MC1301A1 - Derives d'urethane - Google Patents

Description

I

■1-

'La présente invention concerne des dérivés d'uréthane de formule générale

10

MeO

Me'

,Aco0H\

OH

E>1HITOCCr^'

où R est un aryle, un alcoylaryle, un-haloaryle, un nitroaryle, un alcoxyaryle, un aryloxyaryle, un acyl-

15 aryle, un alcoyle, un cycloalcoyle, un arylalcoyle,

2

un haloarylalcoyie, ou un arylcycloalcoyle; et R est un méthyle ou un éthyle,

et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

L'expression abrégée Me est utilisée d'un bout 20 à l'autre pour représenter le méthyle.

Les composés de l'invention et leurs sels présentent une activité comme agents anti-bactériens,

agents favorisant la croissance chez les ruminants et les animaux monogastriques qui font fermenter les ma-25 tières végétales dans le caecum, comme coccidiostati-

ques, antihypertenseurs, agents antimalariaux et agents permettant le traitement de la dysentei-ie des porcs.

Le terme "acyle" représente une fraction acide alcanoi'que en C^ à Cy, de préférence • en à C^, c'est-bO à-dire des radicaux de formule

R—C

11

0

où R est un alcoyle en à ou un hydrogène, par exemple un acétyle, un prop.ionyle, un butyryle, etc.

-2-

Le terme "alcoxy" représente un groupe alcoyle inférieur en à ayant comme substituant une fonction oxygène, comme le méthoxy, l'éthoxy, le n-propoxy, etc.

5 Le terme "aryle" dénote un résidu aromatique dérivé par le retrait d'un atome d'hydrogène d'un hydrocarbure aromatique, comme par exemple le phényle, le pyridyle ou le furyle, en particulier le phényle. Le résidu "aryle" peut ensuite être substitué par divers 10 groupes. Un substituant sur un noyau phényle est de préférence en position 4- comme dans 4—alcoylaryle, par exemple 4-méthylphényle (4-tolyle), 4-halophényle, par exemple 4-chlorophényle, 4-nitrophényle, 4-aryloxyaryle, par exemple 4-phénoxyphényle, 4—alcoxyphényle, par 15 exemple 4-méthox^rphényle, 4~(alcanoyl)-phényle, par exemple 4-acétyl-phényle ou dans 4-(benzoyl)-phényle.

Le terme "alcoyle" représente un hydrocarbure à chaîne droite ou ramifiée en à C,-,, de préférence en à C^, comme le méthyle, l'éthyle, le n-propyle, 20 1'isopropyle, le n-butyle. Le groupe "alcoyle" peut être substitué par un résidu "aryle" tel que défini ci-dessus pour former un résidu "arylalcoyle", par exemple 1-phényléthyle, 2-phényléthyle (phénéthyle), ou par un résidu "haloaryle" tel que défini ci-dessus pour former 25 un résidu "halcarylalcoyle", par exemple 4-bromophéné-thyle.

Le terme "cycloalcoyle" représente les groupes hydrocarbures cycliques contenant de 3 à 7 atomes de carbone, comme cyclopropyle, cyclobutyle, cyclohexyle, 30 etc, le cyclohexyle étant préféré. Le groupe "cycloalcoyle" peut être substitué par un résidu "aryle" tel que défini ci-dessus pour former un résidu "arylcyclo-alcoyle", par exemple 2-(phényl)-cyclopropyle.

Certains des dérivés d'uréthane, à savoir 35 ceux de formule I où est un phénéthyle et leurs sels

-3-

pharmaceutiquement acceptables, sont produits par des organismes du type Strentomyces appelés espèces X-14-667 ^ X-14-573 et X-14-575. Streutomyces sp. X-14-667 a été isolé à partir d'un échantillon de sol recueilli dans le 5 temple d'Esculape à Epidaure, en Grèce. Strentomyces sp. X-14-573 a été isolé à partir d'un échantillon de sol recueilli à l'université d'Arizona, Tempe, Arizona. Streotomyces sp. X-14-575 a été isolé à partir d'un échantillon de sol recueilli dans un champ de mais dans les 10 Catskills, dans l'Etat de New-York. Strentomyces sp.

X-14-667, X-14-573 et X-14-575 ont été déposés au Ministère ' américain de l'Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Régional Research Laboratories (ERRL), Peoria, Illinois, aux Etats-Unis, sous forme de flacons lyophi-15 lisés des cultures. Les cultures, ayant reçu les numéros d'identification ERRL 11336 (X-14-667), ÎIRRL 11337 (X-14-573) et NKRL 11338 (X-14-575) ont toutes été déposées aux KRRL, le 29 juin 1978.' Des sous-cultures en ont été déposées le 23 août 1979 sous forme de flacons 20 lyophilisés à 1'American Type Culture Collection,

Rockville, Maryland, Etats-Unis, et ont reçu les numéros d'identification ATCC 31551 (X-14-667), ATCC 31552 (X-14:573) et ATCC 31553 (2-14575) par ATCC.

Les dérivés d'uréthane sont des antibiotiques 25 polyéthers et forment de nombreux sels pharmaceutique-ment acceptables. On prépare ces sels à partir de la forme acide libre des antibiotiques par des procédés bien connus des spécialistes pour les composés du type polyéther; par exemple, en lavant l'acide libre en solu-30 tion avec une base ou un sel approprié. Comme exemples de telles substances basiques pharmaceutiquement acceptables capables de former des sels pour application selon l'invention, il faut mentionner les bases de métaux alcalins, comme l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde 35 de potassium, l'hydroxyde de lithium, etc; les bases de

-4-

métaux alcalino-i;erreux, comme l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de baryum, etc, et l'hydroxyde d'ammonium. Les sels de métaux alcalins ou alcalino-terreux permettent de former des sels pharmaceutiquement acceptables, 5 peuvent comprendre des anions comme les carbonates, bicarbonates et sulfates.

Comme exemples de bases organiques formant des sels pharmaceutiquement acceptables avec les composés polyéthers, on peut citer les alcoylamines inférieures, 10 les hydroxyalcoylamines inférieures primaires,* secondaires et tertiaires comme 1'éthylamine, l'isopropyl-amine, la diéthylamine, la méthyl-n-butylamine, l'étha-nolamine et la diéthanolamine.

Comme aminé particulièrement appréciée, il faut 15 mentionner la N-méthylglucaminé. Les sels de la N-méthyl-glucamine sont particulièrement intéressants de par leur solubilité dans l'eau qui les rend appropriés à l'application parentérale.

CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES

20 Les souches représentatives de Strentomyces sp.

X-14667? X-14573 et X-14575 les caractéristiques suivantes :

La tolérance au chlorure de sodium, l'hydrolyse * de la caséine et la réduction du nitrate sont détermi-25 nées par les procédés recommandés par Gordon et Smith, J. Bacteriol., 65, 41-48, 1953. L'hydrolyse de l'amidon est déterminée après croissance sur gélose d'un bouillon d'Actinomyces (Difco) avec 0,25 % d'amidon soluble, et est testée en noyant les plaques avec une solution 30 d'iode - Kl. L'hydrolyse de la gélatine est testée selon Skerman, (A Guide to Identification of the Généra of Bacteria, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1967) en utilisant un bouillon d'Actinomyces (Difco) avec 2 c/o

-5-

de gélose au lieu de gélose de macération de viande. Toutes les expériences s'effectuent à 28°C.

On utilise les milieux ISP standard de Shirling et Gottlieb pour la description de la croissance et de 5 la pigmentation (les déterminations colorées sont fai-.tes au bout de 2 semaines d'incubation à 28°C). On détermine également l'utilisation du carbone par le procédé de Shirling et Gottlieb (Int. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340, 1966). On homogénéise et on centrifuge une 10 culture de bouillon ISP-1 de 24- heures pour obtenir une suspension lavée aux fins d'inoculation. On détermine la capacité de l'organisme à croître à 10, 28, 371 4-5 et 50°C en inoculant un bouillon de milieu ISP-1 (Difco). L'analyse de la paroi cellulaire s'effectue selon le 15 procédé de Beclcer £t al. (Applied Microbiol. 12, 421 -4-23, 1954).

Examen microscopique. Streptomyces sp. X-14667> X-14573 et X-14575 produisent un mycélium substrat qui ne se fragmente pas en spores, et un mycélium aérien, 20 qui forme ultérieurement des chaînes de spores. Au bout de 14 jours d'incubation à 28°C, les chaînes de spores apparaissent droites et flexibles avec plus de 50 spores par chaîne. Les spores sont lisses et leur taille est comprise entre 0,70 et 0,5 pa à 1,35 et 0,33, p.m pour 25 X-14667; 0,7 et 0,4 à 1,45 et 0,4 ipm pour X-14573; 0,8 et 0,5 pm à 0,6 et 1,0 pi pour X-14575.

La paroi cellulaire des cultures contient l'isomère LL de l'acide diamineipimélique, ce qui, avec les caractéristiques ci-dessus, place ces organismes 30 dans le genre Streptomyces (Lechevalier et al., Adv.

Appl. Microbiol., 14, 47-72, 1971).

Examen macroscopique. Les tableaux 1, 2 et 3 résument l'importance de la croissance, le degré de sporulation, la couleur de la masse des spores, la couleur 35 de l'envers du mycélium substrat, et la présence d'un pigment Foluble produit par les souches Streptomyces sp. X-14657, X-14573 et X-14575 sur divers milieux solides.

S

TABLEAU 1.

Caractères culturaux de' Streptomyces SP. X-14657

Milieu gélosé

Croissance; degré de sporulation

Couleur de la masse des spores3-

Couleur de l'envers du mycélium substrat ^

Extrait de malt , de levure (ISP-2)

croissance modérée; sporulation modérée b (blanc d'huître)

31g (brun adobe)

Farine d'avoine (lSP-3)b croissance modérée; sporulation modérée; envers légèrement rose qui devient bleu avec NaOH

b (blanc d'huître)

5ge (bois de rose)

Amidon de sels '

inorganiques

(ISP-4)

croissance abondante; sporulation abondante; hydrolyse l'amidon

3çb (sable)

5ie (brun cuivré)

Glycérol asparagine (ISP^)"*5

croissance modérée; sporulation abondante b (blanc d'huître)

31g (brun adobe)

bord du 2ec (biscuit)

Czapek-Dox c croissance abondante; sporulation abondante

3dc (naturelle)

2gc (bambou); bord du 2ec (biscuit)

La combinaison de couleurs utilisée a été empruntée au Color Harmony Manual, 4 e ed», 1958 (Container Corporation of American, Chicago)

Milieux recommandés par le Projet Streptomyces international (Shirling, E.B. & D. Gottlieb, Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340, 1966).

C Bouillon Czapek-Dox (BBL) auquel on ajoute 1,5 % de gélose.

TABLEAU 2. Caractères culturaux de Streptomyces SP. X-14-573

milieu gélosé

Croissance ; degré de sporulation

Couleur de la masse des spores3-

Couleur de l'envers du mycélium substrat a

Extrait de malt de levure (±SP-2)b croissance abondante; bonne sporulation; pigment soluble brun-rouge foncé

3çb (sable)

5ni (chocolat)

farine d'avoine (ISP-3) b croissance modérée à abondante; sporulation modérée b (blanc d'huître)

4-ie (brun liège)

Amidon de.sels linorganiques (ISP-4-) b jcroissance abondante; bonne sporulation; hydrolyse l'amidon; pigment soluble brun

5çb (sans désignation)

4-nl (chocolat)

Glycérol asparagine (ISP-5) b croissance abondante; bonne sporulation; pigment soluble brun; hygroscopique

3de (naturelle)

4-nl (chocolat)

Czapek-Dox c croissance modérée à abondante; bonne sporulation

3çb (sable)

4-ie (brun liège)

La combinaison de couleurs utilisée a été empruntée au Color Harmony Manual, 4-e ed., 1958 (Container Corporation of American, Chicago)

Milieux recommandés par le Projet Streptomyces international (Shirling, E.B. & D. Gottlieb, Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-34-0, 1966).

c Bouillon Czapek-Dox (BBL) auquel on ajoute 1,5 % de gélose.

TABLEAU 3. Caractères culturaux de Streptomyces SP. X-14575

Milieu gélosé

Croissance; degré de sporulation

Couleur de la masse des spores3-

Couleur de l'envers du mycélium substrat a

Exurait de malt de levure (lSP-2)b croissance modérée; sporulation clairsemée; pigment brun b (blanc d'huître)

4-nl (chocolat)

Farine d'avoine (lSP-3)b croissance modérée; sporulation modérée b (blanc d'huître)

3ec (bisque) pour la plus grande partie; 31g (brun adobe) par endroits

Amidon de sels inorganiques croissance modérée; sporulation modérée; hydrolyse l'amidon; pigment soluble brunâtre lorsque non hydrolyse b (blanc d'huître)

31g (brun adobe)

Glycérol aspara-gine (lSP~5)b croissance modérée ; pas de sporulation

3ig (brun adobe) 31e. (fauve) sur bords isolés; non sporulé

3ie (fauve)

Czapek-Doxc croissance modérée; sporulation clairsemée

4-lg (brun épice clair)surtout lorsque non sporulé; b (blanc d'huître) lorsque sporulé en taches

4-ie (brun liège)

3. r * s ' @

La combinaison de couleurs utilisée a été empruntée au Color Harmony Manual, 4- ed. , 1958 (Container Corporation of American, Chicago).

-y.

Milieux recommandés par le Projet Streptomyces international (Shirling, E.B. & D. Gottlieb, Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-540, 1966).

r\

Bouillon Czapek-Dox (BBL) auquel on ajoute 1,5 % de gélose.

_Q_

j

10

, Caractères physiologiques : Les tableaux 4 et 5 donnent les résultats de l'utilisation du carbone et les caractères métaboliques de Streptomyces sp X-14667» X-14573 et X-14575 et comparent les résultats avec ceux de S. cinnamonensis, 1712A qui produit la monensine.

TABLEAU 4. Comparaison de l'utilisation du carbone par Streptomyces.sp. X-14667» X-14573, X-14575 et S. cinnamonensis 1712A.

Source de carbone

Réaction de croissance* de

S. cinna-

monensis

X-14667 X-14573 X-14575 1712A

15

20

25

D-Glucose

++

+ +

++

+ +

D-Xylose

+

++.

++

++

L-Arabinose

++

++

++

+ (+)

L-Rhamnose

. -

+ +

-

++

D-Fructose

+ (+)

++

++

4-4-

D-Galactose

4*4-

+ +

4—h

Raffinose

+4-

+(+)

++

+ (+)

D-Mannitol

4*4-

++

+ +

++

i-Inositol

4*

++

++

++

Salicine ià+

++

++

+ (+)

Sucrose

-

-

-

-

Cellulose

_

—

_

—

$0

réaction négative; -, réaction douteuse; +, croissance supérieure à celle que l'on obtient avec le témoin carboné mais inférieure à ce qu'on obtient sur glucose; ++, réaction positive égale à celle que l'on obtient sur glucose.

TABLEAU 5 - CARACTERES METABOLIQUES

Test

•x-14667

X-14573

x-14575

S. cinnamonensis

1712A

Assombrissement de ISP-6

Mélanine ISP-7

Hydrolyse de la caséine

Hydrolyse de la gélatine

Hydrolyse de l'amidon

Tolérance du NaCl (%)

Intervalle de temp. de croissance (°C)

Assombrissement de ISP-1

Pigment de l'envers

Pigment soluble

Production d'antibiotique

Réduction du nitrate Hygroscopie

+ + +

<10 problt=7%

10-37

+ +

7

+ + +

7

+,rouge séquoia brun brun-rouge

-,lég brunâtre brun, occasionnellement brun lég brun-rouge rose,réversible au bleu avec NaOH

monensine A et B et les phénéthyluréthanes correspondants +

+ 4*

légère sur isp-5

+

+

+

<10

10-37

+ léger brunâtre occasionnellement brunâtre monensine A et B i en 2 semaines

-11-

Une comparaison de la description de Streptomyces sp. X'-14667, X-14573 et X-14575 avec celles de l'espèce de Streptomyces décrite dans le manuel de Bergey (Buchanan & Gibbons, dir. publ., Bergey's Manual 5 of De terni native Bacteriology, 8e éd., 748-829, 1974-)} dans la clé de classification de H. Nonomura (j. Ferment. Technol., 52, 78-92, 1974) et la classification de Pridham et Lyons (Dev. Ind. Microbiol. 10, 183-221, 1969), montre que S. cinnamonensis est le parent le plus 10 proche des souches ci-dessus, d'après la combinaison de critères suivante : couleur grise de la masse des spores, chaîne sporulée droite et flexible, surface lisse des spores, réaction chromogène sur milieux ISP 1 et 6, et caractères de l'utilisation du carbone. S. cinnamo-15 nensis est semblable à X-14667, X-14573 et X-14575 en ce qu'ils produisent tous la monensine A et la monensine B. Cependant, S. cinnamonensis diffère des souches ci-dessus car elle ne produit aucun des monensine-phénéthyl-uréthanes.

20 Les espèces de Streptomyces X-14667) X-14573

et X-14575 comprennent toutes les souches de Streptomyces de l'invention qui forment les monensine-phénéthyluré-thanes et qui ne peuvent être différenciées nettement des souches ERRL 11336 (ATCC 31551), ERRL 11337 (ATCC 25 31552) et ERRL 11338 (ATCC 31553) et de leurs sous-cultures, y compris les mutants-et les variantes. Les composés revendiqués sont ici décrits et, une fois cette identification connue, il est facile de différencier des autres les souches produisant ces composés. 30 - Streptomyces X-14667, X-14573 et X-14575,

lorsqu'on les cultive dans des conditions convenables, produisent des dérivés de monensine-uréthane. On prépare un bouillon de fermentation contenant Streptomyces X-14667, X-14573 ou X-14575 en inoculant des spores ou 35 des mycelia de l'organisme produisant les dérivés dans

-12-

un milieu approprié puis en les cultivant: dans des conditions aérobies. Pour la production des dérivés, la culture sur un milieu solide est possible, mais pour la production en grandes quantités, la culture dans un mi-5 lieu liquide est préférable. La température de la culture peut varier dans un large intervalle, 20-35°C»

dans lequel l'organisme peut croître, mais on préfère une température de 26-30°C et un pH pratiquement neutre. Dans la fermentation .aérobie submergée de l'organisme 10 pour la production des dérivés de monensine, le milieu peut contenir comme source de carbone un glycéride,

huile que l'on trouve dans le commerce, ou un hydrate de carbone comme le glycérol, le glucose, le maltose, le lactose, la dextrine, l'amidon, etc., dans des états 15 purs ou impurs et, comme source d'azote, une matière organique comme la farine de soja, les distillats so-lubles, la farine d'arachide, la farine de graine de coton, l'extrait de viande, la peptone, la farine de poisson, l'extrait de levure, la liqueur de mais macé-20 rée, etc, et, si on le désire, des sources inorganiques d'azote comme les nitrates et les sels d'ammonium et des sels minéraux comme le sulfate d'ammonium, le sulfate de magnésium, etc. Il peut également contenir du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du phosphate 25 de potassium, etc, et des agents tampon comme le citrate de sodium, le carbonate de calcium ou des phosphates et des quantités de l'ordre d'une trace de sels de métaux lourds. Dans les procédés de cultures submergées aérées, on utilise un agent anti-émulsifiant comme 30 la paraffine liquide, les huiles grasses ou des composés siliconés. On peut utiliser pour la production des dérivés de monensine plus d'une sorte de source de carbone, d'azote ou d'anti-émulsifiant.

L'activité antibiotique des dérivés d'uréthane 35 est illustrée par le tableau suivant (Tableau 6) :

TABLEAU 6

Spectre antimicrobien de dérivés d'uréthane de monensine

Q

Concentration inhibitrice minimale (mcg/ml)—

-

Staph. aureus 6538

Sarcina lutea 9341

Streptococcus faecium 8043

Bacillus sp. E 27859

Bacillus subtilis 583^

Monensine B, phénéthyluréthane (préparé par fermentation)

6,3

3,1

0,8

1,6

3,1

Monensine A, phénéthyluréthane

(préparé par fermentation)

6,3

1,6

0,4

0,8

1,6

Monensine B,(R)-1-phényl-éthyluréthane

6,3

3,1

0,8

0,4

1,6

Monensine B,(S)-1-phényl-éthyluréthane

1,6

. 1,6

0,2

0,1

0,8

Monensine A,4-bromophényl-uréthar.e

0,8

0,2

0,1

0,05

0,4

Monensine A,4-chlorophényl-uréthane

0,4

0,2

0,05

0,02

0,4

Monensine A,phényluréthane

0,8

0,8

0,1

0,05

0,4

Monensine A,4-fluoro-- phenyluréthane

1,6

0,8

0,1

0,2

0,8

Monensine A, cyclohexyl-uréthane

1,6

0,8

0,1

0,2

0,8

Monensine A,2-(phényl)-cyclopropyluréthane

3,1

0,8

0,2

0,4

co o

TABLEAU 6 (Suite)

Staph. aureus 6538

Sarcina lutea 9341

Streptococcus faecium.

8043

Bacillus sp. E 27859

Bacillus subtilis

583—

Monensine A, méthyluréthane

25

25

1,6

6,3

1,6

Monensine A,n~butyluréthane

1,6

1,6

0,2

0,2

0,4

Monensine à,4-(méthyl-carbonyl)-phényluréthane

1,6

1,6

0,8

0,2

1,6

Monensine A,4-phénoxy-phényluréthane

0,4

0,4

0,1

0,4

. 0,4

Monensine A,4-iodophényl-uréthane

0,4

0,2

0,1

0,02

0,4

Monensine A,4—méthoxy-phé nylurét hane

1,6

1 >6

0,4

0,1

0,8

Monensine A,4-méthyl-phényluréthane

0,4

0,4

0,2 .

0,05

0,4

(a) Limite inférieure de dilution à la moitié donnant une zone d'inhibition dans le dosage de diffusion dans le réservoir de gélose.

(b) Numéro de collection NRRL; tous les autres sont des numéros ATCC.

TABLEAU 6 (Suite)

Bacillus megaterium 8011

Bacillus sp. TA 27860

Myco-Bact.

phlei

355

Streptococ-cus cellul. 3313

Paecilomyces varioti

25820

Monensine B, pilé né thyluré thane (préparé par fermentation)

3,1

3,1

25

12,5

Monensine A, phénéthyluréthane (préparé par fermentation)

0,8

1,6

6,3

12,5

12,5

Monensine B,(R)-1-phényl-éthyluréthane

1,6

1,6

12,5

3,1

3,1

Monensine B, (S)-1 -phényl~ éthyluré thane

0,4-

0,2

6,3

6,3

6,3

Monensine A,4—bromophényl-uréthane

0,1

0,2

1,6

0,8

1,6

Monensine A,4-chlorophényl-urothane

0,2

0,2

0,8

0,8

3,1

Monensine A, phényluréthane

0,4-

0,4-

3,1

3,1

3,1

Monensine A,4-fluoro-phényluréthane

0,4-

0,8

3,1

3,1

3,1

Monensine A, cyclohexyl-uréthane

0,4-

0,8

3,1

3,1

3,1

Monensine A,2-(phényl)-cyc1opropyluré thane

0,8

0,4-

3,1

12,5

6,3

TABLEAU 6 (Suite)

Bacillus megaterium

8011

Bacillus sp. TA 27860

Myco-Bact.

phlei

355

Streptococ-cus cellul. 3313

i

Paecilomyces varioti

25820

Monensine A, méthyluréthane

6,3

12,5

-

-

—

Monensine A,n-butyluréthane

0,8

0,4

6,3

3,1

6,3

Monensine A,4-(méthyl-c arbonyl)-phé nyluré thane

1,6

0,8

6,3

3,1

6,3

Monensine A,4-phénoxy~ phényluré thane

0,4

0,2

1,6

0,8

0,8

Monensine A,4-iodophényl-uréthane

0,2

0,2

1,6

0,4

1,6

Monensine A,4-méthoxy-phényluréthane

0,8

0,8

6,3

1,6 ■

6,3

Monensine A,4-méthyl-phényluréthane

0,2

0,2

1,6

0,8

1,6

(a) Limite inférieure de dilution à la moitié donnant une zone d'inhibition dans le dosage de diffusion dans le réservoir de gélose.

(b) Numéro de collection NRRL; tous les autres sont des numéros ATGG.

-17-

D'après le tableau 6 ci-dessus, qui indique

10

15

If

20

25

l'activité in vitro des composés de l'invention contre certaines bactéries grain-positives, on note leur utilité comme agents anti-bactériens utiles dans les solutions de lavage à but hygiénique comme le lavage des mains et le nettoyage des équipements, des sols ou du mobilier des pièces ou des laboratoires contaminés.

En outre, on a trouvé que certains des dérivés d'uréthane ici décrits, à savoir ceux de formule I où

p

R est un aryle,un haloaryle, un rdtroaryle, un alcoyl-aryle ou un cycloalcoyle et leurs sels pharmaceutiquement acceptables présentent une activité anti-coccidien-ne contre l'organisme Eimeria tenella.

Cette activité anti-coccidienne se démontre sur des poulets de laboratoire de la façon suivante :

Procédé expérimental. Cette expérience utilise dix poulets par groupe de médicaments. On utilise dix poulets comme témoins de poids et dix poulets comme témoins infectés. On administre le médicament 4-8 heures avant l'infection. On mélange 1 g du médicament expérimental dans un mélangeur mécanique avec une quantité suffisante d'aliment pour poulet pour aboutir à la dose désirée. L'infection se fait au moyen d'environ 200 000 oocystes par voie orale en utilisant une pipette. L'expérience dure 11 jours, puis on autopsie les animaux survivants et on les examine pour détecter les lésions macroscopiques dans le caecum. On évalue les animaux expérimentaux d'après le nomore de survivants et le nombre de lésions caecales. Les résultats sont exprimés sous forme de degré moyen d'infection (D.M.I.). Un degré moyen d'infection inférieur à 2,5 est considéré comme significatif.

-18-

Tableau 7

Effets anti-coccidiens des monensme-uréthanes ajoutés à la nourriture des poulets infectés avec Eimeria tenella.

5 Composé Dosage en Degré moyen aliments, d'infection ppm (DMI)

Témoin non traité non infecté - 0,0

Témoin non traité infecté - 3j0

10 Monensine A, 4—nitrophényluréthane 75 0,5

Monensine A, 4-"bromophényluréthane 75 0,7

Monensine A, phényluréthane 75 0,9

Monensine A, 4--chlorophé nyluré thane 65 0,8

Monensine A, 4—méthylphényluréthane 75 1*1

15 Monensine A, 4—iodophényluréthane 125 0,1

Monensine A, 4—fluorophényluréthane 125 1*0

Monensine A, cyclohexyluréthane 125 0,8

Les dérivés a'uréthane de l'invention se sont également révélés actifs contre Trenonena hyoaysenteriae 20 La concentration minimale inhibitrice des dérivés d'uréthane est la suivante :

Composé CMI (mcg/ml)

Monensine B, phônéthyluréthane 0,4—2,0

(préparé par fermentation)

25 Monensine B, phénéthvluréthane 2,0

(produit de synthèse)

30

35

Monensine

A,

4—bromophényluréthane

0

,4-

Monensine

B,

(R)-1-phényléthyluréthane

0

,4

Monensine

A,

phénéthyluréthane

0

Monensine

A,

phényluréthane

0,08'

-0,4-

Monensine

A,

4—chlorophényluréthane

0

,08

Monensine

B,

(S)-1-phényléthyluréthane

0

,4

Monensine

A»

cyclohexyluréthane

0

Monensine

A,

2-(phényl)-cyclopropyl-

ur6thane

0

Monensine

A?

4—fluorophényluréthane

0

,08

-19-

' La recherche de l'activité contre Trenonema hyod7^senterlae, provoquant la dysenterie chez les porcs, consiste à inoculer à des plaques de gélose au sang, contenant une série de dilutions à la moitié ou au quart 5 des dérivés d'uréthane, des dilutions au dixième de la souche de T. hyodysenteriae. Au bout de 48 heures d'incubation à 42°C dans une atmosphère anaérobie, on enregistre les concentrations inhibitrices minimum comme les plus faibles concentrations de composés qui inhibent 10 complètement l'inocolum le plus dilué de chaque souche de T. hyodysenteriae.

On a également trouvé que les dérivés d'uréthane présentent une activité comme agents favorisant la croissance chez les ruminants, 15 L'administration des dérivés d'uréthane, appe lés ci-dessous "antibiotiques" ou "composés antibiotiques" prévient et traite la cétose et améliore également l'utilisation de la nourriture chez les ruminants ou les porcs. Le mécanisme causal de la cétose est une 20 déficience de la production de composés de propionate. Le traitement actuellement recommandé consiste à administrer de l'acide propionique ou des aliments qui produisent préférentiellement les propionates. Il est évident qu'encourager la production de propionate à partir 25 d'aliments ordinaires réduira la fréquence de la cétose.

On a trouvé que les dérivés d'uréthane augmentent l'efficacité de l'utilisation de la nourriture chez les ruminants lorsqu'ils sont administrés oralement aux animaux. La manière la plus simple d'administrer 30 l'antibiotique consiste à le mélanger à la nourriture de 1'animal.

Cependant, les antibiotiques peuvent être administrés utilement d'autres manières. Ainsi, ils peuvent être incorporés dans des comprimés, des potions, des 35 bols ou des capsules et administrés quantitativement

-20-

aux animaux. La formulation des composés antibiotiques sous ses formes posologiques peut s'effectuer au moyen de procédés bien connus des spécialistes de pharmacie vétérinaire.

5 II est facile de produire des capsules en rem plissant des capsules de gélatine de n'importe quelle forme souhaitée de l'antibiotique désiré. Si on le désire, on peut diluer les antibiotiques avec un diluant pulvérulent inerte, comme le sucre, l'amidon, ou la 10 cellulose cristalline purifiée afin d'augmenter leur volume pour faciliter le remplissage des capsules.

On fabrique des comprimés des antibiotiques selon les procédés pharmaceutiques classiques. Outre l'ingrédient actif, un comprimé contient généralement 15 une base, un désintégrant, un absorbant, un liant et un lubrifiant. Les bases caractéristiques comprennent le lactose, le sucre glace fin, le chlorure de sodium, l'amidon et le mannitol. L'amidon est également un bon désintégrant comme l'acide alginique. On utilise égale-20 ment quelquefois des agents tensio-actifs comme le laurylsulfate de sodium et le suifosuccinate de dioctyl-sodium. Les absorbants communément utilisés comprennent là encore l'amidon et le lactose, tandis que le carbonate de magnésium est également utile pour les subs-25 tances huileuses. Comme liants fréquemment utilisés, il faut mentionner la gélatine, les gommes, l'amidon, la dextrine et divers dérivés de cellulose. Parmi les lubrifiants communément utilisés, on peut citer le stéarate de magnésium, le talc, la cire de paraffine, di-30 vors savons métalliques, et le polyéthylèneglycol.

L'administration des composés antibiotiques peut se faire sous la-forme d'un bol à diffusion lente. Ces bols sont préparés comme les comprimés, sauf que l'on fournit un moyen de retarder la dissolution des 35 antibiotiques. Les bols sont conçus pour diffuser sur

-21-

de longues périodes. On contribue à ralentir la dissolution en choisissant une forme très insoluble dans l'eau des antibiotiques. On ajoute une substance comme la- limaille de fer pour augmenter la densité du bol 5 et le maintenir immobile au fond de la panse.

On retarde la dissolution des antibiotiques en utilisant une matrice de matériaux insolubles dans laquelle le médicament est noyé. Par exemple, des substances comme les cires végétales, les cires minérales 10 purifiées et les matières polymères insolubles dans l'eau sont utiles.

On.prépare très facilement des potions des antibiotiques en choisissant une forme de l'antibiotique soluble dans l'eau. Si l'on désire pour quelque raison 15 une forme insoluble, on peut faire une suspension. On peut également formuler une potion sous la forme d'une solution dans un solvant physiologiquement acceptable comme un polyéthylèneglycol.

On peut préparer des suspensions de formes 20 insolubles des antibiotiques dans des corps non solvants tels que les huiles végétales, comme l'huile d'arachide, l'huile de mai's, ou l'huile de sésame, dans un glycol comme le propylèneglycol ou un polyétherglycol; ou dans l'eau, selon la forme choisie pour les antibiotiques. 25 Des adjuvants appropriés physiologiquement ac ceptables sont nécessaires pour- maintenir les antibiotiques en suspension. Les adjuvants peuvent être choisis parmi les épaississants, comme la carboxyméthylcellu-lose, la polyvinylpyrrolidone, la gélatine, et les algi-30 nates. De nombreuses classes d'agents tensio-actifs servent à mettre les antibiotiques en suspension. Ainsi, la lécithine, les additifs aieoylphénol/oxyde de poly-éthylène, les naphtalènesulfonates, les alcoylbensène-sulfonates, et les esters de polyoxyéthylènesorbitan 35 sont utiles pour faire des suspensions dans des liquides non solvants.

-22-

_ En outre, de nombreuses substances affectant 1'hydrophilie, la densité et la tension superficielle du liquide peuvent aider à faire des suspensions dans certains cas. Par exemple, les anti-émulsifiants sili-5 ccnés, les glycols, le sorbitol et les sucres peuvent être des agents suspenseurs utiles.

Les antibiotiques susceptibles d'être mis en suspension peuvent être présentés à l'éleveur sous la forme d'une suspension ou d'un mélange sec des anti-10 biotiques et des adjuvants à diluer avant l'emploi.

Les antibiotiques peuvent également être administrés dans l'eau de boisson des ruminants. L'incorporation dans l'eau de boisson s'effectue en ajoutant, en quantité convenable, une forme soluble dans l'eau ou 15 susceptible d'être mise en suspension dans l'eau, de l'antibiotique. La formulation des antibiotiques aux fins d'addition dans l'eau de boisson suit les mêmes principes que la formulation des potions.

La façon la plus pratique de traiter les ani-20 maux avec les composés antibiotiques consiste à formuler les composés dans l'alimentation. Tous les types de nourriture peuvent se voir ajouter les composés antibiotiques, y compris les aliments secs habituels, les aliments liquides, et les aliments en pelle ts. 25 Les procédés de formulation des médicaments dans les aliments pour animaux sont bien connus. On a l'habitude de faire un pré-mélange médicamenteux concentré sous forme de matériau brut pour les nourritures additionnées de médicaments. Par exemple, les prémélan-50 ges médicamenteux caractéristiques peuvent contenir d'environ 2,2 g à environ 883 S de médicament par kg de prémélange. Ce large intervalle résulte du large intervalle de concentration médicamenteuse qui peut être désiré dan^ l'aliment final. Les prémélanges peuvent 35 être liquides ou solides.

-23-

La formulation des nourritures pour ruminants contenant les quantités convenables d'antibiotique pour un traitement utile est bien comprise. Il suffit de calculer la quantité de composés que l'on souhaite adminis-5 trer à chaque animal, de prendre en compte la quantité de nourriture par jour que mange l'animal et la concentration de composés antibiotiques dans le prémélange à utiliser, et de calculer la concentration convenable de composés antibiotiques, ou de prémélange, dans la nour-10 riture.

Tous les procédés de formulation, de mélange et de transformation en pellets de la nourriture que l'on utilise normalement dans l'alimentation des ruminants conviennent parfaitement pour préparer des ali-15 ments contenant les composés antibiotiques.

Comme on l'a montré, l'administration orale de l'antibiotique modifie favorablement Introduction de propionates par rapport à la production d'acétate dans la panse. On peut donc supposer que le même traitement 20 serait également bénéfique aux animaux monogastriques qui font fermenter la matière végétale fibreuse dans le caecum car on s'attendrait à ce qu'un changement bénéfique intervienne dans le rapport propionate/acétate après administration orale des présents antibiotiques. 25 Les chevaux, les porcs et les lapins sont des exemples d'animaux qui digèrent une partie de leur nourriture par fermentation caecale.

Détermination de la production d'acides gras volatils (AGV)

30 On utilise un bovin, sur lequel on intervient par chirurgie avec une fistule dans la panse, comme source de liquide de la panse. On maintient l'intégrité de la panse par une canule que l'on ouvre pour obtenir des échantillons de liquide de la panse. On donne 3> 2 fois par jour à l'animal un concentré à 80 °/o (surtout

-24-

mais jaune avec addition de farine d'huile de soja et de farine de luzerne) : 20 % de ration de fourrage grossier. Le liquide de la panse est obtenu avant le repas du matin. On filtre le liquide à travers quatre 5 couches de gaz dans un récipient de 4,54 1 et on maintient sous C02 de qualité anaérobie. On ajoute 1000 ml de liquide de la panse filtré à 2 ml d'un tampon glacé ayant la composition suivante :

ïïa2HP0Zl

0,316' g/1

MgSO^

0,112

KH2PO4 '

0,152

CaCl2

0,038

nahcoj

2,260

PeSO^.

7H2o

0,008

NaCl

0,375

ZnSO^.

7E2o

0,004

KC1

0,375

CuSO^.

5H20

0,002

On maintient le liquide de la panse tamponné 15- dans un entonnoir séparateur de 4 1. Afin d'aider à

maintenir le caractère anaérobie du liquide de la panse et l'homogénéité du liquide de la panse tamponné, on fait barbotter constamment du CO2 de qualité anaérobie à travers le liquide dans un entonnoir de séparation 20 en commençant environ 1 cm au-dessus du robinet d'arrêt de l'entonnoir de séparation.

On utilise des erlenmeyers de 250 ml pour les différentes fermentations. Chaque flacon auquel on doit ajouter un composé contient 1 g d'un concentré à 80 % 25 finement moulu : 20 % de ration de foin de luzerne. Les flacons qui doivent être utilisés comme témoins sans médicament contiennent 1,07 g ûe la ration finement moulue. On ajoute à chaque flacon 1 ml de solution de composé expérimental dissous dans un-solvant approprié 30 et on laisse reposer pendant 1/2 heure à 1 heure. Chaque composé est examiné dans des flacons en double à une concentration finale de 50 ppm. On ajoute du solvant sans composé expérimental aux ballons de fermentation témoins sans médicament. On utilise la monensine à 10 35 et 50 ppn comme témoin positif dans- toutes les fermentations. K

-25-

On ajoute 80 g de liquide de panse tamponné à chaque flacon contenant le composé expérimental et on ajoute aux flacons témoins 85,93 g. On bouche les flacons auxquels on a ajouté tous les composants avec un 5 appareil pour recueillir les gaz et on laisse reposer à la température ambiante jusqu'à ce que tous les flacons aient été terminés. On retire des échantillons de 6 ml de tous les flacons témoins comme échantillons de temps 0. On commence la période d'incubation et la col-10 lecte du gaz qui s'est dégagé pendant la fermentation

10 minutes après que les flacons aient été disposés dans un bain d'eau à 38°C. On fait incuber les flacons tout en agitant (90 oscillations par minute) pendant 4- heures.

On mesure à des intervalles d'1/2 heure le vo-15 lume de gaz produit par chaque fermentation. L'appareil manométrique pour recueillir le gaz et mesurer le volume dégagé a été décrit par Trei et al., J. Anim. Sci., 30, 825 (1970).

On verse le liquide de la panse dans des tubes 20 en verre de 25 x 150 mm et on laisse dans un bain glacé pendant environ 15 minutes pour permettre aux particules de se déposer. On ajoute alors 6 ml de liquide de panse à 2 ml d'acide métaphosphorique à 25 % (p/v) dans des tubes à centrifugation de 13 ml en polycarbonate. On 25 bouche tous les tubes et on mélange soigneusement. On laisse les tubes dans un bain glacé pendant 30 minutes puis on centrifuge à 16 000 tpm pendant 10 minutes. On ajoute alors 1 ml de l'étalon interne (acide 2-méthyl-valérique à 0,25 %) à 4- ml du surnageant. On filtre le 30 mélange obtenu à travers un filtre Millipore de 0,22 micron en utilisant une seringue de 5 ml. On scelle le filtrat dans des flacons en verro d'1 ml avec des septa de crêpe de caoutchouc revêtus de téflon.

Chaque flacon,, représentant chacune des diffé-35 rentes fermentations, est analysé pour rechercher les

-26-

acides gras volatils.

Les résultats sont donnés au tableau suivant

~ \

TABLEAU 8

Effet de divern ionophores sur la production de gaz et d'AGV dans les fermentations de panse in vitro.

Composé

Concentration du composé

Production en % des fermentations " témoins

(ppm)

Total des AGV

Taux de production de gaz

Niveaux relatifs de prxpipnabe (C3) sur ace.tate -4-butyrate (CpfC /+)*)

Monensine B, phénéthyl uréthane (préparé par fermentation)

10

50

157,8 149,1

93 92-

129 146

Monensine A

10 50

110,7 105,3

85

. 89

162 165

Narasine

10 50

102,5

106,0

88 86

166

167

Monensine A, phénéthyluréthane (préparé par fermentation)

50

84,3

101 ,7

187

Mono-(4-bromophényl uréthane) de monensine

50

89,9

103,0

165

Monensine B, 1(R)-phényléthyluré thane

50

82,7

103,3

167

Témoin

0

100

100

100

*) Le rapport CU : (C2 + C^) est normalisé à une valeur de 100 pour le témoin non-traite.

-28-

2

Les composés de formule I où R est un aryle, un haloaryle ou un nitroaryle et leurs sels pharmaceutiquement acceptables sont oralement actifs comme agents anti-malariaux. Cette activité est montrée par les acti-5 vités suivantes contre l'agent vecteur de malaria Plasmodium berghsi chez les souris :

Composé DE50 P-°«

Monensine A, 4-chlorophényluréthane 2,3

Monensine A, phényluréthane 4

10 Monensine A, 4-bromophényluréthane 15-20

Les composés de formule I et leurs sels phanaa-r ceutiquement acceptables sont oralement actifs comme agents antihypertenseurs. Cette activité est démontrée par le tableau suivant (tableau 9) :

TABLEAU 9

Composé

Dose orale

Jour de modification (95)

maximale

Tension l

artérielle moyenne (mm HpO ;

(mg/kg)

T.

A.

Fréquence cardiaque

Avant traitement

Au moment de l'effet maxi

jour

Modif on jour

Modifon mum

Monensine B, uré thane phénéthyl

10

2

13

3

14-

216

189

Monensine A, uréthane phénéthyl

10

5

15

2

18

223

189

Monensine A, 4-'bromo-* phényl uréthane

1

2

21

-

_*

225

178

Monensine A, uréthane phényl-*

10

2

26

—

_*

229

170

Monensine A, 4—chloro-phényl uréthane

1

5

20

5

19

224-

179

Monensine A, 4—fluoro-phényl uréthane

3

2

17

—

_*

220

182

Monensine A, 4—métiiyl-phényl uréthane

1

3

16

4-

15

217

182

On préfère les composés qui affectent la tension artérielle, mais non la fréquence cardiaque.

-30-

On peut préparer le composé de l'invention en faisant réagir la monensine A ou B, c'est-à-dire un composé de formule générale

Me Me

Me

MeO

Me^COgH

10

C0

v;

où R est un méthyle (monensine B) ou un éthyle (monensine A) ou son sel avec un isocyanate de formule

R1-NC0 III

A

15 où R est tel que ci-dessus.

On utilise de préférence un sel du composé de départ de formule II, en particulier le sel de sodium. On ajoute de préférence 1'isocyanate de formule III en léger excès, par exemple un excès d'environ 10 de 20 manière à optimiser la formation de mono-dérivés. La réaction s'effectue de préférence dans un solvant inerte comme un hydrocarbure chloré, par exemple le tétrachlorure de carbone, le chlorure de méthylène ou le chloroforme, l'éther, l'acétate d'éthyle, ou dans un solvant 25 hydrocarboné aromatique comme le benzène ou le toluène. La température réactionnelle n'est pas d'une importance capitale mais peut se situer entre environ 0°C et le point d'ébullition du mélange réactionnel, de préférence aux environs de la température ambiante. 30 Exemple 1

Fermentation de S tr entonne es X-14-667 dans un flacon agité

On cultive et on entretient la culture de X-14667 sur une gélose d'amidon inclinée ayant la com-3b position suivante (g/1 d'eau distillée) :

-31-

Amidon 10,0 N-Z aminé A 2,0 Extrait de boeuf 1,0 Extrait de levure 1,0 5 CoC12.6H20 0,02

Gélose 10,0

On inocule à la gélose la culture d1X-14667 et on fait incuber à 28°G pendant 7 à 14 jours. On utilise alors un morceau de gélose contenani/La culture 10 sporulée provenant de la gélose inclinée pour inoculer un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu d'ino-culum stérilisé ayant la composition suivante (g/1 d'eau distillée) :

Pulpe de tomate

5,0

Distillats solubles

5,0

Peptone

5,0

Levure sans'amertume

5,0

Amidon de maïs

20,0

CaCOj

1,0

ïyiPC^

1,0

On ajuste le pH à 7)0

avec NaCH avant stérili-

sation.

On fait incuber le milieu d'inoculum inoculé à 28°C pendant 48-72 heures sur un agitateur rotatif fonc-25 tionnant à 250 tpm avec un battement de 5 cm.

On utilise alors une fraction de 3 ml (3 % v/v) de la culture obtenue pour inoculer un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu de production stérilisé ayant la composition suivante (g/1 d'eau distillée):

30 Pulpe de tomate 5î0

Distillats solubles 5,0

Peptone 5,0

Levure sans amertume 5)0

Amidon de mais 20,0

35 CaCO- 1,0

K2HP % 1,0

-32-

On ajuste le pH à 7,0 avec NaOH avant de passer à l'autoclave.

On fait incuber le milieu inoculé à 28°C pendant 5 jours sur un agitateur rotatif fonctionnant à 5 250 tpm avec un battement de 3 cm.

Exemple 2

Fermentation de Streptomyces X-14667 dans une cuve On cultive et on entretient la culture de X-14667 sur une gélose inclinée de caséine d'amidon 10 ayant la composition suivante (g/1 d'eau distillée) :

Amidon soluble 10,0

Caséine 1,0

K2HFO4 0,3

MgSO^ (anhydre) 0,5

15 Gélose 20,0

On ajuste le pH à 7,4- avec NaOH avant de passer à l'autoclave.

On inocule à la gélose inclinée la culture de X-14667 et on fait incuber à 28°C pendant 7 à 10 20 jours. On utilise alors un morceau de gélose provenant de la culture sporulée pour préparer un inoculum végétatif en inoculant un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu d'inoculum ayant la composition suivante (g/1 d'eau distillée) :

25 Pulpe de tomate 5,0

Distillats solubles 5,0

Peptone 5,0

Levure sans amertume 5,0

Amidon de mais • 20,0

30 CaCO^ 1,0

K2HP04 1,0

On ajuste le pH à 7,0 avant de passer à l'autoclave.

On fait incuber le milieu inoculé pendant 35 96 heures à 28°C sur un agitateur rotatif fonctionnant

-33-

10

à 250 tpm avec un battement de 5 cm.

On utilise 20 ml (1 c/o, v/v) de cette culture pour inoculer un erlenmeyer de 6 1 contenant 2 1 de milieu ayant la composition suivante (g/1 d'eau distillée) :

Pulpe de tomate

5,0

Distillats solubles

5,0

Peptone

5,0

Levure sans amertume

5,0

Amidon de maïs

20,0

CaCO^

1,0

K2HPO4

1,0

On ajuste le pH à 7,0 avant de passer à l'auto-

2

clave à une pression de 1,05-1,4 kg/cm pendant 4-5 mi-15 nutes.

On fait incuber le milieu inoculé pendant . 72 heures à 28°C sur un agitateur rotatif fonctionnant à 250 tpm.

On utilise 6 1 de cette culture pour inoculer 20 230 1 au milieu suivant dans un fermentateur de $80 1 (g/1 d'eau du robinet) :

Pulpe de tomate

5,0

Distillats solubles

5,0

Peptone

5,0

25

Levure sans amertume

5,'0

Amidon de maïs

20,0

CaCO-,

p

1,0

K2HP°4. .

1,0

Antiémulsifiant

0,1

30

On ajuste le pH du milieu a 7,0 avec NaOH avant de stériliser pendant 1 heure 1/4- sous une vapeur de 4-, kg/cm2.

On aère le milieu inoculé avec de l'air comprimé à un débit de 9 1/min et on agite avec des agitateurs 35 a 280 tpm. La fermentation s'effectue à 28°C pendant 5 jours.

-34-

Exemple 3 '

Isolement de la monensine A, de la nonensine B et la

5

10

15

On dissout les cristaux mélangés obtenus comme dans l'exemple 3 dans 100 ml de chlorure de méthylène et on lave avec HC1 1 ÏT. On concentre la couche de solvant à un faible volume et, après addition de 20 n-hexane, on sépare la diphénéthylurée (P^ 136°C) par filtration.

On dilue le filtrat (liqueur-mère) avec du diéthyléther, on lave avec du carbonate de sodium saturé, et après concentration et addition de n-hexane, 25 on sépare la monensine B cristalline (P^ 27b°C), et on recueille également une seconde récolte de cristaux.

En procédant plusieurs fois à une chromatogra-phie en couche mince sur gel de silice (solvant de développement : acétate d1éthyle) on détermine que la 30 seconde récolte de cristaux est un mélange de monensine B et de monensine A.

Exemple 5

Isolement de monensine A-nhénéthyluréthane et de monensine B-phéréthyluréthane 35 On dissout l'huile provenant de la première diphénéthyluree

On extrait le bouillon entier d'une fermentation de 230 1 de Streptomyces sp. X-14667 à pïï 7,6 avec un volume égal d'acétate d'éthyle. On sépare la couche de solvant et on concentre à 1,0 1 sous une pression réduite. On lave le concentré de solvant successivement avec des volumes égaux de HC1 1 N, d'eau, de carbonate de sodium saturé et d'eau puis on sèche sur sulfate de sodium. En concentrant encore et en filtrant, on obtient un mélange cristallin contenant de la monensine A, de la monensine B, de la diphénéthyluree et une huile.

Exemple 4

Isolement de la monensine A et de la diphéné thyluré e

-35-

filtration (exemple 3) dans le n-hexane (0,4-7 1) Qt on " extrait 2 fois avec 0,4-7 1 d'acétonitrile. On réunit les extraits, on concentre en une huile, et on lave avec du n-liexane. On dissout le solide huileux, insoluble dans 5 le n-hexane, dans du diéthyléther, on filtre et on chromât ographie sur 500 g de gel de silice en éluant avec un gradient entre 5 1 de chlorure de méthylène et 5 1 de chlorure de méthylène-éthanol (9:1). On recueille des fractions d'environ 18 ml chacune et on rassemble les 10 numéros 120 à 180 pour les rechromatographier. On réunit les fractions n° 185 à- 235* on concentre sous une pression réduite jusqu'à un solide huileux, on dissout dans le diéthyléther et on lave successivement avec HCl 1 N, du carbonate de sodium saturé, et de l'eau. On fait éva-15 porer le solvant sous une pression réduite pour donner le sel de sodium de monensine B phénéthyluréthane sous la forme d'une poudre, 70°C; [a]D +48° (CHCl^, C=1 o/o), +44-® (CH^OH, C =1 o/o). Analyse élémentaire :

Cale. : CZJ4.H68N012Na (826,98) : C, 63,90; H, 8,41; 20 N, 1,69; Ha, 2,78. Trouvé : C, 64-,45; H, 8,68; N, 1,76; LTa, 2,31.

On dissout 200 mg du sel de sodium dans l'acétate d'éthyle et on lave avec HCl 1 N. On fait évaporer le solvant sous une pression réduite, ce qui. donne 25 100 mg de monensine B-phénéthyluréthane sous la forme

■ d'une poudre beige, Pf 5C°C [cc]D +59)6° (CHCl^, C=1 o/o); +45,8° (CH^OH, C=1 o/o). Analyse élémentaire : Cale.: C^H6gIî0i2 (804,4) : C, 65,65; H, 8,76; N, 1,74; 0, 23,85. Trouvé : C, 65,53; H, 8,16; N, 1,49; 0, 24,16. 30 On concentre les fractions n° 120 à 180 réunies sous une pression réduite pour donner une huile et on rechromatographie sur une colonne de 700 g de gel de silice. On élue la colonne d'abord avsc 4 1 d'acétate d'é-thyle, puis 4 1 d'acétate d'éthyle-acétone (1:1) et enfin 35 4 1 d'acétate d'éthyle-éthanol (9^:1)* Les fractions n°

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29 à 35 (réunies) donnent, après concentration, de la diphénéthylurée. Les fractions n° 86 à 121 réunies donnent, après concentration, 2 g de monensine B-phénéthyluréthane. On concentre les fractions n° 55 à 5 85 réunies sous une pression réduite pour donner un solide huileux et on rechromatographie en utilisant du n-hexane-acétone (8:2). On redissout le mélange à deux composants pour donner la monensine B-phénéthyluréthane et la monensine A 2-phénéthyluréthane, cette dernière

10 sous forme d'une poudre après concentration, P^ 103°G [ot]jj +50° (CHClj, C=1 o/o) Cale. : C^H^NO^Na (840,04); C, 64,34; H, 8,40; N, 1,67; Na, 2,73-Trouvé : C, 64,43; H, 8,29; N, 1,92; Ha, 2,49.

15 mées par synthèse à partir de monensine A et B, respectivement. On prépare la matière semi-synthétique dans les deux cas en dissolvant 1 mMole de l'antibiotique dans le benzène et en ajoutant 1,2 mole de phénéthyl-isocyanate. Après avoir laissé réagir pendant la nuit, 20 on traite les composés en lavant le mélange réactionnel avec du Na^CO^ aqueux et en faisant évaporer le solvant sous une pression réduite. On purifie les produits de réaction bruts par chromatographie sur gel de silice comme il est dit pour les produits finals de fermenta-25 tion. On montre que les produits semi-synthétiques et les produits de fermentation sont identiques d'après le point de fusion, l'[a]D, les spectres IR, EMIT et SM.

On peut préparer le phénéthylisocyanate utilisé dans la réaction précédente comme suit : 30 On mélange 40 g de phénéthylamine dans 300 ml de toluène sec saturé avec du gaz chlorhydrique jusqu'à formation d'un lourd précipité blanc. On ajoute encore 200 ml de toluène sec avec "50 ml de phosgène (à 12,5 % dans le benzène). On fait refluer le mélange (10 minutes) 35 puis on ajoute lentement 450 ml de phosgène pendant

Ces structures des produits finals sont confir-

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30 minutes et on fait refluer le mélange pendant 4 heures. On laisse refroidir lentement le mélange réactionnel à la température ambiante et on retire le solvant sous vide, ce qui laisse une huile jaune. La dis-5 tillation de l'huile sous vide à 82-83°C/0,1 mm donne 1,8 g de produit final.

Exemple 6

Préparation du 4-bromonhényIuréthane de monensine A à partir de la monensine A, acide libre 10 On dissout 10 mMoles (6,89 g) de monensine A

hydratée dans le benzène (100 ml), et on ajoute à cette solution un excès (11 mMoles) de 4-bromophénylisocyana-te dans un volume égal de benzène, et on agite la réaction à la température" ambiante. On suit le cours de la 15 réaction par chromâtographie en couche mince sur gel de silice en utilisant l'acétate d'éthyle-n-hexane-éthanol (80:20:2) comme solvant de développement et un réactif vanilline-acide phosphorique pour la détection.

Au bout d'une semaine, la réaction semble ter-20 minée et on lave le mélange réactionnel successivement avec HCl 0,5 N, de l'eau, du Ka^CO^ saturé et de l'eau. On fait sécher la solution benzénique (î^SO^) et on fait évaporer sous une pression réduite jusqu'à donner un solide amorphe. On cristallise le dérivé- à partir de 25 1'acétonitrile pour donner le sel de sodium du 4-bromo-phényluréthane de monensine A, P^ 201 à 203°C, [ccjy. +65>3° (CHClj, C=1 0/0). Calculé pour C^^Hg^O^^HBrNa (891,87), 0/0 C, 57,90; H, 7,46; N, 1,57; Br, 8,96. Trouvé : 0/0 C, 58,57; H, 7,36; N,-1,23; Br, 8,90. 30 Exemple 7

Préparation du 4-bromophértyluréthane de monensine A à partir du sel de sodium de monensine

En partant de 5 S d-u <3-e sodium de monensine A (7 mMoles) et de 2 g de 4-bromophénylisocyanate, on 35 procède à la réaction comme dans 1'.exemple 6, mais le

-38-

sel de sodium semble réagir plus vite, et d'après la chromatographie en couche mince, la réaction est complète au bout de 2 jours.

Après avoir traité comme auparavant, on pro-5 duit le 4—bromophényluréthane de monensine A.

Exemple 8

En suivant les•enseignements des exemples 6 et 7, on peut produire, en utilisant 1'isocyanate approprié, les composés suivants :

Composé

Point de fusion °C

1 "

rotations optiques aD, 0

Monensine A,

méthyluréthane

191-193

Monensine A, thyluréthana

4-bromophéné-

201-203

Monensine B, (R)-1-phényl-éthyluréthane

89-93

Monensine A,

phényluréthane

199-210

Monensine A, uréthane

4—chlorophényl-

199-207

Monensine B,

(S)~1-phényl-

éthyluréthane

116-120

Monensine A, uréthane cyclohexyl-

110-123

Monensine A, 2-(phényl)-cyclopropyl uréthane

119-124-

'

Monensine A, uréthane

4—fluorophényl-

199-223

Monensine A, uréthane

4—nitrophényl-

189-192

+ 104-, 7 ( 1/o 1CH j CN)

Monensine A, uréthane

4—méthylphényl-

220

+ 59,6(1%,CHCI5) + 67,6(l/a,CHCl^)

Monensine A, uréthane

4—iodophényl-

203-206

Monensine A,

n-butyluréthane

+ 59,2(1%,CHC15)

Monensine A, uréthane

4--phé n oxyph é ny 1

210-213

+ 67,9(1#,CHCI5)

Exemple 9

FORMULATIONS DE COMPRIMES : (granulation humide) N° Ingrédients

1. Monensine B phénéthyluréthane ou Monensine A phénéthyluréthane

2. Lactose

3. Amidon modifié

4-. Amidon prégélatinisé

5. Eau distillée q.s.

6. Stéarate de magnésium

Poids du comprimé

mg/comprimé mg/comprimé mg/comprimé

15

188 25 20

30

173 25 20

60

188 30 20

250 mg

250 mg

300 mg

PROCEDE :

1) Mélanger les n° 1-4- dans un mélangeur approprié.

2) Granuler avec suffisamment d'eau distillée pour obtenir une consistance convenable, Moudre.

3) Sécher dans un four approprié.

4) Moudre et mélanger avec le stéarate de magnésium.

5) Comprimer sur une presse appropriée équipée de poinçons convenables pendant 3 minutes.

EXEMPLE 10

FORMULATIONS DE COMPRIMES : (Compression directe)

N° Ingrédients mg/comprimé mg/comprimé mg/comprimé

1. Monensine B phé.né thyluré thane ou 15 30 60 monensine A phénéthyluréthane

2. Lactose 207 192 162

3. Avicel 4-5 45 45

4. Amidon compression directe 30 30 30

5. Stéarate de magnésium 3 3 3 ^

Poids du comprimé 300 mg 300 mg 300 mg

PROCEDE :

1)' Mélanger le n° 1 avec une quantité égale de lactose. Bien mélanger.

2) Mélanger avec les n° 3, 4, et le reste du n° 2. Bien mélanger.

3) Ajouuer le stéarate de magnésium et mélanger pendant 3 minutes.

4) Comprimer sur un poinçon approprié.

i

Exemple 11

FORMULATIONS DE CAPSULES :

II 1.

Ingrédients Monensine B phénéthyluréthane ou mg/capsule mg/capsule mg/capsule monensine A phénéthyluréthane

15

3°

60

2. Lactose

239

224

194

3. Amidon

30

30

30

4. Talc

15

15

15

5. Stéarate de magnésium

1

1

1

Poids des capsules remplies

300 mg

300 mg o o ro*

PROCEDE :

1) . Mélanger les n° 1-3 dans un mélangeur approprié.

2) Ajouter le talc et le stéarate de magnésium et mélanger pendant un court instant,

3) Encapsuler sur une encapsuleuse appropriée.

J?

-42-

Exemple 12

Aliment pour animaux destiné à être appliqué selon l'invention :

Tel quel Base matière sèche o/o en poids o/o en poids

Silage de maïs 21,6 10,7

Maïs roulé séché 70,7 80,0

Supplément protéique 7*7 9)3

Supplément protéiaue

Foin de luzerne 15)4-9

Graine de sorgho roulé sec . 3)72

Farine de semence de coton 63)56

Calcaire 8,97

Sel (NaCl) 3)4-0

Minéraux à l'état de traces 0,11

Prémélange de vitamine A 0,13

KCl 4,36 Monensine A phénéthyluréthane

Prémélange (15 o/o en poids) 0,26

100,00

Monensine A phénéthyluréthane prémélange

Momensine A phénéthyluréthane Enveloppes de grains de riz

-43-

Claims (1)

1. revendications

   1 ~ Procédé de préparation de dérivés d'uré-5 thane de formule générale

   10

   tëeO

   Me^°2ïï

   o/\ ^0^

   R£

   R HNOCO

   OH

   ^ ' j où R est un aryle, un alcoylaryle, un haloaryle, un nitroaryle, un alcoxyaryle, un aryloxyaryle, un acyl-

   arylé,'un alcoyle, un cycloalcoyle, un arylalcoyle,

   2

   un haloarylalcoyle, ou un arylcycloalcoyle; et R est un méthyle ou un éthyle,

   20 et leurs sels pharmaceutiquement acceptables,

   qui consiste à faire réagir un composé de formule générale

   25

   30

   MeO

   Me

   OH

   35

   où R est un méthyle ou un éthyle avec un isocyanate de formule

   R1~ÎTC0 III

   où R est tel que ci-dessus.

   «h

   -44-

   2 - Procédé selon la revendication 1 de prépa-

   A

   ration de composés où R est un aryle, un alcoylaryle, un haloaryle, un nitroaryle, un alcoxyaryle, un aryloxyaryle, un acylaryle ou un cycloalcoyle, où l'on utilise 5 un isocyanate de départ de formule III substitué de façon correspondante.

   3 - Procédé selon la revendication 1 de prépa-

   A

   ration de composés où R est un aryle, un alcoylaryle ou un haloaryle, où l'on utilise un isocyanate de for-10 mule III de départ substitué de façon correspondante.

   4 - Procédé selon l'une auelconque des reven-

   2

   dications 1-3 de préparation de composés où R est un éthyle, où l'on utilise un composé de départ de formule II substitué de façon correspondante. 15 5 - Procédé selon l'une quelconque des reven-

   dications 1-4 de préparation de' composés où R est un phényle ou un halophényle, où l'on utilise un isocyanate de départ de formule III substitué de façon correspondante .

   20 6 - Procédé selon la revendication 5 de prépa-

   1 p ration de composés où R est un phényle et R est un éthyle, où l'on utilise des produits de départ de formules II et III substitués de façon correspondante.

   7 - Procédé selon la revendication 5 de prépa-

   *1 2;25 ration de composés où R est un 4-chlorophényle et R;est un éthyle, où l'on utilise des produits de départ de formules II et III substitués de façon correspondante .;8 - Procédé selon la revendication 5 de prépa-;1 _ p;30 ration de composés où R est un 4-bromophényle et R;est un éthyle, où l'on utilise des produits de départ de formules II et III substitués, de façon correspondante.;9 - Procédé selon la revendication 5 de prépa-;1 - 2;ration de composés où R est un 4-fluorophényle et R;35 est un éthyle, où l'on utilise des produits de départ;-45-;de formules II et III substitués de façon correspondante .;10 - Procédé selon 1Revendication 5 de prépa-;1 2;ration de composés où R est un 4-nitrophényle et R;5 est un éthyle, où l'on utilise des produits de départ de formules II et III substitués de façon correspondante .;11 - Procédé selon les revendications 1 ou 4-de préparation de composés où R est un phénéthyle, où;10 l'on utilise un produit de départ de formule III substitué de façon correspondante.;12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, où l'on ajoute 1'isocyanate de formule III en léger excès, par exemple environ 10 °/o,;15 13 - Procédé selon les revendications 1 ou 4;de préparation de composés où R est un phénéthyle, qui implique de cultiver une sous-culture de l'une des souches- Streptomyces sp. X-14667 NRRL 11336 (ATCC 31551) Streptomyces sp. X-14573 NRRL 11337 (ATCC 31552) et 20 Streptomyces sp. X-14575 HRRL 11338 (ATCC 31553) dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone contenant un agent nutritif azoté dans des conditions aérobies submergées puis d'isoler le produit final à partir de ladite solution.;25 14 - Procédé de préparation de préparations pharmaceutiques, destinées particulièrement à être appli quées comme agents contre les maladies bactériennes, la coccidiose, l'hypertension, la malaria et/ou la dysenterie des porcs, qui implique d'incorporer un 30 composé de formule I ou son sel pharmaceutiquement acceptable dans une formulation galénique.;15 - Procédé de préparation de pré-mélanges ou de compositions destinées à être facilement consommées, qui augmente l'efficacité de l'utilisation de la 35 nourriture chez les ruminants et les animaux mono-;V);—Z{-6~;gastriques qui font fermenter les matières végétales fibreuses dans le caecum, qui implique d'incorporer un composé de formule I ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables dans une formulation sans danger pour 5 lesdits animaux, de préférence dans la nourriture pour .animaux,;16 - Préparation pharmaceutique qui contient un composé de formule I ou son sel pharmaceutiquemont acceptable.;10 17 - Préparation pharmaceutique pour le traite ment et la prophylaxie des maladies bactériennes, de la coccidiose, de l'hypertension, de la malaria et/ou de la dysenterie des porcs, qui contient un composé de formule I ou son sel pharmaceutiquement acceptable.;15 18 - Pré-mélange ou composition destinée à être facilement consommée, augmentant l'efficacité de l'utilisation de la nourriture chez les ruminants et les animaux monogastriques qui font fermenter les matières végétales fibreuses dans le caecum, qui contient un com-;20 posé de formule I ou son sel pharmaceutiquement acceptable .;19 - Dérivés d'uréthane de formule générale;25;30;MeO;OH;35;où H est un aryle, un alcoylaryle, un haloaryle, un nitroaryle, un alcoxyaryle, un aryloxyaryle, un acylaryle, un alcoyle, un cycloalcoyle, un arylalcoyl^;h;-47-;2;un haloarylalcoyle, ou un arylcycloalcoyle; et R est un méthyle ou un éthyle,;et leurs sels pharmaceutiquement acceptables,;qu'ils soient préparés selon le procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1-11 ou par un équivalent chimique évident de ce procédé.;20 - Composé de la revendication 19, où R est un aryle, un alcoylaryle, un haloaryle, un nitroaryle, un alcoxyaryle, un aryloxyaryle, un acylaryle ou un cycloalcoyle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 2 ou par un équivalent chimique évident de ce procédé.;21 - Composé de la revendication 19) où R est un aryle, un alcoylaryle, ou un haloaryle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 3 ou par un équivalent chimique évident de ce procédé.;22 - Composé de l'une quelconque des revendi-;v 2;cations 19-21 où R est un éthyle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans IRevendica-tion 4 ou par un équivalent chimique évident de ce procédé.;23 - Composé de l'une quelconque des revendi-;A;cations 19-22, où R est un phényle, ou un halophényle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 5 Par un équivalent chimique évident de ce procédé.;A;24 - Composé de la revendication 23, où R est un phényle et R est un éthyle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 6;ou par un équivalent chimique évident de ce procédé.;A;25 - Composé de la revendication 23 où R est un 4-chlorophényle et R est un éthyle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 7 ou par un équivalent chimique évident de ce procédé.;-48-;26 - Composé de la revendication 23 où R est o;un 4-bromo-ph.énylc et R est un éthyle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 8 ou par un équivalent chimique évident de ce 5 procédé.;1;27 - Composé de la revendication 23 où R est o;un 4-fluorophényle et R est un éthyle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 9 ou par un équivalent chimique évident de ce 10 procédé.;1;28 - Composé de la revendication 23 où R est;2;un 4-nitrophényle et R est un éthyle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 10 ou par un équivalent chimique évident de ce 15 procédé.;29 - Composé de la revendication 19 ou 22, où;y\;R est un phénéthyle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 11 ou par un équivalent chimique évident de ce procédé. 2C 30 - Composé selon la revendication 19 ou 22,;A;où R est un phénéthyle, qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 13 ou par un équivalent chimique évident de ce procédé.;31 - L'invention telle que décrite ci-dessus. ORIGINAL;en itl pages contenant _ Renvois;- mof ajouté mot ravé;!AU;Conseil en Propriété Industrielle;26 b'*, Boul. Princesse Charlotte MONTE-CARLO » Par procuration h