MC2348A1 - Production et isolement d'avermectines. - Google Patents

Description

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Brevet d'invention

Titre de l'invention: Production et isolement d'avermectines

Nom du déposant: SETEX S.A.

ABREGE DESCRIPTIF

Les avermectines de type Ala, B^a, Blb sont isolées à partir du jus de fermentation de souches de Streptomyces avermitilis par homogénéisation dudit jus de fermentation en présence d'un solvant miscible à l'eau et 5 séparation des avermectines par absorption sur une résine choisie parmi un ester polyacrylique et un copolymère polycondensé phénol-formaldéhyde suivie d'une éluition avec un gradient d'un mélange eau/solvant miscible à l'eau. Le jus de fermentation peut être obtenu à partir de la nouvelle souche Streptomyces avermitilis VKM Ac-1475 D.

10 DESCRIPTION

La présente invention concerne un procédé pour la production et l'isolement d'avermectines. Plus particulièrement l'invention se rapporte à l'isolement d'avermectines de type Ala, Bla et B-j^, notamment de celles de type B^a. Les avermectines sont une famille 1

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metabolite bactériens obtenus par fermentation d'une souche productrice de ces composés telle que celle décrite dans le brevet allemand 2717040 Il s'agit de macrolides ayant une puissante activité parasiticide répondant a la structure (I) et les différents composants individuels 5 sont les suivants:

10 II est connu que, pour l'isolement de metabolites bactériens, il est possible d'utiliser des agents d'absorptions tels que des résines macroréticulaires sinthetiques, comme décrit dans le brevet US 4,399,274. Selon la technique utilisée dans ce document, un extrait du mycéluim est traité avec un co-polymère réticulé.

15 On a maintenant trouvé que les avermectines sont plus facilement isolées par traitement non d'un extrait, mais de jus de fermentation intégral avec deux types particuliers de résines:

a) les esters polyacryliques qui, à la différence des résines décrites dans le brevet US 4,399,274, ne sont pas de co-polymères;

20 b) les copolymères polycondensés phénol-formaldéhyde qui, à la différence des résines décrites dans le brevet US 4,399,274 qui ne présentent pas de groupe fonctionnel, contiennent des fonctions

Avermectine A^a R* = C2H5 R2 = OCH3

Alfa R1 = CH3 R2 = OCH3

Bla r1 = c2»5 1,2 " 0B

Blb R1 = CH3 R2 = OH

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faiblement basiques.

On a aussi trouvé qu'en utilisant un des deux types de résines ci-dessus, il est possible de diriger le procédé d'isolement vers l'obtention préférentielle des avermectines de type A^a et B-^.

5 Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé pour l'isolement d'avermectines, caractérisé en ce qu'on homogénise le jus de fermentation intégral provenant d'une culture de Streptomyces avermitilis, productrice d'avermectines, en presence d'un solvant miscible à l'eau, on traite le homogénéisé ainsi obtenu avec une résine 10 choisie parmi les esters polyacryliques et les copolymères polycondensés phénol-formaldéhyde et on libère les avermectines absorbées sur la résine avec un gradient d'un mélange eau/solvant miscible à l'eau.

A la fin de la fermentation le jus intégral est mélangé avec un volume 15 approprié de solvant organique miscible à l'eau (par ex. acétone, méthanol, isopropanol) . Le mélange susdit est après versé dans un homogénéisateur pour la rupture des cellules et faciliter l'extraction des avermectines. La masse homogénéisée est chargée directement en contre-courant sans filtration ou centrifugation, sur des colonnes qui 20 contiennent une résine à matrice d'esters polyacryliques (par ex. Amberlite®XAD-8 ou Diaion HP) ou de copolymères polycondensés phénol-formaldéhyde.

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La résiné est lavée avec une gradient d'un mélange eau/solvant. L'élution des avermectines absorbées est conduite employant un gradient d'un mélange eau/solvant miscible à l'eau, qui n'est pas nécessairement le même solvant employé dans le procédé d'absorption.

5 En employant un gradient approprié, il est possible de separer les nombreuses avermectines.

Le procédé d'isolement selon la présente invention peut être appliqué à des jus de fermentation provenant de n'importe quelle souche productrice d'avermectine. Des jus de fermentation particulierment 10 avantageux sont obtenus à partir d'un nouveau micro-organisme Streptomyces avermitilis dont un échantillon a été déposé à la collection permanente de cultures de Russian Academy of Sciences -Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms à Puschchino, Moscow Région et a reçu le numéro d'enregistrement VKM Ac-1475 D. La 15 souche VKM Ac-1475 D représente un aspect ultérieur de la présente invention. Celle ci, par sa fermentation, produit un mélange intracellulaire d'avermectines, dans lesquelles les composants principeaux sont les avermectines Bla et Aja dans une pourcentage variable de 18% à 26% pour la première et de 10% à 15% pour la 20 deuxième.

Les caractéristiques de morphologie et de culture de Streptomyces avermitilis VKM Ac-1475 D sont les suivantes: le producteur des spoi—

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forment des colonies gris-brunes avec une partie centrale conique proéminent, revêtue normalement sur toute la surface par le milieu de culture. Autour de les colonies il y a un bord blanc et rarement d'autres types de colonies paraissent.

5 On observe une sporulation sur agar organique, agar de Pridham-Gottlieb, agar glycerol-nitrate, agar minéral, agar au glucose-asparagine, agar à la farine d'avoine, agar au glucose-nitrate, agar nutritive.

Agar organique

10 (*) SM: brun à noir. (*) SM = Culture végétative

Agar de Pridham-Sottlieb (*) AM: gris brunâtre. 15 Agar au glycerol-nitrate (*) AM: faible, blanc.

SM: jaune orange à ocre. SP: néant ou jaune clair. Agar minéral 20 (*) AM: faible, blanc.

AM: faible, gris.

AM = Mycélium aérien

SP: brun à noir.

SP = Pigment soluble

SP: néant.

SM: incolore ou jaune clair à brun jaunâtre.

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Agar au glucose-asparagine (*) AM: faible, blanc.

SM: faible, incolore.

SP: néant.

5 Agar à la farine d'avoine

{*) AM: gris, quelquefois avec des taches blanches. SM: jaune-gris, gris brunâtre.

SP: néant.

Agar au glucose-nitrate 10 (*) AM: gris brunâtre.

Agar nutritive

(*) AM: gris brunâtre mélangé avec blanc.

15 Toutes les lectures sont effectuées après 2 semaines à 28°C. Le pH de tous les milieaux est approximativement neutre.

Une comparaison soigneuse des valeurs précédentes avec les descriptions publiées des souches connues révèle des différences notables qui indiquent que le micro-organisme doit être classé comme une nouvelle 20 espèce de Streptomyces avermitilis.

Les exemples suivants décrivent le nouveau procédé pour la récupération des avermectines A^a, B^a, B2a. Ces exemples sont seulement explicatifs

SM: brun à noir.

SP: brun.

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et il ne sont pas limitatifs par l'invention.

PREPARATION

Jus de fermentation à partir de Streptomyces avermitilis VKM Ac-1475 D. Les avermectines sont obtenues en utilisant le Streptomyces avermitilis 5 VKM Ac-1475 D. Les bactéries sont conservées sur slant d'agar glucose-pommes de terre, dans des éprouvettes pour l'éssai des vitamines, à +4°C. La réinoculation sur terrain frais avec la même composition doit être exécutées au moins une fois par mois. La culture à conserver doit être cultivée pour 7 jours à +28°C.

10 1. Les bactéries sont cultivées et conservées sur un terrain agarisé ayant la composition suivante:

glucose 10 g/1

agar-agar 15 g/1

jus de pommes de terre jusqu'à 1 1 15 Pour préparer le jus de pommes de terre, on fait boullir 300 g de pomme de terre dans 700 ml d'eau pour 30 minutes. La solution est centrifugée (6000 rpm, 20 min.) pour préparer le jus du précipité. Pour préparer le terrain, le glucose et 1'agar-agar sont ajoutés au jus de pommes de terre, après on ajoute d'outre jus de pommes de 20 terre jusqu'on arrive au volume de 1 litre, après on stérilise dans un stérilisateur à 110°C et 4,9-10~2 mbar pour 30 minutes. Dans un

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pour l'éssai des vitamines, 15 ml pour éprouvette, qui sont maintenues en position inclinée jusqu'à ce que le terrain agarisé est complètement rafraichi. Pour obtenir l'inoculum, la souche VKM Ac-1475 D est réinoculée sur slants (agar à bec de clairon) d'agar 5 glucose-pommes de terre frais. La culture doit être cultivée dans des éprouvettes pour l'éssai des vitamines pour la durée de 5 jours à 28°C (volume des éprouvettes: 35 ml).

2. Préparation de l'inoculum dans des matras sous agitation

2.1. L'inoculum est cultivé dans des matras en utilisant le terrain 10 nutritif de la composition suivante:

lactose 20 g/1

farine de soja 15 g/1

autolysé de levure 5 g/1

eau distillée jusqu'à 1 1

15 Le pH est porté à 7,0-^7,2 avec NaOH 10%.

Pour préparer le terrain, la farine de soja et l'autolysé de levure sont mis dans l'eau distillée. Le contenu est énergiquement mélangé, son pH est porté à 7,0^7,2 avec une solution de NaOH et est porté à 1 litre avec de l'eau 20 distillée. Le terrain liquide est après distribué dans la quantité de 100 ml dans des matras et stérilisé dans un stérilisateur à 120°C et 9,8-10~2 mbar pour 1 heure (volume des

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matras: 750 ml).

Le glucose est dissous dans de l'eau distillée, chargé dans le collecteur, le volume est porté à 7 litres, le contenu est stérilisé dans un stérilisateur à 110°C, pression 4,9*10~2 mbar 5 pour la durée de 30 minutes. L'extract de maïs est stérilisé

dans un récipient séparé dans un stérilisateur à 110°C,

_ O

pression 4,9-10 ° mbar, pour la durée de 30 minutes. La farine de soja est dissoute dans de l'eau froide, versée dans le fermenteur pendant que l'agitateur est en fonction, portée à 10 80°C, maintenue a 80°C pour 30 minutes, puis elle est faite rafroidir à une température de 30°C. Après avoir chargé les autres composants, à l'exclusion du glucose et de l'extract de maïs, on porte le volume total à 53 litres, on prélève l'échantillon, on mesure le pH et on introduit le mesureur de 15 pH, et le pH du terrain liquide est porté à 7,0-r7,2 par une solution de NaOH à 10%. Le terrain est stérilisé à la temperature de 120°C, à la pression de 9,8*10~2 mbar, pour la durée de 1 heure. Après avoir fait refroidir le terrain dans le fermenteur jusqu'à la temperature de 29^-30°C, on pompe 20 aseptiquement dans le terrain les solutions stérilisées de glucose de l'extract de maïs. Des échantillons de terrain sont

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solution de lactose à 25% en eau distillée est stérilisée séparément dans un stérilisateur à 110°C et 4,9*10~2 mbar pour la durée de 30 minutes. Avant de procéder à l'inoculation, 8 ml de la solution de lactose sont ajoutés, en conditions stériles, 5 à chaque matras contenant déjà le terrain liquide. Pour inoculer le terrain dans un matras on prend un petit morceau de terrain agarisé avec la culture, qui est prélevé par les éprouvettes pour l'éssai des vitamines, en travaillant en conditions stériles.

10 2.2. Croissance de l'inoculum dans des matras agités.

L'inoculum de Streptomyces avermitilis VKM Ac-1475 D est fait croîte dans un shaker à 190+200 rpm à 28°C pendant 20 + 24 heures. L'inoculum cultivé dans les matras agités doit satisfaire les conditions suivantes:

15 1) absence de microflore contaminante;

2) l'inoculum doit être de consistance liquide et de couleur marron foncé;

3) le pH doit être 6,9+7,2;

4) aspect microscopique: rares conglomérats avec hyphes actino 20 mycètiques proéminents.

3. Culture du Streptomyces avermitilis VKM Ac-1475 D dans un fermenteur. 3.1. Préparation du fermenteur

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Avant d'effectuer le remplissage, le fermenteur doit être scrupuleusement nettoyé et soigneusement contrôlé en ce qui concerne son étancheté à l'air en employant de l'eau saponée, à une pression de 14,7-10-2 mbar. Le fermenteur prêt à être utilisé est muni de mesureur de pH, O2 et temperature.

.2. Préparation du terrain nutritif stérilisé dans le fermenteur. Pour la culture du Streptomyces avermitilis VKM Ac-1475 D on utilisé un terrain nutritif ayant la composition suivante:

Charge pour 60

litres d'

eau (*)

Contenu en r poids en % de la en

Nom substance < g/1

total substance volume

base, % L

g de base, g

1

farine de soja

12

720

720

extract de maïs

50 3

180

90

glucose

90 65

3900

3510

levure sèche

6

360

CaCOo

98 6

360

352,8

Propinol B-400

0,003

eau distillée

jusqu'à

60

(*) Volume total 60 litres, volume de l'inoculum 50 ml

Le terrain doit être stérilisé et avoir les caractéristiques biochimiques suivantes:

pH = 7,0+7,2

contenu en glucose = 5,0+7,9%

Le terrain nutritif dans le fermenteur est inoculé avec l'inoculum cultivé dans les matras.

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3.3. Culture de Streptomyces avermitilis VKM Ac-1475 D.

La culture du producteur d'avermectine dans le fermenteur est conduite dans les conditions suivantes:

temperature : 28°±1°C

5 agitation initiale: 200 rpm aération initiale : 0 1/min.

Quand la valeur de la pC>2 a diminuée à 60% de la saturation, elle est mantenue à ce niveau en augmentant le numéro des révolutions à 400+450 rpm et en augmentant la fourniture d'air 10 à 12+15 1/min., c'est-à-dire, à 0,2+0,25 volumes d'air par volume de terrain par minute. La valeur du pH pendant la culture dans les 24 premières heures diminue spontanément, après elle recommence à augmenter jusqu'à 7,2 et après elle ne change plus jusqu'à la fin de la fermentation. La mousse qui se 15 forme pendant la culture est cassée par la suspension aqueuse du Propinol B-400. La plus intense formation de mousse est observe vers les 18+24 heures de croissance, lorsque la biomasse augmente intensément, et il y a développement de CC^. La consommation moyenne de l'émulsion à 38°C de 1'anti-mousse 20 est de 3 litres à chaque fois. Pendant la culture, les hyphes de 1'actinomycète sont attachées à la surface des particules du substrat, et elle donnent lieu à la formation de conglomérats.

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Pendant la phase logarithmique, les hyphes qui sortent des conglomérats sont longues et élargies. Vers la fin de la croissance de la culture, les conglomérats des hyphes deviennent plus denses. Pendant la phase stationnaire de croissance, les hyphes sont courtes ou tout à fait invisibles. Vers la fin de la fermentation, on observe généralement un autolysé de 1'actinomycète. Les conglomérats comprimés par une lamelle de ferre couvre-objet observés au microscope se présentent comme masses informes. Le temps de fermentation varie entre 143 et 187 heures; en moyenne, il est généralement de 168 heures. La fin d'une fermentation est jugée sur la base des paramétres suivantes:

- absence de glucose dans le terrain;

- le contenu en avermectine n'est pas inférieur à 100 mcg/ml. A la fin de la fermentation, le liquid de culture du fermenteur est filtré et on obtient ainsi le jus de fermentation prêt pour l'isolement des avermectines.

EXEMPLE 1

A la fin de la fermentation selon la PREPARATION, 30 1 de jus intégral, ayant la suivante composition avermectines totales .... 720 mg/1 avermectine B^a + B-^ ... 150 mg/1

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avermectine Aja 86 mg/1

sediment humide 300 g/1

sont melangées avec 30 1 d'acétone dans un mélangeur muni d'agitateur très rapide. Le mélange est après transféré dans un'homogénéisateur à 5 haute pression pour la rupture des cellules. L'homogénéisé est chargé directement en contre-courant dans une colonne d'Amberlite ® XAD-8 à une vitesse de 110 ml/min. Le mélangé obtenu comme éluat en fractions de 1500 ml pendant la phase d'absorption contient les produits relatifs à la biomasse, alors qu'aucun produit relatif aux avermectines n'est 10 présent. On lave à la fin avec 5500 ml d'acétone 50% pour enlever le jus restant de la résine. L'élution des avermectines absorbées est faite initialement avec de l'acétone à 60% à la vitesse de 58 ml/min. en recueillant l'éluat en fractions de 750 ml. Les 4 premières fractions ne contiennent pas d'avermectines, les fractions 5-14 15 contiennent 1'avermectine Bja avec une quantité relativement faible de B2a. La plus grande partie d'avermectine Bla est élueé dans les fractions 15-21. L'avermectine A^a est présente dans la fraction finale obtenue par élution avec de l'acétone pur. La récupération des avermectines B-^a et B^ est environ de 85%. 20 EXEMPLE 2

L'homogénéisé, comme dans l'exemple 1, obtenu par traitement du jus intégral avec égal volume de méthanol, est centrifugé. Le liquide

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surnagéant limpide est chargé sur une colonne de Duolite ^ A7 (résine phénol-formaldéhyde polycondensé) à une vitesse de 100 ml/min. L'élution est conduite avec un mélange gradient éthanol-eau et avec le contrôle simultané du pH de l'éluat par l'emploi d'une solution 5 basique. Les fractions 13-20 réunies sont évaporées à sec et le residue est traité avec de l'acétate d'éthyle. Après la filtration de la partie insoluble, le filtrat limpide est évaporé sous vide à sec. Après cristallisation avec le méthanol on obtien 4,82 g d'avermectine B^a avec une pureté de 86%.

Claims (5)

10 REVENDICATIONS

1. Un procédé d'isolement d'avermectines caractérisée en ce qu'on homogénise le jus de fermentation intégral provenant d'une culture de Streptomyces avermitilis en presence d'un solvant miscible à l'eau, on traite l'homogénéisé ainsi obtenu avec une résine choisie

15 parmi les esters polyacrylique et les copolymères polycondensés phénol-formaldéhyde et on libère les avermectines absorbées sur la résine avec un gradient d'un mélange eau/solvant miscible à l'eau.

2. Un procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'homogéné isé est chargé sur une colonne contenant une résine avec matrice

20 d'esters polyacryliques ou de copolymères polycondensés phénol-formaldéhyde indiqués pour l'absorption des avermectines et que l'élution du produit a lieu avec un gradient d'un mélanop

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eau/solvant miscible à l'eau.

3. Un procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'homogénéisé est préparé par une methode mécanique choisie parmi les moulins à boulets, les homogénéisateurs à haute pression ou

4. Un procédé selon une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'homogénéisé est chargé directement en contre-courant sur une colonne pour l'absorption de les avermectines contenant un ester polyacrylique ou un copolymère polycondensé phénol-formaldéhyde. 10 5. Un procédé selon une des revendications précedéntes caractérisé en ce que l'élution de 1 'avermectines sur la résine est conduite avec un gradient d'un mélange d'eau et un solvant miscible à l'eau, choisi parmi acétone, méthanol, éthanol et isopropanol.

6. Un procédé selon une des revendications précedéntes caractérisé en 15 ce que le jus de fermentation intégral provient de la souche VKM Ac-

7. En tant que microorganisme nouveau, le Streptomyces avermitilis souche VKM Ac-1475 D.

5 machines à ultra-sons.

1475 D.