LV11042B - METHOD FOR PRODUCING OF PERMANENT ANIMAL AND HUMAN CELL LINES AND USE THEREOFL ACARICIDALLY ACTIVE TETRAZINE DERIVATIVESrylpirrole - Google Patents

Description

LV 11042

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von permanent zilchtbaren tierischen und humanen Zellinien und die Vervendung so erhaltener Zellinien zur Gevinnung von Zellprodukten. Šeit langem bemuht man sich, sowohl aus wissenschaftlichen als auch aus prak-tischen Grunden menschliche und tierische Zellen unab-hāngig vom normalen tierischen oder menschlichen Gewebe permanent zu ziichten. Bisher ist dies nicht befriedigend gelungen und nur in wenigen Sonderfāllen konnte eine permanente ZUchtbarkeit bei bestimmten Blutzellen erzielt werden.

Es ist bekannt, zur Herstellung monoklonaler Antikdrper mit definierter Antigen-BindungsspezifitSt die soge-nannte Hybridoma-Technik anzuwenden. Mit diesem von Kčhler und Milstein {Continuous culture of fused celis secreting antibody of predefined specificity, Nature 256, 495-497 (1975)) entvickelten Verfahren kann eine einzelne, Antikārper (AK) bildende Zelle potentiell "unsterblich" gemacht und beliebig vermehrt werden.

Durch Fusion der AK-bildenden Zellen (B-Lymphocyt) mit'* einer maligne entarteten Zelle (Myelom) kSnnen Zellhybride geschaffen werden, die die Eigenschaften beider Elternteile in sich vereinen: Die FShigkeit, Antikdrper zu produzieren und die FShigkeit zu perma-nentem Wachstum. Das neue Wort "Hybridoma" wurde durch Fusion von Hybrid-Zelle und Myeloma gebildet.

Zum leichteren VerstSndnis der Besonderheiten dieser Technik sollen einige Grundlagen der Struktur und Synthese von Antikbrpern (Immunglobuline, Ig) darge-stellt werden. Ein Ig-Molekūl setzt sich aus zwei LV 11042

identischen Leicht-(L) und zwei identischen Schwer-(H)-Ketten zusammen. Jede H- und L-Kette ist in genetisch und funktionell unterschiedliche Abschnitte aufgeteilt. Die Antigen-Bindungsstellen des Antikorpers (englisch: combining sites) sind in den sog. variablen Regionen ausgebildet, die einen hohen Grad an Sequenz-Heterogeni-tat aufweisen. Die vielfāltigen Aminosauren-Austausche erzeugen ein groBes Repertoire von dreidimensionalen Strukturen, die in ihrer Form komplementār zu einer groBen Anzahl von Antigenen sind. Man schatzt, daB ein Sāuger zwischen 10^ und 10^ verschiedene Antigen-Bindungsstellen ausbilden kann.

Antikorper sind das Synthese-Produkt von B-Lymphocyten. Wahrend der ontogenetischen Entwicklung einer B-Zelle aus einer Stammzelle wird eins der vielen verfiigbaren Variablen-Region-Gene mit einem der vergleichsveise venigen Konstant-Region-Genen kombiniert/ und zwar so-wohl fur die L- wie die H-Kette. Sobald die Gen-Assozi-ierung erfolgt ist, -ist die betreffende B-Zelle darauf festgelegt, nur einen einzigen Typ von Antik6rper-Mole-kvil zu bilden, und diese Festlegung vererbt sie ihren Tochterzellen. Ohne Antigen-Stimulus verharrt die B-Zelle in einem Ruhezustand, ohne zu proliferieren.

Sie produziert und sezerniert nur wenig Immunglobulin, trāgt aber in ihrer Zellmembran fest verankert Antikorper, die exakt die gleiche Antigen-Bindungsstelle haben wie der sezernierte Antikdrper. Wenn ein Antigen in den Organismus eindringt, wird es in einer Serie von komplexen zellulSren Interaktionen den B-Zellen prāsen-tiert. -3-

Die B-Zelle, deren Membran-Immunglobulin mit dem Anti-gen spezifisch reagiert, wird dažu gebracht, sich zu teilen und einen Klon von Tochterzellen zu bilden, die zu Antikorper-produzierenden Zellen (Plasmazellen) differenzieren. Da ein B-Zellklon Antikdrper mit iden-tischer Struktur und mit identischen Antigen-Bindungs-stellen bildēt, wird das Produkt eines solchen Klons "monoklonaler Antikdrper" genannt. Komplex aufgebaute Antigene wie Proteine, Mikroorganismen oder Zellen ent-halten viele verschiedene, Antigen-virksame Stellen (Determinanten, Epitope) und folgerichtig werden viele verschiedene B-Zellen stimuliert, sich zu teilen und Klone auszubilden. Deshalb wird eine groBe Vielzahl von Antikdrpern gebildet, die sich hinsichtlich ihrer GrSBe, Ladung, Spezifit&t und AffinitSt unterscheiden und vereint im Immunserum erscheinen. Aber auch die gegen eine einzige Determinante gerichtete Immunantwort ist in aller Regel polyklonal. Es ist bekannt, daB Māuse bis zu 103 verschiedene Antikdrper gegen ein ein-faches Hapten, d. h.. eine isolierte Determinante, bil-den kdnnen. Diese Tatsachen verdeutlichen, daB es SuBerst schvierig, wenn nicht unmāglich ist, in repro-duzierbarer Weise Antisera gegen ein bestimmtes Antigen zu erzeugen. Viele Jahre wurde deshalb nach einem Ver-** fahren gesucht, das gestattet, vereinzelte B-Zellen klonal 2U expandieren, um auf diese Weise zu homogenen, monoklonalen AntikSrpern zu gelangen. Die nattirlichen Vorbilder waren die Myelome bzw. Plasmacytome, die als maligne Erkrankungen šeit langem in MSusen, Ratten und Menschen bekannt waren. Ein Myelom entsteht, wenn eine B-Zelle maligne entartet und ungehemmt proliferiert, wobei der Klon von Tochterzellen groBe Mengen an homogenen Antikdrpern produziert. Myelome kčnnen in gewis-sen Inzucht-MausstSmmen durch chemische Manipulation induziert werden. Aile Versuche, durch Kombination von -4- -4- LV 11042

Hyperimmunisierung und Myelom-Induktion zu monoklonalen Antikdrpern mit bekannter Antigen-BindungsspezifitSt zu kommen, sind jedoch erfolglos geblieben. Immerhin fuhrten diese Bemtlhungen zu Myelom-Zellinien, die in vitro kultivierbar waren und zur Grundlage der Hybridoma-Technologie gevorden sind. Die grundlegende Idee von Milstein und K5hler var, eine Hybridzelle durch Fusion zu normalen B-Zellen aus inununisierten Tieren mit einer kulturfShigen und permanent wachsenden Myelomzelle zu erzeugen. *·· .

In ihren ersten Versuchen fusionierten sie die Myelom-zellen mit den Lymphocyten aus der Milz einer Maus, die mit Schaf-Erythrocyten immunisiert worden var. Sie er-hielten 10 lebensfāhige Hybride, von denen zvei Anti-korper mit SpezifitSt gegen Schaf-Erythrocyten bildeten. Die Antik6rper-produzierenden Hybride Shnelten den Myelomzellen insoveit, als daB sie kontinuierlich in Kultur vuchsen und Tumoren bildeten, venn sie syngene-ischen Māusen implantiert vurden. Von groBer praktischer Bedeutung var veiterhin, daB die Hybridzellen vie Myelomzellen in FlUssigstickstoff eingelagert und ūber lange ZeitrSume lebensfShig konserviert verden konnten.

Technik der Hybridoma-Herstellung Māuse verden vie bei der konventionellen Antiserum-Her-stellung mit Antigen immunisiert, in der Regel vieder-holt mit mehrvochigen Unterbrechungen. Unmittelbar vor der Fusion vird die Maus getfitet und ihre Milz unter aseptischen Bedingungen exzidiert. Der Milzsack vird aufgeschnitten und die Milzpulpa vorsichtig herausge- Ο drUckt. Die Milzlymphocyten (ca. 10 Zellen) verden in -5-

Zellkulturmedium suspendiert und mit Myelomzellen im Verhāltnis 1:1 bis 10:1 vermischt. Die Zellmischung wird durch Zentrifugation dicht auf den Boden eines Rāhrchens gepackt und nach Entfernung des fllissigen Uberstandes mit dera Fusionsmedium (30 bis 50 %ige PolySthylen-Glycol-L5sung oder suspendiertes, inakti-viertes Sendai-Virus) behandelt. Nach Auswaschen des Fusionsmediums wird die Zellmischung in einer Zell-dichte von ca. 10^ Zellen pro ml in sterile Kulturge-fSBe (TUpfelplatten) Uberfiihrt und in einem CC^-bega-stem Inkubator kultiviert. 2 bis 4 Wochen nach Fusion wird das Wachstum von Hybridoma-Klonen mikroskopisch sichtbar. Ab diesem Zeitpunkt kann der Kulturiiberstand auf Vorhandensein von Antikorpern mit der gesuchten Spezifit&t untersucht verden. Dažu sind Analysenver-fahren notvendig, die Antikorper im Sub-Mikrogramm-Bereich nachweisen konnen (RIA, ELISA, Immunofluores-zenz). Die Zellen aus positiven Teilkulturen verden sodann kloniert, d. h. Einzel-Zellkulturen angelegt. Isolierte Klone, die den "richtigen" Antikorper bilden, werden expandiert und zur Tumorinduktion in die Bauch-hdhle von Pristan-vorbehandelten syngeneischen Māusen (in der Regel Balb/c-Inzucht-Mause) gespritzt. 6 bis 20 Tage nach der Inokulierung kdnnen bei Angehen des Tumors homogene Antikorper aus dem Blut oder vorzugs-veise aus der BauchhShle (Ascites) gewonnen werden (mit einer Ausbeute von 50 bis 150 mg monoklonaler Antikorper pro Maus).

Nach der Fusion liegt ein sehr heterogenes Gemisch aus

Hybriden und nichtfusionierten Zellen vor. Bei Einsatz 8 3 von 10 Maus-Milzzellen kann man mit max. 10 lebensfS- higen Hybridoma-Zellen rechnen. Da die Hybridzellen eine gewisse Anlaufzeit brauchen, bevor sie mit der

Proliferation beginnen kdnnen, die nicht-fusionierten -6 LV 11042

Myelomzellen aber sofort weitervachsen, muB ein Selektions-verfahren das Uberleben der venigen Hybridoma sichern.

Das Standard-Selektionsverfahren in der Hybridoma-Tech-nik basiert auf dem sogenannten HAT-Selektionsmedium (Littlefield, J.W.: Selection of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. Science 145, 709-710 (1964)). A steht fiir Aminopterin, einem FolsSure-Antagonisten, der den Hauptweg der DNS-Synthese blockiert. Normāle Zellen kdnnen den Aminopte-rin-Block mit Hilfe von Thymidin-Kinase (TK) und Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT) umgehen, sofern ihnen im Kulturmedium Thymidin (T) und Hypoxanthin (H) angeboten verden. Fehlt einer Zelle eines der beiden Enzyme, d'ann ist sie in HAT-Medium nicht iiberlebensfShig. Fiir die Hybridoma-Entwicklung werden deshalb Mutanten von Myelomzellen vervendet, welche TK- oder HGPRT-defizient sind. Diese Zellen sind in HAT-Medium nur dann IebensfShig, wenn sie mit einer normalen Zelle fusioniert sind, die mit ihrem Genpool das fehlende Enzym Ln die Hybridzelle einbringt. Die nicht-fusionierten Lymphocyten der Milz haben in Kultur eine natūrlich begrenzte Lebensdauer und stellen deshalb keine Bedrohung der Hybridoma dar.

Bei der Hybridoma-Herstellung treten nun folgende Probleme auf: 1. HAT-Medium-Selektion

Die selektive Unterdruckung des Wachstums von nicht-fusionierten Myelomzellen ist, wie oben dar-gestellt, eine essentielle Voraussetzung fiir die Erzeugung von Hybridoma-Klonen. Die HAT-Selektion ist aber auch fiir normāle, nicht-defiziente Zellen -7- ein SuBerst unphysiologisches Verfahren, das die Teilungs- und Uberlebensfāhigkeit der Zellen be-eintrāchtigt. Besonders bei menschlichen Lymphocy-ten ist es auBerordentlich schvierig, die Komponen-ten des HAT-Mediums konzentrationsmāBig so einzu-stellen, daB HGPRT-negative Zellen zuverlāssig abgetdtet verden, HGPRT-positive Zellen dagegen Uberleben kdnnen.

Das MiBverhāltnis zvischen der Zahl an eingesetzten Lymphozyten und Myelornzellen einerseits und der Ausbeute an vermehrungsfāhigen Hybriden anderer-seits veranschaulichen folgende Zahlen: Bei Einga- g be von 10 Maus-Lymphocyten in einen typischen

Fusionsansatz gelten 500 Hybridoma-Klone allgemein als sehr gutes Ergebnis. Da in der Milz einer Maus - auch wenn sie wiederholt (hyper-)immunisiert 4 3 worden ist - nur eine von 10 bis 10 Zellen Anti-kbrper gegen das Immunogen bildēt (wie mittels Jerne-Plaque-Te.chnik Jerne, N.V. and NORDIN, A.A.: Science 140, 405 (1963) nachgewiesen worden ist), muBten bei rein zufallsbedingter Hybridoma-Bildung 4 101 2 bis 10 Klone aufgezogen verden, um auch nur einen Klon mit gewiinschter Antikorper-Spezifitāt " ervarten zu konnen. Bei der Herstellung menschlicher Hybridoma ist das MiBverhaltnis noch krasser: Als gutes Ergebnis gilt, wenn pro Fusion 4 bis 10 Hybrid-Klone erhalten verden. 1

Chroinosomen-Verluste 2

Nach einer erfolgreichen Fusion muB die neu ent-standene Hybridzelle mit etva der doppelten, von der Natur ursprvinglich vorgesehenen Chromosomen-Menge fertig werden. Wie die praktische Erfahrung -8 -8 LV 11042 gezeigt hat, neigen Hybridzellen dažu, Chromosomen zu "verlieren". Bei jeder Zellteilung besteht bei der unphysiologischen Ubermenge von Chromosomen die Gefahr, daB diese nicht gleichmāBig auf die beiden Tochterzellen verteilt werden. Die Tochter-zelle, die veniger von dem UbermaB abbekommt und deshalb nicht mit Luxusproduktionen aufgehalten wird, hat gegenuber der anderen einen Selektions-vorteil und wird zur dominierenden Zelle in der Kultur, Die Synthese von Immunglobulin ist aber fur die Lebensfāhigkeit einer Hybridzelle nicht essentiell, sondern stellt eine "Luxus"-Synthese-Leistung dar. Das Erscheinen von Non-Producer-Varianten in einem Hybridoma-Klon ist deshalb ein hāufiges Ereignis und erfordert aufvenige Re-Klo-nierungsmaBnahmen, um die Produktionsfāhigkeit eines Klons zu sichern. Die Tendenz, Chromosomen zu verlieren, ist besonders extrem bei Inter-Spezies-Hybriden vorhanden.

Hybride Immunglobuline

Myelom-Zellen sind maligne B-Zellen und bilden selbst Immunglobuline (mit unbekannter Antigen-Bindungsspezifitāt). Diese Fāhigkeit bringt die Myelomzelle wie die normāle B-Zelle in das Hybri-doma mit ein. Da die verschiedenen Ketten des Ig-Molekiils getrennt synthetisiert und erst nach-trāglich zu kompletten Antikdrpern zusammengesetzt werden, entstehen in einer Hybridoma-Zelle, in der die zwei verschiedenen L- und H-Ketten syntheti-siert werden, zufallsbedingt 10 verschiedene Kombinationen, von denen der gesuchte "richtige" Antikdrper nur l/16tel der Gesamt-Ig-Menge aus-macht. Deshalb sind mit groBem .Aufwand bereits -9·

Maus-Myelom-Zell-Mutanten entwickelt vorden, die selbst keine H- oder L-Ketten bilden. Flir die Fusion von menschlichen Lymphocyten steht aber bislang noch keine Shnlich weit entvickelte Myelom-Linie zur VerfUgung.

Noch gravierendere Probleme liegen vor bei den Alter- nativen zur Hybridoma-Technik: 1. Immortalisierung von B-Lymphocyten durch Viren

Menschliche B-Lymphocyten von normalen Spendern kdnnen durch Infektion mit Epstein-Barr-Virus (EBV) maligne transformiert verden. Die EBV-infi-zierten, lymphoblastoiden Zellen konnen kontinu-ierlich in vitro kultiviert und kloniert werden.

Im Vergleich mit Hybridoma produzieren EBV-lympho-blasoide Linien jedoch nur 1/10 oder weniger an Immunglobulinen bei unzufriedener Produktionssta-bilitSt. Man nimmt an, daB B-Zellen in einem friihen Differenzierungsstadium durch EBV fixiert verden und deshalb ūberproportional hāufig Klone erhalten verden, die IgM in sehr geringen Mengen produzieren.

In analoger Weise kdnnen Maus-B-Lymphocyten durch den Abelson-MSuse-LeukSmie-Virus (MuLV) transformiert verden. Auch hier verden die Lymphocyten ungiinstigerveise in einem friihen Dif ferenzierungsstadium fixiert und sind schlechte Antikorper-Pro-duzenten. -10- LV 11042 2. Langzeitkulturen von nicht-transformierten B-Lymphocyten

Neueste Veroffentlichungen (Spredni, B. et al.: Long-term culture and cloning of nontransformed human B-lymphocytes. J. Exp. Med. 154, 1500-1516 (1981), Howard, M. et al.; Long-therm culture of normai mouse B-lymphocytes. Proc. Nati. Acad. Sci, USA in press) zeigen die Mdglichkeit auf, B-Lympho-cyten ohne Transformierung durch spezielle Kultur-bedingungen (permanente mitogene Stimulierung; Lymphokin-konditionierte Medien etc.) permanent zu kultivieren und zu klonieren. Fur eine routine-maBige Herstellung von monoklonalen Antikorpern sind diese Verfahren derzeit mit Sicherheit noch nicht geeignet.

Der Stand der Technik kann daher zusammenfassend wie folgt beschrieben werden: B-Lymphocyten von normalen Spendern kdnnen artifiziell "immortalisiert" werden. Die Hybridoma-Technik verven-det lebende, in Kultur unbegrenzt vermehrungsfāhige Myelom-Zellen, die rait Antigen-stimulierten B-Lymphocy-* ten fusioniert werden. Die durch Zell-Zell-Fusion ge-schaffenen Hybridzellen verden durch HAT-Selektion iso-liert und durch Anlagen von Einzelzell-Kulturen klo-niert. Hybridoma-Klone, die AntikSrper mit der ge-suchten Spezifitāt bilden, werden fur die Massenproduk-tion von monoklonalem Antikdrper vermehrt. Erhebliche Nachteile ergeben sich jedoch aus der HAT-Selektion, durch Chromosomen-Verluste und hybride Immunglobuline.

II

In einem anderen Verfahren werden B-Lymphocyten durch Infektion mit speziellen Viren maligne transformiert und in permanent vachsende Zellen umgewandelt, unter Erhalt der Antik5rper-Synthese. Sie sind aber notorisch schvache Antikorper-Produzenten.

In Hinsicht auf Massenproduktion von monoklonalen Anti-kdrpern mit definierter Antigen-BindungsspezifitSt ist daher die Hybridoma-Technik den alternativen Verfahren derzeit eindeutig tiberlegen.

Aber auch die Hybridoma-Technik hat schwerwiegende Nachteile. Der vichtigste Nachteil besteht darin, daB das Verfahren einerseits auf HAT-sensitive Fusionspart-ner, andererseits auf venige Zellarten, nSmlich Lympho-cyten und Nervenzellen beschrSnkt ist. Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, diese Nachteile zu eliminieren und ein neues, vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von permanent ziichtbaren tierischen und humanen Zellinien zu. schaffen.

Gelāst wird diese Aufgabe erfindungsgemaB durch ein Verfahren zur Gevinnung von permanent ziichtbaren tierischen und humanen Zellinien durch Fusion von normalen - tierischen und humanen Zellen mit biologischen Kompo-nenten, welche eine ZUchtungsfShigkeit in vitro bewir-ken, dadurch gekennzeichnet, daB man normāle tierische und humane Zellen mit alleine nicht vermehrungsfShigen Zellfragmenten transformierter Zellen fusioniert und in einem Kulturmedium ohne Selektionssubstanzen zttchtet.

Wesentlich beim Verfahren der Erfindung ist, daB die fiir die Fusion vervendeten Fragmente vdllig frei sind von noch vermehrungsfShigen Zellen und sich alleine auch nicht mehr vermehren kdnnen. -12- LV 11042

Uberraschenderveise fiihrt beim Verfahren der Erfindung das Ubergewicht des Cytoplasmaanteils des nicht entarteten Partners, also der normalen Zelle, nicht zu einer Extinktion der malignen Eigenschaften der entarteten Zellen und damit zur Beseitigung der Fāhigkeit zu permanentem Wachstum, obwohl es bekannt ist, daB durch Fusion von transformierten Zellen mit normālēm Cyto-plasma aus nichtmalignen Zellen die Malignitāt geloscht wird (Shay, W.J. et al.: Supression of tumorigenicity in Cybrids. J. Supramol. St. Celi. Biochem. 16^ 75-82 (1981)). Ebenso var nicht vorhersehbar, ob sich die Zellkerne mit den isolierten Kernen der entarteten Zellen, z. B. mit Myelomkernen, zu einem gemeinsamen Genom vereinigen, venn das" Myelom- Cytoplasma nicht mit in das Hybrid eingebracht vird.

Die Fusion erfolgt nach bekannten Methoden zveckmaBig in Gegenvart von fusiogenen Substanzen, vorzugsveise von Polyāthylenglycol oder von Sendai-Virus, da hier-durch analog wie bei der Hybridoma-Technik eine Erho-hung der Fusionsausbeute bewirkt wird. VJeitere fusio-gene Substanzen sind dem Fachmann bekannt und ebenfalls verwendbar.

Die Gewinnung der Fragmente der transformierten Zellen, beispielsweise also der Myelomzellen, kann nach bekannten Methoden erfolgen. Bevorzugt wird die Zellvand durch Lyse oder mechanisch aufgebrochen. Gegebenenfalls konnen dann durch Zentrifugieren die Kernfraktionen von den Cytoplasmafraktionen getrennt und die Fraktionen alleine verwendet verden. Besonders bevorzugt erfolgt die Lyse durch quellen lassen der Zellen in Glycerin und anschlieBendes Einbringen in glycerinfreie Puffer-losung. Dies fūhrt zum Platzen der Zellmembranen. Eine -13- andere bevorzugte Methode besteht in der Herstellung von Karyoplasten und Cytoplasten durch Behandlung der Zellen mit Cytochalasin B, einem ira Handel erhSltlichen Antibiotikum. Dieses Verfahren ist bekannt aus Biochem. Biophys. Res. Comm. 63, 669-674 (1975). Bei diesem Verfahren tritt eine Art "Zellteilung" auf, in den nur noch von der Zellmembran umgebenen Zellkern, den Karyo-plasten einerseits und das ebenfalls von einer Membran umschlossene, kernlose Cytoplasma, den sogenannten Cytoplasten, andererseits. Beide erviesen sich im Rahmen der Erfindung als in gleicher Weise filr die Fusion geeignet wie durch Lyse oder mechanisch erhal-tene Zellfragmente bzw. Kerne oder Cytoplasmafraktionen, die nicht mehr von einer Zellmembran umgeben sind. Der mechanische Aufschlufi kann nach den dera Fachmann wohl-bekannten Methoden, die hier keiner Erlšuterung bedilrfen erfolgen.

Die Zellfragmente kdnnen in frischem Zustand unmittel-bar nach ihrer Herstellung oder erst spMter filr die Fusionierung eingesetzt werden, wobei sich in letzterem Fall eine Aufbewahrung in lyophilisiertera Zustand be-wāhrt hat.

Unter transformierten Zellen werden solche verstanden, die in vitro und in vivo den normalen Vīachstumsregel-mechanismen nicht mehr gehorchen. Beispiele hierfiir sind raaligne entartete Zellen, wie z. B. Krebszellen, durch Virusinfektion (z. B. Eppstein-Barr-Virus) entartete Zellen und durch kanzerogene Stoffe verān-derte Zellen.

Fails filr das Verfahren der Erfindung Zellfraktionen vervendet werden, so milssen diese nicht vdllig rein sein, sie diirfen jedoch keine intakten vermehrungsfShi-gen Zellen enthalten. -14- LV 11042

Ein vesentliches Merkmal der Erfindung liegt darin, daB die erhaltenen Hybride nicht der Konkurrenz von entar-teten, nicht hybriden, in vitro ziichtungsfāhigen Zellen ausgesetzt sind und daher deren Wachstum auch nicht durch HAT-Selektionssubstanzen unterdruckt werden muB. Dadurch wird der sehr nachteilige EinfluB des HAT-Selek-tionsmediums auf die Hybride beseitigt und eine ent-scheidende Verbesserung der Ausbeute und Lebensf&higkeit an permanent ztichtbaren Zellen erzeugt.

Ferner ist es erfindungsgemSB fUr die Hybridbildung nicht mehr Voraussetzung, als entartete Zelle eine HAT-sensitive Zelle zu vervenden. Es gibt viele perma-nent wachsende Zellinien, die keine HAT-Sensibilitāt aufweisen und fur die konventionelle Hybridoma-Technik nicht vervendbar waren, im Rahmen der Erfindung aber zur Herstellung der Fragmente fttr die Fusion eingesetzt werden konnen.

Zellen verden durch Cytochalasin B (Pilz-Metabolit) veranlaBt, ihren Kern in einer extremen Ausstulpung zu "extrudieren". Unter EinfluB von Schverkraften (z. B. Zentrifugation) reiBt die diinne Verbindung leicht ab. Dadurch entsteht ein kernloser Zell-Leib (Cytoplast) und ein Kern, der mit Zellmembran und einem schmalen Cytoplasma-Saum umgeben ist (Karyoplast oder Minicell). Weder Karyoplast noch Cytoplast sind vermehrungsfāhig, halten aber ihre speziellen Funktionen uber einige Stunden bis Tage aufrecht. Die Kern-Extrusion erfordert eine relativ hohe Cytochalasin-B-Konzentration und ist, solange die Verbindung nicht abreiBt, voll reversibel. Geringere Cytochalasin-B-Konzentrationen unterdriicken die Zellteilung nach Mitose ohne Kern-Extrusion. Die Standard-Methode fiir die Cytoplast/Karyoplast-Herstel-lung filr nicht-adharente Zellen ist in Vīigler, M.H. and Weinstein, I.B.: preparative method for obtaining enucleated mammalian celis Biochem, Biophys. Res. Comm. 63, 669-674 (1975) beschrieben. -15

Es stellte sich ferner heraus, daB nicht nur oben er-vāhnte B-Lymphozyten sondern auch aile anderen bisher untersuchten tierischen und menschlichen Zellen sich erfindungsgemSB "immortalisieren" lassen (s. Beispiele 6 bis 8) . Es konnten so unterschiedliche Zelltypen vie T-Lymphozyten (Trāger der zellvermittelten ImmunitSt und Regulatorzellen des Immunsystems) , Endothelzellen (Wandzellen aus menschlichen Nabelschnurvenen) und Melanomzellen (aus kryoprāserviertem Tumormetastasen-material isoliert) durch die erfindungsgem&Be Methode in permanentes Wachstum uberfuhrt (immortalisiert) verden.

Damit macht es das erfindungsgemSBe Verfahren mdglich, beliebige tierische und menschliche Zellen in Kultur zu nehmen und auf diese Weise auch das Problem zu ldsen, Zellprodukte wie z. B. Antikorper, Gerinnungsfaktoren, Enzyme und sonstige, von der Zelle synthetisierte Sub-stanzen in vitro herzustellen. Ebenso machen es die er-findungsgemāBen Kulturen moglich, in erheblichem Umfange Versuchstiere fvir die Prūfung chemischer Sub-stanzen entbehrlich zu machen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Vervendung einer nach dem erfindungsgemSBen Verfahren hergestellten, permanent zUchtbaren Zellinie zur Ge-winnung von Zellprodukten wie monoklonalen Antikdrpern, Gerinnungsfaktoren, Lymphokinen, Enzymen und sonstigen zu den Proteinen oder anderen Stoffgruppen gehčrenden Zellprodukten.

Insbesondere kann man diese Ausfuhrungsform der Erfindung bei Vervendung permanent zUchtbarer B-Lymphozyten zur Herstellung monoklonaler Antikdrper, bei Vervendung -16- LV 11042 permanent ztichtbarer Endothel-Zellen, Melanomzellen, Hepatozyten, Nierenzellen und dergleichen zur Gevinnung von Gerinnungsfaktoren, bei Vervendung permanent ziicht-barer T-Lymphocyten + B-Lymphocyten oder/und Makrophagen zur Gevinnung von Lymphokinen, bei permanent zuchtbaren Driisenzellen zur Gevinnung der von den DrUsen sezernier-ten Produkte vie Hormone und dergleichen vervenden. Man erkennt, daB je nach der Art der fūr die Immortalisie-rung gemāB der Erfindung vervendeten tierischen Zellen aile interessierenden Zellprodukte gevonnen verden konnen, so daB es nicht erforderlich erscheint, diese hier detailliert aufzufuhren.

Die Gevinnung von Zellprodukten ist jedoch nicht auf die Produkte der Ausgangszellen, also homologe Zellprodukte, beschrānkt. Die erfindungsgemāB erhaltenen, permanent zuchtbaren Zellinien kčnnen auch zur Expression von Zellprodukten vervendet verden, die von den Ausgangszellen nicht gebildet verden, also heterolog sind und deren genetische Infprmation erst nach den Methoden der Genneukombination in die bereits permanente Hybridzelle eingebracht vird, die also heterolog sind. Die Herstel-lung heterologer Zellprodukte durch die permanente Hybridzelle kann z. B. durch Transformation bevirkt verden. So haben Versuche gezeigt, daB in die permanente Zelle gemāB der Erfindung mit Hilfe eines Vektors DNA eingefūhrt verden kann und somit zur Expression der durch' die eingefvihrte DNA codierten Produkte vervendet verden kann.

Die erfindungsgemāBen permanent zuchtbaren Zellen konnen dariiberhinaus vie ervāhnt auch als Prūfobjekte fūr Wirksubstanzen vervendet verden. Ferner konnen die erfindungsgemāB erhaltenen immortalisierten Hybridzel-len auch als Ouelle fūr die genetische Information, velche die Expression gevdnschter Zellprodukte codiert, vervendet verden, derart, daB man den die genetische Information tragenden Bestandteil der Hybridzelle, also ihr Genom, Teile des Genoms oder RNA gevinnt und nach -17- den Methoden der Genneukombination in einen geeigneten Mikroorganismus transformiert und das gevtinschte Zell-produkt aus letzterem gevinnt.

Gem&B einer Abvandlung der erfindungsgemSBen Vervendung kann daher die Herstellung der Zellprodukte wie der monoklonalen Antikorper und anderer zellulārer Substan-zen, auch- so erfolgen, daB die gebildeten Hybridzellen nicht direkt ftir die Zellproduktbildung bzw. Substanz-synthese geziichtet, sondern ihr Genom oder Teile des Genoms oder RNA nach den Methoden der Genneukombination in einen geeigneten Mikroorganismus transformiert und letzterer zur Gevinnung des monoklonalen Antikdrpers oder der zellulSren Substanzen geztichtet wird. Bei die-ser AusfUhrungsform der Erfindung isoliert man das Genom der Hybridzellen nach den dem Fachmann hierfur bekannten Methoden und transformiert es mit Hilfe eines geeigneten Vektors, wozu die handelstiblichen Vektoren verwendet werden kdnnen, nach den hierfur entwickelten Standardmethoden in einen geeigneten Mikroorganismus.

Der transformierte Mikroorganismus wird dann in ūbli-cher Weise gezūchtet und das gevunschte Zellprodukt aus ihm gevonnen. Als Mikroorganismus wird vorzugsweise einer der fūr die Genneukombination bewShrten E. coli-Stāmme vervendet.

Die folgenden Beispiele erlSutern die Erfindung veiter. Dabei verden folgende Abktirzungen und Warenbezeichnungen vervendet: AK ig H- bzw. L-Kette

Pristan

Antikdrper Immunglobu1in "Schwer"- bzw. "Leicht"-Proteinkette von Ig-Mole-kiilen 2, 6, 10, 14-Tetramethyl-pentadecan -18- LV 11042 HAT-Selektionsmedium

TK HGPRT EBV MuLV CB

DMSO DMEM FKS Ficoll PEG PBS POD ABTS EBSS RPMI 1640

Tris PBL MNC hTSH

B-hTSH

Kulturmedium enthaltend Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin Thymidin-Kinase Hypoxarvthin-Guanin-Phos- phoribosyl-Transferase Epstein-Barr-Virus Abelson-Māuse-Leukāmie- Virus Cytochalasin B Antibioti-cum (ALDRICH BIOCHEMICALS Milvaukee USA) Dimethylsulfoxid Dulbecco's Minimal Essential Medium Fetales Kālberserum polymerer Rohrzucker (PHARMACIA) Polyāthylenglycol phosphate buffered ^aline Peroxidase Ammoniumsalz von 2,2'-azino-di(3-ethylbenzothiazoline-6- .. sulfonic acid) Earle's Balanced Salt Solution Rosevell Park Memory Institut (Medium) Tris(hydroximethyl)aminomethan periphere Blut-Lymphozyten Mononucleāre Zellen (Lymphocyten, Monocyten) Humanes Thyreoidea-stimulie-rendes Hormon β-Kette des... FA CFA IFA Methocel 1500 CMV FITC-Covaspheres

EAZ

Freund'sches Adjuvans komplettes Freund'sches Adjuvans inkomplettes Freund'sches Adjuvans

Methylcellulose (FLUKA) Cytoplasma-Membran-Vesikel Fluoreszeinisothiocyanat in Kugelform (COVALENT TECHNICALS Ann Arbor, Mich. USA) Ehrlich-Aszites-Zellen (ATCC; CCL 77)

Beispiel 1 A Herstellung von Karyoplasten und Cytoplasten aus Maus-Myelomzellen der Linie Ρ3Χ63 Ag 8.653 ATCC No-CRL-1580 (analog der in Vīigler, M.H. and Weinstein, I.B.: A preparative method for obtaining enucleated mammalian celis. Biochem. Biophys. Res. Conun. 63, 669-674 (1975) beschriebenen Methode). A.l Material Cytochalasin B (CB, Aldrich Biochemicals, Milvaakee, USA) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO, Merck) geldst (2 mg/ml) und als Stammldsung bei 4 *C gelagert.

Ficoll-400 (Pharmacia; polymerer Rohrzucker) wurde in redestilliertem Wasser geldst (1 g/ml), autoklaviert und als 50 %ige Stammlosung bei -20 •C gelagert. -20- LV 11042

Einfach- und doppelkonzentriertes Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), Fetales KSlberse-rum (FKS) , L-Glutamin (200 itunol/1) , Streptomycin-Penicillin von Boehringer Mannheim. Cellulose-Nitratrdhrchen vurden durch UV-Bestrahlung sterilisiert.

Myelomzell-Linie Ag 8.653 ATCC CRL-1580: Die Linie ist in Kearney, J.F. et ai.: A new mouse myeloma celi line that hat lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibodysecreting hybrid celi lines. J. Imraunol. 123, 1548-1550 (1979) beschrieben. Sie ist Azaguinin- resistent, HAT-sensitiv und synthetisiert weder H- noch L-Ig-Ketten. Sie wird in DMEM + 15 % FKS +

Glutamin + Penicillin-Streptomycin + Pyruvat (= DMEM-Vollmedium) bei 37 *C in 7 % CC^-Atmosphāre gehalten. A.2 Methoden Enukleierung: 8 x 10^ Ag 8.653-Zellen vurden 5 min bei 10* UpM zentrifugiert und in 12 ml einer 12,5 %igen Ficoll-DMEM-CB-DMSO-Lbsung so lange resuspendiert, bis eine Zellklumpen-freie Suspension hergestellt var. Je 3 ml der Zellsuspeo.-sion vurden auf 4, 12 Stunden vorher praparierte Ficoll-Gradienten, geschichtet und mit 2 ml Ficoll-freier DMEM-CB-DMSO-LSsung tiberschichtet.

Die Rohrchen mit den Gradienten vurden in einer Ultrazentrifuge 60 Minuten lang bei 25.000 UpM (31 °C) zentrifugiert.

Nach Beendigung der Zentrifugation vurden die makroskopischen sichtbaren Fraktionen ("Banden") mit Hilfe einer Injektionsspritze mit langer Kanii-le von oben her getrennt gesammelt, in je 20 ml -21-

Kulturmedium (DMEM ohne ZusStze) verdiinnt, durch Zentrifugation sedimentiert und in frischem DMEM resuspendiert.

Folgende 4 Fraktionen vrnrden erhalten: a) Zell-Debris (an der Grenze zvischen 0 und 12,5% Ficoll), b) kernlose Cytoplasten im Bereich von 15 bis 16 % Ficoll), c) Kerne ohne erkennbaren Plasmasaura und ca. 2 % kernlose "Zellen" an der Grenze zwischen 17 und 25 % Ficoll, d) kernhaltige, nach morphologischen Kriterien in-takte Zellen mit gut erkennbarem Plasmasaum und wenige Kerne ohne Plasmasaum als Sediment auf dem Rbhrchenboden.

Die ZellzShlung ergab, daB von den 8 χ 107 Ag 8.653-Zellen in b) 1,25 x 10® Cytoplasten, in c) 4 x 10® Karyoplasten und in d) 1,1 χ 107 mutmaBličh intakte Zellen enthalten waren. B) Fusion von Maus-Milz-Zellen mit isolierten Myelom-Karyoplasten, -Cytoplasten und -Sedimentzellen aus Versuch A. B.l Material

Fusionsmittel: 20 g Polyethylenglycol (PEG-4000) wurden im Autoklaven geschmolzen, auf 56 eC abgekUhlt und bei dieser Temperatur mit 20 ml DMEM vermischt. -22- -22- LV 11042 HAT-Selektionsmedium: Zu DMEM-Vollmedium wurden Aroinopterin (4 x 10-^ M), Thymidin (1 x 10~* M) und Hypoxanthin (3,1 x 10 ^ M) gegeben.

KulturgefSBe: Tissue Culture Cluster 24 und Cluster 96 der Firma Costar, Cambridge, Mass., USA. B.2 Methoden

Fusionen: Die im Versuch A prāparierten Fraktionen b), c) und d) wurden in getrennten AnsStzen mit Milzzellen im VerhSltnis 10:1 vermischt und durch

Zentrifugieren sedimentiert. Die iiberstehende Flussigkeit wurde sorgfSltig entfernt. Zu dem Se-diment vurden 0,8 ml 50 %ige PEG-Losung (bei 37 eC, gleichmSBig ūber 1 Minūte verteilt, unter standigem, sanften Schiitteln) und dann 5 ml DMEM (bei Raumtemperatur, gleichmSBig uber 5 Minuten) gegeben. Nach Zugabe von veiteren 20 ml DMEM wurden die Zellen sedimentiert, in frischem DMEM-Vollmedium (5 ml) resuspendiert, und auf je 10, mit ’feedercells" beschichte 24er Costar-Tupfel Gewebskulturgef3Be verteilt.' Die Einzelkulturen vurden am Tag 1, 2, 3, 5, 7, 10, 13 mit DMEM-Vollmedium "gefvittert".

Feeder-cells ((Bauchhdhlen-Makrophagen): Am Tag vor der Fusion vurden Inzuchtmause (Balb/c) durch Streckung getotet. Unter sterilen Bedingungen vurden 4 bis 5 ml PBS in die Bauchhohle gespritzt -23- und nach 1 Minūte vieder abgesaugt. Die ausgespiil-ten Zellen vurden in DMEM gewaschenf in Vollmedium auf eine Dichte von 2 x 10^ Zellen pro ml suspen-diert und in 0,5 ml-Portionen auf 24er Costar-TOpfel verteilt.

Milzzellen: Einer Balb/c-Maus wurde unmittelbar vor Fusion unter aseptischen Bedingungen die Milz exstirpiert und deren Zellen in DMEM suspendiert. Zellaggregate und Gevebsstiicke vurden mit Mullgaze abfiltriert.

Elisa auf Maus-Immunoglobulin: Mikrotiterplatten r · vurden mit Maus-Ig-Antik8rpern vom Schaf (IgG-Frak-tion? 10 μg/ml 0,9 %ige NaCl- LČJsung; 150 μΐ Antikbrper-Ldsung pro Tiipfel) beschichtet. Je 100 μΐ Kulturiiberstand vurden in die beschichteten Ttlpfel pipettiert und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Absaugen der Oberstānde und zveimaligem Waschen vurden die Tiipfel mit 100 μΐ anti-Maus-Ig-POD-Konjugat-LQsung igleicher AntikSrper vie oben; kovalent verbunden mit Meerrettich-Peroxi-dase) beschickt und eine Stunde bei Raumtemperatur. inkubiert. Nach dreimaligem Viaschen wurden pro Tiipfel 100 μΐ Substrat- Ldsung (ABTS) pipettiert und die Farbentvicklung photometrisch bestimmt. B.3 Ergebnisse

Die gemāB A prSparierten Cytoplast-, Karyoplast-und Sediment-Fraktionen vurden parallel mit Milzzellen einer Balb/c-Maus fusioniert und auf je 10 1-ml-Kulturen verteilt. Je 5 der Teilkulturen _ 24 _ 24 LV 11042 vurden ohne (Platte I) und je 5 mit HAT-Zusatz (Platte II) gefūttert.

Bis zum Tag 21 nach Fusion (n.F.) war in keinem der Tiipfel Wachstum von lymphoiden Zellen makros-kopisch oder mikroskopisch nachveisbar, mit Aus-nahme der Tiipfel 4A, 4B, 4C, 3C und 3D auf Platte I, die das Fusionat der Sedimentfraktion ohne HAT-Medium enthielten. In diesen Tupfeln waren be-reits 5 Tage nach Fusion (n.F.) Kolonien erkenn-bar, die sich rapide vergrdBerten. Am Tag 8 n.F. wurde in diese Tiipfel HAT-Medium gegeben: inner-halb von 4 Tagen waren daraufhin aile sichtbaren Kolonien abgestorben.

Ab Tag 27 n.F. wurden zunāchst vereinzelt, dann in nahezu allen Tupfeln Kolonien sichtbar, die aus groBen, kugeligen, transparenten, nicht-adhārent-vachsenden Zellen bestanden. Am Tag 65 n.F. waren mit Ausnahme von I-3B, II-1A, II-4A aile Tupfel mit multiplen Kolonien von lymphoiden Zellen be-setzt. Die Prvifung der Kulturiiberstande auf Gehalt an Maus-Ig an diesem Tag ergab, wie die Zusammen-.. stellung in Tabelle 1 zeigte, positive bis stark positive Werte im ELISA in allen Teilkulturen mit Ausnahme der obengenannten Kolonie-freien Tiipfel: -25-

Tabelle 1 ELISA zum Nachweis von Maus-Immunglobulin in den KulturilberstMnden des Versuchs B (Tag 65 nach Fusion) .

Tttpfel-Kulturplatte I; ohne HAT (Ausnahmen: 4A, 4B, 4C, 3C, 3D: + HAT, Tag 8 bis 15) 1 2 3 4 5 6 A 664 601 706 632 B 526 766 011 633 C 576 769 855 623 D _ 794 . . 1500 791

T T T 12 3 1 * Cytoplasten-Fusionat 2 * Karyoplasten-Fusionat 3 = Sedimentzellen-Fusionat " 26 - " 26 - LV 11042 Tūpfel-Kulturplatte II! mit HAT (Tag 1 bis 14) 1 2 3 4 5 6 A 008 568 580 000 B 267 538 539 547 C 656 530 729 822 D 848 570 605

t t T 12 3 negativ-Ktr. 1 (DMEM-Vollmedium) : * 010 negativ-Ktr. 2 (DMEM, ohne FKS): * 040 positiv-Ktr. 1 (Mausserum 1x10”^) : * 723 _2 positiv-Ktr. 2 (Mausserum 1x10 ): >1500 a) Die Fusion von Karyoplasten mit Maus-Milz-Zellen fOhrte zu in vitro vermehrbaren, Immunglobulin-sezernierenden Zellen. Obwohl nur ein kleiner Teil des Cytoplasmas des malignen Partners in das Hybrid eingebracht wurde/ kam es nicht zu der mdglichen Extinktion des Merkmals "permanentes Wachstum". b) Die mit Karyoplasten erzeugten Hybridzellen synthetisierten und sezernierten Maus-Immunglobu-lin in "Hybridoma"-Quantitāten. Das Fehlen des Cytoplasma-Anteils der Ag 8.653 beeintrāchtigte demnach die Produktions- und SekretionsfShigkeit der Karyoplast-Milzzell-Hybride nicht. - 27- c) Aus der Fusion von Cytoplasten mit Milzzellen gingen ebenfalls Zellklone hervor, die in vitro proliferierten und Antikorper sezernierten. Eine befriedigende ErklSrung ist fur dieses besonders Uberraschende Phānomen z. Z. nicht zu geben.

Beispiel2

Zellfragmentierung mittels Glycerin-Lyse und Fusion mit humanen Blut-Lymphocyten

Material

Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), Kulturmedium APMI 1640, Fetales Kalberserum (PKS) von Boehringer Mannheim. 8-Azaguanin (8-Ag) von Serva (Heidelberg), Agar (Bacto-Agar 1614) von Difco (Fa. Hedinger KG, Stuttgart) . Die humane Plasmacytom-Linie HS SULTĀN ATCC CRL-1484 wurde als kryoprāserviertes Zellmaterial nach ATCC-Vorschrift aufgetaut und in Kultur genommen.

Nach dem in Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 71., 2679-2683 (1974) beschriebenen Verfahren vurden 8 χ 107 HS Sultan-Zellen in 100 ml RPMI 1640-Vollmedium, das 20 uM 8-Ag enthielt, 48 Stunden lang kultiviert. Die Uberlebenden Zellen vurden in 10 ml RPMI 1640-Vollme-dium. ohne 8-Ag aufgenommen und tiber 10 Tage vermehrt. Die Zellen vurden sodann auf Soft-Agar-Platten (COFFINO, P. et al: Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 68, 219-223 (1971)), die mit RPMI 1640-Vollmedium + 20 uM 8-Ag hergestellt vorden varen, ausgesSt (ca. 500 Zellen “ 28 " “ 28 " LV 11042 pro Petrischale) und im CC^-Inkubator bebriltet. Nach 9 Tagen vurden isoliert vachsende Kolonien steril von der AgaroberflSche entnommen und in RPMI 1640-Vollmedium + 8-Ag vermehrt. Ein Klon (als HS-SULTAN-8Ag-Rl bezeichnet) , der mit einer Verdopplungszeit von ca. 20 Stunden vuchs, wurde fūr den folgenden Versuch vervendet. Die HS-Rl-Zellen waren HAT-sensitiv: Zellen, die in einer Dichte von 1 bis 5 x 10^ pro ml HAT-Medium (RPMI 1640-Vollmedium mit 0,1 mM Hypoxanthin, 400 nM Aminopterin, 31 μΜ Thymidin) kultiviert wurden, vermehrten sich nicht und starben innerhalb von 7 Tagen vollstandig ab.

Humane Lymphocyten (aus dem peripheren Blut: PBL): 300 ml Venenblut wurden steril in Heparin-Losung (2 U/ml Blut) gesammelt und die Fraktion der mononukleSren Zellen (MNC: Lymphocyten, Monocyten) mit Standard-Me-thoden isoliert. 3 x 10® MNC wurden in 100 ml RPMI 1640 x 10 % FKS suspendiert und zur Abtrennung der Monocyten 24 h in KulturgefāBen bei 37 °C in 5 % CC^-Atmosphāre inkubiert.

Methoden

Fragmentierung von HS-R1: Die Zellen vurden nach (Jett, M. et al.: Isolation and characterization of plasma membranes and intact nuclei from lymphoid celis. J. Biol. Chem. 252, 2134-2142 (1977)) mit Glycerin beladen und durch Inkubation in 10 mM Tris-HCl-Puffer lysiert. Die Kerne vurden durch Zentrifugation mit 200 g (10 Minuten, 4 eC) von den Membranvesikeln abgetrennt, die ihrerseits durch Zentrifugation bei 5000 g (40 Minuten, 4 eC) sedimentiert vurden. 29

Fusion: Ca. 1 χ 108 729 HS-Rl-Kerne vurden mit Human-Lymphocyten in RPMI 1640 im VerhSltnis 1:1 suspendiert und, wie in Beispiel 1, B.2 beschrieben, mittels PEG fusioniert.

O

Das Sediment von Membranvesikeln aus etwa 1 x 10 HS-Rl-Zellen wurde mit einer Suspension von 1 χ 107 Human- Lymphocyten (iberschichtet und mittels PEG fusioniert.

In einem Kontrollansatz vurden ca. 2 χ 107 HS-Rl-Kerne in RPMI 1640-Vollmedium (ohne HAT) aufgenommen und in 4 24er Costar-Tiipfeln im CC^-Inkubator in Kultur genommen.

Aile Fusionate und die Kontroll-Kultur vurden auf Maus-Bauchhohlen-Makrophagen vie in Beispiel 1 beschrieben, als feeder- celis kultiviert.

Nachveis von Human-Ig in KulturiiberstSnden: Mikrotiter-ELISA vie in Beispiel 1, B.2 beschrieben. Zur Beschichtung vurde immunadsorptiv gereinigtes anti-human-Ig vom Schaf vervandt. Die gleiche AK-PrSparation. vurde zur Herstellung des anti-human-Ig-POD-Konjugats vervandt. Der Schaf-AK reagierte mit allen menschlichen Ig-Klassen und zeigte keine Kreuzreaktivitāt mit bovi-nem oder murinem Ig.

Ergebnisse:

Fragmentierung durch Glycerin-Tris-HCl-Lyse: Die Behandlung zerlegte HS-Rl-Zellen in eine kernhaltige Fraktion, die bei 200 g sedimentierte und in eine -30- -30- LV 11042 kernlose Cytoplasma-Membran-Vesikel-Fraktion, die bei 5000 g sedimentierbar var. Unter dem Mikroskop varen in keiner der beiden Fraktionen intakte HS-Rl-Zellen erkennbar. Die Kerne varen mit mehr oder veniger, unregelmāBig begrenzten Cytoplasma-Fetzen uingeben. Die Auszahlung ergab eine Kern-Ausbeute von 85 %. Die Vesikel-Fraktion enthielt neben venigem Debris massen-haft 0,5 bis 2 μιη groBe Vesikel ohne erkennbare Kernbe-standteile.

Die Kultur von 2 x 10^ Kernen in RPMI-Vollmedium (ohne HAT) fuhrte in einem Beobachtungszeitraum von 12 Wochen zu keinem Machstum von HS-Rl-Zellen.

Kultur der Fusionate: Die Kern-Lymphocyten- und Cyto-plasma-Vesikel-Lymphocyten-Fusionate vurden auf 96 bzv. 10 24er Costar-Tūpfel verteilt und je zur Hālfte mit und ohne HAT-Zusatz in RPMI-Vollmediura auf Maus-Makro-phagen kultiviert. Ab der zweiten Vīoche nach Fusion vurden Kolonien von -lymphoiden Zellen sichtbar, die kontinuierlich an GroBe zunahmen.

Produktion von humanem Immunglobulin: Am Tag 21 nach Fusion vurden Kulturilberstānde (am Tag 19 var ein kompletter Medium-Wechsel vorgenommen vorden) auf Gehalt an menschlichem Immunglobulin geprUft. Die Er-gebnisse zeigen die Tabellen 2a und 2b. -31-

Tabelle 2a ELISA zum Nachveis von Human-Immunglobulin in Kultur-UberstSnden (Karyoplasten-Fusion, 21 Tage nach Fusion). I + HAT 1 2 3 4 5 6 A 029 147 286 147 228 270 B 171 086 050 144 846 121 C 118 156 250 082 179 059 D 120 1148 024 096 023 151 I - HAT 1 2 3 4 5 6 A 660 233 175 270 410 322 B 103 264 229 253 271 260 C 045 343 370 128 150 126 D 171 173 141 116 218 699 II + HAT 1 2 3 4 5 6 A 135 290 107 279 530 674 B 116 500 469 315 315 627 C 120 050 068 159 226 145 D 191 078 686 110 242 561 II - HAT 1 2 3 4 5 6 A 381 235 489 514 608 217 B 348 239 214 158 367 163 C 185 275 235 234 322 316 D 21-9 202 292 283 220 052 32- LV 11042

Tabelle 2b

Cytoplasten-Fusion, 21 Tage nach Fusion. 1 2 3 4 5 6 A 052 627 917 B 041 326 715 C 071 400 826 0889 D 079 917 494 1016 T T t 12 3 1 = Kern-Kontroll-Kultur

2 = mit HAT

3 = ohne HAT

Setzt man die Extinktionswerte von 0 bis 99 als negativ bis zweifelhaft, die Vīerte von 100 bis 200 als positiv, die Werte>200 als stark positiv an, dann ergibt sich fiir die durch Kernfusion erzeugten Kulturen folgende Verteilung: -33-

Kern-Lymphocyten-Hybride, kultiviert ELISA auf Human-Immunglobulin negativ positiv stark positi\ n 11 18 19 mit HAT (n = 48) (%) (23) (37) (40) n 2 12 34 Dhne HAT (n = 48) (%) (4) (25) (71)

Die Ergebnisse lassen folgendes erkennen:

Fusionate, die mit Lyse-Fraktionen hergestellt werden, kSnnen ohne HAT-Selektion kultiviert werden. Das Ver-fahren ist sehr viel weniger arbeitsaufvendig als die Cytochalasin-B-Extrusion und liefert fusionsfShiges Ma-terial in hoher Ausbeute. Eine klare Auftrennung in "Kern-" und "Cytoplasma-Membran"-Fraktionen wird mit keinem der beiden Verfahren erreicht. Sowohl die tlber-wiegend Kern-Material enthaltende wie die Uberwiegend Cytoplasma-Membran-Vesikel enthaltende Fraktion erzeugt nach Fusion mit menschlichen Lymphocyten aus dem Blut in vitro vermehrungsfāhige, AK-produzierende Zell-Klone. - 34 “ - 34 “ LV 11042

Der Parallel-Ansatz der Kern-Lymphocyten-Hybride mit und ohne HAT-Zusatz dokumentiert die negativen Ausvir-kungen des Selektionsmediums: Mit HAT sind 23 % der Prinarkulturen Ig-negativ und nur 40 % stark positiv; ohne HAT sind Uber 70 % stark positiv und nur 4 % Ig-negativ.

Beispiel 3

Fusion von Milzzellen einer immunisierten Maus mit nativen und fragmentierten Myelomzellen Ag 8.653

Material

Humanes Thyreoidea-stimulierendes Hormon (hTSH) und dessen isolierte β-Kette (fi-hTSH) stanunten von Boehringer Mannheim. Komplettes und Inkomplettes Freund'sches Adjuvans {CFA, IFA) von Difco, Methocel 1500 von Fluka und FITC-Covaspheres von Covalent Tech. Co.; Ann. Arbor, Michigan, USA.

Methoden

Immunisierung: Balb/c-Māuse vurden mit BhTSH (40 ug in CFA, intraperitoneal) primSr immunisiert (Tag 1), und am Tag 196 mit hTSH (50 ug in IFA, i.p.), am Tag 266 mit hTSH ohne Adjuvans i.p. sowie am Tag 294 mit hTSH intravends "geboostert". Ο

Milzzellen (ca. 1 x 10 ) vurden von einer der immunisierten Māuse 3 Tage nach der letzten Booster-Immuni-sierung, wie in Beispiel 1, B.2 beschrieben, gevonnen und je zur HSlfte fiir zvei Fusionen vervandt. -35-

Fusion 1: 5 χ 107 Milzzellen und 1 χ 107 Ag 8.653-Zel-len wurden vermischt, wie in Beispiel 1, B.2 beschrie-ben, fusioniert und in 48 24er Tūpfel mit Maus-Makro-phagen-Zellen in HAT-haltigem DMEM-Vollmedium kulti-viert.

Fusion 2: 1 χ 107 Ag 8.653-Zellen vurden wie in Beispiel 2 beschrieben, durch schrittveise Behandlung mit Glycerin und 10 mM Tris-HCl-Puffer lysiert. Die Cytoplasma-Membran-Vesikel- (CMV-) Fraktion wurde pelle-tiert (5.000 g, 40 Minuten, 4 eC) . Die Kern-Fraktion wurde mit 7 χ 107 Milzzellen vermischt, durch Zentrifu-gation auf das CMV-Sediment geschichtet und mittels PEG nach dem Standardverfahren, wie in Beispiel 1, B.2 be-schrieben, fusioniert. Das Fusionat wurde im DMEM-Voll-medium auf 24 24er Costar-Tūpfeln mit Makrophagen erteilt und ohne HAT-Zus3tze kultiviert.

Antigenspezifische Markierungen von Hybridzellen und Klonierung: (FITC-) Covaspheres vurden nach der allgemeinen Vorschrift des Herstellers mit hTSH kovalent beschichtet (TSH-CS) und in 5 o/oo Hatriumazid-L6sung gelagert. Nach dem in PARKS, D.R. et. als Proc. Nati. Acad. Sci. USA J±, 1982-1966 (1979) beschriebenen Verfahren vurden die Zellen mit den be-schichteten Covaspheres markiert und mit Hilfe eines Cytofluorographen groBe, Fluoreszenz-positive Zellen einzeln in Tvipfel und 96er Costar-Platten "abgelegt". Die Tupfel varen 24 Stunden zuvor mit Maus-Makrophagen in DMEM-Vollmedium beschicht vorden. ELISA fiir TSH-spezifische Antikdrper: Beschichtung, Inkubation der KulturdberstMnde, Substrat-Reaktion und Ablesung vie in Beispiel 1, B.2, beschrieben. Anstelle -36- LV 11042 von anti-Maus-Ig-POD wurde TSH-POD-Konjugat vervendet. Als positive Kontrolle vrnrde Serum einer hTSH-hyper-immunisierten Maus, 10~3 verdilnnt, eingesetzt; als Negativ-Kontrolle diente ein Klon, velcher Antikorper gegen ein nichtvervandtes Antigen bildete (Maus-anti-Digoxin).

Ergebnisse

Sowohl in den Kulturen aus Fusion 1 (mit intakten Ag 8.653- Zellen) als auch denen aus Fusion 2 (mit Ag 8.653- Lyse-Fragmenten) waren am Tag 14 in allen Tvipfeln Kolonien von groBen, lymphoiden Zellen erkennbar. Der mit KulturiiberstSnden vom Tag 14 durchgefiihrte ELISA zum Nachveis von TSH-spezifischen Antikorpern ergab die in Tabelle 3 zusammengefaSten Werte: In allen Teilkul-turen wurde anti-TSH nachgewiesen.

Tabelle 3 a) 1 2 3 4 5 6 A 235 236 212 149 119 212 B 109 221 119 104 176 068 C 116 108 135 139 093 135 D 171 128 120 228 137 145 b) m m 1 2 3 4 5 6 A 271 268 267 286 194 291 B 288 278 362 317 280 305 C 207 292 252 226 292 271 D 295 376 370 338 310 333

Negativ-Kontrolle (DMEM-Vollmedium) : 000 Positiv-Kontrolle (Anti-TSH-Mausserum) : 362 ELISA zum Hachveis von Anti-TSH in KulturiiberstSnden am Tag 14 nach Fusion. a) Fusion 1 (intakte Ag8.653)/ b) Fusion 2 (Ag653-Fragmente) -37-

Am Tag 15 wurden die nicht-adhārenten Zellen aus den Einzel-TUpfeln von Fusion 1 und 2 herausgesptllt und in getrennten Ansātzen TSH-Antigen-spezifisch markiert (Grundlage: Hybridoma tragen in der Regel wie B-Lympho-cyten einen Teil der von ihnen synthetisierten Antikdr-permolekiile in der Zellmembran verankert, mit "nach auBen" gerichteten Antigen-Bindungsstellen) und mit Hilfe des.Zellsorters kloniert.

Beispiel 4

Fusion von Humanen PBL mit intakten und mit fragmen-tierten Ag 8.653-Zellen.

Material

Inaktiviertes Hepatitis-B-Surface-Antigen (HB .;

d X

Biotest) wurde durch Immunadsorption von Serumproteinen gereinigt. ELISA zum Nachweis von humanen HBs-Antikorpern: Mikrotiter-Platten wurden mit gereinigtem HB . (20 ug/ml 0,9%ige NaCl-Losung)

S X beschichtet. Inkubation der Kulturiiberstānde, Konjugat-und Substrat-Reaktion sowie Ablesung wie im Beispiel 1.B.2 beschrieben. Anstelle von Anti-Maus-Ig-POD wurde (Scha f-)Anti-Human-Ig-POD verwende t.

Durchfuhrung HPBL von einem Spender mit,hohem anti-HBs-Titer vurden aus 200 ml Venenblut durch Ficoll-Gradienten-Zentrifu-gation isoliert. Zur Anreicherung der B-Lymphocyten wurden die T-Zellen mit Schaferythrocyten (nach Standard-verfahren) rosettiert und mittels einer zweiten Ficoll- -38- LV 11042

Gradienten-Zentrifugation abgetrennt. Die Fraktion der nicht-rosettierenden Zellen (HPBL(B)) vurden in einer 7

Dichte von 5 x 10 Zellen in RPMI 1640 + 10 % autologem

Plasma (30 min/56 eC-hitzeinaktiviert) mit ca. 10 ug HBsi im C00-lnkubator kultiviert (Mediumvechsel aile 12 ^ ·

Stunden).

Fusion 1: 1 x 10^ der vorbehandelten HPBL(B) wurden 7 mit 1 x 10 Ag 8.653 vermischt und, vie in Beispiel 1, B.2 beschrieben, mittels PEG fusioniert. Das Fusionat wurde in RPMI 1640 + 10 % Humanplasma + HAT in 4 24er Costar-Tupfeln kultiviert. o

Fusion 2: 1,1 x 10 Ag 8.653-Zellen vurden mittels

Glycerin-Lyse fragmentiert. 1 x 10^ Ag 8.653-Kerne vurden mit 1 x 10^ HPBL(B) vermischt und auf das Sēdi- g ment von Membran-Cytoplasma-Vesikeln (aus 1 x 10 Ag 8.653-Zellen) geschichtet. Nach Fusion mit PEG vurde das- Fusionat in 4 24er Costar-Tupfeln in RPMI 1640 + 10 % Humanplasma (ohne HAT-Zusatz) kultiviert.

Ergebnisse

In allen Tupfeln von Fusion 1 und 2 trat ab Tag 3 star-kes Wachstum von sehr groBen, adhSrenten Zellen auf. Am Tag 5 vurde die Hauptmasse der nicht-adhārenten Zellen vorsichtig suspendiert und auf zvei neue 24er Costar-Tūpfel verteilt (z. B. AI B1 und Cl). Am Tag 28 in Fusion 1: kleine Kolonien in A2 und A3, in den restli-chen Ttipfeln nur adhārente Zellen; in Fusion 2: massi-ves Wachstum multipler Kolonien in allen Tupfeln mit Ausnahme von C3. Der mit Kulturuberstānden vom Tag 35 durchgefiihrte ELISA zum Nachveis von humanen Immunglobu-linen mit SpezifitSt gegen Hepatitis-B-Antigen ergab -39- das in Tabelle 4 zusammengefaBte Ergebnis: die Fusion 1 (intakte Ag 8.653-Zellen, Kultur in HAT-Medium) lieferte keine positive Kultur; dagegen waren 5 von 12 Kulturen der Fusion 2 (Ag 8.653-Fragmente, Kultur in Norma1-Medium) eindeutig Anti-HB -positiv. 5

Tabelle 4 a) 1 2 3 4 A 000 000 000 000 B 000 001 011 000 C 005 000 000 004 b) 1 2 3 4 A 010 000 189 553 B 000 003 198 032 C 000 173 000 107

Negativ-Kontrolle (Anti-HB -neg. Humanserum): 000

Positiv-Kontrolle (Anti-HBs-pos. Humanserum): 185 s ELISA zum Nachweis von Human-Anti-HB in KulturtiberstSn-den am Tag 35 nach Fusion. a) Fusionsl (intakte Ag 8.653), b) Fusion 2 (Ag 8.653-Fragmente). -40- -40- LV 11042

Beispiel 5

Fusion von HPBL mit Fragmenten aus der humanen Plasma cytom-Linie HS SULTĀN

Material HS Sultān wurde von der American Type Culture Collec-tion (ATCC) unter dem Code CRL-1484 als kyroprāservier-tes Zellmaterial bezogen und nach ATCC-Vorschrift auf-getaut und in Kultur genommen.

Durchftihrung HPBL wurden wie in Beispiel 4 beschrieben vom gleichen Spender aufgearbeitet und in vitro mit HBsi "geboostert".

Fusion: 4 x 10^ HS SULTAN-Zellen vurden mittels Glycerin-Lyse fragmentiert. Die

Membran-Cytoplasma-Vesikelfraktion wurde bei 5500 g (40 Minuten) sedimentiert und ein Gemisch von ca. 4 x 10^ HS-SULTAN-Kernen und 4 x 10^ HPBL(B) daraufgeschichtet PEG-Fusion erfolgte nach Beispiel 4. Aussaat des Fusionats auf 12 24er Costar-

Tupfel in RPMI 1640 + 20 % FKS + Pyruvat + Insulin (Novo 2 U/ml) + 1 % nicht-essentielle Aminosauren (BM) + 1 % Methocel 1500 ohne HAT-Zusatz.

Ergebnisse

Tag 14 nach Fusion: Wachstum von grofien, nichtadharen ten, lymphoiden Zellkolonien. -41-

Beispiel 6

Immortalisierung von menschlichen T-Lymphozyten 6.1 Material und Methoden T-Lymphozyten vurden mittels Standardverfahren (Rosettierung mit Schaferythrozyten, Ficoll-Gradientenzentrifugation) aus der Lymphozyten-Gesarotfraktion isoliert und sofort oder nach 3tāgiger Kultur behandelt. Ehrlich-Aszites-Zellen (ATCC; CCL 77) vurden in DMEM mit 10 % Pferdeserum kultiviert und dienten als Spender der transfor-mierenden Fragmente. Die Fragmentierung der EAZ vurde nach Jett et al. (J. Biol. Chem. 252, 2134-2142 (1977)) mittels Glycerin-Lyse ausgefvlhrt. Die Uberviegend Kernmaterial enthaltende Fraktion vurde durch Zentrifugation abgetrennt und vervor-fen. Die Mitochondrien-reiche cytoplasmatische tlembran-Vesikelfraktion (CMV) vurde zur Transfor-mierung vervandt. 5 χ 107 T-Lymphozyten vurden mit einem UberschuB. an PHA-Lektin (Difco) beladen, mit der CMV-Fraktion aus EAZ vermischt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung vurde durch Zentrifugation sedimentiert, der flOssige Oberstand restlos entfernt und durch 1 ml einer 50%igen PEG-L5sung ersetzt. Nach lminiitiger Ein-virkungszeit vurde die PEG-Losung durch Zugabe von RPMI-1640-Kulturmedium ausverdvlnnt und durch Zentrifugation von den Zellen abgetrennt. Die Zellen vurden in RPMI-Medium mit 20 % foetalem -42- LV 11042 Kālberserum (FKS, BM) aufgenommen, aus 12 1-ml-Kul-turtilpfel verteilt und bei 37 °C in 5%iger C02“ Atmosphāre kultiviert. Die Charakterisierung der Zellen anhand von OberflSchenraerkmalen erfolgte nach Standardverfahren mittels Schafserythrozyten (E)-Rosettierung (KAPLAN, M.E. et al.; J. Immunol. Methods 5_, 131 (1974)) und mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung der beiden T-Zell-spezifischen Antikorper OKT-3 (Ortho; REINHERZ, E.L. et al.; J. Inununol. 123, 1312 (1979)) bzw. MAK 4-11 (RIEBER, P. et al.; Hybridoma 1^, 59 (1981)) und f luoreszenzmarkiertem Anti-Human-Immunglobulin (Ig; Fa. Dako) zum Nachveis von B-Zell-typischem Membran- Ig. 6.2 Ergebnisse

Innerhalb der ersten 14 Tage starb der GroBteil der Zellen in den Kulturen ab. Ab Tag 21 vurden im Zelldebris Kolonien von kleinen bis mittelgroBen Zellen sichtbar, die sich kontinuierlich vermehr-ten. Wachstum von Kolonien wurden in allen 12 Tupfeln gefunden, und zwar bis zu 50 Kolonien pro Tiipfel. Am Tag 30 vurden die Kolonien in groflere KulturgefSBe Uberfuhrt und veiter vermehrt. Die Zellen vurden anhand ihrer Oberflāchen-Marker ana-lysiert und folgende Ergebnisse erhalten: > 95 % > 90 % > 90 % 4 5% a) E-Rosetten-positiv: b) ΟΚΤ-3-positiv: c) 4-11-positiv: d) Igs-Positiv; -43- 6.3 Beurteilung

Fragmente, die aus EAZ (permanente Mauszell-Linie) durch Glycerin-Lyse gevonnen werden kdnnen, erzeu-gen nach PEG-Fusion mit isolierten T-Lymphozyten permanent in Kultur vachsende Zellen, die aufgrund ihrer Oberflāchenmerkmale eindeutig als T-Lympho-zyten identifizierbar sind.

Beispiel 7

Immortalisierung von menschlichen Endothelzellen 7.1 Material und Methoden

Aile Kulturgef&Be vurden vor Einsaat von Zellen mit Gelatine beschichtet. Das Kulturmedium bestand aus einer l:l-Mischung von RPMI-1640 und Medium 199 (BM) mit 20 % FKS. Menschliche Endothelzellen vurden nach Jaffe et al. (J. Clin. Invest. 52, 2745-2756 (1973)) mittels Collagenase-Lbsung (Gibco) aus den Venen von frischen NabelschnUren gevonnen und vor der Transformierung durch Anlage einer PrimSrkultur ūber ca. 14 Tage vermehrt. FUr die Transformierung vurden die adhārent vachsenden Endothelzellen mittels Trypsin-EDTA-LQsung (BM) abgelūst und in Suspension, vie unter 6.1 beschrie-ben, mit der CMV-Fraktion aus EAZ fusioniert. Die so behandelten Zellen vurden in einer Zelldichte von 5 x 10^ pro 75 cma-Kulturgefafl ausgesat und im COj-Inkubator kultiviert. Zur Kontrolle vurden je-veils ein Aliquot der Endothelzellen aus den PrimSrkulturen ohne CMV-Fraktion mit PEG-Ldsung behandelt (Scheinfusion) und rekultiviert. Sobald -44- LV 11042 die Zellen auf dem Boden des KulturgefāBes einen ltickenlosen Zellrasen ausgebildet hatten, vurden sie mittels Trypsin-EDTA-Losung abgelfist und im Verhaltnis 1:3 auf frische KulturgefāSe ūbertragen (= Passage). 7.2 Ergebnisse

Die mit CMV-Fraktion fusionierten Endothelzellen hafteten nach Einsaat mit einer Effizienz von 20 bis 30 % an und wuchsen innerhalb von zwei bis drei Tagen zu einem konfluenten Zellrasen aus. Die schein-fusionierten Zellen hafteten mit etwa der gleichen Effizienz an, vermehrten sich aber kaum und starben - ohne einen konfluenten Zellrasen auszubilden - innerhalb von ca. 21 Tagen vollstān-dig ab. Ganzlich unbehandelte Endothelzellen vermehrten sich bis maximal in die 3. Passage, stellten dann das Wachstum ein, losten sich unter Abkugelung vom Boden des Kulturgef&Bes und lysier-ten. In 8 verschiedenen Ansātzen mit Endothelzellen aus insgesamt 18 verschiedenen Nabelschnuren vuchsen die CMV-behandelten Zellen problemlos iiber. die 10. Passage hinaus. Die transformierten Endothelzellen konnten ohne Verlust an Lebens- und TeilungsfShigkeit in flUssigen Stickstoff ein- und ausgelagert verden. 7.3 Beurteilung

Humane Umbilical-Endothelzellen konnten ohne transformierende Manipulation gemSB Erfindung nicht iiber die 3. Passage kultiviert werden, womit die in der Literatur mitgeteilten Erfahrungen (z. B. Grimbrone, M.A., in Progress in Haemostasis and -45-

Thrombosis, Voļ. 3; Maciag, T. et al., J. Celi Biol. 91, 420-426 (1981)) bestStigt vurden. Durch Fusion mit der Mitochondrien-reichen CMV-Fraktion aus Ehrlich-Aszites-Zellen vurden die Kultureigen-schaften der Endothelzellen so verāndert, dafi sie problemlos Uber die kritische 3. Passage hinaus vermehrbar varen (und sich derzeit in der 23. Passage befinden, ohne "Ermvidungserscheinungen" zu zeigen).

Beispiel 8

Immortalisierung von menschlichen Melanomzellen 8.1 Material und Methoden

Melanomzell-haltiges Gevebe vurde durch chirur-gische Exzidierung einer Huft-Lymphknoten-Meta-stase gevonnen, unter sterilen Bedingungen in kleine Wūrfel zerschnitten und bis zur Fusion in fltlssigen Stickstoff eingelagert. CMV-Fraktionen aus EAZ vurden, vie unter 6.1 beschrieben, herge-stellt.

Vor der Fusion vurde das Melanomzell-haltige Material aufgetaut und mittels Trypsin-Behandlung einer Einzelzell-Suspension hergestellt. Die Frak-tion der groBen, braun-rot pigmentierten Melanomzellen vurden durch Ficoll-Gradienten-Zentrifuga-tion von den Begleit-Lymphozyten befreit und, vie unter 6.1 beschrieben, mit CMV-Fraktion unter PEG-Einflufl fusioniert (ca. 4 x 10^ Melanomzellen mit CMV aus ca. 1 x 10^ EAZ) . Zur Fusionskontrolle -46- LV 11042 dienten 4 x 10^ Melanomzellen, die ohne CMV mit PEG behandelt wurden. Die Zellen vurden nach der Fusion in einer Dichte von 1 x 10^ Zellen pro Tiipfel in RPMI 1640 + 20 % FKS ausgesāt und bei 37eC in 5%iger C02”Atmosphāre kultiviert. 8.2 Ergebnisse

In allen 4 Teilkulturen der mit CMV fusionierten Melanomzellen wuchsen ab Tag 28 Kolonien von typisch pigmentierten Zellen in Form von semi-adhārenten Zellhaufen, die sich kontinuierlich vergroBerten. In der Kontroll-Kultur der schein-fusionierten Zellen kam es zu keiner Zellvermeh-rung, vielmehr zeigten die Zellen ab Tag 8 eine zunehmende Granulierung, und am Tag 22 waren nur noch Zelltrummer in der Kultur vorhanden. 8.3 Beurteilung

Humane Melanomzellen aus kryoprāserviertem Meta-stasengewebe konnten durch CMV-Fusion zu in vitro Kultur- und vermehrungsfāhigen Zellen transfor-miert verden. Scheinfusionierte Melanomzellen gleicher Herkunft starben dagegen bei sonst identischen Kulturbedingungen ab.

Beispiel 9

Einfiihrung eines eukaryontischen DNA-Vektors in immor-talisierte menschliche Endothel-Zellen 9.1 Nachweis von transfiziertem Material in den Zellen durch Abklatschen (Southern blotting) von Hirt-Uber-stānden. -47- 9.1.1 Material

Plasmid Z-pBR 322/RchrBG-A425 B (Dierks, P. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78, 1411-1415 (1981)) enthSlt ein 2.070 Basenpaare (Bp) Kaninchen-B-globin-Genfragment.

Das Cla-Pvu I-Fragment von pBR 322 wurde durch ein 3.039 Bp Hpa I-Bam H 1-Fragment ersetzt, velches die gesamte Region der frūhen Gene und den Anfang der Region der spSten Gene von SV 40 enthālt (Tooze, J. (1980), in "DNA Tumor Viruses", J. Tooze, ed., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory und B. Wieringa et el., Cetus-UCLA Symposium on Gene regulation 1982). Dieses Plasmid wird im folgenden als pBR 322 RBG SV 40 bezeichnet. 9.1.2 Methoden

Menschliche Endothelzellen wurden, wie im Beispiel 7 beschrieben, immortalisierb und vachsen gelassen. Je 10^ Sellen wurden mit 6 ug pBR 322 RBG SV 40 und mit 4 ug mit Ultraschall behandelter Kalbsthymus DNA transfiziert unter An-vendung der KalziumphosphatfSllungsme-thode (Graham, F.L. et al., Virology 52^, 456-467 (1973) und Wigler, M. et al.,

Celi 14, 725-731 (1978)). 10 Stunden und 40 Stunden nach der Transfektion wurden Hirt-UberstSnde hergestellt (Hirt, B., J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967)). -48- -48- LV 11042

Die Hirt-Uberstānde wurden auf einem l%igen Agarosegel getrennt und nach der

Methode von Southern (Southern, E.M., J.

Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)) auf

Nitrocellulosepapier ubertragen. Plasmid 32 pBR 322 RBG SV 40 vmrde mīt P unter Anvendung der Nick-Translationsmethode von Rigby, P.W. et al., J. Mol. Biol. 113, 237-251 (1977) markiert und mit der ilbertragenen DNA auf den Nitrocellulose-filtern hybridisiert wie beschrieben bei Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).

Der Filter wurde auf Rontgenfilm bei -70eC belichtet. 9.1.3 Ergebnisse

Menschliche Endothelzellen, die mit Plasmid pBR 322 RBG SV 40 transfiziert vmrden, ergeben ein starkes Hybridisie-rungssignal, velches dem authentischen Plasmid entspricht hinsichtlich seiner Mobilitāt auf Agarosegel. Ein Vergleich der Signale der Hirt-Uberst&nde der Zellen 40 Stunden nach der Transfektion mit denen der Zellen 10 Stunden nach der Transfektion ergab eine vier- bis fUnffache Steigerung der Intensitāt des Hybridisierungssignals.

Eine Hybridisierung an DNA-Spezies, die kleiner sind als das eingebrachte Plasmid wurde ebenfalls beobachtet. Diese -49-

Signale waren in nicht transfizierten immortalisierten menschlichen Endothel-zellen nicht feststellbar.

Die gleiche IntensitStsverteilung der Hybridisierungssignale wurde beobachtet, wenn HeLa-Zellen mit Plasmid pBR 322 RflG SV 40 transfiziert wurden. 9.1.4 Beurteilung

Die Tatsache, dafl in den Hirt-UberstSn- den menschlicher inunortalisierter

Epi thelzellen, die mit Plasmid pBR 322

RflG SV 40 transfiziert vorden waren, 32 eine DNA-Hybridisierung an P-markier-tem eingebrachtem Plasmid festgestellt wurde, jedoch nicht bei nichttransfizierten Zellen, ist ein Beweis dafiir, dafl der Vektor in die eukaryontische Zell-linie eingefahrt wurde. Die Beobachtung, dafl das Hybridisierungssignal bei trans-fizierten Zellen 40 Stunden nach der Transfektion vier- bis fUnffach stSrker6* IntensitSt aufv/ies als bei Zellen 10 Stunden nach der Transfektion, l&flt die Schluflfolgerung zu, dafl das transfizier-te Plasmid in den Zellen repliziert vairde. 9.2 Nachweis von Kaninchen-fl-globin spezifischen Transcripten in immortalisierten menschlichen Endothelzellen, die mit Plasmid pBR 322 RflG SV 40 transfiziert wurden. -50- -50- LV 11042

Material

Als Nuklease S^, Polynukleotidkinase und Kālberdarmphosphatase wurden die handelsiiblichen Prāparate von Boehringer Mannheim verwendet.

Methoden

Immortalisierte menschliche Epithelzel-len wurden wie in 9.1.2 beschrieben, vermehrt und mit dem das Kaninchen-S-globin-Gen enthaltenden Vektor transfi-ziert. 48 Stunden nach der Transfektion vrurden 1 bis 2 x 10^ Zellen lysiert und die RNA nach der LiCl-Harnstoff-Methode (Auffray, C. at al. , Eur. J. Biochem. 107, 303-314 (1980)) extrahiert.

Herstellung einer Kaninchen-B-globin spezifischen Hybridisierungssonde.

Plasmid pBR 322 RBG SV 40 wurde mit Hae III abgebaut und das sich von +135 bis -75 erstreckende Fragment (Dierks, P. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78, 1411-1415 (1981)) und Van Oyen, A. et al., Science 206, 337-344 (19 ) wurde auf einem 2%igen Agarosegel isoliert und durch DEAE-Cellulose-Chromatographie weiter gereinigt (Miiller, W. et al., J. Mol. Biol. 1_24, 343-358 (1978)). Das Fragment wurde mit KSlberdarmphosphatase 32 -51- und P-dephosphoriliert und mit 32 f- P-ATP und Polynukleotidkinase markiert wie beschrieben in (Mantei, N. et al.# Gene 10, 1-8 (1980)).

Nuklease Kartierung

Das mit der Kinase behandelte Fragment wurde zusammen mit 10 ug E. coli t-RNA (Boehringer Mannheim) durch Athanol gef&llt und in 100 ul 0,4 M/l NaCl, 1 mM/1 EDTA, 40 mM/1 Pipes-Puffer, pH 6,4 und 80 % Formamid gelost (Mantei, N. et ai-, Nature 281, 40-46 (1979). Die cellulare RNA (= 25 ug) wurde vakuumge-trocknet, in 10 ul Sonde (0,01 pMol, 30.000 cpm) in Puffer, wie oben beschrieben geldst, denaturiert, in Glaskapillare eingeschmolzen und 16 Stunden bei 48eC hybridisiert. In einem Kontrollversuch vurde die Sonde mit Kaninchen-B-globin m-RNA (Mīles) hybridi-siert. Die Probe vurde mit 100 ul 0,2 M/l NaCl, 50 mM/1 Natriumacetatpuffer pH' 4,5, 1 mM/1 ZnS04 und 0,5 % Glycerin verdiinnt und mit 50 Einheiten Nuklease Sj 60 Minuten bei 30°C inkubiert (Weaver, R. et al., Nucl. Acid Res. 7, 1175-1193 (1979)) .

Die Proben vurden mit Phenol behandelt, zusammen mit 10 ug E. coli t-RNA durch Athanol gefSllt, mit 80 %igem Athanol gevaschen (20 Minuten bei -70eC), -52- -52- LV 11042 vakuumgetrocknet, in 5 ul Fārbelosung geldst (0,05 % Bromphenolblau, 0,05 % Xylolxyanol, 1 mM/1 EDTA, 90 % V/V Formamid), 2 Minuten in einem siedenden Wasserbad erhitzt und der Elektrophorese auf 5 % Polyacrylamidgel (89 mM/1 Trisbase, 89 mM/1 BorsSure, 1 mM/1 EDTA und 7 M/l Harnstoff) untervorfen. Das Gel wurde mit Rčntgenfilm der Firma Fuji und einem Verstārkerschirm bei -70°C autoradiographiert. 9.2.3 Ergebnisse

Die GroBe der geschiitzten Fragmente konnte durch Vergleich mit GroBenmarkern 32 ( P-markiertes pBR 322 x Hinf 1 und pBR 322 x Hae III) beurteilt werden. Nicht transfizierte Zellen ergaben keinerlei globijļspezif ische Hybridisierungssignale (ausgenommen renaturierte Hybridisierungs-sonde = 210 Bp). Aus den transfizierten immortalisierten menschlichen Epithelzel-len extrahierte RNA schUtzte zwei Fragmente, deren Grbfle mit 80 bis 90 Bp be-stimmt wurde. Derartige Transkripte vrurden auch durch Grosveld et al.,

Nature 295, 120-126 (1982) und Weidle, U. et al., Nature (1981) gefunden und verden dem Vorhandensein einer internen cryptischen SpleiBstelle auf dem Kaninchen-B-globin-Gen zugeschrieben. Transcripte, die von der cap-Stelle des Kaninchen-B-globin-Gens stammen, konnten nicht festgestellt verden. In einem Ver- -53- gleichsversuch wurden HeLa-Zellen mit Plasmid pBR 322 RBG SV 40 transfiziert. Korrekt iniziierte Transcripte (135 Bp geschūtzt) sowie Transcripte, die auf das Vorhandensein einer internen crypti-schen PleiBstelle zurilckgefilhrt verden (Grosveld, G. et al., Nature 295, 120-126 (1982) und Weidle, U. et al.,

Nature (1983) wurden durch Sļ-Kartierung festgestellt. 9.2.4 Beurteilung

Die Tatsache, daB Kaninchen-B-globin spezifische Transcripte in immortalisier-ten menschlichen Epithelzellen feststellbar sind, welche mit einem von SV 40 stammenden eukaryotischen Vektor, der das Kaninchen-fl-globin-Gen enthālt, transfiziert vurden, zeigt, daB sich diese Zellinie als Wirtsystem fdr die Expression von wieder eingefilhrten geklonten Genen eignet. -I<=> LV 11042

Patentansprvlche

Verfahren zur Gevinnung von permanent ziichtbaren tierischen und humanen Zellinien durch Fusion von normalen tierischen und humanen Zellen mit biologischen Komponenten, welche eine ZUchtungs-fāhigkeit in vitro bevirken, d a d u r c h gekennzeichnet , daB man normāle tierische und humane Zellen mit alleine nicht ver-mehrungsfāhigen Zellfragmenten transformierter Zellen fusioniert und in einem Kulturmedium ohne Selektionssubstanzen zuchtet. dadurch daB die Fusion oder Sendai-Virus

Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet , in Gegenwart von PolySthylenglycol erfolgt.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daB man durch

Behandlung mit Cytochalasin B erhaltene Karyoplasten oder Cytoplasten von transformierten Zellen vervendet.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daB man durch

Lyse oder mechanischen AufschluB von transformierten Zellen erhaltene Zellfragmente, insbesondere Kernfraktionen oder Cytoplasma-Fraktionen vervendet.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet , daB man zur

Fusion eine mitochondrienreiche Cytoplasma-Fraktion vervendet.

Verfahren nach einem der vorhergehenden AnsprUche, dadurch gekennzeichnet, dafi man als transformierte Zellen Myelomzellen, mit Eppstein-Barr-Virus infizierte Zellen oder Aszites-Tumorzellen vervendet.

Verwendung einer nach dem Verfahren eines der AnsprUche 1 bis 6 hergestellten permanent zUcht-baren menschlichen oder tierischen Zellinie zur Gevinnung von homologen oder/und heterologen Zell-produkten wie monoklonalen Antikdrpern, Gerinnungs-faktoren und Lymphokinen oder zur PrUfung von Wirksubstanzen.

Abānderung der Vervendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daB man aus den Hybridzellen der hergestellten Zellinien die Gene oder die Messenger-RNA fur das gevUnschte Zellprodukt gevinnt und mit Hilfe eines n geeigneten Vektors in einem Mikroorganismus, ins-besondere E. coli, transformiert und das Zellprodukt aus dem transformierten Mikroorganismus gevinnt.

Claims (8)

1. LV 11042 IZGUDROJUMA FORMULA 1 .Paņēmiens nepārtraukti augošu dzīvnieku un cilvēka šūnu līni.1u υιυ1>;Αΐΰ" iegūšanai savienojot normālas dzīvnieku un cilvēka šūnas ar kiem komponentiem,kas izraisa augšanu in vitro, kas atšķiras ar to,ka normālas dzīvnieku un cilvēka šūnas savieno tikai ar vairoties nespējīgiem transformētu šūnu fragmentiem bez selekcijas vielu piedevām.
2. 2. Panemiens pēc punkta 1 ,kas atšķiras ar to,ka savienošanu veic polietilēnglikola vai vīrusa klātienē.
3. 3. Paņēmiens pēc punkta 1 vai 2,kas atšķiras ar to,ka izmanto ar eitohalazīnu apstrādātu transformētu šūnu karioplastus un citoplastus. to, ka iegūtos frakciju.
4. 4. Paņēmiens pēc punkta 1 vai 2, kas atšķiras ar izmanto lizējot vai mehāniski noārdot transformētās šūnas šūnu fragmentus.konkrēti - kodolu frakciju un citoplazmas 1
5. 5 .Fanemiens pēc punkta 1 vai 2, kas atšķiras ar to, ka savienošanai izmanto ar ml tohondri jārn bagatinatu citoplazmas frakci ju.
6. 6.Paņēmiens pēc jebkura no punktiem 1-3, kas atšķiras ar to,ka par transformētajām šūnām izmanto ar vīrusu Ephstein Barr inficētas mielomas šūnas vai ascītā audzēja šūnas.
7. 7.Pēc jebkura no punktiem 1-6 iegūto nepārtraukti augošo dzīvnieku vai cilvēka šūnu pielietošana homogēnu un/vai heterogēnu šūnu produktu, piemēram,monoklonālo antikermenīšu.sarecēšanas faktoru un limfokīnu iegūšanai vai aktīvo vielu pārbaudei.
8. 8. Pielietošanas pēc punkta 7 variants, kas atšķiras ar to,ka no iegūto šūnu līniju hibrīdajām šūnām izdala vēlamā šūnas produkta gēnu vai mesendšera RNS un ar piemērota vektora palīdzību transformē mikroorganismā,sevišķi E. colt,un šūnas produktu iegūst no transformētā mikroorganisma.