은 비제한적으로 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥대상 동물과 같은 척추동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰구스 원숭이, 거미 원숭이 및 마카크, 예를 들어 레수스를 비제한적으로 포함한다. 설치류는 마우스, 랫트, 우드처크, 흰담비, 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가정용 및 사냥대상 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종, 예를 들어, 가정용 고양이, 갯과 종, 예를 들어, 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어, 닭, 에뮤, 타조, 및 어류, 예를 들어, 송어, 메기 및 연어를 비제한적으로 포함한다. 본 명세서에 기재된 양태의 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류 또는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 또한, 대상체는 영아 또는 아동일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 신생아 또는 태어나지 않은 대상체일 수 있으며, 예를 들어 대상체는 자궁 내에 있다. 바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예에 제한되지는 않는다. 인간 이외의 포유동물이 질환 및 장애의 동물 모델을 대표하는 대상체로서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 사육된 동물 및/또는 애완동물을 위해 사용될 수 있다. 인간 대상체는 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족 그룹, 예를 들어, 백인(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카인 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 임상 환경에서 환자 또는 다른 대상체일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 이미 치료 중이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 원하는 항원-결합 활성을 나타내는한, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 비제한적으로 포함하는 다양한 항체 구조를 포함한다. "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 동일한 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편 및 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함한다. 항체 및 항체 단편의 예는 Fv, scFv, Fab 단편, Fab', F(ab')2, Fab'-SH, 단일 도메인 항체(dAb), 중쇄, 경쇄, 중쇄 및 경쇄, 완전 항체(예를 들어, 각각의 Fc, Fab, 중쇄, 경쇄, 가변 영역 등을 포함), 이중특이적 항체, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 인트라바디, 단클론성 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 다량체 항체를 비제한적으로 포함한다. 항체 또는 항체 단편은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 비제한적으로 포함하는 임의의 부류 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 비제한적으로 포함하는 임의의 서브클래스일 수 있다. 또한, 항체는 임의의 포유동물, 예를 들어 영장류, 인간, 랫트, 마우스, 말, 염소 등으로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 변형된 항체이다. 일부 구현예에서, 항체의 성분은 단백질 성분의 발현 후 항체가 자기-조립하도록 개별적으로 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 질환 또는 질환의 증상을 치료할 목적으로 원하는 기능, 예를 들어 원하는 단백질의 상호작용 및 억제를 갖는다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 프레임워크 영역 또는 Fc 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체 분자의 용어 "항원-결합 도메인"은 항원 결합에 참여하는 항체 분자, 예를 들어 면역글로불린(Ig) 분자의 일부를 지칭한다. 구현예에서, 항원 결합 부위는 중쇄(H) 및 경쇄(L)의 가변(V) 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 초가변 영역으로 지칭되는, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내에서 3개의 고도로 분기되는 스트레치는 "프레임워크 영역"(FR)으로 불리는 보다 보존된 측접 스트레치 사이에 배치된다. FR은 면역글로불린에서 초가변성 영역 사이에서 그리고 그에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열이다. 구현예에서, 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변성 영역 및 중쇄의 3개의 초가변성 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 항원-결합 표면을 형성하고, 이는 결합된 항원의 3차원 표면에 대해 상보적이다. 각각의 중쇄 및 경쇄의 3개의 초가변성 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 프레임워크 영역 및 CDR은 예를 들어 Kabat, E. A., et al.(1991) 면역학적 관심 단백질의 서열, 제5판, 미국 보건복지부, NIH 공개 번호 91-3242 및 Chothia, C. et al.(1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917에 정의 및 기재되어 있다. 각각의 가변성 사슬(예를 들어, 가변 중쇄 및 가변 경쇄)은 전형적으로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카복시-말단으로 아미노산 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "전장 항체"는 예를 들어 자연적으로 발생하고 정상적인 면역글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 형성된 면역글로불린(Ig) 분자(예를 들어, IgG 항체)를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 항체 단편"은 온전한(예를 들어, 전장) 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원에 결합하는 단편을 지칭한다. 용어 "항체 단편" 또는 "기능적 단편"은 또한 가변 영역으로 구성된 단리된 단편, 예를 들어 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 "Fv" 단편 또는 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커("scFv 단백질")에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩타이드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 항원 결합 활성이 없는 항체의 일부, 예컨대 Fc 단편 또는 단일 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "면역글로불린 가변 도메인 서열"은 면역글로불린 가변 도메인의 구조를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 서열은 자연 발생 가변 도메인의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열은 하나, 둘 또는 그 이상의 N- 또는 C-말단 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있거나, 단백질 구조의 형성에 적합한 다른 변경을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는 방법 또는 조성물에 필수적이지만 아직 불특정된 요소의 포함에 개방된 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분(들)과 관련하여, 필수 여부에 관계없이 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "본질적으로 구성되는"은 주어진 구현예에 필요한 요소들을 지칭한다. 이 용어는 그 구현예의 기본 및 신규한 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다.
용어 "구성되는"은 구현예의 설명에서 인용되지 않은 임의의 요소를 배제한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성 요소를 지칭한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명확하게 명시되지 않는한 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본 명세서에 기재되고/되거나 본 개시내용 등을 읽을 때 당해 분야의 숙련가에게 명백할 하나 이상의 방법 및/또는 단계의 단계를 포함한다. 유사하게, 용어 "또는"은 문맥상 달리 명확하게 나타내지 않는한 "및"을 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 아래에 기재되어 있다. 약어 "예를 들어"는 라틴어 예시적 Gratia로부터 유래되고, 비-제한적인 예를 나타내기 위해 본 명세서에 사용된다. 따라서 약어 "예를 들어"는 "예를 들면"과 동의어이다.
작동 예 이외에, 또는 달리 나타내는 경우에, 본원에 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 나타내는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형된 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 연관하여 사용될 때 용어 "약"은 평균 ±1%를 의미할 수 있다. 이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위가 이것에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 정해진다.
제한없이, 본 발명의 지질 나노입자는 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA 벡터를 관심있는 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는데 사용될 수 있는 지질 제형을 포함한다. 일반적으로, 지질 나노입자는 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA 벡터 및 이온화가능한 지질 또는 이의 염을 포함한다.
따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 ceDNA 및 이온화가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 실시예 1의 방법에 의해 수득되거나 그렇지 않으면 본원에 개시된 ceDNA로 제조되고 장입된 지질 나노입자 제형. 이는 이온화가능한 지질을 양성자화하는 낮은 pH에서 에탄올성 지질과 수성 ceDNA의 고 에너지 혼합에 의해 달성될 수 있으며, ceDNA/지질 결합 및 입자의 핵 생성에 유리한 에너지를 제공한다. 입자는 유기 용매의 수성 희석 및 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 입자는 원하는 수준으로 농축될 수 있다.
일반적으로, 지질 입자는 약 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 ceDNA(질량 또는 중량) 비로 제조된다. 일부 구현예에서, 지질 대 ceDNA 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다. 지질 및 ceDNA의 양은 원하는 N/P 비, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL의 범위일 수 있다.
이온화가능한 지질은 전형적으로 핵산화물, 예를 들어 ceDNA를 낮은 pH에서 응축시키고 막 결합 및 발연성을 유도하기 위해 사용된다. 일반적으로, 이온화가능한 지질은 산성 조건, 예를 들어 pH 6.5 이하에서 양으로 하전되거나 양성자화되는 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 지질이다. 이온화가능한 지질은 또한 본 명세서에서 양이온성 지질로 지칭된다.
예시적인 이온화가능한 지질은 표 1에 열거된 PCT 및 미국 특허 공보에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2016/0311759에 정의된 바와 같은 하기 화학식 X, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US20150376115 또는 US2016/0376224에 정의된 바와 같은 화학식 I, 
의 화합물이며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US20160151284에 정의된 바와 같은 화학식 I, 
또는 화학식 II, 
또는 화학식 III, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US20170210967에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
또는 화학식 IA, 
또는 화학식 II, 
또는 화학식 IIA, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US20150140070에 정의된 바와 같은 화학식 I-c, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0178541에 정의된 바와 같은 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0303587 또는 US2013/0123338에 정의된 바와 같은 화학식 I, 
의 화합물이며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2015/0141678에 정의된 바와 같은 화학식 I, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2015/0239926에 정의된 바와 같은 화학식 II, 
화학식 III, 
화학식 IV, 
또는 화학식 V, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2017/0119904에 정의된 바와 같은 화학식 I, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 각각 구조가 WO2017/117528에 정의된 바와 같은, 구조식: 
를 각각 갖는 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2012/0149894에 정의된 바와 같은 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2015/0057373에 정의된 바와 같은 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 WO2013/116126에 정의된 바와 같은 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0090372에 정의된 바와 같은 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0274523에 정의된 바와 같은 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0274504에 정의된 바와 같은 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0053572에 정의된 바와 같은 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 WO2013/016058에 정의된 바와 같은 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 WO2012/162210에 정의된 바와 같은 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2008/042973에 정의된 바와 같은 화학식 I, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2012/01287670에 정의된 바와 같은 화학식 I, 
, 화학식 II, 
, 화학식 III, 
, 또는 화학식 IV, 
의 화합물이고, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2014/0200257에 정의된 바와 같은, 구조식: 
을 각각 갖는, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2015/0203446에 정의된 바와 같은, 구조식: 
을 갖는 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2015/0005363에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
또는 화학식 III, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2014/0308304에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
화학식 IA, 
화학식 IB, 
화학식 IC, 
화학식 ID, 
화학식 II, 
화학식 IIA, 
화학식 IIB, 
화학식 IIC, 
화학식 IID, 또는 화학식 III-XXIV의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0338210에 정의된 바와 같은, 화학식, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 WO2009/132131에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
화학식 II, 
화학식 III, 
또는 화학식 IV, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2012/01011478에 정의된 바와 같은, 화학식 A, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2012/0027796에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
또는 화학식 XXXV, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2012/0058144에 정의된 바와 같은, 화학식 XIV, 
또는 화학식 XVII, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0323269에 정의된 바와 같은, 화학식, 
, 
또는 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2011/0117125에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2011/0256175에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
화학식 II, 
또는 화학식 III, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2012/0202871에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
, 화학식 II, 
, 화학식 III, 
, 화학식 IV, 
, 화학식 V, 
, 화학식 VI, 
, 화학식 VII, 
, 화학식 VIII, 
, 화학식 IX, 
, 화학식 X, 
, -화학식 XI, 
또는 화학식 XII, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2011/0076335에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
, 화학식 II, 
, 화학식 III, 
, 화학식 IV, 
, 화학식 V, 
, 화학식 VI, 
, 화학식 VII, 
, 화학식 VIII, 
, 화학식 IX, 
, 화학식 X, 
, 화학식 XI, 
, 화학식 XII, 
, 화학식 XIII, 
, 화학식 XIV, 
, 화학식 XV, 
, 또는 화학식 XVI, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2006/008378에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
또는 화학식 II, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0123338에 정의된 바와 같은 화학식 I, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2015/0064242에 정의된 바와 같은, 화학식 I, X-A-Y-Z의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0022649에 정의된 바와 같은, 화학식 XVIX, 
, 화학식 XVII, 
또는 화학식 XVIII, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0116307에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
, 화학식 II, 
또는 화학식 III, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2010/0062967에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
또는 화학식 II, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 각각 구조가 US2013/0189351에 정의된 바와 같은, 구조식: 
을 갖는 화학식 I-X의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2014/0039032에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2018/0028664에 정의된 바와 같은, 화학식 V, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2016/0317458에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 US2013/0195920에 정의된 바와 같은, 화학식 I, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 실시예 9에 기재되어 있는 MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 실시예 10에 기재되어 있는 지질 ATX-002이다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 실시예 11에 기재되어 있는 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)이다.
일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 실시예 12에 기재되어 있는 화합물 6 또는 화합물 22이다.
제한없이, 이온화가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20~90%(mol)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이온화가능한 지질 몰 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20~70%(mol), 30~60%(mol) 또는 40~50%(mol)일 수 있다. 일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol% 내지 약 90 mol%를 포함한다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 비-양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 비-이온성 지질은 양친매성 지질, 중성 지질 및 음이온성 지질을 포함한다. 따라서, 비-양이온성 지질은 중성 하전되지 않은, 양쪽이온성 또는 음이온성 지질일 수 있다. 비-양이온성 지질은 전형적으로 발연성을 향상시키기 위해 사용된다.
예시적인 비-양이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG) 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG) 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC) 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 라이소레시틴, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티디카시드, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 라이소포스파티딜콜린, 딜리놀레오일포스파티딜콜린 또는 이들의 혼합물을 비제한적으로 포함한다. 다른 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민 인지질도 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 이들 지질 중의 아실 기는 바람직하게는 C10-C24 탄소 사슬을 갖는 지방산, 예를 들어 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 또는 올레오일로부터 유도된 아실기이다.
지질 나노입자에 사용하기에 적합한 비-양이온성 지질의 다른 예는 비인성 지질, 예컨대, 예를 들어 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤리시놀레이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴 중합체, 트리에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트 폴리에틸옥실화 지방산 아미드, 디옥타데실디메틸 암모늄 브로마이드, 세라마이드, 스핑고미엘린 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 비-양이온성 지질은 인지질이다. 일부 구현예에서, 비-양이온성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 비-양이온성 지질은 DPSC이다.
예시적인 비-양이온성 지질은 PCT 공개 WO2017/099823 및 미국 특허 공개 US2018/0028664에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 예에서, 비-양이온성 지질은 US2018/0028664에 정의된 바와 같은, 올레산 또는 화학식 I, 
, 화학식 II, 
, 또는 화학식 IV, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
비-양이온성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0~30%(mol)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비-양이온성 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5~20%(mol) 또는 10~15%(mol)이다. 다양한 구현예에서, 이온화가능한 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1의 범위이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 임의의 인지질을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 막 무결성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 성분을 추가로 포함할 수 있다.
지질 나노입자에 사용될 수 있는 하나의 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 및 이의 유도체이다. 콜레스테롤 유도체의 비-제한적인 예는 극성 유사체, 예컨대 5α-콜레스타놀, 5β-코프로스타놀, 콜레스테릴-(2'-하이드록시)-에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르 및 6-케토콜레스타놀; 비-극성 유사체, 예컨대 5α-콜레스테인, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5β-콜레스타논 및 콜레스테릴 데카노에이트; 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤 유도체는 극성 유사체, 예컨대 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르이다.
예시적인 콜레스테롤 유도체는 PCT 공개 WO2009/127060 및 미국 특허 공개 US2010/0130588에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
막 무결성을 제공하는 성분, 예컨대 스테롤은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0~50%(mol)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 성분은 지질 나노입자의 총 지질 함량의 20~50%(mol) 30~40%(mol)이다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 콘주게이팅된 지질 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 나노입자의 응집을 억제하고/하거나, 입체 안정화를 제공하는데 사용된다. 예시적인 콘주게이팅된 지질은 PEG-지질 콘주게이트, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 콘주게이트, 폴리아미드-지질 콘주게이트(예컨대, ATTA-지질 콘주게이트), 양이온성-중합체 지질(CPL) 콘주게이트 및 이들의 혼합물을 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 콘주게이팅된 지질 분자는 PEG-지질 콘주게이트, 예를 들어(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-콘주게이팅된 지질이다.
예시적인 PEG-지질 콘주게이트는 PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라마이드(Cer), 페길화된 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카밤, N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, 또는 이들의 혼합물을 비제한적으로 포함한다. 추가의 예시적인 PEG-지질 콘주게이트는 예를 들어 US5,885,613, US6,287,591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224, US2017/0119904 및 US/099823에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 US2018/0028664에 정의된 바와 같은, 화학식 III, 
, 화학식 III-aI, 
, 화학식 III-a-2, 
, 화학식 III-b-1, 
, 화학식 III-b-2, 
, 또는 화학식 V, 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 US20150376115 또는 US2016/0376224에 정의된 바와 같은, 화학식 II, 
의 화합물이며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
PEG-DAA 콘주게이트는, 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸일옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(Cholest-5-en-3[β]-옥시)카복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카바모일-[ω]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕시벤질-[ω]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 중 하나 이상일 수 있다. 일부 예에서, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000], 
, 
, 
, 및 
로 구성된 군으로부터 선택된다.
PEG 이외의 분자와 콘주게이팅된 지질이 또한 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 콘주게이트, 폴리아미드-지질 콘주게이트(예컨대, ATTA-지질 콘주게이트) 및 양이온성 중합체 지질(CPL) 콘주게이트가 PEG-지질 대신에 또는 그 외에 사용될 수 있다.
예시적인 콘주게이팅된 지질, 즉 PEG-지질, (POZ)-지질 콘주게이트, ATTA-지질 콘주게이트 및 양이온성 중합체-지질은 표 2에 열거된 PCT 및 미국 특허 출원에 기재되어 있으며, 이의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
PEG 또는 콘주게이팅된 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0~20%(mol)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG 또는 콘주게이팅된 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0.5~10% 또는 2~5%(mol)이다.
이온화가능한 지질, 비-양이온성 지질, 스테롤 및 PEG/콘주게이팅된 지질의 몰비는 필요에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 지질 입자는 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 30~70% 이온화가능한 지질, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 0~60% 콜레스테롤, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 0~30% 비-양이온성-지질 및 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 1~10% 콘주게이팅된 지질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 30~40% 이온화가능한 지질, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 40~50% 콜레스테롤, 및 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 10~20% 비-양이온성 지질을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 조성물은 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 50~75% 이온화가능한 지질, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 20~40% 콜레스테롤, 및 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 5 내지 10% 비-양이온성 지질, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 1~10% 콘주게이팅된 지질을 포함한다. 조성물은 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 60~70% 이온화가능한 지질, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 25~35% 콜레스테롤, 및 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 5~10% 비-양이온성-지질을 함유할 수 있다. 조성물은 또한 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 최대 90% 이온화가능한 지질 및 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 2 내지 15% 비-양이온성 지질을 함유할 수 있다. 제형은 또한 예를 들어 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 8~30% 이온화가능한 지질, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 5~30% 비-양이온성 지질, 및 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 0~20% 콜레스테롤; 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 4~25% 이온화가능한 지질, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 4~25% 비-양이온성 지질, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 2 내지 25% 콜레스테롤, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 10% 내지 35% 콘주게이트 지질, 및 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 5% 콜레스테롤; 또는 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 2~30% 이온화가능한 지질, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 2~30% 비-양이온성 지질, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 1 내지 15% 콜레스테롤, 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 2 내지 35% 콘주게이트 지질, 및 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 1~20%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 최대 90% 이온화가능한 지질 및 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 2~10% 비-양이온성 지질, 또는 조성물의 몰당 또는 총 중량 기준으로 100% 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자 제형일 수도 있다. 일부 구현예에서, 지질 입자 제형은 이온화가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 페길화(PEG-ylated) 지질을 50:10:38.5:1.5의 몰비로 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 지질 입자 제형은 이온화가능한 지질, 콜레스테롤 및 페길화 지질을 60:38.5:1.5의 몰비로 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 입자는 이온화가능한 지질, 비-양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 페길화 지질을 포함하며, 여기서 지질의 몰비는 이온화가능한 지질의 경우, 40~60의 표적과 함께 20 내지 70 몰%의 범위이고, 비-양이온성 지질의 몰%는 0 내지 15의 표적과 함께 0 내지 30의 범위이고, 스테롤의 몰%는 30 내지 50의 표적과 함께 20 내지 70의 범위이고, 및 페길화 지질의 몰%는 2 내지 5의 표적과 함께 1 내지 6의 범위이다.
일부 구현예에서, 지질 입자는 이온화가능한 지질/비-양이온성 지질/스테롤/콘주게이팅된 지질을 50:10:38.5:1.5의 몰비로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 화합물이 또한 포함될 수 있다. 이들 화합물은 별도로 투여될 수 있거나 추가의 화합물이 본 발명의 지질 나노입자에 포함될 수 있다. 다시 말해서, 지질 나노입자는 ceDNA 외에 다른 화합물 또는 제1 ceDNA와는 다른 제2 ceDNA를 함유할 수 있다. 제한없이, 다른 추가 화합물은 소형 또는 큰 유기 또는 무기 분자, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 다당류, 펩타이드, 단백질, 펩타이드 유사체 및 이의 유도체, 펩타이도미메틱, 핵산, 핵산 유도체, 생물학적 물질로 제조된 추출물 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 화합물은 치료제일 수 있다. 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류로부터 선택될 수 있다. 다시 말해, 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류로부터 선택될 수 있다. 즉, 치료제는 원하는 치료 목표 및 생물학적 작용에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, LNP 내의 ceDNA가 암 치료에 유용한 경우, 추가의 화합물은 항암제(예를 들어, 화학요법제, 표적화된 암 요법(소분자, 항체 또는 항체-약물 콘주게이트를 비제한적으로 포함함)일 수 있다. 다른 예에서, ceDNA를 함유하는 LNP가 감염 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항균제(예를 들어, 항생제 또는 항바이러스 화합물)일 수 있다. 또 다른 예에서, ceDNA를 함유하는 LNP가 면역 질환 또는 장애의 치료에 유용한 경우, 추가의 화합물은 면역 반응을 조절하는 화합물(예를 들어, 면역억제제, 면역자극 화합물, 또는 하나 이상의 특정 면역 경로를 조절하는 화합물)일 수 있다. 일부 구현예에서, 다른 화합물을 함유하는 다른 지질 나노입자의 다른 칵테일, 예컨대 다른 단백질을 코딩하는 ceDNA 또는 다른 화합물, 예컨대 치료제가 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 추가의 화합물은 면역 조절제이다. 예를 들어, 추가의 화합물은 면역억제제이다. 일부 구현예에서, 추가의 화합물은 면역자극성이다.
예시적인 면역 조절제는 인터루킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-12), 사이토카인(예를 들어, 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 인터페론), 케모카인(예를 들어, CCL3, CCL26, CXCL7), 면역조절 이미드 약물(IMiD)(예를 들어, 탈리도마이드 및 그의 유사체(레날리도마이드, 포말리도마이드 및 아프레밀라스트), 시토신 포스페이트-구아노신, 올리고데옥시뉴클레오타이드, 글루칸을 비제한적으로 포함하는 다른 면역 조절제를 비제한적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 조절제는 면역억제 약물일 수 있다. 예시적인 면역억제 약물에는 글루코코르티코이드, 세포증식억제제, 항체, 이뮤노필린에 작용하는 약물 및 다른 약물이 비제한적으로 포함된다. 글루코코르티코이드에는 프레드니손, 덱사메타손 및 하이드로코르티손이 비제한적으로 포함된다. 세포증식억제제의 예는 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드(예를 들어, 사이클로포스파미드), 니트로소우레아 및 백금 화합물을 포함한다. 세포증식억제제는 또한 항대사물질, 예컨대 엽산 유사체(예를 들어, 메토트렉세이트), 퓨린 유사체(예를 들어, 아자티오프린 및 머캅토퓨린), 피리미딘 유사체(예를 들어, 플루오로우라실) 및 단백질 합성 억제제를 포함할 수 있다. 다른 세포증식억제제로는 세포독성 항생제, 예컨대 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신 및 미트라마이신이 포함된다.
면역 억제를 위한 항체는 말 혈청에서 얻은 아트감(Atgam), 및 티모글로불린(Thymoglobuline), IL-2 수용체-(CD25-)에 대한 항체 및/또는 CD3-지향 항체, MUROMONAB-CD3™(오르쏘클론 OKT3), 바실릭시맙(SIMULECT™), 다클리주맙(ZENAPAX™) 및 무로모납을 비제한적으로 포함한다.
이뮤노필린에 작용하는 약물은 시클로스포린, 타크롤리무스, 라파마이신(SIROLIMUS™) 및 에베롤리무스를 비제한적으로 포함한다. 생물학적 제제의 예는 아바타셉트, 아나킨라, 세르톨리주맙, 골리무맙, 익세키주맙, 나탈리주맙, 리툭시맙, 세큐키누맙, 토실리주맙, 우스테키누맙 및 베돌리주맙을 포함한다.
면역 조절제 또는 면역 억제제로서 유용한 다른 약물은 인터페론(예를 들어, IFN-β), 오피오이드, TNF 결합 단백질(예를 들어, TNF-α(종양 괴사 인자-알파) 결합 단백질, 인플릭시맙(REMICADE™), 에타너셉트(ENBREL™) 또는 아달리무맙(HUMIRA™)), 커큐민(강황 성분) 및 카테킨(녹차), 마이코페놀레이트, 핀골리모드, 마이리오신, 항증식제(예를 들어, 마이리오신, 타크롤리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 마이코페놀레이트 나트륨, 아자티오프린), mTOR 억제제(예를 들어, 시롤리무스 및 에베롤리무스), 칼시뉴린 억제제(예를 들어, 사이클로스포린 및 타크롤리무스), IMDS 억제제(예를 들어, 아자티오프린, 레플루노마이드 및 마이코페놀레이트), 핀골모드, 아바타셉트, 아나킨라, 세르톨리주맙, 골리무맙, 익세키주맙, 나탈리주맙, 리툭시맙, 세큐키누맙, 토실리주맙, 우스테키누맙 및 베돌리주맙을 비제한적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 조성물 및 방법에 유용한 면역억제제는 하기 화합물들 중 하나로부터 선택될 수 있다: 마이코페놀산, 사이클로스포린, 아자티오프린, 타크롤리무스, 사이클로스포린 A, FK506, 라파마이신, 레플루노마이드, 데옥시스페르괄린, 프레드니손, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸, OKT3, ATAG 또는 미조리빈.
특정 구현예에서, 면역 억제제는 프레드니손, 메틸 프레드니솔론, 케날로그(Kenalog), 경구용 메드롤(Medrol Oral), 경구용 메드롤(Pak)(Medrol(Pak) Oral), 주사용 데포-메드롤(Depo-Medrol Inj), 경구용 프레드니솔론, 주사용 솔루-메드롤(Solu-Medrol Inj), 경구용 하이드로코르티손, 경구용 코르테프(Cortef Oral), 정맥용 솔루-메드롤(Solu-Medrol IV), 경구용 코르티손, 주사용 셀레스톤 솔루스판(Celestone Soluspan Inj), 경구용 오라프레드 ODT(Orapred ODT Oral), 경구용 오라프레드(Orapred Oral), 경구용 프렐론(Prelone Oral), 주사용 메틸프레드니솔론 아세테이트, 경구용 프레드니손 인텐솔, 주사용 베타메타손 아세트&소드 포스(betamethasone acet & sod phos Inj), 베리프레드(Veripred), 경구용 셀레스톤(Celestone Oral), 정맥용 메틸프레드니솔론 소듐 succ, 주사용 메틸프레드니솔론 소듐 succ, 경구용 밀리프레드(Millipred Oral), 주사용 솔루-메드롤(PF)(Solu-Medrol (PF) Inj), 주사용 솔루-코르테프(Solu-Cortef Inj), 관절내 주사용 아리스토스판(Aristospan Intra-Articular Inj), 주사용 하이드로코르티손 소드 숙시네이드(hydrocortisone sod succinate Inj), 경구용 프레드니솔론 소듐 포스페이트, 정맥내 메틸프레드니솔론 소드 숙(PF), 정맥내 솔루-메드롤(PF), 주사용 트리암시놀론 헥사세토니드, 주사용 A-하이드로코트(A-Hydrocort Inj), 주사용 A-메타프레드(A-Methapred Inj), 경구용 밀리프레드 DP(Millipred DP Oral), 경구용 플로-프레드(Flo-Pred Oral), 병변내 주사용 아리스토스판(Aristospan Intralesional Inj), 경구용 베타메타손(betamethasone Oral), 주사용 메틸프레드니솔론 sod suc(PF)(methylprednisolone sod suc(PF) Inj), 주사용 하이드로코르티손 sod succ (PF)(hydrocortisone sod succ (PF) Inj), 주사용 솔루-코르테프 (PF)(Solu-Cortef (PF) Inj), 경구용 프레드니솔론 아세테이트, 정맥내 0.9% NaCl 중 덱사메타손, 레이오스(Rayos), 레보티록신(levothyroxine)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 물론, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 면역 억제제는 이 목록이 완전하거나 제한적인 것으로 간주되어서는 안되므로 쉽게 대체될 수 있다.
면역 억제제는 대상체에서 면역 세포의 감소, 예를 들어 CD11b, CD4, CD8 중 하나 이상을 발현하는 면역 세포의 감소 및/또는 TNFα 또는 MCP-1로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는 전-염증성 사이토카인의 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 전-염증성 사이토카인은 사이토카인, 림포카인, 모노카인, 줄기 세포 성장 인자, 림포톡신, 조혈 인자, 콜로니 자극 인자(CSF), 인터페론(IFN), 부갑상선 호르몬, 티록신, 인슐린, 프로인슐린, 렐락신, 프로렐락신, 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 황체형성 호르몬(LH), 간 성장 인자, 프로스타글란딘, 섬유아세포 성장 인자, 프로락틴, 태반 락토겐, OB 단백질, 형질전환 성장 인자(TGF), TGF-α, TGF-β., 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 종양 괴사 인자(TNF), TNF-α, TNF-β, 뮬러리아-억제 물질(MIS), 마우스 고나도트로핀-관련 펩타이드, 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장 인자, 인테그린, 인터루킨(IL), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터페론-알파 인터페론-베타, 인터페론-감마, S1 인자, IL-1, IL-1 cc, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 IL-21, IL-23, IL-25, LIF, 키트-리간드, FLT-3, 안지오스타틴, 트롬보스폰딘 및 엔도스타틴 중 임의의 하나 또는 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 전-염증성 사이토카인은 인터루킨-1β(IL-1β), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 인터페론-γ(IFN-γ), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 단핵구 화학유인 단백질-1(MCP-1), RANTES, 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-12(IL-12), 매트릭스 메탈로프로테이나제 2(MMP2), IP-10, 대식세포 염증성 단백질 1α(MIP1α) 및/또는 대식세포 염증성 단백질 1β(MIP1β) 중 임의의 하나 또는 조합으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 조절제는 NLRP3 작용제이다. 예시적인 NLRP3 작용제는 이마다조퀴놀린; 이미다조나프티리딘; 피라졸로피리딘; 아릴-치환된 이미다조퀴놀린; 1-알콕시 1H-이미다조 고리계를 갖는 화합물; 옥사졸로[4,5-c]-퀴놀린-4-아민; 티아졸로[4,5-c]-퀴놀린-4-아민; 셀레나졸로[4,5-c]-퀴놀린-4-아민; 이미다조나프티리딘, 이미다조퀴놀린아민; 1-치환된, 2-치환된 1H-이미다조[4,5-C]퀴놀린-4-아민; 융합된 사이클로알킬이미다조피리딘; 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민; 1-치환된 1H-이미다조-[4,5-c]퀴놀린-4-아민; 이미다조-[4,5-C]퀴놀린-4-아민; 2-에틸 1H-이미다조[4,5-시퀴놀린-4-아민; 올페닉 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민; 6,7-디하이드로-8-(이미다졸-1-일)-5-메틸-1-옥소-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-2-카복실산; 피리도퀴녹살린-6-카복실산; 6,7-디하이드로-8-(이미다졸-1-일)-5-메틸-1-옥소-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-2-카복실산; 치환된 나프토[ij]퀴놀리진; 치환된 피리도퀴녹살린-6-카복실산; 7-하이드록시-벤조[ij]퀴놀리진-2-카복실산 유도체; 치환된 벤조[ij]퀴놀리진-2-카복실산; 7-하이드록시-벤조[ij]퀴놀리진-2-카복실산; 치환된 피리도[1,2,3,-de]-1,4-벤족사진; 및 테트라하이드로퀴놀린의 N-메틸렌 말로네이트를 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, NLRP3 작용제는 US20170056448A1에 정의된 바와 같은, 화학식: 
의 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 면역 조절제는 TLR7 및/또는 TLR8 리간드이다. 일부 구현예에서, 면역 조절제는 이미퀴모드(1-이소부틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민) 또는 레시퀴모드이다.
일부 구현예에서, 면역 조절제는 US9034336B2에 정의된 바와 같은, 화학식: 
의 임퀴다졸퀴놀린계 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 면역 조절제는 SMAD7 조절제이다. 예를 들어, SMAD7 조절제는 WO2017059225A1에 정의된 바와 같은 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)일 수 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
면역 조절제는 TLR 조절제일 수 있다. 예를 들어, 면역 조절제는 TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 또는 TLR9 조절제, 예컨대 TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 또는 TLR9 작용제 또는 TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 또는 TLR9 길항제일 수 있다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR3 조절제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR4 조절제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR7 조절제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR8 조절제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR9 조절제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR3 작용제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR4 작용제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR7 작용제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR8 작용제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR9 작용제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR3 길항제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR4 길항제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR7 길항제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR8 길항제이다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR9 길항제이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 TLR 조절제는 둘 이상의 TLR을 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 하나 이상의 TLR을 활성화시키고 하나 이상의 TLR을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, TLR 조절제는 TLR9 조절제, 예컨대 KAPPAPROCT® 또는 MONARSEN®이다. 일부 예시적인 TLR 조절제는 예를 들어 WO2017059225A1에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 면역 조절제는 WO2017059225A1에 기재된 CpG-A 또는 Cpg-B 올리고뉴클레오타이드이다.
병원체-유래 DNA의 세포질 검출은 TANK 결합 키나제 1(TBK1) 및 그의 다운스트림 전사 인자, IFN-조절 인자 3(IRF3)을 통한 신호전달을 필요로 한다. STING(IFN 유전자의 자극제; MITA, ERIS, MPYS 및 TMEM173이라고도 함)이라는 막관통 단백질은 이러한 사이클릭 퓨린 디뉴클레오타이드에 대한 신호전달 수용체로서 작용하여 TBK1-IRF3 신호전달 축 및 STING-의존적 유형 I 인터페론 반응을 자극시킨다. 따라서 일부 구현예에서, 면역 조절제는 STING 조절제이다. STING은 사이클릭 디구아닐레이트 모노포스페이트에 직접 결합하지만 다른 비관련 뉴클레오타이드 또는 핵산에는 결합하지 않는다. 따라서, 일부 구현예에서, STING 조절제는 사이클릭 퓨린 디뉴클레오타이드이다. 예시적인 사이클릭 퓨린 디뉴클레오타이드 및 STING 조절제는 예를 들어 US9549944B2에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
추가의 예시적인 면역억제제는 아바타셉트; 아달리무맙; 아데노신 수용체 작용제; 아나킨라; 아릴 탄화수소 수용체 억제제; 자가포식 억제제, 예컨대 3-메틸아데닌; 칼시뉴린 억제제; 칼시뉴린 억제제, 예컨대 사이클로스포린 및 타크롤리무스; 카스파제-1 억제제; 세르톨리주맙; cGAS 억제제; 코르티코스테로이드; 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 부데소니드, 프레드니솔론; 사이토카인 억제제; 사이토카인 수용체 활성화제; 사이토카인 수용체 억제제; 에타네르셉트; 글루코코르티코이드; 골리무맙; G-단백질 결합 수용체 작용제; G-단백질 결합 수용체 길항제; 히스톤 데아세틸라제 억제제; 히스톤 데아세틸라제 억제제, 예컨대 트리코스타틴 A; IMDH 억제제, 예컨대 아자티오프린, 레플루노미드 및 마이코페놀레이트; 인플릭시맙; 미토콘드리아 기능 억제제, 예컨대 로테논; 익세키주맙; 키나제 억제제; 메틸프레드니솔론; 단일클론 항체, 예컨대 바실릭시맙, 다클리주맙 및 무로모납; mTOR 억제제, 예컨대 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, 시롤리무스 및 에버롤리무스; 나탈리주맙; NF-κβ 억제제, 예컨대 6Bio, 덱사메타손, TCPA-1, IKK VII; OTK3; 산화된 ATP, 예컨대 P2X 수용체 차단제; P38 억제제; 퍼옥시좀 증식제-활성화 수용체 작용제; 퍼옥시좀 증식제-활성화 수용체 길항제; 포스파타제 억제제; 포스포디에스테라제 억제제, 예컨대 포스포디에스테라제 4 억제제(PDE4), 예컨대 롤리프람; PI3 KB 억제제, 예컨대 TGX-221; 프로스타글란딘 E2 작용제(PGE2), 예컨대 미소프로스톨; 프로테아좀 억제제 I(PSI); 프로테아좀 억제제; 레티노이드; 리툭시맙; 세큐키누맙; 스타틴; TGF-β 수용체 작용제; TGF-β 신호전달제; 티모글로불린; TLR9 길항제; 토실리주맙; 우스테키누맙; 및 베돌리주맙을 비제한적으로 포함한다. 면역억제제는 또한 IDO, 비타민 D3, 사이클로스포린, 예컨대 사이클로스포린 A, 아릴 탄화수소 수용체 억제제, 레스베라트롤, 아자티오퓨린(Aza), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 6-티오구아닌(6-TG), FK506, 상리페린(sanglifehrin) A, 살메테롤, 마이코페놀레이트 모페틸(MMF), 아스피린 및 다른 COX 억제제, 니플루민산, 에스트리올 및 트립톨리드, 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-10), 사이클로스포린 A, siRNA 표적화 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 조절제는 3-메틸아데닌, 6-Bio, 6-메르캅토퓨린(6-MP, 6-티오구아닌(6-TG), FK506, 상리페린 A, 아바타셉트, 아달리무맙, 아나킨라, 아릴 탄화수소 수용체 억제제, 아스피린, 자가포식 억제제, 아자티오프린, 바실릭시맙, 부데소니드, 칼시뉴린 억제제, 카스파제-1 억제제, 세르톨리주맙, cGAS 억제제, COX 억제제, 니플루민산, 사이클로스포린, 사이토카인 억제제, 사이토카인 수용체 활성화제, 사이토카인 수용체 억제제, 다클리주맙, 덱사메타손, 에스트리올, 에타너셉트, 에베롤리무스, 글루코코르티코이드, 골리무맙, G-단백질 결합된 수용체 작용제, G-단백질 결합된 수용체 길항제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, IDO, IKK VII, 인플릭시맙, 인터루킨-1, 인터루킨-10, 익세키주맙, 키나제 억제제, 레플루노마이드, 메틸프레드니솔론, 미소프로스톨, 무로모납, 마이코페놀레이트, 마이코페놀레이트 모페틸(MMF), 나탈리주맙, OTK3, 산화된 ATP, P2X 수용체 차단제, P38 억제제, 퍼옥시좀 증식제-활성화된 수용체 작용제, 퍼옥시좀 증식제-활성화된 수용체 길항제, 포스파타제 억제제, PI3 KB 억제제, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로테아좀 억제제 I(PSI), 프로테아좀 억제제, 라파마이신 및 라파마이신 유사체, 레스베라트롤, 레티노이드, 리툭시맙, 롤리프람, 로테논, 살메테롤, 세큐키누맙, 시롤리무스, 스타틴, 타크롤리무스, TCPA-1, TGX-221, 티모글로불린, TLR9 길항제, 토실리주맙, 트리코스타틴 A, 트립톨리드, 우스테키누맙, 베돌리주맙, 비타민 D3 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 면역 조절제 중 임의의 하나가 본원에 개시된 지질 나노입자, ceDNA 벡터 및/또는 조성물과 함께 사용될 수 있음에 주목한다. 예를 들어, 목적 조절제가 단독으로 또는 본원에 기재된 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의) 다른 면역 조절제와 조합하여 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 조절제는 아릴 탄화수소 수용체 억제제; 카스파제-1 억제제; cGAS 억제제; 사이토카인 억제제; G-단백질 결합된 수용체 작용제; G-단백질 결합된 수용체 길항제; 미토콘드리아 기능 억제제; mTOR 억제제; NF-κβ 억제제; 퍼옥시좀 증식제-활성화된 수용체 작용제; 포스파타제 억제제; 포스포디에스테라제 억제제, TGX-221; 프로스타글란딘 E2 작용제(PGE2); TLR9 길항제; 프로테아좀 억제제; TGF-β 수용체 작용제 및 TGF-β 신호전달제로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 하나 이상의 상기 작용제를 단독으로 또는 ceDNA를 함유하는 LNP와 조합하여 사용할 수 있다.
지질 나노입자 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 또한 제공된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약제학적 부형제를 추가로 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제형은 수크로스, 트리스, 트레할로스 및/또는 글리신을 추가로 포함한다.
일부 예시적인 LNP 특성
일반적으로, 본 발명의 지질 나노입자는 의도된 치료 효과를 제공하기 위해 선택된 평균 직경을 갖는다. 따라서, 일부 양태에서, 지질 나노입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 보다 전형적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 보다 전형적으로 약 60 nm 내지 약 130 nm, 보다 전형적으로 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 전형적으로 약 85 nm 내지 약 105 nm, 및 바람직하게는 약 100 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 일반적인 나노입자에 비해 크기가 크고 약 150 내지 250 nm인 지질 입자를 제공한다. 지질 나노입자 입자 크기는 예를 들어 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, UK) 시스템을 사용하는 준-탄성 광 산란에 의해 결정될 수 있다.
지질 입자의 의도된 용도에 따라, 성분의 비율이 변할 수 있고, 특정 제형의 전달 효율은 예를 들어 엔도좀 방출 파라미터(ERP) 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
ceDNA는 입자의 지질 부분과 복합체화되거나 지질 나노입자의 지질 위치에 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA는 지질 나노입자의 지질 위치에서 완전히 캡슐화될 수 있으며, 이에 의해, 예를 들어 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 ceDNA는 37℃에서 지질 나노입자를 뉴클레아제에 적어도 약 20, 30, 45 또는 60분 동안 노출시킨 후에 실질적으로 분해되지 않는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 ceDNA는 37℃에서 혈청에서 적어도 약 30, 45 또는 60분 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 또는 36시간 동안 입자의 배양 후 실질적으로 분해되지 않는다.
특정 구현예에서, 지질 나노입자는 대상체, 예를 들어 포유동물, 예컨대 인간에 실질적으로 무독성이다.
일부 양태에서, 지질 나노입자 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 고체 코어 입자이다. 다른 구현예에서, 지질 나노입자는 비-이중층 구조, 즉 비-라멜라(즉, 비-이중층) 형태를 갖는다. 제한없이, 비-이중층 형태는 예를 들어 3차원 튜브, 막대, 입방체 대칭 등을 포함할 수 있다. 지질 입자의 비-라멜라 형태(즉, 비-이중층 구조)는 당해 분야의 숙련가에게 알려지고, 사용되는 분석 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 기술은 동결-전송 전자 현미경(Cryo-Transmission Electron Microscopy)("Cryo-TEM"), 시차 주사 열량측정("DSC"), X-선 회절 등을 비제한적으로 포함한다. 예를 들어, 지질 나노입자(라멜라 대 비-라멜라)의 형태는 예를 들어 US2010/0130588에 기재된 바와 같은 Cryo-TEM 분석을 사용하여 용이하게 평가되고, 특성화될 수 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 추가의 구현예에서, 비-라멜라 형태를 갖는 지질 나노입자는 전자 고밀도이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 구조상 단일 층 또는 다중 층인 지질 나노입자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다중-소포성 입자 및/또는 기포-기반 입자를 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
지질 성분의 조성 및 농도를 제어함으로써, 지질 콘주게이트가 지질 입자로부터 교환되는 속도, 및 이어서 지질 나노입자가 발연성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 또한, 예를 들어 pH, 온도 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수를 사용하여 지질 나노입자가 발연성이 되는 속도를 변화 및/또는 제어할 수 있다. 지질 나노입자가 발연성이 되는 속도를 제어하는데 사용될 수 있는 다른 방법은 본 개시내용에 기초하여 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 지질 콘주게이트의 조성 및 농도를 제어함으로써 지질 입자 크기를 제어할 수 있음이 또한 명백할 것이다.
제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관될 수 있다(Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176(2010), 이들 둘 다 그 전문이 참조로 포함됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광에 기초한 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 측정될 수 있다.
지질 입자에서의 ceDNA의 캡슐화는 핵산과 결합될 때 형광이 강화된 염료를 사용하는 막-불투과성 형광 염료 배제 분석, 예를 들어 Oligreen® 분석 또는 PicoGreen® 분석을 수행함으로써 결정될 수 있다. 일반적으로, 캡슐화는 염료를 지질 입자 제형에 첨가하고, 생성된 형광을 측정하고, 소량의 비-이온성 시약을 첨가할 때 관찰된 형광과 비교함으로써 결정된다. 지질 이중층의 시약-매개된 파괴는 캡슐화된 ceDNA를 방출하여 막-불투과성 염료와 상호 작용할 수 있게 한다. ceDNA의 캡슐화는 E =(I0-I)/I0으로 계산될 수 있으며, 여기서 I 및 I0은 시약 첨가 전후의 형광 강도를 나타낸다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 면역원성/항원성을 감소시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 작용기를 갖는 하나 이상의 화합물(소위 "페길화(PEG-ylated) 화합물")을 포함하고, 화합물(들)에 대한 친수성 및 소수성을 제공하고/하거나, 치료적으로 효과적인 투여 빈도를 감소시키는 리포좀 제형을 제공한다. 다른 양태에서, 리포좀 제형은 단순히 추가 성분으로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함할 수 있다. 이러한 양태에서, PEG 또는 PEG 작용기의 분자량은 62 Da 내지 약 5,000 Da일 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 수 시간 내지 수 주에 걸쳐 연장 방출 또는 제어 방출 프로파일을 갖는 ceDNA를 전달할 리포좀 제형을 제공한다. 일부 관련된 양태에서, 리포좀 제형은 지질 이중층에 의해 결합된 수성 챔버를 포함할 수 있다. 다른 관련된 양태에서, 리포좀 제형은 고온에서 물리적 전이를 겪는 추가의 성분으로 ceDNA를 캡슐화하여 수 시간 내지 수주에 걸쳐 ceDNA를 방출한다.
일부 양태에서, 리포좀 제형은 스핑고미엘린 및 본 명세서에 개시된 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 옵티좀을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-콘주게이팅된 지질, HSPC(수소첨가된 대두 포스파티딜콜린); PEG(폴리에틸렌 글리콜); DSPE(디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린); DOPC(디올레오일포스파티딜콜린); DPPG(디팔미토일포스파티딜글리세롤); EPC(에그 포스파티딜콜린); DOPS(디올레오일포스파티딜세린); POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린); SM(스핑고미엘린); MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜); DMPC(디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG(디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DSPG(디스테아로일포스파티딜글리세롤); DEPC(디에루코일포스파티딜콜린); DOPE(디오레올리-sn-글리세로-포스포에탄올아민). 콜레스테릴 설페이트(CS), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), DOPC(디오레올리-sn-글리세로-포스파티딜콜린) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 콜레스테롤 및 페길화 지질을 56:38:5의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형의 전체 지질 함량은 2~16 mg/mL이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 에탄올아민 작용기를 함유하는 지질 및 페길화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 에탄올아민 작용기를 함유하는 지질 및 페길화 지질을 각각 3:0.015:2의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 콜레스테롤 및 페길화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 페길화 지질은 PEG-2000-DSPE이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 DPPG, 대두 PC, MPEG-DSPE 지질 콘주게이트 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 하나 이상의 지질 및 에탄올아민 작용기를 함유하는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의: 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 에탄올아민 작용기를 함유하는 지질 및/또는 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 DOPC/DEPC; 및 DOPE를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약제학적 부형제, 예를 들어 수크로스 및/또는 글리신을 추가로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 구조상 단일 라멜라 또는 다중층이 있는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다중-소포성 입자 및/또는 발포체-기반 입자를 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 일반적인 나노입자에 비해 크기가 크고 약 150 내지 250 nm인 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 외부에 단리된 ceDNA를 갖는 혼합물에 약염기를 첨가함으로써 실시예 1의 방법에 의해 수득되거나, 그렇지 않으면 본원에 개시된 ceDNA 벡터로 제조되고 장입된 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 첨가는 리포좀 외부의 pH를 약 7.3으로 증가시키고 ceDNA를 리포좀으로 유도한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 내부에서 산성인 pH를 갖는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우, 리포좀 내부는 pH 4~6.9, 더욱 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 리포좀내 약물 안정화 기술을 사용하여 제조된 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 중합체성 또는 비-중합체성 고전하 음이온 및 리포좀내 포착제, 예를 들어 폴리포스페이트 또는 수크로스 옥타설페이트가 이용된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
본 명세서에 개시된 ceDNA는 대상체의 세포, 조직 또는 장기에 생체내 전달을 위해 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터는 원하는 치료적 투여 경로(예를 들어, 비경구 투여)에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입, 및 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주입 또는 세포내질 주사를 통한 수동적인 조직 형질도입이 또한 고려된다. 치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산물, 리포좀 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주입가능 용액은 필요에 따라 ceDNA 벡터 화합물을 필요한 양으로 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적합한 완충액에 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 국소, 전신, 양막내, 척추강내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 장기, 조직내(예를 들어, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 척추강내, 방광내, 결막(예를 들어, 궤도 외, 안와내, 안구뒤, 망막내, 망막하, 맥락막, 하위-맥락막, 기질내, 전방내 및 유리체내), 달팽이관내, 및 점막(예를 들어, 경구, 직장, 비강) 투여에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입, 및 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주입 또는 세포내질 주사를 통한 수동적인 조직 형질도입이 또한 고려된다.
ceDNA 벡터를 포함하는 약제학적 활성 조성물은 핵산내 이식유전자를 수령체의 세포로 전달하여 그 안에 이식유전자의 치료적 발현을 생성하도록 제형화될 수 있다. 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 벡터는 다양한 목적으로 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 연구 목적, 예를 들어 이식유전자를 보유한 체세포성 형질전환 동물 모델을 생산하기 위해, 예를 들어 이식유전자 산물의 기능을 연구하기 위해 사용되는 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화한다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생산하기 위해 사용되는 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태의 치료, 개선, 예방에 유용한 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화한다. 이식유전자는 발현 감소, 발현 부족 또는 유전자 기능 이상과 연관된 질환을 치료하는데 충분한 양으로 임상 환경에서 대상체에게 전달될 수 있다(예를 들어, 발현된다). 일부 구현예에서, 이식유전자는 발현 증가, 유전자 산물의 활성, 또는 이식유전자가 억제하거나 달리 발현을 감소시키는 유전자의 부적합한 상향조절과 연관된 질환을 치료하는데 충분한 양으로 대상체에게 전달될 수 있다(예를 들어, 발현된다).
치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 본 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산물, 리포좀 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주입가능 용액은 필요에 따라 ceDNA 벡터 화합물을 필요한 양으로 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적합한 완충액에 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다.
본원에 기재된 ceDNA 벡터는 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 투여될 수 있다.
일반적으로, 투여는 분자를 혈액 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉시키기 위해 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법은 이용가능하고, 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 보다 즉각적이고 또 다른 경로보다 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다. 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터의 예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 질, 척추강내, 안구내, 경피, 내피, 자궁내(또는 난내), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 진피내, 두개내, 근육내[골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에의 투여 포함], 늑막내, 뇌내 및 관절내), 국소(예를 들어, 피부 및 점막 표면 모두, 기도 표면, 및 경피 투여를 포함), 림프내 등, 및 직접적인 조직 또는 장기 주사(예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 또는 뇌로 주사)를 포함한다.
ceDNA 벡터의 투여는 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부 및 눈으로 구성된 군으로부터 선택된 부위를 비제한적으로 포함는 대상체의 임의의 부위에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터의 투여는 또한 종양(예를 들어, 종양 또는 림프절내 또는 근처)에 있을 수 있다. 임의의 경우에 가장 적합한 경로는 치료, 개선 및/또는 예방되는 상태의 성질 및 중증도 및 사용중인 특정 ceDNA 벡터의 성질에 따라 달라질 것이다. 또한, ceDNA는 단일 벡터 또는 다수의 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 칵테일)에서 하나 초과의 이식유전자를 투여할 수 있게 한다.
골격근에 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터를 투여하는 것은 사지(예를 들어, 상완, 하완, 상지 및/또는 하지)의 골격근, 등, 목, 두부(예를 들어, 혀), 흉부, 복부, 골반/회음부 및/또는 손(발)가락에의 투여를 비제한적으로 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 사지 관류(선택적으로 다리 및/또는 팔의 고립된 사지 관류; 예를 들어 Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464 참고), 및/또는 직접적인 근육내 주사에 의해 골격 근육에 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 사지 관류, 임의로 단리된 사지 관류(예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여)에 의해 대상체(예를 들어, DMD와 같은 근육 이영양증을 갖는 대상체)의 사지(팔 및/또는 다리)에 투여된다. 구현예들에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 "유체역학적" 기술을 사용하지 않고 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 심장 근육으로의 투여는 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 격막에의 투여를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 예컨대 대동맥내 투여, 직접적인 심장 주사(예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실) 및/또는 관상동맥 관류에 의해 심장 근육으로 전달될 수 있다. 횡격막 근육으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 평활근으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 투여는 평활근에 존재하거나, 부근 및/또는 평활근 상에 존재하는 내피 세포에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 ceDNA 벡터는 (예를 들어, 근이영양증 또는 심장병(예를 들어, PAD 또는 울혈성 심장기능상실)을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해) 골격근, 횡격막 근육 및/또는 심장 근육에 투여된다.
본 발명에 따른 ceDNA 벡터는 CNS(예를 들어, 뇌 또는 눈)에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터는 척수, 뇌간(연수, 뇌교), 중뇌(성 상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체샘, 흑질, 송과선), 소뇌, 종뇌(선상체, 후두를 포함하는 대뇌, 후두부, 두정 및 전두엽, 피질, 기저핵, 해마 및 편도문(portaamygdala)), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌 및 하구에 도입될 수 있다. ceDNA 벡터는 또한 망막, 각막 및/또는 시신경과 같은 눈의 다른 영역에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터는 (예를 들어, 요추 천자에 의해) 뇌척수액으로 전달될 수 있다. 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황(예를 들어, 뇌종양 또는 뇌경색)에서 ceDNA 벡터가 혈관 내로 CNS에 추가로 투여될 수 있다.
ceDNA 벡터는 척추강내, 안구내, 뇌내, 심실내, 정맥내(예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재 하에서), 비강 내, 귀내, 안구내(예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위(예를 들어, 테논 하부의 영역) 전달뿐만 아니라 운동 뉴런으로의 역행 전달을 통한 근육내 전달을 비-제한적으로 포함하여 당 업계에 공지된 임의의 경로에 의해 CNS의 원하는 영역(들)에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 CNS의 원하는 영역 또는 구획에 직접 주사(예를 들어, 뇌정위적 주사)에 의해 액체 제형으로 투여된다. 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 원하는 영역에 국소 적용하거나 에어로졸 제형의 비강내 투여에 의해 제공될 수 있다. 눈에의 투여는 액적의 국소 적용에 의해 될 수 있다. 추가의 대안으로서, ceDNA 벡터는 고체 서방형 제제로서 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,201,898호 참고). 또 다른 추가의 구현예에서, ceDNA 벡터는 운동 뉴런(예를 들어, 근위축성 측삭 경화증(ALS); 척추 근육 위축증(SMA) 등)을 포함하는 질환 및 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 역행 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 뉴런으로 이동할 수 있는 근육 조직으로 전달될 수 있다.
생체외 치료
일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 제거되고, ceDNA 벡터가 그 안에 도입되고, 이어서 세포가 대상체로 다시 대체된다. 생체외 치료를 위해 대상체로부터 세포를 제거하고 이어서 대상체로 다시 도입하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,399,346호 참고; 그의 개시내용은 그 전문이 본 명세서에 포함됨). 대안적으로, ceDNA 벡터는 또 다른 대상체의 세포, 배양된 세포 또는 임의의 다른 적합한 공급원의 세포로 도입되고, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
ceDNA 벡터로 형질도입된 세포는 바람직하게는 약제학적 담체와 함께 "치료적-유효량"으로 상기 대상체에게 투여된다. 당해 분야의 숙련가는 치료 효과가 대상체에게 일부 이점이 제공되는한 완전하거나 치유적일 필요는 없음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포에서 바람직하게 생산되는 임의의 폴리펩타이드인 이식유전자(이종성 뉴클레오타이드 서열이라고도 함)를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 치료 방법에서 ceDNA 벡터의 사용과 대조적으로, 일부 구현예에서 ceDNA 벡터는 예를 들어 항원 또는 백신의 생산을 위해 배양된 세포, 및 이로부터 단리된 발현된 유전자 산물에 도입될 수 있다.
ceDNA 벡터는 수의과 및 의료 용도 모두에 사용될 수 있다. 상기 기재된 생체외 유전자 전달 방법에 적합한 대상체는 조류(예를 들어, 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩) 및 포유동물(예를 들어, 인간, 소과, 양, 염소, 말, 고양이,갯과 및 토끼목)을 포함하며, 포유동물이 바람직하다. 인간 대상체가 가장 바람직하다. 인간 대상체에는 신생아, 영아, 청소년 및 성인이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 카세트, 발현 작제물 또는 ceDNA 벡터에 존재하는 이식유전자는 숙주세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 천연 서열(예를 들어, 원핵 서열)의 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당수의 코돈을 대체함으로써 관심 척추동물, 예를 들어 마우스 또는 인간(예를 들어, 인간화된)의 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 최초 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은 예를 들어 Aptagen의 Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc.) 또는 또 다른 공개적으로 이용가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상체 숙주세포에서 이식유전자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 숙주세포는 간(즉, 간) 세포, 폐 세포, 심장 세포, 췌장 세포, 창자 세포, 횡격막 세포, 신장(즉, 신장) 세포, 신경 세포, 혈구, 골수 세포, 또는 유전자 요법이 고려되는 대상체의 임의의 하나 이상의 선택된 조직을 비제한적으로 포함하는, 혈구, 줄기 세포, 조혈 세포, CD34+ 세포, 간 세포, 암 세포, 혈관 세포, 근육 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 안구 또는 망막 세포, 상피 또는 내피 세포, 수지상 세포, 섬유모세포, 또는 포유동물 기원의 임의의 다른 세포를 포함하는 인간 숙주세포이다. 일 양태에서, 본 발명의 숙주세포는 인간 숙주세포이다.
본 명세서에 기재된 기술의 일 양태는 이식유전자를 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 시험관내 방법의 경우, ceDNA 벡터는 본 명세서에 개시된 방법뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터는 바람직하게는 생물학적 유효량으로 세포에 투여된다. ceDNA 벡터가 생체내 세포(예를 들어, 대상체)에 투여되는 경우, 생물학적 유효량의 ceDNA 벡터는 표적 세포에서 이식유전자의 형질도입 및 발현을 야기하기에 충분한 양이다.
용량 범위
생체내 및/또는 시험관내 검정은 선택적으로 사용하기 위한 최적의 투여량 범위를 확인하는데 도움이 될 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 상태의 중증도에 따라 달라질 것이며, 숙련가의 판단 및 각각의 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 효과적인 용량이 외삽될 수 있다.
ceDNA 벡터는 원하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 부작용없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약제학적으로 허용가능한 투여 경로는 상기 "투여" 섹션에서 상기한 것, 예컨대 선택된 장기로의 직접 전달(예를 들어, 간으로의 문내 전달), 경구, 흡입(비강내 및 장기내 전달 포함), 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 진피내, 종양내 및 기타 친계 투여 경로를 비제한적으로 포함한다. 원하는 경우 투여 경로가 조합될 수 있다.
특정 "치료 효과"를 달성하기 위해 요구되는 ceDNA 벡터의 양의 용량은 핵산 투여 경로, 치료 효과를 달성하는데 요구되는 유전자 수준 또는 RNA 발현 수준, 치료되는 특정 질환 또는 장애, 및 유전자(들), RNA 생산물(들) 또는 생산된 발현 단백질(들)의 안정성을 비제한적으로 포함하는 몇몇 인자에 기초하여 변할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 상기 언급된 인자 및 당 업계에 잘 알려진 다른 인자에 기초하여 특정 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 ceDNA 벡터 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 반복적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 몇개의 용량이 매일 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 용량이 비례하여 감소될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 올리고뉴클레오타이드가 세포 또는 대상체에게 투여되는지 여부에 관계없이 대상체의 올리고뉴클레오타이드의 적합한 투여 용량 및 투여 스케줄을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
"치료적으로 효과적인 용량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이고, 특정 적용에 의존할 것이다(신경 세포는 매우 소량을 필요로 하는 반면, 전신 주사는 다량을 필요로 한다). 예를 들어, 인간 대상체의 골격 또는 심장 근육으로의 생체내 직접 주사의 경우, 치료적으로 효과적인 용량은 약 1 μg 내지 100 g의 ceDNA 벡터일 것이다. 엑소좀 또는 극미립자가 ceDNA 벡터를 전달하기 위해 사용되는 경우, 치료적으로 효과적인 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 1 μg 내지 약 100 g의 벡터를 전달할 것으로 기대된다.
약제학적으로 허용가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은 다양한 치료 요법에서 본 명세서에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 마찬가지로 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
시험관내 형질감염의 경우, 세포(lx106 세포)로 전달되는 유효량의 ceDNA 벡터는 0.1 내지 100 μg ceDNA 벡터, 바람직하게는 1 내지 20 μg, 더욱 바람직하게는 1 내지 15 μg 또는 8 내지 10 μg일 것이다. 더 큰 ceDNA 벡터는 더 높은 용량을 요구할 것이다. 엑소좀 또는 극미립자가 사용되는 경우, 효과적인 시험관내 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만 일반적으로 동일한 양의 ceDNA 벡터를 전달하도록 의도될 것이다.
치료는 단일 용량 또는 다중 용량의 투여를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 다양한 간격, 예를 들어 매일, 매주, 매월, 매년 등에 걸쳐 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 1회 초과의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 이상의 투여)가 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 1회 초과의 용량이 대상체에게 투여될 수 있고; 실제로, 바이러스 캡시드의 부재로 인해 항-캡시드 숙주 면역 반응을 ceDNA 벡터가 유발하지 않기 때문에, 필요에 따라 다중 용량이 투여될 수 있다. 이와 같이, 당해 분야의 숙련가는 적합한 수의 용량을 쉽게 결정할 수 있다. 투여되는 용량의 수는 예를 들어 1 내지 100, 바람직하게는 2 내지 20 용량일 수 있다.
임의의 특정 이론에 구속되고자 하지 않으면서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 투여에 의해 유발되는 전형적인 항-바이러스 면역 반응의 부재(즉, 캡시드 성분의 부재)는 ceDNA 벡터가 여러 차례 숙주에게 투여될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산이 대상체에게 전달되는 경우의 수는 2 내지 10회(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회)의 범위이다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 10회 초과로 대상체에게 전달된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 캘린더 1일당 1회 이하(예를 들어, 24-시간 기간) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 캘린더 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 1회 이하 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 ceDNA 벡터는 캘린더 1주일(예를 들어, 7일)에 1회 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 ceDNA 벡터는 2주 이하(예를 들어, 캘린더 2주일에 1회) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 ceDNA 벡터는 1개월에 1회 이하(예를 들어, 캘린더 30일에 1회) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 ceDNA 벡터는 캘린더 6개월마다 1회 이하 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 ceDNA 벡터는 캘린더 1년마다(예를 들어, 365일 또는 윤년에 366일) 1회 이하 대상체에게 투여된다.
단위 투여 형태
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약제학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 적합할 것이다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 증발기에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 에어로졸에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 척추강내 또는 뇌심실내 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 것이다.
지질 나노입자의 제조
지질 나노입자는 ceDNA 및 지질(들)의 혼합시 자발적으로 형성될 수 있다. 원하는 입자 크기 분포에 따라, 생성된 나노입자 혼합물은 예를 들어 Lipex 압출기(Northern Lipids, Inc)와 같은 열 배럴 압출기를 사용하여 막(예를 들어, 100 nm 컷-오프)을 통해 압출될 수 있다. 경우에 따라 압출 단계가 생략될 수 있다. 에탄올 제거 및 동시 완충제 교환은 예를 들어, 투석 또는 접선 유동 여과에 의해 달성될 수 있다.
일반적으로, 지질 나노입자는 하기를 포함하는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자는 예를 들어 US2013/0037977, US2010/0015218, US2013/0156845, US2013/0164400, US2012/0225129 및 US2010/0130588에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 연속 혼합 방법, 직접 희석 공정 또는 인-라인 희석 공정을 사용하여 제조될 수 있다. 직접 희석 및 인-라인 희석 공정을 사용하여 지질 나노입자를 제조하기 위한 장치에 대한 공정 및 장치는 US2007/0042031에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 단계식 희석 공정을 사용하여 지질 나노입자를 제조하기 위한 공정 및 장치는 US2004/0142025에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
비-제한적인 일례에서, 지질 나노입자는 충돌 제트 공정에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 입자는 알콜(예를 들어, 에탄올)에 용해된 지질을 완충제, 예를 들어 시트레이트 완충제, 아세트산 나트륨 완충제, 아세트산 나트륨 및 염화 마그네슘 완충제, 말산 완충제, 말산 및 염화나트륨 완충제, 또는 시트르산 나트륨 및 염화나트륨 완충제에 용해된 ceDNA와 혼합함으로써 형성된다. 지질 대 ceDNA의 혼합비율은 약 45~55% 지질 및 약 65~45% ceDNA일 수 있다.
지질 용액은 이온화가능한 지질, 비-양이온성 지질(예를 들어, 인지질, 예컨대 DPSC), PEG 또는 PEG 콘주게이팅된 분자(예를 들어, PEG-지질) 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)을 알코올, 예를 들어 에탄올에서 5~30 mg/mL, 보다 가능성이 높게는 5~15 mg/mL, 가장 가능성이 높게는 9~12 mg/mL의 총 지질 농도로 함유할 수 있다.
지질 용액에서, 지질의 몰비율은 양이온성 지질의 경우 약 25~98%, 바람직하게는 약 35~65%; 비-이온성 지질의 경우 약 0~15%, 바람직하게는 약 0~12%; PEG 또는 PEG 콘주게이팅된 분자의 경우 약 0~15%, 바람직하게는 약 1~6%; 및 스테롤의 경우 약 0~75%, 바람직하게는 약 30~50%의 범위일 수 있다.
ceDNA 용액은 pH 3.5 내지 5의 완충 용액 중 0.3 내지 1.0 mg/mL, 바람직하게는 0.3 내지 0.9 mg/mL의 농도로 ceDNA를 포함할 수 있다.
LNP를 형성하기 위해, 하나의 예시적이지만 비제한적인 구현예에서, 2개의 액체가 약 15~40℃, 바람직하게는 약 30~40℃ 범위의 온도로 가열된 후, 예를 들어, LNP를 즉시 형성하는 충돌 제트 믹서에서 혼합된다. 혼합 유량은 10 내지 600 ml/분의 범위일 수 있다. 튜브 ID는 0.25 내지 1.0 mm의 범위 및 10 내지 600 mL/분의 총 유량을 가질 수 있다. 유량 및 튜브 ID의 조합은 30 내지 200 nm에서 LNP의 입자 크기를 제어하는 효과를 가질 수 있다. 이어서, 용액을 1:1 내지 1:3 vol:vol, 바람직하게는 약 1:2 vol:vol의 범위의 혼합 비율로 더 높은 pH에서 완충 용액과 혼합할 수 있다. 필요한 경우, 이 완충 용액은 15~40℃ 또는 30~40℃ 범위의 온도일 수 있다. 이어서, 혼합된 LNP는 음이온 교환 여과 단계를 거칠 수 있다. 음이온 교환 전에, 혼합된 LNP는 일정 기간, 예를 들어 30분 내지 2시간 동안 배양될 수 있다. 배양하는 동안 온도는 15~40℃ 또는 30~40℃의 범위일 수 있다. 배양 후, 용액을 음이온 교환 분리 단계를 포함하는 0.8 ㎛ 필터와 같은 필터를 통해 여과한다. 이 공정은 1 mm ID 내지 5 mm ID 범위의 튜브 ID 및 10 내지 2000 mL/분의 유량을 사용할 수 있다.
형성 후, LNP는 알코올을 제거하고 완충액을 최종 완충액, 예를 들어 약 pH 7, 예를 들어 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3 또는 약 pH 7.4에서 인산염 완충 식염수(PBS)로 교환하는 한외여과 공정을 통해 농축시키고 정용여과될 수 있다.
한외여과 공정은 30~500 KD의 막 공칭 분자량 컷오프 범위를 사용하여 접선 유동 여과 포맷(TFF)을 사용할 수 있다. 막 포맷은 중공사 또는 평판 카세트이다. 적절한 분자량 컷오프를 갖는 TFF 공정은 잔류물에 LNP를 보유할 수 있고, 여과액 또는 투과물은 알코올; 시트레이트 완충액 및 최종 완충액 폐기물을 함유한다. TFF 공정은 초기 농도 내지 1~3 mg/mL의 ceDNA 농도를 갖는 다단계 공정이다. 농축 후, LNP 용액은 최종 완충액에 대해 10~20 부피 동안 정용여과되어, 알코올을 제거하고 완충액 교환을 수행한다. 이어서 물질을 추가로 1~3배 농축시킬 수 있다. 농축된 LNP 용액은 멸균 여과될 수 있다.
ceDNA
다양한 구현예에서, ceDNA 벡터는 서로 상이하거나 비대칭인 5' 역전된 말단 반복(ITR) 서열 및 3' ITR 서열을 포함하는, 공유적으로-폐쇄된 말단(선형, 연속 및 비-캡슐화된 구조)을 갖는 상보성 DNA의 연속 가닥으로부터 형성된 캡시드-비함유 선형 듀플렉스 DNA 분자이다. ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위 및 복제 단백질 결합 부위(RPS)(때로는 복제 단백질 결합 부위로 지칭됨), 예를 들어 Rep 결합 부위를 포함한다. 일반적으로, ceDNA 벡터는 적어도 하나의 변형된 AAV 역전된 말단 반복 서열(ITR), 즉 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 및/또는 치환, 및 발현성 이식유전자를 함유한다.
일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 AAV ITR, 예를 들어 야생형 AAV ITR이다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 다른 ITR에 비해 변형된 ITR이며, 즉, ceDNA는 서로 비대칭인 ITR을 포함한다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 비-기능성 ITR이다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 (1) 시스-조절 요소, 프로모터 및 적어도 하나의 이식유전자를 포함하는 발현 카세트; 또는 (2) 적어도 하나의 이식유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 (3) 상기 발현 카세트에 측접하는 2개의 자가-상보적 서열, 예를 들어, ITR을 포함하며, ceDNA 벡터는 캡시드 단백질과 결합되지 않는다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 AAV 게놈에서 발견되는 2개의 자가-상보적 서열을 포함하고, 여기서 적어도 하나는 작동가능 Rep-결합 요소(RBE) 및 AAV의 말단 분할 부위(trs) 또는 RBE의 기능적 변이체, 및 이식유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 시스-조절 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 추가 성분, 예를 들어 이식유전자의 발현을 제어 및 조절하기 위한 조절 스위치를 포함하고, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 제어된 세포 사멸을 가능하게 하는 사멸 스위치인 조절 스위치를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 자가-상보성 서열은 임의의 알려진 파보바이러스, 예를 들어 데펜도바이러스, 예컨대 AAV(예를 들어, AAV1-AAV12)로부터의 ITR 서열일 수 있다. 헤어핀 이차 구조 형성을 허용하는 가변성 회문성 서열에 더하여 Rep-결합 부위(RBS), 예컨대 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호: 531) 및 말단 분할 부위(trs)를 보유하는, 변형된 AAV2 ITR 서열을 비제한적으로 포함하는 임의의 AAV 혈청형이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 합성일 수 있다. 일 구현예에서, 합성 ITR은 하나 초과의 AAV 혈청형으로부터의 ITR 서열에 기초한다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV-기반 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV-소싱 서열의 일부만을 가지거나 아예 갖지 않지만 상기 기재된 ITR 구조를 보존한다. 일부 양태에서, 합성 ITR은 야생형 Rep 또는 특정 혈청형의 Rep와 우선적으로 상호작용할 수 있거나, 일부 경우 야생형 Rep에 의해 인식되지 않고 돌연변이된 Rep에 의해서만 인식될 것이다. 일부 구현예에서, ITR은 헤어핀 이차 구조 형성을 허용하는 가변성 회문성 서열에 더하여 기능성 Rep-결합 부위(RBS), 예컨대 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호: 531) 및 말단 분할 부위(TRS)를 보유하는 합성 ITR 서열이다. 일부 예에서, 변형된 ITR 서열은 RBS, trs의 서열 및 야생형 AAV2 ITR의 상응하는 서열로부터의 ITR 헤어핀 이차 구조 중 하나의 말단 루프부를 형성하는 Rep 결합 요소의 구조 및 위치를 유지한다. ceDNA 벡터에 사용하기 위한 예시적인 ITR 서열은 2018년 9월 7일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US18/49996의 표 2~9, 10A 및 10B, 서열번호: 2, 52, 101~449 및 545~547, 및 도 26a~26b에 도시된 부분 ITR 서열에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 2018년 9월 7일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US18/49996의 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10A 및 10B 중 임의의 하나 이상에 개시된 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열의 임의의 변형에 상응하는 ITR의 변형을 갖는 ITR을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 폐쇄된-말단 DNA 벡터는 이식유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하고, 여기서 ceDNA는 캡시드 단백질이 없고, (a) 헤어핀 이차 배열에서 서열번호: 2와 동일한 수의 분자내 듀플렉스 염기쌍을 갖는 돌연변이된 우측 AAV2 ITR 또는 서열번호:51과 동일한 수의 분자내 듀플렉스 염기쌍을 갖는 돌연변이된 좌측 AAV2 ITR을 암호화하는 (바람직하게는 이러한 참조 서열과 비교한 이러한 구성에서의 임의의 AAA 또는 TTT 말단 루프의 결실을 배제하는) ceDNA-플라스미드로부터 생산되며, 및 (b)는 실시예 1의 천연 겔 및 변성 조건 하에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 ceDNA의 식별을 위한 분석을 사용하여 ceDNA로 식별된다.
ceDNA 벡터는 본 개시내용을 읽은 후 당업자에게 공지된 다수의 수단에 의해 수득가능하다. 예를 들어, 캡시드 비함유 비-바이러스성 DNA 벡터는 하기 순서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 발현 작제물 주형을 포함하는 플라스미드(본 명세서에서 "ceDNA-플라스미드"로 지칭됨)로부터 수득될 수 있다: 제1 5' 역전된 말단 반복(예를 들어, AAV ITR); 발현 카세트; 및 3' ITR(예를 들어, AAV ITR), 여기서, 상기 5' 및 3' ITR 중 적어도 하나가 변형된 ITR이거나, 또는 5' 및 3' ITR이 모두 변형될 때 서로 다른 변형을 갖고, 동일한 서열이 아니다. 제한없이, ceDNA 벡터를 생산하는데 사용된 폴리뉴클레오타이드 발현 작제물 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드 및/또는 ceDNA-배큘로바이러스일 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 이식유전자, 예를 들어 리포터 유전자 및/또는 치료 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트가 삽입될 수 있는 ITR 사이에 작동가능하게 위치된 제한 클로닝 부위(예를 들어, 서열번호: 7)를 포함한다.
예를 들어, 비-바이러스성 캡시드 비함유 DNA 벡터는 2개의 서로 다른 역전된 말단 반복(ITR) 서열 사이에 위치된 이종 유전자를 함유하는 발현 작제물(예를 들어, 플라스미드, 백미드, 배큘로바이러스 또는 통합된 세포주)로부터의 허용 숙주 세포에서 생산될 수 있다. ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되고; ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위(trs) 및 Rep 결합 부위를 포함한다. ceDNA 벡터는 바람직하게는 발현 카세트와 같은 분자의 적어도 일부에 대해 듀플렉스, 예를 들어 자가-상보적이며, 예를 들어 ceDNA는 이중 가닥 원형 분자가 아니다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 공유적으로 닫힌 말단을 가지며, 따라서 엑소 뉴클레아제 소화(예를 들어, 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III)에 대해, 예를 들어 37℃에서 1시간 이상동안 내성이 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로: 제1 아데노-연관된 바이러스(AAV) 역전된 말단 반복(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 발현 카세트) 및 제1 ITR 및 제2 ITR이 서로에 대해 비대칭인, 즉 서로 상이한 제2 AAV ITR을 포함한다. 예시적인 구현예로서, 제1 ITR은 야생형 ITR일 수 있고 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있고, 제2 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 모두 변형되었지만 상이한 서열이거나, 또는 상이한 변형을 갖거나, 동일한 변형된 ITR이 아니다. 달리 말하면, ITR은 한 ITR의 임의의 변화가 다른 ITR에 반영되지 않는다는 점에서 비대칭적이거나; 또는 대안적으로, ITR이 서로 상이하다.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 이식유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터, 전사후 조절 인자, 및 폴리아데닐화 및 종결 신호 중 하나 이상을 갖는 하기 순서로 구성된 2개의 ITR 사이에 위치된다. 일 구현예에서, 프로모터는 조절가능-유도성 또는 억제성이다. 프로모터는 이식유전자의 전사를 촉진하는 임의의 서열일 수 있다. 일 구현예에서, 프로모터는 조절가능-유도성 또는 억제성이다. 프로모터는 이식유전자의 전사를 촉진하는 임의의 서열일 수 있다. 일 구현예에서 프로모터는 CAG 프로모터(예를 들어, 서열번호: 03) 또는 그의 변이체이다. 전사후 조절 인자는 이식유전자의 발현을 조절하는 서열, 비-제한적인 예로서 이식유전자의 발현을 향상시키는 3차 구조를 생산하는 임의의 서열이다.
일반적으로, ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내의 제한 공간에 의해 부과되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는 캡슐화된 AAV 게놈과 대조적으로, 원핵생물-생산된 플라스미드 DNA 벡터에 대한 생존가능한 진핵적으로-생산된 대안을 나타낸다. 이는 조절 요소, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 이식유전자, 다중 이식유전자 등의 삽입을 허용한다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있고, 제2 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 모두 변형되었지만 상이한 서열이거나, 상이한 변형을 갖거나, 동일한 변형된 ITR이 아니다. 달리 말하면, ITR은 한 ITR의 임의의 변화가 다른 ITR에 반영되지 않는다는 점에서 비대칭적이며; 또는 대안적으로, ITR이 서로에 대해 상이하다. ceDNA 벡터에서 및 ceDNA-플라스미드를 생산하기 위해 사용하기 위한 예시적인 ITR은 2018년 9월 7일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US18/49996에 개시되어 있다.
본원의 명세서 및 실시예에서 예시된 ITR은 AAV2 ITR이지만, 당해 분야의 숙련가는 상기 언급된 바와 같이 임의의 공지된 파보바이러스, 예를 들어 데펜도바이러스로부터의 ITR, 예컨대 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ, 및 AAV-DJ8 게놈. 예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), 키메라 ITR, 또는 임의의 합성 AAV로부터의 ITR을 사용할 수 있음을 인식하고 있다. 일부 구현예에서, AAV는 온혈 동물, 예를 들어 조류(AAAV), 소(BAAV), 갯과, 말 및 양 아데노-연관된 바이러스를 감염시킬 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 B19 파보비리스(GenBank 수탁 번호: NC 000883), 마우스로부터의 미세 바이러스(MVM)(GenBank 수탁 번호 NC 001510); 거위 파보바이러스(GenBank 수탁 번호 NC 001701); 뱀 파보바이러스 1(GenBank 수탁 번호 NC 006148)로부터 유래된다.
파보바이러스 및 파보비리다에 계열의 다른 구성원은 일반적으로 Kenneth I. Berns, "파보비리다에: 바이러스 및 그들의 복제", FIELDS VIROLOGY(3d Ed. 1996)의 Chapter 69에 기재되어 있다.
당업자는 ITR 서열이 이중-가닥 홀리데이 접합부의 공통 구조를 가지며, 이는 전형적으로 T-형상화된 또는 Y-형상화된 헤어핀 구조이고(예를 들어, 도 2a 및 도 3a 참조), 여기서 각각의 ITR은 더 큰 회문성 아암(A-A')에 포매된 2개의 회문성 아암 또는 루프(B-B' 및 C-C')와 단일가닥 D 서열에 의해 형성되고, (이러한 회문성 서열의 순서는 ITR의 플립 또는 플롭 배향을 정의함), 본원에 제공된 예시적인 AAV2 ITR 서열에 기초하여 ceDNA 벡터 또는 ceDNA-플라스미드에 사용하기 위한 임의의 AAV 혈청형으로부터 상응하는 변형된 ITR 서열을 쉽게 결정할 수 있음을 알고 있다. 예를 들어, 문헌 [Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14]에 기재된 상이한 AAV 혈청형(AAV1-AAV6)으로부터의 ITR의 구조 분석 및 서열 비교를 참고한다. ITR에서의 예시적인 특정 변경 및 돌연변이는 2018년 9월 7일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US18/49996에 상세하게 기재되어 있다. 명확성을 위해, ITR과 관련하여, "변경된" 또는 "돌연변이된"은 뉴클레오타이드가 야생형, 참조, 또는 원래의 ITR 서열에 대해 삽입, 결실 및/또는 치환된 것을 나타내고, 2개의 측접하는 ITR을 갖는 ceDNA 벡터에서 다른 측접하는 ITR에 비해 변경될 수 있다. 변경 또는 돌연변이된 ITR은 조작된 ITR일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "조작된"은 인간의 손에 의해 조작된 양태를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 하나 이상의 양태, 예를 들어 이의 서열이 인간의 손으로 조작되어, 자연에 존재하는 양태와 상이한 경우 폴리펩타이드는 "조작된" 것으로 간주된다.
임의의 파보바이러스 ITR은 변형을 위한 ITR 또는 기본 ITR로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 파보바이러스는 데펜도바이러스이다. 더 바람직하게는 AAV이다. 선택된 혈청형은 혈청형의 조직 굴성에 기초할 수 있다. AAV2는 광범위한 조직 굴성을 가지며, AAV1은 우선적으로 뉴런 및 골격근을 표적으로 하고, AAV5는 뉴런, 망막 색소 상피 및 광수용체를 우선적으로 표적으로 한다. AAV6은 우선적으로 골격근 및 폐를 표적으로 한다. AAV8은 간, 골격근, 심장 및 췌장 조직을 우선적으로 표적으로 한다. AAV9는 간, 골격 및 폐 조직을 우선적으로 표적으로 한다. 일 구현예에서, 변형된 ITR은 AAV2 ITR에 기초한다. 예를 들어, 서열번호: 2 및 서열번호: 52로 구성된 그룹에서 선택된다. 이들 양태 각각의 일 구현예에서, 벡터 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 및 서열번호: 2 및 서열번호: 51로 구성된 군으로부터 선택되는 한 쌍의 ITR을 포함한다. 이들 양태 각각의 일 구현예에서, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드 또는 비-바이러스성 캡시드-비함유 DNA 벡터는 서열번호: 101 및 서열번호: 102; 서열번호: 103, 및 서열번호: 104, 서열번호: 105, 및 서열번호: 106; 서열번호: 107, 및 서열번호: 108; 서열번호: 109, 및 서열번호: 110; 서열번호: 111, 및 서열번호: 112; 서열번호: 113 및 서열번호: 114; 및 서열번호: 115 및 서열번호: 116으로 구성된 군으로부터 선택되는 한 쌍의 상이한 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 서열번호: 2, 52, 63, 64, 101~499 중 임의의 하나로부터 선택되며, 2018년 9월 7일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US18/49996에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원에 제공된 바와 같이 서열번호: 500~529로 구성되거나 본질적으로 이루어진 임의의 서열로부터 선택된 변형된 ITR을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호: 500~529로부터 선택된 임의의 서열로부터 선택된 ITR을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, ceDNA는 분자내 듀플렉스 이차 구조를 형성할 수 있다. 제1 ITR 및 비대칭 제2 ITR의 이차 구조는 야생형 ITR(예를 들어, 도 2a, 3a 및 3c 참고) 및 변형된 ITR 구조(예를 들어, 도 2b 및 3b, 3d 참고)의 맥락에서 예시된다. 이차 구조는 ceDNA 벡터를 생산하는데 사용된 플라스미드의 ITR 서열에 기초하여 추론되거나 예상된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 좌측 ITR은 야생형(wt) AAV ITR 구조에 대해 변형되거나 돌연변이되며, 우측 ITR은 야생형 AAV ITR이다. 일 구현예에서, ceDNA 벡터의 우측 ITR은 야생형 AAV ITR 구조에 대해 변형되고, 좌측 ITR은 야생형 AAV ITR이다. 이러한 구현예에서, ITR의 변형(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 AAV 게놈으로부터 유래된 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 생산될 수 있다.
본원에 사용된 ITR은 분해가능하고 분해가능하지 않을 수 있으며, ceDNA 벡터에서 사용하기 위해 선택되는 것은 AAV 서열이며, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9가 바람직하다. 분해가능한 AAV ITR은 말단 반복이 원하는 기능, 예를 들어, 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구출 등을 매개하는한 야생형 ITR 서열을 필요로 하지 않는다(예를 들어, 내인성 또는 야생형 AAV ITR 서열은 삽입, 결실, 절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있다). 전형적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되며, 예를 들어 ceDNA 벡터의 ITR 서열 둘다는 AAV2로부터 유래된다. ITR은 AAV 역전된 말단 반복으로서 기능하는 합성 서열일 수 있다. 필요하지는 않지만, ITR은 동일한 파보바이러스로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어 두 ITR 서열 모두 AAV2로부터 유래된다.
일부 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 Rep 결합 및/또는 Rep 닉킹에 대한 결함있는 ITR이다. 일 구현예에서, 결함은 야생형 감소 ITR에 비해 적어도 30%이고, 다른 구현예에서는 적어도 35%..., 50%..., 65%..., 75%..., 85%..., 90%..., 95%..., 98%..., 또는 기능 또는 그 사이의 지점이 완전히 부족하다. 숙주세포는 바이러스 캡시드 단백질을 발현하지 않으며, 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형에는 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여되어 있다. 일 구현예에서, AAV 캡시드 유전자가 결여되어 있는 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형 및 숙주세포 및 수득한 단백질은 다른 바이러스의 캡시드 유전자를 암호화하거나 발현하지 않는다. 또한, 특정 구현예에서, 핵산 분자는 또한 AAV Rep 단백질 암호화 서열이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, ITR의 구조 요소는 큰 Rep 단백질(예를 들어, Rep 78 또는 Rep 68)과 ITR의 기능적 상호작용에 관여하는 임의의 구조 요소일 수 있다. 특정 구현예에서, 구조 요소는 큰 Rep 단백질과 ITR의 상호작용에 대한 선택성을 제공하고, 즉, Rep 단백질이 ITR과 기능적으로 상호작용하는 것을 적어도 부분적으로 결정한다. 다른 구현예에서, Rep 단백질이 ITR에 결합될 때 구조 요소는 큰 Rep 단백질과 물리적으로 상호작용한다. 각각의 구조 요소는, 예를 들어 ITR의 이차 구조, ITR의 뉴클레오타이드 서열, 2개 이상의 요소 사이의 간격, 또는 이들 중 임의의 조합일 수 있다. 일 구현예에서, 구조 요소는 A 및 A' 아암, B 및 B' 아암, C 및 C' 아암, D 아암, Rep 결합 부위(RBE) 및 RBE'(즉, 유능한 RBE 서열) 및 말단 분할 부위(trs)로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 구체적으로, 구조 요소가 특정한 큰 Rep 단백질과 기능적으로 상호작용하는 능력은 구조 요소를 변형시킴으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소의 뉴클레오타이드 서열은 ITR의 야생형 서열과 비교하여 변형될 수 있다. 일 구현예에서, ITR의 구조 요소(예를 들어, A 아암, A' 아암, B 아암, B' 아암, C 아암, C' 아암, D 아암, RBE, RBE' 및 trs)가 제거되고, 상이한 파보바이러스로부터의 야생형 구조 요소로 대체될 수 있다. 예를 들어, 대체 구조는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파보바이러스(예를 들어, 로얄 파이톤 파보바이러스), 소과 파보바이러스, 염소 파보바이러스, 조류 파보바이러스, 갯과 파보바이러스, 말 파보바이러스, 새우 파보바이러스, 돼지 파보바이러스 또는 곤충 AAV로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, ITR은 AAV2 ITR일 수 있으며, A 또는 A' 아암 또는 RBE는 AAV5의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, ITR은 AAV5 ITR일 수 있고, C 또는 C' 아암, RBE 및 trs는 AAV2의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, AAV ITR은 B 및 B' 아암이 AAV2 ITR B 및 B' 아암으로 대체된 AAV5 ITR일 수 있다.
일부 구현예에서, 구조 요소의 뉴클레오타이드 서열은 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 뉴클레오타이드 또는 그 안의 임의의 범위를 변형시킴으로써) 변형되어, 변형된 구조 요소를 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 구조 요소의 구조는 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소는 스템의 높이 및/또는 루프의 뉴클레오타이드 수의 변화이다. 예를 들어, 스템의 높이는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 뉴클레오타이드 이상 또는 임의의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 스템 높이는 약 5개의 뉴클레오타이드 내지 약 9개의 뉴클레오타이드일 수 있고, Rep와 기능적으로 상호작용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 스템 높이는 약 7개의 뉴클레오타이드일 수 있고, Rep와 기능적으로 상호작용할 수 있다. 또 다른 예에서, 루프는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상의 임의의 범위를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, RBE 또는 연장된 RBE 내의 GAGY 결합 부위 또는 GAGY-관련된 결합 부위의 수는 증가 또는 감소될 수 있다. 일 예에서, RBE 또는 연장된 RBE는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이상의 GAGY 결합 부위 또는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 서열이 Rep 단백질에 결합하기에 충분하다면, 각 GAGY 결합 부위는 독립적으로 정확한 GAGY 서열 또는 GAGY와 유사한 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, (예를 들어, RBE 및 헤어핀으로 제한되지는 않는) 두 요소 사이의 간격은 큰 Rep 단백질과의 기능적 상호작용을 변경하기 위해 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)될 수 있다. 예를 들어, 간격은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개 뉴클레오타이드 또는 그 이상의 임의의 범위일 수 있다.
도 2a 및 2b는 ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 기전을 도시한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 Rep-결합 부위(RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열번호: 531) 및 말단 분할 부위(TRS; 5'-AGTT, 서열번호: 46)를 포함하는 하나 이상의 기능성 ITR 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 ITR(wt 또는 변형된 ITR)은 기능적이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA 벡터가 서로 상이하거나 비대칭인 2개의 변형된 ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 변형된 ITR은 기능적이고 적어도 하나의 변형된 ITR은 비-기능적이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터의 변형된 ITR(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내에 변형을 갖는다. 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내에 변형을 갖는 ITR의 예시적인 서열은 2018년 9월 7일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US18/49996의 표 2~9, 10A 및 10B에 열거되어 있다.
ceDNA 벡터는 시스-조절 인자의 특이적 조합을 추가로 포함하는 발현 작제물로부터 생산될 수 있다. 시스-조절 인자는 프로모터, 리보스위치, 절연체, 미르-조절가능 요소, 전사후 조절 인자, 조직- 및 세포 유형-특이적 프로모터 및 향상제를 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 이식유전자에 대한 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 추가의 성분, 예를 들어 2018년 9월 7일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US18/49996에 기재된 바와 같이, 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 조절 스위치, 또는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 사멸시킬 수 있는 킬 스위치를 포함한다.
발현 카세트는 또한 이식유전자의 발현을 증가시키기 위해 전사후 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 우드 처크 간염 바이러스(WHP) 전사후 조절 인자(WPRE)(예를 들어, 서열번호: 8)는 이식유전자의 발현을 증가시키는 데 사용된다. 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 유전자로부터의 전사후 요소 또는 B형 간염 바이러스(HBV)와 같은 다른 전사후 처리 요소가 사용될 수 있다. 분비성 서열은 이식유전자, 예를 들어 VH-02 및 VK-A26 서열, 예를 들어 서열번호: 25 및 서열번호: 26에 연결될 수 있다. 발현 카세트는 당 업계에 공지된 폴리-아데닐화 서열 또는 이의 변형, 예컨대 소과 BGHpA(예를 들어, 서열번호: 74) 또는 바이러스 SV40pA(예를 들어, 서열번호: 10), 또는 합성 서열(예를 들어, 서열번호: 27)로부터 단리된 자연 발생 서열을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 폴리A 신호 업스트림 향상제(USE) 서열을 포함할 수 있다. USE는 SV40pA 또는 이종성 폴리-A 신호와 함께 사용될 수 있다.
발현 카세트는 4000개 뉴클레오타이드, 5000개 뉴클레오타이드, 10,000개 뉴클레오타이드 또는 20,000개 뉴클레오타이드, 또는 30,000개 뉴클레오타이드, 또는 40,000개 뉴클레오타이드 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드, 또는 약 4000~10,000개 뉴클레오타이드 또는 10,000~50,000개 뉴클레오타이드, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드의 임의의 범위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 50,000개 뉴클레오타이드 길이 범위의 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 75,000개 뉴클레오타이드 길이 범위의 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 10,000개 뉴클레오타이드 길이 범위인 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 1000 내지 10,000개 뉴클레오타이드 길이 범위인 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 5,000개 뉴클레오타이드 길이 범위인 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡시드화된 AAV 벡터의 크기 제한을 갖지 않으므로, 이식유전자의 효율적인 발현을 제공하기 위해 대형 발현 카세트의 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 원핵 생물-특이적 메틸화가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 5'에서 3' 방향으로의 발현 카세트 길이는 AAV 비리온에 캡시드화되는 것으로 알려진 최대 길이보다 크다. 일부 구현예에서, 길이는 4.6 kb 이상, 5 kb 이상, 6 kb 이상, 또는 7 kb 이상이다.
도 1a~1c는 비-제한적, 예시적인 ceDNA 벡터 또는 상응하는 ceDNA 플라스미드 서열의 개략도를 나타낸다. ceDNA 벡터는 캡시드가 비함유되어 있고, 하기 순서로 플라스미드 암호화으로부터 수득될 수 있다: 제1 ITR, 발현성 이식유전자 카세트 및 제2 ITR, 여기서, 제1 및/또는 제2 ITR 서열 중 적어도 하나는 상응하는 야생형 AAV2 ITR 서열에 대해 돌연변이된다. 발현성 이식유전자 카세트는 바람직하게는 향상제/프로모터, ORF 리포터(이식유전자), 전사후 조절 인자(예를 들어, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예를 들어, BGH 폴리A) 중 하나 이상을 포함한다.
발현 카세트는 임의의 관심 이식유전자를 포함할 수 있다. 관심의 이식유전자는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 비-암호화 핵산(예를 들어, RNAi, miR 등), 바람직하게는 치료적(예를 들어, 의료, 진단 또는 수의적 용도) 또는 면역원성(예를 들어, 백신용) 폴리펩타이드를 비제한적으로 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트의 이식유전자는 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAis, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편 또는 이들의 임의의 조합을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 치료 유전자 또는 마커 단백질이다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 효능제 또는 길항제이다. 일부 구현예에서, 길항제는 모방체 또는 항체, 또는 항체 단편 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들어 중화 항체 또는 항체 단편 등이다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본 명세서에 정의된 바와 같은 전장 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 항체는 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원-결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다.
특히, 이식유전자는 예를 들어 단백질(들), 폴리펩타이드(들), 펩타이드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편 뿐만 아니라 질환, 기능 이상, 손상 및/또는 장애 중 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한 이의 변이체 및/또는 그의 활성 단편을 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 치료제(들)를 암호화할 수 있다.
플라스미드-기반 발현 벡터와 상이한 ceDNA 벡터의 많은 구조적 특징이 존재한다. ceDNA 벡터는 하기 특징들 중 하나 이상을 가질 수 있다: 최초(즉, 삽입되지 않은) 박테리아 DNA의 부족, 원핵 복제 기원의 부족, 자가-함유, 즉 이들은 Rep 결합 및 말단 분할 부위(RBS 및 TRS)를 포함하는 2개의 ITR 이외의 임의의 서열, 및 ITR 사이의 외인성 서열을 요구하지 않음, 진핵 기원(즉, 진핵 세포에서 생산됨)의, 헤어핀을 형성하는 ITR 서열의 존재, 및 박테리아-유형 DNA 메틸화의 부재 또는 실제로 포유동물 숙주에 의해 비정상적인 것으로 간주되는 임의의 다른 메틸화. 일반적으로, 본 벡터는 임의의 원핵 DNA를 함유하지 않는 것이 바람직하지만, 일부 원핵 DNA는 프로모터 또는 향상제 영역에서 비-제한적인 예로서 외인성 서열로서 삽입될 수 있는 것으로 고려된다. 플라스미드 발현 벡터로부터 ceDNA 벡터를 구별하는 또 다른 중요한 특징은 ceDNA 벡터가 폐쇄 말단을 갖는 단일-가닥 선형 DNA인 반면, 플라스미드는 항상 이중-가닥 DNA라는 것이다.
ceDNA 벡터는 바람직하게는 제한 효소 소화 검정에 의해 결정된 바와 같이 비-연속적 구조보다는 선형 및 연속적 구조를 갖는다(도 4d). 선형 및 연속적 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터보다 안정할뿐만 아니라 재조합될 가능성이 적고 돌연변이유발을 야기하는 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속적 구조에서 ceDNA 벡터가 바람직한 구현예이다. 연속적인 선형의 단일 가닥 분자내 듀플렉스 ceDNA 벡터는 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 서열없이 공유결합된 말단을 가질 수 있다. 이들 ceDNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 듀플렉스 핵산 분자인, 플라스미드(본 명세서에 기재된 ceDNA 플라스미드 포함)와 구조적으로 구별된다. 상보적인 플라스미드 가닥은 변성 후에 분리되어 2개의 핵산 분자를 생산할 수 있는 반면, 대조적으로, 상보적인 가닥을 가지면서 ceDNA 벡터는 단일 DNA 분자이고 따라서 변성되더라도 단일 분자로 유지된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 플라스미드와 달리 원핵 유형의 DNA 염기 메틸화없이 생산될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터 및 ceDNA-플라스미드는 구조(특히 선형 대 원형) 및 이들 상이한 목표물을 생산 및 정제하는데 사용된 방법의 관점 및, 또한 ceDNA-플라스미드에 대한 원핵 유형 및 ceDNA 벡터에 대한 진핵 유형의 DNA 메틸화의 관점에서 상이하다.
세포로부터 본 명세서에 기재된 DNA 벡터를 수확하고 수집하는 시간은 DNA 벡터의 고수율 생산을 달성하도록 선택되고 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수확 시간은 세포 생존율, 세포 형태, 세포 성장 등을 고려하여 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포는 배큘로바이러스 감염 후 충분한 시간 후에 수확되어, DNA 벡터를 생산하지만, 바이러스 독성 때문에 다수의 세포가 전에 죽기 시작한다. DNA-벡터는 Qiagen ENDO-FreeTM Plasmid 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법은 DNA-벡터에도 적용할 수 있다. 일반적으로, 당해 분야에 공지된 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
프로모터: 상기 기재된 것들을 포함하여 적합한 프로모터는 바이러스로부터 유래될 수 있으며, 따라서 바이러스 프로모터로 지칭될 수 있거나, 원핵 또는 진핵 유기체를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 적합한 프로모터를 사용하여 임의의 RNA 중합효소(예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 유도할 수 있다. 예시적인 프로모터는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 긴 말단 반복(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순 포진 바이러스(HSV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 즉각적인 초기 프로모터 영역(CMVIE), 루 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 소형 핵 프로모터(U6, 예를 들어, 서열번호: 18)(Miyagishi 등, Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), 향상된 U6 프로모터(예를 들어, Xia 등, Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17)), 인간 H1 프로모터(H1)(예를 들어, 서열번호: 19), CAG 프로모터, 인간 알파 1-안티팁신(HAAT) 프로모터(예를 들어, 서열번호: 21) 등을 비제한적으로 포함한다. 구현예에서, 이들 프로모터는 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 다운스트림 인트론 함유 말단에서 변경된다. 구현예에서, 뉴클레아제 절단 부위(들)를 함유하는 DNA는 프로모터 DNA에 이질적이다.
프로모터는 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함하여 발현을 추가로 향상시키고/시키거나 이의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변경시킬 수 있다. 프로모터는 또한 원위 향상제 또는 억제인자 요소를 포함할 수 있으며, 전사 개시 부위로부터 수천개 정도의 염기쌍에 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 발생하는 세포, 조직 또는 장기에 대하여, 또는 발현이 발생하는 발달 단계에 대하여, 또는 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여, 유전자 성분의 발현을 구성적으로 또는 차별적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예로는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터, 뿐만 아니라 하기에 열거된 프로모터가 포함된다. 이러한 프로모터 및/또는 향상제는 임의의 관심 유전자, 예를 들어 유전자 편집 분자, 공여체 서열, 치료적 단백질 등의 발현에 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 치료적 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 치료적 단백질 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 시미안 바이러스 40(SV40)로부터의 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 예컨대 소과 면역결핍 바이러스(BIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스(ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 즉각적인 초기 프로모터, 엡슈타인 바르 바이러스(EBV) 프로모터 또는 루(Rous) 육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 유전자, 예컨대 인간 유비퀴틴 C(hUbC), 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인으로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 조직 특이적 프로모터, 예컨대 간 특이적 프로모터, 예컨대 인간 알파 1-안티팁신(HAAT), 천연 또는 합성일 수 있다. 일 구현예에서, 간으로의 전달은 간세포 표면에 존재하는 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체를 통해 간세포에 대한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 내인성 ApoE 특이적 표적화를 사용하여 달성될 수 있다.
일 구현예에서, 사용된 프로모터는 치료적 단백질을 암호화하는 유전자의 천연 프로모터이다. 치료적 단백질을 암호화하는 각각의 유전자에 대한 프로모터 및 다른 조절 서열은 공지되어 있고, 특성규명되어 있다. 사용되는 프로모터 영역은 하나 이상의 추가의 조절 서열(예를 들어, 천연), 예를 들어 향상제(예를 들어, 서열번호: 22 및 서열번호: 23)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 프로모터의 비-제한적인 예는 예를 들어(서열번호: 3)의 CAG 프로모터, HAAT 프로모터(서열번호: 21), 인간 EF1-α 프로모터(서열번호: 6), 또는 EF1a 프로모터(서열번호: 15) 및 래트 EF1-α 프로모터(서열번호: 24)의 단편을 포함한다.
폴리아데닐화 서열: 폴리아데닐화 서열을 암호화하는 서열은 ceDNA 벡터에 포함되어 ceDNA 벡터로부터 발현된 mRNA를 안정화시키고 핵 방출 및 번역을 보조할 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 벡터는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50개 또는 그 초과의 아데닌 디뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 약 43개 뉴클레오타이드, 약 40~50개 뉴클레오타이드, 약 40~55개 뉴클레오타이드, 약 45~50개 뉴클레오타이드, 약 35~50개 뉴클레오타이드, 또는 이들 사이의 임의의 범위를 포함한다.
일부 구현예에서, ceDNA는 2개의 상이한 역전된 말단 반복 서열(ITR)(예를 들어, AAV ITR) 사이에 작동가능하게 위치된 이종성 핵산을 암호화하는 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득될 수 있으며, 여기서 ITR 중 적어도 하나는 말단 분할 부위 및 복제 단백질 결합 부위(RPS), 예를 들어 Rep 결합 부위(예를 들어, AAV2의 경우 wt AAV ITR 서열번호: 1 또는 서열번호: 2)를 포함하며, ITR 중 하나는 다른 ITR, 예를 들어 기능성 ITR에 대한 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
숙주 세포는 바이러스 캡시드 단백질을 발현하지 않으며, 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형에는 임의의 바이러스 캡시드 코딩 서열이 결여되어 있다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형은 AAV 캡시드 유전자뿐만 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자가 결여되어 있다). 또한, 특정 구현예에서, 핵산 분자에는 또한 AAV Rep 단백질 암호화 서열이 결여되어 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자에는 기능성 AAV 캡 및 AAV rep 유전자 모두 결여되어 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호: 548, 549, 551, 552, 553, 553, 554, 555, 556 및 557로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 ITR을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원(또는 2018년 9월 7일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US18/49996)에 개시된 바와 같은 조절 스위치 및 서열번호: 548, 549, 551, 552, 553, 553, 554, 555, 556 및 557로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 변형된 ITR을 포함한다.
제한없이, 본 발명자들은 상기 면책의 권리의 유보는 적어도 본 출원의 청구항 1~33 및 [00293] 및 [00294]에 기재된 단락에 적용된다고 진술한다.
본 명세서에 개시된 다양한 양태의 일부 구현예는 하기 단락들 중 임의의 단락에 의해 정의될 수 있다:
1. ceDNA 벡터를 캡슐화하는 리포좀을 포함하는, 리포좀 ceDNA 벡터로서, ceDNA 벡터는 하기를 포함하며:
시스-조절 인자를 포함하는 발현 카세트로서, 시스-조절 인자는 전사후 조절 인자 및 BGH 폴리-A 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 발현 카세트;
발현 카세트의 업스트림(5'-말단)상의 야생형 ITR로서, 서열번호: 51의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 야생형 ITR; 및
발현 카세트의 다운스트림(3'-말단)상의 변형된 ITR로서, 서열번호: 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 변형된 ITR,
상기 DNA 벡터는 원핵생물-특이적 메틸화가 결여되어 있고, AAV 캡시드 단백질에 캡시드화되지 않는, 리포좀 ceDNA 벡터.
2. 단락 1에 있어서, DNA 벡터는 선형 및 연속적 구조를 갖는, DNA 벡터.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, 전사후 조절 인자가 WHP 전사후 조절 인자(WPRE)를 포함하는, DNA 벡터.
4. 단락 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 클로닝 부위를 추가로 포함하는, DNA 벡터.
5. 단락 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는, DNA 벡터.
6. 단락 1에 있어서, 발현 카세트가 서열번호: 3, 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, DNA 벡터.
7. 단락 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 클로닝 부위 및 클로닝 부위에 삽입된 외인성 서열을 추가로 포함하는, DNA 벡터.
8. 단락 7에 있어서, 외인성 서열이 적어도 2000개 뉴클레오타이드를 포함하는, DNA 벡터.
9. 단락 7에 있어서, 외인성 서열이 단백질을 암호화하는, DNA 벡터.
10. 단락 7에 있어서, 외인성 서열이 리포터 단백질을 암호화하는, DNA 벡터.
본 명세서에 개시된 다양한 양태의 일부 구현예는 하기 단락 중 어느 하나에 의해 정의될 수 있다:
1. 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터) 및 이온화가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자로서, 상기 ceDNA 벡터는 비대칭 역전된 말단 반복 서열(비대칭 ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 비대칭 ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는, 지질 나노입자.
2. 단락 1에 있어서, ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화되고 천연 및 변성 겔 전기영동 둘다에 의해 분석될 때 상기 ceDNA 벡터는 선형 및 비-연속적 DNA 대조군과 비교하여, 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드를 나타내는, 지질 나노입자.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, 비대칭 ITR 서열 중 하나 이상이 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래된, 지질 나노입자.
4. 단락 3에 있어서, 상기 비대칭 ITR이 상이한 바이러스 혈청형으로부터 유래된, 지질 나노입자.
5. 단락 4에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 이상이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래된, 지질 나노입자.
6. 단락 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 이상이 합성인, 지질 나노입자.
7. 단락 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, ITR 중 하나 이상이 야생형 ITR이 아닌, 지질 나노입자.
8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두가 A, A', B, B', C, C', D, 및 D'로부터 선택된 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된, 지질 나노입자.
9. 단락 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, ceDNA 벡터가 하기로부터 선택된 적어도 2개의 비대칭 ITR을 포함하는, 지질 나노입자:
a. 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 및
b. 서열번호: 2 및 서열번호: 51.
10. 단락 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, ceDNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 방법으로부터 수득되는, 지질 나노입자:
a. 적어도 하나의 Rep 단백질의 존재하에, ceDNA 발현 작제물을 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 ceDNA 발현 작제물이 곤충세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 ceDNA 벡터를 암호화하는 단계; 및
b. 곤충세포로부터 ceDNA 벡터를 단리하는 단계.
11. 단락 10에 있어서, ceDNA 발현 작제물은 ceDNA 플라스미드, ceDNA 백미드 및 ceDNA 배큘로바이러스로부터 선택되는, 지질 나노입자.
12. 단락 10 또는 11에 있어서, 곤충 세포가 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는, 지질 나노입자.
13. 단락 10에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질은 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는, 지질 나노입자.
14. 단락 13에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 지질 나노입자.
15. 단락 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA 벡터는 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득되며, 여기서 벡터 폴리뉴클레오타이드는 2개의 역전된 말단 반복 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하며, 2개의 ITS는 서로 상이하며(비대칭), ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는 기능성 ITR이며, ITR 중 하나는 기능성 ITR에 대한 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하고; Rep 단백질이 존재함으로써 곤충 세포에서 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제 및 DNA 벡터의 생성이 유도되고, DNA 벡터는 하기 단계들을 포함하는 방법으로부터 수득가능한, 지질 입자:
a. 곤충세포 내에서 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에, 바이러스성 캡시드 암호화 서열이 결여되어 있는, 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 곤충 세포가 벡터의 부재하에 곤충 세포내에 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA의 생산을 포함하지 않는, 단계; 및
b. 곤충세포로부터 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA를 수확 및 단리하는 단계.
16. 단락 10 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 존재가 확인될 수 있는, 지질 입자.
17. 단락 16에 있어서, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화하고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하여, 확인될 수 있는, 지질 입자.
18. 단락 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, DNA 벡터는 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득되며, 상기 벡터 폴리뉴클레오타이드는 벡터 폴리뉴클레오타이드는 제1 및 제2 AAV2 역전된 말단 반복 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하고, ITR 중 적어도 하나는 Rep 단백질의 존재하에 곤충 세포에서 DNA의 복제를 유도하기 위해 서열번호: 1 또는 서열번호: 51의 상응하는 AAV2 야생형 ITR에 대해 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 결실, 삽입 및/또는 치환을 가지며, DNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 공정으로부터 수득가능한, 지질 입자:
a. 곤충 세포내에서 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA 벡터의 생산을 유도하는데 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안, Rep 단백질의 존재 하에서 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여된 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 곤충 세포가 바이러스성 캡시드 암호화 서열을 포함하지 않는, 단계; 및
b. 곤충 세포로부터 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA를 수확하고 단리하는 단계.
19. 단락 18에 있어서, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유 비-바이러스성 DNA의 존재가 확인될 수 있는, 지질 입자.
20. 단락 19에 있어서, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화하고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하여, 확인될 수 있는, 지질 입자.
21. 단락 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 지질 입자는 하나 이상의 비-양이온성 지질; PEG 콘주게이팅된 지질; 및 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 지질 입자.
22. 단락 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 이온화가능한 지질은 표 1에 기재된 지질인, 지질 입자.
23. 단락 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 지질 나노입자는 비-양이온성 지질을 추가로 포함하고, 여기서 비-이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 라이소레시틴, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티디카시드, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 라이소포스파티딜콜린, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택되는, 지질 입자.
24. 단락 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 지질 입자는 콘주게이팅된 지질을 추가로 포함하며, 콘주게이팅된 지질은 PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라마이드(Cer), 페길화된 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 석시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸) 부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카밤, 및 N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염으로 구성된 군으로부터 선택되는, 지질 입자.
25. 단락 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 지질 입자는 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 추가로 포함하는, 지질 입자.
26. 단락 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 하기를 포함하는, 지질 입자:
(i) 이온화가능한 지질;
(ii) 비-양이온성 지질;
(iii) 입자의 응집을 억제하는 콘주게이팅된 지질; 및
(iv) 스테롤.
27. 단락 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 하기를 포함하는, 지질 입자:
(a) 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 90 mol%의 양으로 이온화가능한 지질,
(b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 30 mol%의 양으로 비-양이온성 지질,
(c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol% 내지 약 20 mol%의 양으로 입자의 응집을 억제하는 콘주게이팅된 지질, 및
(d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 50 mol%의 양으로 스테롤.
28. 단락 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 총 지질 대 DNA 벡터(질량 또는 중량) 비는 약 10:1 내지 약 30:1인, 지질 입자.
29. 제1 지질 나노입자 및 추가의 화합물을 포함하는 조성물로서, 제1 지질 나노입자는 제1 캡시드 비함유, 비-바이러스성 벡터를 포함하고, 단락 1 내지 28 중 어느 하나의 지질 나노입자인, 조성물.
30. 단락 29에 있어서, 상기 추가의 화합물은 제2 지질 나노입자에 포함되며, 상기 제1 및 제2 지질 나노입자가 상이한, 조성물.
31. 단락 28 또는 29에 있어서, 상기 추가의 화합물은 제1 지질 나노입자에 포함되는, 조성물.
32. 단락 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가의 화합물이 치료제인, 조성물.
33. 단락 28에 있어서, 상기 추가의 화합물이 제2 캡시드 비함유, 비-바이러스성 벡터이며, 상기 제1 및 제2 캡시드 비함유, 비-바이러스성 벡터가 상이한, 조성물.
하기 실시예는 비제한적인 예시로서 제공된다.
실시예
실시예 1: ceDNA 벡터를 생산하기 위한 예시적인 방법
ceDNA 플라스미드의 작제
폴리뉴클레오타이드 작제물 주형을 사용한 ceDNA 벡터의 생산이 기재된다. 예를 들어, 본 발명의 ceDNA 벡터를 생산하는데 사용된 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드 및/또는 ceDNA-배큘로바이러스일 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 허용된 숙주세포에서, 예를 들어 Rep의 존재하에, 2개의 ITR 및 ITR 중 적어도 하나가 변형되는 발현 작제물을 갖는 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형이 복제되어 ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 두 단계: 첫째, Rep 단백질을 통한 주형 백본(예를 들어 ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드, ceDNA-배큘로바이러스 게놈 등)으로부터 주형의 절개("구제") 및 둘째, 절단된 ceDNA 벡터의 Rep 매개된 복제를 겪는다.
ceDNA 벡터를 생산하는 예시적인 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ceDNA-플라스미드로부터의 것이다. 도 1a 및 1b를 참조하면, 각각의 ceDNA-플라스미드의 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형은 ITR 서열 사이에 하기를 갖는 좌측 ITR 및 우측 돌연변이된 ITR 둘 다를 포함한다:(i) 향상제/프로모터; (ii) 이식유전자에 대한 클로닝 부위; (iii) 전사후 반응 인자(예를 들어, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절 인자(WPRE)); 및 (iv) 폴리-아데닐화 신호(예를 들어, 소과 성장 호르몬 유전자(BGHpA)로부터 유래). 독특한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(R1-R6)(도 1a 및 1b에 도시됨)가 또한 각각의 성분 사이에 도입되어, 작제물내 특정 부위로의 신규한 유전적 성분의 도입을 촉진하였다. R3(PmeI) GTTTAAAC(서열번호: 7) 및 R4(PacI) TTAATTAA(서열번호: 542) 효소 부위는 클로닝 부위로 조작되어, 이식유전자의 오픈 리딩 프레임을 도입한다. 이들 서열을 ThermoFisher Scientific으로부터 입수한 pFastBac HT B 플라스미드에 클로닝하였다.
간단히 말해서, 일련의 ceDNA 벡터는 도 4a 내지 4c에 도시된 과정을 사용하여 표 3에 도시된 ceDNA-플라스미드 작제물로부터 수득되었다. 표 5는 이식유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터의 한쪽 말단에서 복제 단백질 부위(RPS)(예를 들어, Rep 결합 부위)로서 활성인 서열을 포함하는, 각각의 성분에 대한 상응하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 수를 나타낸다. 표 3의 숫자는 각각의 성분의 서열에 해당하는 이 문서의 서열번호를 지칭한다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 제조하기 위한 작제물은 조절 스위치인 프로모터, 예를 들어 유도성 프로모터를 포함한다. 루시퍼라제 이식유전자에 작동가능하게 연결된 MND 또는 HLCR 프로모터를 포함하는 ceDNA 벡터를 제조하기 위해 다른 작제물을 사용하였다.
ceDNA-백미드의 생산:
도 4a와 관련하여, DH10Bac 반응능 세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ 반응능 세포, Thermo Fisher)를 제조사 지침에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 배큘로바이러스 셔틀 벡터 간의 재조합을 유도하여 재조합 ceDNA-백미드를 생산시켰다. 형질전환체에 대한 선택 및 백미드 및 전위효소 플라스미드의 유지를 위해, X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트에서 이. 콜라이(Φ80dlacZΔM15 마커는 백미드 벡터로부터 β-갈락토시다아제 유전자의 α-보체를 제공함)에서 청색-백색 스크리닝에 기초한 양성 선택을 스크리닝함으로써 재조합 백미드를 선택하였다. β-갈락토시드 지표 유전자를 파괴하는 전위에 의해 야기된 백색 콜로니를 선별하여 10 mL의 배지에서 배양하였다.
재조합 ceDNA-백미드를 이. 콜라이로부터 단리하고 FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포로 형질감염시켜 감염성 배큘로바이러스를 생산시켰다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크에서 50 ml의 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지(PO 바이러스를 함유함)를 세포로부터 제거하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 감염성 배큘로바이러스 입자를 세포 또는 세포 잔해로부터 분리하였다.
선택적으로, 제1 세대의 배큘로바이러스(P0)는 50 내지 500 mL의 배지에서 미접촉 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시킴으로써 증폭되었다. 세포가 직경 18~19 nm(미접촉 직경 14~15 nm), 및 ~ 4.0E + 6 세포/mL의 밀도에 도달할 때까지 세포 직경 및 생존율을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 회전식 진탕기 인큐베이터에서의 현탁 배양에서 세포를 유지시켰다. 감염 후 3 내지 8일 사이에, 배지에서 P1 배큘로바이러스 입자를 원심분리하여 세포 및 잔해물을 제거한 다음 0.45 μm 필터를 통해 여과한 후 수집하였다.
시험 작제물을 포함하는 ceDNA-배큘로바이러스를 수집하고, 배큘로바이러스의 감염성 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 2.5E + 6 세포/ml에서 4 x 20 ml Sf9 세포 배양물을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000 희석에서 P1 배큘로바이러스로 처리하고, 25~27℃에서 인큐베이팅하였다. 감염성은 세포 직경 증가율 및 세포주기 정지율, 및 4 내지 5일 동안 매일 세포 생존율의 변화에 의해 결정되었다.
도 4a와 관련하여, 도 6a에 따른 "Rep-플라스미드"는 Rep78(서열번호: 13) 또는 Rep68(서열번호: 12) 및 Rep52(서열번호: 14)를 모두 포함하는 pFASTBACTM-이중 발현 벡터(ThermoFisher)에서 생산하였다.
Rep-플라스미드를 제조사가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac™ 반응능 세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ 반응능 세포(Thermo Fisher))로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 배큘로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합이 유도되어, 재조합 백미드("Rep-백미드")를 생산하였다. 재조합 백미드는 X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트상에서, 이. 콜라이에서 청백색 스크리닝을 포함하는 양성 선택에 의해 선택되었다(Φ80dlacZΔM15 마커는 백미드 벡터로부터 β-갈락토시다아제 유전자의 α-보체를 제공한다). 단리된 백색 콜로니를 10 ml의 선별 배지(LB 액체 배지 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라사이클린)에 골라 접종하였다. 재조합 백미드(Rep-백미드)를 이. 콜라이로부터 분리하고, Rep-백미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포로 형질감염하여 감염성 배큘로바이러스를 생산했다.
Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 50 ml의 배지에서 4일 동안 배양하고, 감염성 재조합 배큘로바이러스("Rep-배큘로바이러스")를 배양물로부터 단리하였다. 선택적으로, 제1 세대의 렙-배큘로바이러스(P0)는 미접촉 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 증폭시키고, 50 내지 500 ml의 배지에서 배양하였다. 감염 후 3 내지 8일 사이에, 배지에서 P1 배큘로바이러스 입자를 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 공정에 의해 세포를 분리함으로써 수집하였다. Rep-배큘로바이러스를 수집하고 배큘로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 2.5x106 세포/mL에서 4 x 20 mL Sf9 세포 배양물을 하기 희석, 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000에서 P1 배큘로바이러스로 처리하고 인큐베이팅하였다. 감염률은 세포 직경 증가율 및 세포주기 정지율, 및 4 내지 5일 동안 매일 세포 생존율의 변화에 의해 결정되었다.
ceDNA 벡터 생산 및 특성규명
도 4b와 관련하여, (1) ceDNA-백미드 또는 ceDNA-배큘로바이러스를 함유하는 샘플, 및 (2) 상기 기재된 Rep-배큘로바이러스를 함유하는 Sf 곤충 세포 배양 배지를 Sf9 세포의 신선한 배양물에 각각 1:1000 및 1:10,000의 비율로 첨가하였다(2.5E + 6 세포/ml, 20ml). 이어서 세포를 130 rpm에서 25℃에서 배양하였다. 공동-감염 후 4~5일 후에, 세포 직경 및 생존율이 검출된다. 세포 직경이 약 70~80%의 생존율로 18~20nm에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿을 먼저 물 또는 완충제 중 적합한 부피의 수성 매질에 재현탁된다. ceDNA 벡터는 Qiagen MIDI PLUS™ 정제 프로토콜(Qiagen, 컬럼 당 0.2mg의 세포 펠릿 덩어리 처리)을 사용하여 세포로부터 단리 및 정제하였다.
Sf9 곤충 세포로부터 생산되고 정제된 ceDNA 벡터의 수득량은 260 nm에서의 UV 흡광도에 기초하여 초기에 결정하였다. UV 흡광도에 기초하여 결정된 다양한 ceDNA 벡터의 수득량은 하기 표 4에 제공된다.
ceDNA 벡터는 도 4d에 도시된 바와 같이 고유 또는 변성 조건 하에서 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인함으로써 평가될 수 있으며, 여기에서 ceDNA 벡터는 천연 겔 상에서 여러 밴드를 생성하며, 예를 들어 도 4d를 참고한다. 각 밴드는 상이한 형태, 예를 들어 단량체, 이량체 등을 갖는 벡터를 나타낼 수 있다. 변성 조건 하에서 단일 밴드의 존재 및 비변성 조건 하에서 이중 밴드(단량체 및 이량체 형태에 해당)의 존재는 ceDNA 벡터의 존재의 특징이다.
단리된 ceDNA 벡터의 구조는 a) ceDNA 벡터 내에 단일 절단 부위만 존재하고, b) 0.8% 변성 아가로스 겔(> 800 bp)에서 분별될 때 명확하게 볼 수 있을 정도로 큰 생산된 단편을 위해 선택된 제한 엔도뉴클레아제로 공-감염된 Sf9 세포(본 명세서에 기재된 바와 같이)로부터 수득된 DNA를 소화시킴으로써 추가로 분석하였다. 도 4e에 도시된 바와 같이, 비-연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터 및 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터는 반응 생성물의 크기에 의해 구별될 수 있다 - 예를 들어, 비-연속 구조를 갖는 DNA 벡터는 1kb 및 2kb 단편을 생산할 것으로 기대되는 반면, 연속 구조를 갖는 비-캡시드화된 벡터는 2kb 및 4kb 단편을 생산할 것으로 기대된다.
따라서, 정의에 의해 요구되는 바와 같이 단리된 ceDNA 벡터가 공유적으로 폐쇄-종결되는 것을 정성적 방식으로 입증하기 위해, 샘플은 단일 제한 부위를 갖는 것으로 특정 DNA 벡터 서열의 맥락에서 확인된 제한 엔도뉴클레아제로 소화되어, 바람직하게는 동일하지 않은 크기(예를 들어, 1000 bp 및 2000 bp)의 2개의 절단 생성물이 생성된다. 변성 겔(2개의 상보성 DNA 가닥을 분리하는)에서 소화 및 전기영동 후, 선형의 비-공유적으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp 크기로 분해되는 반면, 공유적으로-폐쇄된 DNA(즉, ceDNA 벡터)는 2개의 DNA 가닥이 연결되어 펼쳐지고 길이가 2배(단일 가닥이지만)이므로, 2배 크기(2000 bp 및 4000 bp)로 유지될 것이다. 게다가, DNA 벡터의 단량체성, 이량체성 및 n량체성 형태의 소화는 다량체 DNA 벡터의 말단간 연결로 인해 동일한 크기의 단편으로 모두 분해될 것이다(도 4d 참조).
도 5는 하기와 같이 ceDNA 벡터를 갖는 변성 겔의 예시적인 사진을 제공한다: 엔도뉴클레아제에 의한 소화를 갖는 (+) 또는 소화없는 (-) 작제물-1, 작제물-2, 작제물-3, 작제물-4, 작제물-5, 작제물-6, 작제물-7 및 작제물-8(모두 상기 표 3에 기재됨). 작제물-1로부터 작제물-8까지의 각각의 ceDNA 벡터는 엔도뉴클레아제 반응 후 2개의 밴드(*)를 생성하였다. 크기 마커를 기준으로 결정된 두개의 밴드 크기는 사진 하단에 제공된다. 밴드 크기는 작제물-1 내지 작제물-8을 포함하는 플라스미드로부터 생산된 각각의 ceDNA 벡터가 연속 구조를 가짐을 확인시켜 준다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "천연 겔 및 변성 조건 하에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 확인을 위한 검정"은 제한 엔도뉴클레아제 소화를 수행한 후 소화 생성물의 전기영동 평가를 수행함으로써 ceDNA의 근접성을 평가하기 위한 검정을 지칭한다. 하나의 이러한 예시적인 검정이 이어지지만, 당해 분야의 숙련가는 본 실시예에서 많은 공지된 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 벡터 길이의 약 1/3x 및 2/3x의 생성물을 생산할 관심있는 ceDNA 벡터에 대한 단일 절단 효소로 선택된다. 이것은 천연 겔과 변성 겔 둘다의 밴드를 분해한다. 변성 전에 샘플에서 완충액을 제거하는 것이 중요하다. Qiagen PCR 정리 키트 또는 탈염 "스핀 컬럼"(예를 들어, GE HEALTHCARE ILUSTRATM MICROSPINTM G-25 컬럼은 엔도뉴클레아제 분해를 위한 공지된 옵션이다. 검정은 예를 들어, i) 적합한 제한 엔도뉴클레아제(들)로 DNA를 소화시키고, 2) 예를 들어 Qiagen PCR 세정 키트에 적용하고, 증류수로 용리하고, iii) 10x 변성 용액(10x = 0.5 M NaOH, 10 mM EDTA)을 첨가하고, 10X 염료를 첨가하고, 완충하지 않고, 1 mM EDTA 및 200 mM NaOH와 함께 이전에 인큐베이팅한 0.8~1.0% 겔 상에서 4배속에 10X 변성 용액을 첨가하여 준비한 DNA 래더와 함께 분석하여, NaOH 농도가 겔 및 겔 박스에서 균일하도록 하고, 1x 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)의 존재하에 겔을 진행시키는 것을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 크기 및 원하는 결과 타이밍에 기초하여 전기영동을 진행시키기 위해 어떤 전압을 사용할지 이해할 것이다. 전기영동 후, 겔을 배수시키고 1x TBE 또는 TAE에서 중화시키고, 1x SYBR 금을 사용하여 증류수 또는 1x TBE/TAE로 옮긴다. 그런 다음 예를 들어, Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain(DMSO 중 10,000X 농축물) 및 형광등(파란색) 또는 UV(312nm)를 사용하여 밴드를 시각화할 수 있다.
생산된 ceDNA 벡터의 순도는 임의의 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 하나의 예시적이고 비-제한적인 방법으로서, ceDNA 벡터의 형광 강도를 표준과 비교함으로써 샘플의 전체 UV 흡광도에 대한 ceDNA-플라스미드의 기여를 추정할 수 있다. 예를 들어, UV 흡광도를 기준으로 4μg의 ceDNA 벡터가 젤에 장입되고, ceDNA 벡터 형광 강도가 1μg인 것으로 알려진 2 kb 밴드에 해당하는 경우 1μg의 ceDNA 벡터가 있으며, ceDNA 벡터는 총 UV 흡수물질의 25%이다. 그런 다음 겔의 밴드 강도는 밴드가 나타내는 계산된 투입에 대해 플로팅되는데, 예를 들어 총 ceDNA 벡터가 8 kb이고 절단된 비교 밴드가 2 kb인 경우 밴드 강도는 총 투입의 25%로 플롯되고, 이 경우 1.0 μg 투입의 경우 0.25 μg이다. ceDNA 벡터 플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 작성하면 회귀선 방정식을 사용하여 ceDNA 벡터 밴드의 양을 계산할 수 있으며, 이를 사용하여 ceDNA 벡터 또는 퍼센트 순도에 의해 제시된 총 투입의 퍼센트를 결정할 수 있다.
실시예 2: ceDNA 벡터는 시험관내에서 루시퍼라제 이식유전자를 발현한다
루시퍼라제 리포터 유전자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 ceDNA-플라스미드 작제물의 클로닝 부위에 도입함으로써 작제물을 생산하였다: 작제물-1, 작제물-3, 작제물-5 및 작제물-7. 루시퍼라제 암호화 서열을 포함하는 ceDNA-플라스미드(표 3에서 상기 참고)는 각각 플라스미드 작제물 1-Luc, c 플라스미드 작제물-3-Luc, 플라스미드 작제물-5-Luc 및 플라스미드 작제물 7-Luc로 명명된다.
HEK293 세포를 형질감염 제제로서 FUGENE®(Promega Corp.)를 사용하여 100 ng, 200 ng 또는 400 ng의 플라스미드 작제물 1, 3, 5 및 7로 배양하고 형질감염시켰다. 각각의 플라스미드로부터 루시퍼라제의 발현은 각각의 세포 배양에서 루시퍼라제 활성에 기초하여 결정되었고, 결과는 도 7a에 제공된다. 루시퍼라제 활성은 미처리 대조군 세포("미처리") 또는 Fugene 단독으로 처리된 세포("Fugene")로부터 검출되지 않아, 루시퍼라제 활성이 플라스미드로부터의 유전자 발현으로부터 초래되었음을 확인하였다. 도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같이, 루시퍼라제의 강력한 발현이 작제물 1 및 7로부터 검출되었다. 작제물 7로부터의 발현은 루시퍼라제 활성의 용량-의존적 증가가 검출되는 루시퍼라제를 발현하였다.
각각의 플라스미드로 형질감염된 세포의 성장 및 생존율을 또한 측정하여. 도 8a 및 도 8b에 제시하였다. 형질감염된 세포의 세포 성장 및 생존율은 상이한 작제물로 처리된 상이한 군의 세포간에 유의미하게 상이하지 않았다.
따라서, 각각의 그룹에서 측정되고 세포 성장 및 생존율에 기초하여 표준화된 루시퍼라제 활성은 표준화없이 루시퍼라제 활성과 상이하지 않았다. 작제물 1-Luc를 갖는 ceDNA-플라스미드는 정규화의 유무에 관계없이 루시퍼라제의 가장 강력한 발현을 나타냈다.
따라서, 도 7a, 7b, 8a 및 8b에 제시된 데이터는 5' 내지 3'-WT-ITR(서열번호: 51), CAG 프로모터(서열번호: 3), R3/R4 클로닝 부위(서열번호: 7), WPRE(서열번호: 8), BGHpA(서열번호: 9) 및 변형된 ITR(서열번호: 2)을 포함하는 작제물 1이 ceDNA 벡터 내에서 이식유전자의 단백질을 발현할 수 있는 ceDNA 벡터를 생산하는데 효과적임을 입증한다.
실시예 3: 지질(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA)
ceDNA를 포함하는 지질 입자는 지질(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)-부타노에이트(DLin-MC3-DMA)와 조합하여 제조 또는 제형화될 수 있으며, 본 명세서에서 "MC3"으로도 지칭되며, 하기 구조를 갖는다:
지질 DLin-MC3-DMA는 Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 하기와 같이 합성된다:
메탄설폰산 옥타데카-9,12-디에닐 에스테르의 합성: 디클로로메탄(100 mL) 중 알코올 1(26.6 g, 100 mmol)의 용액에 트리에틸아민(13.13 g, 130 mmol)을 첨가하고, 이 용액을 빙욕에서 냉각시킨다. 상기 차가운 용액에, 디클로로메탄(60 mL) 중 메실 클로라이드(12.6 g, 110 mmol)의 용액을 적가하고, 첨가 완료 후, 반응 혼합물을 주위 온도로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 반응의 완료를 나타낸다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(200 mL)으로 희석하고, 물(200 mL), 포화 NaHCO3(200 mL), 염수(100 mL) 및 건조(NaSO4)로 세척하였다. 유기 층을 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 헥산 중 0~10% Et2O를 사용하여 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔)로 정제하였다. 순수한 생성물 분획을 합치고 농축시켜 순수한 생성물 메탄설폰산 옥타데카-9,12-디에닐 에스테르를 무색 오일로서 수득한다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d 5.42-5.21 (m, 4H), 4.20 (t, 2H), 3.06 (s, 3H), 2.79 (t, 2H), 2.19-2.00 (m, 4H), 1.90-1.70 (m, 2H), 1.06-1.18 (m, 18H), 0.88 (t, 3H). 13C NMR (CDCl3) d 130.76, 130.54, 128.6, 128.4, 70.67, 37.9, 32.05, 30.12, 29.87, 29.85, 29.68, 29.65, 29.53, 27.72, 27.71, 26.15, 25.94, 23.09, 14.60. MS. C19H36O3S에 대해 계산된 분자량, 344.53.
18-브로모-옥타데카-6,9-디엔의 합성: 메실레이트(메탄설폰산 옥타데카-9,12-디에닐 에스테르, 13.44 g, 39 mmol)를 무수 에테르(500 mL)에 용해시키고, 여기에 MgBr.Et2O 복합체(30.7 g, 118 mmol)를 아르곤하에 첨가하고, 그 혼합물을 아르곤하에 26시간 동안 환류시키며, 여기서 TLC는 반응의 완료를 나타낸다. 반응 혼합물을 에테르(200 mL)로 희석하고, 빙-냉수(200 mL)를 이 혼합물에 첨가하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 1% 수성 K2CO3(100 mL), 염수(100 mL)로 세척하고, 건조시켰다(무수 Na2SO4). 유기 층의 농축은 미정제 생성물을 제공하고, 이것을 헥산 중 0~1% Et2O를 사용하여 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔)에 의해 추가로 정제하여, 생성물 18-브로모-옥타데카-6,9-디엔을 무색 오일로서 분리한다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 5.41-5.29 (m, 4H), 4.20 (d, 2H), 3.40 (t, J = 7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.88-1.00 (m, 2H), 1.46-1.27 (m, 18H), 0.88 (t, J = 3.9 Hz, 3H). 13C NMR (CDCl3) δ 130.41, 130.25, 128.26, 128.12, 34.17, 33.05, 31.75, 29.82, 29.57, 29.54, 29.39, 28.95, 28.38, 27.42, 27.40, 25.84, 22.79, 14.28.
(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올(DLin-MeOH)의 합성: 화염 건조된 500mL RB 플라스크에, 새로 활성화된 Mg 터닝(2.4 g, 100 mmol)을 첨가하고, 플라스크에는 자기 교반 막대, 첨가 깔대기 및 환류 응축기가 장착된다. 이 셋업을 탈기시키고, 아르곤으로 플러싱하고, 주사기를 통해 10 mL의 무수 에테르를 플라스크에 첨가한다. 18-브로모-옥타데카-6,9-디엔(26.5 g, 80.47 mmol)을 무수 에테르(50 mL)에 용해시키고, 첨가 깔때기에 첨가하였다. 이 에테르 용액 약 5 mL를 격렬하게 교반하면서 Mg 터닝에 첨가한다. 발열 반응이 관찰되고(그리그나드(Grignard) 시약 형성을 확인/촉진하기 위해, 5 mg의 요오드를 첨가하고, 즉각적인 탈색이 관찰되어, 그리그나드 시약의 형성을 확인함), 에테르가 환류를 시작한다. 플라스크를 물에서 냉각시킴으로써 반응을 완만한 환류하에 유지하면서 브롬화물의 나머지 용액을 적가한다. 첨가 완료 후, 반응 혼합물을 35℃에서 1시간 동안 유지한 다음 빙조에서 냉각시켰다. 에틸 포르메이트(2.68 g, 36.2 mmol)를 무수 에테르(40 mL)에 용해시키고, 첨가 깔때기로 옮기고, 교반하면서 반응 혼합물에 적가한다. 발열 반응이 관찰되고, 반응 혼합물이 환류를 시작했다. 반응 개시 후, 포름산염의 나머지 에테르 용액을 스트림으로서 신속하게 첨가하고, 반응 혼합물을 추가 1시간 동안 주위 온도에서 교반한다. 10 mL의 아세톤을 적가한 다음, 빙수(60 mL)를 첨가하여 반응을 켄칭시킨다. 반응 혼합물을 용액이 균질해지고 층이 분리될 때까지 수성 H2SO4(10 부피%, 300 mL)로 처리한다. 수성 상을 에테르(2x100 mL)로 추출한다. 합한 에테르 층을 건조시키고(Na2SO4), 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 밤새 실온에서 이를 메탄올(200 mL) 중 1 g의 나트륨으로 처리하였다. 반응이 완료되면, 대부분의 용매가 증발된다. 생성된 혼합물을 150 mL의 5% 염산 용액에 부었다. 수성 상을 에테르(2 x 150 mL)로 추출한다. 합한 에테르 추출물을 물(2 x 100 mL), 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증발시켜 미정제 생성물을 수득하였으며, 이를 컬럼(실리카 겔, 헥산 중 0~10% 에테르) 크로마토그래피로 정제하고, 순수한 생성물 분획을 증발시켜 생성물 DLin-MeOH를 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 5.47 - 5.24 (m, 8H), 3.56 (dd, J = 6.8, 4.2, 1H), 2.85 - 2.66 (m, 4H), 2.12 - 1.91 (m, 9H), 1.50 - 1.17 (m, 46H), 0.98 - 0.76 (m, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 130.41, 130.37, 128.18, 128.15, 77.54, 77.22, 76.91, 72.25, 37.73, 31.75, 29.94, 29.89, 29.83, 29.73, 29.58, 29.53, 27.46, 27.43, 25.89, 25.86, 22.80, 14.30.
6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트( MC3 )의 합성: DLin-MeOH(144 g, 272 mmol)를 1 L의 디클로로메탄에 용해시키고, 여기에 디메틸아미노부티르산 7(55 g, 328 mmol)의 하이드로클로라이드 염을 첨가한 후 디이소프로필에틸아민(70 mL) 및 DMAP(4 g)을 첨가한다. 주위 온도에서 5분 동안 교반한 후, EDCI(80 g, 417 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반한 후, TLC(실리카 겔, CH2Cl2 중의 5% MeOH) 분석은 출발 알콜의 완전한 소실을 나타낸다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(500 mL)로 희석하고 포화 NaHCO3(400 mL), 물(400 mL) 및 염수(500 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공에서 제거한다. 이렇게 얻어진 미정제 생성물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피[2.5 Kg 실리카 겔, 하기 용리액을 사용함: i) DCM 중 6 L의 0.1% NEt3으로 패킹된 컬럼; 장입 후, ii) DCM 중 4 L의 0.1% NEt3; iii) DCM 중 16 L의 2% MeOH - 98%의 0.1% NEt3; iv) DCM 중 4 L의 2.5% MeOH - 97.5%의 0.1% Net3; v) DCM 중 12 L의 3% MeOH - 97%의 0.1% NEt3]로 순수한 생성물 MC3을 무색 오일로서 단리시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.46 - 5.23 (m, 8H), 4.93 - 4.77 (m, 1H), 2.83 - 2.66 (m, 4H), 2.37 - 2.22 (m, 4H), 2.20 (s, 6H), 2.10 - 1.96 (m, 9H), 1.85 - 1.69 (m, 2H), 1.49 (d, J = 5.4, 4H), 1.39 - 1.15 (m, 39H), 0.95 - 0.75 (m, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 173.56, 130.38, 130.33, 128.17, 128.14, 77.54, 77.22, 76.90, 74.44, 59.17, 45.64, 34.36, 32.69, 31.73, 29.87, 29.76, 29.74, 29.70, 29.56, 29.50, 27.44, 27.41, 25.84, 25.55, 23.38, 22.78, 14.27. EI-MS (+ve): C43H79NO2 (M + H)+의 경우 MW 계산: 642.6.
실시예 4: 지질 ATX-002
ceDNA를 포함하는 지질 입자는 하기 구조를 갖는 지질 ATX-002와 조합하여 제조되거나 제형화될 수 있다:
지질 ATX-002는 WO2015/074085에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 하기와 같이 합성된다:
메틸 8-브로모옥타노에이트의 합성: N2 분위기 하에서, 8-브로모옥탄산(60 gm, 1 당량)을 400 ml의 건조 메탄올에 용해시킨다. 진한 H2SO4 10 방울을 적가하고, 반응 혼합물을 환류 하에서 3시간 동안 교반하였다.
반응은 완료될 때까지 박막 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터링한다. 용매는 진공 상태에서 완전히 제거된다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물로 세척하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 재-추출한다. 총 유기 층을 포화 NaHCO3 용액으로 세척하였다. 유기 층을 물로 다시 세척하고 마지막으로 염수로 세척하였다. 생성물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 농축시켰다.
디메틸 8,8'-(벤자네디일)디옥타노에이트의 합성: 건조 K2CO3(104.7 gm, 6 당량)을 취하여 N2 하에 건조 디메틸포름아미드에 첨가한다. 디메틸포름아미드 중 벤질 아민(13.54 gm, 1 당량)을 천천히 첨가한다. 이어서 디메틸포름아미드에 용해된 메틸 8-브로모옥타노에이트(60 gm, 2 당량)를 실온에서 첨가한다. 반응 혼합물을 80℃로 가열하고, 교반하면서 반응을 36시간 동안 유지시켰다.
반응은 완료될 때까지 박막 크로마토그래피에 의해 모니터링한다. 반응 생성물을 실온으로 냉각시키고 물을 첨가한다. 화합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 재-추출한다. 총 유기 층을 물 및 마지막으로 염수 용액으로 세척한다. 생성물을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다.
반응 생성물을 클로로포름 중 3% 메탄올에서 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제한다. 클로로포름 중의 10% 메탄올의 TLC 시스템을 사용하여, 생성물을 Rf:0.8로 이동시키고, 닌하이드린에서 탄화시켜 시각화한다. 화합물은 연갈색 액체이다. 구조는 1H-NMR에 의해 확인한다.
디메틸 8,8'-아자네디일디옥타노에이트의 합성: 디메틸 8,8'-(벤자네디일)디옥타노에이트(3.5 gm, 1 당량)를 수소화 유리 용기로 옮기고, 90 ml의 에탄올을 첨가한 후 10% Pd/C(700mg)를 첨가한다. 반응 혼합물을 파르-쉐이커 장치에서 50 psi H2 대기압하에 실온에서 2시간 동안 진탕시킨다. 반응 생성물을 셀라이트를 통해 여과하고, 뜨거운 에틸 아세테이트로 세척한다. 여액을 진공하에 농축시킨다.
디메틸 8,8'-((tert부톡시카보닐)아자네딜)디옥타노에이트의 합성: 디메틸 8,8'-아자네디일-디옥타노에이트(32 gm, 1 당량)를 건조 DCM(700 ml)에 옮기고, 건조 Et3N(9 gm, 4 당량)을 반응물에 첨가하고 0℃로 냉각시킨다. DCM에 희석된 Boc 무수물(31.3 gm, 1.5 당량)을 상기 반응에 적가한다. 첨가가 완료된 후, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한다.
반응을 물로 켄칭하고 DCM 층을 분리한다. 수상을 DCM으로 재-추출하고 합한 DCM 층을 염수 용액으로 세척하고, Na2SO4로 건조시킨다. 농축 후, 미정제 화합물이 수집된다. 미정제 반응 생성물을 헥산 중 0~12% 에틸 아세테이트에서 박막 컬럼 크로마토그래피로 정제한다. 단일 생성물은 닌하이드린으로 탄화시키면서 0.5의 Rf를 갖는 헥산 중 20% 에틸 아세테이트에서 박막 크로마토그래피에 의해 이동한다.
8,8'-((tert부톡시카보닐)아자네디일)디옥탄산의 합성: 디메틸 8,8'-((tert부톡시-카보닐)아자네딜) 디옥타노에이트(21 gm, 1 당량)를 건조 THF(200ml)로 옮겼다. 6N 수산화 나트륨 수용액(175 ml)을 실온에서 첨가한다. 실온에서 밤새 교반하면서 반응을 유지시킨다.
반응물을 25℃에서 진공하에 증발시켜, THF를 제거한다. 반응 생성물을 5N HCl로 산성화시킨다. 에틸 아세테이트를 수성 층에 첨가한다. 분리된 유기층을 물로 세척하고, 수층을 에틸 아세테이트로 재-추출하였다. 합한 유기 층을 염수 용액으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용액을 농축하여, 미정제 생성물을 제공한다.
디((Z)-논-2-엔-1-일) 8,8'((tert부톡시카보닐)아자네디일)의 합성: 8,8'-((tert부톡시카보닐)아자네디일)디옥탄산(18 gm, 1 당량)을 건조 DCM(150ml)에 용해시킨다. HATU(26.15 gm, 2.1 당량)를 이 용액에 첨가한다. D-이소프로필에틸아민(14.81 gm, 3.5 당량)을 실온에서 반응 혼합물에 천천히 첨가한다. 내부 온도가 40℃로 상승하고, 담황색 용액이 형성된다. DMAP(400 mg, 0.1 당량)을 반응 혼합물에 첨가한 후 건조 DCM 중 시스-2-노넨-1-올 용액(9.31 gm, 2 당량)을 첨가한다. 반응물이 갈색으로 변한다. 반응물을 실온에서 5시간 동안 교반한다.
반응은 완료시 박막 크로마토그래피에 의해 확인한다. 물을 반응 생성물에 첨가하고, 이를 DCM으로 추출한다. DCM 층을 물로 세척한 다음 염수 용액으로 세척한다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켜 미정제 화합물을 수득한다.
ATX-002의 합성: 디((Z)-논-2-엔-1-일) 8,8'((tert부톡시카보닐) 아자네디일) 디옥타노에이트(13.85 mmol, 9 그램)를 건조 DCM(150 ml)에 용해시킨다. 0℃에서 TFA를 첨가하여, 반응을 개시한다. 반응 온도를 교반하면서 30분 동안 실온으로 천천히 가온시켰다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료되었음을 나타낸다. 반응 생성물을 40℃에서 진공하에 농축시키고 미정제 잔여물을 DCM으로 희석하고, 10% NaHCO3 용액으로 세척한다. 수성 층을 DCM으로 재-추출하고, 합한 유기 층을 염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시킨다. 수집된 미정제 생성물을 질소 가스하에 건조 DCM(85 ml)에 용해시킨다. 트리포스겐을 첨가하고 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, Et3N을 적가한다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반한다. 이 박막 크로마토그래피는 반응이 완료되었음을 나타낸다. N2 하에서 증류에 의해 반응 물질로부터 DCM 용매를 제거한다. 반응 생성물을 0℃로 냉각시키고, DCM(50 ml)으로 희석하고, 2-(디메틸아미노)에탄티올 HCl(0.063 mol, 8.3 g)을 첨가한 후, Et3N(건조)을 첨가한다. 이어서, 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반한다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료되었음을 나타낸다. 반응 생성물을 0.3M HCl 용액(75 ml)으로 희석하고, 유기 층을 분리한다. 수성 층을 DCM으로 재-추출하고, 합한 유기 층을 10% K2CO3 수용액(75 ml)으로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨다. 용매의 농축은 미정제 생성물을 제공한다. 미정제 화합물을 3% MeOH/DCM을 사용하여 실리카 겔 컬럼(100~200 메시)으로 정제한다.
실시예 5:(13Z,16Z)-
N,N
-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)
ceDNA를 포함하는 지질 입자는 하기 구조를 갖는 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)과 조합하여 제조하거나 제형화할 수 있다:
화합물 32는 WO2012/040184에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 하기와 같이 합성된다:
α,β- 불포화 아미드(vii)의 합성:
실릴 아미드 피터슨(Peterson) 시약(3.1 g, 16.7 mmol)을 THF(35mL)에 용해시키고, -63℃로 냉각시킨다. 이 용액에 nBuLi(16.7 mmol, 6.7 mL의 2.5M 용액)를 첨가한다. 반응물을 30분 동안 주위 온도로 가온시킨다. 케톤(iii)(5.0 g, 11.9 mmol)을 제2 플라스크에서 THF(25mL)에 용해시켰다. 온도를 -60℃ 내지 -40℃로 유지하면서 케톤 용액을 30분에 걸쳐 피터슨 시약으로 옮겼다. 반응물을 1시간 동안 -40℃로 가온한 다음, 30분 동안 0℃로 가온하였다. 반응을 중탄산 나트륨으로 켄칭하고, 추가의 물로 희석하고, 물/헥산 사이에 분배시켰다. 유기물을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공에서 증발시켰다. 플래시 크로마토그래피(0~40% MTBE/헥산)에 의한 정제로 α,β-불포화 아미드(vii)를 제공한다. 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 5.75 (s, 1H), 5.36 (m, 4H), 3.01 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 2.78 (t, 2H), 2.28 (t, 2H), 2.05 (m, 6H), 1.35 (m, 34H), 0.89 (m, 6H).
α,β-불포화 아미드(vii)(1 g, 2.1 mmol) 및 LS-셀렉트라이드(4.1 mmol, 4.1 mL의 1M 용액)를 밀봉된 튜브에서 합하고, 24시간 동안 60℃로 가열한다. 반응물을 주위 온도로 냉각시키고, 염화 암모늄 용액과 헵탄 사이에 분배시킨다. 유기물을 황산나트륨상에서 건조시키고, 여과하고 진공에서 증발시켜 아미드(viii)를 수득하였다. 이 중간체는 다음 반응 미정제 물질로 직접 운반된다.
α,β- 불포화 아미드(vii)의 대안적인 콘주게이트 감소는 구리 수소화물 환원의 사용을 포함한다.
[5L RB에서, 구리 촉매(9.77 g, 17.13 mmol)를 질소 하에서 톨루엔(1713 ml)에 용해한다. 여기에 Aldrich제 PMHS(304 ml, 1371 mmol)를 단일 부분으로 첨가한다. 반응물을 5분 동안 숙성시킨다. 그 용액에 α,β- 불포화 아미드(vii)(167.16 g, 343 mmol)를 첨가한다. 이어서, 이 혼합물에 주사기 펌프를 통해 3시간에 걸쳐 t-아밀 알코올(113 ml, 1028 mmol)을 첨가한다. 첨가가 완료된 후, 그 용액에 약 1700 mL 20% NH4OH를 첨가하여 소량으로 반응시킨다. 주의: 켄칭 시작시 격렬한 발포 및 기포가 발생하며 면밀히 모니터링하고 수산화 암모늄을 소량씩 천천히 첨가해야 한다. 반응물을 물과 헥산 사이에 분배시킨다. 셀 라이트를 통해 유기물을 여과하고 진공에서 증발시킨다. 생성된 고무 고체 물질을 헥산 중의 기계식 교반기를 사용하여 분쇄하여, 작은 미립자를 수득한 다음 여과하고 헥산으로 세척한다. 이어서 유기물을 진공에서 증발시키고 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 0~15% 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여 원하는 아미드(viii)를 수득하였다. LC/MS(M+H)=490.7.
화합물 32의 합성: 아미드(viii)(2.85 g, 5.8 mmol)의 용액에 리튬 알루미늄 하이드라이드(8.7 mmol, 8.7 mL의 1M 용액)를 첨가한다. 반응물을 주위 온도에서 10분 동안 교반한 다음, 황산나트륨 십수화물 용액을 천천히 첨가하여 켄칭시킨다. 고체를 여과하고, THF로 세척하고, 여액을 진공에서 증발시켰다. 미정제 혼합물을 역상 분취 크로마토그래피(C8 컬럼)로 정제하여 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)을 오일로서 제공한다. HRMS(M + H)는 476.5190을 계산했다. HRMS (M+H)는 476.5190으로 계산됨. 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 5.37 (m, 4H), 2.78 (t, 2H), 2.42 (m, 8H), 2.05 (q, 4H), 1.28 (m, 41H), 0.89 (m, 6H).
실시예 6: 화합물 6 및 22
ceDNA를 포함하는 지질 입자는 하기 구조를 갖는 화합물 6 또는 22와 조합하여 제조되거나 제형화될 수 있다:
화합물 6 및 22는 WO2015/199952에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 화합물 6 및 22는 하기와 같이 합성되었다:
화합물 6의 합성: 염화 메틸렌(80 mL) 중 노난-1,9-디올(12.6 g) 용액을 2-헥실데칸 산(10.0 g), DCC(8.7 g) 및 DMAP(5.7g)로 처리한다. 용액을 2시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 여과하고 용매를 제거한다. 잔류물을 가온한 헥산(250 mL)에 용해시키고 결정화시킨다. 용액을 여과하고 용매를 제거한다. 잔류물을 염화 메틸렌에 용해시키고 묽은 염산으로 세척하였다. 유기 분획을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 용매를 제거한다. 잔류물을 용리제로서 0~12% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카 겔 칼럼(75 g)으로 통과시켜, 오일로서 9-(2'-헥실데카노일옥시)노난-1-올을 수득한다.
생성물을 염화 메틸렌(60mL)에 용해시키고 피리디늄 클로로크로메이트(6.4g)로 4시간 동안 처리한다. 디에틸 에테르(200 mL)를 첨가하고 상청액을 실리카 겔 베드를 통해 여과한다. 용매를 여액으로부터 제거하고, 생성된 오일을 에틸 아세테이트/헥산(0~12%) 구배를 사용하여 실리카 겔(75 g) 컬럼으로 통과시켜, 오일로서 9-(2'-에틸헥사노일옥시)노난알을 수득한다.
염화 메틸렌(20 mL) 중 미정제 생성물(6.1 g), 아세트산(0.34 g) 및 2-N,N-디메틸아미노에틸아민(0.46 g)의 용액을 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(2.9 g)로 2시간 동안 처리한다. 용액을 염화 메틸렌으로 희석하고, 수성 수산화 나트륨으로 세척한 다음, 물로 세척한다. 유기상을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 용매를 제거한다. 잔류물을 메탄올/염화 메틸렌(0~8%) 구배를 사용하여 실리카 겔(75 g) 컬럼에 통과시킨 후, 염화 메틸렌/아세트산/메탄올 구배를 사용하여 제2 컬럼(20 g)을 통과시킨다. 정제된 분획을 염화 메틸렌에 용해시키고, 묽은 수산화 나트륨 수용액으로 세척하고, 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 용매를 제거하여 원하는 생성물을 무색 오일로서 수득한다.
화합물 22의 합성: 단계 1에서, DCM(80 mL) 중 6-브로모헥산산(20 mmol, 3.901 g), 2-헥실-1-데칸올(1.8 당량, 36 mmol, 8.72 g) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP 0.5 당량, 10 mmol, 1.22 g)의 용액에 DCC(1.1 당량, 22 mmol, 4.54 g)를 첨가한다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한다. 침전물을 여과로 폐기한다. 여액을 농축시킨다. 잔류물을 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배 혼합물(0~2%)로 용리하는 실리카 겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제한다. 이것은 원하는 생성물을 무색 오일로서 제공한다.
단계 2에서, 응축기가 장착된 250 mL 플라스크에서 아세토니트릴(70 mL) 중 단계 1로부터의 브로마이드 혼합물(1.34 당량, 7.88 g, 18.8 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(1.96 당량, 27.48 mmol, 4.78mL) 및 N,N-디메틸에틸렌디아민(1 당량, 14.02 mmol, 1.236 g, 1.531 mL)의 혼합물을 79℃(오일 조)에서 16시간 동안 가열한다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 농축시킨다. 잔류물을 에틸 아세테이트 및 헥산(1:9) 및 물의 혼합물로 취한다. 상을 분리하고, 물(100 mL) 및 염수로 세척한다. 이어서 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시킨다(8.7 g 오일). 미정제물(8.7 g 오일)을 실리카 겔상에서 컬럼 크로마토그래피(클로로포름 중 0~3% MeOH)로 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 합치고 농축시킨다. 잔류물을 1 mL의 헥산에 용해시키고 실리카 겔 층(3~4 mm, 8 mL의 헥산으로 세척)을 통해 여과한다. 여액을 Ar의 스트림으로 블로잉하여 건조시키고, 진공에서 밤새 잘 건조시킨다. 원하는 생성물은 무색 오일로서 수득된다. 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 3.96 (d, 5.8 Hz, 4H), 2.55-2.50 (m, 2H), 2.43-2.39 (m, 4H), 3.37-3.32 (m, 2H), 2.30 (t, 7.5 Hz, 4H), 2.23 (s, 6H), 1.63 (퀸텟-유사, 7.6 Hz, 6H), 1.48-1.40 (m, 4H), 1.34-1.20 (52H), 0.88 (t-like, 6.8 Hz, 12H).
실시예 7: 지질 제형의 제조
지질 나노입자(LNP)는 대략 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 ceDNA 중량비로 제조될 수 있다. 간단히 말하면, 이온화가능한 지질(예를 들어, MC3, ATX-002, 화합물 6, 화합물 22, 화학식 (A') 또는 (A")의 화합물, 또는 화학식 (B'), (B') 또는 (B")의 화합물, 비-양이온성 지질(예를 들어, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)), 막 무결성을 제공하는 성분(예컨대, 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤) 및 콘주게이팅된 지질 분자(예컨대, PEG-지질, 예를 들어 평균 PEG 분자량이 2000인 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤("PEG-DMG"))는 50:10:38.5:1.5의 몰비로 알코올(예를 들어, 에탄올)에 용해된다. ceDNA는 완충 용액에서 원하는 농도로 희석된다. 예를 들어, ceDNA는 아세트산 나트륨, 아세트산 나트륨 및 염화 마그네슘, 시트레이트, 말산 또는 말산 및 염화나트륨을 포함하는 완충 용액에서 0.1 mg/ml 내지 0.25 mg/ml의 농도로 희석될 수 있다. 일 예에서, ceDNA는 pH 4의 10 내지 50 mM 시트레이트 완충액에서 0.2 mg/mL로 희석된다. 알콜성 지질 용액은 예를 들어 시린지 펌프 또는 충돌 제트 믹서를 사용하여 10 ml/분 초과의 총 유량으로 약 1:5 내지 1:3(vol/vol)의 비율로 ceDNA 수용액과 혼합한다. 일 예에서, 알콜성 지질 용액을 12 ml/분의 유량으로 약 1:3(vol/vol)의 비율로 ceDNA 수용액과 혼합한다. 알코올을 제거하고 투석에 의해 완충액을 PBS로 대체한다. 대안적으로, 완충제는 원심 튜브를 사용하여 PBS로 대체될 수 있다. 알콜 제거 및 동시 완충제 교환은 예를 들어 투석 또는 접선 유동 여과에 의해 달성될 수 있다. 수득된 지질 나노입자를 추가 사용 전에 0.2 μm 공극 멸균 필터를 통해 여과한다.
실시예 8: 지질 입자 제형의 분석
지질 나노입자 입자 크기는 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, UK)를 사용하여 준-탄성 광 산란에 의해 결정될 수 있으며, 직경은 대략 55~95 nm 또는 대략 70~90 nm이다.
제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관될 수 있다(Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176(2010), 둘 다 그 전문이 참조로 포함됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 각각의 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광에 기초한 분석을 사용하여 지질 나노입자에서 결정된다. 0.4 mM의 총 지질 농도의 PBS 중의 양이온성 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-지질(50/10/38.5/1.5 mol%)을 포함하는 지질 나노입자는 본원 및 다른 곳에 기재된 인라인 공정을 사용하여 제조될 수 있다. TNS는 증류수 중 100 μM 스톡 용액으로 제조될 수 있다. 소포는 pH가 2.5 내지 11의 범위인, 10 mM HEPES, 10 mM MES, 10 mM 암모늄 아세테이트, 130 mM NaCl을 함유하는 2 mL의 완충 용액에서 24 μM 지질로 희석될 수 있다. TNS 용액의 분취량을 첨가하여, 1 μM의 최종 농도를 제공하고, 다음 보르텍스 혼합 형광 강도는 321 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 SLM Aminco 시리즈 2 발광 분광광도계에서 실온에서 측정된다. 시그모이드 베스트핏(sigmoidal best fit) 분석을 형광 데이터에 적용할 수 있으며, pKa는 pH가 최대 형광 세기의 절반으로 나타나는 pH로 측정된다.
지질 입자에서의 ceDNA의 캡슐화는 Oligreen® 분석에 의해 결정될 수 있다. Oligreen®은 용액 중 올리고뉴클레오타이드 및 단일-가닥 DNA 또는 RNA를 정량화하기 위한 초-민감성 형광 핵산 스테인이다(Invitrogen Corporation으로부터 입수가능함; Carlsbad, CA). 대안으로 PicoGreen®을 사용할 수 있다. 간단히 말해서, 캡슐화는 핵산과 관련될 때 형광이 강화된 염료를 사용하는 막-불투과성 형광 염료 배제 분석을 수행함으로써 결정될 수 있다. 캡슐화는 염료를 지질 입자 제형에 첨가하고, 생성된 형광을 측정하고, 소량의 비-이온성 제제를 첨가할 때 관찰된 형광과 비교함으로써 결정된다. 지질 이중층의 제제-매개 파괴는 캡슐화된 ceDNA를 방출하여 막-불투과성 염료와 상호작용할 수 있게 한다. ceDNA의 캡슐화는 E =(I0-I)/I0으로 계산될 수 있으며, 여기서/및 I0은 제제 첨가 전후의 형광 강도를 나타낸다.
꼬리 정맥 주사를 통한 투여 후 4시간후에 간에서의 루시퍼라제 발현을 측정함으로써 상대 활성을 결정할 수 있다. 활성은 0.3 및 1.0 mg ceDNA/kg의 용량으로 비교되고 투여 후 4시간후에 측정된 루시퍼라제(ng)/간(g)으로 표현된다.
실시예 9: 예시적인 ceDNA-LNP의 평가
MC3, DSPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2000(몰비 50:10:38.5:1.5)을 포함하는 지질 용액을 사용하여, 예시적인 ceDNA를 포함하는 지질 나노입자를 다양한 N/P 비율(예를 들어, 3, 4, 5 및 6)로 제조하였다. 아세트산 나트륨, 아세트산 나트륨 및 염화 마그네슘, 시트레이트, 말산 또는 말산 및 염화나트륨과 같은 염을 포함하는 완충 용액 중의 ceDNA 벡터의 수용액을 제조하였다. 지질 용액 및 ceDNA 용액을 1:3(v/v)의 지질 대 eDNA 비율로 총 유량 12 ml/분으로 NanoAssembler에서 사내 과정을 사용하여 혼합하였다.
특성규명
지질 나노입자 크기 및 지질 나노입자로의 ceDNA 캡슐화를 측정하였다. 동적 광 산란(ZEN3600, Malvern Instruments)에 의해 입자 크기를 측정하였다. 캡슐화 효율은 피코 그린(Thermo Scientific)을 LNP 슬러리(C유리)에 첨가할 때 형광을 측정하고, 이 값을 1% 트리톤 X-100(C전체)에 의한 LNP의 용해시 수득된 총 ceDNA 함량과 비교함으로써 캡슐화되지 않은 ceDNA 함량을 결정함으로써 계산되었으며, 여기서 % 캡슐화 = (C전체-C유리)/C전체 × 100이다. 결과는 도 9~11에 도시되어 있다.
엔도솜 탈출 분석
LNP로부터의 ceDNA의 캡슐화 및 방출에 대한 혈청 및 BSA의 효과를 측정하였다. DOPS:DOPC:DOPE(몰비 1:1:2)를 클로로포름에서 혼합한 후 진공에서 용매를 증발시켜 음이온성 리포좀을 모방하는 엔도솜을 제조하였다. 건조된 지질 필름을 짧은 초음파처리로 DPBS에 재현탁시킨 후, 0.45 μm 주사기 파일러를 통해 여과하여 음이온성 리포좀을 형성하였다.
ceDNA 및 BSA 또는 혈청을 함유하는 LNP를 동일한 부피로 함께 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 음이온성 리포좀을 pH 7.5 또는 6.0에서 DPBS 중 원하는 음이온성/양이온성 지질 몰비로 LNP-BSA 또는 혈청 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 생성된 조합물을 추가 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 음이온성 리포좀 대신에 동일한 부피의 DPBS를 LNP-BSA 또는 혈청 혼합물에 첨가하였다. pH 7.5 또는 pH 6.0에서 상이한 처리를 갖는 유리 ceDNA는 피코그린(Thermo Scientific)을 LNP 슬러리(C유리)에 첨가할 때 형광을 측정하고 이 값을 1% 트리톤 X-100(C전체)에 의한 LNP의 용해시 수득된 총 ceDNA 함량과 비교함으로써 캡슐화되지 않은 ceDNA 함량을 결정함으로써 계산되었으며, 여기서 % 유리 = C유리/C전체 × 100이다. 음이온성 리포좀과 함께 배양한 후 방출된 % ceDNA는 하기 식에 기초하여 계산하였다:
방출된 ceDNA(%) = % 유리 ceDNA음이온성 리포좀과 혼합됨 - % 유리 ceDNADPBS와 혼합됨
결과는 도 12~15에 도시되고, 표 5에 요약되어 있다.
ApoE 결합
지질 나노입자의 ApoE에 대한 결합을 측정하였다. LNP(10 ㎍/mL)를 1x DPBS 중 동일한 부피의 재조합 ApoE3(500 ㎍/mL)와 함께 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, LNP 샘플을 1x DPBS를 사용하여 10배 희석하고, 하기 조건에 따라 AKTA pure 150(GE Healthcare)에서 헤파린 세파로스 크로마토그래피로 분석하였다:
결과는 도 16에 도시되어 있다.
HEK293 발현
지질 나노입자로 캡슐화된 ceDNA의 발현을 다음과 같이 분석하였다.
HEK293 세포를 10% 소태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM + GlutaMAX™ 배양 배지(Thermo Scientific)에서 5% CO2로 37℃에서 유지시켰다. 형질감염 전날에 세포를 30,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 리포펙타민(Lipofectamine)™ 3000(Thermo Scientific) 제조사의 프로토콜에 따라 100ng/웰의 대조군 ceDNA를 형질감염시키기 위해 형질감염 시약을 사용하였다. 대조군 ceDNA를 Opti-MEM™(Thermo Scientific)에 희석시키고, P3000™ 시약을 첨가하였다. 이어서, 리포펙타민™ 3000을 Opti-MEM™에서 최종 농도 3%로 희석하였다. 희석된 리포펙타민™ 3000을 1:1 비율로 희석된 ceDNA에 첨가하고, 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 원하는 양의 ceDNA-지질 복합체 또는 LNP를 세포를 함유하는 각각의 웰에 직접 첨가하였다. 세포를 72시간 동안 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. HEK293-조건화된 배지에서 분비된 인자 IX의 발현 수준은 제조사의 지시에 따라 VisuLize FIX 항원 ELISA 키트(Affinity Biologics)에 의해 결정하였다. 결과는 도 17~19에 도시되어 있다.
실시예 10: 제형 A의 화합물
ceDNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)는 바람직하게는 ceDNA 벡터의 저장 및 치료적 전달에 적합한 리포좀 또는 지질 나노입자를 형성하는 하나 이상의 화학식 I 또는 II의 화합물과 조합하여 제조 또는 제형화될 수 있다.
지질 입자 제형의 제조에 유용한 화학식 I의 화합물 또는 그의 염은 하기 구조를 갖는다:
여기서
각각의 R1, R2, R4 및 R5는 수소, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐 및 콜레스테릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R3은 C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, 및 C2-C20 알키닐로 구성된 군으로부터 선택되고;
L은 S, O, C1-C20 알케닐, 치환된 C1-C20 알케닐로 구성된 군으로부터 선택되고;
X1은 없거나, 
또는 
이며;
X2는 없거나, 
또는 
이며; 및
각각의 R6은 독립적으로 C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, 및 C2-C20 알키닐로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
지질 입자 제형의 제조에 유용한 화학식 I의 화합물 또는 그의 염은 하기 구조를 갖는다:
여기서
각각의 R1, R2, 및 R4는 수소, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐 및 콜레스테릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R3은 C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, 및 C2-C20 알키닐로 구성된 군으로부터 선택되고;
R5는 존재하지 않거나 C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, 및 C2-C20 알키닐로 구성된 군으로부터 선택되고;
L은 S, O, C1-C20 알케닐, 치환된 C1-C20 알케닐로 구성된 군으로부터 선택되고;
X1은 없거나, 
또는 
이며;
X2는 없거나, 
또는 
이며;
각각의 R6은 독립적으로 C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, 및 C2-C20 알키닐로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; 및
R5가 존재하는 경우 
는 R5에 대한 공유 결합이며, 또는 R5가 존재하지 않는 경우 
는 존재하지 않는다.
화학식 I 또는 화학식 II의 일부 예시적인 화합물에서, R1은 분지형 C12-C20 알킬이고; R2는 선형 C5-C10 알킬 또는 분지형 C12-C20 알킬이고; R4 및 R3은 각각 독립적으로 선형 C1-C5 알킬이고; 각각의 R6은 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-C5 알킬이고; L은 선형 C1-C3 알킬이다.
화학식 I 또는 II의 예시적인 화합물은 도 20에 도시된 화합물로부터 선택된 하나 이상의 화합물일 수 있다.
화학식 I 및 II의 화합물의 일반적인 합성이 도 21 및 22에 도시되어 있으며, 여기서, 각각의 R 값은 독립적으로 선택된다.
일반적으로, 상기 개시된 출발 화합물 및 다른 화합물은 상업적 공급원으로부터 구입하거나 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 방법에 따라 제조할 수 있다. 숙련가는 통상의 합성 방법 및 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 화학적 화합물 및 화학적 반응에 관한 참고 문헌 및 데이터베이스를 통해 본원에 기재된 화합물에서 가장 치환된 스캐폴드를 구축할 수 있을 것이다. 본원에 개시된 화합물의 제조에 유용한 반응물의 합성을 상세하게 설명하거나 본원에 개시된 화합물의 제조를 설명하는 논문에 대한 언급을 제공하는 적합한 참고 문헌 및 논문은 예를 들어, "합성 유기 화학", John Wiley and Sons, Inc. New York; S. R. Sandler et al, "유기 작용기 제조," rd. Ed., Academic Press, New York, 1983; H. 0. House, "모뎀 합성 반응," 2nd Ed., W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Calif., 1972; T. L. Glichrist, "헤테로사이클릭 화학," 2nd Ed. John Wiley and Sons, New York, 1992; J. March, "고급 유기 화학: 반응, 메커니즘 및 구조," 5th Ed., Wiley Interscience, New York, 2001을 포함하며; 구체적이고 유사한 반응물은 대부분의 공공 및 대학 도서관에서 이용할 수 있는 미국 화학회(American Chemical Society)의 화학 초록 서비스(Chemical Abstract Service)에 의해 작성된 알려진 화학물질의 색인과 온라인 데이터베이스(자세한 내용은 American Chemical Society, Washington, D.C.에 문의)를 통해 확인될 수 있다. 공지되어 있지만 카탈로그에서 시판되지 않는 화학물질은 주문제작 화학 합성 회사에서 제조할 수 있으며, 많은 표준 화학 공급 회사는 주문제작 합성 서비스를 추가로 제공한다.
실시예 11: 제형 B의 화합물
ceDNA를 포함하는 다른 지질 입자는 본 실시예에 기재된 화학식 III, IV 또는 V의 하나 이상의 화합물과 조합하여 제조 또는 제형화될 수 있으며, 바람직하게는 ceDNA 벡터의 저장 및 치료적 전달에 적합한 리포좀 또는 지질 나노입자를 형성한다.
지질 입자 제형의 제조에 유용한 화학식 III의 화합물 또는 그의 염은 하기 구조를 갖는다:
여기서
각각의 R1, R2, R3 및 R4는 수소, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; 및
X1은 없거나, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, 
또는 
이며;
X2는 없거나, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, 
또는 
이다.
화학식 III의 일부 예시적인 화합물에서, R1, R2, R3 및 R4 중 적어도 하나는 하기이다:
화학식 III의 화합물은 도 23에 도시된 화합물로부터 선택된 화합물일 수 있다.
지질 입자 제형의 제조에 유용한 화학식 IV의 화합물 또는 그의 염은 하기 구조를 갖는다:
여기서 :
n은 0~150이고; 및
각각의 R1, R2, 및 R3은 수소, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐 및 콜레스테릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
지질 입자 제형의 제조에 유용한 화학식 V의 화합물 또는 그의 염은 하기 구조를 갖는다:
여기서
각각의 R1, R2, R3, R4 및 R5는 수소, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐 및 콜레스테릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; 콜레스테롤;
X1은 없거나, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, 또는 
이며;
X2는 없거나, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, 
, 또는 
이며;
X3은 없거나, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, 
, 또는 
이다.
화학식 V의 예시적인 화합물 또는 그의 염은 하기를 비제한적으로 포함한다:
여기서, n 및 m은 각각 독립적으로 0~20이고; 및
각각의 R1 및 R2는 독립적으로 수소, C1-C20 알킬, 치환된 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 치환된 C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐 및 콜레스테릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 III, 화학식 IV 및 V의 화합물의 일반적인 합성이 도 24에 도시되어있으며, 여기서, 각각의 R 값은 독립적으로 선택된다.
당해 분야의 숙련가는 본원에 기재된 공정에서 중간체 화합물의 작용기가 적합한 보호기로 보호될 필요가 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 작용기는 하이드록시, 아미노, 머캅토 및 카복실산을 포함한다. 하이드록시에 대한 적합한 보호기는 트리알킬실릴 또는 디아릴알킬실릴(예를 들어, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴 또는 트리메틸실릴), 테트라하이드로피라닐, 벤질 등을 포함한다. 아미노, 아미디노 및 구아니디노에 적합한 보호기는 t-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐 등을 포함한다. 머캅토에 적합한 보호기는 -C(O)-R"(여기서 R"은 알킬, 아릴 또는 아릴알킬임), p-메톡시벤질, 트리틸 등을 포함한다. 카복실산에 적합한 보호기는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 에스테르를 포함한다. 보호기는 당업자에게 공지되어 있고 본원에 기재된 표준 기술에 따라 첨가되거나 제거될 수 있다. 보호기의 사용은 Green, T.W. and P.G.M. Wutz, 유기 합성시 보호기 (1999), 3rd Ed., Wiley(그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 상세히 기재되어 있다. 당업자라면, 보호기는 또한 왕(Wang) 수지, 린크(Rink) 수지 또는 2-클로로트리틸-클로라이드 수지와 같은 중합체 수지일 수 있다. 일반적으로, 출발 성분은 Sigma Aldrich, Lancaster Synthesis, Inc., Maybridge, Matrix Scientific, TCI 및 Fluorochem USA 등의 공급원으로부터 입수할 수 있거나 당업자에게 공지된 공급원에 따라 합성될 수 있다(예를 들어, 고급 유기 화학: 반응, 메커니즘 및 구조, 5th edition (Wiley, December 2000), 본원에 그 전문이 참고로 포함됨).
실시예 12: 지질 제형의 제조
리포좀 나노입자(LNP)가 제조될 수 있다. 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질은 50:10:38.5:1.5의 몰비로 에탄올에 용해될 수 있다. 지질 나노입자(LNP)는 대략 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 ceDNA 중량비로 제조될 수 있다. 간략하게, ceDNA는 pH 4의 10 내지 50mM 시트레이트 완충액에서 0.2 mg/mL로 희석된다. 주사기 펌프를 사용하여 에탄올 지질 용액을 ceDNA 수용액과 약 1:5 내지 1:3(vol/vol)의 비율로 15 ml/분 이상의 총 유량으로 혼합할 수 있다. 이어서 에탄올을 제거하고 투석에 의해 외부 완충액을 PBS로 대체한다. 마지막으로, 지질 나노입자는 0.2 μm 공극 멸균 필터를 통해 여과될 수 있다. 지질 나노입자 입자 크기는 약 55~95 nm 직경이고, 일부 경우에 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, UK)를 사용하여 준-탄성 광 산란에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 약 70~90 nm 직경이다.
제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관될 수 있다(Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010), 둘 다 그 전문이 참조로 포함됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 각각의 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광에 기초한 분석을 사용하여 지질 나노입자에서 결정된다. 0.4 mM의 총 지질 농도의 PBS 중의 양이온성 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-지질(50/10/38.5/1.5 mol%)을 포함하는 지질 나노입자는 본원 및 다른 곳에 기재된 인라인 공정을 사용하여 제조될 수 있다. TNS는 증류수 중 100 μM 스톡 용액으로 제조될 수 있다. 소포는 pH가 2.5 내지 11의 범위인, 10 mM HEPES, 10 mM MES, 10 mM 암모늄 아세테이트, 130 mM NaCl을 함유하는 2 mL의 완충 용액에서 24 μM 지질로 희석될 수 있다. TNS 용액의 분취량을 첨가하여, 1 μM의 최종 농도를 제공하고, 다음 보르텍스 혼합 형광 강도는 321 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 SLM Aminco 시리즈 2 발광 분광광도계에서 실온에서 측정된다. 시그모이드 베스트핏 분석을 형광 데이터에 적용할 수 있으며, pKa는 pH가 최대 형광 세기의 절반으로 나타나는 pH로 측정된다.
지질 나노입자는 또한 하기의 몰비 25를 사용하여 제형화될 수 있다: 50% 양이온성 지질/10% 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)/38.5% 콜레스테롤/1.5% PEG 지질("PEG-DMG", 즉, (1-(모노메톡시)-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤, 평균 PEG 분자량 2000). 본 명세서에 기재된 바와 같이 꼬리 정맥 주사를 통한 투여 후 4시간후에 간에서의 루시퍼라제 발현을 측정함으로써 상대 활성을 결정할 수 있다. 활성은 0.3 및 1.0 mg ceDNA/kg의 용량으로 비교되고 투여 후 4시간후에 측정된 루시퍼라제(ng)/간(g)으로 표현된다.
치료적 ceDNA 작제물 화합물은 하기의 몰비를 사용하여 제형화될 수 있다: 50% 양이온성 지질/10% 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)/38.5% 콜레스테롤/1.5% PEG 지질("PEG-DMA", 2-[2-(w-메톡시(폴리에틸렌글리콜2000)에톡시]-N,N-디테트라데실아세트아미드). 본 명세서에 기재된 바와 같이 꼬리 정맥 주사를 통한 투여 후 4시간후에 간에서의 루시퍼라제 발현을 측정함으로써 상대 활성을 결정할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 활성은 0.3 및 1.0 mg mRNA 또는 DNA/kg의 용량으로 비교되고 투여 후 4시간후에 측정된 루시퍼라제(ng)/간(g)으로 표현된다.
실시예 13: ceDNA 벡터로부터 루시퍼라제 이식유전자의 생체내 단백질 발현.
상기 기재된 작제물 1~8로부터 생산된 ceDNA 벡터로부터의 이식유전자의 생체내 단백질 발현을 마우스에서 평가한다. ceDNA-플라스미드 작제물 1(실시예 1의 표 5에 기재됨)로부터 수득된 ceDNA 벡터를 시험하고, 지질 나노입자에 포함된 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 꼬리 정맥에 유체역학적 주사한 후 마우스 모델에서 지속되고 내구성있는 루시퍼라제 이식유전자 발현을 입증하였다. 루시퍼라제 이식유전자 발현은 CD-1® IGS 마우스(Charles River Laboratories; WT 마우스)로 정맥내 투여 후 IVIS 영상화에 의해 측정하였다.
연구는 CD-1® IGS 마우스에서 정맥내 투여 후 IVIS에 의한 유체역학적 루시퍼라제-발현 비-바이러스성 유전자 치료 벡터의 생체분포를 평가한다. 비히클은 멸균 PBS이다. 이 연구에서, 5마리의 CD-1 마우스의 두 그룹은 꼬리 정맥에 1.2 mL의 유체역학적 주사를 통해 루시퍼라제를 암호화하는 0.35 mg/kg ceDNA 또는 PBS를 투여받았다. 3일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일, 31일, 35일 및 42일차에 IVIS 이미지형성에 의해 루시퍼라제 발현을 평가하였다. 간단히, 마우스에 150 mg/kg의 루시페린 기질을 복강내 주사한 다음 IVIS 이미지형성을 통해 전신 발광을 평가하였다.
생체내 루시퍼라제 발현: 5~7주 수컷 CD-1 IGS 마우스(Charles River Laboratories)에 0.35 mg/kg의 ceDNA 벡터 작제물 1-4 Luc(그룹 1)를 1.2 mL 부피로 정맥 내를 통해 0일째에 유체역학적 투여하였다. 각 그룹의 일부 동물은 동일한 용량의 ceDNA 벡터 작제물 1-4 Luc(그룹 1) 또는 28일에 재-투여받는다.
ceDNA 벡터로부터의 루시퍼라제의 발현은 150 mg/kg 루시퍼라제 기질의 복강내(i.p.) 주사 후 IVIS® 기기를 사용하여 생체내 화학발광에 의해 평가된다. IVIS 이미지형성은 3일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일, 31일, 35일 및 42일에 수행하고, 수집된 장기는 42일째에 희생시킨 후에 생체외에서 이미지화한다.
연구 과정 동안, 동물의 체중을 측정하고, 일반적인 건강 및 복지에 대해 매일 모니터링하였다. 희생시, 혈액은 말단 심장 스틱에 의해 각각의 동물로부터 수집되고, 두 부분으로 분할되어 1) 혈장 및 2) 혈청으로 처리하며, 혈장 스냅-냉동 및 혈청은 간 효소 패널에 사용되며, 이어서 스냅 냉동한다. 또한, 간, 비장, 신장 및 서혜 림프절(LN)을 수집하고, IVIS에 의해 생체외에서 이미지화한다.
루시퍼라제 발현은 MAXDISCOVERY® 루시퍼라제 ELISA 검정(BIOO Scientific/PerkinElmer), 간 샘플의 루시퍼라제에 대한 qPCR, 간 샘플의 조직병리 및/또는 혈청 간 효소 패널(VetScanVS2; Abaxis Preventive Care Profile Plus)에 의해 간에서 평가한다.
참고문헌
특허, 특허 출원, 국제 특허 출원 및 공보를 포함하여, 명세서 및 실시예에 열거되고 개시된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
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aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141
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<213> Artificial Sequence
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aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120
tgcctgcagg 130
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tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg 540
cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta 600
attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg 660
gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg 720
cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg 780
aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg 840
ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc 900
gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt 960
ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc 1020
ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc 1080
ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg 1140
aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag 1200
gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc 1260
tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg 1320
gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg 1380
ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc 1440
ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg 1500
taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct 1560
gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg 1620
aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc 1680
cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 1740
ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tttagccttc 1800
ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcatttgtcg 1860
acagaattcc tcgaagatcc gaaggggttc aagcttggca ttccggtact gttggtaaag 1920
cca 1923
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 4
aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60
ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120
tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180
cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240
tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300
ggtttaggta gtgtgagagg gtccgggttc aaaaccactt gctgggtggg gagtcgtcag 360
taagtggcta tgccccgacc ccgaagcctg tttccccatc tgtacaatgg aaatgataaa 420
gacgcccatc tgatagggtt tttgtggcaa ataaacattt ggtttttttg ttttgttttg 480
ttttgttttt tgagatggag gtttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tgacacaatc 540
tcatctcacc acaaccttcc cctgcctcag cctcccaagt agctgggatt acaagcatgt 600
gccaccacac ctggctaatt ttctattttt agtagagacg ggtttctcca tgttggtcag 660
cctcagcctc ccaagtaact gggattacag gcctgtgcca ccacacccgg ctaatttttt 720
ctatttttga cagggacggg gtttcaccat gttggtcagg ctggtctaga ggtaccggat 780
cttgctacca gtggaacagc cactaaggat tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt 840
ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg ccaccccctc caccttggac acaggacgct 900
gtggtttctg agccaggtac aatgactcct ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg 960
cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag 1020
cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc 1080
ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag 1140
cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatccggac tctaaggtaa atataaaatt 1200
tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tctctctttt agattccaac 1260
ctttggaact ga 1272
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<211> 547
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
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ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60
tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120
cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180
gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240
gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300
gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360
gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420
ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480
gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540
gaactga 547
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ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240
gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300
acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420
cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660
gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720
ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960
tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020
gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080
ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179
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gtttaaac 8
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
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gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60
ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120
actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180
tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240
aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300
attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360
ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420
gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480
ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540
ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 9
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 180
ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60
tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120
ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt 180
tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta 213
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000
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<212> DNA
<213> Adeno-associated virus - 2
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atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60
ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120
tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180
cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240
caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300
aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360
taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420
gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480
acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540
aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600
gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660
tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720
cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780
tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840
cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900
attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960
acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020
accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080
aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140
aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200
gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260
aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320
ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380
gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440
gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500
gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560
gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620
aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680
ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740
tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800
ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860
caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920
cactctctct ga 1932
<210> 13
<211> 1876
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 13
cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60
gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120
gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180
gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240
tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300
caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360
tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420
cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480
gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540
cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600
gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660
atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720
ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780
caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 840
taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 900
gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 960
gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1020
taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1080
aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1140
ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1200
caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1260
cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca 1320
ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1380
ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1440
ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1500
cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1560
gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1620
cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1680
aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1740
tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1800
gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1860
catctttgaa caataa 1876
<210> 14
<211> 1194
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 14
atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60
gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120
gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180
gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240
aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300
ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360
gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420
cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480
aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540
tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600
tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660
atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720
gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780
tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840
cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900
aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960
tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020
cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080
aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140
actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataa 1194
<210> 15
<211> 141
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 15
aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60
cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120
tgcggcgcgc gcagcacctt t 141
<210> 16
<400> 16
000
<210> 17
<400> 17
000
<210> 18
<211> 241
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 18
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
c 241
<210> 19
<211> 215
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 19
gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60
cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120
tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180
gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac 215
<210> 20
<400> 20
000
<210> 21
<211> 546
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 21
ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60
tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120
cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180
gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240
gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300
gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360
gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420
ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480
gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540
gaactg 546
<210> 22
<211> 317
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 22
ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 180
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240
aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300
gcctaggctt ttgcaaa 317
<210> 23
<211> 576
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 23
tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300
tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360
cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420
ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480
aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540
gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag 576
<210> 24
<211> 1313
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 24
ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga 60
ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc 120
atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg 180
gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg 240
tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt 300
agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg 360
gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc 420
gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg 480
ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc 540
tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct 600
gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta 660
aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc 720
gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg 780
aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc 840
tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca 900
ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg 960
gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct 1020
tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc 1080
gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt 1140
tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg 1200
aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt 1260
attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa 1313
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 25
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 26
Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala
1 5 10 15
Ser Arg Gly
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 27
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<400> 29
000
<210> 30
<400> 30
000
<210> 31
<400> 31
000
<210> 32
<400> 32
000
<210> 33
<400> 33
000
<210> 34
<400> 34
000
<210> 35
<400> 35
000
<210> 36
<400> 36
000
<210> 37
<400> 37
000
<210> 38
<400> 38
000
<210> 39
<400> 39
000
<210> 40
<400> 40
000
<210> 41
<400> 41
000
<210> 42
<400> 42
000
<210> 43
<400> 43
000
<210> 44
<400> 44
000
<210> 45
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 45
ggttga 6
<210> 46
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 46
agtt 4
<210> 47
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 47
ggttgg 6
<210> 48
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 48
agttgg 6
<210> 49
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 49
agttga 6
<210> 50
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 50
rrttrr 6
<210> 51
<211> 141
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 51
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc t 141
<210> 52
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 52
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
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<400> 53
000
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<400> 54
000
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<400> 55
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<400> 56
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<400> 57
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<400> 59
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<400> 60
000
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<400> 61
000
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<400> 62
000
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<400> 63
000
<210> 64
<400> 64
000
<210> 65
<400> 65
000
<210> 66
<211> 141
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 66
aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60
cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120
tgcggcgcgc gcagcacctt t 141
<210> 67
<211> 1876
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 67
cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga 60
gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120
gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180
gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240
tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300
caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360
tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420
cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480
gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540
cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600
gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660
atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720
ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780
caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 840
taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 900
gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 960
gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1020
taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1080
aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1140
ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1200
caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1260
cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca 1320
ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1380
ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1440
ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1500
cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1560
gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1620
cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1680
aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1740
tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1800
gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1860
catctttgaa caataa 1876
<210> 68
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 68
atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc 60
gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca 120
tcgggcgcg 129
<210> 69
<211> 1203
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 69
gccgccacca tggagttggt gggctggctc gtggacaaag gcattacttc ggaaaagcag 60
tggattcagg aggatcaggc atcttacatc tcattcaacg ctgccagtaa ctcgaggtcc 120
cagatcaagg cagcgctgga caacgcggga aagattatga gtctgaccaa aactgctcca 180
gactacctcg ttggtcagca accggtggaa gatatctcca gcaacaggat ctacaagatt 240
ctggagctca acggctacga ccctcaatac gctgcctcag tgttcttggg ttgggccacc 300
aagaaattcg gcaagagaaa cactatctgg ctgttcggcc ccgctaccac tggaaagaca 360
aacatcgcag aagcgattgc tcacacggtg ccattctacg gctgcgtcaa ctggacaaac 420
gagaacttcc cgttcaacga ctgtgtcgat aagatggtta tctggtggga ggaaggaaag 480
atgacggcca aagtggtcga aagcgccaag gcaattctgg gtggctctaa agtgcgcgtc 540
gaccagaagt gcaaatcttc agctcaaatc gatcctaccc ccgttattgt gacatcaaac 600
acgaacatgt gtgccgtgat cgacggaaac agtacaacgt tcgaacacca gcaacctctc 660
caggatcgta tgttcaagtt cgagctcacc cgccgtttgg accatgattt cggcaaggtc 720
actaaacaag aggttaagga cttcttccgc tgggctaaag atcacgttgt ggaggttgaa 780
catgagttct acgtcaagaa aggaggtgct aagaaacgtc cagccccgtc ggacgcagat 840
atctccgaac ctaagagggt gagagagtcg gtcgcacagc caagcacttc tgacgcagaa 900
gcttccatta actacgcaga taggtaccaa aacaagtgca gcagacacgt gggtatgaac 960
ttgatgctgt tcccatgccg ccagtgtgag cgtatgaacc aaaactctaa catctgtttc 1020
acacatggcc agaaggactg cctcgaatgt ttccctgtgt cagagagtca gcccgtctca 1080
gtcgttaaga aagcttacca aaagttgtgc tacatccacc atattatggg taaagtccct 1140
gatgcctgta ccgcttgtga tctggtcaac gtggatttgg acgactgtat tttcgagcaa 1200
taa 1203
<210> 70
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<211> 1177
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 74
ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc 60
tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac 120
ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac 180
agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca 240
tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc 300
ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag 360
tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa 420
tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt 480
tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga 540
cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca 600
agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt 660
tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta 720
attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt 780
accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca 840
gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca 900
ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg 960
tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg 1020
gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca 1080
gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc 1140
tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt 1177
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<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 101
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga 60
gcgagcgcgc 70
<210> 102
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 102
gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga 60
gcgagcgcgc 70
<210> 103
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 103
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc 60
gagcgagcgc gc 72
<210> 104
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 104
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60
gagcgagcgc gc 72
<210> 105
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 105
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc 60
gagcgagcgc gc 72
<210> 106
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 106
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 60
gagcgagcgc gc 72
<210> 107
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 107
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg 60
cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83
<210> 108
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 108
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 60
cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83
<210> 109
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 109
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaac gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 60
tgagcgagcg agcgcgc 77
<210> 110
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 110
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgtt tcggcctcag 60
tgagcgagcg agcgcgc 77
<210> 111
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 111
gcgcgctcgc tcgctcactg aggcaaagcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51
<210> 112
<211> 51
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 112
gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51
<210> 113
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 113
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60
cagtgagcga gcgagcgcgc 80
<210> 114
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 114
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60
cagtgagcga gcgagcgcgc 80
<210> 115
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 115
gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60
agtgagcgag cgagcgc 77
<210> 116
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<400> 116
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc 60
agtgagcgag cgagcgcgc 79
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cgggcgacca aaggtcgccc g 21
<210> 514
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<220>
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<212> DNA
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cgggcccgac gcccgggctt tgcccgggc 29
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cgggcgacca aaggtcgccc g 21
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cgcccgggct ttgcccgggc 20
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gcccgggcaa agcccgggcg 20
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cgggcgacct ttggtcgccc g 21
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gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg 42
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gccgcccggg cgacgggcga cctttggtcg cccg 34
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gcccgggcaa agcccgggcg 20
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gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc g 31
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cgggcgacct ttggtcgccc g 21
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gcgcgctcgc tcgctc 16
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<220>
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<400> 540
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91
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<212> DNA
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gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 60
ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91
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<212> DNA
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<220>
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ttaattaa 8
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cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gc 42
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gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg 42
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gcccgctggt ttccagcggg ctgcgggccc gaaacgggcc cgc 43
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cgggcccgtg cgggcccaaa gggcccgc 28
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gcccgggcac gcccgggttt cccgggcg 28
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cgtgcgggcc caaagggccc gc 22
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gcgggccgga aacgggcccg ctgcccgctg gtttccagcg ggc 43
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<400> 556
cgcccgggaa acccgggcgt gcccgggc 28
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<400> 557
gggccgcccg ggaaacccgg gcgtgccc 28
Claims (33)
- 공유적으로-폐쇄된 말단(covalently-closed ends)을 갖는 비-바이러스성 캡시드-비함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터) 및 이온화가능한 지질을 포함하는 지질 입자로서, 상기 ceDNA 벡터는 비대칭 역전된 말단 반복 서열(비대칭 ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 비대칭 ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는, 지질 입자.
- 청구항 1에 있어서, ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화되고 천연 및 변성 겔 전기영동 둘 모두에 의해 분석될 때 상기 ceDNA 벡터는 선형 및 비-연속적 DNA 대조군과 비교하여, 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드를 나타내는, 지질 나노입자.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 비대칭 ITR 서열 중 하나 이상이 파보바이러스, 데펜도바이러스, 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래된, 지질 나노입자.
- 청구항 3에 있어서, 상기 비대칭 ITR이 상이한 바이러스 혈청형으로부터 유래된, 지질 나노입자.
- 청구항 4에 있어서, 하나 이상의 비대칭 ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래된, 지질 나노입자.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 이상이 합성인, 지질 나노입자.
- 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 이상이 야생형 ITR이 아닌, 지질 나노입자.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두가 A, A', B, B', C, C', D, 및 D'로부터 선택된 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된, 지질 나노입자.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA 벡터가 하기로부터 선택된 적어도 2개의 비대칭 ITR을 포함하는, 지질 나노입자:
c. 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 및
d. 서열번호: 2 및 서열번호: 51. - 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 방법으로부터 수득되는, 지질 나노입자:
a. 적어도 하나의 Rep 단백질의 존재하에, ceDNA 발현 작제물을 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅(incubating)하는 단계로서, 상기 ceDNA 발현 작제물이 곤충세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 및 이를 유도하기에 충분한 시간 동안 ceDNA 벡터를 암호화하는 단계; 및
b. 곤충세포로부터 ceDNA 벡터를 단리하는 단계. - 청구항 10에 있어서, ceDNA 발현 작제물은 ceDNA 플라스미드, ceDNA 백미드(bacmid) 및 ceDNA 배큘로바이러스로부터 선택되는, 지질 나노입자.
- 청구항 10 또는 11에 있어서, 곤충 세포가 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는, 지질 나노입자.
- 청구항 10에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질이 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는, 지질 나노입자.
- 청구항 13에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 지질 나노입자.
- 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 벡터는 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득되며, 여기서 벡터 폴리뉴클레오타이드는 2개의 역전된 말단 반복 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하며, 2개의 ITS는 서로 상이하며(비대칭), ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는 기능성 ITR이며, ITR 중 하나는 기능성 ITR에 대한 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하고; Rep 단백질이 존재함으로써 곤충 세포에서 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제 및 DNA 벡터의 생산이 유도되고, DNA 벡터는 하기 단계들을 포함하는 방법으로부터 수득가능한, 지질 입자:
a. 곤충세포 내에서 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 및 이를 유도하기에 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에, 바이러스성 캡시드 암호화 서열이 결여되어 있는, 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 곤충 세포가 벡터의 부재하에 곤충 세포내에 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 생산을 포함하지 않는, 단계; 및
b. 곤충세포로부터 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA를 수확(harvesting) 및 단리하는 단계. - 청구항 10 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 존재가 확인될 수 있는, 지질 입자.
- 청구항 16에 있어서, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화(digesting)하고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있는, 지질 입자.
- 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, DNA 벡터는 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득되며, 상기 벡터 폴리뉴클레오타이드는 제1 및 제2 AAV2 역전된 말단 반복 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하고, ITR 중 적어도 하나는 Rep 단백질의 존재하에 곤충 세포에서 DNA 벡터의 복제를 유도하기 위해 서열번호: 1 또는 서열번호: 51의 상응하는 AAV2 야생형 ITR에 대해 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 결실, 삽입 및/또는 치환을 가지며, DNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능한, 지질 입자:
a. 곤충 세포내에서 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 및 이를 유도하기에 충분한 시간 동안, Rep 단백질의 존재 하에서 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여된 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 곤충 세포가 바이러스성 캡시드 암호화 서열을 포함하지 않는, 단계; 및
b. 곤충 세포로부터 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA를 수확하고 단리하는 단계. - 청구항 18에 있어서, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 존재가 확인될 수 있는, 지질 입자.
- 청구항 19에 있어서, 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스성 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화하고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있는, 지질 입자.
- 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 지질 입자는 비-양이온성 지질; PEG 콘주게이팅된(conjugated) 지질; 및 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 지질 입자.
- 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 이온화가능한 지질은 표 1에 기재된 지질인, 지질 입자.
- 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 지질 입자는 비-양이온성 지질을 추가로 포함하고, 여기서 비-이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 라이소레시틴, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티디카시드, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 라이소포스파티딜콜린, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택되는, 지질 입자.
- 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 지질 입자는 콘주게이팅된 지질을 추가로 포함하며, 콘주게이팅된 지질은, 콘주게이팅된-지질은 PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라마이드(Cer), 페길화된 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 석시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG), PEG 디알콕시프로필카밤, 및 N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염으로 구성된 군으로부터 선택되는, 지질 입자.
- 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 지질 입자는 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 추가로 포함하는, 지질 입자.
- 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는, 지질 입자:
(v) 이온화가능한 지질;
(vi) 비-양이온성 지질;
(vii) 입자의 응집을 억제하는 콘주게이팅된 지질; 및
(viii) 스테롤. - 청구항 1 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는, 지질 입자:
(e) 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 90 mol%의 양으로 이온화가능한 지질,
(f) 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 30 mol%의 양으로 비-양이온성 지질,
(g) 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol% 내지 약 20 mol%의 양으로 입자의 응집을 억제하는 콘주게이팅된 지질, 및
(h) 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 50 mol%의 양으로 스테롤. - 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 총 지질 대 DNA 벡터(질량 또는 중량) 비는 약 10:1 내지 약 30:1인, 지질 입자.
- 제1 지질 나노입자 및 추가의 화합물을 포함하는 조성물로서, 제1 지질 나노입자는 제1 캡시드 비함유, 비-바이러스성 벡터를 포함하고, 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항의 지질 나노입자인, 조성물.
- 청구항 29에 있어서, 상기 추가의 화합물은 제2 지질 나노입자에 포함되며, 상기 제1 및 제2 지질 나노입자가 상이한, 조성물.
- 청구항 28 또는 29에 있어서, 상기 추가의 화합물은 제1 지질 나노입자에 포함되는, 조성물.
- 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가의 화합물이 치료제인, 조성물.
- 청구항 28에 있어서, 상기 추가의 화합물이 제2 캡시드 비함유, 비-바이러스성 벡터이며, 상기 제1 및 제2 캡시드 비함유, 비-바이러스성 벡터가 상이한, 조성물.
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