MC1134A1 - Compositions - Google Patents

Description

Les peptides de formule générale

R3 _ R2 _ R1 0

i r i i i H 4

—CH—CO-j—NH — CH—CO-j-NH—CH—P—R (I)

^ * L * J ** |

■ ' OH

dans laquelle R"*" représente un atome d'hydrogène ou un groupe alcoyle inférieur, cycloalcoyle inférieur, cycloalcoyle inférieur-alcoyle inférieur,

aryle ou aryl-alcoyle inférieur (lesdits groupes pouvant être, le cas échéant, substitués par un ou plusieurs groupes amino, hydroxy, thio, méthyl-

thio, carboxy ou guanidino pour former le groupe caractéristique d'un L-a-amino-acide existant dans 2 3

la nature) j R et R représentent individuellement le groupe caractéristique d'un a-amino-acide du

3

type habituel dans les protéines (sauf que R ne peut pas représenter un atome d'hydrogène quand n = 0 et R représente un atome d'hydrogène ou le groupe phényle) ; R^ représente le groupe hydroxy ou méthyle ; n = 0, 1, 2 ou 3 ; un astérisque seul signifie que l'atome de carbone a la configuration

2 3

L lorsque, selon le cas, R ou R ont une signification autre qu'un atome d'hydrogène y et un double astérisque signifie que , lorsque R"'" a une signification autre qu'un atome d'hydrogène, la configuration à l'atome de carbone est (R) (comme défini ci-après) ,

et leurs sels thérapeutiquement compatibles potentialisent l'activité d'antibiotiques, et possèdent également une activité antibactêrienne.

2

Selon la présente invention, il a été trouvé que les compositions comprenant un peptide de formule générale I, ou l'un de ses sels d'addition d'acides thérapeutiquement compatibles, et un antibiotique choisi parmi les suivants :

5 céphalothine,céphalexine, carbénicilline, ampicilline, pénicilline G, sulbénicilline, céphazoline, céfoxitine, rifampicine, [(R)-1-(2-furoyloxy)-3-méthylbutyl]pénicilline, acide (6R)-6-{[(hexahydro-lH-azépin-l-yl)-méthylène]amino}-pénicillanique, (6R)-6-{[(hexahydro-lH-azépin-l-yl)-méthylène]-10 aminojpénicillanate de (pivaloyloxy)méthyle, céphamandole,

céphaloridine, céphaloglycine, phénéthicilline, méthicilline, propicilline, ticarcilline, sel d'amoxycilline-arginine, phosphonomycine, vancomycine et kanamycine sont particulièrement intéressants au point de vue de la potentialisation obtenue 15 de l'antibiotique.

et elle a donc trait à une composition ayant des propriétés antibiotiques, cette composition comprenant un peptide de formule générale i/ou l'un de ses sels thérapeutiquement 20 compatiblesrainsi qu'un antibiotique,comme décrit ci-dessus.

un groupe alcoyle linéaire ou ramifié contenant de préférence 1 à 6 atomes de carbone (par exemple méthyle, éthyle, propyle, isobutyle, etc.). Le terme "cycloalcoyle inférieur" couvre 25 des groupes alcoyle cycliques contenant de 3 à 6 atomes de carbone. Le terme "aryle" couvre de préférence des groupes mononucléaires, tels que phényle, pouvant être substitués en une ou plusieurs positions par un groupe hydroxy, halogéno, nitro, alcoyle inférieur ou alcoxy inférieur. Le terme "ha-30 logène" couvre les atomes de fluor, chlore, brome et iode, et le terme "alcoxy inférieur" couvre des groupes de structure -0-(alcoyle inférieur), dans lesquels le groupe alcoyle inférieur a la même signification que ci-dessus. Le terme "groupe caractéristique d'un a-amino-acide du type de ceux 35 se trouvant habituellement dans les protéines" signifie que le radical R d'un a-amino-acide naturel de formule générale

La présente invention est basée sur cette découverte

Dans le contexte, le terme "alcoyle inférieur" couvre

H_N CH COOH

2 I

R

est du type de ceùx existant dans les protéines. Ainsi, par exemple, si l1amino-acide est la glycine, le radical R sera un atome d1hydrogènej dans l'alanine, le radical R représentera le groupe méthyle ; dans la leùcine, le radical 5 R représentera le groupe isobutyle et dans l'acide glutamigue, le radical R représentera le groupe 2-carboxyéthyle. R peut aussi représenter un radical relié à l'atome d'azote du groupement amino (avec la perte d'un des atomes d'hydrogène attachés à celui-ci), formant ainsi un cycle azoté comme dans 10 la proline et l'acide pyroglutamique.

Lorsque R**" dans la formule générale I a une signification autre qu'un atome d'hydrogène, la configuration de l'atome de carbone marqué d'un double astérisque sera R, c'est-à-dire celle que l'on obtiendrait en remplaçant le groupe carboxy 15 d'un L-a-amino-acide existant dans la nature par un atome de phosphore.

On notera que dans la formule générale I, lorsque n =

2

2 ou 3, R aura des valeurs égales ou différentes.

Les peptides de formule générale I préférés sont ceux 2 3

20 dans lesquels R et R représentent indépendamment un atome d'hydrogène, ou un groupe méthyle, isopropyle, isobutyle,

benzyle, 4-amino-butyle ou 2-pyrrolidinyle, R"*" représente un atome d'hydrogène ou le groupe méthyle, r4 représente le groupe hydroxy et n = 0 ou 1.

25 Comme exemples de peptides de formule générale I, on peut citer :

acide (L-alanylamino)-méthylphosphonique,

acide (L-valylamino)-méthylphosphonique,

acide (1-leucylamino)-méthylphosphonique,

30 acide (1-lysylamino)-méthylphosphonique,

acide (L-phénylalanylamino)-méthylphosphonique,

acide (lR)-l-(L-alanylamino)-éthylphosphonique,

acide (lR)-l-glycylamino-éthylphosphonique,

acide (lR)-l-(L-alanylamino)-benzylphosphonique,

35 acide (lR)-l-(L-prolylamino)-éthylphosphonique,

h

4

acide (1R)-1-(L-lysylamino)-éthylphosphonique,

acide (lR)-l-(L-leucylamino)-éthylphosphonique,

acide (lR)-l-(L-alanylamino)-2-phényl-éthylphosphonique,

acide (lR)-l-(L-phénylalanylamino)-éthylphosphonique,

5 acide (lR)-l-(L-valylamino)-éthylphosphonique,

acide (L-alanyl-L-alanylamino)-méthylphosphonique,

acide (1-leucyl-L-alanylamino)-méthylphosphonique,

acide (L-alanyl-L-leucylamino)-méthylphosphonique,

• acide (L-alanyl-L-phénylalanylamino)-méthylphosphonique,

10 acide (L-phénylalanyl-L-phénylalanylamino)-méthylphosphonique ,

acide (L-phénylalanyl-L-alanylamino)-méthylphosphonique,

acide (lR)-l-(L-alanyl-L-alanylamino)-éthylphosphonique ,

acide (lR)-l-(glycy1-L-alanylamino)-éthylphosphonique,

acide (lR)-l-(L-valy1-L-alanylamino)-éthylphosphonique,

15 acide (lR)-l-(L-phénylalanyl-L-alanylamino)-éthylphosphoniaue,

acide (lR)-l-(L-prolyl-L-alanylamino)-éthylphosphonique,

acide (L-alanyl-L-alany1-L-alanylamino)-méthylphosphonique,

acide (lR)-l-(L-alany1-L-alany1-L-alanylamino)-éthylphosphonique ,

acide (lR)-l-(glycy1-L-alany1-L-alanylamino)-éthylphosphonique,

20 acide (lR)-l-(L-proly1-L-alany1-L-alanylamino)-éthylphosphonique ,

acide (lR)-l-(glycyl-glycy1-L-alanylamino)-éthylphosphonique,

acide (1R)-1-(L-alany1-L-alany1-L-alany1-L-alanylamino)-éthyl-phosphonique,

àcide [ ( L-alany lamino )méthyl]-méthylphosphiniquej1

25 l'acide (1R)-1-(1-alanylamino)-éthylphosphonique étant spécialement préféré.

Les sels thérapeutiquement compatibles de peptides de la formule générale I sont des sels formés avec des acides forts tels que les acides méthane-suifonique, para-30 toluène-suifonique, chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, etc., et avec des bases telles que l'hydroxyde de sodium etc.

Les antibiotiques mentionnés plus haut sont des substances connues et peuvent être obtenus selon des procédés connus.

Le rapport de poids du peptide de formule générale I,

5

ou de l'un de ses sels thérapeutiquement compatible, à l'antibiotique peut varier dans de larges limites. En général, les compositions peuvent contenir le dérivé peptidique, ou l'un de ses sels thérapeutiquement comptiblœ, et l'antibiotique 5 dans un rapport compris entre environ 100:1 et 1:100, de préférence de 1:64 à 64:1, et spécialement de 1:16 à 16:1.

Le procédé de la présente invention pour la préparation des compositions sus-mentionnées consiste à mélanger le peptide de formule générale I, ou l'un de ses sels thérapeutiquement 10 compatibles,avec l'un des antibiotiques sus-mentionnés. Ce procédé peut être exécuté de manière connue. Dans une mise en oeuvre préférée de ce procédé, le peptide de formule générale I, ou l'un de ses sels thérapeutiquement compatibles, et l'antibiotique sont utilisés dans un rapport de poids de 15 1:100 à 100:1, particulièrement de 1:64 à 64:1 et, de préférence, de 1:16 à 16:1.

Les compositions.de la présente invention sont actives contre un large spectre de bactéries à Gram positif et Gram négatif, comme par exemple Escherichia coli, Proteus mirabilis, 20 Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Klebsiella aerogenes et Klebsiella pneumoniae. Ils sont donc utiles pour combattre et prévenir un grand spectre d'infections bactériennes et peuvent être administrés oralement ou parentéralement, la voie orale étant 25 préférée.

L'activité in vitro des compositions de la présente invention peut être démontrée comme suit :

On prépare des solutions concentrées au rapport désiré des mélanges du peptide de formule générale I et de 30 l'antibiotique. On dilue ensuite afin d'obtenir un spectre approprié de concentration totale des mélanges. Des portions de ces dilutions sont mélangées avec un milieu agar nutritif approprié dans des coupelles de pétri, puis on laisse l'agar se déposer. On prépare des coupelles similaires en utilisant 35 le milieu nutritif d'agar contenant le peptide seul et l'antibiotique seul. On inocule ensuite les organismes-test sur

6

la surface de l'agar au moyen d'un inoculateur approprié. Les coupelles sont ensuite maintenues à 37° pendant 24 heures, après quoi la concentration inhibitrice minimum (C.I.M.) est constatée, puis les indices fractionnels de concentration 5 inhibitrice (I.F.C.I.) calculés. Les résultats obtenus au moyen d'un peptide de formule générale I représentatif, c'est-à-dire l'acide (1R)-1-(L-alanylamino)éthylphosphonique, et des antibiotiques représentatifs sus-mentionnés sont donnés dans les tableaux I et II ci-après :

10 Tableau I

Activité de combinaisons de divers antibiotiques avec l'acide (1R)-1-(L-alanylamino)-éthylphosphonique contre Staphylococcus aureus

15

Antibiotique

C.M.I. (concentration minimale inhibitrice) ng/ml rapport antibio

I

•

O •

H

antibiotique seul combinaison tique/ peptide

20

Céphalexine

4,0

0,012

+

0,00038

32:1

0

,003 ;

II

4/0

0,125

+

0,125

1:1

0

,045

II

4/0

0,03

+

0,97

1:32

0

,13

Céphazoline

0/5

0,12

+

1,88

1:16

0

,3

Céphamandole

0,5

0,05

+

0,2

1:4

0

,15

25

Céphoxitine

0,5

0,084

+

0,042

2:1

0

,25

Sulbénicilline

0,5

0,05

+

0,2

1:4

0

,15

Méthicilline

1/0

0,056

+

0,44

1:8

0

,n |

30

sel d'amoxy-cilline argi-nine

4,0

1/0

+

0,25

4:1

0

1

i

,31

35

acide (6R)-6-{[(hexahydro-lH-azépin-1-' yl)méthylène]-amino}pénici1-lanique

■ 1

8,0

0,12

+

3,88

1:32

0

i

,26

Rifampicine

0,39 j

0,024

+

6,25 J

1:260

0

,11

S

/

Tableau II

Activité de combinaisons de divers antibiotiques avec l'acide (1R)-1-(L-alanylamino)-éthylphosphonique contre des souches de Klebsiella aerogenes et Proteus mirabilis

/[ i" ■ i il i——■ .-in..,!

Antibiotique

Organisme

C.M.I.

(concentration minimale inhibitrice) ng/ml rapport antibiotique/ peptide

I.F.C.I.

i i 1

antibiotique seul combinaison

-Cephalexine

K.aerogenes

2,0

0,05 + 0,2

1:4

0,225 j

II

P.mirabilis

128,0

14,2 +1,8

8:1

0,12 :

Cephoxitine

K.aerogenes

4,0

0,33 + 0,66

1:2

0,16

Cephamandole

K.aerogenes

128,0

1,6 +6,4

1:4

0,06

II

P.mirabilis

2,0

0,66 + 0,33

2:1

0,33

Methicilline

K.aerogenes

256,0

0,89 + 0,11

8:1

0,44

Sulbenicil-

line

K.aerogenes

8,0

0,25 + 0,25

1:1

0,06

acide (6R)-

6-{[(hexa-

hydro-lH-

azépin-1-yl)méthyl

P-mirabilis

128,0

16,0 + 16,0

1:1

0,25

ène] amino}-

pénicilla-

nique

i \

L'activité in vivo des compositions selon l'invention peut être démontrée comme suit :

Des souris sont infectées par voie intrapéritonéale avec 5 à 10 fois la dose LDgg d'organisme infectant . A 35 intervalles (déterminés à l'avance) après l'infection, on traite des groupes de souris par voie sous-cutanée avec des doses graduelles d'antibiotique, de peptide et de combinaisons des deux. Pour chaque traitement, on compte le nombre de souris survivant 7 jours à compter du début de l'infection, puis 40 calcule la dose empêchant la mort dans 50% des cas (DC^^).

L'indice fractionnel de concentration inhibitrice (I.F.C.I.) pour une combinaison d'antibiotique et de peptide est calculé de manière normale. Les résultats obtenus avec l'acide (1R)-1-(L-alanylamino)-éthylphosphonique comme exemple de 5 peptide de formule générale I et les antibiotiques représentatifs sus-mentionnës sont indiqués au tableau III ci-après :

Tableau III

Activité chimiothérapique (DC50 nig/kg sous-cutanée) dé combinaisons de divers antibiotiques avec de l'acide (1R)-1-(L-alanylamirio)-éthylphosphonique contre les infections bactériennes • chez les souris

Antibiotique

Organisme infectant

DC50

antibiotique dc50 peptide

DC50

combinaison relation peptide : antibiotique

I.F.'C.I.

Carbénicilline

S. aureus PS

17,75

>1000

29,5

10:1

.$0,15

Pénicilline G

E. coli

8,03

43,7

5,8

1:1

0,36

[ (R) -1-(2-furoyl-oxy-3-méthyl-bu-tyl]pénicilline

E. coli

15,7

43,7

8,2

1:1

0,25

Ampicilline

K. aerogenes

> 400

283

123

1:1

•$0 ,37

acide (6R)-6-{[(hexahydro-lH-azépin-l-yl)-méthylène]amino}-pénicillanique

E. coli

0,86

4,19

1,15

5:1

0,22

Céphalexine

S. aureus PS

1/7

>1000

6,6

10:1

.$0 ,35

II

S. aureus PR

44,1

> 400

18,5

1:1

$0,2

II

K. pneumoniae

> 125

> 125

44,2

1:1

^0,2

11

Strep. pyogenes

2,0

>1000

9,8

10:1

^10,46

Céphalothine

S. aureus

3,5

> 1000

11,1

10:1

^3,3

Kanamycine

S. aureus

223

> 1000

107

1:1

^0,3

vc

Les compositions de la présente invention peuvent être administrées sous forme de préparations pharmaceutiques, qui font également partie de la présente invention et comprennent un peptide de formule générale I, ou un sel thérapeutiquement 5 compatible, un antibiotique comme défini ci-dessus et un support pharmaceutiquement acceptable.

En tant que support pharmaceutiquement acceptable, on peut utiliser n'importe quel véhicule solide ou liquide compatible avec les peptides de formule générale I, leurs 10 sels thérapeutiquement compatibles, et avec les antibiotiques spécifiés ci-dessus, et appropriés pour l'administration thérapeutique. Il peut s'agire de substances organiques ou inorganiques appropriées pour l'application antérale (par exemple orale) ou parentérale, comme par exemple l'eau, 15 la gélatine, le lactose, les amidons, le stéarate de magnésium, le talc, les huiles végétales, la gomme arabique, les polyalcoylèneglycols, la vaseline etc.

Les préparations pharmaceutiques peuvent être préparées de manière connue et peuvent se présenter sous 20 forme solide (par exemple comprimés, dragées, suppositoires ou capsules), ou sous forme liquide (par exemple de solutions suspensions ou émulsions). Ces préparations pharmaceutiques peuvent être soumises à tout traitement pharmaceutique conventionnel tel que stérilisation et peuvent contenir des 25 adjuvants tels que des agents conservateurs, stabilisants, mouillants, émulsifiants, des sels régularisant la pression osmotique ou des composés—tampons. Lorsqu'un tampon est utilisé, le pH de la préparation variera naturellement dans de larges limites bien connues dans la pratique pharmaceutique.

30 La quantité de peptide de formule générale I, ou d'un de ses sels thérapeutiquement compatible et d'antibiotique présents dans la préparation pharmaceutique de l'invention variera dans de larges limites en fonction de facteurs tels que le peptide choisi ou son sel, l'antibiotique choisi, la 35 voie d'administration et l'infection à traiter. Le dosage administré quotidiennement variera également dans de larges limites et sera adapté aux besoins individuels et aux conditions

S

11

dictées par chaque cas particulier, au gré

du médecin. Par exemple, un dosage quotidien pour administration orale peut comporter de 750 mg à 1500 mg d'une combinaison d'ingrédients actifs (par exemple un peptide de formule générale I,ou un sel thérapeutiquement compatible de ce dernier,et un antibiotique). En outre, une dose quotidienne parentérale pourra par exemple comporter environ 200 mg à 2000 mg d'une combinaison de substances actives. Les doses quotidiennes peuvent être administrées par dose unique ou subdivisée .

Les peptides de formule générale I et leurs sels thérapeutiquement compatibles sont préparés par un procédé caractérisé en ce qu'on a) scinde le(s) groupe(s) protecteur(s) d'un composé de formule générale

E5— NH-

R30

I

■CH — C0-*

•NH-

R20

I

■CH — *

CO'

n

1°

I <^° nh-*ïh~Nr40 i41

(II)

dans laquelle R , R et R ont respectivement

-i 2 3

les mêmes significations que R , R et R sauf que tout groupe amino présent peut être sous forme protégée et tout autre groupe fonctionnel pouvant

être présent se présente le cas échéant sous forme

40 41

protegée, R représente le groupe méthyle ou R ,

41

R représente un groupe hydroxy ou un groupe alcoxy

5

inférieur protecteur, R représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur et l'astérisque simple ou double et n ont la même signification que ci-dessus,

selon des méthodes connues ou b) sépare un peptide diastéréo-isomère (R,S) de formule générale I en ses diastéréo-isomères. et isole le diastéréo-isomère (R), et convertit le cas échéant un composé de formule

générale I obtenu en un sel thérapeutiquement compatible.

Le(s) groupe(s) amino éventuellement présent(s) dans les radicaux R"^, R2® et R3^ de la formule générale II peuvent être protégés par tout groupe protecteur d'amino 5 bien connu en chimie des peptides. Comme groupes protecteurs d1amino particulièrement appropriés aux buts de l'invention, on peut citer les groupes aralcoxycarbonyle, notamment benzyloxycarbonyle, et t.-butoxycarbonyle. Le groupe pro-• tecteur d'amino peut aussi être un groupe formyle, trityle, 10 ou trifluoroacétyle. Tout groupe carboxy ou hydroxy pouvant être présent dans les groupes R10, R20 et R30 de la formule générale II peut être protégé respectivement par un groupe protecteur classique de carboxy ou d'hydroxy. Un groupe carboxy peut par exemple être protégé par conversion en un ester

15 alcoylique (par exemple l'ester t.-butylique) ou un ester aralcoylique (par exemple l'ester benzylique). De plus, un groupe hydroxy peut par exemple être protégé au moyen d'un groupe aralcoxy-carbonyle (par exemple benzyloxy-carbonyle), alcanoyle (par exemple acétyle, propionyle, etc.), aroyle (par 20 exemple benzoyle), alcoyle (par exemple t.-butyle) ou aralcoyle

(par exemple benzyle). la protection d'autres groupes fonctionnels présents dans les radicaux R"^, R^ et R^ peut être effectuée de manière connue, le groupe protecteur représenté par R^ dans la formule générale II peut être tout groupe protecteur d'amino 25 mentionné précédemment en rapport avec R10, R2<^ et R^°.

La scission du (ou des) groupe(s) protecteur(s) présent(s) dans un composé de formule générale II est effectuée selon des méthodes connues, c'est-à-dire des méthodes effectivement utilisées ou décrites dans la littérature sur la scission de groupes 30 protecteurs. Ainsi,'par exemple, un groupe aralcoxy-carbcnyle

(par exemple benzyloxy-carbonyle) ou t.-butoxycarbonyle peut être scindé par hydrolyse (c'est-à-dire par traitement avec un mélange de "bromure d'hydrogène et d'acide acétique glacial). Un groupe aralcoxy-carbonyle (par exemple benzyloxy-carbonyle) peut aussi 35 être scindé par hydrogénolyse (par exemple en présence de charbon palladié ).•Le groupe t.-butoxy-carbonyle peut

là

aussi être scindé au moyen d'acide chlorhydrique dans du aioxane. Un groupe alcoxy inférieur représenté par R^ et/ou R^1 peut être converti en un groupe hydroxy par., traitement avec un mélange de "bromure d'hydrogène dans de l'acide acétique glacial ou au 5 moyen de triméthylchlorosilane, suivi d'une hydrolyse aqueuse. On notera que la scission des groupes protecteurs peut être effectuée en une seule ou plusieurs phases selon la nature des groupes protecteurs présents.

La- résolution d'un composé diastéréo-isomère (R,S) de for-10 mule générale I en ses diastéréo-isomères et l'isolation du diastéréo-isomère (R) peuvent être effectuées selon des méthodes connues, par exemple par cristallisation fractionnée ou par chromatographie liquide à haute pression.

Les substances de départ de formule générale II peuvent 15 par exemple être préparées par condensation d'un composé de formule générale

H-

-H20 R100 •HH—OH—00 MH—CH—P—R40 (m)

^ y* I / "I

rn ^41

dans laquelle R"^,'R^, R^, R^^n et l'astérisque double et simple ont la même signification que ci-20 dessus,

avec un a-amino-acide, un dipeptide, un tripeptide ou un tétrapeptn de protégés de manière adéquate, ou un de leurs dérivés réactifs, selon le cas.

Ainsi, quand on emploie un composé de formule générale III 25 dans laquelle n = 0, un tel composé peut être condensé avec un a-amino-acide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés

14

réactifs pour donner un composé de formule générale II, dans laquelle n = 0, ou avec un dipeptide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de.formule générale II,dans laquelle n = 1, ou avec un tripeptide 5 protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale II,dans laquelle n = 2, ou avec un tétrapeptide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés ré;actifs,pour donner un composé de formule ■ générale II dans laquelle n = 3.

10 De plus, un composé de formule générale III,dans laquelle n = l,peut être condensé avec un a-amino-acide protégé de manière appropriée ou un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale II,dans laquelle n = 1, ou avec un dipeptide protégé de manière appropriée ou l'un de ses dérivés réactifs, 15 pour donner un composé de formule générale II,dans laquelle n = 2, ou avec un tripeptide protégé de manière appropriée ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale II, dans laquelle n = J>.

20 laquelle n = 2,peut être condensé avec un a-amino-acide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale II,dans laquelle n = 2, ou avec un dipeptide protégé de manière appropriée ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale 25 II,dans laquelle n = 3.

Enfin, un composé de formule générale III,dans laquelle n = 3»peut être condensé avec un a-amino-acide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale II,dans laquelle n = 3«

30 Par ailleurs, on peut préparer les composés de formule générale II en effectuant la condensation ci-dessus au moyen

D'autre part, un composé de formule générale III, dans

15

d'un composé (R,S) de formule générale III et en séparant de manière connue le composé (R) du produit (R,S) résultant, par exemple par cristallisation, chromatographie ou cristallisation fractionnée au moyen d'une base appropriée, par exemple 11a-méthylbenzylamine.

5 " La condensation mentionnée ci-dessus peut être effec tuée selon des méthodes connues en chimie des peptides, par exemple par la méthode de l'anhydride mixte, de l'azide, de l'ester activé ou du chlorure d'acide.

10 nérale III peut être condensé avec un amino-acide (di-, tri- ou tétrapeptidique selon le cas) protégé de manière appropriée, la fonction carboxy terminale étant un radical d'anhydride mixte formé avec un acide organique ou inorganique. Avantageusement, un tel amino-acide di-, tri- ou tétrapep-15 tidique portant une fonction carboxy libre est traité avec une base tertiaire telle qu'une trialcoylamine inférieure (par exemple une triéthylamine) ou une N-éthylmorpholine dans un solvant organique inerte (par exemple le tétrahydrofuranne, 1,2-diméthoxyéthane, dichlorométhane, toluène, éther de pétrole .20 ou des mélanges de ceux-ci) et le sel résultant est mis en réaction avec un ester d'acide chloroformique (par exemple ester butylique ou isobutylique) à basse température. L'anhydride mixte obtenu est ensuite condensé avantageusement in situ avec le composé de formule générale III.

25 Dans une autre méthode, un composé de formule générale

III approprié peut être condensé avec un amino-acide (di-, tri- ou tétrapeptidique selon le cas) protégé .de manière appropriée, le groupe carboxy final étant sous forme d'un ,azide d'acide. Cette condensation est effectuée de préférence 30 dans un solvant organique inerte tel que le diméthylformamide ou l'acétate d'éthyle à basse température.

Selon une méthode, un composé approprié de formule gé-

Une autre méthode consiste à condenser un composé de formule générale III approprié avec un amino-acide, (di-,

tri- ou tétrapeptidique selon le cas) protégé de manière appropriée., la fonction carboxy finale étant sous forme d'un groupe ester actif (par exemple p-nitrophényle, 2,4,5-trichlorophényle ou groupe ester N-hydrosuccinimidique). Cette condensation est effectuée avantageusement dans un solvant organique inerte tel

40 / 41

que le diméthylformamide ou, dans le cas ou R et/ou R • représentent un groupe alcoxy inférieur, dans un alcanol aqueux (par exemple éthanol aqueux) .

Selon encore une autre méthode, un composé approprié de formule générale III peut être condensé avec un amino-acide (di-, tri- ou tétrapeptidique selon le cas), protégé de manier appropriée, la fonction carboxy finale se présentant sous forme de chlorure d'acide. Cette condensation est effectuée :de préférence en présence d'une base et à basse température.

X /

Exemple 1

On prépare des capsules de gélatine dure de la teneur suivante :

par capsule

250,0 mg 25,0 mg 20,0 mg 0,5 mg 2,5 mg 298,0 mg

L'acide (1R)-1-(L-alanylamino)-éthylphosphonique et la cêphalexine sont individuellement moulus, mélangés et granulés avec une pâte à 10% d'amidon de maïs contenant 15 l'aérosol OT. Le granulé humide est séché, passé à

travers un tamis, mélangé avec l'aërosil et finalement mis en capsules de gélatine dure.

Ingrédients 5 Acide (1R)-1-(L-alanylamine)-éthyl-phos-phonique Cêphalexine Amidon de maïs Aérosol OT 10 Aérosil

Poids total

Exemple 2

On prépare des caspules de gélatine dure de la teneur 20 suivante :

Ingrédients Par capsule

Acide (1R)-1-(L-alanylamino)-éthylphosphonique 125,0 gm

Cêphalexine 125,0 mg

Amidon de maïs 20,0 mg

25 Aérosol OT 0,5 mg

Aérosil 2,5 mg

Poids total 273,0 mg

Ces capsules sont préparées de manière analogue à celle décrit à l'exemple 1.

S

jLO

Exemple 3

Un mélange poudreux pour la préparation d'une solution d'injection contient les ingrédients suivants :

Acide (6R)-6-{[(hexahydro-lH-azépin-l-yl)-

5 méthylène]amino}pénicillanique 200,0 mg

Acide (1R)-1-(L-alanylamino)-éthylphosphonique 200,0 mg citrate de sodium 20,0 mg

Les ingrédients sont moulus individuellement et bien mélangés. Le mélange est placé dans des récipients appropriés 10 sous conditions stériles, puis les récipients sont scellés.

Afin de préparer une solution d'injection, le mélange poudreux ci-dessus est dissous dans 2 ml d'eau pour injection.

Exemple 4

On prépare une solution d'injection en dissolvant 1,0 g 15 de pénicilline G dans 2 ml d'une solution contenant 100 mg d'acide (1R)-1-(L-alanylamino)-éthylphosphonique par ml de tampon approprié. Un tampon approprié contient les ingrédients suivants :

Chlorure.de sodium 8,3 mg

20 Chlorocrësol 1,0 mg

Acide acétique glacial 1,2 mg

Hydroxyde de sodium q.s. ad pH 4,5

Eau pour injection ad 1,00 ml

Les exemples suivants illustrent en détail la manière 25 de préparer l'acide (1R)-1-(L-alanylamino)-éthylphosphonique.

19

Exemple A

14,1 g (0,168 mole) de bicarbonate de sodium solide sont ajoutés à une solution de 7 g (0,056 mole) d'acide

(1R,S)-l-aminoéthylphosphonique dans 280 ml d'eau et 140 ml 5 d'éthanol sous agitation à 0°. Tandis que l'on agite ce mélange à 0°, une solution de 17,9 g (0,056 mole) d'ester N-hydroxy-succinimidique de N-benzyloxycarbonyl-L-alanine dans 140 ml d'éthanol chaud est ajoutée goutte à goutte en l'espace d'environ 15 minutes. Cette dernière solution est rincée avec 70 ml 10 d'éthanol. Le mélange hétérogène est agité pendant 1 heure

à 0°, puis pendant encore 16 heures à la température ambiante, "le mélange devenant-homogène. Le mélange est évaporé et ré-,évaporé avec 200 ml d'eau pour donner une gomme qui est dissoute dans 500 ml d'eau. La solution est d'abord extraite 15 avec 500 ml, puis 2 fois 250 ml de chlo roforme, acidifiée à pH 2 avec environ 80 ml d'acide chlorhy-drique 2 N, puis à nouveau extraite avec 1 fois 500 ml,

puis 2 fois 250 ml de chloroforme. La phase aqueuse est concentrée et passée à travers une colonne de résine échan-20 geuse de cations (B.D.H., Zerolit 225, SRC 13, RSO^H ;• 750 g ; fraîchement régénéré dans le cycle acide). La colonne est éluée avec de l'eau et l'on recueille 6 fractions de 250 ml. Les 4 premières fractions sont combinées,évaporées et ré-évaporées avec de l'eau pour éliminer l'acide chlorhydrique. On obtient 25 un résidu final d'acide (1R,S)-l-[(N-benzyloxycarbonyl-L-alanyl)amino]-éthylphosphonique qui est séparé comme suit :

Ce dernier résidu est dissous dans 400 ml d'eau et titré à pH 4,5 avec de la benzy lamine 3JM; titre 75 ml ; théorie 56 ml. La solution résultante est concentrée et cristallisée 30 dans l'eau pour donner 5,3 g de sel de benzylamine de l'acide (lS)-l-[(N-benzyloxycarbonyl-L-alanyl)amino]~éthylphosphonique fondant à 210-215°. Par concentration des liqueurs-mères,

puis recristallisation dans l'eau, on obtient le sel de benzylamine de l'acide (lR)-l-[(N-benzyloxy-L-alanyl)-amino]-

éthylphosphonique en une première récolte de 0,59 g [point p n de fusion 226-228° (déc.) ; [a]* = -32,3° (c = 1i? dans l'acide acétique)] et une seconde-récolte de 0,825 g [point de fusion 225-227° (déc.) ; [ct]p° = -33° (c = 1 $> dans l'acide acétique)].

5 Par recristallisation de la première récolte dans l'eau, on obtient 0,333 g de sel de benzylamine pur de R-stéréoisomère ; point de fusion 226-228° (déc.) ; [a]^ = -33,1° (c = ifo dans l'acide acétique).

1,1 g (2,5 mmoles) de sel de benzylamine de l'acide 10. (lR)-l-[(H-benzyloxycarbony1-L-alanyl)amino]-éthylphosphonique est dissous dans 4 ml d'hydroxyde d'ammonium 2N, passé dans une colonne de résine échangeuse de cations (B.D.H., Zerolit 225, SRC 13, RSO^H ; 120 g ; fraîchement regénéré dans le cycle acide) et élué avec de l'eau. On recueille 200 ml d'éluat 15 acide qui est concentré à 100 ml. A ceci, on ajoute successivement 100 ml de méthanol, 0,3 g de catalyseur de charbon pal-ladié à 5et 3 gouttes d'acide acétique glacial. Le mélange est hydrogéné à la température ambiante et à la pression atmosphérique. Le catalyseur est. séparé par filtration et le solvant 20 évaporé. La gomme résiduelle est ré-évaporée avec 3 fois 50 ml de n-propanol pour donner 0,6 g d'un solide gommeux fondant à environ 275-280° (déc.). Après une recristallisation ultérieure dans l'eau et l'éthanol, on obtient 0,2 g d'acide (lR)-l-(L-alanylamino)-éthylphosphonique fondant a 295-296° 25 (déc.) ; [a]j^ = -44,0° (c = Vfo dans l'eau).

Exemple B

Une solution de 30 g (0,24 mole) d'acide (1R,S)-1-aminoéthylphosphonique dans 120 ml (0,48 mole) d'hydroxyde de sodium 4N est agitée à 14° tandis que 180 ml (0,72 mole) d'une 30 solution d'hydroxyde de sodium 4N et 102 g (0,60 mole) de chloroformiate de benzyle sont ajoutés en 4 fois. L'agitation ■est poursuivie et au bout de 2 heures la température atteint

20°. Le mélange est agité pendant encore 16 heures à la température ambiante. 600 ml d'éther sont ensuite ajoutés et le mélange est agité vigoureusement pendant 2 heures pour extraire le chloroformiate de benzyle en excès. Les phases 5 sont séparées et la -phase aqueuse est acidifiée à pH 2 avec environ 110 ml d'acide chlorhydrique 5N tandis que la température est maintenue en-dessous de 10°. On concentre fortement la pâte obtenue pour éliminer le gaz carbonique. Le résidu est dissous dans 100 ml d'hydroxyde de sodium 2N et 50 ml 10 d'eau, passé dans une colonne de résine échangeuse de cations (B.D.H., Zerolit 225, SRC 13, RSO^H ; 750 g ; fraîchement régénéré dans le cycle acide) et élue avec de l'eau. On obtient ainsi environ 3,2 litres d'éluat acide qui sont évaporés à la température ambiante et ré-évaporés avec 3 fois 500 ml d'eau. 15 On dissout le résidu dans l'eau et le laisse cristalliser. Les cristaux sont séparés par filtration, lavés avec de l'eau glacée et séchés ; rendement 39,2 g ; point de fusion 111-113° (déc.). Par évaporation des filtrats combinés, puis recristallisation dans 75 ml d'eau et 10 ml de méthanol et 20 réfrigération, on obtient une autre récolte de 6,51 g ; point de fusion 110-112° (déc.). On obtient un total de 45,71 g d'acide (1R,S)-l-(benzyloxycarbonylamino)-éthylphosphonique qui est identifié comme étant le sel de monobenzylamine fondant à 196-197° (déc. ).

25 42,2 g (163 mmoles) d'acide (1R,S)-l-(benzyloxycarbonyl-

amino)-éthylphosphonique sont dissous dans 100 ml de méthanol. La solution est traitée avec une solution de 30,8 g (81,5 mmoles) de trihydrate de quinine dans .100 ml de méthanol et le mélange est agité pendant 3 heures à la température ambiante, puis 30 pendant la nuit à 0°. Le sel de quinine de l'acide (1S)-1-

' (benzyloxycarbonylamino)-éthylphosphonique est séparé par filtration et lavé avec du méthanol. Les filtrats combinés sont évaporés et le résidu est dissous dans 300'ml d'hydroxyde d'ammonium 2N. la solution est extraite avec 3 fois 300 ml 35 de chloroforme. Chaque extrait de chloroforme est relavé avec 150 ml d'eau. Les extraits aqueux sont combinés, concentrés,

puis passés dans une colonne de résine échangeuse de cations

(B.D.H., Zerolit. 225, SRC 13, RSO^H ; 750 g; fraîchement régénéré dans le cycle acide). Par élution avec de l'eau, on obtient environ 2,3 litres d'éluat acide qui sont évaporés.

5 Le résidu est ré-évaporé, d'abord avec 3 fois 200 ml d'eau,

puis avec 3 fois 300 ml de méthanol pour donner environ 24 g d'un résidu gommeux. Cette gomme est dissoute dans 100 ml de méthanol sec et traitée avec une solution de déhydroabiétylamine

• [82 mmoles ; fraîchement régénéré dans 28,4 g (82 mmoles) d'acé-

10 tate de déhydroabiétylamine avec le mélange hydroxyde d'am-

monium/éther de pétrole]. Le mélange est laissé au repos

à 0°, filtré et le filtrat est lavé avec du méthanol et de l'éther. On obtient ainsi 47,4 g de sel de déhydroabiétylamine brut d'acide (lR)-l-(benzyloxycarbonylamino)-éthylphosphonique 1 * ?n

15 fondant à 189-194° (déc.) ; [cc]p = +16,8° (c = 0,5$ dans le méthanol). Par recristallisation ultérieure dans du méthanol et de l'eau, on obtient 33,0 g de sel de déhydroabiétylamine de l'acide (lR)-l-(benzyloxycarbonyl-amino)-éthylphosphonique

PO

pur fondant à 202-205° (déc.) ; [oc]-q =+18,1° (c = 0,5$ dans 20 le méthanol).

8,0 g (14 mmoles) de l'acide obtenu au paragraphe précédent sont répartis entre 100 ml d'hydroxyde d'ammonium 2N et 100 ml d'éther de pétrole (domaine d'ébullition 60-80°). le mélange est agité vigoureusement, puis les phases sont . 25 séparées. La phase aqueuse est extraite avec deux fois 50 ml d'éther de pétrole. Chaque extrait d'éther de pétrole est ré-extrait avec deux fois 50 ml d'eau. Les extraits aqueux sont combinés et évaporés à la température ambiante pour donner une. huile. Cette huile est dissoute dans de l'eau, 30 passée dans une colonne de résine échangeuse de cations (B.D.H., Zerolit 225, SRC 13, RSO^H ; 250 g fraîchement régénéré dans le cycle acide) et éluée avec de l'eau. On obtient 800 ml d'une fraction acide qui est ensuite concentrée à 400 ml. A ce concentré, on ajoute successivement 2 g de 35 catalyseur de charbon palladié à 1070, 400 ml de méthanol et

0,2 ml d'acide acétique glacial. Le mélange est ensuite hydro-

2J

. . " géné. le catalyseur est séparé par filt-ration et le solvant

évaporé, le résidu est rérévaporé avec 3 fois 100 ml de n-propanol et trituré avec de l'éther pour donner un solide fondant à environ 285-288° (déc.). Par recristallisation dans l'eau et 5 l'éthanol, on obtient 1 g d'acide (lR)-l-aminoéthylphosphonique fondant à 294-295° (déc.) ; [a]^ = -16,9° (c = 2$ dans l'hydroxyde de sodium IN).

0>4 g (3,2 mmoles) de l'acide obtenu au paragraphe précédent dans 14 ml d'eau et 7 ml d'éthanol est agité à 10 10° tandis que 0,806 g (9,6 mmoles) de bicarbonate de sodium ■sont ajoutés graduellement. Le mélange est ensuite agité à 0° , tandis qu'une solution chaude de 1,024 g (3,2 mmoles) d'ester N-hydroxysuccinimique de N-benzyloxycarbonyl-L-alanine dans ■8 ml d'éthanol est ajoutée goutte à goutte rapidement. Le mélange 15 est agité pendant 3 heures à 0°, puis pendant 16 heures à la température ambiante, le mélange est élaboré d'une manière ■analogue à celle de l'exemple a) par passage dans une colonne de résine échangeuse de cations et conversion en sel de benzylamine. On obtient 0,26 g de sel de benzylamine de

20 l'acide (lR)-l-[(N-benzyloxycarbonyl-L-alanyl)amino]éthyl-

PO

'phosphonique fondant à 229-231° (déc.) ; [a]p = -34,2° (c = Vfo dans l'acide acétique glacial).

D'une manière analogue à celle de l'exemple a) , à partir de l'acide obtenu au paragraphe précédent, on obtient 25 l'acide (lR)-l-(L-alanylamino)-éthylphosphonique fondant à 295-296° (déc.) ; = -45,6° (c = 1$ dans l'eau).

24

Exemple C

139,7 g (0,5 mole) de chlorhydrate de 1-benzylamino-éthyl-phosphonate de diméthyle sont dissous dans 1000 ml de méthanol. La solution est hydrogénée à la température ambiante 5 et à la pression atmosphérique en présence de 15 g de charbon palladié à 10$ pendant plusieurs heures jusqu'à la fin de • l'absorption d'hydrogène. Le catalyseur est séparé par fil-tration et le filtrat évaporé sous vide. Le résidu de chlorhydrate de 1-aminoéthylphosphonate de diméthyle est dissous dans 10 500 ml de diméthylformamide sec, puis traité avec 160 g (0,5 mole) d'ester N-hydroxysuccinimidique de N-benzyloxycarbonyl-L-alanine. Tandis que l'on agite et maintient la température en-dessous de 0°, on ajoute goutte à eoutte 70 ml de triéthylamine sèche. Le mélange est ensuite agité pendant 16 heures 15 à la température ambiante, le chlorhydrate de triéthylamine est séparé par filtration et lavé avec un peu de diméthylformamide. Le filtrat est évaporé sous le vide d'une pompe à huile et à une température de bain inférieure à 40°. L'huile résiduelle est traitée avec 40 ml d'eau et le mélange résul-20 tant extrait avec 4 fois 40 ml de chloroforme. Les phases organiques combinées sont lavées avec du carbonate de potassium, puis séchées sur du sulfate de sodium et concentrées à siccité.

m

On obtient un résidu qui, traité avec.600 ml d'éther 25 sec, donne 72,5 g de (1S)-1-[(N-benzyloxycarbonyl-L-alanyl)-

amino]-éthylphosphonate de diméthyle fondant à 134-135° ;

2 0

[a] = + 14,9° (c = 1% dans le méthanol). L'évaporation des liqueur-mères donne environ 100 g de gomme composée en majeure partie de l'isomère R correspondant.

100 g de la gomme obtenue sont traités pendant 5 heures à la température ambiante avec 250 ml d'une solution de bromure d'hydrogène à 45$ dans de l'acide acétique glacial. 750 ml d'éther sont ensuite ajoutés sous

5 agitation, puis l'éther est décanté. Ce procédé est répété

avec deux fois 250 ml d'éther. le résidu est dissous dans

250 ml de méthanol et à la solution résultante, on ajoute une

-■solution de 50 ml d! oxyde de propylène dans 50 ml de méthanol.

Un repos de plusieurs heures, le précipité obtenu est séparé

10 par filtration et lavé avec du méthanol et de l'éther. Le produit séché a un poids constant de 46,1 g et un point de fusion de 283-285° (déc.). la recristallisation dans le mélange eau/éthanol donne 36,5 g d'acide (lR)-l-( L-alanylamino )-éth.yl-

?f)

phosphonique fondant à 295-296° (déc.) ; [ajp = -46,3° (c = 15 1i° dans l'eau).

2b

Claims (1)

1. REVENDICATIONS

   j

   1. Une composition ayant des propriétés antibiotiques et contenant un peptide de formule générale

   R

   H0N—CH—C0-d $

   3 -,2

   R" R O

   I

   HIH—CH— CO

   II

   P

   A A |

   •NH—CH—P—R4 (I)

   n OH

   dans laquelle R^" représente un atome d'hydrogène 5 ou un groupe alcoyle inférieur, cycloalcoyle infé

   rieur, cycloalcoyle inférieur-alcoyle inférieur, aryle ou aryl-alcoyle inférieur (lesdits groupes pouvant être, le cas.échéant, substitués par un ou plusieurs groupes amino, hydroxy, thio, méthyl-10 thio, carboxy ou guanidino pour former le groupe caractéristique d'un L-a-amino-acide existant dans

   0 o la nature) ; R et R représentent individuellement le groupe caractéristique d'un a-amino-acide du type habituel dans les protéines (sauf

   3

   15 que R ne peut pas représenter un atome d'hydro gène quand n = 0 et R"*" représente un atome d'hy-

   4

   drogène ou le groupe phényle) ; R représente le groupe hydroxy ou méthyle •, n=0, 1, 2 ou 3 ;

   un astérisque seul signifie que l'atome de

   20 carbone a la configuration L lorsque, selon le

   2 3

   cas, R ou R ont une signification autre qu'un atome d'hydrogène ; et un double astérisque signifie que (lorsque R"*" a une signification autre qu'un atome d'hydrogène) la configuration à l'atome de 25 carbone est (R) (comme défini ci-dessus),

   ou un de ses sels thérapeutiquement compatibles, et un antibiotique choisi parmi les suivants : céphalothine, cêphalexine,

   2 /

   carbénicilline, ampicillinepénicilline G, sulbénicilline, céphazoline, céfoxitine, rifampicine, [(R)-1-(2-furoyloxy)-3-méthylbutyl]pénicilline, acide (6R)-6-{[(hexahydro-lH-azépin-l-yl)-méthylène]amino}pénicillanique, (6R)-6-5 {[(hexahydro-lH-azépin-l-yl)-méthylène]amino}pénicillanate de (pivaloyloxy)-méthyle, céphamandole, céphaloridine, céphaloglycine, phénéthicilline, méthicilline, propicilline, ticarcilline, sel d'amoxycilline-arginine, phosphonomycine, vancomycine et kanamycine.

   10 2. Compositions selon la revendication 1, caractérisées en ce que dans le peptide de formule générale I les groupes 2 3

   R et R représentent un atome d'hydrogéné ou un groupe méthyle, isopropyle, isobutyle, benzyle, 4-aminobutyle ou 2-pyrrolidinyle , R^" représente un atome d'hydrogène

   15 ou un groupe méthyle, R^ représente un groupe hydroxy et n = 0 ou 1.

   3. Compositions selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisées en ce que dans ledit peptide la valeur de n est 0.

   20 4. Compositions selon l'une des revendications 1 à 3,

   caractérisées en ce que ledit peptide est l'acide (1R)-1-(L-alanylamino)-éthylphosphonique.

   5. Une composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'antibiotique est la cêphalexine.

   25 6. Une composition selon l'une des revendications 1 à 4,

   caractérisée en ce que l'antibiotique est l'acide (6R)-6-{[(hexahydro-lH-azépin-l-yl)méthylène]amino}pénicillanique.

   7. Une composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'antibiotique est le (6R)-6-{[(hexa-

   30 hydro-lH-azépin-l-yl)-méthylène]amino}pénicillanate de (pivaloyloxy)méthyle.

   8. Une composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le rapport peptide (ou sel thérapeuti-

   quement compatible de celui-ci)/antibiotique est de 1:100 à

   100:1.

   9. Une composition selon la revéndication 8, caractérisée en ce que le rapport peptide (ou sel thérapeutiquement

   5 compatible de celui-ci)/antibiotique est de 1:64 à 64:1.

   10. Une composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que le rapport peptide (ou sel thérapeutiquement compatible de celui-ci)/antibiotique est de 1:16 à 16:1.

   11. Procédé pour la préparation d'une composition anti-10 biotique selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé

   en ce qu'on mélange le peptide avec l'antibiotique.

   12. Une composition pharmaceutique contenant un peptide et un antibiotique comme définis dans les revendications 1 à 10, ainsi qu'un support pharmaceutiquement acceptable.

   — Rô?,vois

   I mot ajouté »<* raVé nul

   26 bis ( Boul. Princesse Charlotte MONTE-CARLO

   Par procuration de

   Cl 6

   Sooeie