JPH025892A - 組換えヒトインターロイキン―１αポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインターロイキン−１には２つの型、いわゆるα型
およびβ型が知られている（Ｍａｒｃｈら：Ｎａｔｕｒ
ｅ、３１５：６４１〜６４７．１９８５＞。

ヒトインターロイキン−１α（ｈｌＬ−１α）をコード
するＤＮＡのヌクレオチド配列の解析から、分子量３０
，６０６ダルトンのｈＩ　Ｌ　−１αプレカーサーポリ
ペプチドに相当Ｊる２７１個のアミノ酸の大きな読み取
り枠が明らかにされた。

Ｇｕｂｌｅｒら（Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３６　
：　２４９２〜２４９７．１９８６）によって決定され
たｈｌＬ−１αプレカーサーポリペプチドのヌクレオチ
ド配列およびアミノ酸配列を第１図その１およびその２
にボす。

ヨーロッパ特許出願公告第１８８．８６４号には、ｔｌ
ｌＬ−１αプレノｊ−サーボリベプチドの１１３番目の
ｓｅｐから２７１番目のＡｌａまでのＣ末端部分（第１
図その１およびその２）が生物学的に活性であることが
開示されている。ヨーロッパ特許出願公告第１８８．９
２０＠には、第１図その１およびその２に示したアミノ
酸配列と、１１４番目のＡｈａの代わりにコドンＴＣＡ
でコードされるＳｅｒを有する点でアミノ酸配列が異な
る１ｌｌＬ−１αプレカーサーポリペプチドが開示され
ている。ヨーロッパ特許出願第１８８．９２０＠にはさ
らに、様々なｈｌＬ−１αポリペプチド、すなわち上述
のように第１図その１およびその２に示したアミノ酸配
列の１１４番目のアラニン残基の存在位置がセリン残基
によって置換されているアミノ酸配列の位置６３〜２７
１．１１３〜２７１，１１５〜２７１．１２３〜２７１
゜１２７〜２７１．１２８〜２７１，１２９〜２７１．
１１３〜２６７．１１３〜２６４，１１３〜２６６．１
１３〜２６５および１２８〜２６７のアミノ酸配列を有
するｈｌＬ−１αポリペプチドの製造が開示されている
。ヨーロッパ特許出願公告第２００．９８６号には、１
１８ｆｌ自から２７１番目までのアミノ酸配列と１１７
番目にメオニン残塁を有する組換えｈｌＬ−１αポリペ
プチドのｖＪ造が記載されている。このメチオニンは１
１８番目から２７１番目までのアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡフラグメントの発現に用いられるΔＴＧコドン
に由来するものである。天然のｔｌ　Ｉ　Ｌ　−１αポ
リペプチドは１１７番目」の位置にセリン残塁を有する
ので、ヨーロッパ特許出願公告第２００，９８６号の記
載に従って製造される組換えｈｌＬ−１αポリペプチド
は、ヒト体液または培養ヒト細胞の上澄液から単離され
た相当する天然成熟ｈｔ［−ｉαポリペプチドとはＮ末
端において相違する。この組換えｈｌＬ−１αポリペプ
チドにおける修飾Ｎ末端の存在は、この組換えポリペプ
チドで処置された患者に副作用が起こる可能性を生じる
。このような副作用を回Ｍするために、天然の成熟ｈｌ
Ｌ−１αのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を右Ｊる
組換え成熟ｈｌＬ１αポリペプチドの製造のための手段
が検討されてきた。そして驚くべきことに、第１図その
１およびその２に示したアミノ酸配列の１１７番［１か
ら２７１番目までのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配
列 を右する組換え成熟ｈｌＬ−１αポリペプチド、ならび
に第１図その１おＪ：びぞの２に示したアミノ酸配列の
１２０番目から２７１番目までのアミノ酸配列に相当す
るアミノ酸配列 を有する組換え成熟ｈｌＬ−１αポリペプチドが、単細
胞生物内で、Ｎ末端メチオニン残基をもたずに製造でき
ることが発見された。

したがって、本発明は、アミノ酸配列（Ｉ　）　；Ｊ：
たは（ｎ）を有する均一な組換えヒ１−インターロイキ
ンー１αポリペプチド、このポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、このポリペプチドのいずれかをコードするＤＮ
Ａを含有する組換えベクターならびにこの組換えベクタ
ーを含有し、上）２３のＤＮＡを発現できる単細胞生物
を捉供する。ざらに、本発明は、上述のインターロイキ
ン−１αポリペプチドの製造方法、このポリペプチドか
らなる医薬組成物、ならびに宿主主体の免疫系の刺激、
創（１治癒の促進および危篤状態のタンパク質栄養不良
患者の回復の改善のための上記ポリペプチドまたは医薬
組成物の使用に関する。

本発明のポリペプチドはペプチド合成の慣用方法によっ
て、液相でもしくは好ましくはたとえばＨｅｒｒｉｆｉ
ｅｌｄ　　（Ｊ、　　八ｔ　　Ｃｈｅｔ　　Ｓｏｃ、、
８　５　　：　　２　１　４　９〜２１５．４．１９６
３）の方法のように固相で、または本技術分野の伯の均
等方法によって製造することができる。

本発明のポリペプチドはまた、好ましくは、組換えＤＮ
Ａ技術の方法を用いて製造される。この場合、本発明の
成熟ヒトインターロイキン−１αボリベプヂドをコード
するＤＮＡ配列を含有する組換えベクターを含む単細胞
生物を上記ＤＮＡ配列の発現に適当な条件下に培養し、
その単細胞生物によって産生されたヒトインターロイキ
ン−１αポリペプチドを培養物から単離する。

このような単細胞生物は原核細胞でも真核ｌ１ｌＩ１１
でもよい。このような単細胞生物の多くは市販品として
入手できるし、また、１２３０１　Ｐａｒｋ−ａｗｎ　
Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ、　ＵＳＡに所在する八ｍｅｒ＋ｃａｎ　　Ｔｙｐｅ
　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　（Ａ
　　Ｔ　ＣＣ）の寄託細胞から自由に入手できる。原核
生物の例には、大）賜菌［たとえばＤＺ２９１としてＶ
ｉｌｌａｒｅｊｏら：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、
　１２０　：　４６６〜４７４．１９７４に記載されて
いるｒ：、　ｃｏｌｉ　Ｍ　１５、　ｃ、　ｃｏｌｉ　
２９４　（ＡＴＣＣＮα３１４４６）。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＲＲ１（ＡＴＣＣＮ（１３１，３４３
）またはＥ、　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ随２
７３２５）］のような分裂菌類、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ　）のような桿菌類、ならびにたとえばネズ
ミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｃｌｌａ　ｔＶＥ１旧ｍｕｒ
ｉｕｉ）および霊菌（ＳＯｒｒａｔｉａ　１ａｒｃｅｓ
Ｃｅｎｓ　）のような腸内細菌類がある。プラスミドｐ
ＲＫ２４８ｃ　Ｉ　ｔｓ　（例参照）を含有するＦ、　
ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１株はとくに好ましい。また、ビ
ール酵母菌（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＣＱｒＯＶ　
Ｉ　Ｓ　ｌ　ａｏ　）のような酵母細胞ら宿主生物とし
て使用できる。組換えベクターの宿主生物として適当な
多くの真核細胞が本技術分野の熟練菖には知られている
。ＣＶ−１（ＡＴＣＣＮｎＣＣ１−７０）のような哺乳
類゛細胞およびその誘・導体たとえばＣ０８−１（ＡＴ
ＣＣｋｃＲＬｌ　６５０）またはＣ０８−７（ＡｒＣＣ
ｋｃＲｌ−１６５１）の使用も好ましい。さらに、Ｓｍ
１ｔｈら（Ｈｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．．２　：　２
１５６〜２１６５．１９８３）によって記載された昆虫
細胞の使用も可能である。

紺換えベクターを単細胞生物に導入するには様様の方法
が知られている。このような方法の例としては、マイク
ロインジェクション、トランスフェクションまたはトラ
ンスダクションがある。本技術分野の熟練者によれ【ｋ
、使用する特定の宿主生物に最ら適した方法を選択する
ことは容易である。

本発明に用いられる組換えベクターは、本発明のｈｌＬ
−’１αポリペプチドをコードするＤＮＡ。

たとえば第１図その１およびその２に示したヌクレオチ
ド配列の３８５番目から８５２１ｔ目までまたは３９４
番目から８５２番目までのヌクレオチド配列を有するＤ
ＮＡを含有するベクターである。

このようなりＮＡは慣用の化学的方法、たとえばＮａｒ
ａｎｇら（Ｍｅｓｈ、　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　　６８
　：　９０〜１０８　。

１９７９）によって報告されているホスホトリエステル
法、またハａｒｏｗｎら（Ｈ（！ｔｈ、　ＥｎＺＶＩＯ
’１．、６旦：１０９〜１５１．１９７９）のホスホジ
エステル法により合成できる。いずれの方法でも、まず
長いオリゴメクレオチドを合成し、ついで予め定められ
た順番に互いに連絡する。ＤＮＡのヌクレオチド配列は
上述のヌクレオチド配列と同一でも、また一部もしくは
完全に異なっていてもよい。

これは遺伝暗号の退縮、すなわち１つのアミノ酸が数個
のコドンに対応しているという事実によるものである。

ｈｌＬ−１αポリペプチドの発現に用いられる宿主生物
の好むコドン利用に適合するようにコドンを選択するこ
とができる（　ＧｒＯ３Ｊｅａｎら：Ｇｅｎｅ、１８：
１９９〜２０９．１９８２＞。

この方法で得られるＤＮＡが、たとえば望ましくない制
限酵素切断部位の導入により組換えベクターの構築を困
難にしたり、ポリペプチドの発現を妨害する部分構造を
含まないように注意づる必要がある。

本発明のｈｌＬ−１αポリペプチドをコードするＤＮＡ
はまた、本技術分野において公知の操作（たとえばＨａ
ｒＣｈら：＠出出：ｃｕｂ＋ｅｒら：前出）に従ってヒ
ト遺伝子ライブラリーまたはヒト遺伝子ライブラリーか
らｈｌＬ−１αプレカーサーポリペプチドをコードする
ＤＮＡを単離し、ついで組換えＤＮＡ技術の分野でよく
知られた方法に従い、制限エンドヌクレアーゼおよび場
合により小さな合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮ
Ａを所望の大きさおよびヌクレオチド配列に構築するこ
とによっても製造できる。

上）ホの組換えベクターの構築には、ヨーロッパ特許出
願公告筒２００．９８６号に記載されているような多数
のベクターを使用することができる。

これらのベクターは、ｈ　Ｉ　Ｌ−１αポリペプチドを
コードするＤＮＡの転写および翻訳のために必要な要素
、ならびにそのベクターの宿主内における維持および複
写に必要な要素を含有する。本発明の組換えベクターの
構築に適当なベクターの選択およびその組換えベクター
と適合する単細胞宿主生物の選択は本分野の技術者の技
能で十分対応できる事項である。

本発明の組換えベクターはまた、好ましくは、ｈＩ　Ｌ
　−１αボリベブヂドをコードするＤＮＡを含む組換え
ベクターを、Ｈｏｒｉｎａｇａら（ＢＩＯ／ｒＥｃｌＩ
Ｉ４０ＬＯＧＹ、　２　：　６３６〜６３９．１９８４
）によって記載されたオリゴヌクレオチドの特定部位の
突然変異誘発法を用いて修飾することでも製造できる。

ベクターとｈｌＬ−１αポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを含むこのような組換えベクターの例には、プラスミ
ドｐｈｉｊ！＃１−１５４＊がある。このプラスミドの
構築はヨーロッパ特許出願公告筒２００，９８６号に記
載されている。

本発明によるポリペプチドの発現を行う方法は、使用す
る発現ベクターおよび宿主生物ににって決定される。通
常、発現ベクターを含有する宿主生物は、その宿主生物
の生育に最適ｔ【条件下に生育される。単位時間あたり
の細胞数の増加が低］・する対数増殖期の末期近くに、
本発明のポリペプチドの発現を誘導する。すなわち、ポ
リペプチドをコードするＤＮＡの転写、転写されたｍＲ
ＮＡの翻訳を行わせる。誘導は、生育メジウムにインデ
ューサーまたはデブレッサーを添加することにより、あ
るいは物理的パラメーターたとえば温度を変化させるこ
とによって行うことができる。

宿主生物中に産生されたポリペプチドは、特定の輸送機
構によって１１Ｉｌ１１から分泌ざＵるか、または細胞
を破壊することによって単離できる。細胞は機械的な（
Ｃｔ＋ａｒｍら：　Ｈｅｔｔｌ、　ＥｎＺｖ１０＋、、
　ｚ２：４７６〜５５６．１９７１）、酵素的な（リソ
チーム処理）または化学的な（界面活性剤処理、尿素も
しくはグアニジン塩酸塩処理等）手段、あるいはそれら
の組合せによって破壊することができる。

真核生物では、細胞から分泌されるポリペプチドはプレ
カーサー分子の型に合成される、成熟ポリペプチドは、
いわゆるシグナルペプチドの切断によって生じる。原核
宿主生物では、プレカーサー分子から真核シグナルベブ
チを切断することができないので、原核宿主生物中では
、真核ポリペプチドを直接その成熟型として発現しなけ
ればならない。ＤＮＡのレベルではコドンＡ　Ｔ　Ｇに
相当する翻訳開始シグナルＡＵＧは、原核宿主生物中で
は、すべてのポリペプチドをＮ末端にメチオニン残塁を
もつ型で合成させる。場合によっては、用いた発現シス
テムにより、また多分、発現されるポリペプチドにより
、このメチオニン残基は切断される。

本発明のポリベブヂドは公知の方法により、たとえば様
々な速度での遠心分離、硫酸アンモニウムによる沈殿、
透析（常圧または減圧下での）、製造等電点電気泳動、
ｖＪ造ゲル電気泳動、またはゲル濾過、高速液体り０７
１〜グラフイー（１」Ｐ　ＬＣ）、イオン交換クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびアフィニテ
ィークロマトグラフィー（たとえば５ｅｐｈａｒｏｓｅ
ＯＢＩｕｅ　　ＣＬ　−６ＢまたはｈＩＬ−１αポリペ
プチドに対する担体結合モノクローナル担体）のような
様々のクロア１−グラフ法によって均一に精製できる。

本発明の精製組換えｈｌＬ−１αポリペプチドは、たと
えば病原に対する１１１′主防り１１応答の改善、ワク
チンアジュバントとしての作用および新生物疾患に対す
る宿主防御増強によるような宿主自体の免疫系の刺激の
ために、それ自体公知の方法で使用できる。本技術分野
において１１１　Ｌ−１αについて同定されている他の
臨床的用途には、線維芽細胞の増殖を介して創傷治癒の
促進および危篤状態のタンパク質栄養不良患者の回復の
改善が包含される。

本発明に従って製造された均一なｈ　ｔ　ｌ−−ｉαポ
リペプチドは、上述の臨床的用途のため温血動物に投与
することができる。投与は、静脈内、皮下または筋肉内
のいずれかの非経口投与のような任意の慣用方法で行わ
れる。必要な投与量は、当然、処置すべき特定の状態、
状態の１篤度、処置の期間および投与方法によって変動
する。医薬用途に適当な投与剤型は、滅菌濾過し、凍結
乾燥したｈｌＬ−１αボリペブヂドから得られ、使用に
先立って慣用方法で再構築される。均一なヒトインター
ロイキン−１αを適合性のある医薬的に許容される担体
材料、たとえば緩衝剤、安定化剤、静菌剤Ｊ３よび他の
賦形剤ならびに医薬経口投与剤型に慣用される添加剤と
混合することによる本発明の均一なヒトインターロイキ
ン−１α含有医薬組成物の製造もまた、本分野の技術者
の技能で十分対応できる事項である。

例 Ｈｏｒｉｎａｇａらによって記載されたオリゴヌクレオ
チドの特定部位の突然変異誘発法（ＢＩＧ／ＴＥＣＩＩ
ＮＱＬＯＧＹ、　２　：　６３６〜６３９．１９８４）
を用いてプラスミドｐｈｉオ”１−１５４”　　（ヨー
ロッパ特許出願公開箱２００．９８６号）に突然変異を
誘発して、第１図その１およびその２の１１７番目から
、２７１番目、１１９番目から２７１番目および１２０
番目から２７１番目までのアミノ酸配列を有するｈｌＬ
−１αポリペプチドをコードする遺伝子を製造した。こ
れらの操作を実施するには、以下のヌクレオチド配列 ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＡＧＣＴＴＣＣＴＧ
　ＡＧＣＣｏ、１１７）。

ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＡＧＣＡＡ
Ｔ　ＧＴＧ　　　　　　　（０，１１９）および ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＡＧＣＡＡＴ　ＧＴ
Ｇ　ＡＡＡ　　　　　　（０・１２０）を有する合成オ
リゴヌクレオチドをＨａｔｔｅｕｃｃｉ　らのホスホラ
ミダイト固体支持体（、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ。

Ｓｏｃ、、１０３：３１Ｂ５〜３１９１．１９８１）に
よって製造した。

プラスミドｏｈｉｊ！＃１−１５４＊はＢＱｊ！Ｉｔお
よ′ｃＦＳａｊ！Ｉを用イーｃ　キｖ　’／ブ型に、Ｐ
ｓｔＩを用いて線型に変換した。ギャップ型のへテロニ
重鎮が製造された。上記オリゴヌクレオチドを３段階の
別反応で、アニーリングし、二重鎖型に変換してリゲー
ションを行い、ＣａＣＪ、、法（ＨａｎｉａｔｉＳら：
　　”ＭＯｌｅＣｌｌｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　　＾
ｔａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｈａｎｔｌａｌ”、２５０〜
２５１頁、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２　）を用いてプラス
ミドｐ・ＲＫ　２４８　ｃ　Ｉ　ｔ　ｓ　（Ｂｅｒｎａ
ｒｄら：　Ｈｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、且：４８２
〜４９２．１９７９）含有Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２
ＭＣｌ　０６１株（Ｃａ５ａｄａｂａｎら：　Ｊ、　Ｈ
ｏｔ、　Ｂｉｏｌ、、１３８　：　１７９〜２０７．１
９８０）に形質転換した。Ｅ、　ｃｏｌｉＭＣ１０６１
およびプラスミドｐＲＫ２４８ｃｌｔｓはＡｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ。

１２３０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ＵＳ八から、それぞれ寄託番号Ａ
ＴＣＣＮｎ５３３’３８お・よびＡＴＣＣ魔３３７６６
として入手できる。

所望の突然変異を含むコロニーは＋ａｎｔａｔｔｓら（
前出、３１２〜３１５頁）によって記載されたにうにハ
イブリダイゼーションによって同定した。

ブライマーの突然変異誘発に用いた同じオリゴヌクレオ
チドをＨａｎｉａｔｉＳら（前出、３９６頁）の操作に
従いポリヌクレオチドキナーゼを用いてＴ”２Ｐ−ＡＴ
Ｐで５′末端を標識したのちハイブリダイゼーションの
プローブとして使用した。

オリゴヌクレオチド（０，１１７）は、以下の配列修飾
によってｐｈｉｊ！＃１−１５４＊のｐＨｕｌＬ−１α
（１１７〜２７１）への変換に用いた。

同様に、オリゴヌクレオチド（０１１１９）は以下の配
列でｐＨｕｌＬ−１α（１１９〜２７１）を製造し、 オリゴヌクレオチド（０，１２０）は以下の配列でｐＨ
ｕ　Ｉ　Ｌ−１α（１２０〜２７１）を製造した。

ＤＮＡ配列解析により上記突然変異を確認した。

ｐｈｉＪ”ｌ−１５４［ヨーロッパ特許出願公開筒２０
０．９８６号、ｈｌＬ−１α（１１８〜２７１）を発現
できる］　、ＤＨｕ　Ｉ’Ｌ−１ｔ：ｘ　（１１７〜２
７１）、ｐＨｕｌＬ−１α　（１１９〜２７１）および
ｐＨｕ　Ｉ　Ｌ−１ａ　（１２０〜１７１　）を含有す
るＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１／ＤＲＫ２４８ｃｌｔｓ
を、アンピシリンを含むＭ９メジウム（Ｈａｎｉａｔｉ
Ｓら、前出、６８〜６９頁）中、３０℃で、５５０ｎｌ
ｌｌにおける吸収（Ａ　　　）が０．７に達するまで生
育させ、ついで３時間温度を４２℃に上げた。培養液１
ｒｄからの細菌細胞を遠心分離よって集め、７Ｍグアニ
ジン塩酸塩５０μｌ中に可溶化した。粗細菌抽出液につ
いて、Ｈｉｚｅｌらのマウス胸腺細胞増殖検定法（Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２０：１４９７〜１５０８．１
９７８）を用いてインターロイキン−１の生物活性を検
定した。４種の抽出液のすべてが活性を示した。

不溶性の細胞質封入体を４種のすべての誘導培養液から
単離し、上述のようにして精製し、可溶化してＳＯＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ　　：
　Ｎａｔｕｒｅ、　　２２７　：　６８０〜６８５゜１
９７０＞に付した。インターロイキン−１αの主バンド
をＡｅｂｅｒｓｏｌｄらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、。

２６１　：４２２９〜４２３８．１９８６）によって各
ゲルから溶出し、ｌｌｅｗｉｃｋらの方法（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌＣｈｅｍ、、２５６：７９９０〜７９９７．１９８
１）に従ってＮ末端アミノ酸配列解析に付したところ、
１０サイクルで以下の結果が得られた。

ｈＩＬ−１，α　１１７−２７１　： Ｓａｒ：Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ：Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌ
ｙｓ　ＴＹｒ、Ａｓｎ　ＰｈｅｈＩＬ−’Ｌα　１１８
−２７１　＝ Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌ
ｙｓ　Ｔｙｒ、Ａｓｎ　ＰｈｅｈＩＬ−１，α　１１９
−２７１　＝ Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＶａＬ　Ｌｙｓ　Ｔ
ｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｍｅｌ−ｈｌ［、−１α　（Ｈ
免ｌヱリュ Ｓｅｅ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＴｙｒＡｓｎ　Ｐｈ
ｅ　Ｍｅｌ−Ａｃｇ　Ｉｌｅ明らかなように、最初のメ
チオニンはｈＩＬ−１α（１１７〜２７１）およびｈｌ
Ｌ−１α（１２０〜２７１）からは切断されているが、
ｈｌＬ−１α（１１９〜２７１）およびｈｌＬ−１α（
１１８〜２７１）には残っている。

ｈｌＬ−１αポリペプチド、ｈｌＬ−１α（１１７〜２
７１）、ｈｌＬ−１α（１１８〜２７１）およびｈｌＬ
−１α（１２０〜２７１）についてさらに検討するため
に、ｐ）（ｕｌＬ−１α（１１７〜２７１＞、Ｉ）ｈｉ
ｊ！＃１−１５４およびｐＨｕ　Ｉ　Ｌ−１α（１２０
〜２７１　＞を取り込んだＭＣ１０６１／ｐＲＫ２４８
ｃｌｔｓ形質転換体の分解物の上澄液分画の精製を次の
ように行った。

（１）　　各形質転換体５　Ｋｇを含有する培養液を硫
酸でａｌｌｌ、８に調整し、室温に３０分〜１時間保持
し、酸で殺した細胞を遠心分離によって回収した。

＋２１　　ＡＩで殺した細胞を水１８１に懸濁し、自動
ブレード攪拌器により室温で１時間攪拌した。

（３）　　懸濁した物質を２重のチーズ布で濾過し、細
胞層を除去した。

（４）　　濾過された物質を、８．０００ｐｓｉ（約凱
５Ｘ１０７Ｐａ）で操作したＨＯｎｔＯｎ−Ｇａｕｌｉ
ｎｌｌｌ胞小モジナイザー（Ｈｃｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、、　２２：４８２〜４８４−．１９７１）に２回、
最初は１５℃、次は約３０℃で通過させた。

（５）　　この物質を、５ｏｒｖａｌｌ遠心分１ｉｆｔ
器（［１ｕＰＯｎｔ、　１４ｉ１１ｉｎ（ｌｔｏｎ、　
Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）により、Ｇ５−３０−ター
（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　）を用いて、４℃、８．０ＯＯｒＤ
Ｉｌで１時間遠心分離した。上澄液約１６．６ｊ！を回
収し、ベレットは捨てた。

ｆ６）　　上澄液を０．８１０．２ミクロン５ａｒｔｏ
ｒｉｕｓフイルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　Ｆｉｌｔｅ
ｒｓＩｎＣ，、ｌｌａｙｗｏｏｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎ
ｉａ、　ＵＳＡｊ：たはＳａｒｔｏｒｉｕｓ−Ｈａｍｂ
ｒａｎｆｉｌｔｅｒ　Ｇｍｂｌｌ　　Ｄ　−３４００Ｇ
ｏｔｔｉｎｇｅｎから入手できる）を通して濾過したの
ら、５０％（Ｖ／Ｖ　）水酸化ナトリウム溶液を用いて
ｐＨ１３，０に調整した。

（７）上澄液を、予め０．０２Ｍ酢酸で平衡化した１０
１０Ｘ４０　８１１（＋０１　Ｐ−８Ｐシリカカラム（
スルホブ日ビル陽イオン交換樹脂；４０〜６０ミクロン
、２００人；　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ＩｎｄｕＳｔｒ
ｉｅＳＨｅｔｕｃｈｅｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、　
ＵＳＡ　）に適用した。壱ナンブルを適用後、カラムを
３１１の０．０２Ｍ酢酸で洗浄し、ライで３０ｉＨＴｒ
　ｉ　５−１−ＩＣｊ！、ｐＨ８，０で溶出した。カラ
ム溶出液について２８０ｎｍで比色的にモニタリングを
行った。このようにして、タンパク質の２つのピーク、
４．５に容量の第１のピークおよび７．５１の主ピーク
が得られた。

（）１）　　■程７からの主ピークを、予め３Ｑｎ＋Ｈ
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！、ｐｌ（８，０で平衡化した１
０×４０ｃＩＲＮｕＧｅＪ！　　Ｐ−ＤＥシリカカラム
（ジエチルアミノエチル陰イオン交換樹脂：４０〜６０
ミクロン、２００人；　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　１ｎｄ
ｕｓｔｒｉｅｓ　）に適用した。カラムを１７１の３０
ｍＨＴｒｉＳ１」Ｃｆおよび０．０７５Ｍ　　ＮａＣ１
、ｐＨ８，０で洗浄し、ついで１３１の３０１１ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｊ！および０．２５Ｍ　　ＮａＣ１，０１１
８，０で溶出した。溶出液について２８０　ｎｍの光学
密度（０，０，）で分光測光によりタンバク質の存在を
モニタリングした。このようにして、１３１の容量に含
まれたＯ、Ｄ、　　　タンパり質ビークが得られた。

（９）　　工程８からの溶出液を３．７ｅ＋Ｈ酢酸、ｌ
１１４．８で４倍に希釈し、ｐｈｉを４．８に調整し、
５Ｘ　　２　５　０　　ａｔｒ　　　　Ｎ　　ＬＪ　　
Ｇ　　ｅ　　ｊ！　　　　　Ｐ　　−Ｓ　　Ｐ　　　　
ＨＰ　　Ｌ　　Ｃ，カラム（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　）に流速１５〇−７分で適用した
。次にカラムをｐＨ４，８（３，７５ｍＭ酢酸）からｐ
Ｈ１６，８（１０ｎ＋Ｍ　　Ｋ２　ＨＰＯ４）までの直
線勾配により、流速７５ｔｎｌｌ／分で１２０分を要し
て溶出した。かくして、９．３１の０５Ｄ、２８０ビー
クが得られた。

ＯＩ　１−ＩＰＬｃカラムからの汗１出液を八ｌ１ｉｃ
ｏｎらせんカートリッジ（分子ｉｉ、ｏｏｏカットオフ
；Ｈ，Ｉｔ、　Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ、の＾ｎ＋１ｃｏ
ｎ　Ｄｉｖ　　ＤａｎｖｃｒｓＨａＳＳａＣｈｕＳｅｔ
ｔＳ、　ＵＳＡから人手できる）で約２２５ｄに濃縮し
、予め５０ＩＩＨＫ２トｌＰＯ４＋０、ＩＭ　　ＮａＣ
ｊ！、ａｌ１６．８で平衡化した直列の２本の１０　Ｘ
　１００ｃｍ　　５ｃＤｈａｄｅｘＯＧ　−５０カラム
（ＰｈａｒＩｌａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈａｍｉｃａｌ
ｓ、　ＰｉｓｃａｔａｗａｙＮｅｗ　Ｊｅｒｓｅｖ、Ｕ
ＳＡ）に適用した。８００　ｄの０、Ｄ、　　　ピーク
が得られた。これをΔｎ１ｃｏ０らせ／υカートリッジ
（分子量３ｏ、ｏｏｏカッ１〜オフ）により、パイロジ
エン除去に付した。１４終生成物の容量は約１．０７０
＋！であった。

とくに指示のない限り、上記精製■稈は、室温で流した
Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラムを除き、寸べて４℃で実施した。

精製したｈｌＬ−１α（１１７〜２７１）、ｈｌＬ−１
α（１１８〜２７１）およびｈｌＬ−１α（１２０〜２
７１）タンパク′霞を、上述のようにＳ　Ｄ　Ｓポリア
クリルアミドゲル電気泳動解析に付し、クーマツシーブ
ルーで染色した。いずれし均−ｈ　Ｑ’！であることが
明らかにされた。

生物活性の検定は、精製タンパク質について、Ｋａｙｅ
らのマ・クスＤＩＯ強線細胞増殖検定法（Ｊｒｘｐ、　
　Ｈａｄ、、１５８：８３６〜８５６　１９８３）を用
いて実施した。結束は第１表に示すとおりである。

第１表 ｈ［Ｌ−１αポリペブチ下の活性 蛋白′Ｃ１１ 可溶性旧１−−１αａ） （ｍ４７／に！／） の比活性 （単位／ｍｇ’） ｔ）ｌＬ−１α（１１８〜２７１）　　　６００　　　
　２刈０９ａ）粗ホモジネート中の可溶性ｈｌＬ−１α
の亀はｆｉｌｍ−１αα特異的体を用いたイムノアッセ
イに基づいて計算した。

第１表のデータは（ヨーロッパ特許出願公開用２００．
９８６号の表■に示されたデータと考え合わせると）、
分子内に最低１３２番目から２７１番目まで（第１図そ
の１およびその２）のｈルボキシ末端が存在する限り、
１ｌｌＬ−１αタンパク質の正確な長さは重要でないこ
とを示している。

すべてのタンパク質が同じ特異的生物活性を示した。こ
れらのデータはまた、Ｎ末端の最初のメチオニンの有無
は活性に影響を与えないことら示している。Ｎ末端に付
加的なメチオニンを有づ゛るｈｌＬ−１α（１１８〜２
７１）は、いずれらこのメチオニンを欠く伯の両タンパ
ク質と活性が等しかった。

第１表のデータはまた驚くべきことに、可溶性ｈ［Ｌ−
１α（１１７〜２７１）タンパク質の発現レベルは、タ
ンパク質をコードする遺伝子はすべて同じベクター中に
組込み、細胞の培養および収穫は全く同様に実施したに
らかかわらず、可溶性ｈ　Ｉ　Ｌ　−１α（１１８〜２
７１）およびＯＩ　Ｌ−１α（１２０〜２７１）タンパ
ク質の発現レベルの３倍に達したことを示している。

本発明は、ヒトインターロイキン−１αＣＤＮＡのヌク
レオチド配列および予測されるアミノ酸配列を示した第
１図その１およびその２どともに考慮すると、理解が容
易であろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトインターロイキン−１α（ｈ　！　Ｌ−
１α）プレカーサーポリペ′プチドのヌクレオチド配Ｊ
ｌおよびアミノ酸配列を示１図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）アミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 または 【遺伝子配列があります】 を有する均一な組換えヒトインターロイキン−１αポリ
   ペプチド （２）アミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第１項の均一な組換えヒトイン
   ターロイキン−１αポリペプチド（３）特許請求の範囲
   第１項または第２項に定義されたヒトインターロイキン
   −１αポリペプチドをコードするＤＮＡ （４）特許請求の範囲第３項に記載のＤＮＡを含有し、
   適合性のある単細胞宿主生物中で上記ＤＮＡの発現の指
   示が可能な組換えベクター （５）特許請求の範囲第４項に記載の組換えベクターを
   含有し、ヒトインターロイキン−１αをコードするＤＮ
   Ａを発現できる単細胞生物 （６）宿主主体の免疫系の刺激、創傷治癒の促進、およ
   び危篤状態のタンパク質栄養不良患者の回復の改善のた
   めの特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかに記
   載の均一な組換えヒトインターロイキン−１αポリペプ
   チド （７）（ａ）特許請求の範囲第５項に記載の単細胞生物
   を、ヒトインターロイキン−１αポリペプチドをコード
   するＤＮＡの発現に適当な条件下に培養し、 （ｂ）培養物からヒトインターロイキン−１αポリペプ
   チドを単離し、それを均一に精製する特許請求の範囲第
   １項または第２項に記載のヒトインターロイキン−１α
   ポリペプチドの製造方法 （８）特許請求の範囲第１項または第２項に記載のヒト
   インターロイキン−１αポリペプチドと医薬的に許容さ
   れる担体からなる医薬組成物