MD3672614T2 - Vezicule extracelulare modificate și utilizări ale acestora - Google Patents

Vezicule extracelulare modificate și utilizări ale acestora

Info

Publication number
MD3672614T2
MD3672614T2 MDE20200694T MDE20200694T MD3672614T2 MD 3672614 T2 MD3672614 T2 MD 3672614T2 MD E20200694 T MDE20200694 T MD E20200694T MD E20200694 T MDE20200694 T MD E20200694T MD 3672614 T2 MD3672614 T2 MD 3672614T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
protein
exosome
seq
amino acid
sequence
Prior art date
Application number
MDE20200694T
Other languages
English (en)
Inventor
Kevin P Dooley
Rane A Harrison
Ke Xu
Damian J Houde
Sonya Haupt
John D Kulman
Douglas E Williams
Russell E Mcconnell
Madeleine Youniss
Original Assignee
Codiak Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=70732111&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MD3672614(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/US2018/061679 external-priority patent/WO2019099942A1/en
Application filed by Codiak Biosciences Inc filed Critical Codiak Biosciences Inc
Publication of MD3672614T2 publication Critical patent/MD3672614T2/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Prezenta dezvăluire se referă la exozomi terapeutici îmbogăţiţi la proteinele care sunt prezente în suprafaţa luminală a exozomilor. Prezenta dezvăluire furnizează metode de realizare a exozomilor îmbogăţiţi la proteinele care sunt prezente în suprafaţa luminală a exozomilor, o metodă de asociere a unei peptide sau proteine terapeutice la suprafaţa luminală a exozomilor, şi o metodă de utilizare, de exemplu, metode de utilizare terapeutică sau pentru diagnosticare. Metodele de realizare necesită generarea de exozomi modificaţi la suprafaţa luminală care includ una sau mai multe dintre EV, de exemplu, proteine exozomice în concentraţii mai mari decât cele observate la exozomii de tip sălbatic, o modificare sau un fragment al EV, de exemplu, o proteină exozomică, sau o proteină de fuziune a EV, de exemplu, o proteină exozomică, şi o sarcină utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic, cum ar fi o proteină terapeutică.

Description

DOMENIUL TEHNIC
Prezenta dezvăluire furnizează vezicule extracelulare, de exemplu, exozomi, îmbogăţite cu o proteină schelă asociată cu suprafaţa luminală a veziculei extracelulare, care pot fi utile ca agent pentru profilaxia sau tratamentul cancerului şi al altor boli.
BAZE
Exozomii sunt mediatori importanţi ai comunicării intracelulare. Aceştia sunt de asemenea biomarkeri importanţi în diagnosticul şi prognosticul multor boli, cum ar fi cancerul. Ca vezicule de livrare a medicamentului, exozomii oferă multe avantaje faţă de metodele de livrare tradiţionale ca o nouă modalitate de tratament în multe domenii terapeutice.
O caracteristică esenţială a exozomilor este capacitatea lor de a conţine încărcătură utilă biologic activă în spaţiul lor interior, sau lumen. Este bine cunoscut faptul că exozomii conţin încărcătură utilă endogenă, incluzând mARN, miARN, ADN, proteine, carbohidraţi, şi lipide, dar capacitatea de a direcţiona o anumită cantitate din încărcătura utilă terapeutică dorită este în prezent limitată. Exozomii pot fi încărcaţi prin supra-exprimarea încărcăturilor utile terapeutice într-o celulă producătoare, dar această încărcare are adesea o eficienţă limitată din cauza localizării stocastice a încărcăturii la centrii de procesare ai exozomului celular. Alternativ, exozomii purificaţi pot fi încărcaţi ex vivo prin, de exemplu, electroporare. Aceste metode pot prezenta o eficacitate scăzută sau pot fi limitate la încărcături mici, cum ar fi siARN-uri. Prin urmare, sunt necesare metode adecvate pentru generarea de exozomi încărcaţi foarte eficient şi bine definit, pentru a permite o mai bună utilizare terapeutică şi alte aplicaţii ale tehnologiilor pe bază de exozomi.
US 2018/0015182 A1 descrie exozomi modificaţi pentru livrarea de încărcătură bioactivă utilizând tetraspanine transmembranare. WO 2018/112154 A1 se referă la metode de măsurare a exozomilor utilizând fluorescenţă intrinsecă. WO 2018/039119 A1 dezvăluie metode de suprimare a livrării de exozomi către ficat şi splină. György şi colab. (Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 439-464) tratează aplicaţii terapeutice ale veziculelor extracelulare. Garcia-Manrique şi colab. (J Extracell Vezicule. 2018; 7(1): 1422676) oferă o recenzie a biomaterialelor terapeutice pe bază de vezicule extracelulare. Li şi colab. (PLoS One. 2016; 11(9): e0163043) descrie identificarea şi caracterizarea exozomilor derivaţi din celule 293T. WO 2016/138525 A1 se referă la ansambluri de polipeptide şi metode de producere a acestora. Ryo Tamura, "A thesis submitted to the Faculty of the Graduate School of the University of Colorado in partial fulfillment of the requirement for the degree of Doctor of Philosophy Department of Chemistry şi Biochemistry", 2017, este un studiu privind domeniul efector al proteinei MARCKS ca peptidă de penetrare celulară şi dezvoltarea medicamentelor fotoactivabile de doxazolidină.
DESCRIERE PE SCURT
Invenţia furnizează o veziculă extracelulară (EV) izolată cuprinzând o moleculă activă biologic legată la o proteină schelă, în care proteina schelă cuprinde un domeniu N-terminal (ND) şi un domeniu efector (ED), în care domeniul ND este asociat cu suprafaţa luminală a EV şi domeniul ED este asociat cu suprafaţa luminală a EV, în care domeniul ND cuprinde secvenţa de aminoacizi GGKLSK (SEQ ID NO: 203), dar nu cuprinde o metionină (Met) la capătul N-terminal, în care domeniul ED cuprinde o lizină (Lys) la capătul său N-terminal care este legată direct la lizină la capătul C-terminal al SEQ ID NO: 203 din domeniul ND; şi în care molecula activă biologic cuprinde una sau mai multe proteine heteroloage fuzionate la capătul C-terminal al proteinei schelă. Invenţia furnizează de asemenea o compoziţie farmaceutică cuprinzând o EV conform invenţiei şi un purtător acceptabil farmaceutic. Invenţia furnizează de asemenea o EV conform invenţiei pentru utilizare în prevenirea sau tratarea unei boli la un subiect care are nevoie de aceasta. Exemple de realizare suplimentare conform invenţiei sunt definite în revendicările anexate.
Un aspect conform prezentei dezvăluiri se referă la metode noi de încărcare a veziculelor extracelulare (EV-uri), de exemplu, exozomi pentru uz terapeutic. În mod specific, metodele utilizează markeri care sunt identificaţi recent din suprafaţa luminală a exozomilor. În particular, un grup de proteine (de exemplu, substrat de protein kinază C bogat în alanină miristoilată (MARCKS); substrat de tip 1 de protein kinază C bogat în alanină miristoilată (MARCKSL1); şi proteina 1 solubilă în acid cerebral (BASP1)) au fost identificate ca fiind foarte îmbogăţite pe suprafaţa luminală a exozomilor. Mai departe, o scurtă secvenţă a capătului amino al BASP1, de exemplu, cel puţin şapte aminoacizi, s-a dovedit a fi suficientă pentru a determina o încărcare cu eficienţă mare o moleculelor de proteine fluorescente în aceeaşi măsură cu proteina BASP1 de lungime întreagă. Acest fragment, care este de cel puţin şapte aminoacizi şi mai puţin decât zece aminoacizi, prezintă un avantaj semnificativ în domeniul încărcării de EV modificate, şi permite încărcarea eficientă, reproductibilă, a oricărei molecule biologic active, de exemplu, o încărcătură utilă de proteine terapeutice, în lumenul EV-urilor, de exemplu, exozomi, fără alte etape de manipulare ex vivo. Încărcarea EV-urilor, de exemplu, exozomi, utilizând proteinele de fuziune descrise în prezenta, produce EV-uri modificate, de exemplu, exozomi modificaţi, cu niveluri ale încărcăturii utile semnificativ mai mari comparativ cu ore altă metodă de modificare genetică descrisă până în prezent.
Secvenţele proteice şi peptidice recent identificate din exozomi sunt utilizate în diverse variante de realizare ale prezentei dezvăluiri. De exemplu, unele variante de realizare sunt legate de generarea unei proteine de fuziune prin conjugarea proteinei sau unui fragment proteic de EV, de exemplu, exozom (adică, o proteină schelă) şi o moleculă activă biologic (de exemplu, proteină relevantă terapeutic) şi producerea unei EV, de exemplu, un exozom, conţinând proteina de fuziune pe suprafaţa luminală a EV. Proteina nativă de lungime întreagă sau un fragment biologic activ al moleculei active biologic (de exemplu, o proteină relevantă terapeutic) poate fi transportată pe suprafaţa luminală a EV-urilor, de exemplu, exozomi, prin conjugarea acesteia cu proteine sau fragmente proteice îmbogăţite în exozom.
Prezenta dezvăluire se referă în plus la generarea sau utilizarea de EV-uri cu lumen modificat, de exemplu, exozomi cu lumen modificat, proiectate pentru o încărcare mai eficientă, sau pentru încărcarea unei molecule active biologic (de exemplu, o proteină relevantă terapeutic) în lumenul unei EV, de exemplu, unui exozom. De exemplu, suprafaţa luminală a EV-urilor poate fi modificată astfel încât să conţină o concentraţie mai mare proteină şi/sau un fragment sau o proteină modificată de EV, de exemplu, exozom, nativă de lungime întreagă a proteinei native de EV, de exemplu, de exozom de pe suprafaţa luminală.
Unele variante de realizare conform prezentei dezvăluiri se referă la o celulă producătoare sau o metodă de generare a celulei producătoare pentru producerea unor astfel de EV-uri cu lumen modificat. O polinucleotidă exogenă poate fi introdusă temporar sau stabil într-o celulă producătoare pentru a genera o EV cu lumen modificat, de exemplu, un exozom cu lumen modificat, din celula producătoare.
Prin urmare, într-un aspect, prezenta dezvăluire furnizează o EV, de exemplu, un exozom, cuprinzând o proteină schelă, în care cel puţin o parte o proteinei schelă este exprimată dintr-o secvenţă exogenă, şi proteina schelă cuprinde MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau un fragment, o variantă, un derivat, sau o modificare a acesteia.
În unele aspecte, proteina schelă este prezentă în EV, de exemplu, un exozom, la o densitate mai mare decât o altă proteină schelă dintr-o EV diferită, de exemplu, un exozom, în care proteina schelă diferită cuprinde o EV convenţională, de exemplu, proteină de exozom sau o variantă a acesteia. În unele variante de realizare, EV convenţională, de exemplu, proteină de exozom este selectată din grupul constând din CD9, CD63, CD81, PDGFR, proteine de ancorare GPI, lactaderină, LAMP2, LAMP2B, şi un fragment al acestora.
În unele variante de realizare, EV, de exemplu, un exozom, este produsă dintr-o celulă modificată genetic astfel încât să cuprindă secvenţa exogenă, opţional în care celula este o celulă HEK293.
În unele variante de realizare, celula cuprinde o plasmidă cuprinzând secvenţa exogenă.
În unele variante de realizare, secvenţa exogenă este introdusă într-un situs genomic situat în poziţia 3' sau 5' faţă de o secvenţă genomică care codifică MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1. În unele variante de realizare, secvenţa exogenă este introdusă într-o secvenţă genomică care codifică MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1.
În unele variante de realizare, proteina schelă este o proteină de fuziune cuprinzând MARCKS, MARCKSL1, BASP1, sau un fragment al acesteia, şi o peptidă terapeutică.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic cuprinde o peptidă terapeutică selectată din grupul constând din o peptidă naturală, o peptidă recombinantă, o peptidă sintetică, sau un linker la un compus terapeutic. În unele variante de realizare, molecula activă biologic (de exemplu, un compus terapeutic) este selectată din grupul constând din nucleotide, aminoacizi, lipide, carbohidraţi, şi molecule mici. În unele variante de realizare, molecula activă biologic (de exemplu, o peptidă terapeutică) este un anticorp sau un fragment ori o modificare a acestuia. În unele variante de realizare, peptida terapeutică este o enzimă, un ligand, un receptor, un factor de transcripţie, sau un fragment ori o modificare a acestora. În unele variante de realizare, peptida terapeutică este o peptidă antimicrobiană sau un fragment ori o modificare a acesteia.
În unele variante de realizare, EV, de exemplu, un exozom, mai cuprinde o a doua proteină schelă, în care a doua proteină schelă cuprinde MARCKS, MARCKSL1, BASP1, sau un fragment al acestora. În unele variante de realizare, EV, de exemplu, un exozom, mai cuprinde o a doua proteină schelă, în care a doua proteină schelă cuprinde PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportorul ATP sau un fragment al acestora.
În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde o secvenţă peptidică corespunzătoare modelului (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118) sau respectivul model fără capătul N-terminal (M). În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde o peptidă de (M)(O(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), sau peptida fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), X este orice aminoacid, Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu). În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde o peptidă având secvenţa (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), sau peptida fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu). A se vedea R. Aasland şi colab., FEBS Letters 513 (2002): 141-144 pentru nomenclatorul de aminoacizi.
În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde o peptidă a oricăreia dintre SEQ ID NO: 4-110. În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde o peptidă a MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), sau peptida fără capătul N-terminal M, în care X este orice aminoacid. În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde o peptidă a SEQ ID NO: 110, sau peptida corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde peptida SEQ ID NO: 13, sau peptida corespunzătoare fără capătul N-terminal (M).
În unele variante de realizare, proteina schelă mai cuprinde o încărcătură utilă, de exemplu, o peptidă.
Într-o altă variantă de realizare, prezenta dezvăluire furnizează o compoziţie farmaceutică cuprinzând o EV conform prezentei dezvăluiri, de exemplu, un exozom, şi un excipient.
În unele variante de realizare, compoziţia farmaceutică este substanţial lipsită de macromolecule, în care macromoleculele sunt selectate dintre acizi nucleici, proteine exogene, lipide, carbohidraţi, metaboliţi, şi o combinaţie a acestora.
Într-o altă variantă de realizare suplimentară, prezenta dezvăluire furnizează o populaţie de celule pentru producerea de EV, de exemplu, un exozom, furnizate în prezenta.
În unele variante de realizare, populaţia de celule cuprinde o secvenţă exogenă care codifică proteina schelă cuprinzând MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau un fragment ori o modificare a acestora. În unele variante de realizare, populaţia de celule mai cuprinde o a doua secvenţă exogenă care codifică o a doua proteină schelă, în care a doua proteină schelă cuprinde MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau un fragment ori o modificare a acestora. În unele variante de realizare, populaţia de celule mai cuprinde o a doua secvenţă exogenă care codifică o a doua proteină schelă, în care o a doua proteină schelă cuprinde PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportorul ATP sau un fragment al acestora.
În unele variante de realizare, secvenţa exogenă este introdusă într-o secvenţă genomică care codifică MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1, în care secvenţa exogenă şi secvenţa genomică codifică proteina schelă. În unele variante de realizare, secvenţa exogenă este într-o plasmidă.
În unele variante de realizare, secvenţa exogenă codifică o moleculă activă biologic (de exemplu, o peptidă terapeutică). În unele variante de realizare, peptida terapeutică este selectată dintr-un grup care constă din o peptidă naturală, o peptidă recombinantă, o peptidă sintetică, sau un linker la un compus terapeutic. În unele variante de realizare, compusul terapeutic este selectat din grupul constând din nucleotide, aminoacizi, lipide, carbohidraţi, şi molecule mici. În unele variante de realizare, peptida terapeutică este un anticorp sau un fragment ori o modificare a acestuia. Într-o variantă de realizare particulară, anticorpul este a nanocorp. O persoană având cunoştinţe normale în domeniu ar înţelege faptul că anticorpul utilizat într-o EV conform prezentei dezvăluiri poate fi orice moleculă de legare la antigen cunoscută în domeniu, incluzând, de exemplu, formate de anticorpi alternative, conjugate antigen-medicament (ADC) sau imunotoxine.
În unele variante de realizare, peptida terapeutică este o enzimă, un ligand, un receptor, un factor de transcripţie, sau un fragment ori o modificare a acestora. În unele variante de realizare, peptida terapeutică este o peptidă antimicrobiană sau un fragment ori o modificare a acesteia.
În unele variante de realizare, secvenţa exogenă codifică o fracţiune de ţintire. În unele variante de realizare, fracţiunea de ţintire este specifică unui organ, unui ţesut, sau unei celule.
În unele variante de realizare, a doua proteină schelă mai cuprinde o fracţiune de ţintire. În unele variante de realizare, fracţiunea de ţintire este specifică unui organ, unui ţesut, sau unei celule.
Într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire furnizează o polipeptidă pentru modificarea unei EV, de exemplu, un exozom, cuprinzând o secvenţă a
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M);
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), X este orice aminoacid, Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu); or
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu).
În unele variante de realizare, polipeptida schelei cuprinde o secvenţă a oricăreia dintre SEQ ID NO: 4-110, sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida cuprinde o secvenţă a SEQ ID NO: 13, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida cuprinde o secvenţă a SEQ ID NO: 110, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida cuprinde o secvenţă a MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), în care X este orice aminoacid, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
Într-un aspect, prezenta dezvăluire furnizează un construct polinucleotidic cuprinzând o secvenţă de codare care codifică polipeptida furnizată în prezenta. În unele variante de realizare, secvenţa de codare este codon-optimizată.
Într-un alt aspect, prezenta dezvăluire furnizează o metodă de obţinere a unei EV, de exemplu, exozom, modificate cuprinzând etapele de:
a. introducerea într-o celulă a unui construct de acizi nucleici care codifică o polipeptidă de fuziune cuprinzând
(i) o primă secvenţă care codifică MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau un fragment ori o modificare a acestora, şi
(ii) o a doua secvenţă care codifică o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic cum ar fi o peptidă terapeutică;
b. menţinerea celulei în condiţii care permit celulei să exprime polipeptida de fuziune; şi,
c. obţinerea exozomului modificat cuprinzând polipeptida de fuziune din respectiva celulă.
În unele variante de realizare, prima secvenţă cuprinde o secvenţă a
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M);
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), X este orice aminoacid, Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu); or
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu).
În unele variante de realizare, polinucleotida cuprinde o secvenţă a oricăreia dintre SEQ ID NO: 4-110, sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polinucleotida cuprinde o secvenţă a SEQ ID NO: 13, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polinucleotida cuprinde o secvenţă a SEQ ID NO: 110, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polinucleotida cuprinde o secvenţă a MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, în care X este orice aminoacid.
În unele variante de realizare, polipeptida de fuziune este prezentă pe suprafaţa luminală a EV modificate, de exemplu, un exozom modificat, la o densitate mai mare decât o altă proteină schelă dintr-o EV, de exemplu, un exozom, diferită în care proteina schelă diferită cuprinde o EV convenţională, de exemplu, proteină de exozom sau o variantă a acesteia. În unele variante de realizare, polipeptida de fuziune este prezentă la o densitate de mai mult de 2 ori mai mare decât proteina schelă diferită din EV diferită, de exemplu, un exozom.
În unele variante de realizare, polipeptida de fuziune este prezentă la o densitate de mai mult de 4 ori, 16 ori, 100 de ori, sau 10.000 de ori mai mare decât proteina schelă diferită din EV diferită, de exemplu, un exozom.
Prezenta dezvăluire vizează o veziculă extracelulară (EV) izolată cuprinzând o moleculă activă biologic legată la o proteină schelă, în care proteina schelă cuprinde un domeniu N-terminal (ND) şi un domeniu efector (ED), în care domeniul ND şi domeniul ED sunt asociate cu suprafaţa luminală a EV printr-o interacţiune ionică, în care domeniul ED cuprinde cel puţin două lizine contigue (Lys) în secvenţă. În unele variante de realizare, domeniul ND este asociat cu suprafaţa luminală a EV prin miristoilare. În alte variante de realizare, domeniul ND are Gly la capătul N-terminal.
În unele variante de realizare, domeniul ED cuprinde cel puţin trei Lys, cel puţin patru Lys, cel puţin cinci Lys, cel puţin şase Lys, sau cel puţin şapte Lys. În alte variante de realizare, domeniul ED este legat la domeniul ND printr-o legătură peptidică. În unele variante de realizare, domeniul ED cuprinde (Lys)n, în care n este un număr întreg cuprins între 1 şi 10. În alte variante de realizare, domeniul ED cuprinde KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), sau orice combinaţie a acestora.
În alte variante de realizare, domeniul ND cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în G:X2:X3:X4:X5:X6, în care G este o glicină reprezentată ca Gly; în care ":" reprezintă o legătură peptidică, în care fiecare dintre X2 până la X6 este în mod independent un aminoacid; şi în care X6 cuprinde un aminoacid bazic. În unele variante de realizare, X6 este selectat din grupul constând din Lys, Arg, şi His.
În alte variante de realizare, dezvăluirea este o veziculă extracelulară izolată (EV) cuprinzând o moleculă activă biologic legată la o proteină schelă, în care proteina schelă cuprinde un domeniu N-terminal (ND) şi un domeniu efector (ED), în care domeniul ND cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în G:X2:X3 :X4:X5 :X6, în care G este o glicină, reprezentată prin Gly; în care ":" reprezintă o legătură peptidică, în care fiecare dintre X2 până la X6 este în mod independent un aminoacid; în care X6 cuprinde un aminoacid bazic, şi în care domeniul ED este legat la X6 printr-o legătură peptidică şi cuprinde cel puţin o lizină la capătul N-terminal al domeniul ED. În unele variante de realizare, domeniul ED nu cuprinde un domeniu transmembranar sau un domeniu citoplasmatic al unui virus. În unele variante de realizare, X2 este selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser. În alte variante de realizare, X4 este selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln, şi Met. În unele variante de realizare, X5 este selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser.
În unele variante de realizare, domeniul ND al proteinei schelă cuprinde secvenţa de aminoacizi a G:X2:X3:X4:X5:X6, în care
G reprezintă Gly;
":" reprezintă o legătură peptidică;
X2 este un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser;
X3 este un aminoacid;
X4 este un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln, şi Met;
X5 este un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser; şi
X6 este un aminoacid selectat din grupul constând din Lys, Arg, şi His.
În unele variante de realizare, X3 este selectat din grupul constând din Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, şi Arg.
În unele variante de realizare, domeniul ND şi domeniul ED sunt unite printr-un linker. În unele variante de realizare, linkerul cuprinde unul sau mai mulţi aminoacizi.
În unele variante de realizare, dezvăluirea vizează o veziculă extracelulară (EV) izolată cuprinzând o moleculă activă biologic legată la o proteină schelă, în care proteina schelă cuprinde ND-ED, în care:
ND cuprinde G:X2:X3:X4:X5:X6; în care:
G reprezintă Gly;
":" reprezintă o legătură peptidică;
X2 este un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser;
X3 este un aminoacid;
X4 este un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Glu, şi Met;
X5 este un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser;
X6 este un aminoacid selectat din grupul constând din Lys, Arg, şi His;
"-" este un linker opţional cuprinzând unul sau mai mulţi aminoacizi; şi
ED este un domeniu efector cuprinzând (i) cel puţin două lizine contigue (Lys), care este legat la X6 printr-o legătură peptidică sau unul sau mai mulţi aminoacizi sau (ii) cel puţin one lizină, care este direct legat la X6 printr-o legătură peptidică.
În alte variante de realizare, X2 este selectat din grupul constând din Gly şi Ala. În unele variante de realizare, X3 este Lys. În unele variante de realizare, X4 este Leu sau Glu. În unele variante de realizare, X5 este selectat din grupul constând din Ser şi Ala. În unele variante de realizare, X6 este Lys. În alte variante de realizare, X2 este Gly, Ala, sau Ser; X3 este Lys sau Glu, X4 este Leu, Phe, Ser, şi Glu, X5 este Ser sau Ala; şi X6 este Lys.
În unele variante de realizare, domeniul ND şi domeniul ED sunt legate printr-un linker cuprinzând unul sau mai mulţi aminoacizi. În unele variante de realizare, domeniul ED cuprinde Lys (K), KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), sau orice combinaţie a acestora.
În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din (i) GGKLSKK (SEQ ID NO: 157), (ii) GAKLSKK (SEQ ID NO: 158), (iii) GGKQSKK (SEQ ID NO: 159), (iv) GGKLAKK (SEQ ID NO: 160), sau (v) orice combinaţie a acestora. În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din (i) GGKLSKKK (SEQ ID NO: 161), (ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO: 162), (iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO: 163), (iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO: 164), (v) GGKQSKKK (SEQ ID NO: 165), (vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO: 166), (vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO: 167), (viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO: 168), şi (ix) orice combinaţie a acestora. În unele variante de realizare, proteina schelă are lungimea de cel puţin aproximativ 8, cel puţin aproximativ 9, cel puţin aproximativ 10, cel puţin aproximativ 11, cel puţin aproximativ 12, cel puţin aproximativ 13, cel puţin aproximativ 14, cel puţin aproximativ 15, cel puţin aproximativ 16, cel puţin aproximativ 17, cel puţin aproximativ 18, cel puţin aproximativ 19, cel puţin aproximativ 20, cel puţin aproximativ 21, cel puţin aproximativ 22, cel puţin aproximativ 23, cel puţin aproximativ 24, cel puţin aproximativ 25, cel puţin aproximativ 30, cel puţin aproximativ 35, cel puţin aproximativ 40, cel puţin aproximativ 45, cel puţin aproximativ 50, cel puţin aproximativ 55, cel puţin aproximativ 60, cel puţin aproximativ 65, cel puţin aproximativ 70, cel puţin aproximativ 75, cel puţin aproximativ 80, cel puţin aproximativ 85, cel puţin aproximativ 90, cel puţin aproximativ 95, cel puţin aproximativ 100, cel puţin aproximativ 105, cel puţin aproximativ 110, cel puţin aproximativ 120, cel puţin aproximativ 130, cel puţin aproximativ 140, cel puţin aproximativ 150, cel puţin aproximativ 160, cel puţin aproximativ 170, cel puţin aproximativ 180, cel puţin aproximativ 190, sau cel puţin aproximativ 200 aminoacizi.
În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde (i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID NO: 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO: 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID NO: 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID NO: 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID NO: 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID NO: 178), sau (xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID NO: 179).
În unele variante de realizare, proteina schelă nu cuprinde Met la capătul N-terminal. În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde un rest de aminoacid miristoilat la capătul N-terminal al proteinei schelă. În unele variante de realizare, restul de aminoacizi de la capătul N-terminal al proteinei schelă este Gly. În unele variante de realizare, restul de aminoacizi de la capătul N-terminal al proteinei schelă este sintetic. În unele variante de realizare, restul de aminoacizi de la capătul N-terminal al proteinei schelă este un analog de glicină.
În unele variante de realizare, proteina schelă cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 96%, cel puţin aproximativ 97%, cel puţin aproximativ 98%, cel puţin aproximativ 99%, sau aproximativ 100% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 1 (MARKS), SEQ ID NO: 2 (MARCKSL1), sau SEQ ID NO: 3 (BASP1).
În unele variante de realizare, molecula activă biologic este pe suprafaţa luminală sau lumenul EV. În unele variante de realizare, proteina schelă mai cuprinde un domeniu transmembranar. În unele variante de realizare, domeniul transmembranar este situat între domeniul ED al proteinei schelă şi molecula biologic activă. În unele variante de realizare, proteina schelă mai cuprinde un domeniu extravezicular. În unele variante de realizare, molecula activă biologic este legată la domeniul extravezicular.
În unele variante de realizare, proteina schelă este legată la molecula activă biologic printr-un linker. În unele variante de realizare, domeniul ND este legat la domeniul ED printr-un linker. În unele variante de realizare, linkerul cuprinde unul sau mai mulţi aminoacizi. În unele variante de realizare, linkerul cuprinde un linker clivabil. În unele variante de realizare, linkerul cuprinde un linker flexibil.
În alte variante de realizare, molecula activă biologic cuprinde o proteină, o polipeptidă, o peptidă, o polinucleotidă (ADN şi/sau ARN), un compus chimic, un virus, un ionofor, un purtător pentru un ionofor, o fracţiune care formează un canal sau un por, sau orice combinaţie a acestora. În unele variante de realizare, proteina cuprinde o peptidă recombinantă, o peptidă naturală, o peptidă sintetică, un anticorp, o proteină de fuziune, sau orice combinaţie a acestora. În unele variante de realizare, proteina cuprinde o enzimă, o citokină, un ligand, un receptor, un factor de transcripţie, sau o combinaţie a acestora. În unele variante de realizare, virusul cuprinde un virus adeno-asociat, un parvovirus, un retrovirus, un adenovirus, sau orice combinaţie a acestora.
În alte variante de realizare, EV mai cuprinde o a doua proteină schelă. În unele variante de realizare, a doua proteină schelă cuprinde o polipeptidă PTGFRN, o polipeptidă BSG, o polipeptidă IGSF2, o polipeptidă IGSF3, o polipeptidă IGSF8, o polipeptidă ITGB1, o polipeptidă ITGA4, o polipeptidă SLC3A2, o polipeptidă a transportorului ATP, o polipeptidă a aminopeptidazei N (ANPEP), o polipeptidă a membrului 1 al familiei de ectonucleotid pirofosfataze/fosfodiesteraze (ENPP1), o polipeptidă a neprilizinei (MME), o polipeptidă a neuropolinei-1 (NRP1), sau un fragment al acestora. În unele variante de realizare, molecula activă biologic este un inhibitor pentru un regulator negativ al punctului de control sau un inhibitor pentru un partener de legare al unui regulator negativ al punctului de control. În unele variante de realizare, regulatorul negativ al punctului de control este selectat din grupul constând din: proteina 4 asociată limfocitei T citotoxice (CTLA-4), proteina 1 a morţii celulare programate (PD-1), gena 3 activată de limfocite (LAG-3), proteina 3 care conţine imunoglobulină şi mucină cu celule T (TIM-3), atenuator al limfocitelor B şi T (BTLA), imunoreceptor al celulelor T cu domenii Ig şi ITIM (TIGIT), supresor Ig cu domeniu V al activării celulelor T (VISTA), receptorul A2a de adenozină (A2aR), receptorul de tip imunoglobulinic al celulelor ucigaşe (KIR), indoleamin 2,3-dioxigenaza (IDO), CD20, CD39, şi CD73. În unele variante de realizare, molecula activă biologic este o proteină imunogenă.
În alte variante de realizare, molecula activă biologic este o toxină, un toxoid, sau un mutant netoxic al unei toxine. În unele variante de realizare, toxina este o difterio toxină. În unele variante de realizare, toxoidul este a un toxoid tetanus. În unele variante de realizare, molecula activă biologic este un mutant netoxic al toxinei difterio.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic este un activator pentru o moleculă co-stimulatoare pozitivă sau un activator pentru un partener de legare al unei molecule co-stimulatoare pozitive. În unele variante de realizare, molecula co-stimulatoare pozitivă este un membru al superfamiliei de receptori TNF. În unele variante de realizare, membrul superfamiliei de receptori TNF este selectat din grupul constând din: CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, receptorul Fas, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, receptorul TWEAK, TACI, receptorul BAFF, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, şi XEDAR. În unele variante de realizare, activatorul pentru o moleculă co-stimulatoare pozitivă este un membru al superfamiliei TNF. În unele variante de realizare, membrul superfamiliei TNF este selectat din grupul constând din: TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, ligand 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, ligand GITR, şi EDA-2. În unele variante de realizare, molecula co-stimulatoare pozitivă este o moleculă co-stimulatoare a superfamiliei CD28. În unele variante de realizare, molecula co-stimulatoare a superfamiliei CD28 este ICOS sau CD28. În unele variante de realizare, activatorul pentru o moleculă co-stimulatoare pozitivă este ICOSL, CD80, sau CD86.
În alte variante de realizare, citokina este selectată din grupul constând din: IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, şi IL-15. În unele variante de realizare, proteina cuprinde un receptor de celule T (TCR), un co-receptor de celule T, un complex major de histocompatibilitate (MHC), un antigen uman al leucocitelor (HLA), sau un derivat al acestora. În unele variante de realizare, proteina cuprinde un antigen tumoral. În unele variante de realizare, antigenul tumoral este selectat din grupul constând din: alfa-fetoproteină (AFP), antigen carcinoembrionar (CEA), antigen al celulelor epiteliale (ETA), mucina 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucina 16 (MUC16), tirozinază, antigen asociat melanomului (MAGE), proteina tumorală p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligand de moarte programat 1 (PD-L1), ligand de moarte programat 2 (PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mezotelină, VEGFR, receptor de alfa-folat, CE7R, IL-3, Antigen al cancerului testicular, MART-1 gp100, şi ligandul inductor de apoptoză legat de TNF.
În alte variante de realizare, EV este un exozom.
În unele variante de realizare, dezvăluirea vizează o compoziţie farmaceutică cuprinzând EV conform prezentei dezvăluiri şi un purtător acceptabil farmaceutic. În unele variante de realizare, dezvăluirea vizează o celulă care produce EV conform prezentei dezvăluiri. În unele variante de realizare, dezvăluirea vizează un kit cuprinzând EV conform prezentei dezvăluiri şi instrucţiuni pentru utilizare.
În alte variante de realizare, dezvăluirea vizează o metodă de obţinere a EV-urilor cuprinzând cultivarea celulei conform prezentei dezvăluiri în condiţii adecvate şi obţinerea EV-urilor. În unele variante de realizare, dezvăluirea vizează o metodă de ancorare a unei molecule active biologic la o veziculă extracelulară cuprinzând legarea moleculei active biologic la proteina schelă a dezvăluirii din prezenta.
În alte variante de realizare, dezvăluirea vizează o metodă de prevenire sau tratare a unei boli la un subiect care are nevoie de aceasta, cuprinzând administrarea EV conform prezentei dezvăluiri, în care boala este asociată cu antigenul. În unele variante de realizare, EV este administrată parenteral, oral, intravenos, intramuscular, intra-tumoral, intranazal, subcutanat, sau intraperitoneal.
VARIANTE DE REALIZARE
E1. O EV, de exemplu, un exozom, cuprinzând o proteină schelă, în care cel puţin o parte a proteinei schelă este exprimată dintr-o secvenţă exogenă, şi proteina schelă cuprinde MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau un fragment ori o modificare a acestora.
E2. EV, de exemplu, exozom, conform variantei de realizare E1, în care proteina schelă este prezentă în EV, de exemplu, exozom, la o densitate mai mare decât o altă proteină schelă dintr-o EV diferită, de exemplu, exozom, în care proteina schelă diferită cuprinde o proteină de EV, de exemplu, exozom, convenţională sau o variantă a acesteia.
E3. EV, de exemplu, exozom, conform variantei de realizare E2, în care proteina de EV, de exemplu, exozom, convenţională este selectată din grupul constând din CD9, CD63, CD81, PDGFR, proteine de ancorare GPI, lactaderină, LAMP2, LAMP2B, şi un fragment al acestora.
E4. EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E1 la E3, în care EV, de exemplu, exozom, este produsă dintr-o celulă modificată genetic astfel încât să cuprindă secvenţa exogenă, opţional în care celula este o celulă HEK293.
E5. EV, de exemplu, exozom, conform variantelor de realizare E1 la E4, în care celula cuprinde o plasmidă cuprinzând secvenţa exogenă.
E6. EV, de exemplu, exozom, conform variantelor de realizare E1 la E5, în care celula cuprinde secvenţa exogenă introdusă într-un genom al celulei.
E7. EV, de exemplu, exozom, conform variantelor de realizare E1 la E6, în care secvenţa exogenă este introdusă într-un situs genomic situat la 3' sau 5' faţă de o secvenţă genomică care codifică MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1.
E8. EV, de exemplu, exozom, conform variantelor de realizare E1 la E7, în care secvenţa exogenă este introdusă într-o secvenţă genomică care codifică MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1.
E9. EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E1 la E8, în care proteina schelă este o proteină de fuziune cuprinzând MARCKS, MARCKSL1, BASP1, sau un fragment al acesteia, şi o peptidă terapeutică.
E10. EV, de exemplu, exozom, conform variantei de realizare E9, în care peptida terapeutică este selectată din grupul constând din o peptidă naturală, o peptidă recombinantă, o peptidă sintetică, sau un linker la un compus terapeutic.
E11. EV, de exemplu, exozom, conform variantei de realizare E9, în care compusul terapeutic este selectat din grupul constând din nucleotide, aminoacizi, lipide, carbohidraţi, şi molecule mici.
E12. EV, de exemplu, exozom, conform variantei de realizare E9, în care peptida terapeutică este un anticorp sau un fragment ori o modificare a acestuia.
E13. EV, de exemplu, exozom, conform variantei de realizare E9, în care peptida terapeutică este o enzimă, un ligand, un receptor, un factor de transcripţie, sau un fragment ori o modificare a acestora.
E14. EV, de exemplu, exozom, conform variantei de realizare E9, în care peptida terapeutică este o peptidă antimicrobiană sau un fragment ori o modificare a acesteia.
E15. EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E1 la E14, cuprinzând în plus o a doua proteină schelă, în care a doua proteină schelă cuprinde MARCKS, MARCKSL1, BASP1, sau un fragment al acestora.
E16. EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E1 la E14, cuprinzând în plus o a doua proteină schelă, în care a doua proteină schelă cuprinde PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportorul ATP sau un fragment al acestora.
E17. EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E1 la E16, în care proteina schelă cuprinde o peptidă având secvenţa (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M).
E18. EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E1 la E17, în care proteina schelă cuprinde o peptidă având secvenţa (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), X este orice aminoacid, Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu).
E19. EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E1 la E18, în care proteina schelă cuprinde o peptidă având secvenţa (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu).
E20. EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E18 sau E19, în care proteina schelă cuprinde o peptidă a oricăreia dintre SEQ ID NO: 4-110, sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
E21. EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E18 sau E19, în care proteina schelă cuprinde o peptidă a MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, în care X este orice aminoacid.
E22. EV, de exemplu, exozom, conform variantei de realizare E20, în care proteina schelă cuprinde o peptidă a SEQ ID NO: 110, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
E23. EV, de exemplu, exozom, conform variantei de realizare E20, în care proteina schelă cuprinde peptida SEQ ID NO: 13, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
E24. EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E1 la E24, în care proteina schelă mai cuprinde o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic cum ar fi o peptidă.
E25. O compoziţie farmaceutică cuprinzând EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E1 la E24 şi un excipient.
E26. Compoziţia farmaceutică conform variantei de realizare E25, substanţial lipsită de macromolecule, în care macromoleculele sunt selectate dintre acizi nucleici, proteine exogene, lipide, carbohidraţi, metaboliţi, şi o combinaţie a acestora
E27. O populaţie de celule pentru producerea de EV, de exemplu, exozom, conform oricăreia dintre variantele de realizare E1 la E24.
E28. Populaţia de celule conform variantei de realizare E27, cuprinzând o secvenţă exogenă care codifică proteina schelă cuprinzând MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau un fragment ori o modificare a acestora.
E29. Populaţia de celule conform variantei de realizare E28, cuprinzând în plus o a doua secvenţă exogenă care codifică o a doua proteină schelă, în care a doua proteină schelă cuprinde MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau un fragment ori o modificare a acestora.
E30. Populaţia de celule conform variantei de realizare E28, cuprinzând în plus o a doua secvenţă exogenă care codifică o a doua proteină schelă, în care a doua proteină schelă cuprinde PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportor ATP sau un fragment al acestora.
E31. Populaţia de celule conform oricăreia dintre variantele de realizare E27 la E30, în care secvenţa exogenă este introdusă într-o secvenţă genomică care codifică MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1, în care secvenţa exogenă şi secvenţa genomică codifică proteina schelă.
E32. Populaţia de celule conform oricăreia dintre variantele de realizare E27 la E30, în care secvenţa exogenă este într-o plasmidă.
E33. Populaţia de celule conform oricăreia dintre variantele de realizare E27 la E32, în care secvenţa exogenă codifică o moleculă activă biologic, de exemplu, o peptidă terapeutică.
E34. Populaţia de celule conform variantei de realizare E33, în care peptida terapeutică este selectată dintr-un grup care constă din o peptidă naturală, o peptidă recombinantă, o peptidă sintetică, sau un linker la un compus terapeutic.
E35. Populaţia de celule conform variantei de realizare E33, în care compusul terapeutic este selectat din grupul constând din nucleotide, aminoacizi, lipide, carbohidraţi, şi molecule mici.
E36. Populaţia de celule conform variantei de realizare E33, în care peptida terapeutică este un anticorp sau un fragment ori o modificare a acestuia.
E37. Populaţia de celule conform variantei de realizare E33, în care peptida terapeutică este o enzimă, un ligand, un receptor, un factor de transcripţie, sau un fragment ori o modificare a acestora.
E38. Populaţia de celule conform variantei de realizare E33, în care peptida terapeutică este o peptidă antimicrobiană sau un fragment ori o modificare a acesteia.
E39. Populaţia de celule conform variantei de realizare E28, în care secvenţa exogenă codifică o fracţiune de ţintire.
E40. Populaţia de celule conform variantei de realizare E39, în care fracţiunea de ţintire este specifică unui organ, unui ţesut, sau unei celule.
E41. Populaţia de celule conform variantelor de realizare E29 sau E30, în care a doua proteină schelă mai cuprinde o fracţiune de ţintire.
E42. Populaţia de celule conform variantei de realizare E41, în care fracţiunea de ţintire este specifică unui organ, unui ţesut, sau unei celule.
E43. O polipeptidă pentru modificarea unei EV, de exemplu, exozom, cuprinzând o secvenţă a
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M);
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), X este orice aminoacid, Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu); or
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu).
E44. Polipeptida conform variantei de realizare E43, cuprinzând o secvenţă a oricăreia dintre SEQ ID NO: 4-110, sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
E45. Polipeptida conform variantei de realizare E43, cuprinzând o secvenţă a SEQ ID NO: 13, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
E46. Polipeptida conform variantei de realizare E43, cuprinzând o secvenţă a SEQ ID NO: 110, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
E47. Polipeptida conform variantei de realizare E43, cuprinzând o secvenţă a MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, în care X este orice aminoacid.
E48. Polipeptida conform oricăreia dintre variantele de realizare E43 la E47, în care polipeptida este fuzionată la o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic cum ar fi o peptidă.
E49. Polipeptida conform variantei de realizare E48, în care polipeptida este fuzionată la capătul N-terminal al peptidei.
E50. Un construct polinucleotidic cuprinzând o secvenţă de codare care codifică polipeptida conform oricăreia dintre variantele de realizare E43 la E49.
E51. Constructul polinucleotidic conform variantei de realizare E50, în care secvenţa de codare este codon-optimizată.
E52. O metodă de obţinere a unei EV, de exemplu, exozom, modificate cuprinzând etapele de:
a. introducere într-o celulă a unui construct de acizi nucleici care codifică o polipeptidă de fuziune cuprinzând (i) o primă secvenţă care codifică MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau un fragment ori o modificare a acestora, şi (ii) o a doua secvenţă care codifică o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic cum ar fi o peptidă;
b. menţinere a celulei în condiţii care permit celulei să exprime polipeptida de fuziune; şi
c. obţinere a EV, de exemplu, exozom, modificate cuprinzând polipeptida de fuziune din respectiva celulă.
E53. Metoda conform variantei de realizare E52, în care prima secvenţă cuprinde o secvenţă a
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M);
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), X este orice aminoacid, Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu); sau
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal (M), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu).
E54. Metoda conform oricăreia dintre variantele de realizare E52 sau E53, în care prima secvenţă cuprinde oricare dintre SEQ ID NO: 4-110, sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
E55. Metoda conform variantei de realizare E54, în care prima secvenţă cuprinde SEQ ID NO: 13, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
E56. Metoda conform variantei de realizare E55, în care prima secvenţă cuprinde SEQ ID NO: 110, sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
E57. Metoda conform variantei de realizare E53, în care prima secvenţă cuprinde MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, în care X este orice aminoacid.
E58. Metoda conform oricăreia dintre variantele de realizare E52 la E57, în care polipeptida de fuziune este prezentă pe suprafaţa luminală a EV, de exemplu, exozom, modificate la o densitate mai mare decât o altă proteină schelă dintr-o EV, de exemplu, exozom, diferită în care proteina schelă diferită cuprinde o proteină de EV, de exemplu, de exozom convenţională sau o variantă a acesteia.
E59. Metoda conform variantei de realizare E58, în care polipeptida de fuziune este prezentă la o densitate de mai mult de 2 ori mai mare decât proteina schelă diferită din EV, de exemplu, exozom diferită.
E60. Metoda conform variantei de realizare E59, în care polipeptida de fuziune este prezentă la o densitate de mai mult de 4 ori, 16 ori, 100 ori, sau 10.000 ori mai mare decât proteina schelă diferită din EV, de exemplu, exozom diferită.
SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR
Figurile reprezintă diferite aspecte ale prezentei dezvăluiri exclusiv în scop ilustrativ. O persoană de specialitate în domeniu va recunoaşte imediat din discuţia următoare faptul că pot fi utilizate aspecte alternative ale structurilor şi metodelor ilustrate în prezenta fără a se îndepărta de la principiile dezvăluirii descrise aici.
FIG. 1A reprezintă secvenţe ale proteinelor de fuziune cuprinzând un fragment BASP1 fuzionat la un marcaj FLAG® şi GFP (SEQ ID NO: 135-142, respectiv, în ordinea apariţiei). FIG. 1B reprezintă rezultatele Western blot anti-FLAG® pentru exozomii purificaţi din celule care exprimă stabil una dintre proteinele de fuziune din FIG. 1A. Pentru ambele FIG. 1A şi 1B, poziţiile aminoacizilor, de exemplu, BASP1, 1-30, se referă la un fragment BASP-1 care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 2A reprezintă secvenţe dintr-un fragment BASP1 (1-30) (SEQ ID NO: 4) şi modificări ale acestuia (1-30-S6D, 1-30-S6A, şi 1-30-L5Q) fuzionate la un marcaj FLAG® şi GFP (SEQ ID NO: 143-145, respectiv, în ordinea apariţiei).
FIG. 2B reprezintă rezultatele Western blot anti-FLAG® pentru exozomii purificaţi din celule care exprimă stabil una dintre proteinele de fuziune din FIG. 2A. Pentru ambele FIG. 2A şi 2B, poziţiile aminoacizilor, de exemplu, BASP1, 1-30, se referă la un fragment BASP-1 care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 3 reprezintă o imagine a unui gel proteic colorat cu COOMMASSIE® cu probe de exozomi purificate din celule care exprimă stabil MARCKSL1, BASP1 de lungime întreagă, sau aminoacizii 1-30 ai MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1, toţi fuzionaţi la FLAG®-GFP. Săgeţile albe din imagine indică benzile corespunzătoare proteinelor de fuziune. Pentru FIG. 3, poziţiile aminoacizilor, de exemplu, BASP1, 1-30, se referă la un fragment BASP-1 care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 4 reprezintă un aliniament al unei secvenţe proteice dintre primii 28 de aminoacizi ai BASP1 (regiunea conservată 1), aminoacizii 1-7 şi 152-173 ai MARCKS (regiunea conservată 2), şi aminoacizii 1-7 şi 87-110 ai MARCKSL1 (regiunea conservată 3).
FIG. 5A reprezintă secvenţele de aminoacizi 1-30 ai BASP1 ("BASP1-30") (SEQ ID NO: 4) şi proteinele de fuziune cuprinzând aminoacizii 1-3 din MARCKS sau modificările acestuia fuzionate la domeniul PSD al MARCKS sau modificarea acestuia ("MARCKS-MG-PSD", "MARCKS-MA-PSD", "MARCKS-MG-PSD-K6S" şi "MARCKS-MG-PSD-K6A") (SEQ ID NO: 146-149, respectiv, în ordinea apariţiei). Mutaţiile punctuale introduse în secvenţele MARCKS sunt îngroşate. Poziţiile aminoacizilor, de exemplu, aa 1-30 ai BASP1 sau aa 1-3 ai MARCKS, se referă la un fragment care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 5B reprezintă rezultatele Western blotting anti-FLAG® ale exozomilor purificaţi din celule care exprimă stabil proteine de fuziune cuprinzând secvenţele de aminoacizi din FIG. 5A şi FLAG®.
FIG. 6 reprezintă trei secvenţe consens diferite (toate cele trei secvenţe sunt reprezentate prin SEQ ID NO: 118) derivate din studiile funcţionale ale MARCKS, MARCKSL1, şi BASP1, şi necesarul de aminoacizi al fiecăreia dintre secvenţe pentru încărcarea unei încărcături utile în lumenul exozomilor prin ataşare la suprafaţa luminală.
FIG. 7A reprezintă proteina totală (sus) şi un Western blot anti-Cas9 (jos) ale exozomilor nativi sau exozomilor purificaţi din celule care exprimă stabil Cas9 fuzionată la aminoacizii 1-10 sau 1-30 ai BASP1, precum şi cantităţi descrescătoare de Cas9 recombinant. Poziţiile aminoacizilor, de exemplu, aa 1-10 ai BASP sau aa 1-30 ai BASP1, se referă la un fragment care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 7B Panoul de sus reprezintă o curbă standard derivată din densiometria Cas9 a rezultatelor Western blotting din FIG. 7A. Panoul de jos furnizează în continuare cantităţile de Cas9 încărcate pentru fiecare exozom purificat ca proteine de fuziune conjugate la 1-30 aminoacizi sau 1-10 fragmente de aminoacizi ai BASP1 (2-30 aminoacizi sau 2-10 fragmente de aminoacizi ai BASP1 după procesare (adică, primul Met care este clivat)), estimate pe baza curbei standard.
FIG. 8A reprezintă imagini pe gel proteic ale exozomilor purificaţi din celule transfectate stabil cu un construct care exprimă fuziunea capătului N-terminal al BASP1 (aminoacizii 1-10) la ovalbumină ("BASP1 (1-10)-OVA") sau celule transfectate stabil cu două constructuri, unul care exprimă fuziunea capătului N-terminal al BASP1 (aminoacizii 1-10) la ovalbumină, şi celălalt care exprimă CD40L fuzionată la o proteină transmembranară PTGFRN ("BASP1 (1-10)-OVA; 3XCD40L-PTGFRN"). FIG. 8A mai reprezintă o imagine a cantităţilor descrescătoare din gelul proteic de OVA recombinantă. Numerotarea aminoacizilor, de exemplu, aminoacizii 1-10, se referă la un fragment care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 8B reprezintă rezultatele Western blot cu anti-Ovalbumină ale probelor din FIG. 8A.
FIG. 8C reprezintă rezultatele Western blot comparative dintre ova recombinantă şi ova fuzionată la exoTOPE. FIG. 8D reprezintă o diagramă a exozomului cuprinzând (i) exoTOPE legată la Ovalbumină în partea luminală a exozomului şi (ii) stimulatorul imun din lumenul exozomului.
FIG. 9A reprezintă secvenţa unui nanocorp de camelide direcţionat împotriva GFP fuzionată la aminoacizii 1-10 ai BASP1 şi un marcaj FLAG® (SEQ ID NO: 150). Numerotarea aminoacizilor, de exemplu, aminoacizii 1-10 ai BASP1, se referă la un fragment care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 9B reprezintă un gel proteic şi rezultatele Western blotting anti-FLAG® ale exozomilor purificaţi din celule care exprimă stabil proteina de fuziune din FIG. 10A ("BASP1(1-10)-Nanocorp") sau proteina care nu conţine secvenţa BASP1 ("Nanocorp"). Numerotarea aminoacizilor, de exemplu, BASP1 (1-10)-Nanocorp, se referă la un fragment care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 10 reprezintă o schemă a unui sistem de încărcare a mARN de exozom cuprinzând (i) BASP1 (1-30) fuzionată la FLAG® şi variante MCP monomerice sau dimerice (1XMCP(V29I) ("815"; SEQ ID NO: 111), 1XMCP (V29I/N55K) ("817"; SEQ ID NO: 112), 2XMCP(V29I) ("819"; SEQ ID NO: 113) sau 2XMCP(V29I/N55K)) ("821"; SEQ ID NO: 114) şi (ii) un mARN de luciferază conţinând 3x bucle de ac de păr MS2 ("mARN Luciferază-MS2" sau "811"; SEQ ID NO: 115). Numerotarea aminoacizilor, de exemplu, BASP1 (1-30), se referă la un fragment care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 11A reprezintă un gel proteic exozomilor conţinând constructele de încărcare mARN descrise în FIG. 10, un mARN luciferază (811) în combinaţie cu diverse proteine de fuziune BASP1 (815, 817, sau 819).
FIG. 11B reprezintă un test Western blot anti-FLAG® al probelor din FIG. 11A.
FIG. 12A reprezintă rezultatele RT-qPCR pentru cantitatea de mARN luciferază din celule (sus) sau exozomi (jos) conţinând constructele de încărcare a mARN reprezentate în FIG. 10.
FIG. 12B reprezintă un tabel care cuantifică cantitatea de mARN Luciferază din exozomii purificaţi din probele din FIG. 12A, incluzând îmbogăţirea multiplicată din încărcarea stocastică de mARN Luciferază.
FIG. 13 reprezintă diagrame schematice ale trimerilor CD40L fuzionaţi la fragmente N-terminale de MARCKS, MARCKSL1, şi BASP1 pentru a permite afişarea pe suprafaţa exterioară a proteinelor transmembranare ancorate pe suprafaţa luminală a exozomului. Numerotarea aminoacizilor, de exemplu, MARCKS 1-30, MARCKSL1 1-30, BASP1 1-30, BASP1 1-10 ExoTOPE, se referă la un fragment care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 14A reprezintă rezultatele activării celulelor B de şoarece în culturi incubate cu exozomi având expresie la suprafaţă de CD40L fuzionaţi la fragmente N-terminale de MARCKS, MARCKSL1, şi BASP1.
FIG. 14B reprezintă rezultatele activării celulelor B umane în culturi incubate cu exozomi având expresie la suprafaţă de CD40L fuzionaţi la fragmente N-terminale de MARCKS, MARCKSL1, şi BASP1.
FIG. 14C reprezintă un grafic al potenţei relative pentru diferiţi exozomi prezentând pe suprafaţă CD40L atunci când sunt fuzionaţi la secvenţe N-terminale de MARCKS, MARCKSL1, BASP1, sau PTGFRN de lungime întreagă. Numerotarea aminoacizilor, de exemplu, BASP1 1-30, se referă la un fragment care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
FIG. 15 reprezintă numărul de potriviri de spectre peptidice (PSM-uri) ale proteinelor luminale (MARCKS, MARCKSL1, şi BASP 1) şi EV convenţională, de exemplu, proteine de exozom (CD81 şi CD9) în exozomii purificaţi din diferite linii celulare de diferite origini (HEK293SF, rinichi; HT1080, ţesut conjunctiv; K562, măduvă osoasă; MDA-MB-231, sân; Raji, limfoblast; celule stem mezenchimale (MSC), măduvă osoasă).
FIG. 16 reprezintă un gel proteic (stânga) şi un Western blot anti-FLAG® (dreapta) doar al exozomilor derivaţi din celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), sau din celule care supraexprimă BASP1 sau fragmente N-terminale de BASP1 (1-30 sau 1-8) fuzionate la FLAG®-GFP. Numerotarea aminoacizilor, de exemplu, BASP1 (1-30), se referă la un fragment care este iniţial codificat de constructul genetic. Primul Met este clivat în timpul procesării.
DESCRIERE DEATLIATĂ
Prezenta dezvăluire vizează vezicule extracelulare (EV-uri), de exemplu, exozomi, cuprinzând cel puţin o moleculă biologic activă legată la EV, de exemplu, exozom, via o proteină schelă, în care proteina schelă cuprinde un domeniu N-terminal (ND) şi un domeniu efector (ED), în care domeniul ND şi/sau domeniul ED sunt asociate cu suprafaţa luminală a EV, de exemplu, un exozom, în care domeniul ED cuprinde (i) o repetiţie de lizină în domeniul ED sau (ii) o repetiţie de lizină atunci când se combină cu domeniul ND, de exemplu, K la capătul C-terminal in domeniul ND şi K la capătul N-terminal in domeniul ED, în care domeniul ND şi ED sunt legate direct, adică, printr-o legătură peptidică. Prezenta dezvăluire furnizează de asemenea numărul minim de aminoacizi care pot să ancoreze o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic, la suprafaţa luminală a EV, de exemplu, exozom, de exemplu, de la şapte la 15, de la şapte la 14, de la şapte la 13, de la şapte la 12, de la şapte la 11, de la şapte la 10, de la şapte la 9, sau de la şapte la 8 fragmente de aminoacizi. Domeniul ND poate fi asociat cu suprafaţa luminală a EV, de exemplu, un exozom, prin miristoilare, în timp de domeniul ED poate fi asociat cu suprafaţa luminală a EV, de exemplu, un exozom, printr-o interacţiune ionică, de exemplu, prin interacţiune electrostatică atractivă. Exemple nelimitative ale diferitelor aspecte sunt arătate în prezenta dezvăluire.
Înainte de a descrie mai detaliat prezenta dezvăluire, este necesar să se înţeleagă faptul că această dezvăluire nu este limitată la compoziţiile sau etapele de procedeu particulare descrise, întrucât acestea pot, bineînţeles, să varieze. După cum va deveni evident pentru persoanele de specialitate în domeniu în urma parcurgerii prezentei dezvăluiri, fiecare dintre aspectele individuale descrise şi ilustrate aici are componente şi caracteristici discrete care pot fi imediat separate de, sau combinate cu caracteristicile oricăruia dintre celelalte aspecte. Orice metodă citată poate fi realizată în ordinea evenimentelor citată sau în orice altă ordine care este logic posibilă.
Titlurile furnizate în prezenta nu constituie limitări ale diferitelor aspecte ale dezvăluirii, care pot fi definite prin trimitere la descriere ca un întreg. Trebuie de asemenea să se înţeleagă faptul că terminologia utilizată în prezenta are doar scopul descrierii aspectelor particulare, şi nu este menită să fie limitativă.
Prin urmare, termenii definiţi imediat în cele ce urmează sunt definiţi cu mai mare acurateţe prin trimitere la descriere în totalitatea ei.
I. Definiţii
Cu excepţia cazului în care se definesc altfel, toţi termenii tehnici şi ştiinţifici utilizaţi în prezenta au semnificaţia înţeleasă de obicei de către o persoană de specialitate în domeniul de care aparţine această dezvăluire. De exemplu, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, ed. a 2-a, 2002, CRC Press; Dictionary of Cell and Molecular Biology, ed. a 3-a, 1999, Academic Press; şi Oxford Dictionary Of Biochemistry and Molecular Biology, Revizuit, 2000, Oxford University Press, furnizează unei persoane de specialitate un dicţionar general al multora dintre termenii utilizaţi în această dezvăluire. Astfel cum se utilizează în prezenta, următorii termeni au semnificaţiile atribuite lor mai jos.
Este necesar să se reţină faptul că termenul "o" sau "un" entitate se referă la una sau mai multe din acea entitate; de exemplu, "o secvenţă de nucleotide," este înţeles ca reprezentând una sau mai multe secvenţe de nucleotide. Ca atare, termenii "un" (sau "o"), "unul/una sau mai mulţi/multe," şi "cel puţin unul/una" pot fi utilizaţi interschimbabil în prezenta. Mai trebuie să se reţină faptul că revendicările pot fi redactate astfel încât să excludă orice element opţional. Ca atare, această declaraţie este menită să servească drept bază antecedentă pentru utilizarea unei terminologii exclusive precum "exclusiv," "doar" şi altele asemenea în legătură cu citarea elementelor din revendicări, sau utilizarea unei limitări negative.
Mai departe, "şi/sau" atunci când se utilizează în prezenta, trebuie considerat ca dezvăluire specifică a fiecăreia dintre două caracteristici sau componente specificate, cu sau fără celelalte. Aşadar, termenul "şi/sau" utilizat într-o propoziţie precum "A şi/sau B" în prezenta este menit să includă "A şi B," "A sau B," "A" (singur), şi "B" (singur). În mod similar, termenul "şi/sau" utilizat într-o propoziţie precum "A, B, şi/sau C" este menit să cuprindă fiecare dintre următoarele aspecte: A, B, şi C; A, B, sau C; A sau C; A sau B; B sau C; A şi C; A şi B; B şi C; A (singur); B (singur); şi C (singur).
Se înţelege faptul că ori de câte ori aspectele sunt descrise în prezenta în limbajul "cuprinzând," sunt furnizate de asemenea aspecte de altfel analoage descrise în termeni de "constând din" şi/sau "constând în esenţă din".
Unităţile, prefixele şi simbolurile sunt notate în forma lor acceptată din Sistemul Internaţional de Unităţi (SI).
Intervalele numerice includ numerele care definesc intervalul. Atunci când este citat un interval de valori, trebuie să se înţeleagă că fiecare valoare integră intermediară, şi fiecare fracţie a acesteia, situată între limitele superioară şi inferioară indicate ale acelui interval este dezvăluită de asemenea în mod specific, împreună cu fiecare subinterval situat între aceste valori. Limitele superioară şi inferioară ale oricărui interval pot fi în mod independent incluse în sau excluse din interval, şi fiecare interval în care una, niciuna sau ambele limite sunt incluse, este de asemenea cuprins în dezvăluire.
Aşadar, intervalele citate în prezenta se înţeleg ca fiind o stenografie a tuturor valorilor din interval, inclusiv capetele citate. De exemplu, un interval de la 1 la 50 e înţelege că include orice număr, combinaţie de numere, sau subinterval din grupul constând din 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, şi 50.
Dacă nu se indică altfel, referirea la un compus care are unul sau mai mulţi stereocentri vizează fiecare stereoizomer, şi toate combinaţiile de stereoizomeri ale acestora.
Atunci când o valoare este citată în mod explicit, trebuie să se înţeleagă că valorile care au aproximativ aceeaşi cantitate sau cuantum cu valoarea citată se află de asemenea în domeniul de aplicare al dezvăluirii. Atunci când o combinaţie este dezvăluită, fiecare sub-combinaţie a elementelor acelei combinaţii este de asemenea în mod specific dezvăluită şi se află în domeniul de aplicare al dezvăluirii. Reciproc, atunci când sunt dezvăluite individual diferite elemente sau grupuri de elemente, combinaţiile acestora sunt de asemenea dezvăluite. Atunci când orice element al unei dezvăluiri este dezvăluit ca având o multitudine de alternative, exemple ale acelei dezvăluiri în care fiecare alternativă este exclusă individual sau în orice combinaţie cu celelalte alternative, sunt de asemenea dezvăluite; mai mult de un element al unei dezvăluiri pot avea aceste excluderi, şi toate combinaţiile de elemente având aceste excluderi sunt astfel dezvăluite.
Nucleotidele sunt indicate prin codurile lor general acceptate formate dintr-o singură literă. Dacă nu se indică altfel, secvenţele de nucleotide sunt scrise de şa stânga la dreapta în orientarea de la 5' la 3'. Nucleotidele sunt indicate în prezenta prin simbolurile lor în general cunoscute formate dintr-o singură literă, recomandate de IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Prin urmare, A reprezintă adenină, C reprezintă citozină, G reprezintă guanină, T reprezintă timină, U reprezintă uracil.
Secvenţele de aminoacizi sunt scrise de la stânga la dreapta în orientarea de la amino la carboxi. Aminoacizii sunt indicaţi în prezenta prin simbolurile lor larg cunoscute de trei litere sau prin simbolurile dintr-o singură lieră recomandate de IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.
Termenul "aproximativ" este utilizat în prezenta cu semnificaţia circa, în mare, în jur de, sau aproape de. Atunci când termenul "aproximativ" este utilizat împreună cu un interval numeric, acesta modifică respectivul interval prelungindu-i limitele peste şi sub valorile numerice stabilite. În general, termenul "aproximativ" poate modifica o valoare numerică peste şi sub valoarea declarată printr-o variaţie de, de exemplu, 10 la sută, în sus sau în jos (mai mare sau mai mică).
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "aproximativ," folosit în legătură cu una sau mai multe valori de interes, se referă la o valoare care este similară cu o valoare de referinţă declarată. În anumite aspecte, termenul "aproximativ" se referă la un interval de valori care sunt cu 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, sau mai puţin în orice direcţie (mai mare decât sau mai mică decât) a valorii de referinţă declarate, cu excepţia cazului în care se declară altfel sau devine evident din context (cu excepţia cazului în care un astfel de număr ar depăşi 100% dintr-o valoare posibilă).
Termenii "administrare," "administra," şi variantele gramaticale ale acestora se referă la introducerea unei compoziţii, cum ar fi o EV (de exemplu, exozom) conform prezentei dezvăluiri, într-un subiect printr-o cale acceptabilă farmaceutic. Introducerea unei compoziţii, cum ar fi o EV (de exemplu, exozom) conform prezentei dezvăluiri, într-un subiect se face prin orice cale adecvată, incluzând intratumorală, orală, pulmonară, intranazală, parenterală (intravenoasă, intra-arterială, intramusculară, intraperitoneală, sau subcutanată), rectală, intralimfatică, intratecală, perioculară sau topică. Administrarea include auto-administrarea şi administrarea de către o altă persoană. O cale adecvată de administrare permite compoziţiei sau agentului să îşi realizeze funcţia preconizată. De exemplu, dacă o cale adecvată este cea intravenoasă, compoziţia este administrată prin introducerea compoziţiei sau agentului într-o venă a subiectului.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "agonist" se referă la o moleculă care se leagă la un receptor şi activează receptorul pentru a produce un răspuns biologic. Receptorii pot fi activaţi printr-un agonist endogen sau unul exogen. Exemple nelimitative de agonist endogen includ hormoni, neurotransmiţători, şi dinucleotide ciclice. Exemple nelimitative de agonist exogen includ medicamente, molecule mici, şi dinucleotide ciclice. Agonistul poate fi unul întreg, parţial sau invers.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "antagonist" se referă la o moleculă care blochează sau amortizează un răspuns mediat de un agonist în loc să provoace un răspuns biologic în sine după ce se leagă de un receptor. Mulţi antagonişti îşi ating potenţa concurând cu liganzi endogeni sau substraturi la situsuri de legare definite structural de pe receptori. Exemple nelimitative de antagonişti includ alfa blocanţi, beta-blocanţi, şi blocanţi ai canalului de calciu. Antagonistul poate fi un antagonist competitiv, non-competitiv, sau necompetitiv.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "veziculă extracelulară" sau "EV" se referă la o veziculă derivată din celulă cuprinzând o membrană care înconjoară spaţiul interior (lumen). Veziculele extracelulare cuprind toate veziculele legate prin membrane care au un diametru mai mic decât celula din care sunt derivate. În general, veziculele extracelulare variază în diametru de la 20 nm la 1000 nm, şi pot cuprinde diverse încărcături utile fie în spaţiul interior (adică, lumen), fie prezente pe suprafaţa exterioară sau suprafaţa luminală a veziculei extracelulare, şi/sau acoperind membrana. Încărcătura utilă poate cuprinde, de exemplu, acizi nucleici, proteine, carbohidraţi, lipide, molecule mici, şi/sau combinaţii ale acestora. Spre exemplificare şi fără limitare, veziculele extracelulare includ corpuri apoptotice, fragmente de celule, vezicule derivate din celule prin manipulare directă sau indirectă (de exemplu, prin extrudare serială sau tratament cu soluţii alcaline), organele veziculate, şi vezicule produse de celule vii (de exemplu, prin înmugurire directă din membrana plasmatică sau fuziune a endozomului târziu cu membrana plasmatică). Veziculele extracelulare pot fi derivate dintr-un organism viu sau mort, ţesuturi sau organe explantate, şi/sau celule cultivate. În unele aspecte, EV cuprinde o proteină schelă dezvăluită în prezenta.
Astfel cum se utilizează în prezenta termenul "exozom" se referă la o veziculă extracelulară (EV) mică (între 20-300 nm în diametru, mai preferabil 40-200 nm în diametru) derivată din celulă cuprinzând o membrană care înconjoară un spaţiu interior (lumen), şi care, în unele aspecte, este generată dintr-o celulă (de exemplu, o celulă producătoare), de exemplu, prin înmugurire directă din membrana plasmatică sau prin fuziunea endozomului târziu cu membrana plasmatică. Exozomul este o specie de veziculă extracelulară (EV). În unele aspecte, exozomul cuprinde lipide sau acid gras şi polipeptidă şi opţional cuprinde o încărcătură utilă (de exemplu, o moleculă activă biologic cum ar fi un agent terapeutic), un receptor (de exemplu, o fracţiune de ţintire), o polinucleotidă (de exemplu, un acid nucleic, ARN, sau ADN), un zahar (de exemplu, un zahar simplu, polizaharidă, sau glican), sau alte molecule. Exozomul poate fi derivat dintr-o celulă producătoare, şi izolat din celula producătoare în funcţie de mărimea lui, densitate, parametri biochimici, sau o combinaţie a acestora. În unele aspecte, exozomul cuprinde o proteină schelă conform prezentei dezvăluiri. În unele aspecte, exozomii conform prezentei dezvăluiri sunt produşi de celule care exprimă unul sau mai multe produse transgenice.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "proteină a lumenului de exozom" se referă la o proteină schelă, adică, o proteină ataşată la sau asociată cu suprafaţa luminală a EV, de exemplu, exozom, cum ar fi MARCKS, MARKSL1, BASP1, sau orice fragment funcţional al acestora, orice variantă a acestora, orice derivat al acestora, sau orice combinaţie a acestora, şi care este adecvată pentru utilizare ca o schelă pentru a ţinti o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic (de exemplu, proteine terapeutice) la suprafaţa luminală a EV-urilor, de exemplu, exozomi.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "nanoveziculă" se referă la o veziculă mică (între 20-250 nm în diametru, de exemplu, 30-150 nm în diametru) derivată din celule cuprinzând o membrană care înconjoară un spaţiu interior, şi care este generată dintr-o celulă (de exemplu, celulă producătoare) prin manipulare directă sau indirectă astfel încât nanovezicula nu ar fi produsă de către celula producătoare fără această manipulare. Manipulările adecvate ale celulei producătoare pentru produce nanoveziculele includ, dar nu se limitează la extrudare serială, tratament cu soluţii alcaline, sonicare, sau combinaţii ale acestora. Producerea de nanovezicule poate, în unele cazuri, să conducă la distrugerea celulei producătoare. În unele aspecte, populaţiile de nanovezicule descrise în prezenta sunt substanţial lipsite de vezicule care sunt derivate din celule producătoare prin oricare dintre înmugurire directă din membrana plasmatică sau fuziune a endozomului târziu cu membrana plasmatică. În unele aspecte, nanovezicula cuprinde lipide sau acid gras şi polipeptidă, şi opţional cuprinde o încărcătură utilă (de exemplu, un agent terapeutic), un receptor (de exemplu, o fracţiune de ţintire), o polinucleotidă (de exemplu, un acid nucleic, ARN, sau ADN), un zahar (de exemplu, un zahar simplu, polizaharidă, sau glican) sau alte molecule. Nanovezicula, odată ce a fost derivată dintr-o celulă producătoare în conformitate cu manipularea, poate fi izolată din celula producătoare în funcţie de mărimea ei, densitate, parametri biochimici, sau o combinaţie a acestora. În unele aspecte, nanovezicula poate cuprinde o proteină schelă dezvăluită în prezenta.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "EV cu lumen modificat" se referă la o EV, de exemplu, un exozom cu suprafaţa luminală a membranei sau lumenul EV, de exemplu, exozom, modificată în compoziţie astfel încât suprafaţa luminală sau lumenul EV, de exemplu, exozom, modificate este diferită de cea a EV, de exemplu, exozom, dinainte de modificare sau cea a EV, de exemplu, exozom prezentă în natură.
Modificarea poate fi făcută direct în lumen (adică, spaţiul liber din interiorul EV) sau în membrana EV (de exemplu, exozom) în particular suprafaţa luminală a EV, astfel încât lumenul şi/sau suprafaţa luminală a EV, de exemplu, exozom, este modificată. De exemplu, membrana este modificată în compoziţia ei de o proteină, o lipidă, o moleculă mică, un carbohidrat, etc. astfel încât suprafaţa luminală a EV, de exemplu, exozom, este modificată. În mod analog, conţinutul lumenului poate fi modificat. Compoziţia poate fi schimbată printr-o metodă chimică, fizică sau biologică sau prin producerea ei dintr-o celulă modificată în prealabil printr-o metodă chimică, fizică sau biologică. În mod specific, compoziţia poate fi schimbată prin modificare genetică sau prin producerea dintr-o celulă modificată în prealabil prin modificare genetică. În unele aspecte, o EV cu lumen modificat, de exemplu, exozom cu lumen modificat, cuprinde o proteină exogenă (adică, o proteină pe care EV, de exemplu, exozom, nu o exprimă în mod natural) sau un fragment sau o variantă a acesteia care poate fi expusă la suprafaţa luminală sau lumenul EV, de exemplu, exozom, sau poate fi un punct de ancorare (ataşare) pentru o fracţiune expusă pe stratul interior al EV, de exemplu, exozom. În alte aspecte, o EV cu lumen modificat, de exemplu, un exozom cu lumen modificat, cuprinde o expresie mai înaltă a unei proteine naturale de EV, de exemplu, exozom (de exemplu, o proteină schelă) sau un fragment sau o variantă a acesteia care poate fi expusă la lumenul EV, de exemplu, exozom, sau poate fi un punct de ancorare (ataşare) pentru o fracţiune expusă pe suprafaţa luminală a EV, de exemplu, exozom.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "EV modificată la suprafaţă" se referă la o EV cu suprafaţa exterioară a EV modificată în compoziţie astfel încât suprafaţa exterioară a EV modificate este diferită de cea a EV dinainte de modificare sau a EV prezente în natură.
Astfel cum se utilizează în prezenta termenul "exozom modificat la suprafaţă" se referă la un exozom cu suprafaţa exterioară a exozomului modificată în compoziţie astfel încât suprafaţa exterioară a exozomului modificat este diferită de cea a exozomului dinainte de modificare sau a exozomului prezent în natură.
Termenul "modificat," atunci când este utilizat în contextul EV-urilor, de exemplu, exozomi, descrise în prezenta, se referă la o alterare sau inginerizare a unei EV, de exemplu, exozom şi/sau celula producătoare a acesteia, astfel încât EV modificată, de exemplu, exozom, este diferită de o EV prezentă în natură, de exemplu, exozom. În unele aspecte, o EV, de exemplu, exozom, modificată descrisă în prezenta cuprinde o membrană care diferă în compoziţie de proteină, o lipidă, o moleculă mică, un carbohidrat, etc. comparativ cu membrana unei EV prezente în natură, de exemplu, exozom. De exemplu, membrana cuprinde o densitate sau număr mai mare de proteine naturale de EV, de exemplu, exozom, şi/sau membrana cuprinde proteine care nu se regăsesc în mod natural în EV, de exemplu, exozomi. În anumite aspecte, aceste modificări la membrană modifică suprafaţa exterioară a EV, de exemplu, exozom (de exemplu, EV-uri şi exozomi cu suprafaţa modificată descrişi în prezenta). În anumite aspecte, aceste modificări la membrană modifică suprafaţa luminală a EV, .de exemplu, exozom (de exemplu, EV şi exozomii cu lumen modificat descrişi în prezenta).
De exemplu, lumenul este modificat în compoziţie de o proteină, o lipidă, o moleculă mică, un carbohidrat, etc. Compoziţia poate fi modificată printr-o metodă chimică, fizică sau biologică sau prin producerea dintr-o celulă anterior modificată printr-o metodă chimică, fizică sau biologică. În mod specific, compoziţia poate fi modificată printr-o modificare genetică sau prin producerea dintr-o celulă anterior modificată prin modificare genetică.
Astfel cum se utilizează în prezenta termenul "modificare" a unei proteine, de exemplu, ca în "proteină modificată" sau "modificare a proteinei" sau variantele gramaticale ale acestora, se referă la o proteină având cel puţin 15% identitate cu secvenţa de aminoacizi nemutantă a proteinei. O modificare a unei proteine include un fragment sau o variantă a proteinei. O modificare a unei proteine mai poate include o modificare chimică sau fizică la un fragment sau o variantă a proteinei. În unele aspecte, o proteină modificată reţine cel puţin o funcţie fiziologică a proteinei nemodificate.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "un fragment" al unei proteine (de exemplu, o moleculă activă biologic cum ar fi o proteină terapeutică, sau o proteină schelă dezvăluită în prezenta) se referă la o proteină care este mai scurtă decât secvenţa prezentă în natură, de exemplu, deletată N- şi/sau C-terminal comparativ cu proteina prezentă în natură.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "fragment funcţional" se referă la un fragment de proteină care reţine funcţia proteinei. Prin urmare, în unele aspecte, un fragment funcţional al unei proteine schelă dezvăluită în prezenta, cum ar fi MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1 reţine capacitatea de a ancora o moleculă activă biologic pe suprafaţa luminală a EV, de exemplu, exozom.
Faptul dacă un fragment este un fragment funcţional în acel sens poate fi apreciat prin orice metode cunoscute în domeniu pentru a determina conţinutul de proteine al EV-urilor, de exemplu, exozomi incluzând Western Blot, analiză FACS şi fuziuni ale fragmentelor cu proteine autofluorescente precum, de exemplu, GFP. Într-un aspect particular, fragmentul de MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1 reţine, de exemplu, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 55%, cel puţin aproximativ 60%, cel puţin aproximativ 65%, cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 99%, sau cel puţin aproximativ 100% din capacitatea MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1 prezente în natură de a ancora o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic, pe suprafaţa luminală sau pe cea exterioară a EV, de exemplu, exozom. Într-un aspect particular, capacitatea unei variante de MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau a unui fragment de MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1 este cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 99%, sau cel puţin aproximativ 100% din capacitatea MARCKS, MARCKSL1, şi BASP1, respectiv, de a ancora o încărcătură utilă, de exemplu, moleculă activă biologic, pe suprafaţa luminală sau pe cea exterioară a EV, de exemplu, exozom. Capacitatea poate fi apreciată, de exemplu, prin variante marcate fluorescent, în testele descrise în secţiunea experimentală.
Termenul "derivat" astfel cum se utilizează în prezenta se referă la o componentă de EV, de exemplu, exozom (de exemplu, o proteină sau o lipidă), o proteină schelă conform prezentei dezvăluiri, sau la o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic (de exemplu, o polipeptidă, polinucleotidă, lipidă, carbohidrat, anticorp sau fragment al acestuia) care a fost modificată chimic sau enzimatic.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "variantă" a unei proteine se referă la o proteină care are în comun anumite identităţi structurale (de exemplu, identitate a secvenţelor de aminoacizi) şi funcţionale cu altă proteină prin comparaţia (de exemplu, prin alinierea secvenţelor) printr-o metodă cunoscută în domeniu. De exemplu, o variantă a unei proteine poate include o substituţie, inserţie, deleţie, deplasare a cadrului sau rearanjare în altă proteină. În unele aspecte, o variantă a unei proteine reţine cel puţin o funcţie fiziologică a proteinei care nu este variantă.
Într-un aspect particular, varianta este o variantă de proteină având cel puţin 70% identitate cu MARCKS, MARCKSL1, BASP1 mature, de lungime întreagă, sau un fragment de MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1.
În unele aspecte, variantele sau variantele de fragmente de MARCKS au în comun cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu MARCKS în conformitate cu SEQ ID NO: 1 sau cu un fragment funcţional al acesteia, astfel cum se determină, de exemplu, prin aliniere pe perechi utilizând algoritmul Needleman-Wunsch.
În unele aspecte, variantele sau variantele de fragmente de MARCKSL1 au în comun cel puţin 70%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu MARCKSL1 în conformitate cu SEQ ID NO: 2 sau cu un fragment funcţional al acesteia, astfel cum se determină, de exemplu, prin aliniere pe perechi utilizând algoritmul Needleman-Wunsch.
În unele aspecte, variantele sau variantele de fragmente de BASP1 au în comun cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu BASP1 în conformitate cu SEQ ID NO: 3 sau cu un fragment funcţional al acesteia, astfel cum se determină, de exemplu, prin aliniere pe perechi utilizând algoritmul Needleman-Wunsch.
În unele aspecte, o variantă a unei proteine schelă (de exemplu, MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1), un fragment funcţional al unei proteine schelă, sau o variantă a unui fragment funcţional a unei proteine schelă, este un derivat.
În fiecare dintre cazurile de mai sus, varianta sau varianta unui fragment al unei proteine schelă (de exemplu, o variantă a MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau un fragment al MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1) reţine capacitatea de a ancora încărcătura, de exemplu, o moleculă activă biologic, pe suprafaţa luminală sau pe cea exterioară a EV, de exemplu, exozom.
Invocarea unei proteine furnizate în prezenta cuprinde o variantă funcţională a proteinei. Termenul "variantă funcţională" a unei proteine se referă la o variantă a proteinei care reţine capacitatea de a ancora o moleculă activă biologic pe suprafaţa luminală sau pe cea exterioară a EV, de exemplu, exozom. Într-un aspect particular capacitatea variantei funcţionale de MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sau a unui fragment de MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1 este cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95% sau cel puţin aproximativ 99% din capacitatea MARCKS, MARCKSL1, şi BASP1, respectiv, de a ancora o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic, pe suprafaţa luminală sau pe cea exterioară a EV, de exemplu, exozom.
Variantele prezente în natură sunt denumite "variante alelice," şi se referă la una din multe forme alternative ale unei gene care ocupă un anumit locus pe un cromozom al unui organism (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Aceste variante alelice pot varia la nivel polinucleotidic şi/sau polipeptidic şi are incluse în prezenta dezvăluire. Alternativ, variantele care nu sunt prezente în natură pot fi produse prin tehnici de mutageneză sau prin sinteză directă.
Utilizând metode cunoscute de modificare genetică a proteinelor şi tehnologia cu ADN recombinant, variantele pot fi generate astfel încât să îmbunătăţească sau să modifice caracteristicile polipeptidelor. De exemplu, unul sau mai mulţi aminoacizi pot fi deletaţi de la capătul N-terminal sau capătul C-terminal al proteinei secretate fără pierderi substanţiale ale funcţiei biologice. Ron şi colab., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), au raportat proteine varianta KGF având activitate de legare a heparinei chiar şi după deletarea a 3, 8, sau 27 de resturi de aminoacizi amino-terminale. În mod analog, interferonul gama a prezentat o activitate de până la zece ori mai mare după deletarea a 8-10 resturi de aminoacizi de la capătul carboxi al acestei proteine. (Dobeli şi colab., J. Biotechnology 7:199-216 (1988))
Mai mult, dovezi ample arată faptul că variantele reţin adesea o activitate biologică similară cu cea a proteinei prezente în natură. De exemplu, Gayle şi coautorii (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)) au efectuat analize mutaţionale extinse asupra citokinelor IL-1a umane. Aceştia au folosit mutageneză aleatorie pentru a genera peste 3.500 de mutanţi IL-1a individuali care au avut în medie 2,5 modificări de aminoacizi per variantă pe întreaga lungime a moleculei. Multiple mutaţii au fost examinate în fiecare poziţie posibilă a aminoacizilor. Investigatorii au constatat că "cea mai mare parte a moleculei a putut fi modificată cu efecte reduse pentru oricare [activitate de legare sau biologică]." (a se vedea rezumatul.) De fapt, numai 23 de secvenţe de aminoacizi unice, din mai mult de 3.500 de secvenţe de nucleotide examinate, au produs o proteină care a avut o activitate diferită în mod semnificativ de cea de tip sălbatic.
Astfel cum s-a statuat mai sus, variantele sau derivaţii includ, de exemplu, polipeptide modificate. În unele aspecte, variantele sau derivaţii de, de exemplu, polipeptide, polinucleotide, lipide, glicoproteine, sunt rezultatul modificării chimice şi/sau modificării endogene. În unele aspecte, variantele sau derivaţii sunt rezultatul modificării in vivo. În unele aspecte, variantele sau derivaţii sunt rezultatul modificării in vitro. În alte aspecte suplimentare, variantele sau derivaţii sunt rezultatul modificării intracelulare în celule producătoare.
Modificările prezente în variante şi derivaţi includ, de exemplu, acetilare, acilare, ADP-ribozilare, amidare, legarea covalentă a flavinei, legarea covalentă a unei fracţiuni hem, legarea covalentă a unei nucleotide sau a unui derivat de nucleotidă, legarea covalentă a unei lipide sau a unui derivat lipidic, legarea covalentă a fosfotidilinozitol, reticulare, ciclizare, formarea de legături disulfidice, demetilare, formarea de legături încrucişate covalente, formarea de cisteină, formarea de piroglutamat, formilare, gama-carboxilare, glicolizare, formarea de ancore GPI, hidroxilare, iodinare, metilare, miristoilare, oxidare, pegilare (Mei şi colab., Blood 116:270-79 (2010)), prelucrare proteolitică, fosforilare, prenilare, racemizare, selenoilare, sulfatare, adiţia mediată de ARN transfer a aminoacizilor la proteine cum ar fi arginilare, şi ubiquitinare.
Termenul "substituţie de aminoacizi" se referă la înlocuirea unui rest de aminoacizi prezent într-o secvenţă mamă sau de referinţă (de exemplu, o secvenţă de tip sălbatic) cu un alt rest de aminoacizi. Un aminoacid poate fi substituit într-o secvenţă mamă sau de referinţă (de exemplu, o secvenţă polipeptidică de tip sălbatic), de exemplu, prin sinteză peptidică chimică sau prin metode recombinante cunoscute în domeniu. Prin urmare, referirea la "substituţie la poziţia X" se referă la substituţia unui aminoacid prezent la poziţia X cu un rest de aminoacizi alternativ. În unele aspecte, modelele de substituţie pot fi descrise în conformitate cu schema AnY, în care A este codul format dintr-o singură literă corespunzător aminoacidului prezent în mod natural sau originar la poziţia n, şi Y este restul de aminoacizi substituitor. În alte aspecte, modelele de substituţie pot fi descrise în conformitate cu schema An(YZ), în care A este codul format dintr-o singură literă corespunzător restului de aminoacizi care substituie aminoacidul prezent în mod natural sau originar la poziţia n, şi Y şi Z sunt resturi de aminoacizi substituitori alternativi care pot înlocui A.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "anticorp" înglobează o globulină, fie naturală, fie produsă parţial sau integral sintetic, şi fragmente ale acesteia. Termenul acoperă de asemenea orice proteină având un domeniu de legare care este omolog cu un domeniu de legare a imunoglobulinei. "Anticorp" mai include o polipeptidă cuprinzând o regiune cadru de la o genă imunoglobulinică sau fragmente ale acesteia care leagă în mod specific şi recunoaşte un antigen. Utilizarea termenului de anticorp este de natură să includă anticorpi integrali, anticorpi policlonali, monoclonal şi recombinanţi, fragmente ale acestora, şi să mai includă anticorpi monocatenari, anticorpi umanizaţi, anticorpi murinici, anticorpi monoclonali himerici, şoarece-uman, şoarece-primată, primată-uman, anticorpi anti-idiotip, fragmente de anticorpi, cum ar fi, de exemplu, scFv, (scFv)2, Fab, Fab', şi F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, şi fragmente Fd, diacorpi, şi polipeptide legate de anticorpi. Anticorpii includ anticorpi bispecifici şi anticorpi multispecifici atâta timp cât aceştia prezintă activitatea sau funcţia biologică dorită. În unele aspecte conform prezentei dezvăluiri, încărcătura utilă este o moleculă activă biologic cuprinzând un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia. În unele aspecte, anticorpul (de exemplu, o moleculă activă biologic conform prezentei dezvăluiri) este un nanocorp.
Termenii "conjugat anticorp-medicament" şi "ADC" sunt utilizaţi interschimbabil şi se referă la un anticorp legat, de exemplu, covalent, la un agent terapeutic (uneori denumit în prezenta agent, medicament, sau ingredient farmaceutic activ) sau agenţi. În unele aspecte conform prezentei dezvăluiri, încărcătura utilă este o moleculă activă biologic cuprinzând un conjugat anticorp-medicament.
O "substituţie conservativă de aminoacizi" este una în care restul de aminoacizi este înlocuit cu un rest de aminoacizi având o catenă laterală similară. Familiile de resturi de aminoacizi având catene laterale similare au fost definite în domeniu, incluzând catene laterale bazice (de exemplu, lizină, arginină, histidină), catene laterale acide (de exemplu, acid aspartic, acid glutamic), catene laterale polare neîncărcate (de exemplu, glicină, asparagină, glutamină, serină, treonină, tirozină, cisteină), catene laterale nepolare (de exemplu, alanină, valină, leucină, izoleucină, prolină, fenilalanină, metionină, triptofan), catene laterale beta-ramificate (de exemplu, treonină, valină, izoleucină) şi catene laterale aromatice (de exemplu, tirozină, fenilalanină, triptofan, histidină). Aşadar, dacă un aminoacid dintr-o polipeptidă este înlocuit cu un alt aminoacid din aceeaşi familie de catenă laterală, substituţia este considerată ca fiind conservativă. Într-un alt aspect, un şir de aminoacizi poate fi înlocuit conservativ cu un şir similar din punct de vedere structural care diferă în ceea ce priveşte ordinea şi/sau compoziţia membrilor familiei de catenă laterală.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "conservat" se referă la o nucleotidă sau resturi de aminoacizi ale unei secvenţe de polinucleotide sau secvenţe de polipeptide, respectiv, care sunt cele care apar nemodificate în aceeaşi poziţie a două sau mai multe secvenţe care sunt comparate. Nucleotidele sau aminoacizii care sunt relativ conservate sunt cele care sunt conservate la nivelul secvenţelor mai înrudite decât nucleotidele sau aminoacizii care apar în alte poziţii din secvenţe.
În unele aspecte, două sau mai multe secvenţe se numesc "complet conservate" sau "identice" dacă sunt identice 100% una cu cealaltă. În unele aspecte, două sau mai multe secvenţe se numesc "foarte conservate" dacă sunt cel puţin 70% identice, cel puţin 80% identice, cel puţin 90% identice, sau cel puţin 95% identice una cu cealaltă.
În unele aspecte, două sau mai multe secvenţe se numesc "foarte conservate" dacă sunt aproximativ 70% identice, aproximativ 80% identice, aproximativ 90% identice, aproximativ 95%, aproximativ 98%, sau aproximativ 99% identice una cu cealaltă. În unele aspecte, două sau mai multe secvenţe se numesc "conservate" dacă sunt cel puţin 30% identice, cel puţin 40% identice, cel puţin 50% identice, cel puţin 60% identice, cel puţin 70% identice, cel puţin 80% identice, cel puţin 90% identice, sau cel puţin 95% identice una cu cealaltă. În unele aspecte, două sau mai multe secvenţe se numesc "conservate" dacă sunt aproximativ 30% identice, aproximativ 40% identice, aproximativ 50% identice, aproximativ 60% identice, aproximativ 70% identice, aproximativ 80% identice, aproximativ 90% identice, aproximativ 95% identice, aproximativ 98% identice, sau aproximativ 99% identice una cu cealaltă. Conservarea secvenţei se poate aplica pe întreaga lungime a unei polinucleotide sau polipeptide, sau se poate aplica pe o porţiune, regiune sau caracteristică a acesteia.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "omologie" se referă la înrudirea de ansamblu dintre moleculele polimerice, de exemplu între moleculele de acid nucleic (de exemplu molecule ADN şi/sau molecule ARN) şi/sau între molecule polipeptidice. În general, termenul "omologie" implică o relaţie evolutivă între două molecule. Aşadar, două molecule care sunt omoloage vor avea un strămoş evolutiv comun. În contextul prezentei dezvăluiri, termenul omologie înglobează atât identitatea, cât şi similaritatea.
În unele aspecte, moleculele polimeric sunt considerate "omoloage" una cu cealaltă dacă cel puţin 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, sau 99% dintre monomerii din moleculă sunt identici (exact acelaşi monomer) sau sunt similari (substituţii conservative). Termenul "omolog" se referă în mod necesar la o comparaţie între cel puţin două secvenţe (secvenţe de polinucleotide sau polipeptide).
În contextul prezentei dezvăluiri, substituţiile (chiar şi atunci când sunt denumite substituţii de aminoacizi) sunt efectuate la nivel de acid nucleic, adică, substituirea unui rest de aminoacizi cu un rest de aminoacizi alternativ este realizată substituind codonul care codifică primul aminoacid cu un codon care codifică al doilea aminoacid.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "identitate" se referă la conservarea de ansamblu a monomerilor între moleculele polimerice, de exemplu, între molecule polipeptidice sau molecule polinucleotide (de exemplu moleculă de ADN şi/sau moleculă de ARN). Termenul "identice" fără alte calificative, de exemplu, proteina A este identică cu proteina B, implică faptul că secvenţele sunt 100% identice (100% identitate de secvenţe). Descrierea a două secvenţe ca, de exemplu, "70% identice," este echivalentă cu descrierea acestora ca având, de exemplu, "70% identitate de secvenţe."
Calcularea procentului de identitate dintre secvenţe polipeptidice, de exemplu, poate fi realizată prin alinierea celor două secvenţe în scopul comparării optime (de exemplu, pot fi introduse gapuri în una sau ambele dintre o primă şi o a doua secvenţă polipeptidică pentru alinierea optimă şi secvenţele neidentice pot fi desconsiderate în scopul comparării). În anumite aspecte, lungimea unei secvenţe aliniate în scopul comparării este cel puţin 30%, cel puţin 40%, cel puţin 50%, cel puţin 60%, cel puţin 70%, cel puţin 80%, cel puţin 90%, cel puţin 95%, sau 100% din lungimea secvenţei de referinţă. Aminoacizii de la poziţiile corespunzătoare ale aminoacizilor pot fi apoi comparaţi.
Atunci când o poziţie din prima secvenţă este ocupată de acelaşi aminoacid ca poziţia corespunzătoare din a doua secvenţă, atunci moleculele sunt identice la acea poziţie. Identitatea procentuală dintre cele două secvenţe este o funcţie de numărul de poziţii identice avute în comun de secvenţe, luând în considerare numărul de gapuri, şi lungimea fiecărui gap, care trebuie introduse pentru alinierea optimă a celor două secvenţe. Comparaţia secvenţelor şi determinarea identităţii procentuale dintre două secvenţe poate fi realizată utilizând un algoritm matematic.
Metode de aliniere a secvenţelor pentru comparare sunt bine cunoscute în domeniu. Diferite programe şi algoritmi de aliniere sunt descrise în: Smith şi Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman şi Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson şi Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins şi Sharp, Gene 73: 15 237-44 (1988); Higgins şi Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989) Corpet şi colab., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang şi colab., Comp. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992); şi Pearson şi colab., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994). The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [Altschul 20 şi colab., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990) J este disponibil din mai multe surse, incluzând National Center for Biological Information (NBCl, Bethesda, Md.) şi pe internet, pentru utilizare în legătură cu programele de analiză a secvenţelor blastp, blastn, blastx, tblastn şi tblastx. BLAST şi o descriere a modului în care se determină identitatea de secvenţe utilizând programul pot fi accesate pe website-ul oficial al NCBI (National Center for Biotechnology Information) din cadrul NIH (National Institute of Health).
Alte programe adecvate sunt, de exemplu, Needle, Stretcher, Water, sau Matcher, o parte din seria EMBOSS de programe bioinformatice şi de asemenea disponibile de la European Bioinformatics Institute (EBI) la adresa www.ebi.ac.uk/Tools/psa. Alinierile de secvenţe pot fi efectuate utilizând metode cunoscute în domeniu cum ar fi MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X sau Clustal Omega), MUSCLE, etc.
Diferite regiuni din interiorul unei singure secvenţe polinucleotidice sau polipeptidice ţintă care se aliniază cu o secvenţă polinucleotidică sau polipeptidică de referinţă pot să aibă fiecare propria identitate procentuală a secvenţelor. Se observă faptul că valoarea identităţii procentuale de secvenţe este rotunjită la cea mai apropiată zecime. De exemplu, 80,11, 80,12, 80,13, şi 80,14 sunt rotunjite prin lipsă la 80,1, în timp ce 80,15, 80,16, 80,17, 80,18, şi 80,19 sunt rotunjite prin adaos la 80,2. Se observă de asemenea faptul că valoarea lungimii va fi întotdeauna un număr întreg.
În anumite aspecte, identitatea procentuală (%ID) sau a unei prime secvenţe de aminoacizi (sau secvenţe de acizi nucleici) faţă de o a doua secvenţă de aminoacizi (sau secvenţă de acizi nucleici) este calculată ca %ID = 100 x (Y/Z), unde Y este numărul de resturi de aminoacizi (sau nucleobaze) marcate ca potriviri identice în aliniamentul primei şi a celei de-a doua secvenţe (aliniate prin inspecţie vizuală sau un anumit program de aliniere a secvenţelor) şi Z este numărul total de resturi din a doua secvenţă. Dacă lungimea unei prime secvenţe este mai mare decât a doua secvenţă, identitatea procentuală a primei secvenţe cu a doua secvenţă va fi mai mare decât identitatea procentuală a celei de-a doua secvenţe cu prima secvenţă.
O persoană de specialitate în domeniu va aprecia faptul că generarea unei alinieri de secvenţe pentru calcularea identităţii procentuale între secvenţe nu este limitată la comparaţii binare secvenţă-secvenţă determinate exclusiv de date primare ale secvenţelor. Se va înţelege de asemenea faptul că alinierile de secvenţe pot fi generate prin integrarea datelor referitoare la secvenţe cu date din surse eterogene cum ar fi date structurale (de exemplu, structuri proteice cristalografice), date funcţionale (de exemplu, localizarea mutaţiilor), sau date filogenetice. Un program adecvat care integrează datele eterogene pentru a genera o aliniere de secvenţe multiple este T-Coffee, disponibil la adresa www.tcoffee.org, şi disponibil în mod alternativ, de exemplu, de la EBI. Se va înţelege de asemenea faptul că alinierea finală utilizată pentru calcularea procentului de identitate de secvenţe poate fi realizată fie automat, fie manual.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "similaritate" se referă la înrudirea de ansamblu dintre moleculele polimeric, de exemplu între moleculele de polinucleotide (de exemplu molecule de ADN şi/sau molecule de ARN) şi/sau între moleculele polipeptidice. Calcularea similarităţii procentuale a moleculelor polimerice una cu cealaltă poate fi realizată în acelaşi mod cu cel al calculării identităţii procentuale, cu excepţia faptului că calcularea similarităţii procentuale ţine cont de substituţiile conservative astfel cum este înţeles în domeniu. Este înţeles faptul că procentajul de similaritate este condiţionat de scala de comparaţie utilizată, adică, dacă aminoacizii sunt comparaţi, de exemplu, în conformitate cu proximitatea lor evolutivă, sarcina, volumul, flexibilitatea, polaritatea, hidrofobicitatea, aromaticitatea punctul izoelectric, antigenicitatea, sau combinaţii ale acestora.
Astfel cum se utilizează în prezenta termenul "celulă producătoare" se referă la o celulă utilizată pentru generarea unei EV, de exemplu, un exozom. O celulă producătoare poate fi o celulă cultivată in vitro, sau o celulă in vivo. O celulă producătoare include, dar nu se limitează la, o celulă cunoscută ca fiind eficientă în generarea de EV-uri, de exemplu, exozomi, de exemplu, celule HEK293, celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), şi celule stem mezenchimale (MSC-uri), celule fibroblaste umane de prepuţ BJ, celule fibroblaste fHDF, celule ale precursorului neuronal AGE.HN®, celule amniotice CAP®, celule stem mezenchimale din ţesutul adipos, celule RPTEC/TERT1. În anumite aspecte, a celulă producătoare nu este o celulă care prezintă antigen. În unele aspecte, a celulă producătoare nu este o celulă dendritică, o celulă B, o celulă mastocitară, un macrofag, o neutrofilă, celulă Kupffer-Browicz, celulă derivată din oricare dintre aceste celule, sau orice combinaţie a acestora.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenii "izola," "izolat," şi "izolare" sau "purifica," "purificat," şi "purificare" precum şi "extras" şi "extragere" şi variantele gramaticale ale acestora sunt utilizate interschimbabil şi se referă la starea unui preparat (de exemplu, o multitudine de cantităţi şi/sau concentraţii cunoscute sau necunoscute) din EV-uri dorite, de exemplu, exozomi, care au fost supuse la unul sau mai multe procese de purificare, de exemplu, o selecţie sau o îmbogăţire a preparării EV-urilor dorite, de exemplu, exozomi. În unele variante de realizare, izolarea sau purificarea astfel cum se utilizează în prezenta este procesul de îndepărtare, îndepărtare parţială (de exemplu, o fracţie) a EV-urilor, de exemplu, exozomi, dintr-o probă conţinând celule producătoare. Într-o anumită variantă de realizare, o compoziţie de EV izolată, de exemplu, exozom, nu are activitate nedorită detectabilă sau, alternativ, nivelul sau cantitatea de activitate nedorită se află la sau sub un nivel sau cantitate acceptabilă.
În alte variante de realizare, o compoziţie de EV, de exemplu, exozom, izolate are o cantitate şi/sau concentraţie de EV-uri dorite, de exemplu, exozomi, la sau peste o cantitate şi/sau concentraţie acceptabile. În alte aspecte, compoziţia de EV-uri, de exemplu, exozomi, izolate este îmbogăţită comparativ cu materialul de pornire (de exemplu, preparate cu celulă producătoare) din care compoziţia este obţinută. Această îmbogăţire poate fi cu cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 15%, cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 25%, cel puţin aproximativ 30%, cel puţin aproximativ 35%, cel puţin aproximativ 40%, cel puţin aproximativ 45%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 55%, cel puţin aproximativ 60%, cel puţin aproximativ 65%, cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 96%, cel puţin aproximativ 97%, cel puţin aproximativ 98%, cel puţin aproximativ 99%, cel puţin aproximativ 99,9%, cel puţin aproximativ 99,99%, cel puţin aproximativ 99,999%, cel puţin aproximativ 99,9999%, sau mai mult decât aproximativ 99,9999% comparativ cu materialul de pornire.
În unele aspecte, preparatele de EV, de exemplu, exozom, izolate sunt substanţial lipsite de produse biologice reziduale (de exemplu, contaminanţi). În unele aspecte, preparatele de EV, de exemplu, exozom, izolată sunt aproximativ 100% lipsite, cel puţin aproximativ 99% lipsite, cel puţin aproximativ 98% lipsite, cel puţin aproximativ 97% lipsite, cel puţin aproximativ 96% lipsite, cel puţin aproximativ 95% lipsite, cel puţin aproximativ 94% lipsite, cel puţin aproximativ 93% lipsite, cel puţin aproximativ 92% lipsite, cel puţin aproximativ 91% lipsite, sau cel puţin aproximativ 90% lipsite de orice materie biologică contaminantă. Produsele biologice reziduale pot include materiale abiotice (incluzând chimicale) sau acizi nucleici, proteine, lipide, sau metaboliţi, nedorite. În anumite aspecte, preparatele de EV, de exemplu, exozom, izolată sunt aproximativ 100% lipsite, cel puţin aproximativ 99% lipsite, cel puţin aproximativ 98% lipsite, cel puţin aproximativ 97% lipsite, cel puţin aproximativ 96% lipsite, cel puţin aproximativ 95% lipsite, cel puţin aproximativ 94% lipsite, cel puţin aproximativ 93% lipsite, cel puţin aproximativ 92% lipsite, cel puţin aproximativ 91% lipsite, sau cel puţin aproximativ 90% lipsite de orice macromoleculă, de exemplu, de orice acizi nucleici, proteine, lipide, şi/sau carbohidraţi. Substanţial lipsite de produse biologice reziduale poate de asemenea să însemne că compoziţia de EV, de exemplu, exozom, izolată nu conţine celule producătoare detectabile şi doar EV-urile, de exemplu, exozomi, sunt detectabile.
Termenul "excipient" sau "purtător" se referă la o substanţă inertă adăugată la o compoziţie farmaceutică pentru a facilita o mai bună administrare a unui compus. Termenii "purtător acceptabil farmaceutic," "excipient acceptabil farmaceutic," şi variantele gramaticale ale acestora cuprind oricare dintre agenţii aprobaţi de către agenţia de reglementare din Guvernul Federal al S.U.A. sau enumeraţi în U.S. Pharmacopeia pentru utilizare la animale, incluzând oameni, precum şi orice purtător sau diluant care nu provoacă iritaţii semnificative la un subiect şi nu abrogă activitatea biologică şi proprietăţile compusului administrat. Sunt incluşi excipienţi şi purtători care sunt utili la prepararea unei compoziţii farmaceutice şi sunt în general siguri, netoxici, şi dezirabili.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "încărcătură utilă" se referă la orice moleculă care poate fi ataşată la o schelă conform prezentei dezvăluiri şi ulterior ancorată la membrana unei EV, de exemplu, un exozom, conform prezentei dezvăluiri. În unele variante de realizare, încărcătura utilă este ataşată la membrana suprafeţei luminale a EV, de exemplu, exozom,. Termenul încărcătură utilă cuprinde moleculă activă biologic, de exemplu, moleculă care poate avea un efect terapeutic şi/sau profilactic, precum şi moleculă de diagnostic. Prin urmare, termenul încărcătură utilă cuprinde de asemenea fracţiuni detectabile cum ar fi radionuclide, molecule fluorescente, agenţi de contrast, etichete, sau entităţi moleculare care pot fi recunoscute de o fracţiune detectabilă, de exemplu, liganzi sau etichete.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul încărcătură utilă este echivalent cu şi interschimbabil cu termenul "sarcină." Prin urmare "proteină de sarcină" sau "peptidă de sarcină " se referă la tipuri specifice de molecule de încărcătură utilă (proteine şi peptide, respectiv) ataşate la o schelă conform prezentei dezvăluiri.
Termenul "moleculă activă biologic" astfel cum se utilizează în prezenta se referă la orice moleculă care poate fi ataşată la o EV, de exemplu, exozom, printr-o schelă conform prezentei dezvăluiri în care molecula poate avea un efect terapeutic sau profilactic la un subiect care are nevoie de aceasta, sau afectează homeostaza unei celule sau ţesut la un subiect. Exemple nelimitative de moleculă activă biologic care poate fi introdusă într-o EV, de exemplu, exozom, şi/sau a celulă producătoare includ, de exemplu, agenţi terapeutici cum ar fi nucleotide (de exemplu, nucleotide cuprinzând o fracţiune detectabilă sau o toxină sau care întrerupe transcripţia), acizi nucleici (de exemplu, molecule de ADN sau mARN care codifică o polipeptidă cum ar fi o enzimă, sau molecule de ARN care au funcţie de reglare cum ar fi miARN, dsADN, IncARN, şi siRNA), aminoacizi (de exemplu, aminoacizi cuprinzând o fracţiune detectabilă sau o toxină sau care întrerupe translaţia), polipeptide (de exemplu, enzime sau anticorpi), lipide, carbohidraţi, virusuri şi particule virale (de exemplu, virusuri adeno-asociate şi particule virale, retrovirusuri, adenovirusuri, etc.) şi molecule mici (de exemplu, medicamente şi toxine cu molecule mici), incluzând agonişti STING cu molecule mici incluzând dinucleotide ciclice cum ar fi ML-RR S2 şi 3'-3' cAIMPdFSH). În anumite aspecte, o încărcătură utilă cuprinde un antigen. În anumite aspecte, molecula biologic activă, de exemplu, agentul terapeutic, de exemplu, agent terapeutic la oameni, reţine o funcţie biologică, de exemplu, o funcţie terapeutică, atunci când este fuzionată la o proteină schelă dezvăluită în prezenta. În unele aspecte, molecula activă biologic poate avea cel puţin 5 aminoacizi, cel puţin 6 aminoacizi, cel puţin 7 aminoacizi, cel puţin 8 aminoacizi, cel puţin 9 aminoacizi, cel puţin 10 aminoacizi, cel puţin 15 aminoacizi, cel puţin 20 aminoacizi, cel puţin 25 aminoacizi, cel puţin 30 aminoacizi, cel puţin 35 aminoacizi, cel puţin 40 aminoacizi, cel puţin 45 aminoacizi, cel puţin 50 aminoacizi, cel puţin 55 aminoacizi, cel puţin 60 aminoacizi, cel puţin 65 aminoacizi, cel puţin 70 aminoacizi, cel puţin 75 aminoacizi, cel puţin 100 aminoacizi, cel puţin 150 aminoacizi, cel puţin 200 aminoacizi, cel puţin 250 aminoacizi, cel puţin 300 aminoacizi, cel puţin 350 aminoacizi, cel puţin 400 aminoacizi, sau cel puţin 500 aminoacizi. În unele aspecte, molecula activă biologic poate avea cel puţin 5 aminoacizi. În unele aspecte, molecula activă biologic poate avea cel puţin 10 aminoacizi. În unele aspecte, molecula activă biologic poate avea cel puţin 50 aminoacizi. În unele aspecte, molecula activă biologic poate avea cel puţin 100 aminoacizi. În unele aspecte, molecula activă biologic poate avea cel puţin 5 aminoacizi, de exemplu, 5-500, 5-450, 5-400, 5-350, 5-300, 5-250, 5-200, 5-150, 5-100, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, sau 5-10 aminoacizi. În unele aspecte, molecula activă biologic poate avea cel puţin 10 aminoacizi, de exemplu, 10-500, 10-450, 10-400, 10-350, 10-300, 10-250, 10-200, 10-150, 10-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, sau 10-15 aminoacizi. În unele aspecte, molecula activă biologic poate avea cel puţin 50 aminoacizi, de exemplu, 50-500, 50-450, 50-400, 50-350, 50-300, 50-250, 50-200, 50-150, 50-100, 50-90, 50-80, 50-50, sau 50-60 aminoacizi. În unele aspecte, molecula activă biologic poate avea cel puţin 100 aminoacizi, de exemplu, 100-500, 100-450, 100-400, 100-350, 100-300, 100-250, 100-200, sau 100-150 aminoacizi. În alte aspecte, molecula activă biologic are cel puţin două, cel puţin trei, cel puţin patru, cel puţin cinci, cel puţin şase, cel puţin şapte, cel puţin opt, cel puţin nouă, cel puţin zece, cel puţin 11, cel puţin 12, cel puţin 15, cel puţin 20, cel puţin 25, cel puţin 30, cel puţin 35, cel puţin 40, cel puţin 45, cel puţin 50, cel puţin 60, cel puţin 70, cel puţin 80, cel puţin 90, cel puţin 100, cel puţin 110, cel puţin 120, cel puţin 130, cel puţin 140, cel puţin 150, cel puţin 160, cel puţin 170, cel puţin 180, cel puţin 190, cel puţin 200, cel puţin 300, cel puţin 400, sau cel puţin 500 nucleotide. În alte aspecte, molecula activă biologic are cel puţin două nucleotide, de exemplu, 2-1000, 2-900, 2-500, 2-300, sau 2-50. În alte aspecte, molecula activă biologic are cel puţin 10 nucleotide, de exemplu, 10-1000, 10-900, 10-500, 10-300, sau 10-50. În alte aspecte, molecula activă biologic are cel puţin 15 nucleotide, de exemplu, 15-1000, 15-900, 15-500, 15-300, sau 15-50. În alte aspecte, molecula activă biologic are cel puţin 20 nucleotide, de exemplu, 20-1000, 20-900, 20-500, 20-300, sau 20-50. În alte aspecte, molecula activă biologic are cel puţin 50 nucleotide, de exemplu, 50-1000, 50-900, 50-500, 50-300, sau 50-100. În alte aspecte, molecula activă biologic are cel puţin 100 nucleotide, de exemplu, 100-10000, 100-9000, 100-5005, 100-3000, sau 100-500. În alte aspecte, molecula activă biologic are cel puţin 200 nucleotide, de exemplu, 200-10000, 200-9000, 200-5000, 200-3000, sau 200-500. În alte aspecte, molecula activă biologic are cel puţin 500 nucleotide, de exemplu, 500-10000, 500-9000, 500-5000, sau 500-3000. Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "antigen" se referă la orice agent care, atunci când este introdus într-un subiect, declanşează un răspuns imun (celular sau umoral) la el. În unele aspecte, molecula încărcăturii utile este legată covalent la EV, de exemplu, exozom. În alte aspecte, o încărcătură utilă cuprinde un adjuvant.
O polipeptidă sau proteină "recombinantă" se referă la o polipeptidă sau proteină produsă prin tehnologia cu ADN recombinant. Polipeptidele şi proteinele produse recombinant exprimate în celule gazdă inginerizate sunt considerate izolate în scopul dezvăluirii, după cum sunt şi polipeptidele native sau recombinante care au fost separate, fracţionate, sau purificate parţial sau substanţial prin orice tehnică adecvată. Polipeptidele dezvăluită în prezenta pot fi produse recombinant utilizând metode cunoscute în domeniu. Alternativ, proteinele şi peptidele dezvăluite în prezenta pot fi sintetizate chimic. În unele aspecte ale prezentei dezvăluiri, proteinele schelă prezente în EV-uri, de exemplu, exozomi, sunt produse recombinant supraexprimând proteinele schelă în celulele producătoare, astfel încât nivelurile de proteine schelă din EV-uri, de exemplu, exozomi, rezultate, sunt semnificativ crescute faţă de nivelurile proteinelor schelă prezente în EV-uri, de exemplu, exozomi, de celule producătoare care nu supraexprimă aceste proteine schelă.
a Astfel cum se utilizează în prezenta, termenii "a ancora" sau "ancorare" a unei molecule active biologic de pe suprafaţa luminală sau exterioară a unei EV (de exemplu, exozom) conform prezentei dezvăluiri printr-o proteină schelă se referă la ataşarea covalentă a moleculei active biologic la porţiunea moleculei schelă situată pe suprafaţa luminală sau, respectiv, exterioară a EV (de exemplu, exozom). Termenii "asociat," "asociere," şi variantele gramaticale ale acestora sunt utilizaţi interschimbabil şi se referă la o primă fracţiune, de exemplu, o primă secvenţă de aminoacizi sau secvenţă de nucleotide, unită covalent sau necovalent cu o a doua fracţiune, de exemplu, o a doua secvenţă de aminoacizi sau secvenţă de nucleotide, respectiv. Prima fracţiune poate fi unită direct sau juxtapusă la a doua fracţiune sau alternativ o fracţiune intermediară poate uni covalent prima fracţiune cu a doua fracţiune. În unele variante de realizare, termenul "asociat" include miristoilare, interacţiune ionică, sau orice combinaţie a acestora. Termenul "legat" sau "fuzionat" astfel cum se utilizează în prezenta se referă la o fuziune între o primă fracţiune şi o a doua fracţiune la capătul C-terminal sau capătul N-terminal printr-o legătură peptidică sau printr-un linker de unul sau mai mulţi aminoacizi. Termenul "legat" sau "fuzionat" include de asemenea introducerea primei fracţiuni (sau a celei de-a doua fracţiuni) integrale în, de exemplu, între, oricare două puncte, de exemplu, aminoacizi, din a doua fracţiune (sau prima fracţiune, respectiv). Într-un aspect, prima fracţiune este legată la o a doua fracţiune printr-o legătură peptidică sau un linker. Prima fracţiune poate fi legată la o a doua fracţiune printr-o legătură fosfodiesterică sau un linker. Linkerul poate fi o peptidă sau o polipeptidă (pentru lanţuri polipeptidice) sau o nucleotidă sau un lanţ nucleotidic (pentru lanţuri nucleotidice) sau orice fracţiune chimică (pentru lanţuri polipeptidice sau polinucleotidice sau orice moleculă chimică). Termenul "legat" poate de asemenea să fie indicat printr-o liniuţă (-). În unele aspecte, o proteină schelă de pe o EV, de exemplu, exozom, poate fi legată sau fuzionată la o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic. Astfel cum se utilizează în prezenta, "un subiect mamifer" include toate mamiferele, incluzând fără limitare, oameni, animale domestice (de exemplu, câini, pisici şi altele asemenea), animale de fermă (de exemplu, vaci, oi, porci, cai şi altele asemenea) şi animale de laborator (de exemplu, maimuţe, şobolani, şoareci, iepuri, purceluşi de guineea, şi altele asemenea). Termenii "individ," "subiect," "gazdă," şi "pacient," şi variantele acestora, sunt utilizate interschimbabil în prezenta şi se referă la orice subiect mamifer pentru care se doreşte diagnostic, tratament sau terapie, în particular oameni. Metodele descrise în prezenta sunt aplicabile atât terapiilor umane, cât şi aplicaţiilor veterinare. În unele aspecte, subiectul este un mamifer, şi în alte aspecte subiectul este un om. Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "substanţial lipsit(ă)" semnifică faptul că proba cuprinzând EV-uri, de exemplu, exozomi cuprinde mai puţin de 10% din macromolecule, de exemplu, contaminanţi, ca o concentraţie procentuală de masă/volum (m/v). Unele fracţii pot conţine mai puţin decât aproximativ 0,001%, mai puţin decât aproximativ 0,01%, mai puţin decât aproximativ 0,05%, mai puţin decât aproximativ 0,1%, mai puţin decât aproximativ 0,2%, mai puţin decât aproximativ 0,3 %, mai puţin decât aproximativ 0,4%, mai puţin decât aproximativ 0,5%, mai puţin decât aproximativ 0,6%, mai puţin decât aproximativ 0,7%, mai puţin decât aproximativ 0,8%, mai puţin decât aproximativ 0,9%, mai puţin decât aproximativ 1%, mai puţin decât aproximativ 2%, mai puţin decât aproximativ 3%, mai puţin decât aproximativ 4%, mai puţin decât aproximativ 5%, mai puţin decât aproximativ 6%, mai puţin decât aproximativ 7%, mai puţin decât aproximativ 8%, mai puţin decât aproximativ 9%, sau mai puţin decât aproximativ 10% (m/v) din macromolecule. Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "macromoleculă" semnifică acizi nucleici, proteine exogene, lipide, carbohidraţi, metaboliţi (de exemplu, metaboliţi polimerici), sau o combinaţie a acestora. Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "proteină de EV convenţională" semnifică o proteină cunoscută anterior ca fiind îmbogăţită în EV-uri. Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "proteină de EV, de exemplu, exozom, convenţională" semnifică o proteină cunoscută anterior ca fiind îmbogăţită în exozomi, incluzând, dar fără a se limita la CD9, CD63, CD81, PDGFR, proteine de ancorare GPI, lactaderină LAMP2, şi LAMP2B, un fragment al acestora, sau o peptidă care se leagă la acestea. Pentru înlăturarea oricărei neînţelegeri, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportorul ATP sau un fragment sau o variantă a acestora nu sunt proteine de EV, de exemplu, exozom, convenţionale. Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "compoziţie farmaceutică" se referă la unul sau mai mulţi dintre compuşii descrişi în prezenta, cum ar fi, de exemplu, o EV, cum ar fi exozom conform prezentei dezvăluiri, amestecaţi sau încorporaţi cu, sau suspendaţi în una sau mai multe componente chimice, cum ar fi purtători şi excipienţi acceptabili farmaceutic. Un scop al unei compoziţii farmaceutice este de a facilita administrarea preparatelor cu EV-uri, de exemplu, exozomi, la un subiect. Termenul "polinucleotidă" astfel cum se utilizează în prezenta se referă la polimeri de nucleotide de orice lungime, incluzând ribonucleotide, deoxiribonucleotide, analogi ai acestora, sau amestecuri ale acestora. Acest termen se referă la structura principală a moleculei. Aşadar, termenul include acid deoxiribonucleic ("ADN") triplu-, dublu- şi simplu-spiralat, precum şi acid ribonucleic ("ARN") triplu-, dublu- şi simplu-spiralat. Acesta include de asemenea forme modificate, de exemplu prin alchilare, şi/sau prin acoperire, ale polinucleotidei şi forme nemodificate ale polinucleotidei. Mai specific, termenul "polinucleotidă" include polideoxiribonucleotidă (conţinând 2-deoxi-D-riboză), poliribonucleotidă (conţinând D-riboză), incluzând tARN, rARN, hARN, siARN şi mARN, fie matisat sau nematisat, orice alt tip de polinucleotidă care este o N- sau C-glicozidă a unei baze purinice sau pirimidinice, şi alţi polimeri conţinând schelete normucleotidice, de exemplu, poliamide (de exemplu, peptide de acizi nucleici "PNA-uri") şi polimorfolino polimeri, şi alţi polimeri de acid nucleic sintetici specifici secvenţei cu condiţia ca polimerii să conţină nucleobaze într-o configuraţie care permite împerecherea bazelor şi şi înşirarea bazelor, cum se regăseşte în ADN şi ARN. În aspecte particulare, polinucleotida cuprinde un mARN. În alt aspect, mARN-ul este un mARN sintetic. În unele aspecte, mARN-ul sintetic cuprinde cel puţin o nucleobază nenaturală. În unele aspecte, toate nucleobazele unei anumite clase au fost înlocuite cu nucleobaze nenaturale (de exemplu, toate uridinele dintr-o polinucleotidă dezvăluită în prezenta pot fi înlocuite cu o nucleobzaă nenaturală, de exemplu, 5-metoxiuridină). În unele aspecte conform prezentei dezvăluiri, molecula activă biologic este o polinucleotidă. Termenii "polipeptidă," "peptidă," şi "proteină" sunt utilizaţi interschimbabil în prezenta şi se referă la polimeri de aminoacizi de orice lungime. Polimerul poate cuprinde aminoacizi modificaţi. Termenii cuprind de asemenea un polimer de aminoacid care a fost modificat natural sau prin intervenţie; de exemplu, formarea de legături disulfidice, glicozilare, lipidare, acetilare, fosforilare, sau orice altă manipulare sau modificare, cum ar fi conjugarea cu o componentă de etichetare. În definiţie sunt incluse şi, de exemplu, polipeptidele conţinând unul sau mai mulţi analogi ai unui aminoacid (incluzând, de exemplu, aminoacizi nenaturali cum ar fi homocisteină, ornitină, p-acetilfenilalanină, D-aminoacizi, şi creatină), precum şi alte modificări cunoscute în domeniu. În unele aspecte conform prezentei dezvăluiri, încărcătura utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic, ataşată la EV, de exemplu, exozom, este o polipeptidă, de exemplu, un anticorp sau un derivat al acestuia cum ar fi un ADC, un PROTAC, o toxină, o proteină de fuziune, sau o enzimă. Termenul "polipeptidă," astfel cum se utilizează în prezenta, se referă la proteine, polipeptide, şi peptide de orice dimensiune, structură, sau funcţie. Polipeptidele includ produse genetice, polipeptide prezente în natură, polipeptide sintetice, omologi, ortologi, paralogi, fragmente şi alţi echivalenţi, variante, şi analogi ai celor de mai sus. O polipeptidă poate fi o polipeptidă singulară sau poate fi un complex multi-molecular cum ar fi un dimer, trimer sau tetramer. Acestea pot de asemenea să cuprindă polipeptide monocatenare sau multicatenare. Cele mai comune legături disulfidice se regăsesc în polipeptidele multicatenare. Termenul polipeptidă poate de asemenea să se aplice la polimerii de aminoacid în care unul sau mai multe resturi de aminoacizi sunt un analog chimic artificial al unui aminoacid prezent în natură. În unele aspecte, o "peptidă" poate avea mai puţin de sau exact 50 aminoacizi în lungime, de exemplu, aproximativ 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, sau 50 aminoacizi în lungime. În unele aspecte, o "peptidă" poate avea cel puţin aproximativ 2 la aproximativ 50, cel puţin aproximativ 3 la aproximativ 50, cel puţin aproximativ 4 la aproximativ 50, cel puţin aproximativ 5 la aproximativ 50, cel puţin aproximativ 10 la aproximativ 50, cel puţin aproximativ 15 la aproximativ 50, cel puţin aproximativ 20 la aproximativ 50, cel puţin aproximativ 25 la aproximativ 50, cel puţin aproximativ 30 la aproximativ 50, cel puţin aproximativ 35 la aproximativ 50, cel puţin aproximativ 40 la aproximativ 50, sau cel puţin aproximativ 45 la aproximativ 50 aminoacizi în lungime. Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "proteină schelă conform prezentei dezvăluiri," sau variantele gramaticale, se referă la
(i) o proteină (exprimată natural, sintetizată chimic sau enzimatic, sau produsă recombinant) care se situează la suprafaţa luminală a EV-urilor, de exemplu, exozomi, cum ar fi MARCKS, MARKSL1, sau BASP1;
(ii) orice fragment funcţional al (i);
(iii) orice variantă funcţională a (i)-(ii);
(iv) orice derivat al (i)-(iii);
(v) orice peptidă corespunzătoare unui domeniu sau combinaţie a acestora derivată dintr-o proteină din (i) care se poate lega la suprafaţa luminală a EV-urilor, de exemplu, exozomi, sau o moleculă cuprinzând o astfel de peptidă;
(vi) orice peptidă derivată dintr-un motiv derivat dintr-o proteină din (i) care se poate lega la suprafaţa luminală a EV-urilor, de exemplu, exozomi, sau o moleculă cuprinzând o astfel de peptidă;
(vii) o moleculă a (i) până la (vi) cuprinzând cel puţin un aminoacid nenatural;
(viii) sau orice combinaţie a acestora,
care este adecvată pentru utilizare ca schelă pentru a ţinti (ataşa la) încărcături utile, de exemplu, molecule active biologic (de exemplu, proteine terapeutice) la suprafaţa luminală a EV-urilor, de exemplu, exozomi.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "EV, de exemplu, exozom, conform prezentei dezvăluiri," sau variantele gramaticale, se referă la o EV, de exemplu, un exozom, care cuprinde cel puţin o proteină schelă conform prezentei dezvăluiri.
Astfel cum se utilizează în prezenta, termenul "celulă producătoare conform prezentei dezvăluiri," sau variantele gramaticale, se referă la o celulă care poate produce o EV, de exemplu, exozom, conform prezentei dezvăluiri.
II. Proteine de veziculă extracelulară, de exemplu, proteine de exozom
Unele aspecte conform prezentei dezvăluiri se referă la identificarea, utilizarea şi modificarea proteinelor de EV-uri, de exemplu, exozom (proteine schelă), care sunt foarte îmbogăţite în suprafeţele luminale ale EV, de exemplu, exozom. Aceste proteine de EV sau proteine de exozom (proteine schelă) pot fi identificate prin analizarea EV-urilor, de exemplu, exozomi, purificate cu spectrometrie de masă sau alte metode cunoscute în domeniu.
Proteinele schelă conform prezentei dezvăluiri includ diverse proteine luminale sau proteine membranare, cum ar fi proteine transmembranare (adică, proteine care se întind pe membrana EV prin una sau mai multe spirale transmembranare), proteine integrale, şi proteine periferice (adică, proteine de pe suprafaţa luminală care interacţionează cu suprafaţa prin interacţiuni electrostatice şi/sau fracţiuni de ancorare), îmbogăţite pe membranele EV, de exemplu, exozom. În mod specific, proteinele schelă conform prezentei dezvăluiri includ, dar nu se limitează la,
(1) substrat de protein kinază C bogat în alanină miristoilată (MARCKS);
(2) substrat de protein kinază C bogat în alanină miristoilată de tip 1 (MARCKSL1); şi
(3) proteina 1 solubilă în acid cerebral (BASP1).
Una sau mai multe proteine de EV, de exemplu, exozom, identificate în prezenta (proteine schelă) pot fi utilizate selectiv în funcţie de o celulă producătoare, condiţiile de producere, metodele de purificare, sau aplicarea preconizată a exozomilor.
Proteinele de EV, de exemplu, exozom, îmbogăţite în lumenul (de exemplu, pe suprafaţa luminală a membranei EV) anumitor EV-uri, de exemplu, exozomi, cu un interval de mărimi, o fracţiune de ţintire, o densitate a încărcării, o încărcătură utilă, etc. pot fi identificate şi utilizate în unele aspecte conform prezentei dezvăluiri.
În unele aspecte, mai mult de o proteină de EV, de exemplu, exozom, dezvăluită în prezenta (de exemplu, proteine schelă cum ar fi MARCKS, MARKSL1, BASP1, orice fragment, variantă sau derivat funcţional al acesteia, sau orice combinaţie a acestora) poate fi utilizată concomitent sau subsecvent pentru generarea şi izolarea de EV terapeutice, de exemplu, exozomi, conform prezentei dezvăluiri.
III. EV-uri, de exemplu, exozomi, cu lumen modificat
Veziculele extracelulare (EV-uri), de exemplu, exozomi, au în mod tipic 20 nm până la 1000 nm în diametru. Exozomii, care sunt vezicule extracelulare mici, au în mod tipic 100-200 nm în diametru. EV-urile, de exemplu, exozomi, sunt compuse dintr-un bistrat lipidic limitrof şi un set divers de proteine şi acizi nucleici (Maas, S.L.N., şi colab., Trends. Cell Biol. 27(3):172-188 (2017)). EV-urile, de exemplu, exozomi, prezintă o absorbţie preferenţială în diferite tipuri de celule şi ţesuturi, şi tropismul lor poate fi dirijat prin adăugarea de proteine la suprafaţa lor care interacţionează cu receptorii de pe suprafaţa celulelor ţintă (Alvarez-Erviti, L., şi colab., Nat. Biotechnol. 29(4):341-345 (2011)).
Spre deosebire de anticorpi, EV-urile, de exemplu, exozomii, pot găzdui numere mari de molecule ataşate de suprafaţa lor, de ordinul miilor până la zeci de mii de molecule per EV, de exemplu, exozom. Conjugatele sau complexele cuprinzând EV-uri, de exemplu, exozomi, şi încărcături utile, de exemplu, molecule active biologic (de exemplu, molecule terapeutice), reprezintă aşadar o platformă pentru livrarea unei concentraţii mari de compus terapeutic sau de diagnostic către diferite tipuri de celule, limitând totodată expunerea sistemică de ansamblu la compus, care la rândul său reduce toxicitatea în afara ţintei. Mai departe, EV-urile, de exemplu, exozomii, oferă posibilitatea de a găzdui multiple încărcături utile, de exemplu, molecule active biologic, în diferite compartimente. De exemplu, EV, de exemplu, exozomul, poate cuprinde, de exemplu, fracţiuni de ţintire ataşate la suprafaţa exterioară a EV-urilor care ar dirija EV către o anumită celulă ţintă (de exemplu, o celulă canceroasă) sau ţesut ţintă (de exemplu, ficat sau creier), una sau mai multe fracţiuni terapeutice (de exemplu, medicamente), şi/sau una sau mai multe fracţiuni detectabile (de exemplu, reactivi de contrast sau radionuclide).
EV, de exemplu, exozomul, poate de asemenea să cuprindă diferite încărcături utile, de exemplu, fracţiuni terapeutice (de exemplu, medicamente) şi/sau fracţiuni detectabile (de exemplu, reactivi de contrast sau radionuclide) ataşate de suprafaţa luminală a EV-urilor. În plus, EV, de exemplu, exozomul, poate de asemenea să cuprindă una sau mai multe încărcături utile, de exemplu, molecule active biologic (de exemplu, agenţi terapeutici, reactivi de diagnosticare, adjuvanţi, etc.), în lumenul EV, de exemplu, un exozom.
Aşadar, EV-urile, de exemplu, exozomii, asigură un format de livrare care combină multiple încărcături utile, de exemplu, molecule active biologic, cu acelaşi rol sau cu roluri diferite într-un singur vehicul de livrare, şi la o densitate foarte mare.
EV-urile, de exemplu, exozomii, descrise în prezenta sunt vezicule extracelulare cu un diametru între aproximativ 20-300 nm. În anumite variante de realizare, o EV, de exemplu, exozom, conform prezentei dezvăluiri are un diametru între aproximativ 20-290 nm, 20-280 nm, 20-270 nm, 20-260 nm, 20-250 nm, 20-240 nm, 20-230 nm, 20-220 nm, 20-210 nm, 20-200 nm, 20-190 nm, 20-180 nm, 20-170 nm, 20-160 nm, 20-150 nm, 20-140 nm, 20-130 nm, 20-120 nm, 20-110 nm, 20-100 nm, 20-90 nm, 20-80 nm, 20-70 nm, 20-60 nm, 20-50 nm, 20-40 nm, 20-30 nm, 30-300 nm, 30-290 nm, 30-280 nm, 30-270 nm, 30-260 nm, 30-250 nm, 30-240 nm, 30-230 nm, 30-220 nm, 30-210 nm, 30-200 nm, 30-190 nm, 30-180 nm, 30-170 nm, 30-160 nm, 30-150 nm, 30-140 nm, 30-130 nm, 30-120 nm, 30-110 nm, 30-100 nm, 30-90 nm, 30-80 nm, 30-70 nm, 30-60 nm, 30-50 nm, 30-40 nm, 40-300 nm, 40-290 nm, 40-280 nm, 40-270 nm, 40-260 nm, 40-250 nm, 40-240 nm, 40-230 nm, 40-220 nm, 40-210 nm, 40-200 nm, 40-190 nm, 40-180 nm, 40-170 nm, 40-160 nm, 40-150 nm, 40-140 nm, 40-130 nm, 40-120 nm, 40-110 nm, 40-100 nm, 40-90 nm, 40-80 nm, 40-70 nm, 40-60 nm, 40-50 nm, 50-300 nm, 50-290 nm, 50-280 nm, 50-270 nm, 50-260 nm, 50-250 nm, 50-240 nm, 50-230 nm, 50-220 nm, 50-210 nm, 50-200 nm, 50-190 nm, 50-180 nm, 50-170 nm, 50-160 nm, 50-150 nm, 50-140 nm, 50-130 nm, 50-120 nm, 50-110 nm, 50-100 nm, 50-90 nm, 50-80 nm, 50-70 nm, 50-60 nm, 60-300 nm, 60-290 nm, 60-280 nm, 60-270 nm, 60-260 nm, 60-250 nm, 60-240 nm, 60-230 nm, 60-220 nm, 60-210 nm, 60-200 nm, 60-190 nm, 60-180 nm, 60-170 nm, 60-160 nm, 60-150 nm, 60-140 nm, 60-130 nm, 60-120 nm, 60-110 nm, 60-100 nm, 60-90 nm, 60-80 nm, 60-70 nm, 70-300 nm, 70-290 nm, 70-280 nm, 70-270 nm, 70-260 nm, 70-250 nm, 70-240 nm, 70-230 nm, 70-220 nm, 70-210 nm, 70-200 nm, 70-190 nm, 70-180 nm, 70-170 nm, 70-160 nm, 70-150 nm, 70-140 nm, 70-130 nm, 70-120 nm, 70-110 nm, 70-100 nm, 70-90 nm, 70-80 nm, 80-300 nm, 80-290 nm, 80-280 nm, 80-270 nm, 80-260 nm, 80-250 nm, 80-240 nm, 80-230 nm, 80-220 nm, 80-210 nm, 80-200 nm, 80-190 nm, 80-180 nm, 80-170 nm, 80-160 nm, 80-150 nm, 80-140 nm, 80-130 nm, 80-120 nm, 80-110 nm, 80-100 nm, 80-90 nm, 90-300 nm, 90-290 nm, 90-280 nm, 90-270 nm, 90-260 nm, 90-250 nm, 90-240 nm, 90-230 nm, 90-220 nm, 90-210 nm, 90-200 nm, 90-190 nm, 90-180 nm, 90-170 nm, 90-160 nm, 90-150 nm, 90-140 nm, 90-130 nm, 90-120 nm, 90-110 nm, 90-100 nm, 100-300 nm, 110-290 nm, 120-280 nm, 130-270 nm, 140-260 nm, 150-250 nm, 160-240 nm, 170-230 nm, 180-220 nm, sau 190-210 nm. Dimensiunea EV-urilor, de exemplu, exozomi, descrise în prezenta poate fi măsurată în conformitate cu metodele descrise mai jos.
În unele aspecte, o EV, de exemplu, exozom, conform prezentei dezvăluiri cuprinde o membrană bi-lipidică ("membrană de EV, de exemplu, exozom"), cuprinzând o suprafaţă interioară şi o suprafaţă exterioară. În anumite variante de realizare, suprafaţa interioară este îndreptată către nucleul interior (adică, lumen) al EV, de exemplu, exozom. În anumite aspecte, suprafaţa exterioară poate fi în contact cu endozomul, corpii multiveziculari, sau membrana/citoplasma unei celule producătoare sau a unei celule ţintă.
În unele aspecte, membrana de EV, de exemplu, exozom, cuprinde lipide şi acizi graşi. În unele aspecte, membrana de EV, de exemplu, exozom, cuprinde fosfolipide, glicolipide, acizi graşi, sfingolipide, fosfogliceride, steroli, colesteroli, şi fosfatidilserine.
În unele aspecte, membrana de EV, de exemplu, exozom, cuprinde o foiţă interioară şi o foiţă exterioară. Compoziţia foiţei interioare şi exterioare poate fi determinată prin teste de distribuţie în transbistrat cunoscute în domeniu, a se vedea, de exemplu, Kuypers şi colab., Biohim Biophys Acta 1985 819:170. În unele aspecte, compoziţia foiţei exterioare este între aproximativ 70-90% fosfolipide din colină, între aproximativ 0-15% fosfolipide acide, şi între aproximativ 5-30% fosfatidiletanolamină. În unele aspecte, compoziţia foiţei interioare este între aproximativ 15-40% fosfolipide din colină, între aproximativ 10-50% fosfolipide acide, şi între aproximativ 30-60% fosfatidiletanolamină.
Într-un aspect, prezenta dezvăluire se referă la generarea şi utilizarea de EV-uri, de exemplu, exozomi, cu lumen modificat. Exozomii cu lumen modificat au un spaţiu interior (suprafaţa luminală a EV-urilor) modificat în compoziţie, de exemplu, modificat faţă de compoziţiile exozomilor regăsiţi în natură. De exemplu, compoziţia suprafeţei luminale poate fi modificată prin schimbarea conţinutului de proteine, lipide sau glicani al componentelor părţii luminale a membranei EV, de exemplu, exozom. În unele aspecte, suprafaţa luminală a EV-urilor, de exemplu, exozomi, poate cuprinde una sau mai multe proteine exprimate recombinant, de exemplu, proteine schelă conform prezentei dezvăluiri, de exemplu, proteine ale lumenului de exozom, care nu sunt naturale pentru EV-uri, de exemplu, exozomi. Prin urmare, prezenta dezvăluire furnizează compoziţii care permit ancorarea unei încărcături utile, de exemplu, o moleculă activă biologic, pe o EV, de exemplu, un exozom, cuprinzând legarea încărcăturii utile, de exemplu, o moleculă activă biologic, la o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri. Prezenta dezvăluire furnizează de asemenea o metodă de ancorare a unei încărcături utile, de exemplu, o moleculă activă biologic, la o EV, de exemplu, un exozom, cuprinzând legarea moleculei active biologic la o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri.
În unele aspecte, proteinele schelă, de exemplu, proteine ale lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri sunt ataşate la suprafaţa luminală a EV, de exemplu, exozom, prin lipidare. În unele aspecte, proteina schelă conform prezentei dezvăluiri este acilată gras. În unele aspecte, proteina schelă este miristoilată.
Miristoilarea este o modificare prin lipidare în care o grupare miristoil, derivată din acidul miristic, este ataşată covalent printr-o legătură amidică la gruparea alfa-amino a unei glicine N-terminale. Acidul miristic este un acid gras saturat cu 14 atomi de carbon (14:4) având numele sistematic de acid n-tetradecanoic. Această modificare poate fi adăugată fie co-translaţional, fie post-translaţional. În timpul adiţiei co-translaţionale a grupării miristoil, glicina N-terminală este modificată după clivarea restului de metionină N-terminal din polipeptida în creştere nou formată. Aceasta se întâmplă în aproximativ 80% din proteinele miristoilate. Miristoilarea post-translaţională are loc în mod tipic după un eveniment de clivare a caspazei care duce la expunerea unui rest de glicină intern, care devine apoi disponibil pentru adiţia de acid miristic. În plus faţă de miristoilarea co-translaţională sau post-translaţională (efectuată fie in vivo, fie in vitro, de exemplu, enzimatic), miristoilarea proteinelor schelă, de exemplu, proteine ale lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri poate avea loc prin sinteză chimică, de exemplu, prin anexarea, ca etapă sintetică, acidului miristic la o proteină schelă în timpul sintezei chimice.
În unele variante de realizare, ancorarea lipidică la membrane biologice nu este palmitoilare (adică, ataşarea de palmitic acid, în general la cisteină şi mai puţin frecvent la serină sau treonină). În alte variante de realizare, ancorarea lipidică la membrane biologice este prenilare (ataşarea de grupări prenil) sau legarea de glicozilfosfatidilinozitol (legare GPI). Proteinele prenilate sunt proteine cu polimeri izoprenici hidrofobi legaţi covalent (adică, hidrocarburi ramificate cu cinci atomi de carbon) la resturile de cisteină ale proteinei. Proteinele legate de GPI sunt ataşate la o grupare moleculară a unui complex de GPI printr-o legătură amidică la gruparea carboxil C-terminală a proteinei. Ataşarea GPI are loc prin acţiunea complexului GPI-transamidază. Lanţurile de acizi graşi ale fosfatidilinozitolului sunt introduse în membrană şi acestea sunt cele care ancorează proteina de membrană.
În unele variante de realizare, EV-urile, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, sunt generate prin metode chimice şi/sau fizice, cum ar fi fuziune indusă de PEG şi/sau fuziune ultrasonică.
În alte variante de realizare, EV-urile, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, sunt generate prin modificare genetică. Exozomii produşi din celule producătoare modificate genetic sau o progenitură a celulei modificate genetic pot conţine compoziţii cu lumen modificat. În unele variante de realizare, EV-urile, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, au proteine de EV, de exemplu, exozom, (de exemplu, o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, cum ar fi MARCKS, MARKSL1, BASP1, sau o combinaţie a acestora) la o densitate mai mare sau mai mică sau includ o modificare sau un fragment al proteinei de EV, de exemplu, exozom (de exemplu, orice fragment, variantă sau derivat funcţional al acesteia, sau orice combinaţie a acestora).
De exemplu, EV-urile, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, pot fi produse dintr-o celulă transformată cu o secvenţă exogenă care codifică proteina de EV, de exemplu, exozom, sau o modificare sau un fragment al proteinei de EV, de exemplu, exozom (de exemplu, o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, cum ar fi MARCKS, MARKSL1, BASP1, orice fragment, variantă sau derivat funcţional al acesteia, sau orice combinaţie a acestora). EV-urile, de exemplu, exozomii, incluzând proteine exprimate din secvenţa exogenă pot include compoziţii cu proteine modificate de la suprafaţa luminală (proteină schelă).
Diferite modificări sau fragmente ale proteinei de EV, de exemplu, proteinei de exozom (de exemplu, o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, cum ar fi MARCKS, MARKSL1, BASP1, orice fragment, variantă sau derivat funcţional al acesteia, sau orice combinaţie a acestora), pot fi utilizate pentru variantele de realizare conform prezentei dezvăluiri. De exemplu, proteinele modificate încât să fie mai eficient ţintite la suprafeţele luminale ale EV, de exemplu, exozomi. Pot de asemenea să fie utilizate proteine modificate încât să cuprindă un fragment minim necesar pentru ţintirea specifică şi efectivă la suprafeţele luminale ale EV, de exemplu, exozom.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri cuprinde proteina MARCKS, sau un fragment, o variantă, sau un derivat al acesteia. Proteina MARCKS (nr. de acces Uniprot P29966) este de asemenea cunoscută ca substrat al protein kinazei C, proteină de 80 kDo proteină, lanţ uşor. Proteina MARCKS umană de lungime întreagă are 332 de aminoacizi în lungime şi cuprinde un domeniu de legare a calmodulinei la resturile de aminoacizi 152-176. În unele variante de realizare, proteina schelă conform prezentei dezvăluiri cuprinde o proteină MARCKS matură (adică, fără metionina N-terminală). În unele aspecte, proteina schelă conform prezentei dezvăluiri este derivată dintr-o proteină MARCKS matură, adică, este un fragment, o variantă, sau un derivat al unei proteine MARCKS mature şi, prin urmare, nu conţine metionina N-terminală prezentă în proteina ne-matură.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri cuprinde proteina MARCKSL1 (nr. de acces Uniprot P49006), cunoscută de asemenea ca proteina 1 de tip MARCKS, şi substrat C kinazic bogat în alanină miristoilată de macrofage. Proteina MARCKSL1 umană de lungime întreagă are 195 aminoacizi în lungime. Proteina MARCKSL1 are un domeniu efector implicat în legarea lipidelor şi legarea calmodulinei la resturile de aminoacizi 87-110. În unele variante de realizare, proteina schelă conform prezentei dezvăluiri cuprinde o proteină MARCKSL1 matură (adică, fără metionina N-terminală). În unele aspecte, proteina schelă conform prezentei dezvăluiri este derivată dintr-o proteină MARCKSL1 matură, adică, este un fragment, o variantă, sau un derivat al unei proteine MARCKSL1 mature şi, ca atare, nu conţine metionina N-terminală prezentă în proteina ne-matură.
În unele aspecte, schela conform prezentei dezvăluiri cuprinde proteina BASP1 (număr de acces Uniprot P80723), cunoscută şi ca proteina acidă îmbogăţită în ţesut neuronal de 22 kDa sau proteina membranei axonului neuronal NAP-22. Secvenţa proteică a BASP1 umană de lungime întreagă (izomer 1) are 227 de aminoacizi în lungime. Un izomer produs printr-o matisare alternativă nu conţine aminoacizii 88 până la 141 din izomerul 1. În unele variante de realizare, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri cuprinde o proteină BASP1 matură (adică, fără metionina N-terminală). În unele aspecte, proteina schelă conform prezentei dezvăluiri este derivată dintr-o proteină BASP1 matură, adică, este un fragment, o variantă, sau un derivat al unei proteine BASP1 mature şi, prin urmare, nu conţine metionina N-terminală prezentă în proteina nematură.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri cuprinde un "domeniu N-terminal" (ND) şi un "domeniu efector," în care domeniul ND şi/sau domeniul ED sunt asociate cu suprafaţa luminală a EV, de exemplu, un exozom. Astfel cum se utilizează în prezenta termenul "asociată cu" se referă la interacţiunea dintre o proteină schelă conform prezentei dezvăluiri şi suprafaţa luminală a EV, de exemplu, un exozom, care nu implică legarea covalentă la o componentă a membranei. De exemplu, schelele conform prezentei dezvăluiri pot fi asociate cu suprafaţa luminală a EV, de exemplu, printr-o ancoră lipidică (de exemplu, acid miristic), şi/sau un domeniu polibazic care interacţionează electrostatic cu capul încărcat negativ al fosfolipidelor membranei. În alte aspecte, proteina schelă cuprinde un domeniu N-terminal (ND) şi un domeniu efector (ED), în care domeniul ND este asociat cu suprafaţa luminală a EV şi domeniul ED este asociat cu suprafaţa luminală a EV printr-o interacţiune ionică, în care domeniul ED cuprinde cel puţin două, cel puţin trei, cel puţin patru, cel puţin cinci, cel puţin şase, sau cel puţin şapte lizine continue (Lys) în secvenţă.
În alte aspecte, domeniul ED mai cuprinde una sau mai multe domenii de complexitate, de exemplu, un motiv PEST. O secvenţă PEST este o secvenţă peptidică bogată în prolină (P), acid glutamic (E), serină (S), şi treonină (T). În unele aspecte, domeniul ED mai cuprinde resturi încărcate negativ (de exemplu, Glu) şi multiple Ser şi Thr care sunt supuse fosforilării temporare (aşadar, ambele adăugând sarcini negative la zonele din afara ED).
În unele aspecte, domeniul ND este asociat cu suprafaţa luminală a EV, de exemplu, un exozom, prin lipidare, de exemplu, prin miristoilare. În unele variante de realizare, domeniul ND are Gly la capătul N-terminal. În unele variante de realizare, Gly N-terminală este miristoilată. În unele aspecte, domeniul ND nu cuprinde Met la capătul N-terminal. În alte variante de realizare, domeniul ND cuprinde Gly, care este miristoilată, şi nu cuprinde Met la capătul N-terminal.
În unele aspecte, domeniul ED este asociat cu suprafaţa luminală a EV, de exemplu, un exozom, printr-o interacţiune ionică. În unele variante de realizare, domeniul ED este asociat cu suprafaţa luminală a EV, de exemplu, un exozom, printr-o interacţiune electrostatică, în particular, o interacţiune electrostatică atractivă.
În unele aspecte, domeniul ED cuprinde (i) un aminoacid bazic (de exemplu, lizină), sau (ii) doi sau mai mulţi aminoacizi bazici (de exemplu, lizină) unul lângă altul într-o secvenţă polipeptidică. În unele aspecte, aminoacidul bazic este lizină (Lys; K), arginină (Arg, R), sau Histidină (His, H). În unele variante de realizare, aminoacidul bazic este (Lys)n, în care n este un număr întreg cuprins între 1 şi 10.
În alte aspecte, domeniul ED cuprinde cel puţin o lizină şi domeniul ND cuprinde o lizină la capătul C-terminal dacă capătul N-terminal al domeniului ED este direct legat la lizină la capătul C-terminal al domeniul ND, adică, lizina este în capătul N-terminal al domeniului ED şi este fuzionată la lizina din capătul C-terminal al domeniului ND. În alte variante de realizare, domeniul ED cuprinde cel puţin două lizine, cel puţin trei lizine, cel puţin patru lizine, cel puţin cinci lizine, cel puţin şase lizine, sau cel puţin şapte lizine atunci când capătul N-terminal al domeniului ED este legat la capătul C-terminal al domeniului ND printr-un linker, de exemplu, unul sau mai mulţi aminoacizi.
În unele aspecte, domeniul ED cuprinde K, KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), sau orice combinaţie a acestora. Prezenta dezvăluire furnizează de asemenea faptul că, în unele aspecte, repetiţiile de lizină pot fi înlocuite cu arginine. În alte aspecte, repetiţiile de arginină din domeniul ED sau din proteinele schelă asigură o eficacitate de încărcare mai mică comparativ cu eficacitatea lizinei.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, utilă pentru prezenta dezvăluire necesită cel puţin două lizine sau cel puţin trei lizine, repetate în secvenţa din domeniul ED sau din domeniul ED împreună cu domeniul ND, adică, lizină la capătul C-terminal al domeniul ND şi K în capătul N-terminal al domeniului ED. În unele variante de realizare, domeniul ED cuprinde K, KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), sau orice combinaţie a acestora. În unele aspecte, domeniul ND cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în G:X2:X3:X4:X5:X6, în care G reprezintă Gly; în care ":" reprezintă o legătură peptidică, în care fiecare dintre X2 până la X6 în mod independent reprezintă un aminoacid; şi în care X6 reprezintă un aminoacid bazic. În unele aspecte, aminoacidul X6 este selectat din grupul constând din Lys, Arg, şi His. În unele aspecte, aminoacidul X5 este selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser. În unele variante de realizare, aminoacidul X2 este selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser. În unele aspecte, X4 este selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln, şi Met. În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde Met la capătul N-terminal, de exemplu, miristoilată.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinde un ND şi un ED, în care ND cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în G:X2:X3:X4:X5:X6, în care G reprezintă Gly; în care ":" reprezintă o legătură peptidică, în care fiecare dintre X2 până la X6 în mod independent reprezintă un aminoacid; în care X6 reprezintă un aminoacid bazic, aminoacidul X5 este selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser, X4 este selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln, şi Met, X3 reprezintă un aminoacid, şi aminoacidul X2 este selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser, în care domeniul ED cuprinde cel puţin un aminoacid, de exemplu, cel puţin un Lys, şi în care proteina schelă nu este (i) secvenţa de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122-150, sau 180-190 sau (ii) secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115 sau 118 la 121.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinde un domeniu N-terminal (ND) şi un domeniu efector (ED), în care domeniul ND cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în G:X2:X3:X4:X5:X6, în care G este o glicină, reprezentată ca Gly; în care ":" reprezintă o legătură peptidică, în care fiecare dintre X2 până la X6 este în mod independent un aminoacid; în care X6 cuprinde un aminoacid bazic, şi în care domeniul ED este legat la X6 printr-o legătură peptidică şi cuprinde cel puţin o lizină la capătul N-terminal al domeniul ED. În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde Met la capătul N-terminal, de exemplu, miristoilată. În alte aspecte, proteina schelă nu cuprinde sau nu constă din (i) secvenţa de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122 la 150, sau 180 la 190 sau (ii) secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115 sau 118 la 121.
În unele variante de realizare, domeniul ND al proteinei schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, cuprinde secvenţa de aminoacizi a G:X2:X3:X4:X5:X6, în care
a. G reprezintă Gly;
b. ":" reprezintă o legătură peptidică;
c. X2 reprezintă un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser;
d. X3 reprezintă orice aminoacid;
e. X4 reprezintă un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln, şi Met;
f. X5 reprezintă un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser; şi
g. X6 reprezintă un aminoacid selectat din grupul constând din Lys, Arg, şi His.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, nu cuprinde Met la capătul N-terminal, de exemplu, miristoilată. În alte aspecte, proteina schelă nu cuprinde sau constă din (i) secvenţa de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122 la 150 sau 180 la 190 sau (ii) secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115 sau 118 la 121. În unele aspecte, aminoacidul X3 este selectat din grupul constând din Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, şi Arg.
În unele aspecte, domeniul ND şi ED sunt unite printr-un linker. În unele variante de realizare, linkerul cuprinde unul sau mai mulţi aminoacizi. În unele aspecte, termenul "linker" se referă la o secvenţă peptidică sau polipeptidică (de exemplu, o secvenţă peptidică sau polipeptidică sintetică) sau la o non-polipeptidă, de exemplu, un lanţ alchil. În unele aspecte, doi sau more linkeri pot fi legaţi în tandem. În general, linkerii asigură flexibilitate sau previn/ameliorează obstacolele sterice. Linkerii nu sunt în mod tipic clivaţi; totuşi, în anumite aspecte, o astfel de clivare poate fi dezirabilă. Prin urmare, în unele variante de realizare, un linker poate cuprinde unul sau mai multe situsuri clivabile ale proteazei, care pot fi situate în interiorul secvenţei sau pot flanca linkerul la orice capăt al secvenţei linker. Atunci când domeniile ND şi ED sunt unite printr-un linker, domeniul ED cuprinde cel puţin două lizine, cel puţin trei lizine, cel puţin patru lizine, cel puţin cinci lizine, cel puţin şase lizine, sau cel puţin şapte lizine.
În unele aspecte, linkerul este un linker peptidic. În unele aspecte, linkerul peptidic poate cuprinde cel puţin aproximativ doi, cel puţin aproximativ trei, cel puţin aproximativ patru, cel puţin aproximativ cinci, cel puţin aproximativ 10, cel puţin aproximativ 15, cel puţin aproximativ 20, cel puţin aproximativ 25, cel puţin aproximativ 30, cel puţin aproximativ 35, cel puţin aproximativ 40, cel puţin aproximativ 45, cel puţin aproximativ 50, cel puţin aproximativ 55, cel puţin aproximativ 60, cel puţin aproximativ 65, cel puţin aproximativ 70, cel puţin aproximativ 75, cel puţin aproximativ 80, cel puţin aproximativ 85, cel puţin aproximativ 90, cel puţin aproximativ 95, sau cel puţin aproximativ 100 aminoacizi.
În unele aspecte, linkerul este un linker de glicină/serină. În unele variante de realizare, linkerul peptidic este linker de glicină/serină în conformitate cu formula [(Gly)n-Ser]m unde n este orice număr întreg de la 1 la 100 şi m este orice număr întreg de la 1 la 100. În alte aspecte, linkerul de glicină/serină este în conformitate cu formula [(Gly)x-Sery]z în care x este un număr întreg de la 1 la 4, y este 0 sau 1, şi z este un număr întreg de la 1 la 50. În unele aspecte, linkerul peptidic cuprinde secvenţa Gn, unde n poate fi un număr întreg de la 1 la 100. În unele aspecte, linkerul peptidic poate cuprinde secvenţa (GlyAla)n, în care n este un număr întreg cuprins între 1 şi 100. În alte aspecte, linkerul peptidic poate cuprinde secvenţa (GlyGlySer)n, în care n este un număr întreg cuprins între 1 şi 100.
În unele aspecte, linkerul peptidic este sintetic, adică, nu este prezent în natură. Într-o variantă de realizare, un linker peptidic include peptide (sau polipeptide) (de exemplu, peptide naturale sau care nu sunt prezente în natură) care cuprind o secvenţă de aminoacizi care leagă sau fuzionează genetic o primă secvenţă liniară de aminoacizi cu o a doua secvenţă liniară de aminoacizi la care aceasta nu este legată în mod natural sau fuzionată genetic în natură. De exemplu, într-un aspect linkerul peptidic poate cuprinde polipeptide care nu sunt prezente în natură care sunt forme modificate ale polipeptidelor prezente în natură (de exemplu, cuprinzând o mutaţie cum ar fi o adiţie, substituţie, sau deleţie).
În alte aspecte, linkerul peptidic poate cuprinde aminoacizi care nu sunt prezenţi în natură. În alte aspecte suplimentare, linkerul peptidic poate cuprinde aminoacizi prezenţi în natură într-o secvenţă liniară care nu este prezentă în natură. În alte aspecte suplimentare, linkerul peptidic poate cuprinde o secvenţă polipeptidică prezentă în natură.
Prezenta dezvăluire furnizează de asemenea o veziculă extracelulară (EV), de exemplu, un exozom, izolată, cuprinzând o moleculă activă biologic legată la o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, în care proteina schelă cuprinde ND-ED, în care:
a. ND cuprinde G:X2:X3:X4:X5:X6; în care:
i. G reprezintă Gly;
ii. ":" reprezintă o legătură peptidică;
iii. X2 reprezintă un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser;
iv. X3 reprezintă orice aminoacid;
v. X4 reprezintă un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Glu, şi Met;
vi. X5 reprezintă un aminoacid selectat din grupul constând din Pro, Gly, Ala, şi Ser;
vii. X6 reprezintă un aminoacid selectat din grupul constând din Lys, Arg, şi His;
b. "_" reprezintă un linker opţional; şi
c. ED este un domeniu efector cuprinzând (i) cel puţin două lizine contigue (Lys), lizina N-terminală legată la X6 printr-o legătură peptidică sau unul sau mai mulţi aminoacizi sau (ii) cel puţin o lizină, care este direct legată la X6 printr-o legătură peptidică. În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde Met la capătul N-terminal, de exemplu, miristoilată. În alte aspecte, proteina schelă nu cuprinde sau nu constă din (i) secvenţa de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122-150 sau 180 la 190 sau (ii) secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115 sau 118 la 121.
În unele aspecte, aminoacidul X2 este selectat din grupul constând din Gly şi Ala. În unele aspecte, aminoacidul X3 este Lys. În unele aspecte, aminoacidul X4 este Leu sau Glu. În unele aspecte, aminoacidul X5 este selectat din grupul constând din Ser şi Ala. În unele aspecte, aminoacidul X6 este Lys. În unele aspecte, aminoacidul X2 este Gly, Ala, sau Ser; aminoacidul X3 este Lys sau Glu; aminoacidul X4 este Leu, Phe, Ser, sau Glu; aminoacidul X5 este Ser sau Ala; şi aminoacidul X6 este Lys. În unele aspecte, linkerul cuprinde o legătură peptidică sau unul sau mai mulţi aminoacizi.
În unele aspecte, domeniul ED din proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinde Lys (K), KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), Arg (R), RR, RRR, RRRR (SEQ ID NO: 153); RRRRR (SEQ ID NO: 154), KR, RK, KKR, KRK, RKK, KRR, RRK, (K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (SEQ ID NO: 155), (K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (SEQ ID NO: 156), sau orice combinaţie a acestora.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinde o secvenţă de aminoacizi stabilită în (i) GGKLSKK (SEQ ID NO: 157), (ii) GAKLSKK (SEQ ID NO: 158), (iii) GGKQSKK (SEQ ID NO: 159), (iv) GGKLAKK (SEQ ID NO: 160), sau (v) orice combinaţie a acestora. În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde secvenţa de aminoacizi având Met la capătul N-terminal al secvenţei din (i) la (v). În alte aspecte, proteina schelă nu cuprinde sau constă din (i) secvenţa de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, sau 122-150 sau (ii) secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115 sau 118 la 121.
În unele aspecte, domeniul ND din proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinde o secvenţă de aminoacizi a (i) GGKLSK (SEQ ID NO: 203), (ii) GAKLSK (SEQ ID NO: 204), (iii) GGKQSK (SEQ ID NO: 205), (iv) GGKLAK (SEQ ID NO: 206), sau (v) orice combinaţie a acestora şi domeniul ED din proteina schelă cuprinde (a) K, (b) KK, (c) KKK, (d) KKKG (SEQ ID NO: 207), (e) KKKGY (SEQ ID NO: 208), (f) KKKGYN (SEQ ID NO: 209), (g) KKKGYNV (SEQ ID NO: 210), (h) KKKGYNVN (SEQ ID NO: 211), (i) KKKGYS (SEQ ID NO: 212), (k) KKKGYG (SEQ ID NO: 213), (1) KKKGYGG (SEQ ID NO: 214), (m) KKKGS (SEQ ID NO: 215), (n) KKKGSG (SEQ ID NO: 216), (o) KKKGSG (SEQ ID NO: 217), (p) KKKGSGS (SEQ ID NO: 218), (q) KKKS (SEQ ID NO: 219), (r) KKKSG (SEQ ID NO: 220), (s) KKKSGG (SEQ ID NO: 221), (t) KKKSGGS (SEQ ID NO: 222), (u) KKKSGGSG (SEQ ID NO: 223), (v) KKSGGSGG (SEQ ID NO: 224), (w) KKKSGGSGGS (SEQ ID NO: 225), (x) KRFSFKKS (SEQ ID NO: 226), sau orice combinaţie a acestora. În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde secvenţa de aminoacizi având Met la capătul N-terminal al secvenţei din (i) la (v). În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde sau constă din (i) secvenţa de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122 la 150 sau 180 la 190 sau (ii) secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115 sau 118 la 121.
În unele aspecte, secvenţa polipeptidică a unei proteine schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri constă dintr-o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din (i) GGKLSKK (SEQ ID NO: 157), (ii) GAKLSKK (SEQ ID NO: 158), (iii) GGKQSKK (SEQ ID NO: 159), (iv) GGKLAKK (SEQ ID NO: 160), sau (v) orice combinaţie a acestora.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinde o secvenţă de aminoacizi a (i) GGKLSKKK (SEQ ID NO: 161), (ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO: 162), (iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO: 163), (iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO: 164), (v) GGKQSKKK (SEQ ID NO: 165), (vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO: 166), (vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO: 167), (viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO: 168), sau (ix) orice combinaţie a acestora. În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde secvenţa de aminoacizi având Met la capătul N-terminal al secvenţei din (i) la (ix). În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde sau constă din (i) secvenţa de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122 la 150 sau 180 la 190 sau (ii) secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115 sau 118 la 121.
În unele aspecte, secvenţa polipeptidică a unei proteine schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri constă dintr-o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din (i) GGKLSKKK (SEQ ID NO: 161), (ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO: 162), (iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO: 163), (iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO: 164), (v) GGKQSKKK (SEQ ID NO: 165), (vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO: 166), (vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO: 167), (viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO: 168), şi (ix) orice combinaţie a acestora.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, are cel puţin aproximativ 8, cel puţin aproximativ 9, cel puţin aproximativ 10, cel puţin aproximativ 11, cel puţin aproximativ 12, cel puţin aproximativ 13, cel puţin aproximativ 14, cel puţin aproximativ 15, cel puţin aproximativ 16, cel puţin aproximativ 17, cel puţin aproximativ 18, cel puţin aproximativ 19, cel puţin aproximativ 20, cel puţin aproximativ 21, cel puţin aproximativ 22, cel puţin aproximativ 23, cel puţin aproximativ 24, cel puţin aproximativ 25, cel puţin aproximativ 26, cel puţin aproximativ 27, cel puţin aproximativ 28, cel puţin aproximativ 29, cel puţin aproximativ 30, cel puţin 31, cel puţin aproximativ 32, cel puţin aproximativ 33, cel puţin aproximativ 34, cel puţin aproximativ 35, cel puţin aproximativ 36, cel puţin aproximativ 37, cel puţin aproximativ 38, cel puţin aproximativ 39, cel puţin aproximativ 39, cel puţin aproximativ 40, cel puţin aproximativ 41, cel puţin aproximativ 42, cel puţin aproximativ 43, cel puţin aproximativ 44, cel puţin aproximativ 50, cel puţin aproximativ 46, cel puţin aproximativ 47, cel puţin aproximativ 48, cel puţin aproximativ 49, cel puţin aproximativ 50, cel puţin aproximativ 55, cel puţin aproximativ 60, cel puţin aproximativ 65, cel puţin aproximativ 70, cel puţin aproximativ 75, cel puţin aproximativ 80, cel puţin 85, cel puţin aproximativ 90, cel puţin aproximativ 95, cel puţin aproximativ 100, cel puţin aproximativ 105, cel puţin aproximativ 110, cel puţin aproximativ 115, cel puţin aproximativ 120, cel puţin aproximativ 125, cel puţin aproximativ 130, cel puţin aproximativ 135, cel puţin aproximativ 140, cel puţin aproximativ 145, cel puţin aproximativ 150, cel puţin aproximativ 155, cel puţin aproximativ 160, cel puţin aproximativ 165, cel puţin aproximativ 170, cel puţin aproximativ 175, cel puţin aproximativ 180, cel puţin aproximativ 185, cel puţin aproximativ 190, cel puţin aproximativ 195, cel puţin aproximativ 200, cel puţin aproximativ 205, cel puţin aproximativ 210, cel puţin aproximativ 215, cel puţin aproximativ 220, cel puţin aproximativ 225, cel puţin aproximativ 230, cel puţin aproximativ 235, cel puţin aproximativ 240, cel puţin aproximativ 245, cel puţin aproximativ 250, cel puţin aproximativ 255, cel puţin aproximativ 260, cel puţin aproximativ 265, cel puţin aproximativ 270, cel puţin aproximativ 275, cel puţin aproximativ 280, cel puţin aproximativ 285, cel puţin aproximativ 290, cel puţin aproximativ 295, cel puţin aproximativ 300, cel puţin aproximativ 305, cel puţin aproximativ 310, cel puţin aproximativ 315, cel puţin aproximativ 320, cel puţin aproximativ 325, cel puţin aproximativ 330, cel puţin aproximativ 335, cel puţin aproximativ 340, cel puţin aproximativ 345, sau cel puţin aproximativ 350 aminoacizi în lungime.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, are între aproximativ 5 şi aproximativ 10, între aproximativ 10 şi aproximativ 20, între aproximativ 20 şi aproximativ 30, între aproximativ 30 şi aproximativ 40, între aproximativ 40 şi aproximativ 50, între aproximativ 50 şi aproximativ 60, între aproximativ 60 şi aproximativ 70, între aproximativ 70 şi aproximativ 80, între aproximativ 80 şi aproximativ 90, între aproximativ 90 şi aproximativ 100, între aproximativ 100 şi aproximativ 110, între aproximativ 110 şi aproximativ 120, între aproximativ 120 şi aproximativ 130, între aproximativ 130 şi aproximativ 140, între aproximativ 140 şi aproximativ 150, între aproximativ 150 şi aproximativ 160, între aproximativ 160 şi aproximativ 170, între aproximativ 170 şi aproximativ 180, între aproximativ 180 şi aproximativ 190, între aproximativ 190 şi aproximativ 200, între aproximativ 200 şi aproximativ 210, între aproximativ 210 şi aproximativ 220, între aproximativ 220 şi aproximativ 230, între aproximativ 230 şi aproximativ 240, între aproximativ 240 şi aproximativ 250, între aproximativ 250 şi aproximativ 260, între aproximativ 260 şi aproximativ 270, între aproximativ 270 şi aproximativ 280, între aproximativ 280 şi aproximativ 290, între aproximativ 290 şi aproximativ 300, între aproximativ 300 şi aproximativ 310, între aproximativ 310 şi aproximativ 320, între aproximativ 320 şi aproximativ 330, între aproximativ 330 şi aproximativ 340, sau între aproximativ 340 şi aproximativ 250 aminoacizi în lungime.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinde (i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID NO: 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO: 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID NO: 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID NO: 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID NO: 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID NO: 178), sau (xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID NO: 179). În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde secvenţa de aminoacizi având Met la capătul N-terminal al secvenţei din (i) la (xi). În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde sau constă din (i) secvenţa de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122 la 150 sau 180 la 190 sau (ii) secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115 sau 118 la 121.
În unele aspecte, secvenţa polipeptidică a unei proteine schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri constă din (i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID NO: 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO: 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID NO: 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID NO: 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID NO: 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID NO: 178), sau (xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID NO: 179). În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde secvenţa de aminoacizi având Met la capătul N-terminal al secvenţei din (i) la (xi). În unele aspecte, proteina schelă nu cuprinde sau constă din (i) secvenţa de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122 la 150 sau 180 la 190 sau (ii) secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115 sau 118 la 121.
În alte aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinde oricare dintre secvenţele dezvăluite în prezenta, dar nu cuprinde secvenţa corespunzătoare având Met la capătul N-terminal, de exemplu, SEQ ID NO: 4 la 109. În unele aspecte, proteina schelă cuprinde oricare dintre secvenţele din TABELUL 1, dar nu cuprinde sau constă din (i) secvenţa de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122 la 150 sau 180 la 190 sau (ii) secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115 sau 118 la 121.
Exemple nelimitative ale proteinelor schelă, de exemplu, proteine ale lumenului de exozom, utile pentru prezenta dezvăluire, sunt enumerate mai jos.
TABELUL 1.
SEQ ID NO: Proteină schelă: GX2X3X4X5X6-ED 227 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEGAA 228 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEGA 229 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEG 230 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAE 231 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKA 232 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKK 233 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDK 234 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKD 235 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEK 236 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKE 237 GGKLSKKKKGYNVNDEKAK 238 GGKLSKKKKGYNVNDEKA 239 GGKLSKKKKGYNVNDEK 240 GGKLSKKKKGYNVNDE 241 GGKLSKKKKGYNVND 169 GGKLSKKKKGYNVN 242 GGKLSKKKKGYNV 243 GGKLSKKKKGYN 244 GGKLSKKKKGY 245 GGKLSKKKKG 246 GGKLSKKKK 161 GGKLSKKK 157 GGKLSKK 247 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKEA 248 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKE 249 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK 250 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNK 251 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKN 252 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKK 253 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFK 254 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSF 255 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFS 256 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGF 257 GAKKSKKRFSFKKSFKLSG 258 GAKKSKKRFSFKKSFKLS 259 GAKKSKKRFSFKKSFKL 260 GAKKSKKRFSFKKSFK 261 GAKKSKKRFSFKKSF 179 GAKKSKKRFSFKKS 262 GAKKSKKRFSFKK 263 GAKKSKKRFSFK 264 GAKKSKKRFSF 265 GAKKSKKRFS 266 GAKKSKKRF 267 GAKKSKKR 268 GAKKSKK 269 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKEA 270 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKE 271 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK 272 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNK 273 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKN 274 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKK 275 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFK 276 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSF 277 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFS 278 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGF 279 GAKKAKKRFSFKKSFKLSG 280 GAKKAKKRFSFKKSFKLS 281 GAKKAKKRFSFKKSFKL 282 GAKKAKKRFSFKKSFK 283 GAKKAKKRFSFKKSF 284 GAKKAKKRFSFKKS 285 GAKKAKKRFSFKK 286 GAKKAKKRFSFK 287 GAKKAKKRFSF 288 GAKKAKKRFS 289 GAKKAKKRF 290 GAKKAKKR 291 GAKKAKK 292 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKK 293 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSGFSFK 294 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSGFSF 295 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSGFS 396 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSGF 297 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSG 298 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLS 299 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKL 300 GAQESKKKKKKRFSFKKSFK 301 GAQESKKKKKKRFSFKKSF 302 GAQESKKKKKKRFSFKKS 303 GAQESKKKKKKRFSFKK 304 GAQESKKKKKKRFSFK 305 GAQESKKKKKKRFSF 306 GAQESKKKKKKRFS 307 GAQESKKKKKKRF 308 GAQESKKKKKKR 309 GAQESKKKKKK 310 GAQESKKKKK 311 GAQESKKKK 312 GAQESKKK 313 GAQESKK 314 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLSFKRNRK 315 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLSFKRNR 316 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLSFKRN 317 GSQSSKKKKKKtSFKKPFKLSGLSFKR 318 GSQSSKKKKKKtSFKKPFKLSGLSFK 319 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLSF 320 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLS 321 GSQSSKKKKKKSFKKPFKLSGL 322 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSG 323 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLS 324 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKL 325 GSQSSKKKKKKFSFKKPFK 326 GSQSSKKKKKKFSFKKPF 327 GSQSSKKKKKKFSFKKP 328 GSQSSKKKKKKFSFKK 329 GSQSSKKKKKKFSFK 330 GSQSSKKKKKKFSF 331 GSQSSKKKKKKFS 332 GSQSSKKKKKKF 333 GSQSSKKKKKK 334 GSQSSKKKKK 335 GSQSSKKKK 336 GSQSSKKK 337 GSQSSKK
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri constă sau constă în esenţă din oricare dintre secvenţele din prezenta dezvăluire. În unele aspecte, schela conform prezentei dezvăluiri constă dintr-o secvenţă dezvăluită din TABELUL 1. În unele aspecte, schela conform prezentei dezvăluiri constă dintr-o secvenţă dezvăluită în prezenta, de exemplu, o secvenţă dezvăluită din TABELUL 1, legată covalent la o ancoră a membranei (de exemplu, un acid miristic). În unele aspecte, ancorarea în membrană poate fi realizată prin lipidare. În unele variante de realizare, lipidarea poate fi, de exemplu, acilare grasă. În unele aspecte, acilarea grasă poate fi, de exemplu, miristoilare. În unele aspecte, ancora din membrană este legată covalent la aminoacidul N-terminal al unei secvenţe dezvăluite în prezenta, de exemplu, o secvenţă dezvăluită în TABELUL 1. În unele aspecte, ancora din membrană este legată covalent la glicina N-terminală a unei secvenţe dezvăluite în prezenta, de exemplu, o secvenţă dezvăluită în TABELUL 1. Prin urmare, în unele aspecte, schela conform prezentei dezvăluiri constă din o secvenţă dezvăluită, de exemplu, o secvenţă dezvăluită în TABELUL 1, care a fost N-miristoilată.
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri nu conţine o Met N-terminală. În unele aspecte, proteina schelă cuprinde un aminoacid lipidic, de exemplu, un aminoacid miristoilat, la capătul N-terminal al proteinei schelă, care funcţionează ca o ancoră lipidică. În unele aspecte, restul de aminoacizi de la capătul N-terminal al proteinei schelă este Gly. Prezenţa unei Gly N-terminale este cerinţă pentru N-miristoilare. În unele aspecte, restul de aminoacizi de la capătul N-terminal al proteinei schelă este sintetic. În unele aspecte, restul de aminoacizi de la capătul N-terminal al proteinei schelă este un analog de glicină, de exemplu, alilglicină, butilglicină, sau propargilglicină.
În unele aspecte, o ancoră lipidică poate fi ataşată prin sinteză chimică sau enzimatic la orice aminoacid N-terminal al unei proteine schelă conform prezentei dezvăluiri.
În alte aspecte, ancora lipidică poate fi orice ancoră lipidică cunoscută în domeniu, de exemplu, acid palmitic sau glicozilfosfatidilinozitoli. În cazuri neobişnuite, de exemplu, utilizând un mediu de cultură în care acidul miristic limitează, pot fi ataşaţi la glicina N-terminală alţi acizi graşi incluzându-i pe cei cu catenă mai scurtă şi nesaturaţi. De exemplu, în canalele de BK, miristatul s-a raportat ca fiind ataşat post-translaţional la resturile interioare de serină/treonină sau tirozină printr-o legătură hidroxi esterică. Ancorele membranei cunoscute în domeniu sunt prezentate în următorul tabel.
TABELUL 2
Modificare Grupare modificatoare S-Palmitoilare N-Palmitoilare N-Miristoilare Farnesilare Geranilgeranilare Colesterol
În unele variante de realizare, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 96%, cel puţin aproximativ 97%, cel puţin aproximativ 98%, cel puţin aproximativ 99%, sau aproximativ 100% identitate de secvenţă cu forma matură a SEQ ID NO: 1 (MARCKS), SEQ ID NO: 2 (MARCKSL1), sau SEQ ID NO: 3 (BASP1), adică, fără aminoacidul metionină de la capătul N-terminal prezent în SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, sau SEQ ID NO: 3.
În unele variante de realizare, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 96%, cel puţin aproximativ 97%, cel puţin aproximativ 98%, cel puţin aproximativ 99%, sau aproximativ 100% identitate de secvenţă cu un fragment funcţional al formei mature a SEQ ID NO: 1 (MARCKS), SEQ ID NO: 2 (MARCKSL1), sau SEQ ID NO: 3 (BASP1), adică, fără aminoacidul metionină la capătul N-terminal prezent în SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, sau SEQ ID NO: 3.
În unele aspecte, o moleculă activă biologic ataşată la proteina schelă conform prezentei dezvăluiri este pe partea luminală a EV (de exemplu, un exozom).
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, mai cuprinde un domeniu transmembranar. În unele aspecte, domeniul transmembranar este interpus între domeniul ED al proteinei schelă, care este situat pe partea luminală a EV (de exemplu, un exozom) şi încărcătura utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic. Aşadar, încărcătura utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic, este ancorată la suprafaţa exterioară a EV (de exemplu, un exozom).
În unele aspecte, proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, mai cuprinde un domeniu extravezicular. În unele variante de realizare, domeniul extravezicular este interpus între domeniul transmembranar şi molecula biologic activă.
În unele aspecte, proteina schelă este legată la molecula activă biologic prin cel puţin un linker, de exemplu, un linker peptidic. În unele aspecte, domeniul ND este legat la domeniul ED printr-un linker direct interpus între ambele domenii. În unele aspecte, linkerul cuprinde, de exemplu, o legătură peptidică sau unul sau mai mulţi aminoacizi. În unele aspecte, linkerul cuprinde un linker clivabil. În unele aspecte, linkerul cuprinde un linker flexibil. În unele aspecte, linkerul cuprinde un linker auto-imolativ.
Pot fi utilizate de asemenea fuziuni între o proteină schelă conform prezentei dezvăluiri şi o moleculă activă biologic (de exemplu, o moleculă având activitate terapeutică). De exemplu, proteina de fuziune poate cuprinde o proteină schelă cum ar fi MARCKS, MARCKSL1, BASP1, sau o modificare a acesteia, în particular un fragment sau o variantă a acesteia, şi o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic (de exemplu, o peptidă terapeutică). În unele aspecte, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă cuprinzând un fragment al capătului amino terminal al BASP1. În unele aspecte, molecula activă biologic cuprinde o proteină, o polipeptidă, o peptidă, o polinucleotidă (ADN şi/sau RNA), un compus chimic, un virus, un ionofor, un purtător pentru un ionofor, o fracţiune care formează un canal sau un por, sau orice combinaţie a acestora.
Molecula activă biologic (de exemplu, o peptidă terapeutică) poate fi selectată dintr-un grup care constă dintr-o peptidă naturală, o peptidă recombinantă, o peptidă sintetică, proteină de fuziune, sau un linker la un compus terapeutic. Molecula activă biologic (de exemplu, un compus terapeutic) poate fi de asemenea o nucleotidă, un aminoacid, o lipidă, carbohidrat, sau o moleculă mică. Molecula activă biologic (de exemplu, o peptidă terapeutică) poate fi un anticorp, o enzimă, un ligand, un antigen (de exemplu, un antigen tumoral sau un antigen dintr-un agent infecţios cum ar fi o bacterie, un virus, ciupercă, sau protozoare), un receptor, o peptidă antimicrobiană, un factor de transcripţie, sau un fragment ori o modificare a acestora.
Proteina de fuziune cuprinzând schela conform prezentei dezvăluiri fuzionată sau conjugată la o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic, poate fi ataşată la suprafaţa luminală a EV, de exemplu, un exozom, şi asigura, de exemplu, activitate terapeutică a EV, de exemplu, exozom.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic (de exemplu, o peptidă terapeutică) este o componentă a unui complex de editare genomică. În unele variante de realizare, respectivul complex de editare genomică este o nuclează efectoare de tip activator al transcripţiei (nucleaza efectoare TAL sau TALEN); o nuclează deget de zinc (ZFN); o recombinază; un complex CRISPR/Cas9, un complex CRISPR/Cpf1, un complex CRISPR/C2c1, C2c2, sau C2c3, un complex CRISPR/CasY sau CasX, sau orice alt complex CRISPR adecvat cunoscut în domeniu; sau orice alt complex de editare genomică adecvat cunoscut în domeniu sau orice combinaţie a acestora.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic (de exemplu, o peptidă terapeutică) este o peptidă transmembranară. Peptidele transmembranare descrise în prezenta pot fi exprimate ca proteine de fuziune pentru oricare dintre secvenţele descrise în prezenta sau orice fragmente sau variante ale acestora. În unele variante de realizare, proteina transmembranară are un prim capăt fuzionat la secvenţa luminală din lumenul EV, de exemplu, exozom, şi un al doilea capăt exprimat pe suprafaţa EV, de exemplu, exozom.
În unele variante de realizare, o EV, de exemplu, conform prezentei dezvăluiri poate cuprinde o a doua proteină schelă. În unele variante de realizare, a doua proteină schelă cuprinde o proteină transmembranară cuprinzând a PTGFRN polipeptidă, a BSG polipeptidă, o polipeptidă IGSF2, o polipeptidă IGSF3, o polipeptidă IGSF8, o polipeptidă ITGB1, o polipeptidă ITGA4, o polipeptidă SLC3A2, o polipeptidă a transportorului ATP, o polipeptidă a aminopeptidazei N (ANPEP), o polipeptidă din familia 1 de ectonucleotid pirofosfatază/fosfodiesterază (ENPP1), o polipeptidă a neprilizinei (MME), o polipeptidă a neuropolinei-1 (NRP1), sau un fragment, o variantă, sau un derivat al acestora. Exemple nelimitative pentru a doua proteină schelă pot fi găsite în brevetul din SUA nr. 10,195,290 şi publicarea PCT nr. WO 2019/040920.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic (de exemplu, o peptidă terapeutică) este o proteină de legare a acidului nucleic. În unele variante de realizare, proteina de legare a acidului nucleic este Dicer, o proteină Argonaute, TRBP, MS2 proteina învelişului de bacteriofage. În unele variante de realizare, proteina de legare a acidului nucleic cuprinde în plus una sau mai multe molecule de ARN sau ADN. În unele variante de realizare, respectivul unul sau mai mulţi ARN este un miARN, siARN, ARN de ghidare, lincARN, mARN, ARN antisens, dsARN, sau combinaţii ale acestora.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic (de exemplu, o peptidă terapeutică) este o parte a unui sistem de interacţiune proteină-proteină. În unele variante de realizare, sistemul de interacţiune proteină-proteină cuprinde un sistem de interacţiune FRB-FKBP, de exemplu, sistemul de interacţiune FRB-FKBP descris în Banaszynski şi colab., J Am Chem Soc. 2005 Apr 6; 127(13):4715-21.
Proteinele de fuziune pot fi ţintite la suprafaţa luminală a EV-urilor, de exemplu, exozomi şi asigura activitate terapeutică a EV, de exemplu, exozom.
În unele variante de realizare, sunt utilizate proteine de fuziune având o fracţiune de ţintire. De exemplu, proteinele de fuziune pot cuprinde (i) o proteină schelă cum ar fi MARCKS, MARCKSL1, BASP1, sau un fragment, o variantă, sau o modificare a acestora, şi (ii) o fracţiune de ţintire. Fracţiunea de ţintire poate fi utilizată pentru ţintirea EV, de exemplu, exozom, la un organ, ţesut sau celulă specifice pentru un tratament utilizând EV, de exemplu, exozom. În unele variante de realizare, fracţiunea de ţintire este un anticorp sau fragment de legare la antigen al acestuia.
Anticorpii şi fragmentele de legare la antigen ale acestora includ anticorpi integrali, anticorpi policlonali, monoclonali şi recombinanţi, fragmente ale acestora, şi mai includ anticorpi monocatenari, anticorpi umanizaţi, anticorpi murinici, anticorpi monoclonali himerici, şoarece-uman, şoarece-primată, primată-uman, anticorpi anti-idiotip, fragmente de anticorpi, cum ar fi, de exemplu, scFv, (scFv)2, Fab, Fab', şi F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, şi fragmente Fd, diacorpi, minicorpi, anticorpi de camelidă, şi polipeptide legate de anticorpi.
Anticorpii şi fragmentele de legare la antigen ale acestora includ de asemenea anticorpi bispecifici şi anticorpi multispecifici atâta timp cât aceştia prezintă activitatea sau funcţia biologică dorită. Arhitectura modulară a anticorpilor a fost exploatată pentru a crea mai bine de 60 de formate de anticorpi bispecifici diferiţi. A se vedea Spiess şi colab. (2015) Molecular Immunology 67:95-106. Prin urmare, în unele variante de realizare, formatul de anticorp bispecific este selectat dintre crossMab, DAF (Fab cu acţiune duală) (doi-în-unu), DAF (patru-în-unu), DutaMab, DT-IgG, LC comună butoane-în-găuri, ansamblu butoane-în-găuri, pereche de sarcini, schimb de braţ Fab, SEEDcorp, Triomab, LUZ-Y (anticorp bispecific cu un fermoar leucină care indue heterodimerizarea a două HC-uri), Fcab, Kλ-corp, Fab ortogonal, DVD-IgG (domeniu variabil dual IgG), IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zycorp, DVI-IgG (patru-în-unu), Nanocorp, Nanocorp-HSA, BiTE (antrenor de celule T bispecifice), Diacorp, DART (reţintire cu dublă afinitate), TandAb (anticorp tandem), scDiacorp, scDiacorp-CH3, Triple Corp, Minianticorp, Minicorp, TriBi minicorp, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-ScFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, Ab HC tetravalent, scDiacorp-Fc, Diacorp-Fc, Tandem scFv-Fc, Intracorp, Dock şi Locck, ImmTAC, HSAcorp, scDiacorp-HSA, Tandem scFv-Toxină, IgG-IgG, Cov-X-Corp, şi scFv1-PEG-scFV2. Anticorpii bispecifici pot fi anticorpi monospecifici modificaţi genetic pentru bispecificitate prin anexarea la capetele amino sau carboxi ale lanţului uşor sau greu de unităţi de legare la antigen suplimentare. Alternativele pentru aceste unităţi suplimentare de legare la antigen includ anticorpi cu domeniu unic (VL sau VH nepereche), domenii variabile de anticorpi pereche (de exemplu, Fv sau scFv) sau schele proteice modificate genetic. În domeniu sunt cunoscute numeroase forme de fragmente bispecifice cărora le lipsesc o parte sau întregile domenii constante ale anticorpilor bispecifici.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic (de exemplu, o peptidă terapeutică) este o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă conform prezentei dezvăluiri şi o proteină virală. În unele variante de realizare, proteina virală cuprinde o capsidă virală, o proteină de anvelopă, sau o combinaţie a acestora. În unele variante de realizare, proteinele de fuziune permit asamblarea de virusuri intacte care sunt reţinute pe suprafaţa luminală a unei EV, de exemplu, un exozom.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic este un inhibitor al regulatorului negativ al punctului de control sau un inhibitor pentru un partener de legare al unui regulator negativ al punctului de control. În unele variante de realizare, regulatorul negativ al punctului de control este selectat din grupul constând din: proteina 4 asociată limfocitelor T citotoxice (CTLA-4), proteina 1 a morţii celulare programate (PD-1), gena 3 activată de limfocite (LAG-3), proteina 3 care conţine imunoglobulină şi mucină cu celule T (TIM-3), atenuatorul de limfocite B şi T (BTLA), imunoreceptor al celulelor T cu domenii Ig şi ITIM (TIGIT), supresor Ig cu domeniu V al activării celulelor T (VISTA), receptorul A2a de adenozină (A2aR), receptorul de tip imunoglobulinic al celulelor ucigaşe (KIR), indoleamin 2,3-dioxigenaza (IDO), CD20, CD39, şi CD73.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic este o proteină imunogenă. În unele variante de realizare, molecula activă biologic este o toxină, un toxoid, sau un mutant netoxic al unei toxine. În unele variante de realizare, toxina este toxină difterio. În unele variante de realizare, toxoidul este un toxoid tetanus. În unele variante de realizare, toxina difterio este un mutant netoxic al toxinei difterio.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic este un activator pentru o moleculă co-stimulatoare pozitivă sau un activator pentru un partener de legare al unei molecule co-stimulatoare pozitive. În unele variante de realizare, molecula co-stimulatoare pozitivă este un membru al superfamiliei de receptori TNF selectat din grupul constând din: CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas receptor, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK receptor, TACI, BAFF receptor, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, şi XEDAR. În unele variante de realizare activatorul pentru o moleculă co-stimulatoare pozitivă este un membru al superfamiliei TNF selectat din grupul constând din: TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB ligand, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR ligand, şi EDA-2. În unele variante de realizare, molecula co-stimulatoare pozitivă este o moleculă co-stimulatoare a superfamiliei CD28. În unele variante de realizare, molecula co-stimulatoare a superfamiliei CD28 este ICOS sau CD28. În unele variante de realizare, activatorul pentru o moleculă co-stimulatoare pozitivă este ICOSL, CD80, sau CD86.
În unele variante de realizare, molecula activă biologic este o citokină selectată din grupul constând din: IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, şi IL-15. În unele variante de realizare, molecula activă biologic este o proteină cuprinzând un receptor de celule T (TCR), un co-receptor de celule T, un complex major de histocompatibilitate (MHC), un antigen uman al leucocitelor (HLA), sau un derivat al acestora. În unele variante de realizare, molecula activă biologic este o proteină cuprinzând un antigen tumoral. În unele variante de realizare, antigenul tumoral este selectat din grupul constând din: alfa-fetoproteină (AFP), antigen carcinoembrionar (CEA), antigen al celulelor epiteliale (ETA), mucină 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucină 16 (MUC16), tirozinază, antigen asociat melanomului (MAGE), proteina tumorală p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligand de moarte programat 1 (PD-L1), ligand de moarte programat 2 (PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mezotelină, VEGFR, receptor de alfa-folat, CE7R, IL-3, antigen al cancerului testicular, MART-1 gp100, şi ligandul inductor de apoptoză legat de TNF.
În unele aspecte, proteinele de fuziune care cuprind o moleculă activă biologic şi o proteină schelă conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, MARCKSL1, BASP1, oricare dintre SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1), sau o modificare a acestora, în particular un fragment sau o variantă a acestora), au ca rezultat îmbogăţirea unei molecule active biologic în EV-uri, de exemplu, exozomi, comparativ cu expresia unei molecule active biologic lipsită de proteina schelă. În unele aspecte, proteine de fuziune care cuprind o moleculă activă biologic şi o proteină schelă conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, MARCKSL1, BASP1 fără capătul N-terminal M, secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122 la 150 sau 180 la 190 fără capătul N-terminal M, secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115, sau 118 la 121, sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M) au ca rezultat îmbogăţirea unei molecule active biologic în EV-uri, de exemplu, exozomi, comparativ cu expresia unei molecule active biologic lipsită de proteina schelă.
În unele variante de realizare, proteina schelă utilă pentru prezenta dezvăluire cuprinde oricare dintre SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau orice secvenţe dezvăluite în TABELUL 1. În unele aspecte, proteina schelă utilă pentru prezenta dezvăluire cuprinde oricare dintre SEQ ID NO: 4-109, în care proteina schelă nu cuprinde un Met N-terminal. În unele aspecte, proteina schelă cuprinde o secvenţă dezvăluită în TABELUL 1, în care proteina schelă nu cuprinde un Met N-terminal. În unele aspecte, proteina schelă utilă pentru prezenta dezvăluire cuprinde MARCKS, MARCKSL1, BASP1 fără capătul N-terminal M, secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122 la 150 sau 180 la 190 fără capătul N-terminal M, secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115, sau 118 la 121, sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M. În unele aspecte, proteina schelă utilă pentru prezenta dezvăluire cuprinde MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1, în care proteina schelă nu cuprinde un Met N-terminal. În unele aspecte, proteina schelă cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 4 la 114, 116 la 118, 122 la 150 sau 180 la 190, în care proteina schelă nu cuprinde un Met N-terminal. În unele aspecte, proteina schelă cuprinde secvenţa de aminoacizi codificată de SEQ ID NO: 115, sau 118 la 121, în care proteina schelă nu cuprinde un Met N-terminal. În alte variante de realizare, proteina schelă utilă pentru prezenta dezvăluire cuprinde orice secvenţă dezvăluită în prezenta, dar nu este oricare dintre SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau orice secvenţe dezvăluite în TABELUL 1 fără capătul N-terminal M. În alte variante de realizare, proteina schelă utilă pentru prezenta dezvăluire cuprinde orice secvenţă dezvăluită în prezenta, dar nu cuprinde oricare dintre SEQ ID NO: 4-109.
În unele variante de realizare, proteinele de fuziune cuprind o proteină schelă cuprinzând o peptidă cu secvenţa MGXKLSKKK, unde X este alanină sau orice alt aminoacid (SEQ ID NO: 117); sau o peptidă cu secvenţa de (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), în care M N-terminal este clivat, astfel încât proteina de fuziune rezultată cuprinde GXKLSKKK (SEQ ID NO: 425) sau (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) unite cu molecula biologic activă, în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu). În unele variante de realizare, proteina schelă utilă pentru prezenta dezvăluire nu este MGXKLSKKK, unde X este alanină sau orice alt aminoacid (SEQ ID NO: 117) sau nu este o peptidă cu secvenţa de (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+). În unele variante de realizare, proteina schelă utilă pentru prezenta dezvăluire nu cuprinde MGXKLSKKK, unde X este alanină sau orice alt aminoacid (SEQ ID NO: 117) sau nu cuprinde o peptidă cu secvenţa de (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+).
În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă cuprinzând o peptidă cu secvenţa de (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) sau (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), X este orice aminoacid, Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu). În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă cuprinzând o peptidă cu secvenţa de (G)(π)(X)((Φ/π)(π)(+)(+), în care proteina schelă nu cuprinde un M N-terminal (de exemplu, o metionină N-terminală).
În unele aspecte, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă cuprinzând o peptidă cu secvenţa de (G)(π)(X)((Φ/π)(π)(+)(+), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), X este orice aminoacid, Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu), în care secvenţa nu este (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+). În unele aspecte, proteina schelă cuprinde peptida cu secvenţa de (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), în care proteina schelă nu cuprinde un Met N-terminal.
În unele variante de realizare, proteina de EV, de exemplu, exozom, convenţională este selectată din lista constând din CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI proteine de ancorare, LAMP2, LAMP2B, şi un fragment, o variantă, sau un derivat al acestora.
În unele variante de realizare, îmbogăţirea proteinei de fuziune cuprinzând MARCKS, MARCKSL1, BASP1, sau oricare dintre SEQ ID NO: 4-109 în exozomi este >2 ori, >4 ori, >8 ori, >16 ori, >25 ori, >50 ori, >100 ori, >200 ori, >500 ori, >750 ori, >1.000 ori, >2.000 ori, >5.000 ori, >7.500 ori, >10.000 ori mai mare decât proteina de fuziune lipsită de MARCKS, MARCKSL1, BASP1, oricare dintre SEQ ID NO: 4-109 sau comparativ cu proteinele de fuziune care cuprind proteine de EV, de exemplu, exozom, convenţionale. În unele aspecte, îmbogăţirea proteinei de fuziune cuprinzând MARCKS, MARCKSL1, BASP1 fără capătul N-terminal M, oricare dintre SEQ ID NO: 4-109 fără capătul N-terminal M sau orice secvenţe dezvăluite în prezenta, de exemplu, TABELUL 1, fără capătul N-terminal M în exozomi este >2 ori, >4 ori, >8 ori, >16 ori, >25 ori, >50 ori, >100 ori, >200 ori, >500 ori, >750 ori, >1.000 ori, >2.000 ori, >5.000 ori, >7.500 ori, >10.000 ori mai mare decât proteina de fuziune lipsite de MARCKS, MARCKSL1, BASP1 fără capătul N-terminal M, oricare dintre SEQ ID NO: 4-109 fără capătul N-terminal M sau orice secvenţe dezvăluite în prezenta, de exemplu, TABELUL 1, fără capătul N-terminal M sau comparativ cu proteinele de fuziune care cuprind proteine de EV, de exemplu, exozom, convenţionale.
În unele variante de realizare, îmbogăţirea proteinei de fuziune cuprinzând MARCKS, MARCKSL1, BASP1, oricare dintre SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M în exozomi este cel puţin aproximativ 2 ori, cel puţin aproximativ 4 ori, cel puţin aproximativ 6 ori, cel puţin aproximativ 8 ori, cel puţin aproximativ 10 ori, cel puţin aproximativ 12 ori, cel puţin aproximativ 14 ori, cel puţin aproximativ 16 ori, cel puţin aproximativ 18 ori, cel puţin aproximativ 20 ori, cel puţin aproximativ 25 ori, cel puţin aproximativ 30 ori, cel puţin aproximativ 35 ori, cel puţin aproximativ 40 ori, cel puţin aproximativ 45 ori, cel puţin aproximativ 50 ori, cel puţin aproximativ 60 ori, cel puţin aproximativ 70 ori, cel puţin aproximativ 80 ori, cel puţin aproximativ 90 ori, cel puţin aproximativ100 ori, cel puţin aproximativ 200 ori, cel puţin aproximativ 300 ori, cel puţin aproximativ 400 ori, cel puţin aproximativ 500 ori, cel puţin aproximativ 750 ori, cel puţin aproximativ 1.000 ori, cel puţin aproximativ 1.500 ori, cel puţin aproximativ 2.000 ori, cel puţin aproximativ 2.500 ori, cel puţin aproximativ 3.000 ori, cel puţin aproximativ 3.500 ori, cel puţin aproximativ 4.000 ori, cel puţin aproximativ 4.500 ori, cel puţin aproximativ 5.000 ori, cel puţin aproximativ 5.500 ori, cel puţin aproximativ 6.000 ori, cel puţin aproximativ 6.500 ori, cel puţin aproximativ 7.000 ori, cel puţin aproximativ 7.500 ori, cel puţin aproximativ 8.000 ori, cel puţin aproximativ 8.500 ori, cel puţin aproximativ 9.000 ori, cel puţin aproximativ 9.500 ori sau cel puţin aproximativ 10.000 ori mai mare decât proteina de fuziune lipsite de MARCKS, MARCKSL1, BASP1, oricare dintre SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M, sau comparativ cu proteinele de fuziune care cuprind proteine de EV, de exemplu, exozom, convenţionale.
În unele variante de realizare, secvenţa proteică a oricăreia dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este suficientă pentru a încărca EV-urile, de exemplu, exozomii, cu proteina de fuziune.
În unele variante de realizare, EV, de exemplu, exozom, cu lumen modificat cuprinzând o proteină de fuziune conţinând o secvenţă exogenă (de exemplu, o moleculă activă biologic) şi o proteină a lumenului EV, de exemplu, exozom, (proteină schelă) nou identificată în prezenta are o densitate mai mare a proteinei de fuziune decât EV-urile, de exemplu, exozomii, modificate în mod similar, cuprinzând o secvenţă exogenă conjugată la o proteină de EV, de exemplu, exozom, convenţională cunoscută în domeniu (de exemplu, CD9, CD63, CD81, PDGFR, proteine de ancorare GPI, lactaderină, LAMP2, şi LAMP2B, un fragment al acestora, sau o peptidă se leagă la acestea).
În unele variante de realizare, proteina de fuziune conţinând o proteină a lumenului de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) nou identificată în prezenta este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare în suprafaţa luminală a EV, de exemplu, exozom, decât proteinele de fuziune din alte suprafeţe luminale de EV, de exemplu, exozom, modificate în mod similar utilizând o proteină de EV, de exemplu, exozom, convenţională.
În unele variante de realizare, proteina de fuziune conţinând o proteină a lumenului de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) nou identificată în prezenta este prezentă la 2 până la 4 ori, 4 până la 8 ori, 8 la 16 ori, 16 până la 32 ori, 32 până la 64 ori, 64 la 100 ori, 100 până la 200 ori, 200 până la 400 ori, 400 până la 800 ori, 800 la 1.000 ori sau la o densitate mai mare în suprafaţa luminală a EV, de exemplu, exozom, decât proteinele de fuziune din alte suprafeţe luminale de EV, de exemplu, exozom, modificate în mod similar utilizând o proteină de EV, de exemplu, exozom, convenţională.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD9.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD63.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD81.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând PDGFR.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând proteine de ancorare GPI.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând lactaderină.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând LAMP2.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând LAMP2B.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând o proteină convenţională.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKS, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi modificate în mod similar utilizând o variantă unei proteine de EV, de exemplu, exozom, convenţională.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKSL1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD9.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKSL1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD63.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKSL1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD81.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKSL1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând PDGFR.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKSL1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând proteine de ancorare GPI.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKSL1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând lactaderină.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKSL1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând LAMP2.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKSL1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând LAMP2B.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKSL1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând o proteină convenţională.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, MARCKSL1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi modificate în mod similar utilizând o variantă unei proteine de EV, de exemplu, exozom, convenţională.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, BASP1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD9.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, BASP1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD63.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, BASP1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD81.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, BASP1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând PDGFR.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, BASP1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând proteine de ancorare GPI.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, BASP1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând lactaderină.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, BASP1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând LAMP2.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, BASP1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând LAMP2B.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, BASP1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând o proteină convenţională.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, BASP1, o variantă, un fragment, o variantă a unui fragment, sau o modificare a acestora) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând o variantă unei proteine de EV, de exemplu, exozom, convenţională.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD9. În unele aspecte, EV, de exemplu, exozom, cuprinde o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal, şi în care proteina de fuziune este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD9.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD63. În unele aspecte, EV, de exemplu, exozom, cuprinde o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal, şi în care proteina de fuziune este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD63.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD81. În unele aspecte, EV, de exemplu, exozom, cuprinde o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal, şi în care proteina de fuziune este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând CD81.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând PDGFR. În unele aspecte, EV, de exemplu, exozom, cuprinde o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal, şi în care proteina de fuziune este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând PDGFR.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând proteine de ancorare GPI. În unele aspecte, EV, de exemplu, exozom, cuprinde o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal, şi în care proteina de fuziune este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând proteine de ancorare GPI.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând lactaderină. În unele aspecte, EV, de exemplu, exozom, cuprinde o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal, şi în care proteina de fuziune este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând lactaderină.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând LAMP2. În unele aspecte, EV, de exemplu, exozom, cuprinde o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal, şi în care proteina de fuziune este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând LAMP2.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând LAMP2B. În unele aspecte, EV, de exemplu, exozom, cuprinde o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal, şi în care proteina de fuziune este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând LAMP2Bt.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând o proteină convenţională. În unele aspecte, EV, de exemplu, exozom, cuprinde o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal, şi în care proteina de fuziune este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând o proteină convenţională.
În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M sau orice secvenţă de proteine schelă dezvăluită în prezenta (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând o variantă unei proteine de EV, de exemplu, exozom, convenţională. În unele aspecte, EV, de exemplu, exozom, cuprinde o proteină de fuziune cuprinzând oricare dintre SEQ ID NO: 1-109, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal, şi în care proteina de fuziune este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare decât la EV-uri, de exemplu, exozomi, modificate în mod similar utilizând o proteină de EV, de exemplu, exozom, convenţională.
În unele variante de realizare, EV-urile, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, descrise în prezenta demonstrează caracteristici superioare comparativ cu EV-urile, de exemplu, exozomi cu lumen modificat, cunoscute în domeniu. De exemplu, EV-urile, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, produse utilizând proteinele nou identificate de EV, de exemplu, exozom, furnizate în prezenta conţin proteine modificate mai puternic îmbogăţite pe suprafaţa lor luminală comparativ cu EV-urile, de exemplu, exozomii din stadiul tehnicii, de exemplu, cei produşi utilizând proteine de EV, de exemplu, exozom, convenţionale.
Mai mult, EV-urile, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, conform prezentei dezvăluiri pot avea o activitate biologică mai mare, mai specifică, sau mai controlată comparativ cu EV-urile, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, cunoscuţi în domeniu. De exemplu, o EV, de exemplu, exozom, cu lumen modificat cuprinzând o încărcătură utilă, de exemplu, o secvenţă exogenă relevantă terapeutic sau biologic fuzionată la o proteină de EV, de exemplu, exozom, sau un fragment al acesteia descrise în prezenta (de exemplu, o schelă conform prezentei dezvăluiri cum ar fi BASP1 sau un fragment, o variantă, sau un derivat al acesteia) poate avea mai mult din caracteristicile modificate genetic dorite decât fuziunea la schele cunoscute în domeniu.
Proteinele schelă cunoscute în domeniu includ molecule de tetraspanină (de exemplu, CD63, CD81, CD9 şi altele), proteina membranară 2 asociată lizozomilor (LAMP2 şi LAMP2B), receptorul factorului de creştere derivat din trombocite (PDGFR), proteine de ancorare GPI, lactaderină şi fragmente ale acestora, şi peptide care au afinitate la oricare dintre aceste proteine sau fragmente ale acestora. Pentru evitarea oricărei neînţelegeri, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportorul ATP sau un fragment sau o variantă a acestora nu sunt proteine de EV, de exemplu, exozomi, convenţionale. Anterior, supraexprimarea proteinelor exogene se baza pe dispoziţia stocastică sau aleatorie a proteinelor exogene în exozom pentru producerea de exozomi cu lumen modificat. Aceasta a condus la o densitate de nivel scăzut, imprevizibilă a proteinelor exogene din exozomi. Aşadar, proteinele de EV, de exemplu, exozom şi fragmente ale acestora descrise în prezenta furnizează avansuri importante în noi compoziţii de EV, de exemplu, exozom şi metode de obţinere a acestora.
Proteinele de fuziune furnizate în prezenta pot cuprinde o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, conform prezentei dezvăluiri cum ar fi MARCKS, MARCKSL1, BASP1, sau un fragment, o variantă, sau un derivat al acestora, şi o peptidă suplimentară. Peptida suplimentară poate fi ataşată fie la capătul N-terminal sau la capătul C-terminal al proteinei de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) sau un fragment, o variantă, sau un derivat al acesteia.
În unele variante de realizare, proteinele de fuziune furnizate în prezenta cuprind o proteină schelă conform prezentei dezvăluiri cum ar fi MARCKS, MARCKSL1, BASP1, sau un fragment, o variantă, sau un derivat al acesteia, şi două peptide suplimentare. Ambele peptide suplimentare pot fi ataşate la capătul N-terminal sau la capătul C-terminal al proteinei de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) sau un fragment, o variantă, sau derivat al acesteia. În unele variante de realizare, una dintre cele două peptide suplimentare este ataşată la capătul N-terminal şi cealaltă dintre cele două peptide suplimentare este ataşată la capătul C-terminal al proteinei de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) sau un fragment, o variantă, sau un derivat al acesteia.
În unele variante de realizare, compoziţiile şi metodele de generare a veziculelor extracelulare cu lumen modificat descrise în prezenta cuprind nanovezicule.
IV. Celulă producătoare pentru producerea de EV, de exemplu, exozomi cu lumen modificat
EV, de exemplu, exozomi, conform prezentei dezvăluiri se pot produce dintr-o celulă crescută in vitro sau un corp fluid al unui subiect. Atunci când EV, de exemplu, exozomi, sunt produşi din cultură celulară in vitro, diverse celule producătoare, de exemplu, celule HEK293, se pot utiliza pentru prezenta dezvăluire. Tipuri de celule suplimentare care se pot utiliza pentru producerea de EV, de exemplu exozomi, cu lumen modificat, descrise în acest document includ, fără limitare, celule stem mezenchimale, celule T, celule B, celule dendritice, macrofage şi linii celulare canceroase.
Prin urmare, prezenta dezvăluire furnizează celule care produc respectivele EV, de exemplu, exozomi, conform prezentei dezvăluiri. În unele variante de realizare, cuprind unul sau mai mulţi vectori, unde vectorii cuprind o secvenţă de acid nucleic care codifică proteina schelă şi încărcătura utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic. În unele variante de realizare, o secvenţă de acid nucleic codifică proteina schelă şi o a doua secvenţă de acid nucleic codifică încărcătura utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic. În unele variante de realizare, secvenţa de acizi nucleici care codifică proteina schelă şi secvenţa de acizi nucleici care codifică încărcătura utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic, sunt într-un singur cadru de citire deschis; aşadar, produsul de expresie ar fi o proteină de fuziune cuprinzând proteina schelă fuzionată la încărcătura utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic. În unele variante de realizare, secvenţa de acizi nucleici este legată funcţional la un promoter.
Celula producătoare poate fi modificată genetic să cuprindă una sau mai multe secvenţe exogene pentru a produce EV cu lumen modificat, de exemplu, exozomi. Celula producătoare modificată genetic poate să conţină secvenţa exogenă prin transformare tranzitorie sau stabilă. Secvenţa exogenă poate fi transformată ca o plasmidă. Secvenţele exogene pot fi integrate într-un mod stabil într-o secvenţă genomică a celulei producătoare, la un situs ţintit sau la un situs aleatoriu. În unele variante de realizare, este generată o linie celulară stabilă pentru producerea de EV cu lumen modificat, de exemplu, exozomi.
Secvenţele exogene pot fi introduse într-o secvenţă genomică a celulei producătoare, localizată în interiorul, în amonte (capătul 5') sau în aval (capătul 3') faţă de o secvenţă endogenă care codifică proteina de EV, de exemplu, exozom. Se pot utiliza diverse metode cunoscute în domeniu pentru introducerea de secvenţe exogene în celula producătoare. De exemplu, celulele modificate care utilizează diverse metode de editare a genelor (de exemplu, metode care utilizează un sistem de recombinare omolog, mediat de transpozon, un sistem loxP-Cre, CRISPR/Cas9 sau TALEN) fac parte din domeniul de aplicare a prezentei dezvăluiri.
Secvenţele exogene pot cuprinde o secvenţă care codifică o proteină schelă conform prezentei dezvăluiri (de exemplu, o proteina de EV, de exemplu, exozom sau o modificare sau un fragment al proteina de EV, de exemplu, exozom). O copie suplimentară a secvenţei care codifică proteina schelă (de exemplu, o proteina de EV, de exemplu, exozom) poate fi introdusă pentru a produce o EV cu lumen modificat, de exemplu, exozom, având o densitate mai mare a proteina de EV, de exemplu, exozom. O secvenţă exogenă care codifică o modificare sau un fragment al proteina de EV, de exemplu, exozom poate fi introdusă pentru a produce o EV cu lumen modificat, de exemplu, exozom, conţinând modificarea sau fragmentul de proteina de EV, de exemplu, exozom. O secvenţă exogenă care codifică un marcaj de afinitate poate fi introdusă pentru a produce o EV cu lumen modificat, de exemplu, exozom, conţinând o proteină de fuziune cuprinzând marcajul de afinitate ataşat la proteina de EV, de exemplu, exozom.
În unele variante de realizare, o EV cu lumen modificat, de exemplu, exozom, are o densitate mai mare a proteina de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) decât EV native, de exemplu, exozomi, izolate din acelaşi tip de celulă producătoare sau una similară. În unele variante de realizare, respectiva proteina de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) este prezentă la o densitate de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1.000 de ori sau mai mare pe respectiva EV, de exemplu, exozom, cu lumen modificat decât EV< de exemplu, exozom nativă. În unele variante de realizare, proteina de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) este prezentă la o densitate de la 2 la 4 ori, 4 la 8 ori, 8 la 16 ori, 16 la 32 ori, 32 la 64 ori, 64 la 100 ori, 100 la 200 ori, 200 la 400 ori, 400 la 800 ori, 800 la 1.000 ori sau la mai mare pe EV, de exemplu, exozom, cu lumen modificat decât EV nativă, de exemplu, exozom. În unele variante de realizare, o proteină de fuziune cuprinzând proteina de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) este prezentă la o densitate de 2 la 4 ori, 4 la 8 ori, 8 la 16 ori, 16 la 32 ori, 32 la 64 ori, 64 la 100 ori, 100 la 200 ori, 200 la 400 ori, 400 la 800 ori, 800 la 1.000 ori sau mai mare pe respectiva EV , de exemplu, exozom, cu lumen modificat, decât proteină de EV, de exemplu, exozom, nemodificată (proteină schelă) pe EV nativă, de exemplu, exozom. În unele variante de realizare, un fragment sau o variantă a proteinei de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) este prezentă la o ori 2 la 4, ori 4 la 8, ori 8 la 16, ori 16 la 32, ori 32 la 64, ori 64 la 100, ori 100 la 200, ori 200 la 400, ori 400 la 800, ori 800 la 1.000 sau la o densitate mai mare pe EV , de exemplu, exozom, cu lumen modificat decât proteina nemodificată de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) pe EV, de exemplu, exozom, nativă.
În variante de realizare particulare, MARCKS, un fragment sau o variantă a MARCKS, sau o modificare a acesteia este prezent la oria 2 la 4, ori 4 la 8, ori 8 la 16, ori 16 la 32, ori 32 la 64, ori 64 la 100, ori 100 la 200, ori 200 la 400, ori 400 la 800, ori 800 la 1.000 sau la o densitate mai mare pe respectiva EV , de exemplu, exozom, cu lumen modificat decât MARCKS nemodificată pe respectiva EV, de exemplu, exozom, nativă. În unele variante de realizare, MARCKSL1, un fragment sau o variantă a MARCKSL1, sau o modificare a acesteia este prezentă la oria 2 la 4, ori 4 la 8, ori 8 la 16, ori 16 la 32, ori 32 la 64, ori 64 la 100, ori 100 la 200, ori 200 la 400, ori 400 la 800, ori 800 la 1.000 sau la o densitate mai mare pe respectiva EV , de exemplu, exozom, cu lumen modificat decât MARCKSL1 nemodificată pe respectiva EV, de exemplu, exozom, nativă. În unele variante de realizare, BASP1, un fragment sau o variantă a BASP1, sau o modificare a acesteia este prezentă la oria 2 la 4, ori 4 la 8, ori 8 la 16, ori 16 la 32, ori 32 la 64, ori 64 la 100, ori 100 la 200, ori 200 la 400, ori 400 la 800, ori 800 la 1.000 sau la o densitate mai mare pe respectiva EV , de exemplu, exozom, cu lumen modificat decât BASP1 nemodificată pe EV, de exemplu, exozom, nativă.
În unele variante de realizare, celula producătoare este modificată suplimentar pentru a cuprinde o secvenţă exogenă suplimentară. De exemplu, o secvenţă exogenă suplimentară poate fi inclusă pentru modularea expresiei genei endogene, sau produce un exozom incluzând o anumită polipeptidă ca încărcătură utilă. În unele variante de realizare, celula producătoare este modificată pentru a cuprinde două secvenţe exogene, una care codifică proteina de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) sau o modificare sau un fragment al proteinei de EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), şi cealaltă care codifică o încărcătură utilă.
Mai exact, EV-urile, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, se pot produce dintr-o celulă transformată cu o secvenţă care codifică una sau mai multe proteine ale lumenului exozomic (proteine schelă) incluzând, dar nu se limitează la, (1) substrat de protein kinază C bogat în alanină miristoilată (MARCKS); (2) substrat de protein kinază C bogat în alanină miristoilată de tip 1 (MARCKSL1); şi (3) proteina 1 solubilă în acid cerebral (BASP1). Oricare dintre respectiva una sau mai multe proteine ale lumenului EV, de exemplu, exozom (proteine schelă) descrise în acest document pot fi exprimate dintr-o plasmidă, o secvenţă exogenă inserată în genom sau un alt acid nucleic exogen, cum ar fi un ARN mesager sintetic (ARNm).
În unele variante de realizare, respectiva una sau mai multe proteina de EV, de exemplu, exozom a lumenului (proteină schelă) este exprimată într-o celulă transformată cu o secvenţă exogenă care codifică întreaga sa lungime, forma endogenă. În unele variante de realizare, această secvenţă exogenă codifică proteina MARCKS din SEQ ID NO: 1 sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În anumite aspecte, această secvenţă exogenă codifică proteina MARCKS din SEQ ID NO: 1. În unele variante de realizare, această secvenţă exogenă codifică proteina MARCKS din SEQ ID NO: 1, în care proteina MARKS codificată de secvenţa exogenă nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, această secvenţă exogenă codifică proteina MARCKSL1 din SEQ ID NO: 2 sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În anumite aspecte, această secvenţă exogenă codifică proteina MARCKSL1 din SEQ ID NO: 2. În unele variante de realizare, această secvenţă exogenă codifică proteina MARCKSL1 din SEQ ID NO: 2, în care proteina MARCKSL1 codificată de secvenţa exogenă nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, această secvenţă exogenă codifică proteina BASP1 din SEQ ID NO: 3 sau secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În anumite aspecte, această secvenţă exogenă codifică proteina BASP1 din SEQ ID NO: 3. În unele variante de realizare, această secvenţă exogenă codifică proteina BASP1 din SEQ ID NO: 3, în care proteina BASP1 codificată de secvenţa exogenă nu cuprinde un Met N-terminal.
EVle, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, se pot produce dintr-o celulă transformată cu o secvenţă polinucleotidică care codifică un fragment al uneia sau mai multor proteine ale lumenului de EV, de exemplu, exozom (proteine schelă) incluzând, dar nu se limitează la, (1) substrat de protein kinază C bogat în alanină miristoilată (MARCKS); (2) substrat de protein kinază C bogat în alanină miristoilată de tip 1 (MARCKSL1); şi (3) proteina 1 solubilă în acid cerebral (BASP1).
În unele variante de realizare, secvenţa polinucleotidică codifică un fragment al proteina de EV, de exemplu, exozom a lumenului (de exemplu, o proteină schelă cum ar fi MARCKS, MARCKSL1 sau BASP1) căreia îi lipsesc cel puţin 5, 10, 50, 100, 200, sau 300 de aminoacizi din capătul N-terminal al proteinei native. În unele variante de realizare, secvenţa polinucleotidică codifică un fragment al proteina de EV, de exemplu, exozom a lumenului (de exemplu, o proteină schelă cum ar fi MARCKS, MARCKSL1, sau BASP1) căreia îi lipseşte cel puţin 5, 10, 50, 100, 200 sau 300 de aminoacizi din capătul C-terminal al proteinei native. În unele variante de realizare, secvenţa polinucleotidică codifică un fragment al proteina de EV, de exemplu, exozom a lumenului (de exemplu, o proteină schelă cum ar fi MARCKS, MARCKSL1 sau BASP1) căreia îi lipsesc cel puţin 5, 10, 50, 100, 200 sau 300 de aminoacizi atât din capătul N-terminal şi C-terminal al proteinei native. În unele variante de realizare, secvenţa polinucleotidică codifică un fragment al proteina de EV, de exemplu, exozom a lumenului (de exemplu, o proteină schelă cum ar fi MARCKS, MARCKSL1 sau BASP1) căreia îi lipsesc unul sau mai multe domenii funcţionale sau structurale ale proteinei native.
În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o peptidă din SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau orice secvenţe proteice schelă dezvăluite în acest document (de exemplu, Tabelul 1) fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o peptidă din SEQ ID NO: 4-109 sau orice secvenţă proteică schelă dezvăluită în acest document (de exemplu, Tabelul 1), în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde peptida din SEQ ID NO: 13. În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde peptida din SEQ ID NO: 13, în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, cuprinzând o peptidă cu secvenţa MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 117) sau GXKLSKKK (SEQ ID NO:425), în care X este alanină sau oricare alt aminoacid. În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă, de exemplu, o proteină a lumenului de exozom, cuprinzând o peptidă cu secvenţa GXKLSKKK (SEQ ID NO:425), în care X este alanină sau oricare alt aminoacid, şi în care proteina schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, cuprinzând o peptidă cu secvenţa GXKLSKKK (SEQ ID NO:425), în care X este alanină sau oricare alt aminoacid, şi în care proteina de fuziune nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă cuprinzând secvenţa de aminoacizi a GXKLSKKK (SEQ ID NO:425), în care X este alanină sau oricare alt aminoacid, în care proteina schelă nu are Met la capătul N-terminal al secvenţei de aminoacizi, de exemplu, cuprinde MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 117). În alte variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă, de exemplu, proteina lumenului de exozom, cuprinzând o secvenţă de aminoacizi a GXKLSKKK (SEQ ID NO: 425), în care proteina de fuziune nu cuprinde MGXKLSKKK. În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă cuprinzând o peptidă cu secvenţa din (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) sau (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu). În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, o secvenţă de aminoacizi a (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), în care proteina de fuziune nu cuprinde (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+). În unele variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, cuprinzând o peptidă cu secvenţa din (M)(O(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) sau (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), X este orice aminoacid, Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+) nici (Asp sau Glu). În alte variante de realizare, proteina de fuziune cuprinde o proteină schelă, de exemplu, proteină a lumenului de exozom, cuprinzând o secvenţă de aminoacizi a (G)(π)(X)((Φ/π)(π)(+)(+), în care proteina de fuziune nu cuprinde (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+).
În unele variante de realizare, EVle, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, se pot produce dintr-o celulă transformată cu o secvenţă care codifică o proteina de EV, de exemplu, exozom (de exemplu, o proteină schelă de exemplu, proteină a lumenului de exozom, cum ar fi MARCKS, MARCKSL1 sau BASP1) sau un fragment ori o modificare a acestora fuzionată la una sau mai multe proteine heteroloage. În unele variante de realizare, respectivele una sau mai multe proteine heteroloage sunt fuzionate la capătul N-terminal al proteina de EV, de exemplu, exozom (de exemplu, o proteină schelă cum ar fi MARCKS, MARCKSL1 sau BASP1) sau o modificare a acestora, în particular un fragment sau o variantă a acestora. În unele variante de realizare, respectivele una sau mai multe proteine heteroloage sunt fuzionate la capătul C-terminal al proteina de EV, de exemplu, exozom (de exemplu, o proteină schelă cum ar fi MARCKS, MARCKSL1 sau BASP1) sau o modificare a acestora, în particular un fragment sau o variantă a acestora. În unele variante de realizare, respectivele una sau mai multe proteine heteroloage sunt fuzionate la capătul N-terminal şi capătul C-terminal al proteina de EV, de exemplu, exozom (de exemplu, o proteină schelă cum ar fi MARCKS, MARCKSL1 sau BASP1) sau o modificare a acestora, în particular un fragment sau o variantă a acestora. În unele variante de realizare, respectivele una sau mai multe proteine heteroloage sunt proteine de mamifer. În unele variante de realizare, respectivele una sau mai multe proteine heteroloage sunt proteine umane.
În unele variante de realizare a EV, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, sunt produşi dintr-o celulă transformată cu o secvenţă care codifică o polipeptidă a unei secvenţe identice sau similare uneia de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă) care includ, dar nu se limitează la,
(1) substrat de protein kinază C bogat în alanină miristoilată (MARCKS);
(2) substrat de protein kinază C bogat în alanină miristoilată de tip 1 (MARCKSL1); şi
(3) proteina 1 solubilă în acid cerebral (BASP1).
În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin de aproximativ 50% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, 50% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 55% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 55% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 60% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 60% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 65% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 65% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 70% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 70% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 75% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 75% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, respectiva polipeptidă este cel puţin aproximativ 80% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 80% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 85% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 85% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, respectiva polipeptidă este cel puţin aproximativ 90% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 90% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 95% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 95% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 99% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 99% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 99,9% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al unei proteine native a lumenului EV, de exemplu, exozom (proteină schelă), de exemplu, cel puţin aproximativ 99,9% identică cu SEQ ID NO: 1-3 sau oricare dintre secvenţele corespunzătoare fără capătul N-terminal M.
În unele variante de realizare, EV, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, produşi din celulă cuprind o polipeptidă a unei secvenţe identice sau similare cu un fragment al proteinei 1 solubile în acid cerebral (BASP1). În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 50% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 50% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 55% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 50% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, respectiva polipeptidă este cel puţin aproximativ 60% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 60% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 65% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 65% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 70% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 70% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 75% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 75% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 80% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 80% identică cu SEQ ID NO4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 85% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 85% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 90% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 90% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 95% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 95% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 99% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 99% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 99,9% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 99,9% identică cu SEQ ID NO: 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este aproximativ 100% identică cu un fragment al BASP1, de exemplu, aproximativ 100% identică cu 4-109, secvenţa corespunzătoare fără capătul N-terminal M, sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, fără respectivul M N-terminal.
În unele variante de realizare, EV, de exemplu exozomii, cu lumen modificat, produşi din celulă cuprind o polipeptidă a unei secvenţe identice sau similare cu un fragment al proteinei 1 solubile în acid cerebral (BASP1), în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 50% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 50% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 55% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 50% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, respectiva polipeptidă este cel puţin aproximativ 60% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 60% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 65% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 65% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 70% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 70% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 75% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 75% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 80% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 80% identică cu SEQ ID NO4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 85% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 85% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 90% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 90% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 95% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 95% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 99% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 99% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este cel puţin aproximativ 99,9% identică cu una de lungime întreagă sau un fragment al BASP1, de exemplu, cel puţin aproximativ 99,9% identică cu SEQ ID NO: 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal. În unele variante de realizare, polipeptida este aproximativ 100% identică cu un fragment al BASP1, de exemplu, aproximativ 100% identică cu 4-109 sau oricare secvenţe BASP1 descrise în acest document, de exemplu, TABELUL 1, în care polipeptida nu cuprinde un Met N-terminal.
VI. Metode de realizare
EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri se pot produce prin sinteză chimică, tehnologie cu ADN recombinant, fragmentare biochimică sau enzimatică a moleculelor mari, combinaţii ale celor de mai sus sau oricare altă metodă. Într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire furnizează o metodă de conjugare a unei molecule active biologic la o EV (de exemplu, exozom). Metoda cuprinde legarea unei molecule active biologic la o EV (de exemplu, exozom) astfel cum s-a descris mai sus.
În unele variante de realizare a prezentei dezvăluiri, EV, de exemplu, exozomii conform prezentei dezvăluiri pot fi realizaţi utilizând celule producătoare astfel cum s-a descris mai sus. Prin urmare, prezenta dezvăluire furnizează o metodă de obţinere a EV, de exemplu, exozomilor, cuprinzând cultivarea unei celule producătoare dezvăluite în acest document în condiţii adecvate şi obţinerea EV, de exemplu, exozomilor conform prezentei dezvăluiri.
În alte variante de realizare, proteinele schelă, de exemplu, proteina lumenului exozomic, conform prezentei dezvăluiri se poate produce într-un mod recombinant şi se poate încorpora ulterior într-o EV, de exemplu, exozom, conform prezentei dezvăluiri. În alte variante de realizare, doar porţiunea polipeptidică a proteinei schelă este produsă într-un mod recombinant. În unele variante de realizare, porţiunea polipeptidică a proteinei schelă produsă într-un mod recombinant este ulterior modificată, de exemplu, chimic sau enzimatic, pentru a încorpora o ancoră membranară (de exemplu, un acid miristic N-terminal). În unele variante de realizare, proteina schelă produsă într-un mod semi-recombinant (adică, combinând produsul recombinant al porţiunii polipeptidice urmată de modificarea chimică sau enzimatică) este ulterior încorporată într-o EV, de exemplu, exozom, conform prezentei dezvăluiri.
În alte variante de realizare, proteinele schelă, de exemplu, proteina lumenului exozomic, conform prezentei dezvăluiri se pot produce chimic, de exemplu, utilizând sinteza peptidică în fază solidă, şi ulterior se încorporează într-o EV, de exemplu, exozom, conform prezentei dezvăluiri. În alte variante de realizare, doar porţiunea polipeptidică a proteinei schelă este produsă într-un mod sintetic. În unele variante de realizare, porţiunea polipeptidică a proteinei schelă produse într-un mod sintetic este ulterior modificată, de exemplu, chimic sau enzimatic, pentru a încorpora o ancoră membranară (de exemplu, un acid miristic N-terminal). În unele variante de realizare, proteina schelă produsă într-un mod semi-sintetic (adică, combinând produsul sintetic al porţiunii polipeptidice urmată de modificarea chimică sau enzimatică) este ulterior încorporată într-o EV, de exemplu, exozom, conform prezentei dezvăluiri.
În alte variante de realizare, proteinele schelă, de exemplu, proteina lumenului exozomic, conform prezentei dezvăluiri se pot produce in vitro, de exemplu, utilizând o expresie fără celule cum ar fi un sistem reticulocitar, şi ulterior se încorporează într-o EV, de exemplu, exozom, conform prezentei dezvăluiri. În alte variante de realizare, doar porţiunea polipeptidică a proteinei schelă este produsă in vitro, de exemplu, într-un sistem fără celule. În unele variante de realizare, porţiunea polipeptidică a proteinei schelă produsă in vitro, de exemplu, într-un sistem fără celule este ulterior modificată, de exemplu, chimic sau enzimatic, pentru a încorpora o ancoră membranară (de exemplu, un acid miristic N-terminal). În unele variante de realizare, proteina schelă produsă semi-in vitro (adică, combinând in vitro produsul porţiunii polipeptidice urmată de modificarea chimică sau enzimatică) este ulterior încorporată într-o EV, de exemplu, exozom, conform prezentei dezvăluiri.
În unele variante de realizare, metodele descrise în acest document mai cuprind etapa de caracterizare a EV, de exemplu, exozomilor, conţinuţi în fiecare fracţie colectată pe durata producerii şi purificării acestora. În unele variante de realizare, conţinuturile de EV, de exemplu, exozomi, pot fi extrase pentru studiere şi caracterizare. În unele variante de realizare, EV, de exemplu, exozomi, sunt izolaţi şi caracterizaţi metric incluzând, dar nu se limitează la, dimensiune, formă, morfologie, sau compoziţii moleculare, cum ar fi acizi nucleici, proteine, metaboliţi şi lipide.
VII. Compoziţii farmaceutice şi metode de administrare
Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, compoziţii farmaceutice cuprinzând EV (de exemplu, exozomi) descrise în acest document care sunt adecvate pentru administrare la un subiect. Compoziţiile farmaceutice, în general, cuprind o multitudine de EV (de exemplu, exozomi) cuprinzând cel puţin o încărcătură utilă, de exemplu, o moleculă activă biologic, legată covalent sau ne-covalent la multitudinea de EV (de exemplu, exozomi) şi un excipient acceptabil farmaceutic sau purtător într-o formă adecvată pentru administrare la un subiect.
Excipienţii sau purtătorii acceptabili farmaceutic sunt determinaţi parţial prin compoziţia particulară care se administrează, precum şi prin metoda particulară utilizată pentru administrarea compoziţiei. Prin urmare, există o mare varietate de formulări adecvate de compoziţii farmaceutice cuprinzând o multitudine de EV (de exemplu, exozomi). (A se vedea, de exemplu, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. ed. a 18-a (1990)). Compoziţiile farmaceutice sunt în general formulate steril şi în deplină conformitate cu toate reglementările privind bunele practici de fabricaţie (GMP) ale Food and Drug Administrare din S.U.A. În unele variante de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinde unul sau mai mulţi compuşi chimici, cum ar fi de exemplu, molecule mici legate covalent la o EV (de exemplu, exozom) descrise în acest document.
În unele variante de realizare, o compoziţie farmaceutică cuprinde unul sau mai mulţi agenţi terapeutici sau de diagnosticare şi o EV (de exemplu, exozom) descrisă în acest document. În anumite variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt co-administrate cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici sau de diagnosticare suplimentari, într-un purtător acceptabil farmaceutic. În unele variante de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinzând EV (de exemplu, exozom) este administrată anterior administrării agenţilor terapeutici sau de diagnosticare suplimentari. În alte variante de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinzând EV (de exemplu, exozom) este administrată după administrarea agenţilor terapeutici sau de diagnosticare suplimentari. În exemple de realizare suplimentare, compoziţia farmaceutică cuprinzând EV (de exemplu, exozom) este administrată concomitent cu agenţii terapeutici sau de diagnostic suplimentari.
În acest document se furnizează compoziţii farmaceutice cuprinzând o EV (de exemplu, exozom) conform prezentei dezvăluiri având gradul de puritate dorit, şi un purtător sau excipient acceptabili farmaceutic, într-o formă adecvată pentru administrare la un subiect. Excipienţii sau purtătorii acceptabili farmaceutic pot fi determinaţi parţial prin compoziţia particulară care se administrează, precum şi prin metoda particulară utilizată pentru administrarea compoziţiei. Prin urmare, există o largă varietate de formulări adecvate de compoziţii farmaceutice cuprinzând o multitudine de vezicule extracelulare. (A se vedea, de exemplu, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. ed. a 21-a (2005)). Compoziţiile farmaceutice sunt, în general, formulate steril şi în deplină conformitate cu toate reglementările privind bunele practici de fabricaţie (GMP) ale Food and Drug Administrare din S.U.A.
În unele variante de realizare, o compoziţie farmaceutică cuprinde unul sau mai mulţi agenţi terapeutici sau de diagnosticare şi o EV (de exemplu, exozom) descrise în acest document. În anumite variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt co-administrate cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici sau agenţi de diagnosticare suplimentari, într-un purtător acceptabil farmaceutic. În unele variante de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinzând EV (de exemplu, exozom) este administrată anterior administrării agenţilor terapeutici sau de diagnosticare suplimentari. În alte variante de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinzând EV (de exemplu, exozom) este administrată după administrarea agenţilor terapeutici sau de diagnosticare suplimentari. În exemple de realizare suplimentare, compoziţia farmaceutică cuprinzând EV (de exemplu, exozom) este administrată concomitent cu agenţii terapeutici sau de diagnostic suplimentari.
Purtătorii, excipienţii sau stabilizatorii acceptabili nu sunt toxici pentru destinatari (de exemplu, animale sau oameni) în dozele şi concentraţiile utilizate, şi includ agenţi de tamponare cum ar fi fosfat, citrat şi alţi acizi organici; antioxidanţi incluzând acid ascorbic şi metionină; conservanţi (cum ar fi clorură de amoniu de octadecildimetilbenzil; clorură de hexametoniu; clorură de benzalconiu, clorură de benzetoniu; fenol, alcool butilic sau benzilic; parabeni alchilici, cum ar fi paraben metilic sau propilc; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; şi m-cresol); polipeptide cu masă moleculară redusă (mai puţin de aproximativ 10 resturi); proteine, cum ar fi albumină serică, gelatină sau imunoglobuline; polimeri hidrofili cum ar fi polivinilpirolidonă; aminoacizi cum ar fi glicină, glutamină, asparagină, histidină, arginină sau lizină; monozaharide, dizaharide şi alţi carbohidraţi incluzând glucoză, manoză sau dextrine; agenţi de chelare, cum ar fi EDTA; zaharuri, cum ar fi sucroză, manitol, trehaloză sau sorbitol; contraionii formatori de sare cum ar fi sodiu; complexe metalice (de exemplu, complexe proteice de Zn); şi/sau surfactanţi ne-ionici, cum ar fi TWEEN™, PLURONICS™ sau polietilenglicol (PEG).
Exemple de purtători sau diluanţi includ, dar nu se limitează la, apă, soluţie salină, soluţii Ringer, soluţie de dextroză şi 5% albumină serică umană. Utilizarea acestor medii şi compuşi pentru substanţe active farmaceutic este bine cunoscută în domeniu. Cu excepţia măsurii în care oricare mediu sau compus convenţional este incompatibil cu veziculele extracelulare descrise în acest document, se prezintă utilizarea acestora în compoziţii. De asemenea, se pot încorpora agenţi terapeutici suplimentari în compoziţii. În mod tipic, o compoziţie farmaceutică este formulată pentru a fi compatibilă cu calea de administrare dorită a acesteia. EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri poate fi administrată pe cale parenterală, topică, intravenoasă, orală, subcutanată, intra-arterială, intradermică, transdermică, rectală, intracraniană, intraperitoneală, intranazală, intratumorală, intramusculară sau ca inhalanţi. În anumite variante de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinzând EV (de exemplu, exozomi) este administrată intravenos, de exemplu prin injectare. EV (de exemplu, exozomi) se poate, opţional, administra în combinaţie cu alţi agenţi terapeutici care sunt cel puţin parţial eficienţi în tratarea bolii, tulburării sau afecţiunii pentru care EV (de exemplu, exozomii) este destinată.
Soluţiile sau suspensiile pot include următoarele componente: un diluant steril cum ar fi apă, soluţie salină, uleiuri fixate, polietilen glicol, glicerină, propilenglicol sau alţi solvenţi sintetici; compuşi antibacterieni, cum ar fi alcool benzilic sau parabeni metilici; antioxidanţi, cum ar fi acid ascorbic sau bisulfit de sodiu; compuşi chelatori, cum ar fi acid etilendiaminetetraacetic (EDTA); agenţi de tamponare cum ar fi acetaţi, citraţi sau fosfaţi, şi compuşi pentru reglarea tonicităţii, cum ar fi clorură de sodiu sau dextroză. pH-ul poate fi reglat cu acizi sau baze, cum ar fi acid clorhidric sau hidroxid de sodiu. Preparatul poate fi încapsulat în ampule, seringi de unică folosinţă sau flacoane cu doze multiple fabricate din sticlă sau plastic.
Compoziţiile farmaceutice adecvate pentru utilizarea prin injectare includ soluţii apoase sterile (în cazul solubilităţii apei) sau dispersii şi pulberi sterile. În cazul administrării intravenoase, purtătorii adecvaţi includ soluţie salină fiziologică, apă bacteriostatică, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) sau soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS). Compoziţia este, în general, sterilă şi fluidă în limita unei utilizări uşoare cu seringile. Purtătorul poate fi un solvent sau mediu de dispersie conţinând, de exemplu, apă, etanol, poliol (de exemplu, glicerol, propilenglicol, şi polietilenglicol lichid, şi altele asemenea), şi amestecuri adecvate ale acestora. Fluiditatea adecvată poate fi menţinută, de exemplu, utilizând un înveliş, cum ar fi lecitină, menţinând dimensiunea dorită a particulelor în cazul dispersiei şi prin utilizarea surfactanţilor. Prevenirea acţiunii microorganismelor poate fi obţinută prin diverşi compuşi antibacterieni şi antifungici, de exemplu, parabeni, clorobutanol, fenol, acid ascorbic, timerosal, şi altele asemenea. Dacă se doreşte, se pot adăuga în compoziţie compuşi izotonici, de exemplu, zaharuri, polialcooli, cum ar fi manitol, sorbitol, şi clorură de sodiu. Absorbţia prelungită a compoziţiilor injectabile poate fi adusă aproximativ incluzând în compoziţie un compus care întârzie absorbţia, de exemplu, monostearat de aluminiu şi gelatină.
Soluţiile injectabile sterile pot fi preparate încorporând EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri într-o cantitate eficientă şi într-un solvent adecvat cu unul sau o combinaţie de ingrediente enumerate în acest document, după cum se doreşte. În general, dispersiile se prepară încorporând EV (de exemplu, exozomi) într-un vehicul steril care conţine un mediu de dispersie bazic şi orice alte ingrediente dorite. În cazul pulberilor sterile pentru prepararea soluţiilor injectabile sterile, metodele de preparare sunt uscarea în vid şi uscarea prin congelare prin care se obţine o pulbere din ingredientul activ plus orice ingredient suplimentar dorit dintr-o soluţie a acestuia filtrată steril anterior. EV (de exemplu, exozomi) pot fi administrate sub forma unei injecţii de depozit sau preparat de implant care se poate formula astfel încât să permită o eliberare susţinută sau pulsatilă a EV (de exemplu, exozomi).
Administrarea sistemică a compoziţiilor cuprinzând EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri se poate realiza, de asemenea, prin mijloace transmucozale. În cazul administrării transmucozale, se utilizează penetranţi adecvaţi la barieră pentru a o pătrunde, în formulare. Aceşti penetranţi sunt, în general, cunoscuţi în domeniu, şi includ, de exemplu, în cazul administrării transmucozale, detergenţi, săruri bile, şi derivaţi ai acidului fusidic. Administrarea transmucozală poate fi realizată cu succes utilizând, de exemplu, spray-uri nazale.
În anumite variante de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinzând EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri este administrată intravenos la un subiect care ar urma să aibă beneficii din compoziţia farmaceutică. În anumite alte variante de realizare, compoziţia este administrată în sistemul limfatic, de exemplu, prin injectare intralimfatică sau prin injectare intranodală (a se vedea de exemplu, Senti şi colab., PNAS 105(46): 17908 (2008)), sau prin injectare intramusculară, prin administrare subcutanată, prin injectare intratumorală, prin injectare directă în timus, sau în ficat.
În anumite variante de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinzând EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri este administrată sub forma unei suspensii lichide. În anumite variante de realizare, compoziţia farmaceutică este administrată sub forma unei formulări care are capacitatea să formeze un depozit după administrare. În anumite variante de realizare preferate, depozitul eliberează lent EV (de exemplu, exozomi) în circulaţie, sau rămâne sub formă de depozit.
În mod tipic, compoziţiile acceptabile farmaceutic sunt înalt purificate pentru a nu avea contaminanţi, sunt biocompatibile şi nu sunt toxice, şi sunt adecvate pentru administrare la un subiect. Dacă apa este un constituent al purtătorului, apa este înalt purificată şi procesată pentru a nu avea contaminanţi, de exemplu, endotoxine.
Purtătorul acceptabil farmaceutic poate fi lactoză, dextroză, sucroză, sorbitol, manitol, amidon, gumă de acacia, fosfat de calciu, alginaţi, gelatină, silicat de calciu, celuloză microcristalină, polivinilpirolidonă, celuloză, apă, sirop, metil celuloză, benzoat metilhidroxi, benzoat propilhidroxi, talc, stearat de magneziu şi/sau ulei mineral, dar nu este limited la acestea. Compoziţia farmaceutică poate include în plus un lubrifiant, un agent de umectare, un îndulcitor, un potenţator de aromă, un agent de emulsifiere, un agent de suspensie şi/sau un conservant.
Compoziţiile farmaceutice descrise în acest document cuprind EV (de exemplu, exozomi) descrise în acest document şi opţional un agent activ farmaceutic sau terapeutic şi/sau un agent de diagnosticare. Agentul terapeutic poate fi un agent biologic, un agent molecular mic, sau un agent de acid nucleic. Agentul de diagnosticare poate fi, de exemplu, un reactant de contrast.
Sunt furnizate forme de dozare care cuprind o compoziţie farmaceutică cuprinzând EV (de exemplu, exozomi) descrise în acest document. În unele variante de realizare, forma de dozare este formulată sub forma unei suspensii lichide pentru injectare intravenoasă. În unele variante de realizare, forma de dozare este formulată sub forma unei suspensii lichide pentru injectare intratumorală.
În anumite variante de realizare, prepararea EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri este supusă la radiaţii, de exemplu, raze X, raze gama, particule beta, particule alfa, neutroni, protoni, nuclei elementari, raze UV pentru a deteriora acizii nucleici reziduali competenţi la replicare.
În anumite variante de realizare, prepararea EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri este supusă iradierii gama utilizând o doză de iradiere mai mare de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 sau mai mare de 100 kGy.
În anumite variante de realizare, prepararea EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri este supusă iradierii cu raze X utilizând o doză de iradiere mai mare de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 sau 10000.
EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri se pot utiliza concomitent cu alte medicamente. Pentru a fi specifică, EV (de exemplu, exozomii) conform prezentei dezvăluiri se pot utiliza împreună cu medicamente, cum ar fi agenţi hormonali terapeutici, agenţi chemoterapeutici, agenţi imunoterapeutici, medicamente care inhibă acţiunea factorilor de creştere celulară sau receptori ai factorului de creştere celulară şi altele asemenea.
VIII. Utilizări terapeutice
Prezenta dezvăluire furnizează metode de tratare a unei boli sau afecţiuni la un subiect care are nevoie de acestea cuprinzând administrarea unei compoziţii cuprinzând EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri la subiect. Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, metode de prevenire sau ameliorare a simptomelor unei boli sau afecţiuni la un subiect care are nevoie de acestea cuprinzând administrarea unei compoziţii cuprinzând EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri la subiect. De asemenea, se furnizează metode de diagnosticare a unei boli sau afecţiuni la un subiect care are nevoie de acestea cuprinzând administrarea unei compoziţii cuprinzând EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri la subiect. De asemenea, se furnizează EV (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri pentru utilizare în terapie, pentru utilizare ca medicament, pentru utilizare în tratarea unei boli sau afecţiuni la un subiect care are nevoie de acestea, pentru utilizare în prevenirea sau ameliorarea simptomelor unei boli sau afecţiuni la un subiect care are nevoie de acestea, sau pentru diagnosticarea unei boli sau afecţiuni la un subiect care are nevoie de acestea.
Într-o variantă de realizare, boala sau tulburarea este un cancer, o boală inflamatorie, o tulburare neurodegenerativă, o boală a sistemului nervos central sau o boală metabolică.
Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, metode de prevenire şi/sau tratare a unei boli sau tulburări la un subiect care are nevoie de acestea, cuprinzând administrarea unei EV (de exemplu, exozom) dezvăluite în acest document la subiect. În unele variante de realizare, o boală sau tulburare care poate fi tratată cu prezentele metode cuprinde un cancer, boala grefă-versus-gazdă (GvHD), boală autoimună, boli infecţioase sau boli fibrotice. În unele variante de realizare, tratamentul este profilactic. În alte variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) pentru prezenta dezvăluire se utilizează pentru a induce un răspuns imun. În alte variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) pentru prezenta dezvăluire se utilizează pentru a vaccina un subiect. În unele variante de realizare, boala sau tulburarea este un cancer.
În unele variante de realizare, boala sau tulburarea este o boală infecţioasă. În anumite variante de realizare, boala sau tulburarea este un virus oncogenic. În unele variante de realizare, bolile infecţioase care se pot trata cu prezenta dezvăluire includ, dar nu se limitează la, Virusul herpesului gama uman 4 (virus Epstein Barr), gripa cu virus A, gripa cu virus B, citomegalovirus, stafilococul auriu, mycobacterium tuberculosis, chlamydia trachomatis, HIV-1, HIV-2, corona virusuri (de exemplu, MERS-CoV şi SARS CoV), filovirusuri (de exemplu, Marburg şi Ebola), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, specii plasmodice (de exemplu, vivax şi falciparum), Chikunga virus, virusul papiloma uman (HPV), hepatita B, hepatita C, virusul herpesului uman 8, virusul herpes simplex 2 (HSV2), Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus sp., Proteus sp., Enterobacter sp., Actinobacter sp., coagulase-negative staphylococci (CoNS), Mycoplasma sp., sau combinaţii ale acestora.
În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt administrate intravenos în sistemul circulator al subiectului. În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt infuzate în lichid adecvat şi se administrează într-o venă a subiectului.
În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) se administrează intra-arterial în sistemul circulator al subiectului. În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt infuzate în lichid adecvat şi se administrează într-o arteră a subiectului.
În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt administrate la subiect prin administrare intratecală. În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt administrate printr-o injectare în canalul spinal, sau în spaţiul subarahnoid astfel încât să ajungă la fluidul cerebrospinal (CSF).
În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt administrate intratumoral în una sau mai multe tumori ale subiectului.
În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt administrate la subiect prin administrare intranazală. În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) pot fi insuflate prin nas sub formă de administrare topică sau administrare sistemică. În anumite variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt administrate sub formă de spray nazal.
În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt administrate la subiect prin administrare intraperitoneală. În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt infuzate în lichid adecvat şi se injectează în peritoneul subiectului. În unele variante de realizare, administrarea intraperitoneală are ca rezultat distribuţia EV (de exemplu, exozomi) în limfatice. În unele variante de realizare, administrarea intraperitoneală are ca rezultat distribuţia EV (de exemplu, exozomi) în timus, splină şi/sau măduva osoasă. În unele variante de realizare, administrarea intraperitoneală are ca rezultat distribuţia EV (de exemplu, exozomi) în unul sau mai mulţi noduli limfatici. În unele variante de realizare, administrarea intraperitoneală are ca rezultat distribuţia EV (de exemplu, exozomi) în unul sau mai mulţi dintre nodulii limfatici cervicali, nodulul limfatic inghinal, nodulul limfatic mediastinal sau nodulul limfatic sternal. În unele variante de realizare, administrarea intraperitoneală are ca rezultat distribuţia EV (de exemplu, exozomi) în pancreas.
În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) sunt administrate la subiect prin administrare perioculară. În unele variante de realizare, EV (de exemplu, exozomi) se injectează în ţesuturile perioculare. Administrarea perioculară a medicamentului include căile de administrare subconjunctivală, anterior sub-Tenon's, posterior sub-Tenon's, şi retrobulbară.
IX. Kituri
Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, kituri sau produse de fabricare care cuprind una sau mai multe EV-uri (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri şi, opţional, instrucţiuni pentru utilizare. În unele variante de realizare, kitul sau produsul de fabricare conţine o compoziţie farmaceutică descrisă în prezenta care cuprinde cel puţin o EV (de exemplu, exozom) conform prezentei dezvăluiri, şi instrucţiuni pentru utilizare.
În unele variante de realizare, kitul sau produsul de fabricare cuprinde cel puţin o EV (de exemplu, exozom) conform prezentei dezvăluiri sau o compoziţie farmaceutică cuprinzând respectivele EV-uri (de exemplu, exozomi) în unul sau mai multe recipiente. Un specialist în domeniu va recunoaşte cu uşurinţă faptul că respectivele EV-uri (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri, compoziţia farmaceutică care cuprinde respectivele EV-uri (de exemplu, exozomi) conform prezentei dezvăluiri, sau combinaţiile acestora se pot încorpora cu uşurinţă în unul dintre formatele de kituri consacrate care sunt bine cunoscute în domeniu.
În unele variante de realizare, kitul sau produsul de fabricare cuprinde (i) EV-uri (de exemplu, exozomi), (ii) una sau mai multe sarcini utile, de exemplu, o moleculă activă biologic, (ii) reactanţi pentru ataşarea covalentă a respectivei una sau mai multe sarcini utile, de exemplu, o moleculă activă biologic, la respectivele EV-uri (de exemplu, exozomi), sau (iv) orice combinaţie a acestora, şi instrucţiuni pentru realizarea reacţiei pentru ataşarea covalentă a respectivei una sau mai multe sarcini utile, de exemplu, o moleculă activă biologic la respectivele EV-uri (de exemplu, exozomi).
În unele variante de realizare, kitul cuprinde reactanţi pentru conjugarea unei încărcături utile, de exemplu, o moleculă activă biologic într-o EV (de exemplu, exozom), şi instrucţiuni pentru realizarea conjugării.
Punerea în practică a prezentei dezvăluiri va necesita, dacă nu se indică contrariul, tehnici convenţionale de biologie celulară, cultură celulară, biologie moleculară, biologie transgenică, microbiologie, ADN recombinant şi imunologie, care fac parte din stadiul tehnicii. Aceste tehnici sunt explicate în întregime în literatură. A se vedea, de exemplu, Sambrook şi colab., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (ed. a 2-a; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook şi colab., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) ADN Cloning, Volumele I şi II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis şi colab. Brev. S.U.A. nr. 4.683.195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription and Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Celule (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Celule and Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Celule, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu şi colab., eds., Methods In Enzymology, Vol. 154 şi 155; Mayer şi Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumele I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies şi Applications, Ed. a 2-a CRC Press (2007) şi în Ausubel şi colab. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
SECVENŢE
SEQ ID NO Descriere Secvenţă 1 2 3 4 MGGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEGAA 5 MGGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAE 6 MGGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDK 7 MGGKLSKKKKGYNVNDEKAKE 8 MGGKLSKKKKGYNVNDEK 9 MGGKLSKKKKGYNVN 10 MGGKLSKKKKGY 11 MGGKLSKKKKG 12 MGGKLSKKKK 13 MGGKLSKKK 14 MGGKLSKK 15 MGGKLSK 16 MGGKLAKK 17 MGGKFSKK 18 MGGKFAKK 19 MGGKSSKK 20 MGGKSAKK 21 MGGKQSKK 22 MGGKQAKK 23 MGGQLSKK 24 MGGQLAKK 25 MGGQFSKK 26 MGGQFAKK 27 MGGQSSKK 28 MGGQSAKK 29 MGGQQSKK 30 MGGQQAKK 31 MGAKLSKK 32 MGAKLAKK 33 MGAKFSKK 34 MGAKFAKK 35 MGAKSSKK 36 MGAKSAKK 37 MGAKQSKK 38 MGAKQAKK 39 MGAQLSKK 40 MGAQLAKK 41 MGAQFSKK 42 MGAQFAKK 43 MGAQSSKK 44 MGAQSAKK 45 MGAQQSKK 46 MGAQQAKK 47 MGSKLSKK 48 MGSKLAKK 49 MGSKFSKK 50 MGSKFAKK 51 MGSKSSKK 52 MGSKSAKK 53 MGSKQSKK 54 MGSKQAKK 55 MGSQLSKK 56 MGSQLAKK 57 MGSQFSKK 58 MGSQFAKK 59 MGSQSSKK 60 MGSQSAKK 61 MGSQQSKK 62 MGSQQAKK 63 MGGKLAK 64 MGGKFSK 65 MGGKFAK 66 MGGKSSK 67 MGGKSAK 68 MGGKQSK 69 MGGKQAK 70 MGGQLSK 71 MGGQLAK 72 MGGQFSK 73 MGGQFAK 74 MGGQSSK 75 MGGQSAK 76 MGGQQSK 77 MGGQQAK 78 MGAKLSK 79 MGAKLAK 80 MGAKFSK 81 MGAKFAK 82 MGAKSSK 83 MGAKSAK 84 MGAKQSK 85 MGAKQAK 86 MGAQLSK 87 MGAQLAK 88 MGAQFSK 89 MGAQFAK 90 MGAQSSK 91 MGAQSAK 92 MGAQQSK 93 MGAQQAK 94 MGSKLSK 95 MGSKLAK 96 MGSKFSK 97 MGSKFAK 98 MGSKSSK 99 MGSKSAK 100 MGSKQSK 101 MGSKQAK 102 MGSQLSK 103 MGSQLAK 104 MGSQFSK 105 MGSQFAK 106 MGSQSSK 107 MGSQSAK 108 MGSQQSK 109 MGSQQAK 110 MGAKLSKKK 111 112 113 114 115 116 X este oricare aminoacid MGXKLSKKK 117 X este alanină sau oricare alt aminoacid MGXKLSKKK 118 X1=(G/A/S); X2=(K/Q); X3=(L/F/S/Q);X4=(S/A) MGX1X2X3X4KK 119 tggaggtgctcaaagagttg 120 ttgggcgtgcacttgat 121 gggcattggcttc 122 123 124 125 126 127 128 MGGKLSKKKKGYNVNDEKAKESAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKGEELFTG 129 MGGKLSKKKKGYNVNDEKSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKGEELFTG 130 MGGKLSKKKKGYNVNSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKGEELFTG 131 MGGKLSKKKKGYSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKGEELFTG 132 MGGKLSKKKSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKGEELFTG 133 MGGKLSSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKGEELFTG 134 MGGSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKGEELFTG 135 136 MGGKLSKKKKGYSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKG 137 MGGKLSKKKKGSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKG 138 MGGKLSKKKKSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKG 139 MGGKLSKKKSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKG 140 MGGKLSKKSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKG 141 MGGKLSKSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKG 142 MGGKLSSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSVSKG 143 MGGKLDKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEGAA 144 MGGKLAKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEGAA 145 MGGKQSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEGAA 146 MGAKKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKEA 147 MAAKKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKEA 148 MGAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKEA 149 MGAKKAKKRFSFKKPFKLSGFSFKKNKKEA 150 151 KKKK 152 KKKKK 153 RRRR 154 RRRRR 155 (K/R) (K/R) (K/R) (K/R) 156 (K/R) (K/R) (K/R) (K/R) (K/R) 157 GGKLSKK 158 GAKLSKK 159 GGKQSKK 160 GGKLAKK 161 GGKLSKKK 162 GGKLSKKS 163 GAKLSKKK 164 GAKLSKKS 165 GGKQSKKK 166 GGKQSKKS 167 GGKLAKKK 168 GGKLAKKS 169 GGKLSKKKKGYNVN 170 GAKLSKKKKGYNVN 171 GGKQSKKKKGYNVN 172 GGKLAKKKKGYNVN 173 GGKLSKKKKGYSGG 174 GGKLSKKKKGSGGS 175 GGKLSKKKKSGGSG 176 GGKLSKKKSGGSGG 177 GGKLSKKSGGSGGS 178 GGKLSKSGGSGGSV 179 GAKKSKKRFSFKKS 180 (M) (G) (G) (K/Q) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 181 (M) (G) (A) (K/Q) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 182 (M) (G) (S) (K/Q) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 183 (M) (G) (G/A/S) (K) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 184 (M) (G) (G/A/S) (Q) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 185 (M) (G) (G/A/S) (K/Q) (L) (S/A) (K) (K) 186 (M) (G) (G/A/S) (K/Q) (F) (S/A) (K) (K) 187 (M) (G) (G/A/S) (K/Q) (S) (S/A) (K) (K) 188 (M) (G) (G/A/S) (K/Q) (Q) (S/A) (K) (K) 189 (M) (G) (G/A/S) (K/Q) (L/F/S/Q) (S) (K) (K) 190 (M) (G) (G/A/S) (K/Q) (L/F/S/Q) (A) (K) (K) 191 (G) (G) (K/Q) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 192 (G) (A) (K/Q) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 193 (G) (S) (K/Q) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 194 (G) (G/A/S) (K) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 195 (G) (G/A/S) (Q) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 196 (G) (G/A/S) (K/Q) (L) (S/A) (K) (K) 197 (G) (G/A/S) (K/Q) (F) (S/A) (K) (K) 198 (G) (G/A/S) (K/Q) (S) (S/A) (K) (K) 199 (G) (G/A/S) (K/Q) (Q) (S/A) (K) (K) 200 (G) (G/A/S) (K/Q) (L/F/S/Q) (S) (K) (K) 201 (G) (G/A/S) (K/Q) (L/F/S/Q) (A) (K) (K) 202 (G) (G/A/S) (K/Q) (L/F/S/Q) (S/A) (K) (K) 203 GGKLSK 204 GAKLSK 205 GGKQSK 206 GGKLAK 207 KKKG 208 KKKGY 209 KKKGYN 210 KKKGYNV 211 KKKGYNVN 212 KKKGYS 213 KKKGYG 214 KKKGYGG 215 KKKGS 216 KKKGGS 217 KKKGSG 218 KKKGSGS 219 KKKS 220 KKKSG 221 KKKSGG 222 KKKSGGS 223 KKKSGGSG 224 KKSGGSGG 225 KKKSGGSGGS 226 KRFSFKKS 227 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEGAA 228 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEGA 229 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEG 230 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAE 231 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKA 232 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKK 233 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDK 234 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKD 235 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKEK 236 GGKLSKKKKGYNVNDEKAKE 237 GGKLSKKKKGYNVNDEKAK 238 GGKLSKKKKGYNVNDEKA 239 GGKLSKKKKGYNVNDEK 240 GGKLSKKKKGYNVNDE 241 GGKLSKKKKGYNVND 242 GGKLSKKKKGYNV 243 GGKLSKKKKGYN 244 GGKLSKKKKGY 245 GGKLSKKKKG 246 GGKLSKKKK 247 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKEA 248 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKE 249 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK 250 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNK 251 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKKN 252 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFKK 253 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSFK 254 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFSF 255 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGFS 256 GAKKSKKRFSFKKSFKLSGF 257 GAKKSKKRFSFKKSFKLSG 258 GAKKSKKRFSFKKSFKLS 259 GAKKSKKRFSFKKSFKL 260 GAKKSKKRFSFKKSFK 261 GAKKSKKRFSFKKSF 262 GAKKSKKRFSFKK 263 GAKKSKKRFSFK 264 GAKKSKKRFSF 265 GAKKSKKRFS 266 GAKKSKKRF 267 GAKKSKKR 268 GAKKSKK 269 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKEA 270 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKKE 271 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK 272 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNK 273 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKN 274 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKK 275 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSFK 276 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFSF 277 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGFS 278 GAKKAKKRFSFKKSFKLSGF 279 GAKKAKKRFSFKKSFKLSG 280 GAKKAKKRFSFKKSFKLS 281 GAKKAKKRFSFKKSFKL 282 GAKKAKKRFSFKKSFK 283 GAKKAKKRFSFKKSF 284 GAKKAKKRFSFKKS 285 GAKKAKKRFSFKK 286 GAKKAKKRFSFK 287 GAKKAKKRFSF 288 GAKKAKKRFS 289 GAKKAKKRF 290 GAKKAKKR 291 GAKKAKK 292 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKK 293 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSGFSFK 294 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSGFSF 295 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSGFS 296 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSGF 297 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLSG 298 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKLS 299 GAQESKKKKKKRFSFKKSFKL 300 GAQESKKKKKKRFSFKKSFK 301 GAQESKKKKKKRFSFKKSF 302 GAQESKKKKKKRFSFKKS 303 GAQESKKKKKKRFSFKK 304 GAQESKKKKKKRFSFK 305 GAQESKKKKKKRFSF 306 GAQESKKKKKKRFS 307 GAQESKKKKKKRF 308 GAQESKKKKKKR 309 GAQESKKKKKK 310 GAQESKKKKK 311 GAQESKKKK 312 GAQESKKK 313 GAQESKK 314 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLSFKRNRK 315 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLSFKRNR 316 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLSFKRN 317 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLSFKR 318 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLSFK 319 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLSF 320 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGLS 321 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSGL 322 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLSG 323 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKLS 324 GSQSSKKKKKKFSFKKPFKL 325 GSQSSKKKKKKFSFKKPFK 326 GSQSSKKKKKKFSFKKPF 327 GSQSSKKKKKKFSFKKP 328 GSQSSKKKKKKFSFKK 329 GSQSSKKKKKKFSFK 330 GSQSSKKKKKKFSF 331 GSQSSKKKKKKFS 332 GSQSSKKKKKKF 333 GSQSSKKKKKK 334 GSQSSKKKKK 335 GSQSSKKKK 336 GSQSSKKK 337 GSQSSKK 338 GGKFSKK 339 GGKFAKK 340 GGKSSKK 341 GGKSAKK 342 GGKQAKK 343 GGQLSKK 344 GGQLAKK 345 GGQFSKK 346 GGQFAKK 347 GGQSSKK 348 GGQSAKK 349 GGQQSKK 350 GGQQAKK 351 GAKLAKK 352 GAKFSKK 353 GAKFAKK 354 GAKSSKK 355 GAKSAKK 356 GAKQSKK 357 GAKQAKK 358 GAQLSKK 359 GAQLAKK 360 GAQFSKK 361 GAQFAKK 362 GAQSSKK 363 GAQSAKK 364 GAQQSKK 365 GAQQAKK 366 GSKLSKK 367 GSKLAKK 368 GSKFSKK 369 GSKFAKK 370 GSKSSKK 371 GSKSAKK 372 GSKQSKK 373 GSKQAKK 374 GSQLSKK 375 GSQLAKK 376 GSQFSKK 377 GSQFAKK 378 GSQSAKK 379 GSQQSKK 380 GSQQAKK 381 GGKFSK 382 GGKFAK 383 GGKSSK 384 GGKSAK 385 GGKQAK 386 GGQLSK 387 GGQLAK 388 GGQFSK 389 GGQFAK 390 GGQSSK 391 GGQSAK 392 GGQQSK 393 GGQQAK 394 GAKLAK 395 GAKFSK 396 GAKFAK 397 GAKSSK 398 GAKSAK 399 GAKQSK 400 GAKQAK 401 GAQLSK 402 GAQLAK 403 GAQFSK 404 GAQFAK 405 GAQSSK 406 GAQSAK 407 GAQQSK 408 GAQQAK 409 GSKLSK 410 GSKLAK 411 GSKFSK 412 GSKFAK 413 GSKSSK 414 GSKSAK 415 GSKQSK 416 GSKQAK 417 GSQLSK 418 GSQLAK 419 GSQFSK 420 GSQFAK 421 GSQSSK 422 GSQSAK 423 GSQQSK 424 GSQQAK 425 GXKLSKKK
EXEMPLE
Următoarele exemple sunt prezentate astfel încât să asigure specialiştilor în domeniu o dezvăluire şi o descriere complete ale modului de realizare şi utilizare a prezentei dezvăluiri, şi nu sunt destinate limitării domeniului de aplicare a ceea ce inventatorii revendică ca fiind dezvăluirea acestora, şi nici nu se intenţionează ca experimentele de mai jos să fie toate sau singurele experimente efectuate. S-au făcut eforturi pentru a asigura acurateţea numerelor utilizate (de exemplu, cantităţi, temperatură etc.), dar ar trebui luate în considerare unele erori experimentale şi abateri.
Cu excepţia cazului în care se indică altfel, părţile sunt părţi în greutate, greutatea moleculară este greutatea moleculară medie, temperatura este exprimată în grade Celsius, şi presiunea este egală sau apropiată de cea atmosferică. Se pot utiliza abrevieri standard, de exemplu, bp, pereche (perechi) de bază; kb, kilobază (kilobaze); pl, picolitru (picolitri); s sau sec, secundă (secunde); min, minut (minute); h sau hr, oră (ore); aa, aminoacid (aminoacizi); nt, nucleotidă (nucleotide); şi altele asemenea.
Punerea în practică a prezentei dezvăluiri va necesita, dacă nu se indică în mod diferit, metode convenţionale de chimie proteică, biochimie, tehnici cu ADN recombinant şi farmacologie, din stadiul tehnicii. Aceste tehnici sunt explicate în întregime în literatură. A se vedea, de exemplu, T.E. Creighton, Proteine: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); AL. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, şi colab., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Ediţia a 2-a, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, Ediţia a 21-a (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 2005); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry Ed. a 3-a (Plenum Press) Vol. A şi B(1992).
Exemplul 1
Identificarea unei secvenţe proteice minime suficiente pentru încărcarea sarcinilor utile de exozom luminal
Pentru a identifica secvenţa minimă de aminoacid BASP1 dintre cele douăsprezece trunchieri de aminoacizi care facilitează încărcarea şi cele şase trunchieri de aminoacizi care nu au facilitat încărcarea astfel cum s-a arătat mai sus, mutanţii de trunchiere individuală ai capătului N-terminal al BASP1 fuzionată la un marcaj FLAG® şi GFP s-au generat şi s-au exprimat stabil în celulele HEK293SF (FIG. 1A). Exozomii s-au purificat din culturile celulare stabile astfel cum s-a descris mai sus. Secvenţele BASP1 de şapte până la doisprezece aminoacizi au avut capacitatea de a încărca GFP în exozomi la o densitate mare, în timp ce primii şase aminoacizi nu au avut această capacitate (FIG. 1B). Aceste date demonstrează faptul că este necesar cel puţin un rest de lizină peste poziţia şase pentru încărcarea luminală a exozomilor cu capătul N-terminal al BASP1, adică, pentru ataşarea la suprafaţa luminală a exozomului.
Serina din poziţia 6 a BASP1 este puternic conservată între specii şi în MARCKS şi MARCKSL1. Pentru a se determina dacă acest aminoacid este necesar pentru încărcarea sarcinii utile în exozomi, celulele HEK293SF au fost transfectate în mod stabil cu plasmide de expresie care codifică BASP1 1-30- FLAG®-GFP sau BASP1 1-30- FLAG®-GFP incluzând un mutant punct, înlocuind serina şase cu acid aspartic (S6D; substituţie încărcată polar) sau alanină (S6A; substituţie nepolară redusă). În plus, lizina din poziţia cinci s-a mutaţionat într-un acid glutamic (L5Q) pentru a se testa rolul potenţial al acestei poziţii în modularea miristoilării, palmitoilării şi a altor funcţii membranare ale câtorva proteine asociate membranei (Gottlieb-Abraham şi colab., Mol. Biol. Cell. 2016 Dec 1;27(24):3926-3936) (FIG. 2A). BASP1 S6D a abrogat complet încărcarea GFP în exozomi, în timp ce S6A nu a alterat încărcarea. BASP1 L5Q nu a impactat nici încărcarea luminală, indicând faptul că o sarcină negativă la poziţia şase întrerupe încărcarea, în timp ce o substituţie de aminoacizi polari la poziţia cinci este bine tolerată (FIG. 2B).
Primii treizeci de aminoacizi ai BASP1 conţin secvenţa lider N-terminală identificată mai sus, urmaţi de o porţiune îmbogăţită în lizină de aminoacizi. Pentru a înţelege dacă MARCKS şi MARCKSL1 N-terminale pot să încarce exozomi în mod similar cu BASP1, celulele HEK293SF au fost transfectate în mod stabil cu proteine de lungime întreagă MARCKS şi MARCKSL1 sau aminoacizii 1-30 fuzionaţi la FLAG®-GFP. Exozomii purificaţi s-au analizat prin SDS PAGE şi colorare cu COOMASSIE® pentru a se determina limita de încărcare. MARCKS şi MARCKSL1 de lungime întreagă au avut capacitatea să încarce exozomi cu GFP, însă aminoacizii 1-30 au fost inferiori proteinelor de lungime întreagă, sugerând faptul că există caracteristici suplimentare structurale sau de secvenţă în regiunile distale ale proteinelor MARCKS şi MARCKSL1 necesare încărcării (FIG. 3). Prin testarea secvenţială a MARCKS şi MARCKSL1 s-au descoperit regiuni cu o potenţială omologie secvenţială la capătul N-terminal al BASP1.
Aminoacizii 152-173 ai MARCKS şi 87-110 ai MARCKSL1 sunt îmbogăţiţi în lizină cu resturi intercalate de fenilalanină şi serină şi se anticipează ca fiind domenii fosforilate la situs (PSD) sau domenii efector (ED) (FIG. 4). Celulele HEK293SF au fost transfectate în mod stabil cu constructe plasmidice care fuzionează aminoacizii 1-3 ai MARCKS la domeniul PSD (MG-PSD). Mutaţiile individuale punctuale au fost generate la situsul de miristoilare anticipat (MA-PSD) şi poziţia şase (K6S şi K6A) pentru a se determina rolul acestor resturi în încărcarea exozomilor (FIG. 5A). Testele Western blot ale exozomilor purificaţi au demonstrat faptul că, comparativ cu martorul pozitiv de BASP1 1-30, nici MG-PSD şi nici MA-PSD nu au putut încărca eficient exozomii. În mod interesant, mutaţiile K6A şi K6S au dus la îmbunătăţiri ale încărcării, sugerând faptul că o încărcare pozitivă la poziţia 6 previne încărcarea unei sarcini utile exozomice şi că PSD a MARCKS poate complementa funcţional pentru secvenţa N-terminală endogenă (FIG. 5B). Împreună, aceste studii au permis identificarea câtorva motive suficiente pentru a încărca o încărcătură utilă în exozomi (FIG. 6).
Cel mai apropiat motiv, Motivul 1, permite o secvenţă proteică de (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118) sau
(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 202) fără primul Met, în care fiecare literă între paranteze sau grup de litere este o poziţie a aminoacidului, şi în care, suplimentar, poziţia cinci nu poate fi un aminoacid încărcat pozitiv (K/R/H) şi poziţia şase nu poate fi un aminoacid încărcat negativ (D/E).
Sub-motivele Motivului 1 includ, fără a se limita la, secvenţele proteice:
(M)(G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 180),
(G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 191)
(M)(G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 181),
(G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 192),
(M)(G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 182),
(G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 193),
(M)(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 183),
(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 194),
(M)(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 184),
(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 195),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 185),
(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 196),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 186),
(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 197),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 187),
(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 198),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 188),
(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 199),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K) (SEQ ID NO: 189),
(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K) (SEQ ID NO: 200),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K) (SEQ ID NO: 190), şi
(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K) (SEQ ID NO: 201),
în care poziţia cinci nu poate fi un aminoacid încărcat pozitiv (K/R/H), şi poziţia şase nu poate fi un aminoacid încărcat negativ (D/E).
Motivul 2, un motiv mai larg, poate fi exprimat sub forma (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) sau (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) fără primul Met, în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+), nici (Asp sau Glu). A se vedea R. Aasland şi colab., FEBS Literele 513 (2002): 141-144 pentru nomenclatura aminoacizilor.
Motivul 3, cel mai larg motiv, poate fi exprimat sub forma (M)(G)(π)(X)((Φ/π)(π)(+)(+) sau (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) fără primul Met, în care fiecare poziţie parentetică reprezintă un aminoacid, şi în care π este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Pro, Gly, Ala, Ser), X este orice aminoacid, Φ este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), şi (+) este orice aminoacid selectat din grupul constând din (Lys, Arg, His); şi în care poziţia cinci nu este (+) şi poziţia şase nu este nici (+), nici (Asp sau Glu). În toate cazurile Motivelor 1-3, secvenţa poate fi trunchiată de un aminoacid pentru a fi şapte aminoacizi în total în lungime (adică, constând din aminoacizii 1-7 în ordinea prezentată în Motivele 1-3). Oricare dintre secvenţele derivate din oricare dintre Motivele 1, 2 sau 3 (sau aceste motive cărora de lipseşte aminoacidul 7), pot fi utilizate pentru a încărca o încărcătură utilă în exozomi în aceeaşi limită ca, sau comparabil cu, BASP1 de lungime întreagă sau secvenţele de trunchiere naturală ale BASP1. Această analiză amănunţită a secvenţei de aminoacizi-structură-funcţie furnizează noi perspective asupra cerinţelor pentru direcţionarea sarcinii utile exprimate biologic în exozomi prin celulele producătoare.
Exemplul 2
Capătul N-terminal al BASP1 este suficient pentru a încărca clase diverse de proteine
Rezultatele din Exemplul 1 sugerează faptul că capătul N-terminal al BASP1 poate fi un schelet modificat util pentru generarea exozomilor încărcaţi luminal direct din celulele producătoare. Pentru a testa această ipoteză, s-au generat celule stabile HEK293SF pentru a exprima proteina Cas9 de lungime întreagă cu optimizarea codonului (astfel cum s-a descris în Zetsche B, Volz SE, Zhang F. A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation. Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):139-42) fuzionată la aminoacizii 1-30 sau 1-10 ai BASP1. Exozomii s-au purificat din cultura celulară astfel cum s-a descris mai sus, şi s-au analizat prin SDS-PAGE şi s-au testat prin Western blot utilizând un anticorp anti-Cas9 (Abcam; Catalog # ab191468, clona 7A9-3A3). Astfel cum s-a prezentat în FIG. 7A, atât BASP1 1-30, cât şi 1-10 au fost suficienţi pentru a încărca Cas9 în exozomi. Proteina Cas9 recombinantă s-a utilizat ca martor pozitiv pentru testarea Western blot. Cuantificarea densitometriei şi compararea diverselor cantităţi de Cas9 recombinant şi benzilor exozomice de BASP1-Cas9 din experimentele de testare prin Western blot au relevat faptul că exozomii au fost încărcaţi cu 4-5 molecule Cas9 per exozom (FIG. 7B). Această enzimă Cas9, care are o masă de ∼160kDa, reprezintă o creştere semnificativă a dimensiunii sarcinii utile comparativ cu experimentele GFP prezentate mai sus.
Ca o validare suplimentară a diversităţii de proteine de sarcină utilă care pot fi încărcate ca o fuziune la capătul N-terminal al BASP1, ovalbumina a fost exprimată stabil în celulele HEK293SF ca fuziune la aminoacizii 1-10 ai BASP1 ("BASP1(1-10)-OVA"). O linie celulară separată s-a co-transfectat cu aceeaşi plasmidă şi o a doua plasmidă care codifică CD40L trimerică fuzionată la o glicoproteină PTGFRN de suprafaţă specifică exozomului ("3xCD40L-PTGFRN") utilizând un al doilea marker selectabil. Exozomii s-au purificat din cele două culturi celulare transfectate şi s-au analizat prin SDS-PAGE (FIG. 8A) şi prin western blot anti-ovalbumină (Abcam; Catalog # ab17293, clona 6C8) (FIG. 8B). Ca martor, ovalbumina recombinantă (InvivoGen; Catalog # vac-pova) s-a titrat într-un gel separat. Ovalbumina s-a încărcat puternic în exozomi atunci când a fuzionat la aminoacizii 1-10 ai BASP1 ca un singur construct sau atunci când este în combinaţie cu o plasmidă de supraexprimare suplimentară (3xCD40L-PTGFRN). Acest rezultat demonstrează faptul că exozomii pot fi modificaţi combinatoriu, atât cu o sarcină utilă luminală, cât şi cu o sarcină utilă de suprafaţă simultană (de exemplu, PTGFRN) dintr-un transcript separat.
O altă clasă de proteine care poate fi utilă în contextul exozomilor terapeutici este dată de anticorpi şi fragmente de anticorpi. Un nanocorp camelid cu un singur lanţ care ţinteşte GFP (astfel cum s-a descris în Caussinus E, Kanca O, Affolter M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nat Struct Mol Biol. 2011 Dec 11;19(1):117-21) a fost exprimat stabil în celulele HEK293SF ca proteină de fuziune la aminoacizii 1-10 ai BASP1 şi un marcaj FLAG® ("BASP1(1-10)-Nanocorp") sau un marcaj FLAG® singur ("Nanocorp") (FIG. 9A). Exozomii purificaţi s-au analizat prin SDS-PAGE şi Western blot anti-FLAG®, demonstrând faptul că a existat o îmbogăţire substanţială a nanocorpului cu cantităţi egale din cantitatea totală de proteine încărcată atunci când nanocorpul a fost fuzionat la capătul N-terminal al BASP1 (FIG. 9B). Aceste rezultate demonstrează faptul că sarcini utile proteice ale claselor diverse pot fi exprimate şi împachetate în exozomi de celule producătoare utilizând o secvenţă proteică foarte scurtă derivată din capătul N-terminal al BASP1, adică, un schelet.
Exemplul 3
Capătul N-terminal al BASP1 se poate utiliza pentru a încărca acizi nucleici în lumenul exozomilor
Acizii nucleici, şi în particular ARN-urile (de exemplu, ARNm-uri, ARNsi-uri, ARNmi-uri) sunt o clasă atractivă de sarcină utilă terapeutică care trebuie încărcată în lumenul exozomilor terapeutici. Încărcarea exozomului de ARN poate să protejeze ARN-ul de degradare în mediul extracelular şi exozomul încărcat poate fi direcţionat la anumite celule şi/sau ţesuturi prin niveluri suplimentare de modificări ale exozomului, de exemplu, exprimarea de suprafaţă ţintirii constructului. Pentru a înţelege dacă EV, de exemplu, proteinele exozomice (sau fragmente de proteine) identificate mai sus se pot utiliza pentru a genera exozomii cu ARNm încărcat, s-au generat exozomi modificaţi combinatoriu. Astfel cum s-a prezentat în FIG. 10, aminoacizii 1-30 ai BASP1 au fost exprimaţi ca fuziune la FLAG® şi variantele MCP proteice phage. MCP recunoaşte şi se leagă la o buclă stem de ARNm denumită MS2, care poate fi exprimată sub forma unei fuziuni transcripţionale la ARNm-uri şi la alte ARN-uri, aşadar conducând o asociere fizică între proteinele de fuziune MCP şi ARN-urile de fuziune MS2 de interes. Testarea mutaţională a identificat anterior două poziţii în MCP care cresc afinitatea la MS2; o substituţie valină în izoleucină la poziţia 29 (V29I; Lim & Peacorp, ARN. Acizi nucleici Res. 1994 Sep 11;22(18):3748-52) şi o substituţie asparagină în lizină la poziţia 55 (N55K; Lim şi colab., J Biol Chem. 1994 Mar 25;269(12):9006-10). BASP1 1-30 a fost fuzionată la variantele MCP monomerice sau dimerice, în care fiecare MCP a fost fie V29I, fie V29I/N55K dublu mutaţionată. Un construct raportor de luciferază a fost exprimat ca fuziune la 3 bucle stem MS2 dintr-o plasmidă separată. S-au generat cinci linii celulare stabile HEK293SF, fie MS2 de luciferază singură (#811) sau în combinaţie cu fiecare dintre variantele BASP1-MCP (#815, 817, 819 sau 821) (FIG. 10). Ca martor suplimentar, celulele HEK293SF au fost transfectate în mod stabil cu BASP1 marcat cu FLAG 1-27. Exozomii au fost izolaţi şi s-au tratat cu BENZONASE® pentru a se îndepărta toate ARNm-urile asociate extern, şi s-au purificat în conformitate cu metodele de mai sus. Exozomii purificaţi s-au analizat prin SDS-PAGE (FIG. 11A) şi prin Western blot anti-FLAG® (FIG. 11B), demonstrându-se cantităţi egale din cantitatea totală de proteine şi niveluri comparative de fuziuni BASP1-FLAGS) în fiecare preparare a exozomului. Este important că fuziunile BASP1-MCP exprimate la niveluri comparabile ca fuziune BASP1 1-27 FLAG căreia îi lipseşte o proteină MCP, au demonstrat faptul că adiţia de monomeri sau dimeri MCP nu întrerupe încărcarea mediată de BASP1 a proteinelor în exozomi.
Celulele care exprimă stabil BASP1-MCP şi ARNm MS2 luciferază au fost izolate şi s-a cuantificat cantitatea totală de ARNm luciferază prin RT-qPCR (Primer FWD: 5'-TGGAGGTGCTCAAAGAGTTG-3' (SEQ ID NO: 119); Primer REV: 5'-TTGGGCGTGCACTTGAT-3' (SEQ ID NO: 120); PROBĂ: 5'-/56-FAM/CAGCTTTCC/ZEN/GGGCATTGGCTTC/3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO: 121)). Celulele netransfectate au exprimat niveluri scăzute ale luciferazei faţă de toate celule care exprimă 811, care au exprimat niveluri comparabile de luciferază (FIG. 12A, sus). Exozomii purificaţi din fiecare dintre liniile celulare stabile s-au analizat de asemenea prin RT-qPCR. Exozomii nativi nu au avut niveluri detectabile de MS2 luciferază, în timp ce celulele care exprimă 811 singure au avut niveluri detectabile, dar niveluri foarte scăzute de MS2 luciferază. Este important că, fiecare dintre proteinele de fuziune BASP1-MCP a conţinut cantităţi mai mari de ARNm MS2 luciferază, demonstrându-se importanţa legării dintre MCP şi MS2 pentru a facilita încărcarea ARNm-ului în exozomi (FIG. 12A, jos). Cuantificarea ARNm-ului relativ dintre grupuri a demonstrat o îmbogăţire de la ∼30 la 60 de ori pentru toate fuziunile BASP1-MCP peste 811 singur (FIG. 12B). Constructul BASP1-MCP 821, care a conţinut MCP V29I/N55K dimerică este anticipat pentru a avea cea mai mare afinitate pentru ARNm-urile MS2, şi într-adevăr a conţinut cea mai mare cantitate de MS2 luciferază în acest experiment. Aceste rezultate demonstrează faptul că fragmentele BASP1 sunt proteine de schelet puternice şi versatile pentru încărcarea lumenului exozomilor cu diverse sarcini utile incluzând acizi nucleici.
Exemplul 4
BASP1, MARCKS şi MARCKSL1 se pot utiliza pentru a genera exozomi cu suprafaţa decorată
Rezultatele din experimentele anterioare au demonstrat faptul că regiunile de lungime întreagă şi N-terminale ale MARCKS, MARCKSL1 şi BASP1 se pot utiliza pentru a genera exozomi încărcaţi luminal. Pentru a explora suplimentar potenţialul acestor proteine pentru modificarea exozomului, aminoacizii 1-30 ai MARCKS, MARCKSL1 şi BASP1, sau aminoacizii 1-10 ai BASP1 au fost fuzionaţi la regiunea transmembranară endogenă a CD40L exprimată ca homotrimer. Constructele s-au preparat atât pentru secvenţele umane, cât şi de şoarece de CD40L deoarece liganzii nu reacţionează încrucişat cu receptorul înrudit pe celelalte specii (FIG. 13). Exozomii s-au purificat din celule HEK293SF transfectate stabil cu unul dintre constructele de expresie CD40L şi s-au incubat fie în celule B de şoarece, fie umane. Cantităţile de CD40L de pătrundere pe exozomi s-au măsurat prin CD40L ELISA (s-au utilizat pentru măsurarea CD40L uman, R&D Systems, Catalog # DCDL40, Lot # P168248; şi pentru măsurarea CD40L de şoarece, Abcam, Catalog # ab119517, Lot # GR3218850-2), celulele B s-au cuantificat utilizând marker pentru celule B, CD19, şi s-a măsurat activarea celulelor B ca procentaj de celule închise pozitive la CD69. Curbele de titrare a dozei de CD40L exozomic de şoarece (FIG. 14A) sau uman (FIG. 14B) la culturile potrivite pe specii au prezentat activitate comparabilă între constructele pe bază particulă-la-particulă (graficele din stânga şi tabelul de mai jos) sau comparativ între acestea şi cantităţi egale de proteină recombinantă pe bază molară de CD40L (graficele din dreapta şi tabelul de mai jos). O activitate comparabilă s-a observat atunci când constructele CD40L au fost exprimate, de asemenea, ca monomeri, şi au fost doar relativ puţin mai potente decât CD40L trimerică exprimată pe capătul N-terminal al PTGFRN, un schelet de afişare a exozomului de înaltă densitate (a se vedea, de exemplu, Cererea internaţională de brevet nr. PCT/US2018/048026) (FIG. 14C). Aceste rezultate demonstrează faptul că MARCKS, MARCKSL1 şi BASP1 sunt schelete diverse, puternice utile pentru generarea de clase diverse de exozomi modificaţi pentru utilizare în aplicaţii umane şi animale.
Exemplul 5
Tipurile celulare diverse exprimă BASP1, MARCKS şi/sau MARCKSL1
Liniile celulare din ţesuturi diferite din punctul de vedere al originii (HEK293, kidney; HT1080, ţesut conjunctiv; K562, măduvă osoasă; MDA-MB-231, sân; Raji, limfoblast) au fost crescute în faza logaritmică şi s-au transferat în mediu suplimentat cu ser fără exozom timp de ∼6 zile cu excepţia celulelor HEK293, care au fost crescute în mediu definit chimic. Celulele stem mezenchimale derivate din măduva osoasă (MSC) au fost crescute pe micropurtători 3D timp de cinci zile şi s-au suplimentat în mediul fără ser timp de trei zile. Supernatantul din fiecare cultură de linie celulară s-a izolat, şi exozomii s-au purificat utilizând metoda de ultracentrifugare cu gradient de densitate OPTIPREP™ descrisă mai sus. Fiecare dintre preparatele de exozom purificate s-au analizat prin LC-MS/MS astfel cum s-a descris mai sus, şi s-a cuantificat numărul de potriviri în spectrul peptidic (PSM-uri) pentru BASP1, MARCKS şi MARCKSL1 şi două EV studiate pe larg, de exemplu, proteinele de exozom (CD81 şi CD9). Tetraspaninele CD81 şi CD9 au fost detectabile la majoritatea populaţiilor de exozom purificate, însă în unele cazuri au fost egale cu, sau mai puţine decât proteinele luminale ale EV, de exemplu, exozom (de exemplu, CD9 comparativ cu BASP1 sau MARCKSL1) (FIG. 15). Această descoperite indică faptul că markerii exozomului luminal nou identificat pot fi proteine de fuziune adecvate pentru generarea de exozomi modificaţi din câteva linii celulare neînrudite derivate din ţesuturi diferite.
Exemplul 6
Celulele neumane care supraexprimă BASP1 produc exozomi modificaţi luminal
Rezultatele din Exemplul 5 demonstrează faptul că numeroase celule derivate de la om exprimă în mod natural BASP1 şi cealaltă EV nouă. Pentru a se determina dacă BASP1 se pot utiliza ca proteină de schelet exozomică universală, au fost transfectate celule din ovar de hamster chinezesc (CHO) în mod stabil cu o plasmidă care exprimă BASP1 de lungime întreagă fuzionată la un marcaj FLAG® şi GFP ("BASP1-GFP-FLAG"), o plasmidă care exprimă aminoacizii 1-30 ai BASP1 fuzionată la un marcaj FLAG® şi GFP ("BASP1(1-30)-GFP-FLAG") sau o plasmidă care exprimă aminoacizii 1-8 ai BASP1 fuzionată la un marcaj FLAG® şi GFP ("BASP1(1-8)-GFP-FLAG"). Exozomii s-au purificat din celulele CHO de tip sălbatic şi s-au transfectat celule CHO cu una dintre cele trei plasmide BASP1. Astfel cum s-a prezentat în FIG. 16A-B, fragmentul BASP1 şi proteinele de fuziune BASP1 au fost supraexprimate cu succes în celulele CHO şi s-au încărcat în exozomi astfel cum s-a detectat prin PAGE fără colorare (FIG. 16A) şi Western blot cu un anticorp împotriva FLAG® (FIG. 16B). Acest rezultat demonstrează faptul că celulele neumane, cum ar fi celulele CHO, pot produce exozomi care supraexprimă fragmente BASP1 umane, şi faptul că această supraexprimare poate duce la o încărcătură utilă proteică în lumenul exozomilor la o densitate mare. Acest rezultat indică faptul că BASP1 este o proteină de schelet universală pentru generarea de exozomi modificaţi din numeroase tipuri celulare şi specii diferite.
Prezenta dezvăluire s-a descris mai sus cu ajutorul blocurilor de construcţie funcţionale care ilustrează implementarea funcţiilor şi relaţiilor specificate ale acestora. Limitele acestor blocuri de construcţie funcţionale s-au definit în mod arbitrar în prezenta pentru comoditatea descrierii. Se pot defini limite alternative atât timp cât funcţiile şi relaţiile specificate ale acestora sunt realizate într-un mod adecvat.
Echivalenţi
Prezenta dezvăluire furnizează, inter alia, compoziţii de EV-uri, de exemplu, exozomi conţinând proteine şi peptide modificate exogene pentru utilizare la îmbogăţirea proteinelor exogene în EV-uri, de exemplu, exozomi. Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, o metodă de producere de EV-uri îmbogăţite, de exemplu, exozomi. În timp ce s-au ilustrat şi s-au descris diverse variante de realizare specifice, specificaţia de mai sus nu este restrictivă. Întinderea şi domeniul de aplicare al prezentei dezvăluiri nu trebuie limitate de niciuna dintre variantele de realizare exemplificative descrise mai sus. Numeroase variaţii vor deveni evidente specialiştilor în domeniu în momentul citirii acestei specificaţii.
Prezenta cerere revendică beneficiul Cererii internaţionale nr. PCT/US2018/061679, depuse la data de 16 noiembrie 2018 şi Cererii provizorii S.U.A. nr. 62/835.430, depuse la data de 17 aprilie 2019.
LISTAREA SECVENŢELOR
<110> CODIAK BIOSCIENCES
<120> VEZICULE EXTRACELULARE MODIFICATE ŞI UTILIZĂRI ALE ACESTORA
<130> 4000.041PC01/C-K/BMD
<140> PCT/US2018/061679 <141> 2018-11-16
<150> US 62/835.430 <151> 2019-04-17
<160> 425
<170> PatentIn versiune 3.5
<210> 1 <211> 332 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină MARCKS
<400> 1
<210> 2 <211> 195 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină MARCKSL1
<400> 2
<210> 3 <211> 227 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină BASP1
<400> 3
<210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Fragment BASP1
<400> 4
<210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 5
<210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 6
<210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 7
<210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 8
<210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 9
<210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 10
<210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 11
<210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 12
<210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 13
<210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 14
<210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 15
<210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 16
<210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 17
<210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 18
<210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 19
<210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 20
<210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 21
<210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 22
<210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 23
<210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 24
<210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 25
<210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 26
<210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 27
<210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 28
<210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 29
<210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 30
<210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 31
<210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 32
<210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 33
<210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 34
<210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 35
<210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 36
<210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 37
<210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 38
<210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 39
<210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 40
<210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 41
<210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 42
<210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 43
<210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 44
<210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 45
<210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 46
<210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 47
<210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 48
<210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 49
<210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 50
<210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 51
<210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 52
<210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 53
<210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 54
<210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 55
<210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 56
<210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 57
<210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 58
<210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 59
<210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 60
<210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 61
<210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 62
<210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 63
<210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 64
<210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 65
<210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 66
<210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 67
<210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 68
<210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 69
<210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 70
<210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 71
<210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 72
<210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 73
<210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 74
<210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 75
<210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 76
<210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 77
<210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 78
<210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 79
<210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 80
<210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 81
<210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 82
<210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 83
<210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 84
<210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 85
<210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 86
<210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 87
<210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 88
<210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 89
<210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 90
<210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 91
<210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 92
<210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 93
<210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 94
<210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 95
<210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 96
<210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 97
<210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 98
<210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 99
<210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 100
<210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 101
<210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 102
<210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 103
<210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 104
<210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 105
<210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 106
<210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 107
<210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 108
<210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 109
<210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 110
<210> 111 <211> 167 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 111
<210> 112 <211> 167 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 112
<210> 113 <211> 296 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 113
<210> 114 <211> 296 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 114
<210> 115 <211> 680 <212> ARN <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 115
<210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> peptidă de schelă
<220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa poate fi oricare aminoacid de provenienţă naturală
<400> 116
<210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> peptidă de schelă
<220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa poate fi oricare aminoacid de provenienţă naturală
<400> 117
<210> 118 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(3) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa poate fi oricare aminoacid de provenienţă naturală
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = S, A
<400> 118
<210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 119 tggaggtgct caaagagttg 20
<210> 120 <211> 17 <212> DNA <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 120 ttgggcgtgc acttgat 17
<210> 121 <211> 13 <212> DNA <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 121 gggcattggc ttc 13
<210> 122 <211> 60 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 122
<210> 123 <211> 60 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 123
<210> 124 <211> 60 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 124
<210> 125 <211> 60 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 125
<210> 126 <211> 57 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 126
<210> 127 <211> 54 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 127
<210> 128 <211> 51 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 128
<210> 129 <211> 48 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 129
<210> 130 <211> 45 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 130
<210> 131 <211> 42 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 131
<210> 132 <211> 39 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 132
<210> 133 <211> 36 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 133
<210> 134 <211> 33 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 134
<210> 135 <211> 54 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 135
<210> 136 <211> 36 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 136
<210> 137 <211> 35 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 137
<210> 138 <211> 34 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 138
<210> 139 <211> 33 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 139
<210> 140 <211> 32 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 140
<210> 141 <211> 31 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 141
<210> 142 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 142
<210> 143 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 143
<210> 144 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 144
<210> 145 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 145
<210> 146 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 146
<210> 147 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 147
<210> 148 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 148
<210> 149 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 149
<210> 150 <211> 153 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 150
<210> 151 <211> 4 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> domeniu efector
<400> 151
<210> 152 <211> 5 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> domeniu efector
<400> 152
<210> 153 <211> 4 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> domeniu efector
<400> 153
<210> 154 <211> 5 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> domeniu efector
<400> 154
<210> 155 <211> 4 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> domeniu efector
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> Xaa = K, R
<400> 155
<210> 156 <211> 5 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> domeniu efector
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Xaa= K, R
<400> 156
<210> 157 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 157
<210> 158 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 158
<210> 159 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 159
<210> 160 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 160
<210> 161 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 161
<210> 162 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 162
<210> 163 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 163
<210> 164 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 164
<210> 165 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 165
<210> 166 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 166
<210> 167 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 167
<210> 168 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 168
<210> 169 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 169
<210> 170 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 170
<210> 171 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 171
<210> 172 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 172
<210> 173 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 173
<210> 174 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 174
<210> 175 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 175
<210> 176 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 176
<210> 177 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 177
<210> 178 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 178
<210> 179 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<400> 179
<210> 180 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa= K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa= L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa= S, A
<400> 180
<210> 181 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa= K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa= L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa= S, A
<400> 181
<210> 182 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = S, A
<400> 182
<210> 183 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = S, A
<400> 183
<210> 184 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa= G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa= L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa= S, A
<400> 184
<210> 185 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = S, A
<400> 185
<210> 186 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = S, A
<400> 186
<210> 187 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = S, A
<400> 187
<210> 188 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = S, A
<400> 188
<210> 189 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa= G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa= K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa= L, F, S, Q
<400> 189
<210> 190 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = L, F, S, Q
<400> 190
<210> 191 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A
<400> 191
<210> 192 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A
<400> 192
<210> 193 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A
<400> 193
<210> 194 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2).. (2) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A
<400> 194
<210> 195 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2).. (2) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A
<400> 195
<210> 196 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2).. (2) <223> Xaa= G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa= K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa= S, A
<400> 196
<210> 197 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A
<400> 197
<210> 198 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2).. (2) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A
<400> 198
<210> 199 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A
<400> 199
<210> 200 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q
<400> 200
<210> 201 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q
<400> 201
<210> 202 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de schelă
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2).. (2) <223> Xaa = G, A, S
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A
<400> 202
<210> 203 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 203
<210> 204 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 204
<210> 205 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 205
<210> 206 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 206
<210> 207 <211> 4 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 207
<210> 208 <211> 5 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 208
<210> 209 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 209
<210> 210 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 210
<210> 211 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 211
<210> 212 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 212
<210> 213 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 213
<210> 214 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 214
<210> 215 <211> 5 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 215
<210> 216 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 216
<210> 217 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 217
<210> 218 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 218
<210> 219 <211> 4 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 219
<210> 220 <211> 5 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 220
<210> 221 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 221
<210> 222 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 222
<210> 223 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 223
<210> 224 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 224
<210> 225 <211> 10 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 225
<210> 226 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Domeniu N-terminal
<400> 226
<210> 227 <211> 29 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 227
<210> 228 <211> 28 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 228
<210> 229 <211> 27 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 229
<210> 230 <211> 26 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 230
<210> 231 <211> 25 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 231
<210> 232 <211> 24 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 232
<210> 233 <211> 23 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 233
<210> 234 <211> 22 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 234
<210> 235 <211> 21 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 235
<210> 236 <211> 20 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 236
<210> 237 <211> 19 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 237
<210> 238 <211> 18 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 238
<210> 239 <211> 17 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 239
<210> 240 <211> 16 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 240
<210> 241 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 241
<210> 242 <211> 13 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 242
<210> 243 <211> 12 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 243
<210> 244 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 244
<210> 245 <211> 10 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 245
<210> 246 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 246
<210> 247 <211> 29 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 247
<210> 248 <211> 28 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 248
<210> 249 <211> 27 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 249
<210> 250 <211> 26 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 250
<210> 251 <211> 25 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 251
<210> 252 <211> 24 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 252
<210> 253 <211> 23 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 253
<210> 254 <211> 22 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 254
<210> 255 <211> 21 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 255
<210> 256 <211> 20 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 256
<210> 257 <211> 19 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 257
<210> 258 <211> 18 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 258
<210> 259 <211> 17 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 259
<210> 260 <211> 16 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 260
<210> 261 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 261
<210> 262 <211> 13 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 262
<210> 263 <211> 12 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 263
<210> 264 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 264
<210> 265 <211> 10 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 265
<210> 266 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 266
<210> 267 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 267
<210> 268 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 268
<210> 269 <211> 29 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 269
<210> 270 <211> 28 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 270
<210> 271 <211> 27 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 271
<210> 272 <211> 26 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 272
<210> 273 <211> 25 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 273
<210> 274 <211> 24 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 274
<210> 275 <211> 23 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 275
<210> 276 <211> 22 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 276
<210> 277 <211> 21 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 277
<210> 278 <211> 20 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 278
<210> 279 <211> 19 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 279
<210> 280 <211> 18 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 280
<210> 281 <211> 17 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 281
<210> 282 <211> 16 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 282
<210> 283 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 283
<210> 284 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 284
<210> 285 <211> 13 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 285
<210> 286 <211> 12 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 286
<210> 287 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 287
<210> 288 <211> 10 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 288
<210> 289 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 289
<210> 290 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 290
<210> 291 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 291
<210> 292 <211> 28 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 292
<210> 293 <211> 27 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 293
<210> 294 <211> 26 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 294
<210> 295 <211> 25 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 295
<210> 296 <211> 24 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 296
<210> 297 <211> 23 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 297
<210> 298 <211> 22 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 298
<210> 299 <211> 21 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 299
<210> 300 <211> 20 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 300
<210> 301 <211> 19 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 301
<210> 302 <211> 18 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 302
<210> 303 <211> 17 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 303
<210> 304 <211> 16 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 304
<210> 305 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 305
<210> 306 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 306
<210> 307 <211> 13 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 307
<210> 308 <211> 12 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 308
<210> 309 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 309
<210> 310 <211> 10 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 310
<210> 311 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 311
<210> 312 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 312
<210> 313 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 313
<210> 314 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 314
<210> 315 <211> 29 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 315
<210> 316 <211> 28 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 316
<210> 317 <211> 27 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 317
<210> 318 <211> 26 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 318
<210> 319 <211> 25 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 319
<210> 320 <211> 24 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 320
<210> 321 <211> 23 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 321
<210> 322 <211> 22 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 322
<210> 323 <211> 21 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 323
<210> 324 <211> 20 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 324
<210> 325 <211> 19 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 325
<210> 326 <211> 18 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 326
<210> 327 <211> 17 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 327
<210> 328 <211> 16 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 328
<210> 329 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 329
<210> 330 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 330
<210> 331 <211> 13 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 331
<210> 332 <211> 12 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 332
<210> 333 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 333
<210> 334 <211> 10 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 334
<210> 335 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 335
<210> 336 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 336
<210> 337 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de schelă
<400> 337
<210> 338 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 338
<210> 339 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 339
<210> 340 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 340
<210> 341 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 341
<210> 342 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 342
<210> 343 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 343
<210> 344 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 344
<210> 345 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 345
<210> 346 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 346
<210> 347 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 347
<210> 348 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 348
<210> 349 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 349
<210> 350 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 350
<210> 351 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 351
<210> 352 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 352
<210> 353 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 353
<210> 354 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 354
<210> 355 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 355
<210> 356 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 356
<210> 357 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 357
<210> 358 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 358
<210> 359 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 359
<210> 360 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 360
<210> 361 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 361
<210> 362 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 362
<210> 363 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 363
<210> 364 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 364
<210> 365 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 365
<210> 366 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 366
<210> 367 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 367
<210> 368 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 368
<210> 369 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 369
<210> 370 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 370
<210> 371 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 371
<210> 372 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 372
<210> 373 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 373
<210> 374 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 374
<210> 375 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 375
<210> 376 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 376
<210> 377 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 377
<210> 378 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 378
<210> 379 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 379
<210> 380 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 380
<210> 381 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 381
<210> 382 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 382
<210> 383 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 383
<210> 384 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 384
<210> 385 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 385
<210> 386 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 386
<210> 387 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 387
<210> 388 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 388
<210> 389 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 389
<210> 390 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 390
<210> 391 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 391
<210> 392 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 392
<210> 393 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 393
<210> 394 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 394
<210> 395 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 395
<210> 396 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 396
<210> 397 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 397
<210> 398 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 398
<210> 399 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 399
<210> 400 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 400
<210> 401 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 401
<210> 402 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 402
<210> 403 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 403
<210> 404 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 404
<210> 405 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 405
<210> 406 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 406
<210> 407 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 407
<210> 408 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 408
<210> 409 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 409
<210> 410 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 410
<210> 411 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 411
<210> 412 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 412
<210> 413 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 413
<210> 414 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 414
<210> 415 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 415
<210> 416 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 416
<210> 417 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 417
<210> 418 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 418
<210> 419 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 419
<210> 420 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 420
<210> 421 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 421
<210> 422 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 422
<210> 423 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 423
<210> 424 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> proteină de fuziune
<400> 424
<210> 425 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <223> Proteină de fuziune
<220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa poate fi oricare aminoacid de provenienţă naturală
<400> 425

Claims (15)

1. Veziculă extracelulară (EV) izolată care cuprinde o moleculă activă biologic legată la o proteină schelă,
în care proteina schelă cuprinde un domeniu N-terminal (ND) şi un domeniu efector (ED),
în care domeniul ND este asociat cu suprafaţa luminală a EV, şi domeniul ED este asociat cu suprafaţa luminală a EV,
în care domeniul ND cuprinde secvenţa de aminoacizi GGKLSK (SEQ ID NO: 203), dar nu cuprinde o metionină (Met) la capătul N-terminal,
în care domeniul ED cuprinde o lizină (Lys) la capătul N-terminal al acestuia care este legată direct la lizina de la capătul C-terminal al SEQ ID NO: 203 în domeniul ND; şi
în care molecula activă biologic cuprinde una sau mai multe proteine heteroloage fuzionate la capătul C-terminal al proteinei schelă.
2. EV conform revendicării 1, în care domeniul ED cuprinde KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), sau orice combinaţie a acestora.
3. EV conform revendicării 1 sau 2, în care proteina schelă este legată la molecula activă biologic printr-un linker.
4. EV conform revendicării 3, în care linkerul cuprinde un linker clivabil.
5. EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 4, în care proteina schelă cuprinde GGKLSKKK (SEQ ID NO: 161) sau GGKLSKKS (SEQ ID NO: 162).
6. EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 5, în care proteina schelă este de cel puţin aproximativ 8 aminoacizi în lungime.
7. EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 6, în care molecula activă biologic este pe suprafaţa luminală sau în lumenul EV.
8. EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 7, în care proteina schelă mai cuprinde:
(i) un domeniu transmembranar,
(ii) un domeniu extravezicular, sau
(iii) atât (i), cât şi (ii).
9. EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 6, în care proteina schelă mai cuprinde un domeniu transmembranar şi un domeniu extravezicular, şi:
(i) domeniul transmembranar este între domeniul ED al proteinei schelă şi molecula biologic activă, şi
(ii) molecula activă biologic este legată la domeniul extravezicular.
10. EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 9, în care molecula activă biologic cuprinde:
(a) o proteină, unde proteina, opţional, cuprinde
(i) o peptidă recombinantă, o peptidă naturală, o peptidă sintetică, un anticorp, o proteină de fuziune sau orice combinaţie a acestora;
(ii) o enzimă, o citokină, un ligand, un receptor, un factor de transcripţie sau o combinaţie a acestora;
(iii) un receptor de celule T (TCR), un co-receptor de celule T, un complex major de histocompatibilitate (MHC), un antigen uman al leucocitelor (HLA) sau un derivat al acestora;
(iv) un antigen tumoral opţional selectat din grupul constând din alfa-fetoproteina (AFP), antigen carcinoembrionar (CEA), antigen al celulelor epiteliale (ETA), mucină 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucină 16 (MUC16), tirozinază, antigen asociat melanomului (MAGE), proteina tumorală p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligand de moarte programat 1 (PD-L1), ligand de moarte programat 2 (PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mezotelină, VEGFR, receptor de alfa-folat, CE7R, IL-3, antigen al cancerului testicular, MART-1 gp100, şi ligand inductor de apoptoză legat de TNF;
(b) o polipeptidă;
(c) o peptidă;
(d) o polinucleotidă (ADN şi/sau ARN);
(e) un compus chimic;
(f) un virus, unde virusul cuprinde opţional un virus adeno-asociat, un parvovirus, un retrovirus, un adenovirus sau orice combinaţie a acestora;
(g) un ionofor;
(h) un purtător pentru un ionofor;
(i) o fracţiune care formează un canal sau un por; sau
(j) orice combinaţie a acestora.
11. EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 10, în care EV mai cuprinde o a doua proteină schelă, în care a doua proteină schelă cuprinde opţional o polipeptidă PTGFRN, o polipeptidă BSG, o polipeptidă IGSF2, o polipeptidă IGSF3, o polipeptidă IGSF8, o polipeptidă ITGB1, o polipeptidă ITGA4, o polipeptidă SLC3A2, o polipeptidă a transportorului ATP, o polipeptidă a aminopeptidazei N (ANPEP), o polipeptidă a membrului 1 al familiei de ectonucleotid pirofosfatază/fosfodiesterază (ENPP1), o polipeptidă a neprilizinei (MME), o polipeptidă a neuropolinei-1 (NRP1) sau un fragment al acestora.
12. EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 11, în care molecula activă biologic este:
(a) un inhibitor pentru un regulator negativ al punctului de control sau un inhibitor pentru un partener de legare al unui regulator negativ al punctului de control, în care regulatorul negativ al punctului de control este opţional selectat din grupul constând din:
(i) proteina 4 asociată limfocitelor T citotoxice (CTLA-4),
(ii) proteina 1 a morţii celulare programate (PD-1),
(iii) gena 3 activată de limfocite (LAG-3),
(iv) proteina 3 care conţine imunoglobulină şi mucină cu celule T (TIM-3),
(v) atenuator al limfocitelor B şi T (BTLA),
(vi) imunoreceptor al celulelor T cu domenii Ig şi ITIM (TIGIT),
(vii) supresor Ig al domeniului V de activare a celulelor T (VISTA),
(viii) receptor de adenozină A2a (A2aR),
(ix) receptor de tip imunoglobulinic al celulelor ucigaşe (KIR),
(x) indoleamin 2,3-dioxigenază (IDO),
(xi) CD20,
(xii) CD39, şi
(xiii) CD73;
(b) o proteină imunogenă;
(c) o toxină, un toxoid, sau un mutant netoxic al unei toxine, în care
(i) toxina este opţional o toxină difterică, sau
(ii) toxoidul este opţional un toxoid tetanus;
(d) un activator pentru o moleculă co-stimulatoare pozitivă sau un activator pentru un partener de legare al unei molecule co-stimulatoare pozitive, în care molecula co-stimulatoare pozitivă este opţional selectată din grupul constând din:
(i) un membru al superfamiliei de receptori TNF opţional selectat din grupul constând din: CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, receptor Fas, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, receptor TWEAK, TACI, receptor BAFF, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP şi XEDAR, opţional, în care activatorul pentru molecula co-stimulatoare pozitivă este un membru al superfamiliei TNF opţional selectat din grupul constând din: TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, ligand 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, ligand GITR, şi EDA-2; şi
(ii) o moleculă co-stimulatoare a superfamiliei CD28 opţional selectată dintre ICOS şi CD28, opţional, în care activatorul pentru molecula co-stimulatoare pozitivă este ICOSL, CD80 sau CD86.
13. EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 12, în care EV este un exozom.
14. Compoziţie farmaceutică care cuprinde respectiva EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 13 şi un purtător acceptabil farmaceutic.
15. EV conform oricăreia dintre revendicările 1 la 13 pentru utilizare în prevenirea sau tratarea unei boli la un subiect care are nevoie de aceasta.
MDE20200694T 2018-11-16 2019-05-22 Vezicule extracelulare modificate și utilizări ale acestora MD3672614T2 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2018/061679 WO2019099942A1 (en) 2017-11-17 2018-11-16 Compositions of engineered exosomes and methods of loading luminal exosomes payloads
US201962835430P 2019-04-17 2019-04-17
PCT/US2019/033629 WO2020101740A1 (en) 2018-11-16 2019-05-22 Engineered extracellular vesicles and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3672614T2 true MD3672614T2 (ro) 2022-04-30

Family

ID=70732111

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20200694T MD3672614T2 (ro) 2018-11-16 2019-05-22 Vezicule extracelulare modificate și utilizări ale acestora

Country Status (28)

Country Link
EP (3) EP4059510B1 (ro)
JP (2) JP7538795B2 (ro)
KR (1) KR20210098473A (ro)
CN (2) CN113286603B (ro)
AU (1) AU2019378591A1 (ro)
BR (1) BR112021009231A2 (ro)
CA (1) CA3119720A1 (ro)
CL (1) CL2021001278A1 (ro)
CY (1) CY1124897T1 (ro)
DK (1) DK3672614T3 (ro)
EA (1) EA202191334A1 (ro)
ES (1) ES2907967T3 (ro)
HR (1) HRP20220020T1 (ro)
HU (1) HUE057300T2 (ro)
IL (1) IL283167A (ro)
LT (1) LT3672614T (ro)
MA (1) MA49971B1 (ro)
MD (1) MD3672614T2 (ro)
MX (1) MX2021005636A (ro)
PH (1) PH12021551088A1 (ro)
PL (1) PL3672614T3 (ro)
PT (1) PT3672614T (ro)
RS (1) RS62863B1 (ro)
SG (1) SG11202104956QA (ro)
SI (1) SI3672614T1 (ro)
SM (1) SMT202200156T1 (ro)
TW (2) TWI846697B (ro)
WO (1) WO2020101740A1 (ro)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202111290WA (en) * 2019-04-17 2021-11-29 Codiak Biosciences Inc Compositions of exosomes and aav
EP3994158A1 (en) 2019-07-03 2022-05-11 Codiak BioSciences, Inc. Extracellular vesicles targeting t cells and uses thereof
KR20220070433A (ko) * 2019-08-14 2022-05-31 코디악 바이오사이언시즈, 인크. Stat6을 표적으로 하는 세포외 소포-aso 작제물
CA3147366A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Adam T. BOUTIN Extracellular vesicles with stat3-antisense oligonucleotides
CA3147701A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles with antisense oligonucleotides targeting kras
AU2020330133A1 (en) * 2019-08-14 2022-03-17 Lonza Sales Ag Extracellular vesicle-ASO constructs targeting CEBP/beta
MX2022003570A (es) 2019-09-25 2022-07-11 Codiak Biosciences Inc Composiciones de vesícula extracelular.
KR20220094221A (ko) 2019-09-25 2022-07-05 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 종양의 치료를 위한 il-12 디스플레잉 엑소좀과 조합된 sting 효능제 포함 엑소좀
WO2021062290A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Methods of producing extracellular vesicles
WO2021062057A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Exogenous loading of exosomes via lyophilization
WO2021062058A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Sting agonist comprising exosomes for treating neuroimmunological disorders
KR20210116324A (ko) 2020-03-12 2021-09-27 기초과학연구원 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 세포 사멸 유도 방법
WO2021184020A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Methods of treating neuroinflammation
US20230114434A1 (en) 2020-03-13 2023-04-13 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles for treating neurological disorders
WO2021184021A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting pmp22
JP2023518414A (ja) 2020-03-20 2023-05-01 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 治療のための細胞外小胞
US20230220068A1 (en) 2020-06-05 2023-07-13 Codiak Biosciences, Inc. Anti-transferrin extracellular vesicles
WO2022032140A2 (en) * 2020-08-07 2022-02-10 Amicus Therapeutics, Inc. Vesicle targeting proteins and uses of same
CA3193107A1 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Codiak Biosciences, Inc. Process for preparing extracellular vesicles
WO2022066883A1 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles comprising kras antigens and uses thereof
WO2022066928A2 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Codiak Biosciences, Inc. Process for preparing extracellular vesicles
GB202015399D0 (en) * 2020-09-29 2020-11-11 Evox Therapeutics Ltd Engineered extracellular vesicles displaying enhanced pharmacokinetics
US20230364127A1 (en) 2020-10-06 2023-11-16 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting stat6
CN112410304A (zh) * 2020-11-12 2021-02-26 天津大学 一种基因修饰的外泌体及其制备方法和应用
CN112899307A (zh) * 2021-01-28 2021-06-04 苏州大学 GluN1和/或GluN2亚基羧基末端豆蔻酰化的NMDA受体的应用
JP2024506712A (ja) 2021-02-17 2024-02-14 ロンザ セールス アーゲー 細胞外ベシクルを負荷する方法
CA3207944A1 (en) * 2021-02-17 2022-08-25 Ajay Verma Extracellular vesicle-nlrp3 antagonist
KR20230166101A (ko) 2021-04-01 2023-12-06 론자 세일즈 아게 세포외 소포 조성물
CN114057893B (zh) * 2021-04-26 2022-12-30 苏州大学 一种编码线粒体定位的豆蔻酰化多肽及其制备方法与应用
CN117126886A (zh) * 2022-05-20 2023-11-28 谛邈生物科技(北京)有限公司 一种实现工程化EVs功能蛋白模块化装载的核酸构建体及其应用
KR102788272B1 (ko) * 2022-05-24 2025-04-01 주식회사 시프트바이오 표면-개질된 세포외 소포체 및 이의 치료학적 용도
WO2024215711A1 (en) * 2023-04-10 2024-10-17 Wake Forest University Health Sciences Modified mammalian vesicles and compositions and methods related thereto
CN116769718A (zh) * 2023-04-21 2023-09-19 南京逸微健华生物科技有限公司 一种工程化细胞外囊泡及用途
WO2024226723A1 (en) * 2023-04-26 2024-10-31 Northwestern University Active loading of biomolecular cargo into engineered vesicles
CN118909084A (zh) * 2023-05-08 2024-11-08 天津外泌体科技有限公司 细胞外囊泡支架蛋白及其应用
EP4644537A1 (en) 2024-04-30 2025-11-05 ConvEyXo Targeted extracellular vesicle
WO2025232431A1 (zh) * 2024-05-08 2025-11-13 天津外泌体科技有限公司 筛选影响细胞外囊泡被摄取的基因的系统和方法
WO2026055342A1 (en) 2024-09-04 2026-03-12 Arsenal Biosciences, Inc. Synthetic pathway activators

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP2254586B1 (en) * 2008-02-22 2015-04-08 Agency For Science, Technology And Research (A*star) Mesenchymal stem cell particles
FR2950350B1 (fr) 2009-09-24 2013-12-13 Centre Nat Rech Scient Nouveaux polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leurs utilisations
WO2016004043A1 (en) * 2014-06-30 2016-01-07 Blend Therapeutics, Inc. Targeted conjugates and particles and formulations thereof
WO2016138525A1 (en) * 2015-02-27 2016-09-01 University Of Washington Polypeptide assemblies and methods for the production thereof
WO2016172598A1 (en) * 2015-04-22 2016-10-27 The Broad Institute Inc. Exosomes and uses thereof
EP3397264A4 (en) * 2015-12-30 2019-06-05 The Regents of The University of California METHOD FOR IMPROVED PREPARATION AND INSULATION OF CELL-DERIVED VESICLES
US10617768B2 (en) * 2016-07-12 2020-04-14 Santa Clara University Engineered exosomes for the delivery of bioactive cargo using transmembrane tetraspanins
US20210290556A1 (en) * 2016-08-22 2021-09-23 Codiak Biosciences, Inc. Methods of suppressing delivery of exosomes to liver and spleen
US20200025685A1 (en) * 2016-12-15 2020-01-23 Codiak Biosciences, Inc. Methods of measuring exosomes using intrinsic fluorescence
IL272786B2 (en) 2017-08-25 2025-03-01 Codiak Biosciences Inc Preparation of therapeutic exosomes using membrane proteins
WO2019099942A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 Codiak Biosciences, Inc. Compositions of engineered exosomes and methods of loading luminal exosomes payloads
EP3841112A1 (en) * 2018-08-24 2021-06-30 Codiak BioSciences, Inc. Extracellular vesicles targeting dendritic cells and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022513049A (ja) 2022-02-07
AU2019378591A1 (en) 2021-06-17
TW202438105A (zh) 2024-10-01
EP4628099A2 (en) 2025-10-08
TW202038993A (zh) 2020-11-01
WO2020101740A1 (en) 2020-05-22
WO2020101740A9 (en) 2021-06-10
EA202191334A1 (ru) 2022-02-10
HRP20220020T1 (hr) 2022-04-01
EP4628099A3 (en) 2025-11-19
MA49971A (fr) 2020-07-01
PH12021551088A1 (en) 2022-01-03
SMT202200156T1 (it) 2022-05-12
SG11202104956QA (en) 2021-06-29
EP4059510B1 (en) 2025-05-21
EP4059510A1 (en) 2022-09-21
ES2907967T3 (es) 2022-04-27
DK3672614T3 (da) 2022-01-10
CY1124897T1 (el) 2023-01-05
MA49971B1 (fr) 2022-01-31
IL283167A (en) 2021-06-30
EP3672614A1 (en) 2020-07-01
EP3672614B1 (en) 2021-10-06
PT3672614T (pt) 2022-02-11
RS62863B1 (sr) 2022-02-28
CN113286603A (zh) 2021-08-20
CN113286603B (zh) 2025-07-22
JP7538795B2 (ja) 2024-08-22
SI3672614T1 (sl) 2022-04-29
EP4059510C0 (en) 2025-05-21
CN121102502A (zh) 2025-12-12
CA3119720A1 (en) 2020-05-22
CL2021001278A1 (es) 2022-03-11
JP2024097929A (ja) 2024-07-19
LT3672614T (lt) 2022-04-11
BR112021009231A2 (pt) 2021-08-10
KR20210098473A (ko) 2021-08-10
MX2021005636A (es) 2021-07-06
TWI846697B (zh) 2024-07-01
HUE057300T2 (hu) 2022-05-28
PL3672614T3 (pl) 2022-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3672614B1 (en) Engineered extracellular vesicles and uses thereof
AU2023201482B2 (en) Cytokine conjugates for the treatment of autoimmune diseases
TW202100164A (zh) 用於疫苗遞送之細胞外囊泡
US20230270674A1 (en) Targeted delivery of extracellular vesicles
US20230181758A1 (en) Extracellular vesicles targeting dendritic cells and uses thereof
US20220251200A1 (en) Extracellular vesicles targeting t cells and uses thereof
KR20210039983A (ko) 게놈 편집을 위한 방법 및 조성물
KR20210038841A (ko) 게놈 편집을 위한 방법 및 조성물
US20220017907A1 (en) Engineered extracellular vesicles and uses thereof
US20250249072A1 (en) Methods of treating cancer
HK40032716B (en) Engineered extracellular vesicles and uses thereof
HK40032716A (en) Engineered extracellular vesicles and uses thereof
US20220218811A1 (en) Methods of treating tuberculosis
WO2021003425A1 (en) Methods of inducing hematopoiesis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent for invention definitely lapsed due to non-payment of fees