LU81348A1 - Antiviral wirksame t-rna-praeparate - Google Patents

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Description

r - 4 -
Die Erfindung betrifft Präparate auf der Basis von Transfer-Ribonucleinsäuren (MtRNAM)» ihre Herstellung sowie ihre Anwendung zur Behandlung viraler Infektionen im menschlichen und tierischen Organismus·
In Wirbeltierzellen kann durch Kontakt mit Viren und bestimmten anderen mikrobiellen Substanzen ein Schutz gegen Schädigungen durch Virusinfektionen erzielt werden« Man nimmt an, daß durch diesen Kontakt die Ent-— stehung von Stoffen induziert wird, die eingedrungene
Viren an ihrer Replikation hindern. Der biochemische Mechanismus der antiviralen Wirkung steht zur Zeit noch zur Diskussion. Die induzierten antiviralen Proteine - z.B. das Interferon - sind speziesspezifisch·
Von großer Bedeutung ist es deshalb, geeignete Induktoren aufzufinden, die unmittelbar im menschlichen Organismus die Erzeugung dieser Hemmproteine veranlassen, die dann der allgemeinen Virusabwehr zur Verfügung stehen.
Einen Überblick über die Wirksamkeit von auf Interferoninduzierende Wirkung getesteten Substanzen nach dem Stand > der Technik gibt Tabelle I (Biological Effects of Poly- nucleotides; R.F. Beers/W. Braun; Springer Verlag 1971)·
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ψ - 6 -
Wie die Tabelle am Beispiel des Interferontiters ausweist, ist die Stärke der Induktionswirkung sehr verschieden, z.B. ist das teilsynthetisch gewonnene Poly I:C sehr wirksam, während Transfer-Ribonucleinsäuren (tRNA) hier keine Wirkung besitzen.
Als Maß für die Wirksamkeit einer induzierenden Substanz gilt die antivirale Wirksamkeit. Sie wird in vitro gemessen als Hemmung der Infektionswirkung eines Virus in einer Zellkultur, wobei die Anzahl der durch die infektionsbedingte Zell-Lyse entstandenen Plaques ermittelt wird. (Finter, N.V.s Interferon Assays and Standards; in “Interferons” (North-Holland Publ. Company Amsterdam 1966).
- Lorenz, R.J.: Zur Statistik des Plaque-Testes, Arch. Ges. Virusforsch. 12, 108-137 (1963)·
Im in vivo-Test wird ein Tierkollektiv durch einen Virus in einem bestimmten Bereich der Letaldosis infiziert und die Steigerung der Überlebensrate bzw. Abnahme der Krankheitssymptome oder der Zahl der Viruserreger im Blut (Virämie) durch die induzierende Substanz ermittelt.
Wegen seiner hohen Wirksamkeit hatte Poly I:C allgemein theoretisches und praktisches Interesse gefunden. Es ^ wurde z.B. bei Keratitis lokal am Auge angewandt; einer systemischen Anwendung im menschlichen Organismus steht jedoch seine dem Endotoxin vergleichbare Toxizität entgegen (s. M. Absher und W. Stineberg, Nature 223/S. 715 (1969) sowie H.L. Lindsay, P.W. Trown und J. Brandt,
Nature 223/s. 717 (1969).
Bei der Suche nach anderen, nicht toxischen, wirksamen Induktoren wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die nach der herrschenden Meinung als unwirksam (s. vorstehende Tabelle sowie Arbeit von Stebbing et al (J. gen. Virol. (1977), S. 73-8¾ geltende eukaryotische tRNA, - 7 - » z.B. aus Hefe, in vitro wie in vivo über eine gute antivirale Wirkung verfügt. Diese läuft nämlich keineswegs immer einem entsprechenden Interferontiter parallel, so daß daneben andere Hemmprinzipien postuliert werden müssen. Das mag auch der Grund dafür sein, daß diese antivirale Wirkung - indirekt an einem Interferontiter gemessen - bisher bei eukaryotischer tRNS nicht beschrieben wurde. Darüberhinaus spielt offenbar eine hohe Reinheit der tRNS für die antivirale Wirkung eine wichtige Rolle. Eine Toxizität dieser tRNS konnte im Mäuseversuch auch bei der mehrtausendfachen Konzentration des Wirksamkeitsbereiches nicht festgestellt werden.
Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung aktiver tRNA kommen neben der vorzugsweise verwendeten Hefen (insbesondere verschiedene Bier- und Bäckerhefen) auch Pilzmycele (z.B. von Aspergillus niger) sowie Säugetierleber infrage.
Als Anwendungsbereich für die erfindungsgemäßen Präparate kommen alle virusbedingten Erkrankungen infrage, beispielsweise Erkältung, Grippe, Masern, Röteln, Herpes, Encephalitiden, Polyomyelitia aber auch durch Viren bedingte Krebsarten· Dabei ist nicht nur eine Anwendung in der Human-, - ' sondern auch in der Veterinärmedizin möglich. Die anzu wendende Einzeldosis liegt je nach zu behandelndem Patienten bzw. zu bekämpfenden Virus zwischen 1-150 mg, vorzugsweise 10-15 mg. Die Applikation geschieht vorzugsweise direkt auf die befallenen oralen bzw. nasalen Membranen, vorzugsweise mittels eines (z.B. wäßrigen) Sprays oder in Form einer Lösung oder Salbe (topische Anwendung), aber auch die Anwendung durch Injektion ist möglich. Es ist auch möglich, der tRNA Adjuvantien, wie beispielsweise methyliertes Albumin, Protaminsulfat, Neomycin, Streptomycin, Lysozym, DEAE-Dextran oder Arginin zwecks Wirkungsverstärkung zuzusetzen· Die Dosierung dieser Adjuvantien erfolgt etwa 100 mal höher als die der tRNA.
. - 8 -
Experimenteller Tell Â* Herstellung von tRNA aus Hefe
Beispiel ls Gewinnung aus Bierhefe der Kronenbourg-Brauerei, Straßburg
Die Gewinnung der Roh-tRNA erfolgte in Anlehnung an die Vorschrift von R.W. Holley in Methods in Enzymology, Bd· XII ,a, S. 596.
_ 11 Kilogramm Hefe werden in 11 1 88-tigern Phenol und 25 1 desto Wasser suspendiert (rühren mit Glasstab und Rührmotor) . Das Gemisch bleibt bei etwa 20 bis 25°C bis zur Phasentrennung stehen. Diese ist normalerweise nach 7 bis 10 Tagen erreicht. Die obere wäßrige Phase wird abgehebert und erneut mit 1 1 88-%igen Phenol gemischt und über Nacht stehengelassen. Darauf wird der klare gelbliche Überstand (wäßrige Phase) abgehebert. Er wird mit 150 ml einer zotigen Kaliumacetatlösung pH 5,2 gemischt, anschließend wird mit 32 1 96 tigern Äthanol gefällt. Nach 24 Stunden wird der klare Uberstand abgesaugt und verworfen. Die den Niederschlag enthaltende Suspension wird zentrifugiert und mit ein wenig Äthanol gewaschen. Der gelblich-braune Niederschlag wird danach in 2,3 1 w 0,1M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst. Der klare Überstand wird abge hebert und gesammelt.
In der Zwischenzeit wurden 190 g DEAE-Cellulose (normal) mit 1 Liter 0,1M NaOH behandelt (nicht länger als 20 Minuten), mit dest. Wasser gewaschen (2-fach destilliert, frisch) und anschließend mit 1 Liter 0,1M HCl behandelt. Die DEAE-Cellu-lose wird darauf mit dest, Wasser und mit 4 Liter Puffer Tris-HCl 0,1M pH 7,5 gewaschen. Die so vorbereitete Cellulose wird in eine Glassäule (8x40 cm) eingefüllt. Auf diese Säule wird die obige RNS-Lösung (2,3 Liter) gegeben« Hierbei werden die Ribonucleinsäuren adsorbiert. Das Eluat wird verworfen und die Säule mit 20 Liter 0,1M Tris Puffer pH 7,5 gewaschen.
* - 9 -
Auch dieses Eluat wird verworfen· Anschließend werden die Nucleinsäuren mit 5 Liter eines 0,1M Tris Puffer pH 7,5» der IM an NaCl ist, eluiert. Das Eluat wird mit 10 Liter 96-%igen Äthanol versetzt und Uber Nacht stehengelassen· Am nächsten Morgen wird der Überstand abgehebert und verworfen, das Präzipitat wird zentrifugiert und mit 500 ml 80-tigern sowie anschließend mit 500 ml 96-%igem Äthanol gewaschen· Die Ausbeute an tRNA beträgt nach der Gefriertrocknung etwa 12 g ·
Bei sämtlichen Arbeiten ist darauf zu achten, daß unter i sterilen Bedingungen gearbeitet wird.
Nach der vorstehenden Vorschrift wurde ferner auch ein t-RNA-Präparat aus Bäckerhefe der Société Industrielle de Levure "Fala" (rue St. Nazaire, Straßburg) hergestellt.
B. Charakterisierung der tRNA-Fraktion durch physiko-chemische Methoden (aus Kronenbourg-Bierhefe) 1) Säulenchromatographisches Verhalten:
Chromatographie an Sephadex G 100 (s. Determann, Gelchromatographie, Springerverlag 1967, Seite 72) ergab
Kd-Werte von 0,35 - 0,37 2) UV-Absorption
Der Wert für die Relation des Absorptionsgrades beim Adsorptionsmaximum (258 nm) bzw. beim Absorptionsminimum (280 nm) A258 A280 beträgt 2,09 (Literatur ca. 2,0) « - 10 - 3) Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese wurde nach J. Gangloff, G· Keith, J.P· Ebel und G Dirheimer, Biochim.Biophyl.Acta 259» 210-222 und zwar Seite 212 (1972) in Polyamid-Gel (12 %, 7 molar Harnstoff, pH 8,1) ausgeführt· Die Vermessung der Ionen erfolgte ohne Anfärbung im UV* 4) Hyperchromizität
Die Hyperchromizität, d.h. Zunahme des Absorptionsgrades infolge der Lösung von Wasserstoffbindungen in der Poly-nucleotid-Doppelhelix bei Temperaturerhöhung wurde nach "Methods in Enzymology" Band XII, Teil B, (1968, L. Grossman, K. Moldave Academie Press) Seite 247 bestimmt, Als Lösungsmittel diente 0,01M Kakodylatpuffer (pH 7)» der 0,01M an MgClg war.
Die Zunahme des Absorptionsgrades bei 260 nm betrug beim Erwärmen auf 100° 31%.
5) Schmelzpunkt
Der "Schmelzpunkt" als Wendepunkt der S-förmigen Kurve für die Funktion Absorptionsgrad (260 nm)/Temperatur (s.
, Methods in Enzymology, Band XII, Teil B, 1968,
LoGrossman, K. Moldave Academie Press, S. 194) ergab einen mittleren Wert von 71°C.
Als Lösungsmittel diente wiederum 0,01M Kakodylatpuffer (pH 7) der 0,01M an MgClg war, 6) Totalhydrolyse (Basenzusammensetzung)
Die Totalhydrolyse und Bestimmung der Nucleoside wurde nach J. Gangloff, G, Keith, J,P, Ebel und G Dirheimer, Biochim· Biophys. Acta, 259, 198-209 und zwar Seite 201 (1972) vorgenommen. Folgende Werte wurden erhalten: » « - 11 - Αχ) - 21 % U - 16,5 % G - 31 % C - 26 % Y - 4 % T - 1,7 % ) Abkürzungen nach Eur. J. Biochea. 15, 203 (1970) 7) Beladung mit Aminosäuren
Die Methode ist bei G. Dirheiaer und J.P. Ebel, Bull.Soc. Chim. Biol. 49, 1679-1687 und zwar Seite 1681 (1967) beschrieben. Als Aminosäuren wurden [^C]-Alanin und C]-Valin verwendet. Die Beladung ergab für
Alanin 4 %
Valin 14 % C. Bestimmung der antiviralen Wirkung w1 Für die im folgenden beschriebenen Versuche wurden z.T. als
Vergleichs-Präparat Poly I:C (Miles) herangezogen.
1) Hemmung einer Sindbis-Virus-Infektion in der Maus 2 bzw. lO/zg der Testsubstanz werden in 0,2 ml Puffer jeweils 5 Mäusen (0F-1/IFFA'CREDO) i.v. appliziert. Als Vergleichssubstanz dient das gut untersuchte - aber z.T. toxische - synthetische Polynukleotid Poly IîC. Die Kontrolle besteht aus einer i.v. Gabe von 0,2 ml Pufferlösung.
Die Mäuse erhalten 24 Stunden später eine definierte Menge an Sindbis Virus (RNS-Virus der Arbogruppe) in 0,25 ml PBS-Puffer intraperitoneal appliziert.
% 4 - 12 - nach weiteren 24 Std. werden die Mäuse dekapitierty das gepoolte Serum schrittweise verdünnt und in der Gewebekultur (Hühnerfibroblasten) auf noch vorhandene Viren getestet.
So kann durch Vorbehandlung mit 2 ug Testsubstanz der Virämietiter z.B. von 1:100000 (Viruskontrolle ohne t-RNS-Gabe) auf 1:80 vermindert werden (in der gleichen Größenordnung liegt die Vergleichssubstanz Poly I:C). Analoge Ergebnisse konnten in zahlreichen Experimenten reproduziert werden.
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Interessant ist, daß auch die reine t-RNS-^ mit 10 μ g/Maus den Virustiter von 1:5000 auf 1/200 reduzieren kann. Ein definiertes 22er Polynucleotidbruchstück hiervon zeigt mit einer Verminderung der Virämie von 1/5000 auf 1/500 ebenfalls noch eine Wirkung.
Methoden
Virus:
Jungen Mäusen im Alter von 2 bis 6 Tagen wird intracerebral ein Tropfen einer Sindbis-Virus-Suspension AR 339 mit dem Titer 10^ PFU/ml verabreicht. Nach 42 Stunden entnimmt man das Gehirn der überlebenden Tiere, das Organmaterial wird bei 4° in einer Salzlösung nach J.H. Hanks und R.P. Wallace. Proc.Soc.Exptl.Biol.Med. 71/S. 196-200 (1949)» steril zerrieben (5 ml Lösung für 4 Mäusegehime) und die erhaltene Suspension wird in verschmolzenen Ampullen bei 4° aufbewahrt.
Zellkultur:
Man bereitet eine Suspension von 10^ Hühnerembryo-Fibroblasten pro ml einer Salzlösung nach J.H. Hanks und R.E. Wallace, Proc.Soc.Exptl.Biol.Med. 71/S. 196-200 (1949), der 0,5 % Lactalbuminhydrolysat, 0,1 % Hefeextrakt, 10 % Kalbsserum, 200 Einheiten Penicillin und 50 mg Streptomycin zugesetzt sind. Je 5 ml dieser Suspension # Μ « - 13 - werden in Petrischalen von 7 cm Durchmesser gebracht und diese in geschlossenen Behältern unter 10 % (^-Atmosphäre bei 37° im Wärmeschrank gehalten. Nach 48 Std. erhält man in den Schalen eine geschlossene monozelluläre Schicht.
2) In vitro-Test mit Vesicular Stomatitis Virus (VSV)-infizierten Fibroblasten; Messung der Hemmung der Plaques-Bildung durch Serum von Mäusen, die mit einer ____-________
In einer weiteren Versuchsanordnung erhalten Mäuse die w Testsubstanz i.v. appliziert. Nach 24 Std. wird Serum gewonnen und in V er dünnungsreihen seine antivirale Wirkung im System Fibroblastenzellkultur/VSV ermittelt· Es handelt sich hierbei um eine klassische Versuchsanordnung zum Nachweis einer Interferonbildung· Je größer der Titer ist desto wirksamer ist eine Substanz. 2 μ g t-RNS ergeben Titer von etwa 1:160, 50 g von ca. 1:2560·
Methoden Mäuse:
Es werden 1 Monat alte Mäuse von Stamm OF-^, IFFA-CREDO (Frankreich), frei von pathogenen Keimen, verwendet.
' Die Prüf Substanzen werden in einem Volumen von 0,2 ml
Salzlösung nach R. Earle (J. Natl. Cancer Instit. 4/S.
165 - 212 (1943) in die Schwanzvene injiziert* Nach 24 Std. werden die Tiere getötet und entblutet; für die Interferontitration wird das Serum verwendet·
Titration des Interferons:
Zu der Zellkultur gibt man 4 ml einer passenden Verdünnung (bezogen auf den potentiellen Interferongehalt) des gewonnenen Mäuseserums und inkubiert unter COg-Atmosphäre 16-18 Std. Nun gibt man eine solche Verdünnung der Virue-kultur zu, die eine gequem ablesbare Anzahl von Plaques (50-100) ergibt, hält weitere 48 Std. unter C02 bei 37° 4 4 - 14 - und zählt nach Anfärbung mit Neutralrot die Plaques aus. Der Interferontiter wird als Verdünnung des Serums angegeben, mit der eine Verminderung der Zahl der Plaques auf 50 % erreicht wird.
3· ln vivo-Untersuchungen zur antiviralen Wirkung von t-RNS in der Maus gegen Herpes-Virus Lennette P 381
Je Maus werden 100 /ig in 0,2 ml Puffer i.v. appliziert.
Bei der Kontrolle werden nur 0,2 ml PBS injiziert.
^ 18 Std. danach erhalten alle Tiere 1-2x10^ Herpes-Viren
Lennette P 381 i.p·· Zu diesem Zeitpunkt sind alle Mäuse gesund.
Tag 0 Tiere ohne Lähmungen/Gesamtzahl
Kontrolle 26 / 26 t-RNS 27 / 27 12 Tage später ergab sich das folgende Bild:
Tag 12 Tiere ohne Lähmungen/Gesamtzahl w Kontrolle 7 / 26 (27 %) t-RNS 13 / 27 (48 %)
Nach diesen Ergebnissen besitzt die t-RNS eine protektive Wirkung im Hinblick auf das virale Krankheitsbild "Lähmungen*1 ·
Methoden Mäuse: NMRI-Mäuse, 3-4 Wochen alt Virus:
Herpes-Virus Lennette P 381 (Maus-adaptiert, führt zu charakteristischen Lähmungserscheinungen der Extremitäten).
< «
«I
- 15 - D, Toxizität 2 Monate alten Mäuse vom Stamm OF^, IFFA-CREDO (Frankreich) wurden Mengen zwischen 20 und lOO^g unter den gleichen Bedingungen verabreicht, wie sie im in vivo-Aktivitätstest angewandt wurden· Die anschließende Infektion mit einem Virus-präparat unterblieb· In zwei Versuchsreihen überlebten alle Versuchstiere.
Ferner wurden sowohl im Serum als im Plasma mit Hilfe des ! Technicon 10/60-Autoanalyzers folgende Bestimmungen ausge führt ;
Ca ++9 Phosphat, Glukose, Harnstoff, Harnsäure, Cholesterin» Protein, Albumin, Bilirubin, Kreatin, alk· Phosphates·, Milchsäuredehydrogenase.
Es ergaben sich keine Abweichungen von der Norm· Bei der i.v. Applikation von 0,5 mg/kg beim Hund wurden nach einmaliger bzw. siChstägiger Gabe nur eine vorübergehende Zunahme der Transaminasen und Abnahme der Leukozyten beobachtet· Die Serum-Elektrophorese zeigt ebensowenig Veränderungen der Proteinfraktionen wie die Messungen der übrigen Hämatologie, Körpertemperatur, Körpergewicht und Futterverbrauch· 1 , E. Beispiele für die Anwendung der erfindungsgemäßen t-RNA-Präparate am Menschen: 1) Oral-nasales Präparat
Ein wirksames Präparat zur Vorbeugung gegen bronchial angreifende Viren kann wie folgt hergestellt werden: 0,2 g der gemäß dem oben geschilderten Verfahren isolierten t-RWA werden vor Gebrauch in 20 ml sterilisiertem dest· Wasser (Trockenampulle) oder üblicher Nasentropfen-Flüssigkeit (dest· Vasser das in geringem Maße Reduktionsmittel und Komplexbildner ent- * « - 16 - hält) gelöst· Hiervon wird eine Dosis von 20-50 mg (d.h. etwa 1-5 ml) alle 2-3 Tage mittels einer Pipette oder mittels eines üblichen Verneblers auf die gefährdeten Membranen (beispielsweise die Nasenschleimhaut) aufgebracht. Als Trägerflüssigkeit kann auch 0,15 m Phosphatpuffer vom pH 7,2 angewandt werden.
Es ist ferner möglich, die t-RNA zu suspendieren und mittels eines Dosieraerosols direkt auf die gefährde-.j ten Membranen aufzusprühen· Auch dieses Präparat kann,
Je nach Anweisung des behandelnden Arztes, etwa alle 2-3 Tage angewendet werden.
2) Injektionspräparat
Die tRNA wird zur Herstellung eines derartigen Präparates in einem üblichen Träger, z.B. Sesamöl suspendiert bzw. gelöst. Die Konzentration beträgt zweckmäßigerweise 10 - 50 mg pro ml. Die Abfüllung erfolgt in der üblichen Weise durch Einfüllen in steril gehaltene Glasampullen und anschließendes Einschmelzen.
♦ w 3) Injektionspräparat für i.v. Anwendung
Die in Trockenampullen abgefüllte lyophilisierte tRNA wird vor Gebrauch in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und anschließend injiziert. Konzentration wie bei 2).
4. Augenpräparat
Hier verwendet man um eine Reizung des Bindehautgewebes möglichst zu vermeiden am besten eine ölige Suspension, beispielsweise Erdnußöl. Die Konzentration sollte so hoch sein, daß mittels 1-2 Tropfen die erforderliche Dosis, d.h. ca. 20 - 50 mg, in das Auge eingebracht werden kann.
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X
- 17 - 5) Hautpräparat Für die Behandlung wund gewordener Hautstellen kann man die tRNA in übliche Salbengrundlagen bzw. Lotions einarbeiten, wobei die Konzentration zweckmäßig 1 - 150 mg pro 1 g Grundmasse betragen soll· Die Anwendung erfolgt regelmäßig alle 1-2 Tage nach Anweisung des behandelnden < Arztes.
«

Claims (8)

1. Präparat mit antiviraler Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß es neben üblichen pharmazeutischen Hilfs- und/oder Zusatzstoffen eukaryotische t-RNA . als Wirkstoff enthält.
2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die tRNA aus Hefe stammt.
3. Präparat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die tRNA aus Bierhefe der Kronenbourg-Brauerei isoliert wurde.
4. Präparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Nasenspray mit eukaryotischer t-RNA als Wirkstoff handelt.
5. Präparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine topisch — * anwendbare Lösung oder Salbe mit eukaryotischer t-RNA als Wirkstoff handelt.
6. Präparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Injektionslösung mit eukaryotischer t-RNA als Wirkstoff handelt.
7. Verfahren zur Herstellung eines Präparates nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die , tRNA zusammen mit üblichen pharmazeutischen Hilfs- und/oder Zusatzstoffen zu an sich bekannten pharmazeutischen Anwendungsformen verarbeitet wird. - 3 - < ί
8. Verfahren zur Bekämpfung viraler Infekte, dadurch gekennzeichnet, daß ein Präparat gemäß den Ansprüchen 1, 2 oder 3 auf die gefährdete Membran des menschlichen oder tierischen Organismus aufgebracht oder injiziert wird. e Λ »
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