KR20220163979A - 높은 수준의 오메가-3 지방산을 갖는 미생물 오일 - Google Patents

높은 수준의 오메가-3 지방산을 갖는 미생물 오일 Download PDF

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지용 선
로베르토 이 아멘타
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Abstract

본원에서는 미생물 오일, 및 높은 수준의 오메가-3 지방산을 갖는 미생물 오일의 제조 및 사용 방법이 제공된다. 구체적으로, 적어도 85%의 총 지방산을 포함하는 미생물 오일이 제공되고, 여기서 총 지방산은 적어도 50%의 DHA를 포함한다. 또한, 지방산 합성 억제제를 포함하는 배양 배지에서 오일 생성 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 적어도 500 mg/g의 오일을 포함하는 바이오매스의 제조 방법이 제공된다.

Description

높은 수준의 오메가-3 지방산을 갖는 미생물 오일
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 4월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 63/005,054에 대한 우선권을 주장하며, 이 가출원은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
배경
미생물로부터의 오일은 두 가지 병렬 지방산 합성 경로의 결과로 생성된다: 고전적 지방산 합성(FAS) 경로 및 다중불포화 지방산(PUFA) 생성효소 경로. 미리스트산(C14:0) 및 팔미트산(C16:0) 같은 중쇄 지방산은 일반적으로 FAS 경로로부터 생성되고, 도코사헥사엔산(DHA, C22:6 n-3) 및 도코사펜타엔산(DPA, C22:5 n-6) 같은 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)은 일반적으로 PUFA 생성효소 경로로부터 생성된다. 그러나, 결과적으로 얻은 지방산 프로파일(profile)은 이들 병렬 경로의 상대적 활성에 의존해서 미생물 전체에 걸쳐서 크게 다르다.
간단한 요약
본원에서는 미생물 오일, 및 높은 수준의 오메가-3 지방산을 갖는 미생물 오일의 제조 및 사용 방법이 제공된다. 구체적으로, 중량 기준으로 적어도 85%의 총 지방산을 포함하고, 여기서 총 지방산이 중량 기준으로 적어도 50%의 DHA를 포함하는 것인 미생물 오일이 제공된다. 또한, 지방산 합성 억제제를 포함하는 배양 배지에서 오일 생성 미생물(예를 들어, 오란티오키트리움(Aurantiochytrium))을 배양하는 단계를 포함하는 적어도 500 mg/g의 오일을 포함하는 바이오매스의 제조 방법이 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 20℃에서 상이한 초기 지방산 합성 억제제 투여 시점을 이용하여 오란티오키트리움 종(G3)의 지방산 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 2는 20℃에서 다양한 농도의 지방산 합성 억제제에서 오란티오키트리움 종(G3)의 지방산 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 3은 20℃에서 다양한 지방산 합성 억제제 투여 전략에서 오란티오키트리움 종(G3)의 지방산 프로파일을 나타내는 그래프이다. 3x 및 6x를 지시하는 처리는 접종 후 24 시간에서 시작하여 등간격의 시간 간격으로 지방산 합성 억제제를 여러 번 첨가하는 것이다. 3X 실험의 경우에는 간격이 24 시간마다였다. 6X 실험의 경우에는 간격이 12 시간마다였다.
도 4는 20℃에서 다양한 지방산 합성 억제제 투여 전략에서 오란티오키트리움 종(G3)에서 최종 생성물(DHA, 총 지방산(TFA), 및 포화 지방산(SFA)) 농도를 나타내는 그래프이다. 3x 및 6x를 지시하는 처리는 접종 후 24 시간에서 시작하여 등간격의 시간 간격으로(12 시간마다) 지방산 합성 억제제를 여러 번 첨가하는 것이다.
도 5는 20℃에서 다양한 지방산 합성 억제제 투여 전략에서 오란티오키트리움 종(G3)에서 소비된 글루코스의 단위 당 생성물(SFA 및 DHA)의 수율을 나타내는 그래프이다. 3x 및 6x를 지시하는 처리는 접종 후 24 시간에서 시작하여 등간격의 시간 간격으로(12 시간마다) 지방산 합성 억제제를 여러 번 첨가하는 것이다.
도 6은 플라스크 규모에서 25℃ 및 20℃ 배양 조건으로부터의 오란티오키트리움 종 (G3)의 지방산 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 7은 오란티오키트리움 종 (G3)의 지방산 프로파일을 나타내는 그래프이다. 대조군은 플라스크에서 25℃에서 화학적 억제제 없이 배양되었다. 전체-길이 발효 실행은 30L 발효기에서 언급된 온도에서 유가 발효였고, 지방산 합성 억제제 처리는 플라스크 규모에서 12μM 총 세룰레닌의 펄스형 첨가로 20℃에서 배양되었다.
상세한 설명
장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA) 계열의 도코사헥사엔산(DHA, C22:6 n-3) 및 에이코사펜타엔산(EPA, C20:5 n-3)을 포함한 오메가-3 지방산은 인간 및 비인간 포유동물의 필수 지방산이다. 미생물 오일에 요구되는 오메가-3 지방산의 양은 응용에 기초하여 다르다. 예를 들어, 식이 보충제 및 의약품은 대표적으로 오일 단위 당 더 높은 농도의 오메가-3 지방산을 선호한다. 그러한 농도를 달성하기 위해, 오메가-3 지방산은 대표적으로 에스테르교환 및 분자 증류에 의해 농축된다(Bonilla-Mendez and Hoyos-Concha, Corpoica Cienc Tecnol Agropecuaria, Mosquera (Colombia), 19(3):645-668(2018)). 그러나, 최종 농축 생성물은 대표적으로 지질이 미생물에 의해 합성될 때의 천연 화학 구조인 트리글리세리드(TG) 형태가 아닌 에틸-에스테르(EE) 화학적 형태이다. EE 형태는 그의 후각 특성을 손상시킬 수 있는 추가 가공을 요구할 뿐만 아니라, 오메가-3의 EE 형태는 원래 TG 형태보다 인체에서 생체 이용률이 낮다는 것이 밝혀졌다.
오메가-3 함량을 증가시키는 흔한 전략은 높은 오메가-3 미생물 균주 선택, 고전적 돌연변이유발 및 유전자 변형을 포함한다(Lian 등, Appl Biochem Biotechnol, 162:935-941 (2010)). 대안적으로, 다양한 메커니즘 하에서 지방산 합성 대사에 영향을 미칠 가능성이 있는 화학물질을 상이한 미생물에서 시험하였다. 그러나, 그러한 원리를 적용하여 DPA 및 포화 지방산을 포함하는 다른 지방산 성분의 임의의 바람직하지 않은 변화를 피하거나 또는 최소화하면서 DHA 함량의 상업적으로 의미있는 증가를 달성하는 효율적이고 효과적인 방법은 없다.
본원에서는 DHA가 지방산 프로파일의 대략 50-70%를 차지하는 높은 수준의 오메가-3 지방산을 함유하는 오일이 기재된다. 또한 지방산 합성 억제제를 사용하여 PUFA 생성효소 경로로부터의 고가치(high-value) PUFA 생성물에 유리하게 FAS 경로의 덜 바람직한 생성물을 억제하는 방법이 기재된다. 제공된 오일은 미생물의 생산성을 희생시키지 않으면서 고농도의 DHA를 함유한다. 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 지방산 생성효소 다중효소 복합체를 억제하는 억제제를 사용하는 방법이 기재된다. 실시예는 DHA 함량의 실질적 증가(대조군과 비교할 때 최대 83.3% 초과) 및 지방산 합성 억제제의 펄스형 첨가로 훨씬 더 많은 증가를 나타내는 G3의 지방산 프로파일을 예시한다. 오일에서 거의 70%의 TG 형태 DHA의 결과는 보고된 DHA 농도를 초과한다.
트라우스토키트리드(Thraustochytrid)를 포함한 미생물은 다양한 형태 및 양의 지방산을 포함하여 다양한 지질을 함유하는 오일을 생성한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 지질이라는 용어는 인지질, 유리 지방산, 지방산 에스테르, 트리아실글리세롤, 스테롤 및 스테롤 에스테르, 카로티노이드, 크산토필 (예를 들어, 옥시카로티노이드), 탄화수소, 및 관련 분야의 통상의 기술을 가진 자에게 알려진 다른 지질을 포함한다. 지방산은 카르복실기로 끝나는 탄화수소 사슬이고, 그것이 적어도 1 개의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 경우에는 불포화라고 부르고, 그것이 다수의 탄소-탄소 이중 결합을 함유할 때는 다중불포화라고 부른다. 예를 들어, 미생물은 (i) 6개 미만의 탄소를 갖는 지방족 꼬리를 가진 지방산(예를 들어 부티르산)인 단쇄 지방산(SCFA); (ii) 6-12개 탄소를 갖는 지방족 꼬리를 가진 지방산인 중쇄 지방산(MCFA); (iii) 13개 초과의 탄소를 갖는 지방족 꼬리를 가진 지방산인 장쇄 지방산(LCFA)을 생성할 수 있다. 다양한 미생물이 다양한 유형 및 양의 이들 지방산을 생성한다. 본원에서는 FAS 경로에 의해 생성되는 중쇄 지방산으로부터 PUFA 생성효소 경로에 의해 생성되는 장쇄 지방산으로 이들 지방산의 생성을 이동시키는 미생물 및 방법이 제공된다. 지방산 합성(FAS)은 지방산 생성효소라고 부르는 효소의 작용을 통해 아세틸-CoA 및 NADPH로부터 지방산을 생성하는 것으로 정의된다. PUFA 생성효소 경로는 큰 다중-도메인 다중-소단위체(multi-subunit) 효소에 의해 말로닐-CoA로부터 다중불포화 지방산을 새롭게 합성하는 것을 가능하게 한다. FAS 경로의 주요 최종 생성물은 팔미테이트이고, 한편 PUFA 생성효소의 주요 최종 생성물은 PUFA 예컨대 DHA 및 DPA이다.
따라서, 본원에서는 미생물 오일 및 미생물 오일의 제조 및 사용 방법이 제공된다. 오일은 모노글리세리드, 디글리세리드 및 트리글리세리드 형태의 지방산,뿐만 아니라 유리 지방산 및 인지질을 포함한다. 임의적으로, 미생물 오일은 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)의 트리글리세리드를 포함한다. 임의적으로, 미생물 오일은 적어도 95%의 트리글리세리드를 포함한다.
오일은 또한 중량 기준으로 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)의 총 지방산(TFA)을 함유한다. 임의적으로, 오일은 중량 기준으로 85% 내지 99%의 총 지방산을 함유한다. 임의적으로, 미생물 오일은 중량 기준으로 85% 내지 95%의 총 지방산을 포함한다. 임의적으로, 미생물 오일은 중량 기준으로 적어도 90%의 총 지방산을 포함한다.
오일 또는 총 지방산에 대한 백분율은 전부 중량 퍼센트로 나열된다. 예를 들어, 미생물 오일이 적어도 90%의 총 지방산을 포함할 때, 오일은 중량 기준으로 오일의 적어도 90%의 총 지방산을 함유한다. 또한, 총 지방산은 특정 지방산들을 함유하고, 특정 지방산의 백분율은 전부 총 지방산의 중량 %로 표현된다. 예를 들어, 오일 중의 총 지방산이 DHA를 함유할 때, DHA의 양은 총 지방산의 중량 %로 표현된다. 예를 들어, 총 지방산은 중량 기준으로 적어도 50%의 DHA를 포함한다.
기재된 바와 같이, 제공된 오일의 총 지방산은 DHA를 함유한다. 임의적으로, 총 지방산은 적어도 35%, 적어도 40%, 또는 적어도 45%의 DHA를 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 적어도 50%의 DHA를 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 적어도 60%의 DHA를 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 50% 내지 70%의 DHA를 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 60% 내지 70%의 DHA를 포함한다.
임의적으로, 오일은 또한 6% 내지 18%의 DPA를 함유한다. 임의적으로, 오일은 10% 내지 18%의 DPA를 함유한다. 임의적으로, 오일은 6% 내지 10%의 DPA를 함유한다. 임의적으로, 총 지방산은 적어도 60%의 DHA 및 중량 기준으로 10% 내지 18%의 DPA를 포함한다. 임의적으로, DHA 대 DPA의 비는 7:1 또는 6:1 이하이다. 임의적으로, 총 지방산은 적어도 50%의 DHA를 포함하고, DHA 대 DPA의 비는 7:1 이하이다. 임의적으로, 총 지방산은 적어도 50%의 DHA를 포함하고, DHA 대 DPA의 비는 6:1 이하이다.
임의적으로, 오일은 1% 미만의 스테아르산을 함유한다. 임의적으로, 총 지방산은 0.01% 내지 1%의 스테아르산 또는 중량 기준으로 0.001% 내지 1%의 스테아르산을 포함한다.
임의적으로, 미생물 오일은 적어도 85%의 총 지방산을 포함하고, 여기서 총 지방산은 적어도 50%의 DHA, 6% 내지 18%의 DPA, 및 1% 미만의 스테아르산을 포함한다. 임의적으로, 미생물 오일은 적어도 85%의 총 지방산을 포함하고, 여기서 총 지방산은 적어도 60%의 DHA를 포함한다.
임의적으로, 총 지방산은 3%, 2% 또는 1% 미만의 에이코사펜타엔산을 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 0.01% 내지 1%의 에이코사펜타엔산 또는 0.001% 내지 1%의 에이코사펜타엔산을 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 0.01% 내지 2%의 에이코사펜타엔산 또는 0.001% 내지 2%의 에이코사펜타엔산을 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 0.01% 내지 3%의 에이코사펜타엔산 또는 0.001% 내지 3%의 에이코사펜타엔산을 포함한다.
임의적으로, 총 지방산은 5% 미만, 4% 미만, 또는 3% 미만의 펜타데칸산을 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 0.01% 내지 3%, 0.01% 내지 4%, 또는 0.01% 내지 5%의 펜타데칸산을 포함한다.
임의적으로, 총 지방산은 45%, 40%, 35%, 30% 또는 25% 미만의 포화 지방산(SFA)을 포함한다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 오일 중의 포화 지방산은 C12:0 (라우르산), C14:0 (미리스트산), C15:0 (펜타데칸산), C16:0 (팔미트산), C17:0 (헵타데칸산), 및 C18:0 (스테아르산)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 임의적으로, 총 지방산은 10% 내지 45%의 포화 지방산(예를 들어, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 15% 내지 30%, 15% 내지 20%, 20% 내지 30%, 또는 20% 내지 25%의 포화 지방산)을 포함한다.
임의적으로, 총 지방산은 0.001% 내지 2.0% (예를 들어, 0.01% 내지 2.0% 또는 0.05% 내지 2.0%)의 아라키돈산(C20:4 (n-6))을 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 0.001% 내지 1%(예를 들어, 0.01% 내지 1%)의 에이코사테트라엔산(C20:4 (n-3))을 포함한다.
임의적으로, 총 지방산은 중량 기준으로 5% 미만의 미리스트산을 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 중량 기준으로 0.001% 내지 5%(예를 들어, 0.01% 내지 5%, 0.1% 내지 5%, 0.01% 내지 4%, 0.1% 내지 4% 또는 1% 내지 4%)의 미리스트산을 포함한다.
임의적으로, 총 지방산은 중량 기준으로 40% 미만의 팔미트산을 포함한다. 임의적으로, 총 지방산은 중량 기준으로 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 20% 내지 40%, 20% 내지 30%, 20% 내지 40%, 20% 내지 25%, 또는 25% 내지 40%의 팔미트산을 포함한다.
임의적으로, 총 지방산은 중량 기준으로 0.1% 내지 0.5% 또는 0.001% 내지 0.5%의 헵타데칸산을 포함한다.
임의적으로, 바이오매스 중의 또는 그로부터 단리된 지방산은 중량 기준으로 3% 미만의 에이코사펜타엔산, 중량 기준으로 5% 미만의 펜타데칸산, 및 45% 미만의 포화 지방산을 포함한다.
임의적으로, 바이오매스 중의 또는 그로부터 단리된 지방산은 0.001% 내지 2.0%, 0.01% 내지 2.0%, 또는 0.05% 내지 2.0%의 아라키돈산, 중량 기준으로 5% 미만의 미리스트산, 및 중량 기준으로 40% 미만의 팔미트산을 포함한다.
또한 오일을 포함하는 미생물 바이오매스가 제공된다. 미생물 바이오매스는 중량 기준으로 총 바이오매스의 40 내지 75%의 총 지방산을 포함한다. 임의적으로, 바이오매스 중의 오일은 DHA를 포함하고, 바이오매스는 중량 기준으로 바이오매스의 20% 내지 55%의 DHA를 포함한다. 임의적으로, 바이오매스 중의 오일은 중량 기준으로 바이오매스의 2.5% 내지 8%의 DPA를 포함한다. 임의적으로, 오일은 중량 기준으로 바이오매스의 4% 내지 8%의 DPA를 함유한다. 임의적으로, 오일은 중량 기준으로 바이오매스의 2.5% 내지 4%의 DPA를 함유한다.
제공된 미생물 오일 및 바이오매스를 생성하는 데 유용한 진핵 미생물은 오블롱기키트리움(Oblongichytrium), 오란티오키트리움, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium), 쉬조키트리움(Schizochytrium) 및 울케니아(Ulkenia) 속 또는 그의 임의의 혼합물로부터 선택되는 미생물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 임의적으로, 오일 생성 진핵 미생물은 서열 번호:1에 제시된 핵산 서열과 적어도 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 18S 서열을 갖는 미생물이다. 임의적으로, 오일 생성 미생물은 오란티오키트리움 리마시눔(Aurantiochytrium limacinum) 균주의 미생물이다. 임의적으로, 진핵 미생물은 2016년 7월 22일에 International Depositary Authority of Canada (IDAC), National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba Canada R3E 3R2에 기탁되어 IDAC에서 배정된 수탁 번호 220716-01을 갖는 미생물과 동일하다. 이 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)의 조건에 따라 유지된다. 이 기탁은 전형적이고, 단지 관련 분야의 기술을 가진 자의 편의를 위해서 이루어진 것이며, 기탁이 특허성을 위해 요구된다는 인정은 아니다. 용어 "G3", "G3-1" 또는 "G3-1 균주" 또는 "균주 G3-1"은 본원에서는 IDAC 수탁 번호 220716-01을 갖는 진핵 미생물을 지칭하는 데 호환가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체 및 보체를 지칭한다. 이 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함한다. 이 용어는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함하고, 이것은 합성, 자연적 발생 및 비자연적 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 그러한 유사체의 예는 제한 없이 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 및 펩티드-핵산(PNA)을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 핵산 서열의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열이 본원에 나열된 특정 핵산 서열 대신에 사용될 수 있다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer 등, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka 등, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini 등, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 핵산이라는 용어는 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드와 호환가능하게 사용된다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 일치하는(identical) 또는 퍼센트 일치성(percent identity)이라는 용어는 아래에 기재된 기본값 매개변수를 이용하는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, NCBI 웹 사이트 등 참고)에 의해 측정할 때 동일하거나 또는 명시된 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드(즉, 비교 창 또는 지정된 영역에서 비교하고 최대 상응성을 위해 정렬할 때 명시된 영역에서 약 60% 일치성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 높은 일치성)를 가지는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 그러면, 그러한 서열들은 실질적으로 일치한다고 말한다. 이 정의는 또한 시험 서열의 컴플리먼트(compliment)를 지칭하거나, 또는 그에 적용될 수 있다. 이 정의는 또한 결실 및/또는 첨가를 가지는 서열, 뿐만 아니라 치환을 가지는 서열을 포함한다. 아래에서 기재된 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 일치성은 길이가 적어도 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 더 바람직하게는 길이가 50-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 대표적으로 1개 서열이 참조 서열로서 작용하고, 이 참조 서열이 시험 서열과 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하다면, 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 바람직하게는, 기본값 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 또는 대체 매개변수가 적절하게 지정될 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기반으로 참조 서열 대비 시험 서열의 퍼센트 서열 일치성을 계산한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 비교 창은 20 내지 600, 보통은 약 50 내지 약 200, 더 보통은 약 100 내지 약 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 임의의 하나의 수의 세그먼트의 참조를 포함하며, 여기서는 어떤 서열과 동일한 인접 위치 수의 참조 서열을 두 서열을 최적으로 정렬한 후 비교할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 관련 분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)의 국부적 상동성 알고리즘에 의해; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해; Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)의 유사성 방법의 검색에 의해; 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WI)에 의해; 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 등, eds. 1995 supplement) 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 일치성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이들은 Altschul 등, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402(1977) 및 Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403-410(1990) 각각에 기재되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0을 본원에 기재된 매개변수와 함께 사용하여 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 일치성을 결정한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 관련 분야에 알려진 바와 같이 National Center for Biotechnology Information을 통해 공개적으로 입수가능한다. 이 알고리즘은 처음에 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 어떤 양수 값의 문턱 점수 T와 매칭하거나 또는 T를 만족시키는 쿼리 서열에서 선택된 길이(W)의 짧은 단어를 식별함으로써 높은 점수매김 서열 쌍(HSP)을 식별하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 점수 문턱이라고 불린다(Altschul 등). 이들 초기 이웃 단어 히트(hit)는 검색을 개시하여 그들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 단어 히트는 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 매개변수 M(1쌍의 매칭하는 잔기에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(비매칭하는 잔기에 대한 벌점 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 점수매김 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 다음과 같은 경우에 각 방향에서 단어 히트의 확장이 중단된다: 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값에서 수량 X만큼 떨어지거나; 하나 이상의 음수-점수매김 잔기 정렬의 축적 때문에, 누적 점수가 0 이하가 되거나; 또는 어느 서열이든 서열의 끝에 도달할 때. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. 기대값(E)은 데이터베이스 검색에서 우연히 발생할 것으로 예상되는 것과 동등하거나 또는 그보다 더 나은 점수를 가진 상이한 정렬들의 수를 나타낸다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 기본값으로서 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 기본값으로서 단어 길이 3, 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 점수매김 매트릭스(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989) 참조), 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
본원에서는 오일 생성 미생물을 사용하여 바이오매스를 제조하는 방법이 제공된다. 구체적으로, 지방산 합성 억제제를 포함하는 배양 배지에서 오일 생성 오란티오키트리움 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 적어도 350, 400, 450 또는 500 mg/g 오일을 포함하는 바이오매스의 제조 방법이 제공된다. 바이오매스는 본원에서 기재된 특성을 갖는 오일을 제조하는 데 사용될 수 있다. 방법은 바이오매스로부터 오일을 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
배양 단계는 15℃ 내지 28℃ (예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28℃)의 온도에서 수행될 수 있다. 임의적으로, 배양 배지는 18℃ 내지 22℃, 22℃ 내지 28℃, 22℃ 내지 25℃, 또는 25℃ 내지 28℃의 온도이다.
지방산 합성 억제제는 미생물을 배양 배지에 첨가하기 전, 후 또는 동시에 배양 배지에 첨가할 수 있다. 임의적으로, 지방산 합성 억제제는 연속적으로 또는 간헐적으로 배양 배지에 공급된다. 임의적으로, 방법은 미생물을 배양 배지에 첨가한 다음, 배양 배지에 미생물을 첨가한 후 적어도 6, 12, 24 또는 48 시간에서 지방산 합성 억제제를 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 임의적으로, 방법은 미생물을 배양 배지에 첨가한 다음, 미생물을 배양 배지에 첨가한 후 24 내지 48 시간에서 지방산 합성 억제제를 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 임의적으로, 방법은 미생물을 배양 배지에 첨가한 다음, 미생물을 배양 배지에 첨가한 후 6 내지 24 시간에서 지방산 합성 억제제를 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 임의적으로, 방법은 미생물을 배양 배지에 첨가한 다음, 미생물을 배양 배지에 첨가한 후 12 내지 24 시간에서 지방산 합성 억제제를 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
지방산 합성 억제제는 1회 이상의 용량으로 배양 배지에 첨가될 수 있다. 임의적으로, 방법은 미생물을 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하고, 배양은 지방산 합성 억제제를 예를 들어 미생물을 배양 배지에 첨가한 후 6, 12, 24, 또는 48 시간에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 용량으로 첨가하는 것을 포함한다. 임의적으로, 1회 이상의 용량은 6, 12 또는 24 시간마다 첨가된다. 예를 들어, 미생물이 배양 배지에 첨가된 후 24 시간에서 시작하여 12 시간마다 3회 용량의 지방산 억제제가 배양 배지에 첨가될 수 있다.
배양 배지에 첨가된 지방산 합성 억제제의 총량은 3μM 내지 40μM을 포함한다. 임의적으로, 지방산 합성 억제제는 억제제 합계가 3μM 내지 40μM에 이르도록 1회 또는 다회 용량(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 용량)으로 투여된다. 예를 들어, 지방산 합성 억제제는 합계가 12μM에 이르도록 2μM의 용량으로 6회 첨가될 수 있다. 다른 예로서, 지방산 합성 억제제는 1, 2, 3, 또는 8 μM의 용량으로 3회 첨가될 수 있다. 임의적으로, 지방산 합성 억제제는 0.5, 1, 2, 3 및 4 μM의 용량으로 6회 첨가될 수 있다. 임의적으로, 배양 동안 배양 배지에 첨가된 지방산 합성 억제제의 총 농도는 바이오매스 그램 당 30 μg 내지 700 μg의 억제제를 포함한다. 임의적으로, 지방산 합성 억제제는 바이오매스 그램 당 합계가 30 μg 내지 700 μg에 이르도록 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 용량으로 투여된다. 예를 들어, 지방산 합성 억제제는 바이오매스 그램 당 합계가 240 μg에 이르도록 40 μg의 용량으로 6회 첨가될 수 있다. 다른 예로서, 지방산 합성 억제제는 바이오매스 그램 당 대략 12, 24, 42 및 120 μg의 용량으로 3회 첨가될 수 있다. 임의적으로, 지방산 합성 억제제는 바이오매스 그램 당 5.5, 11, 25, 40 및 62 μg의 용량으로 6회 첨가될 수 있다.
적합한 지방산 합성 억제제는 지방산 생성효소 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 임의적으로, 지방산 생성효소 억제제는 케르세틴, α-망고스틴, 티오락토마이신, 트리클로산, 이소니아지드, 데시노일-N-아세틸시스테아민(NAC) 및 세룰레닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
위에서 기재된 바와 같이, 제공된 방법에 유용한 진핵 미생물은 오블롱기키트리움, 오란티오키트리움, 트라우스토키트리움, 쉬조키트리움 및 울케니아 속 또는 그의 임의의 혼합물로부터 선택되는 미생물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 임의적으로, 오일 생성 진핵 미생물은 서열 번호:1에 제시된 서열과 적어도 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 18S 서열을 갖는 미생물이다. 임의적으로, 진핵 미생물은 IDAC 수탁 번호 220716-01을 갖는다.
본원에서 기재된 바와 같이, 바이오매스는 지방산, 예를 들어 위에서 기재된 바와 같이 적어도 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 트리글리세리드를 포함하는 지방산을 포함한다. 바이오매스 중의 오일은 또한 위에서 기재된 바와 같이 중량 기준으로 적어도 85%의 총 지방산을 함유한다.
임의적으로, 바이오매스로부터 단리된 지방산은 위에서 기재된 바와 같이 중량 기준으로 적어도 50%의 DHA를 포함한다.
바이오매스 중의 지방산은 임의적으로 위에서 기재된 바와 같이 중량 기준으로 6% 내지 18%의 DPA를 포함한다. 임의적으로, 바이오매스 중의 또는 그로부터 단리된 지방산, 오일에서 DHA 대 DPA의 비는 위에서 기재된 바와 같이 7:1 또는 6:1 이하이다.
바이오매스 중의 또는 그로부터 단리된 오일은 임의적으로 위에서 기재된 바와 같이 중량 기준으로 1% 미만의 스테아르산을 함유한다.
임의적으로, 바이오매스 중의 또는 그로부터 단리된 지방산은 위에서 기재된 바와 같이 중량 기준으로 3% 미만의 에이코사펜타엔산, 중량 기준으로 5% 미만의 펜타데칸산, 및 45% 미만의 포화 지방산을 포함한다.
임의적으로, 바이오매스 중의 또는 그로부터 단리된 지방산은 0.001% 내지 2.0% 또는 0.01% 내지 2.0% 또는 0.05% 내지 2.0%의 아라키돈산, 중량 기준으로 5% 미만의 미리스트산, 및 중량 기준으로 40% 미만의 팔미트산을 포함한다. 임의적으로, 지방산은 중량 기준으로 0.1% 내지 0.5% 또는 0.001% 내지 0.5%의 헵타데칸산을 포함한다.
기재된 방법에서 사용되는 바와 같은 배양 배지는 미생물을 위한 탄소 공급원 및 질소 공급원을 포함하여 다양한 영양 성분을 공급한다. 배양용 배지는 임의의 다양한 탄소 공급원을 포함할 수 있다. 탄소 공급원의 예는 지방산, 지질, 글리세롤, 트리글리세롤, 탄수화물, 폴리올, 아미노 당, 및 임의의 종류의 바이오매스 또는 폐기물 스트림을 포함한다. 지방산은 예를 들어 올레산을 포함한다. 탄수화물은 글루코스, 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 프럭토스, 덱스트로스, 자일로스, 락툴로스, 갈락토스, 말토트리오스, 말토스, 락토스, 글리코겐, 젤라틴, 전분(옥수수 또는 밀), 아세테이트, m-이노시톨(예를 들어, 옥수수 침지액 유래), 갈락투론산(예를 들어, 펙틴 유래), L-푸코스(예를 들어, 갈락토스 유래), 겐티오비오스, 글루코사민, 알파-D-글루코스-1-포스페이트(예를 들어, 글루코스 유래), 셀로비오스, 덱스트린, 알파-시클로덱스트린(예를 들어, 전분 유래) 및 수크로스(예를 들어, 당밀 유래)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리올은 말티톨, 에리트리톨 및 아도니톨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아미노 당은 N-아세틸-D-갈락토사민, N-아세틸-D-글루코사민, 및 N-아세틸-베타-D-만노사민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 탄소 공급원은 종속영양 배지에 200 g/L, 175 g/L, 150 g/L, 100 g/L, 60 g/L 이하의 농도, 예를 들어 1 내지 200 g/L, 5 내지 200 g/L, 10 내지 200 g/L, 50 내지 200 g/L, 또는 100 내지 200 g/L의 농도로 존재할 수 있다.
미생물은 약 0.5 g/L 내지 약 50.0 g/L의 염화물 농도(예를 들어, 약 0.5 g/L 내지 약 35 g/L, 약 18 g/L 내지 35 g/L, 또는 약 2 g/L 내지 약 35 g/L의 염화물 농도)를 갖는 배지에서 배양될 수 있다. 본원에서 기재된 미생물은 낮은 염화물 조건, 예를 들어 약 0.5 g/L 내지 약 20 g/L, 또는 약 0.5 g/L 내지 약 15 g/L에서 성장할 수 있다.
배양 배지는 임의적으로 NaCl을 포함한다. 배양 배지는 나트륨 공급원으로서 비염화물 함유 나트륨 염을 포함할 수 있다. 본 방법에 따라 사용하기에 적합한 비염화물 나트륨 염의 예는 소다회(탄산나트륨 및 산화나트륨의 혼합물), 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 황산나트륨, 및 그의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,340,742 및 6,607,900을 참고하고, 이들 문헌 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 임의적으로, 배지는 20 g/L 탄소, 20 g/L 대두 펩톤 및 5 g/L 효모 추출물을 사용할 때 9 g/L 염화물을 포함한다. 배지가 10 g/L 탄소, 5 g/L 대두 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L 한천을 함유할 때 배지는 35 g/L 염화물을 포함할 수 있다. 배지가 20-40 g/L 탄소, 1 g/L 효모 추출물, 1-20 g/L 글루타민산모노나트륨(MSG), 0.3-2.0 g/L 인산염, 4 g/L 황산마그네슘, 5-10 g/L 황산암모늄, 1.5 mL/L 미량 원소 용액, 1 mL/L 비타민 B 용액 및 0.1 g/L CaCl2를 함유할 때 배지는 2 g/L 염화물을 포함할 수 있다.
미생물 배양을 위한 배지는 임의의 다양한 질소 공급원을 포함할 수 있다. 전형적인 질소 공급원은 암모늄 용액(예를 들어, H2O 중 NH4), 암모늄 또는 아민 염(예를 들어, (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, NH4NO3, NH4OOCH2CH3(NH4Ac)), 펩톤, 대두 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 어분, 글루타민산나트륨, 대두 추출물, 카사미노산 및 증류기 곡물을 포함한다. 적합한 배지에서 질소 공급원의 농도는 대표적으로 상한 및 하한을 포함하여 약 1 g/L 내지 약 25 g/L(예를 들어, 약 5 내지 20 g/L, 약 10 내지 15 g/L, 또는 약 20 g/L) 범위이다. 임의적으로, 질소 농도는 효모 추출물이 배지의 복합 질소 공급원일 때 약 10 내지 15 g/L이다. 임의적으로, 대두 펩톤이 배지에 L-글루탐산 모노나트륨 염 수화물(MSG) 또는 황산암모늄과 함께 있을 때 질소 농도는 약 1 내지 5 g/L이다.
배지는 임의적으로 인산염 예컨대 인산칼륨 또는 인산나트륨(예를 들어, 인산칼륨 일염기성)을 포함한다.
배지의 무기 염 및 미량 영양소는 황산암모늄, 중탄산나트륨, 오르토바나듐산나트륨, 크롬산칼륨, 몰리브덴산나트륨, 셀레노우스산(selenous acid), 황산니켈, 황산구리, 황산아연, 염화코발트, 염화철, 염화망간, 염화칼슘 및 EDTA를 포함할 수 있다. 임의적으로, 배지는 적어도 1.5 ml/L의 미량 원소 용액을 포함한다. 임의적으로, 미량 원소 용액은 2 mg/mL 황산구리(II) 오수화물, 2 mg/mL 황산아연 칠수화물, 1 mg/mL 염화코발트(II) 육수화물, 1 mg/mL 염화망간(II) 사수화물, 1 mg/mL 몰리브덴산나트륨 이수화물, 및 1 mg/mL 황산니켈(II)을 포함한다.
배지는 황산마그네슘을 임의적으로 미량 원소 용액 및/또는 일염기성 인산칼륨과 함께 포함할 수 있다.
비타민 예컨대 피리독신 염산염, 티아민 염산염, 판토텐산칼슘, p-아미노벤조산, 리보플라빈, 니코틴산, 비오틴, 엽산 및 비타민 B12가 배양 배지에 포함될 수 있다.
배지의 pH는 적절한 경우 산 또는 염기를 사용하고/거나 질소 공급원을 사용하여 상한 및 하한을 포함하여 3.0 내지 10.0로 조정될 수 있다. 임의적으로, 배지는 멸균된다.
일반적으로 미생물 배양에 사용되는 배지는 액체 배지이다. 그러나, 미생물 배양에 사용되는 배지는 고체 배지일 수 있다. 본원에서 논의되는 바와 같이 탄소 및 질소 공급원 외에도, 고체 배지는 구조적 지지를 제공하고/거나 배지가 고체 형태인 것을 허용하는 하나 이상의 성분(예를 들어, 한천 및/또는 아가로스)을 함유할 수 있다.
미생물 배양은 공지된 조건, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 2007/069078 및 WO 2008/129358에 기재된 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 배양은 1 내지 30일(예를 들어, 1 내지 21일, 1 내지 15일, 1 내지 12일, 1 내지 9일, 또는 3 내지 5일) 동안 수행될 수 있다. 배양은 4 내지 30℃의 온도에서 수행될 수 있다. 임의적으로, 배양은 통기 진탕 배양, 진탕 배양, 정지 배양, 회분 배양, 유가 배양, 연속 배양, 롤링 회분 배양, 파동 배양 등에 의해 수행된다. 임의적으로, 배양은 1 내지 20%, 1 내지 10%, 또는 1 내지 5%의 배양 배지의 용존 산소 함량으로 수행된다.
본원에 기재된 바와 같은 바이오매스는 최종 생성물(예를 들어, 식품 또는 사료 보충제, 바이오연료 등)에 포함될 수 있다. 따라서, 단백질이 풍부한 바이오매스를 사용하는 방법이 제공된다. 방법은 임의적으로 단백질이 풍부한 바이오매스를 식료품(예를 들어, 애완동물 식품, 가축 사료, 또는 양식 사료)에 혼입시키는 단계를 포함한다.
오일 또는 지질은 기재된 미생물 배양으로부터 단리되어 다양한 식품 및 사료 보충제에 사용될 수 있다. 오일이 혼입될 수 있는 적합한 식품 또는 사료 보충제는 음료 예컨대 우유, 물, 스포츠 드링크, 에너지 드링크, 차 및 주스; 과자류 예컨대 캔디, 젤리, 및 비스킷; 지방 함유 식품 및 음료 예컨대 유제품; 가공 식품 예컨대 부드러운 쌀(또는 죽); 유아용 조제유; 아침식사용 시리얼 등을 포함한다. 임의적으로, 하나 이상의 생성된 지질은 식이 보충제 예컨대 예를 들어 비타민 또는 종합비타민에 혼입될 수 있다. 임의적으로, 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 오일은 식이 보충제에 포함될 수 있고, 임의적으로 식품 또는 사료의 성분(예를 들어, 식품 보충제)에 직접 혼입될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 생성된 오일 또는 지질이 혼입될 수 있는 식료품의 예는 애완동물 식품 예컨대 고양이 식품; 개 식품; 수족관 물고기, 양식 어류 또는 갑각류 등의 사료; 또는 농장에서 기르는 동물(가축 및 수산양식으로 기른 어류 또는 갑각류 포함)의 사료를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 오일 또는 지질이 혼입될 수 있는 식품 또는 사료 물질은 바람직하게는 의도된 수용자인 유기체의 구미에 맞다. 이 식품 또는 사료 물질은 식품 물질에 대해 현재 알려진 임의의 물리적 특성(예를 들어 고체, 액체, 부드러움)을 가질 수 있다.
임의적으로, 생성된 화합물(예를 들어, PUFA) 중 하나 이상이 뉴트라슈티칼(nutraceutical) 제품 또는 의약품에 혼입될 수 있다. 그러한 뉴트라슈티칼 제품 또는 의약품 형태의 예는 다양한 유형의 정제, 캡슐, 음용제 등을 포함할 수 있다. 임의적으로, 뉴트라슈티칼 제품 또는 의약품은 국소 도포(예를 들어 로션 형태)에 적합하다. 투여 형태는 예를 들어 캡슐, 오일, 정제 등을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법에 따라 생성된 오일 또는 지질은 임의의 다양한 다른 작용제와 조합하여 제품에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 그러한 화합물은 하나 이상의 결합제 또는 충전제, 킬레이트화제, 안료, 염, 계면활성제, 보습제, 점도 조절제, 증점제, 연화제, 방향제, 방부제 등, 또는 그의 임의의 조합과 함께 조합될 수 있다.
개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있거나, 개시된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있거나, 개시된 방법 및 조성물의 제조에 사용될 수 있거나, 또는 개시된 방법 및 조성물의 생성물인 물질, 조성물 및 성분이 개시된다. 이들 및 다른 물질이 본원에서 개시되고, 이들 물질의 조합, 하위집합, 상호작용, 그룹 등이 개시될 때, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 순열의 구체적인 언급이 명시적으로 개시될 수 없지만, 각각이 본원에서 구체적으로 고려되고 기재된다는 것을 이해한다. 예를 들어, 방법이 개시되고 논의되고, 방법을 포함하는 많은 분자에 가할 수 있는 많은 변형이 논의되는 경우, 방법의 각각의 및 모든 조합 및 순열, 및 가능한 변형이 구체적으로 반대로 지시되지 않은 한 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 하위집합 또는 조합도 구체적으로 고려되고 개시된다. 이 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법의 단계를 포함하지만 이에 제한되지 않는 이 개시물의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 있는 경우, 이들 추가 단계 각각이 개시된 방법의 임의의 특정 방법 단계 또는 방법 단계들의 조합과 함께 수행될 수 있으며, 그러한 조합 또는 조합의 하위조합 각각이 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 한다는 것을 이해한다.
본원에서 인용된 간행물 및 그들이 인용된 자료는 그 전체가 참고로 구체적으로 본원에 포함된다.
하기 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물의 일부 측면을 추가로 예시하는 것으로 의도되고, 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1. 지방산 합성 억제제 용량 타이밍 전략.
과도한 위해 예컨대 세포 성장 방지 없이 지방산 생성효소 억제제인 세룰레닌 첨가를 위한 이상적인 시점을 결정하기 위해, 접종 후 다양한 양의 시간에서 정해진 양의 세룰레닌을 첨가함으로써 실험을 수행하였다. 모든 실험에서, 대조군 실험은 FAS 억제제의 첨가 없이 동일한 배지 및 성장 조건으로 수행하였다. 결과는 어떠한 첨가 시점에서도 세포 성장이 억제되지 않았고, 하지만 그것이 지방산 프로파일에 유의미한 영향을 미쳤음을 입증하였다(도 1). 표 2는 접종 후 24 시간에서 세룰레닌 첨가가 더 높은 DHA 및 DPA 함량(TFA의 %)을 초래하였고, 지방산 합성 경로 생성물 C14:0 및 C16:0이 각각 21.1% 및 27.9% 감소되었음을 보여준다.
표 1.
Figure pct00001
표 2.
Figure pct00002
실시예 2. 지방산 합성 억제제 농도.
최상의 결과를 제공하는 최적의 세룰레닌 농도를 결정하기 위해, 1μM 내지 40μM의 농도 범위를 시험하였다. 일관성을 위해, 모든 세룰레닌 첨가는 접종 후 24 시간에서 이루어졌다. 도 2는 20℃에서 다양한 농도의 세룰레닌에서 오란티오키트리움 종 (G3)의 지방산 프로파일을 보여준다. 표 5는 세룰레닌 농도 증가가 세포에 축적되는 C16:0 및 DPA의 양에 분명한 영향을 미친다는 것을 보여준다. 총 지방산의 백분율 면에서, 특정 지방산의 그러한 변화는 25μM의 세룰레닌이 사용될 때 DHA 함량(TFA의 %)이 44.71%로부터 높게 50.92%로 증가하는 것에 상응한다(표 4).
표 3.
Figure pct00003
표 4.
Figure pct00004
실시예 3. 지방산 합성 억제제 투여 레지멘.
세룰레닌에 장기간 반복적으로 노출될 때의 영향을 조사하기 위해, 용량들을 실험 동안 균등하게 3 또는 6회에 걸쳐 나눠서 첨가하였다. 각 경우에서, 첨가된 총량은 24 시간에서 전부 첨가된 상응하는 처리와 동등하였다. 모든 첨가는 접종 후 24 시간에서 시작하였다. 도 3 및 4에서, 세룰레닌 농도 증가에 의해 뿐만 아니라 다수의 등가 펄스로 세룰레닌 투여에 의해 DHA 및 DPA가 증가하는 분명한 동향을 볼 수 있었다. 또한, 표 5는 반복된 용량 첨가가 이용될 때 총 지방산에 대한 부정적인 영향을 보여주지 않는 반면, DHA의 실제 양(mg/g)은 세룰레닌이 증가함에 따라 증가하였다. 관찰된 가장 높은 DHA는 합계가 12 μM에 이르도록 동등한 용량의 세룰레닌을 6회 사용하는 것이었고, 그 결과로 51.6%의 DHA 증가를 초래하였다. 또한 85.1% 및 83.9%의 C14:0 및 C16:0의 최대 감소가 있었는데, 이는 이들 조건 하에서 세룰레닌에 의한 FAS 경로의 매우 효과적인 억제를 시사한다.
표 5.
Figure pct00005
표 6.
Figure pct00006
실시예 4. 생성물 수율에 대한 지방산 합성 억제제 영향.
PUFA 향상 전략을 위한 본원에 기재된 방법의 영향을 평가하기 위해, G3 세포에 의해 동화된 탄소의 양에 대한 생성물(즉, TFA, DHA 또는 DPA)의 수율을 조사하였다. 도 5에서는, 합성된 생성물의 총량(총 지방산(TFA), 포화 지방산(SFA) 또는 DHA로 분류됨)이 묘사된다. 일정한 빈도 및 농도로 투여된 지방산 합성 억제제의 존재 하에서, TFA 및 DHA 농도 둘 모두가 증가한 반면, SFA 농도는 감소하였다. 예를 들어, 세룰레닌을 12 시간 간격으로 6회 동안 매회 1μM 투여하는 조건 하에서, 대조군 실험의 결과와 비교할 때 TFA 및 DHA가 각각 15% 및 71% 증가하였다(도 5). 결과를 지방산 수율(생성물 그램/소비된 탄소 그램)로 계산할 때, 임의의 세룰레닌 투여 조건 하에서 DHA 수율은 일반적으로 유의미하게 증가한 반면, SFA 수율은 감소하였다. 예를 들어, 대조군 실험 결과와 비교할 때, 6x1μM에서 최적 조건 중 하나가 DHA 수율 53% 증가 및 SFA 수율 64% 감소를 발견하였고, 이렇게 함으로써 세포가 FAS 경로에 대한 억제를 경험할 뿐만 아니라 그들이 PUFA 생성효소 경로를 상향조절하여 이용가능한 탄소를 더 효율적으로 활용하였다는 것을 시사한다.
실시예 5. 오란티오키트리움 종 (G3)으로부터의 DHA %에 대한 온도의 영향.
플라스크 규모 실험을 수행하여 오란티오키트리움 종(G3)의 지방산 프로파일 및 생산성에 대한 배양 온도 감소(25℃에서 20℃로)의 영향을 조사하였다. 도 6의 데이터는 배양 온도가 20℃로 감소한 경우에 DHA 및 DPA의 비율이 증가함을 도시한다. 표 7 및 8은 각각 27.5% 및 10.6%의 C14:0 및 C16:0 감소와 병행해서 14.7%의 DHA 증가를 나타내는 요약 데이터를 보여준다.
표 7.
Figure pct00007
표 8.
Figure pct00008
실시예 6. 오란티오키트리움 종 (G3)으로부터의 DHA%에 대한 전체-길이 발효의 영향.
오란티오키트리움 종(G3)의 전체-길이 발효를 다양한 온도(25℃에서 20℃로)에서 30L 스테인리스 스틸 발효기를 사용하여 수행하였다. 이들 발효는 일반적으로 150 시간 내지 200 시간 지속되었고, 바이오매스 및 TFA가 각각 130 g/L 초과 및 55% 초과에 도달하였다. 도 7에서 볼 수 있듯이, 25℃의 대표적인 온도에서 전체-길이 발효는 플라스크를 사용한 대표적인 대조군 배양보다 최종 DHA 함량을 개선할 수 있었고, 한편 더 낮은 온도에서의 전체-길이 발효는 훨씬 더 높은 DHA%에 도달할 수 있었다. 도 7에 포함된 예에서, 25℃에서의 발효는 45% DHA에 도달하였고, 이는 37%의 플라스크 대조군의 DHA보다 약 8% 더 높다. 22℃ 및 20℃에서의 발효는 추가의 DHA% 증가를 달성하여 각각 59.7% 및 60.0%였다. 그러나, 세룰레닌을 여러 번 간헐적 투여하는 것을 사용한 플라스크 실험으로부터의 DHA 함량이 여전히 가장 높은 DHA%였고, 68.7%에 도달하였다.
실시예 7. 오란티오키트리움 종(G3)에 대한 상승된 온도의 영향.
G3 균주를 향상된 바이오매스 및 지방산 생성을 위해 30-L 발효기에서 22℃, 25℃ 및 28℃에서 배양하였다. G3는 500 mL의 기본 배지(50 g/L 글루코스, 6.25 g/L 효모 추출물, 4 g/L MgSO4.7H2O, 4 g/L, 2.5 g/L NaCl, 2 mg/L 황산구리, 2 mg/L 황산아연, 1 mg/L 몰리브덴산나트륨, 1 mg/L 염화코발트(II), 1 mg/L 염화망가니즈 및 1 mg/L 황산니켈)를 함유하는 4 개의 삼각 (Erlenmeyer) 플라스크에서 사전배양하였다. 플라스크를 2일 동안 25℃ 및 200 rpm으로 교반 하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, 플라스크(1.5L) 중 3개를 사용하여 175 g/L 글루코스, 9.66 g/L 효모 추출물, 2.57 g/L MgSO4·7H2O, 0.45 g/L 염화나트륨, 6.44 g/L 황산암모늄, 1.6 g/L 일염기성 인산칼륨, 1.74 g/L 이염기성 인산칼륨, 12.87 g/L 글루타민산모노나트륨, 0.1 g/L 염화칼슘 탈수화물, 1 mg/L 황산구리, 1 mg/L 황산아연, 0.5 mg/L 몰리브덴산나트륨, 0.5 mg/L 염화코발트(II), 0.5 mg/L 염화망가니즈, 0.5 mg/L 황산니켈, 0.03 mg/L 비타민 B12, 0.03 mg/L 비오틴 및 6 mg/L 티아민 염산염을 함유하는 30L 생물반응기에 20 L의 배지를 접종하고, 30L 발효기에서 22℃, 25℃ 및 28℃의 조건 하에서 배양하였다. 교반은 325 rpm으로 시작하여 365 rpm으로 증가하였고, 통기는 대기 공기로 0.3 vvm으로 유지하였고, pH 6.0이었다. pH는 염기(27% NH4OH) 첨가에 의해 유지하였다. 750 g/L 글루코스 용액으로 대략 3 g/L/h의 글루코스 소비율을 유지하도록 베슬(vessel)에 공급하였다. 다양한 간격으로 세포를 수집하고, 바이오매스, TFA 및 지질 프로파일을 측정하였다. 25 및 28℃에서 최종 G3 프로파일의 특성을 표 9에서 보여준다. 지질 프로파일을 표 10, 11 및 12에서 보여준다.
표9.
Figure pct00009
표 10.
Figure pct00010
표 11. 25℃에서 배양된 G3의 지방산 프로파일.
Figure pct00011
표 12. 28℃에서 배양된 G3의 지방산 프로파일
Figure pct00012

Claims (45)

  1. 미생물 오일로서, 중량 기준으로 적어도 85%의 총 지방산을 포함하며, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 적어도 50%의 도코사헥사엔산, 중량 기준으로 6% 내지 18%의 도코사펜타엔산 n-6, 및 중량 기준으로 1% 미만의 스테아르산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  2. 미생물 오일로서, 중량 기준으로 적어도 85%의 총 지방산을 포함하며, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 적어도 60%의 도코사헥사엔산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 0.01% 내지 1%의 스테아르산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 10% 내지 18%의 도코사펜타엔산 n-6을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물 오일이 중량 기준으로 85% 내지 95%의 총 지방산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물 오일이 중량 기준으로 적어도 90%의 총 지방산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 1% 미만의 에이코사펜타엔산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 3% 미만의 펜타데칸산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 40% 미만의 포화 지방산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  10. 제9항에 있어서, 상기 총 지방산이 10% 내지 40%의 포화 지방산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  11. 제9항에 있어서, 상기 총 지방산이 10% 내지 30%의 포화 지방산을 포함하는 것인 미생물 오일.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 60% 내지 70%의 도코사헥사엔산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 0.01% 내지 2.0%의 아라키돈산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 0.01% 내지 1%의 에이코사테트라엔산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물 오일이 적어도 90%의 트리글리세리드를 포함하는 것인, 미생물 오일.
  16. 제15항에 있어서, 상기 미생물 오일이 적어도 95%의 트리글리세리드를 포함하는 것인, 미생물 오일.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도코사헥사엔산 대 도코사펜타엔산 n-6의 비가 7:1 이하인, 미생물 오일.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 4% 미만의 미리스트산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 30% 미만의 팔미트산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 적어도 60%의 도코사헥사엔산 및 중량 기준으로 10% 내지 중량 기준으로 18%의 도코사펜타엔산 n-6을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 지방산이 중량 기준으로 0.1% 내지 0.5%의 헵타데칸산을 포함하는 것인, 미생물 오일.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일이 배양 배지에서 22℃ 내지 28℃의 온도에서 오란티오키트리움(Aurantiochytrium) 미생물을 배양함으로써 생성되는 것인, 미생물 오일.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일이 배양 배지에서 25℃ 내지 28℃의 온도에서 오란티오키트리움 미생물을 배양함으로써 생성되는 것인, 미생물 오일.
  24. 바이오매스의 제조 방법으로서, 지방산 합성 억제제를 포함하는 배양 배지에서 오일-생성 오란티오키트리움 미생물을 배양하는 단계를 포함하며, 상기 바이오매스가 적어도 500 mg/g의 오일을 포함하는 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 배양 배지가 18℃ 내지 22℃의 온도인 것인, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 배양 배지가 22℃ 내지 28℃의 온도인 것인, 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 배양 배지가 25℃ 내지 28℃의 온도인 것인, 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 미생물을 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 지방산 합성 억제제가 미생물을 배양 배지에 첨가한 후 24 내지 48 시간에서 배양 배지에 첨가되는 것인, 방법.
  29. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 미생물을 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 지방산 합성 억제제가 미생물을 배양 배지에 첨가한 후 적어도 6, 12, 24 또는 48 시간에서 배양 배지에 첨가되는 것인, 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 1회 이상의 용량의 지방산 합성 억제제를 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  31. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 미생물을 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 배양이 배양 배지에 미생물을 첨가한 후 12 시간에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 또는 6회 용량으로 지방산 합성 억제제를 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 용량이 6, 12, 또는 24 시간마다 첨가되는 것인, 방법.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 동안 배양 배지에 첨가된 지방산 합성 억제제의 총 농도가 3 내지 40 μM을 포함하는 것인, 방법.
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 동안 배양 배지에 첨가된 지방산 합성 억제제의 총 농도가 바이오매스 그램 당 30 μg 내지 700 μg의 억제제를 포함하는 것인, 방법.
  35. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방산 합성 억제제가 배양 배지에 공급되는 것인, 방법.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 IDAC 수탁 번호 220716-01을 갖는 것인, 방법.
  37. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 바이오매스로부터 오일을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  38. 제24항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일이 지방산을 포함하고, 상기 지방산이 중량 기준으로 적어도 50%의 도코사헥사엔산, 중량 기준으로 6% 내지 18%의 도코사펜타엔산 n-6 및 중량 기준으로 1% 미만의 스테아르산을 포함하는 것인, 방법.
  39. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일이 지방산을 포함하고, 상기 지방산이 중량 기준으로 10% 내지 18%의 도코사펜타엔산 n-6을 포함하는 것인, 방법.
  40. 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일이 지방산을 포함하고, 상기 지방산이 중량 기준으로 1% 미만의 에이코사펜타엔산을 포함하는 것인, 방법.
  41. 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일이 지방산을 포함하고, 상기 지방산이 10% 내지 40%의 포화 지방산을 포함하는 것인, 방법.
  42. 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일이 지방산을 포함하고, 상기 지방산이 중량 기준으로 50% 내지 70%의 도코사헥사엔산을 포함하는 것인, 방법.
  43. 제24항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일이 지방산을 포함하고, 상기 지방산이 중량 기준으로 적어도 95%의 트리글리세리드를 포함하는 것인, 방법.
  44. 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일이 지방산을 포함하고, 상기 지방산이 중량 기준으로 적어도 60%의 도코사헥사엔산 및 중량 기준으로 10% 내지 중량 기준으로 18%의 도코사펜타엔산 n-6을 포함하는 것인, 방법.
  45. 제24항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일이 지방산을 포함하고, 상기 지방산이 중량 기준으로 0.1% 내지 0.5%의 헵타데칸산을 포함하는 것인, 방법.
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