RS61667B1

RS61667B1 - Novi peptidi i kombinacija peptida i njihovih skela za upotrebu u imunoterapiji protiv kolorektalnog karcinoma (crc) i drugih malignih tumora

Info

Publication number: RS61667B1
Application number: RS20210416A
Authority: RS
Inventors: Andrea Mahr; Toni Weinschenk; Anita Wiebe; Jens Fritsche; Harpreet Singh; Oliver Schoor
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2016-05-04
Publication date: 2021-04-29
Also published as: MA41393A1; US20180251507A1; MA41393B2; DK3291830T3; MX2017014008A; CA2984123A1; US10442844B2; MA42045A; AU2020244419B2; AU2020244419A1; BR112017023362A2; TWI725026B; US20200002395A1; US20180244741A1; US12180256B2; AU2016258965B2; KR20170141214A; CN113527421A; KR102724868B1; ES2860798T3

Description

Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, proteine, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na peptidne epitope tumor-asocirane T ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima koji mogu na primer služiti kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore, ili za stimulaciju T ćelija ex vivo i prenos u pacijente. Peptidi vezani za molekule glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC), ili peptidi kao takvi, mogu takođe biti ciljevi antitela, solubilnih T-ćelijskih receptora i drugih molekula koji imaju sposobnost vezivanja.

Predmetni pronalazak odnosi se na nekoliko novih peptidnih sekvenci i njihove varijante dobijene iz HLA molekula klase I humanih tumorskih ćelija koje mogu da se koriste u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora, ili kao ciljevi za razvoj farmaceutski/imunološki aktivnih jedinjenja i ćelija.

OSNOVNE INFORMACIJE O PRONALASKU

Kolorektalni karcinom (CRC) je treći najčešći oblik raka kod muškaraca i drugi najčešći oblik raka kod žena. Na svetskom nivou, CRC čini približno 10% svih novodijagnostikovanih slučajeva raka. U 2012. godini dijagnostikovano je 1,36 miliona novih slučajeva CRC, i to 746.000 slučajeva kod muškaraca te 614.000 slučajeva kod žena, što daje odnos muškaraca i žena od 1,2:1 (World Cancer Report, 2014). CRC je oboljenje koje pogađa stariju populaciju. Srednja starost u trenutku postavljanja dijagnoze iznosi 68 godina (SEER Stat facts, 2014).

Stopa incidencije varira uz gotovo desetostruke razlike između različitih geografskih regiona, sa sličnom distribucijom između muškaraca i žena. Najveća stopa incidencije kod oba pola beleži se u Australiji/na Novom Zelandu (kod muškaraca stopa standardizovana za starosnu dob (eng. age-standardized rate; ASR) iznosi 45 na 100.000 muškaraca, dok kod žena ova stopa iznosi 32 na 100.000 žena). Stopa incidencije u Evropi pokazuje malu regionalnu varijaciju, uz ASR od 38 na 100.000 muškaraca i ASR od 25 na 100.000 žena. Najniža stopa incidencije na svetu beleži se u zapadnoj Africi, uz stopu od 4,5 na 100.000 muškaraca i stopu od 3,8 na 100.000 žena (World Cancer Report, 2014).

Ukupna stopa petogodišnjeg preživljavanja kod CRC iznosi približno 65%. Međutim, stopa preživljavanja zavisi od stadijuma u trenutku postavljanja dijagnoze. Kod lokalizovanog CRC petogodišnje preživljavanje iznosi 89,8%, kod CRC kod koga se primarni tumor proširio na obližnje limfne čvorove ili organe i tkiva petogodišnje preživljavanje iznosi 70,5%, dok kod CRC sa udaljenim metastazama ono iznosi 12,9%. CRC je četvrti najčešći uzrok smrti usled raka (694.000 smrtnih ishoda; 8,5%) (SEER Stat facts, 2014; World Cancer Report, 2014).

Stadijum CRC se obično utvrđuje primenom TNM sistema, koji uključuje informacije o veličini primarnog tumora (T), zahvaćenosti limfnih čvorova (N) i pojavi udaljenih metastaza (M). Utvrđivanje stadijuma prema Međunarodnom udruženju za borbu protiv raka (Union Internationale Contre le Cancer; UICC) zasniva se na TNM sistemu i uključuje statističke podatke za predviđanje prognoze (Stintzing, 2014).

Najnovija klinička ispitivanja analiziraju aktivnu imunoterapiju kao terapijsku opciju za CRC. Te strategije uključuju vakcinaciju peptidima iz tumor-asociranih antigena (TAA), celim tumorskim ćelijama, putem vakcina zasnovanih na dendritičnim ćelijama (DC) i virusnim vektorima (Koido et al., 2013).

Peptidne vakcine su dosad bile usmerene protiv karcinoembrionskog antigena (CEA), mucina 1, EGFR, skvamocelularnog karcinomskog antigena kojeg prepoznaju T ćelije 3 (SART3), beta-humanog horionskog gonadotropina (beta-hCG), antigena 1 Vilmsovog tumora (WT1), survivina-2B, MAGE3, p53, ring prst proteina 43 i translokaze spoljašnje mitohondrijalne membrane 34 (TOMM34) ili mutiranog KRAS. U nekoliko kliničkih ispitivanja faze I i II pacijenti su pokazali antigen-specifične CTL odgovore ili proizvodnju antitela. Uprkos imunološkom odgovoru, mnogi pacijenti nisu imali korist od peptidnih vakcina na kliničkom nivou (Koido et al., 2013; Miyagi et al., 2001; Moulton et al., 2002; Okuno et al., 2011).

Vakcine zasnovane na dendritičnim ćelijama obuhvataju DC pulsirane sa peptidima izvedenim iz TAA, lizatima tumorskih ćelija, apoptotičnim tumorskim ćelijama ili RNK tumora odnosno proizvode fuzije DC i tumorskih ćelija. Premda su mnogi pacijenti ispoljili specifičan imunološki odgovor u ispitivanjima faze I/II, samo je kod manjine došlo do kliničke koristi (Koido et al., 2013).

Vakcine zasnovane na celim tumorskim ćelijama sastoje se od autolognih tumorskih ćelija modifikovanih da sekretuju GM-CSF, modifikovanih zračenjem ili virusom inficiranih, ozračenih ćelija. Kod većine pacijenata nije došlo do kliničke koristi u nekoliko ispitivanja faze II/III (Koido et al., 2013).

U kliničkim ispitivanjima faze I virus vakcinije ili ptičji poksvirus defektne replikacije koji kodiraju CEA kao i B7.1, ICAM-1 i LFA-3, korišćeni su kao prenosioci molekula u vakcinama zasnovanim na virusnom vektoru. U drugoj studiji korišćen je nereplicirajući kanaripoks virus koji kodira CEA i B7.1. Pored indukcije CEA-specifičnih T-ćelijskih odgovora, 40% pacijenata pokazalo je objektivan klinički odgovor (Horig et al., 2000; Kaufman et al., 2008).

Imajući u vidu teška neželjena dejstva i trošak lečenja raka, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu da se koriste u lečenju raka uopšte i konkretno CRC. Takođe postoji potreba da se identifikuju faktori koji predstavljaju biomarkere za rak uopšte i konkretno za CRC, koji bi doveli do boljeg dijagnostikovanja raka, bolje procene prognoze i predviđanja uspeha lečenja.

Imunoterapija raka predstavlja mogućnost specifičnog ciljanja ćelija raka uz svođenje neželjenih dejstava na minimum. Imunoterapija raka iskorišćava postojanje tumorasociranih antigena.

Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena (TAA) sadrži sledeće velike grupe:

a) Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumor-specifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije i NY-ESO-1.

b) Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao. Većina poznatih antigena diferencijacije nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumor-specifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za rak prostate.

c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.

d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je β-katenin, CDK4, itd). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora. Tumorska specifičnost (ili asociranost) peptida može takođe biti posledica toga što peptid potiče iz tumor- (-asociranog) egzona u slučaju proteina sa tumor-specifičnim (-asociranim) izoformama.

e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumor-specifični.

f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.

Imunoterapija bazirana na T ćelijama cilja peptidne epitope dobijene iz tumor-asociranih ili tumor-specifičnih proteina, koje prezentuju molekuli glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC). Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, obično ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.

Postoje dve klase MHC molekula, MHC klasa I i MHC klasa II. MHC molekuli klase I su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina, MHC molekuli klase II od alfa i beta lanca. Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima.

MHC molekuli klase I se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. Oni prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ova) i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju npr. u toku endocitoze, i nakon toga obrađuju.

Komplekse peptida i MHC klase I prepoznaju CD8-pozitivne T ćelije koje nose odgovarajući T-ćelijski receptor (TCR), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.

CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora (Gnjatic et al., 2003). Na mestu tumora, T pomoćničke ćelije podržavaju citokinski milje koji je povoljan za citotoksične T ćelije (CTL) (Mortara et al., 2006) i privlače efektorske ćelije, npr. CTL, ćelije prirodne ubice (NK), makrofage i granulocite (Hwang et al., 2007).

U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, otkriveno je da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel et al., 2006).

Elongirani (duži) peptidi iz ove objave mogu da deluju kao MHC klasa II aktivni epitopi.

T-pomoćničke ćelije, aktivirane od strane MHC klasa II epitopa, imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1 tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T-pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.

Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CD8-pozitivnih T limfocita, CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferona-gama (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Postoje dokazi da su CD4 T ćelije direktni antitumorski efektori (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na imunske ćelije, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora ranije se nije smatrala mogućom. Međutim, Dengjel i saradnici su uspešno identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1760 088 B1).

Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8+ T ćelija (ligand: MHC molekul klase I peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekul klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.

Da bi peptid MHC klase I pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on takođe mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji vezuju MHC klasa I su obično dužine 8-12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje.

U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da naknadno prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).

Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane T limfocita kao tumor-specifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne ili u uporedivo malim količinama od strane normalnih zdravih tkiva. U poželjnom otelotvorenju, peptid bi trebalo da bude prekomerno prezentovan od strane ćelija tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumor-specifični i tumorasocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog njihove funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektni tumor-asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et al., 2004). Esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, kako bi se osiguralo da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije koja ima odgovarajući TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.

Stoga su TAA početna tačka za razvoj terapije zasnovane na T ćelijama uključujući, bez ograničavanja, tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA obično su zasnovani na upotrebi T ćelija koje mogu biti izolovane iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva. Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna potpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. U veoma poželjnom primeru je zato važno da se odaberu samo oni prekomerno ili selektivno prezentovani peptidi protiv kojih se može naći funkcionalna i/ili proliferišuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).

U slučaju ciljanja kompleksa peptid-MHC pomoću specifičnih TCR-ova (npr. solubilni TCR) i antitela ili drugih vezujućih molekula (skele) ovde predstavljenih, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. U tim slučajevima presudni faktor je prezentacija.

U dokumentu WO 2015/018805 A1 predstavljeni su peptidi koji imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II. WO 2009/015842A2 se odnosi na peptide dobijene iz tumor-asociranih antigena koji su u stanju da se vezuju za MHC komplekse. Publikacija autora Kristina Stenstedt, K., i sar. (Anticancer research [2012] 32(9):3869-74) odnosi se na upotrebu ekspresije enzima citohroma P450 2W1 (CYP2W1) kao prognostičkog markera za karcinom kolona. WO 2004/037282 odnosi se na upotrebu enzima CYP2W1 citohroma P450 i njegovog promotera kao cilja leka kod antitumorske terapije, kao i na metode skrininga radi dobijanja terapeutskih agenasa za antitumorsku terapiju, te na terapeutske agense koji sadrže komponente koje pokazuju afinitet vezivanja za CYP2W1.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

Predmetni pronalazak se odnosi na peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence ID BR. SEKV 22 kako je definisan u priloženom patentnom zahtevu 1. Dalji aspekti pronalaska definisani su u priloženim patentnim zahtevima.

U prvom aspektu predstavljen je peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191 ili njihovu varijantnu sekvencu koja je najmanje 77%, a poželjno najmanje 88%, homologna (poželjno najmanje 77% ili najmanje 88% identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191, naznačeno time što se navedena varijanta vezuje za MHC i/ili indukuje T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što navedeni peptid nije osnovni polipeptid kompletne dužine.

Takođe je predstavljen peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191 ili njihova varijanta, koja je najmanje 77%, a poželjno najmanje 88%, homologna (poželjno najmanje 77% ili najmanje 88% identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191, naznačeno time što navedeni peptid ili njegova varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14 aminokiselina.

U sledećim tabelama prikazan je peptid u skladu sa predmetnom objavom, njegov odgovarajući ID BR. SEKV i prospektivni izvorni (osnovni) gen za ovaj peptid. Peptid u tabeli 1 vezuje se za HLA-A*02. Tabela 2 je pored toga korisna u dijagnostikovanju i/ili lečenju različitih drugih maligniteta koji podrazumevaju prekomernu ekspresiju ili prekomernu prezentaciju dotičnog osnovnog polipeptida.

Tabela 1: Peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom

Dalje i uopšteno su predstavljeni peptidi prema ovoj objavi za upotrebu u lečenju proliferativnih bolesti, kao što su, na primer, rak pluća, rak mozga, rak želuca, rak bubrega, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija (MCC), melanom, rak jajnika i rak jednjaka.

Naročito su poželjni peptidi – samostalni ili u kombinaciji – u skladu sa predmetnom objavom izabrani iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191. Više poželjni su peptidi – samostalni ili u kombinaciji – izabrani iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 68 (videti tabelu 1), kao i njihova upotreba u imunoterapiji za CRC, rak pluća, rak mozga, rak želuca, rak bubrega, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemiju, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jajnika i rak jednjaka, a poželjno za CRC.

Najpoželjniji su peptidi – samostalni ili u kombinaciji – izabrani iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1, 3, 6, 11, 13, 16, 18, 19, 22, 23, 24, 26, 31, 32, 34, 37, 40, 44, 45, 59, 67, 71, 82, 87, 88, 100, 103, 105, 113, 123, 124, 126, 129, 131, 132, 133, 135, 137, 140, 142, 150, 152, 153, te ID BR. SEKV: 166, kao i njihova upotreba u imunoterapji za CRC, rak pluća, rak mozga, rak želuca, rak bubrega, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemiju, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jajnika i rak jednjaka, a poželjno za CRC. Peptid sa ID BR. SEKV.22 naročito je poželjan za ovde dole opisane metode generisanja odgovarajućih T-ćelijskih receptora (TCR).

Kako je prikazano u tabeli 2 u nastavku, peptid u skladu sa predmetnom objavom takođe se nalazi i na drugim vrstama tumora, te se stoga može koristiti i u imunoterapiji kod drugih indikacija. Takođe pogledajte sliku 1D i primer 1.

Tabela 2: Peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom i njegova specifična primena kod ostalih proliferativnih bolesti, posebno drugih malignih oboljenja. U tabeli je prikazan peptid i na kojim dodatnim vrstama tumora je pronađeno da pokazuje prekomernu prezentaciju (uključujući specifičnu prezentaciju) na više od 5% izmerenih uzoraka tumora, ili prezentaciju na više od 5% izmerenih uzoraka tumora pri čemu je odnos geometrijskih srednjih vrednosti tumora u odnosu na normalna tkiva veći od 3. Prekomerna prezentacija se definiše kao viša prezentacija na uzorku tumora u poređenju sa normalnim uzorkom sa najvišom prezentacijom. Normalna tkiva u odnosu na koja je prekomerna prezentacija testirana su bila: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, ćelije krvi, krvni sud, kostna srž, mozak, jednjak, oko, žučna kesa, srce, bubreg, debelo crevo, jetra, pluća, limfni čvor, nerv, pankreas, paraštitasta žlezda, peritoneum, hipofiza, pleura, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, štitasta žlezda, traheja, ureter, mokraćna bešika.

NSCLC = nesitnoćelijski karcinom pluća, SCLC = sitnoćelijski karcinom pluća, RCC = karcinom bubrega, CRC = karcinom kolona ili rektuma, GC = karcinom želuca, HCC = karcinom jetre, PC = karcinom pankreasa, PrC = karcinom prostate, BRCA = karcinom dojke, MCC = karcinom Merkelovih ćelija, OC = karcinom jajnika, NHL = non-Hočkin limfom, AML = akutna mijeloidna leukemija, HLL = hronična limfocitna leukemija.

Tako se drugi aspekt predmetne objave odnosi na upotrebu ovde predstavljenih peptida za – poželjno kombinovano – lečenje proliferativne bolesti odabrane iz grupe koju čine CRC, rak pluća, rak mozga, rak želuca, rak bubrega, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jajnika i rak jednjaka.

Predmetna objava se zatim odnosi na ovde predstavljene peptide koji imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili – u produženom obliku, kao što je varijanta dužine – MHC klase II.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što se navedeni peptidi (svaki) sastoje ili esencijalno sastoje od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što je navedeni peptid modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina, konkretno fuziranog na N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziranog na (ili u sekvencu) antitela, kao, na primer, antitela koje je specifično za dendritične ćelije.

Predmetna objava se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira ovde predstavljene peptide. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetna objava se dalje odnosi na vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira i/ili eksprimira ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni peptid, ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili ovde predstavljeni vektor ekspresije za upotrebu u lečenju bolesti i medicini, konkretno u lečenju raka.

Predmetna objava se dalje odnosi na antitela koja su specifična protiv ovde predstavljenih peptida ili kompleksa navedenih ovde predstavljenih peptida sa MHC i metode za pravljenje istih.

Predmetna objava se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove), konkretno solubilne TCR (sTCR) i klonirane TCR ubačene u autologne ili alogene T ćelije, i metode za pravljenje istih, kao i NK ćelije ili druge ćelije koje nose navedeni TCR ili koje unakrsno reaguju sa navedenim TCR-ovima.

Antitela i TCR-ovi su dodatna otelotvorenja imunoterapijske upotrebe ovde predstavljenih peptida.

Predmetna objava se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili prethodno opisani vektor ekspresije. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu ćeliju domaćina koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetna objava se dalje odnosi na metod proizvodnje ovde predstavljenog peptida, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ovde predstavljene ćelije domaćina i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetna objava se dalje odnosi na navedeni metod u skladu sa predmetnom objavom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigenprezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigenprezentujućom ćelijom.

Predmetna objava se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnom objavom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira ili eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV: 191, poželjno sadrži ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV 68, ili varijantu aminokiselinske sekvence.

Predmetna objava se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću ovde predstavljenog metoda, naznačeno time što navedena T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja eksprimira polipeptid koji sadrži ovde predstavljenu aminokiselinsku sekvencu.

Predmetna objava se dalje odnosi na metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju ovde predstavljenu aminokiselinsku sekvencu, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija proizvedenih prema ovoj objavi.

Predmetna objava se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnom objavom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnom objavom, ćelije u skladu sa predmetnom objavom, aktiviranog T limfocita, T-ćelijskog receptora ili antitela ili drugog peptida – i/ili molekula koji vezuju peptid-MHC u skladu sa predmetnom objavom u vidu leka ili u proizvodnji leka. Poželjno, navedeni lek je aktivan protiv raka.

Poželjno, navedeni lek je ćelijska terapija, vakcina ili protein zasnovan na solubilnom TCR ili antitelu.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačeno time što su navedene ćelije raka ćelije CRC, raka pluća, raka mozga, raka želuca, raka bubrega, raka jetre, raka pankreasa, raka prostate, leukemije, raka dojke, karcinoma Merkelovih ćelija (MCC), melanoma, raka jajnika i raka jednjaka, a poželjno ćelije CRC.

Predmetna objava se dalje odnosi na biomarkere zasnovane na ovde predstavljenim peptidima, u ovom tekstu nazvane „ciljevima“, a koji se mogu koristiti u dijagnostikovanju raka, poželjno CRC. Marker može da bude prekomerna prezentacija samog(ih) peptida odnosno prekomerna ekspresija odgovarajućeg(ih) gena. Markeri se takođe mogu koristiti za predviđanje verovatnoće uspeha terapije, poželjno imunoterapije, te najpoželjnije imunoterapije čiji je cilj isti kao onaj koji se identifikuje biomarkerom. Na primer, antitelo ili rastvorljivi TCR može da se koristi za bojenje isečaka tumora radi detekcije prisustva peptida od interesovanja u kompleksu sa MHC.

Opciono, antitelo nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.

Predmetna objava se takođe odnosi na upotrebu navedenih novih ciljeva u kontekstu lečenja raka.

I terapijske i dijagnostičke primene protiv dodatnih malignih bolesti predstavljene su u sledećem detaljnijem opisu osnovnih proizvoda ekspresije (polipeptida) peptida u skladu sa ovom objavom.

CYP2W1 kodira člana superfamilije enzima citohroma P450 koji su monooksigenaze koje katalizuju brojne reakcije uključene u metabolizam lekova i u sintezu holesterola, steroida i drugih lipida (RefSeq, 2002). CYP2W1 je prekomerno eksprimiran kod niza humanih karcinoma, uključujući hepatocelularni, kolorektalni i karcinom želuca. Prekomerna ekspresija CYP2W1 povezana je sa progresijom tumora i lošijim izgledima za preživljavanje (Aung et al., 2006; Gomez et al., 2010; Zhang et al., 2014e). Zbog tumor-specifične ekspresije, CYP2W1 predstavlja zanimljiv cilj leka ili enzimski aktivator prolekova tokom antitumorske terapije (Karlgren i Ingelman-Sundberg, 2007; Nishida et al., 2010).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T ćelija iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnoj imunskoj odbrani protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

Na način kako su korišćeni u ovom tekstu, i sem ako nije naznačeno drugačije, svi termini su definisani kako je navedeno u nastavku.

Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane citotoksične T ćelije, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferona-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.

Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, kao i dužine 10, 11, 12, 13 ili 14 ili duži, a u slučaju peptida MHC klase II (elongirane varijante peptida iz ove objave) oni mogu biti dužine od 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 ili više aminokiselina.

Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli. Napomenuto je da se soli peptida u skladu sa predmetnom objavom značajno razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi in vivo nisu soli.

Termin „peptid“ će takođe obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.

Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetnog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR-ova protiv njega.

T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.

Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.

Tabela 3: Učestalosti ekspresije F HLA-A*02 i HLA-A*24 i najučestaliji serotipovi HLA-DR. Učestalosti su izvedene iz učestalosti haplotipova Gf unutar američke populacije adaptirane iz rada Mori i sar. (Mori et al., 1997) primenom Hardi-Vajnbergove formule F = 1 – (1-Gf)². Kombinacije A*02 ili A*24 sa određenim HLA-DR alelima mogu biti obogaćene ili manje učestale nego što je očekivano u odnosu na njihove pojedinačne učestalosti usled neravnoteže povezivanja. Za detalje pogledajte rad Chanock i sar. (Chanock et al., 2004).

Peptidi iz ove objave, poželjno kada su uključeni u vakcinu iz ove objave kako je ovde opisana, vezuju se za A*02. Vakcina može takođe da uključuje sve-vezujuće MHC klasa II peptide. Stoga, vakcina iz ove objave može da se koristi za lečenje malignog tumora kod pacijenata koji su A*02 pozitivni, pri čemu nije neophodan nikakav izbor za MHC klasa II alotipove zbog sve-vezujuće prirode ovih peptida.

Ako se A*02 peptidi iz ove objave kombinuju sa peptidima koji se vezuju za drugi alel, na primer A*24, veći procenat bilo koje populacije pacijenata može da se leči u poređenju sa tim kada se cilja bilo koji od ova dva MHC klasa I alela sam. Dok u većini populacija pomoću bilo kog od ova dva alela samog može da se targetira manje od 50% pacijenata, vakcina koja sadrži HLA-A*24 i HLA-A*02 epitope može da leči najmanje 60% pacijenata u bilo kojoj relevantnoj populaciji. Konkretno, sledeći procenti pacijenata će biti pozitivni na najmanje jedan od ovih alela u različitim regionima: SAD 61%, Zapadna Evropa 62%, Kina 75%, Južna Koreja 77%, Japan 86% (izračunato sa www.allelefrequencies.net).

U poželjnom otelotvorenju, termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer dezoksiribonukleotida.

Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine iz ove objave sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za (ili koji kodira) peptid“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu, na primer, dendritičnu ćeliju ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR-ova.

Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na sekvencu nukleinske kiseline obuhvata i jednolančanu i dvolančanu nukleinsku kiselinu. Tako, na primer za DNK, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence.

Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.

Kodirajući region može biti izveden iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak izveden iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.

Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).

Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.

Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.

Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.

Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine, ako se javlja u prirodi). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.

Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnom objavom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, shodno razumevanju tih termina od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito je obuhvaćen.

Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnom objavom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetnu objavu mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku. Termin „aktivni fragment“ označava fragment, obično peptida, polipeptida ili sekvence nukleinske kiseline, koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom ili u vektoru, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.

Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.

U skladu sa predmetnim pronalaskom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa traženom ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili traženom sekvencom („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli:

procenat identičnosti = 100 [1 -(C/R)]

gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što (i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku, i

(iiii) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;

a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.

Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.

Kao što je ranije pomenuto, predmetna objava tako obezbeđuje peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191 ili njihovu varijantu koja je 88% homologna sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191 ili njihovom varijantom koji će indukovati T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom. Peptidi iz ove objave imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I, a elongirane verzije navedenih peptida za klasu II.

U predmetnoj objavi, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke dostupne su u javnim bazama podataka.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

Pod „varijantom“ date aminokiselinske sekvence pronalazači podrazumevaju da bočni lanci, na primer, jednog ili dva aminokiselinska ostatka budu izmenjeni (na primer tako što će biti zamenjeni bočnim lancem drugog aminokiselinskog ostatka koji se prirodno pojavljuje ili nekim drugim bočnim lancem) tako da peptid i dalje bude sposoban da se vezuje za HLA molekul na značajno isti način kao i peptid koji sadrži datu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191. Na primer, peptid može biti modifikovan tako da najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost interakcije sa i vezivanja za udubljenje za vezivanje prikladnog MHC molekula, kao što su HLA-A*02 ili -DR, i na taj način najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T ćelija.

Ove T ćelije mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima ove objave. Kako se može izvesti iz naučne literature i baza podataka (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje. Tako će osoba stručna u predmetnoj oblasti moći da modifikuje aminokiselinske sekvence navedene u ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 191, zadržavanjem poznatih sidrenih ostataka, i biće u stanju da utvrdi da li takve varijante zadržavaju sposobnost vezivanja za MHC molekule klase I ili II. Varijante predmetne objave zadržavaju sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T ćelija, koje naknadno mogu unakrsno reagovati sa i ubiti ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima ove objave.

Originalni (nemodifikovani) peptidi kako su ovde predstavljeni mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, poželjno selektivnim, položajima unutar peptidnog lanca, ako nije navedeno drugačije. Poželjno, te supstitucije nalaze se na kraju aminokiselinskog lanca. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, kada se jedna aminokiselina zamenjuje aminokiselinom slične strukture i sličnih karakteristika, kao kada se hidrofobna aminokiselina zamenjuje drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili slične veličine i hemijske prirode, kao kada se leucin zamenjuje izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u familijama prirodno javljajućih homolognih proteina, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, i one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i kao takve predstavljaju osnovu za definisanje „konzervativnih supstitucija“.

Konzervativne supstitucije su ovde definisane kao zamena u okviru jedne od sledećih pet grupa: Grupa 1 – mali alifatični, nepolarni ili malo polarni ostaci (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupa 2 – polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupa 3 – polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); Grupa 4 – veliki, alifatični, nepolarni ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i Grupa 5 – veliki aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).

Manje konzervativne supstitucije bi mogle da uključuju zamenu jedne aminokiseline drugom koja ima slične karakteristike ali je malo drugačije veličine, kao što je zamena alaninskog ostatka izoleucinskim ostatkom. Veoma nekonzervativne zamene bi mogle da uključuju supstituisanje kisele aminokiseline polarnom, ili čak i aminokiselinom baznog karaktera. Takve „radikalne“ supstitucije ne mogu, ipak, da se odbace kao potencijalno neefikasne jer hemijski efekti nisu potpuno predvidivi a radikalne supstitucije bi mogle da dovedu do srećnih slučajnih otkrića koja inače ne bi mogla da se predvide iz jednostavnih hemijskih principa.

Naravno, takve supstitucije mogu uključivati strukture koje nisu uobičajene L-aminokiseline. Tako, D-aminokiseline bi mogle da supstituišu L-aminokiseline koje se uobičajeno nalaze u antigenim peptidima iz ove objave a da i dalje budu obuhvaćene onim što je ovde objavljeno. Pored toga, nestandardne aminokiseline (tj. koje nisu uobičajene proteinogene aminokiseline koje se javljaju u prirodi) mogu se takođe koristiti u svrhe supstituisanja da bi se proizveli imunogeni i imunogeni polipeptidi u skladu sa predmetnom objavom.

Ako se utvrdi da supstitucije na više od jednog položaja rezultuju peptidom sa značajnom jednakom ili većom antigenom aktivnošću kako je definisano u nastavku, onda će kombinacije tih supstitucija biti testirane kako bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije rezultuju aditivnim ili sinergističkim efektima na antigenost peptida. Najviše, u okviru peptida neće biti istovremeno supstituisano više od četiri položaja.

Peptid koji se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence kako je navedena u ovom dokumentu može imati zamenjenu jednu ili dve nesidrene aminokiseline (vidite u nastavku u pogledu sidrenog motiva) bez značajnog menjanja ili negativnog uticaja na sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II, kada se uporedi sa nemodifikovanim peptidom. U drugom otelotvorenju, u peptidu koji se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence kako je navedena u ovom dokumentu, jedna ili dve aminokiseline mogu biti zamenjene njihovim partnerima za konzervativnu zamenu (vidite u nastavku dokumenta) bez značajnog menjanja ili negativnog uticaja na sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II, kada se uporedi sa nemodifikovanim peptidom.

Aminokiselinski ostaci koji ne doprinose značajno interakcijama sa T-ćelijskim receptorom mogu da se modifikuju zamenom sa drugim aminokiselinama čija inkorporacija ne utiče značajno na T-ćelijsku reaktivnost i ne eliminiše vezivanje za relevantni MHC. Stoga, nezavisno od navedenog uslova, peptid iz ove objave može biti bilo koji peptid (a pod ovim terminom pronalazači podrazumevaju i oligopeptid ili polipeptid), koji obuhvata aminokiselinske sekvence ili njihov deo ili njihovu varijantu kako je naznačeno.

Takođe, mogu biti prikladni i duži (elongirani) peptidi. Moguće je da se obradom peptida iz dužih peptida ili proteina koji sadrže sam epitop, stvore epitopi MHC klase I, mada su oni obično dužine između 8 i 11 aminokiselina. Poželjno je da ostaci koji su bočni na aktuelni epitop budu ostaci koji ne ometaju u značajnoj meri proteolitičko cepanje koje je neophodno da bi se aktuelni epitop eksponirao tokom obrade.

Peptidi iz ove objave mogu biti produženi za najviše četiri aminokiseline, to jest mogu da se dodaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline na bilo koji kraj u bilo kojoj kombinaciji između 4:0 i 0:4. Kombinacije elongacija u skladu sa ovom objavom navedene su u tabeli 4.

Tabela 4: Kombinacie elon acia e tida ronalaska

Aminokiseline za elongaciju/produžavanje mogu biti peptidi originalne sekvence proteina ili bilo koja druga aminokiselina(e). Elongacija može da se koristi za poboljšavanje stabilnosti ili rastvorljivosti peptida.

Tako, epitopi predmetne objave mogu biti identični prirodno javljajućim tumorasociranim ili tumor-specifičnim epitopima ili mogu obuhvatati epitope koji se razlikuju za ne više od četiri ostataka od referentnog peptida, dokle god imaju značajno identičnu antigenu aktivnost.

U alternativnom otelotvorenju, peptid je produžen na jednom ili oba kraja za više od 4 aminokiseline, poželjno do ukupne dužine od najviše 30 aminokiselina. Ovako mogu nastati peptidi koji se vezuju za MHC klase II. Vezivanje za MHC klase II može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.

Saglasno tome, predmetna objava obezbeđuje peptide i varijante epitopa MHC klase I, naznačene time što peptid ili varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14, naime 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminokiselina, a u slučaju elongiranih peptida koji se vezuju za klasu II, dužina može da iznosi i 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili 22 aminokiseline.

Naravno, peptid ili varijanta u skladu sa predmetnom objavom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II. Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.

Poželjno, kada se T ćelije specifične za peptid u skladu sa predmetnom objavom testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/l, poželjno nije veća od oko 1 µmol/l, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/l, a još poželjnije nije veća od oko 100 pmol/l, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pmol/l. Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane T ćelija dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.

U naročito preferiranom primeru predstavljene objave peptid se sastoji ili se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191.

„Esencijalno se sastoji od“ znači da peptid u skladu sa predmetnom objavom, pored sekvence u skladu sa bilo kojom od ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 191 ili njene varijante, sadrži dodatne N- i/ili C-terminalno locirane produžetke od aminokiselina koji nužno ne obrazuju deo peptida koji funkcioniše kao epitop za epitop MHC molekula.

Ipak, ovi produžeci mogu biti važni za obezbeđivanje efikasnog uvođenja peptida u skladu sa predmetnom objavom u ćelije. U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, peptid je deo fuzionog proteina koji sadrži, na primer, 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku „Ii“) koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497. U drugim fuzijama, peptidi predmetne objave mogu biti fuzirani na antitelo kako je opisano u ovom dokumentu, ili na njegov funkcionalni deo, naročito u sekvencu antitela, tako da budu specifično ciljani od strane navedenog antitela, ili, na primer, na ili u antitelo koje je specifično za dendritične ćelije kako su opisane u ovom dokumentu.

Pored toga, peptid ili varijanta mogu biti dalje modifikovani da bi se poboljšala stabilnost i/ili vezivanje za MHC molekule kako bi se izazvao jači imunski odgovor. Metodi za takvu optimizaciju peptidne sekvence su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju, na primer, uvođenje reverznih peptidnih veza ili nepeptidnih veza.

U reverznoj peptidnoj vezi, aminokiselinski ostaci nisu povezani peptidnim (-CO-NH-) vezama već je peptidna veza obrnuta. Takvi retro-inverzni peptidomimetici mogu biti napravljeni pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, na primer poput onih opisanih u radu Meziere i sar. (1997) (Meziere et al., 1997), koji je pomoću reference inkorporiran u ovaj dokument. Ovaj pristup obuhvata pravljenje pseudopeptida koji sadrže izmene koje uključuju kostur, a ne orijentaciju bočnih lanaca. Meziere i sar. (Meziere et al., 1997) pokazuju da su ovi pseudopeptidi korisni za vezivanje MHC i T-pomoćničke ćelijske odgovore. Retro-inverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, mnogo su otporniji na proteolizu.

Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent US 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.

Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, kako bi se pojačala stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili tbutiloksikarbonil grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9-fluorenilmetoksi-karbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, t-butiloksikarbonil, ili amido grupa.

Nadalje, peptidi iz ove objave mogu biti sintetisani tako da se izmeni njihova prostorna konfiguracija. Na primer, može da se koristi D-izomer jednog ili više aminokiselinskih ostataka peptida, umesto uobičajenog L-izomera. Dodatno, najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka peptida iz ove objave može da se supstituiše jednim od dobro poznatih aminokiselinskih ostataka koji se normalno ne javljaju u prirodi. Izmene poput ovih mogu služiti da se poveća stabilnost, bioraspoloživost i/ili vezivanje peptida iz ove objave.

Slično tome, peptid ili varijanta iz ove objave može da se modifikuje hemijski, reakcijom sa specifičnim aminokiselinama bilo pre ili nakon sinteze peptida. Primeri za takve modifikacije su dobro poznati u stručnoj oblasti i sažeto predstavljeni, na primer, u radu R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3. izd. CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004), koji je pomoću reference inkorporiran u ovaj dokument. Hemijska modifikacija aminokiselina uključuje, ali nije i ograničeno na, modifikaciju pomoću acilacije, amidinacije, piridoksilacije lizina, redukcione alkilacije, trinitrobenzilacije amino grupa sa 2,4,6-trinitrobenzen sulfonskom kiselinom (TNBS), amidne modifikacije karboksil grupa i sulfidrilne modifikacije pomoću oksidacije cisteina performinskom kiselinom do cisteinske kiseline, obrazovanja živinih derivata, obrazovanja mešovitih disulfida sa drugim tiolnim jedinjenjima, reakcije sa maleimidom, karboksimetilacije sa jodosirćetnom kiselinom ili jodoacetamidom i karbamilacije sa cijanatom u alkalnoj pH sredini, iako bez ograničenja na ovde navedeno. U ovom pogledu, osoba stručna u predmetnoj oblasti se upućuje na poglavlje 15 Trenutno važećih protokola u nauci o proteinima, urednici Coligan i sar. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995) za opsežniju metodologiju u vezi sa hemijskim modifikacijama proteina.

Ukratko, modifikacija, na primer, arginilskih ostataka u proteinima često se bazira na reakciji vicinalnih dikarbonilnih jedinjenja kao što su fenilglioksal, 2,3-butandion i 1,2-cikloheksandion kako bi se obrazovao adukt. Drugi primer je reakcija metilglioksala sa argininskim ostacima. Cistein može da se modifikuje bez istovremene modifikacije drugih nukleofilnih mesta kao što su lizin i histidin. Kao rezultat, dostupan je veliki broj reagenasa za modifikaciju cisteina. Veb stranice kompanija kao što je Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) pružaju informacije o specifičnim reagensima.

Selektivna redukcija disulfidnih veza u proteinima je takođe uobičajena. Disulfidne veze mogu da se formiraju i oksidiraju u toku tretiranja biofarmaceutika toplotom. Woodwardov reagens K može da se koristi za modifikaciju specifičnih ostataka glutaminske kiseline. N-(3-(dimetilamino)propil)-N’-etilkarbodiimid može da se koristi za obrazovanje intramolekularnih unakrsnih veza između lizinskog ostatka i ostatka glutaminske kiseline. Na primer, dietilpirokarbonat je reagens za modifikaciju histidilskih ostataka u proteinima. Histidin može takođe da se modifikuje pomoću 4-hidroksi-2-nonenala. Reakcija lizinskih ostataka i drugih α-amino grupa je, na primer, korisna u vezivanju peptida za površine ili unakrsno povezivanje proteina/peptida. Lizin je mesto vezivanja poli(etilen)glikola i glavno mesto modifikacije u glikozilaciji proteina. Metioninski ostaci u proteinima mogu da se modifikuju pomoću npr. jodoacetamida, bromoetilamina i hloramina T.

Tetranitrometan i N-acetilimidazol mogu da se koriste za modifikaciju tirozilskih ostataka. Unakrsno povezivanje pomoću obrazovanja ditirozina može da se postigne vodonik peroksidom/jonima bakra.

U nedavnim studijama o modifikaciji triptofana korišćeni su N-bromosukcinimid, 2-hidroksi-5-nitrobenzil bromid ili 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmerkapto)-3H-indol (BPNS-skatol).

Uspešna modifikacija terapeutskih proteina i peptida sa PEG je često udružena sa produžavanjem poluživota u cirkulaciji dok se unakrsno povezivanje proteina sa glutaraldehidom, polietilen glikol diakrilatom i formaldehidom koristi za pripremanje hidrogelova. Hemijska modifikacija alergena za imunoterapiju se često postiže karbamilacijom sa kalijum cijanatom.

Peptid ili varijanta, naznačeni time što je peptid modifikovan ili sadrži nepeptidne veze, poželjni su primer predstavljenog pronalaska. Uopšteno, peptidi i varijante (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas i sar. (Lukas et al., 1981) i u tamo citiranim referencama. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih preformiranih simetričnih anhidridnih derivata sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog spajanja posredovane N, N-dicikloheksilkarbodiimid/1hidroksibenzotriazolom. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, (Bruckdorfer et al., 2004) i reference koje su tamo citirane).

Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, UK).

Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.

Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.

Da bi se izabrali prekomerno prezentovani peptidi, izračunava se profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijaciju replikata. Profil postavlja jedno uz drugo uzorke tumora od interesovanja sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Svaki od ovih profila može zatim da se konsoliduje u rezultat prekomerne prezentacije pomoću izračunavanja p-vrednosti modela linearnih mešovitih efekata (Pinheiro et al., 2015) uz prilagođavanje za višestruko testiranje pomoću stope lažnog otkrivanja (Benjamini and Hochberg, 1995).

Radi identifikacije i relativne kvantifikacije HLA liganada pomoću masene spektrometrije, HLA molekuli iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni a sekvence su identifikovane pomoću onlajn eksperimenata nano-elektrosprej-jonizacije (nanoESI) tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Tako dobijene peptidne sekvence su potvrđene poređenjem obrasca fragmentacije prirodnih TUMAP zabeleženog iz uzoraka CRC (N = 24 A*02-pozitivna uzorka) sa obrascima fragmentacije odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Budući da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati daju direktan dokaz za prirodnu obradu i prezentaciju identifikovanih peptida na tkivu primarnog karcinoma dobijenog od 24 pacijenta sa CRC.

Linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.1 (vidite na primer US 2013-0096016 koji je ovde u celosti uključen putem reference) omogućava identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prezentovanih peptida kandidata za vakcinu na osnovu direktne relativne kvantifikacije nivoa HLA-restrikovanog peptida na malignim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nemalignih tkiva i organa. Ovo je postignuto razvojem diferencijalne kvantifikacije bez obeležavanja primenom podataka dobijenih pomoću LC-MS koji su obrađeni vlasničkom linijom za analizu podataka, kombinovanjem algoritama za identifikaciju sekvence, grupisanje spektra, brojanje jona, poravnanje vremena zadržavanja, slabljenje naelektrisanog stanja i normalizaciju.

Ustanovljeni su nivoi prezentacije uključujući procene greške za svaki peptid i uzorak. Identifikovani su peptidi koji su isključivo prezentovani na tumorskom tkivu i peptidi koji su prekomerno prezentovani u tumorskim u poređenju sa nemalignim tkivima i organima.

Kompleksi HLA-peptid iz uzoraka tkiva CRC su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani i analizirani pomoću LC-MS (vidite primere). Svi TUMAP koji su sadržani u predmetnoj aplikaciji ovim pristupom su identifikovani na uzorcima primarnog CRC čime je potvrđena njihova prezentacija na primarnom CRC.

TUMAP identifikovani na multiplim tkivima CRC i normalnim tkivima kvantifikovani su pomoću brojanja jona LC-MS podataka bez obeležavanja. Metod pretpostavlja da oblasti LC-MS signala peptida koreliraju sa njegovom obilnošću u uzorku. Svi kvantitativni signali peptida u raznim LC-MS eksperimentima su normalizovani na osnovu centralne tendencije, uprosečene po uzorku i sjedinjeni u stubičasti dijagram, koji se naziva profil prezentacije. Profil prezentacije objedinjuje različite metode analize kao što su pretraživanje baze podataka proteina, grupisanje spektra, slabljenje naelektrisanog stanja (gubitak naelektrisanja) i poravnanje vremena zadržavanja i normalizaciju.

Pored toga, linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.x omogućava direktnu apsolutnu kvantifikaciju nivoa MHC-, poželjno HLA-restrikovanog, peptida na tumorskim ili drugim inficiranim tkivima. Ukratko, ukupan broj ćelija je izračunat iz ukupnog sadržaja DNK analiziranog uzorka tkiva. Ukupna količina peptida za TUMAP u uzorku tkiva izmerena je pomoću nanoLC-MS/MS kao odnos prirodnih TUMAP i poznate količine verzije TUMAP obeležene izotopom, takozvanog unutrašnjeg standarda. Efikasnost izolacije TUMAP utvrđena je pomoću dodavanja kompleksa peptid:MHC svih izabranih TUMAP u lizat tkiva u najranijoj mogućoj tački procedure izolacije TUMAP i njihove detekcije pomoću nanoLC-MS/MS nakon završetka procedure izolacije peptida. Ukupan broj ćelija i ukupna količina peptida izračunati su iz merenja u triplikatu po uzorku tkiva. Efikasnosti izolacije specifičnog peptida izračunate su kao prosek iz 10 eksperimenata sa dodavanjem a svaki je meren u triplikatu (vidite primer 6 i tabelu 9).

Predmetna objava obezbeđuje peptide koji su korisni u lečenju raka/tumora, poželjno CRC, koji prekomerno ili isključivo prezentuju peptide iz ove objave. Za ove peptide je pokazano masenom spektrometrijom da ih prirodno prezentuju HLA molekuli na primarnim humanim uzorcima CRC.

Dokazano je da su mnogi izvorni gen/proteini (koji se takođe nazivaju „proteini kompletne dužine“ ili „osnovni proteini“) iz kojih su dobijeni peptidi visoko prekomerno eksprimirani u malignim u poređenju sa normalnim tkivima – „normalna tkiva“ u pogledu ove objave označavaju ili zdrave ćelije debelog creva (kolona ili rektuma) ili normalne ćelije drugih tkiva, što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena (pogledajte primer 2). Štaviše, sami peptidi su snažno prekomerno prezentovani na tumorskom tkivu – „tumorsko tkivo“ u pogledu ove objave označava uzorak od pacijenta koji boluje od CRC, ali ne na normalnim tkivima (vidite primer 1).

HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije CRC koje prezentuju dobijene peptide.

Za peptide predmetne objave je dokazano da su sposobni da stimulišu T-ćelijske odgovore i/ili da su prekomerno prezentovani i da samim tim mogu da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, kao što su solubilni TCR-ovi, u skladu sa predmetnom objavom (vidite primer 3 i primer 4). Pored toga, peptidi, kada su u kompleksu sa odgovarajućim MHC, mogu takođe da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, konkretno sTCR-ova, u skladu sa predmetnom objavom. Odgovarajući metodi dobro su poznati osobi stručnoj u ovoj oblasti i mogu se naći i u odgovarajućoj literaturi. Tako su peptidi predmetne objave korisni za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptidi predmetne objave nisu prezentovani na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.

Predmetni opis se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove) koji sadrže alfa lanac i beta lanac („alfa/beta TCR-ovi“). Takođe su obezbeđeni peptidi koji su sposobni da se vezuju za TCR-ove i antitela kada ih prezentuje MHC molekul. Predmetni opis se takođe odnosi na nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine za eksprimiranje TCR-ova i peptida predmetnog opisa; i metode za primenu istih.

Termin „T-ćelijski receptor“ (skraćeno TCR) odnosi se na heterodimerni molekul koji sadrži alfa polipeptidni lanac (alfa lanac) i beta polipeptidni lanac (beta lanac), naznačeno time što je heterodimerni receptor sposoban da se vezuje za peptidni antigen koji prezentuje HLA molekul. Termin takođe obuhvata takozvane gama/delta TCR-ove.

U jednom otelotvorenju opis obezbeđuje metod proizvodnje TCR-a kakav je opisan u ovom dokumentu, a metod se sastoji od uzgajanja ćelije domaćina koja je sposobna da eksprimira TCR u uslovima pogodnim za promociju ekspresije TCR-a.

U drugom aspektu opis se odnosi na metode u skladu sa opisom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom ili se antigen postavlja na MHC tetramere klase I ili II tetramerizacijom monomera kompleksa antigen/MHC klase I ili II.

Alfa i beta lanci alfa/beta TCR-ova i gama i delta lanci gama/delta TCR-ova se uopšteno smatraju kao da svaki ima dva „domena“, naime varijabilni i konstantni domen. Varijabilni domen sastoji se od spoja varijabilnog regiona (V) i spojnog regiona (J). Varijabilni domen može da sadrži i vodeći region (L). Beta i delta lanci mogu takođe da uključuju region diverziteta (D). Alfa i beta konstantni domeni mogu takođe da sadrže C-terminalne transmembranske (TM) domene koji usidravaju alfa i beta lance za ćelijsku membranu.

U pogledu gama/delta TCR-ova, termin „TCR gama varijabilni domen“ na način kako je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na spoj TCR gama V (TRGV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR gama J (TRGJ) regiona, a termin „TCR gama konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRGC region, ili na C-terminalno skraćenu TRGC sekvencu. Isto tako, termin „TCR delta varijabilni domen“ odnosi se na spoj TCR delta V (TRDV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR delta D/J (TRDD/TRDJ) regiona, a termin „TCR delta konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRDC region, ili na C-terminalno skraćenu TRDC sekvencu.

TCR-ovi predmetnog opisa se poželjno vezuju za kompleks peptid-HLA molekul sa afinitetom vezivanja (KD) od oko 100 µmol/l ili manje, oko 50 µmol/l ili manje, oko 25 µmol/l ili manje, ili oko 10 µmol/l ili manje. Još poželjniji su TCR-ovi visokog afiniteta koji imaju afinitete vezivanja od oko 1 µmol/l ili manje, oko 100 nmol/l ili manje, oko 50 nmol/l ili manje, oko 25 nmol/l ili manje. Neograničavajući primeri poželjnih opsega afiniteta vezivanja za TCR-ove predmetne objave obuhvataju oko 1 nmol/l do oko 10 nmol/l; oko 10 nmol/l do oko 20 nmol/l; oko 20 nmol/l do oko 30 nmol/l; oko 30 nmol/l do oko 40 nmol/l; oko 40 nmol/l do oko 50 nmol/l; oko 50 nmol/l do oko 60 nmol/l; oko 60 nmol/l do oko 70 nmol/l; oko 70 nmol/l do oko 80 nmol/l; oko 80 nmol/l do oko 90 nmol/l; i oko 90 nmol/l do oko 100 nmol/l.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu u vezi sa TCR predmetnog opisa, termin „specifično vezivanje“ i njegove gramatičke varijante koriste se da označe TCR koji ima afinitet vezivanja (KD) za kompleks peptid-HLA molekul od 100 µmol/l ili manje.

Alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu da imaju uvedenu disulfidnu vezu između njihovih konstantnih domena. Poželjni TCR-ovi ovog tipa obuhvataju one koji imaju TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena osim što su Thr 48 TRAC-a i Ser 57 TRBC1-a ili TRBC2-a zamenjeni cisteinskim ostacima, navedeni cisteini obrazuju disulfidnu vezu između TRAC sekvence konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvence konstantnog domena TCR-a.

Sa ili bez uvedene veze između lanaca navedene iznad, alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu imati TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena, a TRAC sekvenca konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvenca konstantnog domena TCR mogu biti povezane prirodnom disulfidnom vezom između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2.

TRC-ovi predmetnog opisa mogu sadržati detektabilnu oznaku izabranu iz grupe koju čine radionuklid, fluorofor i biotin. TRC-ovi predmetnog opisa mogu biti konjugovani za terapeutski aktivan agens, kao što je radionuklid, hemioterapijski agens ili toksin.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa koji ima najmanje jednu mutaciju u alfa lancu i/ili ima najmanje jednu mutaciju u beta lancu ima modifikovanu glikozilaciju u poređenju sa nemutiranim TCR.

U jednom otelotvorenju, TCR koji sadrži najmanje jednu mutaciju u alfa lancu TCR i/ili beta lancu TCR ima afinitet vezivanja za, i/ili poluživot vezivanja za, kompleks peptid-HLA molekul, koji je najmanje dvostruk od afiniteta vezivanja/poluživota vezivanja TCR koji sadrži nemutirani alfa lanac TCR i/ili nemutirani beta lanac TCR. Pojačanje afiniteta tumor-specifičnih TCR, i njegovo iskorišćavanje, oslanja se na postojanju prozora za optimalne TCR afinitete. Postojanje takvog prozora zasnovano je na opažanjima da TCR-ovi specifični za HLA-A2-restrikovane patogene imaju KD vrednosti koje su uopšteno oko 10 puta manje u poređenju sa TCR-ovima specifičnim za HLA-A2-restrikovane tumor-asocirane autoantigene. Sada je poznato da će imunski sistem, iako tumorski antigeni imaju potencijal da budu imunogeni, zato što tumori nastaju iz sopstvenih ćelija pojedinca, videti samo mutirane proteine ili proteine sa izmenjenom translacionom obradom kao strane. Antigeni koji su ushodno regulisani ili prekomerno eksprimirani (takozvani autoantigeni) neće nužno indukovati funkcionalni imunski odgovor protiv tumora: T ćelije koje eksprimiraju TCR-ove koji su visoko reaktivni na ove antigene bile su negativno selektovane u timusu tokom procesa koji se zove centralna tolerancija, što znači da ostaju samo T ćelije sa TCR-ovima niskog afiniteta za autoantigene. Stoga, afinitet TCR-ova ili varijanti predmetnog opisa za peptide u skladu sa ovom objavom može da se pojača pomoću metoda koje su dobro poznate u predmetnoj oblasti.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od inkubacije mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa monomerima A2/peptidni monomeri, inkubacije PBMC sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od dobijanja transgenskog miša sa čitavim humanim TCRαꞵ genskim lokusima (1,1 i 0,7 Mb), čije T ćelije eksprimiraju raznolik repertoar humanih TCR koji kompenzuje za TCR deficijenciju miša, imunizacije miša sa peptidom od interesa, inkubacije PBMC dobijenih od transgenskih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)–Calibur.

U jednom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-alfa i/ili TCR-beta lance predmetnog opisa se kloniraju u vektore ekspresije, kao što su gama retrovirus ili lentivirus. Rekombinantni virusi se stvaraju a zatim testiraju za funkcionalnost, kao što je antigena specifičnost i funkcionalni aviditet. Zatim se alikvot konačnog proizvoda koristi za transdukciju ciljne T-ćelijske populacije (generalno prečišćene iz pacijentovih PBMC), koja se ekspandira pre infuzije pacijentu. U drugom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti sintetišu se TCR RNK, npr. u in vitro transkripcionim sistemima. In vitro sintetisane TCR RNK se zatim uvode u primarne CD8+ T ćelije dobijene od zdravih donora elektroporacijom u cilju ponovnog eksprimiranja tumor-specifičnih TCR-alfa i/ili TCR-beta lanaca.

Radi povećanja ekspresije, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti operabilno povezane sa snažnim promoterima, kao što su retrovirusni dugi terminalni ponovci (LTRs), citomegalovirus (CMV), mišji virus matičnih ćelija (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK), ꞵ-aktin, ubikvitin, i simijan virus 40 (SV40)/CD43 kompozitni promoter, faktor elongacije (EF)-1a i promoter virusa formiranja fokusa u slezini (SFFV). U jednom poželjnom otelotvorenju, promoter je heterologan za nukleinsku kiselinu koja se eksprimira. Pored snažnih promotera, kasete TCR ekspresije predmetnog opisa mogu da sadrže dodatne elemente koji mogu da pojačaju transgensku ekspresiju, uključujući centralni polipurinski trakt (cPPT), koji promoviše nukleusnu translokaciju lentivirusnih konstrukata (Follenzi et al., 2000), i posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota (wPRE), koji povećava nivo transgenske ekspresije povećanjem stabilnosti RNK (Zufferey et al., 1999).

Alfa i beta lanci TCR-a predmetnog pronalaska mogu da budu kodirani nukleinskim kiselinama koje se nalaze u zasebnim vektorima, ili mogu da budu kodirani polinukleotidima koji se nalaze u istom vektoru.

Postizanje površinske ekspresije TCR-a visokog stepena iziskuje da i TCR-alfa i TCR-beta lanci uvedenog TCR-a budu transkribovani u visokim nivoima. Da bi se to izvelo, TCR-alfa i TCR-beta lanci predmetnog opisa mogu da budu klonirani u bicistronske konstrukte u jednom vektoru, za koji je dokazano da je u stanju da prevaziđe ovu prepreku. Upotreba virusnog mesta vezivanja ribozoma (IRES) između TCR-alfa i TCR-beta lanaca rezultuje koordinisanom ekspresijom oba lanca, zato što se TCR-alfa i TCR-beta lanci stvaraju iz jednog transkripta koji se cepa na dva proteina tokom translacije, čime se osigurava da se proizvodi podjednak molarni odnos TCR-alfa i TCR-beta lanaca. (Schmitt et al.2009).

Nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti kodonski optimizovane da bi se povećala ekspresija iz ćelije domaćina. Obilnost genetskog koda omogućava da neke aminokiseline budu kodirane pomoću više od jednog kodona, ali određeni kodoni su manje „optimalni“ od drugih zbog relativne raspoloživosti podudarnih tRNK kao i drugih faktora (Gustafsson et al., 2004). Pokazano je da modifikacija TCR-alfa i TCR-beta genskih sekvenci tako da svaka aminokiselina bude kodirana optimalnim kodonom za ekspresiju sisarskih gena, kao i eliminacija motiva nestabilnosti iRNK ili mesta kriptičkog cepanja, značajno pojačava ekspresiju TCR-alfa i TCR-beta gena (Scholten et al., 2006).

Pored toga, pogrešno uparivanje uvedenih i endogenih TCR lanaca može rezultovati dobijanjem specifičnosti koje predstavljaju značajan rizik za autoimunost. Na primer, obrazovanje mešovitih TCR dimera može smanjiti broj CD3 molekula dostupnih za obrazovanje pravilno uparenih TCR kompleksa, te stoga može značajno smanjiti funkcionalni aviditet ćelija koje eksprimiraju uvedeni TCR (Kuball et al., 2007).

Da bi se smanjilo pogrešno uparivanje, C-terminalni domen uvedenih TCR lanaca predmetnog opisa može da se modifikuje da bi se promovisao međulančani afinitet, uz smanjenje sposobnosti uvedenih lanaca da se sparuju sa endogenim TCR. Ove strategije mogu da uključuju zamenu humanih TCR-alfa i TCR-beta C-terminalnih domena sa njihovim mišjim antipodima (murinizovani C-terminalni domen); stvaranje druge međulančane disulfidne veze u C-terminalnom domenu uvođenjem drugog ostatka cisteina i u TCR-alfa i u TCR-beta lanac uvedenog TCR (cisteinska modifikacija); zamenjivanje interagujućih ostataka u C-terminalnim domenima TCR-alfa i TCR-beta lanca („knob-in-hole“); i fuziju varijabilnih domena TCR-alfa i TCR-beta lanaca direktno na CD3ζ (CD3ζ fuzija). (Schmitt et al.2009).

U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin se projektuje da eksprimira TCR predmetnog opisa. U poželjnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je humana T ćelija ili progenitorska T ćelija. U nekim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od pacijenta obolelog od raka. U drugim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od zdravog donora. Ćelije domaćini predmetnog opisa mogu da budu alogene ili autologne u odnosu na pacijenta koji će se lečiti. U jednom otelotvorenju, domaćin je gama/delta T ćelija transformisana da eksprimira alfa/beta TCR.

„Farmaceutska smeša“ je smeša koja je pogodna za davanje ljudskom biću u medicinskim okolnostima. Poželjno, farmaceutska smeša je sterilna i proizvedena u skladu sa smernicama Dobre proizvođačke prakse (DPP).

Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (pogledajte ranije u tekstu). Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu –NH2grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične.

U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoro acetata ili hlorovodonične kiseline (hloridi).

Poželjno, lek predmetnog pronalaska je imunoterapeutik, kao što je vakcina. Ona se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transficirane tako da koeksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin 2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (pogledajte u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (pogledajte WO 95/18145 i (Longenecker et al., 1993)). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnoj objavi se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 T ćelija je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 T ćelije, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju one identifikovane u predmetnoj objavi.

U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iznetu u ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV 191 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.

Dalji aspekt objave obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid ili varijantu peptida iz ove objave. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt objave obezbeđuje vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira polipeptid u skladu sa ovom objavom.

Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarnih kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.

Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.

Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid iz ove objave koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK, i sar. (Saiki et al., 1988).Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu iz ove objave. Tako, DNK koja kodira peptid ili varijantu iz ove objave može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, radi konstruisanja vektora ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida iz ove objave. Takve tehnike uključuju one izložene u, na primer, patentima US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji sačinjava jedinjenje iz ove objave može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.

Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.

Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK iz ove objave se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

Predmetna objava se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetne objave. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju ćelije kvasnica, insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj osobi stručnoj u predmetnoj oblasti.

Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, rad Cohen i sar. (Cohen et al., 1972) i (Green and Sambrook, 2012) . Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman i sar. (Sherman et al., 1986) . Metod koji je izložio Beggs (Beggs, 1978) takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.

Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini iz ove objave korisne za pripremanje peptida iz ove objave, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida iz ove objave tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.

U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog karcinoma prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje metod za proizvodnju peptida ili njegove varijante, metod koji obuhvata kultiviranje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njegovog medijuma za kultivaciju.

U drugom otelotvorenju, peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska koriste se u medicini. Na primer, peptid ili njegova varijanta mogu biti pripremljeni za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al., 2012).

Polinukleotid koji se koristi za aktivnu vakcinaciju može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. Teufel i sar. (Teufel et al., 2005). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.

Poželjni adjuvansi su anti-CD40, imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda i rezikvimoda. U poželjnom otelotvorenju farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom, adjuvans je ciklofosfamid, imikvimod ili rezikvimod. Još poželjniji adjuvansi su Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAT ili njihove kombinacije.

Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, rastvarača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta iz priručnika A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2112253.

Važno je da se razume da imunski odgovor izazvan vakcinom u skladu sa pronalaskom napada maligni tumor u različitim ćelijskim fazama i različitim stadijumima razvoja. Pored toga napadaju se i različiti signalni putevi povezani sa malignim tumorom. Ovo je prednost u odnosu na vakcine koje ciljaju samo jedan ili nekoliko ciljeva, što može dovesti do toga da se tumor lako adaptira na napad (izbegavanje tumora). Pored toga, ne eksprimiraju svi pojedinačni tumori isti obrazac antigena. Zbog toga, kombinacija nekoliko tumor-asociranih peptida osigurava da svaki pojedinačan tumor nosi najmanje neki od ciljeva. Smeša je dizajnirana na takav način da se očekuje da svaki tumor eksprimira nekoliko antigena i pokriva nekoliko nezavisnih puteva neophodnih za rast i održavanje tumora. Tako, vakcina se lako može koristi „iz zaliha“ za veću populaciju pacijenata. Ovo znači da prethodna selekcija pacijenata koji će biti lečeni vakcinom može da se ograniči na HLA tipizaciju, ne zahteva bilo kakve dodatne procene biomarkera za ekspresiju antigena, ali se i dalje osigurava da nekoliko ciljeva bude napadnuto istovremeno od strane indukovanog imunskog odgovora, što je važno za efikasnost (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

Peptidi predmetnog pronalaska mogu da se koriste za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Ona se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.

Zato, dalji aspekt pronalaska je obezbeđivanje metoda za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inžinjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje se specifično vezuje za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, naznačeno time što je antitelo poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bispecifično antitelo i/ili himerno antitelo.

Odgovarajući metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I, kao i ostali alati za proizvodnju ovih antitela izneti su u patentima WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, kao i publikacijama (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003), koji su svi za potrebe ovog pronalaska ovde u celosti izričito uključeni putem reference.

Poželjno, antitelo se vezuje za kompleks sa afinitetom vezivanja manjim od 20 nanomol/l, poželjno ispod 10 nanomol/l, što se u kontekstu predmetnog pronalaska takođe smatra „specifičnim“.

Predmetna objava odnosi se na peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191 ili njihovu varijantu koja je najmanje 88% homologna (poželjno identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191 ili njihovom varijantom koja indukuje T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom, naznačeno time što navedeni peptid nije osnovni polipeptid kompletne dužine.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191 ili njihovu varijantu koja je najmanje 88% homologna (poželjno identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191, naznačeno time što navedeni peptid ili varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14 aminokiselina.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom koji imaju sposobnost da se vežu za molekul klase I ili II humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom naznačene time što se peptid sastoji ili esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence prema ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, naznačene time što je peptid (hemijski) modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, naznačene time što je peptid deo fuzionog proteina, konkretno koji sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii), ili naznačene time što je peptid fuziran na (ili u) antitelo, kao, na primer, antitelo koje je specifično za dendritične ćelije.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptide u skladu sa pronalaskom, pod uslovom da peptid nije potpun (kompletan) humani protein.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u medicini, konkretno u lečenju CRC.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačen time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191 ili navedenu varijantu aminokiselinske sekvence.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačene time što navedene T ćelije selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili aktiviranog citotoksičnog T limfocita u skladu sa predmetnim pronalaskom u vidu leka ili u proizvodnji leka. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv malignog tumora.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek vakcina. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv malignog tumora.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije raka ćelije CRC ili ćelije drugog solidnog ili hematološkog tumora kao što je rak pluća, rak mozga, rak želuca, rak bubrega, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jajnika i rak jednjaka.

Predmetna objava se dalje odnosi na konkretne markerske proteine i biomarkere zasnovane na peptidima u skladu sa predmetnim pronalaskom, u ovom tekstu nazvane „ciljevima“, a koji se mogu koristiti kod određivanja dijagnoze i/ili prognoze CRC. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na upotrebu ovih novih ciljeva za lečenje raka.

Termin „antitelo“ ili „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih ili „kompletnih“ molekula imunoglobulina, pod terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti (npr. CDR-ovi, Fv, Fab i Fc fragmenti) ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava (npr. specifično vezivanje markerskog (poli)peptida za CRC, isporučivanje toksina ćeliji CRC koja eksprimira markerski gen za karcinom u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida za CRC) u skladu sa pronalaskom.

Kad god je to moguće, antitela pronalaska mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Antitela pronalaska mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osobi stručnoj u predmetnoj oblasti će biti poznato da za stvaranje antitela pronalaska mogu da se koriste ili markerski polipeptidi za CRC kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela pronalaska može biti parcijalno ili kompletno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK.

Na primer, cDNK koja kodira peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao što je peptid u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191, polipeptid, ili njegova varijanta ili fragment, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. kvasnice, insekti ili ćelije sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za CRC koji se koristi za stvaranje antitela u skladu sa pronalaskom.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će shvatiti da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela pogledajte, npr. rad Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Na primer, antitela mogu da se testiraju u ELISA testovima, ili Western blot testovima, imunohistohemijskim bojenjem uzoraka malignog tumora fiksiranih u formalinu ili zamrznutih isečaka tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.

Termin „monoklonalno antitelo“ na način na koji je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (US 4,816,567, koji je ovde u celosti uključen).

Monoklonalna antitela pronalaska mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.

Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu US 4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela pronalaska može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).

Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u patentima WO 94/29348 i US 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fc fragment. Tretiranje pepsinom proizvodi F(ab')2 fragment i pFc' fragment.

Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije, ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona ili specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disuflidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u predmetnoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.

Antitela pronalaska mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR-a nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR-a ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.

Metodi humanizacije nehumanih antitela dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR-ova ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. Saglasno tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (US 4,816,567), naznačena time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućim sekvencama iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.

U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira region spajanja teškog lanca antitela kod miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultira kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.

Antitela pronalaska se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u predmetnoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.

Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne kao i sistemske terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.

Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski a takva određivanja spadaju u okvir veštine predmetne oblasti. Osobe stručne u predmetnoj oblasti će razumeti da će doza antitela, koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Nakon primene antitela, poželjno za tretiranje CRC, efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u predmetnoj oblasti. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija malignog tumora kod ispitanika koji prima terapiju, može da se prati pomoću standardnih tehnika za imidžing tumora. Antitelo koje se primenjuje u terapijske svrhe, koje zaustavlja rast tumora, rezultuje smanjivanjem veličine tumora i/ili sprečava nastanak novih tumora u poređenju sa tokom bolesti koji bi nastao u odsustvu primene antitela, jeste efikasno antitelo za lečenje malignog tumora.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora (sTCR) koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se poveća pomoću mutageneze koja cilja komplementarne determinišuće regione. U svrhe odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T-ćelijski receptor može biti povezan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite, na primer, patent US 2013/0115191), domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. Pored toga, on može biti eksprimiran u T ćelijama koje se koriste za adoptivni transfer. Dalje informacije se mogu naći u patentima WO 2004/033685A1 i WO 2004/074322A1. Kombinacija sTCR opisana je u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju izneti su u WO 2013/057586A1.

Pored toga, peptidi i/ili TCR-ovi ili antitela ili drugi vezujući molekuli predmetne objave mogu da se koriste da se potvrdi dijagnoza raka patologa na osnovu bioptiranog uzorka.

Antitela ili TCR-ovi se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke testove. Uopšteno, antitelo se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije. U jednom otelotvorenju, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za vanćelijske domene dva ili više ciljeva proteina izabranih iz grupe koju čine gore navedeni proteini, a vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1x10 µmol/l.

Antitela za dijagnostičku primenu mogu biti obeležena probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti bi- ili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba za antitela uključuje kovalentno vezivanje probe, inkorporaciju probe u antitelo, i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije proteina in situ.

Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigenprezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.

Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.

Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Ljunggren i sar. (Ljunggren and Karre, 1985).

Poželjno, pre transfekcije ćelija domaćin značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje kostimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i kostimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.

U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivne T ćelije.

Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji je sposoban da eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 191.

Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje T ćelija in vitro. Na primer, za generisanje CTL mogu da se koriste autologni tumor-infiltrišući limfociti. Plebanski i sar. (Plebanski et al., 1995) upotrebili su autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje T ćelija. Pored toga, moguća je proizvodnja autolognih T ćelija pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Takođe, za proizvodnju autolognih T ćelija mogu da se koriste B ćelije. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih T ćelija. S. Walter i sar. (Walter et al., 2003) opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U predmetnom pronalasku, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa kostimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina, kao što je interleukin 12.

Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija a metod je detaljno opisan u patentu WO 97/26328, ovde uključenom pomoću reference. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice, ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga mogu da se koriste i virusi biljaka (pogledajte, na primer, rad Porta i sar. (Porta et al., 1994) u kom je opisan razvoj mozaičkog virusa crnog pasulja kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.

Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska korisne su u terapiji.

Tako, dalji aspekt pronalaska obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodima pronalaska.

Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 191.

Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentan imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.

In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).

T ćelije predmetne objave mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Na taj način, pronalazak takođe obezbeđuje metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz ove objave, pri čemu metod obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kako je definisano ranije.

Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa normalnim nivoima ekspresije ili da je gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao ali da je eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran“ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.

T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, npr. ranije opisanih.

Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Pregledi se mogu naći u: radu Gattioni i sar. i Morgan i sar. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Drugi aspekt predmetnog pronalaska obuhvata upotrebu peptida koji su u kompleksu sa MHC za stvaranje T-ćelijskog receptora čija nukleinska kiselina je klonirana i uvedena u ćeliju domaćina, poželjno T ćeliju. Ova stvorena T ćelija može zatim da se prenese u pacijenta radi lečenja raka.

Svaki molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, antitelo, vektor ekspresije, ćelija, aktivirana T ćelija, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).

Predmetni pronalazak je dalje usmeren na komplet koji se sastoji od:

(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;

(b) opciono druge posude koja sadrži rastvarač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i

(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.

Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) rastvarač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica, brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.

Kompleti predmetnog pronalaska se poželjno sastoje od liofilizirane formulacije predmetnog pronalaska u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrži(e) uputstva na posudi ili uz nju koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za potkožnu primenu.

Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr. od dve do šest primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni razblaživač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).

Nakon mešanja razblaživača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75 µg) a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500 µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, rablaživače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.

Kompleti predmetnog pronalaska mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša u skladu sa predmetnim pronalaskom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.

Poželjno, kompleti pronalaska obuhvataju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše. Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.

Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd) koji omogućava primenu agenasa pronalaska koji su komponente predmetnog kompleta.

Predmetna formulacija je jedna koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, supkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. primena može biti pomoću infuzione pumpe.

Budući da su peptidi pronalaska izolovani iz CRC, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje CRC.

Pored toga što su korisni za lečenje malignih tumora, peptidi predmetnog pronalaska su takođe korisni kao sredstva za dijagnostikovanje. Budući da su peptidi napravljeni iz ćelija CRC i budući da je utvrđeno da ovi peptidi nisu prisutni ili su prisutni u manjim nivoima u normalnim tkivima, ovi peptidi mogu da se koriste za dijagnostikovanje prisustva tumora.

Prisustvo peptida patentnog zahteva na biopsijama tkiva u uzorcima krvi može da pomogne patologu u postavljanju dijagnoze raka. Detekcija određenih peptida pomoću antitela, masene spektrometrije ili drugih metoda poznatih u stručnoj oblasti može da pokaže patologu da je uzorak tkiva maligan ili inflamiran ili uopšteno oboleo, ili može da se koristi kao biomarker za CRC. Prisustvo grupa peptida može da omogući klasifikaciju ili supklasifikaciju obolelih tkiva.

Detekcija peptida na uzorku obolelog tkiva može da omogući donošenje odluke o koristima terapija koje uključuju imunski sistem, posebno ako je poznato ili se očekuje da T limfociti budu uključeni u mehanizam delovanja. Gubitak MHC ekspresije je dobro opisani mehanizam pomoću kojeg inficirane ili maligne ćelije izbegavaju imunološki nadzor. Tako, prisustvo peptida pokazuje da analizirane ćelije ne iskorišćavaju ovaj mehanizam.

Ovde predstavljeni peptidi mogu da se koriste za analizu limfocitnih odgovora protiv tih peptida, kao što su T-ćelijski odgovori ili odgovori antitelima protiv peptida ili peptida u kompleksu sa MHC molekulom. Ovi limfocitni odgovori mogu da se koriste kao prognostički markeri za donošenje odluke o daljim koracima lečenja. Ovi odgovori mogu takođe da se koriste kao surogat markeri odgovora u imunoterapijskim pristupima čiji je cilj indukcija limfocitnih odgovora pomoću različitih sredstava, npr. vakcinacije proteinom, nukleinskim kiselinama, autolognim materijalom, ili adoptivni transfer limfocita. U smislu genske terapije, limfocitni odgovori protiv peptida mogu se razmatrati u pogledu procene neželjenih dejstava. Praćenje limfocitnih odgovora može takođe biti dragocena alatka za kontrolne preglede terapija transplantacijom, npr. za detekciju bolesti graft protiv domaćina i domaćin protiv grafta.

SLIKE

Slike 1A do M pokazuju prekomernu prezentaciju različitih peptida u normalnim tkivima (beli stupci) i CRC (crni stupci). Slika 1A: simbol(i) gena: ZNF679, ZNF716, SAPCD2, peptid: ALIKQLFEA (ID BR. SEKV: 1), tkiva s leva na desno: 1 masno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 6 arterija, 3 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 1 nerv, 1 jajnik, 8 jednjaka, 2 žučne kese, 5 srca, 16 bubrega, 21 jetra, 46 pluća, 3 limfna čvora, 4 uzorka leukocita, 3 jajnika, 7 pankreasa, 4 periferna nerva, 1 peritoneum, 1 hipofiza, 2 placente, 3 pleure, 1 prostata, 2 pljuvačne žlezde, 4 skeletna mišića, 4 kože, 2 tanka creva, 4 slezine, 7 želudaca, 4 testisa, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 1 traheja, 1 ureter, 3 mokraćne bešike, 2 materice, 2 vene, 13 kolona, 6 rektuma, 24 CRC. Peptid je dodatno detektovan na 9/99 malignih tumora pluća, 2/28 malignih tumora mozga, 4/20 malignih tumora jajnika, 1/45 malignih tumora želuca, 1/33 maligna tumora prostate i 2/15 malignih tumora jednjaka (nije prikazano). Slika 1B: simbol(i) gena: BRCA2, peptid: KQFEGTVEI (ID BR. SEKV: 138), tkiva s leva na desno: 1 masno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 6 arterija, 3 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 1 nerv, 1 jajnik, 8 jednjaka, 2 žučne kese, 5 srca, 16 bubrega, 21 jetra, 46 pluća, 3 limfna čvora, 4 uzorka leukocita, 3 jajnika, 7 pankreasa, 4 periferna nerva, 1 peritoneum, 1 hipofiza, 2 placente, 3 pleure, 1 prostata, 2 pljuvačne žlezde, 4 skeletna mišića, 4 kože, 2 tanka creva, 4 slezine, 7 želudaca, 4 testisa, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 1 traheja, 1 ureter, 3 mokraćne bešike, 2 materice, 2 vene, 13 kolona, 6 rektuma, 24 CRC. Peptid je dodatno detektovan na 1/15 malignih tumora jednjaka, 1/28 malignih tumora mozga, 1/45 malignih tumora želuca i 3/91 malignog tumora pluća (nije prikazano). Slika 1C: simbol(i) gena: IL8, peptid: KLAVALLAA (ID BR. SEKV: 210), tkiva s leva na desno: 1 masno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 6 arterija, 3 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 1 nerv, 1 jajnik, 8 jednjaka, 2 žučne kese, 5 srca, 16 bubrega, 21 jetra, 46 pluća, 3 limfna čvora, 4 uzorka leukocita, 3 jajnika, 7 pankreasa, 4 periferna nerva, 1 peritoneum, 1 hipofiza, 2 placente, 3 pleure, 1 prostata, 2 pljuvačne žlezde, 4 skeletna mišića, 4 kože, 2 tanka creva, 4 slezine, 7 želudaca, 4 testisa, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 1 traheja, 1 ureter, 3 mokraćne bešike, 2 materice, 2 vene, 13 kolona, 6 rektuma, 24 CRC. Peptid je dodatno detektovan na 14/99 malignih tumora pluća, 1/18 malignih tumora bubrega, 2/28 malignih tumora mozga, 2/16 malignih tumora jetre, 1/20 malignih tumora jajnika, 1/45 malignih tumora želuca i 3/15 malignih tumora jednjaka (nije prikazano). Slika 1D) simbol(i) gena: TMEM222, peptid: LLYGKYVSV (ID BR. SEKV: 31) tkiva s leva na desno: 3 pankreasne ćelijske linije, 3 kožne ćelijske linije, 1 leukocitna ćelijska linija, 0 normalnih tkiva, 28 tkiva raka (2 maligna tumora mozga, 1 maligni tumor dojke, 1 maligni tumor kolona, 1 maligni tumor jednjaka, 2 maligna tumora bubrega, 1 leukemija, 5 malignih tumora jetre, 7 malignih tumora pluća, 5 malignih tumora jajnika, 1 maligni tumor prostate, 2 maligna tumora rektuma). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1A-C. Odstupanja u pogledu liste tipova tumora između slike 1D i tabele 2 mogu biti usled strožijih kriterijuma za izbor primenjenih u tabeli 2 (za detalje pogledajte tabelu 24). Slika 1D prikazuje sve uzorke sa detektabilnom prezentacijom peptida Y, bez obzira na parametre prekomerne prezentacije i proveru kvaliteta tehničkog uzorka. Slika 1E: simbol(i) gena: ZNF679, ZNF716, SAPCD2, peptid: ALIKQLFEA (ID BR. SEKV: 1), tkiva s leva na desno: 7 linija ćelija raka, 1 kultura primarne ćelije raka, 58 tkiva raka (5 malignih tumora mozga, 1 maligni tumor dojke, 9 malignih tumora kolona, 1 kolorektalni karcinom, 3 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 2 maligna tumora leukocitne leukemije, 15 malignih tumora pluća, 2 maligna tumora limfnog čvora, 1 maligni tumor mijeloidnih ćelija, 5 malignih tumora jajnika, 1 maligni tumor prostate, 4 maligna tumora rektuma, 1 maligni tumor kože, 2 maligna tumora želuca, 2 maligna tumora mokraćne bešike, 3 maligna tumora materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1A-C. Slika 1F: F) simbol(i) gena: PLAGL2, peptid: FLAELPGSLSL (ID BR. SEKV: 6), tkiva s leva na desno: 8 linija ćelija raka, 1 kultura primarne ćelija raka, 2 normalna tkiva (1 limfni čvor, 1 slezina), 57 tkiva raka (1 maligni tumor kostne srži, 1 maligni tumor dojke, 1 maligni tumor slepog creva, 5 malignih tumora kolona, 2 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 3 maligna tumora leukocitne leukemije, 2 maligna tumora jetre, 13 malignih tumora pluća, 8 malignih tumora limfnog čvora, 1 maligni tumor mijeloidnih ćelija, 9 malignih tumora jajnika, 2 maligna tumora rektuma, 1 maligni tumor kože, 1 maligni tumor želuca, 4 maligna tumora mokraćne bešike, 2 maligna tumora materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1A-C. Slika 1G: simbol(i) gena: CYP2W1, peptid: FLDANGHFV (ID BR. SEKV: 23), tkiva s leva na desno: 1 kultura primarne ćelija raka, 3 normalna tkiva (3 placente), 12 tkiva raka (5 malignih tumora kolona, 1 maligni tumor jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 2 maligna tumora rektuma, 3 maligna tumora želuca). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1A-C. Slika 1H: simbol(i) gena: CYP2W1, peptid: GLIDEVMVL (ID BR. SEKV: 22), tkiva s leva na desno: 1 normalno tkivo (1 želudac), 6 tkiva raka (3 maligna tumora kolona, 1 maligni tumor žučne kese, 2 maligna tumora rektuma). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1A-C. Slika 1I: simbol(i) gena: AXIN2, peptid: ILDDHLSRV (ID BR. SEKV: 9), tkiva s leva na desno: 5 tkiva raka (1 maligni tumor slepog creva, 1 maligni tumor kolona, 1 maligni tumor pluća, 2 maligna tumora rektuma). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1A-C. Slika 1J: simbol(i) gena: RAD54B, peptid: KLLAVIHEL (ID BR. SEKV: 152), tkiva s leva na desno: 3 ćelijske linije, 2 normalna tkiva (1 limfni čvor, 1 slezina), 34 tkiva raka (1 maligni tumor dojke, 7 malignih tumora kolona, 1 maligni tumor jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 1 maligni tumor bubrega, 8 malignih tumora pluća, 4 maligna tumora limfnog čvora, 1 maligni tumor mijeloidnih ćelija, 4 maligna tumora jajnika, 1 maligni tumor pankreasa, 1 maligni tumor rektuma, 3 maligna tumora kože, 1 maligni tumor mokraćne bešike). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1A-C. Slika 1K: simbol(i) gena: ECT2, peptid: SLVQRVETI (ID BR. SEKV: 142), tkiva s leva na desno: 5 ćelijskih linija, 1 primarna kultura, 47 tkiva raka (2 maligna tumora žučnih puteva, 2 maligna tumora dojke, 1 maligni tumor slepog creva, 7 malignih tumora kolona, 3 maligna tumora jednjaka, 3 maligna tumora žučne kese, 1 maligni tumor bubrega, 2 maligna tumora jetre, 10 malignih tumora pluća, 2 maligna tumora limfnog čvora, 4 maligna tumora jajnika, 1 maligni tumor pankreasa, 2 maligna tumora rektuma, 2 maligna tumora kože, 1 maligni tumor želuca, 2 maligna tumora mokraćne bešike, 2 maligna tumora materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1A-C. Slika 1L: simbol(i) gena: MMP12, peptid: KIQEMQHFL (ID BR. SEKV: 192), tkiva s leva na desno: 1 primarna kultura, 44 tkiva raka (5 malignih tumora kolona, 1 maligni tumor jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 1 maligni tumor glave i vrata, 30 malignih tumora pluća, 1 maligni tumor limfnog čvora, 1 maligni tumor rektuma, 1 maligni tumor želuca, 1 maligni tumor testisa, 1 maligni tumor mokraćne bešike, 1 maligni tumor materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1A-C. Slika 1M: simbol(i) gena: COL6A3, peptid: FLLDGSANV (ID BR. SEKV: 212), tkiva s leva na desno: 3 ćelijske linije, 2 normalna tkiva (1 placenta, 1 slezina), 146 tkiva raka (4 maligna tumora žučnih puteva, 13 malignih tumora dojke, 1 maligni tumor slepog creva, 8 malignih tumora kolona, 1 kolorektalni karcinom, 6 malignih tumora jednjaka, 5 malignih tumora žučne kese, 5 malignih tumora glave i vrata, 2 maligna tumora bubrega, 1 maligni tumor jetre, 62 maligna tumora pluća, 2 maligna tumora limfnog čvora, 9 malignih tumora jajnika, 7 malignih tumora pankreasa, 3 maligna tumora rektuma, 4 maligna tumora kože, 5 malignih tumora želuca, 5 malignih tumora mokraćne bešike, 3 maligna tumora materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1A-C.

Na slici 2A do C prikazani su primerni profili ekspresije (relativna ekspresija u poređenju sa normalnim kolonom i rektumom) izvornih gena predmetnog pronalaska koji su visoko prekomerno eksprimirani ili ekskluzivno eksprimirani u CRC u panelu normalnih tkiva (beli stupci) i 10 uzoraka CRC (crni stupci). Tkiva s leva na desno: nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak (ceo), dojka, kolon, jednjak, srce, bubreg (triplikat), leukociti, jetra, pluća, limfni čvor, jajnik, pankreas, placenta, prostata, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, testis, timus, štitasta žlezda, mokraćna bešika, grlić materice, materica, vena, 3 uzorka normalnog tkiva kolona, 10 uzoraka CRC. Slika 2A, CCNB1; slika 2B, CDK1; slika 2C, CHMP5. Na slici 2D prikazani su primerni profili ekspresije (relativna ekspresija u poređenju sa normalnim kolonom i rektumom) izvornih gena predmetnog pronalaska koji su visoko prekomerno eksprimirani ili ekskluzivno eksprimirani u CRC u panelu normalnih tkiva (beli stupci) i 20 uzoraka CRC (crni stupci). Tkiva s leva na desno: 6 arterija, 2 krvne ćelije, 2 mozga, 1 srce, 2 jetre, 3 pluća, 2 vene, 1 masno tkivo, 1 nadbubrežna žlezda, 5 kostnih srži, 1 hrskavica, 1 kolon, 1 jednjak, 2 oka, 2 žučne kese, 2 pljuvačne žlezde, 1 bubreg, 6 limfnih čvorova, 4 pankreasa, 2 periferna nerva, 2 hipofize, 1 rektum, 2 skeletna mišića, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 štitasta žlezda, 7 traheja, 1 mokraćna bešika, 1 dojka, 5 jajnika, 5 placente, 1 prostata, 1 testis, 1 timus, 1 materica, 20 uzoraka CRC. Slika 2D: ECT2.

Na slici 3 prikazani su primerni podaci imunogenosti: rezultati protočne citometrije nakon bojenja peptid-specifičnog multimera.

Na slikama 4A do C prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*02+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*02 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv. 22 (A, levi panel), peptidom ID br. sekv.9 (B, levi panel) odnosno peptidom ID br. sekv. 142 (C, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*02/ID br. sekv. 22 (A), A*02/ID br. sekv.

9 (B) ili A*02/ID br. sekv. 142 (C). Desni paneli (A, B i C) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*02/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

PRIMERI

PRIMER 1

Identifikacija i kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije

Uzorci tkiva

Tkiva tumora pacijenata dobijena su od Univerzitetske bolnice u Tibingenu.

Normalna tkiva dobijena su od kompanije Asterand, Detroit, SAD i Royston, Herts, Velika Britanija; Bio-Options Inc, CA, SAD; BioServe, Beltsville, MD, SAD; Capital BioScience Inc, Rockville, MD, SAD; Geneticist Inc., Glendale, CA, SAD; Tissue Solutions Ltd, Glazgov, Škotska, Velika Britanija; Univerzitetske bolnice u Ženevi; Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu; Prefekturalnog medicinskog univerziteta u Kjotou (KPUM); Univerzitetske bolnice u Minhenu; kompanije ProteoGenex Inc., Culver City, CA, SAD; Univerzitetske bolnice u Tibingenu. Pre operacije ili autopsije, od svih pacijenata je pribavljen pisani informisani pristanak. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem neposredno nakon ekscizije i uskladištena na -70 °C ili manje do izolacije TUMAP.

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

Pulovi HLA peptida iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem dobijeni su imunskom precipitacijom iz čvrstih tkiva u skladu sa blago modifikovanim protokolom (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) primenom HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2, HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, CNBr-aktivirane sefaroze, tretiranja kiselinom i ultrafiltracije.

Analize masenom spektrometrijom

Dobijeni pulovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hidrofobnosti pomoću reverznofazne hromatografije (nanoAcquity UPLC sistem, Waters) a eluirani peptidi su analizirani u LTQ-velos i fuzionim hibridnim masenim spektrometrima (ThermoElectron) opremljenim ESI izvorom. Pulovi peptida su direktno postavljeni na analitičku mikrokapilarnu kolonu od fuzirane silike (75 µm i.d. x 250 mm) upakovanu sa 1,7 µm C18 reverzno-faznim materijalom (Waters) uz primenu brzine protoka od 400 nl u minutu. Nakon toga, peptidi su izdvojeni primenom dvostepenog 180-minutnog binarnog gradijenta iz 10% do 33% B pri brzini protoka od 300 nl u minutu. Gradijent su činili rastvarač A (0,1% mravlja kiselina u vodi) i rastvarač B (0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Staklena kapilara obložena zlatom (PicoTip, New Objective) je korišćena za uvođenje u nanoESI izvor. LTQ-Orbitrap maseni spektrometri su radili u režimu zavisnom od podataka primenom strategije TOP5 (5 najvećih). Ukratko, iniciran je ciklus skeniranja sa kompletnim skeniranjem visoke masene preciznosti u orbitrap (R = 30 000), što je bilo praćeno MS/MS skeniranjima takođe u orbitrap (R = 7500) na 5 najzastupljenijih prekursorskih jona sa dinamičkim isključivanjem prethodno odabranih jona. Tandem maseni spektri su interpretirani pomoću SEQUEST i dodatnom ručnom kontrolom. Identifikovana peptidna sekvenca je potvrđena poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog peptida sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence.

Relativna LC-MS kvantifikacija bez obeležavanja izvršena je pomoću brojanja jona tj. ekstrakcijom i analizom LC-MS karakteristika (Mueller et al., 2007). Metod pretpostavlja da oblast LC-MS signala peptida korelira sa njegovom obilnošću u uzorku. Ekstrahovane karakteristike su dalje obrađene pomoću slabljenja naelektrisanog stanja i poravnanja vremena zadržavanja (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). Na kraju, sve LC-MS karakteristike su referencirane sa rezultatima identifikacije sekvence kako bi se kvantitativni podaci od različitih uzoraka i tkiva kombinovali u profile prezentacije peptida. Kvantitativni podaci su normalizovani na dvostepeni način u skladu sa centralnom tendencijom kako bi se uračunala varijacija u okviru tehničkih i bioloških replikata. Tako svaki identifikovani peptid može biti povezan sa kvantitativnim podacima što omogućava relativnu kvantifikaciju između uzoraka i tkiva. Pored toga, svi kvantitativni podaci dobijeni za peptidne kandidate su ručno pregledani kako bi se osigurala doslednost podataka i potvrdila tačnost automatizovane analize. Za svaki peptid je izračunat profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijacije replikata. Profili postavljaju jedno uz drugo uzorke CRC sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Profili prezentacije primernih prekomerno prezentovanih peptida prikazani su na slici 1. Rezultati prezentacije peptida pronalaska prikazani su u tabeli 5.

Tabela 5: Rezultati prezentacije. U tabeli je naveden peptid koji je veoma visoko prekomerno prezentovan na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno prezentovan na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno prezentovan na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+).

PRIMER 2

Profiliranje ekspresije gena koji kodiraju peptide pronalaska

Prekomerna prezentacija ili specifična prezentacija peptida na tumorskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama je dovoljna za njihovu korisnost u imunoterapiji, a neki peptidi su tumor-specifični iako se njihov izvorni protein takođe javlja u normalnim tkivima. Ipak, profiliranje ekspresije iRNK dodaje dodatni nivo bezbednosti u izboru peptidnih ciljeva za imunoterapije. Naročito za terapijske opcije sa visokim rizicima u pogledu bezbednosti, kao što su afinitetno sazreli TCR-ovi, idealni ciljni peptid će biti dobijen od proteina koji je jedinstven za tumor i ne nalazi se na normalnim tkivima.

RNK izvori i priprema

Hirurški odstranjeni uzorci tkiva obezbeđeni su kako je navedeno ranije (pogledajte primer 1) nakon što je od svakog pacijenta pribavljen pisani informisani pristanak. Uzorci tumorskog tkiva su zamrznuti brzim zamrzavanjem neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani avanom i tučkom u prisustvu tečnog azota. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka pomoću TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Nemačka) nakon čega je sledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Hilden, Nemačka); oba metoda su izvedena u skladu sa protokolom proizvođača.

Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva dobijena je komercijalno (Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Nemačka; Stratagene, Amsterdam, Holandija; BioChain, Hayward, CA, SAD). RNK od nekoliko pojedinaca (između 2 i 123 osobe) izmešana je tako da je RNK od svakog pojedinca bila težinski podjednaka.

Kvalitet i kvantitet svih uzoraka RNK procenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Waldbronn, Nemačka) upotrebom RNA 6000 Pico LabChip kompleta (Agilent).

Eksperimenti na mikročipu

Analiza genske ekspresije svih uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je pomoću Affymetrix Human Genome (HG) U133A ili HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotidnih mikročipova (Affymetrix, Santa Clara, CA, SAD). Svi koraci su izvršeni u skladu sa priručnikom za Affymetrix. Ukratko, sintetisana je dvolančana cDNK iz 5–8 µg ukupne RNK, primenom SuperScript RTII (Invitrogen) i oligo-dT-T7 prajmera (MWG Biotech, Ebersberg, Nemačka) kako je opisano u priručniku. In vitro transkripcija je izvršena sa kompletom BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, SAD) za U133A čipove ili sa kompletom GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) za U133 Plus 2.0 čipove, nakon čega je sledila fragmentacija, hibridizacija i bojenje cRNK sa streptavidin-fikoeritrin i biotiniliranim anti-streptavidin antitelom (Molecular Probes, Leiden, Holandija). Slike su skenirane skenerom Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) ili Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), a podaci su analizirani pomoću GCOS softvera (Affymetrix), upotrebom podrazumevanih podešavanja za sve parametre. Za normalizaciju je korišćeno 100 konstitutivnih gena obezbeđenih od strane kompanije Affymetrix. Vrednosti relativne ekspresije izračunate su iz logaritamskih odnosa signala datih od strane softvera a normalni uzorak bubrega je arbitrarno podešen na 1,0. Primerni profili ekspresije izvornih gena predmetnog pronalaska koji su veoma prekomerno eksprimirani ili isključivo eksprimirani u CRC prikazani su na slici 2. Rezultati ekspresije za dalje primerne gene prikazani su u tabeli 6.

Tabela 6: Rezultati ekspresije. U tabeli su navedeni peptidi iz gena nepovezanih sa pronalaskom koji su veoma visoko prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+).

PRIMER 3

In vitro imunogenost za MHC klasa I-prezentovane peptide

Da bi se dobile informacije u pogledu imunogenosti TUMAP predmetnog pronalaska, istraživači su sproveli ispitivanja pomoću eseja za in vitro prajming T ćelija zasnovanog na ponovljenim stimulacijama CD8+ T ćelija sa veštačkim antigen-prezentujućim ćelijama (aAPĆ) napunjenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom. Na ovaj način istraživači su mogli da pokažu imunogenost za 22 HLA-A*0201-restrikovana TUMAP koji su do sada predstavljeni, dokazujući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih kod ljudi postoje CD8+ prekursorske T ćelije (tabela 7).

In vitro priprema CD8+ T ćelija

Da bi izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija napunjenih kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, pronalazači su prvo izolovali CD8+ T ćelije iz svežih proizvoda leukafereze HLA-A*02 putem pozitivne selekcije primenom CD8 mikroperli (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Nemačka) zdravih donora dobijenih iz Univerzitetskih klinika u Manhajmu, Nemačka, nakon pribavljanja informisanog pristanka.

PBMC i izolovani CD8+ limfociti su inkubirani do primene u T-ćelijskom medijumu (TCM) koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Nemačka), 100 U/ml penicilina / 100 µg/ml streptomicina (Cambrex, Cologne, Nemačka), 1 mmol/l natrijum piruvata (CC Pro, Oberdorla, Nemačka), 20 µg/ml gentamicina (Cambrex). U ovom koraku u TCM je takođe dodato 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Nemačka) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Nemačka).

Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanje su izvršeni u visoko definisanom in vitro sistemu primenom četiri različita pMHC molekula po uslovu stimulacije i 8 različitih pMHC molekula po uslovu očitavanja.

Prečišćeno kostimulatorno mišje IgG2a anti-humano CD28 At 9.3 (Jung et al., 1987) bilo je hemijski biotinilirano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bonn, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom prečnika 5,6 µm (Bangs Laboratories, Illinois, SAD).

pMHC korišćeni za stimulacije pozitivne i negativne kontrole bili su A*0201/MLA-001 (peptid ELAGIGILTV (ID BR. SEKV: 266) iz modifikovanog Melan-A/MART-1) odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5, ID BR. SEKV.267).

800.000 perli / 200 µl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 4 x 12,5 ng različitih biotin-pMHC, isprano i naknadno je dodato 600 ng biotin anti-CD28 u zapremini od 200 µl. Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem 1x10<6>CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 µl TCM u koji je dodato 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) u toku 3 dana na 37 °C. Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 4 dana na 37 °C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta. Za očitavanje pMHC multimera pomoću 8 različitih pMHC molekula po uslovu, korišćen je pristup dvodimenzionalnog kombinatornog kodiranja kako je ranije opisano (Andersen et al., 2012) sa manjim modifikacijama koje obuhvataju spajanje sa 5 različitih fluorohroma. Na kraju, analize multimera su izvršene bojenjem ćelija sa bojom Live/dead near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka), klonom CD8-FITC antitela SK1 (BD, Heidelberg, Nemačka) i fluorescentnim pMHC multimerima. Za analizu je korišćen BD LSRII SORP citometar opremljen odgovarajućim laserima i filterima. Peptid-specifične ćelije izračunate su kao procenat ukupnih CD8+ ćelija. Evaluacija analize multimera izvršena je primenom FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, SAD). In vitro prajming specifičnih multimer+ CD8+ limfocita detektovan je upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovo mesto je sadržalo najmanje 1% specifičnih multimer+ među CD8+ T ćelijama a procenat specifičnih multimer+ ćelija je bio najmanje 10x veći od medijane stimulacija negativne kontrole).

In vitro imunogenost za CRC peptide

Za testirane HLA klasa I peptide, in vitro imunogenost je mogla da se pokaže stvaranjem peptid-specifičnih T-ćelijskih linija. Primerni rezultati protočne citometrije nakon TUMAP-specifičnog bojenja multimera za 1 peptid iz ove objave prikazani su na slici 3 zajedno sa odgovarajućim negativnim kontrolama. Rezultati za peptid iz pronalaska sumirani su u tabeli 7.

Tabela 7: Podaci za in vitro imunogenost HLA klasa I peptida pronalaska.

Primerni rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti izvršenih od strane podnosioca za HLA-A*02-restrikovane peptide pronalaska. Rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti su naznačeni. Procenat pozitivnih mesta i donora (među procenjivim) su sumirani kako je naznačeno <20% = ; 20%–49% = +; 50%–69% = ++; >= 70% = +++

PRIMER 4

Sinteza peptida

Svi peptidi su sintetisani pomoću standardne i dobro ustanovljene sinteze peptida u čvrstoj fazi primenom strategije Fmoc. Identitet i prečišćenost svakog pojedinačnog peptida utvrđeni su masenom spektrometrijom i analitičkom RP-HPLC. Peptidi su dobijeni u vidu belih do krem liofilizata (trifluoro-acetatne soli) u čistoćama >50%. Svi TUMAP se poželjno primenjuju u obliku trifluoro-acetatnih soli ili acetatnih soli, mogući su i drugi oblici soli.

PRIMER 5

Testovi vezivanja MHC

Peptidi kandidati za terapije zasnovane na T ćelijama u skladu sa predmetnim pronalaskom su dalje testirani u pogledu njihovog kapaciteta vezivanja MHC (afinitet). Pojedinačni kompleksi peptid-MHC proizvedeni su pomoću izmene liganada pod UV, gde je peptid osetljiv na UV odvojen odmah nakon UV zračenja i zamenjen peptidom od interesa prema analizi. Samo peptidi kandidati koji mogu efikasno da vežu i stabilizuju peptid-receptivne MHC molekule sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa. Da bi se utvrdio prinos reakcije zamene, sprovedena je ELISA zasnovana na detekciji lakog lanca (β2m) stabilizovanih MHC kompleksa. Esej je sproveden kako je uopšteno opisano u radu Rodenko i sar. (Rodenko et al., 2006).

MAXISorp pločice sa 96 mesta (NUNC) obložene su preko noći sa 2 ug/ml streptavidina u PBS na sobnoj temperaturi, isprane 4 puta i blokirane tokom 1 h na 37 °C u 2% BSA koji sadrži pufer za blokiranje. Ponovo presavijeni HLA-A*02:01/MLA-001 monomeri služili su kao standardi, pokrivajući opseg od 15–500 ng/ml. Monomeri peptid-MHC iz UV-izmenjivačke reakcije razblaženi su 100 puta u puferu za blokiranje. Uzorci su inkubirani tokom 1 h na 37 °C, isprani četiri puta, inkubirani sa 2 µg/ml HRP konjugovanog anti-β2m tokom 1 h na 37 °C, isprani ponovo i detektovani sa rastvorom TMB koji je zaustavljen sa NH2SO4. Apsorpcija je izmerena na 450 nm. Peptidi kandidati koji pokazuju visok prinos izmene (poželjno veći od 50%, najpoželjnije veći od 75%) se generalno preferiraju za generisanje i proizvodnju antitela ili njihovih fragmenata, i/ili T-ćelijskih receptora ili njihovih fragmenata, jer oni pokazuju dovoljan aviditet prema MHC molekulima i sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa.

Tabela 8: Rezultat vezivanja MHC klase I. Raspon vezivanja HLA klasa I-restrikovanog peptida za HLA-A*02:01 utvrđen je pomoću prinosa izmene peptida: >10% = ; >20% = +; >50 = ++; > 75% = +++; J = fosfoserin

PRIMER 6

Apsolutna kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije

Stvaranje vezivača, kao što su antitela i/ili TCR-ovi, je težak proces, koji se može sprovesti samo za određeni broj izabranih ciljeva. U slučaju tumor-asociranih i tumorspecifičnih peptida, kriterijumi za odabir obuhvataju, bez ograničavanja, ekskluzivnost prezentacije i gustinu peptida prezentovanog na površini ćelije. Pored izolacije i relativne kvantifikacije peptida opisanih u PRIMERU 1, pronalazači su analizirali apsolutni broj kopija peptida po ćeliji kako je opisano u patentu x. Kvantifikacija kopija TUMAP po ćeliji u uzorcima solidnog tumora iziskuje apsolutnu kvantifikaciju izolovanog TUMAP, efikasnost izolacije TUMAP i broj ćelija u analiziranom uzorku tkiva. Kratak pregled našeg eksperimentalnog pristupa dat je na slici 4, a eksperimentalni koraci opisani su u nastavku.

Kvantifikacija peptida pomoću nanoLC-MS/MS

Za preciznu kvantifikaciju peptida pomoću masene spektrometrije, za svaki peptid je generisana kalibraciona kriva primenom internog standardnog metoda. Interni standard je dvostruko izotopom obeležena varijanta svakog peptida, tj. u sintezu TUMAP su uključene dve aminokiseline obeležene izotopom. On se od tumor-asociranog peptida razlikuje samo po svojoj masi ali ne pokazuje razliku u drugim fizičko-hemijskim svojstvima (Anderson et al., 2012). Interni standard je dodat u svaki MS uzorak a svi MS signali su normalizovani prema MS signalu internog standarda kako bi se izjednačila potencijalna tehnička odstupanja između MS eksperimenata.

Kalibracione krive su pripremljene u najmanje tri različite matrice, tj. eluati HLA peptida iz prirodnih uzoraka slični rutinskim MS uzorcima, a svaki preparat je izmeren u MS ciklusima u duplikatu. Za evaluaciju, MS signali su normalizovani prema signalu internog standarda a kalibraciona kriva je izračunata logističkom regresijom.

Za kvantifikaciju tumor-asociranih peptida iz uzoraka tkiva, u odgovarajuće uzorke je takođe dodat interni standard; MS signali su normalizovani prema internom standardu i kvantifikovani pomoću kalibracione krive peptida.

Efikasnost izolacije peptid/MHC

Kao i za svaki postupak prečišćavanja proteina, izolacija proteina iz uzoraka tkiva povezana je sa određenim gubitkom proteina od interesovanja. Da bi se utvrdila efikasnost izolacije TUMAP, kompleksi peptid/MHC su stvoreni za sve TUMAP-ove izabrane za apsolutnu kvantifikaciju. Da bi mogli da se razlikuju spajkovani od prirodnih kompleksa peptid/MHC korišćene su jednostruko izotopom obeležene verzije TUMAP-ova, tj. u sintezu TUMAP je uključena jedna aminokiselina obeležena izotopom. Ovi kompleksi su dodati u sveže pripremljene lizate tkiva, tj. u najranijoj mogućoj tački procedure izolacije TUMAP, a zatim uhvaćeni kao prirodni kompleksi peptid/MHC u narednom afinitetnom prečišćavanju. Merenje dobijanja jednostruko obeleženih TUMAP-ova stoga omogućava donošenje zaključaka u pogledu efikasnosti izolacije pojedinačnih prirodnih TUMAP-ova.

Efikasnost izolacije je analizirana na malom broju uzoraka i bila je uporediva među ovim uzorcima tkiva. Suprotno tome, efikasnost izolacije se razlikuje između pojedinačnih peptida. Ovo sugeriše da efikasnost izolacije, iako određena u samo ograničenom broju uzoraka tkiva, može da se ekstrapolira na bilo koji drugi preparat tkiva. Ipak, neophodno je da se svaki TUMAP pojedinačno analizira zato što efikasnost izolacije ne može da se ekstrapolira sa jednog peptida na druge.

Utvrđivanje broja ćelija u solidnom, zamrznutom tkivu

Da bi se utvrdio broj ćelija uzoraka tkiva podvrgnutih apsolutnoj kvantifikaciji peptida, pronalazači su primenili analizu sadržaja DNK. Ovaj metod je primenjiv za širok spektar uzoraka različitog porekla i, što je najvažnije, zamrznute uzorke (Alcoser et al., 2011; Forsey and Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). U toku protokola izolacije peptida, uzorak tkiva se obrađuje do homogenog lizata, iz kojeg se uzima mali alikvot lizata. Alikvot se deli na tri dela, iz kojih se izoluje DNK (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Nemačka). Ukupan sadržaj DNK iz svake izolacije DNK se kvantifikuje pomoću eseja kvantifikacije DNK zasnovanog na fluorescenciji (komplet eseja Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, Nemačka) u najmanje dva replikata.

Da bi se izračunao broj ćelija, stvorena je standardna kriva DNK iz alikvota pojedinačnih zdravih ćelija krvi, sa rasponom definisanih brojeva ćelija. Standardna kriva se koristi za izračunavanje ukupnog sadržaja ćelija iz ukupnog sadržaja DNK iz svake izolacije DNK. Srednja vrednost ukupnog broja ćelija uzorka tkiva korišćenog za izolaciju peptida se ekstrapolira uzimajući u obzir poznatu zapreminu alikvota lizata i ukupnu zapreminu lizata.

Kopije peptida po ćeliji

Uz pomoć podataka iz gore navedenih eksperimenata pronalazači su izračunali broj kopija TUMAP po ćeliji deljenjem ukupne količine peptida sa ukupnim brojem ćelija uzorka, nakon čega je sledilo deljenje kroz efikasnost izolacije. Broj kopija po ćeliji za peptid prikazan je u tabeli 9.

Tabela 9: Apsolutni brojevi kopija. U tabeli su navedeni rezultati apsolutne kvantifikacije peptida u uzorcima NSCLC tumora. Srednji broj kopija po ćelija naznačen je za svaki peptid: <100 = ; >=100 = +; >=1.000 ++; >=10.000 = +++. Naznačen je broj uzoraka, u kojima su dostupni procenjivi, visoko kvalitetni MS podaci.

Lista referenci

Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc.7 (2012): 891-902

Appay, V. et al., Eur.J Immunol.36 (2006): 1805-1814

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995): 289-300

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol.5 (2004): 29-43

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother.53 (2004): 345-357

Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol.65 (2004): 1211-1223

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114

Coligan JE et al., (1995)

Colombetti, S. et al., J Immunol.176 (2006): 2730-2738

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170

Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814

Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med.2 (1996): 1096-1103

Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867

Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911

Green MR et al., 4th, (2012)

Greenfield EA, 2nd, (2014)

Hwang, M. L. et al., J Immunol.179 (2007): 5829-5838

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615 Kibbe AH, rd, (2000)

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759 Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291 Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795 Lundblad RL, 3rd, (2004)

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027 Mortara, L. et al., Clin Cancer Res.12 (2006): 3435-3443 Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61

Mueller, L. N. et al., Proteomics.7 (2007): 3470-3480 Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638 Pinheiro J et al., (2015)

Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787 Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219 Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Rodenko, B. et al., Nat Protoc.1 (2006): 1120-1132

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576 Sherman F et al., (1986)

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother.53 (2004): 187-195 Small, E. J. et al., J Clin Oncol.24 (2006): 3089-3094

Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics.9 (2008): 163

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci.62 (2005): 1755-1762

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med.18 (2012): 1254-1261

Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423

Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577

Albrecht, M. et al., FEBS Lett.569 (2004): 18-26

Albulescu, R., Biomark.Med.7 (2013): 203

Aschauer, H. et al., Wien.Klin.Wochenschr.95 (1983): 785-788 Aung, P. P. et al., Oncogene 25 (2006): 2546-2557

Backen, A. C. et al., Br.J Cancer 96 (2007): 1544-1548

Bai, J. et al., PLoS.One.8 (2013b): e59772

Bailey, C. M. et al., J Cell Physiol 209 (2006): 617-624

Baris, O. et al., J Clin Endocrinol.Metab 89 (2004): 994-1005 Becker, T. M. et al., Mol.Cancer 8 (2009): 4

Bie, L. et al., PLoS.One.6 (2011): e25631

Bilbao-Aldaiturriaga, N. et al., Pediatr.Blood Cancer 62 (2015): 766-769 Boland, A. et al., Nat Struct.Mol.Biol 20 (2013): 1289-1297

Bulk, E. et al., Int.J Cancer 137 (2015): 1306-1317

Cao, R. et al., Br.J Cancer 111 (2014): 539-550

Carvalho, L. et al., Rev Port.Pneumol.15 (2009): 683-696

Chang, H. Y. et al., PLoS.One.8 (2013): e54117

Chen, C. H. et al., Oncotarget.5 (2014a): 6300-6311

Chen, Y. D. et al., Zhonghua Lao.Dong.Wei Sheng Zhi.Ye.Bing.Za Zhi. 30 (2012): 725-729

Chou, C. C. et al., Expert.Rev Mol.Diagn.8 (2008): 179-187

Chung, F. Y. et al., J Surg.Oncol 102 (2010): 148-153

Cohen, Y. et al., Hematology. 19 (2014): 286-292

Cole, C. L. et al., J Biol Chem 289 (2014): 10488-10501

Courson, D. S. et al., Exp.Cell Res 334 (2015): 10-15

Di, Maro G. et al., J Clin Endocrinol.Metab 99 (2014): E1617-E1626

Ding, K. et al., Med.Hypotheses 83 (2014): 359-364

Doherty, J. A. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.20 (2011): 1873-1882 Duursma, A. et al., Mol.Cell Biol 25 (2005): 6937-6947

Egloff, A. M. et al., Cancer Res 66 (2006): 6-9

Fan, C. G. et al., Oncol Rep.26 (2011): 1281-1286

Fang, Y. et al., Cancer Biol Ther. 15 (2014): 1268-1279

Fang, Z. et al., J Biol Chem 288 (2013): 7918-7929

Fang, Z. Q. et al., Genet.Mol Res 12 (2013): 1479-1489

Feng, B. et al., J Gastroenterol.Hepatol. 21 (2006): 1596-1603

Ferreras, C. et al., J Biol Chem 287 (2012): 36132-36146

Fields, A. P. et al., Adv.Enzyme Regul.50 (2010): 190-200

Flanagan, J. M. et al., Mol.Cancer Ther. 8 (2009): 249-260

Freed, E. F. et al., PLoS.Genet. 8 (2012): e1002892

Goldenson, B. et al., Oncogene 34 (2015): 537-545

Gomez, A. et al., Mol.Pharmacol. 78 (2010): 1004-1011

Griffin, J. N. et al., PLoS.Genet.11 (2015): e1005018

Gutierrez-Camino, A. et al., Pediatr.Res 75 (2014): 767-773

Ham, M. F. et al., Cancer Sci.98 (2007): 1041-1047

Hanks, T. S. et al., Apoptosis. 17 (2012): 236-247

Haren, N. et al., Histol.Histopathol. 25 (2010): 1247-1255

Hatabe, S. et al., Mol.Clin Oncol 1 (2013): 845-850

Hayama, S. et al., Cancer Res 67 (2007): 4113-4122

Hegyi, K. et al., Pathobiology 79 (2012): 314-322

Hill, S. J. et al., Genes Dev.28 (2014): 1957-1975

Hiramoto, T. et al., Oncogene 18 (1999): 3422-3426

Hu, J. et al., Pituitary.10 (2007): 47-52

Hu, S. X. et al., Zhonghua Lao.Dong.Wei Sheng Zhi.Ye.Bing.Za Zhi.31 (2013): 890-894 Huff, L. P. et al., Genes Cancer 4 (2013): 460-475

Ishikawa, N. et al., Cancer Sci.97 (2006): 737-745

Ito, K. et al., Protein Cell 2 (2011): 755-763

Jager, D. et al., Cancer Res 60 (2000): 3584-3591

Januchowski, R. et al., Biomed.Res Int 2014 (2014): 365867

Jin, Y. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 8724-8731

Jordheim, L. P. et al., Biomark.Med. 7 (2013): 663-671

Jordheim, L. P. et al., Lancet Oncol 12 (2011): 693-702

Ju, W. et al., Oncol.Res.18 (2009): 47-56

Kanda, A. et al., Oncogene 24 (2005): 7266-7272

Kaplun, A. et al., Crit Rev Eukaryot.Gene Expr.22 (2012): 249-258

Karlgren, M. et al., Expert.Opin.Ther.Targets. 11 (2007): 61-67

Kas, K. et al., J Biol Chem 273 (1998): 23026-23032

Kaur, S. et al., BMC.Cell Biol 9 (2008): 61

Kim, D. H., Yonsei Med.J 48 (2007): 694-700

Kim, D. S. et al., J Proteome.Res 9 (2010a): 3710-3719

Kim, J. E. et al., J Cancer Res Clin Oncol 136 (2010b): 47-53 Kounelakis, M. G. et al., IEEE J Biomed.Health Inform.17 (2013): 128-135 Lages, E. et al., PLoS.One. 6 (2011): e20600

Lallet-Daher, H. et al., Oncogene 28 (2009): 1792-1806

Landrette, S. F. et al., Blood 105 (2005): 2900-2907

Langnaese, K. et al., Cytogenet.Cell Genet.94 (2001): 233-240

Lee, Y. C. et al., Int.J Cancer 122 (2008b): 1630-1638

Li, B. et al., Cancer Res 61 (2001): 8014-8021

Li, G. H. et al., Bioinformatics.30 (2014): 748-752

Li, J. F. et al., Zhonghua Wei Chang Wai Ke.Za Zhi.15 (2012): 388-391 Li, Y. et al., PLoS.One.8 (2013): e84489

Liu, B. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014a): 3089-3100

Liu, L. et al., Retrovirology. 8 (2011a): 94

Liu, X. et al., Eur.J Cancer 50 (2014b): 2251-2262

Liu, Y. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.18 (2009): 204-214 Liu, Y. et al., J Cancer 6 (2015b): 643-651

Lonardo, F. et al., Curr.Pharm.Des 16 (2010): 1877-1881

Lu, X. et al., Mol.Cancer Ther.3 (2004): 861-872

Maass, N. et al., Acta Oncol 39 (2000): 931-934

Marchi, S. et al., Cell Death.Dis.3 (2012): e304

Marioni, G. et al., Acta Otolaryngol. 129 (2009): 476-480

Marnef, A. et al., Int.J Biochem.Cell Biol 41 (2009): 977-981

Martin, L. et al., Oncogene 31 (2012): 4076-4084

Mason, J. M. et al., Nucleic Acids Res.43 (2015): 3180-3196

Matsuda, R. et al., Br.J Cancer 104 (2011): 376-386

Medina, P. P. et al., Epigenetics. 3 (2008): 64-68

Mound, A. et al., Eur.J Cancer 49 (2013): 3738-3751

Naidu, S. R. et al., Oncogene 28 (2009): 2492-2501

Ng, Y. et al., J Biol Chem 279 (2004): 34156-34164

Nibbe, R. K. et al., Mol Cell Proteomics.8 (2009): 827-845

Nishida, C. R. et al., Mol.Pharmacol. 78 (2010): 497-502

O'Geen, H. et al., PLoS.Genet.3 (2007): e89

Ota, T. et al., Cancer Res 62 (2002): 5168-5177

Paliouras, M. et al., Tumour.Biol 29 (2008): 63-75

Papageorgio, C. et al., Int.J Oncol.31 (2007): 1205-1211

Papageorgis, P. et al., Cancer Res 70 (2010): 968-978

Pohl, A. et al., Pharmacogenomics.J 11 (2011): 93-99

Pollari, S. et al., Mol.Cancer Res 10 (2012): 597-604

Qi, F. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015): 1666-1673

RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/

Reisman, D. N. et al., Cancer Res 63 (2003): 560-566

Robles, L. D. et al., J Biol Chem 277 (2002): 25431-25438

Ryu, B. et al., PLoS.One.2 (2007): e594

Sager, R. et al., Curr.Top.Microbiol.Immunol. 213 ( Pt 1) (1996): 51-64

Sakakura, C. et al., Anticancer Res 23 (2003): 3691-3697

Sakurai, Y. et al., Mol.Pharm.11 (2014): 2713-2719

Sakurikar, N. et al., J Biol Chem 287 (2012): 39193-39204

Sheng, S., Front Biosci.9 (2004): 2733-2745

Shibao, K. et al., Cell Calcium 48 (2010): 315-323

Shu, G. S. et al., Cancer Biomark.11 (2012): 107-114

Stone, B. et al., Gene 267 (2001): 173-182

Strekalova, E. et al., Clin.Cancer Res. (2015)

Stutzer, I. et al., J Biol Chem 288 (2013): 10536-10547

Su, K. C. et al., Dev.Cell 21 (2011): 1104-1115

Sun, Y. et al., Oncotarget.6 (2015b): 8244-8254

Takashima, S. et al., Tumour.Biol. 35 (2014): 4257-4265

Tatsuka, M. et al., Cancer Res 58 (1998): 4811-4816

Tsui, K. H. et al., Sci.Rep.5 (2015): 12870

Van Ginkel, P. R. et al., Biochim.Biophys.Acta 1448 (1998): 290-297 Vanaja, D. K. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 1128-1136

Wang, G. et al., Oncogene 35 (2016): 651-661

Wang, G. et al., Tumour.Biol 36 (2015a): 1055-1065

Wang, Q. et al., PLoS.One.8 (2013d): e70191

Wang, W. et al., Int.J Cancer 124 (2009b): 521-530

Wang, W. X. et al., Sichuan.Da.Xue.Xue.Bao.Yi.Xue.Ban. 40 (2009c): 857-860 Wierinckx, A. et al., Endocr.Relat Cancer 14 (2007): 887-900

Williams, K. A. et al., PLoS.Genet.10 (2014): e1004809

Wu, M. X., Apoptosis.8 (2003): 11-18

Wu, M. X. et al., Expert.Opin.Ther.Targets. 17 (2013): 593-606

Wu, S. et al., Cell Cycle 13 (2014a): 2869-2878

Wu, Z. et al., Neoplasia.11 (2009): 66-76

Xu, F. et al., Biochem.J 416 (2008): 15-26

Yang, J. et al., Surg.Oncol 22 (2013): e53-e57

Yang, L. et al., Cancer Res 71 (2011a): 5558-5568

Yang, L. et al., Future.Oncol 8 (2012): 431-440

Yang, X. et al., Biomed.Pharmacother. 67 (2013): 681-684

Yang, Y. S. et al., Lung Cancer 74 (2011b): 12-24

Yousef, G. M. et al., Tumour.Biol 26 (2005): 227-235

Yu, B. et al., Exp.Cell Res 315 (2009): 3086-3098

Zhang, F. et al., J Viral Hepat. 21 (2014a): 241-250

Zhang, K. et al., Tumour.Biol 35 (2014e): 7669-7673

Zhang, M. et al., Zhong.Nan.Da.Xue.Xue.Bao.Yi.Xue.Ban. 36 (2011a): 274-276 Zhang, Y. et al., Cancer Sci.101 (2010): 934-940

Zheng, G. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.364 (2007): 344-350 Follenzi A,et al. Nat Genet.2000 Jun;25(2):217-22.

Zufferey R, et al. J Virol.1999 Apr;73(4):2886-92.

Scholten KB, et al. Clin Immunol.2006 May;119(2):135-45.

Gustafsson C, et al. Trends Biotechnol.2004 Jul;22(7):346-53. Review.

Kuball, J., et al. (2007). Blood 109, 2331–2338.

Schmitt, T. M., et al. (2009). Hum. Gene Ther.20, 1240–1248

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 22, ili i njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što navedeni peptid ima sposobnost da se vezuje za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I, te naznačeno time što navedeni peptid, kada je vezan za MHC, ima sposobnost da ga prepoznaju CD8 T ćelije.

2. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze i/ili naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina koji sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii).

3. Antitelo, solubilno ili vezano za membranu, koje specifično prepoznaje peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 koji je vezan za MHC molekul.

4. T-ćelijski receptor (TCR), solubilni ili vezan za membranu, koji je reaktivan sa HLA ligandom koji je vezan za MHC molekul, naznačeno time što navedeni ligand sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 22.

5. Nukleinska kiselina koja kodira peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, TCR u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili vektor ekspresije koji eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu.

6. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, ili nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5.

7. Rekombinantna ćelija domaćin iz patentnog zahteva 6, naznačeno time što je navedena ćelija domaćin antigen-prezentujuća ćelija za navedenu nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije koji kodira peptid, ili T ćelija ili NK ćelija za navedenu nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije koji kodira TCR.

8. Metod za proizvodnju peptida u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, ili TCR-a u skladu sa patentnim zahtevom 4, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili 7 koja prezentuje peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, ili eksprimira nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, i izolovanja navedenog peptida ili navedenog TCR-a iz ćelije domaćina i/ili njenog medijuma za kultivaciju.

9. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih T limfocita, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačkog konstrukta koji imitira antigen-prezentujuću ćeliju u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1.

10. Aktivirana T ćelija, proizvedena pomoću metoda u skladu sa patentnim zahtevom 9, koja selektivno prepoznaje ćeliju koja prezentuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u patentnom zahtevu 1.

11. Farmaceutska smeša koja sadrži najmanje jedan aktivan sastojak izabran iz grupe koju čine peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 3, TCR u skladu sa patentnim zahtevom 4, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili 7, aktivirana T ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 10, kao i farmaceutski prihvatljiv nosač.

12. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 3, TCR u skladu sa patentnim zahtevom 4, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili 7, aktivirana T ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili farmaceutska smeša u skladu sa patentnim zahtevom 11 za upotrebu u medicini.

13. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 3, TCR u skladu sa patentnim zahtevom 4, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili 7, aktivirana T ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili farmaceutska smeša u skladu sa patentnim zahtevom 11 za upotrebu u lečenju raka.

14. Peptid, antitelo, TCR, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije, rekombinantna ćelija domaćin, aktivirana T ćelija ili farmaceutska smeša za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačeno time što je navedeni rak odabran iz grupe koju čine rak pluća, rak mozga, hepatokarcinom, rak bubrega, kolorektalni karcinom, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jajnika, rak jednjaka i drugi tumori koji pokazuju prekomernu ekspresiju proteina iz kojeg je dobijen peptid sa ID BR. SEKV: 22.

15. Komplet koji sadrži posudu koja sadrži farmaceutsku smešu koja sadrži najmanje jedan aktivan sastojak izabran iz grupe koju čine peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, ćelija domaćin koja sadrži vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili 7, ili aktivirana T ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 10, u rastvoru ili u liofiliziranom obliku.

16. Komplet iz patentnog zahteva 15 koji dodatno sadrži drugu posudu koja sadrži rastvarač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju.