KR20200069358A - 키메라 항원 수용체 발현 세포의 제조 방법 - Google Patents

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조셉 에이. 프라이에타
잔 제이. 멜렌호스트
엘레나 올란도
로더릭 오코너
카를 에이치. 준
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노파르티스 아게
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 개시는 CAR 발현 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포, 또는 NK 세포)의 제조 방법, 그리고 조성물 및 이를 포함하는 반응 혼합물을 제공한다. 또한, 본 개시는 상기 CAR 발현 면역 이펙터 세포를 이용하는 방법을 제공한다.

Description

키메라 항원 수용체 발현 세포의 제조 방법
본 발명은 일반적으로 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포, 또는 NK 세포)를 발현하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 제조 방법, 그리고 조성물 및 이를 포함하는 반응 혼합물에 관한 것이다.
자가 T 세포, 특히 키메라 항원 수용체(CAR)가 형질도입된 T 세포를 이용한 입양 세포 이식(ACT) 요법은 여러 혈액암 시험에서 가능성을 보여주었다.
자가 유전자 변형된 T 세포의 제조는 현재, CAR을 발현하는 조작된 치료적 T 세포가 유래되는 (예컨대, 백혈구 분리반출술로부터 수득한) 환자의 물질에서부터 출발하는 복잡한 과정이다. 환자 백혈구 분리반출술 물질은 높은 수준의 세포 성분 변이성을 나타낼 수 있다. 이 출발 물질은 환자마다 세포 조성에 있어서 그리고 하나의 질환 상태 내에서 크게 다를 수 있다. 세포 불순물은 과립구, 단핵구, 적혈구, 순환 모세포, 및 혈소판을 포함할 수 있다. 자가 세포 치료제 제조 공정은 환자의 상이한 치료 이력, 질환 상태 등과도 싸워야 하는데, 이들은 출발 물질의 세포 함량에 추가로 영향을 미친다(문헌[Burger et al. 2014], 문헌[Kaiser et al. 2015], 문헌[Ramos et al. 2009]). 나아가, 출발 물질로부터의 이러한 불순물은 제조 공정, 궁극적인 제품의 품질, 및 제품의 치료 효능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 더욱 일관된 CAR 발현 세포 치료제의 생산을 제공하여 제조 공정을 간소화하고, 제품의 품질을 개선하며, 제품의 치료 효능을 최대화하는 방법 및 공정이 필요하다.
본 개시는 CAR 발현 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)의 제조 방법, 그리고 조성물 및 이를 포함하는 반응 혼합물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제조 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 (i) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은, Stat3 활성제, (ii) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG), 또는 (i)과 (ii) 둘 다와 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 개시는, 일부 양태에서, CAR 발현 세포를 이용한 치료적 처치를 받을 대상체, 받을 예정인 대상체, 받았던 대상체 또는 받고 있는 대상체를 평가, 예측, 선택, 또는 모니터링하는 방법을 제공한다. 또한, CAR 발현 세포를 이용한 치료적 처치에 대한, 암(예컨대, 본 명세서에서 기술된 암)을 앓는 대상체의 반응성을 평가 또는 예측하는 방법이 본 명세서에서 기술된다.
일부 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 면역 이펙터 세포 집단의 제조 방법이 본 명세서에서 개시되며, 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포의 집단을 제공하는 단계;
b) 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR 폴리펩티드 암호화 핵산과 접촉시키는 단계;
c) 면역 이펙터 세포의 집단을 Stat3 활성제와 접촉시키는 단계;
및
d) 세포를 CAR 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 유지하고, 이에 의해 CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 단계.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 다음 중 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟 개, 또는 전부, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된다:
i) gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체, 또는 IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자, OSM 분자;
ii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 가용성 IL-6 수용체(sIL-6R);
iii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-6/IL-6R 복합체, 예컨대, 이량체;
iv) IL-6 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, IL-31 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자 또는 OSM 분자);
v) CCL20 분자;
vi) IL-10R2 수용체(IL-10R2) 활성제, 예컨대, IL-10 분자, IL-22 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자, IL-29 분자, 또는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-10R2에 결합하는 항체 분자;
vii) IL-10 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-10 분자, IL-19 분자, IL-20 분자, IL-22 분자, IL-24 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자 또는 IL-29 분자);
viii) IL-17 패밀리 사이토카인(예컨대, IL17A 분자, IL17B 분자, IL17C 분자, IL17D 분자, IL17E 분자 또는 IL17F 분자); 또는
ix) IL-23 분자.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체이다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 방법은 IL-21 분자, 예컨대, IL-21을 첨가하는 단계를 포함하거나, 또는 본 명세서의 반응 혼합물은 IL-21 분자, 예컨대, IL-21을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 반응 혼합물은 IL-21 분자, 예컨대, IL-21을 포함하지 않거나, 또는 본 명세서의 방법은 IL-21 분자, 예컨대, IL-21을 첨가하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 방법은 IL-30 분자를 첨가하는 단계를 포함하거나, 또는 본 명세서의 반응 혼합물은 IL-30 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 방법은 IL-6Rα 활성제, 예컨대, IL-6Rα에 결합하는 항체 분자를 첨가하는 단계를 포함하거나, 또는 본 명세서의 반응 혼합물은 IL-6Rα 활성제, 예컨대, IL-6Rα에 결합하는 항체 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-6 패밀리 사이토카인은 IL-6 분자를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로,
예컨대, 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로 gp130 분자의 번역을 허용하는 조건 하에 gp130 분자 암호화 핵산을 도입함으로써, gp130 분자; 또는
예컨대, 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로 Stat3 분자의 번역을 허용하는 조건 하에 Stat3 분자 암호화 핵산을 도입함으로써, Stat3 분자(예컨대, 구성적 활성 Stat3 분자(STAT3C))를 도입하는 단계를 더 포함한다.
일부 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 면역 이펙터 세포 집단의 제조 방법이 본 명세서에서 개시되며, 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포의 집단을 제공하는 단계;
b) 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR 폴리펩티드 암호화 핵산과 접촉시키는 단계;
c) 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로,
예컨대, 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로 gp130 분자의 번역을 허용하는 조건 하에 gp130 분자 암호화 핵산을 도입함으로써, gp130 분자; 또는
예컨대, 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로 Stat3 분자의 번역을 허용하는 조건 하에 Stat3 분자 암호화 핵산을 도입함으로써, Stat3 분자(예컨대, 구성적 활성 Stat3 분자(STAT3C))를 도입하는 단계; 및
d) 세포를 CAR 폴리펩티드, gp130 분자 또는 Stat3 분자의 발현을 허용하는 조건 하에 유지하고, 이에 의해 CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 단계.
일부 구현예에서, 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 다음 중 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟 개, 또는 전부, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 Stat3 활성제와 접촉시키는 단계를 더 포함한다:
i) gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체, 또는 IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자, OSM 분자;
ii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 가용성 IL-6 수용체(sIL-6R);
iii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-6/IL-6R 복합체, 예컨대, 이량체;
iv) IL-6 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, IL-31 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자 또는 OSM 분자);
v) CCL20 분자;
vi) IL-10R2 수용체(IL-10R2) 활성제, 예컨대, IL-10 분자, IL-22 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자, IL-29 분자, 또는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-10R2에 결합하는 항체 분자;
vii) IL-10 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-10 분자, IL-19 분자, IL-20 분자, IL-22 분자, IL-24 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자 또는 IL-29 분자);
viii) IL-17 패밀리 사이토카인(예컨대, IL17A 분자, IL17B 분자, IL17C 분자, IL17D 분자, IL17E 분자 또는 IL17F 분자); 또는
ix) IL-23 분자.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체이다.
일 구현예에서, IL-6 패밀리 사이토카인은 IL-6 분자를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, gp130 분자 또는 Stat3 분자의 발현은 일시적(예컨대, 유도성 또는 비 유도성)이거나 구성적이다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, gp130 분자 또는 Stat3 분자는 면역 이펙터 세포의 집단을,
CAR 폴리펩티드 암호화 핵산; 또는
예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제와 접촉시키기 전에, 동시에, 또는 접촉시킨 후에 면역 이펙터 세포의 집단 내로 도입된다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, Stat3 분자(예컨대, 구성적 활성 Stat3(STAT3C)) 암호화 뉴클레오티드를 포함하는 핵산은 CAR, 예컨대, CD19 CAR 암호화 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, Stat3 활성제는 gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체이다. 일부 구현예에서, 방법은 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진(non-exhausted) 초기 기억 T 세포가 강화된(예컨대, 수준이 증가된) T 세포, 예컨대, CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 집단을 초래한다. 일부 구현예에서, 방법은 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CD4+ 또는 CD8+ 초기 기억 T 세포의 강화를 초래한다. 일부 구현예에서, 초기 기억 T 세포는 다음 특성 중 하나 또는 둘 다를 갖는다: CD27+ 및/또는 CD45RO dim/neg, 예컨대, CD27+ CD45RO dim/neg. 일부 구현예에서, 방법은 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CD4+ 또는 CD8+ 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화를 초래한다. 일부 구현예에서, 비 소진 초기 기억 T 세포는 다음 특성 중 하나 이상, 예컨대, 전부를 갖는다: (i) PD-1 음성; (ii) CD27hi; (iii) CCR7hi; 또는 (iv) CD45ROdim/neg. 일부 구현예에서, 비 소진 초기 기억 T 세포는 PD-1 음성 CD27hi CCR7hi CD45ROdim/neg이다. 일부 구현예에서, T 세포, 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화된 집단은, 예컨대, 증가된 수준의, 예컨대, 적어도 5~90% 더 많은(예컨대, 적어도 5~10, 10~20, 20~30, 30~50, 50~70, 또는 70~90% 더 많은, 또는 5~90, 10~85, 15~80, 20~75, 25~70, 30~70, 35~65, 40~60, 또는 45~55% 더 많은) 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포, 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화된 집단은 증가된 수준의, 예컨대, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30% 더 많은), 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, 증가된 수준의 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포는 예컨대, 실시예 2에서 기술된 바와 같은, Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단과 비교된다. 일부 구현예에서, Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단은 예컨대, 실시예 2에서 기술된 바와 같은, 예컨대, 강화가 수행된, 동일한 T 세포의 집단, 예컨대, 강화 전 집단, 예컨대, 출발 집단이다. 일부 구현예에서, Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단은 상이한 T 세포의 집단, 예컨대, 강화가 수행되지 않은 집단이다.
일부 구현예에서, CD4+ T 세포, 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화된 집단은 Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단과 비교하여 증가된 수준의, 예컨대, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20% 더 많은(예컨대, 적어도 8%), 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포를 갖는다.
일부 구현예에서, CD8+ T 세포, 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화된 집단은 Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단과 비교하여 증가된 수준의, 예컨대, 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30% 더 많은(예컨대, 적어도 20%), 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포를 갖는다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, Stat3 활성제는 다음 중 하나, 둘, 세 개, 또는 전부를 포함한다: IL-6 분자, IL-17 분자, IL-22 분자 또는 CCL20 분자. 일 구현예에서, Stat3 활성제는 천연 분자, 재조합 분자 또는 정제된 분자이다. 일 구현예에서, Stat3 활성제는 혈청에 존재하지 않는다. Stat3 활성제는 예컨대, Stat3을 활성화시키기에, 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 예컨대, 티로신 705(Y705)에서, 예컨대, Stat3을 인산화시키기에, 충분한 양으로 존재하지 않는다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, Stat3 활성제는 가용성(예컨대, 기질에 결합되지 않음)이고, 일부 구현예에서, Stat3 활성제는 기질(예컨대, 비드 또는 세포)에 위치, 예컨대, 고정화된다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서 Stat3 활성제는 기질, 예컨대, 비드 또는 세포에 위치, 예컨대, 고정화된다. 일 구현예에서, Stat3 활성제는 예컨대, Stat3 활성제 세포, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은, 인공 항원 제시 세포(APC)에 위치된다.
일부 구현예에서, 인공 APC는 다음 중 하나, 둘, 또는 전부를 포함한다:
(i) MHC 분자(예컨대, 표면에 MHC 분자를 발현한다);
(ii) 공동 자극 단백질(예컨대, 표면에 공동 자극 단백질을 발현하거나, 또는 공동 자극 단백질이 접합된다); 및/또는
(iii) 항원, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항원, 예컨대, CAR 발현 세포, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포에 의해 인식되는 항원.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, Stat3 활성제는 Stat3 활성제 세포에 의해 발현되거나 Stat3 활성제 세포의 표면에 접합된다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는 예컨대, Stat3을 활성화시키기에, 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 예컨대, 티로신 705(Y705)에서, 예컨대, Stat3을 인산화시키기에, 충분한 양으로 제공된다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는, 비슷한 조건 하에 배양되나 Stat3 활성제와 접촉되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여, 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 12일의 배양 기간 후에 면역 이펙터 세포의 집단을 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9배 이상 확장시키기에 충분한 양으로 제공된다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는, 비슷한 조건 하에 배양되나 Stat3 활성제와 접촉되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여, 면역 이펙터 세포 집단 내의 CD27+ PD-1-인 세포의 백분율을 예컨대, 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5배 이상 증가시키기에 충분한 양으로 제공된다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는, 비슷한 조건 하에 배양되나 Stat3 활성제와 접촉되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여, 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 면역 이펙터 세포 집단 내의 gp130의 발현 수준을 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10배 이상 증가시키기에 충분한 양으로 제공된다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는 다음 중 하나, 둘, 셋, 네 개, 또는 전부(예컨대, 다섯 개)로부터 선택된다: IL-6 분자, IL-17 분자, IL-22 분자, IL31 분자, 및 CCL20 분자.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는 IL-6 분자, 예컨대, 재조합 IL-6을 포함한다. 일 구현예에서, IL-6 분자, 예컨대, 재조합 IL-6은 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 또는 30 ng/ml의 양으로, 또는 1~20, 1~15, 또는 5~15 ng/ml의 범위, 예컨대, 적어도 10 ng/ml로 제공된다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, 항-gp130 항체 분자는 B-S12 또는 B-P8 또는 B-S12 또는 B-P8로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR을 갖는 항체 분자로부터 선택된다. 일 구현예에서, 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 B-S12 및 B-P8 둘 다와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 항-gp130 항체 분자의 총량은 0.1~1000, 0.5~500, 또는 1~100 ug/ml이다. 일 구현예에서, 항-gp130 항체 분자는 적어도 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2 ug/ml, 예컨대, 약 1 ug/ml의 양으로 제공된다.
일부 구현예에서, 항-gp130 항체는
STAT3의 인산화에 의해 측정 시, gp130 매개성 신호전달을 유도하거나;
이량체화, 예컨대, gp130의 동종이량체화, 또는 gp130의, 예컨대, LIF, OSM 또는 CNTF와의 이종이량체화를 유도한다.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제의 존재 하에 배양된 세포의 집단은, 비슷한 조건 하에 배양되나 Stat3 활성제와 접촉되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여,
Stat3의 활성화, 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 예컨대, 티로신 705(Y705)에서, 예컨대, Stat3의 인산화;
예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 12일의 배양 기간 후에 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9배 이상의 확장;
면역 이펙터 세포 집단 내의 CD27+ PD-1-인 세포의 백분율의, 예컨대, 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5배 이상의, 증가;
예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 면역 이펙터 세포 집단 내의 gp130의 발현 수준의 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 또는 10배 이상의 증가;
를 나타낸다.
일부 구현예에서, CCL20 분자는 전장 천연 CCL20(예컨대, 포유류 CCL20, 예컨대, 인간 CCL20), CCL20의 활성 단편, 또는 CCL20의 천연 야생형 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 활성 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 가용성 IL-6 수용체는 전장 천연 IL-6 수용체(예컨대, 포유류 IL-6 수용체, 예컨대, 인간 IL-6 수용체), IL-6 수용체의 활성 단편, 또는 IL-6 수용체의 천연 야생형 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 활성 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-10R2 수용체 활성제는 IL-10R2 신호전달 경로를 활성화시키는 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-10R2 수용체 활성제는 예컨대, 폴리펩티드 또는 소분자를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-6/IL-6R 복합체는 IL-6 분자와 IL-6 수용체(IL-6R) 분자 사이의 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-6R 분자는 전장 천연 IL-6 수용체(예컨대, 포유류 IL-6 수용체, 예컨대, 인간 IL-6 수용체), IL-6 수용체의 활성 단편, 또는 IL-6 수용체의 천연 야생형 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 활성 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서 본 명세서에서 개시된 제조 방법은 예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 동안 또는 1~7, 7~14, 또는 14~21일 동안, 집단을 확장시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서 본 명세서에서 개시된 제조 방법은 Stat3 전사 표적, 예컨대, c-Myc, c-Fos, Sox2, Bcl-2, 또는 RORC의 수준 또는 활성을 측정하여 Stat3 경로 활성화 값을 결정함으로써 면역 이펙터 세포 집단에서의 Stat3 경로 활성화를 분석하는 단계를 더 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 Stat3 경로 활성화 값을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며, 이때, 기준값은 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은, 비슷한 조건 하에 배양되나 Stat3 활성제와 접촉되지 않는 다른 비슷한 면역 이펙터 세포의 집단으로부터 얻는다.
일부 구현예에서, 기준값과 Stat3 경로 활성화 값의 비교에 반응하여, 다음 중 하나 이상을 수행하는 단계를 포함한다:
치료제로 사용하기에 적합하거나 적합하지 않은 집단을 분류하는 단계;
치료적 용도를 위하여, 집단 또는 이의 일정 부분을 제형화 또는 포장하는 단계; 또는
배양 파라미터를 변경하는 단계, 예컨대, i) 배양에 있어서 시간 길이를 변경하거나, 또는 ii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, Stat3 활성제의 농도를 증가시키거나 감소시키는 단계.
본 명세서에서 개시된 제조 방법의 일부 구현예에서, (b)가 (c) 전에 수행되거나, (c)가 (b) 전에 수행되거나, (b)와 (c)가 동시에 수행된다.
일부 구현예에서, 핵산은 DNA 또는 RNA이다.
일부 구현예에서, (b)는 렌티바이러스 형질도입을 수행하여 핵산을 면역 이펙터 세포로 전달하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR과 결합하는 항원(예컨대, CD19)을 발현하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 면역 이펙터 세포 집단을 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 예컨대, 세포 표면의 공동 자극 분자를 자극하는 리간드와 접촉시키는 단계를 더 포함하고, 예를 들어, 작용제는 항-CD3 항체, 또는 이의 단편, 및/또는 항-CD28 항체, 또는 이의 단편과 접합된 비드이다.
일부 구현예에서, CAR 폴리펩티드는 CD19 CAR, CD22 CAR, CD123 CAR 또는 CD33 CAR이다. 일 구현예에서, CAR은 CD19 CAR, 예컨대, 서열번호 39 내지 51의 scFv 아미노산 서열을 포함하는 CAR 또는 서열번호 77 내지 89의 아미노산 서열을 포함하는 CAR이다.
일부 구현예에서, CAR은 항-CD19 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 항체 분자를 포함하고, 상기 항-CD19 결합 도메인은 표 3B에 열거된 임의의 항-CD19 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3) 중 하나 이상 및 표 3A에 열거된 임의의 항-CD19 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3) 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열번호 40 또는 서열번호 51의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 서열번호 78 또는 서열번호 89의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 면역 이펙터 세포 집단의 제조 방법이 본 명세서에서 개시되며, 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포의 집단을 제공하는 단계;
b) 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR 폴리펩티드 암호화 핵산과 접촉시키는 단계;
c) 면역 이펙터 세포의 집단을 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)와 접촉시키는 단계, 및
d) 세포를 CAR 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 유지하고, 이에 의해 CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 단계.
일 구현예에서, (b)가 (c) 전에 수행되거나, (c)가 (b) 전에 수행되거나, (b)와 (c)가 동시에 수행된다.
일 구현예에서, 핵산은 DNA 또는 RNA이다.
일 구현예에서, (b)는 렌티바이러스 형질도입을 수행하여 핵산을 면역 이펙터 세포로 전달하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-DG는, 비슷한 조건 하에 배양되나 당 분해 억제제로 처리되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여,
면역 이펙터 세포의 집단을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 이상 증가시키거나;
면역 이펙터 세포 집단 내에서 중심 기억 표현형을 갖는 세포, 예컨대, CD45RO+CCR7+인 세포의 백분율을 예컨대, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 이상 증가시키기;
에 충분한 양으로 첨가된다.
일 구현예에서, 당 분해 억제제, 예컨대, 2-DG는, 적어도 0.5, 1, 1.5, 2, 또는 2.5 mM, 0.5~2.5 mM, 또는 1~2 mM의 농도로 첨가된다.
일 구현예에서, 당 분해 억제제의 존재 하에 배양된 세포의 집단은, 비슷한 조건 하에 배양되나 당 분해 억제제로 처리되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여,
면역 이펙터 세포 집단의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 이상의 증가; 또는
면역 이펙터 세포 집단 내에서 중심 기억 표현형을 갖는 세포, 예컨대, CD45RO+CCR7+인 세포의 백분율의 예컨대, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 이상의 증가;
를 나타낸다.
일 구현예에서, 방법은 다음을 포함한다:
예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 동안 또는 1~7, 7~14, 또는 14~21일 동안, 집단을 확장시키는 단계; 또는
예컨대, 실시예 1의 성장 조건 하에서, 예컨대, 세포 수의 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 5, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50배 이상의 변화, 예컨대, 최대 약 40 또는 50배의 변화로 집단을 확장시키는 단계.
일 구현예에서, 방법은 예컨대, 2-NBDG 흡수 분석법, 예컨대, 실시예 1의 분석법을 이용하여, 면역 이펙터 세포 집단의 글루코스 대사를 분석하여 글루코스 대사 값을 결정하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 글루코스 대사 값을 기준값과 비교하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 기준값과 글루코스 대사 값의 비교에 반응하여 다음 중 하나 이상을 수행하는 단계를 더 포함한다:
치료제로 사용하기에 적합하거나 적합하지 않은 집단을 분류하는 단계;
치료적 용도를 위하여, 집단 또는 이의 일정 부분을 제형화 또는 포장하는 단계; 또는
배양 파라미터를 변경하는 단계, 예컨대, i) 배양에 있어서 시간 길이를 변경하거나, 또는 ii) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)의 농도를 증가시키거나 감소시키는 단계.
일 구현예에서, 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR과 결합하는 항원(예컨대, CD19)을 발현하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 면역 이펙터 세포 집단을 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 예컨대, 세포 표면의 공동 자극 분자를 자극하는 리간드와 접촉시키는 단계를 더 포함하고, 예를 들어, 작용제는 항-CD3 항체, 또는 이의 단편, 및/또는 항-CD28 항체, 또는 이의 단편과 접합된 비드이다.
일 구현예에서, CAR은 CD19 CAR, CD22 CAR, CD123 CAR 또는 CD33 CAR이다. 일 구현예에서, CAR은 CD19 CAR, 예컨대, 서열번호 39 내지 51의 scFv 아미노산 서열을 포함하는 CAR 또는 서열번호 77 내지 89의 아미노산 서열을 포함하는 CAR이다.
일 구현예에서, CAR은 항-CD19 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 상기 항-CD19 결합 도메인은 표 3에 열거된 임의의 항-CD19 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3) 중 하나 이상 및 표 3에 열거된 임의의 항-CD19 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3) 중 하나 이상을 포함한다.
일 구현예에서, CAR은 항-CD19 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 상기 항-CD19 결합 도메인은 표 3B에 열거된 임의의 항-CD19 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3) 중 하나 이상 및 표 3A에 열거된 임의의 항-CD19 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3) 중 하나 이상을 포함한다.
일 구현예에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열번호 40 또는 서열번호 51의 서열을 포함한다.
일 구현예에서, CAR은 서열번호 78 또는 서열번호 89의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 면역 이펙터 세포 집단의 제조 방법이 본 명세서에서 개시되며, 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포의 집단을 제공하는 단계;
b) 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR 폴리펩티드 암호화 핵산과 접촉시키는 단계;
c) 면역 이펙터 세포의 집단을
c-i) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제; 및
c-iii) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)와 접촉시키는 단계, 및
d) 세포를 CAR 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 유지하고, 이에 의해 CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 단계.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 다음 중 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟 개, 또는 전부, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된다:
i) gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체, 또는 IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자, OSM 분자;
ii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 가용성 IL-6 수용체(sIL-6R);
iii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-6/IL-6R 복합체, 예컨대, 이량체;
iv) IL-6 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, IL-31 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자 또는 OSM 분자);
v) CCL20 분자;
vi) IL-10R2 수용체(IL-10R2) 활성제, 예컨대, IL-10 분자, IL-22 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자, IL-29 분자, 또는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-10R2에 결합하는 항체 분자;
vii) IL-10 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-10 분자, IL-19 분자, IL-20 분자, IL-22 분자, IL-24 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자 또는 IL-29 분자);
viii) IL-17 패밀리 사이토카인(예컨대, IL17A 분자, IL17B 분자, IL17C 분자, IL17D 분자, IL17E 분자 또는 IL17F 분자); 또는
ix) IL-23 분자.
일부 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 면역 이펙터 세포 집단의 제조 방법이 본 명세서에서 개시되며, 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포의 집단을 제공하는 단계;
b) 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR 폴리펩티드 암호화 핵산과 접촉시키는 단계;
c) 면역 이펙터 세포의 집단을
c-i) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG), 및
c-ii) 예컨대, 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로 gp130 분자의 번역을 허용하는 조건 하에 gp130 분자 암호화 핵산을 도입함으로써, gp130 분자; 또는 예컨대, 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로 Stat3 분자의 번역을 허용하는 조건 하에 Stat3 분자 암호화 핵산을 도입함으로써, Stat3 분자(예컨대, 구성적 활성 Stat3 분자(STAT3C))와 접촉시키는 단계; 및
d) 세포를 CAR 폴리펩티드, gp130 분자 또는 Stat3 분자의 발현을 허용하는 조건 하에 유지하고, 이에 의해 CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 단계.
일부 구현예에서, Stat3 활성제, 또는 gp130 분자 또는 Stat3 분자를 포함하는 세포의 집단을 포함하는 제조 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)와 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 당 분해 억제제를 포함하는 제조 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 Stat3 활성제, 또는 gp130 분자 또는 Stat3 분자를 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
일부 양태에서, 다음을 포함하는 반응 혼합물이 본 명세서에서 개시된다:
a) (i) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단(예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포, 예컨대, CD19 CAR 발현 세포) 또는 (ii) 면역 이펙터 세포 및 CAR(예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR, 예컨대, CD19 CAR) 암호화 핵산; 및
b) 다음으로부터 선택되는 작용제:
(i) Stat3 활성제;
(ii) gp130 분자 또는 Stat3 분자 발현 세포 또는 세포 집단; 또는
(iii) gp130 분자, 또는 Stat3 분자, 또는 이를 암호화하는 핵산.
본 명세서에서 개시된 반응 혼합물의 일 구현예에서, Stat3 활성제는 다음으로부터 선택된다:
b-i-i) gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체, 또는 IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자, OSM 분자;
b-i-ii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 가용성 IL-6 수용체(sIL-6R);
b-i-iii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-6/IL-6R 복합체, 예컨대, 이량체;
b-i-iv) IL-6 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, IL-31 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자 또는 OSM 분자);
b-i-v) CCL20 분자;
b-i-vi) IL-10R2 수용체(IL-10R2) 활성제, 예컨대, IL-10 분자, IL-22 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자, IL-29 분자, 또는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-10R2에 결합하는 항체 분자;
b-i-vii) IL-10 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-10 분자, IL-19 분자, IL-20 분자, IL-22 분자, IL-24 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자 또는 IL-29 분자); 또는
b-i-viii) IL-17 패밀리 사이토카인(예컨대, IL17A 분자, IL17B 분자, IL17C 분자, IL17D 분자, IL17E 분자 또는 IL17F 분자).
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 (a)(i) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 (a)(ii) CAR(예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR, 예컨대, CD19 CAR) 암호화 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 (b)(i) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 (b)(ii) gp130 분자 또는 Stat3 분자를 포함하는 세포 또는 세포 집단을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 (b)(iii) gp130 분자, 또는 Stat3 분자, 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 다음을 포함한다: (a)(i) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단; 및 (b)(i) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 다음을 포함한다: (a)(i) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단; 및 (b)(ii) gp130 분자 또는 Stat3 분자를 포함하는 세포 또는 세포 집단.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 다음을 포함한다: (a)(i) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단; 및 (b)(iii) gp130 분자, 또는 Stat3 분자, 또는 이를 암호화하는 핵산.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 다음을 포함한다: (a)(ii) CAR 암호화 핵산; 및 (b)(i) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 다음을 포함한다: (a)(ii) CAR 암호화 핵산; 및 (b)(ii) gp130 분자 또는 Stat3 분자를 포함하는 세포 또는 세포 집단.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 다음을 포함한다: (a)(ii) CAR 암호화 핵산; 및 (b)(iii) gp130 분자, 또는 Stat3 분자, 또는 이를 암호화하는 핵산.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:
(a)(i) 및 b-i-i); (a)(i) 및 b-i-ii); (a)(i) 및 b-i-iii); (a)(i) 및 b-i-iv); (a)(i) 및 b-i-v); (a)(i) 및 b-i-vi); (a)(i) 및 b-i-vii); (a)(i) 및 b-i-viii); (a)(ii) 및 b-i-i); (a)(ii) 및 b-i-ii); (a)(ii) 및 b-i-iii); (a)(ii) 및 b-i-iv); (a)(ii) 및 b-i-v); (a)(ii) 및 b-i-vi); (a)(ii) 및 b-i-vii); 및 (a)(ii) 및 b-i-viii).
일 양태에서, 다음을 포함하는 반응 혼합물이 본 명세서에서 개시된다:
a) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포, 예컨대, CD19 CAR 발현 세포, 및
b) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG).
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 반응 혼합물이 본 명세서에서 개시된다:
a) 면역 이펙터 세포의 집단,
b) CAR, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR, 예컨대, CD19 CAR 암호화 핵산, 및
c) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG).
특정 양태에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 다음을 포함한다:
(i) Stat3 활성제;
(ii) gp130 분자 또는 Stat3 분자 발현 세포 또는 세포 집단;
(iii) gp130 분자, 또는 Stat3 분자, 또는 이를 암호화하는 핵산; 및
(iv) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG).
일 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 렌티바이러스를 더 포함하며, 예컨대, 이때, CAR 암호화 핵산이 렌티바이러스에 패키징된다.
본 명세서에서 개시된 반응 혼합물의 일 구현예에서, 핵산은 DNA 또는 RNA이다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 반응 혼합물은 CAR과 결합하는 항원(예컨대, CD19)을 발현하는 세포의 집단을 더 포함한다.
본 명세서에서 개시된 반응 혼합물의 일 구현예에서, 당 분해 억제제, 예컨대, 2-DG는, 적어도 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 mM, 0.5~2.5 mM, 또는 1~2 mM의 농도로 존재한다.
일부 양태에서, 본 개시는 예컨대, CAR 발현 세포의 투여 전에, CAR 발현 세포를 이용한 치료적 처치에 대한 암(예컨대, 본 명세서에서 기술된 암)을 앓는 대상체의 반응성을 평가 또는 예측하는 방법을 제공하며, 방법은 대상체의 면역 이펙터 세포에서 다음을 평가하고:
i) 글루코스 대사 수준
(글루코스 대사 기준값보다 낮은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 높음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타낼 가능성이 높음을 나타내고,
글루코스 대사 기준값보다 높은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타내지 않음을 의미함); 또는
ii) (예컨대, 티로신 705(Y705)에서의) Stat3의 인산화에 의해 측정한 바와 같은 Stat3 활성화 수준 또는 Stat3 전사 표적(예컨대, c-Myc, c-Fos, Sox2, Bcl-2, 또는 RORC)의 수준 또는 활성
(Stat3 활성화 기준값보다 높은 Stat3 활성화 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 높음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타낼 가능성이 높음을 나타내고,
Stat3 활성화 기준값보다 낮은 Stat3 활성화 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타내지 않음을 의미함),
이에 의해 대상체를 평가하거나, 또는 CAR 발현 세포에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 CAR 암호화 핵산과 접촉되지 않았다.
일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 CAR 암호화 핵산과 접촉되었고, 예컨대, CAR 폴리펩티드를 발현한다.
일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 다음과 접촉되었다:
i) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제;
ii) gp130 분자 또는 Stat3 분자를 포함하는 세포 또는 세포 집단;
iii) gp130 분자, 또는 Stat3 분자, 또는 이를 암호화하는 핵산; 또는
iv) 적어도 0.5, 1, 1.5, 2, 또는 2.5 mM 농도의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG).
일부 구현예에서, 방법은 세포 수, 예컨대, CAR 발현 세포 수의 배수 변화를 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮은 대상체는 무반응(No Response, NR) 또는 부분 반응(PR)을 나타낼 것으로 예측된다.
일부 구현예에서, 다음의 결정에 대하여:
i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 낮음; 또는
ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 높음,
대상체는 CAR 발현 요법의 투여 대상으로 선택되거나, CAR 발현 요법이 투여된다.
일부 구현예에서, 다음의 결정에 대하여:
i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 높음; 또는
ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 낮음,
대상체는 CAR 발현 요법 이외의 요법의 투여 대상으로 선택되거나, CAR 발현 요법 이외의 요법이 투여된다.
일부 구현예에서, 글루코스 대사 기준값은 예컨대, 실시예 1에서 기술된 바와 같은, 완전 반응자 대상체의 세포의 글루코스 대사 값이며, 이때, 예컨대, 세포(예컨대, 세포를 함유하는 샘플)는 모의 자극, 예컨대, 실시예 1에서 기술된 바와 같은, 예컨대, CAR 항원 이외의 항원을 이용한 자극과 접촉된다.
일부 구현예에서, Stat3 활성화 기준값은 예컨대, 실시예 2에서 기술된 바와 같은, 비 반응자 대상체의 세포의 Stat3 활성화 값이다.
일 양태에서, 본 개시는 예컨대, CAR 발현 세포의 투여 전에, CAR 발현 세포를 이용한 치료적 처치에 대한 암(예컨대, 본 명세서에서 기술된 암)을 앓는 대상체의 반응성을 평가 또는 예측하는 방법을 제공하며, 방법은
대상체의 면역 이펙터 세포에서 글루코스 대사 수준을 평가하고, 이때,
기준값보다 낮은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 높음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타낼 가능성이 높음을 나타내고,
기준값보다 높은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타내지 않음을 의미하며,
이에 의해 대상체를 평가하거나, 또는 CAR 발현 세포에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 CAR 암호화 핵산과 접촉되지 않았다.
일 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 CAR 암호화 핵산과 접촉되었고, 예컨대, CAR 폴리펩티드를 발현한다.
일 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 적어도 0.5, 1, 1.5, 2, 또는 2.5 mM 농도의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)와 접촉되었다.
일 구현예에서, 방법은 세포 수의 배수 변화를 결정하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮은 대상체는 무반응(NR) 또는 부분 반응(PR)을 나타낼 것으로 예측된다.
일 구현예에서, 글루코스 대사 수준이 기준값보다 낮다는 결정에 대해, 대상체는 CAR 발현 요법의 투여 대상으로 선택되거나, CAR 발현 요법이 투여된다.
일 구현예에서, 글루코스 대사 수준이 기준값보다 높다는 결정에 대해, 대상체는 CAR 발현 요법 이외의 요법의 투여 대상으로 선택되거나, CAR 발현 요법 이외의 요법이 투여된다.
일 구현예에서, 기준값은 실시예 1에서 기술된 바와 같은 완전 반응자 대상체의 세포의 글루코스 대사 값으로, 이때, 예컨대, 세포(예컨대, 세포를 함유하는 샘플)는 모의 자극, 예컨대, 실시예 1에서 기술된 바와 같은, 예컨대, CAR 항원 이외의 항원을 이용한 자극과 접촉된다.
일부 양태에서, 암(예컨대, 본 명세서에서 기술된 암)을 앓는 대상체의 반응성을 평가하거나 예측하는 방법이 본 명세서에서 개시되는데, 이때, 대상체는 CAR 발현 세포로 처치되었으며, 대상체의 CAR 발현 세포에서 다음을 평가하고:
i) 글루코스 대사 수준
(글루코스 대사 기준값보다 낮은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 높음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타낼 가능성이 높음을 나타내고,
글루코스 대사 기준값보다 높은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타내지 않음을 의미함); 또는
ii) (예컨대, 티로신 705(Y705)에서의) Stat3의 인산화에 의해 측정한 바와 같은 Stat3 활성화 수준 또는 Stat3 전사 표적(예컨대, c-Myc, c-Fos, Sox2, Bcl-2, 또는 RORC)의 수준 또는 활성
(Stat3 활성화 기준값보다 높은 Stat3 활성화 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 높음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타낼 가능성이 높음을 나타내고,
Stat3 활성화 기준값보다 낮은 Stat3 활성화 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타내지 않음을 의미함),
이에 의해 대상체를 평가하거나, 또는 CAR 발현 세포에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 CAR 발현 세포에서 글루코스 대사 수준 또는 Stat3 활성화 수준을 평가하기 전에 대상체로부터 CAR 발현 세포를 수득하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮은 대상체는 NR 또는 PR을 나타낼 것으로 예측된다.
일부 구현예에서, 다음의 결정에 대하여:
i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 낮음; 또는
ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 높음,
대상체는 1 이상의 추가 용량의 CAR 발현 요법의 투여 대상으로 선택되거나, 1 이상의 추가 용량의 CAR 발현 요법이 투여된다.
일부 구현예에서, 다음의 결정에 대하여:
i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 높음; 또는
ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 낮음,
대상체는 CAR 발현 요법 이외의 요법의 투여 대상으로 선택되거나, CAR 발현 요법 이외의 요법이 투여된다.
일부 구현예에서, 글루코스 대사 기준값은 실시예 1에서 기술된 바와 같은 완전 반응자 대상체의 세포의 글루코스 대사 값이며, 예컨대, 세포(예컨대, 세포를 함유하는 샘플)는 모의 자극, 예컨대, 실시예 1에서 기술된 바와 같은, 예컨대, CAR 항원 이외의 항원을 이용한 자극과 접촉된다.
일부 구현예에서, Stat3 활성화 기준값은 예컨대, 실시예 2에서 기술된 바와 같은, 비 반응자 대상체의 세포의 Stat3 활성화 값이다.
일 양태에서, 암(예컨대, 본 명세서에서 기술된 암)을 앓는 대상체의 반응성을 평가하거나 예측하는 방법이 본 명세서에서 개시되며, 이때, 대상체는 CAR 발현 세포로 처치되었으며,
대상체의 CAR 발현 세포에서 글루코스 대사 수준을 평가하고, 이때,
기준값보다 낮은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 높음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응(예컨대, PRTD)을 나타낼 가능성이 높음을 나타내고,
기준값보다 높은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응, 예컨대, PRTD을 나타내지 않음을 의미하며,
이에 의해 대상체를 평가하거나, 또는 CAR 발현 세포에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 CAR 발현 세포에서 글루코스 대사 수준을 평가하기 전에 대상체로부터 CAR 발현 세포를 수득하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮은 대상체는 NR 또는 PR을 나타낼 것으로 예측된다.
일 구현예에서, 글루코스 대사 수준이 기준값보다 낮다는 결정에 대해, 대상체는 1 이상의 추가 용량의 CAR 발현 요법의 투여 대상으로 선택되거나, 1 이상의 추가 용량의 CAR 발현 요법이 투여된다.
일 구현예에서, 글루코스 대사 수준이 기준값보다 높다는 결정에 대해, 대상체는 CAR 발현 요법 이외의 요법의 투여 대상으로 선택되거나, CAR 발현 요법 이외의 요법이 투여된다.
일 구현예에서, 기준값은 실시예 1에서 기술된 바와 같은 완전 반응자 대상체의 세포의 글루코스 대사 값으로, 이때, 예컨대, 세포(예컨대, 세포를 함유하는 샘플)는 모의 자극, 예컨대, 실시예 1에서 기술된 바와 같은, 예컨대, CAR 항원 이외의 항원을 이용한 자극과 접촉된다.
일부 양태에서, 본 개시는 CAR 발현 세포, 예컨대, CAR19 발현 세포(예컨대, CTL019)를 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체의 샘플의 CAR 발현 세포에서 다음을 평가하고:
i) 글루코스 대사 수준
(글루코스 대사 기준값보다 낮은 글루코스 대사 수준은 샘플이 처치에 적합함을 의미하고,
글루코스 대사 기준값보다 높은 글루코스 대사 수준은 샘플이 처치에 덜 적합함을 의미함); 또는
ii) Stat3 활성화 수준
(Stat3 활성화 기준값보다 높은 Stat3 활성화 수준은 샘플이 처치에 적합함을 의미하고,
Stat3 활성화 기준값보다 낮은 Stat3 활성화 수준은 샘플이 처치에 덜 적합함을 의미함),
이에 의해 CAR 발현 세포를 평가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 선택하는 단계, 또는 복수의 세포를 강화하는 단계를 더 포함하며, 세포 또는 복수의 세포는 처치에 적합하다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 제거하는 단계, 또는 복수의 세포를 탈 강화(de-enrich)하는 단계를 더 포함하며, 세포 또는 복수의 세포는 처치에 덜 적합하다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 선택하는 단계, 또는 복수의 세포를 강화하는 단계를 더 포함하며,
글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 낮거나; 또는
Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 높다.
일부 구현예에서, 방법은 세포 또는 복수의 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 CAR 발현 세포에서 글루코스 대사 또는 Stat3 활성화 수준을 평가하기 전에 대상체로부터 CAR 발현 세포를 수득하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 다음의 결정에 대하여:
i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 낮음; 또는
ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 높음,
샘플이 대상체에 대한 투여 대상으로 선택되거나, 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 다음의 결정에 대하여:
i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 높음,
ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 낮음,
샘플이 대상체에 대한 투여 대상으로 선택되지 않거나, 대상체에게 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 글루코스 대사 기준값은 실시예 1에서 기술된 바와 같은 완전 반응자 대상체의 세포의 글루코스 대사 값이며, 예컨대, 세포(예컨대, 세포를 함유하는 샘플)는 모의 자극, 예컨대, 실시예 1에서 기술된 바와 같은, 예컨대, CAR 항원 이외의 항원을 이용한 자극과 접촉된다.
일부 구현예에서, Stat3 활성화 기준값은 예컨대, 실시예 2에서 기술된 바와 같은, 비 반응자 대상체의 세포의 Stat3 활성화 값이다.
일 양태에서, 본 개시는 CAR 발현 세포, 예컨대, CAR19 발현 세포(예컨대, CTL019)를 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
대상체의 샘플의 CAR 발현 세포에서 글루코스 대사 수준을 평가하고
(기준값보다 낮은 글루코스 대사 수준은 샘플이 처치에 적합함을 의미하고,
기준값보다 높은 글루코스 대사 수준은 샘플이 처치에 덜 적합함을 의미함),
이에 의해 CAR 발현 세포를 평가하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 CAR 발현 세포에서 글루코스 대사 수준을 평가하기 전에 대상체로부터 CAR 발현 세포를 수득하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 글루코스 대사 수준이 기준값보다 낮다는 결정에 대해, 샘플이 대상체에 대한 투여 대상으로 선택되거나, 대상체에게 투여된다.
일 구현예에서, 글루코스 대사 수준이 기준값보다 높다는 결정에 대해, 샘플이 대상체에 대한 투여 대상으로 선택되지 않거나, 대상체에게 투여되지 않는다.
일 구현예에서, 기준값은 실시예 1에서 기술된 바와 같은 완전 반응자 대상체의 세포의 글루코스 대사 값으로, 이때, 예컨대, 세포(예컨대, 세포를 함유하는 샘플)는 모의 자극, 예컨대, 실시예 1에서 기술된 바와 같은, 예컨대, CAR 항원 이외의 항원을 이용한 자극과 접촉된다.
본 명세서의 임의의 양태, 예컨대, 면역 이펙터 세포 조성물 및 위의 방법은 본 명세서의 하나 이상의 구현예, 예컨대, 아래의 구현예와 조합될 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서의 방법은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포)의 집단을 제조하거나 강화하는 단계를 포함하며, 이때, 방법은 용리(elutriation)를 수행하는 단계를 포함한다. 방법은 면역 이펙터 세포를 포함하는 냉동 투입 샘플을 제공하는 단계, 냉동 투입 샘플을 해동시켜 해동된 샘플을 생성하는 단계, 및 해동된 샘플에서 용리를 수행하며 면역 이펙터 세포를 수집하고, 이에 의해 CAR의 발현에 적합한 면역 이펙터 세포를 포함하는 산출 샘플을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 냉동 투입 샘플은 혈장 분리반출술(apheresis) 샘플이다.
일 구현예에서, 방법은 다음 중 하나, 둘, 세 단계 또는 전부를 더 포함한다:
i) 유동 조건 하에 CD19+ 세포를 고갈시키는 단계;
ii) 요오딕사놀을 포함하는 배지, 예컨대, 물 중 60% 요오딕사놀(예컨대, Optiprep 배지), 및/또는 Ficoll보다 큰 밀도를 갖는(예컨대, 1.077 g/ml 초과, 예컨대, 약 1.32 g/ml의) 배지를 이용하여 밀도 원심분리를 수행하는 단계;
iii) 덱스트로스 및/또는 염화나트륨을 포함하는 완충액, 예컨대, D5 1/2 NS 배지(5% 덱스트로스 및 0.45% 염화나트륨)를 이용한 (예컨대, 해동된 샘플에 대한) 세척 단계를 수행하는 단계(이때, 세척 단계는 세포 처리 장치, 예컨대, 세포 세척 장치 또는 밀도 구배 원심분리에 사용된 장치, 예컨대, CS5(CellSaver5+) 장치를 이용하여 수행됨); 및
iv) 유동 조건 하에 CD3/CD28+ 세포의 양성 선택을 수행하는 단계.
일 구현예에서, 방법은 예컨대, 해동된 샘플에, 등장액, 예컨대, PBS를 첨가함으로써, 해동된 샘플의 점도를 조정하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 용리는 약 30 내지 82 mL/분 또는 50 내지 80 mL/분의 유속을 이용하여 수행되고/수행되거나, 수집 부피는 각 분획에 대해 약 250 내지 1250 mL 또는 300 내지 1000 mL이다. 일 구현예에서, 용리는 약 30, 40, 50, 60, 70, 72, 또는 82 mL/분, 예컨대, 약 70 또는 72 mL/분의 유속을 이용하여 수행된다. 일 구현예에서, 용리는 약 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 72, 70 내지 82, 72 내지 82 mL/분의 유속을 이용하여 수행된다. 일 구현예에서, 용리는 약 250, 400, 500, 900, 또는 975 mL, 예컨대, 약 400 또는 975 mL의 수집 부피를 이용하여 수행된다. 일 구현예에서, 용리는 약 250 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 900, 900 내지 1000, 또는 1000 내지 1259 mL의 수집 부피를 이용하여 수행된다. 일 구현예에서, 용리는 약 2400 rpm에서 수행된다. 일 구현예에서, 용리는 약 2000 내지 2800, 2200 내지 2600, 또는 2300 내지 2500 rpm에서 수행된다.
일 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 10%, 15%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 35%, 또는 40%의 단핵구를 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20% 미만의 T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 B 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 산출 샘플은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만의 단핵구를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만의 B 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7%, 또는 99.9%의 CD4+CD25+ 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7%, 또는 99.9%의 CD8+CD25+ 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 T 세포의 T 세포 산출 회수율을 초래한다.
일 구현예에서, 산출 샘플은 CAR 암호화 핵산과 접촉된다. 일 구현예에서, 산출 샘플을 CAR 암호화 핵산과 접촉시키는 단계 후에, 산출 샘플은 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CAR+ 세포를 포함한다. 이러한 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 CAR+CD4+ 중심 기억 세포를 포함한다. 이러한 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 CAR+CD8+ 중심 기억 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 산출 샘플을 CAR 암호화 핵산과 접촉시키는 단계 후에, 산출 샘플은 CAR 발현 세포, 예컨대, 형질도입된 세포당 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1 pg 미만의 IFN-감마(IFN-γ)를 생성한다. IFN-감마(IFN-γ) 방출 분석법은 본 명세서에서, 예컨대, 실시예에서 기술된다. 일 구현예에서, 산출 샘플을 CAR 암호화 핵산과 접촉시키는 단계 후에, 산출 샘플은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 또는 30의 세포독성 수준(예컨대, EC50rec)을 포함한다. 세포독성 분석법은 본 명세서에서, 예컨대, 실시예에서 기술된다.
일 구현예에서, 본 명세서의 방법은 CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포)의 집단을 제조하거나 강화하는 단계를 포함하며, 이때, 방법은 밀도 구배 원심분리(본 명세서에서 밀도 원심분리라고도 지칭됨)를 수행하는 단계를 포함한다. 방법은 면역 이펙터 세포를 포함하는 투입 샘플을 제공하는 단계, 및 요오딕사놀을 포함하는 배지, 예컨대, 물 중 60% 요오딕사놀(예컨대, Optiprep 배지), 및/또는 Ficoll보다 큰 밀도를 갖는(예컨대, 1.077 g/ml 초과, 예컨대, 약 1.32 g/ml의) 배지를 이용하여 밀도 원심분리를 수행하고, 이에 의해 CAR 발현에 적합한 면역 이펙터 세포를 포함하는 산출 샘플을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 다음 중 하나, 둘, 세 가지, 또는 전부를 수행하는 단계를 더 포함한다:
i) 유동 조건 하에 CD19+ 세포를 고갈시키는 단계;
ii) 투입 샘플에 대한 용리(이때, 투입 샘플은 선택적으로 해동된 투입 샘플임);
iii) (예컨대, 밀도 원심분리 전에) 덱스트로스 및/또는 염화나트륨을 포함하는 완충액, 예컨대, D5 1/2 NS 배지(5% 덱스트로스 및 0.45% 염화나트륨)를 이용한 세척 단계(예컨대, 세척 단계는 CS5(CellSaver5+) 기기를 이용하여 수행됨); 및 유동 조건 하에 CD3/CD28+ 세포의 양성 선택을 수행하는 단계.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 다음 중 하나 이상을 포함하지 않는다: 글리콜을 포함하는 용액, 예컨대, Ficoll 용액을 사용하는 단계; 또는 덱스트로스 및/또는 염화나트륨을 포함하는 완충액, 예컨대, D5 1/2 NS 배지 중에서 세척 단계를 수행하는 단계(이때, 세척 단계는 CS5 기기를 이용하여 수행됨); 또는 양성 선택 단계를 수행하는 단계.
일 구현예에서, 밀도 원심분리는 세포 분리 장치, 예컨대, Sepax2 장치를 이용하여 수행된다.
일 구현예에서, 투입 샘플은 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 또는 15% 미만의 T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 10%, 15%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 또는 70%의 단핵구를 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 B 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만의 단핵구를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 미만의 B 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 T 세포의 T 세포 산출 회수율을 초래한다.
일 구현예에서, 본 명세서의 방법은 CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포)의 집단을 제조하는 단계를 포함하며, 이때, 방법은 암 관련 항원 발현 세포, 예컨대, CD19 발현(CD19+) 세포를 제거하는 음성 선택 단계를 포함한다. 방법은 면역 이펙터 세포를 포함하는 투입 샘플을 제공하는 단계, 및 예컨대, 유통식(flow-through) 장치, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 세포 처리 시스템을 이용하여, 유동 조건 하에 투입 샘플로부터 CD19+ 세포를 제거하고, 이에 의해 CAR의 발현에 적합한 면역 이펙터 세포를 포함하는 산출 샘플을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, CD19+ 세포는 B 세포를 포함한다. 일 구현예에서, CD19+ 세포는 림프모구를 포함한다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 음성 선택 방법은 다음 중 하나, 둘, 세 가지 또는 전부를 수행하는 단계를 더 포함한다:
i) 투입 샘플에 대한 용리(이때, 투입 샘플은 선택적으로 해동된 투입 샘플임);
ii) 요오딕사놀을 포함하는 배지, 예컨대, 물 중 60% 요오딕사놀(예컨대, Optiprep 배지), 및/또는 Ficoll보다 큰 밀도를 갖는(예컨대, 1.077 g/ml 초과, 예컨대, 약 1.32 g/ml의) 배지를 이용하는 밀도 원심분리 단계;
iii) (예컨대, CD19+ 세포를 제거하기 전에 및/또는 투입 샘플이 해동된 후에) 덱스트로스 및/또는 염화나트륨을 포함하는 완충액, 예컨대, D5 1/2 NS 배지(5% 덱스트로스 및 0.45% 염화나트륨)를 이용한 세척 단계를 수행하는 단계(예컨대, 세척 단계는 CS5(CellSaver5+) 기기를 이용하여 수행됨); 및
iv) 유동 조건 하에 CD3/CD28+ 세포의 양성 선택.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 음성 선택 방법은 용리 또는 밀도 원심분리를 수행하는 단계를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, CD19+ 세포는 자성 분리(magnetic separation)에 의해 투입 샘플로부터 제거된다. 일 구현예에서, 자성 분리는 세포를 분리 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 분리 시약은 자성 또는 상자성 부재 및 CD19 결합 부재를 포함한다. 일 구현예에서, 자성 분리는 유세포 분석법 또는 FACS를 포함한다. 일 구현예에서, CD19+ 세포는 FACS에 의해 제거된다. 일 구현예에서, 자성 분리는 자성 세포 분리 장치, 예컨대, CliniMACs 장치의 사용을 포함한다. 일 구현예에서, CD19+ 세포는 CliniMACs 장치에 의해 제거된다. 일 구현예에서, CD19+ 세포는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 유통식 장치, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 세포 처리 시스템에 의해 제거된다.
일 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 CD19+ 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 미만의 CD19+ 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 투입 샘플과 비교하여 50%, 45%, 40%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 2%, 2%, 또는 1% 미만의 백분율의 CD19+ 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 10%, 15%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 35%, 또는 40%의 단핵구를 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20% 미만의 T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플(예컨대, 세척 후 투입 샘플)은 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 B 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 산출 샘플은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만의 단핵구를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 미만의 B 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 음성 선택 방법은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 T 세포의 T 세포 산출 회수율을 초래한다.
일 구현예에서, 본 명세서의 방법은 CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포)의 집단을 제조하는 단계를 포함하며, 이때, 방법은 양성 선택을 포함한다. 방법은 면역 이펙터 세포를 포함하는 투입 샘플을 제공하는 단계, 및 유동 조건 하에 투입 샘플로부터 CD3+/CD28+ 세포에 대해 양성 선택하고, 이에 의해 CAR의 발현에 적합한 면역 이펙터 세포를 포함하는 산출 샘플을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며, 예컨대, 양성 선택은 유동 조건 하에 수행된다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 양성 선택 방법은 다음 중 하나, 둘, 세 가지 또는 전부를 수행하는 단계를 더 포함한다:
i) 예컨대, 유동 조건 하에, CD19+ 세포를 고갈시키는 단계; 투입 샘플에 대한 용리(이때, 투입 샘플은 선택적으로 해동된 투입 샘플임);
ii) 요오딕사놀을 포함하는 배지, 예컨대, 물 중 60% 요오딕사놀(예컨대, Optiprep 배지), 및/또는 Ficoll보다 큰 밀도를 갖는(예컨대, 1.077 g/ml 초과, 예컨대, 약 1.32 g/ml의) 배지를 이용하여 밀도 원심분리를 수행하는 단계; 및
iii) (예컨대, CD19+ 세포를 제거하기 전에 및/또는 투입 샘플이 해동된 후에) 덱스트로스 및/또는 염화나트륨을 포함하는 완충액, 예컨대, D5 1/2 NS 배지(5% 덱스트로스 및 0.45% 염화나트륨)를 이용한 세척 단계를 수행하는 단계(예컨대, 세척 단계는 CS5(CellSaver5+) 기기를 이용하여 수행됨).
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 양성 선택 방법은 투입 샘플에 대해 용리를 수행하는 단계(예컨대, 투입 샘플은 해동된 투입 샘플임)를 더 포함한다. 선택적으로, 용리는 다음 중 하나 이상(예컨대, 1, 2단계, 또는 전부)과 함께 수행된다: (예컨대, 위의 (i)에서 기술된 바와 같이) CD19+ 세포를 고갈시키는 단계, (예컨대, 위의 (ii)에서 기술된 바와 같이) 밀도 원심분리를 수행하는 단계; 및 (예컨대, 위의 (iii)에서 기술된 바와 같이) 세척 단계를 수행하는 단계.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 양성 선택 방법은 양성 선택을 수행하기 전에, 용리, 세척 단계(선택적), 및 (예컨대, Ficoll 또는 Optiprep 배지를 이용한) 밀도 원심분리를 수행하는 단계를 더 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 양성 선택 방법은 양성 선택을 수행하기 전에, 세척 단계(선택적), 및 (예컨대, Ficoll 또는 Optiprep 배지를 이용한) 밀도 원심분리를 수행하는 단계를 더 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 양성 선택 방법은 용리를 수행하는 단계를 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 양성 선택 방법은 예컨대, CS5+ 기기를 이용하여, 덱스트로스 및/또는 염화나트륨을 포함하는 완충액, 예컨대, D5 1/2 NS 완충액을 이용한 세척을 수행하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 양성 선택은 투입 샘플을 분리 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 분리 시약은 자성 또는 상자성 부재 및 CD3 및/또는 CD28 결합 부재를 포함한다. 일 구현예에서, CD3+/CD28+ 세포에 대한 양성 선택은 약 10 내지 90분, 약 10 내지 60분, 약 10 내지 45분, 약 12 내지 90분, 약 12 내지 60분, 약 12 내지 45분, 약 15 내지 90분, 약 15 내지 60분, 약 15 내지 45분, 예컨대, 약 30분 또는 약 20분 동안 투입 샘플을 분리 시약과 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 분리 시약은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체에 커플링된(예컨대, 공유적으로 또는 비 공유적으로 커플링된) 비드를 포함한다. 일 구현예에서, 양성 선택은 T 세포에 대해 약 3:1 비율의 자성 분리 부재(예컨대, 비드)를 사용한다.
일 구현예에서, 양성 선택은 자성 분리가 일어나는 밀폐 시스템, 예컨대, 챔버 또는 백 내에 면역 이펙터 세포 및 자성 분리 부재를 포함하는 유체를 유동시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 유동은 부재(선택적으로 면역 이펙터 세포에 결합된 부재)의 자성 분리가 일어나게 하는 속도로 수행된다. 일 구현예에서, CD3+/CD28+ 세포에 대한 양성 선택은 약 6, 5, 6, 3, 2, 또는 1분 미만, 또는 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1초 미만의 분리 또는 체류 시간을 포함한다.
일 구현예에서, 양성 선택은 자성 장치, 예컨대, Dynamag CTS, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 자성 요소를 포함하는 유통식 장치, 또는 기타 자성 요소의 배열로 수행된다.
일 구현예에서, 양성 선택은 적어도 하나의 세포 현탁 모듈; 적어도 하나의 유통식 자성 분리/탈비딩(debeading) 모듈; 적어도 하나의 비 자성 산출 모듈; 적어도 하나의 자성 산출 모듈; 선택적으로, 자성 분리/탈비딩 모듈의 외부에 있는, 자성 힘 및/또는 구배를 생성하는 적어도 하나의 자성 성분; 및 선택적으로, 적어도 하나의 완충제 모듈을 포함하는 장치를 이용하여 수행된다. 일 구현예에서, 장치는 자성 분리/탈비딩 모듈의 외부에 있는, 자성 힘 및/또는 구배를 생성하는 적어도 하나의 자성 성분을 더 포함한다. 일 구현예에서, 장치는 적어도 하나의 완충제 모듈을 더 포함한다. 일 구현예에서, 자성 분리/탈비딩 모듈은 벽으로 규정되며 x 방향, y 방향, 및 z 방향을 갖는 챔버; 예컨대, x 방향, y 방향, 또는 z 방향으로, 챔버의 반대쪽 말단에 배열된 유입구 및 유출구; 챔버의 벽에 인접하거나 근접하고 유입구와 유출구 사이에 챔버 내의 영(0)의 구배 선을 확립하도록 배열된 적어도 두 개의 자석을 포함한다. 일 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 챔버 사이를 유동하며, 이때, 챔버의 각 지점은 자석의 2 cm 이내에 있다.
일 구현예에서, 양성 선택 방법은 (예컨대, 단계 a)와 b) 사이에) 면역 이펙터 세포를 덱스트로스 및/또는 염화나트륨을 포함하는 용액, 예컨대, D5 1/2 NS 배지(5% 덱스트로스 및 0.45% 염화나트륨)와 접촉시키는 단계를 포함하며, 선택적으로, 용액은 주위 온도, 예컨대, 약 20 내지 25℃이다. 일 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 예컨대, 단계 a) 및 b) 중에, 유연한 용기, 예컨대, 백 내에 존재한다. 일 구현예에서, 방법은 (예컨대, 단계 a)와 b) 사이에, 예컨대, 면역 이펙터 세포를 식염수와 접촉시키는 단계 후에) 백을 열 절연 물질, 예컨대, 종이, 예컨대, 종이 타올 또는 와입스를 포함하는 복수의 층 위에 놓는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 (예컨대, 단계 b) 이후에) 세포를 약 37℃에서 약 10분 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 (예컨대, 단계 b) 이후에) 세포를 약 36- 내지 38, 35 내지 39, 또는 34 내지 40℃에서, 예컨대 약 10분 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 인큐베이션 단계는 약 8 내지 12, 5 내지 15, 또는 5 내지 20분 동안 지속된다. 일 구현예에서, 인큐베이션은 Plasmatherm 장치에서 수행된다.
양성 선택 방법의 일 구현예에서, 면역 이펙터 세포를 포함하는 투입 샘플은 적어도 20%의 단핵구를 포함한다. 일 구현예에서, 면역 이펙터 세포를 포함하는 투입 샘플은 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%의 단핵구를 포함한다.
일 구현예에서, 양성 선택 방법은 다음 중 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4단계, 또는 전부)을 예컨대, 열거된 순서대로 포함한다:
a) 혈액암을 앓는 환자의 면역 이펙터 세포를 포함하는 냉동 투입 샘플(예컨대, 백혈구 분리반출술 샘플)을 해동시키는 단계(선택적으로, 샘플은 20% 초과의 림프모구를 포함함);
b) 세척 용액, 예컨대, '변형 배지'(MM)라 불리는 X-VIVO15 배지(Lonza) 중에서, 예컨대, 주위 온도, 예컨대, 20 내지 25℃에서 면역 이펙터 세포를 세척하는 단계;
c) 투입 샘플을 분리 시약과 접촉시키는 단계(분리 시약은 자성 또는 상자성 부재 및 CD3 및/또는 CD28 결합 부재를 포함함);
d) 투입 샘플과 분리 시약을 회전장치에서 예컨대, 2 내지 6 rpm, 예컨대, 4 rpm으로 회전시키는 단계로, 회전은 예컨대, 10 내지 30분, 예컨대, 20분 동안 지속되는 단계; 및
e) 분리 시약과 결합하는 세포를 강화하기 위하여 예컨대, 30초 내지 2분, 예컨대, 1분 동안 양성 선택을 수행하는 단계.
일 구현예에서, 양성 선택 방법은 다음 중 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6단계, 또는 전부)을 예컨대, 열거된 순서대로 포함한다:
a) 혈액암을 앓는 환자의 면역 이펙터 세포를 포함하는 냉동 투입 샘플(예컨대, 백혈구 분리반출술 샘플)을 해동시키는 단계(선택적으로, 샘플은 20% 초과의 단핵구를 포함함);
b) 예컨대, 약 5% 덱스트로스 및 0.45% 염화나트륨을 포함하는 세척 용액, 예컨대, D5 1/2NS 중에서, 예컨대, 주위 온도, 예컨대, 20 내지 25℃에서 면역 이펙터 세포를 세척하는 단계;
c) 세포를 포함하는 유연한 용기를 열 절연 물질, 예컨대, 종이, 예컨대, 종이 타올 또는 와입스를 포함하는 복수의 층 위에 놓는 단계;
d) 투입 샘플을 분리 시약과 접촉시키는 단계(분리 시약은 자성 또는 상자성 부재 및 CD3 및/또는 CD28 결합 부재를 포함함);
e) 투입 샘플과 분리 시약을 예컨대, 37℃에서, 예컨대, 5 내지 15분, 예컨대, 10분 동안 인큐베이션시키는 단계;
f) 투입 샘플과 분리 시약을 회전장치에서 예컨대, 2 내지 6 rpm, 예컨대, 4 rpm으로 회전시키는 단계로, 회전은 예컨대, 10 내지 30분, 예컨대, 20분 동안 지속되는 단계; 및
g) 분리 시약과 결합하는 세포를 강화하기 위하여 예컨대, 30초 내지 2분, 예컨대, 1분 동안 양성 선택을 수행하는 단계.
일 구현예에서, 샘플, 예컨대, 투입 샘플은 혈액암, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 혈액암, 예컨대, ALL 또는 DLBCL을 앓는 환자의 샘플이다.
일 구현예에서, 투입 샘플은 약 1x105개 유핵세포/ml, 2x105개 유핵세포/ml, 5x105개 유핵세포/ml, 7x105개 유핵세포/ml, 1x106개 유핵세포/ml, 2x106개 유핵세포/ml, 5x106개 유핵세포/ml, 7x106개 유핵세포/ml, 1x107개 유핵세포/ml, 2x107개 유핵세포/ml, 5x107개 유핵세포/ml, 7x107개 유핵세포/ml, 1x107개 유핵세포/ml, 2x108개 유핵세포/ml, 5x108개 유핵세포/ml, 및 7x108개 유핵세포/ml을 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 약 1 내지 1.5 x107개의 T 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 단핵구를 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 종양 세포, 예컨대, 림프모구를 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20% 미만의 면역 이펙터 세포, 예컨대, T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 B 세포, 예컨대, CD45+CD19+ B 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 B 세포, 예컨대, CD45-CD19+ B 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 산출 샘플은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만의 단핵구를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만의 종양 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 99.9%의 면역 이펙터 세포, 예컨대, T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 T 세포, 예컨대, CD3+CD45+ T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 B 세포, 예컨대, CD45+CD19+ B 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 B 세포, 예컨대, CD45-CD19+ B 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 또는 20%의 T 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 본 명세서의 방법은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포)의 집단을 제조하는 단계를 포함하며, 이때, 방법은 다음 단계를 포함한다:
i) 면역 이펙터 세포를 포함하는 투입 샘플, 예컨대, 냉동 투입 샘플 또는 신선한 투입 샘플을 제공하는 단계; (선택적으로, 투입 샘플은 냉동 투입 샘플임), 냉동 투입 샘플을 해동시켜 해동된 샘플을 생성하는 단계;
ii) 강화 단계를 수행하는 단계(강화 단계는, 투입 샘플에 대한 용리를 수행하는 단계(이때, 투입 샘플은 선택적으로 해동된 투입 샘플임); 또는 요오딕사놀을 포함하는 배지, 예컨대, 물 중 60% 요오딕사놀, 예컨대, Optiprep 배지, 및/또는 Ficoll보다 큰 밀도를 갖는(예컨대, 1.077 g/ml 초과, 예컨대, 약 1.32 g/ml의) 배지를 이용하여 밀도 원심분리 단계를 수행하는 단계를 포함함); 및
iii) 선택 단계를 수행하고(선택은 예컨대, CD3/CD28+ 세포에 대한 양성 선택, 또는 예컨대, CD19+, CD25+, 또는 CD14+ 세포에 대한 음성 선택임);
이에 의해 CAR의 발현에 적합한 면역 이펙터 세포를 포함하는 산출 샘플을 생성하는 단계.
일 구현예에서, 본 명세서의 방법은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포)의 집단을 제조하는 단계를 포함하며, 이때, 방법은 다음 단계를 포함한다:
i) 면역 이펙터 세포를 포함하는 투입 샘플, 예컨대, 냉동 투입 샘플 또는 신선한 투입 샘플을 제공하는 단계;
ii) (선택적으로, 투입 샘플은 냉동 투입 샘플임), 냉동 투입 샘플을 해동시켜 해동된 샘플을 생성하는 단계;
iii) 강화 단계를 수행하는 단계
(강화 단계는,
1) 투입 샘플에 대한 용리를 수행하는 단계(이때, 투입 샘플은 선택적으로 해동된 투입 샘플임); 또는
2) 요오딕사놀을 포함하는 배지, 예컨대, 물 중 60% 요오딕사놀, 예컨대, Optiprep 배지, 및/또는 Ficoll보다 큰 밀도를 갖는(예컨대, 1.077 g/ml 초과, 예컨대, 약 1.32 g/ml의) 배지를 이용하여 밀도 원심분리 단계를 수행하는 단계를 포함함); 및
iv) 선택 단계를 수행하고(선택은 예컨대, CD3/CD28+ 세포에 대한 양성 선택, 또는 예컨대, CD19+, CD25+, 또는 CD14+ 세포에 대한 음성 선택임);
이에 의해 CAR의 발현에 적합한 면역 이펙터 세포를 포함하는 산출 샘플을 생성하는 단계.
일 구현예에서, 본 명세서의 방법은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포)의 집단을 제조하는 단계를 포함하며, 이때, 방법은 다음 단계를 포함한다:
i) 면역 이펙터 세포를 포함하는 투입 샘플, 예컨대, 냉동 투입 샘플 또는 신선한 투입 샘플을 제공하는 단계;
ii) 강화 단계를 수행하는 단계(강화 단계는, 용리 또는 (예컨대, Ficoll 또는 Optiprep 배지를 이용한) 밀도 원심분리를 수행하는 단계를 포함함);
iii) 선택 단계를 수행하고(선택은 예컨대, CD3/CD28+ 세포에 대한 양성 선택, 또는 예컨대, CD19+, CD25+, 또는 CD14+ 세포에 대한 음성 선택임);
이에 의해 CAR의 발현에 적합한 면역 이펙터 세포를 포함하는 산출 샘플을 생성하는 단계. 일 구현예에서, 선택 단계는 예컨대, 유통식 장치를 사용하여, 유동 조건 하에서 수행된다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법 또는 조성물의 추가 특징 또는 구현예는 다음 중 하나 이상을 포함한다:
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 임의의 구현예의 투입 샘플은 면역 이펙터 세포, 예컨대, T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는, 대상체의 생물학적 샘플이다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 혈액 샘플, 예컨대, 전혈 샘플이다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 분리반출술 샘플, 예컨대, 백혈구 분리반출술 샘플이다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 신선한 샘플로, 이때, 샘플은 대상체로부터 수득되었으며, 대상체로부터 수득한 1일, 2일, 5일, 또는 7일 이내에 본 명세서에서 기술된 임의의 방법을 이용하여 처리된다. 일 구현예에서, 투입 샘플은 냉동 또는 동결보존된 샘플, 예컨대, -20℃ 또는 액체 질소 중에서 냉동되었거나 분당 1°의 속도로 -80℃까지 냉동되어 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장된 샘플이다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 단핵구(및 선택적으로 최대 40%, 70%, 또는 95% 단핵구)를 포함한다. 본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 투입 샘플은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 종양 세포, 예컨대, 림프모구(및 선택적으로 최대 50% 또는 95%의 단핵구)를 포함한다. 본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 투입 샘플은 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20% 미만의 면역 이펙터 세포, 예컨대, T 세포(및 선택적으로 20% 초과의 T 세포)를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 산출 샘플은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만의 단핵구(및 선택적으로 1% 또는 0.1% 초과의 단핵구)를 포함한다. 본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 산출 샘플은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 2%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만의 종양 세포(및 선택적으로 1% 또는 0.1% 초과의 종양 세포)를 포함한다. 본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 산출 샘플은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 99.9%의 면역 이펙터 세포, 예컨대, T 세포(및 선택적으로 최대 60% 또는 95%의 T 세포)를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 산출 샘플은 투입 샘플과 비교하여 50%, 45%, 40%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 2%, 2%, 또는 1% 미만의 백분율의 단핵구를 포함한다. 본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 산출 샘플은 투입 샘플과 비교하여 50%, 45%, 40%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 2%, 2%, 또는 1% 미만의 백분율의 종양 세포를 포함한다. 본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 산출 샘플은 투입 샘플과 비교하여 적어도 50%, 45%, 40%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 2%, 2%, 또는 1%의 백분율의 면역 이펙터 세포, 예컨대, T 세포를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 방법은 예컨대, 형질도입에 의해, CAR 암호화 핵산을 산출 샘플 내의 1개 이상의 면역 이펙터 세포 내로 도입하는 단계를 더 포함한다. CAR 암호화 핵산을 도입하는 다른 방법은 본 명세서에서 기술되어 있다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 예컨대, 1차 신호전달 도메인 및/또는 공동 자극 신호전달 도메인을 포함하는, 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 방법은 형질도입 효율을 분석하는 단계를 더 포함한다. 본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 형질도입은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 형질도입 효율을 초래한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 방법은 예컨대, CS5+ 기기를 이용하여, 덱스트로스 및/또는 염화나트륨을 포함하는 완충액, 예컨대, D5 배지로 투입 샘플에 대해 세척 단계를 수행하는 단계를 더 포함한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 인간 면역 이펙터 세포이다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 산출 샘플은 CD8+ T 세포를 포함한다. 본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 산출 샘플은 CD4+ T 세포를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 투입 샘플은 종양 항원, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 종양 항원, 예컨대, CD19와 관련된 질환을 앓는 환자로부터 유래한 것이며, 질환은 증식성 질환, 예컨대, 암 또는 악성 종양 또는 전암성 병태, 예컨대, 골수형성이상증, 골수형성이상 증후군 또는 전백혈병으로부터 선택되거나, 또는 본 명세서에서 기술된 종양 항원의 발현과 관련된 비 암 관련 적응증이다. 일 구현예에서, 질환은 본 명세서에서 기술된 암, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 표적과 관련이 있는 것으로 본 명세서에서 기술된 암이다. 일 구현예에서, 혈액암은 백혈병이다. 일 구현예에서, 암은 B 세포 급성 림프성 백혈병("BALL"), T 세포 급성 림프성 백혈병("TALL"), 급성 림프성 백혈병(ALL)을 포함하나 이에 한정되지 않는 1종 이상의 급성 백혈병; 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함하나 이에 한정되지 않는 1종 이상의 만성 백혈병; B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 광범위 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프구증식 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수형성이상증 및 골수형성이상 증후군, 비 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 골수 혈액 세포의 비효과적인 생산(또는 이형성증)에 의해 통합된 혈액 병태의 다양한 집합인 "전백혈병"을 포함하나 이에 한정되지 않는 추가 혈액암 또는 혈액 병태, 및 본 명세서에서 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 비정형 및/또는 비 전형적 암, 악성 종양, 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 본 명세서에서 기술된 종양 항원의 발현과 관련된 질환; 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 종양 항원과 관련된 질환은 고형 종양, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 고형 종양, 예컨대, 전립선암, 결장직장암, 췌장암, 자궁경부암, 위암, 난소암, 두부암, 또는 폐암이다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 투입 샘플은 B 세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T 세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 급성 림프성 백혈병(ALL)을 포함하나 이에 한정되지 않는 1종 이상의 급성 백혈병; 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함하나 이에 한정되지 않는 1종 이상의 만성 백혈병; B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 광범위 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프구증식 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수형성이상증 및 골수형성이상 증후군, 비 호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 전백혈병, 비정형 및/또는 비 전형적 암, 악성 종양, 전암성 병태 또는 증식성 질환, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 암을 앓는 환자로부터 유래한 것이다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 투입 샘플은 ALL을 앓는 환자로부터 유래한 것이다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 방법은 산출 샘플 내의 세포의 1종 이상의 세포 표면 마커, 예컨대, CD45, CD19, CD3, CD28, CD25, 또는 CD14를 분석하는 단계를 더 포함한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 방법은 산출 샘플을 면역 이펙터 세포의 증식을 자극하는 작용제, 예컨대, CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및/또는 T 세포 표면의 공동 자극 분자를 자극하는 리간드, 예컨대, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 방법은 예컨대, 형질도입, 형질감염, 또는 전기천공에 의해, CAR 암호화 핵산을 도입하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 명세서에서 개시된 방법, 예컨대, 위에서 개시된 방법에 의해 생성된 반응 혼합물을 특징으로 한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서의 반응 혼합물은 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 T 세포 및 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 단핵구를 포함하며, 반응 혼합물 내의 세포의 총 수는 100%까지 더해진다. 일 구현예에서, 반응 혼합물은 적어도 총 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 또는 5x108개의 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 반응 혼합물은 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 B 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 반응 혼합물은 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 암 세포, 예컨대 림프모구를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 반응 혼합물에서, 1개 이상의 T 세포는 CAR, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 임의의 CAR을 발현한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 반응 혼합물에서, 반응 혼합물은 CAR 암호화 핵산을 더 포함하며, 예컨대, 핵산은 T 세포의 내부 또는 T 세포의 외부에 배치된다.
본 명세서에서 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기술된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌(예컨대, 서열 데이터베이스 참조 번호)은 그 전문이 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 명세서에서, 예컨대, 본 명세서의 임의의 표에서 언급된 모든 GenBank, Unigene, 및 Entrez 서열은 참조로 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서의 임의의 표를 포함한, 본 명세서에 명시된 서열 등록 번호는 2017년 10월 25일 현재의 데이터베이스 엔트리를 지칭한다. 하나의 유전자 또는 단백질이 복수의 서열 등록 번호를 참조할 때, 모든 서열 변이체가 포함된다.
또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하려는 것은 아니다. 표제, 하위표제 또는 번호를 매기거나 문자를 붙인 요소, 예컨대, (a), (b), (i) 등은 단순히 이해의 편의를 위해 제시된 것이다. 본 문서에서 표제 또는 번호를 매기거나 문자를 붙인 요소의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 순서로 수행될 것 또는 단계 또는 요소가 반드시 서로 개별적일 것을 요구하지 않는다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 장점은 이러한 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구항으로부터 명백할 것이다.
도 1a 내지 도 1d는 임상 반응과 관련된 T 세포의 고유한 품질 속성을 드러내는 CAR T 세포 생성물의 전사 프로파일을 보여준다. 각각의 점은 개별 환자 세포 생성물 샘플에서 이러한 특징의 상대적인 강화를 나타내고, 막대는 최소값에서 최대값을 반영한다. 각 유전자 세트에 대한 정규화된 강화 점수를 y축에 도표화한 것이다(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001, 양측 웰치 t-검정). 도 1a는 초기 기억-후기 기억 유전자 세트에 대한 상대적인 강화를 보여준다. 도 1b는 기억-이펙터 유전자 세트에 대한 상대적인 강화를 보여준다. 도 1c는 높은 당 분해-낮은 당 분해 유전자 세트에 대한 상대적인 강화를 보여준다. 도 1d는 높은 소진-낮은 소진 유전자 세트에 대한 상대적인 강화를 보여준다.
도 2는 유세포 분석법으로 평가한, 모의 또는 CAR 자극된 후향적 환자 CTL019 세포에서의 형광 글루코스 유사체 2-NBDG의 흡수를 보여준다(**P < 0.01, 대응표본 양측 t-검정).
도 3은 반응자(CR, n = 4; PRTD, n = 2; PR, n = 2)와 비 반응자(NR, n = 6) CTL09 샘플 사이의 2-NBDG 흡수를 비교한 것을 보여준다(**P < 0.01, 비 대응표본 양측 t-검정; NS, 유의미하지 않음).
도 4는 당 분해를 억제하는 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)의 부재(대조군) 또는 존재 하에서의 9일의 배양 후 CD8+ CAR T 세포의 분화 표현형을 도시하는 대표적인 유세포 분석법을 보여준다.
도 5는 2-DG의 존재 또는 부재 하에서의 배양 후 CD8+ 및 CD4+ CAR T 세포 내에서의 T 세포 서브세트의 빈도(%)를 보여준다(**P<0.01, *P<0.05, 대응표본 양측 t-검정). 다음의 T 세포 서브세트가 도시되어 있다: 나이브 유사(CCR7+CD45RO-); 중심 기억(CCR7+CD45RO+); 이펙터 기억(CCR7-CD45RO+); 및 이펙터(CCR7-CD45RO-).
도 6은 2-DG의 존재 또는 부재 하에 제조된 CTL019 세포의 증식 능력을 보여준다. CAR T 세포를 화살표로 표시된 바와 같이, 배양 제0일, 제7일, 및 제12일에 CD19 또는 메소텔린(상관 없는 표적 항원)을 발현하도록 조작된 K562 세포로 연속하여 재자극시켰다. 두 명의 대표적인 대상체로부터의 데이터를 도시하였다.
도 7a 내지 도 7d는 CAR T 세포에서의 IL-6/STAT3 경로 강화를 보여준다. 도 7a는 각각의 반응 카테고리로부터의 평가 가능한 환자 샘플에서 매치된, 비 자극 대조군에 의해 정교화된 기준선 수준을 초과하는, CAR 자극된 CTL019 세포로부터 생성된 가용성 사이토카인의 수준을 보여준다(CR, n = 6; PRTD, n = 3; PR, n = 5; NR, n = 21; *P < 0.05; **P < 0.01, 양측 만 휘트니 검정). 그래프는 측정 표준오차와 함께 평균을 보여준다. 도 7b는 각각의 반응군의 환자로부터의 CAR 자극된 CTL019 세포에서 IL-6/STAT3 경로의 단일 샘플 강화 분석을 보여준다(*P < 0.05, 양측 비 대응표본 t-검정 사용). 막대는 평균 및 측정 표준오차를 나타낸다. 도 7c는 이소형 대조군 항체가 코팅된 비드(모의 자극됨) 또는 CAR19에 대한 항유전자형 항체로 코팅된 비드(CAR19 자극됨)로 밤새 자극한 후의 CR 및 NR 환자로부터의 사전주입 CTL019 세포에서의 pSTAT3의 수준을 보여주는 대표적인 유세포 분석 도표를 보여준다(왼쪽 패널). 기능성이 높은 CAR T 세포(CR, n = 3; PRTD, n = 2) 대 기능성이 불량한 CAR T 세포(PR, n = 3; NR, n = 11)의 환자로부터의 통합된 데이터를 상자 그림으로 도시하였다(오른쪽 패널). 수염은 최소값에서 최대값을 나타내고, 상자는 25 내지 75 백분위수를 나타내며, 중간선은 중앙값을 나타낸다. 형광 강도의 변화(MFI)는 비 자극 세포의 것으로부터 자극된 세포의 pSTAT3의 MFI를 감산하여 계산하였다. 도 7d는 입양 이식된 CAR T 세포의 최대 생체 내 증식 능력과 혈청 IL-6의 피크 수준(CTL019 주입 후 28일 이내; 왼쪽 패널) 또는 환자 매치된 (위에서와 같은) CAR 자극된 CTL019 세포에서의 IL-6/STAT3 유전자 강화(오른쪽 패널) 사이의 스피어만의 로(rho) 상관 관계를 보여준다.
도 8a 내지 도 8c는 CAR T 세포에서의 STAT3 경로의 억제를 보여준다. 도 8a는 이소형 대조군 비드(모의) 또는 CAR19에 대한 항유전자형 항체로 코팅된 비드로 밤새 자극시킨 CTL019 세포에서의 pSTAT3의 수준을 도시하는 대표적인 유세포 분석 도표를 보여준다. CAR 특이적 자극은 STAT3 활성화의 소분자 억제제인 스태틱(Stattic) 5 μM의 존재 또는 부재 하에 수행되었다. 도 8b는 5 μM의 스태틱 또는 동등한 양의 DMSO(대조군)의 존재 또는 부재 하에 제조된 CTL019 세포의 확장 능력을 보여준다. 이어서, 이 대표적인 대상체로부터의 CAR T 세포를 화살표로 표시된 바와 같이, 배양 제0일, 제7일, 및 제12일에 CD19를 발현하도록 조작된 K562 세포로 연속하여 재자극시켰다. 기준선으로부터 CAR T 세포 수의 배수 변화를 파선으로 표시된 세포 생존율(오른쪽 y축)과 병행하여 실선(왼쪽 y축)으로 표시하였다. 도 8c는 재자극 전에 5 μM의 스태틱으로 또는 5 μM의 스태틱 없이 확장시킨 n = 8의 상이한 대상체로부터의 CTL019 세포에 대한 세포 증식 및 생존율 데이터의 요약을 보여준다.
도 9는 재조합 IL-6 또는 동등한 양의 DMSO(대조군)의 존재 또는 부재 하에 제조된 CTL019 세포의 증식 능력을 도시하는 그래프를 보여준다. 이어서, 이 대표적인 대상체로부터의 CTL019 세포를 화살표로 표시된 바와 같이, 배양 제0일, 제7일, 및 제12일에 CD19 또는 메소텔린(음성 대조군)을 발현하도록 조작된 K562 세포로 연속하여 재자극시켰다.
도 10은 반응형(n = 14) 대 비 반응형(n = 21) 환자에게 주입된 상이한 표현형을 보유하는 CAR T 세포의 전체 용량(세포/kg)을 기초로 한 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic, ROC) 곡선을 보여준다.
도 11a 내지 도 11b는 IL-6에 대한 CD27+ PD-1- CD8 T 세포에서의 pSTAT3의 수준을 보여준다. 도 11a는 형광 활성화 세포 분류에 의해 정제되고 재조합 IL-6(10 ng/ml)으로 자극된 CD8+ T 세포 집단의 pSTAT3의 수준을 보여주는 대표적인 히스토그램(왼쪽 패널)을 보여준다. n = 4의 상이한 대상체로부터의 CD27 및 PD-1 발현으로 규정된 CD8+ T 세포 서브세트에서의 IL-6 유도성 pSTAT3 수준의 개요를 오른쪽 패널에 도시하였다. 평균 형광 강도의 변화(ΔMFI)를 매치된, 비 자극 세포에서의 동일한 파라미터로부터 IL-6 처리된 세포의 pSTAT3의 MFI를 감산하여 결정하였다. 도 11b는 CD27 및 PD-1 발현으로 규정된 CD8+ T 세포 집단에서의 인터루킨-6 수용체 서브유닛 베타(CD130)의 수준을 보여주는 n = 7의 상이한 대상체로부터의 대표적인 유세포 분석법(왼쪽 패널) 및 통합된 데이터(오른쪽 패널)를 보여준다.
도 12는 CD8+ T 세포 서브세트에서의 gp130 발현(왼쪽 패널) 또는 gp130을 발현하는 CD8+ T 세포 서브세트의 빈도(오른쪽 패널)를 도시하는 그래프를 보여준다. CD8+ T 세포 서브세트는 다음과 같이 그룹화된다: CD27+ CD45RO-, CD27+ CD45RO+, CD27- CD45RO+ 및 CD27- CD45RO- 세포.
도 13은 구성적 활성 STAT3(STAT3C) 구축물을 포함하는 벡터를 보여준다.
도 14a 내지 도 14b는 T 세포에서의 gp130 발현 및 gp130이 있는 T 세포의 선택을 보여준다. 도 14a는 CD4+ T 세포(윗줄) 또는 CD8+ T 세포(아랫줄)에서의 gp130의 발현을 보여준다. 점 도표는 x축에 gp130 및 y축에 CCR7, CD27, PD1 또는 CD45RO를 나타낸 유세포 분석 데이터를 보여준다. 도 14b는 CD4+ T 세포(윗줄) 또는 CD8+ T 세포(아랫줄)의 gp130 기반 양성 선택을 보여준다. 왼쪽의 패널은 선택 전의 T 세포에서의 CD27 및 CD45RO의 발현을 보여주고, 오른쪽의 패널은 gp130으로의 선택 후의 동일한 마커의 발현을 보여준다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
용어 "a" 및 "an"의 관사는 1개 또는 1개 초과의(즉, 적어도 1개의) 관사의 문법적 대상을 나타낸다. 예로서, "요소"는 1개의 요소 또는 1개 초과의 요소를 의미한다.
용어 "약"은, 측정 가능한 값, 예컨대 양, 기간 등을 언급하는 경우에 명시된 값으로부터 ±20%, 또는 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포괄함을 의미하고, 이는 이러한 변동이 개시된 방법의 수행에 적절하기 때문이다.
용어 "글루코스 대사"는 살아 있는 유기체에서 글루코스의 형성, 분해, 또는 상호 전환을 수반하는 과정, 예컨대, 하나 이상의 생화학적 과정을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "글루코스 대사 값"은 예컨대, 2-NBDG(형광 표지된 데옥시글루코스 유사체)를 이용한 글루코스 흡수 세포 기반 키트 또는 글루코스 비색 분석 키트에 의해 분석한 바와 같은, 글루코스 대사의 측정치를 지칭한다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 면역 이펙터 세포에서의 경우에 세포에게 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성 및 세포내 신호 생성을 제공하는, 가장 단순한 구현예에서는 전형적으로 2개인, 폴리펩티드의 세트를 나타낸다. 일부 구현예에서, CAR은 아래에 정의된 바와 같이, 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 분자 및/또는 공동 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(본 명세서에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 세트는 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다(예컨대, 키메라 융합 단백질을 포함한다). 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 세트는 서로 인접해 있지 않고, 예를 들어 상이한 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재 시 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는, 이량체화 스위치를 포함한다. 일 구현예에서, CAR의 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 관련된 제타 쇄이다. 일 양태에서, 세포질 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인(예를 들어 CD3-제타의 일차 신호전달 도메인)을 포함한다. 일 구현예에서, 세포질 신호전달 도메인은 아래에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동 자극 분자의 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 더 포함한다. 일 구현예에서, 공동 자극 분자는 본 명세서에서 기술된 공동 자극 분자, 예컨대, 4-1BB(즉, CD137), CD27, ICOS, 및/또는 CD28이다. 일 구현예에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 분자의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동 자극 분자의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 하나 이상의 공동 자극 분자(들)의 2개의 기능성 신호전달 도메인 및 자극 분자의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 하나 이상의 공동 자극 분자(들)의 적어도 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노 말단(N 말단)에서 선택적인 리더 서열을 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 N 말단에 리더 서열을 더 포함하고, 리더 서열은 선택적으로 CAR의 세포 처리 및 세포막으로의 국소화 중에 항원 결합 도메인(예를 들어 scFv)으로부터 절단된다.
특정 종양 항원 X, 예컨대 본 명세서에서 기술된 것을 표적화하는 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, 또는 TCR)을 포함하는 CAR은 XCAR로도 지칭된다. 예를 들어, CD19를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR은 CD19CAR로 지칭된다.
용어 "신호전달 도메인"은 제2 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 반응하여 이펙터로서 기능함으로써 규정된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위하여 정보를 세포 내에서 전달하는 것에 의해 작용하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 다클론 또는 단클론, 다중 또는 단일 쇄, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있고, 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 사량체일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호 작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 이황화 연결 Fv(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb(VL 또는 VH), 낙타과 VHH 도메인, 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편과 같은 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 및 항체의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내에 혼입될 수 있다(예를 들어 문헌[Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 또한 폴리펩티드, 예컨대 피브로넥틴 III형(Fn3)을 기반으로 한 스캐폴드 내로 그라프트될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기술한 미국 특허 제 6,703,199호 참조).
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 1개의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 1개의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 합성 링커, 예를 들어 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해 인접하여 연결되고 단쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있고, scFv는 그것이 유래된 온전한 항체의 특이성을 유지한다. 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 scFv는 예를 들어 폴리펩티드의 N 말단 및 C 말단과 관련하여, VL 및 VH 가변 영역을 임의의 순서로 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 CAR의 부분은 다양한 형태로 존재할 수 있으며, 여기서, 항원 결합 도메인은 예를 들어 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단쇄 항체(scFv) 및 인간화 항체를 포함하는 인접 폴리펩티드 쇄의 부분으로서 발현된다(문헌[Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY]; 문헌[Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York]; 문헌[Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 문헌[Bird et al., 1988, Science 242:423-426]). 일 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가 구현예에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 적어도 1개의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편을 지칭한다. 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포괄한다. 일 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이고, 예컨대 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하며, 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열의 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고, 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열의 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일 구현예에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR의 부분은 다양한 형태로 존재할 수 있으며, 여기서, 항원 결합 도메인은 예를 들어 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단쇄 항체(scFv), 인간화 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 인접 폴리펩티드 쇄의 부분으로서 발현된다(문헌[Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY]; 문헌[Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York]; 문헌[Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 문헌[Bird et al., 1988, Science 242:423-426]). 일 양태에서, 본 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가 양태에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
용어 "항체 중쇄"는 자연 발생 입체형태의 항체 분자에 존재하고 통상적으로 항체가 속하는 클래스를 결정하는, 2가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 큰 것을 지칭한다.
용어 "항체 경쇄"는 자연 발생 입체형태의 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄는 2가지의 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(예를 들어 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)이 존재하고 각각의 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)이 존재한다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]("카바트(Kabat)" 넘버링 스킴), 문헌[Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948]("초티아(Chothia)" 넘버링 스킴)에 기술된 것들, 또는 이들의 조합을 비롯하여, 잘 알려진 다수의 스킴 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. 카바트 넘버링 스킴 하에, 일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 내의 CDR 아미노산 잔기는 31 내지 35(HCDR1), 50 내지 65(HCDR2) 및 95 내지 102(HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인(VL) 내의 CDR 아미노산 잔기는 24 내지 34(LCDR1), 50 내지 56(LCDR2) 및 89 내지 97(LCDR3)로 넘버링된다. 초티아 넘버링 스킴 하에, 일부 구현예에서, VH 내의 CDR 아미노산은 26 내지 32(HCDR1), 52 내지 56(HCDR2) 및 95 내지 102(HCDR3)로 넘버링되고; VL 내의 CDR 아미노산 잔기는 26 내지 32(LCDR1), 50 내지 52(LCDR2) 및 91 내지 96(LCDR3)으로 넘버링된다. 조합된 카바트 및 초티아 넘버링 스킴에서, 일부 구현예에서, CDR은 카바트 CDR, 초티아 CDR, 또는 둘 다의 일부인 아미노산 잔기에 상응한다. 예를 들어 일부 구현예에서, CDR은 VH, 예를 들어 포유류 VH, 예를 들어 인간 VH 내의 아미노산 잔기 26 내지 35(HCDR1), 50 내지 65(HCDR2) 및 95 내지 102(HCDR3)에 상응하고; VL, 예를 들어 포유류 VL, 예를 들어 인간 VL 내의 아미노산 잔기 24 내지 34(LCDR1), 50 내지 56(LCDR2) 및 89 내지 97(LCDR3)에 상응한다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예컨대, 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 이 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하고, DNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당해 분야에서 이용 가능하고 잘 알려진 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생성, 또는 특이적 면역 적격(competent) 세포의 활성화, 또는 이들 둘 다를 수반할 수 있다. 숙련자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 마크로분자가 항원으로서의 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 따라서, 숙련자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가, 본 명세서에서 사용되는 용어 "항원"을 암호화함을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 암호화될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 1개 초과의 유전자의 부분적인 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 이들 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 암호화하도록 다양한 조합으로 배열되는 것이 분명하다. 또한, 숙련자는 항원이 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성되어 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 이외의 마크로분자일 수 있음이 분명하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "자가"는 이후에 개체에게 재도입될, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종"은 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 하나 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않은 경우에 둘 이상의 개체는 서로 동종이계라 한다. 일부 양태에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 항원과 관련하여 상호 작용하기에 유전적으로 충분히 다를 수 있다.
용어 "이종"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "암"은 이상 세포의 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예가 본 명세서에 기술되어 있고, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용어 "종양" 및 "암"은 본 명세서에서 상호 교환가능하게 사용되며, 예를 들어 이들 둘 다의 용어는 고형 및 액상, 예를 들어 미만성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암" 또는 "종양"은 악성뿐만 아니라 전암성 암 및 종양을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "~로부터 유래되는"은 제1 분자와 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 이것은 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하며, 제2 분자로부터 유래되는 제1 분자에 대한 공정 또는 공급원 상의 제한은 내포하지 않거나 포함하지 않는다. 예를 들어, CD3제타 분자로부터 유래되는 세포내 신호전달 도메인의 경우, 세포내 신호전달 도메인은 요구되는 기능, 즉, 적절한 조건 하에 신호를 생성하는 능력을 갖도록 하기에 충분한 CD3제타 구조를 보유한다. 이것은 세포내 신호전달 도메인의 특정한 생성 방법에 대한 제한을 내포하지 않거나 포함하지 않으며, 예를 들어, 이것은 세포내 신호전달 도메인을 제공하기 위하여 CD3제타 서열로 시작하여 원하지 않는 서열을 결실시키거나, 또는 돌연변이를 시행하여, 세포내 신호전달 도메인에 도달해야 함을 의미하는 것이 아니다.
어구 "본 명세서에서 기술되는 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 질환”은, 예를 들어, 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성 종양 또는 전암성 병태, 예컨대 골수형성이상증, 골수형성이상 증후군 또는 전백혈병을 비롯하여 본 명세서에서 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 세포와 관련된 병태 또는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 질환; 또는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 세포와 관련된 비암 관련 적응증을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 혈액암이다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 고형암이다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 추가의 질환은, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 비정형 및/또는 비 고전적 암, 악성 종양, 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 비암 관련 적응증은, 예를 들어 자가면역 질환(예를 들어, 루푸스), 염증성 장애(알레르기 및 천식) 및 이식을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.　일부 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 종양 항원을 암호화하는 mRNA를 발현하거나 또는 임의의 시점에 발현하였다. 일 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 종양 항원 단백질(예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생산하고, 종양 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 검출 가능한 수준의 종양 항원 단백질을 한 시점에 생산하였고, 이후에 실질적으로 검출 가능하지 않은 종양 항원 단백질을 생산하였다.
어구 "CD19의 발현과 관련된 질환"은, 예를 들어 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성 종양 또는 전암성 병태, 예컨대 골수형성이상증, 골수형성이상 증후군 또는 전백혈병을 비롯하여 CD19를 발현하는 세포와 관련된 병태 또는 CD19의 발현과 관련된 질환; 또는 CD19를 발현하는 세포와 관련된 비암 관련 적응증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 양태에서, CD19의 발현과 연관된 암은 혈액암이다. 일 양태에서, 혈액암은 백혈병 또는 림프종이다. 일 양태에서, CD19의 발현과 관련된 암은 예를 들어 급성 골수성 백혈병(AML), B 세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T 세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 급성 림프성 백혈병(ALL)을 포함하나 이에 한정되지 않는 1종 이상의 급성 백혈병; 예를 들어, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프성 백혈병(CLL)을 포함하나 이에 한정되지 않는 1종 이상의 만성 백혈병을 포함하나 이에 한정되지 않는 암 및 악성 종양을 포함한다. CD19의 발현과 연관된 추가의 암 또는 혈액 병태는 예를 들어 B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 광범위 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종(MCL), 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수형성이상증 및 골수형성이상 증후군, 비 호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 골수증식 신생물; 조직구 장애(예컨대, 비만 세포 장애 또는 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물); 비만 세포 장애, 예컨대, 전신 비만세포증 또는 비만 세포 백혈병; B 세포 전림프구성 백혈병, 형질세포 골수종, 및 골수 혈액 세포의 비유효 생성(또는 형성이상증)과 연합된 혈액 병태의 다양한 집합인 "전백혈병" 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. CD19 발현과 관련된 추가 질환은, 예를 들어 CD19의 발현과 관련된 비정형 및/또는 비전형 암, 악성 종양, 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. CD19의 발현과 관련된 비 암 관련 적응증은, 예를 들어 자가면역 질환(예를 들어, 루푸스), 염증성 장애(알레르기 및 천식) 및 이식을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 종양 항원을 암호화하는 mRNA를 발현하거나 또는 임의의 시점에 발현하였다. 일 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 종양 항원 단백질(예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생산하고, 종양 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 검출 가능한 수준의 종양 항원 단백질을 한 시점에 생산하였고, 이후에 실질적으로 검출 가능하지 않은 종양 항원 단백질을 생산하였다. 다른 구현예에서, 질환은 CD19 음성 암, 예컨대, CD19 음성 재발 암이다. 일부 구현예에서, 종양 항원(예컨대, CD19) 발현 세포는 종양 항원을 암호화하는 mRNA를 발현하거나 또는 임의의 시점에 발현하였다. 일 구현예에서, 종양 항원(예컨대, CD19) 발현 세포는 종양 항원 단백질(예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생산하고, 종양 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 종양 항원(예컨대, CD19) 발현 세포는 검출 가능한 수준의 종양 항원 단백질을 한 시점에 생산하였고, 이후에 실질적으로 검출 가능하지 않은 종양 항원 단백질을 생산하였다.
어구 "B 세포 항원의 발현과 관련된 질환"은, 예를 들어 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성 종양 또는 전암성 병태, 예컨대 골수형성이상, 골수형성이상 증후군 또는 전백혈병을 비롯하여 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상의 발현과 관련된 질환 또는 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상을 발현하거나 또는 임의의 시점에 발현했던 세포와 관련된 병태; 또는 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상을 발현하는 세포와 관련된 비암 관련 적응증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 의심을 피하기 위해, B 세포 항원의 발현과 관련된 질환은, 예를 들어 B 세포 항원을 표적화하는 분자, 예를 들어 B 세포 표적화 CAR을 사용한 치료로 인해 예를 들어 항원 발현이 하향조절되었기 때문에 현재는 B 세포 항원을 발현하지 않지만, 한 때는 항원을 발현했던 세포와 관련된 병태를 포함할 수 있다. 어구 "B 세포 항원의 발현과 관련된 질환"은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CD19의 발현과 관련된 질환을 포함한다. 구현예에서, CAR 발현 세포는 B 세포 항원과 관련된 질환을 치료하는 데 사용된다. 구현예에서, 본 명세서의 방법에 의해 생성된 CAR은 B 세포 항원을 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재발"은 예컨대, 치료법, 예컨대, 암 치료법을 이용한 사전 치료 후에, 반응성(예를 들어, 완전 반응 또는 부분 반응)의 초기 기간 후 질환(예를 들어, 암)이 재출현하는 것을 지칭한다. 반응성의 초기 기간은 특정 역치 미만, 예를 들어 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로 떨어진 암 세포의 수준을 수반할 수 있다. 재출현은 특정 역치 초과, 예를 들어 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 초과로 상승한 암 세포의 수준을 수반할 수 있다. 예를 들어 B-ALL과 관련하여, 재출현은 완전 반응 후 혈액, 골수(5% 초과), 또는 임의의 골수외 부위에서 예를 들어 모세포의 재출현을 수반할 수 있다. 이와 관련하여, 완전 반응은 5% 미만의 BM 모세포를 수반할 수 있다. 보다 일반적으로, 일 구현예에서, 반응(예를 들어 완전 반응 또는 부분 반응)은 검출 가능한 MRD(최소 잔류 질환)의 부재를 수반할 수 있다. 일 구현예에서, 반응성의 초기 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일; 적어도 1, 2, 3, 또는 4주; 적어도 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 또는 12개월; 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년 지속된다.
본 명세서에서 사용되는 "불응성"은 치료에 반응하지 않는 질환, 예를 들어 암을 지칭한다. 구현예들에서, 불응성 암은 치료 전 또는 치료 시작 시에 치료에 저항성일 수 있다. 다른 구현예에서, 불응성 암은 치료하는 동안 저항성이 될 수 있다. 불응성 암은 저항성 암으로도 칭해진다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특징에 대한 영향이나 변경이 크지 않은 아미노산 변형을 나타낸다. 이러한 보존적 변형에는 아미노산 치환, 부가 및 결실이 포함된다. 변형은 당해 분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 위치 지정 돌연변이유발 및 PCR 매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 분야에서 정의되어 있다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 CAR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 CAR은 본 명세서에서 기술된 기능적 분석법을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "자극"은 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체 또는 CAR)가 이의 동족 리간드(또는 CAR의 경우에 종양 항원)와 결합하여 신호 전달 사건, 예컨대 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달 또는 적절한 NK 수용체 또는 CAR의 신호전달 도메인을 통한 신호 전달(그러나 이에 한정되지 않음)을 매개함으로써 유도되는 1차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 측면에 대한 자극 방식으로 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 면역 세포에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 일 양태에서, 신호는 예를 들어 펩티드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되고, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 T 세포 반응의 매개를 야기하는 일차 신호이다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열("1차 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려져 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 통상적인 FcR 감마(FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타(Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 특정 CAR에서, 본 발명의 임의의 1종 이상의 CAR 내의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 신호전달 서열, 예를 들어 CD3-제타의 1차 신호전달 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 1차 신호전달 서열은 서열번호 9(돌연변이체 CD3 제타)로서 제공된 서열, 또는 비 인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 1차 신호전달 서열은 서열번호 10(야생형 인간 CD3 제타)에 제공된 바와 같은 서열, 또는 비 인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 표면 상에 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 복합체화된 외래 항원을 디스플레이하는 면역계 세포, 예컨대 보조 세포(예를 들어, B 세포, 수지상 세포 등)를 지칭한다. T 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 사용하여 이들 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 프로세싱하여 T 세포에 제시한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR 함유 세포, 예컨대 CART 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성할 수 있다. 예를 들어 CART 세포에서 면역 이펙터 기능의 예는 사이토카인의 분비를 비롯하여 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다. 구현예들에서, 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 부분이다. 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에서 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되는 경우에, 이러한 절두된 부분은, 이것이 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 온전한 쇄 대신 사용될 수 있다. 이에 따라, 용어 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함하고자 한 것이다.
일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 일차 세포내 신호전달 도메인에는 일차 자극, 또는 항원 의존적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것이 포함된다. 일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동 자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동 자극 세포내 신호전달 도메인에는 공동 자극 신호, 또는 항원 독립적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것이 포함된다. 예를 들어 CART의 경우에, 일차 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동 자극 세포내 신호전달 도메인은 공동수용체 또는 공동 자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반의 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278("ICOS"), FcεRI, 및 CD66d, CD32, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 GenBank 기탁 번호 BAG36664.1로서 제공된 단백질 또는 비 인간 종, 예컨대 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화를 위해 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 쇄의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기로서 정의된다. 일 양태에서, 제타의 세포질 도메인은 GenBank 기탁 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164, 또는 이의 기능적 오르소로그인 비 인간 종, 예컨대 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 포함한다. 일 양태에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열번호 9로서 제공된 서열이다. 일 양태에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열번호 10으로서 제공된 서열이다.
용어 "공동 자극 분자"는 공동 자극 리간드와 특이적으로 결합하여, T 세포에 의한 공동 자극 반응, 예컨대 증식(그러나 이에 한정되지 않음)을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동 자극 분자는 항원 수용체 또는 효율적인 면역 반응에 필요한 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동 자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
공동 자극 세포내 신호전달 도메인은 공동 자극 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 고유의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 고유의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
용어 "4-1BB"는 GenBank 기탁 번호 AAA62478.2로서 제공된 아미노산 서열, 또는 비 인간 종, 예컨대 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 갖는 TNFR 수퍼패밀리의 구성원을 나타내고; "4-1BB 공동 자극 도메인"은 GenBank 기탁 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214 내지 255, 또는 비 인간 종, 예컨대 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의된다. 일 양태에서, "4-1BB 공동 자극 도메인"은 서열번호 7로 제공된 서열 또는 비 인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응, 예컨대 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여되는 세포를 나타낸다. 면역 이펙터 세포의 예에는 T 세포, 예컨대 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 및 골수 유래 식세포가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 이펙터 기능 또는 면역 이펙터 반응"은, 예컨대 표적 세포의 면역 공격을 증강시키거나 촉진하는 면역 이펙터 세포의 기능 또는 반응을 나타낸다. 예를 들어 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸, 또는 이의 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우에, 일차 자극 및 공동 자극은 면역 이펙터 기능 또는 반응의 예이다.
용어 "이펙터 기능"은 세포의 특수 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은, 예를 들어 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
본 명세서에서 상호 교환가능하게 사용되는 용어 "고갈" 또는 "고갈시키는"은 공정, 예컨대, 선택 단계, 예컨대, 음성 선택이 수행된 후, 샘플의 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양의 저하 또는 감소를 지칭한다. 고갈은 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 완전 또는 부분 고갈일 수 있다. 일 구현예에서, 고갈은 공정이 수행되기 전 샘플의 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양과 비교하여, 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양의 저하 또는 감소이다.
본 명세서에서 상호 교환가능하게 사용되는 용어 "강화된" 또는 "강화"는 공정, 예컨대, 선택 단계, 예컨대, 양성 선택이 수행된 후, 샘플의 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양의 증가를 지칭한다. 강화는 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 완전 또는 부분 강화일 수 있다. 일 구현예에서, 강화는 기준 샘플의 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양과 비교하여, 적어도 1%, 예컨대, 적어도 1 내지 200%, 예컨대, 적어도 1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 50, 50 내지 70, 70 내지 90, 90 내지 110, 110 내지 130, 130 내지 150, 150 내지 170, 또는 170 내지 200%의 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양의 증가이다. 일부 구현예에서, 강화는 기준 샘플의 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양과 비교하여, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99%의 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양의 증가이다. 일부 구현예에서, 강화는 기준 샘플의 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양과 비교하여, 적어도 1.1배, 예컨대, 1.1 내지 200배, 예컨대, 1.1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 50, 50 내지 70, 70 내지 90, 또는 90 내지 100배의 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양의 증가이다. 일부 구현예에서, 기준 샘플은 동일한 샘플, 예컨대, 공정이 수행되기 전 샘플일 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 샘플은 이후에 강화가 수행되는 샘플, 예컨대, 강화 전 집단, 예컨대, 출발 집단을 지칭한다. 일부 구현예에서, 기준 샘플은 상이한 샘플, 예컨대, 공정이 수행되지 않는 샘플일 수 있다.
용어 "암호화하는"은 뉴클레오티드(예를 들어 rRNA, tRNA 및 mRNA)의 규정된 서열 또는 아미노산의 규정된 서열 및 그로부터 초래된 생물학적 특성을 갖는, 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 마크로분자의 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA 또는 RNA는 그러한 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생성하는 경우에 단백질을 암호화한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에서 제공되는 암호화 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비 암호화 가닥 둘 다는 그러한 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로서 언급될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 축퇴성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어구 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의, 또는 그 내부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 외부로부터 도입되거나 외부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 구동되는 특정한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 친양쪽성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는 수많은 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 핵산의 세포 내로의 전달을 용이하게 하는 비 플라스미드 및 비 바이러스 화합물, 예컨대, 예를 들어 폴리라이신 화합물, 리포솜 등을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "발현 벡터"는 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관 내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어 네이키드이거나 또는 리포솜 내에 포함됨) 및 바이러스(예를 들어 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하는 당해 분야에 공지된 모든 것을 포함한다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과(Retroviridae family)의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특한 것이고; 렌티바이러스는 유의한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있어, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나가 된다. HIV, SIV 및 FIV가 렌티바이러스의 모든 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 특히 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에서 제공되는 바와 같은 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함하는, 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 예를 들어 Oxford BioMedica로부터의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen으로부터의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 비 임상 유형의 렌티바이러스 벡터가 또한 이용 가능하고, 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자와 같은 2개의 핵산 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 나타낸다. 두 분자 모두에서 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각에서 하나의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 그 위치에서 상동성이거나 동일하다. 두 서열 사이의 상동성은 매치되거나 상동성인 위치의 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어, 두 서열에서의 위치의 절반(예를 들어, 중합체 10개의 서브유닛 길이에서 5개의 위치)이 상동성일 경우, 두 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90%(예를 들어 10개 중 9개)가 매치되거나 상동성일 경우, 두 서열은 90% 상동성이다.
비 인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태로는 비 인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이 있다. 대개, 인간화 항체 및 이의 항체 단편은 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비 인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비 인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체/항체 단편은 수용자 항체에서도 발견되지 않고 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 개량하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 이의 항체 단편은 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비 인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 유의한 일부의 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 추가의 상세 사항에 대해서는, 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986]; 문헌[Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988]; 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]을 참조한다.
"완전 인간"은 전체 분자가 인간 기원이거나 항체 또는 면역글로불린의 인간 형태에 대해 동일한 아미노산 서열로 이루어진 면역글로불린, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그것의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비 고유 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 다음의 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 이는 후자의 발현을 초래한다. 예를 들어 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우에 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들어 프로모터는 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우에 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열들은 서로 인접할 수 있고, 예를 들어 2개의 단백질 암호화 영역을 연결하는 것이 필요한 경우에, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다.
용어 면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들어 피하(s.c), 정맥 내(i.v.), 근육 내(i.m.), 또는 흉골 내 주사, 종양 내, 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 또는 이의 DNA 또는 RNA의 조합, 및 이의 중합체를 나타낸다. 용어 "핵산"은 유전자, cDNA 또는 mRNA를 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 합성(예컨대, 화학적으로 합성됨) 또는 재조합 핵산 분자이다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생적인 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 유사체 또는 유도체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오르소로그, SNP, 및 상보성 서열을 묵시적으로 포괄한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; 문헌[Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; 및 문헌[Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호 교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 이루어진 화합물을 나타낸다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열에 포함될 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 존재하지 않는다. 폴리펩티드에는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질이 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어는, 예를 들어 당해 분야에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 통상적으로 나타내는 단쇄, 및 많은 유형이 존재하는, 일반적으로 당해 분야에서 단백질로 나타내는 장쇄를 둘 다 나타낸다. "폴리펩티드"에는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질이 포함된다. 폴리펩티드에는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 이의 조합이 포함된다.
용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는 데 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 예에서 이 서열은 또한 인핸서 서열, 및 유전자 생성물의 발현에 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "구성적" 프로모터는, 유전자 생성물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우에 유전자 생성물이 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건 하에 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성" 프로모터는, 유전자 생성물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우에 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도자가 세포에 존재할 때에만 유전자 생성물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직 특이적" 프로모터는, 유전자에 의해 암호화되거나 특정되는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우에 실질적으로 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 생성물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "암 연관 항원" 또는 "종양 항원"은 정상 세포와 비교할 때, 전체적으로 또는 단편(예를 들어 MHC/펩티드)으로서 암 세포의 표면 상에서 우선적으로 발현되고, 약리학적 작용제의 암 세포로의 우선적 표적화에 유용한 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 상호 교환가능하게 지칭한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 정상 세포 및 암 세포 둘 다에 의해 발현되는 마커, 예를 들어 계통 마커, 예를 들어 B 세포 상의 CD19이다. 특정 양태에서, 본 발명의 종양 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비 호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암 및 선암종, 예컨대 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 암으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 암 연관 항원은 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 과발현, 예를 들어 정상 세포와 비교하여 1배의 과발현, 2배의 과발현, 3배의 과발현, 또는 그 이상으로 과발현되는 세포 표면 분자이다. 일부 구현예에서, 암 연관 항원은 암 세포에서 부적절하게 합성된 세포 표면 분자, 예를 들어 정상 세포 상에서 발현되는 분자와 비교하여 결실, 부가 또는 돌연변이를 함유하는 분자이다. 일부 구현예에서, 암 연관 항원은 암 세포의 세포 표면 상에서 전체적으로 또는 단편(예를 들어 MHC/펩티드)으로서 배타적으로 발현될 것이고, 정상 세포의 표면 상에서는 합성되거나 발현되지 않을 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR은 MHC 제시 펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어 항체 또는 항체 단편)을 포함하는 CAR을 포함한다. 통상적으로, 내인성 단백질로부터 유래된 펩티드는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자의 포켓을 채우고, CD8+ T 림프구 상의 T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식된다. MHC 클래스 I 복합체는 모든 유핵 세포에 의해 구성적으로 발현된다. 암에서, 바이러스 특이적 및/또는 종양 특이적 펩티드/MHC 복합체는 면역치료법을 위한 고유한 클래스의 세포 표면 표적을 나타낸다. 인간 백혈구 항원(HLA)-A1 또는 HLA-A2와 관련하여 바이러스 또는 종양 항원으로부터 유래된 펩티드를 표적화하는 TCR 유사 항체가 기술된 바 있다(예를 들어 문헌[Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942]; 문헌[Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272]; 문헌[Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165]; 문헌[Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21): 1601-1608]; 문헌[Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176): 176ra33]; 문헌[Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100] 참조). 예를 들어 TCR 유사 항체는 라이브러리, 예컨대 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝으로부터 확인될 수 있다.
scFv와 관련하여 사용된 용어 "가요성 폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합되어 사용되는 아미노산, 예컨대 글리신 및/또는 세린 잔기로 이루어진 펩티드 링커를 지칭한다. 일 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n(서열번호 15)을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어 n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10이다. 일 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 (Gly4 Ser)4(서열번호 27) 또는 (Gly4 Ser)3(서열번호 28)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser)(서열번호 29)의 다중 반복부를 포함한다. 또한, 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2012/138475호에 기술된 링커가 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 5' 캡(RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡으로도 지칭됨)은 전사 개시 직후에 진핵 메신저 RNA의 "맨 앞쪽" 또는 5' 말단에 부가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 5' 캡은 제1 전사 뉴클레오티드에 연결된 말단 기로 이루어진다. 이의 존재는 리보솜에 의한 인식 및 RNase로부터의 보호에 중요하다. 캡 부가는 전사와 커플링되고, 전사와 동시에 일어나서, 각각은 서로 영향을 미치게 된다. 전사 시작 직후에, 합성 중인 mRNA의 5' 말단에는 RNA 폴리머라아제와 회합된 캡 합성 복합체가 결합된다. 이러한 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 필요한 화학 반응을 촉매작용한다. 합성은 다단계 생화학 반응으로서 진행된다. 캡핑 모이어티는 mRNA의 기능성, 예컨대 이의 안정성 또는 번역 효율을 조정하도록 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "시험관 내 전사 RNA"는 시험관 내에서 합성된 RNA, 예를 들어 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관 내 전사 RNA는 시험관 내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관 내 전사 벡터는 시험관 내 전사 RNA를 생성하는 데 사용되는 주형을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "폴리(A)"는 폴리아데닐화에 의해 mRNA에 부착된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 구축물의 일부 구현예에서, 폴리A는 50 내지 5000개(서열번호 30), 예를 들어 64개 초과, 예를 들어 100개 초과, 예를 들어 300 또는 400개 초과이다. 폴리(A) 서열은 mRNA 기능성, 예컨대 국소화, 안정성 또는 번역 효율을 조정하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "폴리아데닐화"는 폴리아데닐릴 모이어티, 또는 이의 변형된 변이체의 메신저 RNA 분자에 대한 공유 결합을 지칭한다. 진핵 유기체에서, 대부분의 메신저 RNA(mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리(A) 테일은 효소, 폴리아데닐레이트 폴리머라아제의 작용을 통해 프리(pre)-mRNA에 부가된 아데닌 뉴클레오티드(종종 수백 개)의 긴 서열이다. 고등 진핵생물에서, 폴리(A) 테일은 특정 서열, 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체 상에 부가된다. 폴리(A) 테일 및 그에 결합된 단백질은 mRNA를 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호하는 것을 돕는다. 폴리아데닐화는 또한 전사 종결, mRNA의 핵으로부터의 유출, 및 번역에 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA의 RNA로의 전사 직후에 핵에서 일어나지만, 추가로 이후에 세포질에서도 일어날 수 있다. 전사가 종결된 후에, mRNA 쇄는 RNA 폴리머라아제와 회합된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 통상적으로 절단 부위 근처의 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후에, 아데노신 잔기는 절단 부위의 자유 3' 말단에 부가된다.
본 명세서에서 사용되는 "일시적"은 수 시간, 수 일 또는 수 주의 기간 동안의 비 통합된 이식유전자의 발현을 지칭하고, 여기서 발현 기간은 게놈 내로 통합되거나 숙주 세포 내의 안정적인 플라스미드 레플리콘 내에 포함된 경우의 유전자의 발현을 위한 기간 미만이다.
분리반출술은 개체로부터 전혈을 제거하여, 선택 성분으로 분리하고, 나머지를 순환으로 되돌리는 과정이다. 일반적으로, 혈액 성분 분리를 위한 두 가지 방법이 있는데, 원심분리 및 비 원심분리 방법이다. 백혈구 분리반출술은 환자의 백혈구의 능동 선택 및 제거를 초래한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 요법제(예를 들어 하나 이상의 치료제, 예컨대 본 발명의 CAR)의 투여로부터 초래되는 증식성 장애의 진행, 중증도 및/또는 지속 기간의 감소 또는 개선, 또는 이의 하나 이상의 증상(예를 들어 하나 이상의 식별 가능한 증상)의 개선을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 예를 들어 환자가 반드시 식별할 수 있는 것이 아닌, 증식성 장애의 적어도 하나의 측정 가능한 물리적 파라미터, 예컨대 종양의 성장의 개선을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화에 의해 물리적으로, 예를 들어 물리적 파라미터의 안정화에 의해 생리학적으로, 또는 둘 다에 의해, 증식성 장애의 진행을 억제하는 것을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 종양 크기 또는 암 세포 수의 감소 또는 안정화를 지칭한다.
용어 "신호 전달 경로"는 신호를 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로 전달하는 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자들 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고 세포막을 가로질러 신호를 전달하는 것이 가능한 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아 있는 유기체(예를 들어, 포유류, 인간)를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형이 본질적으로 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 이의 자연 발생 상태에서 보통 회합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 그들의 천연 상태에서 자연적으로 회합되어 있는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 양태에서, 세포는 시험관 내에서 배양된다. 다른 양태에서, 세포는 시험관 내에서 배양되지 않는다.
본 발명의 맥락에서, "종양 항원" 또는 "과다증식성 장애 항원" 또는 "과다증식성 장애와 관련된 항원"은 특정 과다증식성 장애에 통상적인 항원을 지칭한다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비 호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암 및 선암종, 예컨대 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 암으로부터 유래된다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플 내에 존재하는 동족 결합 파트너 단백질을 인식하고 이와 결합하지만 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않거나 결합하지 않는 항체 또는 리간드를 지칭한다.
범위: 본 개시 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양태는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기술은 단지 편의 및 간결함을 위한 것이고, 본 발명의 범주에 대한 융통성 없는 제한으로서 해석되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기술은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위와, 그 범위 내의 개별 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기술은 구체적으로 개시된 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과, 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 또 다른 예로서, 95 내지 99% 동일성과 같은 범위는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것을 포함하고, 하위범위, 예컨대 96 내지 99%, 96 내지 98%, 96 내지 97%, 97 내지 99%, 97 내지 98% 및 98 내지 99% 동일성을 포함한다. 이것은 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Stat3 활성제"는 예를 들어 (예를 들어 티로신 705(Y705)에서) Stat3의 증가된 인산화를 초래함으로써, 또는 Stat3 활성화 유전자의 전사를 증가시킴으로써, 또는 Stat3 억제 유전자의 전사를 감소시킴으로써, Stat3 경로를 활성화시키는 분자를 지칭한다. Stat3 활성제는 예를 들어 폴리펩티드 또는 소분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Stat3 활성제는 예를 들어 gp130과 결합함으로써 Stat3의 상류에서 작용한다. 일부 구현예에서, Stat3 활성제는 Stat3과 결합한다. Stat3 활성제는 IL-6 패밀리 사이토카인; IL-10 패밀리 사이토카인; IL-17 패밀리 사이토카인; CCL20 분자; gp130 활성제; IL-10R2 수용체 활성제; 가용성 IL-6 수용체; 및 IL-6/IL-6R 복합체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, Stat3 활성제는 예를 들어 시험관 내 또는 생체 내에서, CAR T 세포 확장을 초래할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Stat3 활성제 세포"는 (예를 들어, 가용성 단백질로서 또는 세포 표면 상에) Stat3 활성제를 포함하는(예를 들어, 발현하는) 세포, 또는 Stat3 활성제가 접합된, 예컨대, 세포의 표면 상에, 위치된, 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "IL-6 패밀리 사이토카인"은 IL-6 사이토카인 패밀리의 분자를 지칭하고, 전장 천연 IL-6 사이토카인 패밀리 구성원, 이의 활성 단편 또는 이의 활성 변이체를 지칭한다. 구현예들에서, IL-6 패밀리 사이토카인은 IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, IL-31 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자 또는 OSM 분자로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IL-6 패밀리 사이토카인은 수용체, 예컨대, α 수용체(예컨대, IL-6Rα, IL-11Rα 또는 CNTFRα)에 결합한다. 일부 구현예에서, α 수용체에 결합된 IL-6 패밀리 사이토카인은 복합체, 예를 들어 α 수용체 및 신호전달 β 수용체, 예를 들어 gp130을 포함하는 복합체를 형성한다. 구현예들에서, IL-6 패밀리 사이토카인은 신호 전달 β 수용체, 예를 들어 gp130을 통해 신호를 보낸다. 일부 구현예에서, IL-6 패밀리 사이토카인은 Stat3 경로를 활성화시킨다. 예를 들어, 티로신 705를 인산화시키거나, Stat3 활성화 유전자의 전사를 증가시키거나, Stat3 억제 유전자의 전사를 감소시킨다. 일부 구현예에서, IL-6 패밀리 사이토카인은 예를 들어 시험관 내 또는 생체 내에서, CAR T 세포 확장을 초래한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "IL-6 분자"는 전장 천연 IL-6(예컨대, 포유류 IL-6, 예컨대, 인간 IL-6, 예컨대, GenBank 기탁 번호 CAA68278.1), IL-6의 활성 단편, 또는 IL-6 또는 이의 단편의 천연 야생형 폴리펩티드에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 활성 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변이체, 예컨대, 활성 변이체는, 야생형 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산의 유도체, 예컨대, 돌연변이체이다. 일부 구현예에서, IL-6 변이체, 예컨대, IL-6의 활성 변이체는 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 야생형 IL-6 폴리펩티드의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-6 분자는 gp130 수용체를 통해 신호를 보낸다. 일부 구현예에서, IL-6 분자는 Stat3 경로를 활성화시킨다. 예를 들어, 티로신 705를 인산화시키거나, Stat3 활성화 유전자의 전사를 증가시키거나, Stat3 억제 유전자의 전사를 감소시킨다. 일부 구현예에서, IL-6 분자는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 사이토카인 분자의 "활성 변이체"는 예컨대, 당해 분야에서 인정되는 분석법을 이용하여 측정 시, 야생형 사이토카인의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 활성을 갖는 사이토카인 변이체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "IL-10 패밀리 사이토카인"은 IL-10 사이토카인 패밀리의 분자를 지칭하고, 전장 천연 IL-10 사이토카인 패밀리 구성원, 이의 활성 단편 또는 이의 활성 변이체를 지칭한다. 구현예들에서, IL-10 패밀리 사이토카인은 IL-10 분자, IL-19 분자, IL-20 분자, IL-22 분자, IL-24 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자 또는 IL-29 분자로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IL-10 패밀리 사이토카인은 IL-10R2 수용체를 통해 신호를 보낸다. 일부 구현예에서, IL-10 패밀리 사이토카인은 예를 들어 시험관 내 또는 생체 내에서, CAR T 세포 확장을 초래한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "IL-17 패밀리 사이토카인"은 IL-17 사이토카인 패밀리의 분자를 지칭하고, 전장 천연 IL-17 사이토카인 패밀리 구성원, 이의 활성 단편 또는 이의 활성 변이체를 지칭한다. 구현예들에서, IL-17 패밀리 사이토카인은 IL17A 분자, IL17B 분자, IL17C 분자, IL17D 분자, IL17E 분자 또는 IL17F 분자로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IL-17 패밀리 사이토카인은 예를 들어 시험관 내 또는 생체 내에서, CAR T 세포 확장을 초래한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "gp130 활성제"는 gp130을 활성화시켜, 예컨대, gp130의 이량체화, 예컨대, 동종이량체화, 또는 gp130의 예컨대, LIF, OSM 또는 CNTF와의 이종이량체화를 초래하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, gp130 활성제는 IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자, OSM 분자, 또는 gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 항-gp130 항체 분자로부터 선택된다. 일부 구현예에서, gp130 활성제는 gp130을 통한 신호전달을 초래한다. 일부 구현예에서, gp130 활성제는 Stat3 경로를 활성화시킨다. 예를 들어, 티로신 705를 인산화시키거나, Stat3 활성화 유전자의 전사를 증가시키거나, Stat3 억제 유전자의 전사를 감소시킨다. 일부 구현예에서, gp130 활성제는 예를 들어 시험관 내 또는 생체 내에서, CAR T 세포 확장을 초래한다.
용어 "gp130 분자"는 전장 천연 gp130(예컨대, 포유류 gp130, 예컨대, 인간 gp130, 예컨대, GenBank 기탁 번호 AAI17403), gp130의 활성 단편, 또는 gp130 또는 이의 단편의 천연 야생형 폴리펩티드에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 활성 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변이체는 야생형 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산의 유도체, 예컨대, 돌연변이체이다. 일부 구현예에서, gp130 변이체, 예컨대, gp130의 활성 변이체는 야생형 gp130 폴리펩티드의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, gp130 분자는 Stat3 경로를 활성화시킨다. 예를 들어, 티로신 705를 인산화시키거나, Stat3 활성화 유전자의 전사를 증가시키거나, Stat3 억제 유전자의 전사를 감소시킨다. 일부 구현예에서, gp130 활성제는 예를 들어 시험관 내 또는 생체 내에서, CAR T 세포 확장을 초래한다. gp130은 또한 CD130 또는 IL-6 수용체 서브유닛 베타(IL-6RB)라 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Stat3 분자"는 예를 들어 (예를 들어 티로신 705(Y705)에서) Stat3의 증가된 인산화를 초래함으로써, 또는 Stat3 활성화 유전자의 전사를 증가시킴으로써, 또는 Stat3 억제 유전자의 전사를 감소시킴으로써, Stat3 경로를 활성화시키는 분자를 지칭한다. 용어 Stat3 분자는 전장 천연 Stat3(예컨대, 포유류 Stat3, 예컨대, 인간 Stat3, 예컨대, GenBank AAS66986.1), Stat3의 활성 단편, 또는 Stat3의 천연 야생형 폴리펩티드, 또는 이를 암호화하는 핵산에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 활성 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체는 야생형 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산의 유도체, 예컨대, 돌연변이체이다. 일부 구현예에서, Stat3 변이체, 예컨대, Stat3의 활성 변이체는 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 야생형 Stat3 폴리펩티드의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, Stat3 분자는 예를 들어 시험관 내 또는 생체 내에서, CAR T 세포 확장을 초래한다.
설명
본 개시는 그 중에서도 CAR 발현 세포(예컨대, CAR19 발현 세포)의 개선된 제조 방법, 예컨대, 제작 방법을 제공한다. 또한, 본 개시는 조성물 및 이를 포함하는 반응 혼합물을 제공한다. 일부 구현예에서, 제조 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 (i) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은, Stat3 활성제, (ii) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG), 또는 (i)과 (ii) 둘 다와 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 개시는, 일부 양태에서, CAR 발현 세포를 이용한 치료적 처치를 받을 대상체, 받을 예정인 대상체, 받았던 대상체 또는 받고 있는 대상체를 평가, 예측, 선택, 또는 모니터링하는 방법을 제공한다. 또한, CAR 발현 세포를 이용한 치료적 처치에 대한, 암(예컨대, 본 명세서에서 기술된 암)을 앓는 대상체의 반응성을 평가 또는 예측하는 방법이 본 명세서에서 기술된다.
일 양태에서, 본 개시는 CAR 발현 세포의 개선된 제조 방법을 제공한다. 본 명세서에서 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 글루코스 대사를 저하시키는 것은 CAR 발현 세포의 개선된 효능을 초래할 수 있다. 따라서, 더 낮은 글루코스 대사를 갖는다는 것에 기초하여 CAR 요법을 위한 면역 이펙터 세포가 선택될 수 있거나, 또는 CAR 발현 세포의 효능을 개선하기 위하여 글루코스 대사 억제제가 제조 공정에 첨가될 수 있다. 나아가, 본 명세서의 실시예 2는 CAR 발현 세포의 효능을 개선하는 방법으로 Stat3 경로 활성화를 기술한다.
또한, 본 개시는 CAR, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR로 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)의 제조 방법, 그리고 이러한 세포를 포함하는 반응 혼합물 및 조성물을 기술한다. 본 명세서에서 제공된 방법은 CAR의 발현에 적합한 세포의 수율 및 품질, 예컨대, 순도를 개선한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 세포의 개선된 수율 및 품질은 CAR 암호화 핵산 도입의 효율을 개선하고, 생성된 CAR 발현 세포의 확장을 개선한다고 여겨진다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 방법 및 조성물은 대상체의 질환 치료에 사용하기 위한 개선된 CAR 발현 세포 생성물을 제공한다.
또한, 본 개시는 원치 않는 물질, 비 표적 세포, 또는 CAR의 발현 또는 CAR 발현 세포의 치료 효능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 세포를 제거하는 방법을 기술한다. 예를 들어, 본 명세서에서 특징으로 하는 방법은 다음 중 임의의 것의 하나 이상을 제거 또는 고갈시키는 데 사용될 수 있다: 단핵구, 과립구, 적혈구, 혈소판, B 세포, 암 세포, 예컨대, 림프모세포, (냉동 샘플로부터) 동결건조제, 헤모글로빈, 또는 세포 잔해. 예를 들어, 본 명세서에서 특징으로 하는 방법은 다음 중 임의의 것의 하나 이상을 강화하거나 개수를 증가시키는 데 사용될 수 있다: T 세포(CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포), NK 세포, 수지상 세포. 본 명세서에서 기술된 각 방법을 단독으로 또는 본 명세서에서 기술된 각각의 방법 또는 모든 방법과 임의로 조합하여 구현할 경우, CAR을 발현하기 위한 조작에 적합한 개선된 출발 물질이 얻어진다.
신선한 분리반출술 물질은 CAR 발현에 적합한 세포를 제조하는 데 흔히 사용된다. 냉동, 예를 들어 동결보존된 분리반출술 물질을 사용하면 쉽게 수송할 수 있다는 이점을 제공하여, 환자의 위치를 CAR 발현 세포 생성물 제조 시설에 근접시키는 것에 대한 임의의 제한을 제거하고, CAR 발현 세포 제조 공정의 산업화를 가능하게 하며 치료제를 필요로 하는 환자가 치료제에 더 잘 접근할 수 있게 한다. CAR 발현 세포 제조를 위하여 현재 사용되는 방법은 신선한 분리반출술 물질의 처리를 위하여 최적화되어 있고, 냉동 분리반출술 샘플로부터의 CAR 발현에 적합한 세포의 유사한 품질 또는 수율을 수득하는 데 사용될 수 없다. 대조적으로, 본 명세서에서 기술된 방법은 냉동, 예를 들어 동결보존된 분리반출술 샘플로부터의 CAR 발현에 적합한 세포를 처리하고 제조하는 데 사용될 수 있다. 출발 물질이 냉동, 예컨대, 동결보존되는 구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 해동 공정을 가속화하기 위하여 예를 들어 조작자 또는 장치에 의한 간섭 없이 냉동된 세포가 해동되도록 하거나, 또는 냉동된 세포에 대해 예를 들어, 해동 장치, 예컨대 PlasmaTherm을 사용하여 해동 공정을 가속화하는 장치 또는 공정을 수행하는, 해동 단계를 선택적으로 포함한다. 이러한 구현예에서, 해동된 물질은 주위 환경과 동일한 온도, 예를 들어, 방의 주위 온도와 동일한 온도 또는 해동된 물질이 첨가되거나 세척되거나 인큐베이션되는 완충액의 동일한 온도를 갖는다. 본 명세서에서 기술된 방법은 냉동 또는 해동된 투입 샘플, 예를 들어 냉동 또는 해동된 분리반출술 샘플로부터 CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포 집단을 생성 또는 강화하는 데 특히 유용하다.
본 명세서에서 언급되는 방법 B는 현재 사용되는 CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포를 강화하는 일반적인 프로토콜이다. 방법 B는 Ficoll을 사용하여 밀도 구배 정제를 수행하는 단계, 및 CD3/CD28 다이나비즈를 사용한 양성 선택을 포함하며, 이때, 투입 샘플은 신선한 분리반출술 물질이다. 본 명세서에서 기술된 방법은 CAR 발현에 적합한 원하는 면역 이펙터 세포의 더 큰 강화, 개선된 품질 및 수율을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 CAR을 발현하도록 조작된, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 임의의 제조 방법에 의해 제조된, 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 특징으로 하며, 여기서, 조작된 면역 이펙터 세포는 항종양 특성을 나타낸다. 일 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 예시적인 항원은 본 명세서에서 기술된 암 관련 항원(즉, 종양 항원)이다. 일 양태에서, 세포는 CAR로 형질전환되고, CAR은 세포 표면 상에 발현된다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 이러한 구현예에서, 세포는 CAR을 안정적으로 발현할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 CAR을 암호화하는 핵산, 예를 들어 mRNA, cDNA, DNA로 형질감염된다. 일부 이러한 구현예에서, 세포는 CAR을 일시적으로 발현할 수 있다.
더욱이, 본 개시는 CAR 발현 세포 조성물 및 다른 질환 중에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 포함하는, 암 또는 임의의 악성 종양 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 의약 또는 방법에서의 이의 용도를 제공한다.
용리
일 양태에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 원치 않는 세포, 예컨대, 단핵구 및 모세포를 제거하여 CAR 발현에 적합한 원하는 면역 이펙터 세포의 개선된 강화를 초래하는 용리 방법을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 용리 방법은 이전에 냉동된 샘플, 예컨대, 해동된 샘플로부터의 CAR 발현에 적합한 원하는 면역 이펙터 세포의 강화를 위하여 최적화된 것이다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 용리 방법은 당해 분야에 공지된 용리 프로토콜로부터 수집된 세포의 제조와 비교하여 개선된 순도의 세포 제조를 제공한다.
제조 실행 계획(원격 샘플 수집, 운송, 보관, 및 생산 단위 스케줄링)을 용이하게 하기 위하여, 세포 원료 물질은 전형적으로 동결보존된 전혈 또는 분리반출술 물질로, 이들은 제조 개시 전에 해동되어야 한다. 그러나 해동된 이전에 냉동된 물질로부터의 세포의 밀도와 크기는 신선한 물질의 것들과는 상당히 다르다. 따라서, CAR 발현 조작을 위한 세포를 단리하는 데 일반적으로 사용되는 표준 용리 프로토콜은 동결보존되고 해동된 전혈 또는 분리반출술 물질로부터 단핵구, 과립구 또는 임의의 더 큰 크기의 세포를 제거하지 못한다. 이 상황은 후속 CART 제조 단계의 결과에 부정적인 영향을 미쳐 빈약한 수율, 생성물 품질 문제 및 사양을 벗어나는 공정 편차를 초래한다. 용리는 단핵구를 제거할 수 있지만, 모세포는 T 림프구와 유사한 밀도와 크기를 가지므로, 모세포를 제거하는 데에는 효율적이지 않다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 용리 방법은 특정 등장액(예를 들어, PBS)으로 희석함으로써 출발 샘플, 예를 들어 세포 샘플, 예를 들어 해동된 세포 샘플의 최적화된 점도를 이용하고, 용리 장치에 의해 수집된 각 분획에 대한 유속 및 수집 부피의 최적화된 조합을 이용하는 것을 포함한다. 변형된 용리 프로그램의 예는 실시예 1에 기술되어 있다.
단핵구로부터 림프구, 예컨대, T 세포의 분리를 위한 예시적인 용리 설정 범위를 표 4에 제공하였다. 또한, 예시적인 용리 프로그램을 위한 유속, 원심분리, 및 부피에 대한 설정을 표 4에서 "실시예"로 표시된 열에 제공하였다.
Figure pct00001
일 구현예에서, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 또는 열 개 이상의 분획이 용리 단계로부터 수집된다. 일 구현예에서, 다섯 개의 분획이 용리 단계로부터 수집된다. 다섯 개의 분획이 수집되는 일 구현예에서, 세 번째 분획(F3) 또는 네 번째 분획(F4), 또는 세 번째 분획과 네 번째 분획의 조합은 최소량의 단핵구, 과립구 및 기타 비 림프구 세포를 갖는 원하는 림프구 집단을 함유한다. 일 구현예에서, 각 분획은 상이한 유속을 이용하여 수집된다. 일 구현예에서, 각 분획에 대해, 유속은 이전의 분획을 수집하는 데 사용된 유속으로부터 증가된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 분획은 상이한 수집 부피를 이용하여 수집된다.
일 구현예에서, 용리는 약 20 내지 90 mL/분, 약 30 내지 90 mL/분, 약 40 내지 90 mL/분, 약 50 내지 90 mL/분, 약 60 내지 90 mL/분, 약 70 내지 90 mL/분, 약 40 내지 85 mL/분, 약 50 내지 82 mL/분, 약 60 내지 82 mL/분, 약 70 내지 82 mL/분, 약 50 내지 80 mL/분, 약 60 내지 80 mL/분, 약 70 내지 80 mL/분의 유속을 이용하여 수행된다. 일 구현예에서, 용리는 약 30 내지 82 mL/분, 또는 약 50 내지 80 mL/분의 유속을 이용하여 수행된다. 일 구현예에서, 용리는 약 30, 40, 50, 60, 70, 72, 80, 또는 82 mL/분의 유속을 이용하여 수행된다. 일 구현예에서, 용리는 약 70 mL/분 또는 72 mL/분의 유속을 이용하여 수행된다.
일 구현예에서, 최소량의 단핵구, 과립구, 기타 비 림프구 세포, 및 다른 원치 않는 성분을 갖는 원하는 림프구 집단을 함유하는 하나 이상의 분획을 위한 유속은 약 20 내지 90 mL/분, 약 30 내지 90 mL/분, 약 40 내지 90 mL/분, 약 50 내지 90 mL/분, 약 60 내지 90 mL/분, 약 70 내지 90 mL/분, 약 40 내지 85 mL/분, 약 50 내지 82 mL/분, 약 60 내지 82 mL/분, 약 70 내지 82 mL/분, 약 50 내지 80 mL/분, 약 60 내지 80 mL/분, 약 70 내지 80 mL/분이다. 일 구현예에서, 원하는 림프구 집단을 함유하는 하나 이상의 분획을 위한 유속은 약 50 내지 82 mL/분, 약 50 내지 80 mL/분, 약 60 내지 82 mL/분, 약 60 내지 80 mL/분, 약 70 내지 82 mL/분, 약 70 내지 80 mL/분, 약 70 내지 75 mL/분, 약 70 내지 72 mL/분이다. 일 구현예에서, 원하는 림프구 집단을 함유하는 하나 이상의 분획을 위한 유속은 약 70 mL/분 또는 72 mL/분이다.
일 구현예에서, 용리는 약 250 내지 1250 mL, 약 250 내지 1000 mL, 약 300 내지 1000 mL, 약 400 내지 1000 mL, 약 500 내지 1000 mL, 약 600 내지 1000 mL, 약 700 내지 1000 mL, 약 800 내지 1000 mL, 약 900 내지 1000 mL, 약 250 내지 975 mL, 약 300 내지 975 mL, 약 400 내지 975 mL, 약 500 내지 975 mL, 약 600 내지 975 mL, 약 700 내지 975 mL, 약 800 내지 975 ml, 약 300 내지 900 mL, 약 300 내지 800 mL, 약 300 내지 700 mL, 약 300 내지 600 mL, 약 300 내지 500 mL, 또는 약 300 내지 400 mL의 수집 부피를 이용하여 수행된다. 일 구현예에서, 용리는 약 250, 400, 500, 900, 또는 975 mL의 수집 부피를 이용하여 수행된다. 일 구현예에서, 용리는 약 400 mL 또는 약 975 mL의 수집 부피를 이용하여 수행된다.
일 구현예에서, 최소량의 단핵구, 과립구, 기타 비 림프구 세포, 및 다른 원치 않는 성분을 갖는 원하는 림프구 집단을 함유하는 하나 이상의 분획을 위한 수집 부피는 약 250 내지 1250 mL, 약 250 내지 1000 mL, 약 300 내지 1000 mL, 약 400 내지 1000 mL, 약 500 내지 1000 mL, 약 600 내지 1000 mL, 약 700 내지 1000 mL, 약 800 내지 1000 mL, 약 900 내지 1000 mL, 약 250 내지 975 mL, 약 300 내지 975 mL, 약 400 내지 975 mL, 약 500 내지 975 mL, 약 600 내지 975 mL, 약 700 내지 975 mL, 약 800 내지 975 ml, 약 300 내지 900 mL, 약 300 내지 800 mL, 약 300 내지 700 mL, 약 300 내지 600 mL, 약 300 내지 500 mL, 또는 약 300 내지 400 mL이다. 일 구현예에서, 원하는 림프구 집단을 함유하는 하나 이상의 분획을 위한 수집 부피는 약 250, 400, 500, 900, 또는 975 mL이다. 일 구현예에서, 원하는 림프구 집단을 함유하는 하나 이상의 분획을 위한 수집 부피는 약 400 mL 또는 약 975 mL이다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 용리 방법은 용리 장치에 의해 수행된다. 예를 들어, 용리 장치는 Caridian BCT ElutraTM 세포 분리 시스템(Terumo BCT Model 71800)이다. Caridian BCT ElutraTM 세포 분리 시스템(Terumo BCT Model 71800)은 연속 역류 용리 기술을 사용하여 1차적으로 크기에 의해, 2차적으로는 비중에 의해 세포 분리를 수행하는 폐쇄 시스템이다. 분리 챔버로의 매질 흐름 및 원심력에 의해 생성된 침강 속도에 의해 생성된 반대되는 힘은 세포가 분리 챔버 내에서 크기 및 밀도에 의해 자체적으로 배열되게 하며, 분리 챔버 내에서 세포는 사이펀에 의해 수집 백 내로 자동으로 이동된다. 맞춤형 Elutra 설정은 상이한 분획에서 림프구 및 과립구와 조합된 단핵구의 분포를 허용하도록 설계된다. Elutra는 제조사의 지시에 따라 작동될 수 있다.
밀도 구배 원심분리
입양 세포 치료제의 제조는 말초 혈액 분리반출술 출발 물질에 존재하는 혈액 세포 및 혈액 요소의 복잡한 혼합물로부터 벗어나, 원하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포를 처리하는 것을 필요로 한다. 말초 혈액 유래 림프구 샘플은 Ficoll 용액을 통한 밀도 구배 원심분리를 사용하여 성공적으로 분리되었다. 그러나 Ficoll은 임상 용도에 적합하지 않기 때문에, Ficoll은 치료용 세포를 단리하기 위한 바람직한 시약이 아니다. 또한, Ficoll은 글리콜을 함유하는데, 이는 세포에 독성 가능성이 있다. 또한, 동결보존 후 해동된 분리반출술 생성물의 Ficoll 밀도 구배 원심분리는 예를 들어, 본 명세서의 실시예에서 기술된 바와 같이, 최적이 아닌 T 세포 생성물을 생성한다. 예를 들어, 비 T 세포, 특히 바람직하지 않은 B 세포, 모세포 및 단핵구의 상대적인 증가를 수반하는 최종 생성물에서 T 세포의 손실이 Ficoll 용액을 통한 밀도 구배 원심분리에 의해 단리된 세포 제제에서 관찰되었다.
이론에 구애되고자 함이 없이, 동결보존 중에 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 탈수되어 신선한 세포보다 밀도가 높아지는 것으로 여겨진다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 또한, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 다른 혈액 세포보다 더 오래 조밀하게 유지되므로, 다른 세포와 비교하여 Ficoll 밀도 구배 분리 중에 더욱 용이하게 소실되는 것으로 여겨진다. 따라서, 이론에 구애되고자 함이 없이, Ficoll보다 큰 밀도를 갖는 배지는 Ficoll 또는 Ficoll과 동일한 밀도, 예를 들어 1.077 g/ml를 갖는 다른 배지와 비교하여 원하는 면역 이펙터 세포의 개선된 단리를 제공하는 것으로 여겨진다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 요오딕사놀을 포함하는 밀도 구배 배지의 사용을 포함한다. 일 구현예에서, 밀도 구배 배지는 물 중 약 60%의 요오딕사놀을 포함한다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 Ficoll보다 더 큰 밀도를 갖는 밀도 구배 배지의 사용을 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 1.077 g/ml 초과, 예컨대, 1.077 g/ml 초과, 1.1 g/ml 초과, 1.15 g/ml 초과, 1.2 g/ml 초과, 1.25 g/ml 초과, 1.3 g/ml 초과, 1.31 g/ml 초과의 밀도를 갖는 밀도 구배 배지의 사용을 포함한다. 일 구현예에서, 밀도 구배 배지는 약 1.32 g/ml의 밀도를 갖는다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 요오딕사놀, 예컨대, 물 중 약 60%의 요오딕사놀을 포함하며, Ficoll보다 더 큰 밀도를 갖는, 예컨대, 1.077 g/ml 초과, 예컨대, 1.32 g/ml의 밀도를 갖는 밀도 구배 배지의 사용을 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 밀도 구배 배지 OptiPrep™(Sigma)의 사용을 포함한다. OptiPrep™은 사전 제조된, 멸균 및 내독소 시험된, 1.320 ± 0.001 g/ml의 밀도의, 60% (w/v) 요오딕사놀 용액이다. 대조적으로, Ficoll 밀도 구배 용액은 단지 1.077 g/ml의 밀도를 갖는다. Ficoll에 비해 OptiPrep™의 또 다른 장점은 OptiPrep™이 GMP 등급으로 이용 가능하므로, 치료용으로 적합하다는 점이다.
이론에 구애되고자 함이 없이, 예를 들어 해동된 분리반출술 물질을 이용한 OptiPrep 밀도 구배 원심분리 단계의 이용은, 바람직하지 않은 B 세포 및 단핵구를 보유할 가능성이 적은 것으로 여겨지고, 따라서 후속 활성화 및 형질도입 단계를 위하여, 원하는 표적 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수집을 더 개선하는 것으로 여겨진다. 따라서, 이론에 구애되고자 함이 없이, Ficoll과 비교하여 OptiPrep의 더 큰 밀도는 원하는 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 증진된 정제 및 회수, 그리고 CAR 발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 생성물 제조의 지속적으로 성공적인 결과를 방해할 수 있는 바람직하지 않은 비 T 세포 유형의 동반 제거를 가능하게 한다고 여겨진다.
일 구현예에서, 밀도 구배 원심분리는 세포 분리 장치를 이용하여 수행된다. 세포 분리 장치의 예는 Sepax2(Biosafe)를 포함한다. 예를 들어, 밀도 구배 원심분리 단계 전에 또는 후에, 세척 단계, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 개선된 세척 단계가 수행되는 구현예들에서, 세척 단계는 밀도 구배 원심분리 단계에서 사용되는 동일한 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
선택에 의한 강화
CAR 발현에 적합한 원하는 면역 이펙터 세포의 강화를 개선하기 위한 특정 세포의 선택 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일 구현예에서, 선택은 양성 선택, 예를 들어 원하는 면역 이펙터 세포에 대한 선택을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 선택은 음성 선택, 예를 들어 원치 않는 세포에 대한 선택, 예를 들어 원치 않는 세포의 제거를 포함한다. 구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 양성 또는 음성 선택 방법은 예를 들어, 유통식 장치, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 유통식 장치를 사용하여, 유동 조건 하에서 수행된다.
예를 들어, Dynabeads® CD3/CD28 CTS™를 사용하는, 현재의 선택 방법, 예컨대, 양성 선택은 강화를 위하여 더 최적화될 수 있다. 먼저, 선택하는 동안 사용되는 다이나비즈의 양은 전형적으로 CD45+/3+ 세포, 예를 들어, 밀도 구배 원심분리, 예를 들어 Sepax Ficoll 후의 샘플에 존재하는 CD45+/3+ 세포의 백분율을 기초로 하지 않고, 오히려 세포, 예를 들어, 본래의 환자 물질에 존재하는 CD45+/3+ 세포의 백분율을 기초로 한다. 밀도 구배 원심분리 단계, 예를 들어 Sepax Ficoll 분리 절차에 의해 초래된 조성의 현저한 변화를 고려할 때, 이러한 계산은 전형적으로 T 세포 백분율의 감소 및 단핵구 함량의 증가를 초래한다. 둘째, 2시간의 인큐베이션 시간은 비 표적 세포(즉, 비 CD3 및/또는 비 CD28 세포)에 대한 Dynabeads®의 비 특이적 결합 및 세포 내 이입을 통한 비 표적 세포(예를 들어, 단핵구)에 의한 비드 흡수의 충분한 기회를 제공하는데, 이는 양성 선택 생성물에서 T 세포 수율 및 순도를 손상시킬 수 있는 문제이다. 마지막으로, 선택에 사용되는 자성 장치 및 작동은 최적이 아닐 수 있다. 현재, 자성 분리는 큰 부피의 유체(200 ml) 내에서 일어나는데, 이는 결국 자기 표지된 세포와 자성 표면 사이의 큰 간격을 초래한다. 이는 분리에 이용 가능한 자기력을 제한하므로, 분리 감도를 감소시키고 더 긴 분리 시간을 필요로 한다. 또한, 자성 분리는 현재 통계적으로 수행되며, 샘플은 음성 분획을 제거하기 전에 5분 동안 자성 표면 위에 위치된다. 이러한 연장된 분리 시간은 세포에 해로우며, 이의 생존능은 "산적(pile-up)" 효과로 인해 절차 중에 종종 부정적으로 영향을 받고, 비 표적 세포가 비드에 결합하거나 내재화될 수 있는 추가 기회를 제공한다.
현재의 선택 방법과 대조적으로, 본 명세서에서 기술된 선택 방법은 현재의 "고정적" 분리 절차와 반대로, "동적으로", 예를 들어, 유동 조건 하에서, 일어나는 분리를 포함한다. 일 구현예에서, 유동 조건 하에서의 분리는 자성 분리 시약, 예를 들어 표적 항원, 투입 샘플, 및 자석과 선택적으로 결합하는 자성 비드를 포함하는데, 이때, 자성 분리 시약 및 투입 샘플은 자석 위로 통과한다(예를 들어, 흐른다). 특정 구현예들에서, 자성 분리 시약 및 투입 샘플은 연속적으로 자석 위로 통과한다(예를 들어, 흐른다). 이론에 구애됨 없이, 이 동적 기술은 인큐베이션 시간(즉, 시료를 분리 시약과 접촉시킴) 및 분리 시간을 단축시켜 표적 세포에 대한 부정적인 영향을 최소화하고, 비 표적 집단에 의한 비 특이적 결합 및/또는 비드 흡수 가능성을 현저히 감소시킨다. 또한, 본 명세서에서 기술된 선택 방법은 선택 시약(Dynabeads® CD3/CD28 CTS™) 또는 선택에 사용되는 시약의 양(3 대 1의 비드 대 T 세포 비율)에 대한 임의의 변형을 필요로 하지 않는다.
본 명세서에서 기술된 바와 같은 유동 조건 하에서의 분리 또는 선택은 유통식 항체 기반 선택 기술(FAST) 프로토콜을 포함한다. 표 12는 현재의 선택 기술과 FAST 프로토콜 사이에 차이가 있는 파라미터의 개요를 나타낸다.
Figure pct00002
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 선택 방법은 분리 시약 및 투입 샘플의 현재 표준 프로토콜보다 짧은 인큐베이션 기간에 이어, 자성 분리를 포함한다. 일 구현예에서, 인큐베이션 기간은 2시간 미만, 예를 들어, 110분 미만, 100분 미만, 90분 미만, 80분 미만, 70분 미만, 60분 미만, 50분 미만, 40분 미만, 30분 미만, 25분 미만, 20분 미만, 15분 미만, 10분 미만, 또는 5분 미만이다. 일 구현예에서, 인큐베이션은 가벼운 회전 하에 수행된다.
예시적인 선택 키트는 예를 들어, 전체가 참조로서 본 명세서에 포함되는 국제 공개 제2017/117112호에 기술되어 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 키트는 스파이크를 통해 또는 멸균 용접을 통해 추가 샘플/완충액 백에 연결될 수 있는 3개의 백의 조립체를 포함한다. 또한, 변형된 DynaMag 뚜껑이 분리에 사용되는데, 이는 분리하는 동안 최대 부피를 적은 부피로, 예컨대, 100 mL 미만, 90 mL 미만, 80 mL 미만, 70 mL 미만, 60 mL 미만, 50 mL 미만, 40 mL 미만으로, 예를 들어, 약 50 mL로 제한한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 분리하는 동안 사용되는 적은 부피는 분리 과정 중에 작용하는 자기력을 최적화하고 분리 시간을 최소화하는 것으로 여겨진다. 또한, 변형된 DynaMag 뚜껑은 비드:셀 접합체가 자석으로부터 이탈되는 최대 거리를 제한하고, 위치 선택 중에 경험하게 되는 자성을 표준화한다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 키트의 하나 이상의 백은 삼각형 백이다. 일 구현예에서, 선택 백은 삼각형 백이고, 백이 선택 백의 반대측 단부에 포트를 제공하므로, "유통식" 모드에서 자성 분리를 가능하게 한다. 이러한 구현예에서, 세포는 자성 요소(예컨대, DynaMag와 같은 자성 플레이트) 위로 연속하여 흐를 수 있어, 자성 표지된 입자를 실시간으로 분리할 수 있는 반면, 비 표지된 세포는 자기장에 의해 이끌리지 않을 것이며 외부로 흐를 것이다. 이러한 유통식 형태는 시스템을 특히 자동화에 적합하게 만든다. 변형된 분리 백은 추가 포트를 수용하기 위하여 변형된 뚜껑을 포함한다.
일 구현예에서, 선택 백은 삼각형 백이 아니다. 선택 백이 삼각형 백이 아닌 구현예에서, 인큐베이션 시간은 2시간 미만, 예를 들어, 110분 미만, 100분 미만, 90분 미만, 80분 미만, 70분 미만, 60분 미만, 50분 미만, 40분 미만, 30분 미만, 25분 미만, 20분 미만, 15분 미만, 10분 미만, 또는 5분 미만이다.
양성 선택
구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 양성 선택 방법은 원하는 면역 이펙터 세포를 선택하는 단계, 예컨대, 강화하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 양성 선택 방법은 CD3+/CD28+ 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 양성 선택 방법은 다음 중 하나 이상을 선택하는 단계를 포함한다: CD3+ 세포, CD28+ 세포, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 또는 CD45+ 세포.
본 명세서에서 기술된 선택 방법에 사용되는 분리 시약은 자성 또는 상자성 부재, 및 항원 결합 부재를 포함한다. 일 구현예에서, 분리 시약은 비드, 예를 들어, 항원 결합 부재에 (예를 들어, 공유적으로 또는 비 공유적으로) 커플링되는 자성 또는 상자성 특성을 갖는 비드를 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 부재는 항체 또는 이의 항체 단편이다. 일 구현예에서, CD3+/CD28+ 세포에 대한 양성 선택에 사용되는 분리 시약은 CD3 및/또는 CD28 결합 부재, 예를 들어, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 항체 단편에 (예컨대, 공유적으로 또는 비 공유적으로) 커플링되는 비드를 포함한다.
음성 선택
또한, 원치 않는 세포, 예를 들어, 단핵구, 과립구, 적혈구, 혈소판, 및 B 세포의 투입 샘플을 음성 선택하거나 고갈시켜, 원하는 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포를 갖는 생성된 산출 샘플을 강화하는 음성 선택 방법이 본 명세서에 제공된다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 음성 선택 방법은 예를 들어, 유통식 장치, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 유통식 장치를 사용하여, 유동 조건 하에서 수행된다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 음성 선택 방법은 단핵구, 과립구, 적혈구, 혈소판, B 세포, 또는 암 세포, 예를 들어, 림프모구 중 하나 이상을 음성 선택하는 단계를 포함한다.
단핵구, 과립구, 적혈구, 혈소판, 또는 B 세포 중 하나 이상의 고갈 또는 제거가 요망되는 구현예에서, 음성 선택 방법은 다음 중 하나 이상을 발현하는 세포를 선택하는 단계: CD19, CD25, CD14, 또는 단핵구, 과립구, 적혈구, 혈소판, 또는 B 세포에 의해 발현되는 기타 표면 마커 또는 단백질.
대상체가 혈액암을 앓는 구현예들에서, 암 세포는 분리반출술 샘플에 존재할 수 있고, 암 세포의 제거가 요망될 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 음성 선택 방법은 CD19+ 세포, 예를 들어, 림프모구를 음성 선택하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 음성 선택 방법은 다음 중 하나 이상을 발현하는 암 세포를 음성 선택하는 단계를 포함한다: CD19, CD33, CD123, CLL-1, BCMA, ROR1, 또는 FLT3.
본 명세서에서 기술된 선택 방법에 사용되는 분리 시약은 자성 또는 상자성 부재, 및 항원 결합 부재를 포함한다. 일 구현예에서, 분리 시약은 비드, 예를 들어, 항원 결합 부재에 (예를 들어, 공유적으로 또는 비 공유적으로) 커플링되는 자성 또는 상자성 특성을 갖는 비드를 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 부재는 항체 또는 이의 항체 단편이다. 일 구현예에서, CD19+ 세포에 대한 음성 선택에 사용되는 분리 시약은 CD19 결합 부재, 예를 들어 항-CD19 항체 또는 항체 단편에 (예컨대, 공유적으로 또는 비 공유적으로) 커플링되는 비드를 포함한다. 일 구현예에서, CD14+ 세포에 대한 음성 선택에 사용되는 분리 시약은 CD14 결합 부재, 예를 들어 항-CD14 항체 또는 항체 단편에 (예컨대, 공유적으로 또는 비 공유적으로) 커플링되는 비드를 포함한다. 일 구현예에서, CD25+ 세포에 대한 음성 선택에 사용되는 분리 시약은 CD25 결합 부재, 예를 들어 항-CD25 항체 또는 항체 단편에 (예컨대, 공유적으로 또는 비 공유적으로) 커플링되는 비드를 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 방법은 예컨대, 유통식 장치를 사용하여, 유동 조건 하에서 수행될 수 있다. 예시적인 유통식 장치는 본 명세서에서 명백하게 참조로 포함되는, 2016년 12월 27일에 출원된 국제 공개 제2017/117112호의 57~86페이지에 기술되어 있다.
개선된 세척 단계
분리반출술, 예를 들어, 백혈구 분리반출술 생성물의 세포 조성은 환자마다 상당히 다르다. 높은 백분율의 과립구(예를 들어, 호중구)를 갖는 백혈구 분리반출술 생성물은 방법 B를 이용하는 CAR T 세포의 제조 중에 상승된 세포 응집의 사례와 관련이 있었다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 이러한 비가역적인 응집은 이용 가능한 세포 수를 감소시키는 것으로 여겨지고, 강화 공정(예컨대 양성 선택)을 방해하여 세포 수율에 부정적으로 영향을 미치며, 이는 세포 수와 순도의 전반적인 감소를 초래한다. 또한, 이론에 구애되고자 함이 없이, 세포 순도 및 수율의 감소는 후속 공정 성능(예를 들어, 형질도입 효율 및 증식) 및 최종 생성물 세포 수 및 품질에 직접적으로 영향을 미친다. 이것의 순수한 결과는 처리 주기의 종료 시에 용량 사양을 충족할 수 있는 제품 제조 능력을 감소시킨다. 따라서, 이론에 구애되고자 함이 없이, 응집 방지는 세포 손실을 감소시키고 T 세포 순도를 개선하며, 이는 후속 처리 단계에 대한 출발 물질의 더 나은 품질 및 양을 생성할 수 있고 전체적으로 개선된 치료제를 생성할 수 있다고 여겨진다.
당해 분야의 현재의 제조 공정, 예를 들어, 방법 B에서는, 환자 세포 백혈구 분리반출술 물질이 Plasmatherm(Genesis)에서 해동되고, CellSaver 5+기기(Haemonetics)를 사용하여 세척된 다음, '변형 배지'라 불리는 X-VIVO15 배지(Lonza)를 기초로 한 세포 확장 배지 또는 림프구의 후속 Ficoll 선택을 위하여 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 완충 등장성 식염수에 재현탁된다. 변형 배지는 실시예 2에 제공된 프로토콜에 따라 제조된다. 그러나 실시예 2에 기술된 바와 같이, 해동된 세포를 변형 배지 또는 PBS 용액으로 옮기는 것은 세포의 응집을 초래할 수 있다.
따라서, 응집 방지를 위한 개선된 세포 세척 방법이 본 명세서에서 제공되며, 이는 후속 제조 단계, 예를 들어, 항-CD3/CD28 CTS 다이나비즈(Thermo Fisher)를 이용한 자극에 의한, 예를 들어, 양성 선택에 적합하다. 또한, 본 명세서에서 기술된 개선된 세척 단계는 예를 들어, 해동된 세포에서 수행되어, 세포 이하의 잔해, 유리 헤모글리빈 및 동결보존제를 제거하여, 부피 감소를 달성하고, 후속 밀도 구배 분리를 가능하게 한다. 일 구현예에서, 세척 단계는 변형 배지 또는 PBS 용액에 대한 대안적인 세포 재현탁 완충액으로 수행된다. 일 구현예에서, 세척 단계는 덱스트로스 및/또는 염화나트륨을 포함하는 완충액으로 수행된다. 일 구현예에서, 완충액은 약 5% 및 약 0.45%의 염화나트륨, 예컨대, D5 1/2 NS 배지를 포함한다. 일 구현예에서, 완충액은 예컨대, 적어도 30분, 45분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 또는 6시간 동안, 세포 현탁액을 안정화시키고 응집을 방지한다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 개선된 세척 단계는 장치, 예를 들어, 세포 분리 장치, 예를 들어, 밀도 구배 원심분리에 사용되는 동일한 장치를 이용하여 수행된다. 예를 들어, 개선된 세척 단계는 Sepax 2 RM 장치(Biosafe)를 이용하여 수행된다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 세척 단계는 신선한 분리반출술 샘플 또는 이전에 냉동된, 예를 들어, 해동된, 분리반출술 샘플에 사용될 수 있다. 구현예들에서, 본 명세서에서 개시된 세척 단계는 본 명세서에서 기술된 용리, 밀도 구배 원심분리, 또는 선택 방법 중 임의의 것 전에 또는 후에 이용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 세척 단계는 밀도 구배 원심분리 단계, 예를 들어, Optiprep 배지를 이용한 밀도 구배 원심분리 후에 수행된다.
개선된 제조 공정
CAR 발현에 적합한 면역 이펙터 세포의 품질 및 수율을 당해 분야에서 현재 사용되는 방법보다 큰 정도로 개선하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일 구현예에서, 앞선 섹션에서 기술된 용리, 밀도 구배 원심분리, 유동 조건 하에서의 양성 및 음성 선택, 및 개선된 세척 단계는, CAR 발현에 적합한 요망되는 면역 이펙터 세포를 단리하거나 강화하기 위하여, 서로 또는 당해 분야에서 현재 사용되거나 본 명세서에서 기술된 추가 방법과 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
일반적으로, CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포 집단을 생성 또는 강화하는 방법은 투입 샘플을 제공하는 단계, 강화 단계를 수행하는 단계, 선별 단계를 수행하고, 이에 의해 CAR의 발현에 적합한 면역 이펙터 세포를 포함하는 산출 샘플을 생성하는 단계를 포함한다. CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포 집단을 생성하는 방법은 CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포 집단을 생성 또는 강화하는 방법을 포함하고, 예를 들어, 세포가 증식 또는 지속되도록 자극되는 자극 단계를 더 포함하며, CAR 암호화 핵산의 도입을 더 포함한다. 자극 및/또는 CAR의 도입/발현에 관한 추가의 개시는 다음의 섹션에서 추가로 기술된다.
일 구현예에서, 투입 샘플은 신선한 샘플, 예를 들어, 대상체로부터 수득한 신선한 분리반출술, 백혈구 분리반출술, 또는 전혈 샘플이다. 또 다른 구현예에서, 투입 샘플은 냉동 샘플이다. 투입 샘플이 냉동 샘플, 예를 들어, 냉동 또는 동결보존된 분리반출술, 백혈구 분리반출술, 또는 전혈 샘플인 구현예들에서, 방법은 냉동 샘플을 해동시키는 단계 또는 해동 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 냉동된, 예를 들어, 동결보존된 샘플은 수동적 또는 능동적 수단에 의해 해동될 수 있다. 수동적 수단에 의한 해동은 샘플이 해동되게, 예를 들어 주변 환경의 온도에 도달하게, 예를 들어 실온에 도달하게 하거나 샘플이 전달되거나 혼합되는 완충액 또는 용액의 온도에 도달하게 하는 단계를 포함한다. 능동적 수단에 의한 해동은 샘플을 해동시키는, 예를 들어 수동적 수단에 의한 해동보다 빠르게 샘플을 주변 환경의 온도로 가져오는 장치를 이용하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 강화 단계는 용리 또는 밀도 구배 원심분리를 수행하는 단계를 포함한다. 용리는 당해 분야에 공지된 용리 조건, 또는 냉동된 샘플 또는 과거에 냉동된 샘플의 용리를 위한, 본 명세서에서 기술된 개선된 설정을 사용하여 수행될 수 있다. 밀도 구배 원심분리는 Ficoll 또는 요오딕사놀, 예를 들어 물 중 약 60%의 요오딕사놀을 포함하는 배지, 예를 들어 OptiPrep™을 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법에서, 선택 단계는 양성 선택 단계 및/또는 음성 선택 단계를 수행하는 단계를 포함한다. 양성 선택 단계는 예를 들어, 고정 또는 유동 조건 하에서, 분리제, 예를 들어, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체에 커플링된 비드를 사용하여 CD3+/CD28+ 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 음성 선택 단계는 예를 들어 분리제, 예를 들어, 항-CD19 항체에 커플링된 비드를 사용하여 CD19+ B 세포 또는 CD19+ 림프모세포를 음성 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법에서, 세척 단계는 샘플 수집 후, 샘플의 해동 후, 강화 단계 전, 강화 단계 후, 선택 단계 전, 또는 선택 단계 후, 또는 이의 임의의 조합으로 수행될 수 있다.
용리, 밀도 구배 원심분리, 예를 들어, 유동 조건 하에서의, 양성 또는 음성 선택, 또는 개선된 세척 단계 중 하나 이상을 포함하는, CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포의 집단을 생성하거나 강화하는 예시적인 방법은 본 명세서에서 추가로 기술된다.
일 구현예에서, CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포의 집단을 생성하거나 강화하는 방법은 면역 이펙터 세포를 포함하는 냉동 투입 샘플을 제공하는 단계; 냉동 투입 샘플을 해동시켜 해동된 샘플을 생성하는 단계; 강화 단계를 수행하는 단계(강화 단계는 투입 샘플에 대한 용리를 수행하는 단계(이때, 투입 샘플은 선택적으로 해동된 투입 샘플임)를 포함함); 및 선택 단계를 수행하는 단계(선택은 예컨대, CD3/CD28+ 세포에 대한 양성 선택, 또는 예컨대, CD19+, CD25+, 또는 CD14+ 세포에 대한 음성 선택임)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포의 집단을 생성하거나 강화하는 방법은 면역 이펙터 세포를 포함하는 신선한 또는 냉동 투입 샘플을 제공하는 단계; 및 (선택적으로, 투입 샘플은 냉동 투입 샘플임), 냉동 투입 샘플을 해동시켜 해동된 샘플을 생성하는 단계; 강화 단계를 수행하는 단계(강화 단계는 요오딕사놀을 포함하는 배지, 예컨대, 물 중 60% 요오딕사놀, 예컨대, Optiprep 배지, 및/또는 Ficoll보다 큰 밀도를 갖는(예컨대, 1.077 g/ml 초과, 예컨대, 약 1.32 g/ml의) 배지를 이용하여 밀도 원심분리 단계를 수행하는 단계를 포함함); 및 선택 단계를 수행하는 단계(선택은 예컨대, CD3/CD28+ 세포에 대한 양성 선택, 또는 예컨대, CD19+, CD25+, 또는 CD14+ 세포에 대한 음성 선택임)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포의 집단을 생성하거나 강화하는 방법은 면역 이펙터 세포를 포함하는 신선한 또는 냉동 투입 샘플을 제공하는 단계; 강화 단계를 수행하는 단계(강화 단계는, 용리 또는 (예컨대, Ficoll 또는 Optiprep 배지를 이용한) 밀도 원심분리를 수행하는 단계를 포함함); 및 유동 조건 하에서, 예컨대, CD3/CD28+ 세포에 대한 양성 선택 단계를 수행하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포의 집단을 생성하거나 강화하는 방법은 면역 이펙터 세포를 포함하는 신선한 또는 냉동 투입 샘플을 제공하는 단계; 강화 단계를 수행하는 단계(강화 단계는, 용리 또는 (예컨대, Ficoll 또는 Optiprep 배지를 이용한) 밀도 원심분리를 수행하는 단계를 포함함); 및 유동 조건 하에서, 예컨대, CD19+, CD25+, 또는 CD14+ 세포에 대한 음성 선택 단계를 수행하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법에서, 세척 단계는 샘플 수집 후, 샘플의 해동 후, 강화 단계 전, 강화 단계 후, 선택 단계 전, 또는 선택 단계 후, 또는 이의 임의의 조합으로 수행될 수 있다.
원하는 면역 이펙터 세포의 강화를 최적화하고, 제조 성공 및 제품 품질을 보장하기 위하여, 투입 샘플의 특성의 범위 또는 역치를 확인하거나 또는 본 명세서에서 기술된 방법에서 하나 이상의 단계 후, 다음 단계를 지시하거나 결정하는 제어 한계가 정의될 수 있다. 구현예들에서, 제어 한계는 투입 샘플이 수득되는 대상체의 암의 유형에 따라 상이할 수 있다. 예로서, ALL 또는 DLBCL을 앓는 대상체로부터 수득된 투입 샘플에서 단핵구의 존재에 대한 제어 한계는 다음과 같다: 단핵구가 투입 샘플, 예를 들어 백혈구 분리반출술 전혈 세포의 20%를 초과하는 경우, 최적의 방법은 유동 조건 하에서 용리 및/또는 CD3/CD28 양성 선택을 포함하거나; 또는 단핵구가 투입 샘플의 20% 미만인 경우, 투입 샘플은 세척되고, 최적의 방법은 모세포 함량에 기초하여 결정된다. 또 다른 예에서, ALL 또는 DLBCL을 앓는 대상체로부터 수득된 투입 샘플 중 모세포의 존재에 대한 제어 한계는 다음과 같다: 모세포가 유입되는 백혈구 분리반출술 WBC의 20% 이상인 경우, (단핵구, 과립구 및 세포 잔해를 제거하기 위한) 용리 및/또는 (모세포를 제거하기 위한) 변형된 CD19 음성 선택, 또는 모세포를 고갈시키기 위한 기타 기술이 수행되어야 하거나; 또는 모세포가 유입되는 백혈구 분리반출술의 20% 미만인 경우, 백혈구 분리반출술 물질은 세척될 것이고, 공정은 단핵구 함량에 기초하여 결정될 것이다.
CAR 발현에 적합한 면역 이펙터 세포의 강화 후, 일 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 당해 분야에 공지되었거나 본 명세서에서 기술된, 예를 들어 "면역 이펙터 세포의 활성화 및 확장"이라는 표제의 섹션에서 기술된 바와 같은 임의의 방법을 이용하여, 예를 들어, 증식하도록, 자극된다.
CAR 발현에 적합한 면역 이펙터 세포의 강화 후, 및 선택적으로, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 자극 및/또는 확장 후, CAR, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR을 암호화하는 핵산은 면역 이펙터 세포로 도입될 수 있다. 핵산, 예컨대, CAR을 암호화하는 핵산을 도입하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, "CAR을 암호화하는 핵산 구축물", "RNA 형질감염", 및 "비 바이러스 전달 방법"이라는 표제의 섹션에 기술된 바와 같이, 본 명세서에서 기술되어 있다.
면역 이펙터 세포의 공급원
이 섹션은 원하는 면역 이펙터 세포를 포함하는 투입 샘플을 수득하고, 원하는 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포를 단리 및 처리하고, 원치 않는 물질, 예를 들어, 원치 않는 세포를 제거하는 추가의 방법 또는 단계를 제공한다. 이 섹션에 기술된 추가의 방법 또는 단계는 이전의 섹션에서 기술된 용리, 밀도 구배 원심분리, 유동 조건 하에서의 선택, 또는 개선된 세척 단계 중 임의의 것과 조합하여 사용될 수 있다.
세포, 예를 들어 T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포의 공급원을 대상체로부터 수득할 수 있다. 대상체의 예는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 이의 유전자이식 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다.
본 개시의 특정 양태에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 숙련자에게 공지된 임의의 수의 기술 및 본 명세서에서 개시된 임의의 방법을 이의 단계들을 임의로 조합하여 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 유닛으로부터 수득될 수 있다. 일 양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출술에 의해 얻어진다. 분리반출술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포를 포함한 림프구, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 일 양태에서, 분리반출술에 의해 수집된 세포를 세척하여, 혈장 분획을 제거하고, 선택적으로 후속 처리 단계를 위해 세포를 적절한 완충제 또는 배지에 넣을 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 대안적 구현예에서, 세척액에는 칼슘이 없고, 마그네슘이 없을 수 있거나, 전부는 아니지만 많은 2가 양이온이 없을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포는 본 명세서에서 기술된 개선된 세척 단계를 이용하여 세척된다.
칼슘의 부재 하의 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 초래할 수 있다. 당업자가 용이하게 인식하는 바와 같이, 세척 단계는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 반자동화 "유통식" 원심분리기(예를 들어 코브(Cobe) 2991 세포 처리기, 백스터 사이토메이트(Baxter CytoMate), 또는 헤모네틱스 셀 세이버 5(Haemonetics Cell Saver 5))를 제조사의 설명에 따라 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 세척 후에, 세포를 다양한 생체적합성 완충제, 예컨대 Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, 플라스마라이트 A(PlasmaLyte A), 또는 완충제를 포함하거나 포함하지 않는 다른 식염수 중에 재현탁시킬 수 있다. 대안적으로, 분리반출술 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지 내에 직접 재현탁시킬 수 있다.
일 양태에서, 원하는 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심분리 용리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
본 명세서에서 기술된 방법은 예를 들어 본 명세서에서 기술된, 예를 들어 음성 선택 기술을 사용한, 예를 들어 T 조절 세포-고갈 집단, CD25+ 고갈 세포인 면역 이펙터 세포의 특정 하위집단, 예를 들어 T 세포의 선택을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, T 조절 고갈 세포의 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포를 함유한다.
일 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포는 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25 결합 리간드, 예를 들어, IL-2를 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일 구현예에서, 항-CD25 항체, 또는 이의 단편, 또는 CD25 결합 리간드는 기질, 예를 들어, 비드에 접합되거나, 다르게는 기질, 예를 들어, 비드에 코팅된다. 일 구현예에서, 항-CD25 항체 또는 이의 단편은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 기질에 접합된다.
일 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어, CD25+ T 세포는 MiltenyiTM의 CD25 고갈 시약을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일 구현예에서, 세포 대 CD25 고갈 시약의 비는 1e7개 세포 대 20 uL, 또는 1e7개 세포 대 15 uL, 또는 1e7개 세포 대 10 uL, 또는 1e7개 세포 대 5 uL, 또는 1e7개 세포 대 2.5 uL, 또는 1e7개 세포 대 1.25 uL이다. 일 구현예에서, 예를 들어 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 고갈을 위하여, 5억 개 초과의 세포/ml가 사용된다. 추가의 양태에서, 6억, 7억, 8억 또는 9억 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다.
일 구현예에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 6 x 109개의 CD25+ T 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 1 x 109 내지 1x 1010개의 CD25+ T 세포, 및 그 사이의 임의의 정수값을 포함한다. 일 구현예에서, 생성된 T 조절 고갈 세포 집단은 2 x 109개 이하의 T 조절 세포, 예를 들어, CD25+ 세포(예를 들어, 1 x 109, 5 x 108 , 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107개 이하의 CD25+ 세포)를 갖는다.
일 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포는 고갈 튜빙 세트, 예컨대, 예를 들어 튜빙 162-01이 구비된 CliniMAC 시스템을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일 구현예에서, CliniMAC 시스템은 고갈 세팅, 예컨대, 예를 들어 DEPLETION2.1에서 진행된다.
특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 분리반출술 전에 또는 CAR 발현 세포 생성물의 제조 중에 대상체에서 면역 세포의 음성 조절자의 수준을 감소시키면(예를 들어, 원치 않는 면역세포, 예를 들어 TREG 세포의 수를 감소시키면) 대상체의 재발 위험이 현저히 감소된다. 예를 들어, TREG 세포를 고갈시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. TREG 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체(본 명세서에서 기술된 항-GITR 항체), CD25-고갈, mTOR 억제제 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 CAR 발현 세포의 제조 전에 TREG 세포의 수를 감소시키는(예를 들어, TREG 세포를 고갈시키는) 단계를 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은, 예를 들어 CAR 발현 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포) 생성물을 제조하기 전에 TREG 세포를 고갈시키기 위하여, 샘플, 예를 들어, 분리반출술 샘플을 항-GITR 항체 및/또는 항-CD25 항체(또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 분리반출술 전에 또는 CAR 발현 세포 생성물의 제조 중에 대상체에서 면역 세포의 음성 조절자의 수준을 감소시키면(예를 들어, 원치 않는 면역세포, 예를 들어 TREG 세포의 수를 감소시키면) 대상체의 재발 위험을 줄일 수 있다. 일 구현예에서, CAR 발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 TREG 세포를 감소시키는 하나 이상의 요법으로 대상체를 사전 처치함으로써, CAR 발현 세포 처치에 대한 대상체 재발 위험이 감소된다. 일 구현예에서, TREG 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, TREG 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, mTOR억제제, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 시클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 투여는 CAR 발현 세포 생성물의 주입 전에, 주입 중에, 또는 주입 후에 발생할 수 있다. 시클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, mTOR 억제제, 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 투여는 CAR 발현 세포 생성물의 주입 전에, 주입 중에, 또는 주입 후에 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 CAR 발현 세포의 제조 전에 TREG 세포의 수를 감소시키는(예를 들어, TREG 세포를 고갈시키는) 단계를 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은, 예를 들어 CAR 발현 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포) 생성물을 제조하기 전에 TREG 세포를 고갈시키기 위하여, 샘플, 예를 들어, 분리반출술 샘플을 항-GITR 항체 및/또는 항-CD25 항체(또는 이의 단편, 또는 CD25 결합 리간드)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, CAR 발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 시클로포스파미드로 대상체를 사전 처치함으로써, CAR 발현 세포 처치(예를 들어, CTL019 처치)에 대한 대상체 재발 위험이 줄어든다. 일 구현예에서, CAR 발현 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 항-GITR 항체로 대상체를 사전 처치함으로써, CAR 발현 세포 처치에 대한 대상체 재발 위험이 줄어든다.
일 구현예에서, CAR 발현 세포(예컨대, T 세포, NK 세포) 제조 방법은 CAR 발현 세포(예컨대, T 세포, NK 세포) 생성물(예컨대, CTL019 생성물)의 제조 전에 TREG 세포를 고갈시키도록 변형된다. 일 구현예에서, CD25-고갈은 CAR 발현 세포(예컨대, T 세포, NK 세포) 생성물(예컨대, CTL019 생성물)의 제조 전에 TREG 세포를 고갈시키는 데 사용된다.
일 구현예에서, 제거될 세포의 집단은 조절 T 세포 또는 종양 세포 중 어느 것도 아니며, CART 세포의 확장 및/또는 기능에 부정적으로 영향을 미치는 세포, 예를 들어 CD14, CD11b, CD33, CD15, 또는 잠재적 면역 억제 세포에 의해 발현되는 다른 마커를 발현하는 세포이다. 일 구현예에서, 이러한 세포는 조절 T 세포 및/또는 종양 세포와 동시에, 또는 상기 고갈 이후에, 또는 또 다른 순서로 제거되는 것이 고려된다.
본 명세서에서 기술된 방법은 1개 초과의 선택 단계, 예를 들어 1개 초과의 고갈 단계를 포함할 수 있다. 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 강화는, 예를 들어 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 유도된 항체의 조합을 이용하여 달성될 수 있다. 하나의 방법으로는 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 유도된 단클론 항체의 칵테일을 사용하는 유세포 분석법 또는 음성 자기 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선택이 있다. 예를 들어 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 강화하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 방법은 종양 항원, 예를 들어 CD25를 포함하지 않는 종양 항원, 예를 들어 CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 또는 CD11b를 발현하는 세포를 집단으로부터 제거하여, 그에 의해 CAR, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 CAR의 발현에 적합한 T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 및 종양 항원 고갈 세포의 집단을 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 및 항-종양 항원 항체 또는 이의 단편은 동일한 기질, 예를 들어 비드에 부착될 수 있고, 이는 세포를 제거하는 데 사용될 수 있거나, 또는 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 항-종양 항원 항체 또는 이의 단편이 개별 비드에 부착될 수 있고, 이의 혼합물은 세포를 제거하는 데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 종양 항원 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
또한, 체크 포인트 억제자, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 체크 포인트 억제자를 발현하는 세포, 예를 들어 PD1+ 세포, LAG3+ 세포, 및 TIM3+ 세포 중 하나 이상을 집단으로부터 제거하여, 그에 의해 T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 세포 및 체크 포인트 억제자 고갈 세포, 예를 들어 PD1+, LAG3+ 및/또는 TIM3+ 고갈 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 예시적인 체크 포인트 억제제는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예컨대, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF(예컨대, TGF 베타)를 포함한다. 일 구현예에서, 체크 포인트 억제자 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 및 항-체크 포인트 억제자 항체 또는 이의 단편은 동일한 비드에 부착될 수 있고, 이는 세포를 제거하는 데 사용될 수 있거나, 또는 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 및 항-체크 포인트 억제자 항체 또는 이의 단편은 개별 비드에 부착될 수 있으며, 이의 혼합물은 세포를 제거하는 데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 체크 포인트 억제자 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
본 명세서에서 기술된 방법은 양성 선택 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 T 세포는 항-CD3/항-CD28(예를 들어 3x28)-접합된 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께, 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 인큐베이션함으로써 단리될 수 있다. 일 구현예에서, 기간은 약 30분이다. 추가 구현예에서, 기간은 30분 내지 36시간 이상 및 그 사이의 모든 정수값의 범위이다. 추가 구현예에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 10 내지 24시간, 예를 들어, 24시간이다. 다른 세포 유형에 비하여 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서, 예컨대 종양 조직으로부터 또는 면역손상 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하는 데 있어서, T 세포를 단리하기 위하여 보다 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 또한, 보다 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 단순히 시간을 단축하거나 연장함으로써 T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 하고/거나, 비드 대 T 세포의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써(본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같음), T 세포의 하위집단을 우선적으로 배양 개시 시에 또는 그 과정 동안의 다른 시점에 그에 대하여 또는 그에 반하여 선택할 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단을 우선적으로 배양 개시 시에 또는 다른 원하는 시점에 그에 대하여 또는 그에 반하여 선택할 수 있다.
일 구현예에서, IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B 및 퍼포린, 또는 다른 적절한 분자, 예를 들어 다른 사이토카인 중 하나 이상을 발현하는 T 세포 집단이 선택될 수 있다. 세포 발현에 대한 스크리닝 방법은, 예를 들어 국제 공개 제2013/126712호에 기술된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 세포의 원하는 집단의 단리를 위해, 세포의 농도 및 표면(예를 들어 입자, 예컨대 비드)은 달라질 수 있다. 특정 양태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는(예를 들어 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 일 양태에서, 100억 개 세포/ml, 90억 개/ml, 80억 개/ml, 70억 개/ml, 60억 개/ml 또는 50억 개/ml의 농도가 사용된다. 일 양태에서, 10억 개 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가의 일 양태에서 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다.
높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 발생시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(예를 들어, 백혈병성 혈액, 종양 조직 등)로부터, 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 높은 농도의 세포를 사용하는 것은, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
관련 양태에서, 보다 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면(예를 들어 입자, 예컨대 비드)의 혼합물을 유의하게 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이에 상호 작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합되는 다량의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어 CD4+ T 세포는 희석 농도에서 보다 높은 수준의 CD28을 발현하고 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일 양태에서, 사용되는 세포의 농도는 5 x 106/ml이다. 다른 양태에서, 사용되는 농도는 약 1 x 105/ml 내지 1 x 106/ml, 및 그 사이의 임의의 정수값일 수 있다.
다른 양태에서, 세포를 2 내지 10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 길이의 시간 동안 회전기 상에서 인큐베이션시킬 수 있다.
일 구현예에서, 집단의 복수의 면역 이펙터 세포는 디아글리세롤 키나제(DGK)를 발현하지 않는다. 예를 들어, DGK 결함성이다. 일 구현예에서, 집단의 복수의 면역 이펙터 세포는 이카로스(Ikaros)를 발현하지 않는다. 예를 들어, 이카로스 결핍성이다. 일 구현예에서, 집단의 복수의 면역 이펙터 세포는 DGK 및 이카로스를 발현하지 않는다. 예를 들어, DGK 및 이카로스 결함성이다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 이후에 냉동시킬 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 냉동 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도까지의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포를 냉동 용액 중에 현탁시킬 수 있다. 많은 냉동 용액 및 파라미터가 당해 분야에 공지되어 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20%의 DMSO 및 8%의 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10%의 덱스트란 40 및 5%의 덱스트로스, 20%의 인간 혈청 알부민 및 7.5%의 DMSO, 또는 31.25%의 플라스마라이트(Plasmalyte)-A, 31.25%의 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10%의 덱스트란 40 및 5%의 덱스트로스, 20%의 인간 혈청 알부민, 및 7.5%의 DMSO, 또는 예를 들어 헤스판(Hespan) 및 플라스마라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 냉동 매질을 함유하는 배양 배지를 사용하는 것을 수반하고, 이어서, 세포를 1분당 1℃의 속도로 -80℃까지 냉동시키고, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에서 보관한다. 다른 제어된 냉동 방법뿐만 아니라 -20℃에서의 또는 액체 질소에서의 비제어된 즉각적인 냉동이 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 동결보존된 세포를 본 명세서에서 기술된 바와 같이 해동 및 세척하고, 1시간 동안 실온에서 휴지되도록 한 후, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화시킨다.
또한, 본 발명과 관련하여 본 명세서에서 기술된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있을 때 이전의 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출술 생성물을 수집하는 것이 고려된다. 이와 같이, 확장시킬 세포의 공급원을 필요한 임의의 시점에 수집할 수 있고, 원하는 세포, 예컨대 T 세포를 단리하고, 면역 이펙터 세포 요법으로부터 이익을 얻을 임의의 수의 질환 또는 병태, 예컨대 본 명세서에서 기술된 것에 대한 면역 이펙터 세포 요법에서 나중에 사용하기 위해 냉동시킬 수 있다. 일 양태에서, 혈액 샘플 또는 분리반출술을 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취한다. 특정 양태에서, 혈액 샘플 또는 분리반출술을 질환이 발생할 위험이 있지만 아직 질환이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취하고, 관심 세포를 단리하고, 나중의 사용을 위해 냉동시킨다. 특정 양태에서, T 세포를 확장시키고, 냉동시키고, 나중에 사용할 수 있다. 특정 양태에서, 샘플은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후에, 그러나 임의의 치료 이전에 환자로부터 수집된다. 추가 양태에서, 세포는 작용제, 예컨대 나탈리주맙(natalizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체, 시톡산, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 방사선조사를 이용한 치료를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 임의의 수의 관련 치료 양식 이전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 분리반출술로부터 단리된다.
본 발명의 추가 양태에서, T 세포는 기능성 T 세포를 사용한 대상체의 치료 직후에 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 치료 후, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복 중인 기간 동안의 치료 직후에, 수득된 T 세포의 품질은 생체 외에서 확장되는 이의 능력을 위하여 최적이거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본 명세서에서 기술된 방법을 사용한 생체 외 조작 후에, 이들 세포는 증진된 생착 및 생체 내 확장을 위한 바람직한 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 이러한 회복기 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 추가로, 특정 양태에서, 특히 요법 후의 규정된 시간 윈도우 동안 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 확장이 유리한 조건을 대상체에서 생성하기 위해 동원(예를 들어 GM-CSF를 사용한 동원) 및 컨디셔닝 요법이 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
일 구현예에서, CAR 분자, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 CAR 분자를 발현하는 면역 이펙터 세포는 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제를 제공 받은 대상체로부터 수득된다. 일 구현예에서, CAR을 발현하도록 조작될 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 집단은 대상체 내의 또는 대상체로부터 수확된 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가되도록 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 충분한 투약 후에 또는 충분한 시간 후에 수확된다.
다른 구현예에서, CAR을 발현하도록 조작되었거나 또는 조작될 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 집단은 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수를 증가시키거나 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비를 증가시키는 양의 mTOR 억제제와의 접촉에 의해 생체 외에서 처리될 수 있다.
본 출원의 방법은 5% 이하, 예를 들어 2%의 인간 AB 혈청을 포함하는 배양 배지 조건을 활용할 수 있고, 공지의 배양 배지 조건 및 조성, 예를 들어 문헌[Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31]에 기술된 것들을 이용할 수 있는 것으로 인식된다.
일 구현예에서, 본 출원의 방법은 무혈청 배지를 포함하는 배양 배지 조건을 활용할 수 있다. 일 구현예에서, 무혈청 배지는 OpTmizer CTS(LifeTech), Immunocult XF(Stemcell technologies), CellGro(CellGenix), TexMacs(Miltenyi), Stemline(Sigma), Xvivo15(Lonza), PrimeXV(Irvine Scientific), 또는 StemXVivo(RandD systems)이다. 무혈청 배지는 LifeTech의 ICSR(면역 세포 혈청 대체물)과 같은 혈청 대체물로 보충될 수 있다. 혈청 대체물(예를 들어, ICSR)의 수준은 예를 들어, 최대 5%, 예를 들어, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%일 수 있다.
일 구현예에서, T 세포 집단은 디아글리세롤 키나제(DGK)-결함성이다. DGK-결함 세포는 DGK RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 또는 감소되거나 억제된 DGK 활성을 갖는 세포를 포함한다. DGK-결함 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA 간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 DGK 발현을 감소시키거나 방지함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, DGK-결함 세포는 본 명세서에서 기술된 DGK 억제제를 이용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
일 구현예에서, T 세포 집단은 이카로스-결함성이다. 이카로스-결함 세포는 이카로스 RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 또는 감소되거나 억제된 이카로스 활성을 갖는 세포를 포함하고, 이카로스-결함 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA 간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 이카로스 발현을 감소시키거나 방지함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, 이카로스-결함 세포는 이카로스 억제제, 예를 들어 레날리도미드(lenalidomide)를 이용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
구현예들에서, T 세포 집단은 DGK-결함성 및 이카로스-결함성이고, 예를 들어 DGK 및 이카로스를 발현하지 않거나, 또는 감소되거나 억제된 DGK 및 이카로스 활성을 갖는다. 이러한 DGK 및 이카로스-결함 세포는 본 명세서에서 기술된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
일 구현예에서, NK 세포는 대상체로부터 수득된다. 또 다른 구현예에서, NK 세포는 NK 세포주, 예를 들어 NK-92 세포주(Conkwest)이다.
동종이계 CAR 발현 세포
본 명세서에서 기술된 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 동종이계 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 예를 들어 세포는 동종이계 T 세포, 예를 들어 기능성 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 인간 백혈구 항원(HLA), 예를 들어 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II의 발현이 결여된 동종이계 T 세포일 수 있다.
기능성 TCR이 결여된 T 세포는 예를 들어 이의 표면 상에 임의의 기능성 TCR을 발현하지 않도록 조작되거나, 기능성 TCR을 포함하는 하나 이상의 서브유닛을 발현하지 않도록 조작되거나(예를 들어, TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 엡실론, 및/또는 TCR 제타를 발현하지 않도록(또는 이의 감소된 발현을 나타내도록) 조작되거나), 또는 이의 표면 상에 매우 적은 기능성 TCR을 생성하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 예를 들어 TCR의 서브유닛 중 하나 이상의 돌연변이된 또는 절두된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 TCR을 발현할 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR"은 이러한 TCR이 숙주에서 유해 면역 반응을 일으키지 않을 것임을 의미한다.
본 명세서에서 기술된 T 세포는 예를 들어 이의 표면 상에 기능성 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어 본 명세서에서 기술된 T 세포는 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어 HLA 클래스 1 및/또는 HLA 클래스 II가 하향조절되도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, HLA의 하향조절은 베타-2 마이크로글로불린(B2M)의 발현을 감소시키거나 제거함으로써 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포는 기능성 TCR 및 기능성 HLA, 예를 들어 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II가 결여될 수 있다.
기능성 TCR 및/또는 HLA의 발현이 결여된 변형된 T 세포는 TCR 또는 HLA의 하나 이상의 서브유닛의 녹아웃 또는 녹다운을 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어 T 세포는 siRNA, shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복체(CRISPR) 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)를 사용한 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 동종이계 세포는, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 임의의 방법에 의해 억제성 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 예를 들어 CAR 발현 세포가 면역 이펙터 반응을 일으키는 능력을 감소시킬 수 있는 억제성 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF(예를 들어, TGF 베타)를 포함한다. 예를 들어 DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제에 의한 억제성 분자의 억제는 CAR 발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 구현예들에서, 억제성 핵산, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 바와 같은 억제성 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복체(CRISPR), 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)가 사용될 수 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 siRNA 및 shRNA
일부 구현예에서, TCR 발현 및/또는 HLA 발현은, 세포, 예를 들어 T 세포에서 본 명세서에서 기술된 억제성 분자(예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF 베타), 및/또는 TCR 및/또는 HLA를 암호화하는 핵산을 표적으로 하는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 억제될 수 있다.
siRNA 및 shRNA를 위한 발현 시스템, 및 예시적인 shRNA가, 예를 들어 전체가 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일자 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 649 및 650에 기술되어 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 CRISPR
본 명세서에서 사용되는 "CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 CRISPR"은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복체의 세트, 또는 이러한 반복체의 세트를 포함하는 시스템을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "Cas"는 CRISPR-연관 단백질을 나타낸다. "CRISPR/Cas" 시스템은 세포, 예를 들어, T 세포에서 본 명세서에서 기술된 억제성 분자(예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF 베타), 및/또는 TCR 및/또는 HLA 유전자를 침묵시키거나 돌연변이시키는 데 사용될 수 있는 CRISPR 및 Cas로부터 유래된 시스템을 지칭한다.
CRISPR/Cas 시스템 및 이의 용도는, 예를 들어 전체가 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 651~658에 기술되어 있다.
TCR 및/또는 HLA를 억제하는 TALEN
"TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 TALEN"은 세포, 예를 들어, T 세포에서 본 명세서에서 기술된 억제성 분자(예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF 베타), 및/또는 HLA 및/또는 TCR 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제, 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN, 및 그 용도는, 예를 들어 전체가 참조로 포함되는 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 659~665에 기술되어 있다.
HLA 및/또는 TCR을 억제하는 징크 핑거 뉴클레아제
"ZFN" 또는 "징크 핑거 뉴클레아제" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 ZFN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 ZFN"은 세포, 예를 들어, T 세포에서 본 명세서에서 기술된 억제성 분자(예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF 베타), 및/또는 HLA 및/또는 TCR 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제를 지칭한다.
ZFN, 및 그 용도는, 예를 들어 전체가 참조로 포함되는 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 666~671에 기술되어 있다.
텔로머라아제 발현
텔로미어는 체세포 지속성에 있어서 중요한 역할을 하며, 이들의 길이는 텔로머라아제(TERT)에 의해 유지된다. CLL 세포에서 텔로미어 길이는 매우 짧을 수 있고(문헌[Roth et al., "Significantly shorter telomeres in T-cells of patients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia" British Journal of Haematology, 143, 383-386., August 28 2008]), 제조된 CAR 발현 세포, 예를 들어, CART19 세포에서는 훨씬 더 짧을 수 있어, 환자로의 입양 이식 후 이러한 세포가 확장될 가능성을 제한한다. 텔로머라아제 발현은 복제 소진으로부터 CAR 발현 세포를 구할 수 있다.
어떠한 특정한 이론에 구애되고자 함이 없이, 일부 구현예에서, 치료적 T 세포는 T 세포 내에서의 단축된 텔로미어로 인해 환자에서 단기 지속성을 갖고; 이에 따라, 텔로머라아제 유전자를 이용한 형질감염은 T 세포의 텔로미어를 연장시키고 환자에서의 T 세포의 지속성을 개선할 수 있다. 문헌[Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)] 참조. 따라서, 일 구현예에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 텔로머라아제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라아제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 이소적으로 발현한다. 일부 양태에서, 본 개시는 세포를 텔로머라아제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라아제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 암호화하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는, CAR 발현 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 세포를, CAR을 암호화하는 구축물과의 접촉 이전에, 그와 동시에, 또는 이후에 핵산과 접촉시킬 수 있다.
텔로머라아제 발현은 안정적일 수 있거나(예를 들어, 핵산이 세포의 게놈 내로 통합될 수 있음) 일시적일 수 있다(예를 들어, 핵산이 통합되지 않고, 발현이 일정 기간 후에, 예를 들어, 며칠 후에 감소한다). 안정적인 발현은 텔로머라아제 서브유닛 및 선택 가능한 마커를 암호화하는 DNA로 세포를 형질감염 또는 형질도입시키고, 안정적인 구성성분을 선택함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 안정적인 발현은 예를 들어, Cre/Lox 또는 FLP/FRT 시스템을 이용한, 위치 특이적 재조합에 의해 달성될 수 있다.
일시적인 발현은 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대, mRNA로의 형질감염 또는 형질도입을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 일시적인 mRNA 형질감염은 때때로 TERT로의 안정적인 형질감염과 관련된 유전적 불안정성을 피한다. 외인성 텔로머라아제 활성의 일시적인 발현은 예를 들어, 전체가 참조로서 본 명세서에 포함되는 국제 공개 제2014/130909호에 기술되어 있다. 구현예들에서, 텔로머라아제 서브유닛의 mRNA 기반 형질감염은 Moderna Therapeutics가 상용화한 메신저 RNA Therapeutics™ 플랫폼에 따라 수행된다. 예를 들어, 방법은 미국 특허 제8710200호, 제8822663호, 제8680069호, 제8754062호, 제8664194호, 또는 제8680069호에 기술된 방법일 수 있다.
일 구현예에서, hTERT는 GenBank 단백질 ID AAC51724.1의 아미노산 서열을 갖는다(문헌[Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795]):
Figure pct00003
일 구현예에서, hTERT는 서열번호 108의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는다. 일 구현예에서, hTERT는 서열번호 108의 서열을 갖는다. 일 구현예에서, hTERT는 N 말단, C 말단, 또는 둘 다에서 (예를 들어 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 아미노산의) 결실을 포함한다. 일 구현예에서, hTERT는 N 말단, C 말단, 또는 둘 다에서 (예를 들어 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 아미노산의) 이식유전자 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, hTERT는 GenBank 기탁 번호 AF018167의 핵산 서열에 의해 암호화된다(문헌[Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795]):
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
일 구현예에서, hTERT는 서열번호 23의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 핵산에 의해 암호화된다. 일 구현예에서, hTERT는 서열번호 23의 핵산에 의해 암호화된다.
키메라 항원 수용체(CAR)
본 발명은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 암으로 유도하는 하나 이상의 CAR을 함유하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 제공한다. 이것은 암 관련 항원에 특이적인 CAR 상의 항원 결합 도메인을 통하여 달성된다. 본 명세서에서 기술된 CAR이 표적화할 수 있는 두 클래스의 암 관련 항원(종양 항원)이 있다: (1) 암 세포의 표면 상에 발현되는 암 관련 항원; 및 (2) 암 관련 항원으로서, 그 자신은 세포 내에 있지만 이러한 항원의 단편(펩티드)이 MHC(주요 조직적합성 복합체)에 의해 암 세포의 표면 상에 제시되는, 암 관련 항원.
따라서, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 수득된, 면역 이펙터 세포는 다음의 암 관련 항원(종양 항원) 중 하나를 표적으로 하는 CAR을 함유하도록 조작될 수 있다: CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII , GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, PRSS21, SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타아제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE-A1, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라아제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카르복실 에스테라아제, 및 mut hsp70-2.
이중특이적 CAR
일 구현예에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질(또는 다량체성 단백질의 서브유닛) 상에 있다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩된다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되지 않는다. 하나의 구현예에서 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예컨대 상이한 단백질(또는 다량체성 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 존재한다. 일 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 이의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 이의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 이의 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적(예를 들어 이중특이적 또는 삼중특이적) 항체 분자이다. 이중특이적 항체 분자 또는 이종이량체 항체 분자를 생성하는 프로토콜, 및 이중특이적 항체 분자에 대한 다양한 형태는, 예를 들어, 전체가 참조로서 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 455~458에 기술되어 있다.
일 양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열, 예를 들어, CD19에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 scFv를 포함하거나 본 명세서에서 기술된 scFv로부터의 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 CDR을 포함하는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열, 및 상이한 항원 상의 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
키메라 TCR
일 양태에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편(예를 들어, CD19 항체 및 단편)은 T 세포 수용체("TCR") 쇄, 예를 들어 TCR 알파 또는 TCR 베타 쇄의 1개 이상의 불변 도메인에 그라프트되어 키메라 TCR을 생성할 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 키메라 TCR은 항원 결합 시 TCR 복합체를 통해 신호를 전달할 것으로 여겨진다. 예를 들어 본 명세서에서 개시된 바와 같은 scFv는 TCR 쇄, 예를 들어 TCR 알파 쇄 및/또는 TCR 베타 쇄의 불변 도메인, 예를 들어 세포외 불변 도메인의 적어도 일부, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인에 그라프트될 수 있다. 또 다른 예로서, 항체 단편, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 바와 같은 VL 도메인은 TCR 알파 쇄의 불변 도메인에 그라프트될 수 있고, 항체 단편, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 바와 같은 VH 도메인은 TCR 베타 쇄의 불변 도메인에 그라프트될 수 있다(또는 대안적으로, VL 도메인은 TCR 베타 쇄의 불변 도메인에 그라프트될 수 있고, VH 도메인은 TCR 알파 쇄에 그라프트될 수 있다). 또 다른 예로서, 항체 또는 항체 단편의 CDR이 TCR 알파 및/또는 베타에 그라프트되어 키메라 TCR을 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시된 LCDR은 TCR 알파 쇄의 가변 도메인에 그라프트될 수 있고, 본 명세서에서 개시된 HCDR은 TCR 베타 쇄의 가변 도메인에 그라프트될 수 있거나, 또는 그 반대이다. 이러한 키메라 TCR은 예를 들어, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어 문헌[Willemsen RA et al., Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377]; 문헌[Zhang T et al., Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496]; 문헌[Aggen et al., Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74]).
비 항체 스캐폴드
구현예들에서, 항원 결합 도메인은 비 항체 스캐폴드, 예컨대, 피브로넥틴, 안키린, 도메인 항체, 리포칼린, 소형 모듈 면역약제, 맥시바디, 단백질 A, 또는 아필린을 포함한다. 비 항체 스캐폴드는 세포의 표적 항원에 결합하는 능력이 있다. 구현예들에서, 항원 결합 도메인은 세포에서 발현된 천연 단백질의 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 비 항체 스캐폴드를 포함한다. 표적 세포의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 영역이 생성된 폴리펩티드에 포함되는 한, 매우 다양한 비 항체 스캐폴드가 이용될 수 있다.
비 항체 스캐폴드는 다음을 포함한다: 피브로넥틴(Novartis, MA), 안키린(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland), 도메인 항체(Domantis, Ltd., Cambridge, MA, 및 Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgium), 리포칼린(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany), 소형 모듈 면역약제(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), 맥시바디(Avidia, Inc., Mountain View, CA), 단백질 A(Affibody AG, Sweden) 및 아필린(감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴)(SciI Proteins GmbH, Halle, Germany).
일 구현예에서 항원 결합 도메인은 표적 세포의 표면 상의 카운터리간드(counterligand)와 결합하는 분자의 세포외 도메인 또는 이의 카운터리간드 결합 단편을 포함한다.
면역 이펙터 세포는 CAR을 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 포함할 수 있고, 이때, CAR은 종양 항원, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편, TCR 또는 TCR 단편) 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 공동 자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 제타 쇄를 포함할 수 있다. 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 본 명세서에서 기술된 방법은 세포, 예를 들어, T 조절 고갈 세포의 집단으로부터의 세포를 CAR, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 CAR을 암호화하는 핵산으로 형질도입하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 양태들에서, CAR은 scFv 도메인을 포함하며, 여기서, scFv는 서열번호 1로 제공되는 것과 같은 선택적인 리더 서열이 선행하고, 서열번호 2 또는 서열번호 36 또는 서열번호 38로 제공되는 것과 같은 선택적 힌지 서열, 서열번호 6으로 제공되는 것과 같은 막횡단 영역, 서열번호 7 또는 서열번호 16을 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및 서열번호 9 또는 서열번호 10을 포함하는 CD3 제타 서열이 뒤따르며, 예를 들어, 이 도메인들은 단일 융합 단백질을 형성하도록 인접하여 동일 리딩 프레임 내에 있다.
일 양태에서, 예시적인 CAR 구축물은 선택적인 리더 서열(예를 들어 본 명세서에서 기술된 리더 서열), 세포외 항원 결합 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 항원 결합 도메인), 힌지(예를 들어 본 명세서에서 기술된 힌지 영역), 막횡단 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 막횡단 도메인) 및 세포내 자극 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 세포내 자극 도메인)을 포함한다. 일 양태에서, 예시적인 CAR 구축물은 선택적인 리더 서열(예를 들어 본 명세서에서 기술된 리더 서열), 세포외 항원 결합 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 항원 결합 도메인), 힌지(예를 들어 본 명세서에서 기술된 힌지 영역), 막횡단 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 막횡단 도메인), 세포내 공동 자극 신호전달 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 공동 자극 신호전달 도메인) 및/또는 세포내 일차 신호전달 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 일차 신호전달 도메인)을 포함한다.
예시적인 리더 서열은 서열번호 1로서 제공된다. 예시적인 힌지/스페이서 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 36 또는 서열번호 38로서 제공된다. 예시적인 막횡단 도메인 서열은 서열번호 6으로서 제공된다. 4-1BB 단백질의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열번호 7로서 제공된다. CD27의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열번호 16으로 제공된다. 예시적인 CD3 제타 도메인 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10으로서 제공된다.
일 양태에서, 면역 이펙터 세포는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함하며, 여기서, 핵산 분자는 항원 결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 이 서열은 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 인접하고 이와 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. CAR에 사용될 수 있는 예시적인 세포내 신호전달 도메인은, 예를 들어 CD3-제타, CD28, CD27, 4-1BB 등의 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, CAR은 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
원하는 분자를 암호화하는 핵산 서열은 당해 분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대, 예를 들어 이 핵산 분자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이 핵산 분자를, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산은 클로닝되기 보다는 합성에 의해 생성될 수 있다.
CAR을 암호화하는 핵산은 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 구축물을 이용하여 면역 이펙터 세포 내로 도입될 수 있다.
CAR을 암호화하는 핵산은 예를 들어, 세포 내로 직접 형질감염될 수 있는 RNA 구축물을 이용하여 면역 이펙터 세포 내로 도입될 수 있다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은, 3' 및 5' 비 번역 서열("UTR")(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 3' 및/또는 5' UTR), 5' 캡(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 5' 캡) 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 IRES), 발현시킬 핵산 및 폴리A 테일을 함유하는, 전형적으로 50 내지 2000개 염기 길이의 구축물(예를 들어, 실시예에서 기술된 구축물, 예를 들어, 서열번호 35)을 생성하기 위하여, 특수하게 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관 내 전사(IVT)에 이은 폴리A 부가를 수반한다. 이렇게 생성된 RNA는 상이한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 일 구현예에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다. 일 구현예에서, RNA CAR 벡터는 전기천공법에 의해 세포, 예를 들어 T 세포 내로 형질도입된다.
항원 결합 도메인
일 양태에서, 복수의 면역 이펙터 세포, 예컨대, T 조절 고갈 세포의 집단은 다르게는 항원 결합 도메인으로 지칭되는 표적 특이적 결합 요소를 포함하는 CAR 암호화 핵산을 포함한다. 결합 요소의 선택은 표적 세포의 표면을 규정하는 리간드의 유형 및 수에 따라 달라진다. 예를 들어 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 CAR에서 항원 결합 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암 세포와 관련된 것을 포함한다.
일 양태에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR의 부분은 종양 항원, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 종양 항원을 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
항원 결합 도메인은, 단클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 및 단일 도메인 항체, 예컨대, 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL) 및 낙타과 유래 나노바디의 가변 도메인(VHH)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 이의 기능성 단편, 및 항원 결합 도메인으로서의 기능을 하는 것으로 당해 분야에 공지된 대안적인 스캐폴드, 예컨대 재조합 피브로넥틴 도메인, T 세포 수용체(TCR), 또는 이의 단편, 예를 들어 단쇄 TCR 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다. 일부 예에서, 항원 결합 도메인은, CAR이 궁극적으로 사용될 종과 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유익하다. 예를 들어 인간에 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인이 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인을 위한 인간 또는 인간화 잔기를 포함하는 것이 유익할 수 있다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항-CD19 항체, 또는 이의 단편, 예컨대, scFv를 포함한다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 표 1에 열거된 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다. 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 연결하는 링커 서열은 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 링커 서열 중 임의의 것일 수 있거나, 대안적으로 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호 104)일 수 있다.
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일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 1에 열거된 임의의 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함한다. 구현예들에서, 항원 결합 도메인은 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 추가로 포함한다. 구현예들에서, 항원 결합 도메인은 표 1에 열거된 임의의 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 1에 열거된 임의의 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 전부, 및 표 1에 열거된 임의의 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 전부를 포함한다.
임의의 CD19 CAR, 예를 들어 임의의 공지된 CD19 CAR의 CD19 항원 결합 도메인은 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, LG-740; 미국 특허 제8,399,645호; 미국 특허 제7,446,190호; 문헌[Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013); 및 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10]에 기술된 CD19 CAR.
CAR 발현 세포를 사용하여 표적화될 수 있는 예시적인 표적 항원은 특히, 예를 들어 각각의 전문이 본 명세서에서 참조로 포함되는 국제 공개 제2014/130635호, 국제 공개 제2014/130657호, 및 국제 공개 제2015/090230호에 기술된 바와 같은 CD19, CD123, EGFRvIII, 메소텔린을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, CD19에 특이적으로 결합하는 CAR T 세포는 USAN 명칭 TISAGENLECLEUCEL-T를 갖는다. CTL019는 EF-1 알파 프로모터의 제어 하에 CTL019 이식유전자를 함유하는 자가 불활성화, 복제 결함 렌티바이러스(LV) 벡터로의 형질도입을 통한 안정적인 삽입에 의해 매개되는 T 세포의 유전자 변형에 의해 제조된다. CTL019는 이식유전자 양성 T 세포%에 기초하여 대상체에게 전달된 이식유전자 양성 및 음성 T 세포의 혼합물일 수 있다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 인간 CD19에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2014/153270호의 표 3에 따른 CAR 분자, 또는 항원 결합 도메인(예를 들어 인간화 항원 결합 도메인)을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 CD123에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2014/130635호의 표 1 내지 표 2에 따른 CAR 분자(예를 들어 CAR1 내지 CAR8 중 임의의 것) 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 CD123 CAR, 예를 들어 모두 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2014/0322212A1호 또는 미국 공개 제2016/0068601A1호에 기술된 CD123 CAR을 포함한다. 구현예들에서, CD123 CAR은 모두 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2014/0322212A1호 또는 미국 공개 제2016/0068601A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 EGFRvIII에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2014/130657호의 표 2 또는 서열번호 11에 따른 CAR 분자 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 EGFRvIII CAR 분자, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2014/0322275A1호에 기술된 EGFRvIII CAR을 포함한다. 구현예들에서, EGFRvIII CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2014/0322275A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 메소텔린에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2015/090230호의 표 2 내지 표 3에 따른 CAR 분자 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 메소텔린 CAR, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2015/090230호에 기술된 메소텔린 CAR을 포함한다. 구현예들에서, 메소텔린 CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2015/090230호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 BCMA CAR 분자, 예를 들어 미국 공개 제2016/0046724A1호에 기술된 BCMA CAR을 포함한다. 구현예들에서, BCMA CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2016/0046724A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 CLL1 CAR, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2016/0051651A1호에 기술된 CLL1 CAR을 포함한다. 구현예들에서, CLL1 CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2016/0051651A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 CD33 CAR, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2016/0096892A1호에 기술된 CD33 CAR을 포함한다. 구현예들에서, CD33 CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2016/0096892A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법 또는 조성물에 따르면, 구현예들에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 CD123 CAR, 예를 들어 모두가 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2014/0322212A1호 또는 미국 공개 제2016/0068601A1호에 기술된 CD123 CAR을 포함한다. 구현예들에서, CD123 CAR은 모두 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2014/0322212A1호 또는 미국 공개 제2016/0068601A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 다른 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 CD19 CAR 분자, 예를 들어 미국 공개 제2015/0283178A1호에 기술된 CD19 CAR 분자, 예를 들어 CTL019를 포함한다. 구현예들에서, CD19 CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2015/0283178A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 BCMA CAR 분자, 예를 들어 미국 공개 제2016/0046724A1호에 기술된 BCMA CAR을 포함한다. 구현예들에서, BCMA CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2016/0046724A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 CLL1 CAR, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2016/0051651A1호에 기술된 CLL1 CAR을 포함한다. 구현예들에서, CLL1 CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2016/0051651A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 CD33 CAR, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2016/0096892A1호에 기술된 CD33 CAR을 포함한다. 구현예들에서, CD33 CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2016/0096892A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 EGFRvIII CAR 분자, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2014/0322275A1호에 기술된 EGFRvIII CAR을 포함한다. 구현예들에서, EGFRvIII CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 공개 제2014/0322275A1호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일 구현예에서, CAR 분자는 본 명세서에서 기술된 메소텔린 CAR, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2015/090230호에 기술된 메소텔린 CAR을 포함한다. 구현예들에서, 메소텔린 CAR은 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2015/090230호에 나타낸 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
예시적인 CD19 CAR은 본 명세서에서 기술된 CD19 CAR, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 표의 CD19 CAR 또는 각각의 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Xu et al. Blood 123.24(2014):3750-9]; 문헌[Kochenderfer et al. Blood 122.25(2013):4129-39], 문헌[Cruz et al. Blood 122.17(2013):2965-73], NCT00586391, NCT01087294, NCT02456350, NCT00840853, NCT02659943, NCT02650999, NCT02640209, NCT01747486, NCT02546739, NCT02656147, NCT02772198, NCT00709033, NCT02081937, NCT00924326, NCT02735083, NCT02794246, NCT02746952, NCT01593696, NCT02134262, NCT01853631, NCT02443831, NCT02277522, NCT02348216, NCT02614066, NCT02030834, NCT02624258, NCT02625480, NCT02030847, NCT02644655, NCT02349698, NCT02813837, NCT02050347, NCT01683279, NCT02529813, NCT02537977, NCT02799550, NCT02672501, NCT02819583, NCT02028455, NCT01840566, NCT01318317, NCT01864889, NCT02706405, NCT01475058, NCT01430390, NCT02146924, NCT02051257, NCT02431988, NCT01815749, NCT02153580, NCT01865617, NCT02208362, NCT02685670, NCT02535364, NCT02631044, NCT02728882, NCT02735291, NCT01860937, NCT02822326, NCT02737085, NCT02465983, NCT02132624, NCT02782351, NCT01493453, NCT02652910, NCT02247609, NCT01029366, NCT01626495, NCT02721407, NCT01044069, NCT00422383, NCT01680991, NCT02794961, 또는 NCT02456207에 기술된 항-CD19 CAR을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본 명세서에서 기술된 항체(예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2015/142675호, 미국 공개 제2015/0283178A1호, 미국 공개 제2016/0046724A1호, 미국 공개 제2014/0322212A1호, 미국 공개 제2016/0068601A1호, 미국 공개 제2016/0051651A1호, 미국 공개 제2016/0096892A1호, 미국 공개 제2014/0322275A1호 또는 국제 공개 제2015/090230호에 기술된 항체)로부터의 1, 2, 3개(예를 들어 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3, 및/또는 본 명세서에서 기술된 항체(예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2015/142675호, 미국 공개 제2015/0283178A1호, 미국 공개 제2016/0046724A1호, 미국 공개 제2014/0322212A1호, 미국 공개 제2016/0068601A1호, 미국 공개 제2016/0051651A1호, 미국 공개 제2016/0096892A1호, 미국 공개 제2014/0322275A1호 또는 국제 공개 제2015/090230호에 기술된 항체)로부터의 1, 2, 3개(예를 들어 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 위에서 열거된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구현예들에서, 항원 결합 도메인은 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2015/142675호, 미국 공개 제2015/0283178A1호, 미국 공개 제2016/0046724A1호, 미국 공개 제2014/0322212A1호, 미국 공개 제2016/0068601A1호, 미국 공개 제2016/0051651A1호, 미국 공개 제2016/0096892A1호, 미국 공개 제2014/0322275A1호 또는 국제 공개 제2015/090230호에 기술된 항원 결합 도메인이다.
구현예들에서, 항원 결합 도메인은 BCMA를 표적화하며, 미국 공개 제2016/0046724A1호에 기술되어 있다.
구현예들에서, 항원 결합 도메인은 CD19를 표적화하며, 미국 공개 제2015/0283178A1호에 기술되어 있다.
구현예들에서, 항원 결합 도메인은 CD123을 표적화하며, 미국 공개 제2014/0322212A1호, 미국 공개 제2016/0068601A1호에 기술되어 있다.
구현예들에서, 항원 결합 도메인은 CLL1을 표적화하며, 미국 공개 제2016/0051651A1호에 기술되어 있다.
구현예들에서, 항원 결합 도메인은 CD33을 표적화하며, 미국 공개 제2016/0096892A1호에 기술되어 있다.
CAR 발현 세포를 사용하여 표적화될 수 있는 예시적인 표적 항원은 특히, 예를 들어 각각의 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2014/153270호, 국제 공개 제2014/130635호, 국제 공개 제2016/028896호, 국제 공개 제2014/130657호, 국제 공개 제2016/014576호, 국제 공개 제2015/090230호, 국제 공개 제2016/014565호, 국제 공개 제2016/014535호 및 국제 공개 제2016/025880호에 기술된 바와 같은 CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, 메소텔린, BCMA 및 GFR ALPHA-4를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 인간화 CD19에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2014/153270호의 표 3에 따른 CAR 분자, 또는 항원 결합 도메인(예를 들어 인간화 항원 결합 도메인)을 포함할 수 있다. CD19 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 국제 공개 제2014/153270호에 명시되어 있다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 CD123에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2014/130635호의 표 1 내지 표 2에 따른 CAR 분자(예를 들어 CAR1 내지 CAR8 중 임의의 것) 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. CD123 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 국제 공개 제2014/130635호에 명시되어 있다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 CD123에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2016/028896호의 표 2, 표 6 및 표 9에 따른 CAR 분자(예를 들어 CAR123-1 내지 CAR123-4 및 hzCAR123-1 내지 hzCAR123-32 중 임의의 것) 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. CD123 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 국제 공개 제2016/028896호에 명시되어 있다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 EGFRvIII에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2014/130657호의 표 2 또는 서열번호 11에 따른 CAR 분자 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. EGFRvIII CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예컨대 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 국제 공개 제2014/130657호에 명시되어 있다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 CD33에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2016/014576호의 표 2 또는 표 9에 따른 CAR 분자(예를 들어 CAR33-1 내지 CAR-33-9 중 임의의 것) 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. CD33 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 국제 공개 제2016/014576호에 명시되어 있다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 메소텔린에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2015/090230호의 표 2 내지 표 3에 따른 CAR 분자 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 메소텔린 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예컨대 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 국제 공개 제2015/090230호에 명시되어 있다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2016/014565호의 표 1 또는 표 16, 서열번호 271 또는 서열번호 273에 따른 CAR 분자 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. BCMA CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 국제 공개 제2016/014565호에 명시되어 있다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 CLL-1에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2016/014535호의 표 2에 따른 CAR 분자 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. CLL-1 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 국제 공개 제2016/014535호에 명시되어 있다.
다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 GFR ALPHA-4에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 제2016/025880호의 표 2에 따른 CAR 분자 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. GFR ALPHA-4 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 국제 공개 제2016/025880호에 명시되어 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 분자 중 임의의 것(예를 들어 CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, 메소텔린, BCMA 및 GFR ALPHA-4 중 임의의 것)의 항원 결합 도메인은 위에 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3, 및/또는 위에 열거된 항원 결합 도메인으로부터의 1, 2, 3개(예를 들어 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 위에 열거되거나 기술된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 위에 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3, 및/또는 위에 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 위에 열거되거나 기술된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/142675호에 기술된 종양 항원이다. 일부 구현예들에서, 종양 항원은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1(CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24로도 지칭됨); C-형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII); 강글리오시드 G2(GD2); 강글리오시드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 과 구성원 B 세포 성숙(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1(ROR1); Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3); 종양-연관 당단백질 72(TAG72); CD38; CD44v6; 암배아성 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(테스티신(Testisin) 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신(Mucin) 1, 세포 표면 연관(MUC1); 상피 성장 인자 수용체(EGFR); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 프로스타제(Prostase); 전립선 산 포스파타제(PAP); 돌연변이된 신장 인자 2(ELF2M); 에프린(Ephrin) B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-I 수용체); 탄산 탈수효소 IX(CAIX); 프로테아좀(프로좀(Prosome), 마크로파인(Macropain)) 서브유닛, 베타 유형, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 절단점 클러스터 영역(BCR) 및 아벨슨(Abelson) 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 1(Abl)로 이루어진 종양유전자 융합 단백질(bcr-abl); 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량-흑색종-연관 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 폴레이트 수용체 베타; 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련(TEM7R); 클라우딘(claudin) 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질-커플링된 수용체 클래스 C 군 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1(PLAC1); 글로보H(globoH) 글리코세라미드의 육당류 부분(글로보H); 유선 분화 항원(NY-BR-1); 우로플라킨(uroplakin) 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3(ADRB3); 패넥신(pannexin) 3(PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 대안적 리딩 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종-연관 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전위-변이체 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 과, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인(prostein); 서바이빙(surviving); 텔로머라아제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCTA-1 또는 갈렉틴(Galectin) 8); T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MelanA 또는 MART1); 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라아제 역 전사효소(hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종 아폽토시스 억제제(ML-IAP); ERG(막횡단 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라아제 V(NA17); 쌍형성된 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수구종증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래 상동체(MYCN); Ras 상동체 과 구성원 C(RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC-결합 인자(징크 핑거 단백질)-유사(BORIS 또는 각인된 부위의 조절원(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)); T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원(SART3); 쌍형성된 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); A 키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종, X 절단점 2(SSX2); 진행성 당화 최종산물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 편재 1(RU1); 신장 편재 2(RU2); 레구마인(legumain); 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 장 카복실 에스테라아제; 돌연변이된 열 쇼크 단백질 70-2(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연관 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 하위과 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자-유사 과 구성원 f(CD300LF); C-유형 렉틴 도메인 과 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸(Glypican)-3(GPC3); Fc 수용체-유사 5(FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1(IGLL1).
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 위에 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3, 및/또는 위에 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 위에 열거되거나 기술된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 양태에서, 항종양 항원 결합 도메인은 단편, 예를 들어 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다. 일 양태에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항암 관련 항원 결합 도메인은 Fv, Fab, (Fab')2, 또는 이중기능성(예를 들어 이중특이적) 하이브리드 항체이다(예를 들어, 문헌[Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]). 일 양태에서, 본 발명의 항체 및 이의 단편은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 암 관련 항원과 야생형 또는 증진된 친화도로 결합한다.
일부 예에서, scFv는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426] 및 문헌[Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). scFv 분자는 가요성 폴리펩티드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생성될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커(예를 들어, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 폴딩하고 상호 작용하는 방식에 크게 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 짧은 폴리펩티드 링커가 사용되는 경우(예를 들어, 5 내지 10개 아미노산), 쇄 내 폴딩이 방지된다. 쇄간 폴딩은 또한 2개의 가변 영역을 함께 모아 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 필요하다. 링커 배향 및 크기의 예에 대해서는, 예를 들어 문헌[Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448], 미국 특허 출원 공개 제2005/0100543호, 제2005/0175606호, 제2007/0014794호 및 국제 공개 제2006/020258호 및 국제 공개 제2007/024715호를 참조하며, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다.
scFv는 이의 VL 영역과 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복체의 세트, 예컨대 (Gly4Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다(서열번호 25). 일 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)4(서열번호 27) 또는 (Gly4Ser)3(서열번호 28)일 수 있다. 링커 길이의 변이는 활성을 유지시키거나 증진시켜, 활성 연구에서 뛰어난 효능을 유도할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체("TCR"), 또는 이의 단편, 예를 들어 단쇄 TCR(scTCR)이다. 이러한 TCR을 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000)]; 문헌[Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004)]; 문헌[Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)](참고문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨) 참조. 예를 들어, 링커(예를 들어, 가요성 펩티드)에 의해 연결된 T 세포 클론으로부터의 Vα 및 Vβ 유전자를 함유하는 scTCR이 조작될 수 있다. 이러한 접근법은 그 자체는 세포내에 있으나 이러한 항원의 단편(펩티드)이 MHC에 의해 암 세포의 표면 상에 제시되는 암 관련 표적에 매우 유용하다.
추가의 예시적 항원 결합 도메인
일 구현예에서, CD22에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Haso et al., Blood, 121(7): 1165-1174 (2013)]; 문헌[Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903 (2010)]; 문헌[Kato et al., Leuk Res 37(1):83-88 (2013)]; 문헌[Creative BioMart (creativebiomart.net): MOM-18047-S(P)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CS-1에 대한 항원 결합 도메인은 엘로투주맙(BMS)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다. 예를 들어 문헌[Tai et al., 2008, Blood 112(4):1329-37]; 문헌[Tai et al., 2007, Blood. 110(5):1656-63] 참조.
일 구현예에서, GD2에 대한 항원 결합 도메인은 예컨대, 문헌[Mujoo et al., Cancer Res. 47(4):1098-1104 (1987)]; 문헌[Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1985)], 문헌[Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987)], 문헌[Cheung et al., J Clin Oncol 16(9):3053-3060 (1998)], 문헌[Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204 (1992)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예컨대, CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, GD2에 대한 항원 결합 도메인은 mAb 14.18, 14G2a, ch14.18, hu14.18, 3F8, hu3F8, 3G6, 8B6, 60C3, 10B8, ME36.1, 및 8H9로부터 선택된 항체의 항원 결합 부분이다. 예컨대, 국제 공개 제2012/033885호, 국제 공개 제2013/040371호, 국제 공개 제2013/192294호, 국제 공개 제2013/061273호, 국제 공개 제2013/123061호, 국제 공개 제2013/074916호, 및 국제 공개 제2013/85552호 참조. 일부 구현예에서, GD2에 대한 항원 결합 도메인은 미국 특허 공개 제2010/0150910호 또는 국제 공개 제 2011/160119호에 기술된 항체의 항원 결합 부분이다.
일 구현예에서, Tn 항원에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 미국 특허 제8,440,798호, 문헌[Brooks et al., PNAS 107(22):10056-10061 (2010)], 및 문헌[Stone et al., OncoImmunology 1(6):863-873(2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, PSMA에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 문헌[Parker et al., Protein Expr Purif 89(2):136-145 (2013)], 미국 특허 공개 제2011/0268656호(J591 ScFv); 문헌[Frigerio et al, European J Cancer 49(9):2223-2232 (2013)](scFvD2B); 국제 공개 제2006/125481호(mAb 3/A12, 3/E7 및 3/F11)에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR 및 단일 쇄 항체 단편(scFv A5 및 D7)을 포함한다.
일 구현예에서, ROR1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Hudecek et al., Clin Cancer Res 19(12):3153-3164 (2013)]; 국제 공개 제2011/159847호; 및 미국 특허 공개 제2013/0101607호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR을 포함한다.
일 구현예에서, FLT3에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 국제 공개 제2011/076922호, 미국 특허 제5777084호, 유럽 특허 제0754230호, 미국 특허 공개 제2009/0297529호에 기술된 항체, 및 여러 상업적 카탈로그의 항체(R&D, ebiosciences, Abcam)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, TAG72에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Hombach et al., Gastroenterology 113(4):1163-1170 (1997)]에 기술된 항체; 및 Abcam ab691의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, FAP에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 문헌[Ostermann et al., Clinical Cancer Research 14:4584-4592 (2008)](FAP5), 미국 특허 공개 제2009/0304718호에 기술된 항체; 시브로투주맙(예를 들어, 문헌[Hofheinz et al., Oncology Research and Treatment 26(1), 2003)]; 및 문헌[Tran et al., J Exp Med 210(6):1125-1135 (2013)] 참조)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD38에 대한 항원 결합 도메인은 다라투무맙(예를 들어, 문헌[Groen et al., Blood 116(21):1261-1262 (2010)] 참조); MOR202(예를 들어, 미국 특허 제8,263,746호 참조); 또는 미국 특허 제8,362,211호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD44v6에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Casucci et al., Blood 122(20):3461-3472 (2013)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CEA에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Chmielewski et al., Gastoenterology 143(4):1095-1107 (2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, EPCAM에 대한 항원 결합 도메인은 MT110, EpCAM-CD3 이중특이적 Ab(예를 들어, clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596 참조); 에드레콜로맙; 3622W94; ING-1; 및 아데카투무맙(MT201)으로부터 선택되는 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, PRSS21에 대한 항원 결합 도메인은 미국 특허 제8,080,650호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, B7H3에 대한 항원 결합 도메인은 MGA271(Macrogenics)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, KIT에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 미국 특허 제7915391호, 미국 특허 공개 제2012/0288506호에 기술된 항체, 및 여러 상업적 카탈로그의 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, IL-13Ra2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 국제 공개 제2008/146911호, 국제 공개 제2004/087758호에 기술된 항체, 여러 상업적 카탈로그의 항체, 및 국제 공개 제2004/087758호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD30에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제7090843 B1호, 및 유럽 특허 제0805871호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, GD3에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제7253263호; 미국 특허 제8,207,308호; 미국 특허 공개 제2012/0276046호; 유럽 특허 제1013761호; 국제 공개 제2005/035577호; 및 미국 특허 제6437098호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD171에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Hong et al., J Immunother 37(2):93-104 (2014)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, IL-11Ra에 대한 항원 결합 도메인은, Abcam(카탈로그 번호 ab55262) 또는 Novus Biologicals(카탈로그 번호 EPR5446)로부터 입수 가능한 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, IL-11Ra에 대한 항원 결합 도메인은 펩티드이며, 예를 들어, 문헌[Huang et al., Cancer Res 72(1):271-281 (2012)]을 참조한다.
일 구현예에서, PSCA에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Morgenroth et al., Prostate 67(10):1121-1131 (2007)](scFv 7F5); 문헌[Nejatollahi et al., J of Oncology 2013(2013), 논문 ID 839831](scFv C5-II)]; 및 미국 특허 공개 제2009/0311181호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, VEGFR2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Chinnasamy et al., J Clin Invest 120(11):3953-3968 (2010)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 루이스Y에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Kelly et al., Cancer Biother Radiopharm 23(4):411-423 (2008)](hu3S193 Ab (scFvs)); 문헌[Dolezal et al., Protein Engineering 16(1):47-56 (2003)](NC10 scFv)에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD24에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Maliar et al., Gastroenterology 143(5):1375-1384 (2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, PDGFR-베타에 대한 항원 결합 도메인은 항체 Abcam ab32570의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, SSEA-4에 대한 항원 결합 도메인은 항체 MC813(Cell Signaling), 또는 다른 상업적으로 입수 가능한 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD20에 대한 항원 결합 도메인은 항체 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙, 벨투주맙 또는 GA101의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 폴레이트 수용체 알파에 대한 항원 결합 도메인은 항체 IMGN853, 또는 미국 특허 공개 제2012/0009181호; 미국 특허 제4851332호에 기술된 항체, LK26(미국 특허 제5952484호)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, ERBB2(Her2/neu)에 대한 항원 결합 도메인은 항체 트라스투주맙 또는 페르투주맙의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, MUC1에 대한 항원 결합 도메인은 항체 SAR566658의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, EGFR에 대한 항원 결합 도메인은 항체 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙 또는 마투주맙의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, NCAM에 대한 항원 결합 도메인은 항체 클론 2-2B: MAB5324(EMD Millipore)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 에프린(Ephrin) B2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Abengozar et al., Blood 119(19):4565-4576 (2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, IGF-I 수용체에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제8344112 B2호; 유럽 특허 제2322550 A1호; 국제 공개 제2006/138315호, 또는 PCT/US2006/022995에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CAIX에 대한 항원 결합 도메인은 항체 클론 303123(R&D Systems)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, LMP2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제7,410,640호, 또는 미국 특허 공개 제2005/0129701호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, gp100에 대한 항원 결합 도메인은 항체 HMB45, NKI베타B, 또는 국제 공개 제2013/165940, 또는 미국 특허 공개 제2013/0295007호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 티로시나아제에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제5843674호; 또는 미국 특허 공개 제1995/0504048호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, EphA2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Yu et al., Mol Ther 22(1):102-111 (2014)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, GD3에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제7253263호; 미국 특허 제8,207,308호; 미국 특허 공개 제2012/0276046호; 유럽 특허 제1013761 A3호; 제2012/0276046호; 국제 공개 제2005/035577호; 또는 미국 특허 제6437098호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 푸코실 GM1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2010/0297138호; 또는 국제 공개 제2007/067992호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, sLe에 대한 항원 결합 도메인은 항체 G193(루이스 Y의 경우)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함하며, 문헌[Scott AM et al, Cancer Res 60: 3254-61 (2000)]을 참조하는데, 이는 또한 문헌[Neeson et al, J Immunol May 2013 190 (Meeting Abstract Supplement) 177.10]에 기술된 바와 같다.
일 구현예에서, GM3에 대한 항원 결합 도메인은 항체 CA 2523449(mAb 14F7)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, HMWMAA에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Kmiecik et al., Oncoimmunology 3(1):e27185 (2014)](PMID: 24575382)(mAb9.2.27); 미국 특허 제6528481호; 국제 공개 제2010/033866호; 또는 미국 특허 공개 제2014/0004124호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, o-아세틸-GD2에 대한 항원 결합 도메인은 항체 8B6의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, TEM1/CD248에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Marty et al., Cancer Lett 235(2):298-308 (2006)]; 문헌[Zhao et al., J Immunol Methods 363(2):221-232 (2011)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CLDN에 대한 항원 결합 도메인은 항체 IMAB027(Ganymed Pharmaceuticals)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함하며, 예를 들어, clinicaltrial.gov/show/NCT02054351을 참조한다.
일 구현예에서, TSHR에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제8,603,466호; 미국 특허 제8,501,415호; 또는 미국 특허 제8,309,693호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, GPRC5D에 대한 항원 결합 도메인은 항체 FAB6300A(R&D Systems); 또는 LS-A4180(Lifespan Biosciences)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD97에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 미국 특허 제6,846,911호; 문헌[de Groot et al., J Immunol 183(6):4127-4134 (2009)]에 기술된 항체; 또는 R&D로부터의 항체: MAB3734의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, ALK에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Mino-Kenudson et al., Clin Cancer Res 16(5):1561-1571 (2010)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 폴리시알산에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Nagae et al., J Biol Chem 288(47):33784-33796 (2013)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, PLAC1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Ghods et al., Biotechnol Appl Biochem 2013 doi:10.1002/bab.1177]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 글로보H에 대한 항원 결합 도메인은 항체 VK9; 또는 예를 들어 문헌[Kudryashov V et al., Glycoconj J.15(3):243-9 (1998)], 문헌[Lou et al., Proc Natl Acad Sci USA 111(7):2482-2487 (2014)]; 문헌[MBr1: Bremer E-G et al. J Biol Chem 259:14773-14777 (1984)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분을 포함한다.
일 구현예에서, NY-BR-1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Jager et al., Appl Immunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83 (2007)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, WT-1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 문헌[Dao et al., Sci Transl Med 5(176):176ra33 (2013)]; 또는 국제 공개 제2012/135854호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, MAGE-A1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Willemsen et al., J Immunol 174(12):7853-7858 (2005)](TCR-유사 scFv)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 정자 단백질 17에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Song et al., Target Oncol 2013 Aug 14 (PMID: 23943313)]; 문헌[Song et al., Med Oncol 29(4):2923-2931 (2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, Tie 2에 대한 항원 결합 도메인은 항체 AB33(Cell Signaling Technology)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, MAD-CT-2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 PMID: 2450952; 미국 특허 제7635753호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, Fos-관련 항원 1에 대한 항원 결합 도메인은 항체 12F9(Novus Biologicals)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 멜란A/MART1에 대한 항원 결합 도메인은 유럽 특허 제2514766 A2호; 또는 미국 특허 제7,749,719호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 육종 전좌 중단점에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 문헌[Luo et al, EMBO Mol. Med. 4(6):453-461 (2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, TRP-2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Wang et al, J Exp Med. 184(6):2207-16 (1996)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CYP1B1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Maecker et al., Blood 102 (9): 3287-3294 (2003)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, RAGE-1에 대한 항원 결합 도메인은 항체 MAB5328(EMD Millipore)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 인간 텔로머라아제 역전사효소에 대한 항원 결합 도메인은 항체 카탈로그 번호 LS-B95-100(Lifespan Biosciences)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 장 카르복실 에스테라아제에 대한 항원 결합 도메인은 항체 4F12: 카탈로그 번호 LS-B6190-50(Lifespan Biosciences)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, mut hsp70-2에 대한 항원 결합 도메인은 항체 Lifespan Biosciences: 단클론: 카탈로그 번호 LS-C133261-100(Lifespan Biosciences)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD79a에 대한 항원 결합 도메인은 Abcam으로부터 입수 가능한 항체 항-CD79a 항체[HM47/A9](ab3121); Cell Signalling Technology로부터 입수 가능한 항체 CD79A 항체 #3351; 또는 Sigma Aldrich로부터 입수 가능한, 토끼에서 생성된 항-CD79A 항체인 항체 HPA017748의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD79b에 대한 항원 결합 도메인은 항체 폴라투주맙 베도틴, 문헌[Dornan et al., "Therapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate, anti-CD79b-vc-MMAE, for the treatment of non-Hodgkin lymphoma" Blood. 2009 Sep 24;114(13):2721-9. doi: 10.1182/Blood-2009-02-205500. Epub 2009 Jul 24]]에 기술된 항-CD79b, 또는 문헌["4507 Pre-Clinical Characterization of T Cell-Dependent Bispecific Antibody Anti-CD79b/CD3 As a Potential Therapy for B Cell Malignancies" Abstracts of 56th ASH Annual Meeting and Exposition, San Francisco, CA December 6-9 2014]에 기술된 이중특이적 항체 항-CD79b/CD3의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD72에 대한 항원 결합 도메인은 문헌[Myers, and Uckun, "An anti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia." Leuk Lymphoma. 1995 Jun;18(1-2):119-22]에 기술된 항체 J3-109, 또는 문헌[Polson et al., "Antibody-Drug Conjugates for the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma: Target and Linker-Drug Selection" Cancer Res March 15, 2009 69; 2358]에 기술된 항-CD72(10D6.8.1, mIgG1)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, LAIR1에 대한 항원 결합 도메인은 항체, ProSpec으로부터 입수 가능한 ANT-301 LAIR1 항체; 또는 BioLegend로부터 입수 가능한 항-인간 CD305(LAIR1) 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, FCAR에 대한 항원 결합 도메인은 Sino Biological Inc.로부터 입수 가능한 항체 CD89/FCAR항체(카탈로그 번호 10414-H08H)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, LILRA2에 대한 항원 결합 도메인은 항체, Abnova로부터 입수 가능한 LILRA2 단클론 항체(M17), 클론 3C7, 또는 Lifespan Biosciences로부터 입수 가능한 마우스 항-LILRA2 항체, 단클론(2D7)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD300LF에 대한 항원 결합 도메인은 항체, BioLegend로부터 입수 가능한 마우스 항-CMRF35-유사 분자 1 항체, 단클론[UP-D2], 또는 R&D Systems로부터 입수 가능한 래트 항-CMRF35-유사 분자 1 항체, 단클론[234903]의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, CLEC12A에 대한 항원 결합 도메인은 항체, 이중특이적 T 세포 관여항체(BiTE) scFv-항체 및 문헌[Noordhuis et al., "Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugates and Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody" 53rd ASH Annual Meeting and Exposition, December 10-13, 2011, and MCLA-117 (Merus)]에 기술된 ADC의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, BST2(CD317로도 칭해짐)에 대한 항원 결합 도메인은 항체, Antibodies-Online으로부터 입수 가능한 마우스 항-CD317 항체, 단클론[3H4], 또는 R&D Systems로부터 입수 가능한 마우스 항-CD317 항체, 단클론[696739]의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, EMR2(CD312로도 칭해짐)에 대한 항원 결합 도메인은 항체, Lifespan Biosciences로부터 입수 가능한 마우스 항-CD312 항체, 단클론[LS-B8033], 또는 R&D Systems로부터 입수 가능한 마우스 항-CD312 항체, 단클론[494025]의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, LY75에 대한 항원 결합 도메인은 항체, EMD Millipore로부터 입수 가능한 마우스 항-림프구 항원 75 항체, 단클론[HD30], 또는 Life Technologies로부터 입수 가능한 마우스 항-림프구 항원 75 항체, 단클론[A15797]의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, GPC3에 대한 항원 결합 도메인은 문헌[Nakano K, Ishiguro T, Konishi H, et al. Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafting and stability optimization. Anticancer Drugs. 2010 Nov;21(10):907-916]]에 기술된 항체 hGC33, 또는 MDX-1414, HN3, 또는 YP7(3가지 모두는 문헌[Feng et al., "Glypican-3 antibodies: a new therapeutic target for liver cancer." FEBS Lett. 2014 Jan 21;588(2):377-82]에 기술됨)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, FCRL5에 대한 항원 결합 도메인은 문헌[Elkins et al., "FcRL5 as a target of antibody-drug conjugates for the treatment of multiple myeloma" Mol Cancer Ther. 2012 Oct;11(10):2222-32]에 기술된 항-FcRL5 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
일 구현예에서, IGLL1에 대한 항원 결합 도메인은 항체, Lifespan Biosciences로부터 입수 가능한 마우스 항-면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 항체, 단클론[AT1G4], BioLegend로부터 입수 가능한 마우스 항-면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 항체, 단클론[HSL11]의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR을 포함한다.
막횡단 도메인
막횡단 도메인과 관련하여, 다양한 구현예에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 부착된 막횡단 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막횡단 도메인은 막횡단 영역에 인접한 하나 이상의 추가의 아미노산, 예를 들어 막횡단 영역이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 이상의 아미노산(예를 들어 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산) 및/또는 막횡단 단백질이 유래된 단백질의 세포내 영역과 관련된 하나 이상의 추가의 아미노산(예를 들어 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 막횡단 도메인은 CAR의 다른 도메인 중 하나와 회합되는 것이다. 일부 경우에, 막횡단 도메인은 이러한 도메인이 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 결합하는 것을 피하기 위해, 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 선택되거나 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 일 양태에서, 막횡단 도메인은 CAR 발현 세포의 세포 표면 상의 또 다른 CAR과의 동종이량체화가 가능하다. 상이한 양태에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 동일한 CART에 존재하는 고유 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호 작용을 최소화하기 위해 변형되거나 치환될 수 있다.
막횡단 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우에, 도메인은 임의의 막 결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 막횡단 도메인은 CAR이 표적에 결합할 때마다 세포내 도메인(들)에의 신호전달이 가능하다. 본 발명에서 특정 용도의 막횡단 도메인은 적어도, 예를 들어 T 세포 수용체인 CD28, CD27, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 적어도, 예를 들어 KIR2DS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C, 또는 CD19의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 막횡단 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 CAR의 세포외 영역, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 힌지는 인간 Ig(면역글로불린) 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지, 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 일 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다(예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진다). 일 양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호 6의 막횡단 도메인을 포함한다(예를 들어, 서열번호 6의 막횡단 도메인으로 이루어진다).
일 양태에서, 힌지 또는 스페이서는 IgG4 힌지를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 다음의 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM (서열번호 36). 일 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 다음의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 힌지를 포함한다:
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG (서열번호 37).
일 양태에서, 힌지 또는 스페이서는 IgD 힌지를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 다음의 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH (서열번호 38). 일 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 다음의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 힌지를 포함한다:
AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT (서열번호 103).
일 양태에서, 막횡단 도메인은 재조합 도메인일 수 있고, 이 경우에 이는 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 주로 포함할 것이다. 일 양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 재조합 막횡단 도메인의 각각의 말단에서 발견될 수 있다.
선택적으로, 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 막횡단 도메인과 세포질 영역 사이에 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 특히 적합한 링커를 제공한다. 예를 들어, 일 양태에서, 링커는 GGGGSGGGGS(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(서열번호 8)의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일 양태에서, 힌지 또는 스페이서는 KIR2DS2 힌지를 포함한다.
세포질 도메인
CAR의 세포질 도메인 또는 영역에는 세포내 신호전달 도메인이 포함된다. 일반적으로 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 도입된 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다.
본 명세서에서 기술된 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 결합 후에 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 공동수용체 및 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열과, 동일한 기능적 능력을 갖는 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 임의의 재조합 서열을 포함한다.
단독의 TCR을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에는 불충분하고, 이차 및/또는 공동 자극 신호가 또한 필요함이 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 다음의 2개의 별개의 클래스의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개된다고 할 수 있다: TCR을 통해 항원-의존성 일차 활성화를 개시하는 것(일차 세포내 신호전달 도메인) 및 이차 또는 공동 자극 신호를 제공하기 위해 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것(이차 세포질 도메인, 예를 들어 공동 자극 도메인).
일차 신호전달 도메인은 TCR 복합체의 일차 활성화를 자극적인 방식으로 또는 억제적인 방식으로 조절한다. 자극적인 방식으로 작용하는 일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려져 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특히 유용한 1차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278("ICOS"로도 알려짐), FcεRI, DAP10, DAP12, 및 CD66d의 것들을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 CAR은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3-제타(예를 들어 본 명세서에서 기술된 CD3-제타 서열)의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 고유 ITAM 도메인과 비교하여 변경된(예를 들어 증가된 또는 감소된) 활성을 갖는 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 일차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 최적화된 및/또는 절두된 ITAM-함유 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 1, 2, 3 또는 4개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.
공동 자극 신호전달 도메인
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자체적으로 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함할 수 있거나, 본 발명의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 요망되는 세포내 신호전달 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 쇄 부분 및 공동 자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공동 자극 신호전달 도메인은 공동 자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 나타낸다. 일 구현예에서, 세포내 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 양태에서, 세포내 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 ICOS의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다.
공동 자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 그 리간드 이외의 세포 표면 분자일 수 있다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 예를 들어 CD27 공동 자극은 시험관 내에서 인간 CART 세포의 확장, 이펙터 기능, 및 생존을 증진시키고, 생체 내에서 인간 T 세포 지속성 및 항종양 활성을 증강시키는 것으로 입증된 바 있다(문헌[Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706]). 이러한 공동 자극 분자의 추가의 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp30, NKp44, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, NKG2D, NKG2C 및 PAG/Cbp를 포함한다.
CAR의 세포질 부분 내의 세포내 신호전달 도메인은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 선택적으로, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산) 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 세포내 신호전달 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 일 구현예에서, 글리신-세린 이중체가 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 단일 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신이 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 공동 자극 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 구현예에서, 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 공동 자극 신호전달 도메인은 링커 분자, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 링커 분자에 의해 분리된다. 일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동 자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
일 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 양태에서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열번호 7의 신호전달 도메인이다. 일 양태에서, CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열번호 9의 신호전달 도메인이다.
일 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD27의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 양태에서, CD27의 신호전달 도메인은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (서열번호 16). 일 양태에서, CD27의 신호전달 도메인은 다음의 핵산 서열에 의해 암호화된다:
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (서열번호 14).
일 양태에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 제2 CAR, 예를 들어 동일한 표적 또는 상이한 표적(예를 들어 본 명세서에서 기술된 암 관련 항원 또는 본 명세서에서 기술된 상이한 암 관련 항원 이외의 표적, 예를 들어, CD19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타)에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제2 CAR은 암 관련 항원과 동일한 암 세포 유형에 의해 발현된 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CAR 발현 세포는, 제1 항원을 표적화하고 공동 자극 신호전달 도메인을 갖지만 일차 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제2의 상이한 항원을 표적화하고 일차 신호전달 도메인을 갖지만 공동 자극 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 공동 자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, ICOS, CD27 또는 OX-40을 제1 CAR에, 및 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타를 제2 CAR에 배치하면, CAR 활성을 둘 다의 표적이 발현되는 세포로 제한할 수 있다. 일 구현예에서, CAR 발현 세포는 본 명세서에서 기술된 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동 자극 도메인을 포함하는 제1 암 관련 항원 CAR, 및 상이한 표적 항원(예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 암 세포 유형 상에서 발현되는 항원)을 표적화하며, 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 본 명세서에서 기술된 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제1 표적 항원 이외의 항원(예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 암 세포 유형 상에서 발현되는 항원)을 표적화하며, 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동 자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 CAR 발현 세포, 예를 들어, CART 세포의 집단을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, CAR 발현 세포의 집단은 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서, CART 세포의 집단은 본 명세서에서 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 상이한 항원 결합 도메인, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 상이한 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, 제1 세포에 의해 발현된 CAR의 항원 결합 도메인이 결합하는 암 관련 항원과는 상이한 본 명세서에서 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, CAR 발현 세포의 집단은 본 명세서에서 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 본 명세서에서 기술된 암 관련 항원 이외의 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, CAR 발현 세포의 집단은 예를 들어 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포 및 이차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 집단 내의 적어도 하나의 세포가 본 명세서에서 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하고, 제2 세포가 또 다른 작용제, 예를 들어, CAR 발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 발현하는 세포의 집단을 특징으로 한다. 예를 들어 일 구현예에서, 작용제는 억제성 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제성 분자, 예를 들어 PD-1은 일부 구현예에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR 발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF(예를 들어, TGF 베타)를 포함한다. 일 구현예에서, 억제성 분자를 억제하는 작용제는 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 세포내 신호전달 도메인과 회합된, 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제성 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 작용제는 예를 들어 억제성 분자, 예컨대 PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGF 베타, 또는 이들 중 임의의 것의 단편의 제1 폴리펩티드, 및 본 명세서에서 기술된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 공동 자극 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27, OX40 또는 CD28) 및/또는 일차 신호전달 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)을 포함함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 작용제는 PD-1 또는 이의 단편의 제1 폴리펩티드, 및 본 명세서에서 기술된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본 명세서에서 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
항-CD19 결합 도메인의 서열을 본 명세서의 표 1에 제공하였다. 전체 CAR 구축물은 표 1에 기술된 임의의 항원 결합 도메인을 아래에 제공된 1종 이상의 추가의 CAR 성분과 함께 사용하여 생성될 수 있다.
·리더 (아미노산 서열) (서열번호 1)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
· 리더 (핵산 서열) (서열번호 12)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
· 리더 (핵산 서열 2) (서열번호 127)
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
· 리더 (핵산 서열 3) (서열번호 128)
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG
· CD8 힌지 (아미노산 서열) (서열번호 2)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
· CD8 힌지 (핵산 서열) (서열번호 13)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
· CD8 힌지 (핵산 서열 2) (서열번호 129)
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT
· CD8 막횡단 (아미노산 서열) (서열번호 6)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
· 막횡단 (핵산 서열) (서열번호 17)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
· 막횡단 (핵산 서열 2) (서열번호 130)
ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT
· 4-1BB 세포내 도메인 (아미노산 서열) (서열번호 7)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
· 4-1BB 세포내 도메인 (핵산 서열) (서열번호 18)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
· 4-1BB 세포내 도메인 (핵산 서열 2) (서열번호 131)
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG
· CD3 제타 도메인 (아미노산 서열) (서열번호 9)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
· CD3 제타 (핵산 서열) (서열번호 20)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
· CD3 제타 (핵산 서열 2) (서열번호 132)
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
· CD3 제타 도메인 (아미노산 서열; NCBI 기준 서열 NM_000734.3) (서열번호10)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
·CD3 제타 (핵산 서열; NCBI 기준 서열 NM_000734.3); (서열번호21)
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
IgG4 힌지 (아미노산 서열) (서열번호36)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
IgG4 힌지 (뉴클레오티드 서열) (서열번호37)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
EF1 알파 프로모터
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA (서열번호 11).
Gly/Ser (서열번호25)
GGGGS
Gly/Ser (서열번호26): 이 서열은 1 내지 6개의 "Gly Gly Gly Gly Ser" 반복 단위를 포함할 수 있다
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser (서열번호27)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser (서열번호28)
GGGGSGGGGS GGGGS
Gly/Ser (서열번호29)
GGGS
폴리A (서열번호30): A5000
폴리A (서열번호31): A100
폴리T (서열번호32): T5000
폴리A (서열번호33): A5000
폴리A (서열번호34): A400
폴리A (서열번호35): A2000
· Gly/Ser (서열번호15): 이 서열은 1 내지 10개의 "Gly Gly Gly Ser" 반복 단위를 포함할 수 있다
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
본 명세서에서 기술된 방법에 사용될 수 있는 예시적인 CD19 CAR 구축물을 표 3에 나타내었다:
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
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Figure pct00024
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Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 3에 열거된 임의의 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함한다. 구현예들에서, 항원 결합 도메인은 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 추가로 포함한다. 구현예들에서, 항원 결합 도메인은 표 3에 열거된 임의의 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 3에 열거된 임의의 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3 중 3, 2개 또는 전부, 및 표 3에 열거된 임의의 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 전부를 포함한다.
일부 구현예에서, CDR은 카바트 넘버링 스킴, 초티아 넘버링 스킴, 또는 이의 조합에 따라 정의된다.
scFv 도메인의 인간화 CDR 서열의 서열은 중쇄 가변 도메인의 경우 표 3A에, 경쇄 가변 도메인의 경우 표 3B에 나타내었다. "ID"는 각각의 CDR에 대한 각각의 서열번호를 나타낸다.
Figure pct00035
Figure pct00036
CAR과 다른 분자 또는 작용제의 공동 발현
제2 CAR의 공동 발현
일 양태에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 제2 CAR, 예를 들어 동일한 표적(예를 들어, CD19) 또는 상이한 표적(예를 들어 CD19 이외의 표적, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 표적)에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, CAR 발현 세포는, 제1 항원을 표적화하고 공동 자극 신호전달 도메인을 갖지만 일차 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제2의 상이한 항원을 표적화하고 일차 신호전달 도메인을 갖지만 공동 자극 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 공동 자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27, OX-40 또는 ICOS를 제1 CAR에, 및 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타를 제2 CAR에 배치하면, CAR 활성을 둘 다의 표적이 발현되는 세포로 제한할 수 있다. 일 구현예에서, CAR 발현 세포는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동 자극 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 또 다른 항원을 표적화하고 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 또 다른 항원을 표적화하고 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동 자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다.
일 구현예에서, CAR 발현 세포는 본 명세서에서 기술된 XCAR 및 억제성 CAR을 포함한다. 일 구현예에서, 억제성 CAR은 암 세포에서는 발견되지 않지만 정상 세포, 예를 들어 X를 또한 발현하는 정상 세포에서 발견되는 항원과 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 억제성 CAR은 억제성 분자의 세포내 도메인, 막횡단 도메인 및 항원 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 억제성 CAR의 세포내 도메인은 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF(예를 들어, TGF 베타)의 세포내 도메인일 수 있다.
일 구현예에서, CAR 발현 세포가 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하는 경우에, 상이한 CAR의 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인이 서로 상호 작용하지 않도록 하는 것일 수 있다. 예를 들어 제1 및 제2 CAR을 발현하는 세포는 제1 CAR의 항원 결합 도메인을, 예를 들어 제2 CAR의 항원 결합 도메인과 회합을 형성하지 않는 단편, 예를 들어 scFv로서 가질 수 있고, 예를 들어 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 VHH이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 이의 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 분자를 포함하는 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자를 포함한다. 예는 중쇄 가변 도메인, 자연적으로 경쇄가 결여된 결합 분자, 통상적인 4쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인, 조작된 도메인 및 항체로부터 유래된 것 이외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. SDAB 분자는 당해 분야의 것, 또는 임의의 장래의 단일 도메인 분자 중 임의의 것일 수 있다. SDAB 분자는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 또한 낙타과 및 상어 이외의 종으로부터의 자연 발생 단일 도메인 항체 분자를 포함한다.
일 양태에서, SDAB 분자는 어류에서 관찰되는 면역글로불린, 예컨대, 예를 들어 상어의 혈청에서 발견되는 신규 항원 수용체(NAR)로서 공지된 면역글로불린 이소형으로부터 유래된 것의 가변 영역으로부터 유래될 수 있다. NAR("IgNAR")의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자를 생성하는 방법은 국제 공개 제2003/014161호 및 문헌[Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909]에 기술되어 있다.
또 다른 양태에 따르면, SDAB 분자는 경쇄가 없는 중쇄로서 알려진 자연 발생적인 단일 도메인 항원 결합 분자이다. 이러한 단일 도메인 분자는 예를 들어 국제 공개 제1994/004678호 및 문헌[Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448]에 개시되어 있다. 명확성을 위해, 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 분자로부터 유래된 이러한 가변 도메인은 4쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위하여 본 명세서에서 VHH 또는 나노바디로 공지된다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종으로부터, 예를 들어 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 과나코에서 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종이 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 분자를 생성할 수 있고, 이러한 VHH는 본 발명의 범위 내에 있다.
SDAB 분자는 재조합, CDR-그라프트, 인간화, 낙타화, 탈면역화 및/또는 시험관 내 생성(예를 들어 파지 디스플레이에 의해 선택)될 수 있다.
또한, 수용체의 항원 결합 도메인 사이의 상호 작용은 예를 들어 항원 결합 도메인 중 하나 이상이 이의 동족 항원에 결합하는 능력을 억제하기 때문에, 항원 결합 도메인을 포함하는 복수의 키메라 막 임베딩된 수용체를 갖는 세포는 바람직하지 않을 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 따라서, 이러한 상호 작용을 최소화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 비 자연 발생 키메라 막 임베딩 수용체를 갖는 세포가 본 명세서에 개시된다. 또한, 이러한 상호 작용을 최소화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 비 자연 발생 키메라 막 임베딩 수용체를 암호화하는 핵산, 그리고 이러한 세포 및 핵산의 제조 및 사용 방법이 본 명세서에 개시된다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 비 자연 발생 키메라 막 임베딩된 수용체 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타과, 상어 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 조성물은 제1 및 제2 CAR을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv이고, 다른 것은 scFv가 아니다. 일부 구현예에서, 제1 CAR 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타과, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 나노바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 낙타과 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 CAR 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타과, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 나노바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 낙타과 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 표면 상에 존재하는 경우, 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 이의 동족 항원에 대한 결합은 제2 CAR의 존재에 의해 실질적으로 감소되지 않는다. 일부 구현예에서, 제2 CAR의 존재 하에서 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 이의 동족 항원에 대한 결합은 제2 CAR의 부재 하에서 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 이의 동족 항원에 대한 결합의 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%, e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
일부 구현예에서, 세포의 표면 상에 존재하는 경우, 제1 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 둘 다가 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 서로 덜 회합한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 둘 다가 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 더 적게, 예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 더 적게 회합한다.
CAR 활성을 증진시키는 작용제의 공동 발현
또 다른 양태에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR 발현 세포의 활성 또는 적합성을 증진시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에서, 작용제는 T 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어 억제하는 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 기능을 조정하거나 조절하는 분자는 억제성 분자이다. 억제성 분자, 예를 들어 PD1은 일부 구현예에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR 발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신 또는 TGF 베타를 포함한다.
구현예들에서, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 바와 같은 작용제, 예를 들어 억제성 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA; 또는 예를 들어 억제성 단백질 또는 시스템, 예를 들어 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복체(CRISPR), 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)가 CAR 발현 세포에서 T 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 작용제는 shRNA, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 shRNA이다. 일 구현예에서, T 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어 억제하는 작용제는 CAR 발현 세포 내에서 억제된다. 예를 들어, T 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 암호화하는 핵산에 연결된다.
일 구현예에서, 억제성 분자를 억제하는 작용제는 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 세포내 신호전달 도메인과 회합된, 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제성 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 작용제는 예를 들어 억제성 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 또는 TGF 베타의 제1 폴리펩티드, 또는 이들 중 임의의 것의 단편(예를 들어 이들 중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 일부), 및 본 명세서에서 기술된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 공동 자극 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 바와 같은 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 일차 신호전달 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 작용제는 PD1의 제1 폴리펩티드 또는 이의 단편(예를 들어 PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부), 및 본 명세서에서 기술된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 본 명세서에서 기술된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본 명세서에서 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다. PD1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 패밀리의 수용체의 억제성 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포에서 발현된다(문헌[Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75]). PD1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2는 PD1에 대한 결합 시에 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다(문헌[Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34]; 문헌[Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8]; 문헌[Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43]). PD-L1은 인간 암에서 풍부하다(문헌[Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7]; 문헌[Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314]; 문헌[Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094]). 면역 억제는 PD1과 PD-L1의 국소적 상호 작용을 억제함으로써 역전될 수 있다.
일 구현예에서, 억제성 분자, 예를 들어 PD1(Programmed Death 1)의 세포외 도메인(ECD)을 포함하는 작용제는 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 41BB 및 CD3 제타에 융합될 수 있다(본 명세서에서 PD1 CAR로도 지칭됨). 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 XCAR과 조합하여 사용되는 경우 PD1 CAR은 T 세포의 지속성을 향상시킨다. 일 구현예에서, CAR은 서열번호 105에 밑줄로 표시한 PD1의 세포외 도메인을 포함하는 PD1 CAR이다. 일 구현예에서, PD1 CAR은 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함한다.
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (서열번호 105).
일 구현예에서, PD1 CAR은 아래에 제공된 아미노산 서열(서열번호 106)을 포함한다.
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (서열번호 106).
일 구현예에서, 작용제는 PD1 CAR, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 PD1 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, PD1 CAR에 대한 핵산 서열은 아래에 제시되어 있으며, PD1 ECD는 아래 서열번호 107에 밑줄로 표시되어 있다.
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc (서열번호 107).
또 다른 예에서, 일 구현예에서, CAR 발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 공동 자극 분자 또는 공동 자극 분자 리간드일 수 있다. 공동 자극 분자의 예는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, 뿐만 아니라 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 및 4-1BB(CD137)를 포함한다. 이러한 공동 자극 분자의 추가적인 예는, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 바와 같은, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 공동 자극 분자 리간드의 예는 CD80, CD86, CD40L, ICOSL, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL 및 LIGHT를 포함한다. 구현예들에서, 공동 자극 분자 리간드는 CAR의 공동 자극 분자 도메인과 상이한 공동 자극 분자에 대한 리간드이다. 구현예들에서, 공동 자극 분자 리간드는 CAR의 공동 자극 분자 도메인과 동일한 공동 자극 분자에 대한 리간드이다. 일 구현예에서, 공동 자극 분자 리간드는 4-1BBL이다. 일 구현예에서, 공동 자극 리간드는 CD80 또는 CD86이다. 일 구현예에서, 공동 자극 분자 리간드는 CD70이다. 구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 면역 이펙터 세포는 하나 이상의 추가의 공동 자극 분자 또는 공동 자극 분자 리간드를 발현하도록 추가로 조작될 수 있다.
CAR과 케모카인 수용체의 공동 발현
구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포, 예를 들어 CD19 CAR 발현 세포는 케모카인 수용체 분자를 추가로 포함한다. T 세포에서 케모카인 수용체 CCR2b 또는 CXCR2의 유전자이식 발현은 흑색종 및 신경모세포종을 비롯한 CCL2- 또는 CXCL1-분비 고형 종양으로의 전달량을 증진시킨다(문헌[Craddock et al., J Immunother. 2010 Oct; 33(8):780-8] 및 [Kershaw et al., Hum Gene Ther. 2002 Nov;13(16):1971-80]). 따라서, 이론에 구애되고자 함이 없이, 종양, 예를 들어, 고형 종양이 분비하는 케모카인을 인식하는 CAR 발현 세포에서 발현되는 케모카인 수용체는 CAR 발현 세포의 종양으로의 회귀를 향상시키고, CAR 발현 세포의 종양으로의 침윤을 촉진시키고, CAR 발현 세포의 항종양 효능을 증진시킨다. 케모카인 수용체 분자는 자연 발생 또는 재조합 케모카인 수용체 또는 이의 케모카인-결합 단편을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포(예를 들어 CAR-Tx)에서의 발현에 적합한 케모카인 수용체 분자는 CXC 케모카인 수용체(예를 들어 CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 또는 CXCR7), CC 케모카인 수용체(예를 들어 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, 또는 CCR11), CX3C 케모카인 수용체(예를 들어 CX3CR1), XC 케모카인 수용체(예를 들어 XCR1), 또는 이의 케모카인-결합 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR과 함께 발현될 케모카인 수용체 분자는 종양에 의해 분비되는 케모카인(들)에 기초하여 선택된다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 CCR2b 수용체 또는 CXCR2 수용체를 추가로 포함, 예를 들어 발현한다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 및 케모카인 수용체 분자는 동일한 벡터 상에 존재하거나, 또는 2개의 상이한 벡터 상에 존재한다. 본 명세서에서 기술된 CAR 및 케모카인 수용체 분자가 동일한 벡터 상에 존재하는 구현예에서, CAR 및 케모카인 수용체 분자는 각각 2개의 상이한 프로모터의 제어 하에 있거나, 또는 동일한 프로모터의 제어 하에 있다.
CAR을 암호화하는 핵산 구축물
또한, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 1개 이상의 CAR 구축물을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 면역 이펙터 세포, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 제조된 면역 이펙터 세포를 제공한다. 일 양태에서, 핵산 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 일 양태에서, 핵산 분자는 DNA 구축물로서 제공된다.
본 명세서에서 기술된 핵산 분자는 DNA 분자, RNA 분자, 또는 이의 조합일 수 있다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA이다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 전술된 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하는 벡터이다.
일 양태에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 서열이 포유류 세포에서의 발현용으로 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 암호화된다. 일 양태에서, 본 발명의 전체 CAR 구축물은 전체 서열이 포유류 세포에서의 발현용으로 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 암호화된다. 코돈 최적화는 암호화 DNA 내의 동의 코돈(즉, 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편향된다는 발견을 말한다. 이러한 코돈 축퇴성은 동일한 폴리펩티드가 다양한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있도록 한다. 다양한 코돈 최적화 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 적어도 미국 특허 제5,786,464호 및 제6,114,148호에 개시된 방법을 포함한다.
따라서, 일 양태에서, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 제조된, 면역 이펙터 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서, CAR은 본 명세서에서 기술된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 막횡단 도메인), 및 자극 도메인, 예를 들어 공동 자극 신호전달 도메인(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 공동 자극 신호전달 도메인) 및/또는 일차 신호전달 도메인(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 제타 쇄)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
또한, 본 발명은 CAR을 암호화하는 핵산 분자, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 핵산 분자가 삽입된 벡터를 제공한다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 딸세포에서 이식유전자의 장기간의 안정적인 통합 및 이의 증식을 허용하기 때문에 장기적인 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 비 증식 세포, 예컨대 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가의 장점을 갖는다. 렌티바이러스 벡터는 또한 낮은 면역원성의 추가의 장점을 갖는다. 레트로바이러스 벡터는 또한 예를 들어 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터에는, 예를 들어 프로모터, 패키징 신호(Ψ), 프라이머 결합 부위(PBS), 하나 이상(예를 들어 2개)의 장형 말단 반복체(LTR), 및 관심 이식유전자, 예를 들어 CAR을 암호화하는 유전자가 포함될 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터에는 바이러스 구조 유전자, 예컨대 gag, pol, 및 env가 결여되어 있을 수 있다. 예시적인 감마레트로바이러스 벡터에는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 비장-병소 형성 바이러스(SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스(MPSV), 및 이로부터 유래된 벡터가 포함된다. 다른 감마레트로바이러스 벡터가, 예를 들어 문헌[Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기술되어 있다.
또 다른 구현예에서, 원하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터(A5/35)이다. 또 다른 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산의 발현은 트랜스포손, 예컨대 슬리핑 뷰티, crisper, CAS9, 및 징크 핑거 뉴클레아제를 사용하여 달성할 수 있다. 다음을 참조한다: 문헌[June et al. 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716](본 명세서에 참조로 포함됨).
간단히 요약하면, CAR을 암호화하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 구축물을 발현 벡터 내로 혼입시킴으로써 달성된다. 벡터는 복제 및 통합 진핵생물에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다.
핵산은 수많은 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심 있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열결정 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY], 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서의 기능적 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유한다(예를 들어, 국제 공개 제2001/96584호; 국제 공개 제2001/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호).
수많은 바이러스 기반 시스템이 포유류 세포 내로의 유전자 전달을 위해 개발된 바 있다. 예를 들어 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 생체 내 또는 생체 외에서 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 수많은 레트로바이러스 시스템이 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 수많은 아데노바이러스 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 일 구현예에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가적 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 부위의 30 내지 110 bp 상류의 영역에 위치하지만, 수많은 프로모터는 또한 출발 부위의 하류에 기능적 요소를 함유하는 것으로 밝혀진 바 있다. 프로모터 요소 사이의 이격은 빈번하게 탄력적이어서, 프로모터 기능은 요소가 역전되거나 서로에 대해 이동할 때 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 이격은, 활성이 감소하기 시작하기 전 50 bp 떨어질 때까지 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화하기 위해 협동적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제(PGK) 프로모터를 포함한다.
포유류 T 세포에서 CAR 암호화 핵산 분자를 발현할 수 있는 프로모터의 예로는 EF1a 프로모터가 있다. 고유 EF1a 프로모터는 아미노아실 tRNA의 리보솜으로의 효소적 전달을 담당하는 신장 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 유도한다. EF1a 프로모터는 포유류 발현 플라스미드에서 광범위하게 사용되었으며, 렌티바이러스 벡터에 클로닝된 핵산 분자로부터 CAR 발현을 유도하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 예를 들어 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조. 일 양태에서, EF1a 프로모터는 실시예에 제공된 서열을 포함한다.
프로모터의 또 다른 예로는 극초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이 있다. 이 프로모터 서열은 이에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복체(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인바(Epstein-Barr) 바이러스 극초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터와, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-1α 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터와 같은, 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 인간 유전자 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용에 한정되지 않아야 한다. 유도성 프로모터도 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 요망되는 경우에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 개시시킬 수 있거나, 또는 발현이 요망되지 않는 경우에 발현을 종료시킬 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
프로모터의 또 다른 예는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터이다. 구현예에서, 절두된 PGK 프로모터(예를 들어, 야생형 PGK 프로모터 서열에 비해 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300, 또는 400개의 뉴클레오티드 결실을 갖는 PGK 프로모터)가 바람직할 수 있다.
예시적 PGK 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공된다.
야생형 PGK 프로모터:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT (서열번호 109)
예시적 절두된 PGK 프로모터:
PGK100:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG (서열번호 110)
PGK200:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG (서열번호111)
PGK300:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG (서열번호112)
PGK400:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG (서열번호113)
또한, 벡터는 예를 들어 분비를 용이하게 하기 위한 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자(예를 들어 소 성장 호르몬(BGH) 유전자 유래), 에피솜 복제 및 원핵생물에서의 복제를 가능하게 하는 요소(예를 들어 SV40 원점 및 ColE1 또는 당해 분야에 공지되어 있는 다른 것) 및/또는 선택을 가능하게 하기 위한 요소(예를 들어 암피실린 저항성 유전자 및/또는 제오신 마커)를 포함할 수 있다.
CAR 폴리펩티드 또는 이의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염되거나 감염될 것이 추구되는 세포의 집단으로부터 발현 세포를 확인 및 선택하는 것을 용이하게 하기 위한 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 이들 둘 다를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 선택 가능한 마커는 DNA의 개별 조각 상에 보유되고, 공동 형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서 발현이 가능하도록 하는 적절한 조절 서열 측면에 배치될 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 예를 들어 항생제 저항성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로 리포터 유전자는, 수용 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고, 이의 발현이 일부 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소적 활성에 의해 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용 세포 내로 도입된 후 적합한 시점에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라아제, 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제, 분비형 알칼리 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 수득할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 보이는, 최소 5' 측면 배치 영역을 갖는 구축물은 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터 유도 전사를 조정하는 능력에 대해 작용제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
구현예들에서, 벡터는 CAR, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 CAR, 예를 들어 CD19 CAR, 및 제2 CAR, 예를 들어, 억제성 CAR, 또는 CD19 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, CAR을 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열은 동일한 프레임 내 단일 핵산 분자에 의해 단일 폴리펩티드 쇄로서 암호화된다. 이러한 양태에서, 2개 이상의 CAR은, 예를 들어 하나 이상의 펩티드 절단 부위에 의해 분리될 수 있다. (예를 들어, 자가 절단 부위 또는 세포내 프로테아제의 기질). 펩티드 절단 부위의 예는 T2A, P2A, E2A, 또는 F2A 부위를 포함한다.
세포 내로의 유전자의 도입 및 발현 방법은 당해 분야에 알려져 있다. 발현 벡터에 관하여, 벡터는 임의의 방법, 예를 들어, 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전법, 리포펙션, 입자 충격법, 미세주입법, 전기천공법 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생성하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, Ny)] 참조. 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 적합한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
숙주 세포 내로 관심 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유류, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 미국 특허 제5,585,362호 참조.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 및 리포솜을 비롯한 지질 기반 시스템을 포함한다. 시험관 내 및 생체 내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다. 핵산의 현재 기술 상태의 표적화 전달, 예컨대 표적화 나노입자 또는 다른 적합한 마이크로미터 미만 크기의 전달 시스템을 사용한 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 다른 방법이 이용 가능하다.
비 바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클로는 리포솜이 있다. 지질 제형의 사용은 숙주 세포 내로의 핵산의 도입(시험관 내, 생체 외 또는 생체 내)을 위해 고려된다. 또 다른 양태에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합되는 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질 함유 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 내에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀에 함유되거나 또는 이와 복합체화되거나, 또는 다르게는 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조에 한정되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로 존재하거나, 미셀로 존재하거나, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 중에 산재되어서, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어 지질은 세포질에서 자연 발생하는 지방 액적과, 장쇄 지방족 탄화수소 및 그들의 유도체, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜, 및 알데히드를 함유하는 화합물의 클래스를 포함한다.
사용하기 적합한 지질은 상업적 공급처로부터 수득할 수 있다. 예를 들어 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 미국 미주리 주 세인트 루이스 소재의 Sigma로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(미국 뉴욕주 플레인뷰)로부터 수득할 수 있고; 콜레스테롤("Chol")은 Calbiochem-Behring으로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc(미국 앨라배마 주 버밍엄)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관될 수 있다. 클로로포름이 메탄올보다 더 용이하게 증발되기 때문에, 클로로포름이 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸는 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중라멜라 지질 비히클을 포괄하는 일반적 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중라멜라 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 다중라멜라 리포솜은 인지질이 과량의 수성 용액 중에 현탁될 경우에 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조의 형성 전에 자기 재배열을 거치고, 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다(문헌[Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10]). 그러나, 정상 소포 구조와 상이한 용액 중 구조를 갖는 조성물도 포괄된다. 예를 들어 지질은 미셀 구조를 가정할 수 있거나 또는 단지 지질 분자의 불균일 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또는 달리 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키기 위해 사용된 방법과 상관없이, 숙주 세포에서 재조합 핵산 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 분석법을 수행할 수 있다. 이러한 분석법은, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 분석법, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범주 내에 포함되는 작용제를 확인하기 위해 본 명세서에서 기술된 분석법에 의해, 특정한 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 분석법을 포함한다.
자연 살해 세포 수용체(NKR) CAR
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 분자는 자연 살해 세포 수용체(NKR)의 하나 이상의 성분을 포함하며, 그에 의해 NKR-CAR을 형성한다. NKR 구성요소는 다음의 자연 살해 세포 수용체 중 임의의 것으로부터의 막횡단 도메인, 힌지 도메인, 또는 세포질 도메인일 수 있다: 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 예를 들어 KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1, 및 KIR3DP1; 자연 세포독성 수용체(NCR), 예를 들어 NKp30, NKp44, NKp46; 면역 세포 수용체의 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM) 패밀리, 예를 들어 CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME, 및 CD2F-10; Fc 수용체(FcR), 예를 들어 CD16, 및 CD64; 및 Ly49 수용체, 예를 들어 LY49A, LY49C. 본 명세서에서 기술된 NKR-CAR 분자는 어댑터 분자 또는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 DAP12와 상호 작용할 수 있다. NKR 성분을 포함하는 CAR 분자의 예시적인 구성 및 서열은 국제 공개 제2014/145252호에 기술되어 있고, 그 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
스플릿(split) CAR
일부 구현예에서, CAR 발현 세포는 스플릿 CAR을 사용한다. 스플릿 CAR 접근법은 국제 공개 제2014/055442호 및 국제 공개 제2014/055657호에 보다 상세히 설명되어 있다. 간단히 말하자면, 스플릿 CAR 시스템은 제1 항원 결합 도메인 및 공동 자극 도메인(예를 들어, 41BB)을 갖는 제1 CAR을 발현하는 세포를 포함하며, 이 세포는 제2 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, CD3 제타)을 갖는 제2 CAR을 또한 발현한다. 세포가 제1 항원을 만난 경우에, 공동 자극 도메인이 활성화되고 세포는 증식한다. 세포가 제2 항원을 만난 경우에, 세포내 신호전달 도메인이 활성화되고 세포 사멸 활성이 시작된다. 따라서, CAR 발현 세포는 오직 둘 다의 항원의 존재 하에서만 완전히 활성화된다.
키메라 항원 수용체 조절 전략
일부 구현예에서, CAR 활성이 제어될 수 있는 조절 가능한 CAR(RCAR)은 CAR 요법의 안전성 및 효능을 최적화하는 데 바람직하다. CAR 활성을 조절할 수 있는 많은 방식이 존재한다. 예를 들어 이량체화 도메인에 융합된 카스파제를 사용한 유도 가능한 아폽토시스(예를 들어 문헌[Di Stasa et al., N Egnl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683] 참조)는 본 발명의 CAR 요법에서 안전성 스위치로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 CAR을 발현하는 세포(예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 유도 가능한 아폽토시스 스위치를 추가로 포함하며, 여기서 인간 카스파제(예를 들어 카스파제 9) 또는 변형된 버전이 조건부 이량체화를 가능하게 하는 인간 FKB 단백질의 변형에 융합된다. 소분자, 예컨대 라파로그(예를 들어 AP 1903, AP20187)의 존재 하에, 유도 가능한 카스파제(예를 들어 카스파제 9)가 활성화되고, 본 발명의 CAR을 발현하는 세포(예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 신속한 아폽토시스 및 사멸을 야기한다. 카스파제-기반의 유도 가능한 아폽토시스 스위치(또는 이러한 스위치의 하나 이상의 양태)의 예는, 예를 들어 미국 특허 출원 제2004/040047호; 미국 특허 출원 제2011/0286980호; 미국 특허 출원 제2014/0255360호; 국제 공개 제1997/031899호; 국제 공개 제2014/151960호; 국제 공개 제2014/164348호; 국제 공개 제2014/197638호; 국제 공개 제2014/197638호에 기술되어 있고; 이는 모두 본 명세서에 참조로 포함된다.
또 다른 예에서, CAR 발현 세포는 또한 이량체화제(예를 들어 리미두시드(AP1903(Bellicum Pharmaceuticals) 또는 AP20187(Ariad)이라고도 함)의 투여 시 카스파제-9의 활성화 및 세포의 아폽토시스를 유도하는 유도 가능한 카스파제-9(iCaspase-9) 분자를 발현할 수 있다. iCaspase-9 분자는 이량체화 화학 유도제(CID)의 존재 하에 이량체화를 매개하는 CID 결합 도메인을 포함한다. 이는 CAR 발현 세포의 유도성 및 선택적 고갈을 초래한다. 일부 경우에, iCaspase-9 분자는 CAR 암호화 벡터(들)와 별개인 핵산 분자에 의해 암호화된다. 일부 경우에, iCaspase-9 분자는 CAR 암호화 벡터와 동일한 핵산 분자에 의해 암호화된다. iCaspase-9는 CAR 발현 세포의 독성을 피할 안전성 스위치를 제공할 수 있다. 예를 들어 문헌[Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75]; 문헌[Clinical Trial Id. No. NCT02107963]; 및 문헌[Di Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83] 참조.
본 발명의 CAR 요법을 조절하기 위한 대안적 전략은, 예를 들어 CAR 발현 세포를 제거함으로써, 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유도함으로써 CAR 활성을 비활성화하거나 턴오프하는 소분자 또는 항체를 활용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 세포 사멸, 예를 들어 ADCC 또는 보체 유도 세포 사멸을 유도할 수 있는 분자에 의해 인식되는 항원을 또한 발현할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 항체 또는 항체 단편에 의해 표적화될 수 있는 수용체를 또한 발현할 수 있다. 이러한 수용체의 예는 EpCAM, VEGFR, 인테그린(예를 들어, 엔테그린 ανβ3, α4, αΙ¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원(예를 들어, TRAIL-R1, TRAIL-R2), PDGF 수용체, 인터페론 수용체, 폴레이트 수용체, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, IL-6 수용체, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD1 1, CD1 1 a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/lgE 수용체, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/바시진(basigin), CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, 및 EGFR, 및 이의 절두된 버전(예를 들어, 하나 이상의 세포외 에피토프를 보존하지만 세포질 도메인 내에 하나 이상의 영역이 결여된 버전)을 포함한다.
예를 들어, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는, 신호전달 능력은 없지만 ADCC를 유도할 수 있는 분자에 의해 인식되는 에피토프를 보유한 절두된 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 예를 들어 세툭시맙(ERBITUX®)을, 세툭시맙의 투여가 ADCC 및 이후의 CAR 발현 세포의 고갈을 유도하도록, 또한 발현할 수 있다(예를 들어, 국제 공개 제2011/056894호, 및 문헌 [Jonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860] 참조). 또 다른 전략은, 리툭시맙에 결합하는, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포의 CD32 및 CD20 항원 모두로부터의 표적 에피토프를 조합하는 매우 컴팩트한 마커/자살 유전자를 발현하여, 예를 들어 ADCC에 의해, CAR 발현 세포의 선택적 고갈을 초래하는 것을 포함한다(예를 들어, 문헌 [Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287] 참조). 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포를 고갈시키는 다른 방법은, 예를 들어 ADCC를 유도함으로써, 파괴를 위한, 성숙한 림프구, 예를 들어 CAR 발현 세포에 선택적으로 결합하고 이를 표적으로 하는 단클론 항-CD52 항체, CAMPATH의 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, CAR 발현 세포는 CAR 리간드, 예를 들어 항유전자형 항체를 사용해 선택적으로 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항유전자형 항체는 이펙터 세포 활성, 예를 들어 ADCC 또는 ADC 활성을 야기함으로써 CAR 발현 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 다른 구현예에서, CAR 리간드, 예를 들어 항유전자형 항체는 세포 사멸을 유도하는 작용제, 예를 들어, 독소에 커플링됨으로써 CAR 발현 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 대안적으로, CAR 분자 자체는, 활성이 아래에서 기술되는 바와 같이 조절될 수 있도록, 예를 들어 턴온 및 턴오프될 수 있도록 구성될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 T 세포 고갈제에 의해 인식되는 표적 단백질을 또한 발현할 수 있다. 일 구현예에서, 표적 단백질은 CD20이고, T 세포 고갈제는 항-CD20 항체, 예를 들어 리툭시맙이다. 이러한 구현예에서, 예를 들어 CAR 유도 독성을 완화시키기 위해, CAR 발현 세포를 감소 또는 제거하는 것이 바람직하면 T 세포 고갈제가 투여된다. 다른 구현예에서, T 세포 고갈제는 항-CD52 항체, 예를 들어, 본 명세서의 실시예에 기술된 바와 같은, 알렘투주맙이다.
다른 구현예에서, RCAR은 가장 단순한 구현예에서 전형적으로 2개인 폴리펩티드의 세트를 포함하며, 여기서 본 명세서에서 기술된 표준 CAR의 구성요소, 예를 들어 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 개별 폴리펩티드 또는 구성원 상에 분배되어 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재 시에 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 CAR은 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함된 국제 공개 제2014/127261호에 기술된 것과 같은 이량체화 스위치를 사용한다. 이러한 조절 가능한 CAR에 대한 추가설명 및 예시적인 구성은 본 명세서에 및 예를 들어, 전체가 참조로서 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/090229호의 단락 527~551에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, RCAR은 스위치 도메인, 예를 들어, 서열번호 114에 기재된 바와 같은, FKBP 스위치 도메인을 수반하거나, 또는 예를 들어, 서열번호 115에 기재된 바와 같은, FRB와 결합하는 능력을 가진 FKBP의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, RCAR은 예를 들어, 서열번호 116에 기재된 바와 같은 FRB 서열 또는 예를 들어, 서열번호 117 내지 122 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 돌연변이체 FRB 서열을 포함하는 스위치 도메인을 수반한다.
DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY (서열번호 114)
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETS (서열번호 115)
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK (서열번호 116)
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RNA 형질감염
시험관 내 전사된 RNA CAR을 생성하는 방법이 본 명세서에 개시된다. RNA CAR 및 이를 사용하는 방법은 예를 들어, 전체가 참조로서 본 명세서에 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 553~570에 기술되어 있다.
면역 이펙터 세포는 메신저 RNA(mRNA)에 의해 암호화된 CAR을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본 명세서에서 기술된 CAR을 암호화하는 mRNA는 CAR 발현 세포의 생성을 위해, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 제조된, 면역 이펙터 세포 내로 도입된다.
일 구현예에서, 시험관 내 전사된 RNA CAR은 일시적 형질감염의 형태로 세포에 도입될 수 있다. RNA는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)으로 생성된 주형을 이용한 시험관 내 전사에 의해 생성된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라아제를 사용하여 PCR에 의해 시험관 내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원은 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 임의의 다른 적절한 DNA 공급원일 수 있다. 시험관 내 전사를 위한 원하는 주형은 본 명세서에서 기술된 CAR이다. 예를 들어, RNA CAR을 위한 주형은 본 명세서에서 기술된 종양 관련 항원에 대한 항체의 단쇄 가변 도메인; 힌지 영역(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 힌지 영역), 막횡단 도메인(예를 들어, CD8a의 막횡단 도메인과 같은 본 명세서에서 기술된 막횡단 도메인)을 포함하는 세포외 영역; 및 예를 들어, CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 영역을 포함한다.
일 구현예에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터의 자연 발생 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 핵산은 일부의 또는 모든 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)을 포함할 수 있다. 핵산은 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 인간 핵산 서열이다. 또 다른 구현예에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 핵산 서열이다. DNA는 대안적으로 자연 발생 유기체에서 정상적으로는 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열로는 함께 라이게이션되어 융합 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 형성하는 유전자의 부분을 함유하는 것이 있다. 함께 라이게이션되는 DNA의 부분은 단일 유기체로부터 또는 1가지 초과의 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR은 형질감염을 위해 사용되는 mRNA의 시험관 내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 사용된다. PCR을 수행하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR을 위한 주형으로서 사용될 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 상보적인"은 프라이머 서열 내 염기의 대부분 또는 전부가 상보적이거나, 또는 하나 이상의 염기가 비 상보적이거나 미스매치된 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR을 위해 사용되는 어닐링 조건에서 의도된 DNA 표적과 어닐링 또는 혼성화될 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하는, 세포에서 정상적으로 전사되는 핵산의 부분(오픈 리딩 프레임)을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 프라이머는 또한 특정한 관심 도메인을 암호화하는 핵산의 부분을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 일 구현예에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 cDNA의 암호화 영역을 증폭시키도록 설계될 수 있다. PCR에 유용한 프라이머는 당해 분야에 잘 알려진 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. "정방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 상류에 있는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 프라이머이다. "상류"는 암호화 가닥과 관련하여 증폭될 DNA 서열에 대해 5' 위치를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 하류에 있는 이중 가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 프라이머이다. "하류"는 암호화 가닥과 관련하여 증폭될 DNA 서열에 대해 3' 위치를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 폴리머라아제가 본 명세서에서 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 시약 및 폴리머라아제는 수많은 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 갖는 화학 구조도 사용될 수 있다. RNA는 구현예들에서 5' 및 3' UTR을 갖는다. 일 구현예에서, 5' UTR은 1 내지 3000개 뉴클레오티드 길이이다. 암호화 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머의 설계를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 후에 최적 번역 효율을 달성하기 위해 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 핵산에 대한 자연 발생, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머 내로 혼입시킴으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가될 수 있다. 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율의 변형에 유용할 수 있다. 예를 들어 3' UTR 서열 내의 AU-풍부 요소가 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있음이 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR은 당해 분야에 잘 알려진 UTR의 특성을 기초로 하여 전사되는 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
일 구현예에서, 5' UTR은 내인성 핵산의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 대해 내인성이 아닌 5' UTR이 위에 기술된 바와 같이 PCR에 의해 부가되는 경우에, 컨센서스 코작 서열은 5' UTR 서열의 부가에 의해 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 필요한 것으로 보이지는 않는다. 많은 mRNA에 대한 코작 서열에 대한 요건은 당해 분야에 공지되어 있다. 다른 구현예에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정적인 RNA 바이러스의 5' UTR일 수 있다. 다른 구현예에서, mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 지연시키기 위해 3' 또는 5' UTR에 다양한 뉴클레오티드 유사체가 사용될 수 있다.
유전자 클로닝을 필요로 하지 않으면서 RNA를 DNA 주형으로부터 합성할 수 있기 위해, 전사 프로모터는 전사시킬 서열의 상류의 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 폴리머라아제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단에 부가되는 경우에, RNA 폴리머라아제 프로모터는 전사되는 오픈 리딩 프레임의 상류의 PCR 생성물 내로 혼입된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 프로모터는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 T7 폴리머라아제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라아제 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터의 컨센서스 뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 알려져 있다.
일 구현예에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역의 개시 및 mRNA의 안정성을 결정하는 5' 말단 상의 캡 및 3' 폴리(A) 테일 둘 다를 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA에서, RNA 폴리머라아제는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 콘카타머 생성물을 생성한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후에 폴리아데닐화되는 경우에도 진핵 형질감염에 유효하지 않은 정상 크기의 mRNA를 초래한다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라아제는 주형의 마지막 염기를 넘어 전사체의 3' 말단을 연장할 수 있다(문헌[Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)]; 문헌[Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)]).
폴리A/T 스트레치의 DNA 주형 내로의 통상적인 통합 방법으로는 분자 클로닝이 있다. 그러나 플라스미드 DNA 내로 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있고, 이것은 박테리아 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 다른 이상에 의해 고도로 오염되는 이유이다. 이는 클로닝 절차를 어렵고 시간 소모적으로 만들 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 만든다. 이러한 이유 때문에, 클로닝 없이 폴리A/T 3' 스트레치를 갖는 DNA 주형의 구축을 가능하게 하는 방법이 매우 바람직하다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 절편은 폴리T 테일, 예컨대 100T 테일(서열번호 123)(크기는 50~5000 T(서열번호 32)일 수 있음)을 포함하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 중에, 또는 DNA 라이게이션 또는 시험관 내 재조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 다른 방법에 의해 PCR 후에 생성될 수 있다. 폴리(A) 테일은 또한 RNA에 안정성을 제공하고, 그들의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 테일의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계가 있다. 일 구현예에서, 폴리(A) 테일은 100 내지 5000개의 아데노신(예를 들어, 서열번호 33)이다.
RNA의 폴리(A) 테일은 폴리(A) 폴리머라아제, 예컨대 E. 콜라이 폴리A 폴리머라아제(E-PAP)를 사용하여 시험관 내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 일 구현예에서, 폴리(A) 테일의 길이를 100개 뉴클레오티드로부터 300 내지 400개 뉴클레오티드(서열번호 34)로 증가시키면 RNA의 번역 효율이 약 2배 증가한다. 추가로, 상이한 화학기의 3' 말단에의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형/인공 뉴클레오티드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어 ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라아제를 사용하여 폴리(A) 테일 내로 혼입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡이 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당해 분야에 공지되고 본 명세서에서 설명된 기술을 이용하여 제공된다(문헌[Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)]; 문헌[Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)]; 문헌[Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)]).
본 명세서에서 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 함유할 수 있다. IRES 서열은 mRNA로의 캡 비의존성 리보솜 결합을 개시하고 번역의 개시를 용이하게 하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적 설계 서열일 수 있다. 세포 투과성 및 생존능을 촉진하는 인자, 예컨대 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제, 및 계면활성제를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
RNA는 여러 상이한 방법, 예를 들어, 전기천공법(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, 독일 쾰른 소재)), (ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, 미국 매사추세츠주 보스턴 소재) 또는 Gene Pulser II(BioRad, 미국 콜로라도주 덴버 소재), Multiporator(Eppendort, 독일 함부르크 소재), 리포펙션을 이용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, 또는 "유전자총"과 같은 생물학적 입자 전달 시스템을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 상업적으로 이용 가능한 방법 중 임의의 방법을 이용해 표적 세포에 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조).
비 바이러스 전달 방법
일부 양태에서, 본 명세서에서 기술된 CAR을 암호화하는 핵산을 세포 또는 조직 또는 대상체 내로 전달하는 데 비 바이러스 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 비 바이러스 방법은 트랜스포손(전위 가능 요소로도 불림)의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스포손은 게놈 내 위치에 그 자체를 삽입할 수 있는 DNA 조각, 예를 들어 자기-복제 및 이의 카피의 게놈 내로의 삽입이 가능한 DNA 조각, 또는 보다 긴 핵산으로부터 스플라이싱되고, 게놈 내의 또 다른 위치 내로 삽입될 수 있는 DNA 조각이다. 예를 들어 트랜스포손은 전위를 위한 유전자의 측면에 있는 역전 반복체로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
트랜스포손을 이용한 예시적인 핵산 전달 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템(SBTS) 및 피기백(PB) 트랜스포손 시스템을 포함한다. 예를 들어 문헌[Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20]; 문헌[Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971]; 문헌[Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589]; 문헌[Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209]; 문헌[Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166]; 문헌[Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16]; 문헌[Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65]; 및 문헌[Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83]을 참조하는데, 이들 전부는 본 명세서에 참조로 포함된다.
SBTS는 다음의 2가지 구성요소를 포함한다: 1) 이식유전자를 함유하는 트랜스포손 및 2) 트랜스포사아제 효소의 공급원. 트랜스포사아제는 트랜스포손을 운반 플라스미드(또는 다른 공여자 DNA)로부터 표적 DNA, 예컨대 숙주 세포 염색체/게놈으로 전위시킬 수 있다. 예를 들어 트랜스포사아제는 운반 플라스미드/공여자 DNA에 결합하고, 플라스미드로부터 트랜스포손(이식유전자(들) 포함)을 절단하고, 이를 숙주 세포의 게놈 내로 삽입한다. 예를 들어, 위의 문헌[Aronovich et al.] 참조.
예시적인 트랜스포손은 pT2-기반 트랜스포손을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47]; 및 문헌[Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971]을 참조하는데, 이들 전부는 본 명세서에 참조로 포함된다. 예시적인 트랜스포사아제는 Tc1/마리너 유형 트랜스포사아제, 예를 들어 SB10 트랜스포사아제 또는 SB11 트랜스포사아제(예를 들어 사이토메갈로바이러스 프로모터로부터 발현될 수 있는 과다활성 트랜스포사아제)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Aronovich et al.]; 문헌[Kebriaei et al.]; 및 문헌[Grabundzija et al.]을 참조하는데, 이들 전부는 본 명세서에 참조로 포함된다.
SBTS의 사용은 이식유전자, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 CAR을 암호화하는 핵산의 효율적인 통합 및 발현을 허용한다. 예를 들어 트랜스포손 시스템, 예컨대 SBTS를 사용하여 본 명세서에서 기술된 CAR을 안정적으로 발현하는 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 생성하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에서 기술된 방법에 따라, 일부 구현예에서, SBTS 구성요소를 함유하는 하나 이상의 핵산, 예를 들어 플라스미드가 세포(예를 들어 T 또는 NK 세포)에게 전달된다. 예를 들어 핵산(들)은 핵산(예를 들어 플라스미드 DNA) 전달의 표준 방법, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 방법, 예를 들어 전기천공, 형질감염 또는 리포펙션에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산은 이식유전자, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 트랜스포손을 함유한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이식유전자(예를 들어 본 명세서에서 기술된 CAR을 암호화하는 핵산)뿐만 아니라 트랜스포사아제 효소를 암호화하는 핵산 서열도 포함하는 트랜스포손을 함유한다. 다른 구현예에서, 2가지의 핵산을 갖는 시스템, 예를 들어 이중 플라스미드 시스템이 제공되며, 예를 들어 제1 플라스미드는 이식유전자를 포함하는 트랜스포손을 함유하고 제2 플라스미드는 트랜스포사아제 효소를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 예를 들어 제1 및 제2 핵산은 숙주 세포 내로 공동 전달된다.
일부 구현예에서, SBTS를 사용한 유전자 삽입 및 뉴클레아제(예를 들어 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 또는 조작 메가뉴클레아제 재조작된 호밍(homing) 엔도뉴클레아제)를 사용한 유전자 편집의 조합을 사용하는 것에 의해, 본 명세서에서 기술된 CAR을 발현하는 세포, 예를 들어 T 또는 NK 세포가 생성된다.
일부 구현예에서, 비 바이러스 전달 방법의 사용은 세포, 예를 들어 T 또는 NK 세포의 재프로그래밍 및 대상체 내로의 세포의 직접적인 주입을 허용한다. 비 바이러스 벡터의 장점은 환자 집단을 충족시키는데 필요한 충분한 양을 생성하는 것의 용이성 및 상대적으로 낮은 비용, 보관하는 동안의 안정성, 및 면역원성의 결여를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
제조 방법/생산 방법
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법은 세포(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 면역 이펙터 세포) 처치 후 T 세포 고갈제를 투여하고, 이에 의해 CAR 발현 세포(예를 들어 CD19CAR 발현 세포)를 감소시키는(예를 들어 고갈시키는) 단계를 더 포함한다. 이러한 T 세포 고갈제는 독성을 완화하기 위하여 CAR 발현 세포(예를 들어 CD19CAR 발현 세포)를 효과적으로 고갈시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 발현 세포를 본 명세서에서 기술된 방법에 따라 제조하였다. 예를 들어, 본 명세서의 방법에 따라 (예를 들어 형질감염 또는 형질도입 전 또는 후에) 분석하였다.
일부 구현예에서, T 세포 고갈제는 세포, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 면역 이펙터 세포 집단의 투여 1, 2, 3, 4, 또는 5주 후에 투여된다.
일 구현예에서, T 세포 고갈제는 예를 들어 항체 의존적 세포 매개성 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 유도 세포 사멸을 유도하여, CAR 발현 세포를 고갈시키는 작용제이다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 세포 사멸, 예를 들어 ADCC 또는 보체 유도 세포 사멸을 유도할 수 있는 분자에 의해 인식되는 항원(예를 들어, 표적 항원)을 또한 발현할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 항체 또는 항체 단편에 의해 표적화될 수 있는 표적 단백질(예를 들어, 수용체)를 또한 발현할 수 있다. 이러한 표적 단백질의 예는 EpCAM, VEGFR, 인테그린(예를 들어, 엔테그린 ανβ3, α4, αΙ3/4β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원(예를 들어, TRAIL-R1, TRAIL-R2), PDGF 수용체, 인터페론 수용체, 폴레이트 수용체, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, IL-6 수용체, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD11, CD11a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/lgE 수용체, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/바시진, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, 및 EGFR, 및 이들의 절두 버전(예를 들어, 하나 이상의 세포외 에피토프를 보존하지만 세포질 도메인 내에 하나 이상의 영역이 결여된 버전)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, CAR 발현 세포는 CAR 및 표적 단백질을 공동 발현한다. 예를 들어, 표적 단백질을 자연적으로 발현하거나 표적 단백질을 발현하도록 조작된다. 예를 들어, 세포, 예컨대, 면역 이펙터 세포 집단은 CAR 핵산(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CAR 핵산)을 포함하는 핵산(예를 들어, 벡터) 및 표적 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, T 세포 고갈제는 CD52 억제제, 예를 들어, 항-CD52 항체 분자, 예를 들어, 알렘투주무맙이다.
다른 구현예에서, 세포, 예를 들어, 면역 이펙터 세포 집단은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CAR 분자(예를 들어, CD19CAR) 및 T 세포 고갈제에 의해 인식되는 표적 단백질을 발현한다. 일 구현예에서, 표적 단백질은 CD20이다. 구현예들에서, 표적 단백질이 CD20인 경우, T 세포 고갈제는 항-CD20 항체, 예를 들어 리툭시맙이다.
전술된 방법 중 임의의 방법의 추가 구현예에서, 방법은 세포, 예를 들어 조혈 줄기 세포, 또는 골수를 포유류 내로 이식하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 이식 전에 포유류를 조건화하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 포유류에게 CAR 핵산 또는 폴리펩티드, 예를 들어 CD19 CAR 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 이식은 줄기 세포 이식, 예를 들어 조혈 줄기 세포 이식 또는 골수 이식이다. 다른 구현예에서, 세포 이식 전에 대상체를 조건화하는 것은 대상체에서 표적 발현 세포, 예를 들어 CD19 발현 정상 세포 또는 CD19 발현 암 세포의 수를 감소시키는 것을 포함한다.
면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포)의 활성화 및 확장
면역 이펙터 세포, 예컨대 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생성되거나 강화된 T 세포는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0121005호에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
일반적으로, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 조절 세포 고갈 세포의 집단은 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상의 공동 자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 예컨대 표면에 고정된 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성제(예를 들어 브리오스타틴(bryostatin))와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동 자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어 T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송 소재)을 포함하고, 당해 분야에 통상적으로 공지된 다른 방법과 같이 사용될 수 있다(문헌[Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998]; 문헌[Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999]; 문헌[Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999]).
특정 양태에서, T 세포에 대한 일차 자극 신호 및 공동 자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어 각각의 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우에, 작용제는 동일한 표면(즉, "시스" 형태) 또는 개별 표면(즉, "트랜스" 형태)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 한 작용제는 표면에 커플링되고 다른 한 작용제는 용액 중에 존재할 수 있다. 일 양태에서, 공동 자극 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되고, 일차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링된다. 특정 양태에서, 둘 다의 작용제가 용액 중에 존재할 수 있다. 일 양태에서, 작용제는 가용성 형태로 존재하고, 이어서, 표면, 예컨대 Fc 수용체 또는 항체 또는 작용제에 결합할 다른 결합 작용제를 발현하는 세포에 가교될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T 세포를 활성화 및 확장하는데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2004/0101519호 및 제2006/0034810호를 참조한다.
일 양태에서, 2가지의 작용제는 동일한 비드 상에, 즉 "시스"로 또는 개별 비드에, 즉 "트랜스"로 비드 상에 고정된다. 예로서, 일차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 공동 자극 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며; 둘 다의 작용제는 동일한 비드에 동등한 분자량으로 공동 고정된다. 일 양태에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 1:1의 비의 비드에 결합된 각각의 항체가 사용된다. 본 발명의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비는 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록 사용된다. 하나의 특정한 양태에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 일 양태에서, 항-CD3 항체보다 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합된다. 즉, CD23:CD28의 비는 1 미만이다. 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1보다 크다. 하나의 특정한 양태에서, 비드에 결합된 1:100의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 1:75의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 추가의 양태에서, 비드에 결합된 1:50의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 1:30의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 1:10의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 1:3의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 또한 일 양태에서, 비드에 결합된 3:1의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비가 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 당업자가 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 작은 크기의 비드는 오로지 소수의 세포와 결합할 수 있지만, 보다 큰 비드는 많은 세포와 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 범위이고, 추가의 양태에서 이 비는 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하고, 이는 또한 T 세포를 자극하는데 사용될 수 있다. T 세포 자극을 발생시키는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포의 비는 위에 언급된 바와 같이 달라질 수 있지만, 적합한 특정 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 하나의 적합한 비는 적어도 1:1의 입자/T 세포이다. 일 양태에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 하나의 특정한 양태에서, 적합한 입자:세포의 비는 1:5이다. 추가의 양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 일에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 일 양태에서, 입자 대 세포의 비는 제1일에 1:1 내지 10:1이고, 추가의 입자는 이후에 최대 10일 동안 매일 또는 격일로, 1:1 내지 1:10의 최종 비(첨가 일의 세포 수 기준)로 세포에 첨가된다. 하나의 특정한 양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 1:1이고, 자극 제3일 및 제5일에 1:5로 조정된다. 일 양태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 제1일에 1:1, 제3일 및 제5일에 1:5의 최종 비로 첨가된다. 일 양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 2:1이고, 자극 제3일 및 제5일에 1:10으로 조정된다. 일 양태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 제1일에 1:1, 제3일 및 제5일에 1:10의 최종 비로 첨가된다. 당업자라면 다양한 다른 비가 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 비는 입자의 크기 및 세포의 크기 및 유형에 따라 달라질 것이다. 일 양태에서, 사용하기에 가장 전형적인 비는 제1일에 대략 1:1, 2:1 및 3:1이다.
추가적인 양태에서, 세포, 예컨대, T 세포는 작용제-코팅 비드와 조합되고, 비드와 세포는 이후 분리되고, 이어서 세포가 배양된다. 대안적인 양태에서, 배양 전에, 작용제-코팅된 비드 및 세포를 분리하지 않고, 함께 배양한다. 추가의 양태에서, 비드 및 세포는 먼저 힘, 예컨대 자기력을 인가하여 강화함으로써, 세포 표면 마커의 라이게이션을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.
예를 들어 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드(3x28 비드)가 T 세포에 접촉하도록 함으로써 라이게이션될 수 있다. 일 양태에서, 세포(예를 들어 104 내지 109개 T 세포) 및 비드(예를 들어 1:1 비의 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충제, 예를 들어 PBS(2가 양이온, 예컨대, 칼슘 및 마그네슘 미함유) 내에서 조합한다. 다시, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어 표적 세포는 샘플에 매우 드물 수 있고, 단지 샘플의 0.01%만을 이루거나 또는 전체 샘플(즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수가 본 발명의 맥락 내에 있다. 특정 양태에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는(즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 일 양태에서, 약 100억 개 세포/ml, 90억 개/ml, 80억 개/ml, 70억 개/ml, 60억 개/ml, 50억 개/ml 또는 20억 개 세포/ml의 농도가 사용된다. 일 양태에서, 1억 개 세포/ml 초과의 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만, 또는 5000만 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 일 양태에서 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 발생시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 특정 양태에서 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 높은 농도의 세포를 사용하는 것은, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
일 구현예에서, CAR, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 CAR, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 CD19CAR을 암호화하는 핵산이 형질도입된 세포는, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 확장된다. 일 구현예에서, 세포는 수 시간(예를 들어 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21시간) 내지 약 14일(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일)의 기간 동안 배양 중 확장된다. 일 구현예에서, 세포는 4 내지 9일의 기간 동안 확장된다. 일 구현예에서, 세포는 8일 이하, 예를 들어 7, 6 또는 5일의 기간 동안 확장된다. 일 구현예에서, 세포는 5일 동안 배양 중 확장되고, 이에 따른 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 확장된 동일한 세포보다 더 강력하다. 효력은, 예를 들어 다양한 T 세포 기능, 예를 들어 증식, 표적 세포 사멸, 사이토카인 생산, 활성화, 이동, 또는 이들의 조합에 의해 정의될 수 있다. 일 구현예에서, 5일 동안 확장된 세포, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 CD19 CAR 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 확장된 동일한 세포와 비교하여 항원 자극 시 세포 배가의 적어도 1, 2, 3 또는 4배 증가를 보인다. 일 구현예에서, 세포, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 CD19 CAR을 발현하는 세포는 5일 동안 배양 중 확장되고, 이에 따른 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 확장된 동일한 세포와 비교하여 더 높은 전염증성 사이토카인 생산, 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준을 나타낸다. 일 구현예에서, 5일 동안 확장된 세포, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 CD19 CAR 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 확장된 동일한 세포와 비교하여 전염증성 사이토카인 생산(pg/ml), 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10배 이상의 증가를 보인다.
또한, T 세포의 배양 시간이 60일 이상이 될 수 있도록 여러 사이클의 자극이 요구될 수 있다. T 세포 배양을 위해 적절한 조건은 혈청(예를 들어 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 숙련자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존능에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지(예를 들어 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 배지는 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 첨가된, 무혈청이거나 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, 최적화제를 포함할 수 있다. 항생제(예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신)는 실험 배양에만 포함되고, 대상체에 주입되어야 하는 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하는 데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에 유지된다.
일 구현예에서, 세포는, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 방법, 예컨대 유세포 분석법에 의해 측정 시 14일 확장 기간에 걸쳐 적어도 200배(예를 들어 200배, 250배, 300배, 350배)의 세포 증가를 초래하는, 하나 이상의 인터루킨을 포함하는 적절한 배지(예를 들어 본 명세서에서 기술된 배지) 중에서 확장된다. 일 구현예에서, 세포는 IL-15 및/또는 IL-7(예를 들어, IL-15 및 IL-7)의 존재 하에 증식된다.
구현예에서, 본 명세서에서 기술된 방법, 예를 들어 CAR 발현 세포 제조 방법은, 예를 들어 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, IL-2를 사용하여 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포를 제거하는 방법은 본 명세서에 기술되어 있다. 구현예들에서, 방법, 예를 들어, 제조 방법은 세포 집단(예를 들어, CD25+ T 세포와 같은 T 조절 세포가 고갈된 세포 집단; 또는 이전에 항-CD25 항체, 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드와 접촉시킨 세포 집단)을 IL-15 및/또는 IL-7과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포 집단(예를 들어, 항-CD25 항체, 이의 단편, 또는 이전에 CD25-결합 리간드와 접촉시킨 세포 집단)은 IL-15 및/또는 IL-7의 존재 하에 확장된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는, 예를 들어 생체 외에서 CAR 발현 세포의 제조 중에 인터루킨-15(IL-15) 폴리펩티드, 인터루킨-15 수용체 알파(IL-15Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드와 IL-15Ra 폴리펩티드의 조합, 예를 들어, hetIL-15를 포함하는 조성물과 접촉된다. 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는, 예를 들어 생체 외에서 CAR 발현 세포의 제조 중에 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 접촉된다. 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는, 예를 들어 생체 외에서 CAR 발현 세포의 제조 중에 IL-15 폴리펩티드와 IL-15 Ra 폴리펩티드의 조합을 포함하는 조성물과 접촉된다. 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는, 예를 들어 생체 외에서 CAR 발현 세포의 제조 중에 hetIL-15를 포함하는 조성물과 접촉된다.
일 구현예에서 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 생체 외 확장 중에 hetIL-15를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 생체 외 확장 중에 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 생체 외 확장 중에 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일 구현예에서, 접촉은 림프구 하위집단, 예를 들어 CD8+ T 세포의 생존 및 증식을 초래한다.
다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어 전형적인 혈액 또는 분리반출술을 거친 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제자 T 세포 집단(TC, CD8+)보다 더 큰 헬퍼 T 세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극하는 것에 의한 T 세포의 생체 외 확장은 T 세포의 집단을 생성하는데, T 세포의 집단은 제8일~제9일 이전에는 주로 TH 세포로 이루어진 반면, 대략 제8일~제9일 이후에는 T 세포의 집단은 점점 더 큰 TC 세포의 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 따라, 대상체에게 주로 TH 세포로 이루어진 T 세포 집단을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 이와 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 서브세트가 단리되었으면, 이 서브세트를 더 큰 정도로 확장시키는 것이 유리할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커에 더하여, 다른 표현형 마커가 세포 확장 과정 중에 유의하게, 그러나 대부분 재현가능하게 달라진다. 따라서, 그러한 재현가능성은, 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 조정하는 능력을 가능하게 한다.
일단 본 명세서에서 기술된 CAR이 구축되면, 분자의 활성, 예컨대 항원 자극 후 T 세포를 확장시키는 능력, 재자극의 부재 하에서의 T 세포 확장의 지속 능력, 및 적절한 시험관 내 및 동물 모델에서의 항암 활성(이에 한정되지는 않음)을 평가하기 위해 다양한 분석법이 사용될 수 있다. 본 발명의 CAR의 효과를 평가하기 위한 분석법은 아래에 더욱 상세히 기술되어 있다.
1차 T 세포에서 CAR 발현의 웨스턴 블롯 분석은, 예를 들어 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 2015년 3월 13일에 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 695에 기술된 바와 같이 단량체 및 이량체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
항원 자극 후에 CAR+ T 세포의 시험관 내 확장은 유세포 분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 αCD3/αCD28 aAPC로 자극한 후, 분석할 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 형질도입한다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제(PGK) 프로모터를 포함한다. GFP 형광은 유세포 분석법에 의해 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 서브세트에서 배양 제6일에 평가된다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조. 대안적으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자성 비드로 자극하고, 2A 리보솜 스키핑 서열을 사용하여 eGFP와 함께 CAR을 발현하는 2시스트론성 렌티바이러스 벡터를 사용하여 제1 일에 CAR을 이용하여 형질도입한다. 배양물을 세척 후에 본 명세서에서 기술된 암 관련 항원+ K562 세포(본 명세서에서 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 K562), 야생형 K562 세포(K562 야생형) 또는 항CD3 및 항-CD28 항체의 존재 하에 hCD32 및 4-1BBL을 발현하는 K562 세포(K562-BBL-3/28) 중 어느 하나로 재자극한다. 외인성 IL-2를 배양물에 격일로 100 IU/ml로 첨가한다. GFP+ T 세포를 비드 기반 카운팅을 사용하여 유세포 분석법에 의해 카운팅한다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조.
재자극의 부재 하에 지속되는 CAR+ T 세포 확장을 또한 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조. 간략하게, 평균 T 세포 부피(fl)는 배양 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자성 비드를 사용한 자극, 및 제1일에 지시된 CAR을 사용한 형질도입 후에 쿨터 멀티사이저 III(Coulter Multisizer III) 입자 계수기, 넥셀롬 셀로미터 비전(Nexcelom Cellometer Vision) 또는 밀리포어 셉터(Millipore Scepter)를 사용하여 제8일에 측정한다.
또한, 예를 들어 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 2015년 3월 13일에 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 698에 기술된 바와 같이, 동물 모델이 CAR 발현 세포 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
용량 의존성 CAR 치료 반응은, 예를 들어 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 699에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다.
세포 증식 및 사이토카인 생성 평가는, 예를 들어 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 700에 기술된 바와 같이 이전에 기술된 바 있다.
세포독성은, 예를 들어 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 701에 기술된 바와 같은 표준 51Cr-방출 분석법에 의해 평가될 수 있다.
또한, 세포독성은 예를 들어 엑스셀리전스(xCELLigence) 실시간 세포 분석기(RTCA)를 사용하여 부착 세포의 전기 임피던스의 변화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포독성은 다중 시점에서 측정된다.
영상화 기술은, 예를 들어 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 702에 기술된 바와 같이 종양 보유 동물 모델에서 CAR의 특이적 트래픽킹 및 증식을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서의 실시예 섹션에 기술된 것뿐만 아니라 당해 분야에 알려진 것들을 비롯한 다른 분석법도 본 명세서에서 기술된 CAR을 평가하는 데 사용될 수 있다.
대안적으로, 또는 본 명세서에서 개시된 방법과 조합하여, CAR 발현 세포의 검출 및/또는 정량화(예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내(예를 들어, 임상 모니터링)); 면역 세포 확장 및/또는 활성화; 및/또는 CAR 리간드의 사용을 수반하는 CAR 특이적 선택 중 하나 이상을 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 예시적인 일 구현예에서, CAR 리간드는 CAR 분자에 결합하는, 예를 들어 CAR의 세포외 항원 결합 도메인에 결합하는 항체(예를 들어, 항원 결합 도메인에 결합하는 항체, 예를 들어 항유전자형 항체; 또는 세포외 결합 도메인의 불변 영역에 결합하는 항체)이다. 다른 구현예에서, CAR 리간드는 CAR 항원 분자(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CAR 항원 분자)이다.
일 양태에서, CAR 발현 세포를 검출 및/또는 정량화하는 방법이 개시된다. 예를 들어, CAR 리간드는 시험관 내 또는 생체 내에서 CAR 발현 세포를 검출 및/또는 정량화하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 환자에서 CAR 발현 세포의 임상 모니터링, 또는 환자에의 투여). 방법은 다음 단계를 포함한다:
CAR 리간드(선택적으로, 표지화 CAR 리간드, 예를 들어 태그, 비드, 방사성 또는 형광 표지를 포함하는 CAR 리간드)를 제공하는 단계;
CAR 발현 세포를 획득하는 단계(예를 들어, CAR 발현 세포를 함유하는 샘플, 예컨대 제조 샘플 또는 임상 샘플을 획득하는 단계);
CAR 발현 세포를 CAR 리간드와 결합이 일어나는 조건 하에 접촉시켜, 존재하는 CAR 발현 세포의 수준(예를 들어, 양)을 검출하는 단계. CAR 발현 세포와 CAR 리간드의 결합은 FACS, ELISA 등과 같은 표준 기술을 사용하여 검출할 수 있다.
또 다른 양태에서, 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포)를 확장 및/또는 활성화하는 방법이 개시된다. 방법은 다음 단계를 포함한다:
CAR 발현 세포(예를 들어, 제1 CAR 발현 세포 또는 일시적 발현 CAR 세포)를 제공하는 단계;
상기 CAR 발현 세포를 CAR 리간드, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CAR 리간드와 면역 세포 확장 및/또는 증식이 일어나는 조건 하에 접촉시켜, 활성화 및/또는 확장된 세포 집단을 생산하는 단계.
특정 구현예들에서, CAR 리간드가 기질 상에 존재한다(예를 들어, 기질, 예를 들어 비 자연 발생 기질에 고정되거나 부착됨). 일부 구현예에서, 기질은 비 세포 기질이다. 비 세포 기질은 플레이트(예를 들어, 미세적정 플레이트), 막(예를 들어, 니트로셀룰로스 막), 매트릭스, 칩 또는 비드로부터 선택된 고체 지지체일 수 있다. 구현예들에서, CAR 리간드는 기질에 (예를 들어, 기질 표면 상에) 존재한다. CAR 리간드는 기질에 공유적으로 또는 비 공유적으로 고정되거나, 부착되거나, 회합된다(예를 들어 가교된다). 일 구현예에서, CAR 리간드는 비드에 부착된다(예를 들어, 공유적으로 부착된다). 전술된 구현예들에서, 면역 세포 집단은 시험관 내 또는 생체 외에서 확장될 수 있다. 방법은 CAR 분자의 리간드의 존재 하에, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 임의의 방법을 사용하여 면역 세포의 집단을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 세포를 확장 및/또는 활성화하는 방법은 제2 자극 분자, 예를 들어 CD28의 첨가를 더 포함한다. 예를 들어, CAR 리간드 및 제2 자극 분자는 기질, 예를 들어 1개 이상의 비드에 고정되어, 증가된 세포 확장 및/또는 활성화를 제공할 수 있다.
또 다른 양태에서, CAR 발현 세포를 선택 또는 강화하는 방법이 제공된다. 방법은 CAR 발현 세포를 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CAR 리간드와 접촉시키는 단계; 및 CAR 리간드의 결합에 기초하여 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR 발현 세포를 고갈, 감소 및/또는 사멸시키는 방법이 제공된다. 방법은 CAR 발현 세포를 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CAR 리간드와 접촉시키는 단계; 및 CAR 리간드의 결합에 기초하여 세포를 표적화하여, CAR 발현 세포의 수를 감소시키고/감소시키거나 CAR 발현 세포를 사멸시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, CAR 리간드는 독성제(예를 들어, 독소 또는 세포 제거제)에 커플링된다. 또 다른 구현예에서, 항유전자형 항체는 이펙터 세포 활성, 예를 들어 ADCC 또는 ADC 활성을 야기할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 방법에 사용될 수 있는 예시적인 항-CAR 항체가 예를 들어 국제 공개 제2014/190273호 및 문헌[Jena et al., "Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials", PLOS March 2013 8:3 e57838]에 기술되어 있고, 이의 내용은 참조로 포함된다.
일부 양태 및 구현예에서, 본 명세서의 조성물 및 방법은, 예를 들어 2015년 7월 31일에 출원된 미국 일련 번호 제PCT/US2015/043219호에 기술된 바와 같이 T 세포의 특정 서브세트에 대해 최적화되고, 이의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, T 세포의 최적화된 서브세트는 대조군 T 세포, 예를 들어 동일한 구축물을 발현하는 상이한 유형(예를 들어, CD8+ 또는 CD4+)의 T 세포와 비교 시 증진된 지속성을 나타낸다.
일부 구현예에서, CD4+ T 세포는 본 명세서에서 기술된 CAR을 포함하며, 이 CAR은 CD4+ T 세포에 적합한 (예를 들어 CD4+ T 세포에 최적화된, 예를 들어 증진된 지속성으로 이어지는) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 ICOS 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD8+ T 세포는 본 명세서에서 기술된 CAR을 포함하며, 이 CAR은 CD8+ T 세포에 적합한 (예를 들어 CD8+ T 세포에 최적화된, 예를 들어 증진된 지속성으로 이어지는) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB 도메인, CD28 도메인, 또는 ICOS 도메인 이외의 또 다른 공동 자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR은 본 명세서에서 기술된 항원 결합 도메인, 예를 들어 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다.
일 양태에서, 대상체, 예를 들어 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에서 기술된다. 방법은 상기 대상체에게 유효량의
1) CAR을 포함하는 CD4+ T 세포(CARCD4+)로서,
항원 결합 도메인, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 항원 결합 도메인;
막횡단 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 제1 공동 자극 도메인, 예를 들어 ICOS 도메인을 포함하는 CARCD4+; 및
2) CAR을 포함하는 CD8+ T 세포(CARCD8+)로서,
항원 결합 도메인, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 항원 결합 도메인;
막횡단 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 제2 공동 자극 도메인, 예를 들어 4-1BB 도메인, CD28 도메인, 또는 ICOS 도메인 이외의 또 다른 공동 자극 도메인을 포함하는 CARCD8+;
을 투여하는 단계를 포함하며,
CARCD4+ 및 CARCD8+은 서로 상이하다.
선택적으로, 방법은
3) CAR을 포함하는 제2 CD8+ T 세포(제2 CARCD8+)로서,
항원 결합 도메인, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 항원 결합 도메인;
막횡단 도메인; 및
세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CARCD8+을 투여하는 단계를 더 포함하며, 제2 CARCD8+은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CARCD8+ 상에 존재하지 않는 공동 자극 신호전달 도메인을 포함하고, 선택적으로 ICOS 신호전달 도메인은 포함하지 않는다.
생체중합체 전달 방법
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 바와 같은 하나 이상의 CAR 발현 세포는 생체중합체 스캐폴드, 예를 들어 생체중합체 임플란트를 통해 대상체에게 투여되거나 전달될 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포의 전달, 확장, 및/또는 분산을 지지하거나 증진시킬 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 자연 발생적 또는 합성적일 수 있는 생체적합성(예를 들어 염증 또는 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않음) 및/또는 생체분해성 중합체를 포함한다. 예시적인 생체중합체는, 예를 들어 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 2015년 3월 13일에 출원된 국제 공개 제2015/142675호의 단락 1004~1006에 기술되어 있다.
제약 조성물 및 치료
일부 양태에서, 본 개시는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 생산된 CAR 발현 세포를, 선택적으로 1종 이상의 다른 요법과 조합하여 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CAR 발현 세포를 포함하는 반응 혼합물을, 선택적으로 1종 이상의 다른 요법과 조합하여 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CAR 발현 세포를 포함하는 반응 혼합물을 운송 또는 수신하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 생산된 CAR 발현 세포를 수신하는 단계를 포함하고, 환자에게 CAR 발현 세포를, 선택적으로 1종 이상의 다른 요법과 조합하여 투여하는 단계를 더 포함하는, 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 CAR 발현 세포를 본 명세서에서 기술된 바와 같이 생산하는 단계를 포함하고, 환자에게 CAR 발현 세포를, 선택적으로 1종 이상의 다른 요법과 조합하여 투여하는 단계를 더 포함하는, 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 요법은, 예를 들어 암 요법, 예컨대 화학요법일 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR을 발현하는 세포는 Treg 세포 집단을 감소시키는 분자와 조합되어 대상체에게 투여된다. Treg 세포의 수를 감소시키는(예를 들어 고갈시키는) 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 CD25 고갈, 시클로포스파미드 투여, GITR 기능 조정을 포함한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 분리반출술 전 또는 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포의 투여 전에 대상체에서 Treg 세포의 수를 감소시키는 것은 종양 미세환경에서 원치 않는 면역 세포(예를 들어 Treg)의 수를 감소시키고 대상체의 재발 위험을 감소시키는 것으로 여겨진다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 요법, 예를 들어 CAR 발현 세포는 GITR을 표적화하고/표적화하거나 GITR 기능을 조정하는 분자, 예컨대 조절 T 세포(Treg)를 고갈시키는 GITR 효능제 및/또는 GITR 항체와 조합되어 대상체에게 투여된다. 구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 CAR을 발현하는 세포는 시클로포스파미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 일 구현예에서, GITR 결합 분자 및/또는 GITR 기능을 조정하는 분자(예를 들어 GITR 효능제 및/또는 Treg 고갈 GITR 항체)는 CAR 발현 세포 전에 투여된다. 예를 들어 일 구현예에서, GITR 효능제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다.　구현예들에서, 시클로포스파미드는 CAR 발현 세포의 투여(예를 들어, 주입 또는 재주입) 전에 또는 세포의 분리반출술 전에 대상체에게 투여된다. 구현예들에서, 시클로포스파미드 및 항-GITR 항체는 CAR 발현 세포의 투여(예를 들어, 주입 또는 재주입) 전에 또는 세포의 분리반출술 전에 대상체에게 투여된다. 일 구현예에서, 대상체는 암(예를 들어, 고형 암 또는 혈액암, 예컨대 ALL 또는 CLL)을 앓는다. 일 구현예에서, 대상체는 CLL을 앓는다. 구현예들에서, 대상체는 ALL을 앓는다. 구현예들에서, 대상체는 고형 암, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 고형 암을 앓는다. 예시적인 GITR 효능제는 예를 들어 GITR 융합 단백질 및 항-GITR 항체(예를 들어, 2가 항-GITR 항체), 예를 들어, 미국 특허 제 6,111,090호, 유럽 특허 제 090505B1호, 미국 특허 제 8,586,023호, 국제 공개 제 2010/003118호 및 제2011/090754호에 기술된 GITR 융합 단백질, 또는 예를 들어, 미국 특허 제 7,025,962호, 유럽 특허 제 1947183B1호, 미국 특허 제 7,812,135호, 미국 특허 제 8,388,967호, 미국 특허 제 8,591,886호, 유럽 특허 제 1866339호, 국제 공개 제 2011/028683호, 국제 공개 제 2013/039954호, 국제 공개 제 2005/007190호, 국제 공개 제 2007/133822호, 국제 공개 제 2005/055808호, 국제 공개 제 1999/40196호, 국제 공개 제 2001/03720호, 국제 공개 제 1999/20758호, 국제 공개 제 2006/083289호, 국제 공개 제 2005/115451호, 미국 특허 제 7,618,632호 및 국제 공개 제 2011/051726호에 기술된 항-GITR 항체를 포함한다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포는 GITR 효능제, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 GITR 효능제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 일 구현예에서, GITR 효능제는 CAR 발현 세포 이전에 투여된다. 예를 들어 일 구현예에서, GITR 효능제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 대상체는 CLL을 앓는다.
본 명세서에서 기술된 방법은 CAR 발현 세포를 제약 조성물에 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제약 조성물은, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CAR 발현 세포, 예를 들어 복수의 CAR 발현 세포를 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트(예를 들어 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 조성물은 예를 들어, 정맥 내 투여를 위하여, 제형화될 수 있다.
일 구현예에서, 제약 조성물은 예를 들어 내독소, 미코플라스마, 복제 적격 렌티바이러스(RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 코팅 비드, 마우스 항체, 풀링된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택된 오염물이 실질적으로 없고, 예를 들어 검출 가능한 수준의 오염물이 없다. 일 구현예에서, 박테리아는 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 군 A로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1가지이다.
"면역학적 유효량", "항암 유효량", "암 억제 유효량", 또는 "치료량"이 표시되는 경우에, 투여할 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자(대상체)의 상태에서의 개별 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 일반적으로 본 명세서에서 기술된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 포함하는 제약 조성물은, 예를 들어 104 내지 109개 세포/kg(체중), 일부 경우에, 105 내지 106개 세포/kg(체중)(이러한 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있음이 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 다회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에 통상적으로 알려져 있는 주입 기술을 사용함으로써 투여될 수 있다(예를 들어 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 또는 5 x 108개 세포/kg을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 적어도 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 또는 5 x 108개 세포/kg을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 최대 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 또는 5 x 108개 세포/kg을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 약 1.1 x 106 내지 1.8 x 107개 세포/kg을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 적어도 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 최대 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개 세포를 포함한다.
특정 양태에서, 활성화된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 대상체에게 투여한 후, 후속적으로 혈액을 재채취하고 (또는 분리반출술을 수행하고), 그로부터의 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 활성화하고, 환자에게 이들 활성화되고 확장된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 과정은 수 주마다 다회 실시될 수 있다. 특정 양태에서, 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 10 cc 내지 400 cc의 혈액 채취물로부터 활성화될 수 있다. 특정 양태에서, 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc 또는 100 cc의 혈액 채취물로부터 활성화된다.
대상 조성물의 투여는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 조성물은 경동맥으로, 피하로, 피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내로, 근육내로, 정맥내(i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로, 예를 들어, 피내 또는 피하 주사에 의해, 환자에게 투여될 수 있다. 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에서 개시된 구현예의 실례는 본 명세서에서 참조에 의해 명백하게 포함되는 2016년 12월 27일 출원된 국제 공개 제2007/117112호의 페이지 204~219의 실시예 1 내지 10(상기 실시예와 관련된 도면 및 도면 범례를 포함)에 기술되어 있다.
예시적인 당 분해 억제제
일부 구현예에서, 당 분해는 당 분해 억제제, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 소분자의 당 분해 억제제로 억제, 예컨대, 억압될 수 있다. 일부 구현예에서, 당 분해 억제제는 헥소키나제(HK) 억제제, 미토콘드리아 헥소키나제 2(HK2) 억제제, 포스포프룩토스키나제 2(PKF2) 억제제, 포스포글리세레이트 뮤타제(PGAM1) 억제제, 및 피루브산 키나제 2(PKM2) 억제제, 피루브산 탈수소효소 A(LDHA) 억제제, 글루코스-6-인산염 탈수소효소(G6PD) 억제제, 트랜스케톨라아제 유사 1(TKTL1) 억제제, 또는 표 5에 개시된 억제제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제는 다음으로부터 선택된다: 2-데옥시-D-글루코스(2-DG), 3-브로모피루브산(3-BP), 로니다민, (2E)-3-(3-피리디닐)-1-(4-피리디닐)-2-프로펜-1-온(3PO), N4A, YZ9, PGMI-004A, MJE3, TT-23, 시코닌/알칸닌, FX11, 퀴놀린 3-설폰아미드, 디클로로아세트산염(DCA), 6-아미노니코틴아미드(6-AN), 또는 옥시티아민.
일부 구현예에서, 당 분해 억제제는 2-DG이다. 2-데옥시-D-만노스 또는 2-데옥시-D-아라비노-헥소스로도 알려져 있는 2-DG는 글루코스 유사체로, 예를 들어, 글루코스 대사의 경쟁적 억제제로서 작용한다. 2-DG는 화학명이 (4R,5S,6R)-6-(하이드록시메틸)옥산-2,4,5-트리올이고, 다음의 화학 구조를 갖는다:
Figure pct00038
화학 구조
MW: 164.16
Figure pct00039
예시적인 당 분해 억제제는 문헌[Qian Y, et al., (2014) World J Transl Med; 3(2): 37-57]에 개시되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 명세서에서 참조로 포함된다.
구현예들에서, 본 명세서에서 개시된 방법, 반응 혼합물 또는 조성물은 0.5 내지 20 mM, 1 내지 10 mM, 또는 1.5 내지 2.5 mM의 농도의 2-DG를 포함한다. 일부 구현예에서, 2-DG의 농도는 적어도 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 또는 2.5 mM이다. 다른 구현예에서 2-DG의 농도는 2 mM이다.
본 명세서에서 개시된 임의의 방법, 반응 혼합물, 또는 조성물의 구현예들에서, CAR 발현 면역 이펙터 세포 집단은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 44, 48, 52, 60, 70, 80, 90, 100시간 이상(예를 들어 최대 약 2 또는 3주) 동안 2-DG, 예를 들어, 1 mM의 2-DG와 접촉된다. 일부 구현예에서, CAR 발현 면역 이펙터 세포 집단은 적어도 48시간 동안 2-DG, 예를 들어, 2 mM의 2-DG와 접촉된다.
2-DG를 이용한 당 분해의 억제는 예를 들어, 문헌[Huang CC et al., (2015) Disease Models & Mechanisms 8: 1247-1254]에 개시되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 명세서에서 참조로 포함된다.
Stat3 활성제 및 Stat3 분자
본 명세서에서 개시된 임의의 방법, 용도, 또는 반응 혼합물의 구현예에서, Stat3 활성제는 다음을 포함한다:
i) gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체, 또는 IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자, OSM 분자;
ii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 가용성 IL-6 수용체(sIL-6R);
iii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-6/IL-6R 복합체, 예컨대, 이량체;
iv) IL-6 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, IL-31 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자 또는 OSM 분자);
v) CCL20 분자;
vi) IL-10R2 수용체(IL-10R2) 활성제, 예컨대, IL-10 분자, IL-22 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자, IL-29 분자, 또는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-10R2에 결합하는 항체 분자;
vii) IL-10 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-10 분자, IL-19 분자, IL-20 분자, IL-22 분자, IL-24 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자 또는 IL-29 분자);
viii) IL-17 패밀리 사이토카인(예컨대, IL17A 분자, IL17B 분자, IL17C 분자, IL17D 분자, IL17E 분자 또는 IL17F 분자); 또는
ix) IL-23 분자.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체이다.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 가용성 IL-6 수용체(sIL-6R)이다.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 IL-6/IL-6R 복합체, 예컨대, 이량체, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 이량체이다.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 IL-6 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, IL-31 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자 또는 OSM 분자)이다.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 CCL20 분자이다.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 IL-10R2 수용체(IL-10R2) 활성제, 예컨대, IL-10 분자, IL-22 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자, IL-29 분자, 또는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-10R2에 결합하는 항체 분자이다.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 IL-17 패밀리 사이토카인(예컨대, IL17A 분자, IL17B 분자, IL17C 분자, IL17D 분자, IL17E 분자 또는 IL17F 분자)이다.
일부 구현예에서, Stat3 저해제는 IL-23 분자이다.
본 명세서에서 개시된 임의의 방법, 용도, 또는 반응 혼합물의 구현예들에서, Stat3 분자는 서열번호 1000의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Stat3 분자는 서열번호 1000의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 Stat3 분자는 서열번호 1001의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Stat3 분자는 서열번호 1001의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1001의 뉴클레오티드 241 내지 2553에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 세포, 예를 들어, CAR 발현 세포는 서열번호 1001의 서열, 또는 서열번호 1001의 뉴클레오티드 241 내지 2553을 포함하는 핵산 서열, 예를 들어, 이식유전자를 포함한다.
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 Stat3 분자는 Stat3 폴리펩티드, 예를 들어, 야생형 Stat3 또는 구성적 활성 Stat3 폴리펩티드, 예를 들어, STAT3C이다. Stat3의 구성적 형태는 Stat3 유전자의 Stat3-C 돌연변이체 형태에 의해 암호화된다. Stat3-C에서 Stat3의 SH2 도메인의 C 말단 로프 내의 두 개의 시스테인 잔기의 치환은 자발적으로 이량체화하여, DNA에 결합하고, 전사를 활성화하여 구성적 활성 분자를 발생시키는 분자를 생성한다(문헌[Bromberg et al., (1999) Cell 98:295-303]).
본 명세서에서 개시된 임의의 방법, 용도, 또는 반응 혼합물의 구현예들에서, IL-6 분자는 서열번호 1002의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-6 분자는 서열번호 1002의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 IL-6 분자는 서열번호 1003의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, IL-6 분자는 서열번호 1003의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1003의 뉴클레오티드 122 내지 760에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 세포, 예를 들어, CAR 발현 세포는 서열번호 1003의 서열, 또는 서열번호 1003의 뉴클레오티드 122 내지 760을 포함하는 핵산 서열, 예를 들어, 이식유전자를 포함한다.
Figure pct00043
Figure pct00044
본 명세서에서 개시된 임의의 방법, 용도, 또는 반응 혼합물의 구현예들에서, gp130 분자는 서열번호 1004의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, gp130 분자는 서열번호 1004의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 gp130 분자는 서열번호 1005의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, gp130 분자는 서열번호 1005의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1005의 뉴클레오티드 113 내지 2869에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 세포, 예를 들어, CAR 발현 세포는 서열번호 1005의 서열, 또는 서열번호 1005의 뉴클레오티드 113 내지 2869을 포함하는 핵산 서열, 예를 들어, 이식유전자를 포함한다.
Figure pct00045
Figure pct00046
항-gp130 항체
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체이다.
또한, 항-gp130 항체 분자가 본 명세서에서 개시된다. 항-gp130 항체 분자는 예를 들어, 문헌[Gu Z.J. et al., Leukemia (2000) 14:188-197]에 개시되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 명세서에서 참조로 포함된다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법, 용도, 또는 반응 혼합물의 구현예들에서, 항-gp130 항체 분자는 B-S12 항-gp130 항체 또는 B-P8 항-gp130 항체, 또는 B-S12 및 B-P8 항체를 포함한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 일부 구현예에서, B-S12 및/또는 B-P8 항체 분자는 gp130의 이량체화를 초래하는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 항-gp130 항체는 다음 특징 중 1, 2, 3, 4개 이상(예를 들어, 전부)을 갖는다:
i) STAT1, STAT3, ERK1 또는 ERK2의 인산화에 의해 측정 시, gp130 매개성 신호전달을 유도하거나;
ii) IL-6 억제제, 예를 들어 Sttatic, 또는 본 명세서에서 기술된 억제제에 의해 억제되지 않거나;
iii) 골수종 세포주의 성장을 촉진하거나;
iv) 1차 골수종 세포의 생존을 지지하거나;
v) 이량체화, 예컨대, gp130의 동종이량체화, 또는 gp130의, 예컨대, LIF, OSM 또는 CNTF와의 이종이량체화를 유도한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 gp130 항체 분자는 B-S12 또는 B-P8로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR을 갖는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CDR은 초티아, 카바트 또는 이의 조합에 따라 정의된다.
일부 구현예에서, gp130 항체 분자는 B-S12로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, gp130 항체 분자는 B-S12의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, gp130 항체 분자는 B-S12의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, gp130 항체 분자는 B-S12의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3) 중 하나 이상 및 B-S12의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3) 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, gp130 항체 분자는 B-P8로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, gp130 항체 분자는 B-P8의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, gp130 항체 분자는 B-P8의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, gp130 항체 분자는 B-P8의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3) 중 하나 이상 및 B-P8의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3) 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, gp130 항체, 예컨대, B-S12 또는 B-P8 항체 분자는 적어도 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2 ug/ml, 및 선택적으로 최대 약 2 ug/ml, 예컨대, 약 1 ug/ml의 양으로 제공된다. 일부 구현예에서, gp130 항체, 예컨대, B-S12 또는 B-P8 항체 분자는 1 ug/ml의 양으로 제공된다.
일부 구현예에서, 항-gp130 항체 분자는 제1 및 제2 항-gp130 항체 분자, 예컨대, B-S12 및 B-P8 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, B-S12 및 B-P8 항체 분자는 약 1:1의 비로 제공된다. 일부 구현예에서, B-S12 및 B-P8 항체는 0.1 내지 1000, 0.5 내지 500, 또는 1 내지 100 ug/ml의 조합된 양으로 제공된다. 일부 구현예에서, B-S12 및 B-P8 항체 분자는 각각 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2 ug/ml, 및 선택적으로 최대 약 2 ug/ml, 예컨대, 각각 약 0.5 ug/ml의 양으로 제공된다. 일부 구현예에서, B-S12 및 B-P8 항체 분자는 각각 0.5 ug/ml의 양으로 제공된다.
일부 구현예에서, Stat3 활성제는 gp130, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체에 결합하는 항체 분자이다.
일부 구현예에서, 제조 방법, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 바와 같은, 예를 들어, 제조 방법은 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포가 강화된(예컨대, 수준이 증가된) T 세포, 예컨대, CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 집단을 초래한다.
일부 구현예에서, 방법은 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CD4+ 또는 CD8+ 초기 기억 T 세포의 강화를 초래한다. 일부 구현예에서, 초기 기억 T 세포는 다음 특성 중 하나 또는 둘 다를 갖는다: CD27+ 및/또는 CD45RO dim/neg, 예컨대, CD27+ CD45RO dim/neg. 일부 구현예에서, 방법은 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CD4+ 또는 CD8+ 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화를 초래한다.
일부 구현예에서, 방법은 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CD4+ 또는 CD8+ 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화를 초래한다. 일부 구현예에서, 비 소진 초기 기억 T 세포는 다음 특성 중 하나 이상, 예컨대, 전부를 갖는다: (i) PD-1 음성; (ii) CD27hi; (iii) CCR7hi; 또는 (iv) CD45ROdim/neg. 일부 구현예에서, 비 소진 초기 기억 T 세포는 PD-1 음성 CD27hi CCR7hi CD45ROdim/neg이다.
일부 구현예에서, T 세포, 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화된 집단은, 증가된 수준의, 예컨대, 적어도 5~90% 더 많은(예컨대, 적어도 5~10, 10~20, 20~30, 30~50, 50~70, 또는 70~90% 더 많은, 또는 적어도 5~90, 10~85, 15~80, 20~75, 25~70, 30~70, 35~65, 40~60, 또는 45~55% 더 많은) 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포, 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화된 집단은 증가된 수준의, 예컨대, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30% 더 많은), 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포를 갖는다.
일부 구현예에서, 증가된 수준의 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포는 예컨대, 실시예 2에서 기술된 바와 같은, Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단과 비교된다. 일부 구현예에서, Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단은 예컨대, 실시예 2에서 기술된 바와 같은, 예컨대, 강화가 수행된, 동일한 T 세포의 집단, 예컨대, 강화 전 집단, 예컨대, 출발 집단이다. 일부 구현예에서, Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단은 상이한 T 세포의 집단, 예컨대, 강화가 수행되지 않은 집단이다.
일부 구현예에서, CD4+ T 세포, 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화된 집단은 Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단과 비교하여 증가된 수준의, 예컨대, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20% 더 많은(예컨대, 적어도 8% 더 많은), 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포를 갖는다.
일부 구현예에서, CD8+ T 세포, 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화된 집단은 Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단과 비교하여 증가된 수준의, 예컨대, 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30% 더 많은(예컨대, 적어도 20% 더 많은), 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포를 갖는다.
실시예
본 발명은 다음의 실험 실시예를 참조하여 추가로 상세히 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 달리 명시되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 어떠한 방식으로도 다음의 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되고, 대신에 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 분명해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: CTL019 세포의 당 분해 대사
적어도 1회 용량의 CD19 유도된 CAR T 세포를 투여 받은, 진행된, 고도로 사전 처치된 고위험의 CLL 환자 41명으로부터의 CAR T 세포 샘플의 대사 변화를 평가하였다.
결과
부분 반응(PR) 또는 무반응(NR)을 나타낸 환자들로부터의 CAR T 세포는 당 분해 유전자 서명을 보여주었다. 후향적 세포 주입 생성물 샘플의 CAR 특이적 자극은 당 분해 및 글루코스 유사체의 흡수를 증가시켰고(도 2), 이는 CLL 환자 T 세포가 합성 CAR의 라이게이션에 의한 대사 조정을 거칠 수 있다는 증거를 제공한다. CR/PRTD(부분 반응, 수혈 의존적) 환자와 비교하여 PR/NR로부터의 CAR 자극된 T 세포는 더 많은 글루코스 유사체의 흡수를 보여주었으며(도 3), 이는 이들 세포의 전사 프로파일과 일치한다(도 1a 내지 도 1d). 또한, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)를 이용한 당 분해 차단은 이펙터 분화를 감소시켰고, 중심 기억 표현형을 갖는 CAR T 세포의 빈도를 증가시켰다(도 4 및 도 5).
당 분해의 약리학적 억제는 CD19 발현 종양 세포로의 재자극 후 증진된 증식 능력을 갖는 기억 CTL019 림프구의 형성을 부수적으로 촉진시켰다(도 6). 이러한 결과는 CR 및 PRTD 환자로부터 생성된 T 세포가 강력한 항종양 효능뿐만 아니라 지속성의 특성을 부여할 수 있는 유전자 발현 프로파일을 나타내고, 당 분해 대사를 감소시키는 것이 CAR T 세포 효능을 증진시키기 위한 실행 가능한 세포 제조의 개선을 나타낼 수 있음을 나타낸다.
이 실시예에서 기술된 결과는, 종양 제어 중재를 담당하는 기계적으로 관련된 하위집단의 절대적인 수가 크거나 상대적인 존재도가 큰 배양물을 선택하고/선택하거나, 이러한 하위집단의 절대적인 수가 크거나 상대적인 존재도가 큰 쪽으로 림프구 집단(CAR+ T 림프구 집단 포함)을 편향되게 하는 제조 조건을 제공함으로써, 입양 이식된 T 림프구의 치료 효능을 증가시키는 것의 잠재적인 유용성을 분명히 보여준다. 또한, 최적의 분화 잠재력뿐만 아니라 이펙터 활성을 갖는 CAR T 세포 주입 생성물의 생성은, 배양에서의 시간의 최소화, 대안적인 사이토카인의 사용, 및 대사 공학에 의해 달성될 수 있다.
재료 및 방법
벡터 생성, T 세포 단리 및 CTL019 세포의 생성
4-1BB/CD3ζ 도메인이 있는 CD19 특이적 CAR을 암호화하는 이식유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터(GeMCRIS0607-793)를 구축하고, 생산하였다. 자가 T 세포를 백혈구 분리반출술에 의해 수집하고 항-CD3 및 항-CD28 단클론 항체로 코팅된 임상 등급의 상자성 폴리스티렌 비드로 활성화시킨 후, 위의 렌티바이러스 벡터를 이용하여 형질도입시켰다. CAR 형질도입된 T 세포를 9 내지 11일 동안 생체 외에서 확장시켰다. 대규모의 CTL019 세포 배양 중에 절대적인 세포 수를 쿨터 계수기(Beckman Coulter)를 이용하여 획득하였다. 집단 배가를 등식 At = A02n을 사용하여 계산하였으며, 여기서, n은 집단 배가의 수이며, A0은 투입 세포 수이며, At는 총 세포 수이다.
유세포 분석법
6개의 파라미터의 Accuri C6 유세포 분석기(BD Biosciences)로 이전에 기술된 바와 같이 CTL019 세포의 확장 및 지속성뿐만 아니라, 말초 B-CLL 부담의 통상적인 종적인 측정을 수행하였다. T 세포의 깊은 면역표현형 분석을 위하여, PBMC 또는 CTL019 주입 생성물(벌크 T 세포 또는 형광 활성화 세포 분류에 의해 정제된 특정한 서브세트)을 아쿠아 블루 사멸 세포 배제 염료(Invitrogen)와 사전 인큐베이션한 후, 상업적으로 이용 가능한 유세포 분석 항체로 표면 염색을 수행하였다. CAR19 단백질 발현을 Alexa Fluor 647 접합 항유전자형 단클론 항체를 사용하여 검출하였다. 이 연구에 사용된 모든 항체를 사용하기 전에 적정하고, 양성 사건에 대한 게이트를 설정하기 위해 각 항체 패널에 대해 형광-1(FMO) 대조군을 생성하였다. 맞춤형 17색, 19파라미터 특별 주문 LSRFortessa(BD Biosciences)에서 세포를 획득하였다. FlowJo 소프트웨어(TreeStar)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
CLL 환자 CAR T 세포에 의한 글루코스 흡수 측정
후향적 CLL 환자 CTL019 세포를 해동시키고, 24-웰 조직 배양 플레이트(BD Biosciences)에서 1 x 106개 세포/ml로 휴식시킨 후, 항유전자형 항체가 코팅된 비드로 밤새 자극시켜 동족 CD19 항원에 의한 항-CD19BBζ CAR의 유발을 재현시켰다. 유사하게 접합된 이소형 항체가 코팅된 비드를 모의 대조군으로 사용하였다. 각 환자 주입 생성물의 형질도입 효율에 따라 3 비드:1 세포의 비로 비드를 첨가하였다. 효소 진단 키트는 제조사(Sigma)의 설명에 따라 사용하였다. 이 대사산물의 농도 범위에서 생성된 신호를 사용하여 표준 곡선을 구축하였다. 모의 자극 및 CAR 자극 T 세포로부터의 세포 상청액을 수집하여 기기에 적용하였다. 밤새 자극한 후, 세포를 세척하고 새로운 RPMI를 다시 공급하고, 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일) 아미노]-2-데옥시-D-글루코스(2-NBDG; Sigma Aldrich)를 500 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 2-NBDG와 30분 인큐베이션한 후, 세포를 얼음 위에 놓고 유세포 분석법을 위해 염색하여 형광 표지된 글루코스 유사체를 흡수한 CAR+ T 세포를 검출하였다.
CAR T 세포의 대사 조정
당 분해 억제제 2-데옥시글루코스(2-DG; Sigma-Aldrich)의 존재 또는 부재 하에 항-CD19BBζ CAR T 세포를 생성하였다. 9일의 배양 후, 이 세포의 분화 표현형을 유세포 분석법으로 결정하였다. CAR+ T-세포를 FACSAria II 세포 분류기(BD Biosciences) 상에서 분류하고, CD19를 발현하도록 조작된, 조사된 K562 세포와 1:1로 조합하였다. CTL019세포를 K562-CD19 표적으로 3회 재자극시켰다. 증식 분석 중에, 절대적인 세포 수를 Luna 자동화 세포 분류기(Logos Biosystems)를 이용하여 획득하였다.
실시예 2: CD19 발현 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포에서의 STAT3 경로 활성화
적어도 1회 용량의 CD19 유도된 CAR T 세포를 투여 받은, 진행된, 고도로 사전 처치된 고위험의 CLL 환자로부터의 CAR T 세포 샘플의 STAT3 경로 활성화를 평가하였다.
재료 및 방법
환자 샘플
펜실베이니아 대학교의 임상연구 심의위원회(IRB)가 승인한 단일 작용제 CTL019 요법의 임상 시험에 등록된 CLL 환자로부터 샘플을 얻었다. 헬싱키 선언 및 ICH-GCP(International Conference on Harmonization Guidelines for Good Clinical Practice)에 따라 모든 참가자는 서면 동의서를 제공하였다. 이들 연구는 ClinicalTrials.gov에 등록되어 있다(식별자: NCT01029366, NCT01747486 및 NCT02640209).
벡터 생성, T 세포 단리 및 CTL019 세포의 생성
4-1BB/CD3ζ 도메인이 있는 CD19 특이적 CAR을 암호화하는 이식유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터(GeMCRIS 377 0607-793)를 구축하고, 생산하였다. 자가 T 세포를 백혈구 분리반출술에 의해 수집하고 항-CD3 및 항-CD28 단클론 항체로 코팅된 임상 등급의 상자성 폴리스티렌 비드로 활성화시킨 후, 위의 렌티바이러스 벡터를 이용하여 형질도입시켰다. CAR 형질도입된 T 세포를 9 내지 11일 동안 생체 외에서 확장시켰다. 대규모의 CTL019 세포 배양 중에 절대적인 세포 수를 쿨터 계수기(Beckman Coulter)를 이용하여 획득하였다. 집단 배가를 등식 At = A02n을 사용하여 계산하였으며, 여기서, n은 집단 배가의 수이며, A0은 투입 세포 수이며, At는 총 세포 수이다.
CAR T 세포에서 pSTAT3 및 STAT3 차단 측정
CLL 환자 주입 생성물로부터의 CTL019 세포를 해동시키고, 항유전자형 항체가 코팅된 비드 또는 모의 비드로 자극시켰다. 일부 실험을 위하여, 세포를 10분 동안 10 ng/ml의 최종 농도의 재조합 인간 IL-6(Miltenyi Biotec.)으로 자극시켰다. 세포 서브세트 평가 실험에서는, 관심 집단을 표면 마커에 대해 염색하고, IL-6으로의 급성 자극 전에 FACSAria II 세포 분류기(BD Biosciences)에서 분류하였다. 자극 후, 세포를 37℃에서 12분 동안 Phosflow 용해/고정 완충제(BD Biosciences)로 고정시키고, Phosflow Perm 완충제 III(BD Biosciences)을 이용하여 30분 동안 얼음에서 투과시켰다. 제조사가 권고한 농도의 항-STAT3(pY705) 항체(BD Biosciences)를 이용하여 실온에서 60분 동안 세포 내 염색을 수행하였다. 샘플을 LSRFortessa(BD)에서 즉시 획득하였다. 최종 농도 5 μM의 STAT3 특이적 억제제인 Stattic(Selleckchem)의 존재 또는 부재 하에 항-CD19BBζ CAR T 세포를 생성하여 STAT3 경로 차단을 수행하였다. 동량의 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 음성 비히클 단독 대조군으로 작용하였다. 위에 기술된 바와 같이 Phosflow 염색에 의해 Stattic이 STAT3 신호전달을 억제하는 능력을 평가하였다. 또한, 위에 기술된 바와 같이 분류된 CAR T 세포와 조사된 K562-CD19 세포를 이용한 연속 재자극 분석을 수행하였다. Luna 자동화 세포 계수기(Logos Biosystems)를 이용한 CAR T 세포 확장 과정에서 절대적인 세포 수와 생존율을 동시에 측정하였다.
사이토카인 분석
위에 기술된 바와 같이 CTL019 생성물을 항유전자형 항체가 코팅된 비드 또는 이소형 대조군 항체가 코팅된 비드와 함께 밤새 배양하고, 상청액을 수집하였다. 원심분리에 의해 기준선 및 CTL019 처리 후 정의된 시점에서의 환자의 전혈에서 혈청을 분리하였다. 이러한 샘플을 1회용 분취액으로 분배하고, -80℃에 보관하였다. 제조사(Life Technologies)의 설명에 따라 Luminex 비드 어레이 플랫폼을 이용하여 위의 배양 상청액 및 혈청 샘플에서 사이토카인 측정을 수행하였다. 모든 샘플을 3회 반복하여 분석하고, 9점 표준 곡선을 사용하여 다수의 내부 표준물질과 비교하였다. FlexMAP-3D 시스템(Luminex Corp.)에서 데이터를 수집하고 XPonent 4.0 소프트웨어와 5개 파라미터 로지스틱 회귀 분석7을 사용하여 분석을 수행하였다.
유세포 분석법
6개의 파라미터의 Accuri C6 유세포 분석기(BD Biosciences)로 이전에 기술된 바와 같이 CTL019 세포의 확장 435 및 지속성뿐만 아니라, 말초 B-CLL 부담의 통상적인 종적인 측정을 수행하였다. T 세포의 깊은 면역표현형 분석을 위하여, PBMC 또는 CTL019 주입 생성물(벌크 T 세포 또는 형광 활성화 세포 분류에 의해 정제된 특정한 서브세트)을 아쿠아 블루 사멸 세포 배제 염료(Invitrogen)와 사전 인큐베이션한 후, 상업적으로 이용 가능한 유세포 분석 항체로 표면 염색을 수행하였다. CAR19 단백질 발현을 Alexa Fluor 647 접합 항유전자형 단클론 항체를 사용하여 검출하였다. 이 연구에 사용된 모든 항체를 사용하기 전에 적정하고, 양성 사건에 대한 게이트를 설정하기 위해 각 항체 패널에 대해 형광-1(FMO) 대조군을 생성하였다. 맞춤형 17색, 19파라미터 특별 주문 LSRFortessa(BD Biosciences)에서 세포를 획득하였다. FlowJo 소프트웨어(TreeStar)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
CAR 자극 후 CR, PRTD, PR 및 NR 환자 주입 생성물로부터 유래된 CTL019 세포로부터 생성된 사이토카인 및 케모카인의 프로파일을 평가하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, CR 및 PRTD 환자로부터 제조된 CD19 유도성 T 세포는 PR 및 NR과 비교하여 IL-6, IL-17, IL-22, IL-31 및 CCL20을 포함한 STAT3 신호전달 매개자 및 표적들의 더 높은 수준을 보여주었다. 이러한 결과는 CAR 자극된 평가 가능한 CR 및 PRTD 환자 CTL019 세포에서의 IL-6/STAT3 경로 상향조절과 일치하였다(도 7b). 이러한 결과는 CAR T 세포에서의 STAT3의 활성화가 덜 분화된, 다능성 T 림프구의 생성에 관여할 수 있음을 시사한다.
이어서, 인산화된 STAT3(pSTAT3)의 수준이, 고도로 강력한 CR/PRTD 환자 CAR T 세포 주입 생성물을 불량한 기능의 PR/NR 대상체의 것으로부터 분리할 수 있는지를 결정하였다. PR/NR 환자로부터 확장된 CAR T 세포와 비교하여 CR/PRTD 환자로부터의 CTL019에서 CAR 특이적 pSTAT3 활성이 유의하게 상승되었다(도 7c). 이러한 결과와 함께, 자극 후에 주입 전 CTL019 세포에서 IL-6/STAT3 경로 유전자 강화뿐만 아니라 최대 정도의 생체 내 CAR T 세포 확장 및 혈청 IL-6 사이에서 강력한, 직접적인 상관 관계가 관찰되었다(도 7d). 따라서, CTL019 세포에서 STAT3 신호전달의 약리학적 차단은 생존율에 영향을 미치지 않으면서(도 8c) CD19 발현 백혈병 세포로의 연속적인 재자극 시 증식 능력을 감소시켰다(도 8a 및 도 8b). CTL019 세포를 제조하는 동안 배양 배지에 외인성 IL-6을 첨가하여 pSTAT3 활성을 증가시키자 CD19 발현 종양 표적으로의 반복된 자극 후 CAR T 세포의 확장 능력 및 절대적인 수가 증가되었다(도 9). 기억 T 세포의 형성 및 유지에서 STAT3 신호전달의 새롭게 떠오른 역할을 고려하면, 이 경로의 유도는 CAR T 세포 생성물에서 덜 분화된 세포의 경계선일 수 있고, 주입 후 그들의 확장 및 장기적인 생존에 기능적으로도 중요할 수 있다.
CTL019 요법에 대한 반응성을 가질 가능성과 고용량의 CD27+PD-1- CD8+ CAR T 세포를 함유하는 CTL019 생성물의 주입 사이의 매우 유의미한 연관성이 도 10에 도시된 바와 같이 관찰되었다. CD27+PD-1- CD8+ 서브세트는 IL-6 자극에 반응하여 pSTAT3을 상향 조절하는 집단을 포함하고(도 11a), 이는 현저하게 높은 수준의 IL-6 수용체-b 쇄(CD130 또는 gp130으로도 알려져 있음)에 기인한다(도 11b). 도 12(왼쪽 패널)는 CD45RO-CD27+ CD8+ T 세포가 CD45RO+ CD27+ CD8+ T 세포, CD45RO+ CD27- CD8+ T 세포, 또는 CD45RO- CD27- CD8+ T 세포와 비교하여 더 높은 수준의 gp130을 발현함을 보여준다. 도 12(오른쪽 패널)는 다른 서브세트에 비해 더 높은 빈도의 gp130 발현 세포가 CD45RO-CD27+ CD8+ T 세포 집단에서 관찰됨을 증명한다. 또한, 도 14a에 도시된 바와 같이, PD-1 음성 CD27hi CCR7hi CD45ROdim/neg 비 소진 초기 기억 T 세포 표현형을 갖는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포는 gp130을 발현, 예를 들어, 선택적으로 발현한다. 따라서, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 gp130 기반의 양성 선택은 초기 기억 표현형 T 세포를 강화, 예를 들어, 선택적으로 강화하였다(도 14b). 강화된 T 세포, 예를 들어, 초기 기억 표현형 T 세포는 CD27+ CD45ROdim/neg의 표현형을 가질 수 있다. 도 14b에 도시된 바와 같이, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 gp130 기반의 강화는 강화 전과 비교하여 CD27+ 및 CD45ROdim/neg의 표현형을 갖는 T 세포 집단의 증가를 초래하였다. gp130으로의 강화 후, 강화 전 38.4%와 비교하여, 46%의 CD4+ T 세포가 CD27+ CD45ROdim/neg였다. gp130으로의 강화 후, 강화 전 55.1%와 비교하여, 76.1%의 CD8+ T 세포가 CD27+ CD45ROdim/neg였다.
따라서, 이러한 발견은 예를 들어, 더 큰 절대적인 수의 CD27+PD-1- CD8+ 세포를 갖는 림프구를 함유하는 배양물을 입양 이식함으로써, CLL에 대한 CAR T 세포요법의 효과가 증가될 수 있음을 시사한다.
등가물
본 명세서에서 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 발명은 특정한 양태와 관련하여 개시되었지만, 당해 분야의 다른 당업자가 본 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 양태 및 변형을 고안할 수 있을 것임이 분명하다. 첨부된 청구범위는 모든 이러한 양태 및 등가의 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 34 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(400) <223> /note="This sequence may encompass 100-400 nucleotides" <400> 34 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2000 <210> 36 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 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cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690 <210> 38 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 38 Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala 1 5 10 15 Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 50 55 60 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln 65 70 75 80 Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly 85 90 95 Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val 100 105 110 Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly 115 120 125 Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn 130 135 140 Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro 145 150 155 160 Gln Arg Leu Met Ala 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 92 atggctctgc ccgtgaccgc actcctcctg ccactggctc tgctgcttca cgccgctcgc 60 ccacaagtcc agcttcaaga atcagggcct ggtctggtga agccatctga gactctgtcc 120 ctcacttgca ccgtgagcgg agtgtccctc ccagactacg gagtgagctg gattagacag 180 cctcccggaa agggactgga gtggatcgga gtgatttggg gtagcgaaac cacttactat 240 tcatcttccc tgaagtcacg ggtcaccatt tcaaaggata actcaaagaa tcaagtgagc 300 ctcaagctct catcagtcac cgccgctgac accgccgtgt attactgtgc caagcattac 360 tactatggag ggtcctacgc catggactac tggggccagg gaactctggt cactgtgtca 420 tctggtggag gaggtagcgg aggaggcggg agcggtggag gtggctccga aatcgtgatg 480 acccagagcc ctgcaaccct gtccctttct cccggggaac gggctaccct ttcttgtcgg 540 gcatcacaag atatctcaaa atacctcaat tggtatcaac agaagccggg acaggcccct 600 aggcttctta tctaccacac ctctcgcctg catagcggga ttcccgcacg ctttagcggg 660 tctggaagcg ggaccgacta cactctgacc atctcatctc tccagcccga ggacttcgcc 720 gtctacttct gccagcaggg taacaccctg ccgtacacct tcggccaggg caccaagctt 780 gagatcaaaa ccactactcc cgctccaagg 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Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn 195 200 205 Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr 210 215 220 Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro 245 250 255 Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly 260 265 270 Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe 275 280 285 Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu 290 295 300 Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg 305 310 315 320 Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro 325 330 335 Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala 340 345 350 Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 355 360 365 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 370 375 380 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 385 390 395 400 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 405 410 415 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 420 425 430 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 435 440 445 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 450 455 460 Pro Pro Arg 465

Claims (102)

  1. 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 면역 이펙터 세포 집단의 제조 방법으로,
    a) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포의 집단을 제공하는 단계;
    b) 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR 폴리펩티드 암호화 핵산과 접촉시키는 단계;
    c) 면역 이펙터 세포의 집단을 Stat3 활성제와 접촉시키는 단계; 및
    d) 세포를 CAR 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 유지하고, 이에 의해 CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, Stat3 활성제는 다음 중 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟 개, 또는 전부, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인, 방법:
    i) gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체, 또는 IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자, OSM 분자;
    ii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 가용성 IL-6 수용체(sIL-6R);
    iii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-6/IL-6R 복합체, 예컨대, 이량체;
    iv) IL-6 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, IL-31 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자 또는 OSM 분자);
    v) CCL20 분자;
    vi) IL-10R2 수용체(IL-10R2) 활성제, 예컨대, IL-10 분자, IL-22 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자, IL-29 분자, 또는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-10R2에 결합하는 항체 분자;
    vii) IL-10 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-10 분자, IL-19 분자, IL-20 분자, IL-22 분자, IL-24 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자 또는 IL-29 분자);
    viii) IL-17 패밀리 사이토카인(예컨대, IL17A 분자, IL17B 분자, IL17C 분자, IL17D 분자, IL17E 분자 또는 IL17F 분자); 또는
    ix) IL-23 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 방법은 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로,
    예컨대, 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로 gp130 분자의 번역을 허용하는 조건 하에 gp130 분자 암호화 핵산을 도입함으로써, gp130 분자; 또는
    예컨대, 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로 Stat3 분자의 번역을 허용하는 조건 하에 Stat3 분자 암호화 핵산을 도입함으로써, Stat3 분자(예컨대, 구성적 활성 Stat3 분자(STAT3C))
    를 도입하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  4. 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 면역 이펙터 세포 집단의 제조 방법으로,
    a) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포의 집단을 제공하는 단계;
    b) 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR 폴리펩티드 암호화 핵산과 접촉시키는 단계;
    c) 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로,
    예컨대, 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로 gp130 분자의 번역을 허용하는 조건 하에 gp130 분자 암호화 핵산을 도입함으로써, gp130 분자; 또는
    예컨대, 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 하나의 세포 내로 Stat3 분자의 번역을 허용하는 조건 하에 Stat3 분자 암호화 핵산을 도입함으로써, Stat3 분자(예컨대, 구성적 활성 Stat3 분자(STAT3C))를 도입하는 단계; 및
    d) 세포를 CAR 폴리펩티드, gp130 분자 또는 Stat3 분자의 발현을 허용하는 조건 하에 유지하고, 이에 의해 CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 다음 중 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟 개, 또는 전부, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 Stat3 활성제와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인, 방법:
    i) gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체, 또는 IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자, OSM 분자;
    ii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 가용성 IL-6 수용체(sIL-6R);
    iii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-6/IL-6R 복합체, 예컨대, 이량체;
    iv) IL-6 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, IL-31 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자 또는 OSM 분자);
    v) CCL20 분자;
    vi) IL-10R2 수용체(IL-10R2) 활성제, 예컨대, IL-10 분자, IL-22 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자, IL-29 분자, 또는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-10R2에 결합하는 항체 분자;
    vii) IL-10 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-10 분자, IL-19 분자, IL-20 분자, IL-22 분자, IL-24 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자 또는 IL-29 분자);
    viii) IL-17 패밀리 사이토카인(예컨대, IL17A 분자, IL17B 분자, IL17C 분자, IL17D 분자, IL17E 분자 또는 IL17F 분자); 또는
    ix) IL-23 분자.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, gp130 분자 또는 Stat3 분자의 발현은 일시적(예컨대, 유도성 또는 비 유도성)이거나 구성적인 것인, 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, gp130 분자 또는 Stat3 분자는 면역 이펙터 세포의 집단을,
    CAR 폴리펩티드 암호화 핵산; 또는
    예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제와 접촉시키기 전에, 동시에, 또는 접촉시킨 후에 면역 이펙터 세포의 집단 내로 도입되는 것인, 방법.
  8. 제3항 또는 제4항에 있어서, Stat3 분자(예컨대, 구성적 활성 Stat3(STAT3C)) 암호화 뉴클레오티드를 포함하는 핵산은 CAR, 예컨대, CD19 CAR 암호화 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 활성제는 gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체인 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진(non-exhausted) 초기 기억 T 세포가 강화된 T 세포, 예컨대, CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 집단을 초래하는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 초기 기억 T 세포는 다음 특성 중 하나 또는 둘 다를 갖는 것인, 방법: CD27+ 및/또는 CD45RO dim/neg.
  12. 제10항에 있어서, 비 소진 초기 기억 T 세포는 다음 특성 중 하나 이상, 예컨대, 전부를 갖는 것인, 방법: (i) PD-1 음성; (ii) CD27hi; (iii) CCR7hi; 또는 (iv) CD45ROdim/neg.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포, 예컨대, 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포의 강화된 집단은 Stat3 활성제와 접촉되지 않은 다른 비슷한 T 세포의 집단과 비교하여, 예컨대, 증가된 수준 또는 양의, 예컨대, 적어도 5%, 예컨대, 5~90% 더 많은(예컨대, 적어도 5~10, 10~20, 20~30, 30~50, 50~70, 또는 70~90% 더 많은, 예컨대, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30% 더 많은), 초기 기억 T 세포 또는 비 소진 초기 기억 T 세포를 갖는 것인, 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 활성제는 IL-6 분자, IL-17 분자, IL-22 분자 또는 CCL20 분자 중 하나, 둘, 세 개, 또는 전부를 포함하는 것인, 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 활성제는 천연 분자, 재조합 분자 또는 정제된 분자인 것인, 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 활성제는 혈청에 존재하지 않는, 예컨대, Stat3을 활성화시키기에, 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 예컨대, 티로신 705(Y705)에서, 예컨대, Stat3을 인산화시키기에, 충분한 양으로 존재하지 않는 것인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 활성제는 기질, 예컨대, 비드 또는 세포에 위치되는, 예컨대, 고정화되는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, Stat3 활성제는 Stat3 활성제 세포에 위치되는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, Stat3 활성제 세포는 인공 항원 제시 세포인 것인, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 활성제는 Stat3 활성제 세포에 의해 발현되거나 Stat3 활성제 세포의 표면에 접합되는 것인, 방법.
  21. 제1항 내지 제3항, 제5항, 또는 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는 예컨대, Stat3을 활성화시키기에, 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 예컨대, 티로신 705(Y705)에서, 예컨대, Stat3을 인산화시키기에, 충분한 양으로 제공되는 것인, 방법.
  22. 제1항 내지 제3항, 제5항, 또는 제9항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는, 비슷한 조건 하에 배양되나 Stat3 활성제와 접촉되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여, 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 12일의 배양 기간 후에 면역 이펙터 세포의 집단을 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9배 이상 확장시키기에 충분한 양으로 제공되는 것인, 방법.
  23. 제1항 내지 제3항, 제5항, 또는 제9항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는, 비슷한 조건 하에 배양되나 Stat3 활성제와 접촉되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여, 면역 이펙터 세포 집단 내의 CD27+ PD-1-인 세포의 백분율을 예컨대, 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5배 이상 증가시키기에 충분한 양으로 제공되는 것인, 방법.
  24. 제1항 내지 제3항, 제5항, 또는 제9항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는, 비슷한 조건 하에 배양되나 Stat3 활성제와 접촉되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여, 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 면역 이펙터 세포 집단 내의 gp130의 발현 수준을 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10배 이상 증가시키기에 충분한 양으로 제공되는 것인, 방법.
  25. 제1항 내지 제3항, 제5항, 또는 제9항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는 IL-6 분자, IL-17 분자, IL-22 분자, IL31 분자, 및 CCL20 분자 중 하나, 둘, 셋, 네 개, 또는 전부(예컨대, 다섯 개)로부터 선택되는 것인, 방법.
  26. 제1항 내지 제3항, 제5항, 또는 제9항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제는 IL-6 분자, 예컨대, 재조합 IL-6을 포함하는 것인, 방법.
  27. 제21항에 있어서, IL-6 분자, 예컨대, 재조합 IL-6은 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 또는 30 ng/ml의 양으로, 또는 1~20, 1~15, 또는 5~15 ng/ml의 범위, 예컨대, 적어도 10 ng/ml로 제공되는 것인, 방법.
  28. 제2항, 제5항, 또는 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항-gp130 항체 분자는 B-S12 또는 B-P8 또는 B-S12 또는 B-P8로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR을 갖는 항체 분자로부터 선택되는 것인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 면역 이펙터 세포의 집단을 B-S12 및 B-P8 둘 다와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 항-gp130 항체 분자의 총량은 약 0.1~1000, 0.5~500, 또는 1~100 ug/ml인 것인, 방법.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서, 항-gp130 항체 분자는 적어도 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2 ug/ml, 예컨대, 약 1 ug/ml의 양으로 제공되는 것인, 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항-gp130 항체는
    STAT3의 인산화에 의해 측정 시, gp130 매개성 신호전달을 유도하거나;
    이량체화, 예컨대, gp130의 동종이량체화, 또는 gp130의, 예컨대, LIF, OSM 또는 CNTF와의 이종이량체화를 유도하는 것인, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Stat3 활성제의 존재 하에 배양된 세포의 집단은, 비슷한 조건 하에 배양되나 Stat3 활성제와 접촉되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여,
    Stat3의 활성화, 예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 예컨대, 티로신 705(Y705)에서, 예컨대, Stat3의 인산화;
    예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 12일의 배양 기간 후에 면역 이펙터 세포 집단의 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9배 이상의 확장;
    면역 이펙터 세포 집단 내의 CD27+ PD-1-인 세포의 백분율의, 예컨대, 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5배 이상의, 증가; 및/또는
    예컨대, 실시예 2의 분석법에 의해 측정 시, 면역 이펙터 세포 집단 내의 gp130의 발현 수준의 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 또는 10배 이상의 증가;
    를 나타내는 것인, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 동안 또는 1~7, 7~14, 또는 14~21일 동안, 집단을 확장시키는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 전사 표적, 예컨대, c-Myc, c-Fos, Sox2, Bcl-2, 또는 RORC의 수준 또는 활성을 측정하여 Stat3 경로 활성화 값을 결정함으로써 면역 이펙터 세포 집단에서의 Stat3 경로 활성화를 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, Stat3 경로 활성화 값을 기준값과 비교하는 단계를 더 포함하며, 이때, 기준값은 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은, 비슷한 조건 하에 배양되나 Stat3 활성제와 접촉되지 않는 다른 비슷한 면역 이펙터 세포의 집단으로부터 얻는 것인, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 기준값과 Stat3 경로 활성화 값의 비교에 반응하여 다음 중 하나 이상을 수행하는 단계를 더 포함하는 방법:
    치료제로 사용하기에 적합하거나 적합하지 않은 집단을 분류하는 단계;
    치료적 용도를 위하여, 집단 또는 이의 일정 부분을 제형화 또는 포장하는 단계; 또는
    배양 파라미터를 변경하는 단계, 예컨대, i) 배양에 있어서 시간 길이를 변경하거나, 또는 ii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, Stat3 활성제의 농도를 증가시키거나 감소시키는 단계.
  38. 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 면역 이펙터 세포 집단의 제조 방법으로,
    a) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포의 집단을 제공하는 단계;
    b) 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR 폴리펩티드 암호화 핵산과 접촉시키는 단계;
    c) 면역 이펙터 세포의 집단을 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)와 접촉시키는 단계, 및
    d) 세포를 CAR 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 유지하고, 이에 의해 CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-DG는, 비슷한 조건 하에 배양되나 당 분해 억제제로 처리되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여,
    면역 이펙터 세포의 집단을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 이상 증가시키거나;
    면역 이펙터 세포 집단 내에서 중심 기억 표현형을 갖는 세포, 예컨대, CD45RO+CCR7+인 세포의 백분율을 예컨대, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 이상 증가시키기;에 충분한 양으로 첨가되는 것인, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 당 분해 억제제, 예컨대, 2-DG는 적어도 0.5, 1, 1.5, 2, 또는 2.5 mM, 0.5~2.5 mM, 또는 1~2 mM의 농도로 첨가되는 것인, 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 당 분해 억제제의 존재 하에 배양된 세포의 집단은, 비슷한 조건 하에 배양되나 당 분해 억제제로 처리되지 않는 다른 비슷한 세포의 집단과 비교하여,
    면역 이펙터 세포 집단의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 이상의 증가; 또는
    면역 이펙터 세포 집단 내에서 중심 기억 표현형을 갖는 세포, 예컨대, CD45RO+CCR7+인 세포의 백분율의 예컨대, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 이상의 증가;
    를 나타내는 것인, 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 동안 또는 1~7, 7~14, 또는 14~21일 동안, 집단을 확장시키는 단계; 또는
    예컨대, 실시예 1의 성장 조건 하에서, 예컨대, 세포 수의 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 5, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50배 이상의 변화, 예컨대, 최대 약 40 또는 50배의 변화로 집단을 확장시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대, 2-NBDG 흡수 분석법, 예컨대, 실시예 1의 분석법을 이용하여, 면역 이펙터 세포 집단의 글루코스 대사를 분석하여 글루코스 대사 값을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 대사 값을 기준값과 비교하는 단계를 더 포함하는 방법.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 기준값과 글루코스 대사 값의 비교에 반응하여 다음 중 하나 이상을 수행하는 단계를 더 포함하는 방법:
    치료제로 사용하기에 적합하거나 적합하지 않은 집단을 분류하는 단계;
    치료적 용도를 위하여, 집단 또는 이의 일정 부분을 제형화 또는 포장하는 단계; 또는
    배양 파라미터를 변경하는 단계, 예컨대, i) 배양에 있어서 시간 길이를 변경하거나, 또는 ii) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)의 농도를 증가시키거나 감소시키는 단계.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포 집단을 제1항에 열거된 Stat3 활성제 또는 제3항 또는 제4항에 열거된 세포의 집단과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  47. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포의 집단을 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, (b)가 (c) 전에 수행되거나, (c)가 (b) 전에 수행되거나, (b)와 (c)가 동시에 수행되는 것인, 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 DNA 또는 RNA인 것인, 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 렌티바이러스 형질도입을 수행하여 핵산을 면역 이펙터 세포로 전달하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR과 결합하는 항원(예컨대, CD19)을 발현하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포 집단을 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 예컨대, 세포 표면의 공동 자극 분자를 자극하는 리간드와 접촉시키는 단계를 더 포함하고, 예를 들어, 작용제는 항-CD3 항체, 또는 이의 단편, 및/또는 항-CD28 항체, 또는 이의 단편과 접합된 비드인 것인, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 폴리펩티드는 CD19 CAR, CD22 CAR, CD123 CAR, BCMA CAR, EGFRvIII CAR, CLL-1 CAR, CD20 CAR, 또는 CD33 CAR인 것인, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD19 CAR, 예컨대, 서열번호 39 내지 51의 scFv 아미노산 서열을 포함하는 CAR 또는 서열번호 77 내지 89의 아미노산 서열을 포함하는 CAR인 것인, 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 항-CD19 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 항체 분자를 포함하고, 상기 항-CD19 결합 도메인은 표 3B에 열거된 임의의 항-CD19 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3) 중 하나 이상 및 표 3A에 열거된 임의의 항-CD19 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3) 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
  56. 제50항에 있어서, 항-CD19 결합 도메인은 서열번호 40 또는 서열번호 51의 서열을 포함하는 것인, 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 서열번호 78 또는 서열번호 89의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것인, 방법.
  58. 반응 혼합물로서,
    a) (i) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단(예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포, 예컨대, CD19 CAR 발현 세포) 또는 (ii) 면역 이펙터 세포 및 CAR(예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR, 예컨대, CD19 CAR) 암호화 핵산; 및
    b) 다음으로부터 선택되는 작용제:
    (i) Stat3 활성제;
    (ii) 제3항 또는 제4항에 열거된 세포 또는 세포 집단; 또는
    (iii) gp130 분자 또는 Stat3 분자, 또는 gp130 분자 또는 Stat3 분자를 암호화하는 핵산
    을 포함하는 반응 혼합물.
  59. 제58항에 있어서, Stat3 활성제는 다음으로부터 선택되는 것인, 반응 혼합물:
    b-i-i) gp130 활성제, 예컨대, gp130에 결합하는 항체 분자, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항-gp130 항체, 또는 IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자, OSM 분자;
    b-i-ii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 가용성 IL-6 수용체(sIL-6R);
    b-i-iii) 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-6/IL-6R 복합체, 예컨대, 이량체;
    b-i-iv) IL-6 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-6 분자, IL-11 분자, IL-27 분자, IL-31 분자, CNTF 분자, CT-1 분자, CLC 분자, LIF 분자, NP 분자 또는 OSM 분자);
    b-i-v) CCL20 분자;
    b-i-vi) IL-10R2 수용체(IL-10R2) 활성제, 예컨대, IL-10 분자, IL-22 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자, IL-29 분자, 또는 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 IL-10R2에 결합하는 항체 분자;
    b-i-vii) IL-10 패밀리 사이토카인(예컨대, IL-10 분자, IL-19 분자, IL-20 분자, IL-22 분자, IL-24 분자, IL-26 분자, IL-28A 분자, IL-28B 분자 또는 IL-29 분자);
    b-i-viii) IL-17 패밀리 사이토카인(예컨대, IL17A 분자, IL17B 분자, IL17C 분자, IL17D 분자, IL17E 분자 또는 IL17F 분자); 또는
    b-i-ix) IL-23 분자.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, (a)(i) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단을 포함하는 반응 혼합물.
  61. 제58항 또는 제59항에 있어서, (a)(ii) CAR(예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR, 예컨대, CD19 CAR) 암호화 핵산을 포함하는 반응 혼합물.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, (b)(i) 제59항에 열거된 Stat3 활성제를 포함하는 반응 혼합물.
  63. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, (b)(ii) 제3항 또는 제4항에 열거된 세포 또는 세포의 집단을 포함하는 반응 혼합물.
  64. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, (b)(iii) gp130 분자, 또는 Stat3 분자, 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 반응 혼합물.
  65. 제58항에 있어서, (a)(i) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단; 및 (b)(i) 제59항에 열거된 Stat3 활성제를 포함하는 반응 혼합물.
  66. 제58항에 있어서, (a)(i) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단; 및 (b)(ii) 제3항 또는 제4항에 열거된 세포 또는 세포의 집단을 포함하는 반응 혼합물.
  67. 제58항에 있어서, (a)(i) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단; 및 (b)(iii) gp130 분자, 또는 Stat3 분자, 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 반응 혼합물.
  68. 제58항에 있어서, (a)(ii) CAR 암호화 핵산; 및 (b)(i) 제59항에 열거된 Stat3 활성제를 포함하는 반응 혼합물.
  69. 제58항에 있어서, (a)(ii) CAR 암호화 핵산; 및 (b)(ii) 제3항 또는 제4항의 세포 또는 세포의 집단을 포함하는 반응 혼합물.
  70. 제53항에 있어서, (a)(ii) CAR 암호화 핵산; 및 (b)(iii) gp130 분자, 또는 Stat3 분자, 또는 gp130 분자 또는 Stat3 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 반응 혼합물.
  71. 제58항 내지 제62항, 제65항 또는 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a)(i) 및 b-i-i); (a)(i) 및 b-i-ii); (a)(i) 및 b-i-iii); (a)(i) 및 b-i-iv); (a)(i) 및 b-i-v); (a)(i) 및 b-i-vi); (a)(i) 및 b-i-vii); (a)(i) 및 b-i-viii); (a)(ii) 및 b-i-i); (a)(ii) 및 b-i-ii); (a)(ii) 및 b-i-iii); (a)(ii) 및 b-i-iv); (a)(ii) 및 b-i-v); (a)(ii) 및 b-i-vi); (a)(ii) 및 b-i-vii); 및 (a)(ii) 및 b-i-viii) 중 하나 이상을 포함하는 반응 혼합물.
  72. 반응 혼합물로서,
    a) CAR 발현 면역 이펙터 세포의 집단, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR 발현 세포, 예컨대, CD19 CAR 발현 세포, 및
    b) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)
    를 포함하는 반응 혼합물.
  73. 반응 혼합물로서,
    a) 면역 이펙터 세포의 집단,
    b) CAR, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 CAR, 예컨대, CD19 CAR 암호화 핵산, 및
    c) 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)
    를 포함하는 반응 혼합물.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 당 분해 억제제, 예컨대, 2-DG는 적어도 0.5, 1, 1.5, 2, 또는 2.5 mM, 0.5~2.5 mM, 또는 1~2 mM의 농도로 존재하는 반응 혼합물.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 활성제; 세포 또는 세포의 집단; 또는 gp130 분자, 또는 a Stat3 분자, 또는 제58항 또는 제59항에 열거된 gp130 분자 또는 Stat3 분자를 암호화하는 핵산을 더 포함하는 반응 혼합물.
  76. 제59항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)를 더 포함하는 반응 혼합물.
  77. 제59항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스를 더 포함하고, 예컨대, 이때, CAR 암호화 핵산이 렌티바이러스에 패키징되는 것인, 반응 혼합물.
  78. 제58항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 DNA 또는 RNA인 것인, 반응 혼합물.
  79. 제58항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, CAR과 결합하는 항원(예컨대, CD19)을 발현하는 세포의 집단을 더 포함하는 반응 혼합물.
  80. 예컨대, CAR 발현 세포의 투여 전에, CAR 발현 세포를 이용한 치료적 처치에 대한 암(예컨대, 본 명세서에서 기술된 암)을 앓는 대상체의 반응성을 평가 또는 예측하는 방법으로, 대상체의 면역 이펙터 세포에서 다음을 평가하고:
    i) 글루코스 대사 수준
    (글루코스 대사 기준값보다 낮은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 높음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타낼 가능성이 높음을 나타내고,
    글루코스 대사 기준값보다 높은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타내지 않음을 의미함); 또는
    ii) (예컨대, 티로신 705(Y705)에서의) Stat3의 인산화에 의해 측정한 바와 같은 Stat3 활성화 수준 또는 Stat3 전사 표적(예컨대, c-Myc, c-Fos, Sox2 또는 Bcl-2)의 수준 또는 활성
    (Stat3 활성화 기준값보다 높은 Stat3 활성화 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 높음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타낼 가능성이 높음을 나타내고,
    Stat3 활성화 기준값보다 낮은 Stat3 활성화 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타내지 않음을 의미함),
    이에 의해 대상체를 평가하거나, 또는 CAR 발현 세포에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 단계를 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 면역 이펙터 세포는 CAR 암호화 핵산과 접촉되지 않은 것인, 방법.
  82. 제80항에 있어서, 면역 이펙터 세포는 CAR 암호화 핵산과 접촉되었고, 예컨대, CAR 폴리펩티드를 발현하는 것인, 방법.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포는
    i) 제1항에 열거된 Stat3 활성제;
    ii) 제3항 또는 제4항에 열거된 세포 또는 세포 집단;
    iii) gp130 분자 또는 Stat3 분자, 또는 gp130 분자 또는 Stat3 분자를 암호화하는 핵산; 또는
    iv) 적어도 0.5, 1, 1.5, 2, 또는 2.5 mM 농도의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자의 당 분해 억제제, 예컨대, 소분자 헥소키나제 억제제, 예컨대, 글루코스 유사체, 예컨대, 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)
    와 접촉된 것인, 방법.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 수, 예컨대, CAR 발현 세포 수의 배수 변화를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮은 대상체는 예를 들어, 완전 반응(CR) 또는 부분 반응(PR)을 나타내지 않을 것으로, 예를 들어, 비 반응자(NR)일 것으로 예측되는 것인, 방법.
  86. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 결정에 대하여:
    i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 낮음; 또는
    ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 높음,
    대상체는 CAR 발현 요법의 투여 대상으로 선택되거나, CAR 발현 요법이 투여되는 것인, 방법.
  87. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 결정에 대하여:
    i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 높음; 또는
    ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 낮음,
    대상체는 CAR 발현 요법 이외의 요법의 투여 대상으로 선택되거나, CAR 발현 요법 이외의 요법이 투여되는 것인, 방법.
  88. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 대사 기준값은 실시예 1에서 기술된 바와 같은 완전 반응자 대상체의 세포의 글루코스 대사 값이며, 예컨대, 세포(예컨대, 세포를 함유하는 샘플)는 모의 자극, 예컨대, 실시예 1에서 기술된 바와 같은, 예컨대, CAR 항원 이외의 항원을 이용한 자극과 접촉되는 것인, 방법.
  89. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 활성화 기준값은 예컨대, 실시예 2에서 기술된 바와 같은, 비 반응자 대상체의 세포의 Stat3 활성화 값인 것인, 방법.
  90. 암(예컨대, 본 명세서에서 기술된 암)을 앓는 대상체의 반응성을 평가하거나 예측하는 방법으로, 이때, 대상체는 CAR 발현 세포로 처치되었으며, 대상체의 CAR 발현 세포에서 다음을 평가하고:
    i) 글루코스 대사 수준
    (글루코스 대사 기준값보다 낮은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 높음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타낼 가능성이 높음을 나타내고,
    글루코스 대사 기준값보다 높은 글루코스 대사 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타내지 않음을 의미함); 또는
    ii) (예컨대, 티로신 705(Y705)에서의) Stat3의 인산화에 의해 측정한 바와 같은 Stat3 활성화 수준 또는 Stat3 전사 표적(예컨대, c-Myc, c-Fos, Sox2 또는 Bcl-2)의 수준 또는 활성
    (Stat3 활성화 기준값보다 높은 Stat3 활성화 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 높음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타낼 가능성이 높음을 나타내고,
    Stat3 활성화 기준값보다 낮은 Stat3 활성화 수준은 대상체가 CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮음, 예컨대, 완전 반응 또는 부분 반응을 나타내지 않음을 의미함),
    이에 의해 대상체를 평가하거나, 또는 CAR 발현 세포에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 단계를 포함하는 방법.
  91. 제90항에 있어서, CAR 발현 세포에서 글루코스 대사 수준 또는 Stat3 활성화 수준을 평가하기 전에 대상체로부터 CAR 발현 세포를 수득하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, CAR 발현 세포를 이용한 처치에 대해 반응할 가능성이 낮은 대상체는 예를 들어, 완전 반응(CR) 또는 부분 반응(PR)을 나타내지 않을 것으로, 예를 들어, 비 반응자(NR)일 것으로 예측되는 것인, 방법.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 결정에 대하여:
    i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 낮음; 또는
    ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 높음,
    대상체는 1 이상의 추가 용량의 CAR 발현 요법의 투여 대상으로 선택되거나, 1 이상의 추가 용량의 CAR 발현 요법이 투여되는 것인, 방법.
  94. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 결정에 대하여:
    i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 높음; 또는
    ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 낮음,
    대상체는 CAR 발현 요법 이외의 요법의 투여 대상으로 선택되거나, CAR 발현 요법 이외의 요법이 투여되는 것인, 방법.
  95. 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 대사 기준값은 실시예 1에서 기술된 바와 같은 완전 반응자 대상체의 세포의 글루코스 대사 값이며, 예컨대, 세포(예컨대, 세포를 함유하는 샘플)는 모의 자극, 예컨대, 실시예 1에서 기술된 바와 같은, 예컨대, CAR 항원 이외의 항원을 이용한 자극과 접촉되는 것인, 방법.
  96. 제90항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 활성화 기준값은 예컨대, 실시예 2에서 기술된 바와 같은, 비 반응자 대상체의 세포의 Stat3 활성화 값인 것인, 방법.
  97. CAR 발현 세포, 예컨대, CAR19 발현 세포(예컨대, CTL019)를 평가하는 방법으로, 대상체의 샘플의 CAR 발현 세포에서 다음을 평가하고:
    i) 글루코스 대사 수준
    (글루코스 대사 기준값보다 낮은 글루코스 대사 수준은 샘플이 처치에 적합함을 의미하고,
    글루코스 대사 기준값보다 높은 글루코스 대사 수준은 샘플이 처치에 덜 적합함을 의미함); 또는
    ii) Stat3 활성화 수준
    (Stat3 활성화 기준값보다 높은 Stat3 활성화 수준은 샘플이 처치에 적합함을 의미하고,
    Stat3 활성화 기준값보다 낮은 Stat3 활성화 수준은 샘플이 처치에 덜 적합함을 의미함),
    이에 의해 CAR 발현 세포를 평가하는 단계를 포함하는 방법.
  98. 제97항에 있어서, CAR 발현 세포에서 글루코스 대사 또는 Stat3 활성화의 수준을 평가하기 전에 대상체로부터 CAR 발현 세포를 수득하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 다음의 결정에 대하여:
    i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 낮음; 또는
    ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 높음,
    샘플이 대상체에 대한 투여 대상으로 선택되거나, 대상체에게 투여되는 것인, 방법.
  100. 제97항 또는 제98항에 있어서, 다음의 결정에 대하여:
    i) 글루코스 대사 수준이 글루코스 대사 기준값보다 높음,
    ii) Stat3 활성화 수준이 Stat3 활성화 기준값보다 낮음,
    샘플이 대상체에 대한 투여 대상으로 선택되지 않거나, 대상체에게 투여되지 않는 것인, 방법.
  101. 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 대사 기준값은 실시예 1에서 기술된 바와 같은 완전 반응자 대상체의 세포의 글루코스 대사 값이며, 예컨대, 세포(예컨대, 세포를 함유하는 샘플)는 모의 자극, 예컨대, 실시예 1에서 기술된 바와 같은, 예컨대, CAR 항원 이외의 항원을 이용한 자극과 접촉되는 것인, 방법.
  102. 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, Stat3 활성화 기준값은 예컨대, 실시예 2에서 기술된 바와 같은, 비 반응자 대상체의 세포의 Stat3 활성화 값인 것인, 방법.
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