KR20200077528A - 염증 상태의 치료에서의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체뿐만 아니라, 이의 제조 방법, 및 생체재료로서 그리고 약학 조성물의 성분으로서의 이의 용도를 개시한다. 본 발명은 또한 변화된 갈렉틴의 발현에 기인하는 병리의 치료에서의 상기 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의 용도를 개시한다.

Description

염증 상태의 치료에서의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체
본 발명은 작용화된 히알루론산(functionalized hyaluronic acid) 또는 이의 유도체 뿐만 아니라, 이의 제조 방법, 및 생체재료(biomaterial)로서 그리고 약학 조성물의 성분으로서의 이의 용도에 관한 것이다.
갈렉틴(galectin)은 N-글리코실화 또는 O-글리코실화를 통해 단백질에 결합될 수 있는, N-아세틸-갈락토사민과 같은, β-갈락토시드 당에 대한 결합 특이성에 의해 정의되는 단백질의 계열이다. 15 갈렉틴은 포유류에서 알려져 있으며, LGALS 유전자에 의해 코딩되고 연속적으로 번호가 매겨지지만, 오직 갈렉틴 -1, -2, -3, -4, -7, -8, -9, -10, -12, 및 -13만이 인간에서 확인되었다.
이들은 세포내 또는 세포외 수준에 위치한다. 후자의 경우, 이들은 세포 표면에서 글리칸과 2가 또는 다가 상호작용을 수행하며 사이토카인 및 기타 염증 매개체의 생성, 세포 부착, 이동, 및 아폽토시스(apoptosis)를 포함한, 다양한 세포 반응을 유도한다. 나아가, 이들은 막 당단백질 수용체와 격자를 형성하고 수용체의 특성을 조절할 수 있다. 세포내 갈렉틴은 신호 전달 경로에 참여하고 아폽토시스, 세포 분화, 및 세포 운동성을 포함한, 생물학적 반응을 변경할 수 있다. 현재 증거에 따르면 갈렉틴은 급성 및 만성 염증 반응뿐만 아니라 기타 다른 병리학적 과정에서 중요한 역할을 한다.
최근 연구는 특정 갈렉틴이 류마티스 관절염 및 골관절염과 같은 특정 근골격계 질환의 염증 반응에 관여함을 보여준다 (D. Weinmann et al. Scientific Reports DOI: 10.1038/srep39112; Toegel S. et al Histochem Cell Biol 2014, 142, 373; Toegel S. The Journal of Immunology 2016, 1910; Li S. et al. J. Clin. Cell Immunol 2013, 4(5), 1000164). 갈렉틴은 많은 염증 병리에서 과발현되므로, 메탈로프로테이나아제 활성의 억제로부터 결과적으로 염증 캐스케이드(cascade)의 현저한 감소를 결정할 수 있다.
더욱이, 갈렉틴은 종양 (tumour)의 발달 및 진행에서 적극적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로, 신생물 (neoplasia)의 진단 및 치료를 개선하기 위하여 갈렉틴 저해제/조절제가 현재 연구되고 있다 (Ebrahim AH, et al. Galectin in cancer: carcinogenesis, diagnosis and therapy. Ann Transl Med 2014;2(9):88. doi: 10.3978/j.issn.2305-5839.2014.09.12).
따라서 본 발명의 목적은 갈렉틴의 변화된 발현에 기인하는 병리에 대해 치료학적으로 작용하기 위하여 이러한 수용체의 발현을 조절하는 산물을 제공하고, 의학적 및 제약학적 관점에서 높은 수용성 (acceptability) 프로파일을 또한 제공하는 것이다.
상기 목적은 청구범위의 제1항에 기재된 것과 같이, 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체에 의해 달성된다.
다른 양태에서, 본 발명은 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 갈렉틴의 변화된 발현에 기인하는 병리의 치료에서의 상기 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다. 상기 수용체의 상향/하향 조절 (over/under regulation)에 의한 영향을 받는 병리의 비제한적인 예는 비-알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis), 판상형 건선 (plaque psoriasis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 신생물 (neoplasia), 및 폐 섬유화 과정 (fibrotic pulmonary process), 신장 섬유화 과정 (fibrotic renal process), 및 심혈관 섬유화 과정 (fibrotic cardiovascular process)이다.
다른 양태에서, 본 발명은 정형외과 질환의 치료에서, 세포 성장을 위한 생체재료 또는 스캐폴드(scaffold)로서의 상기 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 성형/미용성형, 혈액 투석, 심장과, 혈관과, 안과, 이비인후과, 치과, 부인과, 비뇨기과, 피부과, 종양학과, 및 조직 복구(tissue repair)에서, 세포 성장을 위한 생체재료 또는 스캐폴드로서의 상기 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체 및 적어도 하나의 약리 활성 물질 및/또는 적어도 하나의 생리활성 물질(bioactive substance)을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 갈렉틴의 변화된 발현에 기인하는 병리의 치료에서 상기 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 수용체의 상향/하향 조절에 의해 영향을 받는 병리의 비제한적인 예는 비-알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis), 판상형 건선 (plaque psoriasis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 신생물 (neoplasia), 및 폐 섬유화 과정 (fibrotic pulmonary process), 신장 섬유화 과정 (fibrotic renal process), 및 심혈관 섬유화 과정 (fibrotic cardiovascular process)이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 성형/미용성형, 혈액 투석, 심장과, 혈관과, 안과, 이비인후과, 치과, 부인과, 비뇨기과, 피부과, 종양학과, 및 조직 복구에서 상기 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명, 비제한적인 예에 의해 제공된 실시양태 및 여기에 첨부된 도면으로부터 명백해질 것이며, 여기서:
- 도 1은 락토스, 탈아세틸화된 히알루론산, 및 히알루론산의 유도체의 적외선 스펙트럼을 비교한 것을 나타내며, 여기서 R5는 Z(3)이고 Z3은 갈락토스 모이어티(moiety)이고,
- 도 2는 히알루론산, 환원 아미노화를 통해 수득한 환원 당(reducing sugar)의 아민 유도체, 및 히알루론산의 유도체의 적외선 스펙트럼을 비교한 것을 나타내며, 여기서 R은 Z(1)이고 Z3은 갈락토스 모이어티이고,
- 도 3은 1H-NMR 스펙트럼 (400 MHz, D2O, 343 K)을 나타내며: 1) 히알루론산나트륨; 2) 실시예 6에 따라 수득한 히알루론산나트륨; 3) 실시예 13에 따라 수득한 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아민 유도체 (환원 당을 이용한 환원 아미노화)이고,
- 도 4는 1H-NMR 스펙트럼 (400 MHz, D2O, 298 K)을 나타낸다: 1) 히알루론산나트륨; 2) 실시예 3에 따라 수득한 환원 당의 아민 유도체; 3) 실시예 13에 따라 수득한 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산 (환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화)의 아미드 유도체.
따라서, 본 발명은 화학식 (I)을 갖는 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체에 관한 것이다:
Figure pct00001
(I)
여기서,
R1, R2, R3, R4는, 각각 독립적으로, H, SO3 -, 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 계열의 카르복실산으로부터 유도된 아실 기, -CO-(CH2)2-COOY이고, 여기서 Y는 음전하 또는 H이고,
R은 Z(1) 또는 Z(2)이며, R5는 -CO-CH3, H, SO3 -, 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 계열의 카르복실산으로부터 유도된 아실 기, 히알루론산의 아실 기이고,
여기서 Z(1)은 화학식 (1)의 모이어티이고:
Figure pct00002
(1)
여기서 Z1은 -NR6CH2-이고, R6은 H, 또는 치환된 또는 비-치환된, 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 기이고,
Z2는 -OH, 또는 -NHCOCH3이고,
Z3은 H, 단당류, 이당류, 또는 올리고당류(oligosaccharide)이고,
또는 Z(2)는 화학식 (2)의 모이어티이고:
Figure pct00003
(2)
여기서 Z4는 -NR6CH-이고, R6은 H, 또는 치환된 또는 비-치환된, 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 기이고,
Z5 및 Z6은, 각각 독립적으로, H, 단당류, 이당류, 또는 올리고당류이고,
또는
R5는 Z(3) 또는 Z(4)이고, R은 NR6R7, 또는 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 계열의 알코올 기, OH, O-, 히알루론산의 알코올 기, 히알루론산의 아민 기이고, R6, R7은, 각각 독립적으로, H, 또는 치환된 또는 비-치환된, 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 기이고,
여기서 Z(3)은 화학식 (3)의 모이어티이고:
Figure pct00004
(3)
여기서 Z1은 -CH2- 또는 -CO-이고,
Z2는 -OH, 또는 -NHCOCH3이고,
Z3은 H, 단당류, 이당류, 또는 올리고당류이고,
또는 Z(4)는 화학식 (4)의 모이어티이고:
Figure pct00005
(4)
여기서 Z4는 -CH-이고,
Z5 및 Z6은, 각각 독립적으로, H, 단당류, 이당류, 또는 올리고당류이고,
또는
R은 Z(1) 또는 Z(2)이고, R5는 Z(3) 또는 Z(4)이다.
상기 용어 "지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭"은 바람직하게는 하기로부터 선택되는, 선형, 분지, 또는 고리형 모이어티, 포화 또는 불포화, 지방족 또는 방향족을 의미한다: C1-C10 알킬, 치환된 C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, 치환된 C2-C10 알케닐, C4-C10 디에닐, 치환된 C4-C10 디에닐, C2-C10 알키닐, 치환된 C2-C10 알키닐, 페닐, 치환된 페닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1-C10 알킬티오, 치환된 C1-C10 알킬티오, 페닐티오, 치환된 페닐티오, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 카르보닐, 치환된 C1-C6 카르보닐, 카르복실, 치환된 C1-C6 카르복실, 아미노, 치환된 C1-C6 아미노, 아미드, 치환된 C1-C6 아미드, 술포닐, 치환된 C1-C6 술포닐, 술폰산, 포스포닐, 치환된 C1-C6 포스포닐, 폴리아릴, 치환된 폴리아릴, C3-C20 시클로알킬, 치환된 C3-C20 시클로알킬, C3-C20 헤테로시클로알킬, 치환된 C3-C20 헤테로시클로알킬, C2-C10 시클로알케닐, 치환된 C2-C10 시클로알케닐, C4-C10 시클로디에닐, 치환된 C4-C10 시클로디에닐, 또는 아미노산. 상기 용어 "치환된"은 적어도 하나의 할로겐, 히드록실, C1-C4 알킬, 카르복실, 또는 이의 조합을 의미한다.
바람직하게, Z3, Z5 및 Z6은, 각각 독립적으로, H, 글루코스, 갈락토스, 아라비노스, 자일로스, 만노스, 락토스, 트레할로스, 겐티오비오스, 셀로비오스, 셀로트리오스, 말토스, 말토트리오스, 키토비오스, 키토트리오스, 만노비오스, 멜리비오스, 프럭토스, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸갈락토사민의 모이어티, 또는 이의 조합이다. 보다 바람직하게, Z3은 H, 글루코스, 갈락토스, 만노스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민의 모이어티, 또는 이의 조합이다.
구체적으로 바람직한 실시양태에서, 화학식 Z의 모이어티는 락토스 또는 갈락토스의 모이어티이고, 여기서 Z는 Z(1), Z(2), Z(3) 및 Z(4) 중 어느 하나이다.
상기 나타난 구조식에서 확인할 수 있듯이, 히알루론산 또는 이의 유도체는 Z(1), Z(2), Z(3) 또는 Z(4)인지 상관없이 화학식 Z의 모이어티와 하기에 의한 컨쥬게이션(conjugation)을 통해 작용화된다:
1) 1차 아민 또는 암모니아 공급원 (source)을 이용한 Z의 전구체의 환원 아미노화를 통한, 히알루론산 또는 이의 유도체의 카르복실 기와 아민 간의 아미드 결합,
2) 환원 아미노화를 통한, 이전에 탈아세틸화되었던 히알루론산 또는 이의 유도체의 아민 기와 모이어티 Z 간의 아민 결합,
3) 이전에 탈아세틸화되었던 히알루론산 또는 이의 유도체의 아민 기와 모이어티 Z의 전구체의 카르복실 기 간의 아미드 결합.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
i) 히알루론산 또는 이의 부분 또는 전부 탈아세틸화된 유도체를 제공하는 단계;
ii) 환원 아미노화 반응을 통해 단당류, 이당류, 올리고당류의 아민 유도체를 제공하는 단계;
iii) a) 카르보디이미드의 존재하에서 및/또는 카르복시 기 활성화제의 존재하에서 상기 단계 i)의 히알루론산을 단계 ii)의 아민 유도체와 반응시키거나,
b) 아미노-보란의 존재하에서 상기 단계 i)의 부분적으로 또는 전부 탈아세틸화된 유도체를 단당류, 이당류, 올리고당류와 반응시키거나;
c) 카르보디이미드의 존재하에서 및/또는 카르복시 기 활성화제의 존재하에서 단계 i)의 부분적으로 또는 전부 탈아세틸화된 유도체를 단당류, 이당류, 올리고당류의 카르복실 유도체(carboxylic derivative)와 반응시키거나;
d) 카르보디이미드의 존재하에서 및/또는 카르복시 기 활성화제의 존재하에서 단계 iii-b)에서 수득된 유도체를 단계 ii)의 아민 유도체와 반응시키거나;
e) 카르보디이미드의 존재하에서 및/또는 카르복시 기 활성화제의 존재하에서 단계 iii-c)에서 수득된 유도체를 단계 ii)의 아민 유도체와 반응시키는 단계;
및
iv) 이와 같이 수득된 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체를 유기 용매를 이용하여 침전시키는 단계.
아미노-보란은 카르보닐 기에 비해 이미노 기의 환원에 뛰어난 선택성을 보이며 수성 매질과 상용성(compatible)이므로, 1차 아민, 암모니아 공급원, 및 다당류의 아민 모이어티의 존재하에서, 환원 당의 효과적인 아민 환원이 가능하도록 한다는 것이 놀랍게도 확인되었다. 동시에, 카르보디이미드 및/또는 카르복실 기 활성화제의 존재는 에스테르 유도체의 형성에 대해 뛰어난 선택성을 갖는 히알루론산의 아미드 유도체의 형성을 효과적으로 촉진한다. 따라서, 전체 방법은 바람직하게는 화학적 스페이서를 도입할 필요 없이도 히알루론산 주쇄에 단당류, 이당류, 및 올리고당류를 결합할 가능성을 제공한다.
본 발명에 따른 작용화된 유도체의 제조에서 사용될 수 있는 히알루론산의 유도체는 바람직하게는 다음과 같다:
- 히알루론산나트륨, 히알루론산칼륨, 히알루론산칼슘, 히알루론산마그네슘, 히알루론산아연, 히알루론산코발트, 히알루론산암모니아, 히알루론산테트라부틸암모늄, 및 이의 혼합과 같은, 히알루론산 염,
- EP0216453B1에 또한 기술된 것과 같이, 카르복실 기의 부분 또는 전체가 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 또는 헤테로시클릭 계열 알코올로 에스테르화된, 히알루론산 에스테르,
- EP0341745B1에 또한 기술된 것과 같이, 카르복실 기의 부분 또는 전체가 동일한 다당류 사슬 또는 기타 사슬의 알코올 기와 에스테르화된, 자기-가교결합된 히알루론산 에스테르,
- EP0265116B1에 또한 기술된 것과 같이 카르복실 기의 부분 또는 전체가 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 또는 헤테로시클릭 계열 폴리알코올과 에스테르화되고, 스페이서 사슬에 의해 가교결합을 형성하는, 가교결합된 히알루론산 화합물,
- WO96/357207에 또한 기술된 것과 같이, 히알루론산과 또는 히알루론산 에스테르의 부분 또는 전체와의 숙신산 헤미에스테르 또는 숙신산 중금속 염,
- WO95/25751에 또한 기술된 것과 같은 O-황산화 유도체, 또는 WO1998/045335에 또한 기술된 것과 같은 N-황산화 유도체.
상기 단당류, 이당류, 또는 올리고당류는 모이어티 Z에 대해 상술된 정의에 상응한다.
상기 아미노-보란은 바람직하게는 2-메틸피리딘 보란, 5-에틸-2-메틸피리딘 보란, 피리딘 보란, 트리메틸아민 보란, 트리에틸아민 보란, 디메틸아민 보란, tert-부틸아민 보란, 또는 이의 혼합이다. 보다 바람직하게, 상기 아미노-보란은 2-메틸피리딘 보란, 5-에틸-2-메틸피리딘 보란, 또는 이의 혼합이다.
아미노-보란은 그대로 사용될 수 있거나 알코올과 같은 수-혼화성 유기 용매에 미리 용해되거나 분산될 수 있다. 상기 알코올 중 가장 바람직한 것은 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 또는 이의 혼합이다.
상기 용어 "유기 용매”는 수용성 반응 용액의 유전 상수 (dielectric constant)를 낮출 수 있는 유기 수-혼화성 용매를 의미한다. 적합한 유기 용매는 아세톤, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 또는 이의 혼합이며, 바람직하게 유기 용매는 에탄올 또는 2-프로판올 또는 이의 혼합이다.
상기 용어 "카르복실 기 활성화제”는 상기 기의 히드록실 기능을 변형하여, 치환 반응에서 이의 제거를 촉진하는 시약을 의미한다. 카르복실 기의 활성화제는 히드록시벤조트리아졸, 1,1'-카르보디이미다졸, p-니트로페놀, N-히드록시술포숙신이미드 나트륨 염, N-히드록시숙신이미드, 및 이의 혼합을 포함한다.
적합한 카르보디이미드는 디시클로헥실카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필) 카르보디이미드, N,N'-디이소프로필카르보디이미드 및 이의 혼합을 포함한다.
선택적으로, 단계 iv)에서 분리된 침전물은 물의 퍼센트가 최대 30%, 보다 바람직하게는 최대 10%인, 물 및 유기 용매의 혼합물로 세척된다.
바람직하게, 단계 iii)에서, 히알루론산 또는 이의 유도체에 대한 단당류, 이당류, 또는 올리고당류의 몰비는 0.5 내지 30, 더욱 바람직하게는 1 내지 20, 보다 더 바람직하게는 1 내지 10이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의, 갈렉틴의 변화된 발현에 기인하는 병리의 치료에서의 용도에 관한 것이다. 상기 수용체의 상향/하향 조절에 의해 영향을 받는 병리의 비제한적인 예는 비-알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis), 판상형 건선 (plaque psoriasis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 신생물 (neoplasia), 및 섬유화 과정 (fibrotic pulmonary process), 신장 섬유화 과정 (fibrotic renal process), 및 심혈관 섬유화 과정 (fibrotic cardiovascular process이다.
신생물 (neoplasia) 및 섬유화 과정 (fibrotic process)의 예는 급성 림프 모구 백혈병 (acute lymphoblastic leukaemia), 특발성 섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis), 간 섬유증 (hepatic fibrosis), 심장 섬유증 (cardiac fibrosis), 신장 섬유증 (renal fibrosis), 및 난소 종양 (ovarian tumour), 전립선 종양 (prostate tumour), 종양 (lung tumour), 위 종양 (stomach tumour), 피부 종양 (skin tumour), 갑상선 종양 (thyroid tumour) 및 췌장 종양 (pancreas tumour)을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 정형외과 질환의 치료에서, 세포 성장을 위한 생체재료 또는 스캐폴드로서의 상기 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 성형/미용성형, 혈액 투석, 심장과, 혈관과, 안과, 이비인후과, 치과, 부인과, 비뇨기과, 피부과, 종양학과, 및 조직 복구에서, 세포 성장을 위한 생체재료 또는 스캐폴드로서의 상기 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체는 새로운 생물학적 특성을 가진 매체로 사용되는 물질의 표면에 제공되어, 의료 분야 및 기타 산업 분야에서 사용되는 물체를 코팅하기 위한 생체재료로 사용될 수 있다.
코팅될 수 있는 대상은, 예를 들어, 카테터, 튜브, 프로브, 심장 판막, 연조직 보철물, 동물 기원의 보철물, 인공 힘줄, 뼈 및 심혈관 보철물, 콘텍트 렌즈, 혈액 산소공급기, 인공 신장, 심장, 췌장, 간, 배양 및 세포 및 조직의 재생을 위한 혈액 주머니, 주사기, 수술 기구, 여과 시스템, 실험실 기구, 컨테이너, 펩티드, 단백질, 항체에 대한 배지를 포함한다.
작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체는 화장품 분야 및 피부과에서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체 및 적어도 하나의 약리 활성 물질 및/또는 적어도 하나의 생리활성 물질를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
적합한 약리 활성 물질은 항생제, 항-감염제, 항균제, 항바이러스제, 세포증식억제제, 세포독성제, 항-종양제, 항-염증제, 상처치료제, 마취제, 진통제, 혈관수축제, 콜린성 또는 아드레날린성 작용제 및 길항제, 항혈전제, 항응고제, 지혈제, 피브린용해제, 혈전용해제, 단백질 및 이의 단편, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 성장 인자, 효소, 백신, 또는 이의 조합을 포함한다.
바람직하게, 상기 생리활성 물질은 콜라겐, 피브리노겐, 피브린, 알긴산, 알긴산나트륨, 알긴산칼륨, 알긴산마그네슘, 셀룰로스, 황산 콘드로이틴, 황산데르마탄, 황산케라탄, 헤파린, 황산헤파란, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리카프로락톤, 젤라틴, 알부민, 폴리(글리콜리드-코-카프로락톤), 폴리(글리콜리드-코-트리메틸렌 카르보네이트), 히드록시아파타이트, 인산삼칼슘, 인산이칼슘, 탈회 골 기질 (demineralized bone matrix), 및 이의 혼합으로부터 선택된다.
바람직하게, 상기 적어도 하나의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체 및 상기 적어도 하나의 생리활성 물질은 100:1 내지 1:150의 중량비이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 갈렉틴의 변화된 발현에 기인하는 병리의 치료에서 상기 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 수용체의 상향/하향 조절에 의한 영향을 받는 병리의 비제한적인 예는 비-알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis), 판상형 건선 (plaque psoriasis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 신생물 (neoplasia), 및 폐 섬유화 과정 (fibrotic pulmonary process), 신장 섬유화 과정 (fibrotic renal process), 및 심혈관 섬유화 과정 (fibrotic cardiovascular process)이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 성형/미용성형, 혈액 투석, 심장과, 혈관과, 안과, 이비인후과, 치과, 부인과, 비뇨기과, 종양학과, 피부과, 및 조직 복구에서 상기 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 적어도 하나의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체를 약학 조성물의 중량을 기준으로 최대 10중량%, 보다 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의 최대 5중량%를 포함한다. 상기 적어도 하나의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의 양이 약학 조성물의 중량을 기준으로 0.5-5중량%인 약학 조성물이 특히 바람직하다.
구체적으로 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 상술한 것과 같은 적어도 하나의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체, 및 히드록시아파타이트, 인산삼칼슘 또는 이의 혼합을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 골격 시스템 관련 정형외과 응용분야에서 유리하게 사용된다.
약학 조성물은 경구, 근육내, 정맥내, 관절내, 경피, 피하, 또는 국소 외부적으로 또는 내부적으로, 예를 들어 수술적 수단에 의해 투여될 수 있다.
바람직하게, 상기 약학 조성물은 관절내, 경피, 또는 국소 내부적으로 투여된다.
약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함할 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 부형제는 예를 들어, pH 조절제, 등장성 조절제, 용매, 안정제, 킬레이트제, 희석제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 활택제, 착색제, 현탁제, 계면활성제, 동결방지제, 보존제, 및 산화방지제를 포함한다.
본 발명은 또한, 단독으로 또는 적어도 하나의 상술한 약리 활성 및/또는 생리활성 물질과 조합하여, 상술한 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체를 포함하는 생체재료에 관한 것이다. 상기 생체재료는 마이크로스피어, 나노스피어, 멤브레인, 스폰지, 와이어, 필름, 거즈, 가이드 웨이 (guide way), 탐폰, 겔, 하이드로겔, 직물, 부직포, 캐뉼라, 또는 이의 조합의 형태일 수 있다.
작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체에 대해 유리하고 이점이 있는 것으로 확인된 모든 양상은 상기 언급된 제조 방법, 조성물, 생체재료, 및 용도에 대해서도 동일하게 바람직하고 유리한 것으로 간주되어야 함이 이해되어야 한다.
더욱이, 상기 개시된 바람직한 양태의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체, 제조 방법, 조성물, 생체재료, 및 용도의 모든 가능한 조합도 역시 바람직하다는 것이 이해되어야 한다.
하기는 예시된 목적으로 제공된 본 발명의 실시예이다.
실시예
실시예 1. 환원 당의 1차 아민 유도체의 합성
(4-O-β-D-갈락토피라노실 1-아미노-1-데옥시-D-글루시톨 염산 염)
메탄올 내 락토스 (6.25% w/v) 및 암모늄 아세테이트 (56% w/v)의 용액을 실온에서 교반하며 락토스에 대해 등몰 양의 5-에틸-2-메틸피리딘 보란 복합체로 처리하였다. 이렇게 수득한 혼합물을 동일한 조건 하에 16시간 동안 보관한 다음, 조(raw) 반응 산물을 동일 부피의 이소프로판올과 혼합하고 이어 6N 염산을 이용하여 pH 2-3으로 산성화하여, 락토스의 아민 유도체의 염산 염을 침전시켰다. 이후 침전물을 분리하고 9와 동일한 pH까지 에탄올:물 (9:1, 3x), 에탄올:수산화나트륨 6N (95:5)의 혼합물로, 다시 에탄올:물 (9:1, 2x)로, 마지막으로 에탄올 (1x)로 세척하였다. 이렇게 수득한 고체를 감압 하에서 건조하고 추가 정제 없이 이후 합성 단계에서 사용하였다. 유도체는 IR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 90%.
실시예 2. 환원 당의 벤질아민 유도체의 합성
물 및 메탄올 (3:1) 내 락토스 (3% w/v), 벤질아민 (5% w/v) 및 5-에틸-2-메틸피리딘 보란 (6% w/v) 용액을 55℃의 온도에서 교반하고 20시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서, 혼합물을 식히고, 디클로로메탄으로 추출하고, 최종적으로, 저압에서 수성 상 증발시켜, 이후 에틸 에테르로 세척하고 디캔테이션(decantation)에 의해 최종적으로 회수한 후 감압 하에서 건조한 결정성 백색 고체를 얻었다. 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 90%.
실시예 3. 환원 당의 1차 아민 유도체의 합성
메탄올 및 물 (1:1) 내 실시예 2에 따라 수득한 유도체의 용액 (4% w/v)을 실온에서 자기 교반하며 두었다. 이어서, 석탄 (0.4% w/v) 상의 Pd를 가하고 이렇게 생산된 시스템을 수소로 가압하였다. 48시간 후, 상기 시스템을 감압하고, 동일 부피의 물, 디캔테이션한 고체 및 셀라이트 상에 여과한 용액을 혼합하였다. 이렇게 수득한 용액을 감압 하에서 건조하여, 백색 고체를 얻었다. 이렇게 수득한 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 96%.
실시예 4. 락토바이오닉산(lactobionic acid)의 이미다졸 아미드에 기초한 아실화 용액의 합성
디메틸 설폭시드 내 락토바이오닉산의 용액 (10% w/v)을 1,1-카르보디이미다졸 (1 eq.)과 혼합하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이렇게 수득한 용액을 이어 추가 정제 없이 사용하였다.
실시예 5. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루로네이트 나트륨의 합성 (48시간)
히드라진 일수화물 내 히드라진 설페이트 용액 (1% w/v)을 히알루로네이트 나트륨 (2% w/v)과 혼합하고 이렇게 수득한 시스템을 55℃로 가열하고 48시간 동안 교반하며 반응하도록 두었다. 이어서, 조 반응 산물을 식히고, 이후 에탄올로 침전시킨 후, 분리하고 에탄올로 세척하고 이어 24시간 동안 감압 하에서 건조하였다. 그 후, 이렇게 수득한 산물 (5% w/v)을 아세트산 수용액 (5% v/v)에 용해하고, 그 용액을 4℃까지 식힌 후 HIO3 수용액 (0.5 M, 60% v/v)을 적가하였다. 혼합물을 동일한 조건 하에서 1시간 동안 반응하도록 두고 이후 요오드화수소산 용액 (57% w/v, 용액에 대해서는 11% v/v)을 가한 후 시스템을 15분 더 반응하도록 두었다. 이후 용액을 완전 탈색될 때까지 에틸 에테르로 추출하고, NaOH (1N, 0.1N)로 수성 상의 pH를 7-7.5로 수정한 후, 마지막으로 산물을 에탄올로 침전시키고, 에탄올로 세척하고, 건조하였다. 산물을 1H-NMR 및 IR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 83%, 탈아세틸화도: 11%.
실시예 6. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루로네이트 나트륨의 합성 (72시간)
히드라진 수화물 내 히알루론산나트륨 (2% w/v) 및 히드라진 설페이트 (1% w/v) 용액을 55℃의 온도에서 72시간 동안 자기 교반하며 두었다. 반응 시간이 끝날 때, 에탄올을 가하여 폴리머를 침전시키고, 수득한 고체를 이후 에탄올로 추가 세척하고 질소 흐름 하에서 건조하였다. 산물을 수성 아세트산 용액 (6% w/v, 5% 아세트산)에 다시 용해하고, 0-5℃로 온도 조절하고 물 내 부피 (0.8 eq./부피)의 요오드산 (7.5% w/v)과 혼합하였다. 이렇게 수득한 시스템을 1시간 동안 교반하며 두고, 이후 부피 (0.11 eq./부피)의 수성 요오드화수소산 (57%)과 혼합한 후, 15분 더 반응하도록 두었다. 이어서, NaOH 1M 수용액을 가하여 pH를 9로 조정하고 용액을 완전 탈색될 때까지 에틸 에테르로 추출하였다. 그 후, 산물을 에탄올로 침전시키고, 에탄올로 세척하고, 감압 하에서 건조한 후, IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 86%, 탈아세틸화도: 20%.
실시예 7. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루로네이트 나트륨의 합성 (96시간)
히드라진 일수화물 내 히드라진 설페이트 용액 (1% w/v)을 히알루로네이트 나트륨 (2% w/v)과 혼합하고 이렇게 수득한 시스템을 55℃로 가열하고 96시간 동안 교반하며 반응하도록 두었다. 이어서, 조 반응 산물을 식히고, 이후 에탄올로 침전시킨 후, 분리하고 에탄올로 세척하고 이어 24시간 동안 감압 하에서 건조하였다. 그 후, 이렇게 수득한 산물 (5% w/v)을 아세트산 수용액 (5% v/v)에 용해하고, 용액을 4℃로 식힌 후 HIO3 수용액 (0.5 M, 60% v/v)을 적가하였다. 혼합물을 동일한 조건 하에서 1시간 동안 반응하도록 두고 요오드화수소산 수용액 (57% w/v, 용액에 대하여 11% v/v)을 가한 후 시스템을 15분 더 반응하도록 두었다. 용액을 완전 탈색될 때까지 에틸 에테르로 추출하고, 수성 상의 pH를 NaOH (1N, 0.1N)로 7-7.5로 조정하고, 마지막으로 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 에탄올로 세척하고, 건조하였다. 산물을 1H-NMR 및 IR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 86%, 탈아세틸화도: 21%.
실시예 8. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루로네이트 나트륨의 합성 (120시간)
히드라진 일수화물 내 히드라진 설페이트 용액 (1% w/v)을 히알루로네이트 나트륨 (2% w/v)과 혼합하고 이렇게 수득한 시스템을 55℃로 가열하고 120시간 동안 교반하며 반응하도록 두었다. 이어서, 조 반응 산물을 식히고, 이후 에탄올로 침전시킨 후, 분리하고 에탄올로 세척하고 이어 24시간 동안 감압 하에서 건조하였다. 그 후, 이렇게 수득한 산물 (5% w/v)을 아세트산 수용액 (5% v/v)에 용해시키고, 용액을 4℃로 식히고 HIO3 수용액 (0.5 M, 60% v/v)을 적가하였다. 혼합물을 동일한 조건 하에서 1시간 동안 반응하도록 둔 후 요오드화수소산 용액 (57% w/v, 용액에 대하여 11% v/v)을 가하고 시스템을 15분 더 반응하도록 두었다. 용액을 완전 탈색될 때까지 에틸 에테르로 추출하고, 수성 상의 pH를 NaOH (1N, 0.1N)로 7-7.5로 조정하고, 마지막으로, 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 에탄올로 세척하고, 건조하였다. 산물을 1H-NMR 및 IR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 89%, 탈아세틸화도: 26%.
실시예 9. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루로네이트 나트륨의 합성 (24시간)
히드라진 수화물 내 히알루론산나트륨 (2% w/v) 및 요오드화 암모늄 (0.7% w/v)의 용액을 60℃의 온도에서 24시간 동안 자기 교반하며 두었다. 반응 시간이 끝날 때, 에탄올을 가하여 폴리머를 침전시키고 수득한 고체를 이후 에탄올로 세척하고 질소 흐름 하에서 건조하였다. 그 산물을 수성 아세트산 용액 (6% w/v, 5% 아세트산)에 다시 용해시키고, 0-5℃로 온도 조절한 후 물 내 부피 (0.8 eq./부피)의 요오드산 용액 (7.5% w/v)과 혼합하였다. 이렇게 수득한 시스템을 1시간 동안 교반하며 둔 후, 부피 (0.11 eq./부피)의 수성 요오드화수소산 (57%)과 혼합하고 15분 더 반응하도록 두었다. 이어서, NaOH 1 M 수용액을 가하여 pH를 9로 조정하고 용액을 완전 탈색될 때까지 에틸 에테르로 추출하였다. 그 후, 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 에탄올로 세척하고, 감압 하에서 건조하였다. 이렇게 수득한 고체를 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 88%, 탈아세틸화도: 15%.
실시예 10. 테트라부틸암모늄을 이용한 히알루론산 염의 제조
테트라부틸암모늄 용액 (40% w/v)으로 미리 활성화한 테트라부틸암모늄 염 (용액에 대하여 50% V/V) 형태의 술폰계 수지로 충전된 컬럼을 통해 히알루론산나트륨 수용액 (1.6% w/v)을 여과하였다. 용출된 용액을 이후 동결건조하였다.
실시예 11. 테트라부틸암모늄을 이용한 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산 염의 제조
테트라부틸암모늄 용액 (40% w/v)으로 미리 활성화한 테트라부틸암모늄 염 (용액에 대하여 50% v/v) 형태의 술폰계 수지로 충전된 컬럼을 통해 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산나트륨의 수용액 (1.6% w/v)을 여과하였다. 용출된 용액을 이후 동결건조하였다.
실시예 12. 히알루론산의 아미드 유도체 (환원 당의 아민 유도체를 이용하여 아미드화)
물 내 히알루론산나트륨 용액 (0.25% w/v)을 실시예 1에서 수득한 아민 유도체 (30 eq.)와 혼합하고, 수득되는 용액의 pH를 수산화나트륨 (1N, 0.1N) 또는 염산 (1N, 0.1N)을 적절히 가하여 6.8로 조정하였다. 이어서, 물:디메틸 설폭시드 (1.1:1)에 미리 용해된 (3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (5 eq., 11% w/v) 및 히드록시벤조트리아졸 (3.5 eq., 6% w/v)의 용액을 적가하였다. 수산화나트륨 (1N, 0.1N)을 적절히 첨가하여 용액의 pH를 6.8로 조정하고 수득되는 조 산물을 실온에서 16시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서, pH를 수산화나트륨/염산 (0.1N)으로 7로 적절하게 조정하고 수득되는 용액을 물에 대해 반복적으로 투석하였다 (컷오프: 12-14000). 그 후, 5% w/v 역가(titer)에 도달할 때까지 용액을 염화나트륨과 혼합하고, 목적하는 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 건조하고 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 88%, 환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화: 88%.
실시예 13. 히알루론산의 아미드 유도체 (환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화)
NaOH 0.1 M 수용액 또는 HCl 0.1 M의 수용액을 첨가하여 pH를 6.8로 유지하며, 히알루론산나트륨 (3% w/v), 히드록시벤조트리아졸 (0.4% w/v), N-에틸-N-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (0.6% w/v) 및 실시예 3에 따라 수득한 락토스의 아민 유도체 (2% w/v)를 포함하는 수용액을 22시간 동안 교반하도록 두었다. 이어 NaCl (5 g/100 mL)을 첨가하고 메탄올로 산물을 침전시켰다. 이렇게 수득한 고체를 디캔테이션으로 회수하고, 메탄올 및 물 (4:1), 순수 메탄올로 세척하고, 마지막으로 감압 하에서 건조하였다. 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 86%, 환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화: 27%.
실시예 14. 히알루론산의 아미드 유도체 (환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화)
히알루론산나트륨 (0.5% w/v), N-히드록시숙신이미드 (1.3% w/v), N-에틸-N-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 (1.0% w/v), 및 실시예 3에 따라 수득한 락토스의 아민 유도체 (2.1% w/v)를 포함하는, 물 및 디옥산 (1:1)의 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 시간이 끝날 때, pH를 약 9-10으로 조정하며 탄산수소나트륨을 가하고, 용액을 3시간 더 교반하도록 두었다. 아세트산 (50%, v/v)을 가하여 혼합물의 pH를 7로 조정하고, 이어서 염화나트륨 (5 g/100 mL)을 가하고 이후 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 에탄올 및 에테르로 세척하고, 마지막으로 감압 하에서 건조하였다. 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 85%, 환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화: 21%.
실시예 15. 유기 매질 내 히알루론산의 아미드 유도체 (환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화)
디메틸 설폭시드 내 히알루론산 테트라부틸암모늄 염 (2% w/v)의 용액을 pH를 3으로 조정하기 위해 수성 염산으로 처리하고 이어 1,1-카르보닐디이미다졸 (1.5 eq.)을 혼합하고 12시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서, 용액을 구치 도가니 (Gooch crucible)로 여과하여 고체 모이어티를 제거하고, 실시예 1에서 수득한 아민 유도체 (2 eq.)를 첨가하고 이렇게 수득한 혼합물을 48시간 동안 반응하도록 두었다. 그 후, 포화 염화나트륨 용액을 염화나트륨 내 5% w/v의 최종 역가를 얻기에 충분한 양으로 가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하도록 둔 후, 마지막으로 아세톤을 가하여 산물을 침전시키고 수득한 고체를 분리한 후 건조하였다. 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 80%, 환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화: 10%.
실시예 16. 유기 매질 내 히알루론산의 아미드 유도체 (환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화(amidation))
디메틸포름아미드 내 히알루론산나트륨의 용액 (2% w/v)을 1,1-카르보닐디이미다졸 (1 eq.)과 혼합하였다. 이렇게 수득한 용액을 6시간 동안 반응하도록 두고, 이후 실시예 1에서 수득한 아민 유도체 (5 eq.)를 가하고 36시간 동안 더 시스템을 반응하도록 두었다. 이어서, 산물을 아세톤으로 침전시키고, 분리한 다음, 아세톤으로 세척하고, 이어 감압 하에서 건조하였다. 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 80%, 환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화: 57%.
실시예 17. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아민 유도체 (환원 당을 이용한 환원 아미노화(amination))
실시예 7에 따라 수득한 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산나트륨의 수용액 (1.5% w/v)을 락토스 (10 eq.)와 혼합하고 pH를 5.5 부근의 값에 도달하도록 아세트산 (100%)으로 조정하였다. 이렇게 수득한 시스템을 60℃까지 가열하고 메탄올 내 2-메틸피리딘 보란 용액 (10 eq., 10% w/v)과 혼합하여 2시간 동안 동일한 조건 하에서 반응하도록 두었다. 이어서, 용액의 pH를 2-3 부근의 값에 도달하도록 수성 염산 (4N)으로 조정하고 시스템을 동일한 조건 하에서 15분 동안 유지하였다. 이후 시스템을 냉각시키고, pH를 NaOH (1N)를 이용하여 7-7.5로 조정하고 수득되는 용액을 물에 대해 반복하여 투석하였다 (컷오프: 12-14000). 마지막으로, 5% w/v 역가에 도달할 때까지 용액을 염화나트륨과 혼합하고 목적한 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 건조하고 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 80%, 환원 당을 이용한 아미노화: 21%.
실시예 18. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아민 유도체 (환원 당을 이용한 환원 아미노화)
실시예 7에 따라 수득한 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산나트륨의 수용액 (1.5% w/v)을 락토스 (10 eq.)와 혼합하고 pH를 5.5 부근의 값에 도달하도록 아세트산 (100%)으로 조정하였다. 이렇게 수득한 시스템을 60℃까지 가열하고 메탄올 내 2-메틸피리딘 보란 용액 (10 eq., 10% w/v)과 혼합한 후 2시간 동안 동일한 조건 하에서 반응하도록 두었다. 이어서, 용액의 pH를 2-3 부근의 값에 도달하도록 수성 염산 (4N)으로 조정하고 시스템을 동일한 조건 하에서 15분 동안 유지하였다. 그 후, 시스템을 냉각시키고, pH를 NaOH (1N)로 7-7.5까지 조정하고 5% w/v의 역가에 도달할 때까지 염화나트륨을 가하였다. 목적한 산물을 이후 에탄올로 침전시킨 후, 건조하고, IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 84%, 환원 당을 이용한 아미노화: 21%.
실시예 19. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아민 유도체 (환원 당을 이용한 환원 아미노화)
실시예 5에 따라 수득한 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산나트륨의 수용액 (1.5% w/v)을 락토스 (10 eq.)와 혼합하고 pH를 5.5 부근의 값에 도달하도록 아세트산 (100%)으로 조정하였다. 이렇게 수득한 시스템을 60℃까지 가열하고 메탄올 내 2-메틸피리딘 보란 용액 (10 eq., 10% w/v)과 혼합한 후 2시간 동안 동일한 조건 하에서 반응하도록 두었다. 이어서, 용액의 pH를 2-3 부근의 값에 도달하도록 수성 염산 (4N)으로 조정하고 시스템을 동일한 조건 하에서 15분 동안 유지하였다. 이후 시스템을 냉각시키고, pH를 NaOH (1N)로 7-7.5로 조정하고 수득되는 용액을 물에 대해 반복하여 투석하였다 (컷오프: 12-14000). 마지막으로, 5% w/v의 역가에 도달할 때까지 용액을 염화나트륨과 혼합하고 목적한 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 건조하고 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 78%, 환원 당을 이용한 아미노화: 11%.
실시예 20. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아민 유도체 (환원 당을 이용한 환원 아미노화)
실시예 6에 따라 수득한 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산나트륨의 수용액 (2% w/v)을 락토스 (3 eq.)와 혼합하고 pH를 5.5 부근의 값에 도달하도록 아세트산 (100%)으로 조정하였다. 이렇게 수득한 시스템을 60℃까지 가열하고 이소프로판올 내 2-메틸피리딘 보란 용액 (1 eq., 10% w/v)과 혼합한 후 3시간 동안 동일한 조건 하에서 반응하도록 두었다. 이어서, 반응물의 pH를 2-3 부근의 값에 도달하도록 수성 염산 (4N)으로 조정하였고 시스템을 동일한 조건 하에서 15분 동안 유지하였다. 그 후, 시스템을 냉각시키고 이소프로판올을 가하여 산물을 침전시키고, 이소프로판올:물 (80:20 및 90:10)로 세척한 후 감압 하에서 건조하였다. 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 95%, 환원 당을 이용한 아미노화: 20%.
실시예 21. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아민 유도체 (환원 당을 이용한 환원 아미노화)
실시예 9에 따라 수득한 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산나트륨의 수용액 (2% w/v)을 락토스 (3 eq.)와 혼합하고 pH를 5.5 부근의 값에 도달하도록 아세트산 (100%)으로 조정하였다. 이렇게 수득한 시스템을 60℃까지 가열하고 이소프로판올 내 2-메틸피리딘 보란 용액 (1 eq., 10% w/v)과 혼합한 후 3시간 동안 동일한 조건 하에서 반응하도록 두었다. 이어서, 반응물의 pH를 2-3 부근의 값에 도달하도록 수성 염산 (4N)으로 조정하고 시스템을 동일한 조건 하에서 15분 동안 유지하였다. 그 후, 시스템을 냉각시키고, 이소프로판올을 가하여 산물을 침전시킨 후, 이소프로판올: 물 (80:20 및 90:10)로 세척하고 감압 하에서 건조하였다. 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 95%, 환원 당을 이용한 아미노화: 15%.
실시예 22. 실시예 17-21에 따라 수득한 화합물의 아미드 유도체 (환원 당을 이용한 히알루론산의 환원 아미노화를 통해 수득한 유도체의 아미드화)
물 내 실시예 17에 따라 수득한 히알루론산의 아민 유도체의 용액 (0.25% w/v)을 실시예 1에서 수득한 아민 유도체 (30 eq.)와 혼합하고 수득되는 용액의 pH를 수산화나트륨 (1N, 0.1N) 또는 염산 (1N, 0.1N)을 적절히 가하여 6.8로 조정하였다. 이어서, 물:디메틸 설폭시드 (1.1:1)에 미리 용해된 (3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (5 eq., 11% w/v) 및 히드록시벤조트리아졸 (3.5 eq., 6% w/v)의 용액을 적가하였다. 수산화나트륨 (1N, 0.1N)을 적절히 가하여 용액의 pH를 6.8로 조정하고 수득되는 조 산물을 실온에서 16시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서, 수산화나트륨/염산 (0.1N)을 이용하여 pH를 7로 적절히 조정하고 수득되는 용액을 물에 대해 반복하여 투석하였다 (컷오프: 12-14000). 그 후, 5% w/v의 역가에 도달할 때까지 용액을 염화나트륨과 혼합하고 목적한 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 건조하고 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 90%, 환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화: 90%.
실시예 23. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아미드 유도체 (환원 당의 카르복실 유도체를 이용한 아실화)
물 내 실시예 7에 따라 수득한 탈아세틸화된 히알루론산나트륨의 용액 (0.30% w/v)을 락토바이오닉산 (30 eq.)과 혼합하고 수득되는 용액의 pH를 수산화나트륨 (1N, 0.1N) 또는 염산 (1N, 0.1N)을 적절히 가하여 6.8로 조정하였다. 이어서, 물: 디메틸 설폭시드 (1.1:1)에 미리 용해된 (3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (5 eq., 11% w/v) 및 히드록시벤조트리아졸 (3.5 eq., 6% w/v) 용액을 적가하였다. 수산화나트륨 (1N, 0.1N)을 적절히 가하여 용액의 pH를 6.8로 조정하고 수득되는 조 산물을 실온에서 16시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서, 수산화나트륨/염산 (0.1N)을 이용하여 pH를 7로 적절히 조정하고 수득되는 용액을 물에 대해 반복하여 투석하였다 (컷오프: 12-14000). 그 후, 5% w/v의 역가에 도달할 때까지 용액을 염화나트륨과 혼합하고 목적한 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 건조하고 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 79%, 락토바이오닉산을 이용한 아실화: 5%.
실시예 24. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아미드 유도체 (환원 당의 카르복실 유도체를 이용한 아실화)
실시예 4에 따라 제조된 락토바이오닉산 용액을 물 내 실시예 7에 따라 수득한 탈아세틸화된 히알루론산나트륨의 용액 (0.5 eq., 0.30% w/v)에 가하고 그렇게 수득한 조 산물을 실온에서 16시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서, 수산화나트륨/염산 (0.1N)을 이용하여 pH를 7로 적절히 조정하고 수득되는 용액을 물에 대해 반복하여 투석하였다 (컷오프: 12-14000). 그 후, 5% w/v의 역가에 도달할 때까지 용액을 염화나트륨과 혼합하고 목적한 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 건조하고 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 87%, 락토바이오닉산을 이용한 아실화: 16%.
실시예 25. 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아미드 유도체 (환원 당의 카르복실 유도체를 이용한 아실화)
실시예 4에 따라 제조된 락토바이오닉산의 용액을 물 내 실시예 7에 따라 수득한 탈아세틸화된 히알루론산나트륨 용액 (0.5 eq., 30% w/v)에 가하고 그렇게 수득한 조 산물을 실온에서 16시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서, 포화 염화나트륨 용액을 염화나트륨 내 5% w/v의 최종 역가를 얻기에 충분한 양으로 가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하도록 둔 후, 마지막으로 아세톤을 가하여 산물을 침전시키고 수득한 고체를 분리한 후 건조하였다. 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 85%, 락토바이오닉산을 이용한 아실화: 16%.
실시예 26. 유기 매질 내 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아미드 유도체 (환원 당의 카르복실 유도체를 이용한 아실화)
실시예 4에 따라 제조된 락토바이오닉산 용액을 디메틸 설폭시드 내 실시예 11에 따라 수득한 탈아세틸화된 테트라부틸암모늄 히알루로네이트 용액 (0.5 eq., 2% w/v)에 가하고 그렇게 수득한 조 산물을 실온에서 16시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서, 포화 염화나트륨 용액을 염화나트륨 내 5% w/v의 최종 역가를 얻기에 충분한 양으로 가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하도록 둔 후, 마지막으로 아세톤을 가하여 산물을 침전시키고 수득한 고체를 분리한 후 건조하였다. 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 80%, 락토바이오닉산을 이용한 아실화: 10%.
실시예 27. 유기 매질 내 부분적으로 탈아세틸화된 히알루론산의 아미드 유도체 (환원 당의 카르복실 유도체를 이용한 아실화)
실시예 4에 따라 제조된 락토바이오닉산 용액을 디메틸포름아미드 내 실시예 7에 따라 수득한 탈아세틸화된 히알루론산나트륨 용액 (0.5 eq., 2% w/v)에 가하고 이렇게 수득한 조 산물을 실온에서 16시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서, 포화 염화나트륨 용액을 염화나트륨 내 5% w/v의 최종 역가를 얻기에 충분한 양으로 가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하도록 둔 후, 마지막으로 아세톤을 가하여 산물을 침전시키고 수득한 고체를 분리한 후 건조하였다. 산물을 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 88%, 락토바이오닉산을 이용한 아실화: 19%.
실시예 28. 실시예 23-27에 따라 수득한 화합물의 아미드 유도체 (환원 당의 아민 유도체를 이용한 히알루론산의 아실화를 통해 수득한 유도체의 아미드화)
물 내 실시예 24에 따라 수득한 히알루론산의 아미드 유도체의 용액 (0.25% w/v)을 실시예 1에서 수득한 아민 유도체 (30 eq.)와 혼합하고 수득되는 용액의 pH를 수산화나트륨 (1N, 0.1N) 또는 염산 (1N, 0.1N)을 적절히 가하여 6.8로 조정하였다. 이어서, 물:디메틸 설폭시드 (1.1:1)에 미리 용해된 (3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (5 eq., 11% w/v) 및 히드록시벤조트리아졸 (3.5 eq., 6% w/v) 용액을 적가하였다. 수산화나트륨 (1N, 0.1N)을 적절히 가하여 용액의 pH를 6.8로 조정하고 수득되는 조 산물을 실온에서 16시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서, 수산화나트륨/염산 (0.1N)을 이용하여 pH를 7로 적절히 조정하고 수득되는 용액을 물에 대해 반복하여 투석하였다 (컷오프: 12-14000). 그 후, 5% w/v의 역가에 도달할 때까지 용액을 염화나트륨과 혼합하고 목적한 산물을 에탄올로 침전시킨 후, 건조하고 IR 및 1H-NMR 분광법으로 특성화하였다. 반응 수율: 84%, 환원 당의 아민 유도체를 이용한 아미드화: 93%.
실시예 29. 염증성 마커의 감소
NIH-3T3 라인 마우스 섬유아세포를 10% 태아 송아지 혈청 FCS 존재하에서 DMEM 내에 증식시키고 IL1β 1ng/ml를 24시간 동안 처리하였다. 이어서, 일부 배양물을 실시예 13에 따라 수득한 히알루론산의 아미드 유도체와 함께 1.25 mg/ml 농도로 배양하였다. qPCR에 의한 전염증성 사이토카인 TGF-β1의 발현의 후속 분석을 위해 6, 12, 및 24시간 째에 처리물로부터 세포 RNA를 추출하였다. 상기 분석은 RotorGene Q 시리즈를 이용하여 수행하였는데, 이는 증폭 반응 동안 유전자 발현이 정량화되도록 한다. qPCR을 위한 반응 혼합물에는, 이중-가닥 DNA 분자의 작은 홈 (minor groove)에 결합하는 형광 분자가 있다. 각 반응에 대해 음성 대조군도 수행되었다 (cDNA이 없는 반응 혼합물). 실험은 이중으로 수행되었고 통계 분석은 양측 (two-tailed) t-검정에 의해 수행되었다. t-검정 값 <0.05의 차이는 유의한 것으로 간주되었다. 표에 명시된 값은 Pfaffl 2^-ΔΔCt 방법 (PfafflM.V. Nucleic Acid Research 2001, 29 (9): e45)을 이용한 상대적 정량화에 따라 수득한 2^-ΔΔCt에 상응한다:
ΔCt=Ct 하우스키핑(housekeeping) - Ct 유전자 표적
ΔΔCt=ΔCt 샘플- ΔCt 대조군
2^-ΔΔCt
시간
(시간) 		비처리
대조군 		IL1β 처리
대조군 		IL1β및
히알루론산의 아미드 유도체로
처리한 군
TGF-β1 TGF-β1 TGF-β1
6 1.000 2.101 1.289
12 1.000 1.112 0.946
24 1.000 0.778 0.462
갈렉틴에 의해 영향을 받는 병리학적 과정을 조절하는 능력은 실시예 29에 의해 잘 입증되는데, 본 발명에 따라 수득한 히알루론산 유도체는 섬유증 (fibrosis)과 같이, 갈렉틴 3에 의해 조절되는 과정 내 염증 캐스케이드의 다운스트림 사이토카인인 TGF-β1의 발현을 감소시키는 뛰어난 능력이 있음을 입증한다.

Claims (10)

  1. 화학식 (I)을 갖는 작용화된 히알루론산(functionalized hyaluronic acid) 또는 이의 유도체:
    Figure pct00006
    (I)
    여기서
    R1, R2, R3, R4는, 각각 독립적으로, H, SO3 -, 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 계열의 카르복실산으로부터 유도된 아실 기, -CO-(CH2)2-COOY이고, 여기서 Y는 음전하 또는 H이고,
    R은 Z(1) 또는 Z(2)이며, R5는 -CO-CH3, H, SO3 -, 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 계열의 카르복실산으로부터 유도된 아실 기, 히알루론산의 아실 기이고,
    여기서 Z(1)은 화학식 (1)의 모이어티(moiety)이고:
    Figure pct00007
    (1)
    여기서 Z1은 -NR6CH2-이고, R6은 H, 또는 치환된 또는 비-치환된, 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 기이고,
    Z2는 -OH, 또는 -NHCOCH3이고,
    Z3은 H, 단당류, 이당류, 또는 올리고당류이고,
    또는 Z(2)는 화학식 (2)의 모이어티이고:
    Figure pct00008
    (2)
    여기서 Z4는 -NR6CH-이고, R6은 H, 또는 치환된 또는 비-치환된, 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 기이고,
    Z5 및 Z6은, 각각 독립적으로, H, 단당류, 이당류, 또는 올리고당류이고,
    또는
    R5는 Z(3) 또는 Z(4)이고, R은 NR6R7, 또는 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 계열의 알코올 기, OH, O-, 히알루론산의 알코올 기, 히알루론산의 아미노 기이고, R6, R7은, 각각 독립적으로, H, 또는 치환된 또는 비-치환된, 지방족, 방향족, 아릴지방족, 지환족, 헤테로시클릭 기이고,
    여기서 Z(3)은 화학식 (3)의 모이어티이고:
    Figure pct00009
    (1)
    여기서 Z1은 -CH2- 또는 -CO-이고,
    Z2는 -OH, 또는 -NHCOCH3이고,
    Z3은 H, 단당류, 이당류, 또는 올리고당류이고,
    또는 Z(4)는 화학식 (4)의 모이어티이고:
    Figure pct00010
    (2)
    여기서 Z4는 -CH-이고,
    Z5 및 Z6은, 각각 독립적으로, H, 단당류, 이당류, 또는 올리고당류이고,
    또는
    R은 Z(1) 또는 Z(2)이고, R5는 Z(3) 또는 Z(4)이다.
  2. 제1항에 있어서,
    Z3, Z5 및 Z6이, 각각 독립적으로, H, 글루코스, 갈락토스, 아라비노스, 자일로스, 만노스, 락토스, 트레할로스, 겐티오비오스, 셀로비오스, 셀로트리오스, 말토스, 말토트리오스, 키토비오스, 키토트리오스, 만노비오스, 멜리비오스, 프럭토스, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토사민의 모이어티, 또는 이의 조합인, 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    Z3이 H, 글루코스, 갈락토스, 만노스, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토사민의 모이어티, 또는 이의 조합인, 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    Z가 락토스 또는 갈락토스의 모이어티이고, 여기서 Z는 Z(1), Z(2), Z(3) 및 Z(4) 중 어느 하나인, 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체.
  5. i) 히알루론산 또는 이의 부분 또는 전부 탈아세틸화된 유도체를 제공하는 단계;
    ii) 환원 아미노화 반응을 통해 단당류, 이당류, 올리고당류의 아민 유도체를 제공하는 단계;
    iii)
    a) 카르보디이미드의 존재하에서 및/또는 카르복시 기 활성화제의 존재하에서 상기 단계 i)의 히알루론산을 단계 ii)의 아민 유도체와 반응시키거나;
    b) 아미노-보란의 존재하에서 상기 단계 i)의 부분적으로 또는 전부 탈아세틸화된 유도체를 단당류, 이당류, 올리고당류와 반응시키거나;
    c) 카르보디이미드의 존재하에서 및/또는 카르복시 기 활성화제의 존재하에서 단계 i)의 부분적으로 또는 전부 탈아세틸화된 유도체를 단당류, 이당류, 올리고당류의 카르복실 유도체와 반응시키거나;
    d) 카르보디이미드의 존재하에서 및/또는 카르복시 기 활성화제의 존재하에서 단계 iii-b)에서 수득된 유도체를 단계 ii)의 아민 유도체와 반응시키거나;
    e) 카르보디이미드의 존재하에서 및/또는 카르복시 기 활성화제의 존재하에서 단계 iii-c)에서 수득된 유도체를 단계 ii)의 아민 유도체와 반응시키는 단계;
    및
    iv) 이와 같이 수득된 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체를 유기 용매를 이용하여 침전시키는 단계를 포함하는, 제1항의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    히알루론산 또는 이의 유도체에 대한 단계 iii)의 단당류, 이당류 또는 올리고당류의 몰비가 0.5 내지 30, 바람직하게는 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 1 내지 10인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    갈렉틴의 변화된 발현에 기인하는 병리(pathology)의 치료에 사용하기 위한, 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체로서, 상기 병리가 비-알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis), 판상형 건선 (plaque psoriasis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 신생물 (neoplasia), 및 폐 섬유화 과정 (fibrotic pulmonary process), 신장 섬유화 과정 (fibrotic renal process), 및 심혈관 섬유화 과정 (fibrotic cardiovascular process)을 포함하는, 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체.
  8. 제1항에 있어서,
    정형외과 병리의 치료에서, 세포 성장을 위한 생체재료 또는 스캐폴드(scaffold)로 사용하기 위한, 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체.
  9. 적어도 하나의 제1항의 작용화된 히알루론산 또는 이의 유도체, 및 적어도 하나의 약리 활성 물질 및/또는 적어도 하나의 생리활성 물질(bioactive substance)을 포함하는 약학 조성물로서,
    - 상기 약리 활성 물질은 항생제, 항-감염제, 항균제, 항바이러스제, 세포증식억제제, 세포독성제, 항종양제, 항-염증제, 상처치료제, 마취제, 진통제, 혈관수축제, 콜린성 또는 아드린날린성 작용제 및 길항제, 항혈전제, 항응고제, 지혈제, 피브린용해제, 혈전용해제, 단백질 및 이의 단편, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 성장 인자, 효소, 백신, 및 이의 조합으로부터 선택되며,
    - 상기 생리활성 물질은 콜라겐, 피브리노겐, 피브린, 알긴산, 알긴산나트륨, 알긴산칼륨, 알긴산마그네슘, 셀룰로스, 황산콘드로이틴, 황산데르마탄, 황산케라탄, 헤파린, 황산헤파란, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리카프로락톤, 젤라틴, 알부민, 폴리(글리콜리드-코-카프로락톤), 폴리(글리콜리드-코-트리메틸렌 카르보네이트), 히드록시아파타이트, 인산삼칼슘, 인산이칼슘, 탈회 골 기질 (demineralized bone matrix), 및 이의 혼합으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    갈렉틴의 변화된 발현에 기인하는 병리의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물로서, 상기 병리가 비-알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis), 판상형 건선 (plaque psoriasis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 신생물 (neoplasia), 및 폐 섬유화 과정 (fibrotic pulmonary process), 신장 섬유화 과정 (fibrotic renal process), 및 심혈관 섬유화 과정 (fibrotic cardiovascular process)을 포함하는, 약학 조성물.
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