LU85953A1

LU85953A1 - Compose antibiotique antitumoral

Info

Publication number: LU85953A1
Application number: LU85953A
Authority: LU
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1984-06-18
Filing date: 1985-06-17
Publication date: 1986-01-24
Also published as: IE58629B1; NL8501708A; FI852082A0; SE464524B; KR860000382A; GB8515256D0; GB2160529A; DK272985D0; KR930003107B1; IT8521156A0; AT395860B; JPH0158200B2; IE851504L; PT80656B; BE902670A; FI80475B; JPS6122099A; US4582639A; CA1230568A; AU584075B2

Description

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; Γ. K S GRAXD-DUCHÉ DE LUXEMBOURG

H fc« " HD i J “ »> %r- ^ I ' ||,π^- j -, I du .17 iuin. l“3.5_________ * '*SIl? Monsieur le Ministre ί 1 I ^ t||p§ib de l’Économie et des Classes Moyennes J “ ........................................ Service de la Propriété Intellectuelle

| * ’ ~ ' LUXEMBOURG

| Demande de Brevet d’invention I. Requête ..I»a....aoaiéfc.é. ..dik&i.....BRISYQL-YYEBS......C0YBAL7Y.,... 3A 5 Park...Avenus.,.....A........... (l) ..IJÉM-XO.SI1,.....îî.Y. lois4,.....Etats-Unis.. z ’imérique,......représentée................................

...p.ar....MQnsienr.,,.Jacmi.es..,.de..-.Mii.v.ser.,.....agissant! sr. qualité.....da....iaan.rr....... (2) ...âataire...................................................................................................................................................................................................................................................

déposent) ce.......dix-sept...j.uln.....lS.oo ..quatre-vincTt-ainq.................................. (3) à.......15.............. heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg : 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: ....".CoTiposé... antibiotique antifcirnoral??-»...................................................................... .......................—— (4) % . ·.· ; 2. la délégation de pouvoir, datée de . .. .IvEi*7-YQSK,... K-le ........12 ... juiïl....l9L8.5___ '* 3. la description en langue________________française................. de l’invention en deux exemplaires; 4........././...............planches de dessin, en deux exemplaires; 5. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le.......14.....juin.. .1.9.35................................................................................................................................................................................................................

............................................................ .......................................................................................................... ............................................................................................. (S) revendiquant) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demanae(s) de (6).................................brevet....................................déposée(s) ¢)/ (7) ...aux ...Etats-Unis d ’Amérique...............

le........1S.....juin. .1934...........(Na......621...641)..........................................................................................................................1.......... (8) au nom de _g iuveateur-S·—................................................................................................................................................................................. (9) ή nr»; i t ta elittelisentj·pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg...................................

•35-, bld.—Eopal.......................................................................................................................................................................................—.....................(10) (sollicïte(nt) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’obi et décrit et représenté dans les annexejjp susmentionnées, — avec ajournement de cette délivrance à___________________________________________________mois. (11) \ Le ..mandataire-X.............!.._______| , ^.......a II. Procès-verbal de Dépôt -· La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des > Ciasses Moyennes, Service de la Propriété Intellectuelle à Luxembourg, en date du : -·- y— ?..> ; '·», ··.”'···. v< \ Pr. le Ministre à 15 heures t ~ t * de l’Économie e*des Classes Moveimes ....................... l; /h/· ‘ pp./^MfVr' ΛΤίΟΚΙ nu f A ρΡΐί~»ΡΠΧ fil— i t_ s 'i U f i ï w* ; v Î-" û. 1—Â*"A i i\ i ; ·. ; ί i_

- jy· de ia demande ce brevsx / àv/mûé&4>6lVii.‘W

K^JJ' M Aux ETATS-UNIS D'AMERIQUE

, * Du 18 juin 1984

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Mémoire Descriptif *k déposé à l'appui d'une demande de

BREVET D’INVENTION

au \ y r Luxembourg ß au nom de : bristol-myers company pour: "Composé antibiotique antitumoral".

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MÉMOIRE DESCRIPTIF

DÉPDSÉ A L’APPUI D'UNE DEMANDE DE

BREVET D’INVENTION

FORMÉE PAR

Y

BRISTOL-MYERS COMPANY pour

Composé antibiotique antitumoral

Aperçu de l'invention « L'invention concerne un nouvel antibiotique t cyclique depsipeptidique antitumoral dit sandramycine et sa

- préparation par fermentation de la souche C49,009, ATCC

394IS de l'espece Nocardioides, qui est un nouveau micro-organisme, de même que les compositions pharmaceutiques contenant le nouvel antibiotique antitumoral et des pro-

uT

i cédés d'application de cet antibiotique antitumoral comme agent antimicrobien et antitumoral. L'invention concerne aussi le nouveau micro-organisme lui-même qui est utilisé pour produire la sandramvcine par fermentation.

Généralités

Le brevet EUA 4.360.458 du 23 novembre 1982 (Koshiyama et al.), décrit un complexe antibactérien antitumoral dit BBM-928 et sa production par fermentation d'une nouvelle souche d'actinomycète dite souche G-455-101 (ATCC 31491) qu'une détermination ultérieure a révélée être une nouvelle espèce du genre Actinomadura * et qui a été appelée Actinomadura luzonensis nov. sp.

^ « [ voir J. Antibiotics, 33(10), 1098-1102 (1980)].

r La production, l'isolement, la caractérisa tion et l'activité antitumorale des composants du BBM-928 sont décrits dans J. Antibiotics, 33(10), 1087-1097 (1980). Les structures des BBM-928A, B, C et D (appelés à présent luzopeptinesA, B, C et D, respectivement )f qui sont les composants majeurs du complexe BBM-928,sont décrites dans le brevet EUA 4.451.456 du 29 mai 1984 (Koshiyama et al. ) , et sont explicitées par les formules

H3C Crij CH, H3Ç Ç-OH

D CO-NH-CH2-CO-N-CH2-CO-N-CH L p3 CD-NH-CH-CO-N^N^ORi CO (Γ\

ηοίΛ CH2 Ô W

(/ r2 T N \

V=C Ç p-K ÇH2 Y-ä-OK

i CO R20rJs^K-C0-CH-NH-C0 V L, L CH-N-C0-CK2-K-C0-CH2-NH-CÔ £ 0CH= - » 1 1 HO-C CK3 CH3 h3c CH» / - 1 - « » *1 R2

Luzopeptine A -COCH, -COCH,

B -COCHg K J

"CH H

D -COCH.CH -COCH

Z V J

Les luzopeptines A, B, C et D contiennent un radical d'acide 3-hydroxy-6-méthoxyquinaldique comme Chromophore et un radical d'acide 4-hydroxy~2,3,4,5-tétrahydropyri-dazine-3-carboxylique dont le degré d'acétylation du radical hydroxyle fait la différence de structure entre ces composés.

Description détaillée de l'invention L'invention a pour objet un nouvel antibio-j tique antitumoral depsipeptidique cyclique dit sandra- I mycine répondant à la formule CH, CH, V/ ÇH, ÇH,|

CO OH CO-NHCH,-CO-N-CH,-CO-N-ÇH

nh-ch-co-n^^N 9° f' O ^ \

L O-CO-éH-NH

CH~N“CO-CHrN-CO-CH2NH-CO μο ([0 I CH, CH, Λ_/

CH, SCK, H

O

i j de même que le procédé pour le préparer, l'isoler et le * purifier jusqu'à l'état sensiblement pur.

Le nouvel antibiotique sandrarr-ycine est obtenu par fermentation d'un nouveau micro—c-rrsnisme classifié prcvisoirement comme étant une esrèce :u renre Nocardioides, / j I « kf· à par accumulation de la sandramycine produite par ce micro- _ organisme et par collecte de la sandramycine hors du bouillon de culture. Un micro-organisme producteur de sandramycine qui est préféré est Nocardioides sp. souche C4S,00S isolée d'un écnantillon de terre recueilli au Mexique, outre ses mutants. Cette souche a été déposée à l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland sous le n° ATCC 39419.

Le micro-organisme

Une description générale du micro-organisme préféré pour la production de l'antibiotique antitumoral sandramycine est donnée ci-après.

z Morphologie

La souche C49 .009 forme du mycélium en substrat et du mycélium aérien (largeur de 0,4 ^um) et le mycélium en substrat est long, bien ramifié et fragmenté en filaments courts ou bâtonnets après une semaine. La souche C49.009 tend à perdre son aptitude à former du mycélium aérien lorsque la culture est poursuivie. Les hyphes du mycélium aérien sont peu ramifiés. Les observations microscopiques montrent que les hyphes aériens sont plus ou moins en zigzag au début et se développent en longues chaînes droites ou segments cylindriques ayant un aspect d'arthrospore (0,5 x 1 à r\J 3 ^um), qui sont séparés plus tard par des hyphes translucides. La surface des segments avant un aspect de spores est lisse. La souche C49 .009 est Gram-positive et n'a pas le caractère acido-résistant. On n'observe pas de sporanges, de spores mobiles ni de sclérotes.

s Composition de la paroi cellulaire et sucres constitutifs de la cellule comolete J - ï- La paroi cellulaire de la souche C49.009 contient de l'acide LL—diaminopimeiigue et de la glycine comme srr.i-noacidescaractéristiques constitutifs de la paroi cellulaire suivant les nerhoôes décrites par E. Becker et al.

/ __ r jjf I * dans Appl. Microbiol. , 13 , 236-243 (1965) et T. Yamaguchi , dans J. Bacteriol., 89, 441-453 (1965). L'hydrolysat de cellule entière révèle la présence de glucose, de mannose et de ribose, mais est exempt de tout sucre diagnostic tel que détermine comme décrit par M.P. L-echevalier et al. dans Biol. Actinomycètes Related Organisms, 11, 78-92 (1976). La composition de la paroi cellulaire et les sucres constitutifs de la cellule complète précités indiquent que la souche C49.009 est une espèce d'actinomycète dont la paroi cellulaire est du type I.

Caractéristiques de culture et de physiologie La souche C49.009 est un actinomycète aérobie obliga-^ toire qui croît bien dans la plupart des milieux des criptifs. Le mycélium aérien est formé en abondance ou avec modération sur les milieux ISP No 3, 5 et 7 et sur la gélose au saccharose et au nitrate de Czapek, mais faiblement sur des milieux organiques très nutritifs comme les milieux ISP No 2 et 6 ou la gélose de Bennett. Le mycélium aérien est blanc. Un pigment mélanoïde ou autre pigment distinct n'est produit dans aucun des milieux descriptifs examinés jusqu'à présent. La couleur de l'envers du mycélium végétatif est uniquement jaunâtre. La souche manifeste une croissance optimale à 28°C, modérée à 15°C et 37°C et nulle à 5°C et 45°C. La gélatine et l’amidon sont décomposés. La réaction à la tyrosinase est négative. La croissance est inhibée en présence de 1% de NaCl ou de 0,01% de lyzosyme. Les caractéristiques de culture - et de physiologie de la souche C4S,009 sont détaillées aux tableaux 1 et 2 respectivement. La souche C49,009 utilise la plupart des sucres pour sa croissance et l'utilisation des sources de carbone est détaillée au tableau 3.

/

P

m· ft. * * * TABLEAU 1

Caractéristiques äe culture de la souche C49.009* * *

Bouillon à l'extrait de C: modérée, floconneuse, levure et tryptone faibles sédiments jaunes (ISP No 1) D: néant Gélose au saccharose et C: abondante au nitrate (gélose de R: blanc jaunâtre (92)*** à

Czapek) jaune grisâtre foncé (91) A: modéré, blanc (263) D: modéré, jaune (87) Gélose au glucose et à C: médiocre l'asparagine R* blanc jaunâtre (92) a jaune pâle (89) A : médiocre, blanc (263) D: néant Gélose au glycérol et à C: modérée l'asparagine (ISP No 5) K: jaune clair (86) à jaune modéré (87) A: modéré, blanc (263) p: néant Gélose aux sels inorgani- modérée ques et à l'amidon P* jaune pâle (89) à jaune (ISP No 4) modéré 187} A: médiocre,blanc (263) p: néant Gélose a la tyrosine C* abon,. «r. - - (ISP No 7) R* 3aune pale (85) à jaune * foncé (88) A: modéré, blanc (263) \ p: néant . c: modérée

Gelose nutritive u p: jaune pale (85) » ï I 1 2 3 A: modéré, blanc (263) D: néant Gélose à l'extrait de C: abondante levure et extrait de K: jaune pâle (89) à jaune - ‘ malt (ISP No 2) modéré (87) A: médiocre, blanc (263) D: néant Gélose a la farine C: modérée d'avoine (ISP No 3) R: blanc jaunâtre (92) à jaune modéré (87) A: modéré, blanc (263) D: néant v- Gélose de Bennett C: modérée R: jaune pâle (89) à jaune foncé (88) A: rare à médiore, blanc (263) D: néant Gélose à la peptone, C: médiocre extrait de levure et R: jaune orangé pâle (73) à fer (ISP No 6) jaune orangé clair (70) A: rare, blanc (263) D: néant i

observées après 3 semaines d'incubation à 28°C

2 abréviations : C = croissance, R = couleur du revers, A = mycélium aérien, D = pigment diffusible 3 la couleur et l'indice numérique entre parenthèses sont conformes a l'échelle cclorimétrique dans "Kelly, K.L. et B.B. Judd: ISCC-NBS color-name charts illustrated with Centroid Colors. U.S. Dept. of Coiîiro. Cir. 553, Washington, E.C. Nov 1975".

V

f is TABLEAU 2

Caractéristiques de physiologie de la souche C49.009 Epreuve Réponse Méthode ou milieu

Intervalle de tem- croissance maximale gélose de Bennett pérature de crois- à 28°C, croissance sance modérée à 15 et 37°C.

Croissance nulle à 5 et 45eC

Liquéfaction de liquéfiée 1% d'extrait de la gélatine malt, 0,4% d'ex trait de levure, 0,4% de glucose, 20% de gélatine

Hydrolyse de hydrolyse gélose à l'amidon 11 amidon Réactions dans coagulation lait écrémé Difco le lait écrémé

Formation de négative gélose à la tyro- pigment mêla- sine, gélose à la noïde peptone , extrait de levure et fer et bouillon à la rryptone et extrait de levure Réaction à la négative méthode d'Arai* tyrcsinase Réduction des négative bouillon au sacchs- * nitrates rose et nitrate de

Czapek / i * f 1 1 TABLEAU 2 (suite)

Epreuve Réponse Méthode ou milieu Réduction des .négative 0,5% d'extrait de nitrates levure, 1% de glu cose, 0,55b de KNO^ , 0,1% de CaCC>3

Tolérance au pH croissance de pH gélose à l'extrait 5,0 à 10,5. Pas de de levure et extrait croissance à pH 4,5 de malt

Tolérance au NaCl croissance à 5% de milieu de base: 1%

NaCl ou moins. Pas d'extrait de levure, de croissance à 7% 2% d'amidon soluble, de NaCl 1,5% de gélose

Tolérance au sensible, mais par- bouillon au trypti- lyzozyme tiellement résis- case soya plus tante (croissance 1,5% de gélose de quelques colonies à 0,01% de lyzozyme)

Arai, T. et Y. Mikami, "Chromogenicity of Streptomyces".

Appl. Microbiol.. 23, 402-406 (1972) TABLEAU 3

Utilisation des hydrates de carbone par la souche C49.009

Glvcérol + D(-)-Arabinose + x r L(+)-Arabinose — D-Xylose + D-Ribose -f L-Rhamnose + D-Gluccse + 5 TABLEAU 3 (suite) D-Galactose + D-Fructose + D-Mannose + L(-)-Sorbose

Saccharose +

Lactose +

Gellobiose + Mélibiose +

Tréhalose +

Raffinose + D(+)-Mélézitose +

Amidon soluble +

Cellulose r

Dulcitol r

Inositol + D-Mannitol + D-Sorbitol

Salicine

Observation après 3 semaines d'incubation à 28°C. Milieu de base: milieu inorganique de Pridham-Gottlieb Abréviations +: utilisation positive, utilisation négative

Taxonomie -

La souche C49.0Û3 est caractérisée par une réaction Gram-positive, sa nature non acido-résistante, la fragmentation du mycélium aérien, la forma tion d'un mycélium aérien blanc, la segmentation en * - aspect d'arthrospore dans les parties entières du my célium aérien et l'inaptitude à former un pigment distinct quelconque. Ces caractéristiques, conjointement avec la présence de l'acide LL-ciaminopiméiique et de la glycine, mais l'absence de sucre diagnostic dans / / ! * la paroi cellulaire, font appartenir la souche C49.009 au genre Nocardioides [H. Prauser, Intl. J. Syst. Bac-teriol., 26_, 58-65 (1976)]. La souche C49.009 se différencie des actinomycètes nocardioformes formant un mycélium aérien, notamment Kocardiopsis dassonvillei. Saccharopolyspora hirsuta et toutes les espèces hétérologues du genre Nocardia par les aminoacides et sucres diagnostics de la paroi cellulaire et par les propriétés physiologiques diagnostiques comme décrit par R.E. Gordon et al.. J. Gen. Microbiol. . 109 . 69-78 (1978) et comme illustré au tableau 4. La souche C49.009 se différencie en outre du genre Streptomyces par sa mor-„ phologie sporogène du type des nocardias, par exemple ; les hyphes du substrat de la souche C49.009 se fragmen tent en filaments courts ou bâtonnets. Des segments à aspect d'arthrospore de la souche C49.009 sont discernables des spores de Streptomyces par le site de formation, l'agencement de la gaine de l'hyphe et l'absence de paroi distincte des spores.

TABLEAU 4

Caractéristiques physiologiques diagnostiques de la souche C49 .009

Acido-résistance - Décomposition de:

Adénine

Caséine +

Hypoxanthine

Tyrosine +

Urée ί Xanthine Résistance à:

Ly z or y me -

Rifampicine + I * ί I s

Hydrolyse de:

Esculine +

Hippurate +

Amidon ' +

Acide à partir de: D(-)-Arabinose + L(+)-Arabinose

Erythritol

Glucose +

Inositol +

Lactose + D-Mélézitose + Mélibiose +

Methy loc-glucoside t Raffinose +

Utilisation de:

Benzoate

Citrate +

Muçate

Succinate +

Tartrate

Nitrite à partir de nitrate Survie à 50°C, 8 heures

Abréviations + : caractéristique positive, -: caractéristique négative Le profil de sensibilité à une série de phages spécifiques du taxon fait la différence entre les souches - du genre Nocardioides et les genres apparentés comme

Streptomyces ou Nocardia [voir H. Prauser: Host-phage v relationsnips in nocardioform organisms, dans "The

Biology of rhe Kocardiae", Edit. E. Gcccf ellcv» et al. , Londres, New York et San Francisco, Academie Press •1 t m- » (1976)]. La sensibilité de la souche C49.009 à ces actinophages n'a pas été examinée parce que ces phages n'étaient pas disponibles pour la Demanderesse. Sur base des caractéristiques de culture et de physiologie, les 17 souches du genre Kocardioides qui ont été isolées d'échantillons de terre recueillis dans différents endroits du monde ont été rassemblées en une espèce unique Nocardioides albus. La souche C49.009 diffère de Nocardioides albus par son utilisation du L-arabinose et de l'inositol, mais est semblable à cette dernière par les caractéristiques générales de culture et de physiologie. La souche C49.009 est donc classifiée v provisoirement comme espèce du genre Nocardioides.

? Il convient d'observer que la présente inven tion n'est pas limitée à l'utilisation de la souche C49.009 particulière ou aux organismes répondant étroitement à la description ci-dessus. Il entre spécialement dans le cadre de l'invention d'utiliser d'autres souches ou mutants de cet organisme qui sont producteurs de sandramycine et qui peuvent être obtenus à partir de l'organisme décrit par des moyens connus comme l'exposition au rayonnement X ou ultraviolet, le traitement aux moutardes azotées, l'exposition à des phages, etc.

Production de 11 antibiotique La sandramycine est produite par culture de Nocardioides sp. souche C49.009 (ATCC 39415) ou d'un mutant de cette souche dans un milieu nutritif classique. L'organisme est cultivé dans un milieu nutritif contenant des sources nutritives connues, c'est-a-dire des sources assimilables de carbone et d'azote, outre des sels inorganiques facultatifs et d'autres facteurs ae croissance connus·. Les conditions d'aerobiose en submersion sont préférées pour la production de grandes quantités de l'antibiotique, mais / i c -¾.

m j des quantités limitées peuvent être produites par culture en surface et dans des flacons.

Le milieu nutritif doit contenir une ou plusieurs sources assimilables de carbone comme du glyce— roi, du glucose,.du saccharose, du mannose, du fructose, de l'amidon de maïs, du maltose, du mannitol, de la mélasse etc., sous forme purifiée ou brute. Le milieu nutritif doit contenir aussi une ou plusieurs sources assimilables d'azote, par exemple de la farine de soya, de la farine de poisson, de l'extrait de malt, de l'extrait de levure, de la peptone, de la farine de gluten, de la farine d'embryon de coton, de la farine de soya, de la farine de lin, de la farine de graines de coton, ? de la caséine, des protéines hydrolysées , des nitrates, des sels d'ammonium, de l'urée etc. Des sels inorganiques nutritifs comme du chlorure de sodium, du phosphate de potassium, du sulfate de magnésium, du carbonate de calcium et des traces de sels de métaux lourds tels que le cuivre, le zinc, le manganèse, le fer etc. peuvent être ajoutés aussi au milieu nutritif.

La température de fermentation doit se situer dans l'intervalle de 15°C à environ 37“C et de préférence d'environ 25°C à environ 30°C. Le pH du milieu de fermentation doit se situer dans l'intervalle d'environ 5 à environ 10,5 et de préférence d'environ 6 à environ 8,5. D'ordinaire, la production de la san-dramycine est optimale en environ 2 a 9 jours, suivant la température. Pour la fermentation en cuve, il est souhaitable de produire un inoculum végétatif dans un bouillon nutritif en inoculant le bouillon au moyen d'une culture inclinée ou d’une culture de terre ou » bien au moyen d'une culture lyophilisée du micro-orga- nrsme. L'inoculum actif obtenu de la sorte est ensuite transféré aseptiquement dans le milieu que contient le fermenteur.

v t 2»

Isolement de la sandramycine Au terme de la fermentation, la sandramycine est séparée du milieu de culture et isolée sous forme sensiblement pure 'par le procédé en plusieurs stades illustré au tableau de marche suivant.

Bouillon de fermentation complet (1) Extraire à l'acétate d'éthyle (2) mélanger avec de la terre de diatomées et filtrer (3) séparer les phases et évaporer i —;-1 phase aqueuse usée extrait antibiotique brut (1) extraire au méthanol aqueux et au Skellysolve B et séparer les phases

i- I

phase de Skellysolve B, phase eau-methanol (1:9) rejeter (1) diluer a l'eau rhase eau-méthanol (1:3) (ai extraire au tétrachlorure de carbone, 3 et évaporer l-1 resicu A pnase eau-methanol (1:3) I il; diluer à l'eau L- t k b y î i % phase eau-méthanol (7:13) (1) extraire au chloroforme et évaporer

. I- I

résidu B phase eau-méthanol (7:13), rejeter (1) chromatographier les résidus A et B sur colonne de terre de diatomées (2) évaporer la fraction toluénique ’1

résidu C

(1) chromatographier sur gel de silice (2) élution à gradient linéaire sandramycine (1) recristalliser 'r sandramycine purifiée » j

En l'occurrence, le bouillon complet de la fermentation de Nocardioides sp souche C49.009 est d'abord extrait à l'aide d'un solvant organique non miscible à l'eau, .qui est de préférence l'acétate d'éthyle. Un auxiliaire de filtration tel que de la Dicalite (marque déposée de la société Grefco Inc., Torrance, Ca., pour de la terre de diatomées) est de préférence ajouté au milieu d'extraction et le mélange est ensuite débarrassé des insolubles par filtration. Après filtration, la phase organique est séparée du mélange extrait et filtré et est concentrée par évaporation pour donner un extrait brut de l'antibiotique. L'extrait brut est soumis au partage entre un solvant hydrocarboné aliphatique tel que le Skellysolve B (marque déposée de la société Skelly Oil Co. pour des hexanes isomères) et environ 10% d'eau dans du méthanol. La phase aqueuse méthanolique est diluée avec un supplément d'eau et la solution résultante à environ 25% d'eau dans le méthanol est extraite à l'aide d'un solvant organique tel que le tétrachlorure de carbone. La phase aqueuse méthanolique est diluée à nouveau à l'eau et la solution résultante à environ 35% d'eau dans le méthanol est extraite à l’aide d'un solvant organique tel que le chloroforme. Les extraits dans le tétrachlorure de carbone sont rassemblés et évaporés sous vide pour donner le résidu A. Les extraits dans le chloroforme sont rassemblés et évaporés sous vide pour donner le résidu B. Les résidus A et B peuvent être mélangés et chrcmatographiés sur une colonne de terre de diatomées telle que de la Dicalite, s au moyen de solvants organiques de polarité faible à élevée. Les fractions appropriées contenant l'antibiotique sont combinées et évaporées sous vide pour donner le résidu C. Une purification plus poussée peut être réalisée par chromatographie liquide sous «- 9 * v basse pression sur une colonne de gel de silice du résidu C ou par chromatographie liquide à haute performance et moyenne pression des résidus D, D', E et E' comme décrit dans l’exemple 3 au stade C en recourant à un gradient linéaire allant du chloroforme à 5% de méthanol dans le chloroforme comme éluant. Les fractions appropriées sont évaporées à siccité pour donner la sandramycine qui est recristallisée dans un solvant approprié, conduisant ainsi à la sandramycine cristalline pure*

Structure de la sandramycine

La sandramycine est un antibiotique antitumoral depsipeptidique cyclique contenant un noyau de 3-hydroxyquinoléine comme Chromophore et une entité d'acide pipécolique. La spectroscopie et l'analyse chimique ont permis d'attribuer à la sandramycine la formule de structure /==\ CH, CH,

N \ \'H

V/ <rH>I

CO OH CO-NHCHrCO-N-CHrCO-N-CH

NH-CH-CO-hrN ÇO

t u ^ ? ? fl F*·

CO S. /h’-CO-CH-NH

• I I

CH~N-CO-CH,-N-CO-CH,NH-CO Hq L CH· CK> w

’ ci, '‘CH, y N

O

- r t

La sandramycine est un solide cristallin blanc ayant un point de fusion de 208-212°C, la formule moléculaire C60H76°16N12 et Poiâs moléculaire de 1221,3312. La sandramycine est formée de carbone, d'hydrogène, d'azote et d'oxygène.

L'analyse élémentaire est donnée cz-après:

Analyse pour cgoK76°16^12’ calculé C, 52,78, H, 6,79, N, 12,31, 0 (par différence), 28,12% trouvé C, 52,58, H, 6,27, N, 12,29, 0 (par différence), 28,86%

Le spectre de masse à haute résolution de la sandramycine a été relevé au spectromètre Kratos - MS-50 par ionisation FAB. Le spectre de masse observé est le suivant: calculé pour l'ion (M+H)+: 1221,5579 trouvé pour l'ion (M+H)+: 1221,5571.

Le spectre d'absorption infrarouge de la sandramycine dans une pastille de KBr présente des bandes caractéristiques aux fréquences ci-après exprimées en nombre d'ondes: 3500, 3340, 2970, 2940, 2880, 1748, 1660, 1640, 1598, 1520, 1468, 1445, 1420, 1336, 1290, 1265, 1235, 1172, 1138, 1092, 1055, 1018, 922, 885, 855 et 838.

Le spectre d'absorption ultraviolet de la sandramycine relevé dans le méthanel (0,01798 g/litre) en milieu neutre, acide et alcalin comprend les maxima d’absorption et absorptivités observés ci-aorès: "λ nm ( a ) max__ dans CH3OH: 356(8,1), 296(7,5), 229(62,8), 217(63,7) dans CH30H-HC1: 356(8,3), 306(8,1), 228(58,4), 210(62,3) dans CHjOH-NaOH: 395(9,25, 301(7,2), 245(59,8).

Le spectre de résonance magnétique du proton de la sandramycine dissoute dans le chloroforme deutéré contenant du tétraméthyisilsne comme étalon interne, r*«-- \r -r * -, r « e y I ' déterminé à l'aide d'un spectromètre Bruker modèle KM-360 fonctionnant à 360 MHz, permet d'observer les déplacements chimiques (valeurs de i) et constantes de couplage (valeurs de J en Hz) et multiplicités . ci-après: 11,75(s, 2H, Ar-OK), 9,58(d, J=6,39, 2H, sér KH), 8,55(si, 2H, gly KH), 7,82(sl, 2H, Ar-H8), 7,72(m, 2H, Ar-H5), 7,63(s , 2H, Ar-H4), 7,52(m, 4K, Ar-K6 et Ar-H7), 5,60 ( m, 2H, otH de pip.), 5,56(d, J=17,58, 2H sarocCH), 5,28(m, 2H, sér ocCH) , 5,01(d, J=12,79, 2H, sér peu), 4,88(d, J=12,79, 2H, valocCH), 4,45(dl, J= 12,79, 4H, sêTjhCH et glyoiCH), 4,07(dl, J=15,99, 4H, £H de pip. et gly o(CH) , 3,76(dl, J=12,79, 2H, £H de c pip-), 3 ,58(d, J=17,58 , 2H sar CH), 3,14(s, 6H, N-CH3), 2,96 (s, 6H, N-CH3), 2,06(m, 2H, val^CH), l,82(sl, 4H, pCH de pip.), l,68(ml, 4H, *fCH de pip.), l,57(ml, 4H, $CH de pip.), 0,94(d, J=6,37, 6H, val-CH3), 0,80(d,J= 6,37, 6H, val-CH ).

Un spectre de résonance magnétique du 13 C

de la sandramycine dissoute dans le chloroforme deutéré contenant du tétraméthylsilane comme étalon interne , déterminé à l'aide d'un spectromètre Jeol modèle FX90Q fonctionnant à 22,5 MHz,permet d'observer les déplacements chimiques (valeurs en ppm) ci-après, chaque déplacement chimique représentant deux atomes de carbone et les attributions étant les suivantes:

Ne. Déplacement chimique Attribution _ _( ppm )_ _ 1 171,73 carbcnyle 2 158,54 carbonyle c 3 168,37 carbonyle 4,5 166,91, 166,91 carbonyle 6 155,35 carbonyle 7 153,04 3-hydroxyσuir:d 1 éine C-3 8 140.64 C-2 ♦ «

V

ί y 9 133,87 3-hydroxyquinoléine C-8a 10 131,22 C-4a 11 128,61 C-8 12 127,6'4 C-7 13 126,23 C-5 14 125,58 C-6 15 119,45 C-4

16 61,43 N-méthyl valine OCCH

17 27,90 /CH

18 18,58 TCH3 19 17,82 TCH3 20 29,42 NCH3 21 49,79 glycine ofCH^

^ 22 41,02 sarcosine otCH

23 34,08 N-CH3

24 51,74 sérine cîCH

25 61,11 /CH2

26 48,49 acide pipécolique oc CH

27 27,90 /"CH2 28 19,34 Ï-ch2 29 24,11 (J-CH2 30 43,07 £“CH2

Les particularités de structure de la sandra-mycine qui la distinguent des luzopeptines A, B et C sont ta présence des entités acide 3-hydroxyquinaldique et acide pipécolique au lieu des entités acide 3-hydrcxy- 6-métnoxyquinaldique et tétrahydropyridazine-3-carbo-xylique 4-substituée, respectivement.

Activité biologique de la sanâramyçine

Les activités antibactériennes de la sandra-mycine ont été déterminées par dilution en série de raison deux dans de la gélose. Les résultats sont repris au tableau n en comparaison de ceux que donnent la lyzopeptine A et l'échinoir.veine. Comme il ressert / ; CD.MJ - 21 - * ν'

V

du tableau 5, la sandramycine est une inhibiteur puissant des organismes Gram positifs comme Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus, de même que de Streptococcus faecèlis.

TABLEAU 5

Activité antimicrobienne de la sandramycine

Concentration inhibitrice minimale (CIM) (^ug/ml)

Organisme d'épreuve Sandra- Luzopeptine Echino- mycine A mycine B. subtilis (Rec. +) A22508-2 0,024 0,195 0,049 i EL subtilis (Rec. -) “v A22509-2-2 0,012 0,049 <0,003 S. aureus 209P-A9497 0,012 0,098 0,012 S. aureus (résistant à l'échinomycine ) A9628 0,098 0,098 0,78

Strep.faecalis A9611 0,024 0,195 0,012 E. coli A15119 12,5 12,5 12,5 E. coli (sensible à 1'actinomycine) A21780 (AS-19) 12,5 12,5 6,25

La sandramycine a été essayée aussi contre la leucémie P-388 qui est une tumeur transplantable de la souris et les résultats en sont donnés au tableau 5. * Le mode opératoire appliqué satisfait de manière générale aux protocoles du National Cancer Institute [Cancer Cne-motherapy P.ep. Part 3, 3 , 1-103 (1972>j- Les détails expérimentaux essentiels sont donnés après le tableau 6. Deux posologies différentes ont été essayées, à savoir ί C' € ! r une dose unique le jour 1 et une dose quotidienne pendant 5 jours. Dans les deux cas, la dose optimale se révèle être d'environ 0,2 mg/kg/injection.

• TABLEAU 6

Effet de la sandramycme sur la leucémie P-388

Composé Programme Dose, IP TSM Effet CMP Survide rrg/kg/inj. jours % T/C g vants _ traitement _ _ _ jour 4 jour 5

Sandramycine d. 1 3,2 tox tox -2,8 0/6 1,6 11,5 128 -1,3 6/6 0,8 10,0 111 -1,6 6/6 0,4 11,0 122 -0,7 6/6 0,2 14,5 161 -1,4 6/6 , 0,1 11,0 122 -0,9 6/6 0,05 10,0 111 -0,6 6/6 0,025 9,5 106 -0,2 6/6

Sandramycine d. 1—>-5 1,6 tox tox -1,7 2/6 0,8 6,0 67 -1,4 5/6 0,4 11,0 122 -1,3 6/6 0,2 12,0 133 -1,7 5/6 0,1 11,5 128 -0,8 6/6 0,05 8,5 94 -1,8 6/6 0,025 10,0 111 -1,4 5/5 0,0125 10,5 117 -0,9 6/6 Témoin 1 9,0 - 0,2 10/10

Solution physiologique salée.

ïnocuium de tumeur: 10^ cellules d’ascite en implantation i.p.

Hôte: souris femelles CDF^ s Evaluation: TSM = temps de survie moyen

Effet: % T/C - (TSM traité/TSM contrôle) x 100 S-

Critère: % T/C 125 considéré comme traduisant une activité anrirumorale significative CMP: changement moyen de poids ( traité-contrcle} er. g (au jour 4-

«I

« ? ί * I «r

Comme l'effet antimicrobien et l'effet antitumoral chez la souris l'indiquent ci-dessus, la san-dramycine est utile comme antibiotique et aussi comme agent antitumoral pour inhiber des tumeurs malignes des mammifères, par exemple la leucémie P-388.

L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques contenant une quantité antimicrobienne ou antitumorale efficace de sandramycine conjointement avec un excipient ou diluant pharmaceu-tiquement acceptable. Ces compositions peuvent aussi contenir d'autres agents antimicrobiens ou antitumoraux actifs et peuvent être préparées sous toute forme pharmaceutique propre à la voie d'administration souhaitée. Des exemples de telles compositions * sont les compositions solides pour l'administration par voie orale, comme les comprimés, capsules, pilules, poudres et granules, les compositions liquides pour l'administration par voie orale comme les solutions, suspensions, sirops ou élixirs,et les préparations pour l'administration par voie parentérale comme les solutions, suspensions ou émulsions stériles. Elles peuvent être présentées aussi sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes extemporanément dans de l'eau stérile, de la solution physiologique salée ou un autre milieu stérile pour injection.

Comme agent antimicrobien, la sandramycine ou la composition pharmaceutique en contenant est administrée de façon que la concentration en principe actif soit supérieure à la concentration inhibitrice v· minimale dans l'organisme traité. Les doses et poso-logies optimales de sandramycine administrée comme agent antitumoral à un mammifère détermine peuvent être évaluées aisément par le spécialiste. Il est évident oue la dose oratiaue de sandramvcine varie » * t C“ Λ I V' avec la composition utilisée, le mode et le site d'administration, l'hôte atteint et l'affection traitée.

De nombreux facteurs qui modifient l'effet du médicament sont à prendre en compte comme 1'âge, le poids, le sexe, le régime alimentaire, le moment et la voie d'administration, la vitesse d'excrétion, l'état du patient, les médicaments ajoutés, les réactions de sensibilité et la gravité de l'affection.

Les exemples ci-après illustrent non limitativement l'invention. Le skellysolve B est un éther de pétrole commercialisé (Skelly Oil Co.) qui comprend des hexanes isomères et a un point d'ébullition de 60- . 69eC. La Dicalite est une terre de diatomées commer- v ; cialisée par Grefco, Inc., Torrance, California. Sauf indication contraire, toutes les températures sont en degrés Celsius.

EXEMPLE 1

Fermentation de la sandramycine A. Fermentation en flacon secoué

On entretient et on transfère Nocardioides sp. souche C49.009, ATCC 39419 dans des tubes de culture sur gélose inclinée à l'extrait de malt et de levure.

Ce milieu comprend 4,0 g de glucose, 4,0 g d'extrait de levure, 10,0 g d'extrait de malt et 20,0 g de gélose portés à 1 litre avec de l'eau désionisée. Pour chaque transfert, on met la culture sur gélose inclinée à incuber pendant 7 jours à 27°C. Pour préparer un inoculum en vue de la phase de production, on transfère le mycélium des cultures inclinées dans une fiele c’Er— ^ lenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu stérile T- consistant en 30,0 g de glucose, 10,0 g de farine de soya, 10,0 g de farine de germes de coton et 3,0 g ac CaCO-, portés à 1 litre avec de l’eau désionisée. On met cette culture végétative à incuber à 21°C pensant 48 heures sur une secoueuse Gyrotory (modèle Gr-r, Lev t i < \ * Λ i ', . .

Brunswick Scientific Co., Inc.) réglée à 210 tours/minute et décrivant un cercle d'un diamètre de 51 mm. On transfère 4 ml de culture végétative dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml d'un milieu de production stérile consistant en 20,0 g de saccharose, 10,0 g de farine de soya, 10,0 g de farine de lin et 5,0 g de CaCO^ portés à 1 litre avec de l'eau désionisée. On met la culture de production à incuber à 27°C sur une secoueuse semblable à celle utilisée pour la culture végétative et réglée à 250 tours/minute. A 96 heures , on récolte la culture de production pour en isoler la sandramycine.

B. Fermentation à l'échelle du fermenteur de table

En vue de la production de la sandramycine * dans un fermenteur de table, on transfère 400 ml de culture végétative telle que décrite dans l’exemple IA dans un fermenteur (Microgen modèle SF-116, New Brunswick Scientific Co., Inc.) contenant 10 litres d'un milieu de production consistant en 40 g d'amidon de maïs, 20 g de farine de lin, 1 g de sulfate d'ammonium et 5 g de CaCO^ par litre d'eau désionisée.

On maintient la température à 27°C et l'agitation à 300 tours/minute avec un débit d'air de 8 litres/mi-nute. Après 202 heures d'incubation, on isole la sandramycine de la culture.

C. Fermentation en cuve

Pour une production de la sandramycine à l’échelle pilote, on transfère 2 litres de culture végétative {préparée suivant le mode opératoire général de l'exemple IA) dans un fermenteur contenant 30 litres c d'un milieu de production consistant en 40 g d'amidon v de maïs, 20 g de farine de lin, 2 g de sulfate d'ammo nium et 5 g de CaCO^ par litre d'eau désionisée. La température d'incubation est de 26,5°C, le débit d'air . est de 80 litres/minute, la vitesse d’agitation est / i t * de 375 tours/minute et la contre-pression est de 1 bar. Après 183 heures, on récolte le produit de la fermentation en cuve pour en isoler la sandramycine.

EXEMPLE 2

Isolement et purification de la sandramycine Stade A: Extraction

On transfère le bouillon de fermentation complet brut (ωε litres) dans une cuve en polyéthylène de 20 litres (diamètre de 48 cm au sommet et de 44 cm au fond, profondeur de 55 cm) munie d'un robinet à la partie inférieure. On ajoute un volume égal d'acétate d'éthyle. On agite le mélange avec un agitateur pneumatique à bonne vitesse d'incorporation pendant 30 minutes. On ajoute environ 6 litres (2 kg) de Dicalite - qu'on mélange. On filtre le mélange sur une couche de

Dicalite qu'on accumule dans un entonnoir de Buchner n°12. On recueille le filtrat dans un flacon de 19 litres muni d'une prise de vide. On lave la couche filtrante avec 2 litres d'acétate d'éthyle. On introduit le filtrat dans une ampoule à décantation de 20 litres et on y laisse les phases se séparer. On recueille l'extrait dans l'acétate d'éthyle et on le concentre jusqu'à environ 1 litre dans un évaporateur en verre à circulation et admission continue pour travaux de laboratoire.

On évapore le concentré davantage en une huile visqueuse sous vide à 1'évaporateur rotatif pour recueillir 1,94 g d'extrait brut.

Stade B: Partage liquide-liquide de l'extrait brut

On dissout l'extrait brut du stade A (1,94 g) dans un mélange de 200 ml de méthanol et de 200 ml de

W

v Skellysolve B. On introduit la solution biphasique ‘ dans une ampoule à décantation de 1000 ml et on la dilue avec 22 ml d’eau. On agite le mélange et on laisse les phases résultantes se séparer. On transfère la phase aqueuse métnâr.c-liçue (intérieure) dans une seconde am— » < m * * * poule a décantation de 1000 ml et on l'extrait encore deux fois avec des aliquotes de 200 ml de Skellysolve B qu'on a préalablement saturé avec un volume égal d'eau à 10% dans du méth'anoi. On dilue la phase aqueuse métha-nolique avec 44 ml d'eau et on l'extrait trois fois avec des aliquotes de 200 ml de tétrachlorure de carbone qu'on a préalablement saturé avec un volume égal d'eau à 25% dans du méthanol. On dilue la phase aqueuse mé-thanolique avec 41 ml d'eau et on l'extrait trois fois avec des aliquotes de 200 ml de chloroforme qu'on a préalablement saturé avec un volume égal d'eau à 35% dans du méthanol. On rassemble les extraits dans le tétrachlorure de carbone et on les évapore à siccité sous vide à 1’évaporateur rotatif pour obtenir 595 mg de **-_ résidu A. On rassemble les extraits chloroformiques et on les évapore à siccité sous vide dans un évaporateur rotatif pour obtenir 458 mg de résidu B.

Stade C: Trituration des résidus A et B

On rassemble le résidu A (547 mg) et le résidu B (389 mg) obtenus au stade B et on les dissout dans 30 ml d'un mélange de 2 parties de chloroforme et de 1 partie de méthanol. On ajoute de la Dicalite (17,4 g) à la solution,puis on forme une dispersion en ajoutant 200 ml de Skellysolve B. On évapore les solvants sous vide à 1'évaporateur rotatif. On disperse la poudre résultante dans 500 ml de toluène et on la tasse dans une colonne de chromatographie rapide d'un diamètre intérieur de 41 mm et d'une longueur de 45,7 cm. On tasse la Dicalite en un lit maintenu sous pression dynamique (azote 393 millibars). Lorsque le solvant -ς de tassement atteint la surface du lit, on interrompt /· ^ l'écoulement de gaz et on relâche la pression dans la colonne. On dépose une couche de sable d'Ottawa {^2 cm) a la surface. On élue la colonne ensuite avec écoule--er.: c ' azote sous pression en utilisant la série élu- /'

S

-t * m Λ, *· tropique suivante: toluène (500 ml); éther diéthyliaue (500 ml); chlorure de méthylène (500 ml); chloroforme (500 ml); acétate d’éthyle (500 ml); acétonitrile (500 ml); tétrahydrofurane (500 ml) et méthanol (500 ml). On combine l'éluat toluénique et le filtrat de garnissage (nJlOOO ml) et on les évapore à siccité sous vide à 1'évaporateur rotatif pour recueillir 699 mg de résidu C.

Stade D: Chromatographie du résidu C sur colonne

On garnit une colonne Glenco d'un diamètre intérieur de 20 mm et d'une longueur de 30 cm au moyen d'une dispersion de 37 g de gel de silice Koelm (0,060-

O, 200 mm) dans du chloroforme. On dissout le résidu C

a (0,699 g) dans 5 ml de chloroforme et on l'applique au "S sommet de la colonne. On laisse percoler l'échantillon dans le lit. On remplit le vide entre le sommet de la colonne et le lit de gel de silice avec du sable d'Ottawa normal. On raccorde la colonne à un appareil d'élution à gradient Glenco et on commence l'élution avec 2000 ml d'un milieu à gradient linéaire allant du chloroforme jusqu'à 5% de méthanol dans du chloroforme, en recueillant 20 fractions de 100 ml. On évapore chaque fraction à siccité sous vide à 11évaporateur rotatif. On dissout le résidu dans 3 ml d'un mélange de 2 parties de chloroforme et de 1 partie de méthanol. On dépose des gouttes (2 ^,ul ) de chaque fraction sur des plaques de chromatographie en couche mince de gel de silice Ànaltech GHLF. On élue les plaques avec 5% de méthanol dans du chloroforme et on observe les taches en lumière ÜV à 254 nm et 366 nm. La fraction 6 apparaît homogène.

-χ On recristallise le résidu cristallin de la fraction 6 “ç dans le chloroforme-méthanol pour recueillir 215 mg de sandramycine. On recristallise celle-ci dans le chloro-forme-méthanol pour obtenir 168 mg de sandramycine pure, P. F. 206-212 CC.

/ I) » m r

Analyse pour C6ßH76°i6K12 8 H2° calculé C, 52,78, H, 6,79, N, 12,31% trouvé C, 52,58, H, 6,29, N, 12,29% EXEMPLE 3

Isolement et purification de la sandramycine à plus grande echelle

Stade A: Extraction et partage liquide-liquide de l'extrait brut

En répétant les techniques générales d'isolement décrites dans l'exemple 2, stades A et B, on obtient 1,12 g de résidu A et 3,03 g de résidu B à partir de l'ensemble du bouillon de fermentation ( <v8 litres). Stade B: Trituration des résidus A et B — On dissout le résidu A (1,12 g) obtenu au / stade A dans environ 300 ml d'un mélange de 2 parties de chloroforme et de 1 partie de méthanol. On ajoute de la Dicalite (20 g) à la solution. On évapore le solvant à siccité sous vide à 1'évaporateur rotatif.

On disperse le résidu dans 300 ml de toluène et on évapore le mélange à nouveau à siccité. On répète l'opération une seconde fois. On disperse le résidu résultant dans 300 ml de Skellysolve B et on évapore le mélange à siccité à 1'évaporateur rotatif. On répète l'opération une seconde fois. On disperse le résidu de Dicalite dans 300 ml de Skellysolve B et on le tasse dans une colonne de chromatographie de 41 mm de diamètre intérieur et d'une longueur de 45,7 cm. On tasse la Dicalite en un lit au moyen d'une pression dynamique (azote 393 millibars). On dépose une couche de sable d'Ottawa ( λ>2 cm) sur le lit. On commence l'élution w avec écoulement d'azote sous pression en utilisant la

C

p. série élutropique suivante: Skellysolve E (500 ml); ^ toluene (500 ml); éther diéthyligue (500 ml); chlorure de méthylène (500 rrl); chloroforme (500 ml); acétate d'éthyle (500 ml); acétonitrile (500 ml); tétrahydrc- ! $

Il __χ — $'J — fi t * I*-- » furane (500 ml) et méthanol (500 ml). On évapore l'éluat toluénique à siccité sous vide à 11évaporateur rotatif pour obtenir 912,7 mg du résidu D.

On répè'te le mode opératoire général ci-dessus, sauf qu'on remplace le résidu A par 3,03 g du résidu B pour obtenir ainsi 766,7 mg de résidu E à partir de l'éluat toluénique.

On répète le mode opératoire général décrit ci-dessus dans l'exemple 3, stades A et B, mais en y remplaçant les résidus A et B par 1,5 g et 1,97 g des résidus A' et B', respectivement, de manière à obtenir 993,9 mg de résidu D' et 693 mg de résidu E', respectivement, à partir de l'éluat toluénique.

1 Stade C: Chromatographie des résidus D et E sur colonne ^ On garnit une colonne Glenco d'un diamètre intérieur de 20 mm et d'une longueur de 30 cm au moyen d'une dispersion de 40 g de gel de silice Woelm (0,063-0,200 mm) dans du chloroforme. On insère la colonne dans le système HPLC sous moyenne pression et on l'amène à l'équilibre avec du chloroforme. On rassemble les résidus D, D', E et E' du stade B (environ 3,366 g) i et on les dissout dans 6 ml de chloroforme.. On fait ; passer la solution dans une boucle d'échantillonnage i de 15 ml. On insère la boucle d'échantillonnage dans le système HPLC sous moyenne pression et on pompe l'échantillon dans la colonne avec 200 mi de chloroforme.

i ; On commence l'élution avec 2000 ml c'un milieu à gra- | dient linéaire depuis du chloroforme jusqu'à 5% de méthanol dans du chloroforme en reoueiiianr 17 frac-: tions de 117 ml. Par chromatographie en couche mince, h. on analyse des aliquotes (5 yUl) de chaque fraction ^ en utilisant du méthanol à 5« dans le chloroforme . v comme éluant, avec visualisation en lumière U7 à 366 nm. On rassemble les fractions 5 et 6 qu'on évapore à sic-cité pour recueillir 2,166 g de résidu F. On rassemble / / CI*.MJ - 31 - «t * ë

X

t â? tr *** , les fractions 7 à 12 et on les concentre à siccité sous vide à 1‘évaporateur rotatif. On dissout le résidu (953 mg) dans 6 ir.l de chloroforme et on exécute une nouvelle chromatographie comme ci-dessus avec 2000 ml d'un milieu à gradient linéaire, du chloroforme jusqu'à 1,5% de méthanol dans le chloroforme, en recueillant 20 fractions de 100 ml. On rassemble les fractions 9 à 20 et on les évapore à siccité à 1'évaporateur rotatif pour obtenir 860 mg de résidu G.

On combine les résidus F et G et on les recristallise dans le chloroforme-méthanol pour collecter 1,985 g de sandramycine pure identique au produit isolé dans l'exemple 2.

/~\

V

Claims

1 CH, CH, V-V CH // \ CCCH, )—/ O

1. L'antibiotique antitumoral sandramycine répondant à la formule de structure CH, CH, M \ CH ÇH, ÇH,[ CO-NHCHj-CO-N-CHj-CO-N-CH nh-ch-co~n,^N Ç° r· O ^ 0 | | ÇH» ίο k^N-CO-CH-NH ,4 CH-N-CO-CHrN-CO-CHjNH-CO Hq c0

2. Procédé de préparation de l'antibiotique antitumoral sandramycine, caractérisé en ce qu'on cultive une souche productrice de sandramycine de Nocar-dioides sp. nov. ayant les caractéristiques d'identification d'ATCC 3941S ou un mutant de cetre souche dans des conditions d'aérobiose en submersion dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de carbone et d'azote jusqu'à production et accumulation d'une quantité sensible de sandramycine dans le milieu de culture.

3. Procédé suivant la revendication 2 , carac- ^ térisé en ce qu'on isole la sandramycine du milieu de culture.

4. Culture biologiquement pure du micro-organisme Nocardioides sp. ATCC 39415 qui est capable de / i * ψ A ί i produire l'antibiotique antitumoral sandramycine en quantité isolable par culture dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans deè conditions d'aérobiose en submersion.

4 < *- t s*

5. Procédé de traitement thérapeutique d'un animal atteint d'une infection bactérienne, caractérisé en ce qu'on administre à l'animal de la sandramycine en une dose antibactérienne efficace.

6. Procédé de traitement thérapeutique d'un animal atteint d'une tumeur maligne sensible à la sandramycine, caractérisé en ce qu'on administre à l'animal de la sandramycine en une dose inhibant la tumeur.

7. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend de la sandramycine en quantité 1 antimicrobienne efficace,conjointement avec un excipient ou diluant pharmaceutique.

8. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend de la sandramycine en quantité efficace pour inhiber une tumeur,conjointement avec un excipient ou diluant pharmaceutique. V