LU86761A1 - Compositions d'anticorps monoclonaux humains assurant la protection croisee - Google Patents

Description

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Domaine de l'invention

La présente invention se rapporte à l'appli-'% cation des techniques immunologiques aux fins d'obtenir de nouvelles matières utiles pour le traitement et le diagnostic d'infections bactériennes et, plus particulièrement, à la production et à l'application d'anticorps monoclonaux humains qui sont capables de protéger contre des infections provoquées par différents genres de bactéries .

Arrière-plan de l'invention

Les bactéries Gram-positives et Gram-négatives peuvent provoquer des affections menaçant l'existence des patients infectés. Ces infections bactériennes sont souvent à l'origine d'une morbidité et d'une mortalité > importantes. L'incidence de ces infections est accrue chez les enfants nés avant terme, les patients âgés et '^· les patients dans un état médical grave, par exemple portant des brûlures, un traumatisme chirurgical, des plaies à guérison lente ou des tumeurs malignes. Ces infections sont typiquement d'origine nosocomiale (c'est-à-dire acquises en milieu hospitalier) et se manifestent particulièrement chez les patients qui sont passés par une hospitalisation de longue durée associée à une intervention chirurgicale, des lésions intravasculaires ou un traitement à long terme au moyen d'agents immunosuppresseurs ou d'antibiotiques. De plus, les nouveau-nés dont le système immunitaire est immature sont apparemment très sensibles à la sepsie et à la méningite néonatales provoquées par des bactéries Gram-négatives et Gram-positives particulières.

Au nombre des organismes rencontrés le plus fréquemment dans les affections Gram-négatives et Gram-positives , on trouve Escherichia coli (E. coli) , Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) , Serratia marcescens (S. marcescens) , Enterobacter aerogenes et cloacae

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/ 2 (E. aerogenes/cloacae) , Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Neisseria meningitidis (N. meningitidis), ** Streptococcus Groupe B et Staphylococcus aureus (S.

aureus) (Sonnenwirth, A. C., "The Enteric Bacilli et Similar Gram-Negative Bacteria," pages 753-790, dans Microbiology, 2e édition. Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, H. N., Ginserberg, H.S., Wood, W.B. , et McCarty, M., Eds., Harper and Row, (1973); McCabe, W.R.., "Gram-Negative Bacteremia , " Adv. Intern. Med., 19 :135-138 (1974); Kreger, et al., "Gram-Negative Bacteremia III. Reassessment of Etiology, Epidemiology, and Ecology in 612 Patients," Am. J. Med. 68^332-343 (1980); Robbins, J. B., et al., "Escherichia coli Kl Capsular Polysaccharide Associated With Neonatal Meningitis," New Engl.

J. Med., 290:1216-1220 (1974); et Hughs, J.M., et al., "Nosocomial Infection Surveillance, 1980-1982," Morb. Mort. Weekly Report, 32^:1SS-16SS (1983)). Dans ces infections, la plupart mais l'ensemble des sérotypes de certaines bactéries Gram-négatives, par exemple E. coli, K. pneumoniae, E. aerogenes/cloacae, P. aeruginosa et S^ marcescens provoquent une bactériémie chez la population adulte. Au contraire de l'adulte, le nouveau-né dont l'immunité n'est pas à maturité est particulièrement susceptible de septicémie et de méningite provoquées par les souches encapsulées d1E. coli, N. meningitidis groupe B, Hemophilus influenzae type B et les cinq souches types de Streptococcus groupe B. Bien que d'autres bactéries aussi puissent provoquer ces infections, les bactéries indiquées ci-dessus sont les isolats principaux des infections précitées du sang.

Les antibiotiques ont longtemps constitué l'outil thérapeutique principal pour la maîtrise et l'éradication des infections Gram-positives et Gram-négatives. Toutefois, la gravité et l'incidence persistantes de ces infections, l'apparition ininterrompue *·

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3 * de souches de bactéries qui résistent aux antibiotiques et la toxicité propre de certains antibiotiques imposent ^ des limites à l'antibiothérapie. Ces observations ont accéléré la recherche d'autres approches prophylactiques et thérapeutiques.

Il est généralement admis que les anticorps réactifs à l'égard de structures accessibles (extérieurement exposées) sur les bactéries vivantes peuvent faciliter la destruction de ces bactéries par l'un ou l'autre de divers mécanismes. Au nombre de ces mécanismes, on compte: (1) la lyse directe des bactéries en présence du complément sérique, (2) la bactériostase par blocage des récepteurs qui captent les éléments nutritifs, (3) l'opsonisation et la phagocytose ultérieure des bactéries en présence ou en l'absence du complément sérique et (4) la prévention de la fixation des bactéries aux tissus de l'hôte (Mims, C.Ä., "Recovery from Infection," dans Pathogenesis of Infectious Disease, pages 198-222, Mims, C.A., Ed. , Academie Press (1982)). Pour les bactéries qui portent des molécules d'hydrate de carbone en surface, comme un lipopolysaccharide (LPS),et/ou des capsules, l'anticorps semble de la plus haute efficacité par le mécanisme d'opsonisation (Kaijser, B., et al., "The Protective Effect Against E^ coli of Oand K Antibodies of Different Immunoglobulin Classes ,"Scand. J. Immunol., 1_:276 (1972)). Par conséquent, les anticorps dressés contre ces hydrates de carbone accessibles peuvent constituer un moyen efficace pour l’élimination des bactéries.

En règle générale, les mammifères qui sont exposés à des bactéries pathogènes produisent des anticorps qui sont spécifiques pour le LPS ou la capsule.

Ces antigènes sont des structures chimiquement diverses « ^ composées de molécules d'oligosaccharide fréquemment répétées et dont la présence détermine le sérotype des

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V, souches bactériennes. Du fait qu'ils sont souvent les antigènes bactériens immunodominants, les anticorps spécifiques du sérotype (anti-LPS ou anti-capsule) ont été les plus étudiés des anticorps potentiellement thérapeutiques. Toutefois, en raison de la réactivité croisée limitée de ces anticorps et de la nature apparemment très diverse des hydrates de carbone antigéniques sur les bactéries pathogènes Gram-positives et Gram-négatives ; il serait extrêmement difficile et onéreux de produire une composition thérapeutique contenant uniquement des anticorps spécifiques du sérotype (voir, par exemple, Kaijser, B. et Ahlstedt, S., "Protective Capacity of Antibodies Against Escherichia coli O and K Antigens," Infect. Immun., Γ7:286-292 (1977); outre Morrison, D. C. et Ryan, J. L. , "Bacterial Endotoxins and Host Immune Response," Adv. Immunol., 28:293-450 5’ (1979)). Quoi qu'il en soit, diverses études ont sti mulé l'opinion que des approches immunothérapeutiques pourraient être trouvées pour le traitement des infections par bactéries Gram-négatives.

Le plasma humain fractionné, enrichi en immunoglobulines contenant des anticorps spécifiques et protecteurs contre les organismes infectieux, s'est révélé de quelque efficacité contre les infections par P. aeruginosa. (Collins, M.S. et Robey, R.E., "Protective Activity of an Intravenous Immune Globulin (Human) Enriched in Antibody Against Lipopolysaccharide Antigens of Pseudomonas aeruginosa," Amer. J. Med., 3_:168-174 (1984)). Toutefois, Il n'existe pas encore de produits commercialiés faciles à obtenir en raison des limitations inhérentes qui ont empêché leur application généralisée pour le traitement des affections bactériennes graves.

Une de ces limitations propres aux compositions .d'immunoglobulines est qu'elles sont consti- m-

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\ 5 ' tuées à partir de réserves importantes d'échantillons de plasma qui ont été présélectionnés en fonction de ^ la présence d'un nombre limité d'anticorps particuliers.

Normalement, ces réserves consistent en échantillons provenant d'un millier de donneurs qui peuvent avoir des titres faibles pour certaines bactéries pathogènes. Par conséquent, on n'observe au mieux qu'une augmentation modeste du titre résultant des anticorps souhaités.

Une autre limitation de ce genre est que la présélection elle-même exige une surveillance continue et fort onéreuse de la population des donneurs pour assurer la reproductibilité du produit. Malgré des efforts considérables, le produit peut encore présenter des différences considérables d'un lot à l'autre et entre ré-^ gions géographiques.

Encore une autre limitation propre aux compo-> sitions d'immunoglobulines est que leur administration conduit à l'administration simultanée de grandes quantités de protéines étrangères (par exemple des virus) qui ont la possibilité d’exercer des effets biologiques défavorables. La combinaison de la faiblesse du titre des anticorps souhaités avec la teneur élevée en substances étrangères limite souvent au-dessous de l'optimum la quantité d'immunoglobuline(s) spécifique(s) et donc bénéfique(s) qui peut être administrée au patient.

En 1975, Köhler et Milstein ont indiqué que certaines lignées de cellules de souris pouvaient être hybridées avec des cellules de la rate de souris pour créer des hybridomes qui devraient sécréter des anticorps "monoclonaux" purs (Köhler, G.Milstein, C., "Continuons Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity," Nature, 256 :495-497 (1975)).

Avec cette technologie,est apparue la possibilité de produire des anticorps de souris à l'égard d'un ou plusieurs déterminants particuliers quelconques sur les *1

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6 r antigènes.

A l'aide de cette technologie, des anticorps * monoclonaux de souris ont été préparés à partir de souris immunisées avec le polysaccharide de Neisseria meningi-tidis groupe B. Il a été observé que ces anticorps monoclonaux IgM de souris fixent et opsonisent différentes souches d'E. coli Kl-positives indépendamment de leurs sérotypes LPS (Cross, supra, Soderstrom, supra, et Cross, A. S., et al., "The Importance of the Kl Capsule in Invasive Infections Causedby Escherichia coli," J. Inf. Dis., 149:184-193 (1984)). De plus, les anticorps monoclonaux sont protecteurs chez la souris contre une agression létale par E£_ coli Kl et les méningocoques du groupe B (Cross, supra, et Sunderstrom, supra). Dans un autre exemple, des anticorps monoclonaux de souris spécifiques à l'égard de Streptococcus groupe B type III ont été décrits comme protecteurs dans un modèle d'infection expérimentale chez la souris (Egan, M. L., et al. "Protection of Mice from Experimental Infection with Type III Group B Streptococcus Using Monoclonal Antibodies," J. Exp. Med., £:1006-1011 (1983)).

Un anticorps monoclonal de souris , bien qu'utile pour le traitement de la souris, expose à des inconvénients majeurs en administration chez l'être humain. Le système immunitaire humain est capable de reconnaître tout anticorps monoclonal de souris comme protéine étrangère. Il peut en résulter une élimination accélérée de l'anticorps et ainsi l'abrogation de son effet pharmacologique (Levy, R. et Miller, R. A., "Tumor Therapy with Monoclonal Antibodies," Fed. Proc., £2:2650-2656 (1983)). Chose plus grave, il est concevable que cela conduise à un état de choc et même à la mort par des réactions allergiques analogues à la "maladie sérique". L'expérience clinique a montré que les réactions contre les immunoglobulines de souris ont

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7 r limité l'utilité de ces anticorps chez à peu près la moitié des patients recevant des anticorps monoclonaux * de souris pour le traitement de différentes tumeurs (Sears, H. F., et al., "Phase I Clinical Trial of Monoclonal Antibody in Treatment of Gastrointestinal Tumor," Lancet, _l:762-764 (1982); et Miller, R. A. , et al. , "Monoclonal Antibody Therapeutic Trials in Seven Patients with T-Cell Lymphoma," Blood, 62^:988-995 (1983)).

Il existe par conséquent un besoin pour des anticorps monoclonaux humains qui soient protecteurs contre la maladie bactérienne Gram-positive et Gram-négative. Toutefois, la diversité du caractère antigénique des bactéries pathogènes Gram-positives et Gram-négatives suggère avec force qu'il serait impossible de " produire des anticorps monoclonaux humains spécifiques du sérotype pour chacune des nombreuses bactéries pathogènes importantes.

La diversité du caractère antigénique des bactéries Gram-négatives est attribuée aux régions variables du lipopolysaccharide (LPS), qui est une molécule associée à la membrane extérieure des organismes Gram-négatifs. La molécule de LPS est généralement considérée comme étant constituée de trois régions structurales. La région la plus proche de la membrane extérieure est dite lipide A du LPS. Cette région structuralement conservée possède l'activité endotoxique associée à l’affection Gram-négative. La seconde région structurale, dite coeur,est unie au lipide A souvent à l'intervention d'un reste 2-céto-3-désoxy-D-manno-octonate (KDO) et, comme la région de lipide A, n'est habituellement pas accessible à l'anticorps lorsque la troisième région ou région extérieure du LPS est présente. Bien que cette région soit partiellement conservée dans certaines espèces de bactéries Gram-négatives, de nombreux écarts dans le coeur complet ont été obser-

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* vés parmi les membres de la famille des enterobacté-riacées. La région extérieure d'une molécule de LPS

* est composée d1unités d'oligosaccharides récurrentes et est appelée chaîne latérale O-spécifique. Les sucres dans ces unités d'oligosaccharides comprennent des entités moléculaires qui manifestent la diversité antigénique structurale spécifique du sérotype. Ainsi, les sucres eux-mêmes, leur séquence et leurs liaisons déterminent le pouvoir antigénique de la chaîne latérale O par l'intermédiaire de leur structure tertiaire. Les anticorps contre ces groupes 0 se sont généralement révélés être spécifiques du sérotype. Les sérotypes sont typiquement définis par leur réactivité avec des antisérums monospécifiques, qui ont de 1'activité dè fixation pour un seul déterminant antigénique particulier. Voir à titre général:Mayer et al., Meths. Micro-biology, 18 :157-201 (1985).

Des antisérums contre les régions de coeur et de lipide A du LPS ont été préparés en vue d'exercer une protection contre une infection Gram-négative, voir Sakulramrung et Domingue, J. Inf. Dis., 151:995-1104 (1985); McCabe, et al., J. Infect. Dis., 1365:516 (1977); et Mullan, et al., Infect. Immun., 10_:1195-1201 (1974). Plus récemment, des anticorps monoclonaux de souris et d'êtres humains qui sont réactifs avec les régions conservées ont été produits. Bien que ces anticorps aient parfois manifesté une efficacité partielle i_n vivo dans des systèmes modèle bien choisis (Teng, et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 82^:1790 (1985); outre Bogard et Kung, Demande de brevet n° WO85/01659) , d'autres laboratoires n'ont pas été à même de démontrer des effets semblables. Voir Elkins et Metcalf, Infect. Immun.

48^:597 (1985); et Gigliotti et Shenap, J. Inf. Dis.

151:1005-1011 (1985). Toutefois, en règle générale, ces anticorps ne réagissent pas (ne se fixent pas)

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9 r avec des bactéries Gram-négatives viables intactes ou avec des molécules de LPS purifiées. Ces découvertes • suggèrent qu'il est douteux que les régions de coeur ou de lipide A du LPS sur les bactéries dans leur état naturel ou infectieux soient accessibles pour l'anticorps. Il est généralement admis aussi que les anticorps contre le coeur ou contre le lipide A ne réagiraient pas avec les bactéries Gram-positives parce que ces dernières n'ont pas de LPS. Au vu de ces découvertes, il est improbable que des anticorps monoclonaux contre les régions conservées de coeur ou de lipide A du LPS soient efficaces pour le traitement d'une affection chez l'homme par une bactérie Gram-négative ou a fortiori par une bactérie Gram-positive.

Par conséquent, il existe encore un besoin significatif pour des anticorps monoclonaux humains qui offrent la protection croisée à large spectre (intergenre) contre les affections par les bactéries Gram-positives et Gram-négatives, outre pour des procédés de production pratique et d'utilisation de ces anticorps. La présente invention satisfait à ces besoins. Aperçu de l'invention

En font l'objet de nouvelles lignées cellulaires qui produisent des anticorps monoclonaux humains capables d'une réaction croisée spécifique avec plusieurs espèces bactériennes par fixation sur un épitope accessible comprenant une entité d'hydrate de carbone hors-coeur présente sur au moins deux espèces bactériennes différentes. En font en outre l'objet des procédés pour le traitement prophylactique d'un patient humain susceptible d'une infection bactérienne et pour le traitement thérapeutique d'un patient souffrant d'une telle infection par administration d'une quantité efficace d'une composition comprenant plusieurs anticorps monoclonaux humains, dans laquelle au moins l'un de ces anticorps

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10 * est capable de réagir avec un déterminant antigénique d'hydrate de carbone hors-coeur commun à deux ou plu- * sieurs espèces bactériennes. La composition comprend de préférence un excipient physiologiquement acceptable et peut aussi contenir un ou plusieurs des constituants suivants: anticorps monoclonaux humains supplémentaires capables de réagir avec d'autres genres bactériens; une fraction de gammaglobuline provenant du plasma du sang humain; une fraction de gammaglobuline provenant du plasma du sang humain, dont le plasma provient d'un être humain manifestant des taux élevés d'immunoglobulines réactives avec un ou plusieurs genres bactériens; et un ou plusieurs agents antimicrobiens.

Description des formes de réalisation spécifiques

La présente invention a pour objet de nouvelles cellules capables de produire des anticorps monoclonaux humains et des compositions comprenant ces anticorps, ces compositions étant capables de réagir sélectivement avec plusieurs genres bactériens responsables d'infections nosocomiales, néonatales ou autres, dans lesquelles les anticorps individuels réagissent typiquement avec des épitopes d'hydrate de carbone hors-coeur présents sur des genres bactériens multiples. Les cellules en question ont des chromosomes identifiables dans lesquels leur ADN de la lignée germinale ou d'une cellule précurseur a été réarrangé en vue de coder pour un anticorps ou fragment de fixation de celui-ci présentant un site de fixation pour un déterminant antigénique (épitope) commun à des molécules d'hydrates de carbone observées sur au moins certains sérotypes de deux ou plusieurs genres bactériens. Ces anticorps monoclonaux humains peuvent être utilisés d'une grande variété de façons, notamment pour le diagnostic, la prophylaxie et la thérapie d'infections bactériennes.

Typiquement, les cellules faisant l'objet de

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11 v l'invention sont des cellules capables de produire de façon stable un anticorps humain en culture, en parti- •ç culier des lymphocytes humains rendus immortels qui produisent des anticorps monoclonaux humains protecteurs a l'égard de déterminants d'hydrate de carbone hors-coeur sur des molécules accessibles qui sont communs à au moins deux espèces bactériennes. Par "accessible", on entend que les déterminants d'hydrate de carbone hors-coeur sont physiquement à même dans le milieu d'utilisation d'une interaction directe avec les anticorps monoclonaux. Les anticorps monoclonaux qui font l'objet de l'invention sont utiles pour le traitement ou la prophylaxie de maladies graves induites par de nombreuses infections bactériennes. De plus, les molécules d'hydrates de carbone hors-coeur qui sont dégagées dans le milieu ambiant sont également capables d1 une interaction directe avec les molécules d'anticorps et sont éliminées a l'intervention du système réticuloendothélial .

Les compositions contenant les anticorps monoclonaux de la présente invention seront typiquement utiles pour le traitement thérapeutique et prophylactique d'infections nosocomiales, néonatales et autres.

Du fait que les infections nosocomiales sont typiquement des infections produites par les bactéries suivan-tes: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ,

Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes/cloacae, Serratia marcescens et Streptococcus agalactiae groupe B, les compositions d'anticorps protégeant contre deux, trois, quatre ou davantage de ces bactéries seraient préférées.De même, en médecine néonatale, par exemple contre la sepsie et la méningite néonatales, il est souhaitable que les anticorps soient spécifiques de deux - ou davantage des organismes bactériens suivants: Escheri chia coli Kl, Neisseria meningitidis groupe B, Strepto-

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12 v coccus agalactiae groupe B et Hemophilus influenzae type B. D'autres bactéries infectieuses communes C sont notamment: Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis , Streptococcus pneumoniae, Proteus mirabilis , Proteus vulgaris, Bacteroides fragilis, Pseu-domonas cepacia, Mycobacterium tuberculosis, Provi-dencia morganii, Salmonella typhi f Pneumocystis carinii, Acinetobacter herellea, Pasteurelia multocida, Klebsiella oxytoca. A propos d'autres bactéries pathogènes en cause connues du spécialiste en la matière, on peut se référer à Hughs, J.M., et al., "Nosocomial Infection Surveillance, 1980-1982," Morb. Mort. Weekly Report, 32:1SS-16SS (1983), et, de façon générale, à Microbiology, 3e édition, Davis, B.D. , Dulbecco, R., Eisen, H.N. Ginserberg, H.S., Wood, W.B., et McCarty, M., Eds., Harper and Row (1980), ces deux documents étant repris ici à titre de référence. Les anticorps monoclonaux réagissent avec les membres individuels ou tous les membres d'une espèce bactérienne particulière lorsque ces membres peuvent être distingués par leurs épitopes de surface, en par-ticuler le LPS ou les sites de la capsule, par exemple les sérotypes.

La découverte inattendue de la réactivité croisée d'anticorps monoclonaux avec différentes espèces bactériennes, notamment les espèces cliniquement importantes énumérées ci-dessus, offre' un nouveau moyen pour des traitements thérapeutiques et prophylactiques.

En utilisant en combinaison des anticorps à réactivité croisée préalablement sélectionnés, il est possible de former un mélange de quelques anticorps pour un traitement contre de nombreuses espèces différentes de bactéries infectieuses.

A titre d'exemple non limitatif, un mélange de s deux anticorps monoclonaux, dont l'un donne une réaction croisée avec au moins deux espèces bactériennes d'impor-

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13 ψ tance clinique et dont le second donne une réaction croisée avec au moins deux ou trois espèces différentes, c sera utile pour le traitement contre quatre, cinq ou six espèces différentes ou davantage. L'addition d'un troisième ou quatrième anticorps monoclonal dont chacun donne la réaction croisée avec au moins deux espèces cliniquement importantes, même si une ou plusieurs de ces espèces sont les mêmes que celles reconnues par le premier anticorps et/ou le second, augmente l'utilité du traitement jusque contre cinq a dix espèces ou davantage. Il est évident qu'il peut être nécessaire d'ajouter aussi un ou plusieurs anticorps monoclonaux dont chacun est spécifique d'une seule espèce bactérienne choisie au préalable, par exemple lorsque des anticorps r monoclonaux donnant la réaction croisée avec cette es pèce ne sont pas disponibles.

De même, de nouveaux procédés pour traiter les infections bactériennes basés sur cette découverte font l'objet de l'invention. A nouveau, à titre d'exemple et non limitativement, un nouveau procédé consiste à traiter un patient suspect d'être porteur ou susceptible d'une infection bactérienne provoquée par une espèce bactérienne sélectionnée. Le traitement comporte l'administration d'une composition comprenant un anticorps monoclonal réactif avec l'espèce bactérienne suspectée de provoquer l'infection, étant entendu que l'anticorps monoclonal a été initialement caractérisé comme réactif avec une espèce bactérienne différente.

Un autre exemple est un procédé pour traiter des infections bactériennes par administration de compositions comprenant plusieurs anticorps monoclonaux réactifs avec une fraction sensible (par exemple plus de 50%, de préférence 60 à 80% ou davantage et plus v' avantageusement environ 90%) d'espèces bactériennes cliniquement importantes sélectionnées au préalable,

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14 * étant entendu que le nombre des anticorps est inférieur d'au moins environ deux au nombre des espèces bactérien-ç nés. Typiquement, si "n" représente le nombre des es pèces bactériennes, la composition comprendra environ n - 2 anticorps et plus normalement environ n - 4 à n - 8 anticorps sinon moins pour un traitement visant jusqu'à environ 15 à 20 espèces bactériennes. Dans des situations où on souhaite un traitement contre un spectre étendu d'espèces bactériennes (par exemple 25 à 50 ou davantage), la composition comprend normalement n - 10 à n - 20 anticorps, sinon moins.

La préparation des anticorps monoclonaux peut être effectuée en rendant immortelle l'expression des séquences d'acides nucléiques qui codent pour les anticorps - ou leurs fragments de fixation spécifiques à l'égard d'un épitope d'hydrate de carbone hors-coeur présent dans plusieurs espèces bactériennes. Typiquement, les anticorps monoclonaux sont produits en transformant au moyen du virus d'Epsein-Barr par transfert cellulaire des lymphocytes qui proviennent de donneurs humains qui sont ou ont été exposés aux bactéries Gram-négatives respectives. Les lignées cellulaires sécrétant l'anticorps ainsi obtenues se caractérisent comme étant des cellules lymphoblastoïdes à croissance continue qui ont un caryotype diploïde, sont positives à l'antigène nucléaire d1Epstein-Barr (EBNA) et sécrètent un anticorps monoclonal de l'isotype IgG, IgM, IgA ou IgD. Le procédé de transformation par transfert cellulaire lui-même est une invention cédée à la société Genetic Systems Corporation et est décrit en détail dans le brevet EUA n° 4.454.465 mentionné à titre de référence. Les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés à l'état intact ou à l'état de fragments, par » exemple F^ , Fab , F(ab1mais habituellement à l'état intact.

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15 * En variante, les lignées cellulaires produisant l'anticorps pourraient être produites par hybridation c cellulaire entre des cellules lymphoblastoïdes humaines, des cellules de myélome de souris ou des cellules de myélome humaines convenablement marquées par un médicament avec des lymphocytes B humains pour la .formation de lignées cellulaires hybrides.

Les lignées cellulaires de la présente invention peuvent trouver une application autre que la production directe des anticorps monoclonaux humains. Les lignées cellulaires peuvent être hybridées avec d’autres cellules (par exemple des cellules lymphoblastoïdes humaines, des cellules de myélome de souris ou des cellules de myélome humaines convenablement marquées par un médicament) pour la formation d'hybridomes assurant ainsi le transfert des gènes codant pour les anticorps monoclonaux humains. En variante, les lignées cellulaires peuvent être utilisées comme source de 11 ADN codant pour les immunoglobulines, lequel peut être isolé et transféré à des cellules par des techniques autres que l'hybridation. De plus, les gènes codant pour les anticorps monoclonaux peuvent être isolés et utilisés suivant les techniques de 1'ADN recombinant pour la production de l'immunoglobuline spécifique chez différents hôtes. En particulier, en préparant des bibliothèques de cADN à partir d'ARN messagers, il est possible d'isoler un clone de cADN unique,codant pour les immunoglobulines et exempt d'introns,et de l'introduire dans des vecteurs d'expression procaryotes ou eucaryotes appropriés et de le transformer ensuite dans un hôte en vue de la production en masse finale.

Les lignées de cellules lymphoblastoïdes ou ‘hybrides peuvent être clonées et sélectionnées confor-- mément aux techniques habituelles, les anticorps qui sont capables de se fixer sur les épitopes de divers

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16 ^ genres de bactéries étant détectés dans les liquides surnageants des cellules.

^ Les anticorps monoclonaux de la présente in vention ont une utilité particulière comme constituants de compositions pharmaceutiques contenant une quantité thérapeutique ou prophylactique d'au moins l'un des anticorps monoclonaux de l'invention conjointement avec un excipient pharmaceutiquement efficace. Un excipient pharmaceutique peut être toute substance compatible, non toxique convenant pour administrer les anticorps monoclonaux au patient. De l'eau stérile, de 1'alcool , des graisses , des cires et des solides inertes peuvent être compris dans l'excipient. Des adjuvants pharmaceutiquement acceptés (tampons, dispersants) peuvent être incorporés aussi à la composition pharmaceutique. Ces compositions peuvent contenir un ~ seul anticorps monoclonal donnant la réaction croisée avec des épitopes d'hydrate de carbone hors-coeur communs à deux ou plusieurs espèces bactériennes qui provoquent,par exemple,des infections nosocomiales et néonatales (par exemple sepsie ou méningite).

En variante, une composition pharmaceutique peut contenir deux ou plusieurs anticorps monoclonaux pour la formation d'un "cocktail". Par exemple, un cocktail contenant des anticorps monoclonaux humains dont chacun est protecteur contre deux ou plusieurs genres de bactéries Gram-négatives à l’origine d'infections humaines aurait de l'activité contre la grande majorité des isolats cliniques courants. Si la chose est souhaitée, un ou plusieurs des anticorps monoclonaux pourraient être sélectionnés en raison de la réactivité croisée avec des bactéries Gram-positives également , ce qui rend possible des applications encore plus étendues du produit.

Les compositions d'anticorps monoclonaux pro-

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17 phylactiques et/ou thérapeutiques capables de réagir avec des déterminants d'hydrate de carbone hors-coeur 'm .

communs a trois sérotypes de bactéries ou davantage, habituellement au moins cinq, plus habituellement au moins dix et jusqu'à quinze ou vingt sinon plus,qui comprennent au moins deux, d'habitude au moins trois, plus habituellement au moins cinq et en général moins d'environ dix genres de bactéries offrent de l'intérêt.

Un intérêt particulier est offert par les compositions d'anticorps monoclonaux qui réagissent avec au moins environ trois, de préférence au moins environ cinq et jusqu'à et y compris toutes les bactéries courantes ci-après provoquant des infections nosocomiales: Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella pneumoniae , Enterobacter aerogenes/cloacae, Serratia marcescens, et Streptococcus agalactiae groupe B. Pour le traitement des infections néonatales, les compositions réagissent avantageusement avec au moins deux, d'habitude au moins trois et plus habituellement au moins quatre et jusqu'à et y compris tous les genres bactériens ci-après provoquant de l'infection: Escherichia coli Kl, Neisseria meningitidis groupe B, Streptococcus agalactiae groupe B, Hemophilus influenzae type B, Staphylococcus aureus et Staphylococcus epider-midis

Chacune des compositions comprendra au moins deux, d'habitude au moins trois à cinq et plus habituellement six à dix anticorps monoclonaux humains, parmi lesquels au moins un anticorps réagit avec des épitopes d'hydrate de carbone hors-coeur, (par exemple des molécules de LPS) communs à deux ou plusieurs genres bactériens et assure la protection. Typiquement, l'anticorps ne se fixe pas sur tous les sérotypes de chaque bactérie, mais peut se fixer sur deux ou trois sérotypes ou davantage. Il est souhaitable qu'il y ait au moins

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18 * un anticorps monoclonal qui se fixe sur une entité d'hydrate de carbone hors coeur accessible d'au moins ^ deux genres de bactéries Gram-négatives et au moins un anticorps monoclonal qui se fixe sur une entité d'hydrate de carbone accessible d'une bactérie Gram-négative et d'une bactérie Gram-positive.

Le rapport molaire des divers anticorps monoclonaux ne diffère habituellement pas de l'un à l'autre de plus d'un facteur de 10, habituellement pas de plus d'un facteur de 5 et se situe d'habitude dans un intervalle de rapport molaire d'environ 1:1-2 pour chacun des autres anticorps.

Les anticorps monoclonaux humains peuvent aussi trouver leur application individuellement, en - particulier lorsque l'agent pathogène a été identifié ou est limité à un groupe étroit d'agents pathogènes · au sein du spectre de fixation de l'anticorps particu lier .

Les anticorps monoclonaux humains de la présente invention peuvent être utilisés aussi en combinaison avec d'autres anticorps monoclonaux (par exemple, demande de brevet cédée à la Demanderesse,intitulée "Monoclonal Antibodies Cross-Reactive and Protective Against aeruginosa Serotypes , " U.S.S.N. 807,394 du 10 décembre 1985, citée ici à titre de référence) de même qu'avec des produits du plasma sanguin existants, comme de la gammaglobuline et des immunoglobulines commercialisées utilisées pour le traitement prophylactique ou thérapeutique d'une affection bactérienne chez l'être humain. De préférence, pour les immunoglobulines, le plasma est prélevé chez des donneurs humains manifestant des taux élevés d'immunoglobulines réactives à l'égard de divers genres de bactéries infectieuses.

Voir à ce propos de façon générale l'article de synthèse "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host,"

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19 * Amer. J. Med. , J6_(3a) , 30 mars, 1984 , pages 1-231, repris ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent être utilisés sous la forme de compositions administrées séparément données conjointement avec des antibiotiques ou des agents antimicrobiens. Typiquement, les agents antimicrobiens peuvent comprendre une pénicilline ou céphalosporine (par exemple la carbénicilline, la pénicilline G ou analogue) conjointement avec un ami-noglycoside (par exemple la gentamicine, la tobramycine, etc.) , mais de nombreux autres agents (par exemple les céphalosporines, les sulfamides etc.) bien connus du spécialiste en la matière peuvent être utilisés aussi.

Les anticorps monoclonaux humains et leurs b compositions pharmaceutiques conformes à l'invention sont particulièrement utiles pour l'administration par - voie orale ou parentérale. De préférence, les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par voie parentérale, c'est-à-dire sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. Dès lors, l'invention a pour objet des compositions pour l'administration par voie parentérale qui comprennent une solution de l'anticorps monoclonal humain ou d'un cocktail de celui-ci à l'état dissous dans un excipient approprié, de préférence un excipient aqueux. De nombreux excipients aqueux peuvent être utilisés, par exemple l'eau, l'eau tamponnée, la solution physiologique salée à 0,4%, la solution de glycine à 0,3% etc. Ces solutions sont stériles et généralement exemptes de matières particulaires. Ces compositions peuvent être stérilisées suivant les techniques classiques et bien connues de stérilisation. Les compositions peuvent contenir des substances auxiliaires pharmaceutiquement acceptables telles que requises pour - se rapprocher des conditions physiologiques, comme des agents tampons et d'ajustement du pH, des agents d'ajus-

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20 * tement de la toxicité et ainsi de suite, par exemple de l'acétate de sodium, du chlorure de sodium, du chlorure r de potassium, du chlorure de calcium, du lactate de sodium etc. La concentration de l'anticorps dans ces compositions peut varier beaucoup, à savoir être de moins d'environ 0,5% et d'habitude de ou d'au moins environ 1% jusqu'à 15 ou 20% en poids et est choisie principalement sur base des volumes de liquide, des viscosités etc., conformément au mode particulier d'administration qui a été choisi.

Ainsi, une composition pharmaceutique typique pour l'injection intramusculaire pourrait être préparée de façon à contenir 1 ml d'eau tamponnée stérile et 50 mg d'anticorps monoclonal. Une composition typique pour l'injection intraveineuse pourrait être préparée de manière à contenir 250 ml d'une solution de Ringer = stérile et 150 mg d'anticorps monoclonal. Les procédés pratiques pour la préparation des compositions s'administrant par voie parentérale sont connus ou évidents pour le spécialiste en la matière et sont décrits plus en détail, par exemple, dans Remington's Pharmaceutical Science, 15ème édition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvanie (1980), repris ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent être lyophilisés pour la conservation et être redissous dans un excipient approprié avant l'usage. Cette technique s'est révélée efficace avec des immunoglobulines habituelles et les techniques connues de lyophilisation et de redissolution sont applicables. Il est évident pour le spécialiste en la matière que la lyophilisation et la redissolution peuvent conduire à divers degrés de perte de l'activité de l'anticorps (par exemple avec les immunoglobulines habituelles, les anticorps IgM tendent à perdre plus d'activité que les anticorps IgG) et que les concentrations d'usage

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21 * doivent être ajustées en vue de la compensation.

Les compositions contenant les anticorps mono- ^ clonaux humains conformes à l'invention ou un cocktail de ceux-ci peuvent être administrées pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des infections bactériennes. Pour une application thérapeutique, les compositions sont administrées à un patient déjà infecté, en une quantité suffisante pour le guérir ou au moins partiellement arrêter l'infection et ses complications. Une quantité adéquate à cet effet est définie comme "dose thérapeutiquement efficace." Les quantités efficaces à cet effet dépendent de la gravité de l'infection et de l'état général du système immunitaire du patient, mais s'échelonnent en général d'environ 1 à environ 200 mg d'anticorps par kg de poids du corps, les doses de 5 à 25 mg par kg étant plus couramment administrées. Il convient de ne pas perdre de vue que les produits de l'invention peuvent en général être utilisés dans des affections graves, c'est-à-dire des états menaçant l'existence ou susceptibles de menacer l'existence, spécialement la bactériémie et 1'endotoxémie. Dans de tels cas, en raison de l'absence de substances étrangères et de l'absence du rejet de "substance étrangère" qui sont assurées par les anticorps monoclonaux humains de l'invention, il est possible et il peut être perçu comme souhaitable par le médecin traitant d'administrer des excès notables de ces anticorps.

Pour les applications prophylactiques, les compositions contenant l'anticorps de l'invention ou un cocktail de celui-ci sont administrées à un patient qui n'est pas encore infecté par la bactérie en cause( aux fins d'augmenter la résistance du patient contre l'infection possible. Une telle quantité est définie comme "dose prophylactiquement efficace.". A l'usage, les quantités précises dépendent à nouveau de l'état

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22 r de santé et du niveau général d'immunité du patient, mais se situent en général dans l'intervalle de 0,1 * à 25 mg par kg et spécialement de 0,5 à 2,5 mg par kg.

Des administrations uniques ou multiples des compositions peuvent être effectuées à des doses et suivant des programmes choisis par le médecin traitant.

En tout cas, les compositions pharmaceutiques doivent apporter une quantité du ou des anticorps de l'invention qui est suffisante pour traiter efficacement le patient.

Les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent en outre trouver de nombreuses applications in vitro. Par exemple, les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés pour le typage des bactéries, pour l'isolement de souches de bactéries spécifiques ou fragments de celles-ci, pour la préparation de vaccins ~ et ainsi de suite.

Pour les besoins du diagnostic, les anticorps monoclonaux peuvent être marqués ou non marqués. Typiquement, les épreuves pour diagnostic reviennent à détecter la formation d'un complexe par fixation de l'anticorps monoclonal sur le LPS de l'organisme. Lorsqu'ils ne sont pas marqués, les anticorps trouvent leur application dans les épreuves d'agglutination. En outre, les anticorps non marqués peuvent être utilisés conjointement avec d'autres anticorps marqués (seconds anticorps) qui sont réactifs avec l'anticorps monoclonal, par exemple des anticorps spécifiques pour l'immunoglobuline humaine. En variante, les anticorps monoclonaux peuvent être marqués directement. Une grande variété de marqueurs peuvent être utilisés, par exemple des radionucléides , des agents fluorescents, des enzymes, des substrats pour enzymes, des cofacteurs d'enzymes, des in-" hibiteurs d'enzymes, des ligands (en particulier des haptènes), etc. De nombreux types d'immunodosages sont

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23 t possibles, par exemple certains de ces dosages sont décrits dans les brevets E.ü.A. ne 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074 et 4.098.8 76, tous repris ici à titre de référence.

Couramment, les anticorps monoclonaux de la présente invention sont utilisés dans des immunodosages enzymatiques dans lesquels les anticorps en question ou de seconds anticorps d'une espèce différente sont conjugués avec une enzyme. Lorsqu'un échantillon, par exemple du sang humain ou un produit de lyse de celui-ci, contenant une ou plusieurs bactéries d'un certain nombre de genres ou sérotypes est combiné avec les anticorps en question, la fixation se fait entre les anticorps et les molécules qui présentent les épitopes sélectionnés. Ces cellules peuvent ensuite être séparées des réactants qui n'ont pas été fixés et un second anti-„ corps (marqué à l'aide d'une enzyme) est ajouté. Ensuite, la présence du produit de conjugaison anticorps-enzyme spécifiquement fixé aux cellules est déterminée. D'autres techniques classiques bien connues du spécialiste en la matière peuvent être appliquées aussi.

Il est possible aussi de constituer des trousses à utiliser avec les anticorps de l'invention pour détecter l'infection bactérienne ou la présence d'un antigène défini. Ainsi, la composition d'anticorps monoclonal de l'invention peut être présentée, d'habitude sous forme lyophilisée dans un récipient, soit isolément soit conjointement avec des anticorps supplémentaires spécifiques pour d'autres bactéries Gram-négatives. Les anticorps,qui peuvent être conjugués à un marqueur ou ne pas être conjugués,sont contenus dans les trousses avec des tampons, comme du Tris, du phosphate,du carbonate etc., des stabilisants, des biocides, des protéines , inertes, comme de l'albumine de sérum de boeuf,ou ana logues. En règle générale, ces constituants sont présents

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24 , à raison de moins d'environ 5% en poids, sur la base de la quantité d'anticorps actif, et habituellement présents ; en une quantité totale d'au moins environ 0,001% en poids, à nouveau sur base de la concentration en anticorps. Fréquemment, il est souhaitable d'ajouter un excipient ou diluant inerte pour diluer les constituants actifs, auquel cas l'excipient peut être présent en quantité d'environ 1 à 99% du poids de la composition complète. Lorsqu'un second anticorps capable de fixation sur l'anticorps monoclonal est utilisé, il est habituellement contenu dans une fiole distincte. Le second anticorps est typiquement conjugué à un marqueur et mis en composition de façon analogue à la façon des anticorps décrits ci-dessus.

Les données et informations expérimentales ci-après sont présentées à titre d'exemple non limitatif. EXEMPLE I

Le présent exemple illustre des procédés pour la production d'un anticorps monoclonal humain qui manifeste la réactivité croisée intergenre avec divers membres des genres Escherichia coli (E. coli ) , Serratia marcescens (S. marcescens), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) et Enterobacter aerogenes (E. aerogenes).

De plus, le présent exemple illustre l'activité protectrice .in vivo de cet anticorps contre une agression létale par des sérotypes homologues (à réaction croisée) d1E. coli et E^_ aerogenes.

A. Prélèvement de cellules humaines appropriées

On a prélevé des cellules B (lymphocytes) humaines appropriées sur le sang périphérique d'un individu reconnu comme ayant été porteur de fibrose kystique. On a séparé les cellules mononucléaires du sang périphérique suivant les techniques de centrifu-gation habituelles sur Ficoll-Paque (Boyum, A., "Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes From Human

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25 * Blood," Scand. J. Clin, Lab. Invest., 21. Suppl. 9 7:77- 89, (1968 )) et on les a lavées dem fois avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate (PBS) exempte de calcium et de magnésium avant de les mettre en suspension dans 1 ml de 90% de sérum foetal de boeuf (FBS) et 10% de diméthylsulfoxyde et de les congeler à -196eC dans l'azote liquide.

Lorsque les cellules mononucléaires ont dû être transformées , on a décongelé rapidement à 37°C une 7 ampoule contenant 5 x 10 cellules. On a ajouté la suspension des cellules à 10 ml de milieu d'Iscove contenant 15% de FBS et on les a centrifugées à la température ambiante pendant 10 minutes à 250 x g. On a débarrassé les cellules mononucléaires des cellules T (lymphocytes) suivant une technique modifiée de formation de rosettes E. En résumé, on a remis les cellules en suspension à la con-' centration de 1 x 107 cellules/ml dans du PBS contenant 20% de FBS à 4°C.On a introduit 1 ml de cette suspension dans un tube en polystyrène à fond rond de 17 x 100 mm 9 dans lequel on a introduit 1 x 10 globules rouges de mouton traités par le bromure de 2-aminoéthyl-isothio-uronium (AET) à partir d'une solution à 10% (v/v) dans du milieu d'Iscove (Madsen, M. et Johnson, H.E. , "A Methodological Study of E-rosette Formation Using AET Treated Sheep Red Blood Cells," J. Immun. Methods, 2J7:61-74, (1979)). On a agité la suspension vivement pendant 5 à 10 minutes à 4°C et on a séparé les cellules formant des rosettes E par centrifugation à travers du Ficoll-Paque pendant 8 minutes à 2500 x g à 4eC.

On a lavé les cellules mononucléaires du sang périphérique négatives aux rosettes E (E-PBMC), formant bande à l'interface, une fois dans du milieu d'Iscoveet on les a remises en suspension dans ce même milieu contenant * 15% p/v de FBS (g/ml), de la L-glutamine (2 mM/1), du pyruvate de sodium (1 mM/1), de la pénicilline

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26 , (100 UI/ml) , de la streptomycine (100jA.q/ml) , de l'hy poxanthine (1 x ΙΟ“4 M) et de la thymidine (1,6 x 10 ^ M). Ce milieu est appelé ci-après milieu HAT.

B. Transformation par transfert cellulaire des cellules mononucléaires du sang périphérique

On a effectué la transformation par transfert cellulaire des E PBMC en cocultivant les E~PBMC avec une lignée de cellules transformantes. La lignée de cellules transformantes était une lignée de cellules lymphoblastoïdes humaines EBNA-positives issue de la mutagénèse par 1'éthylméthanesulfonate de la lignée de cellules lymphoblastoïdes GM 1500. La sélection en présence de 30/cg/ml de 6-thioguanine a rendu les cellules déficientes en hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-„ transférase et donc HAT-sensibles. La lignée cellulaire est appelée lignée cellulaire 1A2 et a été déposée _ à l'American Type Culture Collection (A.T.C.C.) le 29 mars 1982 sous le n° A.T.C.C. CRL 8119. On a mis les cellules IA2 en phase de croissance logarithmique en suspension dans du milieu HAT et on les a combinées avec les E-PBMC dans un rapport de 30 cellules 1A2 par cellule E*PBMC.

On a déposé le mélange des cellules sur 10 plaques de microtitrage à 96 cupules à fond rond à la concentration de 62.000 cellules/cupule dans un volume de 200y«_l/cupule et on a mis les cultures à incuber à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 6% de CO2. On a alimenté les cultures cinq jours après la transformation en remplaçant la moitié du liquide surnageant par du milieu HAT frais.On a observé les cupules un jour sur deux au microscope inversé pour y déceler les signes de prolifération cellulaire. Dix jours après le dépçt du mélange des cellules et après que les cellules 1A2 eurent été tuées par la sélection par le HAT, on a effectué l'alimentation des cupules avec un milieu neuf identique au milieu HAT, sauf qu'il était exempt d'aminoptérine.

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27 r Quinze jours après le dépôt, on a observé que 100% des cupules contenaient des cellules en prolifération ï et que dans la plupart des cupules, les cellules avaient atteint une densité suffisante pour un prélèvement et la recherche de l'anticorps anti-E. coli ou anti-S. marcescens dans les liquides surnageants.

C. Détection des cellules sécrétant un anticorps spécifique

On a recherché dans les liquides surnageants la présence des anticorps anti-E. coli ou anti-S. marcescens suivant une technique de dosage d'immunosorp-tion avec enzyme combinée (ELISA) (Engvall, E., "Quantitative Enzyme Immunoassay (ELISA) in Microbiology," Med. Biol., 55^:193-200, (1977)). Les plaques d’antigène consistaient en une série de plaques de microtitrage Immunlon 2 à 96 cupules à fond plat, dont les cupules _ contenaient un mélange de sérotypes viables soit d'E_.

coli , soit de S_^ marcescens fixés a la surface des cupules par de la poly-L-lysine (PLL). En résumé, on a introduit 50yttl de PLL ( l^g/ml ) dans du PBS dans chaque cupule pour une durée de 30 minutes à la température ambiante (TA). On a lavé les plaques à trois reprises au PBS et on a introduit dans chaque cupule soit du PBS, soit 50^0-1 d'une suspension de bactéries mixtes ayant une D.O.ggQ de 0,2. On a mis les plaques à incuber à 37°C pendant 60 minutes et on les a lavées 3 fois avec de la solution physiologique salée/0,02% Tween 20 (sérum salé/T) pour éliminer les bactéries non attachées. Les différentes plaques d'antigène utilisées pour la détection comprenaient: 1) un mélange des sérotypes d'E_;_ coli 01 (A.T.C.C. n° 23499) et 04 (A.T.C.C. n° 12791); 2) un mélange des sérotypes de S_^ marcescens 07, 015, 016 et 018 (toutes les souches de typage de référence provenaient du Communicable Disease Center (CDC) Atlanta, GA); et 3) une plaque de microtitrage exempte de bactéries.

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28 * Pour le mode opératoire ELISA, on a bloqué d'abord les cupules d'épreuve avec 200^/Ll d'un mélange - contenant 5% p/v de lait dégraissé sec, 0,0001% de Foam A et 0,01% p/v de Thimerosal dans 500 ml de PBS pour empêcher une fixation non spécifique des protéines.

Après 1 heure d'incubation à TA, on a lavé les plaques trois fois avec 200y<L/plaque/lavage de sérum salé/T.

On a introduit dans chaque cupule 50^/*-l d'un mélange contenant 0,1% de Tween 20 et 0,2% d'albumine de sérum de boeuf dans du PBS (PTB).On a étalé en réplique les surnageants des cupules de la plaque de culture dans les cupules correspondantes des plaques d'antigène et témoin (50ytl/cupule) et on a mis les plaques à incuber à TA pendant 30 minutes. On a séparé ensuite les liquides surna-v géants, on a lavé les plaques cinq fois avec du sérum salé/T et on a introduit dans chaque cupule 50y«.l d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre biotinylée(Ig) (TAGO ne 9303040 dilué à 1:250 dans du PTB) . Après 30 minutes d'incubation à T«, on a séparé le réactant biotinylé, on a lavé les cupules cinq fois avec du sérum salé/T et on a introduit dans chaque cupule 50yt*l d'un complexe préalablement formé avidinecperoxydase de raifort biotinylée (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories). Après 30 minutes à TA, on a évacué le réactant Vectastain ABC, on a lavé les cupules cinq fois avec du sérum salé/T et on a introduit dans chaque cupule lOOyUl de substrat (0,8 mg/ml de dichlorhydrate d'ortho-phénylènediamine dans du tampon au citrate 100 mM, pH 5,0 avec 0,03% de dans l'eau désionisée en mélange en volumes égaux juste avant l'introduction). Après 30 minutes d'incubation dans l'obscurité, on a ajouté 50^1 de 3N dans chaque cupule, pour arrêter la réaction. En mesurant l'absorbance à 490 nm sur lecteur de microELISA Dynatech MR 580, on a ^ détecté les liquides surnageants des cultures conte nant de l'anticorps réactif avec les plaques portant les

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29 * bactéries.

On a analysé suivant le procédé ci-dessus les z liquides surnageants des cultures de six transforma tions ,conduisant à l'identification d'une cupule (7D7) manifestant de l'activité sur les plaques des sérotypes d'E^ coli et marcescens, mais non sur les plaques témoins.On a déterminé par des ELISA ultérieurs avec des sérotypes d'E^ coli distincts que cette cupule contenait un anticorps réactif avec au moins les sérotypes d'E^ coli: 08, (A.T.C.C. ne 23504) et 075 (A.T.C.C. n° 12798), mais non 04, 06:K2, 08:K8, 09:K9 ou 0 22 :K13 (A.T.C.C. n° 12791, 19138 , 23501, 23505 et 23517, respectivement). En outre, cette cupule contenait un anticorps réactif avec les sérotypes de S_^ marcescens 012, 013 et 015, mais non avec aucun autre des vingt sérotypes LPS connus de marcescens.

D. Clonage des cellules produisant l'anticorps spécifique

On a soumis les cellules de la cupule 7D7 à plusieurs passes de clonage (quatre) jusqu'à ce que tous les liquides surnageants des clones,essayés suivant la technique ELISA ci-dessus, donnent une réaction positive avec les sérotypes 08 et 075 d'E. coli et avec les sérotypes 012, 013 et 015 de S_;_ marcescens. Il n'y a eu aucun exemple qu'un liquide surnageant d'un clone manifeste de la ségrégation dans son profil de réactivité, ce qui suggère que le liquide surnageant de la culture de la cupule 7D7 manifeste la réactivité croisée intergenre vrai à l'égard des sérotypes d'E^ coli et S_^ marcescens déjà indiqués et ne contient pas plus d'une seule lignée cellulaire (chacune manifestant une réactivité individuelle au sérotype).On a cloné les cellules par dilution à la limite dans des plaques à 96 cupules à fond rond ~ en l'absence de cellules d'alimentation. Les milieux consistaient en milieu d'Iscove contenant 15% v/v de FBS, /£·

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30 de la L-glutamine (2 mM/litre), du pyruvate de sodium (1 mM/litre) , de la pénicilline (100 Ul/ml) et de la » streptomycine ( 100^g/ml ) . On a alimenté les cultures tous les trois jours en remplaçant la moitié du liquide surnageant par du milieu frais. En général, les cupules ont atteint 2 à 3 semaines après l'étalement une densité suffisante de cellules lymphoblastoïdes pour l'analyse de la spécificité contre les sérotypes d'E^ coli et S. marcescens.

Par conséquent, au cours de cette expérience, on a obtenu une lignée de cellules humaines transformées clonées qui est continue (immortelle) et qui sécrète un anticorps monoclonal humain à l'égard d'un déterminant à la surface des sérotypes indiqués d'E^ coli et S. marcescens.

Avant le dépôt de la présente demande de brevet, la lignée de cellules humaines transformée continue identifiée 7D7 a été déposée à 1'American Type Culture Collection, Rockville,MD sous l'indication A.T.C.C. n° CRL. 9009.

E. Caractérisation plus détaillée de la réactivité intergenre

On a évalué la réactivité intergenre plus générale de l'anticorps de la lignée de cellules 7D7 clonées en appliquant une variante de la technique habituelle de prise d'empreinte. Spécifiquement, on a examiné la réactivité croisée à l'égard des bactéries pneumoniae, E. aerogenes et E_^ cloacae en déposant en gouttes les bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose quadrillé , en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec l'anticorps et en développant les réactions de l'anticorps avec le système enzymatique phosphatase alca-line/bleu de tétrazolium nitré. En résumé, on a déposé des gouttes de 1,0yUl de bactéries (D.O.ggQ = 0,4) par section de quadrillage d'un disque de papier de nitrocel-

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31 , lulose (Schleicher et Schuell, disque de nitrocellulose de 37 mm, quadrillé, 0,45yUm). Chaque disque peut con-tenir facilement 60 échantillons bactériens différents.

On a séché à 1'air les disques portant les gouttes, on les a fixés dans de 11isopropanol à 25% v/v pendant 30 minutes et on les a bloqués pendant 10 minutes dans le réactif au lait déshydraté dégraissé tel que décrit pour le procédé ELISA. On a lavé les disques bloqués à trois reprises pendant 5 minutes dans du PBS/Tween 20 et on les a transférés ensuite dans les couvercles de boîte pour culture de tissu de 35 x 10 mm.On a déposé le liquide surnageant contenant l'anticorps (1,0 ml) dans le couvercle et on a fait l'incubation à TA pendant 60 minutes. Après trois lavages de 5 minutes dans du PBS/Tween 20, _ on a ajouté pour une durée de 60 minutes à TA 1 à 2 ml d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à la phosphatase alcaline diluée à 1:1000 (PBS) (TAGO, Burlingame, CA).Onalavé les disques comme ci-dessus et on les a immergés dans 1 à 2 ml de substrat frais préparé de la façon suivante: on dissout 16,5 mg de phosphate de bromochloroindolyle et 8,5 mg de bleu de tétrazolium nitré dans 50 ml de tampon à la phosphatase alcaline (Tris-HCl 0,1 M, pH 9,5, avec NaCl 0,1 M et MgC^ 5 mM) , on conserve la solution à l'obscurité et on la filtre immédiatement avant l'usage. Après développement chromogène convenable (10-15 minutes), on a arrêté la réaction en rinçant le disque par plusieurs changements de l'eau distillée. Après séchage, on peut conserver les disques développés.

Les disques contenaient 50 souches de référence de K. pneumoniae typéesd'après l'anticorps capsulaire acquises chez le Dr. George Kenney, üniversity of Washington, Department of Pathobiology, Seattle, WA ,, et à l'American Type Culture Collection, 4 isolats de sang en clinique avec E_j_ aerogenes et 6 isolats de

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32 ' sang en clinique avec cloacae (les isolats de sang provenant du Harborview Hospital, Seattle, WA).

On a typé (défini) les isolats d1 Enterobacter au moyen du système API 20E de 23 tests biochimiques standardisés (API Analytab Products, Plainview, NY). Ce mode opératoire identifie le genre et l'espèce des bactéries Gram-négatives, mais non leur sérotype.

Par conséquent, les Enterobacters , au contraire d1E. coli, de marcescens et de K_;_ pneumoniae, ne sont pas identifiés par le sérotype, mais uniquement par le genre et l'espèce.

D'après ces expériences, l'anticorps 7d7 se révèle posséder une réactivité croisée intergenre supplémentaire. Cet anticorps réagit avec les sérotypes suivants: K. pneumoniae E. coli S. marcescens E. aerogenes » K14,57,60 08,75 012,13,15 isolats cliniques

Par conséquent, l'anticorps monoclonal humain 7D7 se révèle manifester la réactivité croisée intergenre à l'égard des bactéries appartenant aux espèces E. coli, S . marcescens , K. pneumoniae , E . aerogenes, mais non E. cloacae.

F. Caractérisation des anticorps monoclonaux

La découverte que l'anticorps monoclonal donne la réaction croisée avec différents genres de bactéries suggère que l'anticorps est dressé contre une protéine ou un hydrate de carbone qui leur est commun. Ces deux espèces moléculaires se sont révélées être à l'origine de la réactivité croisée intragenre (Mutharia, L. et Hancock, R.E.W., "Characterization of Two Surface-Localized Antigenic Sites on Porin Protein F of Pseudo-monas aeruginosa," Canadian J of Microbiol., 31:381-386 , (1985), outre Orskov, F. et Orskov, I., "Serotyping of Escherichia Coli , " dans Methods in Microbiology, volume 14, Bergan, T., éd. Academie Press, Orlando, FL, 43-112

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, (1984)).

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La caractérisation biochimique de l'espèce moléculaire reconnue par l'anticorps 7D7 a été effectuée par analyse d'empreinte. En résumé, les bactéries lavées provenant de 20 ml d'un bouillon de culture de la veille (pour les sérotypes d'E^ coli, S. marcescens et E^ aerogenes) ou de plaques cultivées depuis la veille (K. pneumoniae) ont été soumises à l'extraction dans 1,0 ml d'une solution contenant 64 ml de Tris 50 mM de pH 7,6, 30 ml de glycérol, 0,3 g de désoxycholate (sel de sodium), 0,14 ml de bêta-mercaptoéthanol et 6 ml d'eau désionisée (Schechter, I. et Block, K., "Solubilization and Purification of trans-Formesyl Pyrophosphate-Squalene Synthe-tase," J. Biol. Chem., 246 :7690-7696, (1971)). Après 18 heures d'incubation à 4°C,on a centrifugé la suspension à 10.000 x g pendant 10 minutes. On a séparé le liquide surnageant et dosé quantitativement la protéine au moyen du Bio-Rad Protein. Assay (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). On a soumis des quantités de 100 à 1000 ng de protéine (variant pour chaque extrait bactérien) de chaque bactérie chacune à 11 électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec dodécylsulfate de sodium (SDS) -(Kusecek, B., et^ al. , "Lipopolysaccharide, Capsule, and Fimbriae as Virulence Factors Among 01, 07, 016, 018 or 075 and Kl, K5 or K100 Escherichia coli," Infection and Immunity, 43^368-379 (1984)). On a transféré les espèces moléculaires ainsi séparées du gel sur une membrane de nitrocellulose (NCM) comme décrit par ailleurs (Towbin, H., ejt al_. , "Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications," Proc. Natl. Acad. Sei., 26^4350-4354, (1979)) et on a bloqué l'empreinte sur NCM pendant 1 heure dans du PBS-Tween (Batteiger, B, et al. , "The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Immuno-logical Détection of Proteins transferred to Nitrocel-

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34 ^ lulose Membranes," J. Immunol. Meth. 5_5 :297- 307, (1982)).

On a mis l'empreinte à incuber pendant 1 heure à TA dans 10 ml de liquide surnageant de culture usé de la lignée 7D7. Après quatre rinçages de 5 minutes dans du PBS-Tween, on a mis 1'empreinte à incuber dans de l'Ig anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline et on 1 ' a développée comme décrit ici à propos du dosage sur disque de nitrocellulose avec bactéries. On a observé des réactions positives sur toutes les traces qui contenaient des extraits au désoxycholate des bactéries décrites ici. Dans ces traces, l'anticorps 7D7 s'est révélé reconnaître une série d'entités moléculaires régulièrement espacées donnant naissance à un motif en échelle sur l'empreinte. Ce profil est entièrement compatible avec celui observé dans l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide du LPS en présence de SDS, où il a été démontré que le profil dimensionnel hétérogène manifesté par les bandes est dû à une population de molécules de LPS qui diffèrent par des incréments de poids équivalant au nombre d'unités de chaîne latérale d'oligosaccharide O-antigénique présentes par molécule (Pavla, E.T. et Makela, P.H., "Lipopolysaccharide Heterogeneity in Salmonella typhimurium Analyzed by Sodium Dodecyl Sulfate/Polyacrylamide Gel Electrophoresis , " Eur. J. Biochem., 107:137-143, (1980) outre Goldman, R.C. et Leive, L., "Heterogeneity of Antigenic-Side-Chain Length in Lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2, Eur. J. Biochem., 107:143-154, (1980)). Ces données montrent que l'anticorps monoclonal 7D7 est dressé contre un déterminant antigénique qui est commun aux molécules de LPS qu'on retrouve sur certains sérotypes d'E^_ coli , S. marcescens, K. pneumoniae et E_^ aerogenes.

= Pour définir plus précisément la nature molé culaire de l'antigène, on a traité les extraits au déso-

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35 ^ xycholate, avant leur électrophorèse, au moyen de l'en zyme protéolytique Proteinase K (Eberling, W., et al., "Proteinase K from Tritirachium album Limber," Eur. J. Biochem. 4J7 :91-97 (1974)). Pour préparer l'échantillon, on a ajouté 10^/ug de Protéinase K à 50^g d'échantillon de protéine et on a chauffé le mélange à 65eC pendant 60 minutes. On a soumis les échantillons à l'électrophorèse et à la prise d'empreinte comme décrit plus haut. Après traitement par la protéinase K, les profils des empreintes sont apparus identiques aux profils observés en l'absence de traitement, ce qui suggère que l'antigène réactif avec l'anticorps 7D7 n'est pas de nature protéinique.

Pour élucider spécifiquement si le 7D7 a réagi avec un épitope d'hydrate de carbone, on a soumis l'échantillon au désoxycholate ayant subi l'électrotransfert à une oxydation modérée par le periodate avant de faire réagir le papier de nitrocellulose avec l'anticorps.

Il a été prouvé que cette réaction détruit les déterminants d'hydrate de carbone et donc leur réactivité ultérieure avec l'anticorps, sans affecter les épitopes de lipide ou de protéine (Woodward, M.P., et al., "Détection of Monoclonal Antibodies Specific for Carbohydrate Epitopes Using Periodate Oxidation," J. of Immunol. Methods, 7^:143-153, (1985)). En résumé, après avoir bloqué avec du PBS-Tween, comme décrit ici, le papier de nitrocellulose qui contient l'échantillon ayant subi l'électrophorèse et qui a subi l'électrotransfert, on a rincé le papier avec du tampon acide acétique-acétate de sodium 50 mM de pH4,5. On a mis le papier de nitrocellulose à incuber dans de l'acide périodique 50 mM en solution dans le tampon à l'acide acétique pendant 60 minutes à l'obscurité et à TA.On a rincé le papier ainsi traité trois fois dans du PBS-Tween et on 1 ' a fait réagir avec l'anticorps comme

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36 décrit ici. Les extraits au désoxycholate électro-transférés traités de la sorte n'ont plus été réactifs à l'égard de l'anticorps monoclonal 7D7. Ces résultats indiquent avec netteté que l'épitope reconnu par cet anticorps est un hydrate de carbone présent dans la molécule de LPS des bactéries décrites ici.

L'isotype de l'anticorps monoclonal 7D7 a été déterminé suivant une technique ELISA analogue aux épreuves de spécificité décrites ci-dessus, sauf que de 1'IgG anti-humaine de chèvre biotinylée (spécifique de la chaîne gamma, TAGO) ou de 1'IgM anti-humaine de chèvre biotinylée (spécifique de la chaîne mu, TAGO) a été utilisée comme réactant de second stade au lieu de l'IgM anti-humaine de chèvre biotinylée plus largement réactive. On a pris les deux réactants à la dilution de 1:500 et la plaque d'antigène contenait des amas des souches 08 et 075 d'E^ coli immobilisées par PLL. La réaction positive de l'anticorps monoclonal 7D7 avec les souches d'E_^ coli a été vue uniquement avec le réactant anti IgM ce qui démontre un isotype d'IgM pour l'anticorps monoclonal. Il est évident pour le spécialiste en la matière que si l'opération ci-dessus était répétée plusieurs.fois et que si les isotypes des anticorps monoclonaux à réaction croisée intergenre ainsi obtenus étaient déterminés, on pouvait trouver des isotypes supplémentaires, par exemple IgM et IgG (Frosch, M. , et al_. , "NZB Mouse System For Production of Monoclonal Antibodies to Weak Bacterial Antigens: Isolation of an IgG Antibody to the Polysaccharide Capsules of Escherichia coli Kl and Grop Meningocci," Proc. Natl. Acad. Sei., 82^1194-1198, (1985)).

G. Activité in vitro

On a examiné l'activité fonctionnelle i£ vitro de l'anticorps monoclonal 7D7 au cours d'une épreuve d'opsonophagocytose iri vitro qui compare l'activité

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37 bactérioside de l'anticorps en la présence et en l'ab-sence de neutrophiles humains et aussi du complément humain.

On a préparé les bactéries soit en inoculant 10 ml de bouillon de soya tryptique (TSB) au moyen de 50yU.l d'un bouillon de culture âgé d'une nuit (pour E^ coli, S. marcescens et Ε^_ aerogenes ) soit pour K_^_ pneumoniae en ensemençant par frottis une boîte de Petri contenant de la gélose de Worfel-Ferguson. Pour les cultures en bouillon, on a mis les tubes à incuber à 37°C sur une secoueuse pendant 3 heures au terme desquelles on a centrifugé 1,5 ml de la culture pendant 1 minute à 10.000 x g et rejeté le milieu de culture usé et on a mis le culot en suspension dans 3,5 ml de solution saline équilibrée de Hank contenant 0,1% de gélatine et du HEPES 5 mM (HBSS/gel). Pour les bactéries cultivées sur plaques de gélose, on a transféré par raclage les colonies de la plaque dans du HBSS/gel stérile. On a ajusté les concentrations bactériennes pour les bacté-ries cultivées dans les deux conditions à 3 x 10 bac-téries/ml en mesurant la D.0.56q et en faisant les dilutions appropriées (environ 1:50.000). On a recueilli des neutrophiles humains suivant van Furth et Van Zwet ("In Vitro Determination of Phagocytosis and Introcel-lular Killing by Polymorphonuclear and Mononuclear Phagocytes," dans Handbook of Experimental Immunology, volume 2, D.M. Weir, ed., 2e édition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 36.1-36.24 (1973)) avec quelques modifications. On a déposé la couche leucocytaire de 10 ml de sang hépariné sur du Ficoll-Paque et on l'a centrifugée. On a lavé le culot de globules rouges (GR) une fois avec du milieu RPMI 1640 et on l'a remis en suspension dans un volume égal de PBS à 37°C. On a ajouté 3 ml de cette suspension à 6 ml de dextrane à 2% (dans du PBS à 37°C) et on a mélangé le contenu doucement mais

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« 38 soigneusement par culbutement. Après 20 minutes d'in- cubation à 37°C pour laisser sédimenter les GR, on a séparé le liquide surnageant (contenant les neutrophiles) on l'a lavé deux fois dans du PBS a 4°C et une fois dans du HBSS/gel, puis on l'a remis en suspension dans celui-ci à 5 x 10 neutrophiles/ml. Pour la source du complément utilisé avec E_^ coli et marcescens , on a adsorbé du sérum humain deux fois sur des pools de bactéries vivantes (Bjornson, A.B. et Michael, J.G., "Factors in Human Serum Promoting Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa I. Interaction of Opsonins with the Bacterium," J. of Inf. Dis., 130Suppl:S119-S126 (1974)) correspondant aux organismes utilisés pour l'épreuve. On a adsorbé ce sérum une fois encore sur du Zymosan bouilli (Bjornson, supra) pour séparer la propéridine constitutive du sérum, qui est une molécule nécessaire pour l'activation de l'autre voie du complément. Pour les épreuves d'opsonophagocytose avec K. pneumoniae et E^_ aerogenes, la source du complément a été du sérum humain normal non adsorbé utilisé à la concentration finale de 1%.

On a préparé les plaques utilisées pour la détermination quantitative du nombre de bactéries survivantes/ détruites en commençant par chauffer des plaques à 24 cupules pendant 3 à 5 heures à 37eC. On a préparé une solution à 0,4% d'agarose dans le TSB en autoclavant le mélange pendant 5 minutes et en le laissant refroidir jusqu'à 50°C au bain-marie. Environ 15 minutes avant la fin de l'incubation finale dans l'épreuve d'opsono-phagocytose, on a retiréuneplaque à 24 cupules de l'incubateur à 37°C, on l'a posée sur une plaque chauffante à 42°C et on a introduit dans chaque cupule 0,4 ml de TSB/agarose. On a remis la plaque immédiatement dans l'incubateur à 37°C afin que l'agarose ne refroidisse jamais au-dessous de 37°C.

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Pour 1 ' épreuve , on a déposé 25jjl\ du liquide surnageant de la culture de 7D7 et 251 d'une souche bactérienne appropriée en double exemplaire dans des « plaques de microtitrage à 96 cupules à fond rond qu'on a fait incuber à TA pendant 30 minutes. Ensuite, on a ajouté 15jjCL de complément humain, 15^/iJ. de neutrophiles humains (5 x 10^/ml) et 70de HBSS/gel. On a épongé 1 'ensemble de la surface de la plaque avec un tampon de coton stérile, on a posé un couvre-plaque en matière plastique adhé-sive pour couvrir efficacement toute la plaque et les régions séparant les cupules et on a fait tourner la plaque à 37°C pendant 1 heure. Après incubation, on a centrifugé la plaque pendant 5 minutes à 100 x g, on a détaché prudemment le couvre-plaque et on a séché la surface de la plaque avec un tampon de coton stérile trempé dans l'éthanol à 70%. On a prélevé 50y*.l dans chaque cupule de microtitrage qu'on a déposés dans des cupules distinctes des plaques à 24 cupules pour détermination quantitative contenant déjà 0,4 ml/cupule de TSB/agarose à 0,4% fondu (38-40°C). On a mis ces plaques sur une secoueuse plane pendant 1 minute à 150 tours par minute et on a laissé l'agarose durcir pendant 15 minutes à TA. Finalement, on a introduit dans chaque cupule une couche surnageante de 0,4 ml de TSB/agarose qu'on a fait durcir pendant 15 minutes à 4°C avant de mettre les plaques à incuber jusqu'au lendemain à 37°C. Après 18 heures, on a dénombré les colonies et on a noté les résultats en unités formant colonies (CFU) pour chaque condition.

Les sérotypes bactériens utilisés ici,sauf K. pneumoniae, sont uniquement inactivés en présence de l'anticorps monoclonal 7D7, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (tableau 1). Lorsqu'on répète cette expérience avec différents sérotypes bactériens non réactifs avec le 7D7, on ne constate pas de destruction des bactéries (données non indiquées),

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40 * ce qui démontre la spécificité fonctionnelle de l'anti corps monoclonal 7D7 et sa capacité d'opsoniser les . bactéries et de favoriser leur phagocytose. Comme les actions combinées des opsonines (anticorps spécifiques) et des leucocytes polymorphonucléaires (neutrophiles) se sont révélées constituer le mécanisme principal de l'immunité contre ces souches bactériennes, ces données suggèrent que l'anticorps 7D7 pourrait, après administration appropriée, assurer la protection contre les agressions létales par les sérotypes bactériens décrits ici.

TABLEAU 1

Bactéries Neutro- Anti- Com- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ _ _ d'origine, % E. coli + 7D7 -a 0 08 et 075 E^ CQli + 6Fllb + 0 08 et 075 E, co li 7D7 + 0 08 et 075 E. coli + 7D7 + 85% 08 et 075 S. marcescens + 7D7 - 0 012 et 015 S. marcescens + 6F11 + 0 . 012 et 015 S. marcescens - 7D7 + 0 012 et 015 S. marcescens + 7D7 + 85% 012 et 015 E. aerogenes + 7D7 - 0

Isolats (2) E, aerogenes + 6F11 + 0

Isolats (2) E. aerogenes - 7D7 + 0

Isolats (2) E. aerogenes + 7D7 + 85% >-· Isolats (2)

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41 a (-) = complément humain inactivé par la chaleur (56°C pendant 30 minutes).

b (6F11) = liquide surnageant d'une culture contenant un anticorps monoclonal humain IgM contre Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2 H. Activité in vivo

Pour vérifier l'hypothèse ci-dessus, on a exécuté des études de protection sur animal au moyen de 11 anticorps 7D7 et au moins un organisme choisi entre les espèces coli et aerogenes décrites ici. En premier lieu, on a concentréàpartir du liquide surnageant des cultures usées les anticorps 7D7 et témoin négatif (6F11, anticorps monoclonal humain IgM. spécifique contre Pseudomonas aeruginosa Fisher immunotype 2) par précipitation au moyen de sulfate d'ammonium solide (concentration finale 50%) (Good, A.J. et al., "Purification of Immunoglobulins and Their Fragments," in Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B.B. et Shiigi, S.M. , eds., W.H. Freeman and Company, San Francisco, CA (1980) 279-286). On a redispersé dans de l'eau stérile la substance précipitée et on l'a dialysée abondamment contre du PBS.

On a purifié 1'anticorps IgM dans le précipité par le sulfate d'ammonium par une chromatographie d'affinité sur une colonne d'affinité avec anticorps IgM anti-humain monoclonal de souris. Pour préparer la colonne, on a mélangé 1 g de Sepharose 4B (Pharmacia) activé au bromure de cyanogène et déshydraté avec 15 ml de HCl ImM glacé dans de l'eau distillée. On a lavé le gel hydraté dans 30 ml de tampon de couplage (carbonate (NaHCO^) 0,1 M dans le NaCl 0,5 M, pH 8,2), on l'a égoutté pour obtenir une masse humide et on a mélangé celle-ci avec le précipité par le sel d'ammonium dissous dans 1 à 3 ml de tampon de· couplage. On a mélangé la suspension du gel par culbutement pendant 2 heures à TA et

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42 » on 11 a centrifugée ensuite à 200 x g pendant 5 minutes.

Pour bloquer les sites réactifs encore accessibles, on v a séparé le liquide surnageant,on a ajouté au gel 10 ml d1éthanolamine IM et poursuivi l'opération de mélange comme ci-dessus. On a centrifugé la suspension à 200 x g pendant 5 minutes et on a rejeté le liquide surnageant.On a préparé le gel en vue de l'utilisation par un lavage dans du tampon acétate 0,1 M/sérum salé (on dissout 6,8 g d'acétate de sodium trihydraté et 14,6 g de NaCl dans 500 ml d'eau distillée contenant 2,9 ml d'acide acétique glacial, pH 4,0), deux lavages dans du tampon de couplage et deux lavages dans du PBS.

On a versé le gel dans une colonne Pharmacia C10/10 et on l'a conservé à 4°C jusqu'à son utilisation.

* Pour purifier l'immunoglobuline, on a dilué 0,5 ml de la matière fractionnée par le sel jusqu'à 2,0 ml dans du PBS et on l'a introduit dans la colonne d'affinité.

Après l'introduction de l'échantillon, on a lavé.la colonne avec du PBS de pH 8,0 jusqu'à ce que le moniteur d'absorbance indique qu'il n'y a plus de protéine dans le flux. On a élué l'anticorps combiné avec du MgC^ 2 M dans le PBS,on a déterminé la concentration de la protéine pour chaque fraction à D.O._or. et on a rassemblé

^oU

les fractions des pics. On a dessalé la fraction contenant l'anticorps sur une colonne de Sephadex G-25 et, si nécessaire, on 1'a concentrée par centrifugation à microconcentration (Centricon 30, Amicon Corp., Danver, MA) jusqu'à 1-2 mg/ml. On a vérifié la pureté de la préparation finale par électrophorèse sur gel de polyacryl-amide avec SDS suivie de coloration des protéines par le nitrate d'argent (Morrissey, J.H., "Silver Stain for Proteins in Polyacrylamide Gels : A Modified Procedure with Enhanced Uniform Sensitivity, " Anal. Biochem., (1981) 117:307-310), outre l'activité de l'anticorps par ELISA comme indiqué ici.

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43 4 Pour chaque agression bactérienne, on a réparti des souris femelles Swiss-Webster d'élevage sélectionné d'un poids de 20 à 22 g en trois groupes de dix animaux chacun. On a mené une expérience représentative comme ci-après:

Groupe Bactéries Anticorps A Ej_ coli 08 7D7 B E_^ coli 08 6F11 C ^ marcescens 014 7D7

Dans chaque groupe recevant l'anticorps, on a injecté par voie intraveineuse 2001 de PBS stérile contenant 25jjlg d'anticorps purifié. Après 2 heures, on a agressé tous les animaux par voie intrapéritonéale au moyen de 300^1 de bactéries vivantes contenant 3 DL,_q de la souche bactérienne respective. On a préparé cette suspension bactérienne à partir d'un bouillon de culture en phase de croissance logarithmique dont on a centrifugé les bactéries qu'on a lavées deux fois dans du PBS et qu'on a remises en suspension à la concentration appropriée dans du PBS.On a observé les animaux pendant 5 jours.

Tous les animaux du groupe B (anticorps non compétent.) et du groupe C (organisme non compétent) sont morts 24 à 48 heures après l'agression. Au contraire, les animaux ayant reçu l'anticorps 7D7 (groupe A) sont tous vivants et exempts de symptômes.

On a appliqué ce modèle de protection sur animal pour démontrer l'effet thérapeutique de l'anticorps 7D7 contre des agressions bactériennes par des organismes appartenant aux trois genres indiqués ici. Un résumé des résultats est présenté au tableau 2.

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44 # TABLEAU 2

Bactéries agressantes Anti- Survivants/ Survivants _ corps Agressés _%_ coli 08 7D7 10/10 100 E. coli 08 6Flla 0/10 0 S. marcescens 014b 7D7 0/10 0 L'anticorps 6F11 est spécifique de Pseudomonas aeruginosa Fischer immunotype 2 et sert d'anticorps témoin négatif.

k S^ marcescens 014 n'est pas réactif avec l'anticorps 7D7 et sert d'organisme témoin non spécifique.

TABLEAU 2a c

Survivants, %

Jour

Anticorps 0_1_2_3_4 6F11 12 2 2 1 1 7D7 12 10 6 4 4 c , f

Les études de DL^q et de protection ont été menées sur des souris chez lesquelles on a induit la neutropénie par injection de cyclophosphamide de la façon suivante: jour 0 - 150 mg/kg, jour 2-50 mg/kg.

Au jour 4, les souris ont reçu l'anticorps et les bactéries comme décrit ici.

Ces données démontrent que 1'anticorps monoclonal humain 7D7 est à même de protéger les souris contre des agressions létales par des bactéries appartenant à trois espèces différentes de bactéries Gram-négatives. Comme le 7D7 est réactif avec un épitope d'hydrate de carbone présent sur le LPS, mais que les molécules de LPS sur K_;_ pneumoniae sont moins accessibles (Orskov, I. et Orskov, F., "Serotyping of Klebsiella , " dans Methods in Microbiology, volume Γ4, Bergan,

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45 s T., Ed., Academie Press, Orlando, PL (1984) 143-146)

la protection par l'anticorps 7D7 contre les infections par K. pneumoniae n 1 était pas évidente (données non indiquées). Néanmoins, l'anticorps monoclonal humain 7D7 donnant la réaction croisée intergenre est à même de protéger avec 25^tg d'anticorps purifiés contre une infection par des organismes appartenant aux espèces bactériennes Gram-négatives Ε_^ coli et Ε_^ aerogenes. EXEMPLE II

L'exemple II illustre des procédés pour la production et la sélection d'un anticorps monoclonal humain qui donne la réaction croisée intergenre contre des membres des espèces Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae et Enterobacter aerogenes. En outre, le , présent exemple démontre l'activité opsonique in vitro de cet anticorps contre des sérotypes homologues de S. marcescens, K. pneumoniae et aerogenes. On a répété le mode opératoire de l'exemple I (essentiellement comme décrit dans les parties A à G) pour obtenir un anticorps monoclonal humain qui offre la protection croisée contre des infections induites par les bactéries décrites ici, sauf qu'il a été nécessaire d'opérer des modifications spécifiques pour caractériser et doser l'anticorps décrit dans le présent exemple. Les différences dans les techniques d'épreuve et les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal décrit ici sont les suivants.

1. On a analysé les liquides surnageants de cultures provenant de six transformations en appliquant le procédé ci-dessus, conduisant à l'identification d'une cupule (4F10) qui manifeste de l'activité sur la plaque du sérotype de S^_ marcescens mais non sur la plaque d'E. coli ou la plaque témoin. On a déterminé par des ELISA ultérieurs avec des sérotypes de marcescens distincts que cette cupule contenait de l'anticorps réactif avec les sérotypes 015 et 018 de S_^ marcescens ,

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46 , mais avec aucun des vingt autres sérotypes connus de LPS de marcescens.

; Avant le dépôt de la présente demande de brevet, la lignée cellulaire humaine transformée continue identifiée 4F10 a été déposée à 1'American Type Culture Collection, Rockville,MD sous l'indication A.T.C.C. ne CRL 9007.

2. On a déterminé la réactivité croisée intergenre plus générale de l'anticorps de la lignée cellulaire 4F10 clonée suivant une variante de la technique normale d'empreinte. Spécifiquement, on a étudié la réactivité croisée contre les bactéries Κ^_ pneumoniae, E. aerogenes et cloacae en déposant des bactéries en gouttes sur un disque de papier en nitrocellulose quadrillé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec cet anticorps et en développant les * réactions de l'anticorps avec un système enzymatique phosphatase alcaline/bleu de tétrazolium nitré.

D'après ces expériences, l'anticorps 4F10 se révèle avoir davantage de réactivité croisée intergenre. Cet anticorps réagit avec les sérotypes ci-après : K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes K3,12,29,31,68,72 015,18 Isolats cliniques

Par conséquent, l'anticorps monoclonal humain 4F10 donne la réactivité croisée intergenre avec des bactéries appartenant aux espèces marcescens, K. pneu-moniae , E. aerogenes.

3. Suivant la technique de l'empreinte, on a observé des réactions positives dans toutes les traces qui contenaient des extraits au désoxycholate des bactéries décrites. Dans ces traces, l'anticorps 4F10 s'est révélé reconnaître soit une large bande de composants soit une série d'entités moléculaires régulièrement espacées donnant lieu à un motif en échelle. Ce profil

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47 est complètement compatible avec celui observé dans les analyses par électrophorèse sur gel de polyacryl-ç amide des entités d'hydrate de carbone qui manifestent soit une hétérogénéité de poids moléculaire importante due à une séquence itérative fréquente d'un sucre spécifique ou à des molécules de LPS différant par des incréments de poids équivalant au nombre d'unités de chaîne latérale d'oligosaccharide O-antigénique par molécule (Vimr, E.R. , et al., "Use of Procaryotic-Derived Probes to Identify Poly(Sialic Acid) in Néonatal Neuronal Membranes," Proc. Natl. Acad. Sei., (1983) 81^:1971-1975; et Holden, K.G. et al., "Gel Electropho-resis of Mucous Glycoproteins, I. Effect of Gel Porosity, " Biochemistry (1971) 10_: 3105-3109 ) . Ces données indiquent que l'anticorps monoclonal 4F10 est dressé contre un déterminant antigénique commun aux molécules d'hydrate de carbone retrouvées sur certains sérotypes de marc-escens , E. pneumoniae et E^ aerogenes.

Les diagrammes d'empreinte observés après traitement par la Protéinase K étaient identiques aux diagrammes observés en l'absence de traitement, ce qui suggère que l'antigène réactif avec l'anticorps 4F10 n'est pas de nature protéinique.

Pour définir spécifiquement si le 4F10 réagit avec un épitope d'hydrate de carbone, on a soumis l'échantillon au désoxycholate qui a subi l'électrotransfert à une oxydation modérée par le periodate avant de faire réagir le papier de nitrocellulose avec l'anticorps. Les extraits au désoxycholate électro-transféré traités de cette façon n'étaient plus réactifs avec l'anticorps monoclonal 4F10. Ces résultats suggèrent nettement que l'épitope reconnu par cet anticorps est une entité d'hydrate de carbone présente sur les molécules que possèdent les bactéries décrites ici.

4. On a déterminé l'isotype de l'anticorps mono-

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9 48 clonal 4F10 suivant une technique ELISA semblable aux épreuves de spécificité décrites dans l'exemple I, sauf que la plaque de 11 antigène contenait un pool des sérotypes 015 et 018 de marcescens immobilisés par PLL.

On a observé une réaction positive de l'anticorps monoclonal 4F10 avec les sérotypes de S_^ marcescens uniquement pour le réactant anti-IgM, ce qui démontre un isotype IgM pour l'anticorps monoclonal. Il est évident pour le spécialiste en la matière que si on répétait le mode opératoire du présent exemple plusieurs fois et que si on déterminait les isotypes des anticorps monoclonaux donnant la réaction croisée intergenre ainsi obtenus, on pourrait trouver des isotypes supplémentaires, par exemple des isotypes IgM et IgG.

5. On a déterminé l'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps monoclonal 4F10 par une épreuve d'opsonophagocytose comparant l'activité bactériocide de l'anticorps en la présence et en l'absence de neutrophiles humains et aussi du complément humain.

Les sérotypes bactériens utilisés ici sont inactivés uniquement en présence de l'anticorps monoclonal 4F10 , d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (tableau 3). En répétant cette expérience avec différents sérotypes bactériens qui ne réagissent pas avec 4F10, on n'observe pas de destruction bactérienne (données non indiquées), ce qui démontre la spécificité fonctionnelle de l'anticorps monoclonal 4F10 et sa capacité d'opsoniser les bactéries et de favoriser leur phagocytose.

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49 TABLEAU 3

Bactéries Neutro- Anti- Corn- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ ___d'origine, % S. marcescens + 7D7 -a 0 018 et 015 S. marcescens + 6Fll° + 0 018 et 015 S marcescens - 7D7 + 0 018 et 015 S. marcescens + 7D7 + 85% 018 et 015 K. pneumoniae + 7D7 - 0 K3 et K12 K. pneumoniae + 6F11 + 0 K3 et K12 K. pneumoniae - 7D7 + 0 K3 et K12 K. pneumoniae + 7D7 + 60% K3 et K12 E. aerogenes + 7D7 - 0

Isolats (2) E. aerogenes + 6F11 + 0

Isolats (2) E. aerogenes - 7D7 + 0

Isolats (2) E. aerogenes + 7D7 + 85%

Isolats (2) a (-) = complément humain inactivé par la chaleur (56°C pendant 30 minutes ) .

(6F11) = liquide surnageant d'une culture contenant un anticorps monoclonal humain IgM contre Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2.

EXEMPLE III

L'exemple III illustre des procédés pour la production d'un anticorps monoclonal humain qui est réactif avec Escherichia coli type capsulaire Kl et aussi

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50 avec le polysaccharide de Neisseria meningitidis (N. me-ningitidis) groupe B et démontre en outre l'activité protectrice de cet anticorps in vivo contre une agression létale par des espèces bactériennes homologues d'E. coli et N^_ meningitidis. On a répété le procédé de l'exemple I (essentiellement décrit dans les parties A à G) pour produire un anticorps monoclonal humain offrant la protection croisée contre les infections provoquées par les bactéries décrites ici, sauf qu'il a été nécessaire d'apporter des modifications spécifiques pour caractériser et vérifier l'anticorps décrit dans le présent exemple. Les différences dans les techniques d'épreuve et les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal décrit ici sont les suivants.

1. On a analysé les liquides surnageants de cultures provenant de cinq transformations suivant le procédé ci-dessus, conduisant à l’’identification de quatre cupules (5D4, 2C10, 9B10 et 8A8) contenant une spécificité anti- coli sur la plaque du sérotype d'E^ coli, mais non sur les plaques témoins ou de S. marcescens. Il est ressorti des ELISA exécutés par après effectués comme indiqué ci-dessous sur les différents types d'E^ coli que ces cupules contenaient un anticorps réactif avec au moins les sérotypes d'E. coli : 01 (ATCC 23499), 07:Kl (ATCC 12792), 016:K1 (ATCC 23511) et 050 (CDC 1113-83) , mais non 04 (ATCC 12792) , 06 :K2 (ATCC 19138), 08:K8 (ATCC 23501), 09 :K9 (ATCC 23505) ou 022:K13 (ATCC 23517). En raison de sa meilleure performance pendant l'opération de clonage et de la production plus importante d'anticorps, on a choisi l'anticorps monoclonal 9B10 pour l'analyse plus détaillée.

Avant le dépôt de la présente demande de brevet, la lignée cellulaire humaine transformée continue appelée ici 9B10 a été déposée à 1'American Type Culture Collection, Rockville, MD sous l'indication A.T.C.C.

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51 s n° CRL 9006.

2. La découverte que les anticorps monoclonaux , de chacun des clones réagissent avec le même groupe de sérotypes O-antigène d'E^ coli indique que ces anticorps sont dressés contre une structure de la surface bactérienne commune à ces sérotypes. On a appliqué plusieurs approches pour définir la structure de surface commune à ces sérotypes d'E. coli. Comme indiqué, deux (07:K1 et 016 :K1) des quatre sérotypes d'E^ coli identifiés par l'anticorps 9B10 ont le sérotype capsulaire Kl, tandis que les deux autres (01 et 050) n'ont pas été typés pour leur sérotype K-antigène. Des lors, on a étudié la possibilité que l’anticorps 9B10 contient de la réactivité à l'égard de l'antigène Kl et que les souches d'E^ coli ayant les sérotypes 01 et 050 O-antigène ont aussi le sérotype capsulaire Kl. c. D'autres ont tiré profit de la thermolabilité de la capsule Kl pour établir sa présence. Le chauffage de sérotypes Kl positifs d'E. coli dans un bain-marie à l'ébullition à 100eC pendant 60 minutes élimine l'aptitude ultérieure de ces souches de réagir avec des sérums anti-Kl et améliore leur aptitude à réagir avec des sérums anti-0 antigène (Orskov, F. et Orskov, I., "Serotyping of Escherichia coli," dans Methods in Micro-biology, volume 14, T. Bergan, ed., Academie Press, Londres (1984) pages 44-105). Les effets réciproques de l'ébullition sont le plus probablement dus à l'élimination de la capsule et à l'accessibilité accrue de l'anticorps aux molécules du lipopolysaccharide (LPS).

On a chauffé les sérotypes Kl positifs d'E^ coli (07 et 016) et les sérotypes typés non-Kl (01 et 050) comme indiqué et on les a fait réagir avec l'anticorps 9B10 et des sérums hétérologues spécifiques du sérotype de r LPS (réactants de typage d'E^ coli Bacto de Difco) dans la technique ELISA. Les organismes traités par

CD. MJ

52 - la chaleur perdent toute réactivité à l'égard de l'anti corps 9B10 et ont une réactivité accrue avec leurs v sérums homologues spécifiques du sérotype de LPS tandis que les organismes non traités (témoins) restent très réactifs avec les liquides surnageants de culture 9310 et médiocrement réactifs avec leurs antisérums respectifs spécifiques du sérotype de LPS.

Le polysaccharide (hydrate de carbone) dans la bactérie Neisseria meningitidis groupe B (un homopo-lymère de l'acide sialique ou acide poly-N-acétyl-neuraminique alpha 2,8-lié) s'est révélé chimiquement et antigéniquement homogène avec le polysaccharide Kl d1E. coli (Grados, O. et Ewing, W.H., "Antigenic Relationship between Escherichia coli and Neisseria meningitidis ,11 J. Immunol. (1973) 110 ;262-268). Ces données suggèrent que si l'anticorps monoclonal 9B10 contient i une spécificité à l'égard de la capsule Kl d'E^ coli , cet anticorps devrait aussi contenir une spécificité à l'égard du polysaccharide de N_^ meningitidis groupe B et de plus que des anticorps monoclonaux contenant de la spécificité à l'égard du polysaccharide du groupe B de N_^ meningitidis devraient aussi manifester de la réactivité à l'égard des souches d'E^ coli possédant la capsule Kl.On a appliqué deux protocoles expérimentaux qui vérifient (1) l'aptitude de l'anticorps 9B10 à réagir avec N_^_ meningitidis et (2) l'aptitude de l'anticorps contre le polysaccharide de Ν^_ meningitidis groupe B à réagir avec les quatre sérotypes d'E^ coli réactifs avec 9B10.

On a fait réagir du polysaccharide du groupe B (Connaught Laboratories, Toronto, Canada) hautement purifié et des bactéries N^_ meningitidis groupe B viables avec l'anticorps 9B10 au cours d'une opération ELISA comme indiqué. L'anticorps monoclonal 9B10 a réagi énergiquement contre les deux préparations d'antigène. Pour

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53 , prouver la spécificité réciproque, on a pris une trousse d'épreuve de la méningite par meningitidis groupe B t ("Directagen" Direct Antigen Détection System, Hynson,

Westcott, and Dunning, Baltimore, MD), utilisant des sphères de latex revêtues d'un anticorps monoclonal de souris à l'égard du polysaccharide du groupe B. Lors des épreuves d'agglutination au moyen des sérotypes d'E. coli positifs à 9B10, les quatre sérotypes ont manifesté tous une réactivité intense avec les sphères revêtues de l'anticorps. Les sérotypes d'E. coli connus comme étant négatifs à l'antigène Kl sont négatifs aussi dans ce système d'épreuve. Collectivement, ces données montrent que l’anticorps monoclonal 9B10 est réactif avec la capsule Kl d'E^ coli et l'hydrate de carbone spécifique du type sur meningitidis groupe B. De plus, comme beaucoup de ces essais ont été effectués sur des - bactéries intactes et viables, on peut en déduire que l'anticorps monoclonal 9B10 est spécifique pour une certaine partie de la région exposée extérieurement de la molécule d'acide poly-sialique.

3. L'isotype de l'anticorps monoclonal 9B10 a été déterminé par une opération ELISA semblable aux épreuves de spécificité décrites dans l'exemple 1, sauf que la plaque d'antigène contenait un pool de sérotypes Kl positifs d'E. coli immobilisés par PLL. La réaction positive de l'anticorps monoclonal 9B10 avec les sérotypes d'E^ coli Kl positifs n'a été observée qu'avec le réactant anti-IgM, ce qui démontre un isotype IgM pour l'anticorps monoclonal. Il est évident pour le spécialiste en la matière que si le procédé du présent exemple était répété à plusieurs reprises et que si les isotypes d'anticorps monoclonaux Kl spécifiques ainsi obtenus étaient déterminés , on pourrait trouver des isotypes supplémentaires , par exemple des isotypes IgM et IgG.

4. L'activité fonctionnelle in vitro de l'an-

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54 ticorps monoclonal 9B10 a été examinée par une épreuve d'opsonophagocytose comparant l'activité bactériocide de l'anticorps en la présence et en l'absence tant de v neutrophiles humains que du complément humain.

Les sérotypes d'E^ coli Kl positifs sont uniquement inactivés en présence de l'anticorps monoclonal 9B10, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (tableau 4). Lorsque cette expérience est répétée avec différents sérotypes d'E^ coli Kl négatifs, aucune épreuve de destruction bactérienne n'est observée (données non indiquées), ce qui démontre la spécificité Kl de l'anticorps monoclonal 9B10 et sa capacité d'opsoniser les bactéries et de favoriser leur phagocytose. Du fait que l'action combinée des opsonines (anticorps spécifiques) et des leucocytes polymorphonucléaires (neutrophiles) est apparue comme mécanisme primaire de l'immunité à l'égard des sérotypes d'E. coli Kl positifs, ces données suggèrent que l'anticorps 9B10 pourrait, après administration appropriée, assurer la protection contre une agression létale par tous les sérotypes Kl encapsulés d'E^ coli, indépendamment du sérotype O-antigène.

TABLEAU 4

Bactéries Neutro- Anti- Com- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ _ _ d’origine, % E. coli 01 : Kl + 9B10 -a 0 et 018:K1 E. coli 01:K1 + 6Fllb + 0 et 018:K1 E. coli 01 :K1 - 9B10 + 0 et 018:K1 E^ coli 01:K1 + 9B10 + 99% et 018:K1 N. meningitidis + 9B10 - 0

groupe B

N. meningitidis + 6F11 + 0

groupe B

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55 , TABLEAU 4 (suite)

Bactéries Neutro- Anti- Com- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ _ _ d'origine, % N. meningitidis - 9B10 + 0

groupe B

N. meningitidis + 9B10 + 99%

groupe B

3 (-) = complément humain inactivé par la chaleur (56°C) pendant 30 minutes.

ÎD

(6F11) = liquide surnageant d'une culture contenant un anticorps monoclonal humain IgM contre Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2.

5. Pour vérifier l'hypothèse ci-dessus, des études de protection sur animal ont été exécutées avec l'anticorps 9B10 et différents sérotypes d'E. coli Kl positifs et Kl négatifs, de même qu'un sérotype de N. meningitidis groupe B (souche H313, obtenue chez le Dr. Cari Frasch, Laboratory of Bacterial Polysaccharides, Office of Biologics, Food and Drug Administration, Bethesda, MD).

Pour chaque agression bactérienne, on a réparti des souris femelles Swiss-Webster d'élevage sélectionné d'un poids de 20 à 22 g en trois groupes de dix animaux chacun. On a mené une expérience représentative de la façon suivante:

Groupe Bactéries Anticorps A coli Kl 9B10 B coli Kl 6F11 C coli K2 9B10

Dans chaque groupe recevant l'anticorps, on a injecté par voie intraveineuse 200/*Ί de PBS stérile contenant 25/<-g ; d'anticorps purifié. Après 2 heures, on a agressé tous les animaux par voie intrapéritonéale au moyen de 300/cl

CD. MJ

56 , de bactéries vivantes contenant 3 DLC- de la souche 50 bactérienne respective. La suspension bactérienne a - été préparée à partir d'un bouillon de culture en phase de croissance logarithmique hors duquel les bactéries ont été centrifugées, avant d'être lavées deux fois dans du PBS et remises en suspension à la concentration appropriée dans du PBS. Les animaux ont été observés pendant cinq jours. Tous les animaux du groupe B (anticorps non compétent) et du groupe C (organisme non compétent) sont morts 24 à 48 heures après l'agression. Au contraire les animaux qui ont reçu l'anticorps 9B10 (groupe A) sont tous vivants et exempts de symptômes.

Ce modèle de protection sur animal a été utilisé pour démontrer l'effet thérapeutique de l'anticorps 9B10 contre les agressions bactériennes par des organismes appartenant aux deux espèces indiquées ici. Un résumé de ces données est présenté au tableau 5.

TABLEAU 5

Bactéries agressantes Anti- Survivants/ Survivants _ corps agressés _%_ E. coli Kl 9B10 10/10 100% E^ coli Kl 6Flla 0/10 0% E^ coli K2b 9B10 0/10 0% N. meningitidis 9B10 5/5 100%

groupe B

N. meningitidis 6F11 0/5 0%

groupe B

L·. coli K2 9B10 0/5 0% a L'anticorps 6F11 est spécifique de Pseudomonas aeruginosa Fischer immunotype 2 et sert d1 anticorps témoin négatif.

E. coli K2 n'est pas réactif avec l'anticorps 9B10 et sert d'organisme témoin non spécifique.

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57

Ces données démontrent que l'anticorps monoclonal humain 9B10 est à même de protéger les souris contre des agressions létales par des bactéries appartenant à deux espèces différentes de bactéries Gram-négatives. L'anticorps offrant la protection croisée intergenre est à même de protéger passivement contre une infection par des organismes appartenant aux espèces bactériennes Gram-négatives E_;_ coli et meningitidis groupe B.

EXEMPLE IV

L'exemple IV illustre des procédés pour la production d'un anticorps monoclonal humain qui donne la réactivité croisée intergenre contre des membres des espèces Escherichia coli (E. coli ) , Enterobacter cloacae (E. cloacae) et Streptococcus groupe B. En outre, le présent exemple illustre un anticorps donnant la réaction ς croisée avec des espèces appartenant aux deux principa les classes de bactéries, savoir les Gram-négatives (E. coli et cloacae) et les Gram-positives (Streptococcus groupe B). De surcroît, le présent exemple illustre l'activité protectrice iri vivo de cet anticorps contre une agression létale par des sérotypes homologues d1E. coli et de Streptococcus groupe B. On a répété le procédé de l'exemple I (essentiellement décrit dans les parties A à G) pour produire un anticorps monoclonal humain qui offre la protection croisée contre des infections provoquées par des bactéries décrites ici, sauf qu 'il a été nécessaire d'apporter des modifications spécifiques à la caractérisation et à l'épreuve de l'anticorps décrit dans le présent exemple. Les différences dans les techniques d'épreuve et les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal décrit ici sont les suivants.

1. On a examiné des liquides surnageants pour déceler la présence d'anticorps anti-Streptococcus groupe B suivant une technique d'épreuve d'immunosorp-

CD.MJ

58 tion avec enzyme fixée (ELISA) comme décrit dans l'exemple I. Les plaques de l'antigène consistaient en une * série de plaques de microtitrage Immunolon 2 à 96 cu pules à fond plat, dont les cupules contiennent des mélanges de types capsulaires de Streptococcus groupe B fixés à la surface de la paroi par de la poly-L-lysine (PLL). Les diverses plaques d'antigène utilisées pour l'examen comprenaient: (1) un mélange de Streptococcus groupe B des types la (A.T.C.C. n° 12400), Ib (A.T.C.C. n° 12401), le (A.T.C.C. n° 27591); (2) un mélange des types II (A.T.C.C. n° 12973) et III (isolat clinique obtenu chez le Dr. C. Wilson, Children's Orthopédie Hospital, Dept. Infecious Disease, Seattle, WA); et (3) une plaque de microtitrage sans bactéries.

?/ On a analysé les liquides surnageants de cultures de deux transformations suivant le procédé ci-dessus, ξ conduisant à l'identification d'une cupule (4B9) ayant de l'activité sur les deux plaques de typage de Streptococcus groupe B, mais non sur les plaques témoins.On a déterminé par des opérations ELISA ultérieures avec des types distincts de Streptococcus groupe B que cette cupule contenait un anticorps réactif avec les cinq souches de typage de référence.

Par conséquent, au cours de cette expérience, on a obtenu une lignée cellulaire humaine transformée clonée qui est continue (immortelle) et secrète un anticorps monoclonal humain à l'égard d'un déterminant à la surface des types de Streptococcus groupe B indiqués .

Avant le dépôt de la présente demande de brevet, la lignée cellulaire humaine transformée continue identifiée 4B9 a été déposée à 1'American Type Culture Collection, Rockville, MD. sous l'indication A.T.C.C. n° CRL 9008.

2. On a déterminé la réactivité croisée de

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59 l'anticorps de la lignée cellulaire 4B9 clonée à l'égard de bactéries Gram-négatives et Gram-positives suivant une variante de la technique d'empreintes normale. Spécifiquement, on a étudié la réactivité croisée à l'égard des bactéries E_^_ coli, K. pneumoniae, S. marc-escens, E. aerogenes , E. cloacae, Hemophilus influenzae, et Staphylococcus aureus en déposant en gouttes des bactéries sur un disque de papier en nitrocellulose quadrillé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec l'anticorps et en développant les réactions de l'anticorps avec un système enzymatique phosphatase alcaline/bleu de tétrazolium nitré (comme décrit dans l'exemple I).

D'après ces expériences, l'anticorps 4B9 se - révèle avoir la réactivité croisée avec des espèces bactériennes Gram-négatives particulières. Cet anticorps réagit avec les sérotypes LPS, 04, 07, 018 et 025 d'E^ coli et avec des isolats cliniques d1E. cloacae. Par conséquent, l'anticorps monoclonal humain 4B9 présente la réactivité croisée intergenre entre les bactéries Gram-négatives et Gram-positives appartenant aux espèces E^_ coli, E. cloacae et Streptococcus Groupe B.

3. La découverte que l'anticorps monoclonal donne la réaction croisée avec plusieurs genres de bactéries différents appartenant aux classes des bactéries Gram-positives et Gram-négatives suggère que l'anticorps est dirigé contre une protéine ou un hydrate de carbone qui leur est commun. La caractérisation biochimique des espèces moléculaires reconnues par l'anticorps 4B9 a été effectuée par analyse d'empreinte. Pour l'analyse des genres Gram-négatifs, on a extrait dans du déso-xycholate des bactéries lavées,comme décrit dans l'exemple I. Pour les bactéries Gram-positives, on a recueilli par centrifugation les bactéries de 1,0 litre de bac-

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60 téries cultivées pendant 6 heures dans du bouillon de Todd-Hewitt modifié (Difco, bouillon de Todd-Hewitt contenant 2,8 g/litre de phosphate de sodium anhydre, pH 7,8) à 37^0 et on les a lavées trois fois dans du PBS.

On a remis les bactéries en suspension dans 85 ml de milieu pour protoplasme (40% de saccharose p/v dans du tampon au phosphate de potassium 0,03 M de pH 6,8 contenant du MgC^ 10 mM) et on chauffe la suspension à 37°C pendant 10 minutes. On a ajouté environ 3000 unités de mutanolysine (SIGMA) et on a agité le mélange à 37°C

pendant 90 minutes ou bien jusqu'à ce que la DO,,A dans

bbU

la suspension soit abaissée de>90%. On a centrifugé le produit de digestion à 2000 x g pendant 15 minutes à TA et on a dialysé le liquide surnageant contre du PBS pendant 48 heures (Young, M.K. et Mattingly, S.J., "Biosynthesis of Cell Wall Peptidoglycan and Polysaccharide Antigens by Protoplasts of Type III Groupe B Streptococcus," J. Bact., (1983) 154 :211-220). On a concentré le produit de dialyse dix fois par dialyse en surpression à travers un filtre PM-10 (Amicon Corp., Danvers, MA).

On a purifié les hydrates de carbone se fixant sur l'agglutinine du germe de blé par chromatographie d'affinité sur une colonne de Sepharose 6MB à la lectine de germe de blé (SIGMA). On a élué le produit de digestion fixé décrit ici hors de la colonne au moyen de 10 ml de N-acétylglucosamine 0,1 Met on a dialysé l'éluat contre de l'eau distillée à 4°C.On a séché par lyophilisation l'éluat purifié par affinité et on a déterminé le poids sec de la matière résultante (Gray, B.M., et al., "Interaction of Group B Streptococcal Type-Specific Polysaccharides with Wheat Germ Agglutinin and Other Lectins," J. or Immunol. Meth. , (1984) 72^269-277). On a noté des réactions positives dans toutes les traces contenant des extraits au désoxycholate des bactéries

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61 décrites ici. Dans les traces contenant des extraits provenant de bactéries Gram-négatives, l'anticorps 4B9 ^ s'est révélé reconnaître une série d'entités molécu laires régulièrement espacées donnant lieu à un motif en échelle sur l'empreinte. Ce profil est entièrement compatible avec celui observé lors de l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide du LPS en présence de SDS, où il a été démontré gue le profil dimensionnel hétérogène manifesté par les bandes est dû à une population de molécules de LPS gui diffèrent par des incréments de poids équivalant au nombre d'unités de chaîne latérale d'oligosaccharide O-antigénique présentes par molécule (Pavla, E.T. et Makela, P.H., supra et Goldman, R.D. et Leive, L. , supra). Dans les traces contenant des extraits provenant des types de Streptococcus groupe B, l'anticorps 4B9 s'est révélé reconnaître des composants présents sur une bande large.

Ce profil est compatible avec celui observé lors des analyses par électrophorèse sur gel de polyacrylamide des entités d'hydrate de carbone qui manifestent une importante hétérogénéité de poids moléculaire avec des séquences de sucres spécifiques fréquemment itératives (Vmir, E.R. et al., supra et Holden, K. G., supra).

Ces données indiquent que l'anticorps monoclonal 4B9 est dirigé contre un déterminant antigénique commun aux molécules trouvées sur certains sérotypes d'E. coli, d1E. cloacae et de Streptococcus groupe B.

Pour définir davantage la structure moléculaire de l'antigène, les extraits au désoxycholate ont été traités au moyen de l'enzyme protéolytique Protéinase K avant leur électrophorèse (Eberling, W., supra). Les diagrammes d'empreinte observés après traitement par la Protéinase K sont identiques aux diagrammes observés en l'absence de traitement,ce qui suggère que l'antigène réactif avec l'anticorps 4B9

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62 * n'est pas de nature protéinique.

Pour définir spécifiquement si le 4B9 réagit * avec un épitope d'hydrate de carbone, on soumet les échantillons au désoxycholate ayant subi l'électrotransfert et la purification d'affinité par agglutination du germe de blé à une oxydation modérée par le periodate avant de faire réagir le papier de nitro-cellulose avec l'anticorps (voir exemple I). Les extraits au désoxycholate ayant subi l'électrotransfert traités de cette façon ne sont plus réactifs avec l'anticorps monoclonal 4B9. Ces résultats suggèrent nettement que l'épitope reconnu par cet anticorps est une entité d'hydrate de carbone présente sur les molécules que possèdent les bactéries Gram-négatives et Gram-po-' sitives décrites ici.

4. On a déterminé l'isotype de l'anticorps monoclonal 4B9 suivant une technique ELISA semblable aux épreuves de spécificité décrites ci-dessus, sauf que la plaque de l'antigène contenait un pool des types II et III de Streptococcus groupe B immobilisés par le PLL. La réaction positive de l'anticorps monoclonal 4B9 avec les souches de Streptococcus groupe B s'observe uniquement avec le réactant anti-IgM, ce qui démontre un isotype IgM pour l'anticorps monoclonal.

5. On a déterminé l'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps monoclonal 4B9 par une épreuve d'opsonophagocytose comparant l'activité bactéricide de l'anticorps en la présence et en l'absence de neutrophiles humains et aussi du complément humain.

Les souches bactériennes utilisées ici sont uniquement inactivées en présence de l'anticorps monoclonal 4B9, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (tableau 6). En répétant cette expérience avec divers sérotypes bactériens ne réagissant pas avec 4B9, on n’observe pas de destruction de bacté-

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63 ^ ries (données non indiquées ), ce qui démontre la spéci ficité fonctionnelle de l'anticorps monoclonal 4B9 et sa capacité d'opsoniser les bactéries et de favoriser leur phagocytose. Du fait que les actions combinées des opsonines (anticorps spécifiques) et des leucocytes polymorphonucléaires (neutrophiles) sont apparues être le mécanisme primaire de l'immunité à l'égard de ces souches bactériennes, ces résultats suggèrent que l'anticorps 4B9 pourrait, après administration appropriée, assurer la protection contre des agressions létales par les souches de bactéries décrites ici.

TABLEAU 6

Bactéries Neutro- Anti- Corn- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ _ _ d'origine, % E. coli + 4B9 -a 0 018 et 025 E. coli + 6Fll^ + 0 018 et 025 E. coli - 4B9 + 0 018 et 025 E. coli + 4B9 + 85% 018 et 025 E. cloacae + 4B9 - 0

Isolats E. cloacae + 6F11 + 0

Isolats E. cloacae - 4B9 + 0

Isolats E. cloacae + 4B9 + 85%

Isolats

Strep. groupe B + 4B9 - 0

types la et III

Strep. groupe B + 6F11 + 0

types la et III

Strep. groupe B - 4B9 + 0

types la et III

Strep. groupe B + 4B9 + 85%

types la et III

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64 £ * (-) = complément humain inactivé par la chaleur (56°C pendant 30 minutes).

(6F11) = liquide surnageant d'une culture contenant un anticorps monoclonal humain IgM contre Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2 6. Pour vérifier l'hypothèse ci-dessus, on a exécuté des études de protection sur animal au moyen de l'anticorps 4B9 et au moins un organisme appartenant à chaque genre décrit ici.

Pour chaque agression par des bactéries Gram-négatives, on a réparti des souris femelles Swiss-Webster d'élevage sélectionné d'un poids de 20 à 22 g en trois groupes de dix animaux chacun. On a mené une expérience représentative de la façon suivante:

Groupe Bactéries Anticorps A coli 018 4B9 B coli 018 6F11 C marcescens 014 4B9

Dans chaque groupe recevant l'anticorps, on a injecté par voie intraveineuse 200/Ll de PBS stérile contenant 25^/rg d'anticorps purifié. Après 2 heures, on a agressé tous les animaux par voie intrapéritonéale au moyen de 300^/tl de bactéries vivantes contenant 3 DL50 de la souche bactérienne respective. La suspension bactérienne a été préparée à partir d'un bouillon de culture en phase de croissance logarithmique à partir duquel les bactéries ont été centrifugées, lavées deux fois dans du PBS et remises en suspension à la concentration appropriée dans du PBS. On a observé les animaux pendant cinq jours.

Tous les animaux du groupe B (anticorps non compétent) et du groupe C (organisme non compétent) sont morts 24 à 48 heures après l'agression. Au contraire, tous les animaux ayant reçu l'anticorps 4B9 (groupe A) sont vi-

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65 vants et exempts de symptômes.

Pour les études de la protection contre Streptococcus groupe B, on a appliqué un modèle sur rat nouveau-né. On a administré l'anticorps et les bactéries essentiellement comme décrit pour les études de protection sur la souris à de jeunes rats Sprague-Dawley d'élevage sélectionné (hébergés avec leur mère) et âgés de moins de 48 heures. Les différences principales étaient les suivantes: 1) les anticorps et aussi les bactéries agressantes ont été injectés par voie intrapéritonéale et 2) le volume d'inoculum a été réduit à 20/H.

On a appliqué ces modèles de protection sur animal pour démontrer l'effet thérapeutique de l'anticorps 4B9 contre des agressions bactériennes au moyen d'organismes appartenant aux trois espèces indiquées ici. Un résumé des résultats est présenté au tableau 7.

TABLEAU 7

Bactéries agressantes Anti- Survivants/ Survivants _ corps agressés %_ E^ coli 025 4B9 10/10 100 E. coli 025 6Flla 0/10 0 T,.

S♦ marcescens 014 4B9 0/10 0

Streptococcus groupe B 4B9 10/10 100

la et III

Streptococcus groupe B 6F11 0/10 0

la et III

S. marcescens 014 9B10 0/10 0 a L'anticorps 6F11 est spécifique de Pseudomonas aeruginosa Fischer immunotype 2 et sert d'anticorps témoin négatif.

b Sj^ marcescens 014 n'est pas réactif avec l'anticorps : 7D7 et sert d'organisme témoin non spécifique.

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66

Ces données démontrent que l'anticorps monoclonal humain 4B9 est à même de protéger la souris et le rat contre des agressions létales par des bactéries de genre appartenant aux deux divisions de bactéries Gram-négatives et Gram-positives. L'anticorps monoclonal humain 4B9 donnant la réaction croisée intergenre est à même d'assurer la protection au moyen de 25yUg d'anticorps purifié contre l'infection par des organismes appartenant au genre coli des bactéries Gram-négatives et par des bactéries Gram-positives appartenant au groupe B de Streptococcus.

EXEMPLE V

L'exemple V illustre des procédés pour la production et la sélection d'un anticorps monoclonal humain : qui manifeste la réactivité croisée intergenre contre des membres des genres Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae et Enterobacter aerogenes. De plus , le présent exemple illustre l'activité opsonique iri vitro de cet anticorps contre les sérotypes homologues de S. marcescens, K. pneumoniae et E^ aerogenes. On a répété le procédé de l'exemple I (essentiellement comme décrit dans les parties A à G) sauf qu'il a été nécessaire d'opérer des modifications spécifiques pour caractériser et essayer l'anticorps décrit dans le présent exemple. Les différences dans les techniques d'épreuve et les résultats obtenus avec l’anticorps monoclonal décrit ici sont les suivants.

1. On a analysé les liquides surnageants de cultures de quatre transformations par le procédé ci-dessus, conduisant à l'identification d'une cupule (7E10) manifestant de l'activité de fixation sur au moins une de quatre plaques de sérotypes de pneumoniae contenant les sérotypes capsulaires; 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, - 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 et 55, mais non sur la plaque témoin (sans bactéries). On a recherché pour

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67 l'anticorps de la lignée cellulaire 7E10 une réactivité croisée intergenre supplémentaire par une modification de la technique d'empreinte normale. Spécifiquement, on a recherché la réactivité croisée à l'égard des bactéries K_^ pneumoniae , E . aerogenes , S . marcescens , E. coli et P^_ aeruginosa en déposant en gouttes des bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose quadrillé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec cet anticorps et en développant les réactions de l'anticorps avec un système enzymatique phosphatase alcaline/bleu de tétrazolium nitré.

D'après ces expériences, l'anticorps 7E10s'est révélé manifester une réactivité croisée intergenre plus générale. Cet anticorps réagit avec les espèces et sérotypes ci-après: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes K2,8,11,12,13,21, 04,12 isolats cliniques 26,29,30,33,42,68,69

Par conséquent, l'anticorps monoclonal humain 7E10 présente la réactivité croisée intergenre avec des bactéries appartenant aux genres K^_ pneumoniae , S. marcescens et aerogenes.

2. On a déterminé l'isotype de l'anticorps monoclonal 7E10 suivant une opération ELISA semblable aux épreuves de spécificité décrites dans l'exemple I, sauf que la plaque d'antigène contenait un pool des sérotypes K8 et Kll de pneumoniae immobilisés par PLL (poly-L-lysine). On observe des réactions positives de l'anticorps monoclonal 7E10 avec les sérotypes de K_^ pneumoniae uniquement avec le réactant anti-IgM, ce qui démontre un isotype IgM pour l'anticorps monoclonal. Il est évident pour le spécialiste en la matière que si le procédé de cet exemple était ; répété à plusieurs reprises et si les isotypes d'anti corps monoclonaux donnant la réaction croisée intergenre

CD.MJ

68 f ainsi obtenue étaient déterminés, on pourrait trouver des isotypes supplémentaires, par exemple des isotypes IgM et IgG.

3. On a examiné l'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps monoclonal 7E10 au cours d'une épreuve d'opsonophagocytose comparant l'activité bac-tériocide de l'anticorps en la présence et en l'absence de neutrophiles humains et aussi du complément humain. Les sérotypes bactériens utilisés ici sont inactivés uniquement en présence de l'anticorps monoclonal 7E10, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (tableau 8). Lorsque cette expérience est répétée avec des sérotypes ne réagissant pas avec l'anticorps 7E10, aucune destruction bactérienne n'est observée (données non indiquées). Ces expériences démontrent la spécificité fonctionnelle de l'anticorps r monoclonal 7E10, de même que sa capacité d'opsoniser les bactéries et de favoriser leur phagocytose.

TABLEAU 8

Bactéries Neutro- Anti- Corn- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ _ _ d'origine, % S. marcescens + 7E10 -a 0 012 S. marcescens + 6F11 + 0 012 S. marcescens - 7E10 + 0 012 S. marcescens + 7E10 + 86% 012 K. pneumoniae + 7E10 - 0 K8 et Kll K. pneumoniae + 6F11 + 0 KÏÏ et Kll K. pneumoniae - 7E10 + 0 K8 et Kll K. pneumoniae + 7E10 + 94% K8 et Kll

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69 TABLEAU 8 (suite)

Bactéries Neutro- Anti- Com- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ _ _ d'origine, % E. aerogenes + 7E10 - 0

Isolat E. aerogenes + 6F11 + 0

Isolat E. aerogenes - 7E10 + 0

Isolat E. aerogenes + 7E10 + 60%

Isolat

^ U

et = voir notes au bas du tableau 3.

EXEMPLE VI

L'exemple VI illustre des procédés pour la production et la sélection d'un anticorps monoclonal humain qui présente la réactivité croisée intergenre " contre des membres des genres Serratia marcescens et

Klebsiella pneumoniae. En outre, le présent exemple démontre l'activité opsonique in vitro de cet anticorps contre des sérotypes homologues de marcescens et K. pneumoniae. On a répété le procédé de l'exemple I (essentiellement comme décrit dans les parties A à G) sauf qu ' il a été nécessaire d'apporter des modifications spécifiques pour caractériser et essayer les anticorps décrits dans le présent exemple. Les différences dans les techniques d'épreuve et les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal décrit ici sont les suivants.

1. On a analysé les liquides surnageants de cultures de quatre transformations suivant le procédé ci-dessus, conduisant à l'identification d'une cupule (8C9) ayant de l'activité de fixation sur au moins une de quatre plaques de sérotypes de K^_ pneumoniae contenant les sérotypes capsulaires: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 et 55, mais non sur la plaque témoin (sans bactéries). On a étudié sur l'anticorps

CD. MJ

70 de la lignée cellulaire 8C9 la réactivité croisée intergenre plus générale par une variante de la technique d'empreinte normale. Spécifiquement, on a examiné 1r l'activité croisée à l'égard des bactéries pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli et aeruginosa en déposant des gouttes des bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose quadrillé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec l'anticorps et en développant les réactions de l'anticorps avec un système enzymatique phosphatase alcaline/bleu de tétrazolium nitré.

D'après ces expériences, l'anticorps 8C9 s'est révélé avoir une réactivité croisée intergenre plus générale. Cet anticorps réagit avec les espèces et sérotypes suivants: K. pneumoniae S. marcescens K5,6,7,14,27,36,55,64 03

Par conséquent, l'anticorps monoclonal humain 8C9 présente la réactivité croisée intergenre à l’égard de bactéries appartenant aux genres K_^ pneumoniae et S. marcescens.

2. On a déterminé l'isotype de l'anticorps monoclonal 8C9 par une opération ELISA semblable aux épreuves de spécificité décrites dans l'exemple I, sauf que la plaque d'antigène contenait un pool des sérotypes K14 et K27 de pneumoniae immobilisés par PLL. La réaction positive de l'anticorps monoclonal 8C9 avec les sérotypes de K. pneumoniae s'observe uniquement avec le réactant anti-IgM, ce qui démontre un isotype IgM pour l'anticorps monoclonal. Il est évident pour le spécialiste en la matière que si on répétait plusieurs fois le procédé du présent exemple et que si on déterminait les isotypes d'anticorps monoclonaux donnant la ; réaction croisée intergenre ainsi obtenue, on pourrait trouver des isotypes supplémentaires, par exemple des

CD.MJ

71 isotypes IgM et IgG.

3. On a examiné l'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps monoclonal 8C9 au cours d'une épreuve d'opsonophagocytose comparant l'activité bac-tériocide de l'anticorps en la présence et en l'absence de neutrophiles humains et aussi du complément humain.

Les sérotypes bactériens utilisés ici sont inactivés uniquement en présence de l'anticorps monoclonal 8C9, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains(tableau 9). Lorsque cette expérience est répétée avec des sérotypes ne réagissant pas avec l'anticorps 8C9, aucune destruction bactérienne n'est observée (données non indiquées). Ces expériences démontrent la spécificité fonctionnelle de l'anticorps monoclonal 8C9, de même que sa capacité d’opsoniser les bactéries et de favoriser leur phagocytose.

TABLEAU 9

Bactéries Neutro- Anti- Corn- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ _ _ d'origine, % S. marcescens + 8C9 -a 0 03 S. marcescens + 6F11° + 0 03 S. marcescens - 8C9 + 0 03 S. marcescens + 8C9 + 70% 03 K, pneumoniae + 8C9 - 0 K14 et 27 K. pneumoniae + 6F11 + 0 K14 et 27 K. pneumoniae - 8C9 + 0 K14 et 27 K. pneumoniae + 8C9 + 93% K14 et 27 a et ^ = voir notes au bas du tableau 3.

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72

EXEMPLE VII

» L'exemple VII illustre des procédés pour la production et la sélection d'un anticorps monoclonal * humain qui présente la réactivité croisée intergenre contre des membres des genres Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes et Enterobacter cloacae. En outre, le présent exemple démontre l'activité opsonique in vitro de cet anticorps contre des sérotypes homologues de S^_ marcescens , K. pneumoniae, E. aerogenes et E^ cloacae. On a répété le procédé de l'exemple I (essentiellement comme décrit dans les parties A à G), sauf qu'il a été nécessaire d'apporter des modifications spécifiques à la caractérisation et à l'épreuve de l'anticorps décrit dans le présent exemple. Les différences dans les techniques d'épreuve et les résultats obtenus avec l’anticorps monoclonal décrit ici sont les suivants.

1. On a analysé les liquides surnageants de cultures de quatre transformations suivant le procédé ci-dessus, conduisant à l'identification d'une cupule (1E4) ayant de l'activité de fixation sur au moins l'une de quatre plaques de sérotypes de pneumoniae contenant les sérotypes capsulaires: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 et 55, mais non sur la plaque témoin (sans bactéries). On a étudié sur l'anticorps de la lignée cellulaire 1E4 une réactivité croisée intergenre plus générale suivant une variante de la technique d'empreinte normale. Spécifiquement, on a examiné l'activité croisée à l'égard des bactéries K, pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli, E. cloacae et aeruginosa en déposant des gouttes de bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose quadrillé,en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec cet anticorps et en développant les réactions de l'anticorps au moyen d'un système enzyma-

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73 g tique phosphatase alcaline/bleu de tétrazolium nitré.

D'après ces expériences, l'anticorps 1E4 s'est révélé avoir une réactivité croisée intergenre » plus générale. Cet anticorps réagit avec les espèces et sérotypes suivants: K.pneumoniae S. marcescens E. aerogenes E, cloacae

Kl,3,8,9,13, 015 isolats isolats 15,29,31,33,36, cliniques cliniques 68,69

Par conséquent, l'anticorps monoclonal humain 1E4 présente la réactivité croisée intergenre à l'égard de bactéries appartenant aux espèces pneumoniae, S. marcescens, E. cloacae et E^ aerogenes.

2. On a déterminé l'isotype de l'anticorps monoclonal 1E4 suivant une opération ELISA semblable aux épreuves de spécificité décrites dans l'exemple I, sauf que la plaque d'antigène contenait un pool des sérotypes K3 et K8 de K_^ pneumoniae immobilisés par PLL. On observe des réactions positives de l'anticorps monoclonal 1E4 avec les sérotypes de K^_ pneumoniae uniquement avec le réactant anti-IgM, ce qui démontre un isotype IgM pour l'anticorps monoclonal.

Il est évident pour le spécialiste en la matière que si on répétait le procédé du présent exemple plusieurs fois et que si on déterminait les isotypes d'anticorps monoclonaux donnant la réaction croisée intergenre ainsi obtenue, on pourrait trouver des isotypes supplémentaires, par exemple des isotypes IgM et IgG.

3. On a examiné l'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps monoclonal 1E4 au cours d'une épreuve d'opsonophagocytose comparant l'activité bac-tériocide de l'anticorps en la présence et en l'absence de neutrophiles humains et aussi du complément humain. Les sérotypes bactériens utilisés ne sont inactivés qu'en présence de l'anticorps monoclonal 1E4, d'une

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74 source de complément actif et de neutrophiles humains (tableau 10). Lorsqu'on répète cette expérience avec des sérotypes ne réagissant pas avec l'anticorps 1E4, on n'observe pas de destruction bactérienne (données non indiquées). Ces expériences démontrent la spécificité fonctionnelle de l'anticorps monoclonal 1E4, de même que sa capacité d'opsoniser les bactéries et de favoriser leur phagocytose.

TABLEAU 10

Bactéries Neutro- Anti- Corn- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ _ _ d'origine, % S. marcescens + 1E4 -a 0 015 b S. marcescens + 6F11° + 0 r 015 S. marcescens - 1E4 + 0 015 S. marcescens + 1E4 + 86% 015 K. pneumoniae + 1E4 - 0 K3 et 29 K. pneumoniae + 6F11 + 0 K3 et 29 K. pneumoniae - 1E4 + 0 K3 et 29 K. pneumoniae . + 1E4 + 80% K3 et 29 E. aerogenes + 1E4 - 0 isolat (2) E. aerogenes + 6F11 + 0 isolat (2) E. aerogenes - 1E4 + 0 isolat (2) E. aerogenes + 1E4 + 80% isolat (2) E. cloacae + 1E4 - 0 ' isolat

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75 TABLEAU 10 (suite)

Bactéries Neutro- Anti- Com- Destruction philes corps plément des bactéries * _ _ _ _ d'origine, % E. cloacae + 6F11 + 0 isolat E. cloacae - 1E4 + 0 isolat E. cloacae + 1E4 + 80% isolat â b et = voir notes au bas du tableau 3.

EXEMPLE VIII

L'exemple VIII illustre des procédés pour la production et la sélection d’un anticorps monoclonal humain qui présente la réactivité croisée intergenre contre des membres des genres Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes et Pseudomonas aeruginosa « En outre, le présent exemple démontre l'activité opsonique in. vitro de cet anticorps contre des sérotypes homologues de marcescens , K. pneumoniae, E. aerogenes et P^ aeruginosa. On a répété le procédé de l'exemple I (essentiellement comme décrit dans les parties A à G) sauf qu'il a été nécessaire d'apporter des modifications spécifiques pour caractériser et éprouver l'anticorps décrit dans le présent exemple. Les différences dans les techniques d'épreuve et les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal décrit ici sont les suivants.

1. On a analysé les liquides surnageants de culturesde quatre transformations suivant le procédé ci-dessus, conduisant à l'identification d'une cupule (9D1) ayant de l'activité de fixation sur au moins l'une de quatre plaques de sérotypes de K_;_ pneumoniae contenant les sérotypes capsulaires: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 24, 27, 31, 43, 44 et 55, mais non sur la plaque témoin

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76 (sans bactéries). On a étudié sur l'anticorps de la lignée cellulaire 9D1 une réactivité croisée intergenre plus générale par une modification de la technique d'empreinte normale. Spécifiquement, on a examiné la réactivité croisée à l'égard des bactéries K^_ pneumoniae , E. aerogenes, S. marcescens, E. coli et P. aeruginosa en déposant des gouttes des bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose quadrillé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec l'anticorps et en développant les réactions de l'anticorps au moyen d'un système enzymatique phosphatase al-caline/bleu de tétrazolium nitré.

D'après ces expériences, l'anticorps 9D1 s'est révélé présenter de la réactivité croisée intergenre plus générale. Cet anticorps réagit avec les espèces et sérotypes ci-après: K. pneumoniae S♦ marcescens E. aerogenes P. aeruginosa E9,13,15,29 , 03,9,15 ,18 isolats F6 33 cliniques

Par conséquent, l'anticorps monoclonal humain 9D1 présente la réactivité croisée intergenre à l'égard de bactéries appartenant aux genres Κ^_ pneumoniae, S. marcescens , E. aerogenes et aeruginosa.

2. On a déterminé l'isotype de l'anticorps monoclonal 9D1 suivant une opération ELISA semblable aux épreuves de spécificité décrites dans l'exemple I, sauf que la plaque d'antigène contenait un pool de sérotypes Kl3 de pneumoniae immobilisé par PLL. La réaction positive de l'anticorps monoclonal 9D1 avec les sérotypes de K^_ pneumoniae s'observe uniquement avec le réactant anti-IgM, ce qui démontre un isotype IgM pour l'anticorps monoclonal. Il est évident pour le spécialiste en la matière que si on répétait le procédé du présent exemple plusieurs fois et que si on déterminait les isotypes des anticorps monoclonaux donnant la réac-

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77 , tion croisée intergenre ainsi obtenue, on pourrait trouver des isotypes supplémentaires, par exemple des isotypes IgM et IgG.

3. On adéterminél'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps monoclonal 9D1 au cours d'une épreuve d'opsonophagocytose comparant l'activité bac-tériocide de l'anticorps en la présence et en l'absence de neutrophiles humains et aussi du complément humain. Les sérotypes bactériens utilisés ici sont uniquement inactivés en présence de l'anticorps monoclonal 9D1, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (tableau 11). Lorsque cette expérience est répétée avec des sérotypes ne réagissant pas avec l'anticorps 9D1, aucune destruction bactérienne n'est observée (données non indiquées). Ces expériences démontrent la spécificité fonctionnelle de l'anticorps monoclonal 9D1, de même que sa capacité d'opsoniser les bactéries et de favoriser leur phagocytose.

TABLEAU 11

Bactéries Neutro- Anti- Corn- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ _ _ d'origine, % S. marcescens + 9D1 -a 0 03 S. marcescens + 6F11d + 0 03 S. marcescens - 9D1 + 0 03 S. marcescens + 9D1 + 87% ÏÏ3 K. pneumoniae + 9D1 - 0 K13 K. pneumoniae + 6F11 + 0 K13 K. pneumoniae - 9D1 + 0 K13 K. pneumoniae + 9D1 + 50% K13

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78 t TABLEAU 11 (suite)

Bactéries Neutro- Anti- Corn- Destruction philes corps plément des bactéries * _ _ _ _ d'origine, % E. aerogenes + 9D1 - 0 isolats (2) E. aerogenes + 6F11 + 0 isolats (2) E. aerogenes - 9D1 + 0 isolats (2) E, aerogenes 4- 9D1 + 70% isolats (2) P. aeruginosa + 9D1 - 0 F6 P. aeruginosa + 6F11 + 0 F6 P. aeruginosa - 9D1 + 0 F6 P. aeruginosa + 9D1 + 75% F6 ci b et = voir notes au bas du tableau 3.

EXEMPLE IX

L'exemple IX illustre des procédés pour la protection d’un anticorps monoclonal humain qui présente la réactivité croisée intergenre contre des membres des espèces Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) , Escherichia coli (E. coli ) et Serratia marcescens ( S . marcescens). En outre, le présent exemple démontre l'activité protectrice in vivo de cet anticorps contre une agression létale par des sérotypes homologues de P_^ aeruginosa, E. coli et marcescens. On a répété le procédé de l'exemple I (essentiellement comme décrit dans les parties A à G) pour produire un anticorps monoclonal humain offrant la réaction croisée contre des infections provoquées s par les bactéries auxquelles il se fixe. Les modifi cations spécifiques au procédé de l'exemple I pour ca-

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79 ractériser et éprouver l'anticorps sont décrites dans le présent exemple. Les différences dans les techniques d'épreuve et les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal sont les suivants.

1. On a recherché dans les liquides surnageants la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa suivant une technique ELISA telle que décrite dans l'exemple I. La plaque d'antigène consistait en une plaque de microtitrage Immunolon 2 à 96 cupules à fond plat (Dynatech,Alexandria, VA) , dont les cupules contenaient un mélange de bactéries immobilisées par la poly-L-lysine (PLL) appartenant aux sept souches de référence Fisher de aeruginosa (Fisher, M.W., et al., J. of Bacteriology (1969) 98:835-836, A.T.C.C. n° 27312-27318).

On a analysé les liquides surnageants de culture d'une transformation suivant le procédé ci-dessus, conduisant à l'identification d'une cupule qui manifeste de l'activité sur la plaque £. aeruginosa, mais non sur la plaque témoin PLL. On a déterminé par des opérations ELISA ultérieures avec les dix-sept sérotypes particuliers de |£_ aeruginosa appartenant à l’International Antigenic Typing Scheme (IATS, A.T.C.C. n° 33348-33364), qu'une cupule principale 9C3 contenait des anticorps qui se fixent sur le sérotype IATS type 1 (Liu, P.V., Int.J.

Syst. Bacteriol. (1983) 33:256-264, repris ici à titre de référence).

Par conséquent, au départ de cette expérience, on a obtenu une lignée cellulaire humaine transformée clonée qui est continue (immortelle) et sécrète un anticorps monoclonal humain unique qui se fixe sur un déterminant à la surface de P^ aeruginosa IATS, type 1.

Avant le dépôt de la présente demande de brevet, la lignée cellulaire humaine transformée continue identifiée 9C3 a été déposée à 1'American Type Culture Collection, Rockville, MD sous l'indication A.T.C.C. n° CRL

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9239.

80 2. On a déterminé aussi sur l'anticorps de la lignée cellulaire 9C3 clonée la réactivité croisée à l'égard de bactéries Gram-négatives et Gram-positives par une modification de la technique d'empreinte normale. Spécifiquement, on a recherché.la réactivité croisée à l'égard des bactéries EL_ coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E. cloacae, Haemophilus influenzae et Staphylococcus aureus en déposant des gouttes de bactéries sur un disque de papier de nitro-cellulose quadrillé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec l'anticorps 9C3 et en visualisant les réactions de l'anticorps au moyen d'un système enzymatique phosphatase alcaline/bleu de tétrazolium nitré (comme décrit dans l'exemple I).

D'après ces expériences, l'anticorps 9C3 s'est révélé se fixer sur le sérotype 06 d'E^ coli et les sérotypes 012 et 014 de JL marcescens. Par conséquent, l'anticorps monoclonal humain 9C3 manifeste la réactivité croisée intergenre contre des bactéries Gram-négatives appartenant aux sérotypes spécifiques des espèces EL_ coli , S. marcescens, et aeruginosa.

3. La découverte que l'anticorps monoclonal donne la réaction croisée avec plusieurs genres bactériens différents suggère que l'anticorps peut se fixer sur un déterminant antigénique qui leur est commun.

La caractérisation biochimique de l'espèce moléculaire reconnue par l'anticorps 9C3 a été faite par analyse d'empreinte comme décrit dans l'exemple I. On a observé des réactions dans les extraits au désoxycholate des sérotypes réactifs de EL_ aeruginosa et coli , mais non de S^_ marcescens. Bien qu'il ne soit pas élucidé pourquoi l'anticorps 9C3 ne réagit pas avec la préparation de £L_ marcescens, il est possible que l'anticorps reconnaisse un épitope conformationnel qui a été détruit

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81 par les traitements de préparation. Pour les extraits bactériens d'E^ coli et P^_ aeruginosa, l'anticorps 9C3 s'est révélé reconnaître une série d'entités moléculaires régulièrement espacées donnant lieu à un motif en échelle sur l'empreinte. Ce profil est entièrement compatible avec celui observé lors de l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide du LPS en présence de SDS, où il a été démontré que le profil dimensionnel hétérogène manifesté par les bandes est dû à une population de molécules de LPS différant par des incréments de poids équivalant au nombre des unités de chaîne latérale d'oligosaccharide O-antigé-nique présentes par molécule (Pavla, E.T., et Makela, P.H., supra, outre Goldman, R.D., et Leive, L. , supra).

Pour définir davantage la nature moléculaire de l'antigène, on a traité les extraits au désoxycholate au moyen d'une enzyme protéolytique, la Protéinase K, avant leur électrophorèse (Eberling, W., supra). Les diagrammes d'empreinte observés après traitement par la Protéinase K sont identiques aux diagrammes observés sans traitement et suggèrent par conséquent que 1'antigène réactif avec l'anticorps 9C3 n'est pas de nature protéinique.

4. On a déterminé l'isotype de l'anticorps monoclonal 9C3 au cours d'une opération ELISA semblable aux épreuves de spécificité décrites ci-dessus, sauf que la plaque d'antigène contenait des bactéries du sérotype Fisher 4 de P^_ aeruginosa. On observe une réaction positive de l'anticorps monoclonal avec la souche de P^ aeruginosa uniquement avec le réactant anti-IgM, ce qui démontre un isotype IgM pour l'anticorps monoclonal.

5. On a examiné in vitro l'activité fonction- c nelle de l'anticorps monoclonal 9C3 au cours d'une épreuve d'opsonophagocytose comparant l'activité bac-

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82 téricide de l'anticorps en la présence et en l'absence de neutrophiles humains et aussi du complément humain.

Les souches bactériennes utilisées ici sont v tuées uniquement en présence de l'anticorps monoclonal 9C3, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (tableau 12). Lorsqu'on répète cette expérience avec différents sérotypes de bactéries ne réagissant pas avec 9C3, on n'observe aucune destruction bactérienne, ce qui démontre la spécificité fonctionnelle de l'anticorps monoclonal 9C3 et sa capacité d'opsoniser les bactéries et de favoriser leur phagocytose. Du fait que l'action combinée des opsonines (anticorps spécifiques) et des leucocytes polymorphonucléaires (neutrophiles) apparaît être le mécanisme principal de l'immunité à l'égard de ces souches bactériennes, ces données indiquent que l'anticorps 9C3, après administration appropriée, offrirait la protection contre des agressions létales par les souches bactériennes décrites ici.

TABLEAU 12

Bactéries Neutro- Anti- Corn- Destruction philes corps plément des bactéries _ _ _ _ d'origine, % coli 06 + 9C3 -(a) 0 IL. coli 06 + 6Fll(b) + 0 E. coli 06 - 9C3 + 0 E. coli 06 + 9C3 + 98% S. marcescens + 9C3 - 0 014 S. marcescens + 6F11 + 0 014 S. marcescens - 9C3 + 0 014 S. marcescens + 9C3 + 94% 014 P. aeruginosa + 9C3 - 0

Fisher 4 P. aeruginosa + 6F11 + 0

Fisher 4

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83 TABLEAU 12 (suite) * Bactéries Neutro- Anti- Com- Destruction phil es corps plément des bactéries d'oriqine, % & - - - - ---1- P. aeruginosa - 9C3 + 0

Fisher 4 P. aeruginosa + 9C3 + 79%

Fisher 4 = complément humain inactivé par la chaleur (56eC pendant 30 minutes), ( ) 6F11 = liquide surnageant d'une culture contenant un anticorps monoclonal humain IgM contre Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2 6. Pour vérifier les caractéristiques de - protection de l'anticorps 9C3, on a exécuté des études de protection sur animal à l'aide d'au moins un organisme de chaque genre décrit ici.

On a utilisé pour les expériences de protection avec P_;_ aeruginosa Fisher 4 et marcescens 014 le modèle sur souris brûlée. Pour chaque agression bactérienne, on a réparti des souris femelles Swiss-Webster d'élevage sélectionné d'un poids de 22-25 g en trois groupes de 7 ou 8 animaux chacun. On a mené une expérience exemplaire de la façon suivante:

Groupe Bactéries Anticorps A P^ aeruginosa F4 9C3 B P^ aeruginosa F4 6F11 C P^_ aeruginosa F2 9C3

La veille de l'expérience, on a rasé chaque souris et on l'a traitée avec un agent épilatoire pour éliminer tout le poil sur le dos (site de la brûlure).

Le jour de l'expérience, chaque animal a reçu dans chaque cuisse 0,1 ml d'une solution saline anesthésiante formée de 0,7 ml de NaCl à 0,85%, de 0,2 ml de xylazine

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84 (à 20 mg/ml) et de 0,1 ml de kétamine (à 100 mg/ml), u de façon que la dose par souris soit de 20 mg/kg de

xylazine et de 180 mg/kg de kétamine. On a fait aux souris une brûlure du troisième degré en épaisseur complète par flamme de gaz sur 10% de la surface totale du corps. Immédiatement après avoir infligé la plaie, on a injecté aux souris sous l'escarre 0,5 ml de liquide de culture usé contenant de l'anticorps à 4eC

préalablement mélangé avec 5 à 10 DLcn de bactéries.

DU

La suspension des bactéries a été préparée à partir d'un bouillon de culture en phase de croissance logarithmique à partir duquel les bactéries ont été centrifugées avant d'être lavées deux fois dans du PBS et remises en suspension à la concentration appropriée dans du PBS. On a observé les animaux pendant dix jours. Tous les animaux du groupe B (anticorps non compétent) et du groupe C (organisme non compétent) sont morts dans les trois à cinq jours succédant à l'agression. Au contraire les animaux ayant reçu l'anticorps 9C3 (groupe A) sont tous vivants et exempts de symptômes(voir tableau 13).

Pour les études de protection contre coli 06, on a réparti des souris Swiss-Webster (20-22 g) en trois groupes de dix animaux chacun. Dans chaque groupe recevant l'anticorps, on injecte par voie intraveineuse 200^m-1 de PBS stérile contenant 25/tg d'anticorps purifié. Après 2 heures, on agresse tous les animaux par voie intrapéritonéale au moyen de 300^1 de bactéries vivantes contenant 3 DLC_ de la souche bactérienne respective (pour les résultats, voir tableau 13).

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85 TABLEAU 13

Expé- Bactéries agressantes Anti- Survivants/ Sur- rience _ corps Agressés vivants % * 1 aeruginosa F4 9C3 5/7 86% P. aeruginosa F4 6Fll^a^ 0/7 0 P. aeruginosa F2^^ 9C3 0/7 0 2 E^ coli 06 9C3 6/10 60% IL·. coli 06 6F11 0/10 0 3 S_^_ marcescens 014 9C3 8/8 100% S. marcescens 014 6F11 0/8 0 ^ L'anticorps 6F11 est spécifique de Pseudomonas aeruginosa Fisher immunotype 2 et sert d’anticorps témoin négatif.

^ ^ p_^ aeruginosa F2 n'est pas réactif avec l'anticorps 9C3 et sert d'organisme témoin non spécifique.

Ces données démontrent que l'anticorps monoclonal humain 9C3 est à même de protéger la souris contre des agressions létales par des bactéries appartenant à trois genres Gram-négatifs. L'anticorps monoclonal humain 9C3 donnant la réaction croisée intergenre est à même d'assurer la protection, au moyen du liquide surnageant de culture contenant de l'anticorps ou bien de l'anticorps purifié,contre l'infection par des organismes appartenant aux genres Gram-négatif coli , S. marcescens et P. aeruginosa.

Des indications ci-dessus, on peut déduire que les lignées cellulaires de la présente invention procurent des compositions d'anticorps monoclonaux humains et de fragments de ceux-ci donnant la réaction croisée avec diverses espèces bactériennes tant Gram-négatives que Gram-positives et la protection croisée contre celles-ci.Ceci permet de mettre au point plus

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86 aisément des compositions prophylactiques et thérapeu-4 tiques qui peuvent être efficaces contre des infections nosocomiales et néonatales dues à la plupart sinon à l'ensemble des genres bactériens. Par combinaison des anticorps, il est possible d'obtenir une protection à large spectre contre une fraction importante, habituellement inférieure à la totalité, des bactéries cliniquement importantes. De plus, les lignées cellulaires procurent des anticorps qui trouvent leur application dans des immunodosages et d'autres opérations bien connues.

Bien que la présente invention ait été décrite avec quelque détail par voie d'illustration et d’exemples pour la clarté de la compréhension, il est évident que certaines adaptations et modifications peuvent être apportées dans le cadre des revendications ci-après.

»

v CD.MJ

Claims (45)

1. 87
2. 1. Composition utile dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'une infection bactérienne, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace de plusieurs anticorps monoclonaux humains ou fragments de fixation de ceux-ci qui sont réactifs avec au moins deux espèces bactériennes d'au moins deux genres, au moins l'un de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci étant capable de réagir spécifiquement avec un épitope d'hydrate de carbone hors-coeur commun à des sérotypes de deux espèces différentes.
3. 2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagit avec au moins un sérotype de chacune des espèces bactériennes Escherichia coli et Neisseria meningitidis.
4. 3. Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que l'espèce Escherichia coli appartient à la classe du type capsulaire Kl et l'épitope est présent sur la capsule Kl.
5. 4. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagit avec des sérotypes d'espèces d'au moins trois espèces et genres bactériens.
6. 5. Composition suivant la revendication 4, caractérisée en ce qu'au moins un de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagit avec au moins un sérotype de chacune des espèces bactériennes Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae et Enterobacter aero-genes ou bien des espèces Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli et Serratia marcescens.
7. 6. Composition suivant la revendication 1, CD. MJ 88 caractérisée en ce qu'au moins une de ces espèces bac-w tériennes est Gram-positive et une seconde est Gram- négative .
8. 7. Composition suivant la revendication 6, caractérisée en ce qu'au moins un de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagit avec au moins un sérotype de chacune des espèces bactériennes Escherichia coli, Enterobacter cloacae et Streptococcus agalactiae groupe B.
9. 8. Composition suivant la revendication 7, caractérisée en ce que ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagissent en outre avec plusieurs sérotypes d1 Escherichia coli .
10. 9. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagit avec au moins un sérotype de chacun d'au moins quatre genres bactériens différents.
11. 10. Composition suivant la revendication 9, caractérisée en ce qu'au moins un de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagit avec un sérotype de chacune des espèces bactériennes Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens et Klebsiella pneumoniae.
12. 11. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que ces espèces bactériennes sont Escherichia coli, Serratia marcescens , Neisseria menin-gitidis , Klebsiella pneumoniae , Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa ou Streptococcus agalactiae groupe B.
13. 12. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagit avec plus d'un sérotype d'au moins une de ces espèces bactériennes.
14. 13. Composition suivant la revendication 1, CD. MJ 89 caractérisée en ce que chacun d'au moins deux de ces ” anticorps est protecteur contre de l'infection causée par des bactéries appartenant à au moins deux genres v différents.
15. 14. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que chacun de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagit spécifiquement avec un épitope d'hydrate de carbone hors-coeur commun à des sérotypes de deux ou plusieurs espèces bactériennes de genres différents et à plusieurs sérotypes d'au moins une espèce, ces espèces comprenant Escherichia coli , Neisseria meningitidis, Serratia marcescens , Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa et Streptococcus agalactiae groupe B. ν’
16. 15. Composition suivant la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle réagit avec au moins cinq de ces espèces.
17. 16. Composition suivant la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle réagit avec toutes les espèces.
18. 17. Composition suivant la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle réagit avec au moins deux sérotypes de chacune d'au moins trois de ces espèces.
19. 18. Composition suivant la revendication 14 , caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un anticorps monoclonal humain qui réagit avec au moins l'une des combinaisons d'espèces bactériennes suivantes: (a) Ε_^_ coli , 5. marcescens et E^ aerogenes; (b) E. coli et N. meningitidis ; (c) coli, E. cloacae et Streptococcus agalactiae groupe B; (d) K_^_ pneumoniae, S. marcescens et E. aerogenes ; (e) K_^_ pneumoniae et marcescens ; (f) K. pneumoniae, S_. marcescens, E. aerogenes et E^_ cloacae; (g) K^_ pneumoniae, S. marcescens , E. aerogenes et P^ aeruginosa ou (h) E^ coli, S. marcescens et aeruginosa.
20. 19. Composition suivant la revendication 18, CD. MJ 90 caractérisée en ce qu'elle contient des anticorps monoclonaux humains distincts qui réagissent avec au moins trois de ces combinaisons d'espèces bactériennes.
21. 20. Composition suivant la revendication 1, utile dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de la sepsie ou de la méningite néonatales , caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité prophylactique ou thérapeutique d'au moins deux anticorps monoclonaux humains ou fragments de fixation de ceux-ci, chacun de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagissant spécifiquement avec un épitope d'hydrate de carbone hors-coeur commun à des sérotypes de deux ou plusieurs espèces bactériennes de genres différents , ces espèces comprenant Escherichia coli Kl, Neisseria meningitidis groupe B, Hemophilus influenzae type B et Streptococcus agalactiae groupe B.
22. 21. Composition suivant la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle réagit avec toutes ces espèces.
23. 22. Composition suivant la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux anticorps monoclonaux humains qui , en combinaison, réagissent avec au moins trois des espèces bactériennes.
24. 23. Composition suivant la revendication 22, caractérisée en ce que les trois espèces bactériennes sont E^_ coli Kl, meningitidis groupe B et agalactiae groupe B.
25. 24. Composition suivant la revendication 1, utile dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique contre un nombre sélectionné au préalable d'espèces bactériennes, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace de deux ou plusieurs anticorps monoclonaux humains ou fragments de fixation de ceux-ci, les anticorps étant capables de réagir avec un total d'au moins quatre des espèces bactériennes. CD. MJ 91
26. 25. Composition suivant la revendication 24, carac- ** térisée en ce que les espèces bactériennes sont Escherichia coli, Serratia marcescens , Neisseria meningitidi s , Klebsiella v pneumoniae, Enterobacter cloacae , Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Hemo-philus influenza, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Proteus mirabilis , Proteus vulgaris, Bacteroides fragilis, Pseudomonas cepacia, Mycobacterium tuberculosis, Providencia morganii , Salmonella typhi, Pneumocystis carinii, Acinetobacter herellea, Pasteurelia multocida ou Klebsiella oxytoca.
27. 26. Composition suivant la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend deux anticorps monoclonaux humains capables de réagir avec au moins cinq des espèces bactériennes.
28. 27. Composition suivant la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend trois anticorps monoclonaux humains capables de réagir avec au moins six des espèces bactériennes.
29. 28. Composition suivant l'une quelconque des revendications 26 et 27, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps monoclonaux humains capables de réagir avec moins que l'ensemble de toutes les espèces bactériennes.
30. 29. Composition suivant la revendication 25, caractérisée en ce que le nombre des anticorps monoclonaux humains est inférieur d'au moins environ deux au nombre des espèces bactériennes.
31. 30. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un agent antimicrobien.
32. 31. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend une fraction de gammaglobuline provenant du plasma de sang humain. * CD. MJ 92 -- 32 - Composition pharmaceutique comprenant une composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend un ex-^ cipient physiologiquement acceptable.
33. 33. Procédé pour inhiber les symptômes d'une affection bactérienne chez un hôte humain, caractérisé en ce qu'il comprend l'administration, à cet hôte, d'une dose thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace d'une composition suivant l'une quelconque des revendications 1 à 31, et d'un excipient physiologiquement acceptable .
34. 34. Procédé pour produire une composition pharmaceutique utile dans le traitement prophylactique ou thérapeutique d'une infection bactérienne, caractérisé en ce qu'il comprend la combinaison de plusieurs ^ anticorps monoclonaux humains tels que cette composi tion réagisse avec au moins deux espèces bactériennes d'au moins deux genres, au moins l'un de ces anticorps monoclonaux ou fragments de fixation de ceux-ci étant capable de réagir spécifiquement avec un épitope d'hydrate de carbone hors-coeur commun à des sérotypes de deux espèces bactériennes différentes.
35. 35. Procédé suivant la revendication 34 de production d'une composition pharmaceutique utile dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de la sepsie ou de la méningite néonatales, caractérisé en ce qu'il comprend la combinaison d'une quantité prophylactique ou thérapeutique d'au moins deux anticorps monoclonaux humains ou fragments de fixation de ceux-ci, chacun de ces anticorps ou fragments de fixation de ceux-ci réagissant avec un épitope d'hydrate de carbone hors-coeur commun à des sérotypes de deux ou plusieurs espèces bactériennes de genres différents et ces espèces comprenant coli Kl, Neisseria meningitidis, Hemophilus ^ influenzae et Streptococcus agalactiae groupe B. C CD.MJ 93
36. 36. Lignée cellulaire immortelle qui sécrète ni un anticorps monoclonal humain ou fragment de fixation , de celui-ci donnant la réaction croisée spécifique avec un épitope comprenant une entité d'hydrate de carbone hors-coeur accessible présente sur au moins deux sérotypes de deux espèces de genres bactériens différents .
37. 37. Lignée cellulaire suivant la revendication 36, caractérisée en ce que l'hydrate de carbone est présent dans les molécules de lipopolysaccharide de sérotypes de deux à quatre espèces de genres bactériens différents.
38. 38. Lignée cellulaire suivant la revendication 36, caractérisée en ce que les espèces bactériennes comprennent au moins une espèce Gram-positive et au moins une espèce Gram-négative.
39. 39. Lignée cellulaire suivant la revendication ^ · 36, caractérisée en ce que les espèces bactériennes sont au moins deux des espèces Escherichia coli, Serratia marcescens , Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa et Streptococcus agalactiae groupe B.
40. 40. Lignée cellulaire suivant la revendication 36, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans la classe formée par les lignées cellulaires ATCC n° CRL 9006, CRL 9007, CRL 9008, CRL 9009 et CRL 9239.
41. 41. Anticorps monoclonal humain ou fragment de fixation de celui-ci capable de se fixer sur un épitope d'hydrate de carbone réactif avec un anticorps monoclonal produit par une lignée cellulaire suivant l'une quelconque des revendications 36 à 40.
42. 42. Procédé pour produire des anticorps mono- ^ * clonaux humains ou fragments de fixation de ceux-ci ca pables de se fixer spécifiquement sur un épitope d'hy- CD.MJ 94 drate de carbone hors-coeur commun à des sérotypes de deux espèces bactériennes différentes, caractérisé en ce qu'il comprend l'isolement de lymphocytes B d'un individu, l'immortalisation de ces lymphocytes B pour former plusieurs clones produisant de l'anticorps, le débrouillage de ces clones en vue de la production d'anticorps spécifiques à l'égard d'un épitope d'hydrate de carbone hors-coeur d'au moins deux espèces bactériennes différentes et la mise en culture de ces clones débrouillés et la collecte de l'anticorps monoclonal ainsi produit.
43. 43. Procédé suivant la revendication 42, caractérisé en ce que les lymphocytes B sont immortalisés par transformation au moyen du virus d'Epstein-Barr.
44. 44. Procédé de production d'un anticorps mono-clonal humain donnant la réaction croisée spécifique avec un épitope d'hydrate de carbone hors-coeur présent dans , au moins deux sérotypes d'au moins deux espèces de genres bactériens différents, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de l'une des lignées cellulaires suivant l'une quelconque des revendications 36 à 40 et la collecte de ces anticorps.
45. 45. Trousse à utiliser pour la détection de la présence d'au moins deux membres d'espèces de genres bactériens différents, laquelle trousse comprend un récipient d'une composition d'anticorps monoclonal contenant au moins un anticorps monoclonal, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal ou un fragment de fixation de celui-ci réagit avec un épitope d'hydrate de carbone hors-coeur commun à au moins deux membres d'espèces bactériennes différentes, outre un marqueur qui procure un signal décelable et qui est fixé par covalence à cet anticorps ou fixé sur un second anticorps réactif avec cet anticorps monoclonal. CD. MJ