KR20200084897A - Vegf 길항제를 포함하는 액상 조성물 - Google Patents

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Abstract

인산염, 히스티딘, 또는 이들의 조합을 포함하는 완충제, 및 염화나트륨을 포함하지 않거나 및/또는 트레할로오스, 수크로오스, 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 안정화제를 포함하는 단백질의 안정화용 조성물; 상기 안정화용 조성물 및 단백질을 포함하는 단백질의 안정화된 액상 조성물; 및 상기 안정화용 조성물을 사용하는 안정화된 액상 조성물의 제조 방법이 제공된다.

Description

VEGF 길항제를 포함하는 액상 조성물
단백질의 안정화된 액상 제형과 관련된 것으로, 인산염, 히스티딘, 또는 이들의 조합을 포함하는 완충제, 및 염화나트륨을 포함하지 않거나 및/또는 트레할로오스, 수크로오스, 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 안정화제를 포함하는 단백질의 안정화용 조성물; 상기 안정화용 조성물 및 단백질을 포함하는 안정화된 액상 조성물; 및 상기 안정화용 조성물을 사용하는 안정화된 액상 조성물의 제조 방법과 관련된 것이다.
융합 단백질 의약품은 일반적인 단백질 의약품에 비해 분자량이 크고 구조가 복잡하여 물리화학적 불안정성을 초래할 가능성이 높으므로 적합한 제형 개발이 요구된다. 단백질 의약품의 화학적 및 물리적 안정성은 pH 조건, buffer 종류, 단백질의 농도, excipient 및 온도 등 다양한 조건에 의해 최적화할 수 있다. 융합 단백질의 안정성을 확보하면서 약리적 활성을 유지하도록 하는 제형의 개발을 위하여, 완충제 변경, pH 최적화, 및 안정화제 첨가 등의 다양한 수단이 사용되고 있다.
한편, 황반변성 치료제인 EYLEA®(aflibercept)는 액상 제형 약물로 40 mg/mL aflibercept, pH 6.2, 10 mM 인산나트륨, 40 mM NaCl, 5%(w/v) 수크로오스, 및 0.03%(w/v) 폴리소르베이트 20의 조성을 갖는다. 안구 투여 약물의 경우 일반적인 바이오 의약품에 비해 sub-visible particle의 규제 기준이 엄격하므로 (표 1 참조), particulate 측면도 함께 고려된 제형 개발이 필요하다.
Sub-visible particle 검출 기준
Category Number of particles
≥10 um ≥25 um
Small-volume (≤100 mL)injections <6,000/container <600/container
Large-volume (>100 mL)injections <25/mL <3/mL
Ophthalmic solution <50/mL <5/mL
* USP 788, 789 기반, light obscuration test 기준
이에, 단백질 약물의 안정성을 증진시키는 안정화용 조성물 및 이를 포함하는 단백질 약물의 안정한 액상 조성물이 제공된다.
일 예는
인산나트륨, 히스티딘, 및 이들의 조합을 포함하는 완충제, 및
염화나트륨을 포함하지 않거나 및/또는 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 안정화제
를 포함하는 단백질 약물의 안정화용 조성물을 제공한다.
다른 예는 단백질; 인산나트륨, 히스티딘, 및 이들의 조합을 포함하는 완충제; 및 염화나트륨을 포함하지 않거나 및/또는 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 안정화제를 포함하는 액상 조성물을 제공한다.
예컨대, 상기 액상 조성물은,
(1) 단백질 5 mg/ml 내지 100 mg/ml;
(2) pH 4 내지 8의 완충제; 및
(3) 안정화제
를 포함하고,
상기 완충제는 인산나트륨, 히스티딘, 또는 이들의 조합을 포함하고,
상기 안정화제는 염화나트륨을 포함하지 않거나, 및/또는 트레할로오스, 수크로오스, 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 액상 조성물은 계면활성제를, 예컨대, 전체 조성물 기준으로 0.01 내지 3 %(w/v)의 양으로, 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 액상 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
예컨대, 상기 액상 조성물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 단백질은 분자량이 10 내지 500 kDa, 10 내지 400 kDa, 10 내지 300 kDa, 10 내지 200 kDa, 또는 10 내지 150 kDa인 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 단백질은 VEGF 길항제일 수 있으며, 예컨대, 애플리버셉트 (Aflibercept; 분자량 약 97 내지 115 kDa), 베바시주맙(Bevacizumab; 분자량 약 149 kDa), 라니비주맙 (Ranibizumab; 분자량 약 48 kDa) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 단백질이 VEGF 길항제, 예컨대, 애플리버셉트 (Aflibercept), 베바시주맙(Bevacizumab), 라니비주맙 (Ranibizumab) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 경우, 상기 약제학적 조성물은 안약 조성물일 수 있으며, 구체적으로 눈의 유리체 내 투여용 주사제일 수 있다.
상기 액상 조성물 또는 약학적 조성물은 유리체 내 투여를 위한 것일 수 있다.
다른 예는 단백질을 상기한 안정화제와 혼합하는 단계를 포함하는 단백질의 안정화 방법 또는 안정화된 수성 액상 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 명세서에서는, 단백질의 안정성을 증진시키기 위한 안정화용 조성물, 이를 포함하는 단백질의 안정한 액상 조성물, 단백질을 포함하는 안정한 수성 액상 조성물의 제조 방법, 및 단백질의 안정화 방법이 제공된다.
일 예는 인산나트륨, 히스티딘, 또는 이들의 조합을 포함하는 완충제, 및 염화나트륨을 포함하지 않거나 및/또는 트레할로오스, 수크로오스, 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 안정화제를 포함하는 단백질의 안정화용 조성물을 제공한다.
다른 예는,
(1) 단백질;
(2) 인산나트륨, 히스티딘, 또는 이들의 조합을 포함하는 완충제; 및
(3) 염화나트륨을 포함하지 않거나 및/또는 트레할로오스, 수크로오스, 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 안정화제
를 포함하는 액상 조성물을 제공한다.
상기 액상 조성물 내의 단백질 함량은 5 mg/ml 내지 100 mg/ml, 5 mg/ml 내지 80 mg/ml, 5 mg/ml 내지 60 mg/ml, 5 mg/ml 내지 50 mg/ml, 10 mg/ml 내지 100 mg/ml, 10 mg/ml 내지 80 mg/ml, 10 mg/ml 내지 60 mg/ml, 10 mg/ml 내지 50 mg/ml, 20 mg/ml 내지 100 mg/ml, 20 mg/ml 내지 80 mg/ml, 20 mg/ml 내지 60 mg/ml, 20 mg/ml 내지 50 mg/ml, 30 mg/ml 내지 100 mg/ml, 30 mg/ml 내지 80 mg/ml, 30 mg/ml 내지 60 mg/ml, 또는 30 mg/ml 내지 50 mg/ml일 수 있으며, 예컨대, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 또는 100 mg/ml일 수 있다.
상기 완충제는 pH 4 내지 8, 예컨대, pH 5.2 내지 7.5, pH 5.2 내지 7.2, pH 5.2 내지 7, pH 5.2 내지 6.8, pH 5.2 내지 6.6, pH 5.2 내지 6.4, pH 5.2 내지 6.2, pH 5.5 내지 7.5, pH 5.5 내지 7.2, pH 5.5 내지 7, pH 5.5 내지 6.8, pH 5.5 내지 6.6, pH 5.5 내지 6.4, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.8 내지 7.5, pH 5.8 내지 7.2, pH 5.8 내지 7, pH 5.8 내지 6.8, pH 5.8 내지 6.6, pH 5.8 내지 6.4, pH 5.8 내지 6.2, 또는 pH 6.2인 것일 수 있다.
상기 완충제는 인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 상기 산들의 약학적으로 허용 가능한 염 (예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등), 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 완충제는 인산나트륨, 히스티딘, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 완충제는, 전체 액상 조성물 기준으로, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 1 mM 내지 약 30 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 15 mM, 약 1 mM 내지 약 12 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 40 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 약 5 mM 내지 약 15 mM, 약 5 mM 내지 약 12 mM, 약 8 mM 내지 약 50 mM, 약 8 mM 내지 약 40 mM, 약 8 mM 내지 약 30 mM, 약 8 mM 내지 약 20 mM, 약 8 mM 내지 약 15 mM, 약 8 mM 내지 약 12 mM, 또는 10 mM의 농도로 포함될 수 있다.
일 예에서, 상기 안정화제는 염화나트륨을 포함하지 않는 것일 수 있다.
다른 예에서, 상기 안정화제는 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 안정화제는 1 내지 20%(w/v), 1 내지 15%(w/v), 1 내지 10%(w/v), 5 내지 20%(w/v), 5 내지 15%(w/v), 5 내지 10%(w/v), 7.8 내지 20%(w/v), 7.8 내지 15%(w/v), 7.8 내지 10%(w/v), 7.8 내지 8.2%(w/v), 또는 8%(w/v)의 트레할로오스, 1 내지 20%(w/v), 1 내지 15%(w/v), 1 내지 10%(w/v), 5 내지 20%(w/v), 5 내지 15%(w/v), 5 내지 10%(w/v), 7.8 내지 20%(w/v), 7.8 내지 15%(w/v), 7.8 내지 10%(w/v), 7.8 내지 8.2%(w/v), 또는 8%(w/v)의 수크로오스, 및 0.5 내지 10%(w/v), 0.5 내지 7.5%(w/v), 0.5 내지 5%(w/v), 1 내지 10%(w/v), 1 내지 7.5%(w/v), 1 내지 5%(w/v), 3 내지 10%(w/v), 3 내지 7.5%(w/v), 3 내지 5%(w/v), 4 내지 5%(w/v), 또는 4.5%(w/v)의 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 액상 조성물이 완충제로서 인산나트륨을 포함하는 경우 또는 완충제로서 인산염 (예컨대, 인산나트륨)을 포함하고 안정화제로서 수크로오스를 포함하는 경우, 상기 액상 조성물은 염화나트륨을 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 액상 조성물은 앞서 설명된 함량의 단백질, 완충제, 및 안정화제와, 잔량의 수성 매질 (예컨대, 물 (정제수), 생리식염수, 주사 용수 등)을 포함하는 것일 수 있다).
일 예에서, 상기 액상 조성물은 계면활성제를, 예컨대, 전체 조성물 기준으로, 0.001 내지 3 %(w/v), 0.001 내지 2 %(w/v), 0.001 내지 1 %(w/v), 0.001 내지 0.5 %(w/v), 0.001 내지 0.1 %(w/v), 0.001 내지 0.05 %(w/v), 0.01 내지 3 %(w/v), 0.01 내지 2 %(w/v), 0.01 내지 1 %(w/v), 0.01 내지 0.5 %(w/v), 0.01 내지 0.1 %(w/v), 0.01 내지 0.05 %(w/v), 또는 0.03 %(w/v)의 양으로, 추가로 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 단백질을 액상 조성물 매질에 고르게 분산시킬 수 있는 약학적으로 허용 가능한 모든 계면활성제들로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제일 수 있으며, 예컨대, 폴리소르베이트류 (예컨대, 폴리소르베이트 20 (폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트), 폴리소르베이트 40 (폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트), 폴리소르베이트 60 (폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노스테아레이트), 폴리소르베이트 80 (폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레이트); 상기 폴리옥시에틸렌 뒤의 수치 (20)은 옥시에틸렌기(-(CH2CH2O)-)의 총 개수를 의미함), 폴록사머 (PEO-PPO-PEO 공중합체; PEO: poly(ethylene oxide), PPO: poly(propylene oxide)), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 화합물 (예컨대, 폴리옥시에틸렌-스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (알킬: C1-C30), 폴리옥시에틸렌 모노라이릴 에테르, 알킬페닐 폴리옥시에틸렌 코폴리머(알킬: C1-C30) 등), 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulphate, SDS) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트류 (예컨대, 폴리소르베이트 20)일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 액상 조성물은 생체와 등장성인 것일 수 있다. 예컨대, 상기 액상 조성물은 삼투압이 약 200 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 예컨대, 약 250 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg인 것일 수 있다. 이와 같은 삼투압은 상기 안정화제에 의하여 조절될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 액상 조성물은 전기 전도도가 약 0.1 mS/cm 이상, 예컨대, 약 0.1 mS/cm 내지 약 10 mS/cm, 약 0.1 mS/cm 내지 약 7 mS/cm, 약 1 mS/cm 내지 약 10 mS/cm, 약 1 mS/cm 내지 약 7 mS/cm, 약 2.5 mS/cm 내지 약 10 mS/cm, 약 2.5 mS/cm 내지 약 7 mS/cm, 약 5 mS/cm 내지 약 10 mS/cm, 또는 약 5 mS/cm 내지 약 7 mS/cm 인 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 액상 조성물에서, 단백질은 단백질 약물, 예컨대, 분자량이 10 내지 500 kDa, 10 내지 400 kDa, 10 내지 300 kDa, 10 내지 200 kDa, 또는 10 내지 150 kDa인 단백질 (예컨대, 융합 단백질)일 수 있다. 일 예에서, 상기 단백질은 VEGF (vascular endothelial growth factor) 길항제, 예컨대, 인간 VEGF 수용체 1 및 VEGF 수용체 2의 세포 외 도메인으로부터 유래하는 VEGF 결합 부위 및 인간 IgG1의 Fc 부위가 융합된 VEGF-특이적 융합 단백질일 수 있다. 일 구체예에서 상기 VEGF-특이적 융합 단백질은 인간 VEGF 수용체 1 (Flt1)의 면역 글로불린-유사(Ig) 도메인 2 및 인간 VEGF 수용체 2(Flt1 또는 Flt4)의 Ig 도메인 3을 필수적으로 포함하는 부위와 인간 IgG1의 Fc 부위가 융합된 융합 단백질일 수 있으며, 예컨대, 다음의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 애플리버셉트 (Aflibercept)일 수 있다.
애플리버셉트 아미노산 서열 (서열번호 1)
SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI PDGKRIIWDS
RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT IIDVVLSPSH GIELSVGEKL
VLNCTARTEL NVGIDFNWEY PSSKHQHKKL VNRDLKTQSG SEMKKFLSTL TIDGVTRSDQ
GLYTCAASSG LMTKKNSTFV RVHEKDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR
TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS
DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH
YTQKSLSLSP G
(Disulfide bridge: 30-79; 124-185; 246-306; 352-410, Dimer: 211; 214)
상기 융합 단백질은 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다
본 명세서에서 제공되는 액상 조성물은 약 40℃의 고온에서도 4주일 이상 안정하게 유지된다.
상기 용어 "안정성이 우수하다" 또는 "안정하게 유지된다" 함은 보관 시에 조성물 내의 단백질의 구조, 및/또는 물리적, 화학적, 및/또는 생물학적 특성이 유지됨을 의미할 수 있다 (예컨대, 보관 중의 낮은 단백질 중합체 형성률, 낮은 단백질 응집률, 낮은 단백질 분해율, 및/또는 낮은 변성률 등). 단백질의 안정성을 측정하는 다양한 분석 기술이 관련 기술분야에 잘 알려져 있다.
예컨대, 본 명세서에서 제공되는 액상 조성물은 단백질 (항체) 함량이 40 mg/ml인 경우, 통상적인 SEC (size exclusion chromatography)로 40℃에서 4주일 동안 보관 시에 측정된 단백질 중합체 형성률 또는 응집률 (High Molecular Weight %(w/v); %HMW)의 변화량 (보관 4주차의 %HMW - 0주차(보관 개시 시)의 %HMW)이 약 9 미만, 예컨대, 약 8.8 이하 또는 약 8.3 이하인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 상기 액상 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물 (예컨대, 정제수), 생리식염수, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 액상 조성물 또는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구적 경로로 투여되는 것일 수 있다. 비경구 투여 (예컨대, 주사)인 경우에는 정맥 내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강 내 투여, 내피 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여, 종양 내 투여, 유리체 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 액상 조성물 또는 약학 조성물은 앞서 설명한 VEGF 길항제를 포함하는 안약 조성물일 수 있고, 이 경우, 눈의 유리체 내 투여되는 주사제일 수 있다.
다른 예는 단백질을 상기한 안정화용 조성물과 혼합하는 단계를 포함하는 단백질의 안정화 방법 또는 안정화된 액상 조성물의 제조 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 방법은,
(1) 단백질;
(2) 인산나트륨, 히스티딘, 또는 이들의 조합을 포함하는 완충제;
(3) 염화나트륨을 포함하지 않거나 및/또는 트레할로오스, 수크로오스, 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 안정화제; 및
(4) 임의로, 계면활성제
를 혼합하는 단계를 포함하는, 단백질의 안정화 방법 또는 안정화된 수성 액상 조성물의 제조 방법이 제공된다.
단백질의 안정화 방법 또는 안정화된 수성 액상 조성물의 제조 방법에 사용되는 각 성분의 종류 및 함량의 구체적 설명은 앞서 기재한 바와 같다.
본 발명은 단백질, 예컨대, 융합 단백질이 물리적, 화학적, 및/또는 생물학적 효능을 장기가 안정적으로 유지할 수 있도록 하는 안정화 조성물 및 액상 제형을 제공함으로써, 단백질의 보관 중 발생할 수 있는 중합체 및/또는 응집체(Aggregate) 생성 및 분해물(Fragment)의 생성 및/또는 charged variants 로의 변성을 억제하여 단백질의 약리 효과를 장기간 유지시킬 수 있다.
도 1은 실시예 2에서 측정된 시험 조성물의 40℃에서 4주 보관시의 4 주 동안의 %HMW (High-molecular weight %) 변화율 (Δ%HMW)을 보여주는 그래프이다.
도 2는 실시예 2에서 측정된 시험 조성물의 40℃에서 4주 보관 시의 4주 동안의 Δ%HMW 결과를 기반으로 통계적으로 유의한 인자를 Minitab (Minitab, version 17)으로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 실시예 3에서 측정된 시험 조성물의 40℃에서 4주 보관 시의 4주 동안의 Δ%Acidic 결과를 기반으로 통계적으로 유의한 인자를 Minitab으로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 실시예 4에서 측정된 시험 조성물의 40℃에서 4주 보관시의 4주 동안의 %RPA (Relative Potency Activity) 변화율 (Δ%RPA) 결과를 기반으로 통계적으로 유의한 인자를 Minitab으로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1. 액상 조성물의 제조
단백질 약물로서 VEGF 길항제 작용을 하는 융합 단백질인 애플리버셉트 (Aflibercept; 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인 유래의 VEGF 결합 부위와 인간 IgG1의 Fc 부위와의 융합 단백질; CAS Number: 862111-32-8; 서열번호 1)를 사용하여, 하기의 표 2의 조성으로 단백질 약물의 액상 조성물 1 내지 14를 제조하였다:
조성물 No. 단백질 약물 농도 pH 완충제 안정화제 계면활성제
1-3a 40 mg/mL 6.2 10 mM 인산나트륨 5%(w/v) Sucrose, 40 mM NaCl 0.03%(w/v) PS20
4 40 mg/mL 6.2 10 mM 인산나트륨 8%(w/v) Sucrose 0.03%(w/v) PS20
5 40 mg/mL 6.2 10 mM 인산나트륨 4.5%(w/v) Mannitol 0.03%(w/v) PS20
6 40 mg/mL 6.2 10 mM 인산나트륨 8%(w/v) Trehalose 0.03%(w/v) PS20
7 40 mg/mL 6.2 10 mM 인산나트륨 4.5%(w/v) dextrose 0.03%(w/v) PS20
8 40 mg/mL 6.2 10 mM 히스티딘 8%(w/v) Sucrose 0.03%(w/v) PS20
9 40 mg/mL 6.2 10 mM 히스티딘 4.5%(w/v) Mannitol 0.03%(w/v) PS20
10 40 mg/mL 6.2 10 mM 히스티딘 8%(w/v) Trehalose 0.03%(w/v) PS20
11 40 mg/mL 6.2 10 mM 히스티딘 4.5%(w/v) dextrose 0.03%(w/v) PS20
12-14b 40 mg/mL 6.2 10 mM 인산나트륨 5%(w/v) Sucrose, 40 mM NaCl 0.03%(w/v) PS20
a Control (EYLEA® 조성을 적용한 제형), b Control (EYLEA®)
실시예 2. HMW 함량 (%) 측정
실시예 1에서 제조된 조성물 1-14의 안정성을 시험하기 위하여, 단백질 약물 농도 40 mg/mL, pH 6.2, 및 40℃ 조건에서 4주 동안 보관하면서 조성물 내의 단백질 약물의 응집 정도를 알 수 있는 %HMW (% high molecular weight; 중량 기준)를 SE-HPLC로 측정하였다.
보다 구체적으로, 모노머가 검출되는 시간 보다 먼저 검출되는 물질을 HMW로 정의하며, %HMW는 HPLC (Waters 2695 separation module alliance) 및 column (Tosoh, TSK-gel G3000 SWXL)을 사용하여 1.0 mL/min flow rate, 17 min injection time 조건 하에서 측정하였다 (%HMW = AreaH/AreaTOTAL x 100).
상기 측정된 %HMW (initial %HMW, 4주차 %HMW, Δ%HMW (4주차 %HMW- initial %HMW)를 표 3에 나타내고, 4주차 %HMW를 도 1에 나타내었다 (P: Na-phosphate, H: Histidine, T: Trehalose, S: Sucrose M: Mannitol):
조성물 No. 완충제 안정화제 Initial 40℃, 4주차
%HMW %HMW Δ%HMW
1-3a(control) 10 mM Na-phosphate 5%(w/v) Sucrose, 40 mM NaCl 0.52 9.92 9.40
[N=3,SD:0.02] [N=3,SD:0.19] [N=3,SD:0.21]
4 8%(w/v) Sucrose 0.52 6.92 6.40
5 4.5%(w/v) Mannitol 0.56 8.68 8.12
6 8%(w/v) Trehalose 0.55 8.62 8.07
7 4.5%(w/v) Dextrose 0.54 16.85 16.31
8 10 mM Histidine 8%(w/v) Sucrose 0.53 6.31 5.78
9 4.5%(w/v) Mannitol 0.54 6.64 6.10
10 8%(w/v) Trehalose 0.51 5.84 5.33
11 4.5%(w/v) Dextrose 0.53 13.19 12.66
12-14b(control) EYLEA® 1.46 10.35 8.89
[N=3,SD:0.00] [N=3,SD:0.07] [N=3,SD:0.07]
a Control (EYLEA® 조성을 적용한 제형), b Control (EYLEA®)
표 3 및 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 안정화제로서 수크로오스, 트레할로오스, 또는 만니톨을 포함하는 모든 시험 조성물에서, 4주차에서의 %HMW 및 initial (0주차) 대비 %HMW 증가율이 모두 control(EYLEA® 및 EYLEA® 조성을 적용한 제형)과 비교하여 낮게 나타났다.
상기 표 3에 나타난 Δ%HMW 결과를 기반으로 통계적으로 유의한 인자를 분석한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 Δ%HMW 영향 측면 유의미한 영향을 미치는 인자로, 안정화제로는 mannitol, sucrose 및 trehalose임을 확인할 수 있다. 도 2에 나타난 바와 같이, 완충제의 경우 종류에 따라 큰 차이는 없었으며, 안정화제의 경우에는 덱스트로오스 를 사용한 경우보다, 만니톨, 수크로오스 또는 트레할로오스를 사용한 경우에 %HMW이 낮게 나타났다.
상기 Δ%HMW이 낮게 나타난 만니톨, 수크로오스, 또는 트레할로오스를 안정화제로 사용한 제형에 대하여, 상기 시험을 반복 수행하여 (n=3), 얻어진 결과를 하기의 표 4에 나타내었다:
조성물 No. 완충제 안정화제 Initial 40℃, 4주차
%HMW %HMW Δ%HMW
1-3 10 mM Na-phosphate 8% Trehalose 0.78 8.56 7.78
[N=3, SD:0.01] [N=3, SD:0.10] [N=3, SD:0.09]
4-6 10 mM Na-phosphate 8% Sucrose 0.80 8.07 7.27
[N=3, SD:0.01] [N=3, SD:0.10] [N=3, SD:0.09]
7-9 10 mM Na-phosphate 4.5% Mannitol 0.78 9.58 8.80
[N=3, SD:0.01] [N=3, SD:0.06] [N=3, SD:0.06]
10-12 10 mM Histidine　 8% Trehalose 0.81 8.75 7.93
[N=3, SD:0.01] [N=3, SD:0.15] [N=3, SD:0.14]
13-15 10 mM Histidine　 8% Sucrose 0.78 8.41 7.63
[N=3, SD:0.00] [N=3, SD:0.17] [N=3, SD:0.17]
16-18 10 mM Histidine　 4.5% Mannitol 0.80 9.32 8.52
[N=3, SD:0.02] [N=3, SD:0.12] [N=3, SD:0.12]
19-21 10 mM Na-phosphate 5%(w/v) Sucrose, 40 mM NaCl 0.82 11.21 10.40
[N=3, SD:0.00] [N=3, SD:0.39] [N=3, SD:0.39]
표 4에 나타난 바와 같이, 안정화제로서 만니톨, 수크로오스, 또는 트레할로오스를 포함하는 제형은, control 제형과 비교하여, 낮은 Δ%HMW를 보여서 안정성이 우수함을 알 수 있으며, 이러한 우수한 안정성은 반복 재현가능한 것으로 확인되었다.
실시예 3. Acidic 함량 (%) 및 Main 함량 (%) 측정
실시예 1 및 표 3에서 안정화 효능이 우수한 것으로 확인된 안정화제인 수크로스, 만니톨, 및 트레할로오스, 및 비교군으로 덱스트로오스를 사용하여 표 5의 조성으로 조성물 1-10을 제조하였다 (단백질 약물 농도 40 mg/mL, pH 6.2, 계면활성제 0.03%(w/v) PS20). 이들 조성물의 안정성을 시험하기 위하여, 40℃ 조건에서 4주 동안 보관하면서 조성물 내의 단백질 약물의 변성 정도를 알 수 있는 %Acidic (% Acidic variants 함량; 중량 기준)과 %Main (Charge variant 측면에서 initial 상태의 surface charge를 유지하는 형태의 함량 (중량기준))를 imaged capillary isoelectric focusing (icIEF)으로 측정하였다.
보다 구체적으로, %Acidic, %Basic, 및 %Main는 Enzyme (Sialidase A, Sigma-Aldrich) 처리 후 incubation 한 sample을 icIEF instrument (Protein simple, iCE3)을 사용하여 110 sec sample injection duration, 2000 psi sample injection pressure 조건 하에서 acidic, main 및 basic isoform을 분석하여 측정하였다.
상기 측정된 %Acidic 및 %Main (initial, 4주차, 4주차 결과 - initial 결과 (Δ%Acidic 및 Δ%Main))를 표 5에 나타내었다:
조성물 No. 완충제 안정화제 icIEF
Initial 40℃, 4주차
%Acidic %Main %Acidic %Main Δ%Acidic Δ%Main
1 10 mM Na-phosphate 8% Sucrose 66.0 31.4 79.6 15.6 13.6 -15.9
2 4.5% Mannitol 64.9 30.4 78.8 15.6 13.9 -14.8
3 8% Trehalose 65.4 31.1 78.2 15.6 12.8 -15.6
4 4.5% Dextrose 67.9 29.2 N/Aa
5 10 mM Histidine 5% Sucrose, 40 mM NaCl 65.7 31.5 76.7 16.3 11.0 -15.2
6 8% Sucrose 65.7 31.8 79.4 15.8 13.7 -15.9
7 4.5% Mannitol 65.5 31.5 78.4 14.8 12.9 -16.7
8 8% Trehalose 65.4 31.5 77.1 16.1 11.7 -15.4
9 135 mM NaCl 65.9 31.2 78.1 15.8 12.2 -15.4
10 4.5% Dextrose 66.7 28.9 N/Aa
a N/A: Not available (Acidic, Main, 및 Basic peak가 구분되지 않음)
표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 비교군인 안정화제로서 덱스트로오스를 사용하는 경우와 비교하여, 모든 시험 조성물에서 %Acidic 및 %Main의 변화 정도가 낮은 것으로 관찰되어, 이들 조성물의 안정성이 우수한 것으로 확인되었다.
상기 표 5의 결과를 토대로 통계적으로 유의한 인자를 분석한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보여지는 바와 같이, 완충제 종류에 따른 Δ%Acidic은 유의한 차이가 없지만, 안정화제의 경우 dextrose를 제외하고 모두 Δ%Acidic에 영향을 미치는 유의한 인자로 분석된 것을 확인할 수 있다.
실시예 4. Aflibercept의 VEGF 결합 효율 측정
실시예 1에서 제조된 표 2의 조성물 1-14 내의 약리학적 유효성분인 Aflibercept의 활성 유지 여부를 시험하기 위하여, 단백질 약물 농도 40 mg/mL, pH 6.2, 및 40℃ 조건에서 4주 동안 보관하면서 조성물 내의 Aflibercept의 VEGF에 대한 %RBA (Relative Binding Activity) 및 %RPA (Relative Potency Activity)를 측정하였다.
보다 구체적으로, %RBA를 다음의 방법으로 측정하였다: MaxiSorp 96 well plate (Nunc) 에 VEGF 165 coating (washing 및 blocking 포함; R&D system)후 순차적으로 aflibercept loading, secondary antibody; Sigma) 및 TMB ELISA substance solution (Thermo Fisher Scientific) 처리 후, ELISA leader (SpectraMax)를 이용하여 %RBA (Relative Binding Activity)를 측정하였다.
상기 측정된 40℃에서의 0주차와 4주차의 %RBA 및 4주 간의 %RBA 변화율 (Δ%RBA)을 표 6에 나타내었다:
조성물 No. 완충제 안정화제 VEGF Binding(±3SD, US: 84-113, EU: 86-114)
Initial 40℃, 4주차
%RBAc %RBA Δ%RBA
1-3a 10 mMNa-phosphate 5% Sucrose, 40 mM NaCl 101 90 -11
[N=3, SD: 4] [N=3, SD: 4] [N=3, SD: 7]
4 8% Sucrose 95 82 -13
5 4.5% Mannitol 97 101 4
6 8% Trehalose 99 94 -5
7 4.5% Dextrose 99 70 -29
8 10 mM Histidine 8% Sucrose 96 101 5
9 4.5% Mannitol 98 92 -6
10 8% Trehalose 96 87 -9
11 4.5% Dextrose 100 78 -22
12-14b EYLEA® 100 90 -10
[N=3, SD: 1] [N=3, SD: 2] [N=3, SD: 1]
a Control (EYLEA® 조성을 적용한 제형), b Control (EYLEA®), c RBA (Relative Binding Activity)
표 6에 나타난 바와 같이, 안정화제로서 덱스트로오스를 포함하는 경우를 제외하고, 시험된 모든 조성물에서 %RBA 감소율이 control보다 낮거나 동등 수준인 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 시험된 모든 조성물에서 Aflibercept가 VEGF에 대한 결합 활성을 잘 유지하고 있음을 보여준다.
또한, %RPA는 다음의 방법으로 측정하였다: Aflibercept 및 VEGF를 순차적으로 loading시킨 96 well plate에 KDR 293 cell (Promega)을 loading 및 incubation 후, Envision microplate reader (Perkin Elmer, Envision 2014)를 이용하여 %RPA (Relative Potency Analysis)를 분석하였다.
상기 측정된 40℃에서의 0주차와 4주차의 %RPA 및 4주 간의 %RPA 변화율 (Δ%RPA)을 표 7에 나타내었다:
조성물 No. 완충제 안정화제 VEGF Neutralization(±3SD, US: 83-118, EU: 92-111)
Initial 40℃, 4주차
%RPAc %RPA Δ%RPA
1-3a 10 mMNa-phosphate 5% Sucrose, 40 mM NaCl 103 91 -8
[N=3, SD:5] [N=3, SD: 5] [N=3, SD: 3]
4 8% Sucrose 96 86 -10
5 4.5% Mannitol 98 86 -12
6 8% Trehalose 100 83 -17
7 4.5% Dextrose 109 77 -32
8 10 mM Histidine 8% Sucrose 102 97 -5
9 4.5% Mannitol 97 97 0
10 8% Trehalose 98 95 -3
11 4.5% Dextrose 109 89 -20
12-14b EYLEA® 105 95 -11
[N=3, SD: 7] [N=3, SD: 1] [N=3, SD: 6]
a Control (EYLEA® 조성을 적용한 제형), b Control (EYLEA®), c RPA (Relative Potency Activity)
표 7에 나타난 바와 같이, 안정화제로서 덱스트로오스를 포함하는 경우를 제외하고, 시험된 모든 조성물에서 %RPA 감소율이 control보다 낮거나 동등 수준인 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 시험된 모든 조성물에서 Aflibercept가 VEGF 중화능에 대한 상대 역가가 유사한 수준임을 보여준다.
상기 표 7에 나타난 %RPA 결과를 토대로 통계적으로 유의한 인자를 분석한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 시험된 완충제 모두 control 대비 동등 이상의 %RPA 감소를 보였으며, 안정화제의 경우에는 덱스트로오스를 제외한 모든 종류에서 control보다 낮거나 동등한 %RPA 감소를 보였다.
실시예 5. 6종 조성물의 안정성 측정
실시예 1에서 제조된 조성물 중, 상기 실시예 2-4에서 안정성이 우수한 것으로 확인된 6종의 조성물 (표 2의 조성물 4, 5, 6, 8, 9, 및 10)의 %Main를 CE-SDS (Capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate)로 측정하였다 (40℃, 4주).
보다 구체적으로, %Main를 다음의 방법으로 측정하였다: SDS sample buffer (AB Sciex) 및 BME (2-mercaptoethaol, Sigma Aldrich)와 mix한 sample (혼합비: 약 1:50 (v:v))을 70℃에서 열처리 후 CE analysis instrument (Beckman Coulter, PA800 plus) 및 32 karat software (Beckman Coulter)를 이용하여 220 nm 하에서 detection되는 %total protein area를 분석하였다.
상기 측정된 40℃에서의 0주차 및 4주차의 %Main 및 4주 간의 %Main 변화율 (Δ%Main)을 표 8에 나타내었다:
조성물 No. 완충제 안정화제 Initial 40℃, 4주차
%Impurity %Main %Main Δ%Main
1-3a 10 mMNa-phosphate 5%(w/v) Sucrose, 40 mM NaCl 3.1 96.9 95.2 -1.7
[N=3,SD:0.37] [N=3,SD:0.37] [N=3,SD:0.12] [N=3,SD:0.24]
4 8%(w/v) Sucrose 2.7 97.3 96.3 -1.0
5 4.5%(w/v) Mannitol 3.1 96.9 95.9 -1.0
6 8%(w/v) Trehalose 2.6 97.4 95.3 -2.1
8 10 mMHistidine 8%(w/v) Sucrose 2.0 98.0 96.3 -1.7
9 4.5%(w/v) Mannitol 2.9 97.0 96.6 -0.4
10 8%(w/v) Trehalose 2.1 97.8 96.3 -1.5
a Control (EYLEA® 조성을 적용한 제형)
표 8에 나타난 바와 같이, 시험된 6종의 조성물에서의 %Main 감소율이 control보다 낮거나 동등 수준으로 나타났다. 이러한 결과는 시험된 6종의 조성물은 모두 control과 비교하여 동등 수준 이상의 안정성을 가짐을 보여준다.

Claims (28)

  1. (1) 단백질 5 mg/ml 내지 100 mg/ml;
    (2) pH 4 내지 8의 완충제; 및
    (3) 안정화제
    를 포함하고,
    상기 완충제는 인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 상기 산의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 안정화제는 염화나트륨을 포함하지 않는 것인,
    액상 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 트레할로오스, 수크로오스, 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 함량은 20 mg/ml 내지 60 mg/ml인, 액상 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 완충제의 pH는 5.2 내지 7.2인, 액상 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 완충제의 농도는 1 내지 50mM인, 액상 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 완충제의 농도는 1 내지 20mM인, 액상 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 안정화제는 1 내지 20%(w/v)의 트레할로오스, 1 내지 20%(w/v)의 수크로오스, 및 0.5 내지 10%(w/v)의 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 안정화제는 5 내지 12%(w/v)의 트레할로오스, 5 내지 12%(w/v)의 수크로오스, 및 2 내지 7%(w/v)의 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 안정화제는 5 내지 12%(w/v)의 수크로오스를 포함하는 것인, 액상 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 완충제는 1 내지 20mM의 인산나트륨을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 안정화제는 5 내지 12%(w/v)의 트레할로오스, 5 내지 12%(w/v)의 수크로오스, 및 2 내지 7%(w/v)의 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 안정화제는 5 내지 12%(w/v)의 수크로오스를 포함하는 것인, 액상 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 완충제는 1 내지 20mM의 히스티딘을 포함하는, 액상 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 안정화제는 5 내지 12%(w/v)의 트레할로오스, 5 내지 12%(w/v)의 수크로오스, 및 2 내지 7%(w/v)의 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 안정화제는 5 내지 12%(w/v)의 수크로오스를 포함하는 것인, 액상 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는, 액상 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 계면활성제는 전체 조성물 기준으로 0.001 내지 3 %(w/v)의 양으로 포함되는 것인, 액상 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 등장성(isotonic)인, 수성 액상 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 삼투압이 200 내지 400 mOsm/kg인, 수성 액상 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 분자량이 10 내지 500 kDa인 것인, 액상 조성물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 VEGF 길항제인, 액상 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 VEGF 길항제는 애플리버셉트 (Aflibercept)인, 액상 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 눈의 유리체 내 투여를 위한 것인, 액상 조성물.
  24. 제23항의 액상 조성물을 포함하는 눈의 유리체 내 투여용 주사제.
  25. (1) 애플리버셉트 (Aflibercept) 30 mg/ml 내지 50 mg/ml;
    (2) pH 5.2 내지 7.2의 완충제;
    (3) 안정화제; 및
    (4) 계면활성제 0.01 내지 0.1 %(w/v)
    를 포함하고,
    상기 완충제는 1 내지 20mM 인산나트륨, 1 내지 20mM 히스티딘, 또는 이들의 조합이고,
    상기 안정화제는 염화나트륨을 포함하지 않는 것인,
    액상 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 안정화제는 5 내지 12%(w/v)의 트레할로오스, 5 내지 12%(w/v)의 수크로오스, 및 2 내지 7%(w/v)의 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 안정화제는 5 내지 12%(w/v)의 수크로오스를 포함하는 것인, 액상 조성물.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 눈의 유리체 내 투여를 위한 것인, 액상 조성물.
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