DD295764A5 - Herstellungsverfahren fuer ein extrazellulaeres exopolymer, das auf diese weise erhaltene exopolymer und pharmazeutische zubereitungen, in denen es enthalten ist. - Google Patents
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Abstract
Prozesz zur Herstellung eines extrazellulaeren Exopolymer mit immunmodulatorischen Eigenschaften durch Kultivierung des Bifidobacterium infantis longum Stammes, der am Institut Pasteur unter der Nummer I-885 in einem geeigneten Medium unter anaeroben Bedingungen hinterlegt ist. Nach Entfernung der Mikroorganismen aus dem Kulturmedium wird das derart hergestellte Exopolymer isoliert, konzentriert und anschlieszend durch Zugabe eines organischen Loesungsmittels ausgefaellt, das mit Hilfe dieser Praezipitation gewonnene Produkt wird schlieszlich lyophilisiert. Das auf diese Weise gewonnene Exopolymer besitzt eine Wirkung auf die zellulaere wie die humorale Immunitaet und koennte somit als immunmodulatorischer Wirkstoff in jedem potentiell moeglichen therapeutischen Anwendungsgebiet verwendet werden.
Description
Die vorliegende Erfindung umfaßt das Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Exopolymers, welches durch Kultivierung ausgewählter Bakterienstämme der Gattung Bifidobacterium gewonnen wird und immunmodulatorische Eigenschaften besitzt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls dieses Exopolymers sowie pharmazeutische Zubereitungen, die das genannte Exopolymer als Wirkstoff enthalten.
Primäre oder sekundäre Störungen des Immunsystems sind der gemeinsame Nenner zahlreicher Erkrankungen, wie Allergien, Autoimmunkrankheiten sowie bestimmte Infektions- und Krebserkrankungen. Während primäre Immundefekte selten sind und im allgemeinen genetische Ursachen haben, sind sekundäre Immundefekte dagegen relativ häufig, und ihre Ursachen sind überwiegend extrinsisch. Hierzu gehören beispielsweise rezidivierende Infektionen, Alterung, Krebserkrankungen, Fehlernährung, Exposition gegenüber immunotoxischen Substanzen und Streß.
Die Immuntherapie ermöglicht bei primären Immundefekten eine Besserung der Symptome und bei sekundären Immundefekten eine Normalisierung des Immunstatus.
Es wurden zahlreiche Immuntherapeutika in Form von Immunstimulantien oder Immunsuppressiva entwickelt.
Immunmodulatoren führen im allgemeinen zu einer unspezifischen Besserung der spezifischen Wirtsreaktivität und unspezifischer Effektormechanismen. Dabei können synthetische Immunmodulatoren und Immunmodulatoren biologischer Herkunft unterschieden werden. Bei der zuletzt genannten Gruppe handelt es sich um Substanzen, die durch Mikroorganismen erzeugt werden, und um Extrakte tierischer oder auch menschlicher Herkunft, wie beispielsweise Thymushormone, dialysierbare Leukozytenextrakte, Interferone und Zytokine.
Die Aktivierung von Lymphozyten oder Makrophagen und ihre Wechselwirkungen werden durch die Einwirkung von Strukturmolekülen von Mikroorganismen oder biologisch aktiven, von Mikroorganismen gebildeten Substanzen erheblich beeinflußt. Für eine Vielzahl von Bakterien und Bakterienprodukten wurde eine Wirkung auf das Immunsystem nachgewiesen.
Dieses Spektrum immunmodulatorischer Substanzen bakterieller Herkunft umfaßt Mykobakterien und deren Produkte,
Lipopolysaccharide von gramnegativen Bakterien, Enterotoxine von Vibrio cholerae. Produkte von Streptococcus, Lipoproteine und Glycoproteine verschiedener gramnegative Bakterien sowie Polysaccharide unterschiedlicher Herkunft. Auf diesem Gebiet wird derzeit intensiv geforscht.
Die vorliegende Erfindung ergänzt die Immuntherapie um ein weiteres Element. Es handelt sich um ein neues extrazelluläres, mit hochinteressanten immunmodulatorischen Eigenschaften ausgestattetes Exopolymer. Genauer gesagt umfaßt die vorliegende Erfindung ein Herstellungsverfahren für das unter Patentanspruch 1 beschriebene Exopolymer sowie das mittels des genannten Verfahrens hergestellte extrazelluläre Exopolymer selbst. Andere Bestandteile der vorliegenden Erfindung werden im Anschluß dargestellt.
Das Exopolymer, das den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildet, wurdedurch Kultivierung ausgewählter Stämme einer neu isolierten Spezies von Bifidobacterium infantis longum, ein grampositives Bakterium mit taxonomischen Eigenschaften, aufgrund derer es zwischen Bifidobacterium infantis und Bifidobacterium longum einzuordnen ist, hergestellt. Dieses Exopolymer besitzt experimentell nachweisbare immunmodulatorische Eigenschaften und ist daher für die Human- und Veterinärmedizin von größtem Interesse.
Charakteristisch für das in der vorliegenden Erfindung enthaltene Verfahren ist, daß der Bakterienstamm 1 BS von Bifidobacterium infantis longum, hinterlegt unter der Nummer I-885 am Institut Pasteur-Col lection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), in einem geeigneten Medium unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird und daß das so gebildete Exopolymer nach Entfernung der Mikroorganismen aus dem Kulturmedium isoliert, konzentriert und anschließend durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels ausgefällt wird. Die mit Hilfe dieser Präzipitation gewonnene Substanz wird schließlich lyophilisiert.
Der Stamm 1 BS kann unter anaeroben Bedingungen, vorzugsweise bei ca. 37°C, in jedem geeigneten Medium kultiviert werden, dessen Komponenten ein Molekulargewicht von weniger als 10000 Dalton aufweisen. Die genaue Zusammensetzung eines derartigen Mediums wird weiter unten beschrieben.
Die Mikroorganismen werden vorzugsweise durch Zentrifugation aus dem Kulturmedium entfernt, und das Exopolymer wird beispielsweise durch Ultrafiltration über eine kalibrierte Porenmembran mit einer Retentionsschwelle von 10000 Dalton oder höher isoliert.
Die auf diese Weise isolierte Substanz wird anschließend konzentriert, dialysiert, durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels, vorzugsweise Äthanol, präzipitiert und schließlich lyophilisiert.
Bei dem entstehenden Exopolymer handelt es sich im wesentlichen um ein Polysaccharid. Dieses besteht in erster Linie aus Glukose und Galaktose in einem Verhältnis von 1:1 bis 4:1 udn enthält eine Proteinfraktion mit einem Gewichtsanteil von maximal 30%. Innerhalb der Polysaccharidfraktion beträgt das Verhältnis von Glukose und Galaktose ca. 1:1 bis 4:1, vorzugsweise ca. 3:2.
Das Exopolymer der vorliegenden Erfindung hat ein apparentes Molekulargewicht zwischen 10000 und 100000 Dalton, vorzugsweise zwischen 20000 und 30000 Dalton. Es kann Aggregate mit einem Molekulargewicht von ca. 106 Dalton bilden, die im Gleichgewicht mit Einheiten niedrigeren Molekulargewichts stehen. Es ist außerdem frei von Lipiden, Nukleinsäuren und sonstigen Säuren.
Das auf diese Weise isolierte und gereinigte Exopolymer besitzt interessante immunmodulatorische Eigenschaften, ohne toxisch zu sein. Sowohl durch Untersuchungen in vitro als auch in vivo wurde gezeigt, daß sich das durch den Stamm 1BS gebildete Exopolymer wie ein Immunmodulator verhält und die unspezifische Abwehrkraft des Wirtsorganismus steigert. Auch hat es eindeutige antileukämische (antitumorale) Wirkungen, die mit seinen immunmodulatorischen Eigenschaften, wie sie im Abschnitt „Bestimmung der immunmodulatorischen Eigenschaften des durch den Stamm 1BS gebildeten Exopolymers" beschrieben sind, in Zusammenhang stehen könnten.
Das durch den Stamm 1BS gebildete Exopolymer ist somit ein sinnvoller Wirkstoff verschiedener oral, parenteral oder lokal anwendbarer pharmazeutischer Zubereitungen. Diese können in unterschiedlichen Formen, wie sie in der Human- oder Veterinärmedizin üblich sind, hergestellt werden, z.B. als Tabletten oder Dragees, Kapseln, Pastillen, Lösungen, Sirups, Suppositorien, injizierbare Präparationen, Pessare, Cremes, Salben, Lotionen, Tropfen und Augentropfen. Alle werden nach den herkömmlichen Verfahren hergestellt.
Der Wirkstoff (das Exopolymer) kann in diese pharmazeutischen Zubereitungsformen allein oder in Kombination mit anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingebracht werden. Zu diesem Zweck werden die herkömmlichen Trägermittel verwendet, wie z. B. Talkum, Gummi arabicium. Mannitol, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nichtwäßrige Trägermittel, tierische oder pflanzliche Fette, Paraffinderivate, Glykole, unterschiedliche Netzmittel, Dispersionsmittel oder Emulgatoren und Konservierungsmittel.
In Tierversuchen wurden bei der Maus signifikante immunmodulatorische Wirkungen bei Dosen zwischen 4-400 pg pro Maus beobachtet.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung illustrieren, ohne sie zu beschränken. Sie betreffen insbesondere die Herstellung des Exopolymers (auch als PB3D bezeichnet) sowie den Nachweis seiner pharmakologischen Eigenschaften.
Der Stamm t BS wird bei 370C unter anaeroben Bedingungen (Elimination der Luft zu Beginn der Fermentierung) in folgendem Nährmedium kultiviert:
| Pepton (MG < 10000 Dalton) | 5 | g/i |
| NaCI | 3 | g/i |
| Glukose | 10 | g/i |
| Zystein | 0,5 | g/i |
| Natriumazetat | 2 | g/i |
| Na2HPO4 | 2,87 | g/l |
| KH2PO4 | 1,12 | g/i |
| MgSO4 | 0,09 | g/i |
| NaH2PO4 | 0,15 | g/i |
| NaHCO3 | 2,2 | g/i |
| Twee π | 1 | ml/l |
| Vitaminlösung | 10 | ml/l |
Zur Verbesserung der Ausbeute kann auch ein Festsubstrat, wie CYTODEX® oder etwas Gleichwertiges, zum Kulturmedium gegeben werden. Unter diesen Bedingungen bildet der Stamm 1BS ein Exopolymer, das mit Hilfe eines speziell zu diesem Zweck entwickelten ELISA Testverfahrens im Überstand quantifiziert werden kann. Dieses Verfahren wird später beschrieben.
10 Liter des oben definierten Kulturmediums werden hergestellt und zur Sterilisation in einen 12-Liter-Fermenter eingebracht. Dieser wird anschließend mit 1000 ml einer Kultur des über 48 Stunden in demselben Medium kultivierten 1 BS Stamms inokuliert. Ein Gemisch von 90% N2 und 10% CO2 wird mit einer Rate von 3 Litern pro Minute während 20 Minuten eingesprudelt.
Die Inkubation erfolgt bei 37°C unter einem N2/CO2 Gemisch im üblichen Verhältnis, welches während der ersten 2 Stunden der Fermentation ins Medium eingebracht wird, wobei mit einer Drehfrequenz von 400rpm gerührt wird. Nach 48 Stunden, d.h. nach Abschluß der Fermentierung, wird die Menge des gebildeten Polysaccharids mittels ELISA bestimmt. Die minimale Ausbeute beträgt 35 Mg/ml.
Stadium B: Isolierung und Reindarstellung des gebildeten Exopolymers
Nach Abschluß der Fermentierung werden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt. Nach Sedimentieren der Zellen wird der Überstand unter Verwendung des Geräts des Typus „AMICON Hallow Fiber H 5 P10-43" ultrafiltriert. Nur Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 10000 Dalton werden zurückgehalten. Die Lösung mit dem gebildeten Polymer wird zehnfach konzentriert und anschließend dialysiert.
Die konzentrierte Lösung wird mit Alkohol präzipitiert (Äthanol :Wasser, Volumanteile 3:1).
Schließlich wird die mit Äthanol präzipitierte Substanz lyophilisiert. Das auf diese Weise gewonnene Produkt ist weißlich und sieht faserig aus.
Aus der obigen Kultur werden 10 Liter der Überstandsflüssigkeit entnommen und anschließend durch Ultrafiltration auf 1 Liter konzentriert. Mit destilliertem Wasser wird das Volumen auf 10 Liter aufgefüllt und dann durch Ultrafiltration wieder auf ca. 1 Liter reduziert. Dieser Vorgang wird zweimal durchgeführt. Der auf diese Weise erhaltenen 1 Liter konzentrierter Lösung werden anschließend mit Äthanol (Volumenanteile 3:1) präzipitiert. Das entstehende Präzipitat wird lyophilisiert und liefert ca. 400mg Lyophilisat.
Das ELISA-Verfahren
Bei dem verwendeten Antigen handelt es sich um eine Polysaccharidzubereitung, deren Reinheit durch zusätzliche Deproteinisierung mit Phenol gewährleistet wird. Zusammen mit komplettem Freund-Adjuvans wird einem Kaninchen eine Anfangsdosis von 0,5 mg in Form von zwei Injektionen, eine intraperitoneal und eine subkutan, verabreicht. Die Injektion wird am 15.Tag wiederholt, wobei nun inkomplettes Freund-Adjuvans angewandt wird. Nach weiteren 15 Tagen wird dem Kaninchen Blut entnommen, um ein Antiserum mit hohen Antikörperkonzentrationen zu erhalten, so daß das chromatographisch auf einer SEPHADEX G 200 Säule gereinigte und das im Überstand der Bifidobacterium Kulturen nach Präzipitation mit Äthanol vorhandene Exopolymer mittels ELISA identifiziert werden kann.
Der ELISA-Test wird auf einer Mikroplatte durchgeführt. Das Antigen wird absorbiert. Freigelassene Vertiefungen werden mit Serumalbumin gefüllt. Dann wird unter Verwendung der spezifischen, vom Kaninchen gewonnenen Antikörper inkubiert. Anschließend werden die gegen die Kaninchenantikörper gerichteten Antikörper hinzugefügt. Diese sind mit alkalischer Phosphatase konjugiert. Schließlich wird das Substrat (Orthonitrophenylphosphat) hinzugefügt. Nach Inkubation wird die Reaktion unter Verwendung von 3M NaOH unterbrochen. Die optische Dichte (Absorption) wird bei 405 nm auf einem ELISA-Lesegerät gemessen. Durch dieses Verfahren werden ausreichend hohe Antikörpertiter erzielt, um positive Ablesungen bei Antiserumverdünnungen von 10~4 von gereinigten Antigenen in Konzentrationen von 4Mg zu ermöglichen.
Beschreibung des durch den Stamm 1BS gebildeten Exopolymers
1) Die gewonnene Substanz besteht im wesentlichen aus Gluziden (Messung mit dem Phenol/Schwefelsäure Verfahren) und Proteinen (Messung mit dem Lowry-Verfahren) im Verhältnis 5:1.
Gemäß der Analyse durch lonenausschlußchromatographie oder Gaschromatographie enthält die Substanz keine Nukleinsäuren. In keinem Fall enthält das Hydrolysat irgendwelche Pentosen.
Entsprechend den nach Extraktion mit n-Heptan durch Gaschromatographie ermittelten Ergebnissen ist die Substanz frei von Lipiden und nach den Messungen durch lonenausschlußchromatographie frei von organischen Säuren.
2) Nach den mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer RP-8300 A Säule ermittelten Ergebnissen ist die Substanz von der Art der Glykoproteine.
3) Nach den mittels lonenausschluß-. Dünnschicht und Gaschromatographie ermittelten Ergebnissen besteht der Gluzidteil aus
Glukose und Galaktose.
4) Nach den mittels Gaschromatographie von hydrolysierten (durch Methanolyse) und anschließend azetylierten (durch Trifluorazetylierung) Monomeren ermittelten Ergebnissen sind Glukose und Galaktose in einem Verhältnis von 3:2 vorhanden.
5) Nach dem durch Gaschromatographie an methylierten (durch Methanolyse) und anschließend azetylierten (durch Trifluorazetylierung) Monomeren ermittelten Chromatogramm ist der Polysaccharidteil mit den Bindungen 1-2,1-3,1-4 und 1-6 verzweigt.
6) Die anhand der Fähigkeit zur Stimulation der Vermehrung piaquebildender Zellen (PEC) gemessene biologische Aktivität geht vom Gluzidteil aus und bleibt nach Behandlung mit einer den Proteinteil zerstörenden Proteinase K bestehen.
7) Nach den durch Chromatographie auf SEPHADEX G 200 (Spitzenwert des niedrigen Molekulargewichts) ermittelten Ergebnissen liegt das ungefähre Molekulargewicht zwischen 20000 und 30000 Dalton.
Das Exopolymer kann Aggregate mit einem Molekulargewicht von ca. 10* Dalton bilden, die im Gleichgewicht mit Einheiten niedrigeren Molekulargewichts stehen.
Die Proliferation von Splenozyten in Gegenwart von Mitogenen kann anhand der Reduktion von MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) zu Formazan durch die Dehydrogenase der Mitochondrien bestimmt werden.
Die Proliferation (Splenozyten der Maus C57BL/6) wird durch die optische Dichte (Absorption) bei 560nm als Funktion der Konzentration von PB3D oder dem als Referenz dienenden LPS ausgedrückt:
| PB3D | OD bei 560 nm | μg/ml | LPS | OD bei 560 nm | |
| Mg/ml | 1,483 | 20 | 1,486 | ||
| 333 | 1,593 | 6,77 | 1,308 | ||
| 111 | 1,459 | 2,22 | 0,964 | ||
| 37 | 1,018 | 0,74 | 0,725 | ||
| 12,3 | 0,580 | 0,25 | 0,526 | ||
| 4,1 | 0,427 | 0,08 | 0,423 | ||
| 1,4 | 0,03 | 0,366 | |||
| 0,273 | Kontrolle 0 | 0,273 | |||
| Kontrolle 0 |
PB3D induziert im Vergleich zu LPS eine etwas geringere Proliferation.
Bei der Maus führt das Exopolymer zu einer unspezifischen Stimulation der Bildung antikörperproduzierender Zellen, wenn es zusammen mit Schafserythrozyten oral oder ohne Schafserythrozyten intraperitoneal verabreicht wird. Bei der Maus unter Immunsuppression mit Cyclophosphamid führte das Exopolymer außerdem zu einer Normalisierung dieser Funktion.
Nach fünftägiger oraler Verabreichung von PB3Dund einer Booster-Dosis am 19. und 20.Tag (Organigramm A) oder ohne Booster-Dosis (Organigramm B) wird in Abhängigkeit von den verabreichten Dosen in der Milz der Maus ein zahlenmäßiger Anstieg der PFC beobachtet.
Schafsery- PFC/106Zellen PFC/Milz
throzyten
Organigramm A: 400 μς
(mit Booster)
40 μg
Organigramm B: 400 pg
(ohne Booster)
40 μg
• = ρ < 0,05.
| 100% | 126%* | 136%* |
| 100% | 134%· | 145%* |
| 100% | 131 %* | 143%* |
| 100% | 115%» | 123%* |
| 100% | 125%» | 133%· |
| 100% | 120%* | 128%· |
| 100% | 104% | 104% |
| 100% | 109%* | 104% |
| 100% | 101 % | 101 % |
| 100% | 111%* | 113%· |
| 100% | 117%* | 123%· |
| 100% | 110%* | 113%· |
Nach intraperitonealer Verabreichung einer Einzeldosis von 400Mg/Maus PB3D wird nach vier Tagen ein signifikanter Anstieg derr PFC-Zahl beobachtet.
| Inokulat | PFC/Milz | Verhältnis Testgruppe/ |
| Kontrollgruppe | ||
| Kontrolle | 12,5 + 0 | |
| PB3D | 43,75 ±31,37 | 3,5 |
| Kontrolle | 6,25+ 6,85 | |
| PB3D | 27,08 ± 24,26 | 4,3 |
Durch Verabreichung des Exopolymers an Mäuse unter Immunsuppression mitCyclophosphamid kann bei behandelten Mäusen eine im Vergleich zu unbehandelten Mäusen geringere Immunsuppression bzw. eine raschere Normalisierung der PFC Zahl beobachtet werden.
| Tage nach der | Kontrollen31 | Behandlung | PFC/Milz | PFC/108 |
| Immunsuppression | Lymphozyten | |||
| 5 | CY" | 1,04 ± 2,25 | 30,00 ± 73 | |
| PB21 | 4,71 ± 7,32 | 83,00 ±146 | ||
| 7 | CY | 0 | ||
| PB | 7,29 ± 6,14 | 81,00± 84 | ||
| 10 | CY | 18,75+13,11 | 46,00+ 38 | |
| PB | 60,41 ± 64,4 | 382,00 ± 508 | ||
| 19 | CY | 25 ±10,2 | 110,00 ± 96 | |
| PB | 18,75 ± 8,83 | 86,00 ± 83 | ||
| 9,5 ± 8,75 | 58,31 ± 49,2 |
1 Mäuse unter Immunsuppression mit Cyclophosphamid.
2 Mäuse unter Immunsuppression mit Cyclophosphamid und späterer Verabreichung von PB3D.
3 Mäuse, denen eine Kochsalzlösung verabreicht wurde.
Verschiedene Immunmodulatoren modifizieren das immunelektrophoretische Muster der als X, LA und LB bezeichneten Serumproteine. Das Exopolymer der vorliegenden Erfindung führt zu einer derartigen Modifikation.
Die intraperitoneale Verabreichung von 400 μg/Maus PB 3D führt nach 24 Stunden und nach vier Tagen zu einer Modifikation der Serumproteine. Diese ist mit der vergleichbar, wie sie durch das Lipopolysaccharid von Escherichia coli (LPS) hervorgerufen wird.
In ähnlicher Weise führt die orale Verabreichung von insgesamt 400pg in fünf aufeinanderfolgenden Teildosen von täglich 80 pg zu einer Proteinveränderung. Diese ist fünf Tage nach Verabreichung des Exopolymers erkennbar.
Kolloidale Kohlenstoff-Clearance
Das Exopolymer wird Balb/c Mäusen intravenös (2,5pg/Maus) verabreicht. Nach 48 Stunden werden 0,2 ml einer kolloidalen Kohlenstoffsuspension intravenös injiziert. Das als Clearance bezeichnete Verschwinden des Kohlenstoffs aus dem Blut wird anhand des logarithmischen Abfalls des Kohlenstoffspiegels in Abhängigkeit von der Zeit ausgedrückt. Das Exopolymer steigert die Clearance.
| Zeit | Kontrolle | Behandelt mit |
| (Min.) | H2O-NaCI 0,9% | PB 3 D 2,5 mg |
| 0 | 1,865 ±0,087 | 1,815 ±0,044 |
| 2 | 1,800 ±0,031 | 1,662 ±0,037 |
| 4 | 1,754 ±0,032 | 1,531 ±0,065 |
| 6 | 1,588 ±0,009 | 1,432 ±0,096 |
| 8 | 1,657 ±0,038 | 1,305 + 0,073 |
| 10 | 1,535 ±0,134 | 1,207 ±0,105 |
| 12 | 1,588 ±0,045 | 1,079 + 0,154 |
Bei Mäusen unter Immunsupression mit Cyclophosphamid und Kälteexposition konnte beobachtet werden, daß das Exopolymer der vorliegenden Erfindung die unspezifische Abwehrkraft des Wirts gegenüber einer bakteriellen Infektion, wie sie durch Pseudomonas an den Schleimhäuten hervorgerufen wird, oder einer Virusinfektion (Coxsackie B Virus) steigert.
Durch intraperitoneale Verabreichung von 200mg/kg Cyclophosphamid wird eine Immunsuppression hervorgerufen. Die fünftägige orale Behandlung mit dem Exopolymer (80Mg/Maus/Tag) beginnt am dritten Tag danach. Die Kontrolltiere erhalten eine äquivalente Menge Kochsalzlösung. Einige Stunden nach Behandlungsende werden die Mäuse intranasal mit einem für die Maus pathogen gemachten Stamm von Pseudomonas aeruginosa infiziert. In der Gruppe der behandelten Mause besteht eine höhere Überlebensrate:
| Versuch | Behandlung | Überlebens- |
| rate(%) | ||
| 1 | Kontrolle | 8/18(44) |
| 400 Mg PB 3 D | 11/20(55) | |
| 2 | Kontrolle | 0/14 (0) |
| 400 Mg PB 3 D | 10/29(34) | |
| 3 | Kontrolle | 7/12(58) |
| 400 Mg PB 3 D | 9/12(82) |
Durch intraperitoneale Verabreichung einer Einzeldosis von 200mg/kg Cyclophosphamid wird eine Immunsuppression hervorgerufen. Die fünftägige orale Behandlung mit dem Exopolymer (80pg/Maus/Tag) beginnt am dritten Tag danach. Die Kontrolltiere erhalten eine äquivalente Menge Kochsalzlösung. Einige Stunden nach Behandlungsende erfolgt eine intraperitoneale Infektion der Mäuse mit dem Coxsackie B5 Virus (0,5ml mit 107 PFU). Die Überlebensrate ist in der Gruppe der behandelten Mäuse höher.
| Behandlung | Bedingungen nach | Überlebensrate |
| der Infektion | (%) | |
| Kontrolle | 4-6 0C | 0/20 (0) |
| PB3D | 4-6 0C | 16/20 (80) |
| Kontrolle | 20 X | 6/10 (60) |
| PB3D | 20X | 10/10(100) |
Tests bei spontanen oder induzierten Leukämien
Das Exopolymer der vorliegenden Erfindung kann bei AKR Mäusen (einem Stamm von Inzuchtmäusen« die sehr häufig spontane Leukämien entwickeln) das Auftreten einer Leukämie verzögern. Bei RF Mäusen kann das Exopolymer außerdem das Auftreten von durch karzinogene Substanzen wie Methylcholanthren induzierten Leukämien verzögern. (Der Stamm RF ist ein Inzuchztstamm, bei dem Methylcholanthren ein rasches Auftreten spontaner Leukämien hervorruft.)
Zwei Gruppen von AKR Mäusen wurden jeden Monat über fünf Tage mit PB3D oral behandelt, während eine dritte Gruppe die Testsubstanz nicht erhielt und als Kontrollgruppe diente. Von den beiden behandelten Gruppen erhielt die eine fünf aufeinanderfolgende Tagesdosen zu 80pg/Maus (Gesamtdosis pro Monat 400Mg), während die andere fünf aufeinanderfolgende Tagesdosen zu 0,8 Mg/Maus (Gesamtdosis pro Monat 4 Mg) erhielt.
Bei den behandelten Mäusen zeigte sich ein verzögertes Auftreten der Leukämie. In der Gruppe unter der Gesamtdosis von 400 Mg war dieser Unterschied eindeutig signifikant. Dies wurde durch einen weiteren Versuch bestätigt, in welchem die behandelten Gruppen 400 bzw. 40Mg PB3Derhielten.
Versuch 1
| Alter (Tage) | PB 3 D 400 pg | Inzidenz von Lymphomen (%) | Kontrollgruppe |
| 5 | PD3D4Mg | 19 | |
| 210 | 5 | 0 | 26 |
| 225 | 11 | 0 | 40 |
| 240 | 21 | 10 | 48 |
| 255 | 26 | 10 | 55 |
| 270 | 37 | 44 | 62 |
| 285 | 37 | 55 | 65 |
| 300 | 42 | 55 | 79 |
| 315 | 47 | 61 | 83 |
| 330 | 55 | 67 | 91 |
| 345 | 61 | 72 | 93 |
| 360 | 65 | 78 | 98 |
| 375 | 71 | 78 | 100 |
| 390 | 71 | 83 | 100 |
| 405 | 83 | ||
Fortsetzung Versuch 1
| Alter (Tage) | Versuch 2 | Alter (Tage) | PB 3 D 400 Mg | Inzidenz von Lymphomen (%) | Kontrollgruppe |
| 76 | PD3D4Mg | 100 | |||
| 420 | 168 | 76 | 83 | 100 | |
| 435 | 175 | 76 | 83 | 100 | |
| 450 | 182 | 76 | 83 | 100 | |
| 465 | 196 | 76 | 89 | 100 | |
| 480 | 203 | 82 | 89 | 100 | |
| 495 | 210 | 94 | |||
| 217 | |||||
| 224 | PB 3 D 400 Mg | Inzidenz von Lymphomen (%) | Kontrollgruppe | ||
| 231 | 0 | PB 3 04OMg | 5 | ||
| 238 | 0 | 5 | 5 | ||
| 245 | 5 | 10 | 5 | ||
| 252 | 5 | 10 | 5 | ||
| 259 | 5 | 15 | 11 | ||
| 273 | 10 | 15 | 11 | ||
| 280 | 15 | 20 | 11 | ||
| 287 | 15 | 30 | 16 | ||
| 294 | 20 | 30 | 26 | ||
| 301 | 25 | 30 | 26 | ||
| 308 | 25 | 30 | 32 | ||
| 315 | 25 | 30 | 32 | ||
| 336 | 30 | 40 | 42 | ||
| 343 | 37 | 40 | 47 | ||
| 350 | 42 | 45 | 53 | ||
| 406 | 53 | 45 | 53 | ||
| 462 | 53 | 50 | 58 | ||
| 518 | 53 | 55 | 58 | ||
| 560 | 53 | 60 | 58 | ||
| 53 | 65 | 63 | |||
| 60 | 65 | 63 | |||
| 60 | 65 | 68 | |||
| 60 | 65 | 68 | |||
| 65 | 70 | 74 | |||
| 65 | 70 | 84 | |||
| 80 | 80 | 95 | |||
| 80 | 85 | 100 | |||
| 85 | |||||
Während der beiden Monate vor der topischen Anwendung von Methylcholanthren wurde zwei Gruppen von RF Mäusen in dreiwöchigem Abstand zweimal PB3D oral verabreicht. Die eine Gruppe erhielt eine monatliche Gesamtdosis von 400Mg (80Mg/Tag/Maus an fünf aufeinanderfolgenden Tagen), während der anderen eine monatliche Gesamtdosis von 4Mg (0,8 [ig/ Tag/Maus an fünf aufeinanderfolgenden Tagen) verabreicht wurde. Die Kontrollgruppe blieb unbehandelt. Durch kutane Applikation an einer gut rasierten Stelle wurde eine Leukämie induziert. Die Verabreichung von PB3D verzögerte das Auftreten der Leukämie. In der Gruppe unter 400M9 PB3D war diese Verzögerung eindeutig signifikant.
| Zeit nach Be | Alter | PB 3 D 400 Mg | Inzidenz von Lymphomen (%) | Kontrollgruppe |
| handlung mit | (Tage) | PB3D4Mg | ||
| Methylencholan- | ||||
| thren (Tage) | ||||
50 80 110 140 170 190 220 250 280 290
| 170 | 0 |
| 200 | 10 |
| 230 | 25 |
| 260 | 35 |
| 290 | 55 |
| 310 | 55 |
| 340 | 55 |
| 370 | 55 |
| 400 | 60 |
| 410 | 65 |
| 6 | 14 |
| 25 | 60 |
| 44 | 75 |
| 62 | 83 |
| 69 | 95 |
| 69 | 100 |
| 81 | 100 |
| 100 | 100 |
| 100 | 100 |
| 100 | 100 |
Akute Toxizitätstests wurden durch intravenöse Injektion des Exopolymers in folgenden Dosen vorgenommen: 1 μg, 10Mg, 15Mg, 100 \ig, 300 pg, 600pg und 1200 Mg pro Maus in die Schwanzvene von fünf Mäusen für jede Dosis. Bei den Mäusen, die zwei Monate nach der Injektion noch immer am Leben waren, traten bei keiner der verschiedenen Dosen negative Reaktionen auf.
Der Stamm 1 BS von Bifidobacterium infantis longum wurde am 6. Juli 1989 bei der „Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 - Paris, Cedex, France) hinterlegt. Er trägt die Code Nummer
Dieser Stamm wurde aus Abwässern isoliert, die Fäkalmaterial menschlicher Herkunft enthalten. Er zeigt taxonomische Charakteristika zwischen Bifidobacterium infantis und Bifidobacterium longum und ist anhand des Profils seiner Strukturkomponenten, der Profile der Fermentierungskataboliten von D-Glukose, des Resistenzprofils gegenüber Antibiotika und der Bildung des Exopolymers der vorliegenden Erfindung typisierbar.
Claims (12)
1. Herstellungsverfahren für ein extrazelluläres Exopolymer, bei dem ein Bakterienstamm von Bifidobacterium infantislongum (hinterlegt unter Nr. 1-885 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismus, CNCM/lnstitut Pasteur) unter anaeroben Bedingungen in einem geeigneten Medium kultiviert und das auf diese Weise gebildete Exopolymer nach Entfernung der Mikroorganismen aus dem Kulturmedium isoliert, konzentriert und anschließend durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels präzipitiert und die durch die Präzipitation entstehende Substanz schließlich lyophilisiert wird.
2. Verfahren gemäß Patentanspruch 1, bei dem das Exopolymer durch Ultrafiltration über eine kalibrierte Porenmembran mit einer Retentionsschwelle von 10000 Dalton oder höher aus dem Kulturmedium isoliert wird.
3. Verfahren gemäß Patentanspruch 1 oder 2, bei dem das aus dem Kulturmedium isolierte Exopolymer durch Ultrafiltration konzentriert wird.
4. Verfahren gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 3, bei dem das Exopolymer durch Zugabe von Alkohol, vorzugsweise Äthanol, präzipitiert wird.
5. Extrazelluläres Exopolymer, hergestellt nach dem in Patentanspruch 1 beschriebenen Verfahren.
6. Exopolymer gemäß Patentanspruch 5, das durch immunmodulatorische Eigenschaften gekennzeichnet ist.
7. Exopolymer gemäß Patentanspruch 5 oder 6, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich im wesentlichen um ein Polysaccharid handelt und in erster Linie aus Glukose und Galaktose in einem Verhältnis von 1:1 bis 4:1 besteht, und daß es eine Proteinfraktion mit einem Gewichtsanteil von maximal 30% enthalten kann.
8. Exopolymer gemäß Patentanspruch 7, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Glukose-Galaktose-Quotient in der Größenordnung von 3:2 liegt.
9. Exopolymer gemäß einem der Patentansprüche 5 bis 8, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein apparentes Molekulargewicht von 10000 bis 100000 Dalton, vorzugsweise zwischen 20000 und 30000 Dalton, aufweist und daß es Aggregate mit einem Molekulargewicht von ca. 106 Dalton bilden kann, die im Gleichgewicht mit Einheiten niedrigeren Molekulargewichts stehen.
10. Exopolymer gemäß einem der Patentansprüche 5 bis 9, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es keine Nukleinsäuren, Lipide und organischen Säuren enthält.
11. Pharmazeutische Zubereitung, die als Wirkstoff das extrazelluläre Exopolymer gemäß einem der Patentansprüche 5 bis 10 enthält.
12. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Patentanspruch 11 mitimmunmodulatorischer, antiinfektiöser und/oder antitumoraler therapeutischer Wirkung.
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