KR20220162151A - 항원 특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터의 구축 방법 및 응용 - Google Patents

항원 특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터의 구축 방법 및 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 구축하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 제한 부위를 특이적으로 인식하는 엔도뉴클레아제를 처리하여 특정 점착성 말단을 갖는 4개의 핵산 단편을 얻은 다음, 핵산 단편이 방향적으로 결찰되도록 하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 방법에 따라 생산된 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터 및 박테리아 라이브러리가 추가로 개시되어 있다. 이러한 유전자 디스플레이 구축방법은 항원-특이적 항원-결합 폴리펩티드 또는 그 단편을 효과적으로 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.

Description

항원 특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터의 구축 방법 및 응용
본 출원은 생물의학 분야에 관한 것으로, 구체적으로 항원-특이적 결합 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 구축하는 방법에 관한 것이다.
현재, 일반적으로 사용되는 주요한 항체 발견(discovery) 방법은 두 가지로, 하이브리도마 기술 및 항체 디스플레이 기술이다. 하이브리도마 기술에는 뮤린 하이브리도마(murine hybridoma) 및 형질전환 마우스 하이브리도마(transgenic mouse hybridoma)의 두 가지 유형이 있다. 항체 디스플레이 기술에는 주로 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 포유류 세포 디스플레이의 세 가지 유형이 있다. 각각의 항체 발견 기술은 매우 분명한 장점이 있지만 매우 중요한 단점과 한계도 존재한다. 예를 들어, 하이드리도마 기술의 경우 항체 약물 종자은행을 구축하는 과정에서 품질 관리가 이루어지지 않으면 항체 라이브러리의 품질이 낮고, 라이브러리 용량이 작으며, 다양성이 낮고, 유효 클론 비율이 낮아 고품질 리드(lead) 항체를 스크리닝하기 어렵다. 항체 라이브러리 스크리닝 기술의 경우 정량적 스크리닝이 불가능하고, 스크리닝 처리량이 적으며, 스크리닝 효과가 좋지 않고, 스크리닝에 시간이 많이 걸린다.
일 관점에서, 본 발명은 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 구축하는 방법을 제공한다.
항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터는 4개의 단편으로 구성되며, 상기 4개의 단편의 5' 및 3'-말단이 성분 라이브러리 및 디스플레이 벡터를 구축하여 특정한 서열의 점착성 말단을 제공함으로써 방향적으로 고리화되어 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 형성한다.
본 발명의 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터의 구축 방법 및 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 사용하여 항원-특이적 결합 폴리펩타이드를 스크리닝하는 방법은 하기 중 적어도 하나 이상의 특성을 갖는다.
1) 본 발명의 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 구축하는데 사용될 수 있는, 방향적 결합을 보장할 뿐만 아니라 잘못된 결합을 방지하고, 각 구성 요소 단편의 분자 수가 결합되는 단계 도중에 1:1로 제어될 수 있으므로 결합(ligation) 및 변환의 효율성이 향상되는 것을 특징으로 하는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 특별한 인식 부위를 포함하는 특성,
동시에 VH 성분 라이브러리 및 LC 성분 라이브러리를 구축하는 전략이 각 단편의 결합 및 형질전환의 효율을 개선하기 위해 사용된다;
2) 당업계의 통상적인 항체 라이브러리 구축방법에서 사용되는 조합(combinatorial) PCR 전략을 사용하지 않음으로써 PCR로 인한 돌연변이 도입 가능성을 효과적으로 감소시키는 특성;
3) 품질 관리의 수행이 쉽고, 산업 대량 생산의 요구를 충족시킬 수 있는 특성;
4) 디스플레이 벡터가 세포에 도입된 후 생물학적 활성 분석 실험에 의해 직접 스크리닝될 수 있어, 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터의 구축으로부터 고유(unique)서열의 항원-특이적 폴리펩타이드를 스크리닝하는 시간을 효과적으로 단축시킬 수 있는 특성,
여기에서, 디스플레이 벡터를 구성한 후 고유한 서열의 양성 클론을 스크리닝하는 데 걸리는 시간은 적어도 1주(또는 적어도 약 10일, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주 또는 적어도 약 8주)일 수 있다;
5) 디스플레이 벡터 박테리아 라이브러리의 클론 다양성이 크고 스크리닝 효율이 높은 특성,
경우에 따라 항원 특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 포함하는 라이브러리의 유효 클론(effective clones)의 비율이 최대 약 50% 이상(또는 바람직하게 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과 또는 가장 바람직하게는 약 95% 이상)일 수 있어 형질전환 효율 및 라이브러리 구축 성공률이 높은 특성;
일 관점에서, 본 발명은 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 구축하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 5'에서 3' 방향으로 B2-디스플레이 VH-B3을 포함하는 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
b) 5'에서 3' 방향으로 S5-디스플레이 LC-S6을 포함하는 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
c) 5'에서 3' 방향으로 B3-디스플레이 벡터 단편 I-S5를 포함하는 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
d) 5'에서 3' 방향으로 S6-디스플레이 벡터 단편 II-B2를 포함하는 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
e) 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드 및 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 각각 B2, B3, S5 및 S6를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클라아제로 특이적으로 절단하여 절단된 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 절단된 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 절단된 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드 및 절단된 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및
f) 상기 절단된 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 절단된 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 절단된 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드 및 절단된 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 혼합하여 이들이 방향적으로 결합되고 고리화되어 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 형성할 수 있도록 하는 단계;
상기 디스플레이 VH는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역을 코딩하고, 상기 디스플레이 LC는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 경쇄를 코딩하며, 상기 B2, B3, S5 및 S6은 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위임.
특정 실시 양태에서, 상기 B2를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B2의 특이적 절단으로부터 생성된 말단은 상응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B3, S5 및 S6 중 어느 하나의 특이적 절단으로부터 생성된 말단을 인식하지 않거나 상호 간 연결되지 않는다.
특정 실시 양태에서, 상기 B3를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B3의 특이적 절단으로부터 생성된 말단이 상응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B2, S5 및 S6 중 어느 하나의 특이적 절단으로부터 생성된 말단을 인식하지 않거나 상호 간 연결되지 않는다.
특정 실시 양태에서, 상기 S5를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 S5의 특이적 절단으로부터 생성된 말단은 상응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B2, B3 및 S6 중 어느 하나의 특이적 절단으로부터 생성된 말단을 인식하지 않거나 상호 간 연결되지 않는다.
특정 실시 양태에서, 상기 S6를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 S6의 특이적 절단으로부터 생성된 말단은 상응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B2, B3 및 S5 중 어느 하나의 특이적 절단으로부터 생성된 말단을 인식하지 않거나 상호 간 연결되지 않는다.
특정 실시 양태에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI, Esp3I 및 BsmBI로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 상기 B2 및 B3은 상기 BsmBI 또는 Esp3I에 의해 특이적으로 인식되고 절단될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 S5 및 S6은 상기 Sfil에 의해 특이적으로 인식되고 절단될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 B2는 서열번호 8로 표시되는 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 B3이 서열번호 9로 표시되는 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 S5가 서열번호 10으로 표시되는 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 S6이 서열번호 11로 표시되는 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제1 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 디스플레이 성분 벡터에 삽입하여 디스플레이 VH 저장 결찰 생성물을 형성하고, 상기 디스플레이 VH 저장 결찰 생성물을 제1 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제2 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 디스플레이 성분 벡터에 삽입하여 디스플레이 LC 저장 결찰 생성물을 형성하고, 상기 디스플레이 LC 저장 결찰 생성물을 제2 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제3 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 디스플레이 성분 벡터에 삽입하여 디스플레이 벡터 단편 I 저장 결찰 생성물을 형성하고, 상기 저장 결찰 생성물을 제3 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제4 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 디스플레이 성분 벡터에 삽입하여 디스플레이 벡터 단편 II 저장 결찰 생성물을 형성하고, 상기 저장 결찰 생성물을 제4 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 디스플레이 벡터 성분 벡터는 pUC 벡터로부터 유래된다.
특정 실시 양태에서, 상기 pUC 벡터는 pUC19 벡터 또는 pUC19 벡터로부터 유래된다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리로부터 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 함유하는 디스플레이 VH 성분 플라스미드를 획득하고, 상기 디스플레이 VH 성분 플라스미드로부터 절단된 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 B2 및 B3를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 상기 디스플레이 VH 성분 플라스미드를 분해하여 절단된 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리로부터 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 함유하는 디스플레이 LC 성분 플라스미드를 획득하고, 상기 디스플레이 LC 성분 플라스미드로부터 절단된 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 S5 및 S6를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 상기 디스플레이 LC 성분 플라스미드를 분해하여 절단된 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 발현 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리로부터 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 포함하는 디스플레이 단편 성분 플라스미드 I을 획득하고, 상기 디스플레이 단편 성분 플라스미드 I로부터 절단된 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 B3 및 S5를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 상기 디스플레이 단편 성분 플라스미드 I을 분해하여 절단된 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 발현 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리로부터 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 포함하는 디스플레이 단편 성분 플라스미드 II를 획득하고, 상기 디스플레이 단편 성분 플라스미드 II로부터 절단된 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 S6 및 B2를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 상기 디스플레이 단편 성분 플라스미드 II를 분해하여 절단된 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다.
a) 5'에서 3' 방향으로 B-항원-특이적 VH-B를 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
b) 5'에서 3' 방향으로 B3-VH 성분 벡터 결찰 단편-B2를 포함하는 제6 폴리뉴클레오티드를 포함하는 VH 성분 벡터를 제공하는 단계;
c) 상기 제5 폴리뉴클레오티드 및 VH 성분 벡터를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 절단된(cleaved) 제5 폴리뉴클레오티드 및 방출된(released) 제6 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및
d) 상기 절단된 제5 폴리뉴클레오티드 및 방출된 제6 폴리뉴클레오티드를 혼합하여 이들이 방향적으로 결합되고 고리화되어 항원-특이적 VH 성분 라이브러리를 형성할 수 있도록 하는 단계;
여기서 항원-특이적 VH는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역을 코딩하고, B는 B2 및/또는 B3을 특이적으로 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위임.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다.
a) 5'에서 3' 방향으로 S-항원-특이적 LC-S를 포함하는 제7 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
b) 5'에서 3' 방향으로 S6-LC 성분 벡터 결찰 단편-S5를 포함하는 제8 폴리뉴클레오티드를 포함하는 LC 성분 벡터를 제공하는 단계;
c) 상기 제7 폴리뉴클레오티드 및 LC 성분 벡터를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 절단된 제7 폴리뉴클레오티드 및 방출된 제8 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및
d) 절단된 제7 폴리뉴클레오티드 및 방출된 제8 폴리뉴클레오티드를 혼합하여 이들이 방향적으로 결합되고 및 고리화되어 항원-특이적 LC 성분 라이브러리를 형성할 수 있도록 하는 단계;
여기서 항원-특이적 LC는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 경쇄를 코딩하고, S는 S5 및/또는 S5를 특이적으로 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위임.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다.
a) 5'에서 3' 방향으로 B2-VH 성분 벡터 도구 단편-B3을 포함하는 제9 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 및
b) 상기 제9 폴리뉴클레오티드를 발현 성분 벡터에 삽입하여 VH 성분 벡터를 수득하는 단계.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다.
a) 5'에서 3' 방향으로 S5-LC 성분 벡터 도구 단편-S6을 포함하는 제10 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 및
b) 상기 제10 폴리뉴클레오티드를 발현 성분 벡터에 삽입하여 LC 성분 벡터를 얻는 단계.
특정 실시 양태에서, 상기 발현 성분 벡터는 pMD 벡터로부터 유래된다.
특정 실시 양태에서, 상기 pMD 벡터는 pMD19 벡터이거나 pMD19 벡터로부터 유래된다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다.
a) 상기 VH 성분 벡터를 제9 박테리아에 도입하여 VH 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계;
b) 상기 VH 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리로부터 VH 성분 벡터 저장 플라스미드를 획득하는 단계; 및
c) 상기 VH 성분 벡터 저장 플라스미드로부터 방출된 제6 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 VH 성분 벡터 저장 플라스미드를 B2 및 B3를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 방출된 제6 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다.
a) 상기 LC 성분 벡터를 10번째 박테리아에 도입하여 LC 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계;
b) 상기 LC 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리로부터 LC 성분 벡터 저장 플라스미드를 획득하는 단계; 및
c) 상기 LC 성분 벡터 저장 플라스미드로부터 방출된 제8 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 LC 성분 벡터 저장 플라스미드를 S5 및 S6을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여, 방출된 제8 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다.
a) 5'에서 3' 방향으로 B2-항원 특이적 VH-B3을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항원 특이적 VH 성분 라이브러리를 제공하는 단계;
b) 5'에서 3' 방향으로 S5-항원-특이적 LC-S6을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항원-특이적 LC 성분 라이브러리를 제공하는 단계;
c) 5'에서 3' 방향으로 B3-디스플레이 벡터 단편 I-S5를 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 5'에서 3' 방향으로 S6-디스플레이 벡터 단편 II-B2를 포함하는; 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 디스플레이 벡터를 제공하는 단계;
d) 상기 항원-특이적 VH 성분 라이브러리, 항원-특이적 LC 성분 라이브러리 및 디스플레이 벡터를 각각 B2, B3, S5 및 S6을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클라아제로 특이적으로 절단하여 방출된 제1 폴리뉴클레오티드, 방출된 제2 폴리뉴클레오티드, 방출된 제3 폴리뉴클레오티드 및 방출된 제4 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및
e) 상기 방출된 제1 폴리뉴클레오티드, 방출된 제2 폴리뉴클레오티드, 방출된 제3 폴리뉴클레오티드 및 방출된 제4 폴리뉴클레오티드를 혼합하여 이들이 방향적으로 결합되고 고리화되어 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 형성할 수 있도록 하는 단계;
여기서, 상기 항원-특이적 LC는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 경쇄를 코딩하고, 상기 항원-특이적 VH는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역을 코딩하며, 상기 B2, B3, S5 및 S6은 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위임.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 항원-특이적 VH 성분 라이브러리를 B2 및 B3을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여, 방출된 제1 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 항원-특이적 LC 성분 라이브러리를 S5 및 S6을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 방출된 제2 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 디스플레이 벡터를 B3를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제 및 S5를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 방출된 제3 폴리뉴클레오티드를 얻는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 디스플레이 벡터를 S6을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제 및 B2를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 방출된 제4 폴리뉴클레오티드를 얻는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 제5 폴리뉴클레오티드, 제7 폴리뉴클레오티드, 제9 폴리뉴클레오티드, 제10 폴리뉴클레오티드, 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드 및/또는 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 샘플 물질로부터 수득된다.
특정 실시 양태에서, 상기 샘플 물질은 특이적 항원을 표적화하는 항체 또는 그 항원 결합 단편 및/또는 IgG를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 ROR1, PD-1 및/또는 PD-L1을 표적화한다.
특정 실시 양태에서, 상기 IgG는 인간 IgG이다.
특정 실시 양태에서, 상기 인간 IgG는 인간 IgG1 또는 인간 IgG2이다.
특정 실시 양태에서, 상기 방향적 결합은 리가아제를 이용하여 이루어진다.
특정 실시 양태에서, 상기 리가아제는 T4 DNA 리가아제를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 세포 내로 도입하고, 세포로부터 항원-특이적 결합 폴리펩티드를 획득하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다.
a) 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 제1 박테리아에 도입하여 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계;
b) 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리로부터 항원-특이적 결합 폴리펩티드 디스플레이 유전자 라이브러리를 획득하는 단계;
c) 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 디스플레이 유전자 라이브러리로부터 항원-특이적 결합 폴리펩티드 발현 벡터 DNA를 획득하는 단계;
d) 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 발현 벡터 DNA를 세포 내로 도입하는 단계; 및
e) 상기 세포로부터 항원-특이적 결합 폴리펩티드를 획득하는 단계.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리, VH 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리, LC 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리, 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리, 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리, 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리 및 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리를 동결 보존하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 VH 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리는 10개 이상의 상이한 클론을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 LC 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리는 10개 이상의 상이한 클론을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리는 10개 이상의 상이한 클론을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리는 10개 이상의 상이한 클론을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리는 10개 이상의 동일한 클론을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리가 10개 이상의 동일한 클론을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리의 유효 클론(effective clones) 비율이 약 10% 이상이다.
특정 실시 양태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다.
다른 관점에서, 본 발명은 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 이용하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 결합 폴리펩티드 또는 그 단편의 스크리닝 방법을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리를 제공한다.
당업자는 하기 상세한 설명을 통해 본 발명의 기타 측면 및 이점을 용이하게 통찰할 수 있다. 하기의 상세한 설명에는 본 발명의 예시적 실시 양태만 도시 및 설명된다. 본 발명의 내용은 본 발명과 관련된 발명의 사상 및 범위를 벗어나 당업자가 개시된 구체적 실시 양태를 변경할 수 없게 한다. 따라서, 본 발명의 도면 및 명세서의 설명은 예시적일 뿐 제한적인 것이 아니다.
본 발명과 관련된 구체적 특징은 청구 범위에 설명된 바와 같다. 하기의 상세한 예시적 실시 양태 및 도면을 통해 본 발명과 관련된 특징 및 이점을 보다 잘 이해할 수 있다. 도면에 대한 간략한 설명은 다음과 같다.
도 1은 본 발명의 디스플레이 벡터의 구조를 나타낸 것이다;
도 2는 본 발명의 디스플레이 벡터의 예를 나타낸 것이다;
도 3은 본 발명의 VH 성분 벡터의 구조를 나타낸 것이다;
도 4는 본 발명의 LC 성분 벡터의 구조를 나타낸 것이다;
도 5a는 본 발명의 항원-특이적 LC의 아미노산 서열을 나타낸 것이다;
도 5b는 본 발명의 항원-특이적 VH의 아미노산 서열을 나타낸 것이다;
도 6은 FACS에 의해 분석된 CHO 세포의 표면 상의 ROR1 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 발현을 나타낸 것이다;
도 7은 8개의 예시(exemplary) 항체의 SDS-PAGE 변성 환원 겔 전기영동 분석 결과를 나타낸 것이다;
도 8은 본 발명의 방법으로 스크리닝된 양성 항체의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다;
도 9는 파지 라이브러리를 구축하는 과정의 경쇄 저장 벡터의 개략도를 나타낸 것이다;
도 10은 파지 라이브러리를 구축하는 과정의 중쇄 저장 벡터의 개략도를 나타낸 것이다;
도 11은 파지 라이브러리를 구축하는 과정의 링커 저장 벡터의 개략도를 나타낸 것이다;
도 12는 파지 라이브러리를 구축하는 과정의 pCom3x 벡터의 개략도를 나타낸 것이다;
도 13은 파지 라이브러리를 구축하는 과정의 파지 디스플레이 벡터의 개략도를 나타낸 것이다;
도 14는 파지 라이브러리를 구축하는 과정에서 디스플레이 용도의 결합(ligation) 산물을 위한 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.
본 발명의 실시 양태는 특정한 구체적 실시예를 통해 하기에서 설명되며, 통상의 지식을 가진 자라면 본 명세서에 개시된 내용을 통해 본 발명의 기타 이점 및 효과를 쉽게 이해할 수 있다.
용어 정의
본 발명에서, 용어 "항원 결합 폴리펩티드"는 일반적으로 특정 항원을 특이적으로 인식 및/또는 중화할 수 있는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 상기 항원 결합 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 온전한 항체의 항원 결합 영역 및/또는 항체 가변 영역을 포함할 수 있다. 기본 4-사슬 항체 단위는 두 개의 동일한 경쇄와 두 개의 동일한 중쇄로 구성된 이종사량체 당단백질이다. IgG의 경우, 각 L 사슬은 공유 이황화 결합을 통해 H 사슬에 연결되는 반면, 두 개의 H 사슬은 H 사슬의 이소타입(isotype)에 따라 그 수가 달라지는 하나 이상의 이황화 결합을 통해 서로 연결된다. 또한, 각 H 및 L 사슬은 규칙적으로 간격을 둔 사슬 내 이황화 결합을 가지고 있다. 각 H 사슬은 N-말단에 가변 도메인(VH)을 가지며, 그 뒤에 3개(α 및 γ 사슬 각각에 대해) 또는 4개(μ 및 ε 이소타입에 대해) 불변 도메인(CH)이 존재한다. 항원 결합 폴리펩타이드는 화학적 방법 및/또는 유전 공학 방법에 의해 얻을 수 있다. 특정 실시 양태에서, 항체는 펩신(pepsin) 및 파파인(papain)을 비롯한 프로테아제를 사용하여 소화되어 항원 결합 단편을 생성할 수 있다. 본 발명에서 상기 항체 단편은 Fab일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "Fab"는 일반적으로 파파인에 의해 온전한 구조(예를 들어, Fc 및 힌지 영역이 제거된)를 갖는 항체를 분해함으로써 생성된 2개의 동일한 항원-결합 단편을 지칭한다. Fab는 온전한(intact) 경쇄, 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)으로 구성될 수 있으며, 각 Fab는 단일 항원 결합 부위를 가질 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제1 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 항원-특이적 VH를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B2-항원 특이적 VH-B3을 포함할 수 있으며, 여기서 B2, B3은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, BsmBI와 같은 B2 및 B3을 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후, 방출된 제1 폴리뉴클레오타이드는 항원-특이적 VH를 포함할 수 있고, 분해 후 상기 항원-특이적 VH의 두 말단은 특정 서열의 점착성 말단을 가질 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제2 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 항원-특이적 LC를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 S5-항원-특이적 LC-S6을 포함할 수 있으며, 여기서 S5, S6은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI와 같은 S5 및 S6을 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후, 방출된 제1 폴리뉴클레오타이드는 항원-특이적 LC를 포함할 수 있고, 분해 후 상기 항원-특이적 LC의 두 말단은 특정 서열의 점착성 말단을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원 특이적 VH"는 일반적으로 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드를 지칭하고, 용어 "항원 특이적 LC"는 일반적으로 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드를 지칭한다. 항원-특이적 VH 및 항원-특이적 LC의 서열은 파지 디스플레이 기술, 효모 표면 디스플레이 기술, 리보솜 디스플레이 기술, mRNA 디스플레이 기술 및/또는 하이브리도마 기술을 포함하나, 이에 국한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 파지 라이브러리 디스플레이 방법을 통해 수득될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제3 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 디스플레이 벡터 단편 I를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 상기 제3 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B3-디스플레이 벡터 단편 I-S5를 포함할 수 있으며, 여기서 B3, S5는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 상기 제3 폴리뉴클레오티드는 상기 디스플레이 벡터에 포함될 수 있다. 상기 제3 폴리뉴클레오타이드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI, BsmBI 및/또는 Esp3I와 같은 B3 및 S5를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후, 제3 폴리뉴클레오타이드가 방출될 수 있다. 상기 방출된 제3 폴리뉴클레오타이드는 디스플레이 벡터 단편 I을 포함할 수 있으며, 이는 또한 두 말단에서 절단 후 특정 서열의 점착성 말단을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어 "방출된 제3 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 디스플레이 벡터로 처리된 후 방출된 제3 폴리뉴클레오티드의 단편을 지칭한다. 본 발명에서, 상기 처리는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 적절한 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, SfiI, BsmBI 및/또는 Esp3I)는 방출된 제3 폴리뉴클레오타이드가 디스플레이 벡터로부터 방출되고 단리될 수 있도록 디스플레이 벡터 상의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위에 대해 선택될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제4 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 디스플레이 벡터 단편 II를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제4 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B3-디스플레이 벡터 단편 I-S5를 포함할 수 있으며, 여기서 S6, B2는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 상기 제4 폴리뉴클레오티드는 상기 디스플레이 벡터에 포함될 수 있다. 상기 제4 폴리뉴클레오타이드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI, BsmBI 및/또는 Esp3I와 같은 S6 및 B2를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후, 제4 폴리뉴클레오타이드가 방출될 수 있다. 상기 방출된 제4 폴리뉴클레오타이드는 디스플레이 벡터 단편 II를 포함할 수 있으며, 이는 또한 두 말단에서 절단 후 특정 서열의 점착성 말단(sticky ends)을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어 "방출된 제4 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 디스플레이 벡터로 처리된 후 방출된 제4 폴리뉴클레오티드의 단편을 지칭한다. 본 발명에서, 상기 처리는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 적절한 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, SfiI, BsmBI 및/또는 Esp3I)는 방출된 제4 폴리뉴클레오타이드가 디스플레이 벡터로부터 방출되고 단리될 수 있도록 디스플레이 벡터 상의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위에 대해 선택될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제5 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 항원-특이적 VH를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제5 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B-항원 특이적 LC-B를 포함할 수 있으며, 여기서 B는 B2 및/또는 B3를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 상기 제5 폴리뉴클레오티드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, BsmBI 및/또는 Esp3I와 같은 B를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후, 절단된 제5 폴리뉴클레오티드는 항원-특이적 VH를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제7 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 항원-특이적 LC를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제5 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 S-항원 특이적 LC-S를 포함할 수 있으며, 여기서 S는 S5 및/또는 S6을 인식하는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 상기 제7 폴리뉴클레오티드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI와 같은 S를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후, 절단된 제7 폴리뉴클레오티드는 항원-특이적 LC를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "VH 성분 벡터"는 일반적으로 제6 폴리뉴클레오티드 및/또는 VH 성분 벡터 도구 단편을 포함하는 고리형 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명에서, 용어 "VH 성분 벡터"는 일반적으로 제8 폴리뉴클레오티드 및/또는 LC 성분 벡터 도구 단편을 포함하는 고리형 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명에서, 용어 "디스플레이 벡터"는 일반적으로 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II를 포함하는 고리형 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 디스플레이 VH 및 디스플레이 LC를 추가로 포함할 수 있다. 처리된 후, 상기 디스플레이 벡터는 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드를 방출할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 디스플레이 VH를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B2-디스플레이 VH-B3를 포함할 수 있으며, 여기서 B2, B3은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, BsmBI와 같은 B2 및 B3를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후, 절단된 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 디스플레이 VH를 포함할 수 있으며, 이는 또한 두 말단에서 절단 후 특정 서열의 점착성 말단(sticky ends)을 가질 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 디스플레이 VH를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 S5-디스플레이 LC-S6을 포함할 수 있으며, 여기서 S5, S6은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI와 같은 S5 및 S6을 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후, 절단된 상기 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 디스플레이 LC를 포함할 수 있으며, 이는 또한 두 말단에서 절단 후 특정 서열의 점착성 말단(sticky ends)을 가질 수 있다.
본 발명에서, 용어 "디스플레이 VH"는 일반적으로 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드를 지칭하고, 용어 "디스플레이 LC"는 일반적으로 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드를 지칭한다. 본 발명에서 "디스플레이 VH" 및 "항원 특이적 VH"는 동일한 항원에 대한 결합 폴리펩티드로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드일 수 있고, 또한 상이한 항원에 대한 결합 폴리펩티드로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명에서 "디스플레이 LC" 및 "항원-특이적 LC"는 동일한 항원에 대한 결합 폴리펩타이드로부터 유래된 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드일 수 있고, 또한 상이한 항원에 대한 결합 폴리펩타이드로부터 유래된 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "디스플레이 벡터 단편"은 일반적으로 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, BsmBI 및/또는 SfiI)를 사용하여 디스플레이 벡터를 절단함으로써 수득된 단편, 예컨대 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II를 지칭한다. 상기 디스플레이 벡터 단편의 5'-말단 및 3'-말단은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 디스플레이 벡터 단편 I을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B3-디스플레이 벡터 단편 I-S5을 포함할 수 있으며, 여기서 B3, S5은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI와 같은 S5를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제 또는 BsmBI 및/또는 Esp3I와 같은 B3을 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후, 절단된 상기 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 디스플레이 벡터 단편 I을 포함할 수 있으며, 이는 또한 두 말단에서 절단 후 특정 서열의 점착성 말단(sticky ends)을 가질 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 디스플레이 벡터 단편 II를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 S6-디스플레이 벡터 단편 II-B2을 포함할 수 있으며, 여기서 S6, B2은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI와 같은 S6을 인식하는 제한 엔도뉴클레아제 또는 BsmBI 및/또는 Esp3I와 같은 B2를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후, 절단된 상기 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 디스플레이 벡터 단편 II를 포함할 수 있으며, 이는 또한 두 말단에서 절단 후 특정 서열의 점착성 말단(sticky ends)을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어 "VH 성분 벡터"는 일반적으로 발현 성분 벡터에 제9 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 형성된 고리형 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에서 "LC 성분 벡터"라는 용어는 일반적으로 발현 성분 벡터에 제10 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 형성된 고리형 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 출원에서 "발현 성분 벡터"라는 용어는 일반적으로 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 제9 폴리뉴클레오티드 및/또는 제10 폴리뉴클레오티드)가 삽입될 수 있는 벡터를 의미한다. 특정 실시 양태에서, 상기 발현 성분 벡터는 pMD 벡터로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 발현 성분 벡터는 pMD19 벡터이거나 pMD19 벡터로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제9 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 VH 성분 벡터 도구 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 9 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B2-VH 성분 벡터 도구 단편-B3을 포함할 수 있으며, 여기서 B2, B3은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제10 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 LC 성분 벡터 도구 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 9 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 S5-LC 성분 벡터 도구 단편-S6을 포함할 수 있으며, 여기서 S5, S6은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "성분 벡터 도구 단편"은 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있지만 그 안에 엔도뉴클레아제(예: 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위가 없는 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 성분 벡터 도구 단편의 길이는 일반적으로 항원 특이적 VH 및 항원 특이적 LC의 길이와 다르다. 특정 실시 양태에서, 성분 벡터 도구 조각의 길이는 약 1kb일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 성분 벡터 도구 단편은 IgG의 Fc 영역으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 성분 벡터 도구 단편은 인간 IgG1 및 인간 IgG2로 이루어진 군으로부터 선택된 Fc 영역으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 엔도뉴클레아제(예: 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위는 B2 및 B3일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위는 S5 및 S6일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "성분 벡터"는 일반적으로 발현 성분 벡터에 제9 폴리뉴클레오티드 및/또는 제10 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 형성된 고리형 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명에서, 용어 "제9 박테리아"는 일반적으로 제9 뉴클레오티드를 도입하거나 포함하는 박테리아를 지칭한다. 상기 제9 박테리아는 상기 VH 성분 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 제9 박테리아는 상기 제9 뉴클레오티드 및/또는 상기 VH 성분 벡터를 발현, 복제 및/또는 저장(예를 들어, 동결보존)할 수 있다. 본 발명에서, 상기 VH 성분 벡터를 포함하는 VH 성분 벡터 저장 플라스미드는 상기 제9 박테리아로부터 수득될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제10 박테리아"는 일반적으로 제10 뉴클레오티드를 도입하거나 포함하는 박테리아를 지칭한다. 상기 제9박테리아는 상기 LC 성분 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 제10 박테리아는 상기 제10 뉴클레오티드 및/또는 상기 LC 성분 벡터를 발현, 복제 및/또는 저장(예를 들어, 동결보존)할 수 있다. 본 발명에서, 상기 LC 성분 벡터를 포함하는 LC 성분 벡터 저장 플라스미드는 상기 제10 박테리아로부터 수득될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제6 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 VH 성분 벡터 결찰 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제4 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B3-VH 성분 벡터 결찰 단편-B2을 포함할 수 있으며, 여기서 B3, B2는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 상기 제6 폴리뉴클레오티드는 상기 VH 성분 벡터에 포함될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 제6 폴리뉴클레오티드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예시로, BsmBI 및/또는 Esp3I와 같은 B3 및 B2를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후 제6 폴리뉴클레오티드가 방출 될 수 있다. 상기 방출된 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 항원-특이적 VH를 포함할 수 있으며, 이는 또한 두 말단에서 절단 후 특정 서열의 점착성 말단(sticky ends)을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어 "방출된 제6 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 VH 성분 벡터로 처리된 후 방출된 제6 폴리뉴클레오티드의 단편을 지칭한다. 본 발명에서, 상기 처리는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 적절한 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, BsmBI 및/또는 Esp3I)는 방출된 제6 폴리뉴클레오타이드가 VH 성분 벡터로부터 방출되고 단리될 수 있도록 디스플레이 벡터 상의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위에 대해 선택될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제8 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 가질 수 있는 LC 성분 벡터 결찰 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 상기 제4 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 BS6-LC 성분 벡터 결찰 단편-S5을 포함할 수 있으며, 여기서 S6, S5는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 상기 제8 폴리뉴클레오티드는 상기 LC 성분 벡터에 포함될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 제8 폴리뉴클레오티드에서 엔도뉴클레아제 인식 부위를 인식하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, SfiI와 같은 S6 및 S5를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 분해된 후 제8 폴리뉴클레오티드가 방출 될 수 있다. 상기 방출된 제8 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 항원-특이적 LC를 포함할 수 있으며, 이는 또한 두 말단에서 절단 후 특정 서열의 점착성 말단(sticky ends)을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어 "방출된 제8 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 LC 성분 벡터로 처리된 후 방출된 제8 폴리뉴클레오티드의 단편을 지칭한다. 본 발명에서, 상기 처리는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 적절한 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, SfiI)는 방출된 제8 폴리뉴클레오타이드가 LC 성분 벡터로부터 방출되고 단리될 수 있도록 디스플레이 벡터 상의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위에 대해 선택될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제한 엔도뉴클레아제"는 일반적으로 이중 가닥 DNA를 절단하는 효소를 지칭한다. 상기 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 리가아제에 결합할 수 있는 돌출된 단일 가닥 DNA의 점착성 말단을 생성할 수 있다. 본 발명에서, 간디 제한 엔도뉴클레아제는 인식 및 제한적 절단(restriction cleavage)의 효과를 가질 수 있다. 특정 실시 양태에서, 제한 엔도뉴클레아제의 절단 부위는 인식 부위로부터 일정한 거리에 있다. 다른 실시 양태에서, 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI, BsmBI 및 Esp3I로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제1 박테리아"는 일반적으로 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 도입하거나 포함하는 박테리아를 지칭한다. 상기 제1 박테리아는 항원-특이적 VH, 항원-특이적 LC, 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 제1 박테리아는 항원-특이적 VH, 항원-특이적 LC, 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II, 또는 항원-특이적 결합 폴리펩티드 발현 벡터 DNA를 발현, 복제 및/또는 저장(예를 들어, 동결보존)할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항원 특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리"는 일반적으로 항원 특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 제1 박테리아에 도입하여 수득한 박테리아 라이브러리를 지칭한다. 본 발명에서, 상기 항원 특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리는 항원 특이적 결합 폴리펩타이드의 경쇄 또는 항원 특이적 폴리펩타이드의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 박테리아 라이브러리일 수 있다. 본 발명에서, 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리는 약 105 내지 약 109(바람직하게는 약 105 내지 약 108, 더 바람직하게는 약 105 내지 약 107, 가장 바람직하게는 약 106 내지 약 107)의, 항원-특이적 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리는 약 107 내지 약 1012(바람직하게는 약 107 내지 약 1011, 보다 바람직하게는 약 107 내지 약 1010, 더욱 바람직하게는 약 107 내지 약 109, 가장 바람직하게는 약 107 내지 약 108)의 제1 박테리아를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제1 디스플레이 박테리아"라는 용어는 일반적으로 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 도입하거나 포함하는 박테리아를 지칭한다. 상기 제1 박테리아는 디스플레이 VH를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 제1 디스플레이 박테리아는 디스플레이 VH 및/또는 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 발현, 복제 및/또는 저장(예를 들어, 동결보존)할 *?**?*수 있다.
본 발명에서, 용어 "디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리"는 일반적으로 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제1 디스플레이 박테리아에 도입하여 수득한 박테리아 라이브러리를 지칭한다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리는 항원-특이적 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 박테리아 라이브러리일 수 있다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리는 디스플레이 VH를 코딩하는 약 105 내지 약 109(바람직하게는 약 105 내지 약 108, 더 바람직하게는 약 105 내지 약 107, 가장 바람직하게는 약 106 내지 약 107)의 핵산서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리는 약 107 내지 약 1012(바람직하게는 약 107 내지 약 1011, 보다 바람직하게는 약 107 내지 약 1010, 더욱 바람직하게는 약 107 내지 약 109, 가장 바람직하게는 약 107 내지 약 108)의 상기 제1 디스플레이 박테리아를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제2 디스플레이 박테리아"라는 용어는 일반적으로 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 도입하거나 포함하는 박테리아를 지칭한다. 제2 박테리아는 디스플레이 LC를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 제2 디스플레이 박테리아는 디스플레이 LC 및/또는 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 발현, 복제 및/또는 저장(예를 들어, 동결보존)할 *?**?*수 있다.
본 발명에서, 용어 "디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리"는 일반적으로 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제2 디스플레이 박테리아에 도입하여 수득한 박테리아 라이브러리를 지칭한다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리는 항원-특이적 폴리펩티드의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 박테리아 라이브러리일 수 있다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리는 디스플레이 LC를 코딩하는 약 105 내지 약 109(바람직하게는 약 105 내지 약 108, 더 바람직하게는 약 105 내지 약 107, 가장 바람직하게는 약 106 내지 약 107)의 핵산서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리는 약 107 내지 약 1012(바람직하게는 약 107 내지 약 1011, 보다 바람직하게는 약 107 내지 약 1010, 더욱 바람직하게는 약 107 내지 약 109, 가장 바람직하게는 약 107 내지 약 108)의 상기 제2 디스플레이 박테리아를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제3 디스플레이 박테리아"라는 용어는 일반적으로 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 도입하거나 포함하는 박테리아를 지칭한다. 제3 박테리아는 디스플레이 벡터 단편 I을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 제3 디스플레이 박테리아는 디스플레이 벡터 단편 I, 및/또는 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 발현, 복제 및/또는 저장(예를 들어, 동결보존)할 *?**?*수 있다.
본 발명에서, 용어 "디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리"는 일반적으로 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제3 디스플레이 박테리아에 도입하여 수득한 박테리아 라이브러리를 지칭한다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리는 디스플레이 벡터 성분 I을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 박테리아 라이브러리일 수 있다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리는 디스플레이 LC를 코딩하는 약 105 내지 약 109(바람직하게는 약 105 내지 약 108, 더 바람직하게는 약 105 내지 약 107, 가장 바람직하게는 약 106 내지 약 107)의 핵산서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리는 약 107 내지 약 1012(바람직하게는 약 107 내지 약 1011, 보다 바람직하게는 약 107 내지 약 1010, 더욱 바람직하게는 약 107 내지 약 109, 가장 바람직하게는 약 107 내지 약 108)의 상기 제3 디스플레이 박테리아를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "제4 디스플레이 박테리아"라는 용어는 일반적으로 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 도입하거나 포함하는 박테리아를 지칭한다. 제4 박테리아는 디스플레이 벡터 단편 II를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 제4 디스플레이 박테리아는 디스플레이 벡터 단편 II, 및/또는 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 발현, 복제 및/또는 저장(예를 들어, 동결보존)할 *?**?*수 있다.
본 발명에서, 용어 "디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리"는 일반적으로 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제4 디스플레이 박테리아에 도입하여 수득한 박테리아 라이브러리를 지칭한다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리는 디스플레이 벡터 성분 II을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 박테리아 라이브러리일 수 있다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리는 디스플레이 LC를 코딩하는 약 105 내지 약 109(바람직하게는 약 105 내지 약 108, 더 바람직하게는 약 105 내지 약 107, 가장 바람직하게는 약 106 내지 약 107)의 핵산서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리는 약 107 내지 약 1012(바람직하게는 약 107 내지 약 1011, 보다 바람직하게는 약 107 내지 약 1010, 더욱 바람직하게는 약 107 내지 약 109, 가장 바람직하게는 약 107 내지 약 108)의 상기 제4 디스플레이 박테리아를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "도입"은 일반적으로 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 전달 또는 도입하는 과정을 의미한다. 상기 세포는 숙주 세포일 수 있다. 도입된 세포는 대상체의 1차 세포 및 그 자손을 포함한다. 상기 세포는 원핵 세포일 수 있으며, 특정 실시 양태에서 박테리아 세포일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "결찰(ligation)"은 일반적으로 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 함께 결합하는 것을 의미한다. 특정 실시 양태에서, 상기 결찰은 리가아제(예: DNA 리가아제)에 의해 달성될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 특정 폴리뉴클레오타이드의 3'-말단은 다른 폴리뉴클레오타이드의 5'-말단에 결찰되어 온전한 폴리뉴클레오타이드 분자를 형성한다. 본 발명의 용어 "결찰"은, 용어 "결합"과 동일한 의미에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "클론"은 일반적으로 콜로니의 수를 의미한다. 특정 실시 양태에서, 상기 클론은 박테리아 라이브러리(예시로, 경쇄 성분 박테리아 라이브러리, 중쇄 성분 박테리아 라이브러리, 디스플레이 박테리아 라이브러리 및/또는 파지 라이브러리)에서 콜로니의 개수(number)이다. 어떤 경우에는 상기 클론은 박테리아 라이브러리에 있는 서로 다른 콜로니의 개수일 수 있다. 다른 경우에, 클론은 단일 클론에 의해 생성된 자손 집단의 개수일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 일반적으로 임의의 길이(200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000, 100,000 등을 포함하는)의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체와 같은 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합을 함유할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "및/또는"은 대안 중 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, 용어 "포함"은 일반적으로 명시적으로 지정된 특징을 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "약"은 일반적으로 명시된 값 이상 또는 이하의 0.5%-10% 범위 내에서 변화하는 것을 의미하며, 특정 실시 양태에서, 상기 "약"은 지정된 값보다 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10% 만큼 높거나 낮은 값을 의미하는 것으로 해석된다.
상세한 설명
일 관점에서, 본 발명은 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 구축하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터는 각각 항원-특이적 VH, 항원-특이적 LC, 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II를 포함할 수 있는 방향적 고리화에 의해 연결된 4개의 단편으로 구성될 수 있다.
성분 벡터
본 발명에 따른 방법은 폴리뉴클레오타이드(예시로, 제9 폴리뉴클레오타이드 및 제10 폴리뉴클레오타이드)를 제공하는 것을 포함할 수 있는 성분 벡터를 구축방법을 포함할 수 있다. 상기 제9 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B2-VH 성분 벡터 도구 단편-B3을 포함할 수 있고, 상기 제10 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 S5-LC 성분 벡터 도구 단편-S6을 포함할 수 있다. 상기 벡터 도구 단편은 IgG의 Fc 단편으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 단편은 인간 IgG1의 Fc 단편 또는 인간 IgG2의 Fc 단편일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 제9 뉴클레오티드는 DDB214 및 DDB215를 프라이머로 사용하고 인간 IgG1의 Fc 단편을 주형으로 사용하여 증폭함으로써 수득될 수 있다. 여기서, DDB214는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, DDB215는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 제10 뉴클레오티드는 DDB216 및 DDB217를 프라이머로 사용하고 인간 IgG1의 Fc 단편을 주형으로 사용하여 증폭함으로써 수득될 수 있다. 여기서, DDB216는 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, DDB217는 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 제9 뉴클레오티드는 2개의 말단에 제한 엔도뉴클레아제의 인식 부위 B2 및 B3을 포함할 수 있고, 상기 제 10 뉴클레오티드는 2개의 말단에 제한 엔도뉴클레아제의 인식 부위 S5 및 S6을 포함할 수 있다.
상기 방법은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 제9 폴리뉴클레오티드 및 제10 폴리뉴클레오티드)를 발현 성분 벡터에 삽입하여 성분 벡터(예를 들어, VH 성분 벡터 및 LC 성분 벡터)를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 발현 성분 벡터는 임의의 벡터, 특히 증폭 및/또는 쉽게 보존될 수 있는 임의의 벡터로부터 유래될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 발현 성분 벡터로 사용되는 벡터는 높은 카피수(copy number), 작은 분자량 등의 특성을 가질 수 있다. 다른 실시 양태에서, 발현 성분 벡터는 pMD 벡터로부터 유래될 수 있다. 상기 발현 성분 벡터는 pMD19 벡터이거나 pMD19 벡터로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서, 상기 발현 성분 벡터를 구축하기 위해 pMD 벡터 또는 pMD 유래 벡터를 조작/변형할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 벡터에서 엔도뉴클레아제에 대한 하나 이상의 인식 부위는 부위 지정 돌연변이유발을 통해 제거될 수 있다(예를 들어, 내부의 BsmBI 및/또는 SfiI에 대한 하나 이상의 인식 부위 제거). 다른 실시 양태에서, 상기 벡터에서 엔도뉴클레아제에 대한 하나 이상의 인식 부위는 부위 지정 돌연변이유발을 통해 추가될 수 있다(예를 들어, 선택된 위치에서 BsmBI 및/또는 SfiI에 대한 하나 이상의 인식 부위 추가).
특정 실시 양태에서, 상기 지정 돌연변이 유발에 의해, 벡터에 원래 포함된 BsmBI에 대한 하나 이상의 인식 부위가 제거될 수 있다. 또는 상기 BsmBI에 대한 하나 이상의 인식 부위가 벡터의 다른 위치에 추가되어 변형된 벡터(예: 변형된 pMD 벡터)를 얻을 수 있다.
본 발명에서, 상기 발현 성분 벡터(예를 들어, VH 성분 벡터의 발현 성분 벡터)는 BsmBI에 대한 인식 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 발현 성분 벡터가 BsmBI에 대한 두 개의 인식 부위를 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 변형된 벡터(예: 변형된 pMD 벡터)를 얻기 위해 부위 지정 돌연변이를 유발시켜 벡터에 원래 포함된 SfiI에 대한 하나 이상의 인식 부위를 제거할 수 있고, 또는 SfiI에 대한 하나 이상의 추가 인식 부위를 벡터의 다른 위치에 추가할 수 있다.
본 발명에서, 상기 발현 성분 벡터(예를 들어, LC 성분 벡터의 발현 성분 벡터)는 SfiI에 대한 인식 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 발현 성분 벡터가 SfiI에 대한 두 개의 인식 부위를 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드(예시로, 제9 폴리뉴클레오티드 및 제10 폴리뉴클레오티드 )를 발현 성분 벡터에 삽입하여 성분 벡터 저장 플라스미드를 얻은 다음, 상기 성분 벡터 저장 플라스미드(예시로, VH 성분 벡터 저장 플라스미드 및 LC 성분 벡터 저장 플라스미드)를 박테리아(제9 박테리아 및 제 10 박테리아)에 도입하여 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리(VH 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리 및 LC 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리)를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 도 3에 도시된 본 발명의 상기 VH 성분 벡터는 제9 폴리뉴클레오티드를 발현 성분 벡터에 삽입하고, 결찰시켜(ligation) 얻을 수 있다. 상기 VH 성분 벡터는 5'에서 3' 방향으로 B3-VH 성분 벡터 결찰 단편-B2를 포함할 수 있는 제6 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 B2 및 B3은 각각 BsmBI 및/또는 Esp3I에 의해 특이적으로 인식되고 절단될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 B2는 서열번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있고, 상기 B3은 서열번호 9에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
분해(digestion)등의 방법으로 처리 후 상기 VH 구성 요소 벡터는 5' 및 3'-말단에서 절단 후에, 특정 서열의 점착성 말단을 가질 수 있는 방출된 제6 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 도 4에 도시된 본 발명의 상기 LC 성분 벡터는 제10 폴리뉴클레오티드를 발현 성분 벡터에 삽입하고, 결찰시켜(ligation) 얻을 수 있다. 상기 LC 성분 벡터는 5'에서 3' 방향으로 S6-LC 성분 벡터 결찰 단편-S5를 포함할 수 있는 제8 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 S6 및 S5는 각각 SfiI에 의해 특이적으로 인식되고 절단될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 S6은 서열번호 11에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있고, 상기 S5는 서열번호 10에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
분해(digestion)등의 방법으로 처리 후 상기 LC 구성 요소 벡터는 5' 및 3'-말단에서 절단 후에, 특정 서열의 점착성 말단을 가질 수 있는 방출된 제8 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다.
항원 특이적 VH 및 항원 특이적 LC
본 발명의 상기 방법은 5'에서 3' 방향으로 B-항원 특이적 VH-B를 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 B는 B2 및/또는 B3를 특이적으로 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위이다. 예를 들어, 상기 항원-특이적 VH는 항원-특이적 VH의 5' 및 3' 말단이 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, BsmBI 및/또는 Esp3I)에 대한 인식 부위에 부착되도록 항원-특이적 VH 단편을 주형으로 사용하여 증폭될 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 5'에서 3' 방향으로 S-항원 특이적 LC-S를 포함하는 제7 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 S는 S5 및/또는 S6을 특이적으로 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위이다. 예를 들어, 상기 항원-특이적 LC는 항원-특이적 LC의 5' 및 3' 말단이 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, SfiI)에 대한 인식 부위에 부착되도록 항원-특이적 LC 단편을 주형으로 사용하여 증폭될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 항원-특이적 VH 단편 및 항원-특이적 LC 단편은 선행 기술의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예시로, 항원으로 면역화된 동물로부터 얻을 수 있고, 조합 항체 라이브러리, 파지 디스플레이 라이브러리, 효모 표면 디스플레이 라이브러리, 리보솜 디스플레이 라이브러리, mRNA 디스플레이 라이브러리를 포함하는 항체 라이브러리에서도 얻을 수 있다.
성분 라이브러리
본 발명의 상기 방법은 상기 제5 폴리뉴클레오타이드 및 VH 성분 벡터를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드 및 방출된 제6 폴리뉴클레오타이드를 획득한 후, 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드 및 방출된 제6 폴리뉴클레오타이드를 방향적으로 연결되고 고리화 될 수 있도록 혼합하여, 항원 특이적 VH 구성 요소 라이브러리를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 항원-특이적 VH 성분 라이브러리는 항원-특이적 VH를 포함할 수 있다. 항원 특이적 VH 성분 라이브러리를 제한 엔도뉴클레아제(예: B2 및 B3을 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 절단한 후, 방출된 항원 특이적 VH를 얻을 수 있으며, 상기 방출된 항원 특이적 VH의 5' 및 3' 말단은 특정 서열의 점착성 말단을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 상기 제7 폴리뉴클레오타이드 및 LC 성분 벡터를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 절단된 제7 폴리뉴클레오타이드 및 방출된 제8 폴리뉴클레오타이드를 획득한 후, 절단된 제7 폴리뉴클레오타이드 및 방출된 제8 폴리뉴클레오타이드를 방향적으로 연결되고 고리화 될 수 있도록 혼합하여, 항원 특이적 LC 구성 요소 라이브러리를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 항원-특이적 LC 성분 라이브러리는 항원-특이적 LC를 포함할 수 있다. 항원 특이적 LC 성분 라이브러리를 제한 엔도뉴클레아제(예: S5 및 S6을 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 절단한 후, 방출된 항원 특이적 LC를 얻을 수 있으며, 상기 방출된 항원 특이적 LC의 5' 및 3' 말단은 특정 서열의 점착성 말단을 가질 수 있다.
디스플레이 벡터
본 발명의 상기 방법은 또한 4개의 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드)로 구성될 수 있는 디스플레이 벡터를 구성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드(예시로, 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드)는 디스플레이 LC 및/또는 디스플레이 VH와 같은 항원-결합 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 디스플레이 LC는 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄를 코딩할 수 있고, 디스플레이 VH는 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄 가변 영역을 코딩할 수 있고, 경쇄는 중쇄 가변 영역에 결합하여 표적을 인식하는 Fab를 형성한다. 특정 실시 양태에서, 상기 표적은 항원일 수 있다. 예시로, 상기 표적은 PD-1일 수 있다.
본 발명의 상기 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II와 같은 디스플레이 벡터 단편을 포함할 수 있다. 상기 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II의 길이 또는 유형은 발현되는 항원 결합 폴리펩티드 또는 그 단편의 길이 또는 성질, 및 제한 부위의 길이 또는 성질에 따라 각각 원하는대로 선택될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II는 표적 유전자를 발현할 수 있는 임의의 하나의 벡터 단편으로부터 유래될 수 있다. 예시로, 상기 발현 벡터 단편 I 및 발현 벡터 단편 II는 디스플레이 벡터 pDGB4의 단편으로부터 유래될 수 있다(pDGB4와 관련하여, Ivan Zhou, et al., “Four-way ligation for construction of a mammalian cell-based full-length antibody display library”, Acta Biochim Biophys Sin 2011, 43: 232-238 참조).
본 발명의 상기 디스플레이 벡터 단편(예시로, 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II)은 프로모터, 인핸서, 신호 펩티드, 스크리닝 마커(예시로, 효소 인식 부위, 저항성 유전자, 리포터 유전자, 스크리닝 유전자 등이 포함될 수 있음)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 기능을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 이는 원하는 기능(특정 기능을 가진 상기 염기서열의 삽입/치환 및/또는 삭제)에 따라 당업자에 의해 디스플레이 벡터 단편에서 조정될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 디스플레이 벡터 단편은 경우에 따라 상이한 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 조정될 수 있다.
본 발명에서, 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B2-디스플레이 VH-B3을 포함할 수 있고, 여기서 B2 및 B3은 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있으며, 상기 디스플레이 VH는 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄 가변 영역을 코딩할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 B2와 B3는 각각 BsmBI에 의해 특이적으로 인식되고 절단될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 B2는 서열번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있고, B3은 서열번호 9에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 S5-디스플레이 LC-S6을 포함할 수 있고, 여기서 S5 및 S6은 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있으며, 상기 디스플레이 LC는 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄를 코딩할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 S5 및 S6은 각각 SfiI에 의해 특이적으로 인식되고 절단될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 S5는 서열번호 0에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있고, S6은 서열번호 11에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 B3-디스플레이 벡터 단편 I-S5을 포함할 수 있고, 여기서 B3 및 S5는 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 S5는 Sfil에 의해 특이적으로 인식되고 절단될 수 있고, B3은 BsmBI 및/또는 Esp3I에 의해 특이적으로 인식 및 절단될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 B3은 서열번호 9에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있고, S5는 서열번호 10에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 S6-디스플레이 벡터 단편 II-B2을 포함할 수 있고, 여기서 S6 및 B2는 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 S6은 Sfil에 의해 특이적으로 인식 및 절단될 수 있고, B2는 BsmBI 및/또는 Esp3I에 의해 특이적으로 인식 및 절단될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 B2는 서열번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있고, S6은 서열번호 11에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드 및/또는 디스플레이 벡터 제4 폴리뉴클레오타이드는 샘플 물질로부터 얻어질 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 샘플 물질은 항원-표적화 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 상기 항원은 PD-1, PD-L1, LAG-3, CD47, CD3을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 면역원성 단편 또는 결정인자일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 PD-1을 표적으로 한다.
디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드가 도입된 양성 박테리아를 스크리닝하기 위해, 상기 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드(예시로, 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드)는 또한 신호 펩티드(예시로, 자연 내성 유전자를 발현하는 신호 펩티드)를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 3'-말단은 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 있는 제한 부위에 결합할 수 있다. 경우에 따라, 의도치 않은 돌연변이(unintentional mutation)를 이용하여 상기 시그널 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 3' 말단 부분에 적절한 제한 부위를 도입하기 위해 염기서열을 변경시킬 수 있지만, 상기 시그널 펩티드의 아미노산 서열은 그대로 유지된다. 특정 실시 양태에서, 상기 시그널 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 12 및 서열번호 14 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있고; 또는 대안적으로, 상기 시그널 펩티드는 서열번호 13 및 서열번호 15로부터 선택된 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 standard PCR, long PCR, hot start PCR, qPCR, RT-PCR 및 등온 증폭(isothermal amplification)을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 당업계의 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 프라이머는 각각 표적 단편(예: 디스플레이 LC, 디스플레이 VH, 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II)의 서열에 따라 설계될 수 있으며, 이어서 이를 증폭용 주형으로 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 디스플레이 LC를 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 20 및 서열번호 21에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 디스플레이 VH를 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 22 및 서열번호 23에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 디스플레이 벡터 단편 I을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 18 및 서열번호 19에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 디스플레이 벡터 단편 II를 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 16 및 서열번호 17에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
상기 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻은 후 이를 박테리아에 별도로 도입하여 박테리아 라이브러리를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다: 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제1 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계; 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제2 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계; 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제3 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계; 및 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제4 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계.
본 발명에서, 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드는 모두 선형 핵산 분자일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드는 디스플레이 성분 벡터에 삽입되어 저장 결찰 생성물을 형성할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 PCR 클로닝을 사용하여 성분 벡터에 삽입될 수 있다. 상기 성분 벡터는 플라스미드 벡터(예시로, pBR322, pUC 벡터), 파지 벡터(예시로, M13 벡터, λ 벡터), 파지 유래 플라스미드(예시로, 파지미드(phagemid), 코스미드(cosmid)), 및 박테리아 인공 염색체(BAC)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 성분 벡터는 pUC 벡터로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 성분 벡터는 pUC19 벡터이거나 pUC19 벡터로부터 유래될 수 있다.
그런 다음, 상기 저장 결찰 생성물을 박테리아에 도입하여 디스플레이 박테리아 라이브러리를 얻을 수 있다.
본 발명에서, 상기 디스플레이 박테리아 라이브러리는 약 10개 이상(또는, 약 100 이상, 200 이상, 300 이상, 400 이상, 500 이상, 600 이상, 800 이상, 약 1000 이상, 약 10000 이상)의 상이한 클론을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 디스플레이 박테리아 라이브러리는 약 10개 이상(또는, 약 100 이상, 200 이상, 300 이상, 400 이상, 500 이상, 600 이상, 800 이상, 약 1000 이상, 약 10000 이상)의 동일한 클론을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 디스플레이 박테리아 라이브러리(예: 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리, 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리, 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리 및 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리)의 효과적인 클론의 비율은 적어도 약 50%(또는, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상 , 적어도 약 95%, 적어도 약 99%)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 디스플레이 박테리아 라이브러리의 박테리아는 액체에서 배양될 수 있다. 액체 배양을 위한 시간은 약 8시간 이하(예시로, 약 4시간 이하, 약 5시간 이하, 약 6시간 이하 또는 약 7시간 이하)일 수 있다. 본 발명에서, 상기 액체 배양의 조작은 간단하다. 특정 실시 양태에서, 상기 디스플레이 박테리아 라이브러리의 박테리아를 접시에 펼쳐 소량의 박테리아 브로쓰(bacterial broth)에서 배양한 다음 콜로니를 분류할 수 있다. 플레이트(plate) 배양 시간은 약 12-18시간(예시로, 약 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간 또는 18시간)일 수 있다. 본 발명에서, 상기 플레이트(plate) 배양은 시퀀싱 분석 전에 콜로니의 선택(예시로, 단일 클론의 선택)을 허용한다.
항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터
본 발명의 상기 방법은 VH 성분 라이브러리, LC 성분 라이브러리 및 디스플레이 벡터를 제한 엔도뉴클레아제(예시로, S5, S6, B2 및 B3을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)로 특이적으로 절단하여 방출된 제1 폴리뉴클레오타이드, 방출된 제2 폴리뉴클레오타이드, 방출된 제3 폴리뉴클레오타이드 및 방출된 제4 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방출된 제1 폴리뉴클레오티드의 5'-말단은 제한 엔도뉴클레아제(예시로, BsmBI 및/또는 Esp3I과 같은 B2를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)에 의해 절단된 후 점착성 말단을 가질 수 있고, 3'-말단은 제한 엔도뉴클레아제(예시로, BsmBI 및/또는 Esp3I와 같은 B3를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)에 의해 절단된 후 점착성 말단을 가질 수 있다.
상기 방출된 제2 폴리뉴클레오티드의 5'-말단은 제한 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI과 같은 S5를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)에 의해 절단된 후 점착성 말단을 가질 수 있고, 3'-말단은 제한 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI과 같은 S6을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)에 의해 절단된 후 점착성 말단을 가질 수 있다.
상기 방출된 제3 폴리뉴클레오티드의 5'-말단은 제한 엔도뉴클레아제(예시로, BsmBI 및/또는 Esp3I와 같은 B3을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)에 의해 절단된 후 점착성 말단을 가질 수 있고, 3'-말단은 제한 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI과 같은 S5를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)에 의해 절단된 후 점착성 말단을 가질 수 있다.
상기 방출된 제4 폴리뉴클레오티드의 5'-말단은 제한 엔도뉴클레아제(예시로, SfiI과 같은 S6을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)에 의해 절단된 후 점착성 말단을 가질 수 있고, 3'-말단은 제한 엔도뉴클레아제(예시로, BsmBI 및/또는 Esp3I과 같은 B2를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제)에 의해 절단된 후 점착성 말단을 가질 수 있다.
본 발명에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드, 제3 폴리뉴클레오티드 및 제4 폴리뉴클레오티드는 모두 선형 핵산 분자일 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 상기 방출된 제1 폴리뉴클레오타이드, 방출된 제2 폴리뉴클레오타이드, 방출된 제3 폴리뉴클레오타이드 및 방출된 제4 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여 이들이 방향적으로 결합되고 고리화되어 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 형성할 수 있도록 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 방향성 결합은 리가아제, 바람직하게는 T4 DNA 리가아제를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터는 제1 박테리아에 도입되어 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리를 수득할 수 있다.
본 발명에서, 상기 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리는 약 10개 이상(예시로, 약 100 이상, 약 200 이상, 약 300 이상, 약 400 이상, 약 500 이상, 약 1000 이상, 약 10000 이상)의 클론을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리에서 효과적인 클론의 비율은 적어도 약 50%(예시로, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상 , 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 적어도 약 99%이상)일 수 있다.
본 발명의 상기 방법을 사용하여 디스플레이 벡터를 구성하는 것부터 시작하여 독특한 서열의 항원-특이적 결합 폴리펩타이드를 스크리닝하는 데 필요한 시간은 적어도 약 1주(예를 들어, 적어도 약 10일, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주 또는 적어도 약 4주)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리의 박테리아는 액체에서 배양될 수 있다. 액체 배양을 위한 시간은 약 24시간 이하(예시로, 약 5시간 이하, 약 10시간 이하, 약 15시간 이하, 약 20시간 이하, 약 22시간 이하 또는 약 22시간 이하)일 수 있다. 본 발명에서, 상기 액체 배양의 조작은 간단하다. 특정 실시 양태에서, 상기 박테리아 라이브러리의 박테리아를 접시에 펼쳐 소량의 박테리아 브로쓰(bacterial broth)에서 배양한 다음 콜로니를 분류할 수 있다. 플레이트(plate) 배양 시간은 약 12-18시간(예시로, 약 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간 또는 18시간)일 수 있다. 본 발명에서, 상기 플레이트(plate) 배양은 시퀀싱 분석 전에 콜로니의 선택(예시로, 단일 클론의 선택)을 허용한다.
상기 방법은 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 세포 내로 도입하는 단계, 및 세포로부터 항원-특이적 결합 폴리펩타이드를 획득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 또한, 상기 항원-특이적 결합 폴리펩타이드는 이어서 박테리아로부터 수득될 수 있다.
제한 부위(restriction site)
본 발명에서, 제한 엔도뉴클레아제의 인식 부위 서열은 항원 결합 폴리펩타이드 또는 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 포함되지 않도록 설계된다. 본 발명의 제한 엔도뉴클레아제는 각각 B2, B3, S5 및 S6을 특이적으로 인식할 수 있다. 여기서, B2, B3, S5 및 S6은 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위일 수 있다.
본 발명에서 상기 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위는 각각 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 제한 엔도뉴클레아제에 의해 특이적으로 인식될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI, BsmBI 및/또는 Esp3I에서 선택될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 다른 적용 가능한 제한 엔도뉴클레아제 역시 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI, BsmBI 및 Esp3I 중에서 선택될 수 있다. 본 발명에서, 상기 BsmBI 및 Esp3I는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 동일한 인식 부위를 인식할 수 있는 동종효소일 수 있다.
본 발명에서, 상기 S5 및 S6은 SfiI에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 본 발명에서, 상기 B2 및 B3은 BsmBI 및/또는 Esp3I에 의해 인식되고 절단될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 SfiI는 13개의 염기(5'에서 3' 방향으로)GGCCNNNN/NGGCC로 구성된 서열을 인식할 수 있고, 이는 효소 절단 후 3'-말단에서 돌출 서열(예시로, 3개의 염기를 포함하는 단일 가닥 서열)을 형성할 수 있으며, 여기서 N은 4개의 염기 GATC 중 어느 하나를 나타낼 수 있다. 따라서 SfiI가 인식할 수 있는 시퀀스는 4^5개이다.
특정 실시 양태에서, 상기 BsmBI 및 Esp3I는 12개의 염기(5'에서 3'방향으로) CGTCTCN/NNNNN로 구성된 서열을 인식할 수 있고, 이는 효소 절단 후 3'-말단에서 돌출 서열(예시로, 3개의 염기를 포함하는 단일 가닥 서열)을 형성할 수 있으며, 여기서 N은 4개의 염기 GATC 중 어느 하나를 나타낼 수 있다. 따라서 SfiI가 인식할 수 있는 서열은 4^6개이다.
특정 실시 양태에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위는 SfiI에 의해 특이적으로 인식되고 절단되는 부위일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 각각 S5 및 S6이라고 할 수 있다. 다른 실시 양태에서, S5는 서열번호 10에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있고, S6은 서열번호 11에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위는 BsmBI 및/또는 Esp3I에 의해 특이적으로 인식되고 절단되는 부위일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 각각 B2 및 B3라고 할 수 있다. 다른 실시 양태에서, B2는 서열번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있고, B3은 서열번호 9에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식부위는 여기에 열거된 인식 부위를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 또한 표적 서열(예시로, 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 원치 않는 인식 또는 절단을 일으키지 않는다면, 상기에 나열되지 않은 다른 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함할 수 있음을 강조한다.
다른 관점에서, 본 발명은 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리를 추가로 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 생성된 디스플레이 벡터를 추가로 제공한다.
어떠한 이론에도 제한되지 않고, 하기의 실시예는 본 발명의 융합 단백질 및 이의 제조 방법 및 용도를 예시하기 위한 것일 뿐, 본 출원의 발명 범위를 제한하기 위해 사용되지 않는다.
실시예
실시예 1 인간 PBMC의 파지 표면 항체(Fab) 디스플레이 라이브러리 구축
1.1 면역물질의 전체(total) RNA/mRNA 획득
전체 RNA는 인간 말초 혈액 림프구에서 추출되었고 mRNA는 전체 RNA에서 추가로 분리되었다(Takara Cat# Z652N/636592, 특정 테스트 단계는 제품 설명서 참조).
1.2 프라이머의 설계 및 합성
Phage Display(실험실 매뉴얼, ISBN 0-87969-546-3)를 참조하여, 프라이머는 인간 중쇄 가변 영역 VH, 경쇄 KLC(full-length Kappa 경쇄) 및 경쇄 LLC(full-length Lamda 경쇄)에 대해 설계되었다. 여기서, 경쇄 정방향 프라이머의 5'-말단은 R1의 염기서열 GGCCCAGGCGGCC(서열번호: 78)를 포함하고, 역방향 프라이머의 5'-말단은 R2의 염기서열 GGCCACATAGGCC(서열번호: 79)를 포함한다; 중쇄 가변영역 정방향 프라이머의 5'-말단은 R5의 염기서열 GGCCCAACCGGCC(서열번호: 80)를 포함하고, 역방향 프라이머의 5'-말단은 GGCCCTCAGCGGCC(서열번호: 81)의 염기서열을 포함한다. 프라이머는 GENEWIZ에 의해 합성되었다.
링커를 증폭하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 pComb3x 벡터를 주형으로 사용하여 설계되었다. 여기서, 정방향 프라이머의 5'-말단은 R3의 염기서열 GGCCACATAGGCC(서열번호: 79)를 포함하고, 역방향 프라이머의 5'-말단은 R4의 염기서열 GGCCCAACCGGCC(서열번호: 80)를 포함한다.
특정 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타난다.
프라이머 이름 서열번호
Forward primer of light chain KLC 82-99
Reverse primer of light chain KLC 100
Forward primer of light chain LLC 101-125
Reverse primer of light chain LLC 126
Forward primer of VH 127-150
Reverse primer of VH 151-155
Forward primer of linker 156
Reverse primer of linker 157
1.3 제1 폴리뉴클레오티드 및 제3 폴리뉴클레오티드의 수득
성분 항체 유전자 라이브러리는 하기 2단계의 접근 방식으로 증폭되었다.
단계 1. 상기 실시예 1.1에서 얻은 mRNA를 주형으로 사용하여 Promega의 MMLV로 역전사하여 cDNA를 합성하는 단계(Promega Co.의 제품 설명서에 따르면, 프라이머는 Thermo Cat# N8080127이고 역전사효소는 Promega Cat# M1701임).
단계 2. 상기 단계 1에서 얻은 cDNA를 주형으로 사용하고, 상기 실시예 1.2에서 얻은 프라이머를 사용하여 성분 항체의 KLC, LLC 및 VH 유전자 라이브러리를 PCR로 증폭하는 단계(Takara Cat# RR900A, 회사 제품 지침에 따름). 이 후 겔 전기영동(Axygen Gel Extraction Kit 사용, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"의 지침에 따라 작동)에 의한 정제 및 회수 후, 각각 KLC 단편, LLC 단편 및 VH 단편인 PCR 산물을 얻었다.
1.4 저장 벡터의 구성
1.4.1 프라이머 디자인
프라이머는 상기 실시예 1.2의 내용을 참조하여 설계되었다.
저장 벡터를 얻기 위한 프라이머를 설계하고 합성했다. 특정 프라이머 서열은 아래 표 2를 참조.
프라이머 이름 서열번호
Forward primer of R1-1kb-R2 158
Reverse primer of R1-1kb-R2 159
Forward primer of R5-1kb-R6 162
Reverse primer of R5-1kb-R6 163
1.4.2 PCR 증폭
1kb 길이의 인간 IgG1 Fc(서열번호 164)를 주형으로 하고 상기 실시예 1.4.1에서 제작한 R1-1kb-R2의 정방향 프라이머와 R1-1kb-R2 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 겔 전기영동(Axygen Gel Extraction Kit 사용)에 의한 정제 및 회수 후, PCR 생성물인 R1-1kb-R2(서열번호 165)를 얻었다.
pComb3x 벡터를 주형으로 하여 R3-링커(linker)-R4의 정방향 프라이머(서열번호 160)와 R3-링커-R4의 역방향 프라이머(서열번호 161)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 겔 전기영동(Axygen Gel Extraction Kit 사용)에 의한 정제 및 회수 후, PCR 산물 R3-링커-R4(서열번호 167)를 얻었다. 여기서, 링커는 72bp의 길이를 가질 수 있으며, 그 염기서열은 서열번호 166으로 표시된다.
1kb 길이의 인간 IgG1 Fc(서열번호 164)를 주형으로 하rh 상기 실시예 1.4.1에서 제작한 R5-1kb-R6의 정방향 프라이머와 R5-1kb-R6 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 겔 전기영동(Axygen Gel Extraction Kit 사용)에 의한 정제 및 회수 후, PCR 생성물인 R5-1kb-R6(서열번호 168)를 얻었다.
1.4.3 경쇄 저장 벡터 및 중쇄 저장 벡터의 구축
TA 클로닝 방법(TA cloning kit, Takara Co.에서 구입)을 이용하여 상기 실시예 1.4.2에서 제조한 R1-1kb-R2 단편을 pMD19-T 벡터에 삽입하여 경쇄 저장 벡터 DDB-R1-1kb-R2를 얻었다. 상기 경쇄 저장 벡터는 전장 경쇄 유전자 라이브러리에 삽입될 수 있으며 그 벡터 맵은 도 9에 표시하였다.
TA 클로닝 방법(TA cloning kit, Takara Co.에서 구입)을 이용하여 상기 실시예 1.4.2에서 제조한 R5-1kb-R6 단편을 pMD19-T 벡터에 삽입하여 R5-1kb- R6 단편을 포함하는 벡터를 얻었다. 그 후, 상기 벡터는 VH 유전자 라이브러리에 삽입하기 위한 중쇄 저장 벡터 DDB-R5-1kb-R6을 얻기 위해, 이 벡터에서 원래의 BsmBI 제한 부위를 프라이머 돌연변이를 통해 제거하기 위한 주형으로 이용되었다. 상기 벡터의 벡터 맵은 도 9에 표시하였다.
특정 프라이머 서열은 아래 표 3을 참조.
프라이머 이름 서열 번호
Vector-mutated forward primer 169
Vector-mutated reverse primer 170
1.4.4 링커(linker) 저장 벡터의 구축 및 링커 성분 박테리아의 획득
TA 클로닝 방법(TA cloning kit, Takara Co.에서 구입)을 이용하여 실시예 1.4.2에서 제조한 R3-linker-R4를 pMD19-T 벡터에 삽입하여 링커 저장 벡터 DDB-R3-linker-R4를 얻었다. 상기 링커 저장 벡터의 벡터 맵은 도 11에 나타냈다. 링커 저장 벡터로 TG1 컴피턴트(competent) 박테리아(Lucigen Co.)를 형질전환하고 플레이트 상에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니는 서열분석(sequencing)을 위해 보낸 다음 냉동보존을 통해 나중에 사용할 링커 성분 박테리아를 얻기 위해 콜로니를 수집했다.
1.5 성분 박테리아 라이브러리 획득
1.5.1 경쇄 성분 박테리아 라이브러리 획득
상기 실시예 1.3에서 제조된 KLC 및 LLC를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제한 엔도뉴클레아제 R1 및 R2로 절단하여 표적 경쇄 단편(약 0.65kb)을 얻었다.
상기 실시예 1.4에서 제조된 경쇄 저장 벡터 DDB-R1-1kb-R2를 제한 엔도뉴클레아제 R1 및 R2로 절단하여 경쇄 저장 벡터 단편(약 2.7kb)을 얻었다.
생성된 표적 경쇄 단편을 경쇄 저장 벡터 단편과 혼합한 후, T4 DNA 리가아제(NEB, Thermo에서 구입)를 사용하여 결합(ligate)하여 경쇄 저장 결찰 생성물을 얻었다. TG1 컴피턴트(competent) 박테리아(Lucigen, Cat# 60502-2, 제조사의 지시에 따라 작동됨)를 경쇄 저장 결찰 산물로 형질전환하고, 암피실린 내성 플레이트(Thermo, Cat# 240845)에 도포한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니는 서열분석(sequencing)을 위해 보낸 다음, 모든 콜로니를 수집하여 경쇄 성분 박테리아 라이브러리를 얻었다. 상기 라이브러리는 품질(quality)이 확인될 수 있고/있거나 나중에 사용하기 위해 냉동보존될 수 있다.
1.5.2 중쇄 성분 박테리아 라이브러리 획득
상기 실시예 1.3에서 제조된 폴리뉴클레오티드를 제한 엔도뉴클레아제 R5 및 R6으로 절단하여 표적 중쇄 가변 영역 단편(약 0.35kb)을 얻었다.
상기 실시예 1.4에서 제조된 중쇄 저장 벡터 DDB-R5-1kb-R6을 제한 엔도뉴클레아제 R5, R6으로 절단하여 중쇄 저장 벡터 단편(약 2.7kb)을 얻었다.
생성된 표적 중쇄 가변영역 단편을 중쇄 저장 벡터 단편과 혼합한 후, T4 DNA 리가아제(NEB, Thermo에서 구입)를 사용하여 결합(ligate)하여 중쇄 저장 결찰 생성물을 얻었다. TG1 컴피턴트(competent) 박테리아(Lucigen, Cat# 60502-2, 제조사의 지시에 따라 작동됨)를 중쇄 저장 결찰 산물로 형질전환시키고, 암피실린 내성 플레이트(Thermo, Cat# 240845)에 도포하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니는 서열분석(sequencing)을 위해 보낸 다음, 모든 콜로니를 수집하여 경쇄 성분 박테리아 라이브러리를 얻었다. 상기 라이브러리는 품질(quality)이 확인될 수 있고/있거나 나중에 사용하기 위해 냉동보존될 수 있다.
1.6 경쇄 성분 플라스미드, 중쇄 성분 플라스미드 및 링커 단편의 획득
플라스미드 추출 키트(Axygen에서 구입)를 이용하여 상기 실시예 1.5.1에서 제작한 경쇄 성분 박테리아 라이브러리와 상기 실시예 1.5.2에서 제작한 중쇄 성분 박테리아 라이브러리의 플라스미드를 각각 추출하여 경쇄 성분 플라스미드 및 중쇄 성분 플라스미드를 얻었다.
상기 실시예 1.5.1에서 제조된 경쇄 성분 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 R1 및 R2로 절단한 후 정제하고 겔 전기영동으로 회수하여 경쇄 삽입 단편 LC를 얻었다.
상기 실시예 1.5.2에서 제조된 중쇄 성분 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 R5 및 R6으로 분해한 다음 정제하고 겔 전기영동으로 회수하여 중쇄 삽입 단편 HC를 얻었다.
플라스미드 추출 키트(Axygen에서 구입)를 사용하여 상기 실시예 1.4.4에서 제조된 링커 성분 박테리아의 플라스미드를 추출하여 링커 성분 플라스미드를 얻었다. 상기 실시예 1.4.4의 링커 성분 플라스미드 또는 링커 저장 벡터를 주형으로 사용하여, 링커를 포함하는 0.8kb의 단편을 링커 정방향 프라이머(서열번호: 156) 및 링커 역방향 프라이머(서열번호: 157)로 증폭하였다. 상기 0.8kb PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 R3 및 R4로 분해한 다음 겔 전기영동(Lifefeng Biotech에서 구입한 작은 단편 젤 추출 키트 사용, Cat# DK402)에 의해 정제 및 회수하여 링커 단편 72pb를 얻었다.
1.7 디스플레이 벡터의 획득
구입한 pComb3x 벡터의 벡터 맵을 도 12에 나타냈고, 항체 Fab 디스플레이에 사용된 변형된 pComb3x-fab 벡터의 벡터 맵을 도 13에 나타내었다.
pComb3x-fab 벡터에서 Fab 유전자의 3'-말단에 있는 SfiI 제한 부위는 넌센스 돌연변이(nonsense mutation)에 의해 제거되었다.
그 후 넌센스 돌연변이 후 벡터의 경쇄 정지 코돈의 하류(downstream)에 제한 엔도뉴클레아제 R2 제한 부위를 추가하고, 넌센스 돌연변이를 통해 중쇄 가변 영역의 시그널 펩타이드 말단에 제한 엔도뉴클레아제 R5 제한 부위를 도입하여 변형된 파지 디스플레이 벡터 DDB-R1R2R5R6을 수득하고, 그 벡터 맵을 도 14에 표시하였다.
1.8 디스플레이 박테리아 라이브러리의 준비
상기 실시예 1.7에서 제조한 디스플레이 벡터 DDB-R1R2R5R6을 제한 엔도뉴클레아제 R7 및 R8로 절단하여 3.6kb의 디스플레이 벡터 단편을 얻었다.
상기 실시예 1.6에서 얻은 경쇄 삽입 단편 LC(0.65kb), 중쇄 삽입 단편 HC(0.35kb), 링커 단편(72bp) 및 파지 디스플레이 벡터 단편(3.6kb)을 1:1:1:1의 분자비율로 혼합하였다. T4 DNA 리가아제로 20°C에서 20시간 이상 결합(ligation)하여 전시용 결찰 생성물(ligation product)을 얻었다.
상기 결찰 생성물을 PCR-Clean-up으로 정제하고, TG1 컴피턴트 박테리아(Lucigen, Cat# 60502-2, 제조사의 지시에 따라 작동)에 옮기고, 항생물질이 없는 2YT 배지에서 37°C에서 250 rpm으로 60분 동안 진탕(shaking)시키면서 배양한 다음, 암피실린 내성 플레이트(Thermo, Cat# 240845)에 도포하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 콜로니를 서열분석을 위해 분류하고, 플레이트에서 성장한 모든 콜로니를 수집하여 나중에 사용하기 위해 보존할 수 있는 파지 디스플레이 박테리아 라이브러리를 얻었다.
1.9 디스플레이 항체 파지 라이브러리의 준비
상기 실시예 1.8에서 제조한 디스플레이 박테리아 라이브러리로부터 적당량의 균액을 취하여 OD600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 2YT 배지(100㎍/ml의 암피실린 및 2% 글루코스 함유)에서 배양하였다. 그런 다음, M13KO7 헬퍼 파지(NEB에서 구입, Cat# N0315S, MOI 약 10-20)를 박테리아 용액에 첨가하고 균일하게 혼합하였다. 혼합 후, 37℃에서 30분간 방치하고, 37℃, 250rpm에서 30분간 진탕하였다. 원심분리 시, M13KO7 헬퍼 파지를 포함하는 배양 배지의 상층액 부분을 제거했다. 박테리아를 박테리아 용액의 원래 부피의 4배인 배양 배지(암피실린 및 카나마이신 함유)에 재현탁하고 30°C 및 250rpm에서 밤새 진탕하였다. 다음날, PEG 침전(precipitation)에 의해 파지를 수집하였다. 파지의 농도를 적정하고, 파지를 나누어 보관함(stored in aliquots)으로써 디스플레이 항체 파지 라이브러리를 얻었다.
실시예 2 디스플레이 벡터의 구성
2.1 샘플 재료의 획득
도 1에 나타낸 디스플레이 벡터를 구성하기 위해 PD-1-표적화 항체 Pembrolizumab 및 pDGB4 벡터를 예시로 선택하였다. Pembrolizumab의 경쇄 염기서열은 서열번호 5, Pembrolizumab의 중쇄 가변영역의 염기서열은 서열번호 6, pDGB4 벡터의 염기서열은 서열번호 7이었다.
2.2 제한 부위의 설계
제한 엔도뉴클레아제 BsmBI 및 SfiI는 2개의 BsmBI 인식 부위의 서열과 2개의 SfiI 인식 부위의 서열을 설계하기 위해 선택되었으며, 여기서, B2의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8에 기재된 바와 같고, B3의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 9에 기재된 바와 같으며, S5의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10에 기재된 바와 같고, S6의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 11에 기재된 바와 같았다.
2.3 신호 펩티드의 선택
천연 항체 유전자를 발현하는 2개의 신호 펩티드: SP1 및 SP2를 선택하였다. 상기 신호 펩타이드의 3'-말단 부분에 적절한 제한 부위를 도입하기 위해 의도하지 않은 돌연변이(unintentional mutation)를 이용하였고, 두 신호 펩티드의 염기서열이 바뀌었지만 시그널 펩타이드의 아미노산 서열은 변하지 않았다. SP1은 디스플레이 VH를 표현했으며, 그 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 12로 표시되고, 그 아미노산 서열은 서열 번호 13으로 표시된다; SP2는 뉴클레오티드 서열 번호 14로 표시되는 디스플레이 LC를 발현하였고, 그 아미노산 서열은 서열번호 15로 표시된다.
2.4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드의 획득
디스플레이 VH, 디스플레이 LC 및 디스플레이 벡터 단편 I 및 디스플레이 벡터 단편 II에 대한 프라이머를 각각 설계하였고, 이들의 발현은 모두 CMV 프로모터에 의해 구동되었다. 합성 프라이머는 실시예 2.1의 서열을 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭되었다. 단편의 서열은 하기 표 4에 나열하였다.
디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드 주형(Template) 정방향 프라이머 역방향 프라이머
디스플레이 LC Pembrolizumab의 경쇄(서열번호 5) P5(서열번호 20) P6(서열번호 21)
디스플레이 VH Pembrolizumab의 중쇄 가변영역(서열번호 6) P7(서열번호 22) P8(서열번호 23)
발현 벡터 단편 I pDGB4(서열번호 7) P3(서열번호 18) P4(서열번호 19)
발현 벡터 단편 II pDGB4(서열번호 7) P1(서열번호 16) P2(서열번호 17)
4개의 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드를 PCR(LA Taq, Takara Co., 회사의 제품 지침에 따라 수행)로 증폭하였고, 사용된 템플릿 및 프라이머 서열은 표 4에 나타내었다. 겔 전기영동("Molecular Cloning: A Laboratory Manual"의 지침에 따라 작동됨)에 의한 정제 및 회수 후에 PCR 생성물을 각각 얻었다. TA 클로닝 방법(TA cloning kit, Takara Co.에서 구입)을 이용하여 PCR 산물을 pUC19 플라스미드 벡터에 삽입하여 저장 결찰 생성물(storage ligation product)을 얻었다. DH5a 컴피턴트 박테리아(Takara Co.)를 저장 벡터 생성물로 형질전환시키고 플레이트 상에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 시퀀싱을 위해 보낸 다음, 원하는 서열을 함유하는 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 전시하는(display) 박테리아가 수득되었으며, 상기 디스플레이 벡터는 디스플레이 VH를 함유하는 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 디스플레이 LC를 함유하는 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 디스플레이 벡터 단편 I을 함유하는 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드 및 디스플레이 벡터 단편 II을 함유하는 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드이었다. 상기 박테리아는 나중에 사용하기 위해 박테리아 라이브러리로 냉동보존될 수 있다.
2.5 분해(Digestion)
상기 실시예 2.4의 박테리아 라이브러리에서 세균의 플라스미드를 각각 플라스미드 추출 키트(Axygen에서 구입)를 이용하여 추출하였다. 그런 다음 플라스미드 벡터를 제한 엔도뉴클레아제 BsmBI 및 SfiI로 분해하고 전기영동으로 분리 및 정제하여 4개의 절단된 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 얻었다.
2.6 결찰에 의한 디스플레이 벡터의 획득
상기 실시예 2.5에서 얻은 4개의 절단된 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오타이드를 동일한 분자 비율로 혼합하고, 여기에 리가아제를 첨가하여 방향적으로 결합하고 고리화하여 발현 벡터를 형성하였다. 상기 발현 벡터를 DH5a 컴피턴트 박테리아(Takara, 제조사의 지시에 따라 작동)에 옮기고, 항생제가 없는 2YT 배지에서 37℃, 250rpm으로 60분간 진탕 배양한 후, 암피실린 내 플레이트(Thermo, Cat#240845)에 도포하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 콜로니를 서열분석을 위해 분류하고 정확한 서열을 포함하는 디스플레이 벡터를 얻었다. 상기 디스플레이 벡터의 구체적인 구조는 도 2에 나타냈다.
실시예 3. VH 성분 벡터 및 LC 성분 벡터의 구축
3.1 VH 성분 벡터
1kb 길이의 인간 IgG1 Fc를 주형으로, 프라이머 DDB214 및 DDB215를 사용하여 PCR을 수행하였다. 겔 전기영동에 의한 정제 및 회수 후, PCR 산물 B2-KB-B3를 얻었으며, 여기서 DDB214의 염기서열은 서열번호 1로 표시되고, DDB215의 염기서열은 서열번호 2로 표시된다. 발현 성분 벡터인 pMD19 벡터에 B2-KB-B3를 삽입하여 VH 성분 벡터 저장 플라스미드를 얻었다. TG1 컴피턴트 박테리아(Lucigen Co.)를 상기 VH 성분 벡터 저장 플라스미드로 형질전환하고 플레이트 상에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 정확한 서열을 함유하는 VH 성분 벡터를 결정하기 위해 콜로니를 분류하여 서열 분석을 수행하였다. 상기 VH 성분 벡터의 구조는 도 3에 나타냈다.
3.2 LC 성분 벡터
1kb 길이의 인간 IgG1 Fc를 주형으로, 프라이머 DDB216 및 DDB217을 사용하여 PCR을 수행하였다. 겔 전기영동에 의한 정제 및 회수 후, PCR 산물 B2-KB-B3를 얻었으며, 여기서 DDB216의 염기서열은 서열번호 3로 표시되고, DDB217의 염기서열은 서열번호 4로 표시된다. 발현 성분 벡터인 pMD19 벡터에 S5-KB-S6를 삽입하여 LC 성분 벡터 저장 플라스미드를 얻었다. TG1 컴피턴트 박테리아(Lucigen Co.)를 상기 LC 성분 벡터 저장 플라스미드로 형질전환하고 플레이트 상에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 정확한 서열을 함유하는 LC 성분 벡터를 결정하기 위해 콜로니를 분류하여 서열 분석을 수행하였다. 상기 LC 성분 벡터의 구조는 도 4에 나타냈다.
실시예 4 항원-특이적 VH 및 항원-특이적 LC의 획득
4.1 1차 스크리닝
상기 실시예 1에서 구축한 파지 라이브러리(Fab 라이브러리, 원래 라이브러리 용량은 4×1010, 유효 클론은 80% 이상, 준비된 파지 라이브러리는 2×1013/ml) 500 ㎕를 취하였다. 바이오틴 표지된(Biotin-labeled) ROR1 항원(Acro Biosystems, Cat# RO1-H82E6)을 파지 라이브러리(항원 농도 10㎍/ml)에 혼합하고, 항원 특이적 Fab를 나타내는 파지가 바이오틴 표지된 항원에 결합하도록 실온에서 2시간 진탕하였다. 다음으로 파지 라이브러리-항원과 80μl의 자성 비드(magnetic beads)를 혼합하여 상온에서 20분간 진탕시킨 후 상기 항원 특이적 파지가 자성 비드(Invitrogen에서 구매)의 표면에서 아비딘(avidin)과 바이오틴(biotin)의 결합에 의해 포획되어 자성 비드-아비딘-바이오틴-항원-Fab 항체 단편 교차-링커(cross-linker)를 형성하였다. 그런 다음, ROR1 항원 특이적 Fab를 운반하는 역할을 하는 상기 형성된 교차-링커를 자성 스탠드(magnetic stand)로 수집하고, ROR1 항원 특이적 Fab를 디스플레이하는 파지를 pH 2.2 글리신(glycine) 용액으로 용출시키고, pH 8.0 Tris 완충액으로 pH 7.0으로 중화시켜, 마지막으로 파지 용액 550μl를 얻었다.
4.2 2차 스크리닝
상기 1차 스크리닝에서 얻은 파지 용액 250㎕를 4% Milk-PBS의 동량과 혼합하여 최종 부피가 0.5ml가 되도록 만들었다. 다음으로, 바이오틴-표지(biotin-labeled)된 항원 4㎍을 파지 용액에 최종 항원 농도가 8㎍/ml가 되도록 혼합하고, 항원 특이적 Fab를 디스플레이하는 파지가 바이오틴-표지된 항원에 결합하도록 실온에서 3시간 동안 진탕하였다. 다음으로 파지 라이브러리-항원과 40μl의 자성 비드(magnetic beads)를 혼합하여 상온에서 20분간 진탕시킨 후 상기 항원 특이적 파지가 자성 비드(Invitrogen에서 구매)의 표면에서 아비딘(avidin)과 바이오틴(biotin)의 결합에 의해 포획되어 자성 비드-아비딘-바이오틴-항원-Fab 항체 단편 교차-링커(cross-linker)를 형성하였다. ROR1 항원-특이적 Fab를 운반하는 상기 형성된 교차-링커를 자기 스탠드를 이용하여 수집하였다. 그 다음, 자성 비드를 1x PBST로 4회 세척한 후, 1xPBS로 4회 세척하였다. 마지막으로, ROR1 항원 특이적 Fab를 나타내는 파지를 pH 2.2 글리신 용액 50㎕로 용출시키고, pH 8.0 Tris 완충액 20㎕로 pH 7.0으로 중화시켜 최종적으로 75㎕의 파지 용액을 얻었다.
4.3 TG1 박테리아의 감염
상기 실시예 4.2의 2차 스크리닝에서 얻은 파지 용액 75μl를 지수적 성장기(logarithmic growth phase)에 있는 TG1 박테리아 500μl와 혼합하고 37℃에서 30분 동안 방치하였다. 그 다음, 감염된 TG1 박테리아 용액을 엠피실린 저항성(Amp-resistant) 플레이트에 도포하고 37℃에서 밤새 배양하였다.
4.4 ELISA에 의한 양성 클론의 스크리닝
상기 플레이트에서 성장한 콜로니를 계수하고, 각 웰에 400㎕의 배양액(2YT+Amp+0.2% glucose)이 들어 있는 96-well deep-well 플레이트 2장에 접종하고, 37℃에서 6시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 각 웰(well)에 최종 농도가 1mM인 IPTG(2YT+Amp+2mM IPTG)가 포함된 배양액 400㎕를 첨가하고, 30℃에서 250rpm으로 진탕하면서 밤새 배양하였다.상기 2개의 96-well ELISA 플레이트를 4°C에서 밤새 100ng/100㎕/well로 바이오틴 표지 없이 ROR1 항원으로 코팅하였다.
항원이 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트를 밤새 세척 및 차단(blocking)한 후, 각 웰에 밤새 배양한 박테리아 용액 100㎕를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 다시 세척하였다; 그리고 2차 항체(HRP-labeled anti-human IgG-Fab antibodies)를 첨가하고 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후 현상액을 가하여 암실에서 30분간 보관하였다. OD600 값은 마이크로플레이트 리더에 의해 판독되었으며, 그 결과는 하기 표 5 및 표 6에 표시하였다.
#1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.365 0.143 1.138 0.080 0.333 0.235 0.714 0.819 0.073 0.101 0.074 0.079
B 0.118 0.673 0.089 0.101 0.076 1.049 0.065 0.402 0.408 0.263 0.065 0.073
C 1.827 0.016 0.102 0.096 0.070 0.070 0.074 0.066 0.168 0.067 0.185 1.480
D 0.119 0.118 0.078 0.185 0.080 0.127 0.072 0.068 0.067 0.079 0.110 0.091
E 0.151 1.598 0.163 1.526 0.102 0.090 0.079 0.065 0.058 0.281 0.083 0.085
F 0.104 0.102 0.107 0.116 0.114 0.093 0.115 2.056 0.063 0.07 0.066 0.196
G 0.095 0.103 0.091 0.161 0.199 0.106 1.637 0.075 0.559 0.069 0.284 0.130
H 0.137 0.131 0.227 0.150 0.516 0.241 0.096 0.090 0.302 0.094 0.103 0.290
#2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.075 0.085 0.076 0.194 0.084 0.080 0.077 0.066 0.080 0.072 0.206 0.079
B 0.068 0.161 0.068 0.945 0.075 0.072 0.074 0.077 0.949 0.070 0.097 0.083
C 0.065 0.062 1.787 0.068 0.068 0.313 0.071 0.087 0.535 0.082 0.080 0.097
D 0.071 0.072 0.068 1.787 0.338 0.070 0.069 0.093 0.110 0.076 0.108 0.126
E 0.372 0.088 0.076 0.068 0.071 0.175 0.275 0.083 0.106 0.156 0.076 0.083
F 0.085 1.101 0.068 0.076 0.080 0.087 0.2228 0.067 0.094 0.093 0.137 0.129
G 0.127 0.127 0.127 0.127 0.127 0.127 0.127 0.127 0.127 0.127 0.083 0.124
H 0.078 1.649 0.517 0.517 0.071 0.067 0.067 0.107 0.267 0.189 0.090 0.132
결과값(reads)이 0.25보다 큰 총 35개의 클론을 서열분석을 위해 보냈다. 시퀀스 분석 결과는 34개의 고유한 VH와 28개의 고유한 LC가 있음을 보여주었다. 경쇄 아미노산 서열의 비교 결과를도 5A에, 중쇄 가변영역 아미노산 서열의 비교 결과를 도 5B에 나타내었다.
실시예 5 VH 성분 라이브러리 및 LC 성분 라이브러리 구축
5.1 항원 특이적 VH 및 항원 특이적 LC의 증폭
제한 엔도뉴클레아제(Esp3I 및 SfiI)에 대한 인식 부위를 포함하는 프라이머를 설계했다. 24개의 정방향 프라이머와 5개의 역방향 프라이머를 포함하여 항원 특이적 VH를 증폭하기 위한 29개의 프라이머; 18개의 정방향 프라이머와 1개의 역방향 프라이머를 포함하는 19개의 항원 특이적 KLC(kappa light chain) 증폭용 프라이머; 및 25개의 정방향 프라이머와 1개의 역방향 프라이머를 포함하는 항원 특이적 LLC(lambda light chain)를 증폭하기 위한 26개의 프라이머를 이용했다. 각 정방향 프라이머 세트의 각 프라이머를 동일한 비율로 혼합하고, VH의 역방향 프라이머도 동일한 비율로 혼합한 다음, 정방향 및 역방향 프라이머를 동일한 비율로 혼합하여 각각 VH, KLC 및 LLC를 증폭하는데 사용하는 3세트의 프라이머를 형성하였다. 예시적으로, KLC를 이용한 구체적 실시 양태에서, 여기서 VH의 정방향 프라이머의 서열은 서열 번호 30-53으로 나타났고, VH의 역방향 프라이머의 서열은 서열 번호 54-58로 나타났으며, KLC의 정방향 프라이머의 서열은 서열 번호는 59-76으로 나타났고, KLC의 정방향 프라이머의 서열은 서열 번호는 77로 나타났다.
상기 실시예 4에서 스크리닝하여 얻은 35개의 양성 클론의 미니 DNA를 동량 혼합하고, 상기 3세트의 프라이머를 이용하여 각각 증폭하였다. PCR에 의해 얻어진 인식 부위를 가지며 정제된, 항원 특이적 VH 및 항원 특이적 LC를 전기영동으로 분석하였다(KLC의 실시 양태에서).
5.2 소화 및 결찰
상기 실시예 5.1에서 얻은 항원 특이적 VH를 Esp3I로 분해하고, 분해 후 정제된 상기 항원 특이적 VH를 전기영동으로 분석하였다. 상기 실시예 3.1에서 얻은 VH 성분 벡터를 Esp3I로 분해하고, 분해 후 정제된 2.8kb의 성분 벡터 단편을 전기영동으로 분석하였다. 상기 정제된 항원 특이적 VH와 2.8kb의 성분 벡터 단편을 결합(ligate)하여 ROR1 특이적 VH 성분 라이브러리를 얻었다.
상기 실시예 5.1에서 얻은 항원 특이적 LC를 SfiI로 분해하고, 분해 후 정제된 상기 항원 특이적 LC를 전기영동으로 분석하였다. 상기 실시예 3.2에서 얻은 LC 성분 벡터를 SfiI로 절단하고, 절단 후 정제된 2.8kb의 성분 벡터 단편을 전기영동으로 분석하였다. 상기 정제된 항원 특이적 LC와 2.8kb의 성분 벡터 단편을 결합(ligate)하여 ROR1 특이적 LC 성분 라이브러리를 얻었다.
실시예 6 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리의 구축
VH 성분 라이브러리를 Esp3I로 분해하고, 분해 후 점착성 말단을 갖는 정제된 0.35kb의 항원 특이적 VH(즉, 방출된 첫 번째 폴리뉴클레오티드)를 전기영동으로 분석하였다. KLC 성분 라이브러리를 SfiI로 분해하고, 분해 후 점착성 말단을 갖는 정제된 0.65kb의 항원 특이적 LC(즉, 방출된 두 번째 폴리뉴클레오티드)를 전기영동으로 분석했다. 상기 실시예 1에서 얻은 디스플레이 벡터를 Esp3I 및 SfiI로 이중 분해하고 정제하여 점착성 말단을 갖는 3kb의 디스플레이 벡터 단편 I(즉, 방출된 세 번째 폴리뉴클레오티드) 및 5kb의 점착성 말단을 갖는 디스플레이 벡터 단편 II(즉, 방출된 네 번째 폴리뉴클레오티드)를 수득하였다. 상기 4개의 절단된 단편을 동일한 분자 비율로 혼합하고, 총 25ng 단편을 함유하는 10㎕의 결찰 시스템(ligation system)에서 20℃에서 4시간 동안 결찰(ligation)하여 항원 특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 벡터를 얻었다.
결찰(ligation) 생성물을 PCR Cleanup kit로 정제하고 10μl ddH2O로 용출하여 수집하였다. 정제된 상기 결찰 생성물 4㎕를 전기천공(Takara DH5a, 전기천공 컴피턴트 박테리아(electroporated competent bacteria))을 위해 취하고, 플레이트에 도말 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 계수하고 라이브러리 용량이 2.3×105에 도달했을 때 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리를 얻었다. 모든 콜로니를 수집하고, 이로부터 벡터 DNA를 추출하여 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리를 수득하였다.
실시예 7 모노클로날 항체의 스크리닝
상기 실시예 6에서 얻은 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리로부터 ROR1 특이적 결합 폴리펩타이드 발현 벡터 DNA를 얻었고, 40㎍의 DNA를 FCHO 세포로 형질전환시켰다. 형질전환 60시간 후, 세포 표면에서 전장(full-length) 항체을 발현시키고 상기 항체의 ROR1 항원 특이성을 FACS로 분석하였다. 도 6의 결과는 세포 표면에 ROR1 전장 항체가 발현되었고, 발현된 항체는 FITC 표지된 ROR1(FITC 표지 키트로 표지하여 획득)에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여주었다. 바이오틴 표지가 없는 ROR1 항원은 Acro Biosystems(Cat# RO1-H5250-1 mg)에서 가져왔다. 도 6은 PE-표지된 마우스 항-인간 카파 경쇄 항체(anti-human Kappa light chain antibody) 및 FITC-표지된 ROR1 항원으로 이중 염색된 세포 및 FACS에 의해 분석된 세포 표면의 형광 신호를 나타내며, 여기서 A는 음성 대조군을 나타내고; B는 ROR1 특이적 항체를 발현하는 세포 라이브러리를 나타낸다.
안정적으로 형질전환된 FCHO 세포 라이브러리를 압력 하에 하이그로마이신(하이그로마이신(hygromycin) 농도 500㎍/ml)으로 스크리닝하였다. 하이그로마이신과 가압 배양한 지 10일 후에 안정적으로 형질전환된 세포 라이브러리를 얻었다. 상기 세포 라이브러리를 PE 표지된 마우스 항-인간 카파 경쇄 항체(PE-labeled mouse anti-human kappa light chain antibody)(BD) 및 FITC 표지된 ROR1 항원으로 이중 염색하고, PE 및 FITC 이중 양성 세포를 FACS로 분류하였다. 단일 세포 클론을 96-well 플레이트에 웰당 하나의 세포로 첨가하고, 압력 하에서 하이그로마이신과 함께 배양하였다. 하이그로마이신과 가압 배양한 지 14일 후, 안정적으로 형질전환된 단세포 클론 92개를 얻었다. 세포를 0.5mM의 EDTA-PBS 완충액으로 소화시켰다. 상기 92개의 단일 세포 클론을 PE-표지된 마우스 항-인간 카파 경쇄 항체 및 FITC-표지된 ROR1 항원(항원 농도는 0.15ng/50㎕)으로 이중 염색하였다.
FACS 분석을 통해 71개의 PE 및 FITC 형광 이중양성 세포 클론을 얻었고, 양성률은 77%(71/92=77%)였다.
실시예 8 양성 클론 서열의 획득
FACS 분석 차트에서 양성 세포 집단의 위치에 따라 항체 유전자의 PCR 증폭을 위해 서로 다른 위치(다른 친화도를 나타냄)에 위치한 총 30개의 세포 클론이 선택되었다. 상기 양성 클론의 세포를 각각 원심분리에 의해 수집하고, 상층액을 버린 후 시약 지침에 따라 20 μl의 세포 게놈 추출 용액(Quick Extraction Buffer, Lucigen)을 사용하여 세포 게놈 DNA를 추출하였다. 각 클론에서 2㎕의 세포 게놈 DNA 추출물을 취하여 각 클론의 VH 및 LC를 PCR로 증폭하였다. VH 단편을 증폭하기 위한 단편은 TGGGCTCTGCTCCTCCTGACC(서열번호: 24), VH 단편을 증폭하기 위한 역방향 프라이머는 AGTTCCACGACACCGTCACCGGTTC(서열번호 25), LC 단편을 증폭하기 위한 정방향 프라이머는 GGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGG(서열번호: 26), LC 단편을 증폭하기 위한 정방향 프라이머는 TAAATTCCTCGGCCGTGCAGGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCT(서열번호 27)였다.
PCR로 증폭된 상기 VH 및 LC 단편을 전기영동으로 분리 및 정제하였다. 정제된 VH 및 LC 단편을 시퀀싱으로 분석하여 14개의 고유한 VH 및 13개의 고유한 LC를 결정했으며, 이를 결합하여 고유한 서열을 갖는 17개의 양성 클론을 얻을 수 있다(경쇄 및 중쇄의 6개 CDR은 하나 이상의 아미노산이 다름). 예를 들어, 한 쌍의 VH 및 LC의 고유한 서열이 여기에 나열되었으며, 여기서 고유한 서열의 VH 아미노산 서열은 서열 번호 28에 제시된 바와 같았고, 고유 서열의 카파 LC 아미노산 서열은 서열 번호 29에 기재된 바와 같았다.
실시예 9 항체 친화도(affinity) 분석
상기 실시예 8에서 얻은 고유한 서열을 갖는 양성 VH 단편은 Esp3I로 절단하고, 상기 실시예 8에서 얻은 고유한 서열을 갖는 양성 LC 단편은 SfiI로 절단하였다. 분해된 VH 및 LC 단편을 PCR cleanup으로 정제했다. 상기 VH 단편과 LC 단편을 각각 용해성 중쇄 발현 벡터에 삽입하고, 콜로니를 시퀀싱하여 결정하였다. 시퀀싱에 의해 결정된 상기 VH 및 LC 발현 벡터의 DNA를 추출하였다.
293개의 EXP 세포를 현탁 배양하여 증폭하였고, 총 17개의 항체 경쇄 및 중쇄 발현 벡터 쌍이 실시예 8에서 결정된 경쇄 및 중쇄 쌍(pairing)에 따라 형성되었다. 각 쌍을 경쇄 발현 벡터 18㎍과 중쇄 발현 벡터 12㎍의 비율로 혼합하고, 현탁된 293EXP 세포 30ml를 형질전환하는데 사용하였다(1.2×106/ml). 형질전환 6일째에 배양 상층액을 채취하고 제품 설명서에 따라 GenScript의 자성 비드(Cat # L00695)로 항체를 정제하고, PBS-항체 용액에 투석하여 평형화하고 -80℃에서 보관하였다. SDS-PAGE 변성 겔 전기영동(denaturing gel electrophoresis)을 이용하여 분석한 결과, 항체 순도가 90% 이상에 도달한 것으로 나타났다. 항원에 대한 정제된 항체의 결합 친화도를 ELISA에 의해 분석한 후, 예시로써 8개의 예시적인 항체의 EC50을 여기에 나열하였고, 결과는 하기 표 7에 나타냈다.
항체 번호 EC50 (μg/ml) 항체 번호 EC50 (μg/ml)
1 0.531 103 0.177
11 0.161 115 0.225
32 0.207 140 0.159
101 0.102 162 0.229
실시예 10 항원-특이적 폴리펩티드의 신속 스크리닝(Rapid screening)
상기 실시예 4의 파지 라이브러리로부터 스크리닝하여 얻은 양성 클론의 ELISA 데이터에 따라, 상기 표 5 및 표 6에서 ELISA 판독값이 0.8보다 큰 15개의 클론을 선택하였다. 동량의 세균액과 혼합한 후, 벡터 DNA를 미니 추출(mini-extracted)하였다. 상기 실시예 5의 절차에 따라 15개 클론의 항원-특이적 VH 및 항원-특이적 LC를 각각 PCR에 의해 증폭하고, 효소 분해(digestion)에 의해 정제하였다. 상기 실시예 6의 절차에 따라, 항원-특이적 결합 폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리를 구축하였다. 그런 다음 48개의 콜로니를 무작위로 분류하여 서열분석을 위해 보냈다. 시퀀싱 결과를 분석한 후, 정확한 VH 및 LC를 갖는 36개의 클론을 분류하고, 이로부터 벡터 DNA를 미니 추출(mini-extracted)하고 CHO 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 60시간 후, 세포를 0.5mM의 EDTA-PBS 완충액으로 소화시켰다. 36개의 세포 집단을 PE-표지된 마우스 항-인간 카파 경쇄 항체 및 FITC-표지된 ROR1 항원(항원 농도는 0.15ng/50㎕)으로 이중 염색하였다. FACS 분석 결과를 도 8에 나타냈다. 6개의 PE 및 FITC 이중 양성 세포 클론을 얻었고 양성률은 17%(6/36)였다. 도 8은 PE-표지된 마우스 항-인간 카파 경쇄 항체 및 FITC-표지된 ROR1 항원으로 이중염색된 세포 및 FACS에 의해 분석된 세포 표면의 형광 신호를 나타낸다. A는 음성 대조군을 나타내고; B는 비-ROR1 특이적 항체를 발현하는 세포 클론을 나타내며; C-H는 ROR1 특이적 항체를 발현하는 6개의 예시적인 양성 세포 클론을 나타낸다.

Claims (66)

  1. 다음 단계를 포함하는 항원-특이적 결합 폴리펩티드(antigen-specific binding polypeptide) 유전자 디스플레이 벡터의 구축방법:
    a) 5'에서 3' 방향으로 B2-디스플레이 VH-B3을 포함하는 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    b) 5'에서 3' 방향으로 S5-디스플레이 LC-S6을 포함하는 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    c) 5'에서 3' 방향으로 B3-디스플레이 벡터 단편 I-S5를 포함하는 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    d) 5'에서 3' 방향으로 S6-디스플레이 벡터 단편 II-B2를 포함하는 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    e) 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드 및 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 각각 B2, B3, S5 및 S6를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클라아제(restriction endonuclease)로 특이적으로 절단하여 절단된(cleaved) 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 절단된 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 절단된 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드 및 절단된 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및
    f) 상기 절단된 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 절단된 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 절단된 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드 및 절단된 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 혼합하여 이들이 방향적으로 결합되고 고리화되어 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 형성할 수 있도록 하는 단계;
    상기 디스플레이 VH는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역을 코딩하고, 상기 디스플레이 LC는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 경쇄를 코딩하며,
    상기 B2, B3, S5 및 S6은 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 B2를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B2의 특이적 절단으로부터 생성된 말단은 상응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B3, S5 및 S6 중 어느 하나의 특이적 절단으로부터 생성된 말단을 인식하지 않거나 상호 간 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 B3를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B3의 특이적 절단으로부터 생성된 말단이 상응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B2, S5 및 S6 중 어느 하나의 특이적 절단으로부터 생성된 말단을 인식하지 않거나 상호 간 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S5를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 S5의 특이적 절단으로부터 생성된 말단은 상응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B2, B3 및 S6 중 어느 하나의 특이적 절단으로부터 생성된 말단을 인식하지 않거나 상호 간 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S6를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 S6의 특이적 절단으로부터 생성된 말단은 상응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 B2, B3 및 S5 중 어느 하나의 특이적 절단으로부터 생성된 말단을 인식하지 않거나 상호 간 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI, Esp3I 및 BsmBI로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B2 및 B3이 상기 BsmBI 또는 Esp3I에 의해 특이적으로 인식되고 절단될 수 있는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S5 및 S6은 상기 Sfil에 의해 특이적으로 인식되고 절단될 수 있는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B2는 서열번호 8로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B3은 서열번호 9로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S5는 서열번호 10으로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S6은 서열번호 11로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제1 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 구축방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 디스플레이 성분 벡터에 삽입하여 디스플레이 VH 저장 결찰 생성물(storage ligation product)을 형성하고, 상기 디스플레이 VH 저장 결찰 생성물을 제1 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리(display VH component bacterial library)를 수득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제2 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 구축방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 디스플레이 성분 벡터에 삽입하여 디스플레이 LC 저장 결찰 생성물을 형성하고, 상기 디스플레이 LC 저장 결찰 생성물을 제2 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제3 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 구축방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 디스플레이 성분 벡터에 삽입하여 디스플레이 벡터 단편 I 저장 결찰 생성물을 형성하고, 상기 저장 결찰 생성물을 제3 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 제4 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 구축방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 디스플레이 성분 벡터에 삽입하여 디스플레이 벡터 단편 II 저장 결찰 생성물을 형성하고, 상기 저장 결찰 생성물을 제4 디스플레이 박테리아에 도입하여 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 벡터 성분 벡터는 pUC 벡터로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 구축방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 pUC 벡터는 pUC19 벡터 또는 pUC19 벡터로부터 유래된 벡터인 것임을 특징으로 하는 구축방법.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리로부터 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 함유하는 디스플레이 VH 성분 플라스미드를 획득하고, 상기 디스플레이 VH 성분 플라스미드로부터 절단된 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 추가로 포함하는 구축방법.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B2 및 B3를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 상기 디스플레이 VH 성분 플라스미드를 분해하여 절단된 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리로부터 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 함유하는 디스플레이 LC 성분 플라스미드를 획득하고, 상기 디스플레이 LC 성분 플라스미드로부터 절단된 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 추가로 포함하는 구축방법.
  26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S5 및 S6를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 상기 디스플레이 LC 성분 플라스미드를 분해하여 절단된 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리로부터 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 포함하는 디스플레이 단편 성분 플라스미드 I을 획득하고, 상기 디스플레이 단편 성분 플라스미드 I로부터 절단된 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 추가로 포함하는 구축방법.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B3 및 S5를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 상기 디스플레이 단편 성분 플라스미드 I을 분해하여 절단된 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리로부터 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 포함하는 디스플레이 단편 성분 플라스미드 II를 획득하고, 상기 디스플레이 단편 성분 플라스미드 II로부터 절단된 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 추가로 포함하는 구축방법.
  30. 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S6 및 B2를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 상기 디스플레이 단편 성분 플라스미드 II를 분해하여 절단된 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 구축방법:
    a) 5'에서 3' 방향으로 B-항원-특이적 VH-B를 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    b) 5'에서 3' 방향으로 B3-VH 성분 벡터 결찰 단편-B2를 포함하는 제6 폴리뉴클레오티드를 포함하는 VH 성분 벡터를 제공하는 단계;
    c) 상기 제5 폴리뉴클레오티드 및 VH 성분 벡터를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 절단된(cleaved) 제5 폴리뉴클레오티드 및 방출된(released) 제6 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및
    d) 상기 절단된 제5 폴리뉴클레오티드 및 방출된 제6 폴리뉴클레오티드를 혼합하여 이들이 방향적으로 결합되고 고리화되어 항원-특이적 VH 성분 라이브러리를 형성할 수 있도록 하는 단계;
    여기서 항원-특이적 VH는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역을 코딩하고, B는 B2 및/또는 B3을 특이적으로 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위임.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 구축방법:
    a) 5'에서 3' 방향으로 S-항원-특이적 LC-S를 포함하는 제7 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    b) 5'에서 3' 방향으로 S6-LC 성분 벡터 결찰 단편-S5를 포함하는 제8 폴리뉴클레오티드를 포함하는 LC 성분 벡터를 제공하는 단계;
    c) 상기 제7 폴리뉴클레오티드 및 LC 성분 벡터를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 절단된 제7 폴리뉴클레오티드 및 방출된 제8 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및
    d) 절단된 제7 폴리뉴클레오티드 및 방출된 제8 폴리뉴클레오티드를 혼합하여 이들이 방향적으로 결합되고 및 고리화되어 항원-특이적 LC 성분 라이브러리를 형성할 수 있도록 하는 단계;
    여기서 항원-특이적 LC는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 경쇄를 코딩하고, S는 S5 및/또는 S5를 특이적으로 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위임.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 구축방법:
    a) 5'에서 3' 방향으로 B2-VH 성분 벡터 도구 단편-B3을 포함하는 제9 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 및
    b) 상기 제9 폴리뉴클레오티드를 발현 성분 벡터에 삽입하여 VH 성분 벡터를 수득하는 단계.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 구축방법:
    a) 5'에서 3' 방향으로 S5-LC 성분 벡터 도구 단편-S6을 포함하는 제10 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 및
    b) 상기 제10 폴리뉴클레오티드를 발현 성분 벡터에 삽입하여 LC 성분 벡터를 얻는 단계.
  35. 제33항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 성분 벡터는 pMD 벡터로부터 유래된 것을 특징으로 하는 구축방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 pMD 벡터는 pMD19 벡터이거나 pMD19 벡터로부터 유래된 벡터인 것을 특징으로 하는 구축방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 구축방법:
    a) VH 성분 벡터를 제9 박테리아에 도입하여 VH 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계;
    b) VH 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리로부터 VH 성분 벡터 저장 플라스미드를 획득하는 단계; 및
    c) VH 성분 벡터 저장 플라스미드로부터 방출된 제6 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계.
  38. 제37항에 있어서, 상기 VH 성분 벡터 저장 플라스미드를 B2 및 B3를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 방출된 제6 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계들을 포함하는 구축방법:
    a) 상기 LC 성분 벡터를 10번째 박테리아에 도입하여 LC 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계;
    b) 상기 LC 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리로부터 LC 성분 벡터 저장 플라스미드를 획득하는 단계; 및
    c) 상기 LC 성분 벡터 저장 플라스미드로부터 방출된 제8 폴리뉴클레오티드를 획득하는 단계.
  40. 제39항에 있어서, 상기 LC 성분 벡터 저장 플라스미드를 S5 및 S6을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여, 방출된 제8 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 구축방법:
    a) 5'에서 3' 방향으로 B2-항원 특이적 VH-B3을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항원 특이적 VH 성분 라이브러리를 제공하는 단계;
    b) 5'에서 3' 방향으로 S5-항원-특이적 LC-S6을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항원-특이적 LC 성분 라이브러리를 제공하는 단계;
    c) 5'에서 3' 방향으로 B3-디스플레이 벡터 단편 I-S5를 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 5'에서 3' 방향으로 S6-디스플레이 벡터 단편 II-B2를 포함하는; 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 디스플레이 벡터를 제공하는 단계;
    d) 상기 항원-특이적 VH 성분 라이브러리, 항원-특이적 LC 성분 라이브러리 및 디스플레이 벡터를 각각 B2, B3, S5 및 S6을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클라아제로 특이적으로 절단하여 방출된 제1 폴리뉴클레오티드, 방출된 제2 폴리뉴클레오티드, 방출된 제3 폴리뉴클레오티드 및 방출된 제4 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및
    e) 상기 방출된 제1 폴리뉴클레오티드, 방출된 제2 폴리뉴클레오티드, 방출된 제3 폴리뉴클레오티드 및 방출된 제4 폴리뉴클레오티드를 혼합하여 이들이 방향적으로 결합되고 고리화되어 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 형성할 수 있도록 하는 단계;
    여기서, 상기 항원-특이적 LC는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 경쇄를 코딩하고, 상기 항원-특이적 VH는 항원-특이적 결합 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역을 코딩하며, 상기 B2, B3, S5 및 S6은 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위임.
  42. 제41항에 있어서, 상기 항원-특이적 VH 성분 라이브러리를 B2 및 B3을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여, 방출된 제1 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 항원-특이적 LC 성분 라이브러리를 S5 및 S6을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 방출된 제2 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 벡터를 B3를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제 및 S5를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 방출된 제3 폴리뉴클레오티드를 얻는 단계를 포함하는 구축방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 벡터를 S6을 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제 및 B2를 특이적으로 인식하는 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 방출된 제4 폴리뉴클레오티드를 얻는 단계를 포함하는 구축방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제5 폴리뉴클레오티드, 제7 폴리뉴클레오티드, 제9 폴리뉴클레오티드, 제10 폴리뉴클레오티드, 제1 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 제2 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드, 제3 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드 및/또는 제4 디스플레이 벡터 폴리뉴클레오티드는 샘플 물질로부터 수득되는 것임을 특징으로 하는 구축방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 샘플 물질은 특이적 항원을 표적화하는 항체 또는 그 항원 결합 단편 및/또는 IgG를 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 ROR1, PD-1 및/또는 PD-L1을 표적화하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  49. 제47항에 있어서, IgG는 인간 IgG인 것을 특징으로 하는 구축방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 인간 IgG는 인간 IgG1 또는 인간 IgG2인 것을 특징으로 하는 구축방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방향적 결합은 리가아제를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 리가아제는 T4 DNA 리가아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 세포 내로 도입하고, 세포로부터 항원-특이적 결합 폴리펩티드를 획득하는 단계를 포함하는 구축방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 구축방법:
    a) 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 제1 박테리아에 도입하여 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리를 수득하는 단계;
    b) 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리로부터 항원-특이적 결합 폴리펩티드 디스플레이 유전자 라이브러리를 획득하는 단계;
    c) 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 디스플레이 유전자 라이브러리로부터 항원-특이적 결합 폴리펩티드 발현 벡터 DNA를 획득하는 단계;
    d) 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 발현 벡터 DNA를 세포 내로 도입하는 단계; 및
    e) 상기 세포로부터 항원-특이적 결합 폴리펩티드를 획득하는 단계.
  55. 제54항에 있어서, 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리, VH 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리, LC 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리, 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리, 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리, 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리 및 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리를 동결 보존하는 단계를 포함하는 구축방법.
  56. 제54항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리는 10개 이상의 상이한 클론을 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LC 성분 벡터 저장 박테리아 라이브러리는 10개 이상의 상이한 클론을 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 VH 성분 박테리아 라이브러리는 10개 이상의 상이한 클론을 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 LC 성분 박테리아 라이브러리는 10개 이상의 상이한 클론을 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 벡터 성분 I 박테리아 라이브러리는 10개 이상의 동일한 클론을 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 벡터 성분 II 박테리아 라이브러리가 10개 이상의 동일한 클론을 포함하는 것을 특징으로 하는 구축방법.
  62. 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리의 유효 클론(effective clones) 비율이 약 10% 이상인 것을 특징으로 하는 구축방법.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 구축방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터를 이용하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 결합 폴리펩티드 또는 그 단편의 스크리닝 방법.
  65. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 벡터.
  66. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 항원-특이적 결합 폴리펩티드 유전자 디스플레이 박테리아 라이브러리.
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