KR20200052283A - 유도성 AAV Rep 유전자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아데노-관련된 바이러스(AAV) Rep 단백질 Rep78 및 Rep68을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이며, 내부 AAV 프로모터 p19는 상기 Rep78 및 Rep68 단백질의 기능성을 유지하는 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성화된다. 본 발명은 또한 각각의 핵산 및 이를 포함하는 벡터 뿐만 아니라 AAV의 생산을 위한 각각의 방법에 관한 것이다.

Description

유도성 AAV Rep 유전자
본 발명은 아데노(Adeno)-관련된 바이러스(AAV) Rep 단백질 Rep78 및 Rep68을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이며, 여기서 내부 AAV 프로모터 p19는 상기 Rep78 및 Rep68 단백질의 기능성(functionality)을 유지하는 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성화된다. 본 발명은 또한 각각의 핵산 및 이를 포함하는 벡터(vector) 뿐만 아니라, AAV의 생산을 위한 각각의 방법에 관한 것이다.
최근에 아데노-관련 바이러스(AAV)-유래된 벡터를 기반으로 한 유전자 요법 시험 생성물의 수가 신속하게 증가되어오고 있다. 유전자 요법에서 AAV 벡터의 장점은 양호한 안전성 프로파일, 즉, 이러한 벡터가 병원성이 아니라는, 즉, 임의의 질환, 이식유전자의 안정한 발현, 및 형질도입 분열 가능성 뿐만 아니라 분열하지 않는 세포와 관련되지 않는다는 사실이다.
재조합 AAV의 생산은 특히 트랜스로(intrans) 공급된 재조합 바이러스의 생산을 위해, 일반적으로 AAV 게놈에 의해 암호화된 AAV Rep 및 Cap 단백질의 발현을 필요로 한다. 또한, 상이한 헬퍼 바이러스로부터 유래될 수 있는 헬퍼 유전자가 사용되어야 하며, 가장 일반적인 것은 아데노바이러스(AV)로부터 취한 헬퍼 바이러스 유전자, 예를 들면, E1A, E1B, E2A, E4orf6, 또는 VA RNA이다. 또한, 목적한 유전자(GOI)를 함유하는 전달 벡터(transfer vector)가 요구된다.
AAV에 대한 현재의 생산 시스템은 그러나, 수개의 단점을 갖는 다음의 기술에 주로 의존한다. 예컨대, 목적한 유전자를 함유하는 전달 벡터, 아데노바이러스 헬퍼 기능을 지닌 플라스미드, 및 캡시드 및 레플리카제 기능을 공급하는 플라스미드를 포함하는 3개의 플라스미드 시스템을 사용한, AAV rep 유전자의 일시적인 형질감염은 확장성, 견고성(robustness), 재현성을 결여하며, 고 비용의 GMP-등급 DNA를 내포한다. 주로 HeLa 세포를 기반으로 하는 생산자 세포주는 여전히 헬퍼바이러스에 의한 감염을 필요로 하므로, 대규모 정제 및 헬퍼 바이러스의 부재의 고비용 증거를 필요로 한다. p19 프로모터의 하부의 rep 유전자자리(locus) 내로의 정지 카세트의 삽입에 의한 AAV rep 유전자의 유도성 발현은 2개의 loxP 부위에 의해 플랭크된(flanked) 정지 신호(예컨대, SV40 폴리(A))를 함유하는 인공 인트론의 삽입을 필요로 한다. 또한, 세포는 loxP 부위를 인식하여 정지 카세트를 절개하는 Cre 리컴비나제를 필요로 한다. 이는 유도적으로 또는 변형된 아데노바이러스 벡터에 의해 공급되어야 하며, 이는 헬퍼 바이러스의 부재의 비용이 많이 드는 입증을 필요로 한다. 또한, Cre-매개된 재조합은 단지 저 효율을 흔히 나타낸다.
따라서, 현재의 AAV 생산 시스템은 확장성, 견고성, 재현성, 사용 용이성 및 비용 효율과 관련하여 제한된다. 따라서, 일시적인 형질감염 또는 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않는 AAV 벡터의 안정한 생산을 위한 확장가능한 시스템이 매우 바람직하다.
따라서, 본 발명에 잠재하는 기술적 과제는 각각의 숙주 세포, 핵산, 벡터 및 이러한 시스템을 구성하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제에 대한 해결은 청구범위에서 특징화된 구현예에 의해 달성된다.
특히, 제1 양태에서, 본 발명은 아데노-관련된 바이러스(AAV) Rep 단백질 Rep78 및 Rep68을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이며, 여기서 내부 AAV 프로모터 p19는 상기 Rep78 및 Rep68 단백질의 기능성을 유지하는 하나 이상의 돌연변이에 의해 불확성화된다.
이러한 맥락에서, AAV의 생산을 위한 안정한 생산자 세포주는 Rep 단백질이 세포에 대해 독성이므로, 생성하기 어렵다. Rep 단백질의 발현은 AAV 생산에 또한 필수적인 E1A에 의해 조절된다. CAP 세포, HEK293 세포 또는 Per.C6 세포와 같은 세포내에서, E1A는 이미 구성적으로 발현되어 있다. 전체적으로, 4개의 Rep 단백질이 존재한다: p5 프로모터로부터 발현되는 2개의 긴 단백질(Rep78, Rep68), 및 긴 Rep 단백질의 암호화 영역내에 위치하는 내부 p19 프로모터로부터 발현된 2개의 짧은 단백질(Rep52, Rep40)(개략적인 고찰에 대해서는 도 1 참고).
p5 프로모터는 유도성 프로모터로 대체될 수 있지만 Rep78 및 Rep68 암호화 영역의 일부인 내부 p19 프로모터에 의해 대체될 수 없다. 따라서, E1A를 구성적으로 발현하는 세포를 기반으로 하는 패키징/생산자 세포의 생성은, Rep52 및 Rep40의 독성 수준의 구성적 발현을 야기할 수 있으므로, 불가능하다. EA1을 구성적으로 발현하지 않는 다른 세포주는 예컨대, 아데노바이러스의 감염에 의한 유도성 E1A 또는 E1A 공급을 필요로 하며, 상기 나타낸 결점을 내포한다.
이러한 문제는 구성적 Rep52 및 Rep40 발현을 방지하지만 동시에 상기 Rep78 및 Rep68 단백질의 기능성을 유지하는 돌연변이에 의한 내부 AAV p19 프로모터의 불활성화를 기반으로 하는 본 발명에 의해 유리하게 해결된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아데노-관련 바이러스" 및 "AAV"는 특수한 AAV 혈청형에 한정되지 않는다. 이러한 맥락에서, AAV Rep 단백질이 상이한 AAV 혈청형 중에서 고도로 보존되어 있음을 주목하여야 한다. 특수한 구현예에서, 상기 용어는 아데노-관련된 바이러스 혈청형 2(AAV2)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "상기 Rep78 및 Rep68 단백질의 기능성을 유지하는"은 본 발명에 따른 돌연변이가 상기 단백질의 기능적 활성을 감소시키지 않거나, 상기 활성을 최대 30%까지, 바람직하게는 최대 25%까지, 최대 20%까지, 최대 15%까지, 최대 12.5%까지, 최대 10%까지, 최대 7.5%까지, 최대 5%까지, 최대 4%까지, 최대 3%까지, 최대 2%, 또는 최대 1%까지 감소시킨다는 사실을 지칭한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 돌연변이는 p19 프로모터, 바람직하게는 SP1-50 영역(뉴클레오타이드 817 내지 829), TATA -20 영역(뉴클레오타이드 843 내지 849), 또는 TATA -35 영역(뉴클레오타이드 830 내지 835)의 조절 부위 중 적어도 하나의 내에 있다. 구체적으로, 상기 하나 이상의 돌연변이는 SP1 -50 영역 내, TATA -20 영역 내, TATA -35 영역 내, SP1 -50 영역 및 TATA -20 영역 둘 다 내, SP1 -50 영역 및 TATA -35 영역 둘 다 내, TATA -20 영역 및 TATA -35 영역 둘 다내, 또는 모든 3개의 영역내, 즉, SP1 -50 영역, TATA -20 영역, 및 TATA -35 영역 내에 존재할 수 있다. 특히, 본 발명에서 상기 영역 중 하나 내의 단일 뉴클레오타이드의 돌연변이는 심지어 Rep52 및 Rep40 발현의 유의적인 감소를 야기함이 밝혀졌다.
이러한 맥락에서, 본원에 나타낸 바와 같은 모든 뉴클레오타이드 위치는 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 AF043303 하에서 이용가능한 AAV2 완전한 게놈 서열을 지칭한다. 이것은 모든 아미노산 위치에 적용된다. 또한, 하기 표 1은 IUPAC에 따른 1-문자 뉴클레오타이드 명명법의 인용을 나타낸다.
표 1. IUPAC 에 따른 1-문자 뉴클레오타이드 명명법.
Figure pct00001
바람직한 구현예에서, 내부 p19 프로모터를 불활성화시키는 본 발명에 따른 하나 이상의 돌연변이는 사일런트 돌연변이(silent mutation), 즉, 암호화된 아미노산을 변경시키지 않는 돌연변이이다.
바람직하게는, 상기 하나 이상의 돌연변이는 돌연변이 731C>D, 732A>C, 734A>B, 737T>C, 746A>G, 749C>D, 752G>H, 758G>A, 761G>H, 764G>H, 818G>A, 824G>H, 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C, 848A>B 또는 848A>G, 849A>T, 850G>C, 및 851C>D로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
상기 하나 이상의 돌연변이가 p19 프로모터의 SP1-50 영역 내에 존재하는 경우, 상기 돌연변이는 돌연변이 818G>A 및 824G>H로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 상기 하나 이상의 돌연변이가 p19 프로모터의 TATA -20 영역 내에 존재하는 경우, 상기 돌연변이는 돌연변이 845T>C, 846T>C, 848A>B 또는 848A>G, 및 849A>T로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 상기 하나 이상의 돌연변이가 p19 프로모터의 TATA -35 영역 내에 존재하는 경우, 상기 돌연변이는 돌연변이 830T>V, 및 833T>C로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 하나 이상의 돌연변이는 상기 돌연변이의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 모든 20개를 포함한다. 따라서, 본 발명의 숙주 세포는 돌연변이 731C>D, 732A>C, 734A>B, 737T>C, 746A>G, 749C>D, 752G>H, 758G>A, 761G>H, 764G>H, 818G>A, 824G>H, 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C, 848A>B 또는 848A>G, 849A>T, 850G>C, 및 851C>D 중 임의의 1개, 임의의 2개, 및 3개, 임의의 4개, 임의의 5개, 임의의 6개, 임의의 7개, 임의의 8개, 임의의 9개, 임의의 10개, 임의의 11개, 임의의 12개, 임의의 13개, 임의의 14개, 임의의 15개, 임의의 16개, 임의의 17개, 임의의 18개, 임의의 19개, 또는 모든 20개를 포함하는 핵산을 포함할 수 있다.
아데노-관련된 바이러스(AAV) Rep 단백질 Rep78 및 Rep68을 암호화하고, 여기서 내부 AAV 프로모터 p19가 사일런트 돌연변이(silent 돌연변이)에 의해 불활성화된, 본 발명에서 사용된 핵산은 바람직하게는 서열 번호: 1 내지 8, 11 내지 14, 및 34 내지 42에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 핵산은 서열 번호: 1, 6, 8, 13, 14, 34 내지 39, 41, 및 42에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
이러한 맥락에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "내부 프로모터"는 AAV p19 프로모터가 Rep78 및 Rep68의 암호화 서열 내에 위치하며 상기 암호화 서열의 일부를 형성한다는 사실을 나타낸다. 또한, AAV p19 프로모터와 관련하여 용어 "불활성화된"은 사일런트 돌연변이를 AAV p19 프로모터 영역내로 도입시킴에 의해, 상기 프로모터가 프로모터 활성을 소멸시키거나 적어도 강력하게 감소시켰다(예컨대, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%까지 감소시켰다)는 사실을 나타낸다.
서열 번호: 1 내지 8, 11 내지 14, 및 34 내지 42에 따른 뉴클레오타이드 서열은 AAV p19 프로모터 영역(AAV2 게놈의 뉴클레오타이드 651 내지 1053)을 나타내며, 여기서 하기 표 2에 나타낸 돌연변이 양식이 나타나 있다.
바람직한 구현예에서, 아데노-관련된 바이러스(AAV) Rep 단백질 Rep78 및 Rep68을 암호화하고, 여기서 내부 AAV 프로모터 p19가 사일런트 돌연변이에 의해 불활성화된, 본 발명에서 사용된 핵산은 바람직하게는 서열 번호: 15 내지 22, 25 내지 28, 및 43 내지 51에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 핵산은 서열 번호: 15, 20, 22, 27, 28, 43 내지 48, 50, 및 51에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
서열 번호: 15 내지 22, 25 내지 28, 및 43 내지 51에 따른 뉴클레오타이드 서열은 Rep 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40에 대한 AAV 암호화 영역(AAV2 게놈의 뉴클레오타이드 321 내지 2252)을 나타내며, 여기서 p19 프로모터 영역(AAV2 게놈의 뉴클레오타이드 651 내지 1053)은 하기 표 2에 나타낸 돌연변이를 함유하는 돌연변이된 p19 프로모터 영역에 의해 대체되었다.
표 2: 바람직한 p19 프로모터 영역 돌연변이 양식.
Figure pct00002
Figure pct00003
다른 바람직한 구현예에서, 내부 p19 돌연변이를 불활성화시키는 본 발명에 따른 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 보존적 아미노산 교환, 즉, 아미노산을 유사한 생화학적 특성(예컨대, 전하, 소수성 또는 크기에 관하여)을 지닌 상이한 아미노산으로 교환시키는 아미노산 교환을 야기하는 돌연변이이다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 아미노산 교환은 지방족 아미노산의 부류(Gly, Ala, Val, Leu, Ile) 내에서, 하이드록실- 또는 황/셀레늄-함유 아미노산(Ser, Cys, Sec, Thr, Met) 내에서, 염기성 아미노산의 부류(His, Lys, Arg) 내에서, 또는 산성 아미노산의 부류(Asp, Glu, Asn, Gln) 내에서 발생하는 아미노산 교환이다.
특수한 구현예에서, 상기 하나 이상의 아미노산 교환은 아미노산 교환 Leu176>Ala 및/또는 Ala168>Gly를 포함한다.
이와 관련하여, 아데노-관련된 바이러스(AAV) Rep 단백질 Rep78 및 Rep68을 암호화하고, 여기서 내부 AAV 프로모터 p19가 보존적 아미노산 교환을 야기하는 돌연변이에 의해 불활성화된, 본 발명에서 사용된 핵산은 바람직하게는 서열 번호: 9 및 10에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이다.
이러한 맥락에서, AAV p19 프로모터와 관련하여 용어 "불활성화된"은 AAV p19 프로모터 영역으로의 보존적 아미노산 교환을 야기하는 돌연변이를 도입함에 의해, 상기 프로모터가 프로모터 활성을 소멸시키거나 적어도 강력하게 감소시킨다(즉, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%까지 감소시킨다)는 사실을 나타낸다.
서열 번호: 9 및 10에 따른 뉴클레오타이드 서열은 AAV p19 프로모터 영역(AAV2 게놈의 뉴클레오타이드 651 내지 1053)을 나타내며, 여기서 하기 표 3에 나타낸 돌연변이 양식이 나타난다.
바람직한 구현예에서, 아데노-관련된 바이러스(AAV) Rep 단백질 Rep78 및 Rep68을 암호화하고, 여기서 내부 AAV 프로모터 p19가 돌연변이에 의해 불활성화되어 보존적 아미노산 교환을 야기하는, 본 발명에 사용된 핵산은 서열 번호: 23 및 24에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이다.
서열 번호: 23 및 24에 따른 뉴클레오타이드 서열은 Rep 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40(AAV2 게놈의 뉴클레오타이드 321 내지 2252)에 대한 AAV 암호화 영역을 나타내며, 여기서 p19 프로모터 영역(AAV2 게놈의 뉴클레오타이드 651 내지 1053)은 하기 표 3에 나타낸 돌연변이를 함유하는 돌연변이된 p19 프로모터 영역에 의해 대체되었다.
표 3: 바람직한 p19 프로모터 영역 돌연변이 양식
Figure pct00004
본 발명의 숙주 세포 속에 함유된 핵산은 유도성 프로모터, 폴리(A) 영역, 선택 마커, IRES 서열 및 향상 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 유도성 프로모터, 예컨대, Tet-유도성 프로모터, 예컨대, 제3 세대 TRE3G-프로모터는 특별히 제한되지 않으며 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 폴리(A) 영역, 예컨대, SV40 폴리(A) 영역은 특별히 제한되지 않으며 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 선택 마커, 예컨대, 항생제 내성 카세트, 예를 들면, 블라스티시딘 또는 앰피실린 내성 카세트는 특별히 제한되지 않으며 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명은 또한 상기 정의한 바와 같은 핵산에 대해 적어도 70% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이며, 단, 상기 정의한 구체적인 돌연변이가 존재한다. 이러한 맥락에서, 용어 "단 상기 정의된 특이적인 돌연변이가 존재한다"는 다음 상황 (i) 내지 (xxiii)을 지칭한다:
(i) 서열 번호: 1 또는 15에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열내에, 돌연변이 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C; 746A>G; 749C>D; 752G>H; 758G>A; 761G>H; 764G>H; 818G>A; 824G>H; 830T>V; 833T>C; 845T>C; 848A>G; 849A>T; 850G>C; 및 851C>D가 존재하고;
(ii) 서열 번호: 2 또는 16에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 845T>C; 848A>G; 849A>T; 850G>C; 및 851C>D가 존재하며;
(iii) 서열 번호: 3 또는 17에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 848A>G가 존재하고;
(iv) 서열 번호: 4 또는 18에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 849A>T; 및 850G>C가 존재하며;
(v) 서열 번호: 5 또는 19에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 845T>C가 존재하고;
(vi) 서열 번호: 6 또는 20에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H, 758G>A; 761G>H; 764G>H, 818G>A; 824G>H, 830T>V; 및 833T>C가 존재하며;
(vii) 서열 번호: 7 또는 21에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H; 758G>A; 761G>H; 및 764G>H가 존재하고;
(viii) 서열 번호: 8 또는 22에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C, 845T>C; 846T>C; 848A>B; 849A>T; 850G>C; 및 851C>D가 존재하며;
(ix) 서열 번호: 9 또는 23에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 846T>G, 847T>C, 및 848A>B가 존재하고;
(x) 서열 번호: 10 또는 24에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 823C>G, 및 824G>H가 존재하며;
(xi) 서열 번호: 11 또는 25에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 846T>C; 및 848A>B가 존재하고;
(xii) 서열 번호: 12 또는 26에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 846T>C가 존재하며;
(xiii) 서열 번호: 13 또는 27에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 및 850G>C가 존재하고;
(xiv) 서열 번호: 14 또는 28에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H, 758G>A; 761G>H; 764G>H, 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C, 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 850G>C, 및 851C>D가 존재하며;
(xv) 서열 번호: 34 또는 43에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 818G>A 및 824G>H가 존재하고;
(xvi) 서열 번호: 35 또는 44에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 830T>V 및 833T>C가 존재하며;
(xvii) 서열 번호: 36 또는 45에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 818G>A가 존재하고;
(xviii) 서열 번호: 37 또는 46에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 824G>H가 존재하며;
(xix) 서열 번호: 38 또는 47에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 830T>V가 존재하고;
(xx) 서열 번호: 39 또는 48에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 833T>C가 존재하며;
(xxi) 서열 번호: 40 또는 49에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 818G>A; 824G>H; 830T>V; 및 833T>C가 존재하고;
(xxii) 서열 번호: 41 또는 50에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 818G>A; 824G>H; 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 및 850G>C가 존재하며;
(xxiii) 서열 번호: 42 또는 51에 따른 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열 내에, 돌연변이 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 및 850G>C가 존재한다.
바람직하게는, 상기 핵산은 상기 정의한 바와 같은 핵산에 대해 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.2%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는다. 특수한 구현예에서, 이러한 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드 결실, 삽입 또는 대체(교환)를 갖는다.
상기 정의한 바와 같은 핵산에 대해 정의된 서열 동일성을 갖거나 상기 정의된 바와 같은 핵산과 관련하여 특이적인 뉴클레오타이드 결실, 삽입 또는 대체를 갖는 각각의 핵산은 임의의 종류의 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이를 갖는 임의의 핵산 뿐만 아니라, 비-기능성 Rep78 및 Rep68 단백질을 암호화하는 임의의 핵산을 배제하는데, 즉, 상기 핵산은 여전히 기능성 Rep78 및 Rep68 단백질을 암호화한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포내에 포함된 핵산은 숙주 세포 게놈내로 안정하게 통합된다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포내에 포함된 핵산은 벡터내에 포함되는데, 즉, 벡터의 부분이다. 상기 벡터는 바람직하게는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 및 인공 염색체 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 벡터이다 바람직하게는 상기 벡터는 발현 벡터이다.
본 발명에 따라서, 내부 AAV p19 프로모터는 사일런트 돌연변이 또는 보존적 아미노산 교환을 야기하는 돌연변이의 도입으로 불활성화된다. 이러한 방식으로, Rep78 및 Rep68을 암호화하는 핵산을 유도성 프로모터의 제어 하에 위치할 수 있으며, 여기서 Rep52 및 Rep40의 구성적 발현은 발생하지 않는다. 그러나, AAV의 생산은 모든 4개의 Rep 단백질을 필요로 하므로, Rep52 및 Rep40을 암호화하는 추가의 핵산이 똑같은(same) 프로모터, 동일한(identical) 프로모터 또는 상이한 프로모터의 제어하에 위치할 수 있다. 따라서, 구체적인 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어 하에서 AAV Rep 단백질 Rep52 및 Rep40을 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 이러한 핵산은 상기 정의한 바와 같은 벡터, 또는 Rep78 및 Rep68을 암호화하는 핵산의 일부일 수 있다. 본 발명에 적합한 숙주 세포는 특별히 제한되지 않으며 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 구성적 E1A 발현을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 CAP 세포, HEK293 세포 또는 Per.C6 세포인데, 즉 상기 세포주로부터 유래된다.
본 발명의 숙주 세포를 생성하는 방법, 즉, 본 발명의 핵산을 적합한 숙주 세포내로 도입하는 방법은 특히 제한되지 않으며 당해 분야에 공지되어 있다. 동일한 것이 본 발명의 핵산 및 벡터의 생성을 위한 방법에 적용된다.
제2 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산 및 벡터에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 숙주 세포내에서 아데노-관련된 바이러스(AAV) Rep 단백질 Rep78 및 Rep68를 재조합적으로 발현하는 단계를 포함하는, AAV의 생산 방법에 관한 것이다.
필수적인 핵산, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 생성하는 각각의 방법 뿐만 아니라 각각의 발현 방법은 특별히 제한되지 않으며 당해 분야에 공지되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 상기 숙주 세포내에서 AAV Rep 단백질 Rep52 및 Rep40을 재조합적으로 발현시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하는"/"포함하다"는 명확하게 용어 "로 필수적으로 이루어진"/"로 필수적으로 이루어지다" 및 "로 이루어진"/"로 이루어지다"를 포함하는데, 즉, 상기 용어들 모두는 서로 상호교환가능하다.
본 발명에 따라서, Rep52 및 Rep40의 구성적 발현없이 AAV Rep 단백질 Rep78 및 Rep68을 발현할 수 있는 숙주 세포가 제공된다. 이는 핵산을 제공함으로써 달성되며 여기서 내부 AAV p19 프로모터 영역은 특이적인 돌연변이를 도입함으로써 불활성화된다.
프로모터는 특이적인 전사 인자 및 기본적인 전사 복합체의 결합에 의해 활성화되며; 이러한 인자는 p19 프로모터에 대해 이미 기술된 프로모터 영역내에 특이적인 결합 부위를 인식한다. 이러한 결합 부위를 돌연변이시키는 것은 프로모터의 활성화를 소멸시킨다. 긴 Rep 단백질의 통합성은 유지되어야 하므로, 뉴클레오타이드 서열을 변경시키지만 유전 코드 내에서 동일한 아미노산을 암호화하는 돌연변이가 선택되어, 동일한 단백질을 형성시키거나(사일런트 돌연변이), 뉴클레오타이드 서열을 변경시키는 돌연변이가 선택되어 보존적 아미노산 변화를 야기한다.
상기 돌연변이를 도입시킨 후, 긴 및 짧은 Rep 단백질에 대한 발현 단위를 분리시키는 것이 가능하다: 긴 Rep 단백질에 대한 발현 카세트는 상기 돌연변이를 지닌 돌연변이된 p19 프로모터를 함유한다. 짧은 Rep 단백질에 대한 단리된 발현 단위는 출발 코돈을 지닌 p19 프로모터의 하부에서 개시된다. 발현 단위 둘 다의 발현은 이후 유도성 프로모터(예컨대, Tet 유도성 프로모터로서)의 조절 하에 위치할 수 있다. 이를 기반으로, 안정한 패키징/생산자 세포주가 생성될 수 있다.
본 발명의 숙주 세포, 핵산, 벡터, 및 방법은 우수한 재현성에 의해, 지속적인 품질, 확장성, 및 비용 효율을 보증함을 유리하게 특징으로 하는 AAV의 생산을 위한 시스템을 나타내며, 이는 헬퍼 바이러스의 사용을 필요로 하지 않는다.
도면은 다음을 나타낸다:
도 1:
rep 유전자자리의 개략적인 개요.
도 2:
유도성 Rep 단백질에 대한 발현 작제물의 개략적 개요.
도 3:
상응하는 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역의 서열 번호를 지닌 분석된 돌연변이 양식의 개요(참고: 또한 표 2). 도 3에서 표시 "SEQ-ID"는 각각의 서열 번호를 나타낸다.
도 4:
p19 프로모터의 조절 서열 내에 사일런트 돌연변이를 함유하는 상이한 작제물(표 2) 및 야생형 작제물(wt)로 형질감염시 CAP 세포내에에서 상이한 Rep 단백질의 발현. 단백질 수준은 항-레플리카제 항체(Progen)를 사용한 형질감염 후 72시간째에 일시적으로 형질감염된 CAP-T 세포의 세포 분해물 속에서 검출되었다. 대조군으로서, 형질감염되지 않은 세포의 세포 분해물이 포함되었다(Bl). 도 4에서 "ID" 번호의 표시는 각각의 서열 번호를 지칭한다.
도 5:
항-Rep 웨스턴 블롯(western blot)의 정량화. Rep 단백질 밴드는 ImageJ를 사용하는 농도계 분석(densitometric analysis)으로 정량화하였다. 긴 Rep 단백질 밴드 대 짧은 Rep 단백질 밴드의 비를 계산하고 wt를 1로 설정하였다. 모든 다른 값을 wt에 대해 표준화하였다. 도 5에서 "ID" 번호의 확인은 각각의 서열 번호를 지칭한다.
도 6:
1 μg/mL의 독시사이클린을 사용한 유도시 안정한 CAP 유래된 세포주에서 Rep 단백질의 유도성 발현. Rep 단백질은 항-레플리카제 항체(Progen)를 사용한 면역블롯으로 검출하였다. 대조군으로서, 유도되지 않은 세포의 세포 분해물을 로딩(loading)하였다(-Dox). ~80 kDa에서, 비특이적인 배경 밴드가 검출된다.
도 7:
안정한 세포주로부터 유래된 단일 세포 클론에서 1 μg/mL 독시사이클린의 첨가에 의한 Rep 단백질의 유도. 세포를 rAAV5 생산을 위한 필수 성분으로 일시적으로 형질감염시키고 형질감염 5시간 후 1 μg/mL 독시사이클린으로 유도하였다. 72 시간 형질감염 후, 세포 분해물을 제조하여, Rep 단백질의 발현을 항-레플리카제 항체(Progen)를 사용한 면역블롯으로 검출하였다. 클론 5B6 및 2E3은 매우 낮은 수준의 긴 Rep 단백질을 발현한다.
도 8:
유도성 Rep 발현 클론에 의한 rAAV5 생산의 바이러스 역가(titer). 바이러스 게놈/mL를 표준물로서 선형화된 전달 플라스미드를 사용하여 CMV-프로모터를 검출하는 프라이머/프로브 조합으로 qPCR에 의해 측정하였다. 단일 세포 클론 5B6 및 2E3은 긴 및 짧은 Rep 단백질의 선명한 발현을 나타내지 않으므로, 또한 매우 낮은 역가의 rAAV5 만을 생산한다.
도 9:
(A & B): 보존적 아미노산 교환 및 야생형 작제물(wt)을 생성하는 p19 프로모터(표 3)의 조절 서열 내에 돌연변이를 함유하는 상이한 작제물을 사용한 형질감염시 CAP 세포내에서 상이한 Rep 단백질의 발현. 단백질 수준은 항-레플리카제 항체(Progen)를 사용한 형질감염 72시간 후 일시적으로 형질감염된 CAP-T 세포의 세포 분해물에서 검출하였다. 대조군으로서, 형질감염되지 않은 세포의 세포 분해물을 포함시켰다(BI).
(C): 다음 작제물 조합을 사용한 CAP 세포의 형질감염시 바이러스 생산: pStbl-Rep-p19mut-ID 47, 48 또는 37 또는 wt, pStbl-TRE3G-Rep50/42, pCMV-Tet3G, pHelper, pStbl-CMV-Cap5, pAAV-GFP. 바이러스 게놈/mL를 표준물로서 선형화된 전달 플라스미드를 사용하여 SV40 PolyA를 검출하는 프라이머/프로브 조합을 사용한 qPCR에 의해 측정하였다.
도 9에서 "ID" 수의 표시는 각각의 서열 번호를 지칭한다.
본 발명은 이에 한정되지 않는 다음의 실시예에서 추가로 나타내어질 것이다.
실시예
실험 과정:
발현 작제물의 클로닝(cloning).
p19 프로모터 내에서 각각의 말단 및 조절 부위에서 HpaI 제한 부위를 지닌 AAV2의 rep 유전자자리의 합성. AAV2의 게놈 서열은 진뱅크(GenBank): AF043303 (뉴클레오타이드 162 내지 2332)로부터 유래하였다. 합성 유전자자리의 서열은 서열 번호: 29에 나타낸다.
p19 프로모터 영역(AAV2 게놈의 뉴클레오타이드 651 내지 1053번)에 대한 상이한 작제물을 조절 서열(표 2) 내에서 상이한 수의 사일런트 돌연변이를 함유하도록 설계하고(표 2) 합성적으로 생산하였다.
각각의 발현 작제물은 표준 클로닝 기술에 의해 생산하고 서열분석으로 입증하였다. 최종 발현 작제물의 성분 pStbl-bsd-Rep, pStbl-bsd-Rep-p19mut-서열 번호: 1 내지 14, 34 내지 42는 p5 프로모터, 돌연변이된 또는 wt p19 프로모터를 함유하는 Rep 유전자자리, SV40 폴리(A), 사람 Ubc 프로모터의 제어 하의 블라스티시딘 선택 카세트, 통합된 ORF의 안정한 전사를 위한 향상 성분, 이. 콜라이(E. coli) 내에서 증식을 위한 pUC ori, 및 이. 콜라이 내에서 선택을 위한 앰피실린 내성 카세트이었다.
제3 세대의 Tet-유도성 프로모터(TRE3G-프로모터)(도 2)의 제어 하에서 Rep 단백질을 위치시키는 작제물을 표준 클로닝 기술로 생산하고 서열분석으로 입증하였다. TRE3G 프로모터로부터 출발하여 SV40 폴리(A)까지, 이러한 작제물 pStbl-bsd-TRE3G-Rep52/40-IRES-Rep78/68의 최종 서열은 서열 번호: 30에 나타낸다. pStbl-bsd-TRE3G-Rep52/40-IRES-Rep78/68의 구성성분은 TRE3G 프로모터, 짧은 Rep 단백질의 출발 코돈으로부터 출발하는 Rep 유전자자리, ECMV의 IRES 서열, 긴 Rep 단백질의 출발 코돈으로부터 출발하여 돌연변이된 p19 프로모터를 함유하는 Rep 유전자자리, SV40 폴리(A), 사람 Ubc 프로모터의 제어 하의 블라스티시딘 선택 카세트, 및 통합된 ORF의 안정한 전사를 위한 향상 성분이다.
세포 배양
CAP 세포를 진탕 플라스크(125mL; Corning) 속에서 4 mM L-알라닐-L-글루타민(Biochrom, 독일)이 보충된 화학적으로 정의된, 혈청 유리된 PEM 배지(Thermo Fisher Scientific) 속에서 진탕 항온처리기 상에서 185 rpm(5 cm orbit), 5% CO2 및 37℃에서 통상적으로 배양하였다.
통상의 배양 동안, 세포를 신선한 배지로 72 내지 96 시간마다 1 × 106개 세포/ml의 살아있는 세포 밀도로 희석시키고 생존능을 CEDEX XS 세포 계수기(Innovatis, Roche Applied Science)를 사용하여 트립판 블루 배제로 측정하였다. Tet-on-3G-활성인자를 발현하는 안정한 세포주를 25 μg/mL G418의 존재하에서 배양하고; pStbl-bsd-TRE3G-Rep50/42-IRES-Rep78/68을 사용한 핵감염시 5 μg/mL의 블라스티시딘을 가하였다.
Rep 단백질 발현을 시험하기 위한 일시적인 형질감염 및 웨스턴 블롯
일시적인 형질감염을 FreeStyle 293 배지(Thermo Fisher Scientific) 속에서 PEImax(PolySciences)를 사용하여 수행하였다. 5시간 형질감염 후, 세포에 완전 PEM 배지(Thermo Fisher Scientific)를 공급하였다. 생성된 일시적인 형질감염 혼주물(pool)의 개요는 하기 표 4에서 찾는다.
웨스턴 블롯 분석을 1 × 105개의 형질감염된 세포로부터의 세포 분해물을 사용하여 마우스-항-레플리카제 항체(Progen, 독일) 및 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 항-마우스 항체(Cell Signaling)를 사용하여 수행하였다. 단백질은 화학발광성 검출기(INTAS)를 통해 Pierce ECL WB 기질 키트(substrate kit)를 사용하여 검출하였다.
안정한 혼주물의 핵감염 및 생성
안정한 혼주물을 제조업자의 설명서에 따라 론자 핵감염기(Lonza's Nucleofector)를 사용하여 생성시켰다. 제3 세대의 Tet-on-3G 트랜스활성인자(transactivator)를 발현하는 안정한 CAP 세포주를 유도성 Rep-발현 작제물을 사용한 핵감염에 사용하였다. 각각의 핵감염 반응을 위해, 1 × 107개의 세포를 원심분리(150 xg, 5분)로 수거하였다. 세포를 100 μL의 완전 핵감염기 용액 V(Lonza) 속에 재현탁시키고 5 μg의 선형화된 발현 벡터와 혼합하였다. DNA/세포 현탁액을 큐베트 내로 이동시키고 핵감염을 X001 프로그램을 사용하여 수행하였다. 형질감염된 세포를 12.5 mL의 성장 배지로 이동시키고 앞서 기술된 바와 같이 37℃, 5% CO2에서 185 rpm으로 배양하였다.
안정한 혼주물의 생성을 위해, 세포를 원심분리로 펠렛화하고 선택 배지(참고: 표 4) 속에서 형질감염 72 내지 96시간 후 재현탁시킨 후 앞서 기술한 바와 같이 진탕 항온처리기 속에서 배양시켰다.
표 4: 생성된 CAP-T 일시적인 발현 및 상응하는 발현 벡터 및 배지와의 CAP 안정한 혼주물:
Figure pct00005
상기 표 4에서 "ID" 번호의 표시는 각각의 서열 번호를 지칭한다.
AAV 생산에 대해 시험하기 위한 유도 및 일시적인 형질감염
유도성 Rep 발현을 사용한 안정한 단일 세포 클론에 의한 AAV 생산에 대해 시험하기 위해, 일시적인 형질감염을 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다. 다음의 3개의 작제물을 사용하여 rAAV5의 생산에 대한 추가의 구성성분을 1:1:0.5(pAAV-GFP : pHelper : pStbl-CMV-Cap5)의 비로 제공하였다. 5시간 형질감염 후, 1 μg/mL의 독시사이클린(Clontech)의 최종 농도를 가하여 Rep 단백질의 발현을 유도하였다.
72시간 형질감염 후, 세포 현탁액을 수거하였다. 세포를 0.5% 트리톤-X를 첨가하여 분해하고 30분 동안 37℃에서 1300 rpm으로 항온처리하였다. 원심분리 후, 상층액을 완충액(50 mM 트리스/HCl, pH 8.0; 2 mM MgCl2)으로 10배 희석시키고 125 U/mL 벤조나제(Merck Millipore)와 함께 2시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 2 mM EDTA의 첨가 및 70℃에서 10분 동안 항온처리를 사용하여 벤조나제를 불활성화시켰다. 바이러스 DNA를 Pure Link Viral RNA/DNA 미니키트(Thermo Fisher Scientific)를 통해 제조업자의 설명서에 따라 정제하였다.
바이러스 역가를 측정하기 위한 qPCR
CMV 프로모터 또는 SV40 폴리 A에 대해 지시된 다음의 프라이머/이중-표지된 프로브 조합(MWG에서 주문함, Eurofins; 표 5)을 사용하여 바이러스 역가를 측정하였다:
표 5: 바이러스 역가를 측정하기 위해 사용된 프라이머/프로브 조합:
Figure pct00006
표준물로서, 정의된 카피 수(copy number)를 지닌 선형화된 전이유전자 플라스미드를 사용하였다. qPCR 반응은 다음의 구성성분을 함유하였다: 2 x 브릴리언트 멀티플렉스(Brilliant Multiplex) qPCR 마스터 혼합물(Master Mix)(Agilent), 뉴클레아제-유리된 H2O(Thermo Fisher Scientific), 프라이머/프로브 혼합물 및 샘플/표준물. qPCR을 제조업자의 설명서에 따라 Agilent Mx3005P에서 수행하였다.
실시예 1:
REP 단백질의 발현시 사일런트 돌연변이의 효과.
도입:
CAP 세포는 사람 양수세포-유래된 현탁 세포이며, 이는 E1A/E1B를 암호화하는 작제물을 사용한 안정한 형질감염에 의해 무한증식되었다.
AAV Rep 단백질은 AAV 게놈에 의해 암호화된다. 총 4개의 Rep 단백질이 존재한다: Rep78 및 Rep68(p5 프로모터로부터 발현됨); 뿐만 아니라 Rep52 및 Rep40(긴 Rep 단백질의 암호화 영역내에 위치하는 p19 프로모터로부터 발현됨). 이러한 단백질은 AAV 게놈의 복제 및 패키징을 매개한다. 그러나, 상기 단백질은 안정하게 발현되는 경우 세포에 대해 독성이다. 사일런트 돌연변이의 도입에 의한 내부 p19 프로모터의 불활성화를 위해, p19 프로모터의 조절 성분을 확인하고 최종 단백질 서열에 영향을 미치지 않는 상이한 사일런트 돌연변이를 이러한 조절 성분의 뉴클레오타이드 서열내로 삽입하였다.
결과:
긴 및 짧은 Rep 단백질의 발현을 p19 프로모터의 조절 서열내에 사일런트 돌연변이를 도입시킴으로써 성공적으로 분리하였다. 돌연변이를 지닌 대부분의 버젼은 짧은 Rep 단백질의 유의적으로 감소된 발현을 나타내었다. 짧은 Rep 단백질의 발현에 있어서의 감소는 하나의 단일 돌연변이의 도입시 이미 가시적으로 되어 20개 이하의 돌연변이를 도입시키는 경우 보다 확연해진다(도 4, 도 5). 5' 및 3' 모티프(motif)의 분리는 특히 프로모터 다음의 3' 모티프가 (SP1 -50; TATA -35, TATA -20) 내부 p19 프로모터의 활성화에 중요함을 나타내었다. TATA -20 모티프만을 돌연변이시키는 것은 유의적이지만 짧은 rep 단백질의 발현의 완전한 감소는 초래하지 않으며 또한 SP1 -50 및 TATA -35가 발현의 활성화에 중요함을 시사하고, 이는 TATA -20을 제외한 모든 것을 돌연변이시키는 것이 또한 짧은 rep 단백질의 발현의 명백한 감소를 야기하였다는 사실에 의해 추가로 뒷받침된다. 단일 모티프에서 보다 가까운 것으로 보이는, 특히 SP1 -50 모티프 및 보다 정확하게는 돌연변이 824G>H는 짧은 rep 단백질의 발현의 매우 명확한 감소를 생성하였다. 또한, TATA -20의 돌연변이는 짧은 rep 단백질의 발현을 매우 명확하게 감소시켰다. TATA -35의 경우, 모티프내 상이한 돌연변이의 조합만이 발현에 있어서 가장 큰 효과를 갖는 돌연변이 848A>G를 사용한 매우 명확한 감소를 야기하였다.
Rep 단백질을 유도적으로 발현하는 안정한 세포주를 생성하기 위하여, 사이런트 돌연변이를 수반하는 긴 Rep 단백질에 대한 유전자 및 짧은 Rep 단백질에 대한 유전자를 분리하고 각각은 유도성 프로모터의 제어 하에 두었다. 추가의 실험을 위해, 19 돌연변이를 지닌 p19mut 작제물을 선택하였다.
실시예 2:
AAV2의 Rep 단백질을 유도적으로 발현하는 안정한 CAP 클론의 생성
도입:
AAV2 Rep 단백질에 대한 유도성 발현 카세트의 생성을 위해 19개의 사일런트 돌연변이를 지닌 p19mut 변이체를 선택하였다.
제3 세대의 Tet-유도성 프로모터(TRE3G-프로모터)를 사용하여 독시사이클린 첨가에 의해 Rep 단백질의 발현을 조절하였다(작제물의 개요는 도 2를 참고한다). Tet-on-3G 트랜스활성인자를 발현하는 CAP 세포를 핵감염 및 25 μg/mL G418를 사용한 선택에 의해 미리 생성시켰다. pStbl-bsd-TRE3G-Rep52/40-IRES-Rep78/68 작제물을 이러한 안정한 혼주물 속에서 핵감염시키고 5 μg/mL 블라스티시딘으로 선택하였다. 제한 희석을 사용하는 단일 세포 클로닝을 수행하고 클론을 Rep 단백질에 대한 웨스턴 블롯으로 스크리닝하였다.
결과:
Tet-on-3G 트랜스활성인자 및 pStbl-bsd-TRE3G-Rep52/40-IRES-Rep78/68를 수반하는 안정한 CAP 세포 혼주물을 독시사이클린을 사용한 유도 전 및 후에 상이한 rep 단백질의 발현에 대해 웨스턴 블롯으로 분석하였다(도 6). 독시사이클린 유도없이, Rep 단백질에 대해 특이적인 신호는 검출될 수 없는 반면, 긴 및 짧은 Rep 단백질 둘 다는 독시사이클린 유도시 발현되었다.
안정한 혼주물로부터, 단일 세포-유래된 클론을 제한 희석으로 생성시켰다. 단일 세포-유래된 클론을 독시사이클린 유도 후 Rep 단백질의 발현에 대해 분석하였다. 5개 클론 중, 3개 클론은 긴 및 짧은 Rep 단백질 둘 다를 예측된 비로 발현하였지만, 클론 중 2개는 감소된 수준의 긴 Rep 단백질을 나타내었다(도 7).
이러한 데이타는 p19 프로모터 내에서 사일런트 돌연변이를 지닌 rep 작제물을 사용하여, 긴 및 짧은 Rep 단백질 둘 다의 유도성 발현을 지닌 클론성 세포 집단을 생성시킬 수 있음을 나타낸다. 이러한 클론은 패키징/생산자 세포주의 생성을 위한 기반으로서 제공될 수 있다.
실시예 3:
AAV2의 Rep 단백질을 유도적으로 발현하는 안정한 CAP 클론내에서 AAV의 생산
도입:
유도성 Rep 세포주가 AAV 벡터를 생산할 수 있는지를 입증하기 위하여, AAV 생산을 위한 결여된 구성성분을 5개의 상이한 클론의 세포내로 일시적으로 도입시켰다.
pStbl 벡터내에서 CMV 프로모터의 제어 하에서 클로닝된 AAV5로부터의 캡시드 단백질, 추가의 헬퍼 유전자 E2A, E4orf6, VA RNA, 뿐만 아니라 목적한 유전자(GOI)를 지닌 전달 벡터: pAAV-GFP.
결과:
안정한 Rep 유도성 발현하는 세포주의 단일 세포 클론을 사용하여, AAV 생산은 결여된 필수 구성성분을 사용한 세포의 형질감염 및 독시사이클린 유도시 나타낼 수 있었다(도 8). 보다 낮은 수준의 긴 Rep 단백질을 사용한 2개의 클론은 또한 예측한 바와 같이 보다 낮은 AAV 역가를 나타내었다. 이는 이러한 접근법이 바이러스 벡터의 생산을 야기하며, 고 생산 AAV 패키징 세포주의 생성이 이제 가능하짐을 입증한다.
실시예 4:
보존적 아미노산 교환된 Rep 단백질을 사용한 AAV 생산
보존적 아미노산 교환을 생성하는 프로모터내 돌연변이 영역내의 도입에 의한 내부 p19 프로모터의 불활성화를 위해, p19 프로모터의 조절 성분을 확인하였다. 3개의 명백한 돌연변이, 846T>G, 847T>C, 848A>B를 TATA -20 영역의 뉴클레오타이드 서열 내로 삽입하여 보존적 Leu176>Ala 교환(ID23)을 생성하였다. 2개의 명백한 돌연변이, 823C>G, 824G>H를 SP1 -50 영역의 뉴클레오타이드 서열 내로 삽입하여 보존적 Ala168>Gly 교환(ID24)을 생성하였다. 상이한 작제물을 CAP-T 세포 내로 일시적으로 도입하고 긴 및 짧은 Rep 단백질의 발현 수준을 분석하고 wt 및 mut-20(ID28)과 비교하였다(도 9a, b).
TATA -20 또는 the SP1 -50 영역내에 보존적 아미노산 교환을 사용하여 긴 rep 단백질의 기능성을 입증하기 위해, AAV를 다음의 작제물 조합을 CAP-T 세포내로 도입함으로써 생산하였다: 긴 Rep 단백질, pStbl-Rep-p19mut-ID23, 또는 -ID24, 또는 -mut20, 또는 -wt를 암호화하는 작제물과 함께, 짧은 Rep 단백질을 암호화하는 작제물(pStbl-TRE3G-Rep50/42), pCMV-Tet3G, 및 추가의 헬퍼 유전자 E2A, E4orf6, VA RNA, 뿐만 아니라 목적한 유전자(GOI), pAAV-GFP를 지닌 전달 벡터(도 9c).
결과:
웨스턴 블롯 분석은 긴 및 짧은 Rep 단백질의 발현이 p19 프로모터의 조절 서열내에 명백한 돌연변이를 도입시킴으로써 성공적으로 분리되어 SP1 -50 또는 TATA -20 영역 내에서 보존적 아미노산 교환을 생성하였음을 나타내었다.
앞서와 같이 SP1 -50 영역 내 돌연변이는 TATA -20 박스 내에 도입된 돌연변이보다 더 두드러진 효과를 가졌으며, SP1 -50의 중요한 역활을 입증한다(도 9a, b).
중요하게는, Leu176>Ala(ID23) 또는 Ala168>Gly(ID24) 교환을 지닌 긴 Rep 단백질의 기능성은 일시적인 생산을 통한 AAV 입자의 생산에 의해 입증될 수 있었다. 보존적 아미노산 교환을 지닌 Rep 단백질로 생산된 AAV 입자의 역가는 ID24 샘플에서 AAV 역가의 일부 감소와 함께, wt 또는 mut-20 대조군과 동일한 범위 내에 있다(도 9c).
본 발명은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
서열 번호: 1
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut19
굵은 글씨: p19 프로모터 내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역 내 돌연변이
Figure pct00007
서열 번호: 2
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut5
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00008
서열 번호: 3
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut1
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00009
서열 번호: 4
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut2
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00010
서열 번호: 5
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut1-2
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00011
서열 번호: 6
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut14
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00012
서열 번호: 7
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut10
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00013
서열 번호: 8
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut10-2
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00014
서열 번호: 9
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut3
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00015
서열 번호: 10
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut2-2
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00016
서열 번호: 11
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut2-3
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00017
서열 번호: 12
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut1-3
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00018
서열 번호: 13
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut5-2
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00019
서열 번호: 14
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut20
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00020
서열 번호: 15
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut19를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00021
서열 번호: 16
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut5를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00022
서열 번호: 17
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut1을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00023
서열 번호: 18
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut2를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00024
서열 번호: 19
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut1-2를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00025
서열 번호: 20
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut14를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00026
서열 번호: 21
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut10을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00027
서열 번호: 22
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut10-2를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00028
서열 번호: 23
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut3을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00029
서열 번호: 24
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut2-2를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00030
서열 번호: 25
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut2-3을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00031
서열 번호: 26
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut1-3을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00032
서열 번호: 27
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut5-2를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역-2
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00033
서열 번호: 28
돌연변이된 p19 프로모터 영역 mut20을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00034
서열 번호: 29
합성 AAV2 rep 유전자자리
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: Hpal 제한 부위
Figure pct00035
서열 번호: 30
AAV2 Rep 단백질에 대한 유도성 발현 작제물
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
서열 번호: 31
CMV 전방 프라이머
Figure pct00039
서열 번호: 32
CMV 역방 프라이머
Figure pct00040
서열 번호: 33
CMV 프로브
Figure pct00041
서열 번호: 34
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 L(SP1 -50)
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00042
서열 번호: 35
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 M(TATA -20)
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00043
서열 번호: 36
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 N(SP1 -50 1)
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00044
서열 번호: 37
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 O(SP1 -50 2)
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00045
서열 번호: 38
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 P(TATA -20 1)
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00046
서열 번호: 39
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 Q (TATA -20 2)
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00047
서열 번호: 40
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 R(SP1 -50 & TATA -35)
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00048
서열 번호: 41
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 S(SP1 -50 & TATA -20)
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00049
서열 번호: 42
AAV2 돌연변이된 p19 프로모터 영역 T(TATA -20 & TATA -35)
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00050
서열 번호: 43
돌연변이된 p19 프로모터 영역 L을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역(SP-1)
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00051
서열 번호: 44
돌연변이된 p19 프로모터 영역 M(TATA -20)을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00052
서열 번호: 45
돌연변이된 p19 프로모터 영역 N(SP1 -50 1)을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00053
서열 번호: 46
돌연변이된 p19 프로모터 영역 O(SP1 -50 2)을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00054
서열 번호: 47
돌연변이된 p19 프로모터 영역 P(TATA -20 1)를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00055
서열 번호: 48
돌연변이된 p19 프로모터 영역 Q(TATA -20 2)를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00056
서열 번호: 49
돌연변이된 p19 프로모터 영역 R(SP1 -50 & TATA -35)을 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00057
서열 번호: 50
돌연변이된 p19 프로모터 영역 S(SP1 -50 & TATA -20)를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00058
서열 번호: 51
돌연변이된 p19 프로모터 영역 T(TATA -20 & TATA -35)를 지닌 AAV2 Rep 단백질 암호화 영역
굵은 글씨: p19 프로모터내 조절 부위
밑줄: p19 프로모터 영역내 돌연변이
Figure pct00059
서열 번호: 52
SV40 폴리A 전방 프라이머
Figure pct00060
서열 번호: 53
SV40 폴리A 역방 프라이머
Figure pct00061
서열 번호: 54
SV40 폴리A 프로브
Figure pct00062
SEQUENCE LISTING <110> CEVEC Pharmaceuticals GmbH <120> INDUCIBLE AAV REP GENES <130> IP20203786DE <150> EP 17 001 562.2 <151> 2017-09-19 <160> 54 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut19 <400> 1 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac dcgbaacggc gccgggggbg ghaacaaagt hgthgatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccaatg ggchtggacv 180 aacatggaac agtacttgtc dgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 2 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut5-1 <400> 2 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180 aatatggaac agtacttgtc dgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 3 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut1-1 <400> 3 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180 aatatggaac agtatttgag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 4 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut2-1 <400> 4 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180 aatatggaac agtatttatc cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 5 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut1-2 <400> 5 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180 aatatggaac agtacttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 6 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut14 <400> 6 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac dcgbaacggc gccgggggbg ghaacaaagt hgthgatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccaatg ggchtggacv 180 aacatggaac agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 7 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut10-1 <400> 7 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac acggaacggc gccgggggag gcaacaaagt cgtcgatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180 aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 8 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut10-2 <400> 8 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccaatg ggchtggacv 180 aacatggaac agtacctbtc dgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 9 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut3 <400> 9 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180 aatatggaac agtatgcbag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 10 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region <400> 10 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggghtggact 180 aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 11 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region <400> 11 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180 aatatggaac agtatctbag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 12 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut1-3 <400> 12 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180 aatatggaac agtatctaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 13 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut5-2 <400> 13 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180 aatatggaac agtacctbtc cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 14 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV mutated p19 promoter region mut20 <400> 14 cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60 tggttcgcgg tcacaaagac dcgbaacggc gccgggggbg ghaacaaagt hgthgatgag 120 tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccaatg ggchtggacv 180 aacatggaac agtacctbtc dgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240 cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300 tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360 ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403 <210> 15 <211> 1932 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV Rep proteins coding region with mutated p19 promoter region mut19 <400> 15 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac dcgbaacggc 420 gccgggggbg ghaacaaagt hgthgatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccaatg ggchtggacv aacatggaac agtacttgtc dgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920 cactctctct ga 1932 <210> 16 <211> 1932 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV Rep proteins coding region with mutated p19 promoter region mut5-1 <400> 16 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga 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attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920 cactctctct ga 1932 <210> 17 <211> 1932 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV Rep proteins coding region with mutated p19 promoter region mut1-1 <400> 17 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttgag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920 cactctctct ga 1932 <210> 18 <211> 1932 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV Rep proteins coding region with mutated p19 promoter region mut2-1 <400> 18 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga 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ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920 cactctctct ga 1932 <210> 51 <211> 1932 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAR Rep proteins coding region with mutated p19 promoter region T (TATA -20 & TATA -35) <400> 51 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggacv aacatggaac agtacctbtc dgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920 cactctctct ga 1932 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> SV40 poly A forward primer <400> 52 agcaatagca tcacaaattt cacaa 25 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> SV40 poly A reverse primer <400> 53 ccagacatga taagatacat tgatgagtt 29 <210> 54 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> SV40 poly A probe <400> 54 agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtc 36

Claims (16)

  1. 아데노-관련된 바이러스(Adeno-associated virus: AAV) Rep 단백질 Rep78 및 Rep68을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로서, 내부 AAV 프로모터 p19가 상기 Rep78 및 Rep68 단백질의 기능성(functionality)을 유지하는 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성화된 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 p19 프로모터 SP1 -50 영역, TATA -20 영역, 및 TATA -35 영역 중 적어도 하나 내에 있는 숙주 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 사일런트 돌연변이(silent mutation)인 숙주 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 돌연변이 731C>D, 732A>C, 734A>B, 737T>C, 746A>G, 749C>D, 752G>H, 758G>A, 761G>H, 764G>H, 818G>A, 824G>H, 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C, 8484A>B, 848A>G, 849A>T, 850G>C, 및 851C>D로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 숙주 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호: 1 내지 8, 11 내지 14, 및 34 내지 42에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호: 15 내지 22, 25 내지 28, 및 43 내지 51에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 하나 이상의 보존적 아미노산 교환을 야기하는 돌연변이인 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 교환이 지방족 아미노산의 부류(Gly, Ala, Val, Leu, Ile) 내, 하이드록실- 또는 황/셀레늄-함유 아미노산의 부류(Ser, Cys, Sec, Thr, Met) 내, 염기성 아미노산의 부류(His, Lys, Arg) 내, 또는 산성 아미노산의 부류(Asp, Glu, Asn, Gln) 내에서의 아미노산 교환인 숙주 세포.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호: 9 및 10에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호: 23 및 24에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의한 바와 같은 핵산에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하고, 상기 청구항들에서 정의된 특이적인 돌연변이가 존재하는, 숙주 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 숙주 세포 게놈내로 안정하게 통합되거나 벡터내에 포함되는 숙주 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 프로모터의 제어 하에서 AAV Rep 단백질 Rep52 및 Rep40을 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CAP 세포, HEK293 세포, 및 Per.C6 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 또는 제12항에 정의된 바와 같은 벡터.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포내에서 AAV Rep 단백질 Rep78 및 Rep68을 재조합적으로 발현시키는 단계를 포함하는, 아데노-관련된 바이러스(AAV)의 생산 방법.
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