MC2002A1

MC2002A1 - Polypeptides interleukines-1alpha humaines recombines

Info

Publication number: MC2002A1
Application number: MC892025A
Authority: MC
Inventors: T Lomedico Peter
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1988-01-15
Filing date: 1989-01-12
Publication date: 1990-01-26
Also published as: AU616461B2; NO890174L; JPH025892A; IL88934A0; EP0324447B1; AR245958A1; FI890175A7; AU2850989A; GR3021887T3; YU6889A; HUT50505A; JP2567079B2; IL88934A; DE58909723D1; EP0324447A2; ES2091752T3; FI890175L; EP0324447A3; PT89438B; HU208996B

Description

1

5

10

15 Polypeptides inter1eukinés-1 a humaines recombinés

Deux formes d'interleukine-1 humaine sont.connues, la forme dite a et la forme dite 3 (March et al. Nature 315, 641-647 [1985]). L'analyse de la séquence 20 nucléotidique d'un ADN codant pour 1'inter1eukine-1 a humaine (hIL-la) a révélé un grand cadre de lecture ouvert de 271 acides aminés, correspondant à un polypeptide précurseur de hIL — 1 ot ayant un poids moléculaire de 30 606 Dalton. La séquence nucléotidique et la sé-25 quence des acides aminés du polypeptide précurseur de hIL-1a telles qu'elles sont déterminées par Gubler et al., J.Immunol. 136, 2492-2497 (1986) sont montrées sur les Fig. 1 a/1b.

30 Lademandede brevet européen, Publication n°188

864 révèle que la partie C-terminale du polypeptide précurseur de hIL-1a s'étendant du résidu Ser en position 113 au résidu Ala en position 271 (Fig. 1a/1b) est bio-logiquement active. La demande de brevet européen, 35 Publication n° 188 920 décrit un polypeptide précurseur

2

de hIL-1a dont la séquence d' acides aminés diffère de la séquence d?-: acides aminés montrée à la Fig. 1a/ 1b, ayant un résidu Ser en position 114 au lieu d'un résidu Ala, ce résidu Ser étant codé par le codon TCA.

5 La demande de brevet européen n° 188 920 décrit de plus la préparation de divers polypeptides hIL-1a, notamment les polypeptides hIL-1a ayant une séquence d'acides aminés s'étendant des position 63 à 271, 113 à 271, 115 à 271, 123 à 271, 127 à 271, 128 à 271, 129 à 271, 113 10 à 267, 113 à 264, 113 à 266, 113 à 265 et 128 à 267 de la séquence d'acides aminés montrée Fig. 1a/lb, mais où, comme mentionné plus haut, le résidu alanine, lorsqu'il est présent, est remplacé par un résidu sérine.La demande de brevet européen, Publication n° 200 986 décrit la 15 préparation d'un polypeptide hIL-1a recombiné ayant une séquence d'acides aminés s'étendant de la position 118 à 271 et ayant un résidu méthionine en position 117, cette méthionine étant dérivée du codon ATG utilisé pour exprimer un fragment d'ADN codant pour la séquence 20 d'acides aminés de la position 118 à la position 271.

Etant donné que le polypeptide hIL-1a naturel a un résidu serine en position 117, le polypeptide hIL-1a recombiné préparé comme décrit dans la demande de brevet européen, Publication n° 200 986 est différent, à l'extrémité 25 N-termin,ale, d'un polypeptide hIL-1ct mature' naturel correspondant, isolé d'un liquide de l'organisme humain ou d'un surnageant dlune culture de cellules humaines. La présence de l'extrémité N-terminale modifiée dans le polypeptide hIL-1a recombiné peut induire des effets 30 secondaires chez un patient traité par ledit polypeptide recombiné. Pour éviter ces effets secondaires, des moyens ont été recherchés pour des méthodes de préparation de polypeptides hIL-1a recombinés ayant une séquence d'acides aminés qui est identique à la séquence 35 d'acides aminés de l'hIL-1a mature naturelle. Il a été

1

3

trouvé que, de façon surprenante, le polypeptide hIL-1a mature recombiné ayant la séquence d'acides aminés

Ser

Phe

Leu

Ser

Asn

Val

Lys

Tyr

Asn

Phe

MET

Arg

Ile

Lys

Tyr

Glu

Phe

Ile

Leu

Asn

Asp

Ala

Leu

Asn

Gin

Ser

Ile

Arg

Ala

Asn

Asp

Gin

Tyr

Leu

Thr

Ala

Leu

His

Asn

Leu

Asp

Glu

Ala

Val

Lys

Phe

Asp

MET

Gly

Ala

Tyr

Lys

Ser

Lys

Asp

Ala

Lys

Ile

Thr

Val

Ile

Leu

Arg

Ile

Ser

Lys

Thr

Gin

Leu

Tyr

Val

Thr

Ala

Gin

Asp

Glu

Asp

Gin

Pro

Val

Leu

Lys

Glu

MET

Pro

Glu

Ile

Pro

Lys

Thr

Ile

Thr

Gly

Ser

Glu

Thr

Asn

Leu

Phe

Trp

Glu

Thr

His

Gly

Thr

Lys

Asn

Tyr

Phe

Thr

Ser

Val

Ala

His

Pro

Asn

Leu

Phe

Ile

Ala

Thr

Lys

Gin

Asp

Tyr

Trp

Val

Cys

Leu

Ala

Gly

Pro

Ser

Ile

Thr

Asp

Phe

Gin

Ile

Leu

Glu

Asn

Gin

Ala

(I)

cette séquence d'acides aminés correspondant à la séquence d'acides aminés s'étendant de la position 117 15 à 271 de la séquence d'acides aminés montrée Fig. 1a/1b et le polypeptide hIL-1a mature recombiné ayant la séquence d'acides aminés

Ser

Asn

Val

Lys

Tyr

Asn

Phe

MET

Arg

Ile

Lys

Tyr

Glu

Phe

Ile

Leu

Asn

Asp

Ala

Leu

Asn

Gin

Ser

Ile

Arg

Ala

Asn

Asp

Gin

Tyr

Leu

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Àla

Ala

Leu

His

Asn

Leu

Asp

Glu

Ala

Val

Lys

Phe

Asç

MET

Gly

Ala

Tyr

Lys

Ser

Lys

Asp

Ala

Lys

Ile

Thr

Val

Ile

Leu

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Ile

Ser

Lys

Thr

Gin

Leu

Tyr

Val

Thr

Ala

Gin

Asp

Glu

AS£

Gin

Pro

Val

Leu

Lys

Glu

MET

Pro

Glu

Ile

Pro

Lys

Thr

Ile

Thr

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Ser

Glu

Thr

Asn

Leu

Phe

Trp

Glu

Thr

His

Gly

Thr

Lys

Asn

Tyr

Phe

Thr

Ser

Val

Ala

His

Pro

Asn

Leu

Phe

Ile

Ala

Thr

Lys

Gin

Asp

Tyr

Trp

Val

Cys

Leu

Ala

Gly

Pro

Ser

Ile

Thr

AS£

Phe

Gin

Ile

Leu

Glu

Asn

Gin

Ala

(II)

cette séquence d'acides aminés correspondant à la séquence d'acides aminés s'étendant de la position 120 à 271 de la séquence d'acides aminés montréeFig. 1a/1b, peuvent être produits dans un organisme unicellulaire sans le résidu méthionine N-terminal.

Ainsi, la présente invention propose des polypeptides interleukines-1a humaines recombinés homo-35 gènes ayant la séquence d'acides aminés (I) ou (II),

4

des ADN codant pour lesdits polypeptides, des vecteurs recombinants contenant un ADN codant pour chacun desdits polypeptides et un organisme uni ce 11u1 aire contenant un tel vecteur recombinant, cet organisme uni-5 cellulaire étant capable d'exprimer ladite séquence.

De plus, la présente invention concerne un procédé de production desdits polypeptides inter1eukines-1 a, des compositions pharmaceutiques comprenant un tel polypeptide et l'utilisation desdits polypeptides ou com-10 positions pharmaceutiques pour stimuler le système immunitaire d'un sujet hôte, pour activer la cicatrisation des plaies et pour améliorer le rétablissement de patients carences en protéines, dans un état de

*

santé critique.

1 5

Les polypeptides de la présente invention peuvent être obtenus par des méthodes classiques de synthèse de peptides en phase liquide ou, de préférence, en phase solide, telles que les méthodes de Merrifield 20 (J.Am.Chem.Soc. 8_5, 2149-2154 [1963]) ou par d'autres méthodes équivalentes modernes.

Ou encore, et de préférence, les polypeptides de la présente invention sont obtenus en utilisant des 25 méthodes de la technique de recombinaison de 1 'ADN.

Pour cela, un organisme unicellulaire contenant un vecteur recombinant contenant une séquence d'ADN codant pour un polypeptide interlBukine-^a humaine mature de la présente invention est cultivé dans des condi-■*0 tions appropriées pour l'expression de ladite séquence d'ADN et le polypeptide interleukine-1a produit par l'organisme unicellulaire est isolé de la culture.

Cet organisme unicellulaire peut être une cellule 35 procaryote ou eucaryote. Un grand nombre de tels

5

organismes unicellulaires peuvent s'obtenir dans le commerce ou librement dans des dépôts tels que 1'"American Type Culture Collection" (ATCC) qui se trouve 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA.

5 Des exemples de cellules porcaryotes sont des bactéries telles que E. coli [p.ex. E. coli M15 décrit comme DZ291 par Villarejo et al. dans J. Bacteriol. 120, 466-474 [1974], E. coli 294 (ATCC n° 31446), E. coli RR1 (ATCC n0 31 343) ou E. coli W3110 (ATCC n° 27325)], des 10 bacilles tels que B. subtilis et des Enterobacteriaceae parmi lesquelles peuvent être mentionnés comme exemples Salmonella typhimurium et Serratia marcescens. La souche d'E. coli spécialement préférée est la souche MC1061 contenant le plasmide pRK248cITs (voir Exemple). Ou 15 encore, des cellules de levures telles que Saccharomyces cerevisiae peuvent être utilisées comme organismes hôtes. De nombreuses cellules eucaryotes convenant comme organismes hôtes pour les vecteurs recombinants sont connues du spécialiste en la matière. Des cellules de mammifères 20 telles que CV-1 (ATCC n° CCL 70) et ses dérivés tels que C0S-1 (ATCC n° CRL 1650) ou C0S-7 (ATCC n° CRL 1651) sont utilisées de préférence. De plus, il est possible d'utiliser des cellules d'insectes comme le décrivent Smith et al. (Mol.Cell.Biol. 2, 2156-2165 [1983]).

25

Diverses méthodes pour introduire les vecteurs recombinants dans les organismes unicellulaires sont connues. Des exemples de telles méthodes sont la micro-injection, la transfection ou la transduction. Le spécia-30 liste en la matière n'éprouve aucune difficulté à

choisir la méthode la plus appropriée pour l'organisme hôte spécifique utilisé.

Les vecteurs recombinants utilisés dans la présente 35 invention sont des vecteurs contenant unADN codant pour

%

6

le polypeptide hIL-1a de la présente invention, notamment les ADN ayant la séquence nucléotidique de la position 385 à la positio 852 ou de la position 394 à la position 852 de la séquence nucléotidique représentée Fig.

5 1a/1b. Un tel ADN peut être synthétisé par des méthodes chimiques classiques, p.ex. par la méthode du phospho-triester qui est décrite par Narang et al. dans Meth. Enzymol. 6J3, 90-108 [1979], ou par la méthode du phospho-diester (Brown et al., Meth. Enzymol. 6_8, 109-151 10 [1979]). Dans les deux méthodes, de longs oligonucléoti-des sont d'abord synthétisés, puis liés ensemble d'une manière prédéterminée. La séquence nucléotidique de 1'ADN peut être identique aux séquences nucléotidiques mentionnées ci-dessus ou bien elle peut être partielle-15 ment ou complètement différente. Ceci est dû au fait que le code génétique est dégénéré, ce qui signifie qu'un acide aminé peut être codé par plusieurs codons. Les codons choisis peuvent être adaptés à l'usage du codon préféré de l'organisme hôte utilisé pour exprimer le 20 polypeptide hIL-1a (Grosjean et al., Gene J_8 , 1 99-209

[1982]). Il faut veiller à ce que 1'ADN obtenu de cette façon ne contienne pas de séquences partielles qui rendent la construction du vecteur recombinant difficile, p.ex. en introduisant un site de clivage d'une 25 enzyme de restriction indésirable, ou qui empêche l'expression du polypeptide.

L'ADN codant pour le polypeptide hIL-1a de la présente invention peut également être préparé en isolant 30 un ADN codant pour le polypeptide précurseur de hIL-1a d'une banque d'ADNc humains ou d'une banque de génomes humains selon des procédés connus dans la profession (p.ex. March et al., supra; Gubler et al., supra), puis en ajustant 1'ADN à la taille et à la séquence nucléoti-35 dique voulues en utilisant des endonucléases de restric

7

tion et éventuellement de petits o1igonuc1éotides synthétiques selon des méthodes bien connues de la technologie de recombinaison de l'ADN.

5 Un grand nombre de vecteurs tels que ceux mention nés dans la demande de brevet européen, Publication n° 200 986 peuvent être utilisés pour construire les vecteurs recombinants mentionnés ci-dessus. Ces vec-•teurs contiennent les éléments nécessaires pour la trans-10 cription et la traduction de l'ADN codant pour le polypeptide hIL-1a de même que les éléments nécessaires pour le maintien et la réplication du vecteur dans l'hôte. Le choix d'un vecteur approprié pour construire les vecteurs recombinants de la présente invention et 15 le choix d'un organisme hôte .unicellulaire compatible avec lesdits vecteurs recombinants entrent dans les compétences d'une personne travaillant dans le domaine.

Ou encore et de préférence, les vecteurs recombi-20 nants de la présente invention sont préparés en modifiant les vecteurs recombinants contenant un ADN codant pour un polypeptide hIL-1a en utilisant la méthode de mutagenèse dirigée sur un site spécifique par un oligo-nucléotide, décrite par Morinaga et al., BI0/TECHN0L0GY 25 2_, 636-639 (1984). Un exemple d'un tel vecteur recombinant contenant un vecteur et un ADN codant pour un polypeptide hIL-1a est le plasmide phil ^1-154*. La construction de ce plasmide est décrite dans la demande de brevet européen, Publication n° 200 986.

30

La manière dont l'expression des polypeptides conformément à l'invention est réalisée dépend du vecteur d'expression et de l'organisme hôte utilisé. Habituellement les organismes hôtes qui contiennent le vecteur 35 d'expression sont cultivés dans des conditions qui sont

8

optimales pour la croissance de l'organisme hôte. Vers la fin de la croissance exponentielle, lorsque l'augmentation du nombre de cellules par unité de temps diminue, l'expression du polypeptide de la présente invention 5 est induite, c'est-à-dire que l'ADN codant pour le polypeptide est transcrit et l'ARNm transcrit est traduit. L'induction peut être réalisée en ajoutant un inducteur ou un dérepresseur au milieu de croissance ou en altérant un paramètre physique, p.ex. par un changement de 1 0 température.

Le polypeptide produit dans les organismes hôtes peut être sécrété hors de la cellule par des mécanismes de transport spéciaux ou bien il peut être isolé en 15 brisant la cellule pour l'ouvrir. La cellule peut être ouverte- ainsi par des moyens mécaniques (Charm et al., Meth. Enzymol. 22_, 476-556 [1971]), enzymatiques (traitement par le lysozyme) ou chimiques (traitement par un détergent, traitement par l'urée ou la guanidine-HCl, 20 etc.) ou par une combinaison de ces moyens.

Dans les eucaryotes, les polypeptides qui sont sécrétés à partir de la cellule sont synthétisés sous forme d'une molécule précurseur. Le polypeptide 25 mature est obtenu en séparant ce que l'on appelle le peptide signal. Etant donné que les organismes hôtes pro-caryotes ne sont pas capables de séparer les peptides signaux e.ucaryotes des molécules précurseurs, les polypeptides eucaryotes doivent être exprimés directement 30 sous leur forme mature dans les organismes hôtes pro-caryotes. L'AUG signal du début de la traduction, qui correspond au codon ATG au niveau de l'ADN, fait que tous les polypeptides sont synthétisés dans un organisme hôte procaryote avec un résidu méthionine à l'extrémité 35 N-terminale. Dans certains cas, suivant le système

9

d'expression utilisé et dépendant peut-être du polypeptide devant être exprimé, ce résidu méthionine N-terminal est séparé.

5 Les polypeptides selon la présente invention peuvent être purifiés jusqu'à l'homogénéité par des méthodes connues telles que, par exemple, par centrifuga-tion à différentes vitesses, par précipitation au sulfate d'ammonium, par dialyse (sous pression normale ou sous 10 pression réduite), par concentration isoélectrique pré-parative, par électro.phorèse en gel préparative ou par diverses méthodes chromatographiques telles que filtra-tion sur gel, chromatographie liquide haute performance (HPLC), chromatographie par échange d'ions, chromatogra-

15 phie en phase inversée et chromatographie d'affinité

TM

(p.ex. sur Sepharose Blue CL-6B ou sur des anticorps monoclonaux liés au substrat dirigés contre un.polypeptide hIL-1a ).

20 Les polypeptides hIL-1a recombinés de la présente invention peuvent être utilisés d'une manière connue en soi pour stimuler le système immunitaire d'un sujet hôte comme, par exemple, en améliorant la réponse de défense de l'hôte à des germes pathogènes, en agissant comme un 25 adjuvant vaccinal et en stimulant la défense de l'hôte contre des maladies cancéreuses. D'autres utilisations cliniques identifiées pour hIL-1a dans le domaine comprennent l'activation de la cicatrisation des plaies par la stimulation de la prolifération des fibroblastes et 30 l'amélioration du rétablissement des patients carences en protéines, dans un état de santé critique.

Des polypeptides hIL-1 a homogènes préparés conformément à la présente invention peuvent être administrés 35 à des mammifères à sang chaud pour les emplois cliniques

10

indiqués plus haut. L'administration peut se faire par toute méthode habituelle, c'est-à-dire par administration parentérale, par vois intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire. Il est évident que la dose nécessaire 5 variera avec l'état particulier traité, la gravité de l'état, la durée du traitement et la méthode d'administration. Une forme convenant à l'usage pharmaceutique peut être obtenue à partir d'un polypeptide hIL-la lyophilisé, filtré jusqu'à stérilité, reconstitué avant 10 l'emploi d'une manière habituelle. Cela entre également dans les compétences de celui qui travaille dans le domaine de préparer des compositions pharmaceutiques contenant une interleukine-la humaine homogène de la présente invention en mélangeant ladite interleukine-la 15 avec des substrats compatibles pharmaceutiquement acceptables tels que tampons, stabilisateurs, bactériostati-ques et autres excipients et additifs habituellement utilisés dans les formes pharmaceutiques pour administration parentérale.

20

Exemple

La méthode de mutagenèse dirigée sur un site spécifique par un oligonucléotide, décrite par Morinaga et 25 al., BI0/TECHN0L0GY 2, 636-639 (1984, a été -utilisée pour muter le plasmide phil ^1-154* (demande de brevet européen, Publication n° 200 986) pour produire des gènes codant codant pour des polypeptides hIL-1a ayant une séquence d'acides aminés s'étendant de la position 30 117 à 271, 119 à 271 et 120 à 271 de la Fig. 1a/1b.

Pour réaliser ces procédés, des oligonucléotides synth-tiques ayant les séquences nuc1éotidiques

35

11

GGA ATT AAT ATG AGC TTC CTG AGC

GGA ATT AAT ATG CTG AGC AAT GTG

5 GGA ATT AAT ATG AGC AAT GTG AAA

ont été produits par la méthode du support solide de phosphoramidite de Matteucci et al., 3.Am.Chem.Soc. 103, 3185-3191 (1981).

Le plasmide /1-154* a été transformé en forme discontinue en utilisant BglII et Sali et en forme linéarisée en utilisant Pstl. Des hétérologues discontinus ont été créés. Dans trois réactions séparées, les oli-.gonucléotides ci-dessus ont été soudés, transformés en forme double brin et liés et inclus dans E. coli K — 12 souche MC1061 (Casadaban et al., j.Mol.

Biol. 138, 179-207 [1980]) contenant le plasmide pRK248cIts (Bernard et al., Leth.Enzym. 6_8, 482-492 [1979]) en utilisant une méthode au CaC^ (Maniatis et al., in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" [1982]). E. coli MC1061 et le plasmide pRK248cIts peuvent être obtenus à 1'"American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, sous les numéros respectifs d'enregistrement ATCC n° 53338 et ATCC n0 33766.

Les colonies contenant la mutation voulue ont été

identifiées par hybridation comme décrit par Maniatis et al. (plus haut, pp. 312-315). Les mêmes oligonucléo-

tides que ceux utilisés pour la mutagenèse dirigée par une amorce spécifique ont été utilisés comme sondes pour les hybridations après marquage de l'extrémité 5'

3 2

avec y- P-ATP en utilisant la polynucléotide kinase 35 selon le procédé de Maniatis et al., ci-dessus, p.396.

(O. 117). (O. 119) (O. 120)

10

1 5

20

25

°t\

12

20

25

L1oligonucléotide (0. 117) a dirigé la conversion de phil M 1-154* en pHuIL-1a (117-271) avec la modifies tion de séquence suivante:

code pour acides aminés supplém.

1

118 119 120 121

phil #1-154* ATGAATAGAATTCGGATCCGC TTC CTG AGC AAT Met Phe Leu Ser Asn

10 117 118 119 120

pHuIL-la (117-271) GGAATTAATATG AGC TTC CTG AGC

Met Ser Phe Leu Ser

De la même façon, 1 ' oligonucléotide (0. 119) a créé 15 pHuIL-la (119-271) avec la séquence suivante:

119 120 121 122 GGAATTAATATG CTG AGC AAT GTG Met Leu Ser Asn Val;

et 11oligonucléotide (0. 120) a produit pHuIL-1a (12 0— 271) avec la séquence suivante:

120 121 122 123 GGAATTAATATG AGC AAT GTG AAA Met Ser Asn Val Lys.

L'analyse des séquences d'ADN a confirmé les mutations ci-dessus.

■50

E. coli MC1 061 /pRK248c I ts contenant phil 1-154 (voir demande de brevet européen, Publication n°200 986, capable d'exprimer hIL — 1 ot (118-271)), pHuIL-la (117-271), pHuIL-1ct (119-271) et pHuIL-1a ( 1 20-271 ont été cultivés 35 sur des milieux M9 (Mabiatis et al., ci-dessus, p.68-69)

1 3

contenant de 11ampicilline à 30°C jusqu'à ce que l'ab-sorbance à 550 nm (A^g) ait atteint 0,7, moment où les cultures ont été déplacées à 42°C pendant 3 heures. Les cellules bactériennes de 1 ml de culture ont été re-5 cueillies par centrifugation et solubilisées dans 50 ul de guanidine-HCl 7 M. Les extraits bactériens bruts ont été analysés pour déterminer la bioactivité de l'inter-leukine-1 en utilisant le test de prolifération des thymocytes murins de Mizel et al., J.Immunol. 120, 10 1497-1508 (1978). Les quatre extraits étaient actifs.

Les corps d'inclusion cytoplasmiques insolubles ont été isolés des quatre cultures induites, purifiés comme décrit ci-dessus, solubilisés et soumis à une 15 électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (Laemmli,

Nature 227, 680-685 [1970]). La principale bande d'inter-leukine-1a a été éluéeà partir de chaque gel à l'aide de la méthode d'Aebersold et al., J. Biol. Chem. 261, 4229-4238 (1986) et soumise à une analyse de la séquence 20 d'acides aminés N-terminale à l'aide de la méthode de

Hewick et al., J.Biol.Chem. 256, 7990-7997 (1981), avec les résultats suivants après 10 cycles:

hIL-1 g (117-271 ) :

Ser'

Phe,

Leu Ser Asn

Val

Lys

Tyr

Asn

Phe hlL-

1 a

018-271):

Met

Phe

Leu Ser Asn

Val

Lys

Tyr

Asn

Phe h IL -

1 a

(119-271):

Met Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met

35

hIL-1a (120-271):

Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg Ile

14

Il est facile de voir que la méthionine d'induction à été séparée de hIL-1ot (117-271) et de hIL-1a (120-271) mais non de hIL-1a (119-271) ou de hIL-1a (118-271 ) .

5

Pour une étude plus approfondie des polypeptides hIL-1ahIL-1a (117-271), hIL-1a (118-271) et hIL-1a (120-271), la purification des fractions surnageantes des lysats des transformants MC1061/pRK248c 11s 10 hébergeant pHuIL-1a (117-271), phil =/1-154 et pHuIL-1a (120-271) a été effectuée de la façon suivante :

1. Des cultures contenant 5 kg de chaque transfor-15 mantont été ajustées à PH 1,8 avec H^SO^ et maintenues à température ambiante pendant 30 minutes à 1 heure, et les cellules tuées par l'acide ont été récupérées par centri fugation.

20 2. Les cellules tuées par l'acide ont été mises en suspension dans 18 litres d'eau et agitées pendant 1 heure à température ambiante à l'aide d'un agitateur mécanique à pales.

25 3. Le matériel en suspension a été filtré sur 2

morceaux de tissu de fromagerie à double couche pour enlever les débris cellulaires.

4. On a fait passer le matériel filtré deux fois 30 par un homogénéisateur de cellules Manton-Gaulin (Meth. Enzymol. 2_2, 482-484 [1971]) fonctionnant à 8 000 psi (env. 5,5 x 10^ Pa), d'abord à 15°C puis à environ 30°C .

35 5. Le matériel a été centrifugé dans une centri

1 5

fugeuse Sorvall (Du Pont, Wilmington, Delaware, USA) à 4°C pendant 1 heure à 8 000 t/min, en utilisant un rotor GS-3 (Du Pont). Environ 16,6 litres de liquide surnageant ont été recueillis et le culot a été rejeté.

6. Le liquide surnageant a été filtré sur un filtre Sartorius de 0,8/0,2 micron, (pouvant être obtenu chez Sartorius Filters Inc., Hayward, California, USA ou chez Sartorius-Membranfi1ter GmbH, D-3400 Gottin-gen), après quoi le pH a été ajusté à 3,0 avec une solution à 5 0% (v/v) d'hydroxyde de sodium.

7. Le liquide surnageant a été chargé sur une colonne de silice Nugel P-SP de 10 x 40 cm (un échangeur de cations su 1fopropyle : 40-60 microns, 200 Angstrom: Séparation Industries, Metuchen, New Jersey, USA) qui avait été équilibrée avec de l'acide acétique 0,02 M. Après application de l'échantillon, la colonne a été lavée avec 31 litres d'acide acétique 0,02 M, puis éluée avec Tris-HCl 30 mM, pH 8,0. L'effluent de la colonne a été contrôlé par spectrophotométrie à 280 nm. Deux pics de protéine ont ainsi été obtenus - un premier pic d'un volume de 4,5 litres et un pic principal de

7,5 litres.

8. Le pic principal de l'étape 7 a été chargé sur une colonne de silice Nugel P-DE de 10 x 40 cm (un échangeur d'anions diéthylaminoéthyle; 40-60 microns, 200 Angstroms: Séparation Industries) qui avait été équilibrée avec Tris-HCl 30 mM, pH 8,0. La colonne a été lavée avec 17 litres de Tris-HCl 30 mM et NaCl 0,075 M, pH 8,0, puis éluée avec 13 litres de Tris-HCl 30 mM et NaCl 0,25 M, pH 8,0. L'effluent a été contrôlé pour la présence de protéines par spectrophotométrie à une densité optique de 280 nm (D.O.^qq)- Un pic de protéines

16

de d-°*280 contenu dans un volume de 13 litres a ainsi été obtenu.

9. L'éluat de l'étape 8 a été dilué 4 fois avec

5 de l'acide acétique 3,7 mM, pH 4,8, ajusté à pH 4,8 et chargé sur une colonne HPLC NuGel P-SP de 5 x 250 cm (Séparation Industries) à un débit de 150 ml/min. La colonne a ensuite été éluée avec un gradient linéaire du pH 4,8 (acide acétique 3,75 mM) à pH 6,8 (I^HPO^ 10 10 mM) sur une période de 120 minutes, avec un débit de 75 ml/min. Un pic de D.02qq de 9,3 litres a ainsi été obtenu.

10. L'éluat de la colonne HPLC a été concentré à 15 environ 225 ml dans une cartouche à spirale Amicon,

(arrêt- au poids moléculaire de 1000, pouvant être obtenue chez Amicon, Div. of W.R. Grâce & Co., Danvers,

Massahusetts, USA), puis chargé sur deux colonnes de TM

Sephadex G-50 de 10 x 100 cm (Pharmacia Fine Chemicals, 20 Piscataway, New Jersey, USA) en série, qui avaient été équilibrées avec (^HPO^ 50 mM et NaCl 0,1 M, pH 6,8. Un pic de D.0.2gq d'un volume de 800 ml a été obtenu; il a été débarrassé des pyrogènes dans une cartouche à spirale Amicon (arrêt au poids moléculaire de 30 000). 25 Le produit final se trouvait en un volume d''environ 1,070 ml.

Sauf indication contraire, toutes les phases de purification ci-dessus ont été effectuées à 4°C, sauf 30 pour la colonne HPLC qui a été utilisée à température ambiante.

Les protéines hIL-1a (117-271), hIL-1o (118-271) et hIL-1a (120-271) ont été analysées par électro-35 phorèse sur gel de polyacrylamide SDS comme décrit plus

1 7

haut et colorées au bleu de Coomassie. Toutes se sont révélées de forme homogène.

Les déterminations d'activité biologique ont été effectuées sur les protéines purifiées en utilisant le test de prolifération des thymocytes murins D10 de Kaye et al., 3. Exp. Med. J_3_8, 836-856 ( 1 983 ) dont les résultats sont présentés dans le tableau I.

10

Tableau I

Activité des polypeptides hIL-1a

1 5

Protéine hIL-1 solubles dans homogénat brut3

(mg/kg )

Activité spécifique des protéines puri fiées (unités/mg)

20

23

h IL-1a (117-271) hIL-1a (118-271 hIL-1a (120-271

1 .800 600 600

2 x 10' 2 x 10! 2 x 105

La quantité de hIL-1a solubles dans 1 ' homogénat brut a été calculée en se basant sur un dosage immunologique utilisant des anticorps spécifiques anti hIL-1a.

Les données du tableau I (ainsi que les données présentées dans le tableau I de la demande de brevet européen, Publication n° 200 986) montrent que la lon-30 gueur exacte de la protéine n'a pas une importance critique tant que la séquence C-terminale minimum, s'étendant de la position 132 à 271 (Fig. 1a/1b) est présente dans la molécule. Toutes les protéines avaient la même activité spécifique. Les données montrent également que 35 la présence ou l'absence d'une méthionine d'initiation

- 18 -

N-terminale n'affecte pas l'activité. Le polypeptide hIL-1a (118-271) comprenant une méthionine supplémentaire à l'extrémité N-terminale était aussi actif que les autres protéines qui, toutes deux, étaient dépour-5 vues de cette méthionine.

De façon surprenante, les données du tableau I montrent également que le niveau d'expression de la protéine soluble hIL-1a (117-271) était trois fois plus 10 élevé que le niveau d'expression des protéines solubles hIL-1a (118-271) et hIL-la (120-271) bien que les gènes codant pour les protéines aient été tous dans le même vecteur et dans la même cellule hôte et que les cellules aient été cultivées et récoltées de la même façon.

15

II. sera plus facile de comprendre la présente inven tion en la considérant en liaison avec la Figure 1a/1b jointe qui montre la séquence nucléotidique et la séquen ce prévue des acides aminés de l'ADNc de 1'interleukine-20 1a humaine.

25

30

35

19

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour la préparation d'un polypepti de interleukine-1 a humaine recombiné homogène ayant la 5 séquence d'acides aminés

Ser Phe Leu Sec Asn Val Lys Tyr Asn Phe MET Arg Ile Ile Lys Tyr

Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gin Ser Ile Ile Arg Ala Asn

Asp Gin Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala Val

Lys Phe Asp MET Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile

Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gin Leu Tyr Val Thr Ala Gin

10 Asp Glu Asp Gin Pro Val Leu Leu Lys Glu MET Pro Glu Ile Pro Lys

Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp Glu Thr His

Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn Leu Phe Ile

Ala Thr Lys Gin Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gin Ile Leu Glu Asn Gin Ala

Sar

Asn

Val

Lys

Tyr

Asn

Phe

MET

Arg

Ile

Lys- Tyr

Glu

Phe

Ile

Leu

Asn

Asp

Ala

Leu

Asn

Gin

Ser

Ile

Arg

Ala-

Asn

Asp

Gin

Tyr

Leu

Thr

Ala

Leu

His

Asn

Leu

Asp

Glu

Ala

Val

Lys

Phe

Asp

MET

Gly

Ala

Tyr

Lys

Ser

Lys

Asp

Ala

Lys

Ile

Thr

Val

Ile

Leu

Arg

Ile

Ser

Lys

Thr

Gin

Leu

Tyr

Val

Thr

Ala

Gin

Asp

Glu

Asp

Gin

Pro

Val

Leu

Lys

Glu

MET

Pro

Glu

Ile

Pro

Lys

Thr

Ile

Thr

Gly

Ser

Glu

Thr

Asn

Leu

Phe

Trp

Glu

Thr

His

Gly

Thr

Lys

Asn

Tyr

Phe

Thr

Ser

Val

Ala

His

Pro

Asn

Leu

Phe

Ile

Ala

Thr

Lys

Gin

Asp

Tyr

Trp

Val

Cys

Leu

Ala

Gly

Pro

Ser

Ile

Thr

Asp

Phe

Gin

Ile

Leu

Glu

Asn

Gin

Ala

25 ce procédé comprenant

(a) la culture d'un organisme unicellulaire transformé par un vecteur reoombinant contenant un ADN codant pour ledit polypeptide dans des conditions convenant à l'expression dudit ADN; et

(b) l'isolement du polypeptide interleukine-1 a humaine à partir de la culture et sa purification jusqu'à l'homogénéité.

20

2. Procédé pour la préparation d'un polypeptide interleukine-1a humaine recombiné homogène selon la revendication 1, ayant la séquence d'acides aminés

Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe MET Arg Ile

5 Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gin Ser Ile Ile

Asp Gin Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp

Lys Phe Asp MET Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp

Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gin Leu Tyr Val

Asp Glu Asp Gin Pro Val Leu Leu Lys Glu MET Pro Glu

Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp

Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn

1Q Ala Thr Lys Gin Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly Gly

Ile Thr Asp Phe Gin Ile Leu Glu Asn Gin Ala,

ce procédé comprenant

(a) la culture d'un organisme unicellulaire transit formé par un vecteur recombinant contenant un ADN

codant pour ledit polypeptide dans des conditions convenant à l'expression dudit ADN; et

(b) l'isolement du polypeptide interleukine-1a 20 humaine à partir de la culture et sa purification jusqu'à l'homogénéité.

3. Procédé pour la préparation d'un organisme unicellulaire capable d'exprimer un polypeptide, comme

25 défini dans la revendication 1 ou 2, ce procédé comprenant la transformation d'un organisme unicellulaire d'une manière connue en soi par un vecteur recombinant contenant un ADN codant pour ledit polypeptide.

30

4. Procédé pour la préparation d'une composi tion pharmaceutique contenant un polypeptide interleukine-la humaine homogène, comme défini dans la revendication 1 ou 2, ce procédé comprenant le mélange dudit polypeptide interleukine-1a humaine avec un substrat 35 compatible, pharmaceutiquement acceptable.

Ile Lys Tyr Arg Ala Asn Glu Ala Val Ala Lys Ile Thr Ala Gin Ile Pro Lys Glu Thr His Leu Phe Ile Pro Pro Ser

21

5.' Utilisation d'un polypeptide inter1eukine-1 a humaine homogène, comme défini dans la revendication 1 ou 2, pour la préparation d'une composition pharmaceutique.

5

6. L'invention telle qu'elle est réalisée et décrite précédemment.

7. ADN codant pour un polypeptide interleukine-

10 1a , comme défini dans la revendication 1 ou 2.

8. Vecteur recombinant contenant un ADN selon la revendication 7, ce vecteur recombinant étant capable de diriger l'expression de l'ADN dans un organisme uni-

15 cellulaire compatible.

9. Vecteur recombinant choisi dans legroupe de pHuIL-1a (117-271) et pHuIL-1ct ( 120-271 ).

20

10. Organisme unicellulaire transformé par un vecteur recombinant selon la revendication 8 ou 9, cet organisme unicellulaire étant capable d'exprimer un polypeptide interleukine-1a humaine, comme défini dans la revendication 1 ou 2.

25

30

35

ORIGINAL

en pag«*»;contenant Renvoi»;mot ajouté mot ravé R"';José CURAU ^;CônfSCen Propriété Indu^^lte;26"s, Bbul. Princesse CW^otte;MONTE-CAfCr par procurai»» à*

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