MD3291830T2 - Noi peptide și combinații de peptide și eşafodaje ale acestora pentru utilizare în imunoterapie împotriva carcinomului colorectal (CCR) și a altor cancere - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la peptide, proteine, acizi nucleici şi celule pentru utilizare în metode imunoterapeutice. În mod special, prezenta invenţie se referă la imunoterapia cancerului. În plus, prezenta invenţie se referă la epitopii peptidici ai celulelor T citotoxice asociate tumorii, singuri sau asociaţi cu alte peptide asociate tumorii, care pot servi, de exemplu, drept componente farmaceutice active ale formulelor de vaccin care stimulează răspunsurile imunitare antitumorale sau pentru stimularea celulelor T ex vivo şi transferarea la pacienţi. Peptidele legate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), sau peptidele ca atare, pot fi, de asemenea, ţinte ale anticorpilor, ale receptorilor solubili ai celulelor T şi ale altor molecule de legare.

Description

Prezenta invenţie se referă la peptide, proteine, acizi nucleici şi celule pentru utilizare în metode imunoterapeutice. În mod special, prezenta invenţie se referă la imunoterapia cancerului. În plus, prezenta invenţie se referă la epitopii peptidici ai celulelor T citotoxice asociate tumorii, singuri sau asociaţi cu alte peptide asociate tumorii, care pot servi, de exemplu, drept componente farmaceutice active ale formulelor de vaccin care stimulează răspunsurile imunitare antitumorale sau pentru stimularea celulelor T ex vivo şi transferarea la pacienţi. Peptidele legate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), sau peptidele ca atare, pot fi, de asemenea, ţinte ale anticorpilor, ale receptorilor solubili ai celulelor T şi ale altor molecule de legare.

Prezenta invenţie se referă la mai multe secvenţe peptidice noi şi variantele acestora derivate din moleculele HLA de clasă I ale celulelor tumorale umane care se pot folosi în formule de vaccin pentru inducerea de răspunsuri imunitare antitumorale sau drept ţinte pentru dezvoltarea de compuşi sau celule active din punct de vedere farmaceutic/imunologic.

FUNDAMENTELE INVENŢIEI

Cancerul colorectal (CRC) este al treilea cel mai frecvent cancer la bărbaţi şi al doilea cel mai frecvent cancer la femei. La nivel global, CRC reprezintă aproximativ 10% din toate cazurile de cancer nou diagnosticate. În 2012 au fost diagnosticate 1,36 milioane de cazuri noi de CRC, cu 746.000 de cazuri la bărbaţi şi 614.000 de cazuri la femei, rezultând un raport bărbaţi:femei de 1,2:1 (World Cancer Report, 2014). CRC este o boală a persoanelor în vârstă. Vârsta medie la momentul diagnosticării este de 68 de ani (SEER Stat facts, 2014).

Ratele de incidenţă variază geografic de aproximativ zece ori, cu similarităţi la bărbaţi şi la femei. Cele mai mari rate de incidenţă la ambele sexe apar în Australia/Noua Zeelandă (rata standardizată în funcţie de vârstă (ASR) = 45 la 100.000 de bărbaţi şi ASR = 32 la 100.000 de femei). Ratele de incidenţă în Europa arată variaţii regionale mici şi ASR = 38 la 100.000 de bărbaţi şi ASR = 25 la 100.000 de femei. Cele mai scăzute rate de incidenţă la nivel mondial sunt în Africa de Vest, cu 4,5 la 100.000 de bărbaţi şi 3,8 la 100.000 de femei (World Cancer Report, 2014).

Rata generală de supravieţuire la 5 ani pentru CRC este de aproximativ 65%. Cu toate acestea, ratele de supravieţuire depind de stadiul la momentul diagnosticării. Supravieţuirea la 5 ani pentru CRC localizat este de 89,8%, pentru CRC regional şi la distanţă de 70,5% şi, respectiv, 12,9%. CRC este a patra cea mai frecventă cauză de deces prin cancer (694.000 de decese; 8,5%) (SEER Stat facts, 2014; World Cancer Report, 2014).

CRC este de obicei stadializat utilizându-se sistemul TNM, care încorporează informaţii despre dimensiunea tumorii primare (T), implicarea ganglionilor limfatici (N) şi apariţia metastazelor la distanţă (M). Stadializarea UICC (Union Internationale Contre le Cancer) se bazează pe sistemul TNM şi include date statistice pentru predicţia prognosticului (Stintzing, 2014).

Cele mai recente studii clinice analizează imunoterapia activă ca opţiune de tratament împotriva CRC. Respectivele strategii includ vaccinarea cu peptide din antigeni asociaţi tumorii (TAA), celule tumorale întregi, vaccinuri cu celule dendritice (DC) şi vectori virali (Koido et al., 2013).

Vaccinurile peptidice au fost direcţionate până acum împotriva antigenului carcinoembrionar (CEA), mucinei 1, EGFR, antigenului carcinomului cu celule scuamoase recunoscut de celule T 3 (SART3), gonadotropinei corionice beta-umane (beta-hCG), antigenului tumorii Wilms 1 (WT1), survivinei-2B, MAGE3, p53, proteinei degetului inelar 43 şi translocazei membranei mitocondriale externe 34 (TOMM34) sau KRAS mutant. În mai multe studii clinice de fază I şi II, pacienţii au prezentat răspunsuri CTL specifice antigenului sau producţie de anticorpi. În contrast cu răspunsurile imunologice, numeroşi pacienţi nu au beneficiat de vaccinuri peptidice la nivel clinic (Koido et al., 2013; Miyagi et al., 2001; Moulton et al., 2002; Okuno et al., 2011).

Vaccinurile cu celule dendritice cuprind Celule dendritice (DC) pulsate cu peptide derivate din TAA, cu lizate de celule tumorale, cu celule tumorale apoptotice sau cu ARN tumoral ori produse de fuziune a celulelor tumorale DC. În timp ce numeroşi pacienţi din studiile de fază I/II au prezentat răspunsuri imunologice specifice, doar o minoritate a avut un beneficiu clinic (Koido et al., 2013).

Vaccinurile cu celule tumorale întregi constau din celule tumorale autologe modificate pentru a secreta GM-CSF, modificate prin iradiere sau celule infectate cu virus, iradiate. Majoritatea pacienţilor nu au prezentat beneficii clinice în mai multe studii de fază II/III (Koido et al., 2013).

Virusul vaccinia sau poxvirusul aviar cu deficienţă de replicare care codifică CEA, precum şi B7.1, ICAM-1 şi LFA-3 au fost utilizate ca vehicule în vaccinurile vectoriale virale în studii clinice de fază I. Un studiu diferit a folosit virusul canarypox nereplicant care codifică CEA şi B7.1. Pe lângă inducerea de răspunsuri la celule T specifice CEA, 40% dintre pacienţi au prezentat răspunsuri clinice obiective (Horig et al., 2000; Kaufman et al., 2008).

Având în vedere efectele secundare severe şi cheltuielile asociate cu tratarea cancerului, este necesară identificarea factorilor care pot fi utilizaţi în tratamentul cancerului în general şi al CRC în special. De asemenea, este necesară identificarea factorilor care reprezintă biomarkeri pentru cancer în general şi pentru CRC în special, conducând la îmbunătăţirea diagnosticării cancerului, a evaluării prognosticului şi a prezicerii succesului tratamentului.

Imunoterapia cancerului reprezintă o opţiune de ţintire specifică a celulelor canceroase concomitent cu minimizarea efectelor secundare. Imunoterapia cancerului foloseşte existenţa antigenilor asociaţi tumorii.

Clasificarea curentă a antigenilor asociaţi tumorii (AAT) cuprinde următoarele grupuri principale:

a) Antigenii pentru cancer testicular: Primele AAT identificate vreodată care se pot recunoaşte de către celulele T aparţin acestei clase, denumite iniţial antigeni de cancer testicular (CT), deoarece exprimarea membrilor clasei se face în diferite tipuri histologice de tumori umane şi, la nivelul ţesuturilor naturale, are loc numai în spermatocite/spermatogoniile din testicul şi, ocazional, în placentă. Deoarece celulele testiculare nu exprimă molecule HLA de clasă I şi II, aceşti antigeni nu pot fi recunoscuţi de celulele T în ţesuturi normale şi prin urmare pot fi consideraţi specifici tumorii din punct de vedere imunologic. Exemple bine cunoscute de antigeni CT sunt membrii familiei MAGE şi NY-ESO-1.

b) Antigene de diferenţiere: Aceste TAA sunt comune tumorilor şi ţesutului normal din care provin tumorile. Majoritatea antigenilor de diferenţiere cunoscuţi sunt identificaţi în melanoame şi melanocite normale. Multe dintre aceste proteine corelate cu linia melanocitară sunt implicate în biosinteza melaninei şi prin urmare nu sunt specifice tumorii, dar sunt totuşi folosite pe scară largă pentru imunoterapia cancerului. Exemplele includ, fără a se limita la, tirozinază şi Melan-A/MART-1 pentru melanom sau PSA pentru cancer prostatic.

c) TAA-uri supraexprimate: Genele care codifică TAA-uri larg exprimate au fost depistate în tipuri histologice diferite de tumori precum şi în multe ţesuturi normale, în general cu niveluri reduse de exprimare. Este posibil ca mulţi dintre epitopii procesaţi şi posibil prezentaţi de ţesuturile normale să fie sub nivelul prag pentru recunoaşterea de către celulele T, în timp ce supraexprimarea lor în celulele tumorale poate declanşa un răspuns anticanceros prin încălcarea toleranţei anterior stabilite. Exemplele cunoscute pentru această clasă de TAA-uri sunt Her-2/neu, survivina, telomeraza sau WT1.

d) Antigene specifice tumorilor: aceste TAA unice apar din mutaţii ale genelor normale (cum ar fi β-catenina, CDK4 etc.). Unele dintre aceste modificări moleculare sunt asociate cu transformări neoplazice şi/sau progresie. Antigenii specifici tumorii sunt în general capabile să inducă un răspuns imunitar puternic fără a purta riscul unor reacţii autoimune împotriva ţesuturilor normale. Pe de altă parte aceste TAA sunt în majoritatea cazurilor relevante numai tumorii exacte din care au fost identificate şi de obicei nu sunt comune mai multor tipuri individuale de tumori. Specificitatea (sau asocierea) cu tumoarea a unei peptide poate apărea, de asemenea, dacă peptida provine dintr-un exon din tumoare (asociat tumorii) în cazul izoformelor specifice tumorii (asociate tumorii).

e) TAA care apar prin modificări anormale posttranslaţie: aceste TAA apar din proteine care nu sunt nici specifice, nici supra-exprimate în tumori, dar care devin totuşi asociate tumorii prin procese post-translaţionale active în mod principal în tumori. Exemplele pentru aceste clase apar din tipare de glicozilare alterată, care duc la epitopi noi în tumori cum ar fi pentru MUC1 sau evenimente de tip scindarea proteinei in timpul degradării, care pot sau nu să fie specifice tumorii.

f) Proteine oncovirale: aceste TAA sunt proteine virale care pot juca un rol critic în procesul oncogen şi acestea, deoarece sunt străine (nu au origine umană) pot evoca un răspuns al celulelor T. Exemple de astfel de proteine sunt proteinele papilomavirusului uman de tip 16, E6 si E7, care sunt exprimate in carcinomul cervical.

Imunoterapia bazată pe celule T vizează epitopi peptidici derivaţi din proteine asociate tumorii sau specifice tumori, care sunt prezentate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC). Antigenii care sunt recunoscuţi de limfocitele T specifice tumorii, epitopii acestora, pot fi molecule derivate din toate categoriile de proteine, cum ar fi enzimele, receptorii, factorii de transcriere etc. care sunt exprimate şi care, comparativ cu celulele nemodificate cu aceeaşi origine, sunt, de obicei, suprareglate în celulele respectivei tumori.

Există două clase de molecule MHC, MHC de clasă I şi MHC de clasă II. Moleculele MHC de clasă I sunt compuse dintr-un lanţ greu alfa şi din beta-2-microglobuline, molecule MHC de clasă II ale unui lanţ alfa şi ale unui lanţ beta. Conformaţia lor tridimensională prezintă o incizură de legare care este folosită pentru interacţiuni necovalente cu peptide.

Moleculele MHC de clasă I pot fi găsite pe majoritatea celulelor nucleate. MHC de clasă I prezintă peptide care rezultă din clivajul proteolitic al proteinelor predominant endogene, produse ribozomale defecte (DRIP) şi peptide mai mari. Totuşi, proteinele derivate din compartimentele endozomale sau surse exogene se regăsesc frecvent pe moleculele MHC de clasă I. Această modalitate non-clasică de prezentare a clasei I este cunoscută în literatură ca „prezentare încrucişată» (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). Moleculele MHC de clasă II se pot găsi numai pe celulele „profesioniste» prezentatoare de antigen (APC) şi prezintă iniţial peptidele unor proteine exogene sau transmembranare captate de APC-uri, de exemplu în timpul endocitozei, şi care sunt procesate ulterior.

Complexele de peptidă şi MHC de clasă I sunt recunoscute de celule T CD8-pozitive purtătoare de receptor de celule T (TCR) adecvat, în timp ce complexele de peptidă şi molecule MCH de clasă II sunt recunoscute de celule T helper CD4-pozitive cu TCR-ul adecvat. Este bine cunoscut faptul că TCR, peptida şi MHC sunt prezente în raport stoechiometric 1:1:1.

Celulele T pozitive pentru CD4 joacă un rol important în inducerea şi susţinerea răspunsurilor efective de către celulele T citotoxice pozitive pentru CD8. Identificarea epitopilor celulelor T CD4-pozitive derivate din antigene asociate tumorilor (TAA) are o mare importanţă pentru dezvoltarea de produse farmaceutice care declanşează răspunsuri imune antitumorale (Gnjatic et al., 2003). La locul tumorii, celulele T helper susţin un mediu citokinic favorabil celulelor T citotoxice (CTL-favorabil) (Mortara et al., 2006) şi atrag celulele efectoare, de exemplu CTL-uri, celule natural killer (NK), macrofage şi granulocite (Hwang et al., 2007).

În absenţa inflamaţiei, exprimarea moleculelor MHC de clasă II este limitată în principal la celulele sistemului imunitar, în special la celulele profesioniste prezentatoare de antigen (APC) cum ar fi monocitele, celulele derivate din monocite, macrofagele sau celulele dendritice. La pacienţii cu cancer, celulele tumorale au fost identificate surprinzător că exprimă molecule MHC de clasă II (Dengjel et al., 2006).

Peptidele alungite (mai lungi) din descriere pot acţiona ca epitopi activi ai MHC de clasă II.

Celulele T helper, activate de epitopii MHC de clasă II, joacă un rol important în modularea rolului efector al CTL în imunitatea antitumorală. Epitopii celulelor T care declanşează un răspuns din partea celulelor T helper de tip TH1 susţin funcţiile efectorii ale celulelor T killer CD8-pozitive, care includ funcţii citotoxice îndreptate împotriva celulelor tumorale care prezintă pe suprafaţa celulară complexe MHC/peptide asociate tumorii. Astfel epitopii peptidei unei celule T helper asociate tumorii, singur sau asociat cu alte peptide asociate tumorii, poate servi ca ingredient farmaceutic activ al formulelor de vaccin care ar stimula răspunsul imunitar antitumoral.

S-a demonstrat pe modele animale (mamifere), de exemplu şoarece, că până şi în absenţa limfocitelor T CD8 pozitive, celulele T CD4-pozitive sunt suficiente pentru inhibarea manifestărilor tumorale prin inhibarea angiogenezei prin secreţia de interferon gamma (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Există dovezi pentru celule T CD4 ca efectori antitumorali direcţi (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Deoarece exprimarea constitutivă a moleculelor HLA de clasă II este, de obicei, limitată la celulele imune, posibilitatea de izolare a peptidelor de clasă II direct din tumori primare nu a fost considerată anterior posibilă. Totuşi, Dengjel et al. au reuşit să identifice un număr de epitopi MHC de clasă II direct din tumori (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).

Deoarece ambele tipuri de răspuns, CD8 şi CD4 dependente, contribuie împreună şi sinergic la efectul antitumoral, identificarea şi caracterizarea antigenilor asociaţi tumorii recunoscuţi de celule T CD8+ (ligand: moleculă MHC de clasă I + epitop peptidă) sau celule T helper CD4-pozitive (ligand: moleculă MHC de clasă II + epitop peptidă) este important în dezvoltarea de vaccinuri tumorale.

Pentru ca o peptidă MHC de clasă II să declanşeze (inducă) un răspuns imunitar celular, trebuie, de asemenea, să se lege de o moleculă MHC. Acest proces depinde de alelele moleculei MHC şi de polimorfismele specifice ale secvenţei de aminoacizi ai peptidei. Peptidele care leagă MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-12 resturi de aminoacizi şi conţin două resturi conservate („ancore») în secvenţa acestora, care interacţionează cu şanţul de legare corespunzătoare a moleculei MHC. Astfel, fiecare alelă MHC are un „motiv de legare» care determină ce peptide se pot lega specific de incizura de legare.

În cazul reacţiile imunitare dependente de MHC de clasă I, peptidele nu numai că se pot lega de anumite molecule MHC de clasă I exprimate de celulele tumorale, dar trebuie să fie şi recunoscute ulterior de celulele T care prezintă receptori specifici pentru celulele T (TCR).

Pentru ca proteinele să fie recunoscute de limfocitele T ca antigeni specifici tumorii sau asociaţi tumorii, şi pentru a putea fi utilizate în terapie, trebuie îndeplinite anumite condiţii prealabile. Antigenul trebuie să fie exprimat preponderent în celulele tumorale, şi deloc sau nici măcar în cantităţi mici în ţesuturile sănătoase. Într-o realizare preferată, peptida trebuie să fie supraprezentată de celulele tumorale comparativ cu ţesuturile sănătoase normale. Este, de asemenea, de dorit ca respectivul antigen să nu fie prezent într-un singur tip de tumoare, şi să fie prezent în concentraţii mari (de exemplu, număr de copii per celulă pentru respectiva peptidă). Antigenii specifici tumorii şi asociaţi tumorii sunt adesea derivate din proteine implicate direct în transformarea unei celule normale într-o celulă tumorale datorită funcţiei lor, de exemplu, în controlul ciclului celular sau suprimarea apoptozei. Suplimentar, ţintele din aval pentru proteinele care cauzează direct transformarea pot fi reglate în sens crescător şi prin urmare pot fi asociate indirect tumorii. Aceste antigene asociate indirect tumorii pot fi de asemenea ţinta unei abordări de tip vaccinare (Singh-Jasuja et al., 2004). Este esenţială prezenţa epitopilor în secvenţa de aminoacizi a antigenului pentru a se asigura faptul că o astfel de peptidă („peptidă imunogenă»), fiind derivată dintr-un antigen asociat tumorii, duce la un răspuns in vitro sau in vivo al celulelor T.

În principiu, orice peptidă care se poate lega de o moleculă MHC poate funcţiona ca epitop al celulei T. Cerinţa prealabilă pentru inducerea unui răspuns al celulelor T, in vitro sau in vivo, este prezenţa unei celule având TCR corespunzător şi absenţa toleranţei imunologice pentru acest anumit epitop.

Prin urmare, TAA sunt un punct de plecare pentru dezvoltarea unei terapii bazate pe celule T, incluzând, însă nelimitându-se la vaccinuri tumorale. Metodele pentru identificarea şi caracterizarea TAA sunt bazate, de obicei, pe utilizarea de celule T care se pot izola de la pacienţi sau subiecţi sănătoşi sau sunt bazate pe generarea de profiluri diferenţiate sau tipare de exprimare diferenţiate pentru peptide între tumori şi ţesuturi normale. Cu toate acestea, identificarea genelor supraexprimate în ţesuturi tumorale sau linii celulare tumorale umane sau exprimate selectiv în astfel de ţesuturi sau linii celulare nu asigură informaţii precise asupra utilizării antigenilor care se transcriu din aceste gene într-un tratament imunitar. Aceasta deoarece numai o subpopulaţie individuală de epitopi ai acestor antigeni este adecvată pentru o astfel de aplicaţie, deoarece o linie de celule T cu TCR corespunzător trebuie să fie prezentă iar toleranţa imunologică pentru acest anumit epitop trebuie să fie absentă sau minimală. Într-un exemplu foarte preferat este, deci, important să se selecteze numai acele peptide prezentate peste sau selectiv împotriva cărora se poate găsi o celulă T funcţională şi/sau proliferantă. Astfel de celule T funcţionale sunt definite ca celule T care, la stimularea cu un anumit antigen, pot fi extinse clonal şi pot executa funcţii efectoare („celule T efectoare»).

În cazul ţintirii peptidei-MHC de către TCR-uri specifice (de exemplu, TCR solubile) şi anticorpi sau alte molecule de legare (eşafodaje) descrise în prezentul document, imunogenitatea peptidelor subiacente este secundară. În aceste cazuri, prezentarea este factorul determinant.

WO 2015/018805 A1 descrie peptide care au capacitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II. WO 2009/015842A2 se referă la peptide derivate din antigeni asociaţi tumorii care sunt capabili să se lege de complexe MHC. Kristina Stenstedt, K., et al. (Anticancer research \tab32(9):3869-74) se referă la utilizarea exprimării enzimei citocromului P450 2W1 (CYP2W1) ca marker de prognostic pentru cancerul de colon. WO 2004/037282 se referă la utilizarea enzimei citocromului P450 CYP2W1 şi a promotorului acestuia ca ţintă medicamentoasă pentru terapia cancerului, precum şi la metodele de screening pentru obţinerea agenţilor terapeutici pentru terapia cancerului şi agenţii terapeutici care conţin fragmente care prezintă afinitate de legare pentru CYP2W1.

REZUMATUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie se referă la o peptidă care cuprinde secvenţa de aminoacid din SEQ ID NO 22, aşa cum este definită în Revendicarea 1 anexată. Alte aspecte ale invenţiei sunt definite în revendicările anexate.

Într-un prim aspect se descrie o peptidă care cuprinde o secvenţă aminoacidică selectată din grupul format din SEQ ID NO 1 până la SEQ ID NO: 191 sau o variantă de secvenţă a acestuia care este de cel puţin 77%, de preferinţă de cel puţin 88%, omologă (de preferinţă cel puţin 77% sau cel puţin 88% identică) cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191, în care varianta menţionată se leagă de MHC şi/sau induce celule T care reacţionează încrucişat cu peptida menţionată, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia, în care peptida menţionată nu este polipeptida de bază cu lungime completă.

Este descrisă, de asemenea, o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191 sau o variantă a acesteia care este de cel puţin 77%, de preferinţă de cel puţin 88%, omologă (de preferinţă cel puţin 77% sau cel puţin 88% identică) cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191, în care peptida menţionată sau varianta acesteia are o lungime totală între 8 şi 100, de preferinţă între 8 şi 30 şi, cel mai preferat, între 8 şi 14 aminoacizi.

Tabelele următoare prezintă peptida în conformitate cu prezenta descoperire, valorile lor SEQ ID NO: respective şi gena-sursă (subiacentă) prospectivă pentru această peptidă. Peptida din Tabelul 1 se leagă la HLA-A*02. Tabelul 2 este, de asemenea, util în diagnosticul şi/sau tratamentul diferitelor alte malignităţi care implică o supraexprimare sau o supraprezentare a polipeptidei respective.

Tabelul 1: Peptida în conformitate cu prezenta invenţie

SEQ ID NO: Secvenţă ID-uri gene Simboluri oficiale de gene 22 GLIDEVMVL 54905 CYP2W1

În plus, sunt dezvăluite în general peptidele descrise pentru utilizare în tratamentul bolilor proliferative, cum ar fi, de exemplu, cancerul pulmonar, cancerul cerebral, cancerul de stomac, cancerul renal, cancerul hepatic, cancerul pancreatic, cancerul de prostată, leucemia, cancerul de glandă mamară, carcinomul cu celule Merkel (MCC), melanomul, cancerul ovarian şi cancerul esofagian.

Preferate în mod special sunt peptidele - singure sau în combinaţie - în conformitate cu prezenta descoperire selectate din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191. Mai preferate sunt peptidele - singure sau în combinaţie - selectate din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 68 (vezi Tabelul 1) şi utilizările acestora în imunoterapia pentru CRC, cancer pulmonar, cancer cerebral, cancer de stomac, cancer renal, cancer hepatic, cancer pancreatic, cancer de prostată, leucemie, cancer de glandă mamară, carcinom cu celule Merkel, melanom, cancer ovarian şi cancer esofagian şi, de preferinţă, CRC.

Cele mai preferate sunt peptidele - singure sau în combinaţie - selectate din grupul format din SEQ ID NO: 1, 3, 6, 11, 13, 16, 18, 19, 22, 23, 24, 26, 31, 32, 34, 37, 40, 44, 45, 59, 67, 71, 82, 87, 88, 100, 103, 105, 113, 123, 124, 126, 129, 131, 132, 133, 135, 137, 140, 142, 150, 152, 153 şi SEQ ID NO: 166 şi utilizările acestora în imunoterapia pentru CRC, cancer pulmonar, cancer cerebral, cancer de stomac, cancer renal, cancer hepatic, cancer pancreatic, cancer de prostată, leucemie, cancer de glandă mamară, carcinom cu celule Merkel, melanom, cancer ovarian şi cancer esofagian şi, de preferinţă, CRC. Peptida din SEQ ID NO: 22 este, de asemenea, preferată în mod special pentru metodele descrise mai jos de generare a respectivilor receptori de celule T (TCR-uri).

Aşa cum se arată în Tabelul 2 de mai jos, peptida în conformitate cu prezenta descoperire se găseşte, de asemenea, pe alte tipuri de tumori şi, prin urmare, poate fi utilizată, de asemenea, în imunoterapia altor indicaţii. Consultaţi, de asemenea, Figura 1D şi Exemplul 1.

Tabelul 2: Peptida în conformitate cu prezenta invenţie şi utilizările sale specifice în alte boli proliferative, în special în alte boli canceroase. Tabelul arată peptida şi pe ce tipuri de tumori suplimentare a fost găsită, prezentând supraprezentare (inclusiv prezentare specifică) pe mai mult de 5% din probele tumorale măsurate sau prezentare pe mai mult de 5% din probele tumorale măsurate cu un raport de medii geometrice tumoare vs. ţesuturi normale mai mare de 3. Supraprezentarea este definită ca prezentare mai mare pe proba tumorală în comparaţie cu proba normală cu prezentarea cea mai mare. Ţesuturile normale pe care a fost testată supraprezentarea au fost: ţesut adipos, glandă suprarenală, celule sanguine, vas de sânge, măduvă osoasă, creier, esofag, ochi, vezică biliară, inimă, rinichi, intestin gros, ficat, plămân, ganglion limfatic, nerv, pancreas, glandă paratiroidă, peritoneu, hipofiză, pleură, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, glandă tiroidă, trahee, ureter, vezică urinară.

SEQ ID NO: Secvenţă Entităţi suplimentare 22 GLIDEVMVL Cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară

NSCLC = cancer pulmonar cu celule mici, SCLC = cancer pulmonar cu celule mici, RCC = cancer renal, CRC = cancer de colon sau rect, GC = cancer stomacal, HCC = cancer hepatic, PC = cancer pancreatic, PrC = cancer de prostată, BRCA = cancer mamar, MCC = carcinom cu celule Merkel, OC = cancer ovarian, NHL = limfom non-Hodgkin, AML = leucemie mieloidă acută, CLL = leucemie limfocitară cronică.

Astfel, un alt aspect al prezentei descoperiri se referă la utilizarea peptidelor descrise în prezentul document pentru tratamentul - de preferinţă combinat - al unei boli proliferative selectate din grupul de CRC, cancer pulmonar, cancer cerebral, cancer de stomac, cancer renal, cancer hepatic, cancer pancreatic, cancer de prostată, leucemie, cancer de glandă mamară, carcinom cu celule Merkel, melanom, cancer ovarian şi cancer esofagian.

Prezenta descoperire se referă, în plus, la peptidele descrise în prezentul document care au capacitatea de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau - într-o formă alungită, cum ar fi o variantă de lungime - sau de clasă II.

Prezenta descoperire se referă şi la peptidele descrise în prezentul document în care peptidele respective (fiecare) constau, în esenţă, dintr-o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191.

Prezenta invenţie se referă în continuare la peptidele descrise în prezentul document, în care respectiva peptidă este modificată şi/sau include legături non-peptidice.

Prezenta descoperire se referă suplimentar la peptidele descrise în prezentul document, în care respectiva peptidă face parte dintr-o proteină de fuziune, în special fuzionată cu aminoacizi N-terminali ai lanţului invariant (Ii) asociat cu antigenul HLA-DR sau fuzionată cu un anticorp (sau în secvenţa unui anticorp), cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celulele dendritice.

Prezenta descoperire se referă în continuare la un acid nucleic care codifică peptidele descrise în prezentul document. Prezenta descoperire referă în continuare la acidul nucleic descris în prezentul document, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora.

Prezenta descoperire se referă în continuare la un vector de exprimare care este capabil să exprime şi/sau exprimă un acid nucleic aşa cum este descris în prezentul document.

Prezenta descoperire se referă în continuare la o peptidă conform descrierii din prezentul document, un acid nucleic conform descrierii din prezentul document sau un vector de exprimare conform descrierii din prezentul document pentru utilizare în tratamentul bolilor şi în medicină, în special în tratamentul cancerului.

Prezenta descoperire se mai referă la anticorpi care sunt specifici împotriva peptidelor descrise în prezentul document sau complexe ale peptidelor menţionate în conformitate cu descrierea din prezentul document cu MHC şi metode de realizare a acestora.

Prezenta descoperire se referă în continuare la receptori de celule T (TCR), în special TCR solubil (sTCR) şi TCR clonate transformate în celule T autologe sau alogene şi metode de realizare a acestora, precum şi celule NK sau alte celule care poartă respectivul TCR sau care reacţionează încrucişat cu TCR menţionate.

Anticorpii şi TCR sunt concretizări suplimentare ale utilizării imunoterapeutice a peptidelor în conformitate cu descrierea din prezentul document.

Prezenta descoperire se referă în continuare la o celulă gazdă cuprinzând un acid nucleic în conformitate cu descrierea din prezentul document sau un vector de exprimare descris anterior. Prezenta descoperire se referă în continuare la celula-gazdă în conformitate cu descrierea din prezentul document, care este o celulă prezentatoare de antigen şi, de preferinţă, este o celulă dendritică.

Prezenta descoperire se referă în continuare la o metodă de producere a unei peptide în conformitate cu descrierea din prezentul document, metoda cuprinzând cultivarea celulei gazdă în conformitate cu descrierea din prezentul document şi izolarea peptidei din celula gazdă menţionată sau din mediul său de cultură.

Prezenta descoperire se referă în continuare la metoda menţionată în conformitate cu prezenta descoperire în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I sau de clasă II exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

Prezenta descoperire se referă în continuare la metoda în conformitate cu prezenta descoperire în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare capabil să exprime respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO: 1 până la SQ ID NO: 191, de preferinţă conţinând SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 68, sau o variantă de secvenţă de aminoacizi.

Prezenta descoperire se referă în continuare la celulele T activate produse prin metoda descrisă în prezentul document, în care celula T menţionată recunoaşte selectiv o celulă care exprimă o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu descrierea din prezentul document.

Prezenta descoperire se referă în continuare la o metodă de ucidere a celulelor ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi în conformitate cu descrierea din prezentul document, metoda cuprinzând administrarea, la pacient, a unui număr eficace de celule T produse în conformitate cu descrierea din prezentul document.

Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, acidul nucleic în conformitate cu prezenta descoperire, vectorul de exprimare în conformitate cu prezenta descoperire, celula în conformitate cu prezenta descoperire, limfocitul T activat, receptorul celulelor T sau anticorpul sau alte molecule de legare peptidică şi/sau peptidă-MHC în conformitate cu prezenta descoperire ca medicament sau la fabricarea unui medicament. De preferinţă, respectivul medicament este activ împotriva cancerului.

De preferinţă, respectivul medicament este o terapie celulară, un vaccin sau o proteină bazată pe un TCR sau anticorp solubil.

Prezenta dezvăluire se referă în continuare la o utilizare descrisă în prezentul document, în care celulele canceroase menţionate sunt CRC, cancer pulmonar, cancer cerebral, cancer de stomac, cancer renal, cancer hepatic, cancer pancreatic, cancer de prostată, leucemie, cancer de glandă mamară, carcinom cu celule Merkel (MCC), melanom, cancer ovarian şi cancer esofagian şi, de preferinţă, celule CRC.

Prezenta descoperire se referă în continuare la biomarkeri pe baza peptidelor descrise în prezentul document, numite aici „ţinte», care pot fi utilizate în diagnosticarea cancerului, de preferinţă CRC. Markerul poate fi supraprezentarea peptidei (peptidelor) în sine sau supraexprimarea genei (genelor) corespunzătoare. Markerii pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a prezice probabilitatea de succes a unui tratament, de preferinţă o imunoterapie, şi, cel mai preferat, o imunoterapie care vizează aceeaşi ţintă identificată de biomarker. De exemplu, un anticorp sau un TCR solubil poate fi utilizat pentru colorarea secţiunilor tumorii pentru detectarea prezenţei unei peptide de interes în complex cu MHC.

Opţional, anticorpul poartă o funcţie efectoare suplimentară, cum ar fi un domeniu de stimulare imunitară sau o toxină.

Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la utilizarea acestor ţinte noi în contextul tratamentului cancerului.

Utilizările terapeutică şi diagnostică împotriva cancerelor suplimentare sunt prezentate în următoarea descriere mai detaliată a produselor de exprimare subiacente (polipeptide) ale peptidelor în conformitate cu descoperirea.

CYP2W1 codifică un membru al superfamiliei citocromului P450 de enzime care sunt monooxigenaze ce catalizează numeroase reacţii implicate în metabolismul medicamentelor şi în sinteza colesterolului, a steroizilor şi a altor lipide (RefSeq, 2002). CYP2W1 este supraexprimat într-o varietate de tipuri de cancer uman, inclusiv cancer hepatocelular, colorectal şi gastric. Supraexprimarea CYP2W1 este asociată cu progresia tumorii şi supravieţuirea slabă (Aung et al., 2006; Gomez et al., 2010; Zhang et al., 2014e). Datorită exprimării specifice tumorii, CYP2W1 este o ţintă interesantă a medicamentului sau un activator enzimatic al promedicamentelor în timpul terapiei anticancer (Karlgren şi Ingelman-Sundberg, 2007; Nishida et al., 2010).

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢEI

Stimularea unui răspuns imunitar depinde de prezenţa unor antigeni recunoscuţi ca străini de către sistemul imunitar al gazdei.8 Descoperirea antigenilor asociaţi tumorilor a creat posibilitatea de a folosi sistemul imunitar al gazdei pentru a interveni asupra creşterii tumorale. În prezent, imunoterapia cancerului explorează diferite mecanisme de valorificare a ambelor componente, umorală şi celulară, ale sistemului imunitar.

Elemente specifice ale răspunsului imunitar celular sunt capabile de a recunoaşte şi distruge în mod specific celulele tumorale. Izolarea celulelor T din populaţiile celulare care infiltrează tumorile sau din sângele periferic sugerează că aceste celule au un rol important în reacţia imunitară naturală împotriva cancerului. În special celulele T CD8-pozitive capabile să recunoască moleculele de clasă I ale peptidelor purtătoare ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), care includ, de obicei, 8 până la 10 resturi de aminoacizi derivate din proteine sau produse ribozomale defectuoase (DRIP) localizaţi în citozol, joacă un rol important în acest răspuns. Moleculele MHC umane sunt desemnate şi ca antigeni leucocitari umani (HLA).

După cum sunt folosiţi aici, şi cu excepţia cazurilor în care este altfel specificat, toţi termenii sunt definiţi după cum urmează:

Termenul „răspuns celular T» se referă la proliferarea şi activarea specifică a funcţiilor efectoare induse de o peptidă, in vitro sau in vivo. Pentru celule T citotoxice restricţionate la MHC de clasă I, funcţiile efectoare pot fi de liză a celulelor ţintă cu peptide pulsate, precursori de peptide pulsate sau care prezintă peptide naturale, de secreţie de citokine, preferabil interferon gamma, TNF-alfa sau IL-2 indusă de peptide, secreţie de molecule efectoare, preferabil granzime sau perforine induse de peptidă, sau degranulare.

Termenul „peptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Peptidele au, preferabil, o lungime de 9 aminoacizi, dar pot avea lungimea de 8 aminoacizi şi până la 10, 11, 12, 13 sau 14 aminoacizi sau mai mult şi, în cazul peptidelor MHC de clasă II (variante alungite ale peptidelor din descoperire), pot avea o lungime de 15, 16, 17, 18, 19 sau 20 de aminoacizi sau mai mult.

Mai mult, termenul „peptidă» va include săruri ale unei serii de resturi aminoacid conectate între ele, de obicei, prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. De preferinţă, sărurile sunt săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic ale peptidelor, cum ar fi, de exemplu, sărurile de clorură sau acetat (trifluoroacetat). Trebuie menţionat că sărurile peptidelor în conformitate cu prezenta descoperire diferă în mod substanţial de peptidele în starea lor in vivo, întrucât peptidele nu sunt săruri in vivo.

Termenul „peptidă» include, de asemenea, „oligopeptidă». Termenul „oligopeptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea oligopeptidei nu este critică pentru invenţie atât timp cât epitopul corect (sau epitopii corecţi) se includ în aceasta. Oligopeptidele au, de obicei, o lungime mai mică de 30 de aminoacizi, dar mai mare de 15 aminoacizi.

Termenul „polipeptidă» desemnează o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi -carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea polipeptidei nu este critică pentru invenţie atâta timp cât sau epitopii corecţi se păstrează. Spre deosebire de termenii „peptidă» sau „oligopeptidă», termenul „polipeptidă» se referă la molecule care conţin mai mult de circa 30 de resturi de aminoacid.

O peptidă, oligopeptidă, proteină sau polinucleotidă care codifică o astfel de moleculă este „imunogenă» (desemnată prin termenul „imunogen» în prezenta invenţie) dacă este capabilă să inducă un răspuns imunitar. În cazul prezentei invenţii, imunogenitatea este definită mai specific ca fiind abilitatea de a induce un răspuns mediat de celulele T. Astfel, o „imunogenă» este o moleculă capabilă să inducă un răspuns imunitar şi, în cazul prezentei invenţii, o moleculă capabilă să inducă un răspuns al celulelor T. Într-un alt aspect, imunogenul poate fi peptida, complexul peptidei cu MHC, oligopeptida şi/sau proteina care este utilizată pentru a ridica anticorpi sau TCR-uri specifice împotriva acesteia.

Un „epitop» al celulei T de clasă I necesită o peptidă scurtă care se leagă de receptorul MHC de clasă I formând un complex ternar (catenă alfa MCH de clasă I, beta-2-microglobulină şi peptidă) care poate fi recunoscut de o celulă T care poartă un receptor de celulă T corespunzător care se leagă de complexul MHC/peptidă cu afinitatea adecvată. Peptidele care se leagă de molecule MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-14 aminoacizi, cel mai frecvent având lungimea de 9 aminoacizi.

La oameni există trei loci genetici diferiţi care codifică moleculele MHC de clasă I (moleculele MHC ale omului sunt şi antigeni leucocitari umani desemnaţi (HLA)): HLA-A, HLA-B şi HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, şi HLA-B*07 sunt exemple de diferite alele MHC de clasă I care pot fi exprimate din aceşti loci.

Tabelul 3: Frecvenţele de exprimare F pentru HLA*A02 şi HLA-A*24 şi cele mai frecvente serotipuri HLA-DR. Frecvenţele sunt deduse din frecvenţele haplotipurilor Gf din populaţia americană adaptate din Mori et al. (Mori et al., 1997) folosind formula Hardy-Weinberg: F = 1 - (1-Gf)І. Combinaţiile de A*02 sau A*24 cu anumite alele HLA-DR pot fi îmbogăţite sau mai puţin frecvente decât s-a estimat pe baza frecvenţelor singulare datorită unor dezechilibre de legare. Pentru detalii, vezi Chanock et al. (Chanock et al., 2004).

Alelă Populaţie Fenotip calculat din frecvenţa alelei A*02 Caucaziană (America de Nord) 49,1% A*02 Afro-americană (America de Nord) 34,1% A*02 Asiatic-americană (America de Nord) 43,2% A*02 Latino-americană (America de Nord) 48,3% DR1 Caucaziană (America de Nord) 19,4% DR2 Caucaziană (America de Nord) 28,2% DR3 Caucaziană (America de Nord) 20,6% DR4 Caucaziană (America de Nord) 30,7% DR5 Caucaziană (America de Nord) 23,3% DR6 Caucaziană (America de Nord) 26,7% DR7 Caucaziană (America de Nord) 24,8% DR8 Caucaziană (America de Nord) 5,7% DR9 Caucaziană (America de Nord) 2,1% DR1 Afro-(nord)-americană 13,20% DR2 Afro-(nord)-americană 29,80% DR3 Afro-(nord)-americană 24,80% DR4 Afro-(nord)-americană 11,10% DR5 Afro-(nord)-americană 31,10% DR6 Afro-(nord)-americană 33,70% DR7 Afro-(nord)-americană 19,20% DR8 Afro-(nord)-americană 12,10% DR9 Afro-(nord)-americană 5,80% DR1 Afro-(nord)-americană 6,80% DR2 Afro-(nord)-americană 33,80% DR3 Afro-(nord)-americană 9,20% DR4 Afro-(nord)-americană 28,60% DR5 Afro-(nord)-americană 30,00% DR6 Afro-(nord)-americană 25,10% DR7 Afro-(nord)-americană 13,40% DR8 Afro-(nord)-americană 12,70% DR9 Afro-(nord)-americană 18,60% DR1 Latino-(nord)-americană 15,30% DR2 Latino-(nord)-americană 21,20% DR3 Latino-(nord)-americană 15,20% DR4 Latino-(nord)-americană 36,80% DR5 Latino-(nord)-americană 20,00% DR6 Latino-(nord)-americană 31,10% DR7 Latino-(nord)-americană 20,20% DR8 Latino-(nord)-americană 18,60% DR9 Latino-(nord)-americană 2,10% A*24 Filipine 65% A*24 Neneţia, Rusia 61% A*24:02 Japonia 59% A*24 Malaysia 58% A*24:02 Filipine 54% A*24 India 47% A*24 Coreea de Sud 40% A*24 Sri Lanka 37% A*24 China 32% A*24:02 India 29% A*24 Australia de Vest 22% A*24 SUA 22% A*24 Samara, Rusia 20% A*24 America de Sud 20% A*24 Europa 18%

Peptidele din descoperire, de preferinţă atunci când sunt incluse într-un vaccin al descoperirii, aşa cum este descris aici, se leagă de A*02. Un vaccin poate include, de asemenea, peptide MHC de clasă II. Prin urmare, vaccinul din descoperire poate fi utilizat pentru tratarea cancerului la pacienţi care sunt A*02 pozitivi, întrucât nu este necesară nicio selecţie pentru alotipurile MHC de clasă II având în vedere natura de pan-legare a acestor peptide.

Dacă peptidele A*02 din descoperire sunt combinate cu peptide care se leagă la o altă alelă, de exemplu A*24, un procent mai mare din orice populaţie de pacienţi poate fi tratat comparativ cu abordarea oricărei alele de MHC de clasă I singulare. În timp ce în majoritatea populaţiilor, mai puţin de 50% dintre pacienţi pot fi abordaţi printr-o alelă singulară, un vaccin care conţine epitopi de HLA-A*24 şi HLA-A*02 poate trata cel puţin 60% dintre pacienţi din orice populaţie relevantă. În mod specific, următoarele procentaje de pacienţi vor fi pozitive pentru cel puţin una dintre aceste alele în diferite regiuni: SUA 61%, Europa de Vest 62%, China 75%, Coreea de Sud 77%, Japonia 86% (calcule de pe www.allelefrequencies.net).

Într-o concretizare preferată, termenul „secvenţă nucleotidică» se referă la un heteropolimer al dezoxiribonucleotidelor.

Secvenţa nucleotidică ce codifică o anumită peptidă, oligopeptidă sau polipeptidă poate fi întâlnită în mod natural sau poate fi construită artificial. În general, segmentele ADN care codifică peptidele, polipeptidele şi proteinele care fac subiectul acestei descoperiri sunt asamblate pornind de la fragmente ADNc şi liganzi scurţi oligonucleotidici sau de la serii de oligonucleotide, care asigură o genă sintetică capabilă de a fi exprimată într-o unitate de transcriere recombinantă care conţine elemente regulatoare derivate dintr-un operon microbian sau viral.

Aşa cum se utilizează aici, termenul „o codificare (sau codare) cu nucleotide pentru o peptidă» se referă la o codificare cu o secvenţă de nucleotide pentru peptidă care include coduri de start şi stop artificiale (făcute de om) compatibile pentru sistemul biologic pentru care secvenţa urmează să fie exprimată, de exemplu, o celulă dendritică sau un alt sistem celular util pentru producerea de TCR.

Aşa cum este utilizată aici, referirea la o secvenţă de acid nucleic include atât acid nucleic monocatenar, cât şi acid nucleic dublu-catenar. Astfel, de exemplu pentru ADN, secvenţa specifică, dacă contextul nu indică altminteri, se referă la ADN-ul monocatenar al secvenţei respective, la duplexul respectivei secvenţe cu complementul acesteia (ADN dublu catenar) şi la complementul secvenţei respective.

Termenul „regiune de codare» se referă la acea porţiune a genei care codifică, fie în mod natural, fie în mod normal, produsul de exprimare al acelei gene în mediul său genomic natural, adică regiunea care codifică in vivo produsul de expresie nativ al genei respective.

Regiunea de codificare poate fi derivată dintr-o genă non-mutantă („normală»), mutantă sau alterată ori poate fi derivată chiar dintr-o secvenţă ADN sau o genă sintetizată în întregime în laborator folosindu-se metode bine cunoscute profesioniştilor din domeniul sintezelor ADN.

Termenul „produs de exprimare» se referă la polipeptida sau proteina care reprezintă produsul natural de translaţie al genei şi orice echivalenţi de codificare a secvenţei de acid nucleic rezultaţi din degenerarea codului genetic care, astfel, codifică aceiaşi aminoacizi.

Termenul „fragment», atunci când se referă la o secvenţă de codificare, înseamnă o porţiune de ADN care conţine mai puţin decât regiunea completă de codificare, al cărei produs complet de exprimare reţine, în principal, aceeaşi funcţie sau activitate biologică ca şi produsul de exprimare al întregii regiuni de codificare.

Termenul „segment ADN» se referă la un polimer ADN, sub forma unui fragment separat sau ca o componentă a unei construcţii ADN mai mari, care a fost obţinută din ADN izolat cel puţin o dată în formă substanţială pură, adică fără contaminanţi endogeni şi în cantităţi sau concentraţii care permit identificarea, manipularea şi recuperarea segmentului şi a secvenţelor nucleotidice componente prin metode biochimice standard, de exemplu prin utilizarea unui vector de clonare. Aceste segmente sunt furnizate sub forma unui cadru deschis de citire, neîntrerupt de secvenţe interne netraduse (sau introni) care sunt de obicei prezente în genele eucariote. Secvenţele de ADN netradus pot fi prezente în aval de cadrul de citire deschis, unde acestea nu interferă cu manipularea sau exprimarea regiunilor de codificare.

Termenul „amorsă» se referă la o secvenţă de acid nucleic scurtă care poate fi cuplată cu o monocatenă de ADN şi care asigură un capăt 3'-OH liber la nivelul căruia ADN polimeraza începe sinteza unei catene dezoxiribonucleotidice.

Termenul „promotor» se referă la o regiune de ADN implicată în legarea ARN-polimerazei pentru a iniţia transcrierea.

Termenul „izolat» se referă la faptul că materialul este îndepărtat din mediul său original (de exemplu, mediul natural, dacă apare în mod natural). De exemplu, o polinucleotidă sau polipeptidă care apare natural într-un animal viu nu este izolată; dar aceeaşi polinucleotidă sau polipeptidă separată de una sau toate materialele coexistente din sistemul natural reprezintă un izolat. Aceste polinucleotide pot face parte dintr-un vector şi/sau aceste polinucleotide sau polipeptide pot face parte dintr-un compus, dar rămânând izolate deoarece vectorul sau compusul nu face parte din mediul natural.

Polinucleotidele şi polipeptidele recombinate sau imunogene, dezvăluite în conformitate cu prezenta descoperire, pot să fie în formă „purificată». Termenul „purificat» nu se referă la puritate absolută; mai degrabă este intenţionat ca definiţie relativă, şi poate include produse care sunt înalt purificate sau produse care sunt numai parţial purificate, deoarece aceşti termeni sunt înţeleşi de cei instruiţi în domeniul relevant. Pentru exemplificare, clonele individuale izolate dintr-o bibliotecă de ADNc au fost purificate în mod convenţional până la omogenitate electroforetică. Purificarea materialelor de început sau naturale până la cel puţin un ordin de mărime, preferabil la două sau trei ordine de mărime, şi ideal la patru sau cinci ordine de mărime este de dorit în special. Mai mult, este avută în vedere în mod special o polipeptidă revendicată care are o puritate de, preferabil, 99,999%, sau cel puţin 99,99% sau 99,9%; sau chiar şi 99% ca greutate sau mai mare.

Produsele de exprimare a acizilor nucleici şi polipeptidelor descrise în conformitate cu prezenta descoperire, precum şi vectorii de exprimare care conţin aceşti acizi nucleici şi/sau aceste polipeptide pot fi în „formă îmbogăţită». În accepţiunea documentului, termenul „îmbogăţit» se referă la faptul că materialul respectiv este în concentraţie de cel puţin 2, 5, 10, 100 sau 1000 de ori mai mare decât concentraţia sa naturală (de exemplu), mai avantajos 0,01% masic, preferabil cel puţin 0,1% masic. Produsele îmbogăţite cu 0,5%, 1%, 5%, 10% şi 20% masic sunt de asemenea de interes. Secvenţele, compuşii, vectorii, clonele şi celelalte materiale care sunt cuprinse în prezenta descoperire pot fi, în funcţie de interes, în formă îmbogăţită sau izolată. Termenul „fragment activ» se referă la un fragment, de obicei o peptidă, o polipeptidă sau o secvenţă de acid nucleic, care generează un răspuns imunitar (adică, are activitate imunogenă) la administrare, singur sau, opţional, alături de un adjuvant adecvat, unui animal, cum ar fi de exemplu un mamifer, ca de exemplu un iepure sau cobai, dar care include si un om, răspunsul imunitar putând lua forma unui răspuns de stimulare a celulelor T în cadrul animalului primitor, cum ar fi omul. Alternativ, termenul „fragment activ» se poate utiliza pentru inducerea unui răspuns celular T in vitro.

În accepţiunea prezentului document, termenii „porţiune», „segment» şi „fragment», atunci când sunt folosiţi în raport cu polipeptidele, se referă la o secvenţă continuă de resturi, cum ar fi resturi de aminoacid, care secvenţă formează un subset al unei secvenţe mai mari. De exemplu, dacă o polipeptidă este supusă unui tratament cu oricare dintre endopeptidazele uzuale, cum ar fi tripsina sau chimotripsina, oligopeptidele care rezultă din acest tratament reprezintă porţiuni, segmente sau fragmente ale polipeptidei iniţiale. Atunci când sunt folosiţi în raport cu polinucleotidele, aceşti termeni se referă la produse obţinute prin tratarea polinucleotidelor respective cu oricare dintre endonucleazele uzuale.

În accepţiunea prezentului brevet, termenul de „identitate procentuală» sau „procentaj identic», cu referire la o secvenţă, presupune că o secvenţă este comparată cu o secvenţă patentată sau descrisă după alinierea secvenţei care se compară („secvenţa comparată») cu secvenţa descrisă sau patentată („secvenţă de referinţă»). Identitatea procentuală se determină conform următoarei formule:

identitate procentuală = 100 [1-(C/R)]

unde C este numărul de diferenţe dintre secvenţa de referinţă şi secvenţa comparată pe lungimea aliniamentului dintre secvenţa de referinţă şi cea comparată, în care

(i) fiecare bază sau aminoacid din secvenţa de referinţă care nu are un corespondent aliniat, bază sau aminoacid, în secvenţa comparată şi

(ii) fiecare lipsă din secvenţa de referinţă şi

(iii) fiecare bază sau aminoacid aliniat(ă) din secvenţa de referinţă care diferă de baza sau aminoacidul aliniat din secvenţa comparată, reprezintă diferenţe;

(iiii) alinierea trebuie să înceapă la poziţia 1 a secvenţelor aliniate;

şi R este numărul de baze sau aminoacizi din secvenţa de referinţă pe lungimea alinierii cu secvenţa comparată, orice lipsă apărută în secvenţa de referinţă fiind de asemenea numărată ca bază sau aminoacid.

Dacă există un aliniament între secvenţa comparată şi secvenţa de referinţă pentru care identitatea procentuală calculată anterior este aproximativ egală cu, sau mai mare decât o identitate procentuală minimă specificată, atunci secvenţa comparată are o identitate procentuală minimă specificată cu secvenţa de referinţă, deşi pot exista aliniamente pentru care anterior-menţionata identitate procentuală să fie mai mică decât identitatea procentuală specificată.

După cum s-a menţionat mai sus, prezenta descoperire furnizează, astfel, o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191 sau o variantă a acesteia care este 88% omologă SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191, sau o variantă a acesteia care va induce reactivitate încrucişată a celulelor T cu peptida menţionată. Peptidele din descoperire au capacitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau de versiuni alungite ale peptidelor menţionate la clasa II.

În prezenta descoperire, termenul „omolog» se referă la gradul de identitate (consultaţi secţiunea „Identitate procentuală» de mai sus) dintre secvenţele a două secvenţe de aminoacizi, adică secvenţe peptidice sau polipeptidice. Anterior menţionata „omologie» se stabileşte prin compararea a două secvenţe aliniate in condiţii optime cu secvenţele care vor trebui comparate. O astfel de omologie a secvenţei se poate calcula prin crearea unei alinieri folosind, de exemplu, algoritmul ClustalW. Programe de analiză a secvenţei disponibile în mod obişnuit, mai specific Vector NTI, GENETYX sau alte instrumente sunt furnizate de baze de date publice.

Specialiştii în domeniu vor putea analiza dacă celulele T induse de o variantă a unei peptide specifice vor putea reacţiona încrucişat cu peptida în sine (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

Prin „variantă» a unei secvenţe date de aminoacizi, inventatorii se referă la faptul că lanţurile secundare provenite, de exemplu, de la unul sau două resturi de aminoacid sunt modificate (de exemplu prin substituirea lor cu lanţul secundar al altui rest de aminoacid natural sau cu un alt lanţ secundar) astfel încât peptida să fie în continuare capabilă să se lege de molecula HLA în principal în acelaşi mod ca şi peptida care conţine secvenţa dată de aminoacid constând din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191. De exemplu, o peptidă se poate modifica astfel încât aceasta să menţină, dacă nu să amelioreze posibilitatea de a interacţiona cu şi de a se lega de un situs de legare al unei molecule MHC adecvate, cum ar fi HLA-A*02 sau -DR, şi astfel să menţină - cel puţin, dacă nu să îmbunătăţească abilitatea de a se lega la TCR pentru celulele T activate.

Aceste celule T pot apoi reacţiona încrucişat cu celulele şi pot distruge celulele care exprimă o polipeptidă care conţine secvenţa naturală de aminoacizi a peptidei înrudite definite în descrierea descoperirii. După cum se poate deriva din literatura de specialitate şi baze de date (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), anumite poziţii ale peptidelor care leagă HLA sunt de obicei reziduuri ancoră care constituie o secvenţă centrală care corespunde tiparului de cuplare al incizurii de cuplare a receptorului HLA, care este definit de proprietăţile polare, electrofizice, hidrofobe şi spaţiale ale lanţului polipeptidei care constituie incizura de cuplare. Astfel, un expert în domeniu ar putea modifica secvenţele de aminoacizi stabilite în SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191, prin menţinerea resturilor-ancoră, şi vor putea stabili dacă aceste variante îşi menţin abilitatea de a se lega de moleculele MHC de clasă I sau II. Variantele prezentei descoperiri îşi păstrează abilitatea de a lega TCR pentru celule T activate, care pot reacţiona încrucişat cu celulele şi pot ucide celulele care exprimă polipeptida care conţine secvenţa naturală de aminoacid a peptidei înrudite definite în descrierea invenţiei.

Peptidele originale (nemodificate) în conformitate cu descrierea din prezentul document se pot modifica prin substituirea unuia sau a mai multor resturi din diferite poziţii diferite, posibil selectate, din structura catenei peptidice, dacă nu s-a specificat altfel. Preferabil, aceste substituţii sunt localizate la capătul catenei de aminoacizi. Astfel de substituţii pot fi conservatoare, de exemplu, dacă un aminoacid este substituit cu un alt aminoacid cu structură şi caracteristici similare, astfel încât de exemplu un aminoacid hidrofob să fie înlocuit cu un alt aminoacid hidrofob. Mult mai conservatoare ar fi înlocuirea aminoacizilor cu unii de dimensiune şi natură chimică identică sau similară, cum ar fi în cazul în care leucina este înlocuită de izoleucină. În studiile variaţiilor de secvenţe la familii cu proteine omologe natural-survenite, anumite substituţii aminoacide sunt mai frecvent tolerate decât altele, aceasta corelându-se cu similitudinile de dimensiune, sarcină, polaritate şi hidrofobicitate dintre aminoacidul natural şi cel care îl înlocuieşte, aceasta fiind baza de definire a „substituţiilor conservatoare».

Substituţiile conservatoare sunt în prezentul document definite ca schimburi în cadrul unuia dintre următoarele cinci grupuri: Grupul 1 - resturi mici, alifatice, nepolare sau uşor polare (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupul 2 - resturi polare, încărcate negativ şi amidele lor (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupul 3 - resturi polare, încărcate pozitiv (His, Arg, Lys); Grupul 4 - resturi mari, alifatice, nepolare (Met, Leu, Ile, Val, Cys); şi Grupul 5 - resturi mari, aromatice (Phe, Tyr, Trp).

Substituţiile mai puţin conservatoare pot implica schimbarea unui aminoacid cu un altul cu caracteristici similare dar oarecum diferit ca dimensiuni, cum ar fi de exemplu substituirea alaninei cu un rest de izoleucină. Substituţiile înalt non-conservatoare pot implica substituirea unui aminoacid acid cu unul care este polar sau chiar bazic. Astfel de substituţii „radicale» nu pot fi apreciate, totuşi, ca potenţial ineficiente deoarece efectele chimice nu sunt complet previzibile; astfel de substituţii radicale pot provoca efecte caracterizate de serendipitate, fiind impredictibile pe baza principiilor chimice elementare.

Desigur, aceste substituţii pot implica structuri diferite de L-aminoacizii uzuali. Astfel, D-aminoacizii se pot substitui cu L-aminoacizii identificaţi uzual în peptidele antigenice ale descoperirii, fiind în continuare incluşi în prezentul document. În plus, aminoacizii nestandard (adică alţii decât aminoacizii proteinogeni care se găsesc în mod natural) pot fi utilizaţi şi în scopuri de substituţie pentru a produce imunogeni şi polipeptide imunogene în conformitate cu prezenta descoperire.

Dacă substituţiile din mai mult de o poziţie se descoperă că pot conduce la o peptidă cu activitate antigenică substanţial echivalentă sau mai mare decât cea descrisă mai jos, atunci aceste substituţii se vor testa pentru a identifica dacă substituţiile combinate provoacă efecte cumulative sau sinergice ale antigenicităţii peptidei. În cel mai rău caz, nu se pot substitui simultan mai mult de 4 poziţii din cadrul peptidei.

O peptidă constând în esenţă din secvenţa de aminoacizi indicată aici poate avea unul sau doi aminoacizi neancoraţi (a se vedea mai jos în ceea ce priveşte motivul de ancoră) schimbaţi fără ca această capacitate de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II să fie modificată substanţial sau să fie afectată negativ în comparaţie cu peptida nemodificată. Într-o altă concretizare, într-o peptidă care constă în esenţă din secvenţa de aminoacizi indicată în prezentul document, unul sau doi aminoacizi pot fi schimbaţi cu partenerii lor de schimb conservatori (a se vedea aici mai jos), fără ca această capacitate de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II să fie modificată substanţial sau este afectată negativ în comparaţie cu peptida nemodificată.

Reziduurile aminoacidice care nu contribuie substanţial la interacţiunea cu receptorul celulelor T pot fi modificate prin substituirea cu alţi aminoacizi a căror încorporare nu modifică substanţial reactivitatea celulelor T şi care nu elimină cuplarea cu MHC relevant. Astfel, cu excepţia condiţiei explicate, peptida care face obiectul descoperirii poate fi orice peptidă (termen în care includem şi oligopeptide sau polipeptide) care include secvenţele de aminoacizi sau o porţiune sau variantă a acestora.

Pot fi adecvate, de asemenea, peptide mai lungi (alungite). Este posibil ca epitopii MHC de clasă I, deşi de obicei cu lungimea de 8-11 aminoacizi, să fie generaţi prin procesarea peptidelor provenite din peptide sau proteine mai lungi care includ epitopul efectiv. Este preferabil ca resturile care flanchează epitopul efectiv să fie resturi care să nu influenţeze substanţial clivajul proteolitic necesar pentru expunerea epitopului efectiv în timpul procesării.

Peptidele din descoperire pot fi alungite cu până la patru aminoacizi, adică 1, 2, 3 sau 4 aminoacizi pot fi adăugaţi la orice capăt în orice combinaţie între 4:0 şi 0:4. Combinaţiile alungirilor conform descoperirii pot fi găsite în Tabelul 4.

Tabelul 4: Combinaţii de alungiri ale peptidelor conform invenţiei

C-terminus N-terminus 4 0 3 0 sau 1 2 0 sau 1 sau 2 1 0 sau 1 sau 2 sau 3 0 0 sau 1 sau 2 sau 3 sau 4 N-terminus C-terminus 4 0 3 0 sau 1 2 0 sau 1 sau 2 1 0 sau 1 sau 2 sau 3 0 0 sau 1 sau 2 sau 3 sau 4

Aminoacizii pentru alungire/extindere pot fi peptidele secvenţei iniţiale a proteinei sau a oricărui alt aminoacid S. Alungirea poate fi utilizată pentru a spori stabilitatea sau solubilitatea peptidelor.

Astfel, epitopii din prezenta descoperire pot fi identici cu cei care apar natural asociaţi tumorii sau specifici tumorii, sau pot include epitopi care diferă prin cel mult patru resturi de peptida de referinţă, atâta timp cât au activitate antigenică substanţial identică.

Într-o concretizare alternativă, peptida este alungită pe oricare parte sau pe ambele părţi cu mai mult de 4 aminoacizi, de preferinţă pe o lungime totală de până la 30 de aminoacizi. Acest lucru poate duce la peptide cu legare la MHC de clasă II. Legarea la MHC de clasă II poate fi testată prin metode cunoscute în domeniu.

În consecinţă, prezenta descoperire furnizează peptide şi variante de epitopi MHC de clasă I, în care peptida sau varianta are o lungime totală cuprinsă între 8 şi 100, preferabil între 8 şi 30, şi, cel mai preferabil, între 8 şi 14, şi anume 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminoacizi; în cazul peptidelor de legare de clasă II alungite, lungimea poate fi, de asemenea, de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 sau 22 de aminoacizi.

Desigur, peptida sau varianta în conformitate cu prezenta descoperire va avea capacitatea să se lege de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I or II. Legarea unei peptide sau a unei variante la un complex MHC poate fi testată prin metode cunoscute în domeniu.

De preferat, atunci când celulele T specifice pentru o peptidă în conformitate cu prezenta descoperire sunt testate faţă de peptide substitute, concentraţia de peptide la care peptidele substituite ating jumătate din creşterea maximă a lizei comparativ cu fundalul este mai mică de 1mM, preferabil nu depăşeşte 1 μM, şi mai preferabil nu depăşeşte 1nM, - cel mai preferabil nu depăşeşte 100 pM şi în mod ideal nu depăşeşte 10 pM. Este, de asemenea, de preferat ca peptida substituită să fie recunoscută de celule T provenind de la mai mulţi indivizi, preferabil doi, dar, şi mai preferabil, trei indivizi.

Într-o realizare preferată în mod special a descoperirii, peptida constă sau constă în esenţă dintr-o secvenţă de aminoacizi conformă cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191.

„Constând în esenţă din» înseamnă că o peptidă în conformitate cu prezenta descoperire, pe lângă secvenţa în conformitate cu oricare dintre SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191 sau o variantă a acestora, conţine segmente de aminoacid N-terminale sau C-terminale care nu fac în mod necesar parte din peptida care funcţionează ca epitop pentru molecule MHC.

Totuşi, aceste resturi pot fi importante pentru a furniza o introducere adecvată a peptidei care face obiectul prezentei descoperiri în interiorul celulei. Într-o realizare a prezentei invenţii, peptida face parte dintr-o proteină de fuziune care conţine, de exemplu, cei 80 aminoacizi N-terminali ai lanţului invariabil asociat antigenului HLA-DR (p33, următoarea „Ii») derivaţi din NCBI, număr de identificare GenBank X00497. În alte fuziuni, peptidele din prezenta descoperire pot fi fuzionate la un anticorp aşa cum este descris în prezentul document, sau o parte funcţională a acestuia, în special într-o secvenţă a unui anticorp, astfel încât să fie direcţionate în mod specific de respectivul anticorp, sau, de exemplu, către sau într-un anticorp care este specific pentru celulele dendritice descrise în prezentul document.

În plus, peptida sau varianta pot fi ulterior modificate pentru a îmbunătăţi stabilitatea şi/sau legarea de molecule MHC pentru a exercita un răspuns imun mai puternic. Metodele pentru această optimizare a secvenţei de peptidă este cunoscută în domeniu şi poate include, de exemplu, introducerea unor legături peptidice inversate sau a unor legături non-peptidice.

Într-o legătură peptidică inversată, reziduurile aminoacidice nu sunt unite prin legături peptidice (-CO-NH-), ci legătura peptidică este inversată. Astfel de retro-inverso peptido-mimetice se pot obţine utilizând metodele cunoscute în literatura de specialitate, cum ar fi de exemplu cele descrise în Meziere et al. (1997) (Meziere et al., 1997), încorporate în prezentul document prin referinţă. Această abordare implică sinteza de pseudopeptide care conţin modificări care implică scheletul şi nu orientarea lanţurilor secundare. Meziere et al. (Meziere et al., 1997) arată că aceste pseudopeptide sunt utile pentru legarea MHC şi răspunsurile celulelor T helper. Peptidele retro-inversate, care conţin legături NH-CO şi nu legături peptidice CO-NH, sunt mult mai rezistente la proteoliză.

O legătură non-peptidică este, de exemplu, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, şi -CH2SO-. US 4,897,445 furnizează o metodă pentru sinteza în fază solidă a unor legături non-peptidice (-CH2-NH) în lanţuri de polipeptide care implică polipeptide sintetizate de procedurile standard şi legături non-peptidice sintetizate prin reacţia dintre o amino-aldehidă şi un aminoacid în prezenţa NaCNBH3.

Peptidele care conţin secvenţele descrise mai sus pot fi sintetizate cu ajutorul unor grupări chimice suplimentare prezente la capetele amino- sau carboxi-terminale, pentru a îmbunătăţi stabilitatea, biodisponibilitatea şi/sau afinitatea peptidelor. De exemplu, grupările hidrofobe, cum ar fi carbo-benzoxil, dansil sau T-butil-oxi-carbonil pot fi adăugate capătului peptidic amino-terminal. Similar, o grupare acetil sau o grupare 9-fluorenil-metoxi-carbonil se poate plasa la capătul amino-terminal al peptidei. În plus, grupările hidrofobe, cum ar T-butil-oxi-carbonil, sau o grupare amido- pot fi adăugate capătului peptidic amino-terminal.

Mai mult, peptidele din descoperire pot fi sintetizate în funcţie de configuraţia lor sterică. De exemplu, se poate utiliza izomerul D al unuia sau mai multor resturi de aminoacid peptidic în locul izomerului L uzual. Ba chiar mai mult, cel puţin unul dintre resturile de aminoacid al peptidei din descoperire poate fi substituit cu unul dintre resturile de aminoacid cunoscute, care nu apar în mod natural. Alterări de tipul acestora pot ajuta la creşterea stabilităţii, biodisponibilităţii şi/sau legării peptidelor care fac obiectul descoperirii.

Similar, o peptidă sau o variantă a descoperirii se poate modifica din punct de vedere chimic prin reacţii cu diverşi aminoacizi înainte sau după sinteza peptidei. Exemplele acestor modificări sunt bine cunoscute în domeniu şi sunt rezumate, de exemplu, în R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004), încorporate aici prin referinţă. Modificarea chimică a aminoacizilor include, fără a se limita la, modificarea prin acilare, amidinare, piridoxilarea lizinei, alkilare reductivă, trinitrobenzilarea grupurilor amino cu acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfonic (TNBS), modificarea amidică a grupărilor carboxil şi sulfhidril prin oxidarea cu acid performic a cisteinei la acid cisteic, formarea de derivaţi de mercur, formarea de disulfide mixte cu alţi compuşi tiolici, reacţia cu maleimidă, carboximetilarea cu acid iodoacetic sau iodoacetamidă şi carbamoilare cu cianat la pH alcalin, deşi fără a se limita la acestea. În aceste privinţe, doritorii sunt trimişi la Capitolul 15 al protocolului prezent din Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995) pentru metodologia extinsă legată de modificarea chimică a proteinelor.

Pe scurt, modificarea de exemplu a resturilor arginil sunt de obicei bazate pe reacţia dintre compuşii dicarbonil vecini cum ar fi fenilglioxal, 2, 3-butandionă, şi 1,2-ciclohexan-dionă pentru formarea unui aduct. Un alt exemplu este reacţia dintre metilglioxal şi resturile de arginină. Cisteina se poate modifica fără modificarea concomitentă a altor situri nucleofile cum ar fi lizina şi histidina. Ca rezultat, pentru modificarea cisteinei sunt disponibili un număr mare de reactivi. Paginile unor companii cum ar fi Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) pot furniza informaţii despre anumiţi reactivi.

Reducerea selectivă a punţilor disulfitice din proteine este şi ea frecventă. Punţile disulfidice se pot forma şi oxida prin tratamentul termic al produselor biofarmaceutice. Reactivul K de la Woodward se poate folosi pentru modificarea resturilor de acid glutamic. N-(3-(dimetil-amino)propil)-N'-etilcarbodiimida se poate folosi pentru a forma legături intra-moleculare între un rest de lizină şi un rest de acid glutamic. De exemplu, dietilpirocarbonatul este un reactiv pentru modificarea resturilor de histidil din proteine. Histidina se poate modifica la rândul sau folosind 4-hidroxi-2-nonenal. Reacţia resturilor de lisină şi a altor grupări α-amino este utilă, de exemplu, pentru legarea peptidelor de suprafeţe sau de legături încrucişate proteine-peptide. Lisina este locul de ataşare a poli(etilen)glicolului şi locul principal de modificare în cazul glicozilării proteinelor. Resturile de metionină din proteine se pot modifica de exemplu folosind iodoacetamidă, brometilamină şi cloramină T.

Tetranitrometanul şi N-acetil-imidazolul se pot folosi pentru modificarea resturilor tirozil. Legarea încrucişată prin formarea de ditirosină poate fi realizată cu ioni de cupru sau apă oxigenată.

Studii recente privind modificarea triptofanului au utilizat N-bromosuccinimidă, bromură 2-hidroxi-5-nitrobenzil sau 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (BPNS-scatol).

Modificarea cu succes a proteinelor şi peptidelor terapeutice cu PEG este adesea asociată cu o extindere a timpului de înjumătăţire circulatorie în timpul legării încrucişate a proteinelor cu glutaraldehidă, diacrilat de polietilen-glicol, iar formaldehida este utilizată pentru pregătirea hidrogelurilor. Modificarea chimică a alergenilor pentru imunoterapie este obţinută adesea prin carbamilare cu cianat de potasiu.

O peptidă sau o variantă, în care peptida este modificată sau include legături non-peptidice reprezintă un exemplu preferat al descoperirii. În general, peptidele şi variantele (cel puţin cele care conţin legături peptidice între resturile aminoacidice) pot fi sintetizate prin modul Fmoc-poliamidă al sintezei peptidelor în stare solidă, după cum se arată în Lu et al. (Lukas et al., 1981) şi referinţele citate în prezentul document. Protecţia temporară a grupării N-amino este asigurată de gruparea 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc). Clivajul repetitiv al acestei grupări de protecţie cu intensă labilitate de bază este realizat folosind 20% piperidină în N,N-dimetilformamidă. Funcţionalităţile lanţurilor secundare se pot proteja sub forma butil-eterilor (în cazul serinei, treoninei şi tirozinei), a butil-esterilor (în cazul acizilor glutamic şi aspartic), a derivaţilor butiloxicarbonil (în cazul lizinei şi histidinei), a derivaţilor tritil (în cazul cisteinei) şi a derivaţilor de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil (în cazul argininei). Dacă resturile C-terminale sunt glutamina sau asparagina, pentru protejarea funcţiei amido a lanţului secundar se va folosi gruparea 4,4'-dimetoxibenzhidril. Suportul în faza solidă este furnizat de un polimer polidimetil-acrilamidă format din cei trei monomeri dimetilacrilamidă (schelet-monomer), bisacriloetilen diamină (agent de legătură) şi acriloilsarcozin-metil-ester (agent de funcţionalizare). Agentul de legătură peptidă-răşină scindabil folosit este derivatul labil în mediu acid al acidului 4-hidroximetil-fenoxiacetic. Toţi derivaţii aminoacid sunt adăugaţi sub formă de derivaţi simetrici anhidri preformaţi cu excepţia asparaginei şi glutaminei, care sunt adăugate folosind o procedură de cuplare inversă mediată de N,N-diciclohexil-carbodiimidă/1-hidroxibenzotriazol. Toate reacţiile de cuplare şi deprotejare sunt monitorizate folosind proceduri care folosesc ninhidrină, trinitrobenzen, acid sulfonic şi izotin-test. După finalizarea sintezei, peptidele sunt scindate din suportul rezinic cu îndepărtarea concomitentă a grupărilor protectoare ale lanţurilor secundare prin tratarea cu acid trifluoroacetic 95% care conţine un amestec curăţător 50%. Substanţele de curăţare folosite cel mai frecvent includ etan-ditiol, fenol, anisol şi apă, alegerea exactă fiind dependentă de aminoacizii constituenţi ai peptidei sintetizate. De asemenea, pentru sintetizarea peptidelor, se poate utiliza o combinaţie de metode în stare solidă şi în stare de soluţie (vezi, de exemplu, (Bruckdorfer et al., 2004) şi referinţele citate în prezentul document).

Acidul trifluoroacetic este îndepărtat prin evaporare in vacuo, cu triturarea ulterioară cu dietileter, care duce la formarea peptidei brute. Toate substanţele de curăţare prezente sunt eliminate printr-o procedură simplă de extragere, care, după liofilizare în fază apoasă, conduce la peptida brută fără substanţe de curăţare. Reactivii pentru sinteza peptidelor sunt în general disponibili, de exemplu, de la Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Regatul Unit).

Purificarea poate fi realizată prin una sau mai multe tehnici, precum recristalizarea, cromatografia cu excludere dimensională, cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia cu interacţiune hidrofobă şi (de regulă) cromatografia lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, folosind, de exemplu, separare în gradient de acetonitril/apă.

Analiza peptidelor poate fi efectuată folosind cromatografie în strat subţire, electroforeză, în particular electroforeză capilară, extragere în fază solidă (CSPE), cromatografie lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, analiză a aminoacizilor după hidroliza acidă şi prin analiză spectrometrică în masă la bombardarea rapidă cu atomi (FAB), dar şi analiză spectrometrică în masă de tip MALDI şi ESI-Q-TOF.

Pentru a selecta peptide supraprezentate, se calculează un profil de prezentare arătând prezentarea mediană a probei, precum şi variaţia replicării. Profilul juxtapune probe ale entităţii tumorale de interes pentru o linie de bază a probelor de ţesut normal. Fiecare dintre aceste profiluri poate fi apoi consolidat într-un scor de supraprezentare, calculându-se valoarea p a unui model liniar cu efecte combinate (Pinheiro et al., 2015), care se ajustează pentru testarea multiplă prin rata de descoperire falsă (Benjamini and Hochberg, 1995).

Pentru identificarea şi cuantificarea relativă a liganzilor HLA prin spectrometrie de masă, moleculele HLA din probele de ţesut îngheţat prin şoc au fost purificate şi peptidele asociate cu HLA au fost izolate. Peptidele izolate au fost separate şi secvenţele au fost identificate prin experimente online de nano-electropulverizare-ionizare (nanoESI) prin cromatografie de lichid-spectrometrie de masă (LC-MS). Secvenţele peptidice rezultate au fost verificate prin compararea modelului de fragmentare a peptidelor asociate TUMAP-urilor naturale înregistrate din probe de CRC (N = 24 probe A*02-pozitive) cu modele de fragmentare ale peptidelor de referinţă sintetice corespunzătoare ale secvenţelor identice. Deoarece peptidele au fost identificate direct ca liganzi ai moleculelor HLA ale tumorilor primare, aceste rezultate furnizează dovezi directe pentru procesarea şi prezentarea naturale ale peptidelor identificate pe ţesutul canceros primar obţinut de la 24 de pacienţi cu CRC.

Pipeline-ul descoperirii XPRESIDENT® v2.1 (vezi, de exemplu, US 2013-0096016, care este încorporat în mod specific aici prin referinţă în întregime) permite identificarea şi selectarea candidaţilor relevanţi pentru vaccinare cu peptide supraprezentate pe baza cuantificării relative directe a nivelurilor de peptide HLA-restricţionate pe ţesuturile canceroase comparativ cu mai multe ţesuturi şi organe necanceroase diferite. Acest lucru a fost realizat prin dezvoltarea unei cuantificări diferenţiale fără etichete utilizându-se datele LC-MS obţinute, procesate de un pipeline patentat de analiză a datelor, combinându-se algoritmi pentru identificarea secvenţelor, gruparea spectrală, numărarea ionilor, alinierea timpului de retenţie, deconvoluţia de stare a încărcării şi normalizarea.

Au fost stabilite nivelurile de prezentare, inclusiv estimările de eroare pentru fiecare peptidă şi probă. Au fost identificate peptide prezentate exclusiv pe ţesuturi tumorale şi peptide supraprezentate în tumoră faţă de ţesuturi şi organe necanceroase.

Complecşii HLA-peptidă din probe de ţesut de CRC au fost purificate şi peptidele HLA-asociate au fost izolate şi analizate prin LC-MS (vezi exemplele). Toate peptidele TUMAP conţinute în prezenta aplicaţie au fost identificate cu această abordare pe probe de CRC primar, confirmându-se prezentarea acestora pe CRC primar.

TUMAP-urile identificate pe mai multe de CRC şi ţesuturi normale au fost cuantificate utilizându-se numărarea de ioni la datelor LC-MS fără etichete. Metoda presupune că zonele de semnal LC-MS ale unei peptide se corelează cu abundenţa sa în probă. Toate semnalele cantitative ale unei peptide în diferite experimente LC-MS au fost normalizate pe baza tendinţei centrale, mediate per probă şi fuzionate într-o diagramă de bare, denumită profil de prezentare. Profilul de prezentare consolidează diferite metode de analiză, cum ar fi căutarea în baza de date cu proteine, gruparea spectrală, deconvoluţia de stare de încărcare (decompresie) şi alinierea şi normalizarea timpului de retenţie.

Mai mult, pipeline-ul descoperirii XPRESIDENT® v2.x permite cuantificarea absolută directă a nivelurilor de peptide MHC-restricţionate, de preferinţă HLA-restricţionate, pe ţesuturi de cancer sau alte ţesuturi infectate. Pe scurt, numărul total de celule a fost calculat din conţinutul total de ADN al probei de ţesut analizate. Cantitatea totală de peptidă pentru un TUMAP într-o probă de ţesut a fost măsurată prin nanoLC-MS/MS ca raport între TUMAP-ul natural şi o cantitate cunoscută dintr-o versiune marcată cu izotop de TUMAP, aşa-numitul standard intern. Eficacitatea izolării TUMAP-urilor a fost determinată prin îmbogăţirea complexelor peptidă:MHC ale tuturor TUMAP-urilor selectate în lizatul de ţesut în cel mai timpuriu punct posibil al procedurii de izolare a TUMAP-urilor şi detectarea lor prin nanoLC-MS/MS după finalizarea procedurii de izolare a peptidei. Numărul total de celule şi cantitatea de peptidă totală au fost calculate din măsurători triplicate pentru fiecare probă de ţesut. Eficienţele izolării specifice peptidei au fost calculate ca medie din 10 experimente cu îmbogăţire, măsurate fiecare ca triplicat (vezi Exemplul 6 şi Tabelul 9).

Prezenta descoperire furnizează peptide care sunt utile în tratarea cancerelor/tumorilor, de preferinţă CRC, care supraprezintă sau prezintă exclusiv peptidele din descoperire. Aceste peptide sunt ilustrate prin spectrometrie de masă pentru a fi prezentate în mod natural de către moleculele HLA pe probe primare umane de CRC.

S-a constatat că genele-/proteinele-sursă (denumite şi „proteine de lungime completă» sau „proteine subiacente»), din care sunt derivate peptidele, sunt foarte supraexprimate în cancer comparativ cu ţesuturile normale - „ţesuturi normale», în raport cu această descoperire, înseamnă fie celule sănătoase din intestinul gros (colon sau rect), fie alte celule tisulare normale, care demonstrează un grad ridicat de asociere tumorală a genelor-sursă (vezi Exemplul 2). Mai mult, peptidele în sine sunt puternic supraprezentate pe ţesutul tumoral - „ţesut tumoral», în raport cu această descoperire, înseamnă o probă de la un pacient care suferă de CRC, însă nu şi pe ţesuturi normale (a se vedea Exemplul 1).

Peptidele legate de HLA se pot recunoaşte de către sistemul imunitar, în special de limfocite T. Celulele T pot distruge celulele care prezintă complexul HLA-peptidă recunoscut, de exemplu celulele CRC care prezintă peptidele derivate.

Peptidele din prezenta descoperire s-au dovedit a fi capabile să stimuleze răspunsurile celulelor T şi/sau sunt supraprezentate şi astfel pot fi utilizate pentru producerea de anticorpi şi/sau TCR-uri, cum ar fi sTCR-uri solubile, conform prezentei descoperiri (vezi Exemplul 3 şi Exemplul 4). Mai mult, complexul format de peptide cu MHC-ul respectiv poate fi folosit şi pentru producţia de anticorpi specifici şi/sau TCR-uri, în particular sTCR-uri, în conformitate cu prezenta descoperire. Metodele respective sunt bine cunoscute de experţii în domeniu şi pot fi găsite şi în literatura de specialitate respectivă. Astfel, peptidele din prezenta descoperire sunt utile pentru generarea unui răspuns imunitar la un pacient, prin care celulele tumorale pot fi distruse. Răspunsul imun la pacient poate fi indus prin administrarea directă a peptidelor descrise sau a substanţelor precursoare adecvate (de exemplu peptide elongate, proteine sau acizi nucleici care codifică aceste peptide) la pacient, în mod ideal combinate cu un agent care creşte imunogenitatea (de exemplu un adjuvant). Răspunsul imunitar care are originea în astfel de vaccinare terapeutică se poate aştepta să fie foarte specific împotriva celulelor tumorale deoarece peptidele ţintă ale prezentei descoperiri nu sunt prezente pe ţesuturi normale în numere de copii comparabile, fapt care previne riscul unor reacţii autoimune nedorite îndreptat împotriva celulelor normale ale pacientului.

Prezenta descoperire se referă şi la receptori de celule T (TCR-uri) care cuprind un lanţ alfa şi un lanţ beta („TCR-uri alfa/beta»). De asemenea, sunt furnizate peptide capabile să se lege la TCR-uri şi anticorpi atunci când sunt prezentate de o moleculă MHC. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la acizi nucleici, vectori şi celule-gazdă pentru exprimarea TCR-urilor şi peptidelor din prezenta descoperire, precum şi la metodele de utilizare ale acestora.

Termenul „receptor de celule T» (prescurtat TCR) se referă la o moleculă heterodimerică cuprinzând un lanţ polipeptidic alfa (lanţ alfa) şi un lanţ polipeptidic beta (lanţ beta), în care receptorul heterodimeric este capabil să se lege cu un antigen peptidic prezentat de o moleculă HLA. Termenul include, de asemenea, aşa-numitele TCR-uri gamma/delta.

Într-una dintre concretizări, descoperirea oferă o metodă de producere a unui TCR aşa cum este descris aici, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă capabile să exprime TCR-ul în condiţii adecvate pentru promovarea exprimării TCR.

Descrierea într-un alt aspect se referă la metode în conformitate cu descoperirea în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I sau de clasă II exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen sau antigenul este încărcat pe tetrameri MHC de clasă I sau II prin tetramerizarea monomerilor complexului antigen/MHC de clasă I sau II.

Lanţurile alfa şi beta ale TCR-urilor alfa/beta şi lanţurile gamma şi delta ale TCR-urilor gamma/delta sunt considerate, în general, ca având fiecare două „domenii», respectiv domenii variabile şi constante. Domeniul variabil constă într-o concatenare a regiunii variabile (V) şi a regiunii de unire (J). Domeniul variabil poate include, de asemenea, o regiune lider (L). Lanţurile beta şi delta pot include, de asemenea, o regiune de diversitate (D). Domeniile constante alfa şi beta pot include, de asemenea, domenii transmembranare C-terminale (TM) care ancorează lanţurile alfa şi beta la membrana celulară.

În ceea ce priveşte TCR-urile gamma/delta, termenul „domeniu variabil TCR gamma», aşa cum este utilizat aici, se referă la concatenarea regiunii TCR gamma V (TRGV) fără regiunea lider (L) şi a regiunii TCR gamma J (TRGJ), iar termenul „domeniu constant TCR gamma» se referă la regiunea TRGC extracelulară sau la o secvenţă TRGC trunchiată C-terminal. În mod similar, termenul „domeniu variabil TCR delta» se referă la concatenarea regiunii TCR delta V (TRDV) fără regiunea lider (L) şi a regiunii TCR delta D/J (TRDD/TRDJ), iar termenul „domeniu constant TCR delta» se referă la regiunea TRDC extracelulară sau la o secvenţă TRDC trunchiată C-terminal.

TCR-urile din prezenta descoperire se leagă de preferinţă la un complex de molecule peptidice-HLA cu o afinitate de legare (KD) de aproximativ 100 µM sau mai puţin, de aproximativ 50 µM sau mai puţin, de aproximativ 25 µM sau mai puţin ori de aproximativ 10 µM sau mai puţin. Mai preferate sunt TCR-urile cu afinitate ridicată care au afinităţi de legare de aproximativ 1 µM sau mai puţin, de aproximativ 100 nM sau mai puţin, de aproximativ 50 nM sau mai puţin, de aproximativ 25 nM sau mai puţin. Exemple nelimitatoare de afinitate de legare preferate pentru TCR-urile prezentei descoperiri includ: de la aproximativ 1 nM până la aproximativ 10 nM; de la aproximativ 10 nM până la aproximativ 20 nM; de la aproximativ 20 nM până la aproximativ 30 nM; de la aproximativ 30 nM până la aproximativ 40 nM; de la aproximativ 40 nM până la aproximativ 50 nM; de la aproximativ 50 nM până la aproximativ 60 nM; de la aproximativ 60 nM până la aproximativ 70 nM; de la aproximativ 70 nM până la aproximativ 80 nM; de la aproximativ 80 nM până la aproximativ 90 nM; şi de la aproximativ 90 nM până la aproximativ 100 nM.

Aşa cum este utilizat aici în legătură cu TCR-urile din prezenta descoperire, „legare specifică» şi variante gramaticale ale acestei sintagme sunt utilizate pentru a desemna un TCR care are o afinitate de legare (KD) pentru un complex molecular peptidă-HLA de 100 µM sau mai puţin.

TCR-uri alfa/beta heterodimerice din prezenta descoperire pot avea o legătură disulfurică introdusă între domeniile lor constante. TCR-urile preferate de acest tip le includ pe cele care au o secvenţă de domeniu constant TRAC şi o secvenţă de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2, cu excepţia faptului că Thr 48 din TRAC şi Ser 57 din TRBC1 sau TRBC2 sunt înlocuite cu reziduuri de cisteină, cisteinele menţionate formând o legătură disulfurică între secvenţa de domeniu constant TRAC şi secvenţa de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2 a TCR-ului.

Cu sau fără legătura între lanţuri introdusă menţionată mai sus, TCR-urile heterodimerice alfa/beta din prezenta descoperire pot avea o secvenţă de domeniu constant TRAC şi o secvenţă de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2, iar secvenţa de domeniu constant TRAC şi de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2 a TCR-ului poate fi legată de legătura disulfurică nativă dintre Cys4 din exonul 2 al TRAC şi Cys2 din exonul 2 al TRBC1 sau TRBC2.

TCR-urile din prezenta descoperire pot cuprinde o etichetă detectabilă aleasă din grupul constând dintr-un radionuclid, un fluorofor şi biotină. TCR-urile din prezenta descoperire pot fi conjugate cu un agent activ terapeutic, cum ar fi un radionuclid, un agent chimioterapeutic sau o toxină.

Într-una dintre concretizări, un TCR din prezenta descoperire care are cel puţin o mutaţie în lanţul alfa şi/sau cel puţin o mutaţie în lanţul beta a modificat glicozilarea în comparaţie cu TCR-ul fără mutaţie.

În altă concretizare, un TCR cuprinzând cel puţin o mutaţie în lanţul alfa TCR şi/sau lanţul beta TCR are o afinitate de legare pentru şi/sau o semiviaţă de legare pentru un complex de molecule peptidă-HLA care este cel puţin dublu faţă de un TCR cuprinzând lanţul alfa TCR fără mutaţie şi/sau lanţul beta TCR fără mutaţie. Creşterea afinităţii TCR-urilor specifice tumorii şi exploatarea acesteia se bazează pe existenţa unei ferestre pentru afinităţi optime ale TCR-urilor. Existenţa unei astfel de ferestre se bazează pe observaţii conform cărora TCR-urile specifice pentru agenţii patogeni cu HLA-A2-restricţionaţi au valori KD care sunt în general de aproximativ 10 ori mai mici în comparaţie cu TCR-uri specifice pentru autoantigenii asociaţi tumorii HLA-A2-restricţionate. Este cunoscut acum că, deşi antigenii tumorali au potenţialul de a fi imunogeni, deoarece tumorile apar din propriile celule ale individului, numai proteinele cu mutaţie sau proteinele cu procesare translaţională modificată vor fi văzute ca străine de către sistemul imunitar. Antigenii care sunt reglaţi în sens crescător sau supraexprimaţi (aşa-numiţii autoantigeni) nu vor induce neapărat un răspuns imun funcţional împotriva tumorii: Celulele T care exprimă TCR-uri foarte reactive la aceşti antigeni au fost selectate negativ în timus într-un proces cunoscut sub numele de toleranţă centrală, ceea ce înseamnă că rămân doar celulele T cu TCR-uri cu afinitate scăzută pentru autoantigeni. Prin urmare, afinitatea TCR-urilor sau a variantelor din prezenta descriere pentru peptidele în conformitate cu descoperirea poate fi îmbunătăţită prin metode bine cunoscute în domeniu.

Prezenta descriere se mai referă la o metodă de identificare şi de izolare a unui TCR în conformitate cu prezenta descriere, respectiva metodă cuprinzând incubarea de PBMC-uri de la donatori sănătoşi HLA-A*02-negativi cu monomeri peptidici/A2, incubarea PBMC-urilor cu tetramer-ficoeritrină (PE) şi izolarea celulelor T cu aviditate ridicată prin analiză cu sortare de celule activată prin (FACS)-Calibur.

Prezenta descriere se mai referă la o metodă de identificare şi de izolare a unui TCR în conformitate cu prezenta descriere, respectiva metodă cuprinzând obţinerea unui şoarece transgenic cu întregii loci a genei TCRα complet umani (1,1 şi 0,7 Mb) ale cărui celule T exprimă un repertoriu divers de TCR-uri umane, repertoriu care compensează deficienţa de TCR-uri murine, imunizând şoarecele cu peptida de interes, incubând PBMC-urile obţinute de la şoarecii transgenici cu tetramer-fitoceritrină (PE) şi izolând celulele T cu aviditate ridicată prin analiză cu sortare de celule activată prin fluorescenţă (FACS)-Calibur.

Într-unul dintre aspecte, pentru a obţine celule T care exprimă TCR-uri din prezenta descoperire, acizii nucleici care codifică lanţurile TCR-alfa şi/sau TCR-beta din prezenta descoperire sunt clonaţi în vectori de exprimare, de exemplu gamma-retrovirus sau gamma-lentivirus. Virusurile recombinante sunt generate şi apoi testate pentru funcţionalitate, cum ar fi specificitatea antigenică şi aviditatea funcţională. O parte alicotă a produsului final este apoi utilizată pentru a transduce populaţia de celule T ţintă (în general purificată din PBMC-urile pacientului), care este extinsă înainte de perfuzare în pacient. Într-un alt aspect, pentru a obţine celule T care exprimă TCR-uri din prezenta descoperire, ARN-urile TCR-urilor sunt sintetizate prin tehnici cunoscute în domeniu, de exemplu, cu sisteme de transcripţie in vitro. ARN-urile de TCR sintetizate in vitro sunt apoi introduse în celulele T CD8 + primare obţinute de la donatori sănătoşi prin electroporare pentru a reexprima lanţurile TCR-alfa şi/sau TCR-beta specifice tumorii.

Pentru a creşte exprimarea, acizii nucleici care codifică TCR-urile din prezenta descoperire pot fi legaţi în mod operaţional cu promotori puternici, cum ar fi repetiţiile terminale lungi retrovirale (LTR-uri), citomegalovirusul (CMV), virusul celulelor stem murine (MSCV) U3, fosfogliceratul kinazic (PGK) , ꞵ-actina, ubiquitina şi un promotor compus de virus simian 40 (SV40)/CD43, factorul de alungire (EF)-1a şi promotorul de virus formator de focar splenic (SFFV). Într-o concretizare preferată, promotorul este heterolog cu acidul nucleic exprimat. În afară de promotori puternici, casetele de exprimare a TCR-urilor din prezenta descoperire pot conţine elemente suplimentare care pot îmbunătăţi exprimarea transgenică, inclusiv un tract polipurinic central (cPPT), care promovează translocarea nucleară a construcţiilor lentivirale (Follenzi et al., 2000), şi elementul de reglare post-transcripţional al virusului hepatitei marmotei (wPRE), care creşte nivelul de exprimare transgenică prin creşterea stabilităţii ARN-ului (Zufferey et al., 1999).

Lanţurile alfa şi beta ale unui TCR din prezenta invenţie pot fi codificate de acizi nucleici localizaţi în vectori separaţi sau pot fi codificate de polinucleotide localizate în acelaşi vector.

Realizarea unei exprimări de suprafaţă de nivel ridicat a TCR-urilor necesită ca atât lanţurile TCR-alfa, cât şi lanţurile TCR-beta ale TCR-urilor introduse să fie transcrise la niveluri ridicate. Pentru a realiza acest lucru, lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta din prezenta descoperire pot fi clonate în construcţii bi-cistronice într-un singur vector, care s-a dovedit a fi capabil să depăşească acest obstacol. Utilizarea unui loc viral de intrare intra-ribozomal (IRES) între lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta are ca rezultat exprimarea coordonată a ambelor lanţuri, deoarece lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta sunt generate dintr-o singură transcriere care este scindată în două proteine în timpul translaţiei, asigurându-se producerea unui raport molar egal al lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta. (Schmitt et al. 2009).

Acizii nucleici care codifică TCR-urile din prezenta descoperire pot fi optimizaţi cu codoni pentru a creşte exprimarea de la o celulă-gazdă. Redundanţa în codul genetic permite codificarea unor aminoacizi de către mai mulţi codoni, însă anumiţi codoni sunt mai puţin „optimi» decât alţii din cauza disponibilităţii relative a ARNt-urilor corespondente, precum şi a altor factori (Gustafsson et al., 2004). Modificarea secvenţelor de gene TCR-alfa şi TCR-beta astfel încât fiecare aminoacid să fie codificat de codonul optim pentru exprimarea genelor de mamifere, precum şi eliminarea motivelor de instabilitate a ARNm-ului sau a locurilor de îmbinare criptice, s-a dovedit că îmbunătăţeşte semnificativ exprimarea genelor TCR-alfa şi TCR-beta (Scholten et al., 2006).

Mai mult, împerecherea greşită între lanţurile de TCR-uri introduse şi endogene poate cauza dobândirea de specificităţi care prezintă un risc semnificativ pentru autoimunitate. De exemplu, formarea de dimeri de TCR-uri mixte poate reduce numărul de molecule CD3 disponibile pentru formarea de complexe TCR împerecheate corespunzător şi, prin urmare, poate scădea semnificativ aviditatea funcţională a celulelor care exprimă TCR-ul introdus (Kuball et al., 2007).

Pentru a reduce împerecherea greşită, domeniul C-terminal al lanţurilor TCR introduse din prezenta descoperire poate fi modificat pentru promovarea afinităţii între lanţuri, reducând totodată capacitatea lanţurilor introduse de a se împerechea cu TCR-ul endogen. Aceste strategii pot include înlocuirea domeniilor TCR-alfa şi TCR-beta C-terminale umane cu omologii lor murini (domeniul C-terminal murinizat); generarea unei a doua legături de disulfură între lanţuri în domeniul C-terminal prin introducerea unui al doilea reziduu de cisteină atât în ​​lanţurile TCR-alfa, cât şi în lanţurile TCR-beta ale TCR-ului introdus (modificare a cisteinei); schimbarea între ele a reziduurilor care interacţionează în domeniile C-terminale ale lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta („buton în gaură»); şi fuzionarea domeniilor variabile ale lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta direct cu CD3ζ (fuziune CD3ζ). (Schmitt et al. 2009).

Într-una dintre concretizări, o celulă-gazdă este modificată pentru a exprima un TCR al prezentei descoperiri. În concretizările preferate, celula-gazdă este o celulă T umană sau un progenitor de celule T. În unele concretizări, celula T sau progenitorul celulei T este obţinut de la un pacient cu cancer. În alte concretizări, celula T sau progenitorul celulei T este obţinut de la un donator sănătos. Celulele-gazdă din prezenta descoperire pot fi alogene sau autologe în raport cu un pacient care urmează să fie tratat. Într-una dintre concretizări, gazda este o celulă T gamma/delta transformată pentru a exprima un TCR alfa/beta.

O „compoziţie farmaceutică» este compoziţie potrivită pentru administrarea la o fiinţă umană într-un cadru medical. De preferinţă, o compoziţie farmaceutică este sterilă şi produsă conform recomandărilor GMP.

Compoziţiile farmaceutice conţin peptidele fie în forma liberă fie sub forma unei săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic (a se vedea mai sus). În accepţiunea prezentului document, „sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic» se referă la un derivat al peptidei menţionate în care peptida este modificată prin formarea de săruri acide sau bazice ale agentului. De exemplu, sărurile acide sunt produse din baza liberă (de obicei în forma neutră medicamentul are o grupare -NH2 neutră) prin reacţia cu un acid adecvat. Acizii adecvaţi pentru pregătirea sărurilor acide includ atât acizi organici (de exemplu acid acetic, acid propionic, acid glicolic, acid piruvic, acid oxalic, acid malic, acid malonic, acid succinic, acid maleic, acid fumaric, acid tartaric, acid citric, acid benzoic, acid cinamic, acid mandelic, acid metansulfonic, acid etansulfonic, acid p-toluensulfonic, acid salicilic şi alţii asemenea lor), cât şi acizi anorganici, cum ar fi acidul clorhidric, acidul bromhidric, acidul sulfuric, acidul azotic, acidul fosforic şi alţii asemenea lor. Dimpotrivă, preparatele sărurilor bazice ale grupărilor acide care pot face parte din peptidă sunt preparate folosind o bază acceptabilă farmaceutic, cum ar fi hidroxidul de sodiu, hidroxidul de potasiu, hidroxidul de amoniu, hidroxidul de calciu, trimetilamina sau altele asemenea.

Într-o concretizare preferată în mod special, compusul farmaceutic cuprinde peptidele sub forma unor săruri de acid acetic (acetaţi), trifluor-acetaţi sau săruri de acid clorhidric (cloruri).

Preferabil, medicamentul din prezenta invenţie este unul imunoterapeutic, de exemplu un vaccin. Acesta poate fi administrat direct pacientului, în organul afectat sau administrat pe cale sistemică, i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. sau aplicat ex vivo celulelor preluate de la pacient sau unei linii de celule umane care sunt apoi administrate pacientului sau utilizate in vitro pentru selectarea unei subpopulaţii de celule imune derivate de la pacient, care sunt apoi readministrate pacientului. Dacă acidul nucleic este administrat celulelor in vitro, poate fi util ca celulele să fie transfectate astfel încât să coexprime citochine imunostimulatoare, cum este interleukina 2. Peptida poate fi substanţial pură sau combinată cu un adjuvant stimulator imun (vezi mai jos) ori poate fi utilizată în combinaţie cu citokine imunostimulatoare sau poate fi administrată cu un sistem de livrare adecvat, de exemplu lipozomi. De asemenea, peptida poate fi conjugată cu un transportor adecvat, cum ar fi hemocianina melcului Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin, KLH) sau mannan (vezi WO 95/18145 şi (Longenecker et al., 1993)). Peptida poate fi, de asemenea, ţintită, o proteină de fuziune sau o moleculă hibridă. Se anticipează că peptidele a căror secvenţă este furnizată în prezenta descoperire vor stimula celule T CD4 sau CD8. Cu toate acestea, stimularea celulelor T CD8 este mai eficientă în prezenţa celulelor T helper CD4. În consecinţă, pentru epitopii MHC de clasă I care stimulează celulele T CD8, partenerul sau secţiunile de fuziune ale unei molecule hibride furnizează în mod adecvat epitopi care stimulează celule T CD4-pozitive. Epitopii care stimulează CD4 şi CD8 sunt bine cunoscuţi în domeniu şi includ pe cei identificaţi în prezenta descoperire.

Într-unul din aspecte, vaccinul cuprinde cel puţin o peptidă care are secvenţa de aminoacizi de la SEQ ID NO: 1 la SQ ID NO: 191 prezentată şi cel puţin o peptidă suplimentară, de preferinţă două până la 50, mai preferabil două până la 25, chiar mai preferabil două până la 20 şi cel mai preferabil două, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt, nouă, zece, unsprezece, doisprezece, treisprezece, paisprezece, cincisprezece, şaisprezece, şaptesprezece sau optsprezece peptide. Peptida(ele) poate (pot) fi preluată(e) din unul sau mai multe TAA specifice şi se pot lega de molecule MHC de clasă I.

Un alt aspect al descoperirii furnizează un acid nucleic (de exemplu o polinucleotidă) care codifică o peptidă sau o variantă de peptidă din invenţie. Polinucleotida poate fi, de exemplu, ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie a acestora, în helix simplu şi/sau dublu sau în forme native sau stabilizate de polinucleotide, cum ar fi, de exemplu, polinucleotidele cu bază de fosforotioat şi poate conţine sau nu introni, cu condiţia să codifice pentru peptidă. Desigur, numai peptidele care conţin resturi de aminoacid existente în mod natural şi unite prin legături peptidice care apar în mod natural sunt codificabile de o polinucleotidă. Un alt aspect al descoperirii constă în furnizarea unui vector de expresie capabil să exprime o polipeptidă conform descoperirii.

Au fost dezvoltate mai multe metode de legare a polinucleotidelor, în special a ADN-ului, de vectori, de exemplu, prin terminale coezive complementare. De exemplu segmentului ADN i se pot adăuga regiuni homopolimerice complementare care să fie introduse în ADN-ul vector. Vectorul şi segmentul ADN sunt apoi unite prin punţi de hidrogen între cozile complementare homopolimer pentru a forma molecule ADN recombinate.

Agenţii de legătură sintetici care conţin unul sau mai multe situri limitative oferă o modalitate alternativă de alăturare a segmentelor ADN la vectori. Agenţii de legare care conţin o varietate de situri de endonucleaze de restricţie sunt disponibili comercial de la mai multe surse, dintre care amintim pe International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SUA.

O metodă preferabilă de modificare a ADN-ului care codifică polipeptida din descoperire utilizează reacţia de polimerază în lanţ descrisă de Saiki RK et al. (Saiki et al., 1988). Această metodă poate fi utilizată pentru introducerea ADN-ului într-un vector potrivit, de exemplu prin implementarea în locaţii cu restricţii adecvate, sau poate fi utilizată pentru modificarea ADN-ului în alte moduri utile, după cum este cunoscut în domeniu. În cazul utilizării unor vectori virali, sunt preferaţi vectorii virus variolic sau adenovirus.

ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) poate fi apoi exprimat într-o gazdă adecvată pentru a produce o polipeptidă compusă din peptidă sau varianta din descoperire. Prin urmare, ADN-ul care codifică peptida sau varianta din descoperire poate fi utilizat în conformitate cu tehnicile cunoscute, modificate corespunzător instrucţiunilor prezente, în vederea construirii unui vector de expresie, care este apoi utilizat pentru transformarea unei celule-gazdă corespunzătoare pentru exprimarea şi producerea polipeptidei din descoperire. Astfel de tehnici includ cele descrise, de exemplu, în US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 şi 4,810,648.

ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) care codifică polipeptida care formează compusul din descoperire poate fi cuplat cu o mare varietate de alte secvenţe ADN pentru introducerea într-o gazdă adecvată. ADN-ul însoţitor va depinde de natura gazdei, modul de introducere a ADN-ului în gazdă şi dacă se doreşte integrarea sau întreţinerea episomală.

În general, ADN-ul este inserat într-un vector de expresie, cum ar fi o plasmidă, cu orientarea corectă şi intervalul potrivit de citire pentru expresie. Dacă este necesar, ADN-ul poate fi corelat cu secvenţele de nucleotide de transcriere şi translaţie corespunzătoare, recunoscute de gazda dorită, cu toate că astfel de controale sunt disponibile în general în vectorul de expresie. Vectorul este apoi introdus în gazdă prin tehnicile standard. În general, nu toate gazdele vor fi transformate de vector. Prin urmare, va fi nevoie de selectarea unor celule-gazdă transformate. Una dintre tehnicile de selectare implică înglobarea în vectorul de exprimare a unei secvenţe ADN cu toate elementele de control necesare, care să codifice o trăsătură selectabilă din celula transformată, cum ar fi de exemplu rezistenţa la antibiotic.

Alternativ, gena unei asemenea trăsături selectabile poate fi pe un alt vector, care este folosit pentru a cotransforma celula-gazdă dorită.

Celulele-gazdă care au fost transformate de ADN-ul recombinant din descoperire sunt apoi cultivate un timp suficient şi în condiţii corespunzătoare, cunoscute celor iniţiaţi, în conformitate cu îndrumările din acest document, pentru a permite exprimarea polipeptidei, care poate fi apoi recuperată.

Sunt cunoscute numeroase sisteme de exprimare, inclusiv bacterii (de exemplu, E. coli şi Bacillus subtilis), drojdii (de exemplu, Saccharomyces cerevisiae), fungi filamentoşi (de exemplu, Aspergillus spec.), celule vegetale, celule animale şi celule provenite de la insecte. Este de preferat ca sistemul să poată fi format din celule de mamifere, cum ar fi celulele CHO, disponibile din ATCC Cell Biology Collection.

Prezenta descoperire este legată şi de o serie de celule-gazdă transformate cu un vector polinucleotidic, creat în cadrul prezentei invenţii. Celula-gazdă poate fi procariotă sau eucariotă. Este posibil ca celulele bacteriene să fie celule-gazdă procariote preferate în anumite circumstanţe şi, de regulă, sunt o tulpină de E. coli, cum ar fi, de exemplu, tulpinile E. coli DH5, disponibile de la Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SUA, şi RR1, disponibile de la American Type Culture Collection (ATCC) din Rockville, MD, SUA (No ATCC 31343). Printre celulele-gazdă eucariote se numără celulele de drojdie, insecte şi mamifere, de preferinţă celule de vertebrate precum cele de la şoarece, şobolan, maimuţă sau linii de celule fibroblastice sau de colon umane. Celulele-gazdă provenite din drojdii includ YPH499, YPH500 şi YPH501, care sunt disponibile în general de la Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA92037, SUA. Celulele-gazdă preferate provenite de la mamifere includ celulele ovariene de hamster chinezesc, disponibile de la ATCC ca CCL61, celulele embrionare de cobai NIH elveţian, NIH/3T3 disponibile de la ATCC ca CRL 1658, celulele COS-1 derivate din rinichii de maimuţă disponibile de la ATCC ca CRL 1650 şi celulele 293 care sunt celule embrionare renale umane. Celulele preferate provenite de la insecte sunt celulele Sf9 care pot fi transfectate cu vectori de exprimare a baculovirusului. O prezentare generală a opţiunilor de celule-gazdă adecvate poate fi găsită, de exemplu, în manualul scris de Paulina Balbás şi Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols», Partea I, ediţia a doua, ISBN 978-1-58829-262-9 şi în alte lucrări cunoscute în domeniu.

Transformarea celulelor-gazdă adecvate cu un produs ADN obţinut pe baza acestui patent este realizată folosind metode bine cunoscute care depind de obicei de tipul de vector folosit. În ceea ce priveşte transformarea celulelor-gazdă procariote, vezi, de exemplu, Cohen et al. (Cohen et al., 1972) şi (Green and Sambrook, 2012). Transformarea celulelor de drojdii este descrisă în Sherman et al. (Sherman et al., 1986). Metoda lui Beggs (Beggs, 1978) este, de asemenea, utilă. Referitor la celulele de la vertebrate, reactivii utili în transferul unor astfel de celule, de exemplu, formule pe bază de fosfat de calciu şi DEAE-dextran sau lipozom, sunt disponibili de la Stratagene Cloning Systems sau de la Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD20877, SUA. Electro-permeabilizarea este de asemenea utilă pentru transformarea şi/sau transfectarea celulelor şi este o metodă bine cunoscută pentru transformarea celulelor provenite din drojdii, bacterii, insecte şi a celulelor vertebrate.

Celulele transformate cu succes, adică celulele care conţin o construcţie ADN din prezenta invenţie, pot fi identificate prin tehnici bine cunoscute, cum este PCR. Alternativ, prezenţa proteinei în stratul supranatant poate fi detectată folosind anticorpi.

Se va aprecia că anumite celule-gazdă din cadrul descoperirii sunt utile în pregătirea peptidei din descoperire, de exemplu celule de bacterii, de levuri şi de insecte. Totuşi, şi alte celule-gazdă pot fi utile pentru anumite metode terapeutice. De exemplu, celulele prezentatoare de antigen, cum ar fi celulele dendritice, pot fi şi ele utile pentru exprimarea peptidelor din descoperire, astfel încât să fie încărcate în moleculele MHC adecvate. Prin urmare, această invenţie prezintă o celulă-gazdă, compusă dintr-un acid nucleic, sau un vector de exprimare, conform invenţiei.

Într-o integrare optimă, celula-gazdă este o celulă prezentatoare de antigen, în particular o celulă dendritică sau o celulă prezentatoare de antigen. Celulele APC încărcate cu o proteină de fuziune recombinantă, care conţine fosfatază acidă prostatică (PAP), sunt în prezent în curs de investigare de către U.S. Food and Drug Administration (FDA) la data de 29 aprilie 2010 pentru tratamentul cancerului de prostată asimptomatic sau minim simptomatic (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Un alt aspect al invenţiei se referă la o metodă de producere a unei peptide sau a variantei sale, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.

În altă integrare a peptidei, acidul nucleic sau vectorul de expresie inventat este utilizat în medicină. De exemplu, peptida sau varianta acesteia poate fi pregătită pentru injectare intravenoasă (i.v.), injectare subcutanată (s.c.), injectare intradermică (i.d.), injectare intraperitoneală (i.p.) sau injectare intramusculară (i.m.). Metodele preferate de administrare injectabilă pentru peptidă sunt s.c., i.d., i.p., i.m. şi i.v. Metodele preferate de administrare injectabilă pentru ADN sunt i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. Pot fi date doze de peptidă şi ADN cuprinse, de exemplu, între 50 µg şi 1,5 mg, preferabil între 125 µg şi 500 µg, şi vor depinde de peptida sau ADN-ul respectiv. Dozele din acest interval au fost utilizate cu succes în studii anterioare (Walter et al., 2012).

Polinucleotida utilizată pentru vaccinare activă poate fi substanţial pură sau poate fi conţinută de un vector sau de un sistem de livrare adecvat. Acidul nucleic poate fi ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie dintre acestea. Metodele pentru conceperea şi introducerea unui astfel de acid nucleic sunt bine cunoscute în domeniu. O prezentare generală este furnizată, de exemplu, de Teufel et al. (Teufel et al., 2005). Vaccinurile polinucleotidice sunt uşor de preparat, însă modul de acţiune al acestor vectori în inducerea unui răspuns imunitar nu este pe deplin înţeles. Printre vectorii şi sistemele de livrare adecvate se numără ADN-ul şi/sau ARN-ul viral, cum ar fi sistemele bazate pe adenovirus, virusul vaccinia, retrovirusuri, adenovirusuri asociate sau hibrizi care conţin elemente din mai multe virusuri. Printre sistemele de livrare nevirale se numără lipide cationice şi polimeri cationici, bine cunoscuţi în domeniul livrării ADN-ului. Se poate folosi administrarea fizică, cum ar fi cea pe calea unui „pistol genic». Peptida sau peptidele codificată(e) de acidul nucleic poate (pot) fi o proteină de fuziune, de exemplu cu un epitop care stimulează celulele T pentru celula CDR opusă respectivă, după cum s-a observat mai sus.

Adjuvanţii preferaţi sunt anti-CD40, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamidă, sunitinib, bevacizumab, interferon alfa, oligonucleotide şi derivaţi de CpG, poli(I:C) şi derivaţi, ARN, sildenafil şi formulări sub formă de particule cu PLG sau virozomi.

Într-o formulare preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei, adjuvantul este selecţionat dintr-un grup care constă din factori stimulatori ai coloniilor, cum ar fi factorul stimulator al coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod, resiquimod şi interferon alfa.

În concretizarea preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei adjuvantul este selecţionat dintr-un grup care constă din factori stimulatori ai coloniilor, cum ar fi factorul stimulator al coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod şi resiquimod. În formularea preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei, adjuvantul este ciclofosfamidă, imiquimod sau resiquimod. Adjuvanţii şi mai preferaţi sunt Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC (Hiltonol®) şi anti-CD40 mAB sau combinaţii ale acestora.

Această compoziţie este folosită pentru administrare parenterală, cum ar fi subcutanată, intradermică, intramusculară sau orală. Pentru aceasta, peptidele şi opţional alte molecule sunt dizolvate sau in suspensie într-un mediu de transport (transportor) farmacologic acceptabil, preferabil apos. În plus, compoziţia poate conţine excipienţi, cum ar fi tampoane, agenţi de legare, agenţi explozivi, diluanţi, arome, lubrifianţi etc. Peptidele pot fi, de asemenea, administrate împreună cu substanţe care stimulează imunitatea, cum ar fi citokinele. Lista exhaustivă de excipienţi care se pot folosi în această compoziţie poate, de exemplu, fi preluată din A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Compoziţia poate fi folosită pentru prevenirea, profilaxia şi/sau tratamentul bolilor adenomatoase sau canceroase. Exemple de formule pot fi găsite, de exemplu, în EP2113253.

Este important de înţeles că răspunsul imunitar declanşat de vaccin în conformitate cu invenţia atacă cancerul în diferite stadii celulare şi în diferite stadii de dezvoltare. Mai mult, sunt atacate diferite căi de semnalizare asociate cancerului. Acesta este un avantaj faţă de vaccinurile care vizează doar una sau câteva ţinte, ceea ce poate determina adaptarea uşoară a tumorii la atac (evadare a tumorii). Mai mult, nu toate tumorile individuale exprimă acelaşi model de antigeni. Prin urmare, o combinaţie de mai multe peptide asociate tumorii asigură faptul că fiecare tumoare poartă cel puţin unele dintre ţinte. Compoziţia este concepută astfel încât fiecare tumoare este de aşteptat să exprime mai mulţi dintre antigeni şi să acopere mai multe căi independente necesare pentru creşterea şi menţinerea tumorii. Astfel, vaccinul poate fi „de uz general» pentru o populaţie mai mare de pacienţi. Acest lucru înseamnă că o preselectare a pacienţilor care urmează să fie trataţi cu vaccinul poate fi restricţionată la tiparea HLA, nu necesită evaluări suplimentare ale biomarkerului pentru exprimarea antigenului, dar este totuşi asigurat că mai multe ţinte sunt atacate simultan de răspunsul imunitar indus, ceea ce este important pentru eficacitate (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

Peptida din prezenta invenţie se poate folosi pentru a genera şi a dezvolta anticorpi specifici contra complexelor MHC/peptidă. Acestea se pot folosi pentru tratament, direcţionarea toxinelor sau substanţelor radioactive către ţesutul bolnav. O altă utilizare a acestor anticorpi poate fi ţintirea radionuclizilor către ţesutul bolnav în scopuri imagistice, cum ar fi PET. Această utilizare poate ajuta la depistarea metastazelor mici sau pentru stabilirea dimensiunii şi localizării exacte a ţesutului bolnav.

Prin urmare, un alt aspect al invenţiei este furnizarea unei metode pentru producerea unui anticorp recombinant care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I sau II uman care este complexat cu un antigen HLA-restricţionat, metoda cuprinzând: imunizarea unui mamifer non-uman modificat genetic care cuprinde celule care exprimă respectivul complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I sau II uman cu o formă solubilă a moleculei MHC de clasă I sau II complexate cu respectivul antigen HLA-restricţionat; izolarea moleculelor ARNm din celulele producătoare de anticorp ale respectivului mamifer non-uman; producerea unei biblioteci de prezentare a fagilor care prezintă molecule de proteină codificate de respectivele molecule ARNm; şi izolarea cel puţin a unui fag din respectiva bibliotecă de prezentare a fagilor, cel puţin un fag care prezintă anticorpul respectiv cu legare specifică la complexul major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I sau II uman complexat cu antigenul HLA-restricţionat menţionat.

Un alt aspect al invenţiei este acela de a furniza un anticorp care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I sau II care este complexat cu un antigen restricţionat HLA, în care anticorpul este, de preferinţă, un anticorp policlonal, un anticorp monoclonal, un anticorp bi-specific şi/sau un anticorp himeric.

Metodele respective pentru producerea unor astfel de anticorpi şi complexe majore de histocompatibilitate de clasă I cu catenă unică, precum şi alte instrumente pentru producerea acestor anticorpi sunt descrise în WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 şi în publicaţii (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003), care, în scopul prezentei invenţii, sunt toate încorporate în mod explicit prin referinţă în ansamblul lor.

Preferabil, anticorpul se leagă la complex cu o afinitate de legare mai mică de 20 nanomolari, preferabil sub 10 nanomolari, care este, de asemenea, considerată ca fiind „specifică» în contextul prezentei invenţii.

Prezenta descoperire se referă la o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191 sau o variantă a acesteia care este cel puţin 88% omologă (de preferinţă identică) cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191 sau o variantă a acesteia care induce celule T care reacţionează încrucişat cu peptida menţionată, în care peptida menţionată nu este polipeptida de bază cu lungime completă.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191 sau o variantă a acesteia care este cel puţin 88% omologă (de preferinţă identică) cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191, în care peptida menţionată sau varianta acesteia are o lungime totală între 8 şi 100, de preferinţă între 8 şi 30 şi, cel mai preferat, între 8 şi 14 aminoacizi.

Prezenta invenţie se referă şi la peptidele în conformitate cu invenţia şi care au capacitatea de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau de clasă II.

Prezenta invenţie se referă şi la peptidele în conformitate cu invenţia care constau în esenţă dintr-o secvenţă de aminoacizi conformă cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la peptidele în conformitate cu invenţia, în care respectiva peptidă este modificată (chimic) şi/sau include legături non-peptidice.

Prezenta invenţie se referă suplimentar la peptidele în conformitate cu invenţia, în care peptida face parte dintr-o proteină de fuziune, care cuprinde în special aminoacizi N-terminali ai lanţului invariant (Ii) asociat cu antigenul HLA-DR sau în care peptida este fuzionată cu (sau în) un anticorp, cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celulele dendritice.

Prezenta invenţie se referă în plus la un acid nucleic care codifică peptidele în conformitate cu invenţia, cu condiţia ca peptida să nu fie proteina umană completă (întreagă).

Prezenta invenţie se referă în continuare la acidul nucleic în conformitate cu invenţia, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora.

Prezenta invenţie se referă în continuare la un vector de exprimare capabil să exprime un acid nucleic conform prezentei invenţii.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o peptidă conform prezentei invenţii, un acid nucleic conform prezentei invenţii sau un vector de exprimare conform prezentei invenţii pentru utilizare în medicină, în special în tratarea CRC.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o celulă-gazdă cuprinzând un acid nucleic conform invenţiei sau un vector conform invenţiei.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la celula-gazdă în conformitate cu prezenta invenţie care este o celulă prezentatoare de antigen şi, preferabil, este o celulă dendritică.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o metodă de producere a unei peptide în conformitate cu prezenta invenţie, metoda cuprinzând cultivarea celulei-gazdă conform prezentei invenţii şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.

Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu prezenta invenţie în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I sau II exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu invenţia, în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare capabil să exprime respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191 sau varianta menţionată de secvenţă de aminoacizi.

Prezenta invenţie se referă în continuare la celulele T activate produse prin metoda în conformitate cu prezenta invenţie, în care celulele T menţionate recunosc selectiv o celulă care exprimă în mod aberant o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu prezenta invenţie.

Prezenta invenţie se mai referă şi la o metodă de distrugere a celulelor ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi în conformitate cu prezenta invenţie, metoda cuprinzând administrarea, la pacient, a unui număr eficace de celule T în conformitate cu prezenta invenţie.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, a unui acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie, a unui vector de exprimare în conformitate cu prezenta invenţie, a unei celule în conformitate cu prezenta invenţie sau a unei limfocite T citotoxice activate în conformitate cu prezenta invenţie ca medicament sau în fabricarea unui medicament. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu prezenta invenţie în care respectivul medicament este activ împotriva cancerului.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu invenţia în care medicamentul este un vaccin. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu invenţia în care medicamentul este activ împotriva cancerului.

Prezenta invenţie se mai referă la o utilizare în conformitate cu invenţia, în care celulele canceroase menţionate sunt celule de CRC sau alte celule tumorale solide sau hematologice, cum ar fi cancer pulmonar, cancer cerebral, cancer de stomac, cancer renal, cancer hepatic, cancer pancreatic, cancer de prostată, leucemie, cancer de glandă mamară, carcinom cu celule Merkel, melanom, cancer ovarian şi cancer esofagian.

Prezenta descoperire se referă în continuare la proteine marker şi biomarkeri particulari pe baza peptidelor din prezenta invenţie, numite în prezentul document „ţinte», care pot fi utilizate în diagnosticarea şi/sau prognosticul CRC. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la utilizarea acestor ţinte noi pentru tratarea cancerului.

Termenul „anticorp» sau „anticorpi» este utilizat aici într-un sens larg şi include anticorpi atât policlonali, cât şi monoclonali. În plus faţă de moleculele de imunoglobulină intacte sau „complete», în termenul „anticorpi» sunt incluse, de asemenea, fragmente (de exemplu, fragmente de CDR, Fv, Fab şi Fc) sau polimeri ai acelor molecule de imunoglobulină şi versiunile umanizate ale moleculelor de imunoglobulină, atât timp cât acestea manifestă oricare dintre proprietăţile dorite (de exemplu, legarea specifică a unei (poli)peptide marker CRC, livrarea unei toxine într-o celulă de CRC care exprimă o genă marker de cancer la un nivel crescut şi/sau inhibarea activităţii unei polipeptide marker de CRC) în conformitate cu invenţia.

Ori de câte ori este posibil, anticorpii invenţiei pot fi achiziţionaţi din surse comerciale. Anticorpii conform invenţiei pot fi generaţi, de asemenea, folosindu-se metode bine cunoscute. Specialiştii în domeniu vor înţelege că pot fi utilizate fie polipeptide markeri de CRC de lungime completă, fie fragmente ale acestora pentru generarea anticorpilor în conformitate cu invenţia. O polipeptidă de utilizat pentru generarea unui anticorp al invenţiei poate fi purificată parţial sau complet dintr-o sursă naturală sau poate fi produsă utilizându-se tehnici cu ADN recombinant.

De exemplu, un ADNc care codifică o peptidă conform prezentei invenţii, cum ar fi o peptidă cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191, o polipeptidă ori o variantă sau un fragment al acesteia, poate fi exprimat în celule procariote (de exemplu, bacterii) sau celule eucariote (de exemplu, celule de drojdii, de insecte sau de mamifere), după care proteina recombinantă poate fi purificată şi utilizată pentru a genera un preparat de anticorpi monoclonali sau policlonali care leagă în mod specific polipeptida marker de CRC utilizată pentru a genera anticorpul, conform invenţiei.

Un specialist în domeniu va realiza că generarea a două sau mai multe seturi diferite de anticorpi monoclonali sau policlonali maximizează probabilitatea obţinerii unui anticorp cu specificitatea şi afinitatea necesare utilizării sale preconizate (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imagistică in vivo, terapie cu imunotoxine). Anticorpii sunt testaţi pentru activitatea dorită prin metode cunoscute, în conformitate cu scopul pentru care anticorpii urmează să fie utilizaţi (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imunoterapie etc.), pentru îndrumări suplimentare privind generarea şi testarea anticorpilor (vezi, de exemplu, Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). De exemplu, anticorpii pot fi testaţi în teste ELISA, imunoamprente (Western blots), colorare imunohistochimică a cancerelor fixate cu formalină sau secţiuni de ţesut îngheţat. După caracterizarea iniţială in vitro, anticorpii destinaţi utilizării diagnostice terapeutice sau in vivo sunt testaţi conform metodelor cunoscute de testare clinică.

Termenul „anticorp monoclonal», aşa cum este utilizat aici, se referă la un anticorp obţinut dintr-o populaţie substanţial omogenă de anticorpi, adică anticorpii individuali cuprinzând populaţia sunt identici, cu excepţia mutaţiilor posibile în mod natural care pot fi prezente în cantităţi minore. Anticorpii monoclonali descrişi în mod specific includ anticorpi „himerici», în care o porţiune din catena grea şi/sau uşoară este identică sau omologă cu secvenţele corespunzătoare din anticorpi derivaţi dintr-o specie particulară sau aparţinând unei anumite clase sau subclase de anticorpi, în timp ce restul catenei (catenelor) este identic sau omolog cu secvenţele corespunzătoare din anticorpii derivaţi de la o altă specie sau aparţinând unei alte clase sau subclase de anticorpi, precum şi fragmente ale unor astfel de anticorpi, atât timp cât aceştia prezintă activitatea antagonistă dorită (US 4,816,567, care este încorporat aici integral).

Anticorpii monoclonali ai invenţiei pot fi generaţi folosindu-se metode de hibridom. Într-o metodă de hibridom, un şoarece sau alt animal-gazdă adecvat este, de obicei, imunizat cu un agent de imunizare pentru a obţine limfocite care produc sau sunt capabile să producă anticorpi care se vor lega în mod specific la agentul imunizant. Ca alternativă, limfocitele pot fi imunizate in vitro.

Anticorpii monoclonali pot fi obţinuţi, de asemenea, prin metode de ADN recombinant, cum ar fi cele descrise în US 4,816,567. ADN-ul care codifică anticorpii monoclonali ai invenţiei poate fi izolat uşor şi secvenţializat utilizându-se proceduri convenţionale (de exemplu, prin utilizarea probelor oligonucleotidice care sunt capabile să se lege în mod specific la genele codificatoare ale catenelor grele şi uşoare ale anticorpilor murinici).

Metodele in vitro sunt, de asemenea, adecvate pentru prepararea anticorpilor monovalenţi. Digestia anticorpilor pentru a produce fragmente ale acestora, în particular fragmente Fab, poate fi realizată folosindu-se tehnici de rutină cunoscute în domeniu. De exemplu, digestia poate fi efectuată folosindu-se papaină. Exemple de digestie cu papaină sunt descrise în WO 94/29348 şi US 4,342,566. Digestia cu papaină a anticorpilor produce, de obicei, două fragmente identice de legare la antigen, numite fragmente Fab, fiecare cu un singur situs de legare a antigenului şi un fragment Fc rezidual. Tratamentul pepsinei generează un fragment F(ab')2 şi un fragment pFc'.

Fragmentele de anticorpi, fie că sunt ataşate la alte secvenţe sau nu, pot include de asemenea inserţii, deleţii, substituţii sau alte modificări selectate ale unor regiuni particulare sau reziduuri specifice de aminoacizi, cu condiţia ca activitatea fragmentului să nu fie modificată sau degradată în mod semnificativ faţă de anticorpul nemodificat sau fragmentul de anticorp. Aceste modificări pot furniza unele proprietăţi suplimentare, cum ar fi eliminarea/adăugarea de aminoacizi capabili de legare la disulfuri, creşterea biolongevităţii, modificarea caracteristicilor secretoare etc. În orice caz, fragmentul de anticorp trebuie să posede o proprietate bioactivă, cum ar fi activitatea de legare, reglarea legării la domeniul de legare, etc. Regiunile funcţionale sau active ale anticorpului pot fi identificate prin mutageneza unei regiuni specifice a proteinei, urmată de exprimarea şi testarea polipeptidei exprimate. Astfel de metode sunt uşor de înţeles pentru un specialist în domeniu şi pot include mutageneza specifică situsului acidului nucleic care codifică fragmentul de anticorp.

Anticorpii conform invenţiei pot cuprinde suplimentar anticorpi umanizaţi sau anticorpi umani. Formele umanizate ale anticorpilor non-umani (de exemplu, murini) sunt imunoglobuline himerice, catene de imunoglobulină sau fragmente ale acestora (cum ar fi Fv, Fab, Fab 'sau alte subsecvente de legare la antigenului ale anticorpilor) care conţin o secvenţă minimă derivată din imunoglobulină non-umană. Anticorpii umanizaţi includ imunoglobuline umane (anticorp receptor) în care resturile dintr-o regiune determinantă complementară (CDR) a recipientului sunt înlocuite cu resturi dintr-o CDR a unei specii non-umane (anticorp donor), de exemplu de şoarece, şobolan sau iepure cu specificitatea, afinitatea şi capacitatea dorite. În unele cazuri, resturile de cadru Fv (FR) ale imunoglobulinei umane sunt înlocuite cu resturi non-umane corespunzătoare. Anticorpii umanizaţi pot cuprinde, de asemenea, resturi care nu se găsesc nici în anticorpul receptor, nici în secvenţele de CDR sau de cadru importate. În general, anticorpul umanizat va cuprinde, practic, toate cel puţin unul şi, de obicei, două domenii variabile în care toate sau, practic, toate regiunile CDR corespund cu cele ale unei imunoglobuline non-umane şi toate sau, practic, toate regiunile FR sunt cele ale unei secvenţe de consens a imunoglobulinelor umane. Anticorpul umanizat optim va cuprinde, de asemenea, cel puţin o porţiune dintr-o regiune constantă de imunoglobulină (Fc), de obicei cea a unei imunoglobuline umane.

Metodele de umanizare a anticorpilor non-umani sunt bine cunoscute în domeniu. În general, un anticorp umanizat are unul sau mai multe resturi de aminoacid introduse în el dintr-o sursă non-umană. Aceste reziduuri de aminoacid non-umane sunt adesea denumite reziduuri de „import», care sunt, de obicei, luate dintr-un domeniu variabil de „import». Umanizarea poate fi realizată, practic, prin substituirea CDR-urilor sau a secvenţelor CDR de la rozătoare pentru secvenţele corespunzătoare unui anticorp uman. În consecinţă, astfel de anticorpi „umanizaţi» sunt anticorpi himerici (US 4,816,567), în care, practic, mai puţin de un domeniu variabil uman intact a fost substituit cu secvenţa corespunzătoare de la o specie non-umană. În practică, anticorpii umanizaţi sunt, de obicei, anticorpi umani în care unele resturi CDR şi, posibil, unele resturi FR sunt substituite cu resturi din situsuri analoage în anticorpi de la rozătoare.

Pot fi folosite animale transgenice (de exemplu, şoareci), care sunt capabile, după imunizare, să producă un repertoriu complet de anticorpi umani în absenţa producţiei de imunoglobulină endogenă. De exemplu, a fost descris că deleţia homozigotă a genei regiunii de legare a catenei grele de anticorp la şoareci mutanţi himeric şi de filiaţie germinală conduce la inhibarea completă a producţiei de anticorpi endogeni. Transferul seriei de gene de imunoglobulină cu filiaţie germinală umană în astfel de şoareci mutanţi cu filiaţie germinală va conduce la producerea de anticorpi umani după provocarea de către un antigen. Anticorpii umani pot fi, de asemenea, produşi în biblioteci de afişare a fagilor.

Anticorpii din invenţie sunt, preferabil, administraţi unui subiect într-un agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. În mod obişnuit, o cantitate adecvată dintr-o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este utilizată în formulă pentru a face formularea izotonică. Exemplele de agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic includ soluţia salină, soluţia Ringer şi soluţia de dextroză. pH-ul soluţiei este, preferabil, de la aproximativ 5 la aproximativ 8 şi, mai preferabil, de la aproximativ 7 până la aproximativ 7,5. Agenţii purtători suplimentari includ preparate cu eliberare prelungită, de exemplu matrice semipermeabile de polimeri hidrofobi solizi care conţin anticorpul, matricele fiind sub formă de articole formate, de exemplu, pelicule, lipozomi sau microparticule. Va fi evident pentru persoanele de specialitate din domeniu că anumiţi agenţi purtători pot fi mai preferabili în funcţie de, de exemplu, calea de administrare şi concentraţia anticorpului care este administrat.

Anticorpii pot fi administraţi subiectului, pacientului sau celulei prin injectare (de exemplu, intravenoasă, intraperitoneală, subcutanată, intramusculară) sau prin alte metode, cum ar fi perfuzia, care asigură eliberarea sa în sânge într-o formă eficace. De asemenea, anticorpii pot fi administraţi pe căi intratumorale sau peritumorale pentru a exercita efecte terapeutice locale, precum şi sistemice. Este preferabilă injectarea locală sau intravenoasă.

Dozele şi schemele eficace pentru administrarea anticorpilor pot fi determinate empiric şi realizarea unor astfel de determinări se află în domeniul de specialitate. Specialiştii în domeniu vor înţelege că doza de anticorpi care trebuie administrată va varia în funcţie de, de exemplu, subiectul care va primi anticorpul, calea de administrare, de tipul particular de anticorp utilizat şi alte medicamente administrate. O doză zilnică tipică de anticorp utilizat singur poate varia de la aproximativ 1 µg/kg până la 100 mg/kg de greutate corporală sau mai mult pe zi, în funcţie de factorii menţionaţi mai sus. După administrarea unui anticorp, preferabil pentru tratarea CRC, eficacitatea anticorpului terapeutic poate fi evaluată în diverse moduri bine cunoscute de către specialiştii în domeniu. De exemplu, mărimea, numărul şi/sau distribuţia cancerului la un subiect care primeşte tratament pot fi monitorizate utilizându-se tehnici standard de imagistică tumorală. Un anticorp administrat terapeutic care opreşte creşterea tumorii, are ca rezultat contracţia tumorală şi/sau împiedică dezvoltarea de tumori noi în comparaţie cu evoluţia bolii care ar avea loc în absenţa administrării anticorpului este un anticorp eficace pentru tratamentul cancerului.

Un alt aspect al invenţiei este acela de a furniza o metodă pentru producerea unui receptor de celule T solubil (sTCR) care să recunoască un complex peptidă-MHC specific. Astfel de receptori de celule T solubili pot fi generaţi din clone de celule T specifice şi afinitatea lor poate fi crescută prin mutageneză care vizează regiunile determinante de complementaritate. În scopul selectării receptorilor de celule T, poate fi utilizat o afişare de fagi (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). În scopul stabilizării receptorilor celulelor T în timpul afişării fagilor şi în cazul utilizării practice ca medicament, catena alfa şi catena beta pot fi legate, de exemplu, prin legături disulfidice non-native, alte legături covalente (receptor de celulă T cu o singură catenă) sau prin domenii de dimerizare (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). Receptorul de celule T poate fi legat de toxine, medicamente, citokine (a se vedea, de exemplu, US 2013/0115191), domenii care recrutează celule efectoare precum domeniul anti-CD3, etc. pentru a executa anumite funcţii asupra celulelor-ţintă. Mai mult, poate fi exprimată în celule T utilizate pentru transferul adoptiv. Informaţii suplimentare pot fi găsite în WO 2004/033685A1 şi WO 2004/074322A1. O combinaţie de sTCR-uri este descrisă în WO 2012/056407A1. Alte metode pentru producere sunt prezentate în WO 2013/057586A1.

În plus, peptidele şi/sau TCR-urile ori anticorpii sau alte molecule de legare din prezenta descoperire pot fi utilizate pentru a verifica diagnosticul de cancer de la un patolog pe baza unei probe biopsiate.

Anticorpii sau TCR-urile pot fi utilizate, de asemenea, pentru teste diagnostice in vivo. În general, anticorpii sunt etichetaţi printr-o radionucleotidă (cum ar fi 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32 P sau 35S), astfel încât tumora să poată fi localizată folosind imunoscintiografie. Într-una dintre realizări, anticorpii sau fragmentele acestora se leagă la domeniile extracelulare a două sau mai multe ţinte ale unei proteine selectate din grupul format din proteinele menţionate mai sus, iar valoarea de afinitate (Kd) este mai mică de 1 x 10 µM.

Anticorpii pentru utilizare diagnostică pot fi etichetaţi cu sonde adecvate pentru detectarea prin diferite metode imagistice. Metodele pentru detectarea sondelor includ, dar nu se limitează la, fluorescenţă, lumină, microscopie confocală şi electronică; imagistică prin rezonanţă magnetică şi spectroscopie; fluoroscopie, tomografie computerizată şi tomografie cu emisie de pozitroni. Sondele adecvate includ, dar nu se limitează la, fluoresceină, rodamină, eozină şi alţi fluorofori, radioizotopi, aur, gadoliniu şi alte lantanide, fier paramagnetic, fluor-18 şi alţi radionuclizi cu emisie de pozitron. În plus, probele pot fi bi- sau multifuncţionale şi pot fi detectate folosind una sau mai multe dintre metodele prezentate aici. Aceşti anticorpi pot fi marcaţi direct sau indirect cu sondele menţionate. Ataşarea probelor la anticorpi implică ataşarea covalentă a probei, încorporarea probei în anticorp şi ataşarea covalentă a unui compus chelator pentru legarea probei, printre alte acţiuni bine cunoscute în domeniu. Pentru imunohistochimie, proba de ţesut bolnav poate fi proaspătă sau congelată ori poate fi încorporată în parafină şi fixată cu un conservant, cum ar fi formalina. Secţiunea fixată sau încorporată care conţine proba intră în contact cu un anticorp etichetat principal şi cu un anticorp secundar, anticorp folosit pentru a detecta exprimarea proteinelor in situ.

Un alt aspect al acestei invenţii include o metodă in vitro de producere a celulelor T activate, metoda constând în contactarea celulelor T in vitro cu molecule MHC umane încărcate cu antigen, exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate, pentru o perioadă de timp suficientă pentru activarea celulelor T într-un mod specific antigenului, antigenul fiind o peptidă conform invenţiei. Este de preferat să se utilizeze o cantitate suficientă de antigen împreună cu celula prezentatoare de antigen.

Este de preferat o celulă de mamifer, care are un nivel redus sau inexistent de funcţionare ca transportator de peptidă TAP. Printre celulele adecvate, care nu sunt transportatoare de peptidă TAP se numără celulele T2, RMA-S şi Drosophila. TAP este transportatorul asociat cu procesarea antigenului.

Linia de celule umane T2 deficiente în încărcarea peptidei este disponibilă de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, având Nr. de catalog CRL 1992; linia de celule Drosophila, linia Schneider 2 este disponibilă de la ATCC cu NR. de catalog CRL 19863; linia de celule RMA-S de şoarece este descrisă în Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985).

De preferinţă, înainte de transfectare, celula-gazdă nu exprimă în mod substanţial nicio moleculă MHC de clasă I. Este, de asemenea, de preferat ca celula stimulatoare să exprime o moleculă importantă pentru furnizarea unui semnal de costimulare pentru celule T, cum ar fi oricare dintre B7.1, B7.2, ICAM-1 şi LFA3. Secvenţele de acid nucleic ale numeroase molecule de MHC de clasă I şi ale moleculelor de costimulator sunt disponibile public în bazele de date GenBank şi EMBL.

În cazul unui epitop MHC de clasă I utilizat ca antigen, celulele T sunt celule T CD8-pozitive.

Dacă o celulă care prezintă antigen este transfectată pentru a exprima un astfel de epitrop, este de preferat ca celula să conţină un vector capabil să exprime peptida care conţine SEQ. ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191.

Se pot folosi o serie de alte metode pentru generarea celulelor T in vitro. De exemplu, în generarea CTL pot fi folosite limfocite cu infiltrare tumorală autologe. Plebanski et al. (Plebanski et al., 1995) au utilizat limfocite autologe din sânge periferic (PLB) în pregătirea celulelor T. Mai mult, este posibilă producerea de celule T autologe prin pulsarea de celule dendritice cu peptidă sau polipeptidă sau prin infectare cu un virus recombinant. De asemenea, pot fi folosite celule B pentru producerea de celule T autologe. În plus, celulele macrofage pulsate cu peptidă sau polipeptidă sau infectate cu virus recombinant pot fi utilizate pentru prepararea de celule T autologe. S. Walter et al. (Walter et al., 2003) descriu pregătirea in vitro a celulelor T prin utilizarea de celule prezentatoare de antigen artificiale (aAPC), aceasta reprezentând, de asemenea, o modalitate potrivită de generare de celule T pentru peptida aleasă. În prezenta invenţie, celulele aAPC au fost generate prin cuplarea unor complexe de peptide MHC preformate pe suprafaţa unor particule de polistiren (microgranule) prin biochimie biotină:streptavidină. Acest sistem permite controlul exact al densităţii MHC pe celulele aAPC, fapt ce permite amplificarea selectivă a răspunsurilor de aviditate ridicată sau scăzută a celulei T specifice antigenului cu eficienţă crescută, din probele de sânge. Pe lângă complexele MHC:peptidă, celulele aAPC trebuie să poarte alte proteine cu activitate de costimulare, cum ar fi anticorpi anti-CD28 cuplaţi pe suprafeţele lor. Mai mult, astfel de sisteme bazate pe aAPC necesită adesea adăugarea unor factori solubili adecvaţi, de exemplu citokine precum interleukina12.

Pentru pregătirea celulelor T se pot utiliza, de asemenea, celule alogene, iar o metodă este descrisă detaliat în WO 97/26328, încorporată în prezentul document prin referinţă. De exemplu, pe lângă celulele de Drosophila şi celulele T2, se pot utiliza şi alte celule pentru prezentarea antigenilor, cum ar fi celule CHO, celule de insecte infectate cu bacilovirus, bacterii, drojdii, celule ţintă infectate cu vaccin. În plus, se pot utiliza virusuri din plante (a se vedea, de exemplu, Porta et al. (Porta et al., 1994), care descriu dezvoltarea virusului mozaicului din Vigna unguiculata, ca fiind un sistem cu productivitate ridicată pentru prezentarea de peptide străine).

Celulele T activate care sunt orientate spre peptida din invenţie sunt utile în terapie. Astfel, un aspect suplimentar al invenţiei constă în descrierea celulelor T activate care se pot obţine prin metodele anterior menţionate în această invenţie.

Celulele T activate, care sunt produse de metoda de mai sus, vor recunoaşte selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă ce conţine o secvenţă de aminoacizi cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 191.

Este de preferat ca celula T să recunoască celula interacţionând prin TCR cu complexul HLA/peptidă (de exemplu, legare). Celulele T sunt utile într-o metodă de distrugere a celulelor ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din invenţie, atunci când pacientului îi este administrat un număr eficient de celule T activate. Celulele T care sunt administrate pacientului pot fi preluate de la pacient şi activate conform descrierii de mai sus (adică sunt celule T autologe). Ca alternativă, celulele T nu se preiau de la pacient, ci de la alt individ. Desigur, este de preferat ca sursa să fie un individ sănătos. Prin „individ sănătos», inventatorii înţeleg că individul are o stare generală de sănătate bună, de preferat un sistem imunitar puternic şi, mai bine, nu suferă de nicio boală care să poată fi testată sau detectată.

In vivo, celulele ţintă pentru celulele T CD8-pozitive conform prezentei invenţii pot fi celule tumorale (care, uneori, exprimă MHC de clasă II) şi/sau celulele stromale care înconjură tumora (celule tumorale) (care, uneori, pot şi ele exprima MHC de clasă II; (Dengjel et al., 2006)).

Celulele T din prezenta descoperire pot fi utilizate ca ingrediente active ale unei compoziţii terapeutice. Astfel, invenţia furnizează, de asemenea, o metodă de ucidere a celulelor-ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din descoperire, metoda constând în administrarea unui număr eficient de celule T pacientului, aşa cum s-a arătat mai sus.

Prin „exprimată aberant», inventatorii înţeleg, de asemenea, că polipeptida este supra-exprimată în comparaţie cu nivelurile normale de exprimare sau că gena este silenţioasă în ţesutul din care este derivă tumoarea, însă în tumoare este exprimată. Prin „supraexprimată», inventatorii înţeleg că polipeptida este prezentă la un nivel de cel puţin 1,2 ori mai mare decât în ţesutul normal; de preferat de cel puţin 2 ori şi, mai preferabil, de cel puţin 5 ori sau 10 ori mai mare decât nivelul prezent în ţesutul normal.

Celulele T pot fi obţinute prin metode cunoscute în domeniu, - precum cele descrise mai sus.

Protocoale pentru acest aşa-numit transfer adoptiv de celule T sunt bine cunoscute în domeniu. Recenzii pot fi găsite în: Gattioni et al. şi Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Un alt aspect al prezentei invenţii include utilizarea peptidelor complexate cu MHC pentru generarea unui receptor de celule T al cărui acid nucleic este clonat şi introdus într-o celulă gazdă, de preferinţă o celulă T. Această celulă T modificată poate fi transferată unui pacient pentru terapia cancerului.

Toate moleculele din această invenţie, adică peptida, acidul nucleic, anticorpul, vectorul de exprimare, celula T activată, receptorul celulei T sau acidul nucleic care îl codifică sunt utile pentru tratamentul unor afecţiuni caracterizate de celule care evită un răspuns imunitar. În consecinţă, orice moleculă din prezenta invenţie poate fi utilizată ca medicament sau pentru fabricarea unui medicament. Molecula poate fi utilizată ca atare sau combinată cu altă(e) moleculă(e) din invenţie sau cu o moleculă/molecule cunoscută(e).

Prezenta invenţie mai include un kit care cuprinde:

(a) un recipient conţinând o compoziţie farmaceutică conform descoperirii de mai sus, în soluţie sau în formă liofilizată;

(b) opţional, un al doilea recipient care conţine un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată; şi

(c) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei liofilizate.

Trusa poate conţine suplimentar şi una sau mai multe din următoarele: (iii) soluţie tampon, (iv) dizolvant, (v) filtru, (vi) ac sau (v) seringă. Recipientul este, preferabil, o sticlă, o fiolă, o seringă sau o eprubetă, şi poate fi un recipient reutilizabil. Compusul farmacologic este, preferabil, liofilizat.

Trusele din prezentul brevet vor conţine, preferabil, formula liofilizată care face obiectul prezentului brevet într-un recipient adecvat şi instrucţiunile pentru reconstituirea şi/sau utilizarea acesteia. Recipientele adecvate includ, de exemplu, sticle, fiole (de exemplu fiole dublu compartimentate), seringi (cum ar fi seringile dublu-compartimentate) şi eprubete. Recipientul poate fi construit dintr-o varietate de materiale, de exemplu sticlă sau plastic. Preferabil, trusa şi/sau recipientul conţin instrucţiuni privind (sau asociate cu) recipientul, care prezintă instrucţiunile de reconstituire şi/sau administrare. De exemplu, eticheta poate indica dacă formula liofilizată trebuie reconstituită la o concentraţie a peptidelor descrisă anterior. În plus eticheta poate indica dacă formula este utilizabilă sau destinată pentru administrarea subcutanată.

Recipientul care conţine formula poate fi o fiolă pentru utilizări multiple, care permite administrarea repetată (de exemplu, de la două la şase administrări) a formulei reconstituite. Trusa poate include în plus şi un al doilea recipient care conţine un dizolvant adecvat (de exemplu, soluţie de bicarbonat de sodiu).

La amestecarea dizolvantului cu formula liofilizată, concentraţia finală de peptide în formula reconstituită este preferabil de cel puţin 0,15 mg/ml/peptidă (=75 μg) şi preferabil nu depăşeşte 3 mg/ml/peptidă (=1500 μg). În plus trusa poate include şi alte materiale necesare din punct de vedere comercial şi al utilizării, inclusiv alte soluţii tampon, alţi dizolvanţi, filtre, ace, seringi şi pliante cu instrucţiuni de utilizare.

Trusele din prezentul brevet pot prezenta un singur recipient care conţine formula compusului farmacologic conform cu prezentul brevet, cu sau fără alte componente (de exemplu alţi compuşi sau alte formule farmacologice ale acestor alţi compuşi) sau pot prezenta câte un recipient distinct pentru fiecare compus.

Preferabil, trusele din invenţie includ o formă de condiţionare care face obiectul brevetului ambalată pentru utilizarea în combinaţie cu coadministrarea cu un al doilea compus (cum ar fi adjuvanţii (de exemplu GM-CSF, agent chimioterapeutic, produs natural, hormon sau antagonist, agent antiangiogenetic sau inhibitor de angiogeneză, agent inductor de apoptoză sau chelator) sau cu un compus farmacologic al acestora. Componentele trusei pot fi pre-amestecate sau fiecare componentă poate fi într-un recipient separat, distinct, înainte de administrarea către pacient. Componentele trusei se pot furniza în una sau mai multe soluţii lichide, preferabil soluţii apoase, şi în mod ideal ca soluţii apoase sterile. Componentele trusei pot fi furnizate de asemenea şi în stare solidă, care se poate converti în stare lichidă prin adăugarea solvenţilor adecvaţi, care se vor furniza preferabil într-un recipient distinct.

Recipientul unei truse terapeutice poate fi fiolă, eprubetă, flacon, sticlă, seringă sau orice altă formă de depozitare a unui solid sau lichid. De obicei, dacă este vorba de mai mult de un singur component, trusa va include şi o a doua fiolă sau un alt recipient, care permite dozarea separată. Trusa poate include şi un alt recipient pentru un lichid farmacologic acceptabil. Preferabil, trusa terapeutică va include şi un sistem (de exemplu unul sau mai multe ace, seringi, picurătoare pentru ochi, pipete etc.) care permit administrarea agenţilor care fac obiectul invenţiei şi care intră în componenţa trusei.

Formula prezentă este una adecvată pentru administrarea peptidelor pe o cale de administrare acceptabilă, cum ar fi orală (enterală), nazală, oftalmică, subcutanată, intradermică, intramusculară, intravenoasă sau transdermică. Preferabil, administrarea va fi subcutanată şi, cel mai preferabil, intradermică. Administrarea se poate face prin injectomat.

Deoarece peptidele din invenţie sunt izolate din CRC, medicamentul din invenţie este folosit, de preferinţă, pentru tratarea CRC.

Pe lângă utilitatea lor în tratamentul cancerului, peptidele care fac obiectul prezentei invenţii sunt utile şi în scop diagnostic. Deoarece peptidele au fost generate din celule de CRC şi deoarece s-a stabilit că aceste peptide nu sunt prezente sau sunt prezente la niveluri scăzute în ţesuturile normale, aceste peptide se pot folosi pentru a diagnostica prezenţa unui cancer.

Prezenţa peptidelor revendicate în biopsii tisulare de probe de sânge poate ajuta anatomopatologul în diagnosticul cancerului. Detectarea anumitor peptide prin intermediul anticorpilor, spectrometriei de masă sau a altor metode cunoscute în domeniu poate informa anatomopatologul că proba de ţesut este malignă sau inflamată sau, în general, patologică sau poate fi utilizată ca biomarker pentru CRC. Prezenţa grupurilor de peptide poate permite clasificarea sau subclasificarea ţesuturilor bolnave.

Detectarea peptidelor în proba de ţesut patologic poate permite decizia referitoare la beneficiile terapiilor care implică sistemul imun, în special dacă limfocitele T sunt cunoscute sau prezumate ca implicate în mecanismul de acţiune. Pierderea expresiei MHC este un mecanism bine descris prin care celulele infectate sau maligne eludează supravegherea sistemului imun. Astfel, prezenţa de peptide arată că acest mecanism nu este exploatat de celulele analizate.

Peptidele descrise în prezentul document se pot utiliza pentru analizarea răspunsului limfocitar contra acestor peptide, cum ar fi răspunsul celulelor T sau răspunsul de tip anticorp contra peptidelor sau peptidelor care formează complexe cu moleculele MHC. Aceste răspunsuri limfocitare se pot folosi ca markeri de prognostic pentru decizii asupra următoarelor etape terapeutice. Aceste răspunsuri pot fi folosite şi ca markeri de răspuns surogat în abordări imunoterapeutice care vizează inducerea de răspunsuri limfocitare prin diferite mijloace, de exemplu vaccinare cu proteine, acizi nucleici, materiale autologe, transfer adoptiv de limfocite. În configuraţiile de terapie genică, răspunsurile limfocitare contra peptidelor se pot considera şi în evaluarea efectelor secundare. Urmărirea răspunsurilor limfocitare poate fi un instrument valoros pentru examinările de control în cazul terapiilor de transplant, de exemplu pentru identificarea bolilor grefă-contra-gazdă şi gazdă-contra-grefă.

FIGURI

Figurile 1-M arată supraprezentarea unor diverse peptide în ţesuturi normale (barele albe) şi în CRC (barele negre). Figura 1A: Simboluri gene: ZNF679, ZNF716, SAPCD2, Peptidă: ALIKQLFEA (SEQ ID NO:: 1), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 6 artere, 3 măduve osoase, 7 creiere, 3 sâni, 1 nerv, 1 ovar, 8 esofage, 2 vezici biliare, 5 inimi, 16 rinichi, 21 ficaţi, 46 plămâni, 3 ganglioni limfatici, 4 probe de leucocite, 3 ovare, 7 pancreasuri, 4 nervi periferici, 1 peritoneu, 1 glandă hipofizară, 2 placente, 3 pleure, 1 prostată, 2 glande salvare, 4 muşchi scheletici, 4 piei, 2 intestine subţiri, 4 spline, 7 stomacuri, 4 testicule, 2 timusuri, 3 glande tiroide, 1 trahee, 1 ureteră, 3 vezici urinare, 2 utere, 2 vene, 13 colonuri, 6 recturi, 24 CRC. Peptida a fost detectată suplimentar pe 9/99 cancere colorectale, 2/28 cancere cerebrale, 4/20 cancere ovariene, 1/45 cancere de stomac, 1/33 cancere de prostată şi 2/15 cancere esofagiene (nereprezentate). Figura 1B: Simboluri gene: BRCA2, Peptidă: KQFEGTVEI (SEQ ID NO: 138), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 6 artere, 3 măduve osoase, 7 creiere, 3 sâni, 1 nerv, 1 ovar, 8 esofage, 2 vezici biliare, 5 inimi, 16 rinichi, 21 ficaţi, 46 plămâni, 3 ganglioni limfatici, 4 probe de leucocite, 3 ovare, 7 pancreasuri, 4 nervi periferici, 1 peritoneu, 1 glandă hipofizară, 2 placente, 3 pleure, 1 prostată, 2 glande salvare, 4 muşchi scheletici, 4 piei, 2 intestine subţiri, 4 spline, 7 stomacuri, 4 testicule, 2 timusuri, 3 glande tiroide, 1 trahee, 1 ureteră, 3 vezici urinare, 2 utere, 2 vene, 13 colonuri, 6 recturi, 24 CRC. Peptida a fost detectată suplimentar pe 1/15 cancere esofagiene, 1/28 cancere cerebrale, 1/45 cancere de stomac şi 3/91 cancere pulmonare (nereprezentate). Figura 1C: Simboluri gene: IL8, Peptidă: KLAVALLAA (SEQ ID NO: 210), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 6 artere, 3 măduve osoase, 7 creiere, 3 sâni, 1 nerv, 1 ovar, 8 esofage, 2 vezici biliare, 5 inimi, 16 rinichi, 21 ficaţi, 46 plămâni, 3 ganglioni limfatici, 4 probe de leucocite, 3 ovare, 7 pancreasuri, 4 nervi periferici, 1 peritoneu, 1 glandă hipofizară, 2 placente, 3 pleure, 1 prostată, 2 glande salvare, 4 muşchi scheletici, 4 piei, 2 intestine subţiri, 4 spline, 7 stomacuri, 4 testicule, 2 timusuri, 3 glande tiroide, 1 trahee, 1 ureteră, 3 vezici urinare, 2 utere, 2 vene, 13 colonuri, 6 recturi, 24 CRC. Peptida a fost detectată suplimentar pe 14/99 cancere pulmonare, 1/18 cancere renale, 2/28 cancere cerebrale, 2/16 cancere hepatice, 1/20 cancere ovariene, 1/45 cancere de stomac şi 3/15 cancere esofagiene (nereprezentate). Figura 1D) Simboluri gene: TMEM222, Peptidă: LLYGKYVSV (SEQ ID NO: 31) Ţesuturi de la stânga la dreapta: 3 linii celulare pancreatice, 3 linii celulare cutanate, 1 linie celulară leucocitară, 0 ţesuturi normale, 28 ţesuturi canceroase (2 cancere cerebrale, 1 cancer de glandă mamară, 1 cancer de colon, 1 cancer esofagian, 2 cancere renale, 1 leucemie, 5 cancere hepatice, 7 cancere pulmonare, 5 cancere ovariene, 1 cancer prostatic, 2 cancere rectale). Panelul de ţesuturi normale testat a fost acelaşi ca în Figura 1A-C. Discrepanţele cu privire la lista tipurilor de tumori între Figura 1D şi Tabelul 2 s-ar putea datora criteriilor de selecţie mai stricte aplicate în Tabelul 2. (Pentru detalii, consultaţi Tabelul 24.) Figura 1D arată toate probele cu prezentare detectabilă a peptidei Y, indiferent de parametrii supraprezentării şi de verificarea tehnică a calităţii probelor. Figura 1E: Simboluri gene: ZNF679, ZNF716, SAPCD2, Peptidă: ALIKQLFEA (SEQ ID NO:: 1), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 7 linii celulare canceroase, 1 cultură de celule canceroase primare, 58 ţesuturi canceroase (5 cancere cerebrale, 1 cancer de glandă mamară, 9 cancere de colon, 1 cancer colorectal, 3 cancere esofagiene, 1 cancer de vezică biliară, 2 cancere leucemice leucocitare, 15 cancere pulmonare, 2 cancere de ganglioni limfatici, 1 cancer de celule mieloide, 5 cancere ovariene, 1 cancere de prostată, 4 cancere rectale, 1 cancer de piele, 2 cancere de stomac, 2 cancere de vezică urinară, 3 cancere uterine). Panelul de ţesuturi normale testat a fost acelaşi ca în Figura 1A-C. Figura 1F: F) Simboluri gene: PLAGL2, Peptidă: FLAELPGSLSL (SEQ ID NO: 6), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 8 linii de celule canceroase, 1 cultură de celule canceroase primare, 2 ţesuturi normale (1 ganglion limfatic, 1 splină), 57 ţesuturi canceroase (1 cancer de măduvă osoasă, 1 cancer de glandă mamară, 1 cancer de cec, 5 cancere de colon, 2 cancere esofagiene, 1 cancer de vezică biliară, 3 cancere leucemice leucocitare, 2 cancere hepatice, 13 cancere pulmonare, 8 cancere de ganglioni limfatici, 1 cancer de celule mieloide, 9 cancere ovariene, 2 cancere rectale, 1 cancer de piele, 1 cancer de stomac, 4 cancere de vezică urinară, 2 cancere uterine). Panelul de ţesuturi normale testat a fost acelaşi ca în Figura 1A-C. Figura 1G: Simboluri gene: CYP2W1, Peptidă: FLDANGHFV (SEQ ID NO: 23), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 cultură de celule canceroase primare, 3 ţesuturi normale (3 placente), 12 ţesuturi canceroase (5 cancere de colon, 1 cancer esofagian, 1 cancer de vezică biliară, 2 cancere de rect, 3 cancere de stomac). Panelul de ţesuturi normale testat a fost acelaşi ca în Figura 1A-C. Figura 1H: \tabSimboluri gene: CYP2W1, Peptidă: GLIDEVMVL (SEQ ID NO: 22), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut normal (1 stomac), 6 ţesuturi canceroase (3 cancere de colon, 1 cancer de vezică biliară, 2 cancere rectale). Panelul de ţesuturi normale testat a fost acelaşi ca în Figura 1A-C. Figura 1I: Simboluri gene: AXIN2, Peptidă: ILDDHLSRV (SEQ ID NO: 9), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 5 ţesuturi canceroase (1 cancer de cec, 1 cancer de colon, 1 cancer pulmonar, 2 cancere de rect). Panelul de ţesuturi normale testat a fost acelaşi ca în Figura 1A-C. Figura 1J: Simboluri gene: RAD54B, Peptidă: KLLAVIHEL (SEQ ID NO: 152), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 3 linii celulare, 2 ţesuturi normale (1 ganglion limfatic, 1 splină), 34 ţesuturi canceroase (1 cancer de glandă mamară, 7 cancere de colon, 1 cancer de esofag, 1 cancer de vezică biliară, 1 cancer renal, 8 cancere pulmonare, 4 cancere de ganglioni limfatici, 1 cancer de celule mieloide, 4 cancere ovariene, 1 cancer pancreatic, 1 cancer de rect, 3 cancere de piele, 1 cancer de vezică urinară). Panelul de ţesuturi normale testat a fost acelaşi ca în Figura 1A-C. Figura 1K: Simboluri gene: ECT2, Peptidă: SLVQRVETI (SEQ ID NO: 142), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 5 linii celulare, 1 cultură primară, 47 ţesuturi canceroase (2 cancere de cale biliară, 2 cancere de glandă mamară, 1 cancer de cec, 7 cancere de colon, 3 cancere esofagiene, 3 cancere de vezică biliară, 1 cancer renal, 2 cancere hepatice, 10 cancere pulmonare, 2 cancere de ganglioni limfatici, 4 cancere ovariene, 1 cancer de pancreas, 2 cancere de rect, 2 cancere de piele, 1 cancer de stomac, 2 cancere de vezică urinară, 2 cancere uterine). Panelul de ţesuturi normale testat a fost acelaşi ca în Figura 1A-C. Figura 1L: Simboluri gene: MMP12, Peptidă: KIQEMQHFL (SEQ ID NO: 192), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 cultură primară, 44 ţesuturi canceroase (5 cancere de colon, 1 cancer esofagian, 1 cancer de vezică biliară, 1 cancer de cap şi gât, 30 cancere pulmonare, 1 cancer de ganglioni limfatici, 1 cancer rectal, 1 cancer de stomac, 1 cancer testicular, 1 cancer de vezică urinară, 1 cancer uterin). Panelul de ţesuturi normale testat a fost acelaşi ca în Figura 1A-C. Figura 1M: Simboluri gene: COL6A3, Peptidă: FLLDGSANV (SEQ ID NO: 212), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 3 linii celulare, 2 ţesuturi normale (1 placentă, 1 splină), 146 ţesuturi canceroase (4 cancere de cale biliară, 13 cancere de glandă mamară, 1 cancer de cec, 8 cancere de colon, 1 cancer colorectal, 6 cancere esofagiene, 5 cancere de vezică biliară, 5 cancere de cap şi gât, 2 cancere renale, 1 cancer hepatic, 62 cancere pulmonare, 2 cancere de ganglioni limfatici, 9 cancere ovariene, 7 cancere de pancreas, 3 cancere de rect, 4 cancere de piele, 5 cancere de stomac, 5 cancere de vezică urinară, 3 cancere uterine) . Panelul de ţesuturi normale testat a fost acelaşi ca în Figura 1A-C.

Figurile 2A-C arată exemple de profiluri de exprimare (exprimare relativă comparativ cu colon şi rect normale) ale genelor-sursă din prezenta invenţie care sunt foarte supraexprimate sau exprimate exclusiv în CRC într-un panel de ţesuturi normale (bare albe) şi 10 probe de CRC (bare negre). Ţesuturi de la stânga la dreapta: glandă suprarenală, arteră, măduvă osoasă, creier (întreg), sân, colon, esofag, inimă, rinichi (triplicat), leucocite, ficat, plămâni, ganglion limfatic, ovar, pancreas, placentă, prostată, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, testicul, timus, glandă tiroidă, vezică urinară, col uterin, uter, venă, 3 probe de colon normal, 10 probe de CRC. Figura 2A, CCNB1; Figura 2B, CDK1; Figura 2C, CHMP5. Figura 2D arată exemple de profiluri de exprimare (exprimare relativă comparativ cu colon şi rect normale) ale genelor-sursă din prezenta invenţie care sunt foarte supraexprimate sau exprimate exclusiv în CRC într-un panel de ţesuturi normale (bare albe) şi 20 probe de CRC (bare negre). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 6 artere, 2 celule sanguine, 2 creiere, 1 inimă, 2 ficaţi, 3 plămâni, 2 vene, 1 ţesut adipos, 1 glandă suprarenală, 5 măduve osoase, 1 cartilaj, 1 colon, 1 esofag, 2 ochi, 2 vezici biliare, 2 glande salivare, 1 rinichi, 6 ganglioni limfatici, 4 pancreasuri, 2 nervi periferici, 2 glande pituitare, 1 rect, 2 muşchi scheletici, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 glandă tiroidă, 7 trahei, 1 vezică urinară, 1 sân, 5 ovare, 5 placente, 1 prostată, 1 testicul, 1 timus, 1 uter, 20 probe de CRC. Figura 2D: ECT2.

Figura 3 arată exemple de date de imunogenitate: rezultate ale citometriei în flux după colorarea multimerică specifică peptidelor.

Figurile 4A-C arată exemple de rezultate ale răspunsurilor celulelor T CD8+ specifice peptidelor in vitro ale unui donator de HLA-A*02+ sănătos. Celulele T CD8+ au fost amorsate folosindu-se APC-uri artificiale acoperite cu mAb anti-CD28 şi HLA-A*02 în complex cu peptida SEQ ID NO: 22 (A, panoul din stânga), peptida SEQ ID NO: 9 (B, panoul din stânga) sau, respectiv, peptida SEQ ID NO: 142 (C, panoul din stânga). După trei cicluri de stimulare, detectarea celulelor reactive la peptide s-a efectuat prin colorare multimerică 2D cu A*02/ SEQ ID NO: 22 (A) A*02/SEQ ID NO: 9 (B) sau A*02/SEQ ID NO: 142 (C). Panourile din stânga (A, B şi C) arată colorarea de control a celulelor stimulate cu complexe A*02/peptidice irelevante. Celulele singlet viabile au fost selectate prin gating pentru limfocite CD8+. Porţile booleene au ajutat la excluderea evenimentelor fals pozitive detectate cu multimeri specifici pentru diferite peptide. Sunt indicate frecvenţele celulelor multimer+ specifice între limfocitele CD8+.

EXEMPLE

EXEMPLUL 1

Identificarea şi cuantificarea peptidelor asociate tumorii prezentate pe suprafaţa celulară

Probe de ţesut

Ţesuturile tumorale de la pacienţi au fost obţinute de la Spitalul Universitar din Tübingen.

Ţesuturile normale au fost obţinute de la Asterand, Detroit, SUA şi Royston, Herts, Regatul Unit; Bio-Options Inc., CA, SUA; BioServe, Beltsville, MD, SUA; Capital BioScience Inc., Rockville, MD, SUA; Geneticist Inc., Glendale, CA, SUA; Tissue Solutions Ltd, Glasgow, Scotland, Regatul Unit; Spitalul Universitar din Geneva; Spitalul Universitar din Heidelberg; Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto (KPUM); Spitalul Universitar din Munchen; ProteoGenex Inc., Culver City, CA, SUA; Spitalul Universitar din Tubingen. Consimţămintele informate scrise ale pacienţilor au fost obţinute înainte de intervenţiile chirurgicale sau autopsii. Ţesuturile au fost congelate rapid imediat după excizare şi stocate până la izolarea TUMAP la -70°C sau temperaturi mai joase.

Izolarea peptidelor HLA din probe de ţesut

Seturile de peptide HLA din probe de ţesut îngheţate prin şoc au fost obţinute prin precipitare imună din ţesuturi solide conform unui protocol uşor modificat (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) folosindu-se anticorpul HLA-A*02-specific BB7.2, anticorpul HLA-A, -B, -C-specific W6/32, sefaroză CNBr-activată, tratament cu acid şi ultrafiltrare.

Analize prin spectrometrie de masă

Seturile de peptide HLA obţinute au fost separate în funcţie de hidrofobie prin cromatografie în fază inversă (sistem nanoAcquity UPLC, Waters), iar peptidele eluate au fost analizate în spectrometre de masă hibride LTQ-velos şi cu fuziune (ThermoElectron) echipate cu o sursă ESI. Seturile de peptide au fost încărcate direct în coloana de analiză microcapilară cu siliciu infuzat (75 µm i.d. x 250 mm) prevăzută cu material în fază inversă C18, de 1,7 µm (Waters) cu aplicarea unui debit de 400 nl pe minut. Apoi, peptidele au fost separate cu ajutorul unui gradient binar de 180 minute în două trepte, de la 10% la 33% B la un debit de 300 nl pe minut. Gradientul a fost compus din solvent A (0,1% acid formic în apă) şi solvent B (0,1% acid formic în acetonitril). Un capilar din sticlă aurită (PicoTip, New Objective) a fost utilizat pentru introducerea în sursa nanoESI. Spectrometrele de masă LTQ-Orbitrap au fost operate în modul dependent de date folosindu-se o strategie TOP5. Pe scurt, un ciclu de scanare a fost iniţiat cu o scanare completă de mare precizie masică în orbitrap (R = 30.000), urmată de scanări MS/MS tot în orbitrap (R = 7500) pe cele mai abundenţi 5 ioni precursori cu excluderea dinamică a ionilor selectaţi anterior. Spectrul de masă tandem a fost interpretat de SEQUEST şi alte controale manuale. Secvenţa peptidică identificată a fost asigurată pin compararea modelului de fragmentare a peptidei naturale generat cu modelul de fragmentare a peptidei sintetice de referinţă, cu secvenţă identică.

Cuantificarea LC-MS relativă fără etichete a fost efectuată prin numărarea ionilor, adică prin extracţie şi analiză a caracteristicilor LC-MS (Mueller et al., 2007). Metoda presupune că zona de semnal LC-MS a peptidei se corelează cu abundenţa sa în probă. Caracteristicile extrase au fost prelucrate APOI prin deconvoluţia de stare a încărcării şi alinierea timpului de retenţie (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). În final, toate caracteristicile LC-MS au fost referenţiate încrucişat cu rezultatele identificării secvenţei pentru a combina datele cantitative ale diferitelor probe şi ţesuturi cu profilurile de prezentare ale peptidelor. Datele cantitative au fost normalizate pe două niveluri în funcţie de tendinţa centrală pentru a ţine cont de variaţiile în cadrul replicilor tehnice şi biologice. Astfel, fiecare peptidă identificată poate fi asociată cu date cantitative care permit cuantificarea relativă între probe şi ţesuturi. În plus, toate datele cantitative obţinute pentru candidaţii peptidici au fost inspectate manual pentru a se asigura consecvenţa datelor şi a se verifica acurateţea analizei automate. Pentru fiecare peptidă a fost calculat un profil de prezentare care arată prezentarea medie a probei, precum şi variaţiile replicilor. Profilurile juxtapun probe de CRC cu o referinţă de probe de ţesut normal. Profilurile de prezentare ale peptidelor exemplificate supraprezentate sunt prezentate în Figura 1. Scorurile de prezentare pentru peptida din invenţie sunt prezentate în Tabelul 5.

Tabelul 5: Scoruri de prezentare. Tabelul prezintă peptida care este extrem de supraprezentată pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+++), foarte supraprezentate pe tumori în comparaţie cu un panou de ţesuturi normale (++) sau supraprezentate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+).

SEQ ID NO: Secvenţă Prezentare a peptidei 22 GLIDEVMVL +++

EXEMPLUL 2

Profilarea exprimării genelor care codifică peptidele din invenţie

Supraprezentarea sau prezentarea specifică a unei peptide pe celule tumorale în comparaţie cu celule normale este suficientă pentru utilitatea sa în imunoterapie, iar unele peptide sunt specifice tumorii în pofida proteinei-sursă care apare şi în ţesuturile normale. Totuşi, profilarea exprimării ARNm adaugă un nivel suplimentar de siguranţă în selectarea ţintelor peptidice pentru imunoterapii. În special pentru opţiunile terapeutice cu riscuri mari de siguranţă, cum ar fi TCR-urile maturizate în funcţie de afinitate, peptida-ţintă ideală va fi derivată dintr-o proteină care este unică pentru tumoare şi care nu se găseşte pe ţesuturi normale.

Surse de ARN şi pregătirea acestora

Eşantioanele de ţesut prelevate chirurgical au fost furnizate aşa cum este indicat mai sus (a se vedea Exemplul 1) după obţinerea consimţământului informat scris de la fiecare pacient. Probele de ţesut tumoral au fost îngheţate instantaneu imediat după intervenţia chirurgicală şi au fost ulterior omogenizate cu mojar şi pistil sub azot lichid. ARN-ul total a fost preparat din aceste probe, utilizându-se reactiv TRI (Ambion, Darmstadt, Germania), urmat de o curăţare cu RNeasy (QIAGEN, Hilden, Germania); ambele metode au fost executate conform protocolului producătorului.

ARN-ul total din ţesuturi umane sănătoase a fost obţinut comercial (Ambion, Huntingdon, Regatul Unit; Clontech, Heidelberg, Germania; Stratagene, Amsterdam, Ţările de Jos; BioChain, Hayward, CA, SUA). ARN-ul de la mai mulţi indivizi (între 2 şi 123 indivizi) a fost combinat astfel încât ARN-ul fiecărui individ să fie ponderat în mod egal.

Calitatea şi cantitatea tuturor probelor de ARN au fost evaluate printr-un bioanalizor Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Germania) cu trusă RNA 6000 Pico LabChip (Agilent).

Experimente în micromatrice

Analiza expresiei genomului tuturor probelor de ARN din ţesut tumoral şi normal a fost efectuată cu micromatrice de oligonucleotide Affymetrix Human Genome (HG) U133A sau HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, SUA). Toate etapele au fost urmate în conformitate cu manualul Affymetrix. Pe scurt, ADNc cu dublu-helix a fost sintetizat din 5-8 µg ARN total, folosindu-se SuperScript RTII (Invitrogen) şi primerul oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Germania) conform descoperirii din manual. Transcrierea in vitro a fost efectuată cu o trusă BioArray High Yield RNA Transcript Labelling (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, SUA) pentru matricele U133A sau cu o trusă GeneChip IVT Labelling (Affymetrix) pentru matricele U133 Plus 2.0, urmată de fragmentarea ARNc, hibridizare şi colorare cu streptavidină-ficoeritrină şi anticorp anti-streptavidină biotinilat (Molecular Probes, Leiden, Ţările de Jos). Imaginile au fost scanate cu Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) sau cu Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), iar datele au fost analizate cu software-ul GCOS (Affymetrix), folosindu-se setările implicite pentru toţi parametrii. Pentru normalizare au fost folosite 100 gene auxiliare furnizate de Affymetrix. Valorile exprimărilor relative au fost calculate pe baza rapoartelor jurnalelor de semnal furnizate de software, iar proba de rinichi normal a fost stabilită arbitrar la 1,0. Exemplele de profiluri de exprimare ale genelor-sursă din prezenta invenţie care sunt puternic supraexprimate sau exprimate exclusiv în CRC sunt prezentate în Figura 2. Scorurile de exprimare pentru alte exemple de gene sunt prezentate în Tabelul 6.

Tabelul 6: Scoruri de exprimare. Tabelul enumeră peptide din gene necorelate cu invenţia care sunt extrem de supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+++), foarte supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panou de ţesuturi normale (++) sau supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+).

SEQ ID NO: Nume genă Secvenţă Exprimare genă 2 ATP10B ALLPRYFFL +++ 5 SLC12A1,SLC12A2,SLC12A3 WLFDDGGLTL +++ 6 PLAGL2 FLAELPGSLSL +++ 7 MUC2 YLTRHLAVL + 8 HSPD1 ALMLQGVDLL + 13 SMC2 FLLAEDTKV +++ 16 KLK10 VLVDQSWVL + 17 SLC12A2 ALAAARVEL +++ 19 MYO10 RLYTKLLNEA +++ 27 CHMP5 LLADEDSSYL ++ 29 AP3D1 QMLDVAIRV + 35 OLFM4 KLLDLTVRI + 36 LARP4B GLLESPSIFNFTA + 39 CDX2 GLNGGSPAAA ++ 40 SERPINB5 ALSNVIHKV + 41 HEPH ILDDSFKLL ++ 42 HEPH SILDDSFKL ++ 46 PKP3 GLDDRYSLV + 47 ERBB3 KLYERCEVV + 53 TBC1D8B FLLGSEIKL + 55 PMS1 QIITSVVSV ++ 57 PKP2 NLLEKENYL ++ 60 AGTPBP1 VLDEDEPRFL + 63 HEATR2 KLFSILSTV ++ 64 SOX8,SOX9,SOX10 KTLGKLWRL ++ 67 SMARCA4 SLNDLEKDVMLL ++ 68 PTPRO SILQFVHMV + 73 APIP YLFDIAVSM + 74 ARHGAP8,PRR5-ARHGAP8,PRR5 YLMGFLHAV + 75 CFTR EMIENIQSV +++ 77 DDX5 SLLKRDFGA + 79 SRSF11 SLAADQLLKL ++ 81 TGIF1 ALLSQQTHL + 84 DSP SMVEDITGLRL + 86 MUC13 KVFPGKISV +++ 89 ITGA6 SLIEYEFRV ++ 90 EBNA1BP2 GLLKPGLNVVL ++ 92 PARN WIDDTSAFV + 98 ATP13A3 AMNGKSFSV +++ 104 MUC2 ILLTIKDDTIYL + 112 GALNT7 KLGQVLIYL ++ 113 KCNN4 ILYDLQQNL + 123 RRM1 KTLERSYLL +++ 124 AURKB RVLPPSALQSV ++ 126 CCNB1,CCNB2 TLAKYLMEL +++ 129 CNOT1 VLIDVLKEL + 130 PRRC2C GLGGSQLIDTHL ++ 132 NOL11 ALLNAILHSA ++ 134 EIF2S3,LOC255308 GVAGGSILKGV + 135 CENPE KLQEEIPVL + 138 BRCA2 KQFEGTVEI ++ 139 NCAPG VLLNEILEQV +++ 140 NCAPG LLNEILEQV +++ 142 ECT2 SLVQRVETI ++ 144 ZSWIM1 LLNDRIWLA ++ 147 KDM5C TLTELRAFL + 148 PDXDC1 RLLENMTEVV + 152 RAD54B KLLAVIHEL + 156 TOP2A SLMMTIINL +++ 157 URB1 SLIERDLKL + 160 SYNJ2 KLLEFDQLQL + 161 TRAIP FLKNELDNV + 166 CDC6 GLLEARGILGL + 171 HMGXB4 RLQETEGMVAV + 172 COPG1 LLLDTVTMQV + 180 GPD2 NLLEIAPHL + 183 AGK TLQEVVTGV ++ 184 PRKDC SLLDENNVSSYL + 187 CNOT1 GLHNVVYGI + 188 ZSWIM1 FLVDGPRVQL ++ 190 NCAPD2 AMAEMVLQV + 191 CDK5RAP2 QLFSEIHNL + 192 MMP12 KIQEMQHFL ++ 194 RAD54B SLYKGLLSV + 197 ZNF451 SLFGQDVKAV + 198 CEACAM6 VLYGPDVPTI ++ 202 FANCA GLAALAVHL ++ 204 GOLGA4 KLLDLETERILL + 205 RPGRIP1L RLHDENILL + 206 EFR3A RIAGIRGIQGV + 208 NAA35 RLIDRIKTV + 215 CENPE KLQEKIQEL + 219 MUC2 FLDEKGRCV + 223 CDK1 VLMQDSRLYL +++ 225 TOP2A YLYGQTTTYL +++ 228 HNRNPH1,HNRNPH2 SMSGYDQVL +++ 229 DDX11,DDX12P,LOC642846 YLLEKFVAV + 230 WNT5A AMSSKFFLV + 232 LAMC2 RLLDSVSRL ++ 233 LAMC2 RLDDLKMTV ++ 235 TCF20 LLHEENFSV + 236 CENPF KMSELQTYV ++ 239 KIF15 QLIEKNWLL +++ 240 RCN1 VLAPRVLRA ++ 241 CCNB1 ILIDWLVQV +++ 250 EEF2 ALCEENMRGV + 257 CNOT1 SLADFMQEV +

EXEMPLUL 3

Imunogenitatea in vitro pentru peptide prezentate MHC de clasă I

Pentru a obţine informaţii cu privire la imunogenitatea TUMAP-urilor din prezenta invenţie, inventatorii au efectuat investigaţii utilizând un test in vitro de amorsare a celulelor T pe baza stimulărilor repetate de celule T CD8+ cu celule care prezintă un antigen artificial (aAPC) încărcate cu complexe de peptide/MHC şi anticorp anti-CD28. Astfel, inventatorii au putut arăta imunogenitatea pentru 22 TUMAP-uri restricţionate de HLA-A*0201 conform invenţiei până în prezent, demonstrând că aceste peptide sunt epitopi ai celulelor T împotriva cărora există celule T precursoare CD8+ la oameni (Tabelul 7).

Amorsarea in vitro a celulelor T CD8+

Pentru a efectua stimulări in vitro de către celule prezentatoare de antigen artificiale încărcate cu complex peptidă-MHC (pMHC) şi anticorp anti-CD28, inventatorii au izolat mai întâi celule T CD8+ din produse de leucafereză HLA-A*02 proaspete prin selectare pozitivă utilizând microgranule CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germania) de la donatori sănătoşi, obţinute de la University Clinics Mannheim, Germania, după consimţământ informat.

PBMC-urile şi limfocitele CD8+ izolate au fost incubate până la utilizare în mediu de celule T (TCM) constând din RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Germania) suplimentat cu ser AB uman inactivat la căldură 10% (PAN-Biotech, Aidenbach, 100 U/ml penicilină/100 µg/ml streptomicină (Cambrex, Köln, Germania), 1 mM piruvat de sodiu (CC Pro, Oberdorla, Germania), 20 µg/ml gentamicină (Cambrex). În această etapă s-au adăugat, de asemenea, la TCM 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Germania) şi 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Germania).

Generarea granulelor acoperite cu pMHC/anti-CD28, stimularea celulelor T şi citirea au fost realizate într-un sistem in vitro înalt definit utilizându-se 4 molecule diferite de pMHC pentru fiecare condiţie de stimulare şi 8 molecule diferite de pMHC pentru fiecare condiţie de citire.

Anticorpul purificat costimulator 9.3 anti-uman IG2a CD28 de cobai (Jung et al., 1987) a fost biotinilat chimic folosind sulfo-N-hidroxisuccinimicobiotină în condiţiile recomandate de producător (Perbio, Bonn, Germania). Granulele utilizate au fost de particule de polistiren de 5,6 µm acoperite cu streptavidină (Bangs Laboratories, Illinois, SUA).

pMHC-ul utilizat pentru stimularea controalelor pozitiv şi negativ a fost A*0201/MLA-001 (peptidă ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 266) din Melan-A/MART-1) modificat şi, respectiv, A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI din DDX5, SEQ ID NO: 267).

800.000 de granule/200 µl au fost acoperite în plăci cu 96 de godeuri în prezenţa a 4x12,5 ng de biotină-pMHC diferite, au fost spălate şi apoi s-au adăugat 600 ng de biotină anti-CD28 într-un volum de 200 µl. Stimulările au fost iniţiate în plăci de 96 de godeuri prin coincubare cu 1x106 celule T CD8+ cu 2x105 perle tapetate spălate în 200 µl TCM suplimentat cu 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) pentru 3 zile la 37°C. Jumătate din mediu a fost apoi schimbat cu TCM proaspete suplimentate cu 80 U/ml IL-2, iar incubarea a fost continuată timp de 4 zile la 37°C. Acest ciclu de stimulare s-a efectuat în total de trei ori. Pentru citirea multimerului pMHC folosindu-se 8 molecule pMHC diferite per condiţie, a fost utilizată o abordare de codificare combinatorică bidimensională, aşa cum a fost descris anterior (Andersen et al., 2012), cu modificări minore care cuprind cuplarea la 5 fluorocromi diferiţi. În final, s-au efectuat analize multimerice prin colorarea celulelor cu colorant aproape IR viu/mort (Invitrogen, Karlsruhe, Germania), clonă de anticorp CD1-FITC SK1 (BD, Heidelberg, Germania) şi multimeri fluorescenţi pMHC. Pentru analiză a fost utilizat un citometru BD LSRII SORP echipat cu lasere şi filtre adecvate. Celulele specifice peptidei au fost calculate ca procentaje din totalul celulelor CD8+. Evaluarea analizei multimerice a fost efectuată utilizându-se software-ul FlowJo (Tree Star, Oregon, SUA). Amorsarea in vitro a limfocitelor multimer+ CD8+ specifice a fost detectată prin comparaţie cu stimulări de control negative. Imunogenitatea pentru un antigen dat a fost detectată dacă cel puţin un godeu evaluabil stimulat in vitro al unui donor sănătos a fost găsit conţinând o anumită linie de celule T CD8+ după stimulare in vitro (adică acest godeu conţine cel puţin 1% de multimer+ specific între celulele T CD8+ şi procentajul celulelor tetramer+ este de cel puţin 10 ori mediana stimulărilor negative).

Imunogenitatea in vitro pentru peptide CRC

Pentru peptidele HLA de clasă I testate, imunogenitatea in vitro se poate demonstra prin generarea de linii de celule T specifice peptidelor. Exemple de rezultate ale citometriei în flux după colorarea cu multimer TUMAP-specific pentru 1 peptidă din descoperire sunt prezentate în Figura 3 împreună cu controalele negative corespunzătoare. Rezultatele pentru peptida din invenţie sunt rezumate în Tabelul 7.

Tabelul 7: Date pentru imunogenitatea in vitro a peptidei HLA de clasă I din invenţie.

Rezultatele exemplificative ale experimentelor de imunogenitate in vitro efectuate de către solicitant pentru peptidele restricţionate HLA-A*02 din invenţie. Sunt indicate rezultatele experimentelor de imunogenitate in vitro. Procentajele de godeuri şi donatori pozitivi (printre evaluabili) sunt rezumate după cum este indicat; <20% = +; 20% - 49% = ++; 50% - 69% = +++; >= 70% = ++++

SEQ ID NO: Secvenţă Godeuri pozitive [%] 22 GLIDEVMVL "++"

EXEMPLUL 4

Sinteza peptidelor

Toate peptidele au fost sintetizate utilizându-se sinteza standard şi bine stabilită de peptide în fază solidă utilizându-se strategia Fmoc. Identitatea şi puritatea fiecărei peptide individuale au fost determinate prin spectrometrie de masă şi RP-HPLC analitic. Peptidele au fost obţinute sub formă de liofilizaţi de culoare albă până la albă (sare de trifluoroacetat) cu purităţi >50%. Toate TUMAP-urile se administrează preferabil ca săruri de trifluoroacetat sau de acetat, fiind posibile şi alte săruri.

EXEMPLUL 5

Teste de legare la MHC

Peptidele candidate pentru terapii bazate pe celule T în conformitate cu prezenta invenţie au fost testate în continuare în privinţa capacităţii lor de legare la MHC (afinitate). Complexele peptidă-MHC individuali au fost produse prin schimb UV-ligand, unde o peptidă sensibilă la UV este scindată la iradiere UV şi schimbată cu peptida de interes, aşa cum a fost analizată. Doar candidaţii peptidici care se pot lega şi stabiliza în mod eficient moleculele de MHC receptive la peptide împiedică disocierea complexelor MHC. Pentru a determina randamentul reacţiei de schimb, a fost efectuat un ELISA bazat pe detectarea lanţului uşor (β2m) al complecşilor MHC stabilizaţi. Testul a fost efectuat aşa cum este descris cu caracter general în Rodenko et al. (Rodenko et al., 2006).

Plăci de 96 de godeuri MAXISorp (NUNC) au fost acoperite peste noapte cu 2ug/ml streptavidină în PBS la temperatura camerei, au fost spălate de 4 ori şi au fost blocate pentru 1 oră la 37°C în 2% BSA care conţinea tamponul de blocare. Monomerii HLA-A*02:01/MLA-001 reasamblaţi au servit ca standarde, acoperind domeniul 15-500 ng/ml. Monomerii peptidă-MHC ai reacţiei de schimb UV au fost diluaţi de 100 de ori în tampon de blocare. Probele au fost incubate timp de 1 oră la 37°C, au fost spălate de patru ori, au fost incubate cu 2 µg/ml anti-β2m HRP conjugat timp de 1 oră la 37°C, au fost spălate din nou şi au fost detectate cu soluţia TMB stopată cu NH2SO4. Absorbţia a fost măsurată la 450 nm. Peptidele candidate care prezintă un randament de schimb mare (preferabil mai mare de 50%, cele mai preferabil mai mare de 75 %) sunt, în general, preferate pentru o generare şi producţie de anticorpi sau fragmente ale acestora şi/sau receptori de celule T sau fragmente ale acestora, deoarece arată suficientă aviditate la molecule de MHC şi împiedică disocierea complecşilor MHC.

Tabelul 8: Scor de legare MHC clasă I. Legarea peptidei restricţionate HLA de clasă I la HLA-A*02:01 fost clasificată prin randamentul schimbului peptidic: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++; J = fosfoserină

SEQ ID NO: Secvenţă Schimb de peptide 22 GLIDEVMVL "+++"

EXEMPLUL 6

Cuantificarea absolută a peptidelor asociate tumorii prezentate pe suprafaţa celulară

Generarea de lianţi, cum ar fi anticorpi şi/sau TCR-uri, este un proces laborios, care poate fi realizat numai pentru o serie de ţinte selectate. În cazul peptidelor asociate tumorii şi specifice tumorii, criteriile de selecţie includ, dar nu sunt limitate la exclusivitatea prezentării şi la densitatea peptidei prezentate pe suprafaţa celulei. În plus faţă de izolarea şi cuantificarea relativă a peptidelor aşa cum este descris în EXEMPLUL 1, inventatorii au analizat copii absolute de peptide per celulă aşa cum este descris în brevetul x. Cuantificarea copiilor de TUMAP-uri per celulă în probe tumorale solide necesită cuantificarea absolută a TUMAP-urilor izolate, a eficacităţii izolării TUMAP-urilor şi a numărului de celule din proba de ţesut analizată. O imagine de ansamblu asupra abordării noastre experimentale este dată în Figura 4, iar paşii experimentali sunt descrişi mai jos.

Cuantificarea peptidelor prin nanoLC-MS/MS

Pentru o cuantificare precisă a peptidelor prin spectrometrie de masă, a fost generată o curbă de calibrare pentru fiecare peptidă utilizându-se metoda standard internă. Standardul intern este o variantă marcată cu dublu izotop a fiecărei peptide, adică, în sinteza TUMAP-urilor, au fost incluşi doi aminoacizi marcaţi cu izotopi. Aceasta diferă de peptida asociată tumorii doar prin masa sa, însă nu prezintă nicio diferenţă privind alte proprietăţi fizico-chimice (Anderson et al., 2012). Standardul intern a fost îmbogăţit la fiecare probă pentru MS şi toate semnalele MS au fost normalizate la semnalul MS al standardului intern pentru a se nivela variaţiile tehnice potenţiale dintre experimentele cu MS.

Curbele de calibrare au fost preparate în cel puţin trei matrice diferite, adică peptida HLA eluează din probe naturale similare cu probele pentru MS de rutină şi fiecare preparat a fost măsurat rulări de MS duplicate. Pentru evaluare, semnalele SM au fost normalizate la semnalul standardului intern şi o curbă de calibrare a fost calculată prin regresie logistică.

Pentru cuantificarea peptidelor asociate tumorii din probe de ţesut, probele respective au fost, de asemenea, îmbogăţite cu standardul intern; semnalele MS au fost normalizate la standardul intern şi cuantificate utilizându-se curba de calibrare peptidică.

Eficacitatea izolării peptidelor/MHC-urilor

În ceea ce priveşte orice proces de purificare a proteinelor, izolarea proteinelor din probele de ţesut este asociată cu o anumită pierdere a proteinei de interes. Pentru a determina eficienţa izolării TUMAP-urilor, complexele peptidice/MHC au fost generate pentru toate TUMAP-urile selectate pentru cuantificare absolută. Pentru a putea discrimina complexele peptidice/MHC naturale de cele îmbogăţite, s-au utilizat versiuni de TUMAP-uri marcate cu un singur izotop, adică în sinteza TUMAP-urilor a fost inclus un aminoacid marcat izotop. Aceste complexe au fost îmbogăţite în lizate de ţesut proaspăt preparate, adică în cel mai timpuriu punct posibil al procedurii de izolare a TUMAP-urilor, şi apoi au fost capturate precum complexele peptidice/MHC naturale în următoarea purificare de afinitate. Prin urmare, măsurarea recuperării TUMAP-urilor marcate cu un singur izotop permite concluzii cu privire la eficienţa izolării TUMAP-urilor naturale individuale.

Eficienţa izolării a fost analizată pe un număr redus de probe şi a fost comparabilă între aceste probe de ţesut. În schimb, eficienţa izolării diferă între peptidele individuale. Acest lucru sugerează că eficienţa izolării, deşi este determinată doar la un număr limitat de probe de ţesut, poate fi extrapolată la orice alt preparat tisular. Cu toate acestea, este necesar să se analizeze fiecare TUMAP individual, deoarece eficienţa izolării nu poate fi extrapolată de la o peptidă la altele.

Determinarea numărului de celule în ţesut solid, congelat

Pentru a determina numărul de celule din probele de ţesut supuse cuantificării peptidice absolute, inventatorii au aplicat analiza conţinutului de ADN. Această metodă este aplicabilă unei mari varietăţi de probe de origine diferită şi, cel mai important, probelor congelate (Alcoser et al., 2011; Forsey şi Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). În timpul protocolului de izolare peptidică, o probă de ţesut este prelucrat la un lizat omogen, din care se prelevează o parte alicotă mică de lizat. Partea alicotă este împărţită în trei părţi, din care se izolează ADN-ul (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germania). Conţinutul total de ADN de la fiecare izolare de ADN este cuantificat utilizându-se un test de cuantificare a ADN-ului bazat pe fluorescenţă (Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, Germania) în cel puţin două replicări.

Pentru a calcula numărul de celule, a fost generată o curbă ADN standard din părţile alicote de celulelor sanguine sănătoase singulare, cu un interval de numere de celule definit. Curba standard este utilizată pentru a calcula conţinutul total de celule din conţinutul total de ADN de la fiecare izolare de ADN. Numărul mediu total de celule din proba de ţesut utilizată pentru izolarea peptidelor este extrapolat luându-se în considerare volumul cunoscut al părţilor alicote de lizat şi volumul total de lizat.

Copii de peptide per celulă

Cu datele din experimentele menţionate mai sus, inventatorii au calculat numărul de copii de TUMAP-uri per celulă prin împărţirea cantităţii totale de peptide la numărul total de celule din probă, urmată de împărţirea la eficienţa izolării. Numerele de copii celulare pentru peptidă sunt arătate în Tabelul 9

Tabelul 9: Numere absolute de copii. Tabelul prezintă rezultatele cuantificării peptidice absolute la probe tumorale de NSCLC. Numărul median de copii per celulă este indicat pentru fiecare peptidă: <100 = +; >=100 = ++; >=1.000 +++; >=10.000 = ++++. Este indicat numărul de probe în care sunt disponibile date de MS evaluabile de înaltă calitate.

SEQ ID NO: Cod peptidă Copii per celulă (valoare mediană) Număr de probe 22 CYP2W1-001 ++ 23

Listă de referinţă

[000304]

Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902

Appay, V. et al., Eur.J Immunol. 36 (2006): 1805-1814

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995): 289-300

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol. 5 (2004): 29-43

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357

Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol. 65 (2004): 1211-1223

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114

Coligan JE et al., (1995)

Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170

Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814

Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103

Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867

Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911

Green MR et al., 4th, (2012)

Greenfield EA, 2nd, (2014)

Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615

Kibbe AH, rd, (2000)

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759

Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795

Lundblad RL, 3rd, (2004)

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027

Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443

Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61

Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480

Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638

Pinheiro J et al., (2015)

Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787

Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Rodenko, B. et al., Nat Protoc. 1 (2006): 1120-1132

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Sherman F et al., (1986)

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 187-195

Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094

Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics. 9 (2008): 163

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci. 62 (2005): 1755-1762

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261

Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423

Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577

Albrecht, M. et al., FEBS Lett. 569 (2004): 18-26

Albulescu, R., Biomark.Med. 7 (2013): 203

Aschauer, H. et al., Wien.Klin.Wochenschr. 95 (1983): 785-788

Aung, P. P. et al., Oncogene 25 (2006): 2546-2557

Backen, A. C. et al., Br.J Cancer 96 (2007): 1544-1548

Bai, J. et al., PLoS.One. 8 (2013b): e59772

Bailey, C. M. et al., J Cell Physiol 209 (2006): 617-624

Baris, O. et al., J Clin Endocrinol.Metab 89 (2004): 994-1005

Becker, T. M. et al., Mol.Cancer 8 (2009): 4

Bie, L. et al., PLoS.One. 6 (2011): e25631

Bilbao-Aldaiturriaga, N. et al., Pediatr.Blood Cancer 62 (2015): 766-769

Boland, A. et al., Nat Struct.Mol.Biol 20 (2013): 1289-1297

Bulk, E. et al., Int.J Cancer 137 (2015): 1306-1317

Cao, R. et al., Br.J Cancer 111 (2014): 539-550

Carvalho, L. et al., Rev Port.Pneumol. 15 (2009): 683-696

Chang, H. Y. et al., PLoS.One. 8 (2013): e54117

Chen, C. H. et al., Oncotarget. 5 (2014a): 6300-6311

Chen, Y. D. et al., Zhonghua Lao.Dong.Wei Sheng Zhi.Ye.Bing.Za Zhi. 30 (2012): 725-729

Chou, C. C. et al., Expert.Rev Mol.Diagn. 8 (2008): 179-187

Chung, F. Y. et al., J Surg.Oncol 102 (2010): 148-153

Cohen, Y. et al., Hematology. 19 (2014): 286-292

Cole, C. L. et al., J Biol Chem 289 (2014): 10488-10501

Courson, D. S. et al., Exp.Cell Res 334 (2015): 10-15

Di, Maro G. et al., J Clin Endocrinol.Metab 99 (2014): E1617-E1626

Ding, K. et al., Med.Hypotheses 83 (2014): 359-364

Doherty, J. A. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 20 (2011): 1873-1882

Duursma, A. et al., Mol.Cell Biol 25 (2005): 6937-6947

Egloff, A. M. et al., Cancer Res 66 (2006): 6-9

Fan, C. G. et al., Oncol Rep. 26 (2011): 1281-1286

Fang, Y. et al., Cancer Biol Ther. 15 (2014): 1268-1279

Fang, Z. et al., J Biol Chem 288 (2013): 7918-7929

Fang, Z. Q. et al., Genet.Mol Res 12 (2013): 1479-1489

Feng, B. et al., J Gastroenterol.Hepatol. 21 (2006): 1596-1603

Ferreras, C. et al., J Biol Chem 287 (2012): 36132-36146

Fields, A. P. et al., Adv.Enzyme Regul. 50 (2010): 190-200

Flanagan, J. M. et al., Mol.Cancer Ther. 8 (2009): 249-260

Freed, E. F. et al., PLoS.Genet. 8 (2012): e1002892

Goldenson, B. et al., Oncogene 34 (2015): 537-545

Gomez, A. et al., Mol.Pharmacol. 78 (2010): 1004-1011

Griffin, J. N. et al., PLoS.Genet. 11 (2015): e1005018

Gutierrez-Camino, A. et al., Pediatr.Res 75 (2014): 767-773

Ham, M. F. et al., Cancer Sci. 98 (2007): 1041-1047

Hanks, T. S. et al., Apoptosis. 17 (2012): 236-247

Haren, N. et al., Histol.Histopathol. 25 (2010): 1247-1255

Hatabe, S. et al., Mol.Clin Oncol 1 (2013): 845-850

Hayama, S. et al., Cancer Res 67 (2007): 4113-4122

Hegyi, K. et al., Pathobiology 79 (2012): 314-322

Hill, S. J. et al., Genes Dev. 28 (2014): 1957-1975

Hiramoto, T. et al., Oncogene 18 (1999): 3422-3426

Hu, J. et al., Pituitary. 10 (2007): 47-52

Hu, S. X. et al., Zhonghua Lao.Dong.Wei Sheng Zhi.Ye.Bing.Za Zhi. 31 (2013): 890-894

Huff, L. P. et al., Genes Cancer 4 (2013): 460-475

Ishikawa, N. et al., Cancer Sci. 97 (2006): 737-745

Ito, K. et al., Protein Cell 2 (2011): 755-763

Jager, D. et al., Cancer Res 60 (2000): 3584-3591

Januchowski, R. et al., Biomed.Res Int 2014 (2014): 365867

Jin, Y. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 8724-8731

Jordheim, L. P. et al., Biomark.Med. 7 (2013): 663-671

Jordheim, L. P. et al., Lancet Oncol 12 (2011): 693-702

Ju, W. et al., Oncol.Res. 18 (2009): 47-56

Kanda, A. et al., Oncogene 24 (2005): 7266-7272

Kaplun, A. et al., Crit Rev Eukaryot.Gene Expr. 22 (2012): 249-258

Karlgren, M. et al., Expert.Opin.Ther.Targets. 11 (2007): 61-67

Kas, K. et al., J Biol Chem 273 (1998): 23026-23032

Kaur, S. et al., BMC.Cell Biol 9 (2008): 61

Kim, D. H., Yonsei Med.J 48 (2007): 694-700

Kim, D. S. et al., J Proteome.Res 9 (2010a): 3710-3719

Kim, J. E. et al., J Cancer Res Clin Oncol 136 (2010b): 47-53

Kounelakis, M. G. et al., IEEE J Biomed.Health Inform. 17 (2013): 128-135

Lages, E. et al., PLoS.One. 6 (2011): e20600

Lallet-Daher, H. et al., Oncogene 28 (2009): 1792-1806

Landrette, S. F. et al., Blood 105 (2005): 2900-2907

Langnaese, K. et al., Cytogenet.Cell Genet. 94 (2001): 233-240

Lee, Y. C. et al., Int.J Cancer 122 (2008b): 1630-1638

Li, B. et al., Cancer Res 61 (2001): 8014-8021

Li, G. H. et al., Bioinformatics. 30 (2014): 748-752

Li, J. F. et al., Zhonghua Wei Chang Wai Ke.Za Zhi. 15 (2012): 388-391

Li, Y. et al., PLoS.One. 8 (2013): e84489

Liu, B. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014a): 3089-3100

Liu, L. et al., Retrovirology. 8 (2011a): 94

Liu, X. et al., Eur.J Cancer 50 (2014b): 2251-2262

Liu, Y. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 18 (2009): 204-214

Liu, Y. et al., J Cancer 6 (2015b): 643-651

Lonardo, F. et al., Curr.Pharm.Des 16 (2010): 1877-1881

Lu, X. et al., Mol.Cancer Ther. 3 (2004): 861-872

Maass, N. et al., Acta Oncol 39 (2000): 931-934

Marchi, S. et al., Cell Death.Dis. 3 (2012): e304

Marioni, G. et al., Acta Otolaryngol. 129 (2009): 476-480

Marnef, A. et al., Int.J Biochem.Cell Biol 41 (2009): 977-981

Martin, L. et al., Oncogene 31 (2012): 4076-4084

Mason, J. M. et al., Nucleic Acids Res. 43 (2015): 3180-3196

Matsuda, R. et al., Br.J Cancer 104 (2011): 376-386

Medina, P. P. et al., Epigenetics. 3 (2008): 64-68

Mound, A. et al., Eur.J Cancer 49 (2013): 3738-3751

Naidu, S. R. et al., Oncogene 28 (2009): 2492-2501

Ng, Y. et al., J Biol Chem 279 (2004): 34156-34164

Nibbe, R. K. et al., Mol Cell Proteomics. 8 (2009): 827-845

Nishida, C. R. et al., Mol.Pharmacol. 78 (2010): 497-502

O'Geen, H. et al., PLoS.Genet. 3 (2007): e89

Ota, T. et al., Cancer Res 62 (2002): 5168-5177

Paliouras, M. et al., Tumour.Biol 29 (2008): 63-75

Papageorgio, C. et al., Int.J Oncol. 31 (2007): 1205-1211

Papageorgis, P. et al., Cancer Res 70 (2010): 968-978

Pohl, A. et al., Pharmacogenomics.J 11 (2011): 93-99

Pollari, S. et al., Mol.Cancer Res 10 (2012): 597-604

Qi, F. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015): 1666-1673

RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/

Reisman, D. N. et al., Cancer Res 63 (2003): 560-566

Robles, L. D. et al., J Biol Chem 277 (2002): 25431-25438

Ryu, B. et al., PLoS.One. 2 (2007): e594

Sager, R. et al., Curr.Top.Microbiol.Immunol. 213 ( Pt 1) (1996): 51-64

Sakakura, C. et al., Anticancer Res 23 (2003): 3691-3697

Sakurai, Y. et al., Mol.Pharm. 11 (2014): 2713-2719

Sakurikar, N. et al., J Biol Chem 287 (2012): 39193-39204

Sheng, S., Front Biosci. 9 (2004): 2733-2745

Shibao, K. et al., Cell Calcium 48 (2010): 315-323

Shu, G. S. et al., Cancer Biomark. 11 (2012): 107-114

Stone, B. et al., Gene 267 (2001): 173-182

Strekalova, E. et al., Clin.Cancer Res. (2015)

Stutzer, I. et al., J Biol Chem 288 (2013): 10536-10547

Su, K. C. et al., Dev.Cell 21 (2011): 1104-1115

Sun, Y. et al., Oncotarget. 6 (2015b): 8244-8254

Takashima, S. et al., Tumour.Biol. 35 (2014): 4257-4265

Tatsuka, M. et al., Cancer Res 58 (1998): 4811-4816

Tsui, K. H. et al., Sci.Rep. 5 (2015): 12870

Van Ginkel, P. R. et al., Biochim.Biophys.Acta 1448 (1998): 290-297

Vanaja, D. K. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 1128-1136

Wang, G. et al., Oncogene 35 (2016): 651-661

Wang, G. et al., Tumour.Biol 36 (2015a): 1055-1065

Wang, Q. et al., PLoS.One. 8 (2013d): e70191

Wang, W. et al., Int.J Cancer 124 (2009b): 521-530

Wang, W. X. et al., Sichuan.Da.Xue.Xue.Bao.Yi.Xue.Ban. 40 (2009c): 857-860

Wierinckx, A. et al., Endocr.Relat Cancer 14 (2007): 887-900

Williams, K. A. et al., PLoS.Genet. 10 (2014): e1004809

Wu, M. X., Apoptosis. 8 (2003): 11-18

Wu, M. X. et al., Expert.Opin.Ther.Targets. 17 (2013): 593-606

Wu, S. et al., Cell Cycle 13 (2014a): 2869-2878

Wu, Z. et al., Neoplasia. 11 (2009): 66-76

Xu, F. et al., Biochem.J 416 (2008): 15-26

Yang, J. et al., Surg.Oncol 22 (2013): e53-e57

Yang, L. et al., Cancer Res 71 (2011a): 5558-5568

Yang, L. et al., Future.Oncol 8 (2012): 431-440

Yang, X. et al., Biomed.Pharmacother. 67 (2013): 681-684

Yang, Y. S. et al., Lung Cancer 74 (2011b): 12-24

Yousef, G. M. et al., Tumour.Biol 26 (2005): 227-235

Yu, B. et al., Exp.Cell Res 315 (2009): 3086-3098

Zhang, F. et al., J Viral Hepat. 21 (2014a): 241-250

Zhang, K. et al., Tumour.Biol 35 (2014e): 7669-7673

Zhang, M. et al., Zhong.Nan.Da.Xue.Xue.Bao.Yi.Xue.Ban. 36 (2011a): 274-276

Zhang, Y. et al., Cancer Sci. 101 (2010): 934-940

Zheng, G. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 364 (2007): 344-350

Follenzi A,et al. Nat Genet. 2000 Jun;25(2):217-22.

Zufferey R, et al. J Virol. 1999 Apr;73(4):2886-92.

Scholten KB, et al. Clin Immunol. 2006 May;119(2):135-45.

Gustafsson C, et al. Trends Biotechnol. 2004 Jul;22(7):346-53. Review.

Kuball, J., et al. (2007). Blood 109, 2331-2338.

Schmitt, T. M., et al. (2009). Hum. Gene Ther. 20, 1240-1248

Claims (16)

1. O peptidă constând din secvenţa de aminoacizi conformă cu SEQ ID NO: 22 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia, în care peptida menţionată are abilitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I şi în care peptida menţionată este capabilă să fie recunoscută de celule T CD8.

2. Peptida conformă cu Revendicarea 1, unde respectiva peptidă include legături nepeptidice şi/sau respectiva peptidă face parte dintr-o proteină de fuziune care conţine aminoacizi N-terminali ai lanţului invariabil asociat antigenului HLA-DR (Ii).

3. Un anticorp, solubil sau legat de membrană, care recunoaşte în mod specific peptida conform Revendicării 1 sau peptida conform Revendicării 1 care este legată de o moleculă MHC.

4. Un receptor de celule T (TCR), solubil sau legat de membrană, care este reactiv cu un ligand HLA legat de o moleculă MHC, în care ligandul respectiv constă din secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 22.

5. Un acid nucleic care codifică o peptidă în conformitate cu Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, TCR-ul în conformitate cu Revendicarea 4 sau un vector de exprimare care exprimă acidul nucleic menţionat.

6. O celulă-gazdă recombinantă conţinând peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau Revendicarea 2 ori acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5.

7. Celula-gazdă recombinantă în conformitate cu Revendicarea 6, în care respectiva celulă-gazdă este o celulă prezentatoare de antigen pentru respectivul acid nucleic sau vectorul de exprimare care codifică o peptidă, sau o celulă T sau celulă NK pentru respectivul acid nucleic sau vectorul de exprimare care codifică un TCR.

8. O metodă pentru producerea peptidei în conformitate cu Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, metoda care cuprinde cultivarea unei celule-gazdă în conformitate cu Revendicarea 6 sau Revendicarea 7 care prezintă peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau Revendicarea 2 sau exprimă acidul nucleic ori vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5 şi izolarea respectivei peptide sau a respectivului TCR din celula-gazdă şi/sau mediul său de cultură.

9. O metodă in vitro pentru producerea de limfocite T activate, metoda cuprinzând contactarea in vitro a celulelor T cu molecule de MHC de clasă I umane încărcate cu antigen exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau o construcţie artificială care imită o celulă prezentatoare de antigen pentru o perioadă de timp suficientă pentru a activa numitele celule T într-o manieră specifică antigenului, în care respectivul antigen este o peptidă în conformitate cu Revendicarea 1.

10. O celulă T activată produsă prin metoda în conformitate cu Revendicarea 9 care recunoaşte selectiv o celulă care exprimă aberant o peptidă cuprinzând secvenţa de aminoacizi dată în Revendicarea 1.

11. O compoziţie farmaceutică cuprinzând cel puţin un ingredient activ selectat din grupul constând din peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, anticorpul în conformitate cu Revendicarea 3, TCR-ul în conformitate cu Revendicarea 4, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5, celula-gazdă recombinantă cuprinzând vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6 sau Revendicarea 7, celula T activată în conformitate cu Revendicarea 10 şi un purtător acceptabil farmaceutic.

12. Peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, anticorpul în conformitate cu Revendicarea 3, TCR-ul în conformitate cu Revendicarea 4, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5, celula-gazdă recombinantă cuprinzând vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6 sau Revendicarea 7, celula T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau compoziţia farmaceutică în conformitate cu Revendicarea 11 pentru utilizare în medicină.

13. Peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, anticorpul în conformitate cu Revendicarea 3, TCR-ul în conformitate cu Revendicarea 4, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5, celula-gazdă recombinantă cuprinzând vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6 sau Revendicarea 7, celula T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau compoziţia farmaceutică în conformitate cu Revendicarea 11 pentru utilizare în tratarea cancerului.

14. Peptida, anticorpul, TCR-ul, acidul nucleic sau vectorul de exprimare, celula-gazdă recombinantă, celula T activată sau compoziţia farmaceutică pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 13, în care respectivul cancer este selectat din grupul de cancer pulmonar, cancer cerebral, cancer hepatic, cancer renal, cancer colorectal, cancer hepatic, cancer pancreatic, cancer de prostată, leucemie, cancer de glandă mamară, carcinom cu celule Merkel, melanom, cancer ovarian şi cancer esofagian şi alte tumori care prezintă o supraexprimare a unei proteine din care o peptidă SEQ ID NO: 22 este derivată.

15. O trusă cuprinzând un recipient conţinând o compoziţie farmaceutică cuprinzând cel puţin un ingredient activ selectat din grupul constând din peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, anticorpul în conformitate cu Revendicarea 3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5, celula-gazdă cuprinzând vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6 sau Revendicarea 7 ori celula T activată în conformitate cu Revendicarea 10 în soluţie sau în formă liofilizată.

16. Trusa de la Revendicarea 15 care mai cuprinde un al doilea recipient conţinând un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată.