LU87809A1 - Exopolymere extracellulaire,son procede de preparation et compositions pharmaceutiques le contenant - Google Patents
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Description
EXOPOLYMERE EXTRACELLULAIRE, SON PROCEDE DE PREPARATION ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LE CONTENANT
CONFIDENTIEL
La présente invention se rapporte à un exopolymère extracellulaire obtenu par culture de souches bactériennes sélectionnées du genre Bifidobacterium et doué de propriétés immunomodulatrices. La présente invention a également pour objet le procédé de préparation de cet exopolymère ainsi que les médicaments contenant le dit exopolymère comme principe actif.
De nombreuses affections comme des allergies, des maladies autoimmunes, des maladies infectieuses ou certains cancers, ont pour commun dénominateur un dérèglement primaire ou secondaire du système immunitaire. Si les immunodéficiences primaires sont rares et généralement d'origine génétique, les déficiences secondaires sont plus fréquentes et leurs causes le plus souvent extrinsèques parmi lesquelles on trouvera la survenue d'infections répétées, le vieillissement, le cancer, des déficits nutritionnels, l'exposition à des substances immunotoxiques et le stress. L'immunothérapie permet de palier aux symptômes des déficiences primaires et de restaurer l'état immunitaire lors de déficiences secondai res.
Un grand nombre d'agents immunothérapeutiques ont été développés, qu'il s'agisse d1immunostimulants ou d'immunosuppresseurs. De façon générale, sous la définition d'immunomodulateur sont regroupés les agents qui améliorent de manière non spécifique la réactivité spécifique de l'hôte ainsi que les mécanismes effecteurs non spécifiques. On distinguera des immunomodulateurs de synthèse et des immunomodulateurs d'origine biologique se regroupant en produits microbiens et extraits d'origine animale, voire humaine, dont les hormones thymiques, les extraits dialysables de leucocytes, les interférons et cytokines.
De fait, l'activation des lymphocytes ou des macrophages, ainsi que leurs intermodulations sont significativement modifiées par l'exposition à des molécules structurelles de microorganismes, ou à des composants biologiquement actifs produits par ces derniers. Une grande variété de bactéries et de produits bactériens ont montré leur influence sur le système immun; cet arsenal d'agents immunomodulateurs d'origine bactérienne indu les mycobactéries et leurs produits, les lipopolysaccharides de bactéries gram -, des entérotoxines de Vibrio cholerae, des produits de Streptococcus. des lipoprotéines et glycoprotéines de diverses bactéries gram -, et des polysaccharides d'origines diverses. Une recherche intensive est actuellement menée dans ce domaine. L'invention apporte un élément supplémentaire à cet édifice qu'est l'immunothérapie puisqu'elle a pour objet un nouvel exopolymère extracellulaire doué de propriétés immunomodulatrices fort intéressantes. Plus précisément, l'invention a pour objet le dit exopolymère tel que défini à la revendication 1, ainsi que le procédé d'obtention de cet exopolymère extracellulaire. D'autres objets de la présente invention apparaîtront à la lecture du texte ci-après. L'exopolymère objet de la présente invention est produit lors de la culture de souches sélectionées de l'espèce Bifidobacterium înfantis lonqum nouvellement isolée, bactérie gram +, présentant des caractéristiques taxonomiques intermédiaires entre Bifidobacterium infantis et Bifidobacterium lonqum. Doué de propriétés immunomodulatrices démontrées expérimentalement, cet exopolymère présente donc un réel intérêt pour le médecine humaine et vétérinaire.
Le procédé selon l'invention se caractérise par le fait que l'on cultive dans un milieu approprié, en conditions anaérobes, la souche IBS de Bifidobacterium infantis lonqum déposée à l'Institut Pasteur (Collection Nationale de Culture de Microorganismes - CNCM) sous le N° 1-885 et, qu'après élimination des microorganismes du milieu de culture, on isole puis concentre 1'exopolymère ainsi produit, on le précipite par addition de solvant organique et finalement lyophilise le produit résultant de la précipitation.
La culture de la souche IBS peut être effectuée dans tout type de milieu approprié dont les composants ont un poids moléculaire inférieur à 10'000 daltons, en conditions anaérobes, de préférence à 37°C environ dans un milieu dont la composition détaillée figure plus loin. L'élimination des microorganismes du milieu de culture s'effectue de préférence par centrifugation, la séparation de 11exopolymère s'effectuant par exemple par ultrafiltration sur membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention supérieur ou égal à 10Ό00 daltons.
Le produit ainsi isolé est ensuite soumis à concentration et dialyse subséquente, précipitation à l'aide d'un solvant organique, de l'éthanol de préférence, et finalement lyophilisation. L'exopolymère résultant est caractérisé par le fait qu'il est essentiellement de nature polysaccharidique, composé surtout de glucose et de galactose dans une proportion comprise entre 1:1 et 4:1 et par une fraction protéique au plus égale à 30 % en poids. Au sein de la fraction polysacharidique, la proportion de glucose et de galactose est de l'ordre de 1:1 à 4:1, préférentiellement de Tordre de 3:2 L'exopolymère selon l'invention possède un poids moléculaire apparent compris entre 10Ό00 et 100Ό00 daltons, de préférence entre 20Ό00 et 30Ό00 daltons. Il peut former des agrégats de poids g moléculaire d'environ 10 daltons et ce en équilibre avec les unités de poids moléculaire inférieur. Il se caractérise en outre par le fait qu'il est exempt d'acides nucléiques, de lipides et d'acides organiques. L1exopolymère ainsi isolé et purifié présente d'intéressantes propriétés immunomodulatrices tout en étant dépourvu de toxicité.
Les expérimentations in vitro et in vivo effectuées montrent que 11exopolymère issu de la souche IBS se comporte comme immunomodulateur et qu'il induit une augmentation de la résistance non spécifique. Il possède en outre des propriétés anti1eucémiques (antitumorales) certaines, dont l'origine est sans doute à rechercher dans ses propriétés immunomodulatrices dont la description figure sous "Détermination des propriétés immunomodulatrices de 1'exopolymère issu de la souche IBS".
De ce fait, Vexopolymère issu de la souche IBS peut être avantageusement utilisé comme principe actif de diverses compositions pharmaceutiques, administrables aussi bien par voie orale, que parentérale ou locale. Ces compositions peuvent se présenter sous les formes couramment utilisées en médecine humaine ou vétérinaire, par exemple sous forme de comprimés, simples ou dragéifiés, de gélules, de granulés, de solutions, de sirops, de suppositoires, de préparations injectables, d'ovules, de crèmes, de pommades, de lotions, de gouttes et de collyres; elles sont préparées selon les méthodes usuelles.
Dans de telles compositions, le principe actif (exopolymère) peut être incorporé seul ou conjointement à d'autres agents pharmacologiquement actifs. Les excipients utilisés à cet effet sont des excipients usuels, tels le talc, la gomme arabique, le mannitol, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Chez l'animal, des effets immunomodulateurs significatifs ont été observés pour des doses totales de 4-400 pg par souris.
Les exemples ci-après illustrent l'invention sans pour autant la limiter. Ils concernent plus particulièrement la préparation de Vexopolymère (aussi appelle PB3D) et la mise en évidence de ses propriétés pharmacologiques.
PREPARATION DE L'EXOPOLYMERE PAR CULTURE DE LA SOUCHE BACTERIENNE IBS DE BIFIDOBACTERIUM INFANTIS LONGUM
STADE A: Culture de la souche IBS
La souche IBS est cultivée en conditions anaérobes (l'air sera éliminé au début de la fermentation) à 37°C dans un milieu dont la composition est donnée ci-dessous:
Peptone (PM < 10Ό00 daltons) 5 g/1
NaCl 3 g/1
Glucose 10 g/1
Cystéine 0,5 g/1
Acétate de sodium 2 g/1
Na2HP04 2,87 g/1 KH2P04 1,12 g/1
MgS04 0,09 g/1
NaH2P04 0,15 g/1
NaHC03 2,2 g/1
Tween 1 ml/1
Solution de vitamine 10 ml/1
Un support solide tel que le Cytodex® ou un autre support équivalent peut être avantageusement ajouté au milieu de culture. La souche IBS produit dans ces conditions un exopolymère qui peut être dosé dans le surnageant à l'aide d'un test ELISA mis au point dans ce but et tel qu'il sera décrit plus loin.
Exemple
On prépare 10 1 de milieu de culture répondant à la formule donnée plus haut que Ton place dans un fermenteur d'une capacité de 12 1 et que Ton stérilise. Le fermenteur est inoculé par 1000 ml d'une culture de la souche IBS cultivée sur le même milieu durant 48 heures. On met barboter un mélange d'^ 90% et CO^ 10% durant 20 min. à raison de 3 1/min.
On incube à 37°C sous agitation (400 rpm) et on injecte durant les deux premières heures de fermentation un mélange de ^/CO^ dans les proportions usuellement employées. Après 48 h, une fois le processus de fermentation terminé, on détermine la quantité de polysaccharide produit par la méthode ELISA. Le rendement minimal est de 35 pg/ml. STADE B: Séparation et purification de Texopol.ymère Une fois le procédé de fermentation terminé, les cellules sont séparées par centrifugation. Le surnageant, une fois les cellules séaimentées, est soumis à ultrafiltration ayec un appareillage de type Hallow Fiber H5 P10-43 de Amicon ou équivalent. Sont retenues uniquement les molécules de poids moléculaire supérieur à 101000 daitons. La solution contenant Texopolymère produit est concentrée 10 x puis soumise à dialyse.
Le concentré est précipité à l'alcool (éthanol: eau; 3:1; v:v).
Finalement, le produit précipité à l'éthanol est lyophilisé. Le produit ainsi obtenu présente un aspect fibreux de couleur blanchâtre.
Exemple A partir de la culture obtenue comme décrit plus haut, 10 1 de surnageant sont concentrés à 1 1 par ultrafiltration. Le volume est ajusté à 10 1 avec de l'eau distillée puis réduit une nouvelle fois par ultrafiltration jusqu'à un volume approximatif de 1 1. Cette opération est répétée deux fois. Le concentré d'un volume de 1 1 ainsi obtenu est ensuite précipité à l'éthanol (3:1, v;v). Le précipité résultant est soumis à une opération de lyophilisation permettant l'obtention d'environ 400 mg de lyophilisât.
Technique ELISA
On utilise comme antigène une préparation polysaccharidique dont la pureté est garantie par une déprotéinisation supplémentaire au phénol. On injecte à un lapin une première dose de 0,5 mg répartie en deux doses de 0,25 mg, l'une par voie intrapéritonéale et l'autre par voie sous-cutanée conjointement à l'adjuvant complet de Freund. L'injection est répétée au jour 15 en utilisant cette fois l'adjuvant incomplet de Freund. 15 jours plus tard, le lapin est saigné donnant ainsi un antisérum avec des titres élevés en anticorps qui par la technique ELISA permettent de reconnaître l'exopolymère purifié sur Sephadex G 200 et celui présent dans le surnageant des cultures de Bifidobacterium après précipitation à 1'éthanol.
Le test d'ELISA est réalisé en microplaque, l'antigène est adsorbé, puis les emplacements laissés libres sont colmatés dans les godets par de l'albumine sérique. Une incubation avec les anticorps spécifiques obtenus chez le lapin est pratiquée; puis sont ajoutés les anticorps, dirigés contre les anticorps de lapin, ils sont conjugués à la phosphatase alcaline. Finalement, le substrat 11orthonitro-phénylphosphate est ajouté. La réaction est arrêtée à l'aide de NaOH 3M. La densité optique est lue à 405 nm avec un lecteur d'ELISA. Par ce procédé on obtient des titres d'anticorps suffisamment élevés qui permettent pour des concentrations d'antigènes purifiés de 4 pg d'obtenir des lectures positives pour -4 des dilutions de 10 d'antisérum.
Caractérisation de l'exopolymère produit par la souche IBS 1) Le produit obtenu selon le procédé d'obtention faisant l'objet de la présente invention, est constitué essentiellement de glucides (tels que mesurés par la méthode au phénol/acide sulfurique) et de protéines (mesurées par la méthode de Lowry) dans une proportion 5:1.
Le produit ne contient pas d'acides nucléiques selon les résultats analytiques obtenus par chromatographie d'exclusion ionique ou par chromatographie en phase gazeuse. En aucun cas Vhydrolysat ne contient de pentoses. Le produit est dépourvu de lipides selon les résultats de chromatographie gazeuse après extraction au n-heptane. Il n'y a pas d'acides organiques selon les mesures pratiquées en chromatographie d'exclusion ionique. 2) Selon les données de chromatographie liquide haute pression (HPLC) avec une colonne RP-8 300 Â, il s'agit d'un produit de nature glycoprotéique. 3) La partie glucidique est constituée par du glucose et du galactose selon les différentes preuves analytiques (chromatographie d'exclusion ionique, chromatographie sur couches minces, chromatographie gazeuse). 4) Le glucose et le galactose sont présents en proportion 3:2 selon les résultats obtenus en chromatographie en phase gazeuse des monomères hydrolysés par méthanolyse puis acétylés par tri fluoroacétylation. 5) La partie polysaccharidique est ramifiée avec les liaisons 1-2, 1-3, 1-4, et 1-6 selon le chromatogramme obtenu en chromatographie en phase gazeuse des monomères méthylés (méthanolyse) puis acétylés (trifluoroacétylation). 6) L'activité biologique mesurée par la capacité à stimuler une augmentation de plages d'hémolyse directe (PFC) provient de la partie glucidique et est maintenue après traitement à la protéinase K endommageant la partie protéique. 7) Le poids moléculaire approximatif est situé entre 201000 et 30Ό00 daltons selon la chromatographie sur Sephadex G 200 (pic de bas poids moléculaire). L'exopoymère peut former des agrégats de poids moléculaire d'environ 10® daltons et ce en équilibre avec les unités de poids moléculaire inférieur. DETERMINATION DES PROPRIETES IMMUNOMODULATRICES DE L'EXQPQLYMERE ISSU DE LA SOUCHE IBS (PREUVE IN VITRO)
Prolifération des cellules spléniques
La prolifération de cellules spléniques en présence de mitogènes peut être mesurée par la réduction de MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tétrazolium) en formazan par la déhydrogénase mitochondriale.
Exemple
La prolifération (cellules spléniques de souris C57BL/6) est exprimée par la densité optique à 560 nm en fonction de la concentration en PB3D ou en LPS servant de référence:
Le PB3D induit une prolifération légèrement inférieure à celle du LPS. DETERMINATION DES PROPRIETES IMMUNQMQDULATRICES DE L'EXOPOLYMERE ISSU DE LA SOUCHE IBS (PREUVES IN VIVO)
Stimulation de la production de cellules synthétisant des anticorps L'exopolymère stimule de manière non spécifique chez la souris la production de cellules produisant des anticorps soit administrés par voie orale conjointement aux globules rouges de mouton, soit i.p. sans globules rouges de mouton. Il normalise aussi cette capacité chez les souris immunodéprimées par la cyclophosphamide.
Exemple
Après administration par voie orale de PB3D pendant 5 jours consécutifs, et un rappel aux 19 et 20ème jour (organigramme A), ou de PB3D pendant 5 jours consécutifs sans rappel (organigramme B), on observe suivant les doses administrées une augmentation du nombre de plages d'hémolyse dans la rate des souris.
* = P < 0,05
Exemple
Après administration par voie intrapéritonéale d'une seule dose de 400 pg/souris de PB3D, on observe après 4 jours une augmentation significative du nombre de PFC.
Exemple L'exopolymère administré à des souris immunodéprimées par la cyclophosphamide permet d'observer chez les animaux traités une immunosuppression inférieure ou une restauration plus rapide des niveaux normaux du nombre de PFC par rapport aux animaux sans traitement.
1) animaux immunodéprimés à la cyclophosphamide
2) animaux immunodéprimés à la cyclophosphamide qui après ont reçu PB3D 3) animaux qui ont reçu une solution saline
Influence sur la composition des protéines sériques Différents immunomodulateurs produisent un changement du profil immunoélectrophorétique des protéines du sérum reconnues sous les dénominations X, LA et LB. L'exopolymère de la présente invention provoque une telle modification.
Exemple L'administration intrapéritonéale de 400 pg/souris de PB3D produit après 24 h et après 4 jours un changement des protéines sériques comparable à celui provoqué par le lipopolysaccharide de Escherichia coli (LPS).
Exemple
De même l'administration orale d'une dose totale de 400 pg répartie en 5 doses durant 5 jours consécutifs de 80 pg par jour provoque un changement des protéines perceptibles 5 jours après l'administration de 1'exopolymère.
Elimination du carbone colloïdal L'exopolymère est administré par voie i.v. (2,5 mg/souris) à des souris Balb/C. Après 48 h, 0,2 ml d'une suspension de carbone colloïdal sont injectés par voie i.v.
La disparition du carbone dans le sang, appelée "clearance", est exprimée par la pente des logarithmes de la concentration du carbone en fonction du temps. L'exopolymère augmente la "clearance".
Augmentation de la résistance non spécifique
Chez les animaux immunodéprimés par la cyclophosphamide et soumis au froid, il a été possible d'observer que 11exopolymère de la présente invention confère une augmentation de la résistance non spécifique vis-à-vis d'une infection bactérienne telle que celle provoquée par Pseudomonas au niveau des muqueuses ou vis-à-vis d'une infection virale (virus Coxsakie B).
Exemple L'immunosuppression est pratiquée avec une dose intrapéritonéale de cyclophosphamide (200 mg/kg). Au 3ème jour commence le traitement oral avec 1'exopolymère (80 pg/souris/jour) durant 5 jours consécutifs. Les animaux de contrôle reçoivent une solution saline. Quelques heures après la fin du traitement, les animaux sont infectés par voie intranasale par une souche de Pseudomonas aeruqinosa rendue pathogène pour la souris. La survie est améliorée chez les animaux traités.
Exemple L'immunosuppression est pratiquée avec une dose intrapéritonéale de cyclophosphamide (200 mg/kg). Au 3ème jour commence le traitement oral avec 1'exopolymère (80 pg/souris/jour) durant 5 jours consécutifs. Les contrôles reçoivent une quantité équivalente de solution saline.
Quelques heures après la fin du traitement les animaux sont infectés par voie intraperitoneale par le virus de Coxsakie B5 (0,5 ml avec 7 10 PFU) et le taux de survie évalué. Il est amélioré chez les animaux traités.
Essais de leucémie spontanée ou induite L1exopolymère de la présente invention est susceptible de retarder l'apparition de leucémie chez les souris AKR (souche de souris "inbred" développant à une fréquence élevée de la leucémie spontanée). De même, 1'exopolymère est susceptible de retarder chez les souris de la souche RF l'apparition de leucémie induite par une substance carcinogène comme le méthylcholanthrène). (Cette souche RF est une souche "inbred" chez laquelle le méthylcholanthrène provoque une apparition rapide de leucémie spontanée).
Exemple
Deux groupes de souris AKR ont reçu mensuellement un traitement oral de 5 jours de PB3D; un troisième groupe n'a pas reçu le produit à tester et sert de contrôle. Des deux groupes traités, l'un a reçu 5 doses journalières de 80 yg (dose totale mensuelle de 400 yg) et l'autre 5 doses journalières de 0,8 yg (dose totale mensuelle de 4 yg). Les résultats montrent un retard dans l'apparition de la leucémie chez les animaux traités. Cette différence est clairement significative dans le groupe ayant reçu 400 yg comme dose totale. Elle a été confirmée par une autre expérience durant laquelle les groupes traités ont reçu respectivement 400 et 40 yg.
Expérience 1
Expérience 2
Exemple
Deux groupes de souris RF ont reçu dans les deux mois précédant l'administration (par voie topique) de méthylcholanthrène deux traitements par voie orale de PB3D espacés de 3 semaines. Un groupe a reçu une dose mensuelle de 400 pg réparties en 5 doses de 80 pg durant 5 jours consécutifs, l'autre groupe une dose totale mensuelle de 4 pg répartie également en 5 doses de 0,8 pg. Le groupe de contrôle n'a reçu aucun traitement. L'induction de la leucémie est réalisée par traitement cutané dans une zone du corps convenablement rasé. Le traitement au PB3D retarde l'apparition de leucémie; ce retard est clairement significatif chez les animaux ayant reçu 400 pg.
Toxicité aiguë
Des tests de toxicité aiguë ont été réalisés par injection intraveineuse de 1'exopolymère aux doses suivantes: 1 pg, 10 pg, 15 pg, 100 pg, 300 pg, 600 pg et 1200 pg par souris dans la veine caudale de 5 souris pour chaque dose. Aucune dose n'a provoqué de quelconques réactions négatives chez les souris qui étaient encore en vie deux mois après l'injection.
Description de la souche
La souche IBS de Bifidobacterium infantis lonqum a été déposée le 6 juillet 1989 auprès de l'Institut Pasteur (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX, France). Elle porte le N° d'enregistrement 1-885.
Il s'agit d'une souche isolée à partir d'eaux usées contenant des matières fécales d'origine humaine et présentant des caractéristiques taxonomiques intermédiaires entre Bifidobacterium infantis et Bifidobacterium lonqum identifiables par le profil de leurs composants structurels, par les profils des catabolites de fermentation du D-glucose et, par le profil de résistance aux antibiotiques et par la production de Vexopolymère faisant l'objet de la présente invention.
Claims (12)
1) Exopolymère extracellulaire tel que produit par la culture en conditions anaérobes dans un milieu approprié d'une souche bactérienne de Bifidobacterium infantis lonqum déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM / Institut Pasteur) sous le No.
1-885, et isolé par élimination des microorganismes du milieu de culture, concentré puis précipité par l'adjonction d'un solvant organique et finalement lyophilisé.
2) Exopolymère selon la revendication 17 caractéri sé par ses propriétés immunomodulatrices.
3) Exopolymère selon la revendication 1 ou 2,caractérisé par le fait qu'il est essentiellement de nature polysaccharidique, composé surtout de glucose et de galactose dans une proportion comprise entre 1:1 et 4:1 et qu'il peut contenir une fraction protéique au plus égale à 30 % en poids.
4) Exopolymère selon la revendication 3,caractérisé par le fait que la proportion de glucose et galactose est de l'ordre de 3:2.
5) Exopolymère selon les revendications 1 à 4; caractérisé par le fait qu'il possède un poids moléculaire apparent compris entre 10Ό00 et lOO'OOO daltons, de préférence entre 20Ό00 et 30Ό00 daltons, et qu'il peut former des agrégats de poids moléculaire d'environ 10^ daltons et ce en équilibre avec les unités de poids moléculaire inférieur.
6) Exopolymère selon une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu'il est exempt d'acides nucléiques, de lipides ou d'acides organiques.
7) Procédé de préparation de l'exopolymère extraceilulaire selon 1a revendication 1,caractérisé par le fait que l'on cultive en conditions anaérobes dans un milieu approprié une souche bactérienne de Bifidobacterium infantis lonqum déposée auprès de la CNCM sous le No.
1-885 et qu'après élimination des microorganismes du milieu de culture, on isole 1'exopolymère ainsi produit, on le concentre et le précipite par adjonction d'un solvant organique et que finalement, on lyophilise le produit résultant de la précipitation.
8) Procédé selon le revendication 7, caractérisé par le fait que l'exopolymère est isolé du milieu de culture par ultrafiltration sur membrane de porosité calibrée dont le seuil de rétention est supéreur ou égal à lO'OOO daltons.
9) Procédé selon le revendication 7 ou 8,caratérisé par le fait que l'exopolymère isolé du milieu de culture est concentré par ultrafiItration.
10) Procédé selon une des revendications 7 à 9,caractérisé par le fait que l'exopolymère est précipité par adjonction d'alcool, de préférence de l'éthanol. 11) Compositions pharmaceutiques contenant comme principe actif l'exopolymère extracellulaire selon une des revendications 1 à 6. 12) Compositons pharmaceutiques selon la revendication 11 présentant des activités thérapeutiques immunomodulatrices, antiinfectieuses et/ou antitumorales.
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