RS62863B1 - Konstruisane vanćelijske vezikule i njihove upotrebe - Google Patents

Konstruisane vanćelijske vezikule i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS62863B1
RS62863B1 RS20220009A RSP20220009A RS62863B1 RS 62863 B1 RS62863 B1 RS 62863B1 RS 20220009 A RS20220009 A RS 20220009A RS P20220009 A RSP20220009 A RS P20220009A RS 62863 B1 RS62863 B1 RS 62863B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
protein
exosome
seq
sequence
amino acid
Prior art date
Application number
RS20220009A
Other languages
English (en)
Inventor
Kevin P Dooley
Rane A Harrison
Ke Xu
Damian J Houde
Sonya Haupt
John D Kulman
Douglas E Williams
Russell E Mcconnell
Madeleine Youniss
Original Assignee
Codiak Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=70732111&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62863(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/US2018/061679 external-priority patent/WO2019099942A1/en
Application filed by Codiak Biosciences Inc filed Critical Codiak Biosciences Inc
Publication of RS62863B1 publication Critical patent/RS62863B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE
[0001] Ovo otkriće obezbeđuje ekstracelularne vezikule, npr., egzozome, obogaćene skeletnim proteinom koji je povezan sa luminalnom površinom vanćelijskih vezikula koja može biti korisna kao sredstvo za profilaksu ili lečenje kancera i drugih bolesti.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Egzozomi su važni posrednici međućelijske komunikacije. Oni su takođe važni biomarkeri u dijagnozi i prognozi mnogih bolesti, kao što je kancer. Kao sredstva za isporuku lekova, egzozomi nude mnoge prednosti u odnosu na tradicionalne postupke isporuke lekova kao novi modalitet lečenja u mnogim terapijskim oblastima.
[0003] Centralna karakteristika egzozoma je njihova sposobnost da obuhvate biološki aktivnu korisnu nosivost unutar svog unutrašnjeg prostora, ili lumena. Dobro je poznato da egzozomi obuhvataju endogenu korisnu nosivost uključujući mRNK, miRNK, DNK, proteine, ugljene hidrate i lipide, ali je sposobnost usmeravanja specifičnog opterećenja željene terapeutske korsne nosivosti trenutno ograničena. Egzozomi mogu biti opterećeni prekomernom ekspresijom željene terapeutske korisne nosivosti u ćeliji proizvođaču, ali ovo opterećenje je često ograničene efikasnosti zbog stohastičke lokalizacije korisne nosivosti u ćelijskim centrima za obradu egzozoma. Alternativno, prečišćeni egzozomi mogu biti opterećeni ex vivo, na primer, elektroporacijom. Ove postupci mogu imati nisku efikasnost ili biti ograničeni na malu korisnu nosivost, kao što su siRNKs. Zbog toga su potrebne odgovarajući postupci za generisanje visoko efikasnih i dobro definisanih opterećenih egzozoma da bi se bolje omogućila terapeutska upotreba i druge primene tehnologija zasnovanih na egzozomima.
[0004] US 2018/0015182 A1 opisuje konstruisane egzozome za isporuku bioaktivnog tereta korišćenjem transmembranskih tetraspanina. WO 2018/112154 A1 se odnosi na postupke merenja egzozoma korišćenjem intrinzične fluorescencije. WO 2018/039119 A1 otkriva postupke supresije isporuke egzozoma u jetru i slezinu. György et al. (Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 439-464) razmatra terapeutske primene ekstracelularnih vezikula. Garcia-Manrique et al. (J Extracell Vesicles. 2018; 7(1): 1422676) prikazuje terapeutske biomaterijale zasnovane na ekstracelularnim vezikulama. Li et al. (PLoS One. 2016; 11(9): e0163043) opisuje identifikaciju i karakterizaciju egzozoma izvedenih iz 293T ćelija. WO 2016/138525 A1 se odnosi na polipeptidne sklopove i postupke za njihovu proizvodnju. Ryo Tamura, "A thesis submitted to the Faculty of the Graduate School of the University of Colorado in partial fulfillment of the requirement for the degree of Doctor of Philosophy Department of Chemistry and Biochemistry", 2017, je studija o efektorskom domenu MARCKS proteina kao peptidu koji prodire u ćeliju i razvoju fotoaktivirajućih prolekova doksazolidina.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0005] Pronalazak obezbeđuje izolovanu venćelijsku vezikulu (EV) koja sadrži biološki aktivan molekul vezan za skeletni protein, pri čemu skeletni protein sadrži domen na N-kraju (ND) i efektorski domen (ED), pri čemu je ND povezan sa luminalnim površina EV i ED je povezana sa luminalnom površinom EV, pri čemu ND sadrži sekvencu aminokiselina GGKLSK (SEQ ID BR: 203), ali ne sadrži metionin (Met) na N-terminusu, pri čemu ED sadrži lizin (Lys) na svom N kraju koji je direktno vezan za lizin na C-kraju SEQ ID BR: 203 u ND; i pri čemu je biološki aktivni molekul sadržao jedan ili više heterolognih proteina spojenih na C-kraju skeletnog proteina. Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži EV prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. Pronalazak takođe obezbeđuje EV prema pronalasku za upotrebu u prevenciji ili lečenju bolesti kod subjekta kome je to potrebno. Dalji primeri izvođenja prema pronalasku su definisani u priloženim patentnim zahtevima.
[0006] Aspekt ovog otkrića se odnosi na nove postupke opterećenja vanćelijskih vezikula (EVs), npr., egzozoma za terapeutsku upotrebu. Konkretno, postupci koriste proteinske markere koji su nedavno identifikovani sa luminalne površine egzozoma. Posebno, identifikovano je da je grupa proteina (npr. miristoilovani supstrat protein kinaze C bogat alaninom (MARCKS); miristoilovani supstrat protein kinaze C sličan 1bogat alaninom (MARCKSL1); i protein rastvorljiv u moždanoj kiselini 1 (BASP1)) veoma obogaćen na luminalnoj površini egzozoma. Štaviše, pokazalo se da je kratka sekvenca amino kraja BASP1, na primer, najmanje sedam aminokiselina, dovoljna da usmeri visoko efikasno opterećenje fluorescentnih proteinskih molekula u istoj meri kao i BASP1 protein pune dužine. Ovaj fragment, koji ima najmanje sedam aminokiselina i manje od deset aminokiselina, predstavlja značajan napredak u oblasti konstruisanog opterećenja EV i omogućava efikasno, ponovljivo opterećenje bilo kog biološki aktivnog molekula, npr. korisne nosivosti terapeutskog proteina u lumen EVs, npr. egzozoma, bez dodatnih koraka ex vivo manipulacije. Opterećenje EVs, na primer, egzozoma, korišćenjem fuzionih proteina opisanih ovde, proizvodi konstruisane EVs, na primer, konstruisane egzozome, sa značajno višim nivoima korisne nosivosti u poređenju sa bilo kojim drugim postupkom genetičkog inženjeringa opisanog do sada.
[0007] Proteini i peptidne sekvence koje su nedavno identifikovane iz egzozoma se koriste u različitim primerima izvođenja prema ovom otkriću. Na primer, neki primeri izvođenja se odnose na stvaranje fuzionog proteina konjugacijom EV, npr., proteina egzozoma ili fragmenta proteina (tj. skeletnog proteina) i biološki aktivnog molekula (npr. terapeutski relevantnog proteina) i proizvodnje EV, npr. egzozom, koji obuhvata fuzioni protein na luminalnoj površini EV. Nativni protein pune dužine ili biološki aktivni fragment biološki aktivnog molekula (npr. terapeutski relevantan protein) može da se transportuje do luminalne površine EVs, na primer, egzozoma, tako što se konjuguje sa proteinima ili fragmentima proteina obogaćenim egzozomima.
[0008] Ovo otkriće se dalje odnosi na stvaranje ili upotrebu lumenski konstruisanih EVs, npr. lumenski konstruisanih egzozoma, dizajniranih za efikasnije opterećenje, ili za opterećenje biološki aktivnog molekula (npr. terapeutski relevantnog proteina) u lumen EV, na primer, egzozoma. Na primer, luminalna površina EV može biti modifikovana tako da obuhvati višu koncentraciju nativne EV pune dužine, npr. proteina egzozoma i/ili fragmenta ili modifikovanog proteina nativne EV, npr. proteina egzozoma na luminalnoj površini.
[0009] Neki primeri izvođenja prema ovom otkriću se odnose na ćeliju proizvođača ili na postupak generisanja ćelije proizvođača za proizvodnju takvih lumenski konstruisanih EVs. Egzogeni polinukleotid se može privremeno ili stabilno uvesti u ćeliju proizvođaču da bi se stvorio lumenski konstruisana EV, npr., egzozom lumenski konstruisan iz ćelije proizvođača.
[0010] Shodno tome, u jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje EV, npr., egzozom, koji sadrži skeletni protein, pri čemu je najmanje deo skeletnog proteina eksprimiran iz egzogene sekvence, a skeletni protein sardži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili fragment, varijantu, derivat ili njegova modifikacija.
[0011] U nekim aspektima, skeletni protein je prisutan u EV, na primer, egzozom, sa višom gustinom od različitog skeletnog proteina u drugom EV, na primer, egzozom, pri čemu različit skeletni protein sadrži konvencionalni EV, npr. protein egzozoma ili njegove varijante. U nekim primerima izvođenja, konvencionalni EV, npr., protein egzozoma je odabran iz grupe koja se sastoji od CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI usidreni proteini, laktadherin, LAMP2, LAMP2B i njihov fragment.
[0012] U nekim primerima izvođenja, EV, npr., egzozom, se proizvodi iz ćelije genetički modifikovane da sadrži egzogenu sekvencu, izborno pri čemu je ćelija HEK293 ćelija.
[0013] U nekim primerima izvođenja, ćelija je sadržala plazmid koji sadrži egzogenu sekvencu.
[0014] U nekim primerima izvođenja, egzogena sekvenca je umetnuta u genomsko mesto koje se nalazi 3 'ili 5' u odnosu na genomsku sekvencu koja kodira MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1. U nekim primerima izvođenja, egzogena sekvenca je umetnuta u genomsku sekvencu koja kodira MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1.
[0015] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein je fuzioni protein koji sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1, ili njihov fragment, i terapeutski peptid.
[0016] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul sadrži terapeutski peptid odabran iz grupe koja se sastoji od prirodnog peptida, rekombinantnog peptida, sintetičkog peptida ili linkera za terapeutsko jedinjenje. U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul (npr., terapeutsko jedinjenje) je odabran iz grupe koja se sastoji od nukleotida, aminokiselina, lipida, ugljenih hidrata i malih molekula. U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul (npr. terapeutski peptid) je antitelo ili fragment ili njihova modifikacija. U nekim primerima izvođenja, terapeutski peptid je enzim, ligand, receptor, faktor transkripcije, ili njegov fragment ili njegova modifikacija. U nekim primerima izvođenja, terapeutski peptid je antimikrobni peptid ili njegov fragment ili njegova modifikacija.
[0017] U nekim primerima izvođenja, EV, npr., egzozom, koji dalje sadrži drugi skeletni protein, pri čemu drugi skeletni protein sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili njihov fragment. U nekim primerima izvođenja, EV, npr., egzozom, dalje sadrži drugi skeletni protein, pri čemu drugi skeletni protein sadrži PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP transporter ili njegov fragment.
[0018] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein je sadrži peptidnu sekvencu koja odgovara obrascu (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 118) ili pomenuti obrazac bez N-kraja (M). U nekim primerima izvođenja, skeletni protein se sastojao od peptida (M)(O(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), ili peptida bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser), X je bilo koja aminokiselina, Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu). U nekim primerima izvođenja, skeletni protein je sadržao peptid sekvence (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), ili peptid bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) , ξ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu). Videti R. Aasland et al., FEBS Letters 513 (2002): 141-144 za nomenklaturu aminokiselina.
[0019] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein sadrži peptid bilo kog od SEQ ID BR-jevi: 4-110. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein sadrži peptid MGXKLSKKK (SEQ ID BR: 116), ili peptid bez N-kraja M, pri čemu je X bilo koja aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein sadrži peptid SEQ ID BR: 110, ili odgovarajući peptid bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein sadrži peptid SEQ ID BR: 13, ili odgovarajući peptid bez N-kraja (M).
[0020] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein dalje sadrži korisnu nosivost, npr. peptid.
[0021] U drugom primeru izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži EV prema ovom pronalasku, npr., egzozom i ekscipijent.
[0022] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je u suštini bez makromolekula, pri čemu su makromolekuli odabrani od nukleinskih kiselina, egzogenih proteina, lipida, ugljenih hidrata, metabolita i njihove kombinacije
[0023] U još jednom primeru izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje populaciju ćelija za proizvodnju EV, npr., egzozoma, koji je obezbeđen ovde.
[0024] U nekim primerima izvođenja, populacija ćelija sadrži egzogenu sekvencu koja kodira skeletni protein koji sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili njihov fragment ili njegovu modifikaciju. U nekim primerima izvođenja, populacija ćelija dalje sadrži drugu egzogenu sekvencu koja kodira drugi skeletni protein, pri čemu je drugi skeletni protein sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili njihov fragment ili njegovu modifikaciju. U nekim primerima izvođenja, populacija ćelija dalje sadrži drugu egzogenu sekvencu koja kodira drugi skeletni protein, pri čemu drugi skeletni protein sadrži PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP transporter ili njegov fragment.
[0025] U nekim primerima izvođenja, egzogena sekvenca je umetnuta u genomsku sekvencu koja kodira MARCKS, MARCKSL1ili BASP1, pri čemu egzogena sekvenca i genomska sekvenca kodiraju skeletni protein. U nekim primerima izvođenja, egzogena sekvenca je u plazmidu.
[0026] U nekim primerima izvođenja, egzogena sekvenca kodira biološki aktivan molekul (npr. terapeutski peptid). U nekim primerima izvođenja, terapeutski peptid je odabran iz grupe koja se sastoji od prirodnog peptida, rekombinantnog peptida, sintetičkog peptida ili linkera za terapeutsko jedinjenje. U nekim primerima izvođenja, terapeutsko jedinjenje je odabrano iz grupe koja se sastoji od nukleotida, aminokiselina, lipida, ugljenih hidrata i malih molekula. U nekim primerima izvođenja, terapeutski peptid je antitelo ili njegov fragment ili njihova modifikacija. U posebnom primeru izvođenja, antitelo je nanotelo. Običan stručnjak u tehnici bi razumeo da antitelo koje se koristi u EV prema ovom otkriću može biti bilo koji molekul koji se vezuje za antigen poznat u tehnici, uključujući, na primer, alternativne formate antitela, antigen-lek konjugate (ADC) ili imunotoksine .
[0027] U nekim primerima izvođenja, terapeutski peptid je enzim, ligand, receptor, faktor transkripcije, ili njegov fragment ili njegova modifikacija. U nekim primerima izvođenja, terapeutski peptid je antimikrobni peptid ili njegov fragment ili njegova modifikacija.
[0028] U nekim primerima izvođenja, egzogena sekvenca kodira deo sa ciljanim delovanjem. U nekim primerima izvođenja, deo sa ciljanim delovanjem je specifičan za organ, tkivo ili ćeliju.
[0029] U nekim primerima izvođenja, drugi skeletni protein dalje sadrži deo sa ciljanim delovanjem. U nekim primerima izvođenja, deo sa ciljanim delovanjem je specifičan za organ, tkivo ili ćeliju.
[0030] U jednom primeru izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje polipeptid za modifikaciju EV, npr. egzozoma, koji sadrži sekvencu
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 118), ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja (M);
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), ili odgovarajuća sekvenca bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) , X je bilo koja aminokiselina, Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu); ili
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), ili odgovarajuća sekvenca bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) , ξ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu).
[0031] U nekim primerima izvođenja, skeletni polipeptid sadrži sekvencu bilo koje od SEQ ID BR: 4-110, ili bilo koju od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID BR: 13, ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID BR: 110, ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži sekvencu MGXKLSKKK (SEQ ID BR: 116), pri čemu je X bilo koja aminokiselina, ili odgovarajuća sekvenca bez N- kraja M.
[0032] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje polinukleotidni konstrukt koji sadrži kodirajuću sekvencu koja kodira polipeptid koji je obezbeđen ovde. U nekim primerima izvođenja, kodirajuća sekvenca je optimizovana kodonom.
[0033] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupak pravljenja konstruisane EV, na primer, egzozoma, koji sadrži korake:
a. uvođenje u ćeliju konstrukta nukleinske kiseline koji kodira fuzioni polipeptid koji sadrži
(i) prvu sekvencu koja kodira MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili njegov fragment ili njegovu modifikaciju, i
(ii) drugu sekvencu koja kodira korisnu nosivost npr. biološki aktivni molekul kao što je terapeutski peptid;
b. održavanje ćelije u uslovima koji omogućavaju ćeliji da eksprimira fuzioni polipeptid; i,
c. dobijanje konstruisanog egzozoma koji sadrži fuzioni polipeptid iz pomenute ćelije.
[0034] U nekim primerima izvođenja, prva sekvenca sadrži sekvencu od
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 118), ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja (M);
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), ili odgovarajuća sekvenca bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) , X je bilo koja aminokiselina, Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu); ili
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), ili odgovarajuća sekvenca bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) , ξ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu).
[0035] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid sadrži sekvencu bilo koje od SEQ ID BR: 4-110, ili bilo koju od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid sadrži sekvencu SEQ ID BR: 13, ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid sadrži sekvencu SEQ ID BR: 110, ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid sadrži sekvencu MGXKLSKKK (SEQ ID BR: 116), ili odgovarajuću sekvencu bez N- kraja M, pri čemu je X bilo koja aminokiselina,
[0036] U nekim primerima izvođenja, fuzioni polipeptid je prisutan na luminalnoj površini konstruisanih EV, npr., konstruisanog egzozoma, sa višom gustinom od različitog skeletnog proteina u drugoj EV, na primer, egzozomu, pri čemu različit skeletni protein sadrži konvencionalnu EV, npr. protein egzozoma ili njegova varijanta. U nekim primerima izvođenja, fuzioni polipeptid je prisutan sa više od 2 puta većom gustinom od različitog skeletnog proteina u različitim EV, npr., egzozomu.
[0037] U nekim primerima izvođenja, fuzioni polipeptid je prisutan sa više od 4 puta, 16 puta, 100 puta ili 10,000 puta većom gustinom od različitog skeletnog proteina u različitim EV, npr., egzozomu.
[0038] Ovo otkriće je usmereno na izolovanu vanćelijsku vezikulu (EV) koja sadrži biološki aktivan molekul povezan sa skeletnim proteinom, pri čemu skeletni protein sadrži N-kraj domena (ND) i efektorski domen (ED), pri čemu su ND i ED povezane sa luminalnom površinom EV jonskom interakcijom, pri čemu je ED sadrži najmanje dva susedna lizina (Lys) u sekvenci. U nekim primerima izvođenja, ND je povezan sa luminalnom površinom EV preko miristoilacije. U drugim primerima izvođenja, ND ima Gly na N-kraju.
[0039] U nekim primerima izvođenja, ED sadrži najmanje tri Lys, najmanje četiri Lys, najmanje pet Lys, najmanje šest Lys, ili najmanje sedam Lys. U drugim primerima izvođenja, ED je povezan za ND peptidnom vezom. U nekim primerima izvođenja, ED sadrži (Lys)n, pri čemu je n ceo broj između 1 i 10. U drugim primerima izvođenja, ED sadrži KK, KKK, KKKK (SEQ ID BR: 151), KKKKK (SEQ ID BR: 152),, ili bilo koja njihova kombinacija.
[0040] U drugim primerima izvođenja, ND sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u G: X2: X3: X4: X5: X6, pri čemu je G glicin predstavljen kao Gly; pri čemu ":" predstavlja peptidnu vezu, pri čemu je svaki od X2 do X6 nezavisno aminokiselina; i pri čemu X6 sadrži baznu aminokiselinu. U nekim primerima izvođenja, X6 je odabran iz grupe koja se sastoji od Lys, Arg i His.
[0041] U drugim primerima izvođenja, otkriće je izolovana vanćelijska vezikula (EV) koja sadrži biološki aktivan molekul povezan sa skeletnim proteinom, pri čemu skeletni protein sadrži N-kraj domena (ND) i efektorski domen (ED), pri čemu su ND sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u G: X2: X3: X4: X5: X6, pri čemu je G glicin predstavljen kao Gly; pri čemu ":" predstavlja peptidnu vezu, pri čemu je svaki od X2 do X6 nezavisno aminokiselina; pri čemu X6 sadrži baznu aminokiselinu, i pri čemu je ED vezan za X6 peptidnom vezom i sadrži najmanje jedan lizin na N-kraju ED. U nekim primerima izvođenja, ED ne sadrži transmembranski domen ili citoplazmatski domen virusa. U nekim primerima izvođenja, X2 je odabran iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala i Ser. U drugim primerima izvođenja, X4 je odabran iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln i Met. U nekim primerima izvođenja, X5 je odabran iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala i Ser.
[0042] U nekim primerima izvođenja, ND skeletnog proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu G: X2: X3: X4: X5: X6, pri čemu:
G predstavlja Gly;
":" predstavlja peptidnu vezu;
X2 je aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, i Ser;
X3 je aminokiselina;
X4 je aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln, i Met;
X5 je aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, i Ser; i X6 je aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Lys, Arg, i His.
1
[0043] U nekim primerima izvođenja, X3 je odabrana iz grupe koja se sastoji od Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, i Arg.
[0044] U nekim primerima izvođenja, ND i ED su spojeni linkerom. U nekim primerima izvođenja, linker sadrži jednu ili više aminokiselina.
[0045] U nekim primerima izvođenja, otkriće je usmereno na izolovanu vanćelijsku vezikulu (EV) koja sadrži biološki aktivan molekul povezan sa skeletnim proteinom, pri čemu skeletni protein sadrži ND-ED, pri čemu:
ND sadrži G: X2:X3:X4:X5:X6; pri čemu:
G predstavlja Gly;
":" predstavlja peptidnu vezu;
X2 je aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, i Ser;
X3 je aminokiselina;
X4 je aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Glu, i Met;
X5 je aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, i Ser;
X6 je aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Lys, Arg, i His;
"-" je izborni linker koji sadrži jednu ili više aminokiselina; i
ED je efektorski domen koji sadrži (i) najmanje dva susedna lizina (Lys), koji je povezan sa X6 peptidnom vezom ili jednom ili više aminokiselina ili (ii) najmanje jednim lizinom, koji je direktno vezan za X6 peptidnom vezom.
[0046] U drugim primerima izvođenja, X2 je odabran iz grupe koja se sastoji od Gly i Ala. U nekim primerima izvođenja, X3 je Lys. U nekim primerima izvođenja, X4 je Leu ili Glu. U nekim primerima izvođenja, X5 je odabran iz grupe koja se sastoji od Ser i Ala. U nekim primerima izvođenja, X6 je Lys. U drugim primerima izvođenja, X2 je Gly, Ala ili Ser; X3 je Lys ili Glu, X4 je Leu, Phe, Ser i Glu, X5 je Ser ili Ala; a X6 je Lys.
[0047] U nekim primerima izvođenja, ND i ED su povezani linkerom koji sadrži jednu ili više aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, ED sadrži Lys (K), KK, KKK, KKKK (SEQ ID BR: 151), KKKKK (SEQ ID BR: 152) ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0048] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od (i) GGKLSKK (SEQ ID BR: 157), (ii) GAKLSKK (SEQ ID BR: 158), (iii) GGKQSKK (SEQ ID BR: 159), (iv) GGKLAKK (SEQ ID BR: 160), ili (v) bilo koja njihova kombinacija. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od (i) GGKLSKKK (SEQ ID BR: 161), (ii) GGKLSKKS (SEQ ID BR: 162), (iii) GAKLSKKK (SEQ ID BR: 163), (iv) GAKLSKKS (SEQ ID BR: 164), (v) GGKQSKKK (SEQ ID BR: 165), (vi) GGKQSKKS (SEQ ID BR: 166), (vii) GGKLAKKK (SEQ ID BR: 167), (viii) GGKLAKKS (SEQ ID BR: 168), i (ix) bilo koja njihova kombinacija. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein je najmanje oko 8, najmanje oko 9, najmanje oko 10, najmanje oko 11, najmanje oko 12, najmanje oko 13, najmanje oko 14, najmanje oko 15, najmanje oko 16, najmanje oko 17, najmanje oko 18, najmanje oko 19, najmanje oko 20, najmanje oko 21, najmanje oko 22, najmanje oko 23, najmanje oko 24, najmanje oko 25, najmanje oko 30, najmanje oko 35, najmanje oko 40, najmanje oko 45, najmanje oko 50, najmanje oko 55, najmanje oko 60, najmanje oko 65, najmanje oko 70, najmanje oko 75, najmanje oko 80, najmanje oko 85, najmanje oko 90, najmanje oko 95, najmanje oko 100, najmanje oko 105, najmanje oko 110, najmanje oko 120, najmanje oko 130, najmanje oko 140, najmanje oko 150, najmanje oko 160, najmanje oko 170, najmanje oko 180, najmanje oko 190, ili najmanje oko 200 aminokiselina u dužini.
[0049] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein sadrži (i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID BR: 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID BR: 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID BR: 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID BR: 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID BR: 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID BR: 178), ili (xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID BR: 179).
[0050] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein ne sadrži Met na N-kraju. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein sadrži miristoilovani aminokiselinski ostatak na N-kraju skeletnog proteina. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinski ostatak na N-kraju skeletnog proteina je Gly. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinski ostatak na N-kraju skeletnog proteina je sintetički. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinski ostatak na N-kraju skeletnog proteina je analog glicina.
[0051] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, na najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID BR: 1 (MARKS), SEQ ID BR: 2 (MARCKSL1) ili SEQ ID BR: 3 (BASP1).
[0052] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je na luminalnoj površini ili lumenu EV. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein dalje sadrži transmembranski domen. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je između ED domena skeletnog proteina i biološki aktivnog molekula. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein dalje sadrži ekstravezikularni domen. U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je vezan za ekstravezikularni domen.
[0053] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein je povezan sa biološki aktivnim molekulom pomoću linkera. U nekim primerima izvođenja, ND domen je povezan sa ED domenom pomoću linkera. U nekim primerima izvođenja, linker sadrži jednu ili više aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, linker sadrži linker koji se može cepati. U nekim primerima izvođenja, linker sadrži fleksibilni linker.
[0054] U drugim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul sadrži protein, polipeptid, peptid, polinukleotid (DNK i/ili RNK), hemijsko jedinjenje, virus, jonofor, nosač za jonofor, deo koji formira kanal ili pora, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, protein sadrži rekombinantni peptid, prirodni peptid, sintetički peptid, antitelo, fuzioni protein ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, protein sadrži enzim, citokin, ligand, receptor, faktor transkripcije ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, virus sadrži adeno-povezani virus, parvovirus, retrovirus, adenovirus ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0055] U drugim primerima izvođenja, EV dalje sadrži drugi skeletni protein. U nekim primerima izvođenja, drugi skeletni protein sadrži PTGFRN polipeptid, BSG polipeptid, IGSF2 polipeptid, IGSF3 polipeptid, IGSF8 polipeptid, ITGB1 polipeptid, ITGA4 polipeptid, SLC3A2 polipeptid, ATP transportni polipeptid, polipeptid amino peptidaze N (ANPEP), polipeptid člana 1 familije ektonukleotida pirofosfataze/fosfodiesteraze (ENPP1), polipeptid neprilizina (MME), polipeptid neuropilin-1 (NRP1) ili njihov fragment. U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je inhibitor za regulator negativne kontrolne tačke ili inhibitor za vezujućeg partnera regulatora negativne kontrolne tačke. U nekim primerima izvođenja, regulator negativne kontrolne tačke se odabran iz grupe koja se sastoji od: citotoksični T-limfocit-povezani protein 4 (CTLA-4), protein 1 programirane ćelijske smrti (PD-1), gen 3 aktiviran limfocitima (LAG-3 ), protein 3 koji obuhvata T-ćelijski imunoglobulin mucin (TIM-3), atenuator B i T limfocita (BTLA), T ćelijski imunoreceptor sa Ig i ITIM domenima (TIGIT), V-domen Ig supresora aktivacije T ćelija (VISTA), adenozin A2a receptor (A2aR), imunoglobulinu sličan receptor ćelija ubica (KIR), indoleamin 2,3-dioksigenaza (IDO), CD20, CD39 i CD73. U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je imunogeni protein.
[0056] U drugim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je toksin, toksoid ili netoksični mutant toksina. U nekim primerima izvođenja, toksin je toksin difterije. U nekim
1
primerima izvođenja, toksoid je toksoid tetanusa. U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je netoksičan mutant toksina difterije.
[0057] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je aktivator za pozitivan kostimulativni molekul ili aktivator za vezujućeg partnera pozitivnog ko-stimulativnog molekula. U nekim primerima izvođenja, pozitivni ko-stimulativni molekul je član superfamilije TNF receptora. U nekim primerima izvođenja, član superfamilije TNF receptora je odabran iz grupe koja se sastoji od: CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas receptora, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK receptora, TACI, BAFF receptora, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, i XEDAR. U nekim primerima izvođenja, aktivator za pozitivan ko-stimulativni molekul je član superfamilije TNF. U nekim primerima izvođenja, član TNF superfamilije je odabran iz grupe koja se sastoji od: TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB ligand, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR ligand, i EDA-2. U nekim primerima izvođenja, pozitivni ko-stimulativni molekul je ko-stimulativni molekul CD28 superfamilije. U nekim primerima izvođenja, ko-stimulativni molekul CD28-superfamilije je ICOS ili CD28. U nekim primerima izvođenja, aktivator za pozitivan ko-stimulativni molekul je ICOSL, CD80 ili CD86.
[0058] U drugim primerima izvođenja, citokin je odabran iz grupe koja se sastoji od: IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 i IL-15. U nekim primerima izvođenja, protein sadrži T-ćelijski receptor (TCR), T-ćelijski ko-receptor, glavni histokompatibilni kompleks (MHC), humani leukocitni antigen (HLA) ili njihov derivat. U nekim primerima izvođenja, protein sadrži tumorski antigen. U nekim primerima izvođenja, tumorski antigen je odabran iz grupe koja se sastoji od: alfa-fetoprotein (AFP), karcinoembrionalni antigen (CEA), epitelni tumorski antigen (ETA), mucin 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucin 16 (MUC16) , tirozinaza, antigen povezan sa melanomom (MAGE), tumorski protein p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligand 1 programirane smrti (PD-L1), ligand 2 programirane smrti (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, mezotelin, VEGFR, alfa-folatni receptor, CE7R, IL-3, antigen kancera testisa, MART-1 gp100 i TNF-povezan sa apoptozom-indukujući ligand.
[0059] U drugim primerima izvođenja, EV je egzozom.
[0060] U nekim primerima izvođenja, otkriće je usmereno na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži EV prema ovom otkriću i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, otkriće je usmereno na ćeliju koja proizvodi EV prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, otkriće je usmereno na komplet koji sadrži EV prema ovom otkriću i uputstva za upotrebu.
[0061] U drugim primerima izvođenja, otkriće je usmereno na postupak pravljenja EVs koji se sastoji od kultivisanja ćelije prema ovom pronalasku pod pogodnim uslovima i dobijanja EVs. U nekim primerima izvođenja, otkriće je usmereno na postupak usidravanja biološki aktivnog molekula za vanćelijsku vezikulu koji sadrži povezivanje biološki aktivnog molekula sa skeletnim proteinom koji je ovde otkriven.
[0062] U drugim primerima izvođenja, otkriće je usmereno na postupak prevencije ili lečenja bolesti kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu EV prema ovom otkriću, pri čemu je bolest povezana sa antigenom. U nekim primerima izvođenja, EV se primenjuje parenteralno, oralno, intravenozno, intramuskularno, intratumoralno, intranazalno, subkutano ili intraperitonealno.
PRIMERI IZVOĐENJA
[0063]
E1. EV, npr., egzozom, koji sadrži skeletni protein, pri čemu je najmanje deo skeletnog proteina eksprimiran iz egzogene sekvence, a skeletni protein sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili njihov fragment ili njegovu modifikaciju.
E2. EV, npr. egzozom, primera izvođenja E1, pri čemu je skeletni protein prisutan u EV, npr. egzozom, sa višom gustinom od različitog skeletnog proteina u drugom EV, npr. egzozoma, pri čemu različit skeletni protein sadrži konvencionalni EV, npr. egzozom, protein ili njegovu varijantu.
E3. EV, npr. egzozom, primera izvođenja E2, pri čemu je konvencionalni EV, npr. egzozom, protein odabran iz grupe koja se sastoji od CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI usidreni proteini, laktadherin, LAMP2, LAMP2B i njihov fragment.
E4. EV, npr., egzozom, bilo kog od primera izvođenja E1 do E3, pri čemu je EV, npr., egzozom, proizveden iz genetički modifikovane ćelije da sadrži egzogenu sekvencu, izborno pri čemu, ćelija je HEK293 ćelija.
E5. EV, npr., egzozom, primera izvođenja E1 do E4, pri čemu ćelija sadrži plazmid koji sadrži egzogenu sekvencu.
E6. EV, npr., egzozom, primera izvođenja E1 do E5, pri čemu ćelija sadrži egzogenu sekvencu ubačenu u genom ćelije.
1
E7. EV, npr., egzozom, primera izvođenja E1 do E6, pri čemu je egzogena sekvenca umetnuta u genomsko mesto koje se nalazi 3' ili 5' u odnosu na genomsku sekvencu koja kodira MARCKS, MARCKSL1, ili BASP1.
E8. EV, npr., egzozom, primera izvođenja E1 do E7, pri čemu je egzogena sekvenca umetnuta u genomsku sekvencu koja kodira MARCKS, MARCKSL1, ili BASP1. E9. EV, npr., egzozom, bilo kog od primera izvođenja E1 do E8, pri čemu je skeletni protein fuzioni protein koji sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili njihov fragment i terapeutski peptid.
E10. EV, npr., egzozom, primera izvođenja E9, pri čemu je terapeutski peptid odabran iz grupe koja se sastoji od prirodnog peptida, rekombinantnog peptida, sintetičkog peptida ili linkera za terapeutsko jedinjenje.
E11. EV, npr. egzozom, primera izvođenja E9, pri čemu je terapeutsko jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od nukleotida, aminokiselina, lipida, ugljenih hidrata i malih molekula..
E12. EV, npr., egzozom, primera izvođenja E9, pri čemu je terapeutski peptid antitelo ili njegov fragment ili njihova modifikacija.
E13. EV, npr., egzozom, primera izvođenja E9, pri čemu je terapeutski peptid enzim, ligand, receptor, faktor transkripcije, ili njegov fragment ili njihova modifikacija.
E14. EV, npr., egzozom, primera izvođenja E9, pri čemu je terapeutski peptid antimikrobijalni peptid ili njegov fragment ili njihova modifikacija.
E15. EV, npr., egzozom, bilo kog od primera izvođenja E1 do E14, koji dalje sadrži drugi skeletni protein, pri čemu drugi skeletni protein sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili njihov fragment.
E16. EV, npr. egzozom, bilo kog primera izvođenja od E1 do E14, koji dalje sadrži drugi skeletni protein, pri čemu drugi skeletni protein sadrži PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP transporter ili njegov fragment.
E17. EV, npr. egzozom, bilo kog od primera izvođenja E1 do E16, pri čemu skeletni protein sadrži peptid sekvence (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 118), ili odgovarajuća sekvenca bez N-kraja (M).
E18. EV, npr., egzozom, bilo kog primera izvođenja od E1 do E17, pri čemu skeletni protein sadrži peptid sekvence (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), ili odgovarajuća sekvenca bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) , X je bilo koja aminokiselina, Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe
1
koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu).
E19. EV, npr., egzozom, bilo kog primera izvođenja od E1 do E18, pri čemu skeletni protein sadrži peptid sekvence (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), ili odgovarajuća sekvenca bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) , ξ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu).
E20. EV, npr., egzozom, bilo kog od primera izvođenja E18 ili E19, pri čemu skeletni protein sadrži peptid bilo koje od SEQ ID BR: 4-110, ili bilo koje od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M.
E21. EV, npr., egzozom, bilo kog od primera izvođenja E18 ili E19, pri čemu skeletni protein sadrži peptid MGXKLSKKK (SEQ ID BR: 116), ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.
E22. EV, npr., egzozom, primera izvođenja E20, pri čemu skeletni protein sadrži peptid SEQ ID BR: 110, ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M.
E23. EV, npr., egzozom, primera izvođenja E20, pri čemu skeletni protein sadrži peptid SEQ ID BR: 13, ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M.
E24. EV, npr., egzozom, bilo kog od primera izvođenja E1 ili E24, pri čemu skeletni protein dalje sadrži korisnu nosivost, npr., biološki aktivni molekul kao što je peptid. E25. Farmaceutska kompozicija koja sadrži EV, npr., egzozom, bilo kog od primera izvođenja E1 do E24 i ekscipijent.
E26. Farmaceutska kompozicija primera izvođenja E25, suštinski bez makromolekula, pri čemu su makromolekuli odabrani od nukleinskih kiselina, egzogenih proteina, lipida, ugljenih hidrata, metabolita i njihove kombinacije
E27. Populacija ćelija za proizvodnju EV, npr., egzozoma, bilo kog od primera izvođenja E1 do E24.
E28. Populacija ćelija primera izvođenja E27, koja sadrži egzogenu sekvencu koja kodira skeletni protein koji sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili njihov fragment ili njegovu modifikaciju.
1
E29. Populacija ćelija primera izvođenja E28, koja dalje sadrži drugu egzogenu sekvencu koja kodira drugi skeletni protein, pri čemu drugi skeletni protein sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili njihov fragment ili njegovu modifikaciju.
E30. Populacija ćelija primera izvođenja E28, koja dalje sadrži drugu egzogenu sekvencu koja kodira drugi skeletni protein, pri čemu drugi skeletni protein sadrži PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP transporter ili njegov fragment.
E31. Populacija ćelija bilo kog od primera izvođenja E27 do E30, pri čemu je egzogena sekvenca umetnuta u genomsku sekvencu koja kodira MARCKS, MARCKSL1, ili BASP1, pri čemu egzogena sekvenca i genomska sekvenca kodiraju skeletni protein.
E32. Populacija ćelija bilo kog od primera izvođenja E27 do E30, pri čemu je egzogena sekvenca u plazmidu.
E33. Populacija ćelija bilo kog od primera izvođenja E27 do E32, pri čemu egzogena sekvenca kodira biološki aktivan molekul, npr. terapeutski peptid.
E34. Populacija ćelija primera izvođenja E33, pri čemu je terapeutski peptid odabran iz grupe koja se sastoji od prirodnog peptida, rekombinantnog peptida, sintetičkog peptida ili linkera za terapeutsko jedinjenje.
E35. Populacija ćelija primera izvođenja E33, pri čemu je terapeutsko jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od nukleotida, aminokiselina, lipida, ugljenih hidrata i malih molekula.
E36. Populacija ćelija primera izvođenja E33, pri čemu je terapeutski peptid antitelo ili fragment ili njihova modifikacija.
E37. Populacija ćelija primera izvođenja E33, pri čemu je terapeutski peptid enzim, ligand, receptor, faktor transkripcije, ili njegov fragment ili njegova modifikacija.
E38. Populacija ćelija primera izvođenja E33, pri čemu je terapeutski peptid antimikrobni peptid ili njegov fragment ili njegova modifikacija.
E39. Populacija ćelija primera izvođenja E28, pri čemu egzogena sekvenca kodira deo sa ciljanim delovanjem.
E40. Populacija ćelija primera izvođenja E39, pri čemu je deo sa ciljanim delovanjem specifičan za organ, tkivo ili ćeliju.
E41. Populacija ćelija primera izvođenja E29 ili E30, pri čemu drugi skeletni protein dalje sadrži deo sa ciljanim delovanjem.
1
E42. Populacija ćelija primera izvođenja E41, pri čemu je deo sa ciljanim delovanjem specifičan za organ, tkivo ili ćeliju.
E43. Polipeptid za modifikaciju EV, npr. egzozoma, koji sadrži sekvencu
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 118) ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja (M);
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) , X je bilo koja aminokiselina, Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu); ili
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) , ξ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu).
E44. Polipeptid primera izvođenja E43, koji sadrži sekvencu bilo koje od SEQ ID BR: 4-110, ili bilo koju od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M.
E45. Polipeptid primera izvođenja E43, koji sadrži sekvencu SEQ ID BR: 13, ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M.
E46. Polipeptid primera izvođenja E43, koji sadrži sekvencu SEQ ID BR: 110, ili odgovarajuću sekvencu bez N- kraja M.
E47. Polipeptid primera izvođenja E43, koji sadrži sekvencu MGXKLSKKK (SEQ ID BR: 116), ili odgovarajuću sekvencu bez N- kraja M, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.
1
E48. Polipeptid bilo kog od primera izvođenja E43 do E47, pri čemu je polipeptid fuzionisan sa korisnom nosivošću, npr., biološki aktivnim molekulom kao što je peptid.
E49. Polipeptid iz primera izvođenja E48, pri čemu je polipeptid fuzionisan sa N-krajem peptida.
E50. Polinukleotidni konstrukt koji sadrži kodirajuću sekvencu koja kodira polipeptid bilo kog od primera izvođenja E43 do E49.
E51. Polinukleotidni konstrukt primera izvođenja E50, pri čemu je kodirajuća sekvenca optimizovana kodonom.
E52. Postupak pravljenja konstruisanog EV, na primer, egzozoma, koji se sastoji od sledećih koraka:
a. uvođenje u ćeliju konstrukta nukleinske kiseline koji kodira fuzioni polipeptid koji sadrži (i) prvu sekvencu koja kodira MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili njihov fragment ili njihovu modifikaciju i (ii) drugu sekvencu koja kodira korisnu nosivost, npr., biološki aktivan molekul kao što je peptid;
b. održavanje ćelije u uslovima koji omogućavaju ćeliji da eksprimira fuzioni polipeptid; i
c. dobijanje konstuisanog EV, npr., egzozoma, koji sadrži fuzioni polipeptid iz navedene ćelije.
E53. Postupak primera izvođenja E52, pri čemu prva sekvenca sadrži sekvencu od
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 118), ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja (M);
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) , X je bilo koja aminokiselina, Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu); ili
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja (M), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser) ,
2
ξ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu).
E54. Postupak bilo kog od primera izvođenja E52 ili E53, pri čemu prva sekvenca sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 4-110, ili bilo koju od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M.
E55. Postupak primera izvođenja E54, pri čemu prva sekvenca sadrži SEQ ID BR: 13, ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M.
E56. Postupak primera izvođenja E55, pri čemu prva sekvenca sadrži SEQ ID BR: 110, ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M.
E57. Postupak primera izvođenja E53, pri čemu prva sekvenca sadrži MGXKLSKKK (SEQ ID BR: 116), ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.
E58. Postupak bilo kog od primera izvođenja E52 do E57, pri čemu je fuzioni polipeptid prisutan na luminalnoj površini konstruisane EV, npr., egzozoma, sa višom gustinom od različitog skeletnog proteina u drugoj EV, npr. egzozoma, pri čemu različiti skeletni protein sadrži konvencionalni EV, npr. protein egzozoma ili njegovu varijantu.
E59. Postupak primera izvođenja E58, pri čemu je fuzioni polipeptid prisutan u više od 2 puta većoj gustini od različitog skeletnog proteina u različitim EV, npr., egzozomu. E60. Postupak primera izvođenja E59, pri čemu je fuzioni polipeptid prisutan sa više od 4 puta, 16 puta, 100 puta ili 10,000 puta većom gustinom od različitog skeletnog proteina u različitim EV, npr., egzozomu.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0064] Slike prikazuju različite aspekte ovog otkrića samo u svrhu ilustracije. Stručnjak u tehnici će lako prepoznati iz sledeće diskusije da se alternativni aspekti struktura i postupaka ilustrovanih ovde mogu koristiti bez odstupanja od principa ovde opisanog otkrića.
SLIKA 1A prikazuje sekvence fuzionih proteina koji sadrže BASP1 fragment fuzionisan sa FLAG® oznakom i GFP (SEQ ID BR-jevi: 135-142, respektivno, po redosledu pojavljivanja). SLIKA 1B prikazuje rezultate anti-FLAG® Western blota za egzozome prečišćene iz ćelija koje stabilno eksprimiraju jedan od fuzionih proteina na SLICI 1A. Za obe SLIKE 1A i 1B, položaji aminokiselina, npr. BASP1, 1-30, odnose se na BASP-1 fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 2A prikazuje sekvence iz BASP1 fragmenta (1-30) (SEQ ID BR: 4) i njegove modifikacije (1-30-S6D, 1-30-S6A i 1-30-L5Q) fuzionisane sa FLAG® oznakom i GFP ( SEQ ID BR-jevi: 143-145, respektivno, po redosledu pojavljivanja).
SLIKA 2B prikazuje rezultate anti-FLAG® Western blot za egzozome prečišćene iz ćelija koje stabilno eksprimiraju jedan od fuzionih proteina na SLICI 2A. Za obe SLIKE 2A i 2B, položaji aminokiselina, npr. BASP1, 1-30, odnose se na BASP-1 fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 3 prikazuje sliku COOMMASSIE® obojenog proteinskog gela sa uzorcima egzozoma prečišćenim iz ćelija koje stabilno eksprimiraju pune dužine MARCKSL1, BASP1 ili aminokiseline 1-30 MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1 sve fuzionisane sa FLAG®-GFP. Bele strelice na slici označavaju trake koje odgovaraju fuzionim proteinima. Za SLIKU 3, pozicije aminokiselina, npr. BASP1, 1-30, odnose se na BASP-1 fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 4 pokazuje poravnanje proteinske sekvence između prvih 28 aminokiselina BASP1 (konzervirani region 1), aminokiselina 1-7 i 152-173 MARCKS (konzervirani region 2) i aminokiselina 1-7 i 87-110 MARCKSL1 (konzervirani region 3).
SLIKA 5A prikazuje sekvence aminokiselina 1-30 BASP1 ("BASP1-30") (SEQ ID BR: 4) i fuzionih proteina koji sadrže aminokiseline 1-3 MARCKS ili njihove modifikacije fuzionisane sa PSD domenom MARCKS ili njegovom modifikacijom ("MARCKS-MG-PSD", "MARCKS-MA-PSD", "MARCKS-MG-PSD-K6S" i "MARCKS-MG-PSD-K6A") (SEQ ID BR-jevi: 146-149, respektivno, po redosledu pojavljivanja). Tačkaste mutacije uvedene u MARCKS sekvence su podebljane. Položaji aminokiselina, na primer, aa 1-30 od BASP1 ili aa 1-3 od MARCKS, odnose se na fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 5B prikazuje rezultate anti-FLAG® Western blotting prečišćenih egzozoma iz ćelija koje stabilno eksprimiraju fuzione proteine koji sadrže sekvence aminokiselina sa SLIKE 5A i FLAG®.
SLIKA 6 Prikazuje tri različite konsenzus sekvence (sve tri sekvence su predstavljene pomoću SEQ ID BR: 118) izvedene iz funkcionalnih studija MARCKS, MARCKSL1, i BASP1, i potrebe za aminokiselinama svake od sekvenci za opterećivanje korisnom nosivošću u lumen egzozoma preko pričvršćivanja na luminalnu površinu.
SLIKA 7A prikazuje ukupan protein (gore) i anti-Cas9 Western blot (dole) nativnih egzozoma ili egzozoma prečišćenih iz ćelija koje stabilno eksprimiraju Cas9 fuzionisane sa aminokiselinama 1-10 ili 1-30 BASP1, kao i opadajuće količine rekombinantnog Cas9. Položaji aminokiselina, npr. aa 1-10 BASP ili aa 1-30 BASP1, odnose se na fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 7B Gornji panel prikazuje standardnu krivu izvedenu iz Cas9 denzitometrije rezultata Western blotting sa SLIKE 7A. Na donjem panelu su dalje obezbeđene količine Cas9 opterećene po svakom prečišćenom egzozomu kao fuzioni proteini konjugovani sa 1-30 aminokiselina ili 1-10 aminokiselinskih fragmenata BASP1 (2-30 aminokiselina ili 2-10 aminokiselinskih fragmenata BASP1 nakon obrade (tj. prvi Met koji se odvaja)), procenjeno na osnovu standardne krive.
SLIKA 8A prikazuje uslikani proteinski gel egzozoma prečišćenih iz ćelija koje su stabilno transfektovane konstruktom koji eksprimira fuziju BASP1 N-kraja (aminokiseline 1-10) sa ovalbuminom („BASP1 (1-10)-OVA“) ili ćelije stabilno transfektovane sa dva konstrukta, jednim koji eksprimira fuziju BASP1 N-kraj (aminokiseline 1-10) sa ovalbuminom, a drugi koji eksprimira CD40L fuzionisan sa transmembranskim proteinom PTGFRN ("BASP1 (1-10)-OVA; 3XCD40L-PTGFRN"). SLIKA 8A dalje prikazuje sliku proteinskog gela koji je opterećen smanjenom količinom rekombinantne OVA. Numeracija aminokiselina, na primer, aminokiselina 1-10, odnosi se na fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 8B prikazuje rezultate uzoraka sa anti-Ovalbumin Western blota sa SLIKE 8A.
SLIKA 8C prikazuje rezultate Western blot-a upoređujući rekombinantne jajne ćelije sa jajnim ćelijama fuzionisanim sa egzoTOPE. SLIKA 8D prikazuje dijagram egzozoma koji sadrži (i) egzoTOPE povezan za Ovalbumin na luminalnoj strani egzozoma i (ii) imuni stimulator u lumenu egzozoma.
SLIKA 9A prikazuje sekvencu nanotela kamile usmerenog protiv GFP fuzionisanog sa aminokiselinama 1-10 BASP1 i FLAG® oznakom (SEQ ID BR: 150). Numeracija
2
aminokiselina, na primer, aminokiselina 1-10 BASP1, odnosi se na fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 9B prikazuje proteinski gel i rezultate anti-FLAG® Western blotting prečišćenih egzozoma iz ćelija koje stabilno eksprimiraju fuzioni protein sa SLIKE 10A („BASP1(1-10)-Nanotelo“) ili protein kome nedostaje BASP1 sekvenca („Nanotelo“). Numeracija aminokiselina, na primer, BASP1 (1-10)-Nanotelo, odnosi se na fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 10 prikazuje shemu mRNK sistema za optrećenje egzozoma koji sadrži (i) BASP1 (1-30) fuzionisan sa FLAG® i monomerne ili dimerne MCP varijante (1XMCP(V29I) ("815"; SEQ ID NO: 111), 1XMCP (V29I/N55K) ("817"; SEQ ID NO: 112), 2XMCP(V29I) ("819"; SEQ ID NO: 113) or 2XMCP(V29I/N55K)) ("821"; SEQ ID NO: 114) i ( ii) mRNK luciferaze koja obuhvata 3x MS2 ukosnice petlje ("Luciferaza-MS2 mRNK" ili "811"; SEQ ID BR: 115). Numeracija aminokiselina, na primer, BASP1 (1-30), odnosi se na fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 11A prikazuje proteinski gel egzozoma koji obuhvata mRNK konstrukte za opterećenja opisane na SLICI 10, mRNK luciferazu (811) u kombinaciji sa različitim BASP1 fuzionim proteinima (815, 817 ili 819).
SLIKA 11B prikazuje anti-FLAG® Western blot uzoraka na SLICI 11A.
SLIKA 12A prikazuje rezultate RT-qPCR za količinu mRNK luciferaze u ćelijama (gore) ili egzozomima (dole) koji obuhvataju mRNK konstrukte za opterećenja prikazane na SLICI 10.
SLIKA 12B prikazuje tabelu koja kvantifikuje količinu mRNK luciferaze u prečišćenim egzozomima iz uzoraka na SLICI 12A, uključujući višestruko obogaćivanje iz stohastičkog opterećenja mRNK luciferaze.
SLIKA 13 prikazuje shematski dijagram CD40L trimera fuzionisanih sa N-krajem fragmenata MARCKS, MARCKSL1 i BASP1 da bi se omogućio eksterni površinski prikaz transmembranskih proteina usidrenih za luminalnu površinu egzozoma. Numeracija aminokiselina, npr. MARCKS 1-30, MARCKSL1 1-30, BASP1 1-30, BASP1 1-10 ExoTOPE, odnosi se na fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 14A prikazuje rezultate aktivacije mišjih B-ćelija u kulturama inkubiranim sa egzozomima CD40L eksprimirane površine fuzionisanim sa N-krajevima fragmenata MARCKS, MARCKSL1 i BASP1.
SLIKA 14B prikazuje rezultate aktivacije humanih B-ćelija u kulturama inkubiranim sa egzozomima CD40L eksprimirane površine fuzionisanim sa N- krajevima fragmenata MARCKS, MARCKSL1 i BASP1.
SLIKA 14C prikazuje grafikon relativne potencije za različite egzozome CD40L površinskog prikaza kada su fuzionisani sa N-krajevima sekvenci MARCKS, MARCKSL1, BASP1, ili PTGFRN pune dužine. Numeracija aminokiselina, na primer, BASP1 1-30, odnosi se na fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
SLIKA 15 prikazuje broj podudaranja peptidnog spektra (PSMs) luminalnih proteina (MARCKS, MARCKSL1 i BASP 1) i konvencionalnih EV, npr. proteina egzozoma (CD81 i CD9) u egzozomima prečišćenim iz različitih ćelijskih linija različitog porekla (HEK293SF, bubreg; HT1080, vezivno tkivo; K562, koštana srž; MDA-MB-231, dojka; Raji, limfoblast; mezenhimalne matične ćelije (MSC), koštana srž).
SLIKA 16 prikazuje proteinski gel (levo) i anti-FLAG® Western blot (desno) samih egzozoma iz jajnika kineskog hrčka (CHO) ili iz ćelija koje prekomerno eksprimiraju BASP1 ili BASP1 N-krajeve fragmenata (1-30 ili 1-8 ) fuzionisan sa FLAG®-GFP. Numeracija aminokiselina, na primer, BASP1 (1-30), odnosi se na fragment koji je inicijalno kodiran konstruktom gena. Prvi Met se odvaja tokom obrade.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0065] Ovo otkriće je usmereno na vanćelijske vezikule (EVs), na primer, egzozome, koji sadrže najmanje jedan biološki aktivan molekul vezan za EV, na primer, egzozom, preko skeletnog proteina, pri čemu skeletni protein sadrži N-kraj domena (ND) i efektorski domen (ED), pri čemu su ND i/ili ED povezani sa luminalnom površinom EV, na primer, egzozomom, pri čemu ED sadrži (i) ponavljanje lizina u ED ili (ii) ponavljanje lizina kada se kombinuje sa ND, npr. K na C-kraju u ND i K na N-kraju u ED, pri čemu su ND i ED povezani direktno, tj. peptidnom vezom. Ovo otkriće takođe obezbeđuje minimalni broj aminokiselina koje su sposobne da usidre korisnu nosivost, npr., biološki aktivan molekul, na luminalnu površinu EV, npr. egzozom, npr. sedam do 15, sedam do 14, sedam do 13, sedam do 12, sedam do 11, sedam do 10, sedam do 9 ili sedam do 8 fragmenata aminokiselina. ND može biti povezan sa luminalnom površinom EV, na primer, egzozomom, preko
2
miristoilacije, dok ED može biti povezan sa luminalnom površinom EV, na primer, egzozomom, jonskom interakcijom, npr., preko atraktivne elektrostatičke interakcija. Neograničavajući primeri različitih aspekata prikazani su u ovom otkriću.
[0066] Pre nego što ovo otkriće bude opisano detaljnije, podrazumeva se da ovo otkriće nije ograničeno na određene kompozicije ili opisane korake procesa, jer takvi, naravno, mogu da variraju. Kao što će biti očigledno stručnjacima u tehnici nakon čitanja ovog otkrića, svaki od pojedinačnih aspekata opisanih i ilustrovanih ovde ima diskretne komponente i karakteristike koje se mogu lako odvojiti ili kombinovati sa karakteristikama bilo kog od nekoliko drugih aspekata. Bilo koji navedeni postupak može se izvesti po redosledu navedenih događaja ili bilo kojim drugim redosledom koji je logički moguć.
[0067] Naslovi obezbeđeni ovde nisu ograničenja različitih aspekata otkrića, koji se mogu definisati pozivanjem na specifikaciju u celini. Takođe se podrazumeva da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisa određenih aspekata, i nije namera da bude ograničavajuća.
[0068] Shodno tome, termini definisani neposredno ispod su potpunije definisani pozivanjem na specifikaciju u celini.
I. Definicije
[0069] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju značenje koje obično razume stručnjak u tehnici kojoj ovo otkriće pripada. Na primer, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, obezbeđuju veštine sa opštim rečnikom mnogih termina koji se koriste u ovom otkriću. Kako su upotrebljeni ovde, sledeći termini imaju značenja koja su im pripisana u nastavku
[0070] Treba napomenuti da se termin "a" ili "an" entitet odnosi na jedan ili više tih entiteta; na primer, "nukleotidna sekvenca", podrazumeva se da predstavlja jednu ili više nukleotidnih sekvenci. Kao takvi, termini "a" (ili "an"), "jedan ili više" i "najmanje jedan" mogu se ovde koristiti naizmenično. Dalje se napominje da se patentni zahtevi mogu sastaviti tako da isključe bilo koji izborni element. Kao takva, ova izjava treba da posluži kao prethodna osnova za upotrebu takve ekskluzivne terminologije kao što su „isključivo“, „samo“ i slično u vezi sa navođenjem elemenata patentnih zahteva ili upotrebom negativnog ograničenja.
[0071] Štaviše, "i/ili" gde se ovde koristi treba uzeti kao specifično otkrivanje svake od dve specifične karakteristike ili komponente sa ili bez druge. Dakle, termin "i/ili" kako je
2
upotrebljen u frazi kao što je "A i/ili B" ovde treba da uključi "A i B", "A ili B", "A" (samo) i "B “ (samo). Slično, termin "i/ili" kako je upotrebljen u frazi kao što je "A, B, i/ili C" ima za cilj da obuhvati svaki od sledećih aspekata: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (samo); B (samo); i C (samo).
[0072] Podrazumeva se da gde god su aspekti opisani ovde sa jezikom "koji sadrži", inače su takođe obezbeđeni analogni aspekti opisani u terminima "koji se sastoje od" i/ili "koji se sastoje u suštini od".
[0073] Jedinice, prefiksi i simboli su označeni u njihovoj prihvaćenoj formi Sistema međunarodnih jedinica (SI).
[0074] Numerički opsezi uključuju brojeve koji definišu opseg. Kada je naveden raspon vrednosti, podrazumeva se da je svaka vrednost između celobrojna vrednost, i svaki njen deo, između navedene gornje i donje granice tog opsega, takođe je posebno otkriven, zajedno sa svakim podopsegom između takvih vrednosti. Gornje i donje granice bilo kog opsega mogu nezavisno da budu uključene ili isključene iz opsega, a svaki opseg gde jedna, nijedna ili obe granice su uključene takođe je obuhvaćen unutar otkrića.
[0075] Prema tome, podrazumeva se da su opsezi koji su ovde navedeni skraćeni za sve vrednosti unutar opsega, uključujući navedene krajnje tačke. Na primer, podrazumeva se da opseg od 1 do 50 uključuje bilo koji broj, kombinaciju brojeva ili podopseg iz grupe koja se sastoji od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 i 50.
[0076] Osim ako nije drugačije naznačeno, pozivanje na jedinjenje koje ima jedan ili više stereocentara podrazumeva svaki stereoizomer i sve njegove kombinacije stereoizomera.
[0077] Tamo gde je vrednost eksplicitno navedena, podrazumeva se da vrednosti koje su otprilike iste količine ili iznosa kao i navedena vrednost takođe spadaju u obim otkrića. Tamo gde je kombinacija otkrivena, svaka podkombinacija elemenata te kombinacije je takođe posebno otkrivena i nalazi se u obimu otkrića. Suprotno tome, kada su različiti elementi ili grupe elemenata pojedinačno otkriveni, njihove kombinacije su takođe otkrivene. Tamo gde je bilo koji element otkrića otkriven kao da ima više alternativa, primeri tog otkrića u kojima je svaka alternativa isključena pojedinačno ili u bilo kojoj kombinaciji sa drugim alternativama su takođe ovim otkriveni; više od jednog elementa otkrića može imati takva izuzeća, a sve kombinacije elemenata koji imaju takva izuzeća se ovim otkrivaju.
[0078] Nukleotidi se nazivaju njihovim opšteprihvaćenim jednoslovnim kodovima. Osim ako nije drugačije naznačeno, nukleotidne sekvence se pišu s leva na desno u orijentaciji od 5' do 3'. Nukleotidi se ovde nazivaju njihovim opšte poznatim jednoslovnim simbolima koje
2
preporučuje IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Shodno tome, A predstavlja adenin, C predstavlja citozin, G predstavlja guanin, T predstavlja timin, U predstavlja uracil.
[0079] Aminokiselinske sekvence su napisane s leva na desno u amino ka karboksi orijentaciji. Aminokiseline se ovde nazivaju ili njihovim uobičajenim troslovnim simbolima ili simbolima od jednog slova koje preporučuje IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.
[0080] Termin "oko" je upotrebljen ovde da znači približno, otprilike, okolo ili u regionima. Kada se izraz „oko“ upotrebi u kombinaciji sa numeričkim opsegom, on modifikuje taj opseg tako što proširuje granice iznad i ispod navedenih numeričkih vrednosti. Generalno, termin „oko“ može da modifikuje numeričku vrednost iznad i ispod navedene vrednosti varijansom od, na primer, 10 procenata, naviše ili naniže (više ili niže).
[0081] Kako je upotrebljen ovde, termin "približno", primenjen na jednu ili više vrednosti od interesa, odnosi se na vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim aspektima, termin „približno“ se odnosi na opseg vrednosti koje spadaju u 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ili manje u bilo kom smeru (veće ili manje od) navedene referentne vrednosti osim ako nije drugačije navedeno ili na drugi način očigledno iz konteksta (osim kada bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).
[0082] Termini "primena", "koji se primenjuje" i njihove gramatičke varijante odnose se na uvođenje kompozicije, kao što je EV (npr., egzozom) prema ovom otkriću, u subjekt putem farmaceutski prihvatljivog puta. Uvođenje kompozicije, kao što je EV (npr., egzozom) prema ovom otkriću, u subjekt je bilo kojim pogodnim putem, uključujući intratumoralno, oralno, pulmonalno, intranazalno, parenteralno (intravenozno, intraarterijsko, intramuskularno, intraperitonealno, ili subkutano), rektalno, intralimfatično, intratekalno, periokularno ili topikalno. Primenjivanje uključuje sopstvenu primenu i primenu od strane drugog subjekta. Pogodan način primene omogućava kompoziciji ili agensu da izvrši svoju predviđenu funkciju. Na primer, ako je pogodan put intravenski, kompozicija se primenjuje uvođenjem kompozicije ili agensa u venu subjekta.
[0083] Kako je upotrebljen ovde, termin "agonist" se odnosi na molekul koji se vezuje za receptor i aktivira receptor da proizvede biološki odgovor. Receptore mogu aktivirati ili endogeni ili egzogeni agonisti. Neograničavajući primeri endogenog agonista uključuju hormone, neurotransmitere i ciklične dinukleotide. Neograničavajući primeri egzogenog agonista uključuju lekove, male molekule i ciklične dinukleotide. Agonist može biti potpuni, delimični ili inverzni agonist.
2
[0084] Kako je upotrebljen ovde, termin "antagonist" se odnosi na molekul koji blokira ili prigušuje odgovor posredovan agonistima, a ne da provocira sam biološki odgovor nakon vezivanja za receptor. Mnogi antagonisti postižu svoju potenciju kada su u kompeticiji sa endogenim ligandima ili supstratima na strukturno definisanim mestima vezivanja na receptorima. Neograničavajući primeri antagonista uključuju alfa blokatore, beta blokator i blokatore kalcijumovih kanala. Antagonist može biti kompetitivni, ne-kompetitivni ili nekompetitivni antagonist.
[0085] Kako je upotrebljen ovde, termin "vanćelijska vezikula" ili "EV" odnosi se na ćelijski mehur koji sadrži membranu koja obuhvata unutrašnji prostor (lumen). Vanćelijske vezikule sadrže sve vezikule vezane za membranu koje imaju manji prečnik od ćelije iz koje potiču. Generalno, vanćelijske vezikule imaju prečnik od 20 nm do 1000 nm i mogu sadržati različitu korisnu nosivost bilo unutar unutrašnjeg prostora (tj. lumena), prikazana na spoljnoj površini ili luminalnoj površini vanćelijske vezikule, i/ili obuhvataju membranu. Korisna nosivost može da sadrži, na primer, nukleinske kiseline, proteine, ugljene hidrate, lipide, male molekule i/ili njihove kombinacije. Kao primer i bez ograničenja, vanćelijske vezikule uključuju apoptotička tela, fragmente ćelija, vezikule izvedene iz ćelija direktnom ili indirektnom manipulacijom (npr. serijskom ekstruzijom ili tretmanom sa alkalnim rastvorima), vezikularne organele i vezikule proizvedene od živih ćelija ( npr. direktnim pupljenjem plazma membrane ili fuzijom kasnog endozoma sa plazma membranom). Vanćelijske vezikule mogu biti izvedene iz živog ili mrtvog organizma, eksplantiranih tkiva ili organa i/ili kultivisanih ćelija. U nekim aspektima, EV sadrži skeletni protein koji je ovde otkriven.
[0086] Kako je upotrebljen ovde, termin "egzozom" se odnosi na malu izvedenu iz ćelije (prečnik između 20-300 nm, poželjnije 40-200 nm u prečniku) vanćelijsku vezikulu (EV) koja sadrži membranu koja obuhvata unutrašnji prostor (lumen), i koji se, u nekim aspektima, generiše iz ćelije (npr. ćelije proizvođača), na primer, direktnim pupljenjem plazma membrane ili fuzijom kasnog endozoma sa plazma membranom. Egzozom je vrsta vanćelijske vezikule (EV). U nekim aspektima, egzozom sadrži lipid ili masnu kiselinu i polipeptid i izborno sadrži korisnu nosivost (npr., biološki aktivan molekul kao što je terapeutsko sredstvo), primalac (npr. deo sa ciljanim delovanjem), polinukleotid (npr. nukleinsku kiselinu, RNK ili DNK), šećer (npr. jednostavan šećer, polisaharid ili glikan) ili druge molekule. Egzozom može biti izveden iz ćelije proizvođača i izolovan iz ćelije proizvođača na osnovu njegove veličine, gustine, biohemijskih parametara ili njihove kombinacije. U nekim aspektima, egzozom sadrži skeletni protein prema ovom otkriću. U nekim aspektima,
2
egzozome ovog otkrića proizvode ćelije koje eksprimiraju jedan ili više transgenskih proizvoda.
[0087] Kako je upotrebljen ovde, termin "protein lumena egzozoma" se odnosi na skeletni protein, tj. protein vezan ili povezan sa luminalnom površinom EV, na primer, egzozom, kao što je MARCKS, MARKSL1, BASP1, ili bilo koji njegov funkcionalni fragment, bilo koja njihova varijanta, bilo koji njihov derivat, ili bilo koja njihova kombinacija, i koji je pogodan za upotrebu kao skela za ciljanje korisne nosivosti, npr., biološki aktivnog molekula (npr. terapeutski proteini) na luminalnoj površini EVs, npr. egzozoma.
[0088] Kako je upotrebljen ovde, termin "nanovezikula" se odnosi na malu izvedenu iz ćelije (prečnik između 20-250 nm, npr.30-150 nm u prečniku) vezikulu koji sadrži membranu koja obuhvata unutrašnji prostor i koja se generiše iz ćelija (npr. ćelije proizvođača) direktnom ili indirektnom manipulacijom tako da nanovezikula ne bi bila proizvedena od strane ćelije proizvođača bez takve manipulacije. Odgovarajuće manipulacije ćelije proizvođača za proizvodnju nanovezikula uključuju, ali se ne ograničavaju na serijsku ekstruziju, tretman sa alkalnim rastvorima, sonikaciju ili njihove kombinacije. Proizvodnja nanovezikula može, u nekim slučajevima, dovesti do uništenja ćelije proizvođača. U nekim aspektima, populacije nanovezikula koje su ovde opisane su u suštini bez vezikula koje su izvedene iz ćelija proizvođača putem direktnog pupljenja iz plazma membrane ili fuzije kasnog endozoma sa plazma membranom. U nekim aspektima, nanovezikula sadrži lipid ili masnu kiselinu i polipeptid, i izborno sadrži korisnu nosivost (npr. terapeutski agens), primalac (npr. deo sa ciljanim delovanjem), polinukleotid (npr. nukleinsku kiselinu, RNK ili DNK), šećer (npr. jednostavan šećer, polisaharid ili glikan) ili druge molekule. Nanovezikula, nakon što je izvedena iz ćelije proizvođača u skladu sa manipulacijom, može se izolovati iz ćelije proizvođača na osnovu njene veličine, gustine, biohemijskih parametara ili njihove kombinacije. U nekim aspektima, nanovezikula može da sadrži skeletni protein koji je ovde otkriven.
[0089] Kako je upotrebljen ovde, termin „lumen konstruisanog EV“ odnosi se na EV, npr., egzozom sa luminalnom površinom membrane ili lumenom EV, npr. egzozomom, modifikovanog u svojoj kompoziciji tako da se površina lumina ili lumen konstruisanog EV, na primer, egzozoma, razlikuje od onog od EV, na primer, egzozoma, pre modifikacije ili prirodnog EV, na primer, egzozoma.
[0090] Inženjering može biti direktno u lumenu (tj. praznini unutar EV) ili u membrani EV (npr. egzozom), posebno na luminalnoj površini EV, tako da se lumen i/ili luminalna površina EV, na primer, egzozoma, menja. Na primer, membrana je modifikovana u svojoj kompoziciji proteina, lipida, malog molekula, ugljenih hidrata, itd., tako da je luminalna površina EV, na primer, egzozoma, modifikovana. Slično, sadržaj lumena se može modifikovati. Kompozicija se može promeniti hemijskim, fizičkim ili biološkim postupkom ili tako što se proizvodi iz ćelije koja je prethodno modifikovana hemijskim, fizičkim ili biološkim postupkom. Konkretno, kompozicija se može promeniti genetičkim inženjeringom ili tako što se proizvodi iz ćelije koja je prethodno modifikovana genetičkim inženjeringom. U nekim aspektima, lumen-konstruisana EV, npr. lumen- konstruisan egzozom, sadrži egzogeni protein (tj. protein koji EV, npr., egzozom, ne eksprimira prirodno) ili njegov fragment ili varijantu koji može biti izložen u luminalnoj površini ili lumenu EV, npr. egzozomu, ili može biti tačka usidrenja (zakačinjanje) za deo izložen na unutrašnjem sloju EV, na primer, egzozomu. U drugim aspektima, lumen-konstruisani EV, npr., lumen- konstruisani egzozom, sadrži veću ekspresiju prirodnog EV, npr. egzozoma, proteina (npr. skeletni proteina) ili njegovog fragmenta ili varijante koji može biti izložen lumen EV, npr., egzozoma, ili može biti tačka usidrenja (zakačinjanje) za deo koji je izložen na luminalnoj površini EV, npr. egzozom.
[0091] Kako je upotrebljen ovde, termin „površina konstruisanog EV“ odnosi se na EV sa spoljašnjom površinom EV modifikovanom u njegovoj kompoziciji tako da se spoljašnja površina konstruisanog EV razlikuje od EV pre modifikacije ili EV koja se prirodno pojavljuje.
[0092] Kako je upotrebljen ovde, termin "površina konstruisanog egzozoma" odnosi se na egzozom čija je spoljašnja površina egzozoma modifikovana u njegovoj kompoziciji tako da je spoljašnja površina konstruisanog egzozoma različita od egzozoma pre modifikacije ili egzozoma koji se prirodno pojavljuje.
[0093] Termin „modifikovani“, kada se koristi u kontekstu EVs, npr., egzozoma, koji je ovde opisan, odnosi se na promenu ili konstruisanje EV, npr. egzozoma i/ili njegove ćelije proizvođača, tako da se modifikovani EV, npr., egzozom, razlikuje od prirodnog EV, na primer, egzozoma. U nekim aspektima, modifikovani EV, npr. egzozom, koji je ovde opisan, sadrži membranu koja se razlikuje po kompoziciji proteina, lipida, malih molekula, ugljenih hidrata, itd. u poređenju sa membranom prirodnog EV, npr. egzozoma. Na primer, membrana sadrži veću gustinu ili broj prirodnih EV, na primer, egzozoma, proteina i/ili membrana sadrži proteine koji se prirodno ne nalaze u EV, npr., egzozomima. U određenim aspektima, takve modifikacije membrane menjaju spoljašnju površinu EV, npr., egzozoma (npr., površina kostruisanih EVs i egzozoma opisanih ovde). U određenim aspektima, takve modifikacije membrane menjaju luminalnu površinu EV, npr., egzozoma (npr., lumen konstruisanog EV i egzozoma koji su ovde opisani).
1
[0094] Na primer, lumen je modifikovan u svojoj kompoziciji proteina, lipida, malog molekula, ugljenih hidrata, itd. Kompozicija se može promeniti hemijskim, fizičkim ili biološkim postupkom ili tako što se proizvodi iz ćelije koja je prethodno. modifikovana hemijskim, fizičkim ili biološkim postupkom. Konkretno, kompozicija se može promeniti genetičkim inženjeringom ili proizvesti iz ćelije prethodno modifikovane genetičkim inženjeringom.
[0095] Kako je upotrebljen ovde, termin "modifikacija" proteina, na primer, kao u "modifikovanom proteinu" ili "modifikovanju proteina" ili njihovim gramatičkim varijantama, odnosi se na protein koji ima najmanje 15% identičnosti sa ne-mutiranom aminokiselinskom sekvencom proteina. Modifikacija proteina uključuje fragment ili varijantu proteina. Modifikacija proteina može dalje uključivati hemijsku ili fizičku modifikaciju fragmenta ili varijante proteina. U nekim aspektima, modifikovani protein zadržava najmanje jednu fiziološku funkciju ne-modifikovanog proteina.
[0096] Kako je upotrebljen ovde, termin "fragment" proteina (npr., biološki aktivan molekul kao što je terapeutski protein, ili skeletni protein koji je ovde otkriven) odnosi se na protein koji je kraći od sekvence koja se prirodno pojavljuje, npr. N i/ili C-kraj izbrisan u poređenju sa prirodnim proteinom.
[0097] Kako je upotrebljen ovde, termin "funkcionalni fragment" se odnosi na proteinski fragment koji zadržava funkciju proteina. Shodno tome, u nekim aspektima, funkcionalni fragment skeletnog proteina koji je ovde otkriven, kao što je MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1 zadržava sposobnost da usidri biološki aktivni molekul na luminalnoj površini EV, npr., egzozoma.
[0098] Da li je fragment funkcionalni fragment u tom smislu da se može proceniti bilo kojim postupcima poznatim u tehnici za određivanje sadržaja proteina u EVs, npr., egzozoma uključujući Western blots, FACS analizu i fuzije fragmenata sa autofluorescentnim proteinima kao što je, na primer, GFP. U određenom aspektu, fragment MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1 zadržava, npr., najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili najmanje oko 100% sposobnosti prirodnog MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1 za usidravanje korisne nosivosti, npr., biološki aktivnog molekula, na luminalnu ili na spoljašnju površinu EV, na primer, egzozoma. U određenom aspektu, sposobnost varijante MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili fragmenta MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1 je najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85 %, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko
2
99%, ili najmanje oko 100% sposobnosti MARCKS, MARCKSL1 i BASP1, respektivno, da usidre korisnu nosivost, npr., biološki aktivan molekul, na luminalnoj ili na spoljnoj površini EV, npr. egzozoma. Ova sposobnost se može proceniti, npr. fluorescentno obeleženim varijantama, u analizama opisanim u eksperimentalnom delu.
[0099] Termin "derivat" kako je upotrebljen ovde odnosi se na EV, npr., egzozomsku, komponentu (npr. protein ili lipid), skeletni protein prema ovom pronalasku, ili na korisnu nosivost, npr., biološki aktivan molekul (npr. polipeptid, polinukleotid, lipid, ugljeni hidrat, antitelo ili njegov fragment) koji je hemijski ili enzimski modifikovan.
[0100] Kako je upotrebljen ovde, termin "varijanta" proteina se odnosi na protein koji deli određeni strukturni (npr. identičnost sekvence aminokiselina) i funkcionalne identičnosti sa drugim proteinom nakon poređenja (npr. poravnanjem sekvence) postupkom poznatim u tehnici. Na primer, varijanta proteina može uključivati supstituciju, inserciju, deleciju, pomeranje okvira ili preuređenje u drugom proteinu. U nekim aspektima, varijanta proteina zadržava najmanje jednu fiziološku funkciju ne-varijantnog proteina.
[0101] U određenom aspektu, varijanta je varijantni protein koji ima najmanje 70% identičnosti sa punom dužinom, zrelih MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili fragmenta MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1.
[0102] U nekim aspektima, varijante ili varijante fragmenata MARCKS dele najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili na najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa MARCKS prema SEQ ID BR: 1 ili sa njenim funkcionalnim fragmentom, kao što je određeno, na primer, poravnanjem u parovima korišćenjem Needleman-Wunsch algoritma.
[0103] U nekim aspektima, varijante ili varijante fragmenata MARCKSL1 dele najmanje 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa MARCKSL1 prema SEQ ID BR: 2 ili sa njenim funkcionalnim fragmentom, kao što je određeno, na primer, poravnanjem u paru korišćenjem Needleman-Wunsch algoritma.
[0104] U nekim aspektima, varijante ili varijante fragmenata BASP1 deli najmanje 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa BASP1 prema SEQ ID BR: 3 ili sa njenim funkcionalnim fragmentom, kao što je određeno, na primer, poravnanjem u paru korišćenjem Needleman-Wunsch algoritma.
[0105] U nekim aspektima, varijanta skeletnog proteina (npr. MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1), funkcionalni fragment skeletnog proteina, ili varijanta funkcionalnog fragmenta skeletnog proteina, je derivat.
[0106] U svakom od prethodno navedenih slučajeva, varijanta ili varijanta fragmenta skeletnog proteina (npr. varijanta MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili fragment MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1) zadržava sposobnost da usidri korisnu nosivost, npr., biološki aktivni molekul, na luminaloj ili na spoljnoj površini EV, npr. egzozoma.
[0107] Pomijanje bilo kog proteina koji je ovde obezbeđen obuhvata funkcionalnu varijantu proteina. Termin "funkcionalna varijanta" proteina odnosi se na varijantu proteina koja zadržava sposobnost da usidri biološki aktivni molekul na luminalnoj ili na spoljašnjoj površini EV, npr., egzozoma. U određenom aspektu, sposobnost funkcionalne varijante MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili fragmenta MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1 je najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90 %, najmanje oko 95% ili najmanje oko 99% sposobnosti MARCKS, MARCKSL1 i BASP1, respektivno, da usidre korisnu nosivost, npr., biološki aktivan molekul, na luminalnu ili na spoljašnju površinu EV, na primer, egzozoma.
[0108] Varijante koje se javljaju u prirodi nazivaju se „alelske varijante“ i odnose se na jedan od nekoliko alternativnih oblika gena koji zauzimaju dati lokus na hromozomu organizma (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Ove alelske varijante mogu da variraju bilo na nivou polinukleotida i/ili polipeptida i uključene su u ovo otkriće. Alternativno, varijante koje se ne pojavljuju u prirodi mogu se proizvesti tehnikama mutageneze ili direktnom sintezom.
[0109] Koristeći poznate postupke proteinskog inženjeringa i tehnologije rekombinantne DNK, mogu se generisati varijante za poboljšanje ili izmenu karakteristika polipeptida. Na primer, jedna ili više aminokiselina mogu biti izbrisane sa N-kraja ili C-kraja izlučenog proteina bez značajnog gubitka biološke funkcije. Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), saopštavaju o varijantama KGF proteina koji imaju aktivnost vezivanja heparina čak i nakon brisanja 3, 8 ili 27 amino-kraja aminokiselinskih ostataka. Slično, interferon gama je pokazao do deset puta veću aktivnost nakon brisanja 8-10 aminokiselinskih ostataka sa karboksi kraja ovog proteina. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)).
[0110] Štaviše, brojni dokazi pokazuju da varijante često zadržavaju biološku aktivnost sličnu onoj kao kod prirodnog proteina. Na primer, Gayle i saradnici (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)) sproveli su opsežnu mutacionu analizu humanog citokina IL-1a. Oni su koristili nasumičnu mutagenezu da bi generisali preko 3,500 pojedinačnih mutanata IL-1a koji
4
su u proseku imali 2,5 promena aminokiselina po varijanti na celoj dužini molekula. Ispitivano je više mutacija na svim mogućim pozicijama aminokiselina. Istraživači su otkrili da „[većina] molekula može biti izmenjena sa malim uticajem na ili [vezivanje ili biološku aktivnost].“ (Videti sažetak.) U stvari, samo 23 jedinstvene aminokiselinske sekvence, od više od 3,500 ispitanih nukleotidnih sekvenci, proizvele su protein koji se značajno razlikovao u aktivnosti od divljeg tipa.
[0111] Kao što je prethodno navedeno, varijante ili derivati uključuju, npr., modifikovane polipeptide. U nekim aspektima, varijante ili derivati, na primer, polipeptida, polinukleotida, lipida, glikoproteina, su rezultat hemijske modifikacije i/ili endogene modifikacije. U nekim aspektima, varijante ili derivati su rezultat in vivo modifikacije. U nekim aspektima, varijante ili derivati su rezultat in vitro modifikacije. U još drugih aspekata, varijante ili derivati su rezultat intracelularne modifikacije u ćelijama proizvođačima.
[0112] Modifikacije prisutne u varijantama i derivatima uključuju, na primer, acetilaciju, acilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju, kovalentno vezivanje flavina, kovalentno vezivanje hem dela, kovalentno vezivanje nukleotida ili derivata nukleotida, kovalentno vezivanje lipida ili derivata lipida, kovalentno vezivanje fosfotidilinozitola, unakrsno povezivanje, ciklizacija, formiranje disulfidne veze, demetilacija, formiranje kovalentnih unakrsnih veza, formiranje cisteina, formiranje piroglutamata, formilacija, gama-karboksilacija, glikozilacija, formiranje GPI usidravanja, hidroksilacija, jodiranje, metilacija, miristoilacija, oksidacija, pegilacija (Mei et al., Blood 116:270-79 (2010)), proteolitička obrada, fosforilacija, prenilacija, racemizacija, selenoilacija, sulfatacija, dodavanje aminokiselina proteinima posredovano transferom RNK kao što je arginilacija i ubikvitinacija.
[0113] Termin "supstitucija aminokiselina" se odnosi na zamenu aminokiselinskog ostatka prisutnog u roditeljskoj ili referentnoj sekvenci (npr. sekvenci divljeg tipa) sa drugim aminokiselinskim ostatkom. Aminokiselina može biti supstituisana u roditeljskoj ili referentnoj sekvenci (npr. sekvenca polipeptida divljeg tipa), na primer, putem hemijske peptidne sinteze ili putem rekombinantnih postupaka poznatih u tehnici. Shodno tome, pozivanje na "supstituciju na poziciji X" odnosi se na supstituciju aminokiseline prisutne na poziciji X sa alternativnim aminokiselinskim ostatkom. U nekim aspektima, obrasci supstitucije se mogu opisati prema shemi AnY, pri čemu je A jednoslovni kod koji odgovara prirodnoj aminokiselini ili prvobitno prisutna na poziciji n, a Y je supstitucioni aminokiselinski ostatak. U drugim aspektima, obrasci supstitucije se mogu opisati u skladu sa shemom An(YZ), pri čemu je A šifra od jednog slova koja odgovara aminokiselinskom ostatku koji supstituiše prirodnu aminokiselinu ili prvobitno prisutnu na poziciji n, a Y i Z su alternativna supstitucija aminokiselinskih ostataka koji mogu zameniti A.
[0114] Kako je upotrebljeno ovde, termin "antitelo" obuhvata imunoglobulin, bilo prirodan ili delimično ili potpuno sintetički proizveden, i njegove fragmente. Termin takođe obuhvata bilo koji protein koji ima vezujući domen koji je homologan domenu za vezivanje imunoglobulina. "Antitelo" dalje uključuje polipeptid koji sadrži okvirni region iz imunoglobulinskog gena ili njegove fragmente koji se specifično vezuje i prepoznaje antigen. Upotreba termina antitelo podrazumeva cela antitela, poliklonska, monoklonska i rekombinantna antitela, njihove fragmente, i dalje uključuje jednolančana antitela, humanizovana antitela, mišja antitela, himerna, mišja-humana, mišja-primata, primatahumana monoklonska antitela, anti-idiotipska antitela, fragmenti antitela, kao što su, na primer, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' i F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb i Fd fragmenti, dijatela i polipeptide koji se odnose na antitela. Antitelo uključuje bispecifična antitela i multispecifična antitela sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost ili funkciju. U nekim aspektima sadašnjeg otkrića, korisna nosivost je biološki aktivan molekul koji sadrži antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen. U nekim aspektima, antitelo (npr., biološki aktivan molekul prema ovom otkriću) je nanotelo.
[0115] Termini "konjugat antitelo-lek" i "ADC" se koriste naizmenično i odnose se na povezano antitelo, npr., kovalentno, sa terapeutskim sredstvom (ponekad se ovde pominje kao sredstvo, lek ili aktivni farmaceutski sastojak) ili sredstva. U nekim aspektima ovog otkrića, korisna nosivost je biološki aktivan molekul koji sadrži konjugat antitelo-lek.
[0116] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u tehnici, uključujući bazne bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarni bočni lanci (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranati bočni lanci (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatični bočni lanci (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Dakle, ako je aminokiselina u polipeptidu zamenjena drugom aminokiselinom iz iste familije bočnih lanaca, zamena se smatra konzervativnom. U drugom aspektu, niz aminokiselina može se konzervativno zameniti strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili kompoziciji članova familije bočnih lanaca.
[0117] Kako je upotrebljen ovde, termin "konzerviran" se odnosi na nukleotide ili aminokiselinske ostatke polinukleotidne sekvence ili polipeptidne sekvence, respektivno, to su oni koji se javljaju nepromenjeni na istoj poziciji dve ili više sekvenci koje se porede. Nukleotidi ili aminokiseline koje su relativno konzervirane su one koje su konzervirane među više srodnih sekvenci od nukleotida ili aminokiselina koje se pojavljuju negde drugde u sekvencama.
[0118] U nekim aspektima, za dve ili više sekvenci se kaže da su "potpuno konzervirane" ili "identične" ako su 100% međusobno identične. U nekim aspektima, za dve ili više sekvenci se kaže da su "visoko konzervirane" ako su najmanje 70% identične, najmanje 80% identične, najmanje 90% identične, ili najmanje 95% međusobno identične.
[0119] U nekim aspektima, za dve ili više sekvenci se kaže da su „visoko konzervirane“ ako su oko 70% identične, oko 80% identične, oko 90% identične, oko 95%, oko 98% ili oko 99% međusobno identične. U nekim aspektima, za dve ili više sekvenci se kaže da su "konzervirane" ako su najmanje 30% identične, najmanje 40% identične, najmanje 50% identične, najmanje 60% identične, najmanje 70% identične, najmanje 80% identične, najmanje 90% identične ili najmanje 95% međusobno identične. U nekim aspektima, za dve ili više sekvenci se kaže da su "konzervirane" ako su oko 30% identične, oko 40% identične, oko 50% identične, oko 60% identične, oko 70% identične, oko 80% identične, oko 90 % identični, oko 95% identični, oko 98% identični, ili oko 99% međusobno identične. Konzerviranje sekvence se može primeniti na celu dužinu polinukleotida ili polipeptida ili se može primeniti na njihov deo, region ili obeležje.
[0120] Kako je upotrebljen ovde, termin "homologija" se odnosi na ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između molekula nukleinske kiseline (npr. molekula DNK i/ili molekula RNK) i/ili između molekula polipeptida. Generalno, termin "homologija" podrazumeva evolucioni odnos između dva molekula. Dakle, dva homologna molekula će imati zajedničkog evolucionog pretka. U kontekstu ovog otkrića, termin homologija obuhvata i identičnost i sličnost.
[0121] U nekim aspektima, smatra se da su polimerni molekuli "homologni" međusobno ako je najmanje 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% monomera u molekulu identično (potpuno isti monomer) ili su slični (konzervativne supstitucije). Termin "homologan" se nužno odnosi na poređenje između najmanje dve sekvence (polinukleotidne ili polipeptidne sekvence).
[0122] U kontekstu ovog otkrića, supstitucije (čak i kada se pominju kao supstitucija aminokiselina) se sprovode na nivou nukleinske kiseline, tj. zamena aminokiselinskog ostatka alternativnim aminokiselinskim ostatkom se sprovodi supstitucijom kodona koji kodira prvu aminokiselinu kodonom koji kodira drugu aminokiselinu.
[0123] Kako je upotrebljen ovde, termin "identičnost" se odnosi na ukupnu konzervaciju monomera između polimernih molekula, npr. između polipeptidnih molekula ili polinukleotidnih molekula (npr. molekula DNK i/ili RNK molekula). Termin "identičan" bez ikakvih dodatnih kvalifikatora, na primer, protein A je identičan proteinu B, podrazumeva da su sekvence 100% identične (100% identičnost sekvence). Opisivanje dve sekvence kao, npr., „70% identične“, ekvivalentno je opisivanju kao da imaju, na primer, „70% identičnost sekvence“.
[0124] Izračunavanje procenta identičnosti dve polipeptidne sekvence, na primer, može da se izvede poravnavanjem dve sekvence u svrhu optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu uvesti u jednu ili obe od prve i druge sekvence polipeptida za optimalno poravnanje i neidentične sekvence se mogu zanemariti u svrhu poređenja). U određenim aspektima, dužina sekvence koja je poravnjana u svrhu poređenja je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% dužine referentne sekvence. Zatim se porede aminokiseline na odgovarajućim pozicijama aminokiselina.
[0125] Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istom aminokiselinom kao i odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence, uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koju treba uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma.
[0126] Postupci poravnanja sekvenci za poređenje su dobro poznate u tehnici. Različiti programi i algoritmi za poravnanje opisani su u: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 15 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989) Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci.8: 155-65 (1992); i Pearson et al., Meth. Mol. Biol.
24: 307-31 (1994). NCBI osnovni alat za pretragu lokalnog poravnanja (BLAST) [Altschul 20 et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990) J je dostupan iz nekoliko izvora, uključujući Nacionalni centar za biološke informacije (NBCl, Bethesda, Md.) i na Internetu, za upotrebu u vezi sa programima za analizu sekvenci blastp, blastn, blastx, tblastn i tblastx. BLAST i opis kako odrediti identifikaciju sekvence pomoću programa može se pristupiti na zvaničnom sajtu NCBI (Nacionalnog centra za informacije o biotehnologiji) pod NIH (Nacionalni institut za zdravlje).
[0127] Drugi pogodni programi su, na primer, Needle, Stretcher, Water ili Matcher, deo EMBOSS paketa bioinformatičkih programa takođe su dostupni od Evropskog instituta za bioinformatiku (EBI) na www.ebi.ac.uk/Tools/psa. Poravnavanje sekvenci se može sprovesti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici kao što su MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X ili Clustal Omega), MUSCLE, itd.
[0128] Različiti regioni unutar jedne polinukleotidne ili polipeptidne ciljane sekvence koja je poravnjana sa polinukleotidnom ili polipeptidnom referentnom sekvencom mogu imati svaki svoj procenat identičnosti sekvence. Primećuje se da je procentualna vrednost identičnosti sekvence zaokružena na najbližu desetinu. Na primer, 80,11, 80,12, 80,13 i 80,14 su zaokruženi na 80,1, dok su 80,15, 80,16, 80,17, 80,18 i 80,19 zaokruženi na 80,2. Takođe se primećuje da će vrednost dužine uvek biti ceo broj.
[0129] U određenim aspektima, procenat identičnosti (%ID) ili prve aminokiselinske sekvence (ili sekvence nukleinske kiseline) prema drugoj sekvenci aminokiseline (ili sekvenci nukleinske kiseline) se izračunava kao %ID = 100 x (Y/Z), gde je Y broj aminokiselinskih ostataka (ili nukleobaza) dobijenih kao identična poklapanja u poravnanju prve i druge sekvence (kao što je poravnjano vizuelnim proveravanjem ili određenim programom za poravnanje sekvence), a Z je ukupan broj ostataka u drugoj sekvenci. Ako je dužina prve sekvence duža od druge sekvence, procenat identičnosti prve sekvence sa drugom sekvencom biće veći od procenta identičnosti druge sekvence sa prvom sekvencom.
[0130] Stručnjak u tehnici će razumeti da generisanje poravnanja sekvence za izračunavanje procenta identičnosti sekvence nije ograničeno na binarna poređenja sekvenca-sekvenca isključivo vođena podacima o primarnim sekvencama. Takođe će razumeti da se poravnanja sekvenci mogu generisati integracijom podataka o sekvenci sa podacima iz heterogenih izvora kao što su strukturni podaci (npr. kristalografske strukture proteina), funkcionalni podaci (npr. lokacija mutacija) ili filogenetski podaci. Pogodan program koji integriše heterogene podatke za generisanje višestrukog poravnanja sekvenci je T-Coffee, dostupan na www.tcoffee.org, a alternativno dostupan, na primer, od EBI. Takođe će razumeti da se konačno poravnanje koje se koristi za izračunavanje procentualne identičnosti sekvence može birati automatski ili ručno.
[0131] Kako je uporebljen ovde, termin "sličnost" se odnosi na ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između polinukleotidnih molekula (npr. molekula DNK i/ili molekula RNK) i/ili između molekula polipeptida. Izračunavanje procenta međusobne sličnosti polimernih molekula može se izvršiti na isti način kao i izračunavanje procenta identičnosti, osim što izračunavanje procenta sličnosti uzima u obzir konzervativne zamene što se podrazumeva u tehnici. Podrazumeva se da je procenat sličnosti zavisan od korišćene skale poređenja, tj. da li se aminokiseline porede, npr. prema njihovoj evolucionoj blizini, naelektrisanju, zapremini, fleksibilnosti, polarnosti, hidrofobnosti, aromatičnosti, izoelektričnoj tački, antigenosti ili njihovim kombinacijama.
[0132] Kako je upotrebljen ovde, termin "ćelija proizvođač" se odnosi na ćeliju koja se koristi za generisanje EV, npr., egzozoma. Ćelija proizvođača može biti ćelija kultivisana in vitro, ili ćelija in vivo. Ćelija proizvođača uključuje, ali se ne ograničava na, ćeliju za koju se zna da je efikasna u generisanju EVs, npr. egzozoma, npr. HEK293 ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) i mezenhimalne matične ćelije (MSCs), BJ humane ćelije fibroblasta prepucijuma, fHDF fibroblastne ćelije, AGE.HN® neuronske prekursorske ćelije, CAP® amniocitne ćelije, adipozne mezenhimalne matične ćelije, RPTEC/TERT1 ćelije. U određenim aspektima, ćelija proizvođač nije ćelija koja predstavlja antigen. U nekim aspektima, ćelija proizvođač nije dendritska ćelija, B ćelija, mastocita, makrofag, neutrofil, Kupffer-Browicz ćelija, ćelija izvedena iz bilo koje od ovih ćelija, ili bilo koja njihova kombinacija.
[0133] Kako su upotrebljeni ovde, termini "izolovati", "izolovani" i "koji se izoluje" ili "pročistiti", "pročišćeni" i "koji je pročišćen", kao i "ekstrahovan" i "koji je ekstrahovan" i njihove gramatičke varijante se koriste naizmenično i odnose se u stanje pripreme (npr. veći broj poznatih ili nepoznatih količina i/ili koncentracija) željenih EVs, npr. egzozoma, koji su prošli jedan ili više postupaka prečišćavanja, npr. selekciju ili obogaćivanje željenog EV, npr. egzozoma, pripremom. U nekim primerima izvođenja, izolovanje ili prečišćavanje kako je uporebljeno ovde je postupak uklanjanja, delimičnog uklanjanja (npr., frakcije) EV, npr., egzozoma, iz uzorka koji obuhvata ćelije proizvođače. U nekom primeru izvođenja, izolovana kompozicija EV, npr., egzozoma, nema uočljivu neželjenu aktivnost ili, alternativno, nivo ili količina neželjene aktivnosti je na ili ispod prihvatljivog nivoa ili količine.
[0134] U drugim primerima izvođenja, izolovana kompozicija EV, npr., egzozoma, ima količinu i/ili koncentraciju željenih EVs, npr. egzozoma, na ili iznad prihvatljive količine i/ili koncentracije. U drugim aspektima, izolovana kompozicija EV, npr., egzozoma, je obogaćena u poređenju sa početnim materijalom (npr. preparati ćelija proizvođača) od kojih je kompozicija dobijena. Ovo obogaćivanje može biti najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko
4
40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85% , najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, najmanje oko 99,9%, najmanje oko 99,99%, na najmanje oko 99,999%, najmanje oko 99,9999%, ili više od oko 99,9999% u poređenju sa početnim materijalom.
[0135] U nekim aspektima, izolovani EV, npr., egzozom, preparati su u suštini bez rezidualnih bioloških proizvoda (npr. zagađivača). U nekim aspektima, izolovani EV, npr. egzozom, preparati su oko 100% slobodni, najmanje oko 99% slobodni, najmanje oko 98% slobodni, najmanje oko 97% slobodni, najmanje oko 96% slobodni, najmanje oko 95% slobodni, najmanje oko 94% slobodni, najmanje oko 93% slobodni, najmanje oko 92% slobodni, najmanje oko 91% slobodni ili najmanje oko 90% bez bilo kakve kontaminirajuće biološke materije. Preostali biološki proizvodi mogu uključivati abiotičke materijale (uključujući hemikalije) ili neželjene nukleinske kiseline, proteine, lipide ili metabolite. U određenim aspektima, izolovani preparati EV, npr. egzozoma, su oko 100% slobodni, najmanje oko 99% slobodni, najmanje oko 98% slobodni, najmanje oko 97% slobodni, najmanje oko 96% slobodni, najmanje oko 95% slobodni, najmanje oko 94% slobodni, najmanje oko 93% slobodni, najmanje oko 92% slobodni, najmanje oko 91% slobodni, ili najmanje oko 90% bez bilo kakvih makromolekula, npr. bilo koje nukleinske kiseline, proteina, lipida i/ili ugljenih hidrata. U suštini bez rezidualnih bioloških proizvoda takođe može značiti da kompozicija EV, npr., egzozoma, ne obuhvata ćelije proizvođače koje se mogu detektovati i da detektuju se samo EVs, npr., egzozomi.
[0136] Termin "ekscipijent" ili "nosač" odnosi se na inertnu supstancu koja se dodaje farmaceutskoj kompoziciji da bi se dodatno olakšala primena jedinjenja. Termini „farmaceutski prihvatljivi nosač“, „farmaceutski prihvatljivi ekscipijent“ i njihove gramatičke varijante obuhvataju bilo koja sredstva koje je odobrila regulatorna agencija federalne vlade SAD ili navedene u Farmakopeji SAD za upotrebu kod životinja, uključujući ljude, kao i bilo koji nosač ili razblaživač koji ne izaziva značajnu iritaciju kod subjekta i ne poništava biološku aktivnost i svojstva primenjenog jedinjenja. Uključeni su ekscipijenti i nosači koji su korisni u pripremi farmaceutske kompozicije i generalno su bezbedni, netoksični i poželjni.
[0137] Kako je upotrebljen ovde, termin "korisna nosivost" odnosi se na bilo koji molekul koji može biti pričvršćen za skeletni protein prema ovom otkriću i naknadno usidren za membranu EV, npr., egzozoma, prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, korisna nosivost je pričvršćena za luminalnu površinu membrane EV, npr., egzozom. Termin korisna nosivost obuhvata biološki aktivne molekule, npr. molekule koji mogu imati terapeutski i/ili profilaktički efekat, kao i dijagnostičke molekule. U skladu sa tim, termin korisna nosivost takođe obuhvata grupe koji se mogu detektovati kao što su radionuklidi, fluorescentni molekuli, kontrastna sredstva, oznake ili molekularni entiteti koji se mogu prepoznati pomoću ostatka koji se može detektovati, na primer, ligandi ili oznake.
[0138] Kako je upotrebljen ovde, termin korisni teret je ekvivalentan i zamenljiv sa terminom "teret". Shodno tome, "teretni protein" ili "teretni peptid" se odnose na specifične tipove molekula korisne nosivosti (proteina i peptida, respektivno) pričvršćenih za skeletni protein prema ovom otkriću.
[0139] Termin "biološki aktivan molekul" kako je upotrebljen ovde odnosi se na bilo koji molekul koji može biti vezan za EV, na primer, egzozom, preko skeletnog proteina prema ovom otkriću pri čemu molekul može imati terapeutski ili profilaktički efekat kod subjekta kome je to potrebno, ili utiču na homeostazu ćelije ili tkiva kod subjekta. Neograničavajući primeri biološki aktivnih molekula koji se mogu uvesti u EV, na primer, egzozom i/ili ćeliju proizvođača uključuju, na primer, terapeutska sredstva kao što su nukleotidi (npr. nukleotidi koji sadrže deo koji se može detektovati ili toksin ili koji ometaju transkripciju), nukleinske kiseline (npr. DNK ili mRNK molekuli koji kodiraju polipeptid kao što je enzim, ili molekuli RNK koji imaju regulatornu funkciju kao što su miRNK, dsDNK, lncRNK i siRNK), aminokiseline (npr. aminokiseline koje sadrže deo koji se može detektovati ili toksin ili koji ometaju translaciju), polipeptide (npr. enzime ili antitela), lipide, ugljene hidrate, viruse i virusne čestice (npr. adeno-povezani virusi i virusne čestice, retroviruse, adenoviruse, itd.) i male molekule (npr. lekovi sa malim molekulima i toksini), uključujući agoniste STING sa malim molekulima uključujući ciklične dinukleotide kao što su ML-RR S2 i 3'-3' cAIMPdFSH). U određenim aspektima, korisna nosivost sadrži antigen. U određenim aspektima, biološki aktivni molekul, npr., terapeutsko sredstvo, npr. terapeutsko sredstvo za čoveka, zadržava biološku funkciju, npr. terapeutsku funkciju, kada je fuzionisan sa skeletnim proteinom koji je ovde otkriven. U nekim aspektima, biološki aktivni molekul može imati najmanje 5 aminokiselina, najmanje 6 aminokiselina, najmanje 7 aminokiselina, najmanje 8 aminokiselina, najmanje 9 aminokiselina, najmanje 10 aminokiselina, najmanje 15 aminokiselina. kiseline, najmanje 20 aminokiselina, najmanje 25 aminokiselina, najmanje 30 aminokiselina, najmanje 35 aminokiselina, najmanje 40 aminokiselina, najmanje 45 aminokiselina, najmanje 50 aminokiselina, najmanje 55 aminokiselina, najmanje 60 aminokiselina, najmanje 65 aminokiselina, najmanje 70 aminokiselina, najmanje 75 aminokiselina, najmanje 100 aminokiselina, najmanje 150 aminokiselina, najmanje 200 aminokiselina, najmanje 250 aminokiselina, najmanje 300 aminokiselina, najmanje 350 aminokiselina, najmanje 400 aminokiselina ili najmanje 500 aminokiselina. U nekim aspektima, biološki aktivni molekul može imati najmanje 5 aminokiselina. U nekim aspektima, biološki aktivni molekul može imati najmanje 10 aminokiselina. U nekim aspektima, biološki aktivni molekul može imati najmanje 50 aminokiselina. U nekim aspektima, biološki aktivni molekul može imati najmanje 100 aminokiselina. U nekim aspektima, biološki aktivni molekul može imati najmanje 5 aminokiselina, npr. 5-500, 5-450, 5-400, 5-350, 5-300, 5-250, 5-200, 5-150, 5-100, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, ili 5-10 aminokiselina. U nekim aspektima, biološki aktivni molekul može imati najmanje 10 aminokiselina, npr. 10-500, 10-450, 10-400, 10-350, 10-300, 10-250, 10-200, 10-150, 10-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, ili 10-15 aminokiselina. U nekim aspektima, biološki aktivni molekul može imati najmanje 50 aminokiselina, npr.50-500, 50-450, 50-400, 50-350, 50-300, 50-250, 50-200, 50-150, 50-100, 50-90, 50-80, 50-50, ili 50-60 aminokiselina. U nekim aspektima, biološki aktivni molekul može imati najmanje 100 aminokiselina, npr. 100-500, 100-450, 100-400, 100-350, 100-300, 100-250, 100-200, ili 100-150 aminokiselina. U drugim aspektima, biološki aktivni molekul ima najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje deset, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 25, najmanje 30, najmanje 35, najmanje 40, najmanje 45, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90 , najmanje 100, najmanje 110, najmanje 120, najmanje 130, najmanje 140, najmanje 150, najmanje 160, najmanje 170, najmanje 180, najmanje 190, najmanje 200, najmanje 300, najmanje 400, ili najmanje 500 nukleotida. U drugim aspektima, biološki aktivni molekul ima najmanje dva nukleotida, npr.2-1000, 2-900, 2-500, 2-300 ili 2-50. U drugim aspektima, biološki aktivni molekul ima najmanje 10 nukleotida, npr. 10-1000, 10-900, 10-500, 10-300 ili 10-50. U drugim aspektima, biološki aktivni molekul ima najmanje 15 nukleotida, npr. 15-1000, 15-900, 15-500, 15-300 ili 15-50. U drugim aspektima, biološki aktivni molekul ima najmanje 20 nukleotida, npr. 20-1000, 20-900, 20-500, 20-300 ili 20-50. U drugim aspektima, biološki aktivni molekul ima najmanje 50 nukleotida, npr. 50-1000, 50-900, 50-500, 50-300 ili 50-100.. U drugim aspektima, biološki aktivni molekul ima najmanje 100 nukleotida, npr. 100-10000, 100-9000, 100-5005, 100-3000 ili 100-500. U drugim aspektima, biološki aktivni molekul ima najmanje 200 nukleotida, npr. 200-10000, 200-9000, 200-5000, 200-3000 ili 200-500. U drugim aspektima, biološki aktivni molekul ima najmanje 500 nukleotida, npr. 500-10000, 500-9000, 500-5000 ili 500-
4
3000. Kako je upotrebljen ovde, termin "antigen" se odnosi na bilo koje sredstvo koje kada se uvede u subjekat izaziva imuni odgovor (ćelijski ili humoralni). U nekim aspektima, molekuli korisne nosivosti su kovalentno povezani sa EV, na primer, egzozom. U drugim aspektima, korisna nosivost sadrži ađuvant.
[0140] "Rekombinantni" polipeptid ili protein se odnosi na polipeptid ili protein proizveden pomoću tehnologije rekombinantne DNK. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini eksprimirani u konstruisanim ćelijama domaćinima smatraju se izolovanim u svrhu ovog otkrića, kao i prirodni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni bilo kojom pogodnom tehnikom. Polipeptidi koji su ovde otkriveni mogu se rekombinantno proizvesti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici. Alternativno, proteini i peptidi koji su ovde otkriveni mogu se hemijski sintetizovati. U nekim aspektima ovog otkrića, skeletni proteini prisutni u EVs, na primer, egzozomima, se rekombinantno proizvode prekomernom ekspresijom skeletnog proteina u ćelijama proizvođačima, tako da su nivoi skeletnih proteina u nastalim EVs, npr., egzozomima značajno povećani u odnosu na na nivoe skeletnih proteina prisutnih u EVs, npr. egzozomima, ćelija proizvođača koje ne eksprimiraju prekomerno takve skeletne proteine.
[0141] Kako su upotrebljeni ovde, termini "usidriti" ili "koji usidrava" biološki aktivni molekul na luminalnoj ili spoljašnjoj površini EV (npr. egzozoma) prema ovom otkriću preko skeletnog proteina odnose se na kovalentno vezivanje biološki aktivnog molekula na deo molekula skeletnog proteina koji se nalazi na luminalnoj ili spoljašnjoj površini EV (npr. egzozoma), respektivno.
[0142] Termini "povezani", "povezanost" i njihove gramatičke varijante se koriste naizmenično i odnose se na prvi deo, npr., prvu aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu, kovalentno ili nekovalentno spojenu sa drugim delom, npr. drugom sekvencom aminokiselina ili sekvencom nukleotida, respektivno. Prvi deo može biti direktno spojen ili postavljen uz drugi deo ili alternativno interventni deo može kovalentno da spoji prvi deo sa drugim delom. U nekim primerima izvođenja, termin "povezani" uključuje miristoilaciju, jonsku interakciju ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0143] Termin "spojen" ili "fuzionisan" kako je upotrebljen ovde odnosi se na fuziju prvog dela sa drugim delom na C-kraju ili N-kraju pomoću peptidne veze ili linkera jedne ili više aminokiselina. Termin "spojen" ili "fuzionisan" takođe uključuje umetanje celog prvog dela (ili drugog dela) u, npr., između bilo koje dve tačke, npr. aminokiseline, u drugom delu (ili prvom delu, respektivno) . U jednom aspektu, prvi deo je spojen sa drugim delom peptidnom vezom ili linkerom. Prvi deo može biti spojen za drugi deo pomoću fosfodiestarske veze ili linkera. Linker može biti peptid ili polipeptid (za polipeptidne lance) ili nukleotid ili nukleotidni lanac (za nukleotidne lance) ili bilo koji hemijski deo (za polipeptidne ili polinukleotidne lance ili bilo koje hemijske molekule). Termin „spojeno“ takođe može biti označen crticom (-). U nekim aspektima, skeletni protein na EV, na primer, egzozom, može biti spojen ili fuzionisan sa korisnom nosivosti, na primer, biološki aktivnim molekulom.
[0144] Kako je upotrebljen ovde, "sisarski subjekt" uključuje sve sisare, uključujući bez ograničenja ljude, domaće životinje (npr. pse, mačke i slično), životinje sa farme (npr. krave, ovce, svinje, konje i slično) i laboratorijske životinje (npr. majmuni, pacovi, miševi, zečevi, zamorci i slično).
[0145] Termini "pojedinac", "subjekat", "domaćin" i "pacijent" i njihove varijante se ovde koriste naizmenično i odnose se na bilo kog subjekta sisara za koga je poželjna dijagnoza, lečenje ili terapija, posebno na ljude. Postupci opisani ovde su primenljivi i na terapiju ljudi i na veterinarsku primenu. U nekim aspektima, subjekt je sisar, a u drugim aspektima subjekt je čovek.
[0146] Kako je upotrebljen ovde, termin "u suštini bez" znači da uzorak koji sadrži EV, npr., egzozome, sadrži manje od 10% makromolekula, npr. zagađivača, prema koncentraciji procenta mase/zapremine (m/v). Neke frakcije mogu obuhvatiti manje od oko 0.001%, manje od oko 0.01%, manje od oko 0.05%, manje od oko 0.1%, manje od oko 0.2%, manje od oko 0.3%, manje od oko 0.4%, manje od oko 0.5 %, manje od oko 0.6%, manje od oko 0.7%, manje od oko 0.8%, manje od oko 0.9%, manje od oko 1%, manje od oko 2%, manje od oko 3%, manje od oko 4%, manje od oko 5%, manje od oko 6%, manje od oko 7%, manje od oko 8%, manje od oko 9%, ili manje od oko 10% (m/v) makromolekula.
[0147] Kako je upotrebljen ovde, termin "makromolekul" označava nukleinske kiseline, egzogene proteine, lipide, ugljene hidrate, metabolite (npr. polimerne metabolite) ili njihovu kombinaciju.
[0148] Kako je upotrebljen ovde, termin "konvencionalni EV protein" označava protein za koji se ranije znalo da je obogaćen u EVs.
[0149] Kako je upotrebljen ovde, termin „konvencionalni EV, npr., egzozomski protein“ označava protein za koji se ranije znalo da je obogaćen u egzozomima, uključujući, ali ne ograničavajući se na CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI proteini za usidravanje, laktadherin LAMP2 i LAMP2B, njegov fragment, ili peptid koji se za njega vezuje. Da ne bi bilo sumnje, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP transporter ili njegov fragment ili varijanta nisu konvencionalne EV, npr., proteini egzozoma.
4
[0150] Kako je upotrebljen ovde, termin "farmaceutska kompozicija" se odnosi na jedno ili više jedinjenja opisanih ovde, kao što je, na primer, EV, kao što je egzozom prema ovom otkriću, pomešan ili izmešan sa, ili suspendovan u jednoj ili više drugih hemijskih komponenti, kao što su farmaceutski prihvatljivi nosači i ekscipijenti. Jedna svrha farmaceutske kompozicije je da olakša primenu preparata EVs, npr., egzozoma, subjektu.
[0151] Termin "polinukleotid" kako je upotrebljen ovde odnosi se na polimere nukleotida bilo koje dužine, uključujući ribonukleotide, deoksiribonukleotide, njihove analoge ili njihove smeše. Ovaj termin se odnosi na primarnu strukturu molekula. Dakle, termin uključuje trostruku, dvolančanu i jednolančanu deoksiribonukleinsku kiselinu („DNK“), kao i trostruku, dvostruku i jednolančanu ribonukleinsku kiselinu („RNK“). Takođe uključuje modifikovane, na primer alkilacijom, i/ili “capping”, i nemodifikovane oblike polinukleotida. Tačnije, termin "polinukleotid" uključuje polideoksiribonukleotide (koji obuhvataju 2-deoksi-D-ribozu), poliribonukleotide (koji obuhvataju D-ribozu), uključujući tRNK, rRNK, hRNK, siRNK i mRNK, bilo da su spojeni ili nepovezani, bilo koji drugi tip polinukleotida koji je N- ili C-glikozid purinske ili pirimidinske baze, i drugi polimeri koji obuhvataju normukleotidne okosnice, na primer, poliamid (npr. peptidne nukleinske kiseline "PNAs") i polimorfolino polimeri, i drugi polimeri nukleinske kiseline specifične sintetičke sekvence pod uslovom da polimeri obuhvataju nukleobaze u konfiguraciji koja omogućava uparivanje baza i slaganje baza, kao što se nalazi u DNK i RNK. U posebnim aspektima, polinukleotid sadrži mRNK. U drugom aspektu, mRNK je sintetička mRNK. U nekim aspektima, sintetička mRNK sadrži najmanje jednu neprirodnu nukleobazu. U nekim aspektima, sve nukleobaze određene klase su zamenjene neprirodnim nukleobazama (npr. svi uridini u polinukleotidu koji su ovde otkriveni mogu biti zamenjeni neprirodnom nukleobazom, npr. 5-metoksiuridinom). U nekim aspektima prema ovom otkriću, biološki aktivni molekul je polinukleotid.
[0152] Termini "polipeptid", "peptid" i "protein" se ovde koriste naizmenično i odnose se na polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može da sadrži modifikovane aminokiseline. Termini takođe obuhvataju polimer aminokiseline koji je modifikovan prirodnim putem ili intervencijom; na primer, formiranjem disulfidne veze, glikozilacijom, lipidacijom, acetilacijom, fosforilacijom, ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. U definiciju su takođe uključeni, na primer, polipeptidi koji obuhvataju jedan ili više analoga aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline kao što su homocistein, ornitin, pacetilfenilalanin, D-aminokiseline i kreatin), kao i druge modifikacije poznate u tehnici. U nekim aspektima prema ovom otkriću, korisna nosivost, npr., biološki aktivan molekul, vezan
4
za EV, na primer, egzozom, je polipeptid, na primer, antitelo ili njegov derivat kao što je ADC, PROTAC, toksin, fuzioni protein ili enzim.
[0153] Termin "polipeptid", kako je upotrebljen ovde, odnosi se na proteine, polipeptide i peptide bilo koje veličine, strukture ili funkcije. Polipeptidi obuhvataju proizvode gena, polipeptide koji se javljaju u prirodi, sintetičke polipeptide, homologe, ortologe, paraloge, fragmente i druge ekvivalente, varijante i analoge prethodno navedenog. Polipeptid može biti pojedinačni polipeptid ili može biti multi-molekularni kompleks kao što je dimer, trimer ili tetramer. Oni takođe mogu da sadrže jednolančane ili višelančane polipeptide. Najčešće se disulfidne veze nalaze u višelančanim polipeptidima. Termin polipeptid se takođe može primeniti na polimere aminokiselina u kojima su jedan ili više aminokiselinskih ostataka veštački hemijski analog odgovarajuće prirodne aminokiseline. U nekim aspektima, "peptid" može biti kraći ili jednak 50 aminokiselina, npr. dugačak oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina. U nekim aspektima, "peptid" može biti dugačak najmanje oko 2 do oko 50, najmanje oko 3 do oko 50, najmanje oko 4 do oko 50, najmanje oko 5 do oko 50, najmanje oko 10 do oko 50, najmanje oko 15 do oko 50, najmanje oko 20 do oko 50, najmanje oko 25 do oko 50, najmanje oko 30 do oko 50, najmanje oko 35 do oko 50, najmanje oko 40 do oko 50, ili na najmanje oko 45 do oko 50 aminokiselina.
[0154] Kako je upotrebljen ovde, termin "skeletni protein prema ovom otkriću" ili gramatičke varijante se odnose na
(i) protein (prirodno eksprimiran, hemijski ili enzimski sintetizovan ili proizveden rekombinantno) koji se nalazi na luminalnoj površini EVs, npr. egzozoma, kao što su MARCKS, MARKSL1 ili BASP1;
(ii) bilo koji funkcionalni fragment (i);
(iii) bilo koju funkcionalnu varijantu (i)-(ii);
(iv) bilo koji derivat od (i)-(iii);
(v) bilo koji peptid koji odgovara domenu ili njegovoj kombinaciji izvedenom iz proteina u (i) koji se može vezati za luminalnu površinu EVs, npr., egzozoma, ili molekula koji sadrži takav peptid;
(vi) bilo koji peptid izveden iz motiva dobijenog od proteina u (i) koji se može vezati za luminalnu površinu EVs, npr., egzozoma, ili molekula koji sadrži takav peptid; (vii) molekul od (i) do (vi) koji sadrži najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu;
(viii) ili bilo koja njihova kombinacija,
4
koja je pogodna za upotrebu kao skela za ciljanje (pričvršćivanje) korisne nosivosti, npr., biološki aktivnih molekula (npr. terapeutskih proteina) na luminalnu površinu EVs, npr., egzozoma.
[0155] Kako je upotrebljen ovde, termin "EV, npr., egzozom, prema ovom otkriću", ili gramatičke varijante, odnosi se na EV, npr., egzozom, koji sadrži najmanje jedan skeletni protein prema ovom otkriću.
[0156] Kako je upotrebljen ovde, termin "ćelija proizvođač prema ovom pronalasku", ili gramatičke varijante, odnosi se na ćeliju koja može da proizvede EV, npr., egzozom, prema ovom otkriću.
II. Proteini vanćelijske vezikule, npr., proteini egzozoma
[0157] Neki aspekti ovog otkrića se odnose na identifikaciju, upotrebu i modifikaciju EV, npr., proteina egzozoma (skeletni proteini), koji su visoko obogaćeni u luminalnoj površini EV, npr., egzozomima. Takvi proteini EV ili proteini egzozoma (skeletni proteini) mogu se identifikovati analizom visoko prečišćenih EV, na primer, egzozoma, sa masenom spektrometrijom ili drugim postupcima poznatim u tehnici.
[0158] Skeletni proteini prema ovom otkriću uključuju različite luminalne proteine ili membranske proteine, kao što su transmembranski proteini (tj. proteini koji prekrivaju EV membranu kroz jednu ili više transmembranskih spirala), integralne proteine i periferne proteine (tj. proteine na luminalnoj površini koji interaguju sa površinom putem elektrostatičkih interakcija i/ili usidrenih grupa), obogaćene na membranama EV, npr. egzozomu. Konkretno, skeletni proteini prema ovom otkriću uključuju, ali nisu ograničeni na, (1) miristoilovanim alaninom bogat supstrat protein kinaze C (MARCKS);
(2) miristoiliranim alaninom bogat supstrat protein kinaze C poput 1 (MARCKSL1); i (3) protein 1 rastvorljiv u moždanoj kiselini (BASP1).
[0159] Jedan ili više EV, npr., egzozoma, proteina koji su ovde identifikovani (skeletni proteini) mogu se selektivno koristiti u zavisnosti od ćelije proizvođača, uslova proizvodnje, postupaka prečišćavanja ili nameravane primene egzozoma.
[0160] EV, na primer, egzozom, proteini obogaćeni u lumenu (npr. na luminalnoj površini EV membrane) određenih EVs, na primer, egzozomi, sa specifičnim opsegom veličine, ciljanim delom, gustinom naelektrisanja, korisnom nosivosti itd. mogu se identifikovati i koristiti u nekim aspektima prema ovom otkriću.
[0161] U nekim aspektima, više od jednog EV, na primer, egzozom, proteina koji je ovde otkriven (npr. skeletni proteini kao što su MARCKS, MARKSL1, BASP1, bilo koji njihov
4
funkcionalni fragment, varijanta ili derivat, ili bilo koja njihova kombinacija) mogu se koristiti istovremeno ili naknadno za stvaranje i izolaciju terapeutskog EV, npr. egzozoma, prema ovom otkriću.
III. Lumen-konstruisani EVs, npr., ekzozomi
[0162] Vanćelijske vezikule (EVs), na primer, egzozomi, obično imaju prečnik od 20 nm do 1000 nm. Egzozomi, koji su male vanćelijske vezikule, obično imaju 100-200 nm u prečniku. EVs, na primer, egzozomi, sastoje se od ograničavajućeg lipidnog dvosloja i raznovrsnog skupa proteina i nukleinskih kiselina (Maas, S.L.N., et al., Trends. Cell Biol. 27(3):172-188 (2017)). EVs, na primer, egzozomi, pokazuju preferencijalno usvajanje u diskretnim tipovima ćelija i tkivima, a njihov tropizam se može usmeriti dodavanjem proteina na njihovu površinu koji stupaju u interakciju sa receptorima na površini ciljanih ćelija (Alvarez-Erviti, L., et al., Nat. Biotechnol.29(4):341-345 (2011)).
[0163] Za razliku od antitela, EVs, na primer, egzozomi, mogu da prime veliki broj molekula vezanih za njihovu površinu, od hiljada do desetina hiljada molekula po EV, na primer, egzozomu. Konjugati ili kompleksi koji se sastoje od EVs, na primer, egzozoma, i korisne nosivosti, na primer, biološki aktivnih molekula (npr. terapeutskih molekula), tako predstavljaju platformu za isporuku visoke koncentracije terapeutskog ili dijagnostičkog jedinjenja diskretnim tipovima ćelija, dok istovremeno ograničavaju ukupnu sistemsku izloženost jedinjenju, što zauzvrat smanjuje toksičnost van ciljanog delovanja. Štaviše, EVs, na primer, egzozomi, nude mogućnost smeštanja višestruke korisne nosivosti, na primer, biološki aktivnih molekula, u različitim odeljcima. Na primer, EV, na primer, egzozom, može da sadrži, na primer, ciljane grupe koje su pričvršćene za spoljašnju površinu EVs koje bi usmerile EV na određenu ciljanu ćeliju (npr. ćeliju kancera) ili ciljano tkivo (npr. jetra ili mozak), jedna ili više terapijskih grupa (npr. lekovi), i/ili jedan ili više grupa koje se mogu detektovati (npr. kontrastni reagensi ili radionuklidi).
[0164] EV, na primer, egzozom, takođe može da sadrži različitu korisnu nosivost, na primer, terapeutske grupe (npr. lekove) i/ili grupe koji se mogu detektovati (npr. kontrastni reagensi ili radionuklidi) pričvršćene za luminalnu površinu EV. Pored toga, EV, npr., egzozom, takođe može da sadrži jedan ili više korisnih nosivosti, npr., biološki aktivnih molekula (npr. terapeutskih sredstava, dijagnostičkih reagenasa, ađuvanata, itd.), u lumenu EV, npr., egzozoma.
4
[0165] Dakle, EVs, na primer, egzozomi, obezbeđuju format isporuke koji kombinuje višestruku korisnu nosivost, na primer, biološki aktivne molekule, sa istim ili različitim ulogama u jednom sredstvu za isporuku, i sa veoma visokom gustinom.
[0166] EVs, na primer, egzozomi, opisani ovde su vanćelijske vezikule sa prečnikom između oko 20-300 nm. U određenim primerima izvođenja, EV, npr., egzozom, prema ovom otkriću ima prečnik između oko 20-290 nm, 20-280 nm, 20-270 nm, 20-260 nm, 20-250 nm, 20-240 nm, 20-230 nm, 20-220 nm, 20-210 nm, 20-200 nm, 20-190 nm, 20-180 nm, 20-170 nm, 20-160 nm, 20-150 nm, 20-140 nm, 20-130 nm, 20-120 nm, 20-110 nm, 20-100 nm, 20-90 nm, 20-80 nm, 20-70 nm, 20-60 nm, 20-50 nm, 20-40 nm, 20-30 nm, 30-300 nm, 30-290 nm, 30-280 nm, 30-270 nm, 30-260 nm, 30-250 nm, 30-240 nm, 30-230 nm, 30-220 nm, 30-210 nm, 30-200 nm, 30-190 nm, 30-180 nm, 30-170 nm, 30-160 nm, 30-150 nm, 30-140 nm, 30-130 nm, 30-120 nm, 30-110 nm, 30-100 nm, 30-90 nm, 30-80 nm, 30-70 nm, 30-60 nm, 30-50 nm, 30-40 nm, 40-300 nm, 40-290 nm, 40-280 nm, 40-270 nm, 40-260 nm, 40-250 nm, 40-240 nm, 40-230 nm, 40-220 nm, 40-210 nm, 40-200 nm, 40-190 nm, 40-180 nm, 40-170 nm, 40-160 nm, 40-150 nm, 40-140 nm, 40-130 nm, 40-120 nm, 40-110 nm, 40-100 nm, 40-90 nm, 40-80 nm, 40-70 nm, 40-60 nm, 40-50 nm, 50-300 nm, 50-290 nm, 50-280 nm, 50-270 nm, 50-260 nm, 50-250 nm, 50-240 nm, 50-230 nm, 50-220 nm, 50-210 nm, 50-200 nm, 50-190 nm, 50-180 nm, 50-170 nm, 50-160 nm, 50-150 nm, 50-140 nm, 50-130 nm, 50-120 nm, 50-110 nm, 50-100 nm, 50-90 nm, 50-80 nm, 50-70 nm, 50-60 nm, 60-300 nm, 60-290 nm, 60-280 nm, 60-270 nm, 60-260 nm, 60-250 nm, 60-240 nm, 60-230 nm, 60-220 nm, 60-210 nm, 60-200 nm, 60-190 nm, 60-180 nm, 60-170 nm, 60-160 nm, 60-150 nm, 60-140 nm, 60-130 nm, 60-120 nm, 60-110 nm, 60-100 nm, 60-90 nm, 60-80 nm, 60-70 nm, 70-300 nm, 70-290 nm, 70-280 nm, 70-270 nm, 70-260 nm, 70-250 nm, 70-240 nm, 70-230 nm, 70-220 nm, 70-210 nm, 70-200 nm, 70-190 nm, 70-180 nm, 70-170 nm, 70-160 nm, 70-150 nm, 70-140 nm, 70-130 nm, 70-120 nm, 70-110 nm, 70-100 nm, 70-90 nm, 70-80 nm, 80-300 nm, 80-290 nm, 80-280 nm, 80-270 nm, 80-260 nm, 80-250 nm, 80-240 nm, 80-230 nm, 80-220 nm, 80-210 nm, 80-200 nm, 80-190 nm, 80-180 nm, 80-170 nm, 80-160 nm, 80-150 nm, 80-140 nm, 80-130 nm, 80-120 nm, 80-110 nm, 80-100 nm, 80-90 nm, 90-300 nm, 90-290 nm, 90-280 nm, 90-270 nm, 90-260 nm, 90-250 nm, 90-240 nm, 90-230 nm, 90-220 nm, 90-210 nm, 90-200 nm, 90-190 nm, 90-180 nm, 90-170 nm, 90-160 nm, 90-150 nm, 90-140 nm, 90-130 nm, 90-120 nm, 90-110 nm, 90-100 nm, 100-300 nm, 110-290 nm, 120-280 nm, 130-270 nm, 140-260 nm, 150-250 nm, 160-240 nm, 170-230 nm, 180-220 nm ili 190-210 nm. Veličina EV, npr., egzozoma, koja je ovde opisana, može se meriti prema postupcima opisanim, infra.
[0167] U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, prema ovom pronalasku sabrži bi-lipidnu membranu („EV, npr. egzozom, membrana“), koja sadrži unutrašnju površinu i spoljašnju površinu. U određenim primerima izvođenja, unutrašnja površina je okrenuta ka unutrašnjem jezgru (tj., lumenu) EV, npr., egzozomu. U određenim aspektima, spoljašnja površina može biti u kontaktu sa endozomom, multivezikularnim telima ili membranom/citoplazmom ćelije proizvođača ili ciljane ćelije.
[0168] U nekim aspektima, membrana EV, npr., egzozom, sadrži lipide i masne kiseline. U nekim aspektima, membrana EV, npr. egzozoma, sadrži fosfolipide, glikolipide, masne kiseline, sfingolipide, fosfogliceride, sterole, holesterol i fosfatidilserine.
[0169] U nekim aspektima, membrana EV, npr., egzozoma, obuhvata unutrašnji i spoljašnji sloj. Kompozicija unutrašnjeg i spoljašnjeg sloja može se odrediti analizama transdvoslojne distribucije poznatim u tehnici, videti, npr., Kuypers et al., Biohim Biophys Acta 1985 819:170. U nekim aspektima, kompozicija spoljašnjeg sloja je između približno 70-90% holin fosfolipida, između približno 0-15% kiselih fosfolipida i između približno 5-30% fosfatidiletanolamina. U nekim aspektima, kompozicija unutrašnjeg sloja je između približno 15-40% holin fosfolipida, između približno 10-50% kiselih fosfolipida i između približno 30-60% fosfatidiletanolamina.
[0170] U jednom aspektu, ovo otkriće se odnosi na generisanje i upotrebu lumenkonstruisanih EVs, npr., egzozoma. Lumen-konstruisani egzozomi imaju unutrašnji prostor (luminalnu površinu EVs) modifikovan u svojim kompozicijama, na primer, modifikovan u odnosu na kompozicije egzozoma koje se nalaze u prirodi. Na primer, kompozicija luminalne površine može se modifikovati promenom sadržaja proteina, lipida ili glikana u komponentama luminalne strane membrane EV, na primer, egzozoma. U nekim aspektima, luminalne površine EVs, na primer, egzozoma, može sadržati jedan ili više rekombinantno eksprimiranih proteina, na primer, skeletni proteini prema ovom otkriću, npr., protein lumena egzozoma, koji nisu prirodni za EVs, npr. egzozome. Shodno tome, ovo otkriće obezbeđuje kompozicije koje omogućavaju usidravanje korisne nosivosti, npr., biološki aktivnog molekula, za EV, na primer, egzozom, koji sadrži spajanje korisne nosivosti, npr., biološki aktivnog molekula, za skeletni protein, npr. protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću. Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupak usidrenja korisne nosivosti, npr., biološki aktivnog molekula, za EV, npr., egzozom, koji sadrži spajanje biološki aktivnog molekula sa skeletnim proteinom, npr., proteinom lumena egzozoma, prema ovom otkriću.
[0171] U nekim aspektima, skeletni proteini, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću su vezani za luminalnu površinu EV, npr., egzozoma, putem lipidacije. U nekim
1
aspektima, skeletni protein prema ovom otkriću je masno acilovan. U nekim aspektima, skeletni protein je miristoiliran.
[0172] Miristoilacija je modifikacija lipidacije gde je miristoil grupa, izvedena iz miristinske kiseline, kovalentno vezana amidnom vezom za alfa-amino grupu N-kraja glicina. Miristinska kiselina je zasićena masna kiselina sa 14 ugljenika (14:4) sa sistematskim nazivom ntetradekanska kiselina. Ova modifikacija se može dodati ili ko-translaciono ili posttranslaciono. Tokom ko-translacionog dodavanja miristoil grupe, N-kraj glicina je modifikovan nakon cepanja N-kraja ostatka metionina u novoformiranom polipeptidu koji raste. Ovo se dešava u približno 80% miristoiliranih proteina. Post-translaciona miristoilacija se obično dešava nakon događaja cepanja kaspazom što dovodi do izlaganja unutrašnjeg ostatka glicina, koji bi tada bio dostupan za dodavanje miristinske kiseline. Pored kotranslacione ili post-translacione miristoilacije (sprovođenje bilo in vivo ili in vitro, npr. enzimski), miristoilacija skeletnog proteina, npr. proteina lumena egzozoma, prema ovom otkriću takođe može da se desi putem hemijske sinteze, npr., dodavanjem, kao sintetičkog koraka, miristinske kiseline u skeletni protein tokom hemijske sinteze.
[0173] U nekim primerima izvođenja, lipidno usidrenje za biološke membrane nije palmitoilacija (tj. vezivanje palmitinske kiseline, generalno za cistein i ređe za serin ili treonin). U drugim primerima izvođenja, lipidno usidrenje za biološke membrane je prenilacija (vezivanje prenil grupa) ili glikozilfosfatidilinozitol-spajanje (GPI-spajanje). Prenilovani proteini su proteini sa kovalentno vezanim hidrofobnim polimerima izoprena (tj. razgranati petougljenični ugljovodonik) na cisteinskim ostacima proteina. GPI-spojeni proteini su vezani za GPI kompleksnu molekularnu grupu preko amidnog spajanja za C-kraj karboksilne grupe proteina. Vezivanje GPI nastaje delovanjem kompleksa GPI-transamidaze. Lanci masnih kiselina fosfatidilinozitola se ubacuju u membranu i tako su ono što usidruje protein za membranu.
[0174] U nekim primerima izvođenja, lumen-konstruisani EVs, npr., egzozomi, se generišu hemijskim i/ili fizičkim postupcima, kao što je PEG-indukovana fuzija i/ili ultrazvučna fuzija.
[0175] U drugim primerima izvođenja, lumen-konstruisani EVs, npr., egzozomi, su generisani genetičkim inženjeringom. Egzozomi proizvedeni iz genetički modifikovane ćelije proizvođača ili potomstva genetički modifikovane ćelije mogu da obuhvate modifikovane kompozicije lumena. U nekim primerima izvođenja, lumen-konstruisani EVs, npr. egzozomi, imaju EV, npr. egzozom, protein (npr. skeletni protein, npr. protein lumena egzozoma, kao što su MARCKS, MARKSL1, BASP1 ili njihova kombinacija) na veću ili manju gustinu ili
2
uključuju modifikaciju ili fragment proteina EV, npr. egzozoma, (npr. bilo koji funkcionalni fragment, varijantu ili njegov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju).
[0176] Na primer, lumen-konstruisani EVs, npr. egzozomi, mogu se proizvesti iz ćelije transformisane egzogenom sekvencom koja kodira EV, npr. egzozom, proteinom ili modifikacijom ili fragmentom EV, npr. egzozoma, proteinom (npr. skeletni protein, npr. protein lumena egzozoma, kao što su MARCKS, MARKSL1, BASP1, bilo koji njegov funkcionalni fragment, varijanta ili derivat, ili bilo koja njihova kombinacija). EVs, npr., egzozomi, uključujući proteine eksprimirane iz egzogene sekvence, mogu uključivati modifikovane kompozicije proteina na luminalnoj površini (skeletni protein).
[0177] Razne modifikacije ili fragmenti EV proteina, npr., protein egzozoma (npr. skeletni protein, npr. protein lumena egzozoma, kao što su MARCKS, MARKSL1, BASP1, bilo koji njegov funkcionalni fragment, varijanta ili derivat, ili bilo koja njihova kombinacija), može se koristiti za primere izvođenja prema ovom otkriću. Na primer, mogu se koristiti proteini modifikovani da budu sa efikasnijim ciljanim delovanjem na luminalnoj površini EV, na primer, egzozomu. Takođe se mogu koristiti proteini modifikovani da sadrže minimalni fragment potreban za specifično i efikasno ciljano delovanje na luminalnoj površini EV, na primer, egzozomu.
[0178] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću sadrži MARCKS protein, ili njegov fragment, varijantu ili derivat. MARCKS protein (Uniprot accession no. P29966) je takođe poznat kao supstrat protein kinaze C, protein od 80 kDa, laki lanac. Humani MARCKS protein pune dužine ima dužinu od 332 aminokiseline i sadrži domen koji se vezuje za kalmodulin na aminokiselinskim ostacima 152-176. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein prema ovom otkriću sadrži zreli MARCKS protein (tj., bez N-kraja metionina). U nekim aspektima, skeletni protein prema ovom otkriću je izveden iz zrelog MARCKS proteina, tj. to je fragment, varijanta ili derivat zrelog MARCKS proteina i stoga mu nedostaje N-terminalni metionin prisutan u nezrelom proteinu.
[0179] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću sadrži MARCKSL1 protein (Uniprot accession no. P49006) je takođe poznat kao protein 1 sličan MARCKS i supstrat C kinaze bogat alaninom bogatim makrofagom. Humani MARCKSL1 protein pune dužine ima dužinu od 195 aminokiseline. MARCKSL1 protein ima efektorski domen koji se vezuje za lipide i kalmodulin na aminokiselinskim ostacima 87-110. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein prema ovom otkriću sadrži zreli MARCKSL1 protein (tj., bez N-kraja metionina). U nekim aspektima, skeletni protein prema ovom otkriću je izveden iz zrelog MARCKSL1 proteina, tj. to je fragment, varijanta ili derivat zrelog MARCKSL1 proteina i stoga mu nedostaje N-terminalni metionin prisutan u nezrelom proteinu.
[0180] U nekim aspektima, skeletni protein prema ovom otkriću sadrži BASP1 protein (Uniprot accession number P80723), takođe poznat kao kiseli protein obogaćen neuronskim tkivom od 22 kDa ili protein neuronske aksonalne membrane NAP-22. Humana BASP1 proteinska sekvenca pune dužine (izomer 1) je dugačka 227 aminokiselina. Izomeru koji je proizveden alternativnim spajanjem nedostaju aminokiseline 88 do 141 iz izomera 1. U nekim primerima izvođenja, skeletni protein, na primer, protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću sadrži zreli BASP1 protein (tj., bez N-kraja metionina) . U nekim aspektima, skeletni protein prema ovom otkriću je izveden iz zrelog BASP1 proteina, tj. to je fragment, varijanta ili derivat zrelog BASP1 proteina i stoga mu nedostaje N-terminalni metionin prisutan u nezrelom proteinu.
[0181] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću sadrži "N-kraj domena" (ND) i "efektorski domen", pri čemu su ND i/ili ED povezani sa luminalnom površinom. EV, na primer, egzozoma. Kako je upotrebljen ovde, termin "povezan sa" odnosi se na interakciju između skeletnog proteina prema ovom otkriću sa luminalnom površinom EV, npr., egzozoma, koja ne uključuje kovalentno spajanje sa komponentom membrane. Na primer, skeletni proteini prema ovom otkriću mogu biti povezani sa luminalnom površinom EV, na primer, preko lipidnog usidravanja (npr. miristinska kiselina), i/ili polibazičnog domena koji elektrostatički reaguje sa negativno naelektrisanom glavom membranskih fosfolipida. U drugim aspektima, skeletni protein sadrži N-kraj domena (ND) i efektorskog domena (ED), pri čemu je ND povezan sa luminalnom površinom EV, a ED je povezan sa luminalnom površinom EV pomoću jonske interakcije, pri čemu ED sadrži najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, ili najmanje sedam susednih lizina (Lys) u sekvenci.
[0182] U drugim aspektima, ED dalje sadrži jedan ili više regiona niske složenosti, na primer, PEST motiv. PEST sekvenca je peptidna sekvenca koja je bogata prolinom (P), glutaminskom kiselinom (E), serinom (S) i treoninom (T). U nekim aspektima, ED dalje sadrži negativno naelektrisane ostatke (na primer, Glu) i mnogo Ser i Thr koji prolaze kroz fosforilaciju (dakle, oba dodaju negativno naelektrisanje oblastima van ED).
[0183] U nekim aspektima, ND je povezan sa luminalnom površinom EV, na primer, egzozomom, preko lipidacije, na primer, preko miristoilacije. U nekim primerima izvođenja, ND ima Gly na N-kraju. U nekim primerima izvođenja, N-kraj Gly je miristoiliran. U nekim
4
aspektima, ND ne sadrži Met na N-kraju. U drugim primerima izvođenja, ND sadrži Gly, koji je miristoiliran, i ne sadrži Met na N-kraju.
[0184] U nekim aspektima, ED je povezan sa luminalnom površinom EV, na primer, egzozoma, jonskom interakcijom. U nekim primerima izvođenja, ED je povezan sa luminalnom površinom EV, na primer, egzozoma, elektrostatičkom interakcijom, posebno atraktivnom elektrostatičkom interakcijom.
[0185] U nekim aspektima, ED sadrži (i) baznu aminokiselinu (npr. lizin), ili (ii) dve ili više baznih aminokiselina (npr. lizin) jednu pored druge u polipeptidnoj sekvenci. U nekim aspektima, bazna aminokiselina je lizin (Lys; K), arginin (Arg, R) ili Histidin (His, H). U nekim primerima izvođenja, bazna aminokiselina je (Lys)n, pri čemu je n ceo broj između 1 i 10.
[0186] U drugim aspektima, ED sadrži najmanje lizin, a ND sadrži lizin na C-kraju ako je N-kraj ED direktno spojen za lizin na C-kraju ND, tj., lizin je u N-kraju ED i fuzionisan je sa lizinom u C-kraju ND. U drugim primerima izvođenja, ED sadrži najmanje dva lizina, najmanje tri lizina, najmanje četiri lizina, najmanje pet lizina, najmanje šest lizina ili najmanje sedam lizina kada je N-kraj ED spojen za C -kraj ND pomoću linkera, npr. jedne ili više aminokiselina.
[0187] U nekim aspektima, ED sadrži K, KK, KKK, KKKK (SEQ ID BR: 151), KKKKK (SEQ ID BR: 152) ili bilo koju njihovu kombinaciju. Ovo otkriće takođe obezbeđuje da se u nekim aspektima ponavljanja lizina mogu zameniti argininima. U drugim aspektima, ponavljanja arginina u ED ili u skeletnim proteinima obezbeđuju nižu efikasnost opterećenja u poređenju sa efikasnošću lizina.
[0188] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, koji je koristan za ovo otkriće zahteva najmanje dva lizina ili najmanje tri lizina, koji se ponavljaju u sekvenci u ED ili u ED zajedno sa ND, tj, lizin na C-kraju ND i K u N-kraju ED. U nekim primerima izvođenja, ED sadrži K, KK, KKK, KKKK (SEQ ID BR: 151), KKKKK (SEQ ID BR: 152) ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim aspektima, ND sadrži aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u G:X2:X3:X4:X5:X6, pri čemu G predstavlja Gly; pri čemu ":" predstavlja peptidnu vezu, pri čemu svaki od X2 do X6 nezavisno predstavlja aminokiselinu; i pri čemu X6 predstavlja baznu aminokiselinu. U nekim aspektima, X6 aminokiselina je odabrana iz grupe koja se sastoji od Lys, Arg i His. U nekim aspektima, aminokiselina X5 je odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala i Ser. U nekim primerima izvođenja, X2 aminokiselina je odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala i Ser. U nekim aspektima, X4 je odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln i Met. U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži Met na N-kraju, npr. miristoiliran.
[0189] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, sadrži ND i ED, pri čemu ND sadrži aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u G:X2:X3:X4:X5:X6, pri čemu G predstavlja Gly; pri čemu ":" predstavlja peptidnu vezu, pri čemu svaki od X2 do X6 nezavisno predstavlja aminokiselinu; i pri čemu X6 predstavlja baznu aminokiselinu, X5 aminokiselina je odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala i Ser, X4 je odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln i Met, X3 predstavlja aminokiselinu i X2 aminokiselina je odabrana iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala i Ser, pri čemu ED sadrži najmanje jednu aminokiselinu, npr., najmanje jedan Lys, i pri čemu skeletni protein nije (i) aminokiselinska sekvenca koja sadrži SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122-150, ili 180-190 ili (ii) aminokiselinska sekvenca koju kodira SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121.
[0190] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, sadrži N-kraj domena (ND) i efektorski domen (ED), pri čemu ND sadrži aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u G:X2:X3:X4:X5:X6, pri čemu je G glicin, predstavljen kao Gly; pri čemu ":" predstavlja peptidnu vezu, pri čemu svaki od X2 do X6 nezavisno predstavlja aminokiselinu; i pri čemu X6 predstavlja baznu aminokiselinu, i pri čemu je ED spojen sa X6 peptidnom vezom i sadrži najmanje jedan lizin na N-kraju ED. U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži Met na N-kraju, na primer, miristoiliran. U drugim aspektima, skeletni protein ne sadrži ili se ne sastoji od (i) aminokiselinske sekvence koja sadrži SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122 do 150 ili 180 do 190 ili (ii) aminokiselinske sekvence koja je kodirana sa SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121.
[0191] U nekim primerima izvođenja, ND skeletnog proteina, na primer, protein lumena egzozoma, sadrži sekvencu aminokiselina G:X2:X3:X4:X5:X6, pri čemu
a. G predstavlja Gly;
b. ":" predstavlja peptidnu vezu;
c. X2 predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, i Ser;
d. X3 predstavlja bilo koju aminokiselinu;
e. X4 predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln, i Met;
f. X5 predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, i Ser; i
g. X6 predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Lys, Arg, i His.
[0192] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, ne sadrži Met na N-kraju, npr. miristoiliran. U drugim aspektima, skeletni protein ne sadrži ili se sastoji od (i) aminokiselinske sekvence koja sadrži SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122 do 150 ili 180 do 190 ili (ii) aminokiselinske sekvence koju kodira SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121. U nekim aspektima, aminokiselina X3 je odabrana iz grupe koja se sastoji od Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His i Arg.
[0193] U nekim aspektima, ND i ED su spojeni pomoću linkera. U nekim primerima izvođenja, linker sadrži jednu ili više aminokiselina. U nekim aspektima, termin "linker" se odnosi na peptidnu ili polipeptidnu sekvencu (npr., sintetički peptid ili polipeptidnu sekvencu) ili na ne-polipeptid, npr., alkil lanac. U nekim aspektima, dva ili više linkera mogu biti spojena u tandemu. Generalno, linkeri obezbeđuju fleksibilnost ili sprečavaju/popravljaju sterične prepreke. Linkeri se obično ne cepaju; međutim, u određenim aspektima, takavo cepanje može biti poželjno. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, linker može da sadrži jedno ili više mesta koja se mogu cepati proteazom, a koja mogu biti locirana unutar sekvence linkera ili flankirati linker na bilo kom kraju sekvence linkera. Kada su ND i ED spojeni pomoću linkera, ED sadrži najmanje dva lizina, najmanje tri lizina, najmanje četiri lizina, najmanje pet lizina, najmanje šest lizina ili najmanje sedam lizina.
[0194] U nekim aspektima, linker je peptidni linker. U nekim aspektima, peptidni linker može da sadrži najmanje oko dva, najmanje oko tri, najmanje oko četiri, najmanje oko pet, najmanje oko 10, najmanje oko 15, najmanje oko 20, najmanje oko 25, na najmanje oko 30, najmanje oko 35, najmanje oko 40, najmanje oko 45, najmanje oko 50, najmanje oko 55, najmanje oko 60, najmanje oko 65, najmanje oko 70, najmanje oko 75, najmanje oko 80, najmanje oko 85, najmanje oko 90, najmanje oko 95, ili najmanje oko 100 aminokiselina.
[0195] U nekim aspektima, linker je glicin/serin linker. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker je glicin/serin linker prema formuli [(Gly)n-Ser]m gde je n bilo koji ceo broj od 1 do 100, a m je bilo koji ceo broj od 1 do 100. U drugim aspektima, glicin/serinski linker je prema formuli [(Gly)x-Sery]z pri čemu je x ceo broj od 1 do 4, y je 0 ili 1, a z je ceo broj od 1 do 50. U nekim aspektima, peptidni linker sadrži sekvencu Gn, gde n može biti ceo broj od 1 do 100. U nekim aspektima, peptidni linker može da sadrži sekvencu (GlyAla)n, pri čemu je n ceo broj između 1 i 100. U drugim aspektima, peptidni linker može da sadrži sekvencu (GlyGlySer)n, pri čemu je n ceo broj između 1 i 100.
[0196] U nekim aspektima, peptidni linker je sintetički, tj. ne pojavljuje se u prirodi. U jednom primeru izvođenja, peptidni linker uključuje peptide (ili polipeptide) (npr. prirodne ili ne-prirodne peptide) koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja povezuje ili genetički spaja prvu linearnu sekvencu aminokiselina sa drugom linearnom sekvencom aminokiselina za koje nije prirodno vezan ili genetički spojen u prirodi. Na primer, u jednom aspektu peptidni linker može da sadrži polipeptide koji se ne pojavljuju u prirodi koji su modifikovani oblici prirodno prisutnih polipeptida (npr. koji sadrže mutaciju kao što je adicija, supstitucija ili delecija).
[0197] U drugim aspektima, peptidni linker može da sadrži aminokiseline koje se ne pojavljuju u prirodi. U još drugih aspekata, peptidni linker može da sadrži prirodne aminokiseline koje se javljaju u linearnoj sekvenci koja se ne javlja u prirodi. U još nekim aspektima, peptidni linker može da sadrži prirodnu polipeptidnu sekvencu.
[0198] Ovo otkriće takođe obezbeđuje izolovanu vanćelijsku vezikulu (EV), npr., egzozom, koja sadrži biološki aktivan molekul spojen sa skeletnim proteinom, na primer, proteinom lumena egzozoma, pri čemu skeletni protein sadrži ND-ED, pri čemu:
a. ND sadrži G:X2:X3:X4:X5:X6; pri čemu:
i. G predstavlja Gly;
ii. ":" predstavlja peptidnu vezu;
iii. X2 predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, i Ser;
iv. X3 predstavlja bilo koju aminokiselinu;
v. X4 predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Glu, i Met;
vi. X5 predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Pro, Gly, Ala, i Ser;
vii. X6 predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Lys, Arg, i His;
b. "_" predstavlja izborni linker; i
c. ED je efektorski domen koji sadrži (i) najmanje dva susedna lizina (Lys), N kraj lizina spojen za X6 peptidnom vezom ili jednu ili više aminokiselina ili (ii) najmanje jedan lizin, koji je direktno spojen za X6 peptidnom vezom. U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži Met na N-kraju, na primer, miristoiliran. U drugim aspektima, skeletni protein ne sadrži ili se ne sastoji od (i) aminokiselinske sekvence koja sadrži SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122-150 ili 180 do 190 ili (ii) sekvence aminokiselina kodirane sa SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121.
[0199] U nekim aspektima, X2 aminokiselina je odabrana iz grupe koja se sastoji od Gly i Ala.U nekim aspektima, X3 aminokiselina je Lys. U nekim aspektima, X4 aminokiselina je Leu ili Glu. U nekim aspektima, X5 aminokiselina je odabrana iz grupe koja se sastoji od Ser i Ala. U nekim aspektima, X6 aminokiselina je Lys. U nekim aspektima, X2 aminokiselina je Gly, Ala ili Ser; X3 aminokiselina je Lys ili Glu; X4 aminokiselina je Leu, Phe, Ser ili Glu; X5 aminokiselina je Ser ili Ala; i X6 aminokiselina je Lys. U nekim aspektima, - linker sadrži peptidnu vezu ili jednu ili više aminokiselina.
[0200] U nekim aspektima, ED u skeletnom proteinu, na primer, protein lumena egzozoma, sadrži Lys (K), KK, KKK, KKKK (SEQ ID BR: 151), KKKKK (SEQ ID BR: 152), Arg (R), RR, RRR, RRRR (SEQ ID BR: 153); RRRRR (SEQ ID BR: 154), KR, RK, KKR, KRK, RKK, KRR, RRK, (K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (SEQ ID BR: 155) , (K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (SEQ ID BR: 156), ili bilo koja njihova kombinacija.
[0201] U nekim aspektima, skeletni protein, na primer, protein lumena egzozoma, sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u (i) GGKLSKK (SEQ ID BR: 157), (ii) GAKLSKK (SEQ ID BR: 158), (iii) GGKQSKK (SEQ ID BR: 159), (iv) GGKLAKK (SEQ ID BR: 160), ili (v) bilo koja njihova kombinacija. U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima Met na N-kraju sekvence u (i) do (v). U drugim aspektima, skeletni protein ne sadrži ili se sastoji od (i) aminokiselinske sekvence koja sadrži SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118 ili 122-150 ili (ii) aminokiselinske sekvence kodirane SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121.
[0202] U nekim aspektima, ND u skeletnom proteinu, na primer, proteinu lumena egzozoma, sadrži sekvencu aminokiselina od (i) GGKLSK (SEQ ID BR: 203), (ii) GAKLSK (SEQ ID BR: 204), (iii) GGKQSK (SEQ ID BR: 205), (iv) GGKLAK (SEQ ID BR: 206), ili (v) bilo koju njihovu kombinaciju i ED u skeletnom protein sadrži (a) K, (b) KK, (c) KKK, (d) KKKG (SEQ ID BR: 207), (e) KKKGY (SEQ ID BR: 208), (f) KKKGYN (SEQ ID BR: 209), (g) KKKGYNV (SEQ ID BR: 210), (h) KKKGYNVN (SEQ ID BR: 211), (i) KKKGYS (SEQ ID BR: 212), (k) KKKGYG (SEQ ID BR: 213), (1) KKKGYGG (SEQ ID BR: 214), (m) KKKGS (SEQ ID BR: 215), (n) KKKGSG (SEQ ID BR: 216), (o) KKKGSG (SEQ ID BR: 217), (p) KKKGSGS (SEQ ID BR: 218), (q) KKKS (SEQ ID BR: 219), (r) KKKSG (SEQ ID BR: 220), (s) KKKSGG (SEQ ID BR: 221), (t) KKKSGGS (SEQ ID BR: 222), (u) KKKSGGSG (SEQ ID BR: 223), (v) KKSGGSGG (SEQ ID BR: 224), (w) KKKSGGSGGS (SEQ ID BR: 225), (x) KRFSFKKS (SEQ ID BR: 226), ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima Met na N-kraju sekvence u (i) do (v). U drugim aspektima, skeletni protein ne sadrži ili se sastoji od (i) aminokiselinske sekvence koja sadrži SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122 do 150 ili 180 do 190 ili (ii) aminokiselinske sekvence kodirane SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121.
[0203] U nekim aspektima, polipeptidna sekvenca skeletnog proteina, npr., proteina lumena egzozoma, prema ovom otkriću sastoji se od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od (i) GGKLSKK (SEQ ID BR: 157), (ii) GAKLSKK (SEQ ID BR: 158), (iii) GGKQSKK (SEQ ID BR: 159), (iv) GGKLAKK (SEQ ID BR: 160), ili (v) bilo koje njihove kombinacije.
[0204] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, sadrži aminokiselinsku sekvencu (i) GGKLSKKK (SEQ ID BR: 161), (ii) GGKLSKKS (SEQ ID BR: 162), (iii) GAKLSKKK (SEQ ID BR: 163), (iv) GAKLSKKS (SEQ ID BR: 164), (v) GGKQSKKK (SEQ ID BR: 165), (vi) GGKQSKKS (SEQ ID BR: 166), (vii) GGKLAKKK (SEQ ID BR: 167), (viii) GGKLAKKS (SEQ ID BR: 168), ili (ix) bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima Met na N-kraju sekvence u (i) do (ix). U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži ili se sastoji od (i) aminokiselinske sekvence koja sadrži SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122 do 150 ili 180 do 190 ili (ii) aminokiselinske sekvence kodirane SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121.
[0205] U nekim aspektima, polipeptidna sekvenca skeletnog proteina, npr., proteina lumena egzozoma, prema ovom otkriću sastoji se od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od (i) GGKLSKKK (SEQ ID BR: 161), (ii) GGKLSKKS (SEQ ID BR: 162), (iii) GAKLSKKK (SEQ ID BR: 163), (iv) GAKLSKKS (SEQ ID BR: 164), (v) GGKQSKKK (SEQ ID BR: 165), (vi) GGKQSKKS (SEQ ID BR: 166), (vii) GGKLAKKK (SEQ ID BR: 167), (viii) GGKLAKKS (SEQ ID BR: 168), i (ix) bilo koje njihove kombinacije.
[0206] U nekim aspektima, skeletni protein, na primer, protein lumena egzozoma, je najmanje oko 8, najmanje oko 9, najmanje oko 10, najmanje oko 11, najmanje oko 12, najmanje oko 13, najmanje oko 14, najmanje oko 15, najmanje oko 16, najmanje oko 17, najmanje oko 18, najmanje oko 19, najmanje oko 20, najmanje oko 21, najmanje oko 22, najmanje oko 23, najmanje oko 24, najmanje oko 25, najmanje oko 26, najmanje oko 27, najmanje oko 28, najmanje oko 29, najmanje oko 30, najmanje oko 31, najmanje oko 32, najmanje oko 33, najmanje oko 34, najmanje oko 35, najmanje oko 36, najmanje oko 37, najmanje oko 38, najmanje oko 39, najmanje oko 39, najmanje oko 40, najmanje oko 41, najmanje oko 42, najmanje oko 43, najmanje oko 44, najmanje oko 50, najmanje oko 46, najmanje oko 47, najmanje oko 48, najmanje oko 49, najmanje oko 50, najmanje oko 55, najmanje oko 60, najmanje oko 65, najmanje oko 70, najmanje oko 75, najmanje oko 80, najmanje oko 85, najmanje oko 90, najmanje oko 95, najmanje oko 100, najmanje oko 105, najmanje oko 110, najmanje oko 115, najmanje oko 120, najmanje oko 125, najmanje oko 130, najmanje oko 135, najmanje oko 140, najmanje oko 145, najmanje oko 150, najmanje oko 155, najmanje oko 160, najmanje oko 165, najmanje oko 170, najmanje oko 175, najmanje oko 180, najmanje oko 185, najmanje oko 190, najmanje oko 195, najmanje oko 200, najmanje oko 205, najmanje oko 210, najmanje oko 215, najmanje oko 220, najmanje oko 225, najmanje oko 230, najmanje oko 235, najmanje oko 240, najmanje oko 245, najmanje oko 250, najmanje oko 255, najmanje oko 260, najmanje oko 265, najmanje oko 270, najmanje oko 275, najmanje oko 280, najmanje oko 285, najmanje oko 290, najmanje oko 295, najmanje oko 300, najmanje oko 305, najmanje oko 310, najmanje oko 315, najmanje oko 320, najmanje oko 325, najmanje oko 330, najmanje oko 335, najmanje oko 340, najmanje oko 345, ili najmanje oko 350 aminokiselina u dužini.
[0207] U nekim aspektima, skeletni protein, na primer, protein lumena egzozoma, je između oko 5 i oko 10, između oko 10 i oko 20, između oko 20 i oko 30, između oko 30 i oko 40, između oko 40 i oko 50, između oko 50 i oko 60, između oko 60 i oko 70, između oko 70 i oko 80, između oko 80 i oko 90, između oko 90 i oko 100, između oko 100 i oko 110, između oko 110 i oko 120, između oko 120 i oko 130, između oko 130 i oko 140, između oko 140 i oko 150, između oko 150 i oko 160, između oko 160 i oko 170, između oko 170 i oko 180, između oko 180 i oko 190, između oko 190 i oko 200, između oko 200 i oko 210, između oko 210 i oko 220, između oko 220 i oko 230, između oko 230 i oko 240, između oko 240 i oko 250, između oko 250 i oko 260, između oko 260. i oko 270, između oko 270 i oko 280, između oko 280 i oko 290, između oko 290 i oko 300, između oko 300 i oko 310, između oko 310 i oko 320, između oko 320 i oko 330, između oko 330 i oko 340, ili između oko 340 i oko 250 aminokiselina u dužini.
[0208] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, sadrži (i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID BR: 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID BR: 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID BR: 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID BR: 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID BR: 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID BR: 178), ili (xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID BR: 179). U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima Met na N-
1
kraju sekvence u (i) do (xi). U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži ili se sastoji od (i) aminokiselinske sekvence koja sadrži SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122 do 150 ili 180 do 190 ili (ii) aminokiselinske sekvence kodirane SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121.
[0209] U nekim aspektima, polinukleotidna sekvenca skeletnog proteina, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću se sastoji od (i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID BR: 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID BR: 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID BR: 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID BR: 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID BR: 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID BR: 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID BR: 178), ili (xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID BR: 179). U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima Met na N-kraju sekvence u (i) do (xi). U nekim aspektima, skeletni protein ne sadrži ili se sastoji od (i) aminokiselinske sekvence koja sadrži SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122 do 150 ili 180 do 190 ili (ii) aminokiselinske sekvence kodirane SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121.
[0210] U drugim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, sadrži bilo koju od sekvenci otkrivenih ovde, ali ne sadrži odgovarajuću sekvencu koja ima Met na N-kraju, npr. SEQ ID BR: 4 do 109. U nekim aspektima, skeletni protein sadrži bilo koju od sekvenci u TABELI 1, ali ne sadrži ili se sastoji od (i) sekvence aminokiselina koja sadrži SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122 do 150 ili 180 do 190 ili (ii) aminokiselinska sekvenca kodirana SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121.
[0211] Neograničavajući primeri skeletnih proteina, npr. proteina lumena egzozoma, korisnih za ovo otkriće, navedeni su u nastavku.
TABELA 1.
2
4
[0212] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću se sastoji ili se u suštini sastoji od bilo koje sekvence u ovom otkriću. U nekim aspektima, skeletni protein prema ovom otkriću se sastoji od sekvence otkrivene u TABELI 1. U nekim aspektima, skeletni protein prema ovom otkriću se sastoji od sekvence koja je ovde otkrivena, npr. sekvenca otkrivena u TABELI 1, kovalentno povezana za membranu usidrenja (npr. miristinska kiselina). U nekim aspektima, usidrenje membrane može da se izvede putem lipidacije. U nekim primerima izvođenja, lipidacija može biti, npr., acilacija masti. U nekim aspektima, acetilacija masti može biti, na primer, miristoilacija. U nekim aspektima, membransko usidrenje je kovalentno vezano za N-kraj aminokiselinske sekvence koja je ovde otkrivena, npr. sekvence otkrivene u TABELI 1. U nekim aspektima, membransko usidrenje je kovalentno vezan glicin za N-kraj sekvence ovde otkrivene, npr. sekvenca otkrivena u TABELI 1. Shodno tome, u nekim aspektima, skeletni protein prema ovom otkriću se sastoji od otkrivene sekvence, npr. sekvence otkrivene u TABELI 1, koja je N-miristoilirana.
[0213] U nekim aspektima, skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću ne obuhvata N-terminalni Met. U nekim aspektima, skeletni protein sadrži lipidiranu aminokiselinu, na primer, miristoilovanu aminokiselinu, na N-kraju skeletnog proteina, koji funkcioniše kao lipidno sidro. U nekim aspektima, aminokiselinski ostatak na N-kraju skeletnog proteina u Gly. Prisustvo N-kraja Gly je uslov za N-miristoilaciju. U nekim aspektima, aminokiselinski ostatak na N-kraju skeletnog proteina je sintetički. U nekim aspektima, aminokiselinski ostatak na N-kraju skeletnog proteina je analog glicina, npr. alilglicin, butilglicin ili propargilglicin.
[0214] U nekim aspektima, lipidno sidro može biti pričvršćeno hemijskom sintezom ili enzimski za bilo koji N-kraj aminokiseline skeletnog proteina prema ovom otkriću.
[0215] U drugim aspektima, lipidno sidro može biti bilo koje lipidno sidro poznato u tehnici, npr., palmitinska kiselina ili glikozilfosfatidilinozitoli. Pod neuobičajenim okolnostima, na primer, korišćenjem medijuma za kulturu gde je miristinska kiselina ograničavajuća, neke druge masne kiseline, uključujući kraće lance i nezasićene, mogu se vezati za N-kraj glicina. Na primer, u BK kanalima, objavljeno je da je miristat post-translaciono vezan za unutrašnje ostatke serina/treonina ili tirozina preko hidroksi estarske veze. Membranska sidra poznata u tehnici su predstavljena u tabeli u nastavku.
TABELA 2
[0216] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein, na primer, protein lumena egzozoma, sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100% identičnosti sekvence sa zrelim oblikom SEQ ID BR: 1 (MARCKS), SEQ ID BR: 2 (MARCKSL1), ili SEQ ID BR: 3 (BASP1), tj. bez N-kraja aminokiseline metionin prisutne u SEQ ID BR: 1, SEQ ID BR: 2 ili SEQ ID BR: 3.
[0217] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein, na primer, protein lumena egzozoma, sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100% identičnosti sekvence sa funkcionalnim fragmentom zrelog oblika SEQ ID BR: 1 (MARCKS), SEQ ID BR: 2 (MARCKSL1), ili SEQ ID BR: 3 (BASP1), tj. bez N-kraja aminokiseline metionin prisutne u SEQ ID BR: 1, SEQ ID BR: 2 ili SEQ ID BR: 3.
[0218] U nekim aspektima, biološki aktivan molekul vezan za skeletni protein prema ovom otkriću nalazi se na luminalnoj strani EV (npr., egzozoma).
[0219] U nekim aspektima, skeletni protein, na primer, protein lumena egzozoma, dalje sadrži transmembranski domen. U nekim aspektima, transmembranski domen je umetnut između ED domena skeletnog proteina, koji se nalazi na luminalnoj strani EV (npr., egzozoma) i korisne nosivosti, na primer, biološki aktivnog molekula. Dakle, korisna nosivost, na primer, biološki aktivan molekul, je usidren za spoljašnju površinu EV (npr., egzozom).
[0220] U nekim aspektima, skeletni protein, na primer, protein lumena egzozoma, dalje obuhvata ekstravezikularni domen. U nekim primerma izvođenja, ekstravezikularni domen je umetnut između transmembranskog domena i biološki aktivnog molekula.
[0221] U nekim aspektima, skeletni protein je vezan za biološki aktivni molekul preko najmanje jednog linkera, na primer, peptidnog linkera. U nekim aspektima, ND je spojen sa ED pomoću linkera koji je direktno umetnut između oba domena. U nekim aspektima, linker sadrži, npr., peptidnu vezu ili jednu od više aminokiselina. U nekim aspektima, linker sadrži linker koji se može cepati. U nekim aspektima, linker sadrži fleksibilni linker. U nekim aspektima, linker sadrži samozapaljivi linker.
[0222] Takođe se mogu koristiti fuzije između skeletnog proteina prema ovom otkriću i biološki aktivnog molekula (npr. molekula koji ima terapeutsku aktivnost). Na primer, fuzioni protein može da sadrži skeletni protein kao što je MARCKS, MARCKSL1, BASP1, ili njegovu modifikaciju, posebno njegov fragment ili varijantu, i korisnu nosivost, npr., biološki aktivan molekul (npr. terapeutski peptid). U nekim aspektima, fuzioni protein sadrži skeletni protein koji sadrži fragment amino kraja BASP1. U nekim aspektima, biološki aktivni molekul sadrži protein, polipeptid, peptid, polinukleotid (DNK i/ili RNK), hemijsko jedinjenje, virus, jonofor, nosač za jonofor, deo koji formira kanal ili pora, ili bilo koja njihova kombinacija.
[0223] Biološki aktivni molekul (npr. terapeutski peptid) može biti odabran iz grupe koja se sastoji od prirodnog peptida, rekombinantnog peptida, sintetičkog peptida, fuzionog proteina ili linkera za terapeutsko jedinjenje. Biološki aktivni molekul (npr. terapeutska jedinjenja) takođe može biti nukleotid, aminokiselina, lipid, ugljeni hidrat ili mali molekul. Biološki aktivni molekul (npr. terapeutski peptid) može biti antitelo, enzim, ligand, antigen (npr. tumorski antigen ili antigen infektivnog sredstva kao što je bakterija, virus, gljiva ili protozoa), receptor, antimikrobni peptid, faktor transkripcije, ili njegov fragment ili njegova modifikacija.
[0224] Fuzioni protein koji sadrži skeletni protein prema ovom otkriću fuzionisan ili konjugovan sa korisnom nosivosti, npr., biološki aktivnim molekulom, može biti vezan za luminalnu površinu EV, npr., egzozoma, i obezbediti, npr., terapeutsku aktivnost za EV, npr. egzozoma.
[0225] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul (npr. terapeutski peptid) je komponenta kompleksa za uređivanje genoma. U nekim primerima izvođenja, pomenuti kompleks za uređivanje genoma je efektorska nukleaza slična aktivatoru transkripcije (TAL-efektorska nukleaza ili TALEN); nukleaza cinkovog prsta (ZFN); rekombinaza; CRISPR/Cas9 kompleks, CRISPR/Cpf1 kompleks, CRISPR/C2c1, C2c2 ili C2c3 kompleks, CRISPR/CasY ili CasX kompleks, ili bilo koji drugi odgovarajući CRISPR kompleks poznat u tehnici; ili bilo koji drugi odgovarajući kompleks za uređivanje genoma poznat u tehnici ili bilo koja njihova kombinacija.
[0226] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul (npr. terapeutski peptid) je transmembranski peptid. Ovde opisani transmembranski peptidi mogu biti eksprimirani kao fuzioni proteini sa bilo kojom od ovde opisanih sekvenci ili bilo kojim njihovim fragmentima ili varijantama. U nekim primerima izvođenja, transmembranski protein ima prvi kraj fuzionisan sa luminalnom sekvencom u lumenu EV, npr., egzozomu, i drugi kraj eksprimiran na površini EV, npr., egzozomu.
[0227] U nekim primerima izvođenja, EV, npr., prema ovom otkriću može da sadrži drugi skeletni protein. U nekim primerima izvođenja, drugi skeletni protein sadrži transmembranski protein koji sadrži PTGFRN polipeptid, BSG polipeptid, IGSF2 polipeptid, IGSF3 polipeptid, IGSF8 polipeptid, ITGB1 polipeptid, ITGA4 polipeptid, SLC3A2 polipeptida, ATP transportnog polipeptida. polipeptida aminopeptidaze N (ANPEP), polipeptid ektonukleotidne pirofosfataze/fosfodiesteraze familje 1 (ENPP1), polipeptid neprilizina (MME), polipeptid neuropilin-1 (NRP1) ili njegov fragment, varijantu ili derivat. Neograničavajući primeri drugog skeletnog proteina mogu se naći u US patentu br. 10,195,290 i PCT publikaciji br. WO 2019/040920.
[0228] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul (npr. terapeutski peptid) je protein koji vezuje nukleinsku kiselinu. U nekim primerima izvođenja, protein koji vezuje nukleinsku kiselinu je Dicer, protein Argonaute, TRBP, MS2 protein omotača bakteriofaga. U nekim primerima izvođenja, protein koji vezuje nukleinsku kiselinu dodatno sadrži jedan ili više RNK ili DNK molekula. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više RNK je miRNK, siRNK, vodeća RNK, lincRNK, mRNK, antisense RNK, dsRNK ili njihove kombinacije.
[0229] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul (npr. terapeutski peptid) je deo sistema interakcije protein-protein. U nekim primerima izvođenja, sistem interakcije proteinprotein sadrži sistem interakcije FRB-FKBP, npr. FRB-FKBP sistem interakcije kao što je opisano u Banaszynski et al., J Am Chem Soc.2005 Apr 6; 127(13):4715-21.
[0230] Fuzioni proteini mogu imati ciljano delovanje na luminalnu površinu EVs, na primer, egzozoma i obezbeđuju terapijsku aktivnost EV, npr., egzozoma.
[0231] U nekim primerima izvođenja, koriste se fuzioni proteini koji imaju ciljano delovanje. Na primer, fuzioni proteini mogu da sadrže (i) skeletne proteine kao što su MARCKS, MARCKSL1, BASP1, ili njihov fragment, varijantu ili modifikaciju i (ii) deo sa ciljanim delovanjem. Deo sa ciljanim delovanjem se može koristiti za ciljano delovanje EV, npr., egzozoma, na određeni organ, tkivo ili ćeliju za lečenje korišćenjem EV, npr., egzozoma. U nekim primerima izvođenja, deo sa ciljanim delovanjem je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.
[0232] Antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen uključuju cela antitela, poliklonska, monoklonska i rekombinantna antitela, njihove fragmente, i dalje uključuju jednolančana antitela, humanizovana antitela, mišja antitela, himerna, mišja-humana, mišjaprimata, primata-humana monoklonska antitela, anti-idiotipska antitela, fragmente antitela, kao što su, na primer, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' i F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb i Fd fragmenti, dijatela, minitela, antitela kamelida i polipeptide koji se odnose na antitela
[0233] Antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen takođe uključuju bispecifična antitela i multispecifična antitela sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost ili funkciju. Modularna arhitektura antitela je iskorišćena za stvaranje više od 60 različitih formata bispecifičnih antitela. Videti Spiess et al. (2015) Molecular Immunology 67:95-106. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, format bispecifičnog antitela je odabran od crossMab, DAF (Dual Action Fab) (dva u jednom), DAF (četiri u jednom), DutaMab, DT-IgG, uobičajenih Knobs-in-holes LC, skupina Knobs-in-holes, Charge pair, razmena Fab-arm, SEEDbody, Triomab, LUZ-Y (bispecifično antitelo sa leukiznim patentnim zatvaračem koje izaziva heterodimerizaciju dva HC), Fcab, Kλ-telo, Orthogonal Fab, DVD-IgG (dualni varijabilni domen IgG), IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V , V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody, DVI-IgG (četiri u jednom), nanotelo, nanotelo-HSA, BiTE (bispecifično angažovanje T ćelija), Diatelo, DART (ponovno ciljano delovanje sa dvostrukim afinitetom), TandAb (tandem antitelo), scDiatelo, scDiatelo-CH3, trostruko telo, miniantitelo, minitelo, TriBi minitelo, scFv -CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-ScFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, Tetravalentno HC Ab, scDiatelo-Fc, Diatelo-Fc, Tandem scFv-Fc, Intratelo, Dock and Locck, ImmTAC, HSAtelo, scDiatelo-HSA, Tandem scFv-Toksin, IgG-IgG, Cov-X-telo i scFv1-PEG-scFV2. Bispecifična antitela mogu biti monospecifična antitela konstruisana za bispecifičnost dodavanjem ili amino ili karboksi krajeva lakih ili teških lanaca sa dodatnim jedinicama za vezivanje antigena. Alternative za ove dodatne jedinice za vezivanje antigena uključuju antitela sa jednim domenom (neuparena VL ili VH), uparene varijabilne domene antitela (npr. Fv ili scFv) ili konstruisane skeletne proteine. Brojni oblici bispecifičnih fragmenata kojima nedostaju neki ili svi konstantni domeni bispecifičnog antitela su poznati u tehnici.
[0234] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul (npr. terapeutski peptid) je fuzioni protein koji sadrži skeletni protein prema ovom otkriću i virusni protein. U nekim primerima izvođenja, virusni protein sadrži virusni kapsid, protein omotača ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, fuzioni proteini omogućavaju sklapanje intaktnih virusa koji se zadržavaju na luminalnoj površini EV, npr., egzozoma.
[0235] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je inhibitor regulatora negativne kontrolne tačke ili inhibitor za partnera za vezivanje regulatora negativne kontrolne tačke. U nekim primerima izvođenja, regulator negativne kontrolne tačke je odabran iz grupe koja se sastoji od: protein 4 povezan sa citotoksičnim T-limfocitom (CTLA-4), protein 1 programirane ćelijske smrti (PD-1), gen 3 aktiviran limfocitima (LAG-3), T-ćelijski imunoglobulin koji obuhvata mucin protein 3 (TIM-3), atenuator B i T limfocita (BTLA), T ćelijski imunoreceptor sa Ig i ITIM domenima (TIGIT), V-domen Ig supresora aktivacije T ćelija (VISTA) , adenozin A2a receptor (A2aR), imunoglobulinu sličan receptor ćelija ubica (KIR), indoleamin 2,3-dioksigenaza (IDO), CD20, CD39 i CD73.
[0236] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je imunogeni protein. U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je toksin, toksoid ili netoksični mutant toksina.
1
U nekim primerima izvođenja, toksin je toksin difterije. U nekim primerima izvođenja, toksoid je toksoid tetanusa. U nekim primerima izvođenja, toksin difterije je netoksični mutant toksina difterije.
[0237] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je aktivator za pozitivan kostimulativni molekul ili aktivator za vezujućeg partnera pozitivnog ko-stimulativnog molekula. U nekim primerima izvođenja, pozitivni ko-stimulativni molekul je član superfamilije TNF receptora odabran iz grupe koja se sastoji od: CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas receptor, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK receptor, TACI, BAFF receptor, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP i XEDAR. U nekim primerima izvođenja, aktivator za pozitivni ko-stimulativni molekul je član superfamilije TNF receptora odabran iz grupe koja se sastoji od: TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB ligand, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR ligand i EDA-2. U nekim primerima izvođenja, pozitivni ko-stimulativni molekul je kostimulativni molekul CD28-superfamilije. U nekim primerima izvođenja, ko-stimulativni molekul CD28-superfamilije je ICOS ili CD28. U nekim primerima izvođenja, aktivator za pozitivni ko-stimulativni molekul je ICOSL, CD80 ili CD86.
[0238] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivan molekul je citokin odabran iz grupe koja se sastoji od: IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 i IL-15. U nekim primerima izvođenja, biološki aktivan molekul je protein koji sadrži T-ćelijski receptor (TCR), T-ćelijski ko-receptor, glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC), humani leukocitni antigen (HLA) ili njihov derivat. U nekim primerima izvođenja, biološki aktivni molekul je protein koji sadrži tumorski antigen. U nekim primerima izvođenja, tumorski antigen je odabran iz grupe koja se sastoji od: alfafetoprotein (AFP), karcinoembrionalni antigen (CEA), epitelni tumorski antigen (ETA), mucin 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucin 16 (MUC16) , tirozinaza, antigen povezan sa melanomom (MAGE), tumorski protein p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligand 1 programirane smrti (PD-L1), ligand 2 programirane smrti (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, mezotelin, VEGFR, alfa-folatni receptor, CE7R, IL-3, antigen kancera testisa, MART-1 gp100 i ligand koji indukuje apoptozu povezan sa TNF.
[0239] U nekim aspektima, fuzioni proteini koji sadrže biološki aktivni molekul i skeletni protein prema ovom otkriću (npr. MARCKS, MARCKSL1, BASP1, bilo koji od SEQ ID BR: 4-109, odgovarajuća sekvenca bez N-kraja M, ili bilo koje sekvence skeletnog proteina koje su ovde otkrivene (npr. Tabela 1), ili njihova modifikacija, posebno njihov fragment ili varijanta), rezultuju obogaćivanjem biološki aktivnog molekula u EVs, npr. egzozomima, u
2
poređenju sa ekspresijom biološki aktivnog molekula kome nedostaje skeletni protein. U nekim aspektima, fuzioni proteini koji sadrže biološki aktivni molekul i skeletni protein prema ovom otkriću (npr. MARCKS, MARCKSL1, BASP1 bez N-kraja M, aminokiselinska sekvenca SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122 do 150 ili 180 do 190 bez N-kraja M, aminokiselinske sekvence kodirane SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121, ili bilo koje sekvence skeletnog proteina otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N- kraja M) dovode do obogaćivanja biološki aktivnog molekula u EVs, na primer, egzozomima, u poređenju sa ekspresijom biološki aktivnog molekula kome nedostaje skeletni protein.
[0240] U nekim primerima izvođenja, skeletni protein koristan za ovo otkriće sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 4-109, odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M, ili bilo koju sekvencu otkrivenu u TABELI 1. U nekim aspektima, skeletni protein koristan za ovo otkriće sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 4-109, pri čemu skeletni protein ne sadrži N-terminalni Met. U nekim aspektima, skeletni protein sadrži sekvencu otkrivenu u Tabeli 1, pri čemu skeletni protein ne sadrži N-terminalni Met. U nekim aspektima, skeletni protein koristan za ovo otkriće sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 bez N-kraja M, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122 do 150 ili 180 do 190 bez N-kraja M, aminokiselinska sekvenca kodirana SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121, ili bilo koja sekvenca skeletnog proteina koja je ovde otkrivena (npr. Tabela 1) bez N-kraja M. U nekim aspektima, skeletni protein koristan za ovo otkriće sadrži MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1, pri čemu skeletni protein ne sadrži N-terminalni Met. U nekim aspektima, skeletni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 4 do 114, 116 do 118, 122 do 150 ili 180 do 190, pri čemu skeletni protein ne sadrži N-terminalni Met. U nekim aspektima, skeletni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu koju kodira SEQ ID BR: 115 ili 118 do 121, pri čemu skeletni protein ne sadrži N-terminalni Met. U drugim primerima izvođenja, skeletni protein koji je koristan za ovo otkriće sadrži bilo koju sekvencu koja je ovde otkrivena, ali nijednu od SEQ ID BR: 4-109, odgovarajuća sekvenca bez N-terminalnog M, ili bilo koje sekvence otkrivene u TABELI 1 bez N-kraja M. U drugim primerima izvođenja, skeletni protein koristan za ovo otkriće sadrži bilo koju sekvencu koja je ovde otkrivena, ali ne sadrži nijednu od SEQ ID BR: 4-109.
[0241] U nekim primerima izvođenja, fuzioni proteini sadrže skeletni protein koji sadrži peptid sa sekvencom MGXKLSKKK, gde je X alanine ili bilo koja druga aminokiselina (SEQ ID BR: 117); ili peptid sa sekvencom (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), pri ćemu je N-terminalni M pocepan, tako da nastali fuzioni protein sadrži GXKLSKKK (SEQ ID BR: 425) ili (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) spojen sa biološki aktivnim molekulom, pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu). U nekim primerima izvođenja, skeletni protein koristan za ovo otkriće nije MGXKLSKKK, gde je X alanin ili bilo koja druga aminokiselina (SEQ ID BR: 117) ili nije peptid sa sekvencom (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+). U nekim primerima izvođenja, skeletni protein koristan za ovo otkriće ne sadrži MGXKLSKKK, gde je X alanin ili bilo koja druga aminokiselina (SEQ ID BR: 117) ili ne sadrži peptid sa sekvencom (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+).
[0242] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein koji sadrži peptid sa sekvencom (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) ili (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser), X je bilo koja aminokiselina, Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu). U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein koji sadrži peptid sa sekvencom (G)(π)(X)((Φ/π)(π)(+)(+), pri čemu skeletni protein ne sadrži N-terminalni M (npr. N-terminalni metionin).
[0243] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein koji sadrži peptid sa sekvencom (G)(π)(X)((Φ/π)(π)(+)(+), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser), X je bilo koja aminokiselina, Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu), pri čemu sekvenca nije (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+). U nekim aspektima, skeletni protein sadrži peptid sa sekvencom (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), pri čemu skeletni protein ne sadrži N-terminalni Met.
[0244] U nekim primerima izvođenja, konvencionalni EV, npr., egzozom, protein je odabran sa liste koja se sastoji od CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI proteina za sidrenje, LAMP2, LAMP2B, i njihovog fragmenta, varijante ili derivata.
4
[0245] U nekim primerima izvođenja, obogaćivanje fuzionog proteina koji sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ili bilo koji od SEQ ID BR: 4-109 u egzozomima je >2 puta, >4 puta, >8 puta, >16 puta, >25 puta, >50 puta, >100 puta, >200 puta, >500 puta, >750 puta, >1,000 puta, >2,000 puta, >5,000 puta, >7,500 puta, >10,000 puta veći od fuzionog proteina kome nedostaju MARCKS, MARCKSL1, BASP1, bilo koji od SEQ ID BR: 4-109 ili u poređenju sa fuzionim proteinima koji sadrže konvencionalne EV proteine, npr. egzozome. U nekim aspektima, obogaćivanje fuzionog proteina koji sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1 bez N-kraja M, bilo koji od SEQ ID BR: 4-109 bez N-kraja M ili bilo koje sekvence otkrivene ovde, npr. TABELA 1, bez N- kraja M u egzozomima je >2 puta, >4 puta, >8 puta, >16 puta, >25 puta, >50 puta, >100 puta, >200 puta, >500 -puta, >750 puta, >1,000 puta, >2,000 puta, >5,000 puta, >7,500 puta, >10,000 puta veći od fuzionog proteina kojem nedostaje MARCKS, MARCKSL1, BASP1 bez N- kraja M, bilo koji od SEQ ID BR: 4-109 bez N-kraja M ili bilo koje sekvence ovde otkrivene, npr. TABELA 1, bez N- kraja M ili u poređenju sa fuzionim proteinima koji sadrže konvencionalne EV proteine, npr., egzozome.
[0246] U nekim primerima izvođenja, obogaćivanje fuzionog proteina koji sadrži MARCKS, MARCKSL1, BASP1, bilo koji od SEQ ID BR: 4-109, odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M, ili bilo koje sekvence skeletnog proteina otkrivenog ovde (npr. Tabela 1) bez N-kraja M u egzozomima je najmanje oko 2 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 12 puta , najmanje oko 14 puta, najmanje oko 16 puta, najmanje oko 18 puta, najmanje oko 20 puta, najmanje oko 25 puta, najmanje oko 30 puta, najmanje oko 35 puta, najmanje oko 40 puta, najmanje oko 45 puta, najmanje oko 50 puta, najmanje oko 60 puta, najmanje oko 70 puta, najmanje oko 80 puta, najmanje oko 90 puta, najmanje oko 100 puta, najmanje oko 200 puta, najmanje oko 300 puta, najmanje oko 400 puta, najmanje oko 500 puta, najmanje oko 750 puta, najmanje oko 1,000 puta, najmanje oko 1,500 puta, najmanje oko 2,000 puta, najmanje oko 2,500 puta, najmanje oko 3,000 puta, najmanje oko 3,500 puta, najmanje oko 4,000 puta, najmanje oko 4,500 puta, najmanje oko 5,000 puta, najmanje oko 5,500 puta, najmanje oko 6,000 puta, najmanje oko 6,500 puta, najmanje oko 7,000 puta, najmanje oko 7,500 puta, najmanje oko 8,000 puta, najmanje oko 8,500 puta, najmanje oko 9,000 puta, najmanje oko 9,500 puta ili najmanje oko 10,000 puta veći od fuzionog proteina kome nedostaju MARCKS, MARCKSL1, BASP1, bilo koji od SEQ ID BR: 4-109, odgovarajuća sekvenca bez N-kraja M, ili bilo koja sekvenca skeletnog proteina koja je ovde otkrivena (npr. Tabela 1) bez N-kraja M, ili u poređenju sa fuzionim proteinima koji sadrže konvencionalne EV proteine, npr. egzozome.
[0247] U nekim primerima izvođenja, sekvenca proteina bilo koje od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuća sekvenca bez N-kraja M, ili bilo koja sekvenca skeletnog proteina koja je ovde otkrivena (npr. Tabela 1) bez N-kraja M je dovoljna da opteretiti EVs, npr. egzozome, sa fuzionim proteinom.
[0248] U nekim primerima izvođenja, lumenski konstruisana EV, npr. egzozom, koji sadrži fuzioni protein koji obuhvata egzogenu sekvencu (npr., biološki aktivan molekul) i EV, npr. egzozom, lumenski protein (skeletni protein) koji je ovde novo identifikovan ima veću gustinu fuzionog proteina od slično konstruisanih EVs, npr. egzozoma, koji sadrže egzogenu sekvencu konjugovanu sa konvencionalnim EV, npr. egzozomom, proteinom poznatim u tehnici (npr. CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI proteini za sidrenje, laktadherin , LAMP2 i LAMP2B, njihov fragment ili peptid koji se vezuje za njih).
[0249] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji obuhvata EV, npr., egzozom, lumenski protein (skeletni protein) koji je novo identifikovan ovde je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200 -, 400-, 800-, 1000 puta ili većoj gustini u luminalnoj površini EV, npr., egzozom, nego fuzioni proteini u drugim luminalnim površinama EV, npr. egzozom, slično modifikovanih korišćenjem konvencionalnog EV proteina, npr. egzozoma.
[0250] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji obuhvata EV, npr. egzozom, lumenski protein (skeletni protein) koji je ovde novo identifikovan, prisutan je 2 do 4 puta, 4 do 8 puta, 8 do 16 puta, 16 do 32 puta.32 do 64 puta, 64 do 100 puta, 100 do 200 puta, 200 do 400 puta, 400 do 800 puta, 800 do 1000 puta ili do veće gustine u luminalnoj površini EV, npr., egzozomu, od fuzionih proteina u drugim luminalnim površinama EV, npr., egzozoma, na sličan način modifikovane korišćenjem konvencionalnog EV proteina, npr. egzozoma.
[0251] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKS, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem CD9.
[0252] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKS, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem CD63.
[0253] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKS, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem CD81.
[0254] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKS, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem PDGFR.
[0255] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKS, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem GPI proteina za sidrenje.
[0256] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKS, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem laktadherina.
[0257] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKS, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem LAMP2.
[0258] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKS, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem LAMP2B.
[0259] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKS, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem konvencionalnog proteina.
[0260] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKS, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem varijante konvencionalnog EV proteina, npr., egzozoma.
[0261] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKSL1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem CD9.
[0262] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKSL1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem CD63.
[0263] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKSL1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem CD81.
[0264] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKSL1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem PDGFR.
[0265] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKSL1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem GPI proteina za sidrenje.
[0266] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKSL1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem laktadherina.
[0267] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKSL1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem LAMP2.
[0268] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKSL1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem LAMP2B.
[0269] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKSL1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem konvencionalnog proteina.
[0270] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. MARCKSL1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem varijante konvencionalnog EV proteina, npr., egzozoma.
[0271] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. BASP1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem CD9.
[0272] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. BASP1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem CD63.
[0273] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. BASP1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem CD81.
[0274] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. BASP1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem PDGFR.
[0275] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. BASP1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem GPI proteina za sidrenje.
[0276] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. BASP1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem laktadherina.
[0277] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. BASP1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem LAMP2.
[0278] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. BASP1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem LAMP2B.
[0279] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. BASP1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem konvencionalnog proteina.
[0280] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću (npr. BASP1, varijanta, fragment, varijanta fragmenta ili njegova modifikacija) je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozoma, na sličan način modifikovani korišćenjem varijante konvencionalnog EV proteina, npr. egzozoma.
[0281] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuća sekvenca bez N-kraja M ili bilo koje sekvence skeletnog proteina otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N-kraja M je prisutna na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem CD9. U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, sadrži fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met, i pri čemu je fuzioni protein prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem CD9.
[0282] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuća sekvenca bez N-kraja M ili bilo koje sekvence skeletnog proteina otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N-kraja M je prisutna na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem CD63. U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, sadrži fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met, i pri čemu je fuzioni protein prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem CD63.
[0283] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuća sekvenca bez N-kraja M ili bilo koje sekvence skeletnog proteina otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N-kraja M je prisutna na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem CD81. U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, sadrži fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met, i pri čemu je fuzioni protein prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem CD81.
[0284] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuća sekvenca bez N-terminalnog M ili bilo koje sekvence skeletnog proteina
1
otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N-terminalnog M je prisutna na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem PDGFR. U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, sadrži fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met, i pri čemu je fuzioni protein prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem PDGFR.
[0285] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuća sekvenca bez N-kraja M ili bilo koje sekvence skeletnog proteina otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N-kraja M je prisutna na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem GPI proteina za sidrenje. U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, sadrži fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met, i pri čemu je fuzioni protein prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem GPI proteina za sidrenje.
[0286] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuća sekvenca bez N-kraja M ili bilo koje sekvence skeletnog proteina otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N-kraja M je prisutna na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem laktadherina. U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, sadrži fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met, i pri čemu je fuzioni protein prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem laktadherina.
[0287] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuća sekvenca bez N-kraja M ili bilo koje sekvence skeletnog proteina otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N-kraja M je prisutna na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem LAMP2. U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, sadrži fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met, i pri čemu je fuzioni protein prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem LAMP2.
2
[0288] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuća sekvenca bez N-kraja M ili bilo koje sekvence skeletnog proteina otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N-kraja M je prisutna na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem LAMP2B. U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, sadrži fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met, i pri čemu je fuzioni protein prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem LAMP2Bt.
[0289] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M ili bilo koje sekvence skeletnog proteina otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N-kraja M je prisutna na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem konvencionalnog proteina. U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, sadrži fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met, i pri čemu je fuzioni protein prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem konvencionalnog proteina.
[0290] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, odgovarajuću sekvencu bez N-terminalnog M ili bilo koju sekvencu skeletnog proteina otkrivene ovde (npr. Tabela 1) bez N-terminalnog M je prisutna na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem varijante konvencionalnog EV proteina npr. egzozoma proteina. U nekim aspektima, EV, npr., egzozom, sadrži fuzioni protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID BR: 1-109, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met, i pri čemu je fuzioni protein prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili većoj gustini nego kod EVs, npr. egzozomi, na sličan način modifikovani korišćenjem konvencionalnog EV proteina npr. egzozoma proteina.
[0291] U nekim primerima izvođenja, lumenski konstruisani EVs, npr., egzozomi, koji su ovde opisani, pokazuju superiorne karakteristike u poređenju sa lumenski konstruisanim EVs, npr. egzozomima poznatim u tehnici. Na primer, lumenski konstruisani EVs, npr. egzozomi, proizvedeni korišćenjem novoidentifikovanih EV, npr. egzozoma, proteini koji su ovde obezbeđeni obuhvataju modifikovane proteine više obogaćene na svojoj luminalnoj površini u poređenju sa EVs, npr. egzozomi u prethodnoj tehnici, npr., one proizvedene korišćenjem konvencionalnih EV proteina npr. egzozoma.
[0292] Štaviše, lumenski konstruisani EVs, npr., egzozomi, prema ovom otkriću mogu imati veću, specifičniju ili više kontrolisanu biološku aktivnost u poređenju sa lumenski konstruisanim EVs, npr. egzozomima, poznatim u tehnici. Na primer, lumenski konstruisani EV, npr., egzozom, koji sadrži korisnu nosivost, npr. terapeutsku ili biološki relevantnu egzogenu sekvencu fuzionisanu sa EV, npr. egzozomom, proteinom ili njegovim fragmentom opisanim ovde (npr. skeletni protein prema ovom otkriću kao što je BASP1 ili njegov fragment, varijanta ili derivat) može imati više od željenih konstruisanih karakteristika od fuzionisanja sa skeletnim proteinom poznatim u tehnici.
[0293] Skeletni proteini poznati u tehnici uključuju molekule tetraspanina (npr. CD63, CD81, CD9 i drugi), membranski protein 2 povezan sa lizozomima (LAMP2 i LAMP2B), receptor faktora rasta koji potiče od trombocita (PDGFR), GPI proteine za sidrenje, laktadherin i njegove fragmente i peptide koji imaju afinitet za bilo koji od ovih proteina ili njihovih fragmenata. Da ne bi bilo sumnje, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP transporter ili njegov fragment ili varijanta nisu konvencionalni EV proteini npr., egzozomi. Ranije se prekomerna ekspresija egzogenih proteina oslanjala na stohastičko ili nasumično raspoređivanje egzogenih proteina u egzozomu za proizvodnju lumenski konstruisanih egzozoma. Ovo je rezultovalo niskim nivoom, nepredvidivom gustinom egzogenih proteina u egzozomima. Dakle, EV, npr., proteini egzozoma i njihovi fragmenti koji su ovde opisani obezbeđuju važan napredak u novim EV, npr., kompozicije egzozoma i postupci pravljenja istih.
[0294] Ovde obezbeđeni fuzioni proteini mogu sadržati skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, prema ovom otkriću, kao što su MARCKS, MARCKSL1, BASP1, ili njegov fragment, varijanta ili derivat i dodatni peptid. Dodatni peptid može biti vezan ili za N-kraj ili C-kraj EV proteina (skeletni protein), npr., egzozom, ili njegov fragment, varijantu ili derivat.
[0295] U nekim primerima izvođenja, ovde obezbeđeni fuzioni proteini sadrže skeletni protein prema ovom otkriću kao što su MARCKS, MARCKSL1, BASP1, ili njihov fragment, varijantu ili derivat i dva dodatna peptida. Oba dodatna peptida mogu biti vezana ili za N-kraj ili C-kraj EV proteina (skeletni protein), npr., egzozom, ili njegov fragment, varijantu ili derivat. U nekim primerima izvođenja, jedan od dva dodatna peptida je vezan za N- kraj, a drugi od dva dodatna peptida je vezan za C- kraj EV protein (skeletni protein), npr. egzozom, ili njegov fragment, varijanta, ili derivat.
4
[0296] U nekim primerima izvođenja, ovde opisane kompozicije i postupci za generisanje lumenski konstruisanih vanćelijskih vezikula sadrže nanovezikule.
IV. Ćelija proizvođač za proizvodnju lumenski konstruisanih EVs, npr. egzozoma [0297] EV, npr., egzozomi, prema ovom otkriću, mogu se proizvesti iz ćelije gajene in vitro ili telesne tečnosti subjekta. Kada se EVs, npr., egzozomi, proizvode iz in vitro ćelijske kulture, različite ćelije proizvođači, npr. HEK293 ćelije, mogu se koristiti za ovo otkriće. Dodatni tipovi ćelija koji se mogu koristiti za proizvodnju lumenski konstruisanih EVs lumenski konstruisanih, npr., egzozoma, koji su ovde opisani, uključuju, bez ograničenja, mezenhimalne matične ćelije, T-ćelije, B-ćelije, dendritske ćelije, makrofage i ćelijske linije kancera.
[0298] Shodno tome, ovo otkriće obezbeđuje ćelije koje proizvode EVs, npr., egzozome, prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, oni sadrže jedan ili više vektora, pri čemu vektori sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira skeletni protein i korisnu nosivost, npr., biološki aktivan molekul. U nekim primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline kodira skeletni protein, a druga sekvenca nukleinske kiseline kodira korisni teret, npr., biološki aktivan molekul. U nekim primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira skeletni protein i sekvenca nukleinske kiseline koja kodira korisni teret, npr., biološki aktivan molekul, nalaze se u jednom otvorenom okviru za čitanje; prema tome, ekspresioni proizvod bi bio fuzioni protein koji sadrži skeletni protein fuzionisan sa korisnom nosivosti, npr., biološki aktivanim molekulom. U nekim primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline je operativno spojena sa promoterom.
[0299] Ćelija proizvođačamože biti genetički modifikovana tako da sadrži jednu ili više egzogenih sekvenci za proizvodnju lumenski konstruisanih EVs, npr. egzozoma. Genetički modifikovana ćelija proizvođač može da obuhvati egzogenu sekvencu prolaznom ili stabilnom transformacijom. Egzogena sekvenca se može transformisati kao plazmid. Egzogene sekvence mogu biti stabilno integrisane u genomsku sekvencu ćelije proizvođača, na ciljanom mestu ili na slučajnom mestu. U nekim primerima izvođenja, generiše se stabilna ćelijska linija za proizvodnju lumenski konstruisanih EVs, npr., egzozoma.
[0300] Egzogene sekvence mogu biti umetnute u genomsku sekvencu ćelije proizvođača, koja se nalazi unutar, uzvodno (5'-kraj) ili nizvodno (3'-kraj) endogene sekvence koja kodira EV protein, npr., egzozom,. Za uvođenje egzogenih sekvenci u ćeliju proizvođača mogu se koristiti različiti postupci poznati u tehnici. Na primer, ćelije modifikovane korišćenjem različitih postupaka za uređivanje gena (npr. postupci koji koriste homolognu rekombinaciju, transpozon-posredovani sistem, loxP-Cre sistem, CRISPR/Cas9 ili TALEN) su u okviru ovog otkrića.
[0301] Egzogene sekvence mogu sadržati sekvencu koja kodira skeletni protein prema ovom otkriću (npr., EV, npr., egzozom, protein ili modifikacija ili fragment EV protein, npr., egzozom). Dodatna kopija sekvence koja kodira skeletni protein (npr. EV protein, npr. egzozom) može se uvesti da bi se proizveo lumenski konstruisan EV, npr. egzozom, koji ima veću gustinu EV proteina, npr. egzozom. Egzogena sekvenca koja kodira modifikaciju ili fragment EV proteina, npr., egzozoma, može biti uvedena da bi se proizveo lumenski konstruisan EV, npr. egzozom, koji obuhvata modifikaciju ili fragment EV proteina, npr. egzozom. Egzogena sekvenca koja kodira afinitetnu oznaku može biti uvedena da bi se proizveo lumenski konstruisan EV, npr., egzozom, koji obuhvata fuzioni protein koji sadrži oznaku afiniteta vezanu za EV protein, npr. egzozom.
[0302] U nekim primerima izvođenja, lumenski konstruisan EV, npr. egzozom, ima veću gustinu EV proteina (skeletni protein), npr., egzozoma, od prirodnih EVs, npr. egzozoma, izolovanih iz istih ili sličnih tipova ćelija proizvođača. U nekim primerima izvođenja, pomenuti EV protein (skeletni protein), npr. egzozom, je prisutan na 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1.000 puta ili do veće gustine na pomenutom lumenski konstruisanom EV, npr. egzozomu, od prirodnog EV< na primer, egzozoma. U nekim primerima izvođenja, EV protein (skeletni protein), npr., egzozom, je prisutan 2 do 4 puta, 4 do 8 puta, 8 do 16 puta, 16 do 32 puta, 32 do 64 puta, 64 puta do 100 puta, 100 do 200 puta, 200 do 400 puta, 400 do 800 puta, 800 do 1.000 puta ili do veće gustine na lumenski konstruisanom EV, npr. egzozomu, od nativnog EV, npr. egzozoma. U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein koji sadrži EV protein (skeletni protein), npr. egzozom, je prisutan 2 do 4 puta, 4 do 8 puta, 8 do 16 puta, 16 do 32 puta, 32 do 64 puta , 64 do 100 puta, 100 do 200 puta, 200 do 400 puta, 400 do 800 puta, 800 do 1000 puta ili do veće gustine na pomenutom lumenski konstruisanom EV, npr. egzozomu, od nemodifikovanih EV proteina (skeletni protein), npr. egzozom, na prirodnom EV, npr. egzozomu. U nekim primerima izvođenja, fragment ili varijanta EV proteina (skeletni protein), npr. egzozom, je prisutna 2 do 4 puta, 4 do 8 puta, 8 do 16 puta, 16 do 32 puta, 32 puta do 64 puta, 64 do 100 puta, 100 do 200 puta, 200 do 400 puta, 400 do 800 puta, 800 do 1000 puta ili do veće gustine na lumenski konstruisanom EV, npr. egzozomu, nego na nemodifikovanom EV proteinu (skeletni protein), npr. egzozom, na nativnom EV, npr. egzozomu.
[0303] U određenim primerima izvođenja, MARCKS, fragment ili varijanta MARCKS, ili njegova modifikacija je prisutan 2 do 4 puta, 4 do 8 puta, 8 do 16 puta, 16 do 32 puta, 32 do 64 puta , 64 do 100 puta, 100 do 200 puta, 200 do 400 puta, 400 do 800 puta, 800 do 1000 puta ili do veće gustine na pomenutom lumenski konstruisanom EV, npr., egzozomu, od nemodifikovanog MARCKS na pomenutom prirodnom EV, npr., egzozomu. U nekim primerima izvođenja, MARCKSL1, fragment ili varijanta MARCKSL1, ili njegova modifikacija je prisutan 2 do 4 puta, 4 do 8 puta, 8 do 16 puta, 16 do 32 puta, 32 do 64 puta , 64 do 100 puta, 100 do 200 puta, 200 do 400 puta, 400 do 800 puta, 800 do 1000 puta ili do veće gustine na pomenutom lumenski konstruisanom EV, npr., egzozomu, od nemodifikovanog MARCKSL1 na pomenutom prirodnom EV, npr., egzozomu. U nekim primerima izvođenja, BASP1, fragment ili varijanta BASP1, ili njegova modifikacija je prisutan 2 do 4 puta, 4 do 8 puta, 8 do 16 puta, 16 do 32 puta, 32 do 64 puta , 64 do 100 puta, 100 do 200 puta, 200 do 400 puta, 400 do 800 puta, 800 do 1000 puta ili do veće gustine na pomenutom lumenski konstruisanom EV, npr., egzozomu, od nemodifikovanog BASP1 na nativni EV, npr. egzozom.
[0304] U nekim primerima izvođenja, ćelija proizvođač je dalje modifikovana da sadrži dodatnu egzogenu sekvencu. Na primer, može se uključiti dodatna egzogena sekvenca da bi se modulirala ekspresija endogenog gena ili proizveo egzozom koji uključuje određeni polipeptid kao korisnu nosivost. U nekim primerima izvođenja, ćelija proizvođač je modifikovana tako da sadrži dve egzogene sekvence, od kojih jedna kodira EV protein (skeletni protein), npr. egzozom, ili modifikaciju ili fragment EV proteina (skeletni protein), npr. egzozom, i drugi koji kodira korisni teret.
[0305] Preciznije, lumenski konstruisani EVs, npr., egzozomi, mogu se proizvesti iz ćelije transformisane sekvencom koja kodira jedan ili više proteina lumena egzozoma (skeletni protein) uključujući, ali ne ograničavajući se na, (1) miristoiliranim alaninom bogat supstrat protein kinaze C (MARCKS); (2) miristoilovanim alaninom bogat supstrat protein kinaze C sličan 1 (MARCKSL1); i (3) protein 1 rastvorljiv u moždanoj kiselini (BASP1). Bilo koji od jednog ili više EV, npr., egzozoma, lumenskih proteina (skeletni protein) opisanih ovde može biti eksprimiran iz plazmida, egzogene sekvence ubačene u genom ili druge egzogene nukleinske kiseline kao što je sintetička mesendžer RNK (mRNK).
[0306] U nekim primerima izvođenja, jedan ili više EV, npr., egzozom, lumenski protein (skeletni protein) je eksprimiran u ćeliji transformisanoj egzogenom sekvencom koja kodira njenu punu dužinu, endogeni oblik. U nekim primerima izvođenja, takva egzogena sekvenca kodira MARCKS protein SEQ ID BR: 1 ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M. U određenim aspektima, takva egzogena sekvenca kodira MARCKS protein SEQ ID BR: 1. U nekim primerima izvođenja, takva egzogena sekvenca kodira MARCKS protein SEQ ID BR: 1, pri čemu MARKS protein kodiran egzogenom sekvencom ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, takva egzogena sekvenca kodira MARCKSL1 protein SEQ ID BR: 2 ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M. U određenim aspektima, takva egzogena sekvenca kodira MARCKSL1 protein SEQ ID BR: 2. U nekim primerima izvođenja, takva egzogena sekvenca kodira MARCKSL1 protein SEQ ID BR: 2, pri čemu MARCKSL1 protein kodiran egzogenom sekvencom ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, takva egzogena sekvenca kodira BASP1 protein SEQ ID BR: 3 ili odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M. U određenim aspektima, takva egzogena sekvenca kodira BASP1 protein SEQ ID BR: 3. U nekim primerima izvođenja, takva egzogena sekvenca kodira BASP1 protein SEQ ID BR: 3, pri čemu BASP1 protein kodiran egzogenom sekvencom ne sadrži N-terminalni Met.
[0307] Lumenski konstruisani EVs, na primer, egzozomi, mogu se proizvesti iz ćelije transformisane polinukleotidnom sekvencom koja kodira fragment jednog ili više EV, npr. egzozoma, proteina lumena (skeletni protein) uključujući, ali ne ograničavajući se na, (1) miristoiliranim alaninom bogat supstrat protein kinaze C (MARCKS); (2) miristoilovanim alaninom bogat supstrat protein kinaze C sličan 1 (MARCKSL1); i (3) protein 1 rastvorljiv u moždanoj kiselini (BASP1).
[0308] U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna sekvenca kodira fragment EV proteina lumen, na primer, egzozoma (npr. skeletni protein kao što je MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1) kome nedostaje najmanje 5, 10, 50, 100, 200 ili 300 aminokiseline sa N-kraja prirodnog proteina. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna sekvenca kodira fragment EV proteina lumena, na primer, egzozoma (npr. skeletni protein kao što je MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1) kome nedostaje najmanje 5, 10, 50, 100, 200 ili 300 aminokiseline sa C-kraja prirodnog proteina. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna sekvenca kodira fragment EV proteina lumena, na primer, egzozoma (npr. skeletni protein kao što je MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1) kome nedostaje najmanje 5, 10, 50, 100, 200 ili 300 aminokiseline sa N-kraja i C-kraja prirodnog proteina. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna sekvenca kodira fragment EV proteina lumena, npr. egzozom, (npr. skeletni protein kao što je MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1) kome nedostaje jedan ili više funkcionalnih ili strukturnih domena prirodnog proteina.
[0309] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži peptid SEQ ID BR: 4-109, odgovarajuću sekvencu bez N-kraja M, ili bilo koju sekvencu skeletnog proteina koja je ovde otkrivena (npr. Tabela 1) bez N-kraja M. u nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži peptid SEQ ID BR: 4-109 ili bilo koju sekvencu skeletnog proteina koja je ovde otkrivena (npr. Tabela 1), pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži peptid SEQ ID BR: 13. U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži peptid SEQ ID BR: 13, pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein, na primer, protein lumena egzozoma, koji sadrži peptid sa sekvencom MGXKLSKKK (SEQ ID BR: 117) ili GXKLSKKK (SEQ ID BR: 425), gde je X alanin ili bilo koja druga aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, koji sadrži peptid sa sekvencom GXKLSKKK (SEQ ID BR: 425), gde je X alanin ili bilo koja druga aminokiselina, i pri čemu skeletni protein, npr. , protein lumena egzozoma, ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein, npr. protein lumena egzozoma, koji sadrži peptid sa sekvencom GXKLSKKK (SEQ ID BR: 425), gde je X alanin ili bilo koja druga aminokiselina, i pri čemu fuzioni protein ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein se sastoji od skeletnog proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu GXKLSKKK (SEQ ID BR: 425), pri čemu je X alanin ili bilo koja druga aminokiselina, pri čemu skeletni protein nema Met na N-kraju aminokiselinske sekvence, npr., sadrži MGXKLSKKK (SEQ ID BR: 117). U drugim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein, npr., protein lumena egzozoma, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu GXKLSKKK (SEQ ID BR: 425), pri čemu fuzioni protein ne sadrži MGXKLSKKK. U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein koji sadrži peptid sa sekvencom (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) ili (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu). U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein npr. protein lumena egzozoma, sa aminokiselinskom sekvencom (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+), pri čemu fuzioni protein ne sadrži (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+).
U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein npr. protein lumena egzozoma koji sadrži peptid sa sekvencom (M)(O(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) ili (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+), pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser), X je bilo koja aminokiselina, Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu). U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži skeletni protein npr. protein lumena egzozoma, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (G)(π)(X)((Φ/π)(π)(+)(+), pri čemu fuzioni protein ne sadrži (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+).
[0310] U nekim primerima izvođenja, lumenski konstruisani EVs, npr., egzozomi, mogu se proizvesti iz ćelije transformisane sekvencom koja kodira EV protein, npr., egzozom (npr. skeletni protein, npr. protein lumena egzozoma, kao što su MARCKS, MARCKSL1, ili BASP1) ili njegov fragment ili njegova modifikacija fuzionisana sa jednim ili više heterolognih proteina. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više heterolognih proteina su fuzionisani sa N-krajem EV proteina, npr., egzozoma (npr. skeletni protein kao što je MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1) ili njihova modifikacija, posebno njegov fragment ili njegova varijanta. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više heterolognih proteina su fuzionisani sa C-krajem EV proteina, npr., egzozom (npr. skeletni protein kao što je MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1) ili njihova modifikacija, posebno njegov fragment ili njegova varijanta. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više heterolognih proteina su fuzionisani sa N-krajem i C-krajem EV proteina, npr., egzozomom (npr. skeletni protein kao što je MARCKS, MARCKSL1 ili BASP1) ili njegovom modifikacijom, posebno njegov fragment ili njegova varijanta. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više heterolognih proteina su proteini sisara. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više heterolognih proteina su humani proteini.
[0311] U nekim primerima izvođenja lumenski konstisani EVs, na primer, egzozomi, se proizvode iz ćelije transformisane sekvencom koja kodira polipeptid sekvence identične ili slične celini ili fragmentu prirodnog EV, npr. egzozoma, proteina lumena (skeletni protein) uključujući, ali ne ograničavajući se na,
(1) miristoiliranim alaninom bogat supstrat protein kinaze C (MARCKS);
(2) miristoilovanim alaninom bogat supstrat protein kinaze C sličan 1 (MARCKSL1); i
(3) protein 1 rastvorljiv u moždanoj kiselini (BASP1).
[0312] U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 50% identičan punoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), na primer, egzozom, npr.50% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-raja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 55% identičan punoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozom, na primer, najmanje oko 55% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 60% identičan celoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozoma, npr., najmanje oko 60% identično SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 65% identičan punoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozom, npr., najmanje oko 65% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 70% identičan celoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozom, npr., najmanje oko 70% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 75% identičan punoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozom, na primer, najmanje oko 75% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, pomenuti polipeptid je najmanje oko 80% identičan celoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozom, npr., najmanje oko 80% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 85% identičan celoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozom, npr., najmanje oko 85% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, pomenuti polipeptid je najmanje oko 90% identičan celoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozom, npr., najmanje oko 90% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 95% identičan celoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozom, npr., najmanje oko 95% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 99% identičan celoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozom, npr., najmanje oko 99% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 99,9% identičan celoj dužini ili fragmentu prirodnog EV proteina lumena (skeletni protein), npr. egzozom, npr., najmanje oko 99,9% identičan SEQ ID BR: 1-3 ili bilo kojoj od odgovarajućih sekvenci bez N-kraja M.
[0313] U nekim primerima izvođenja, lumenski konstruisani EVs, npr., egzozomi, proizvedeni iz ćelije, sadrže polipeptid sekvence identične ili slične fragmentu proteina 1 rastvorljivog u moždanoj kiselini (BASP1). U nekim primerima izvođenja, polipeptid je
1
najmanje oko 50% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 50% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 55% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 50% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, pomenuti polipeptid je najmanje oko 60% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 60% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 65% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 65% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 70% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 70% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 75% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 75% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 80% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 80% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 85% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 85% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 90% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 90% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 95% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 95% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 99% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 99% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili
2
bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 99,9% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 99,9% identičan SEQ ID BR: 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je oko 100% identičan fragmentu BASP1, na primer, oko 100% identičan 4-109, odgovarajućoj sekvenci bez N-kraja M , ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABELA 1, bez N kraja M.
[0314] U nekim primerima izvođenja, lumenski kostruisani EVs, npr. egzozomi, proizvedeni iz ćelije sadrže polipeptid sekvence identične ili slične fragmentu proteina 1 rastvorljivog u moždanoj kiselini (BASP1), pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 50% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 50% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 55% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 50% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 60% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 60% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 65% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 65% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 70% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 70% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 75% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 75% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 80% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 80% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 85% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 85% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 90% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 90% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 95% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 95% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 99% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 99% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je najmanje oko 99,9% identičan punoj dužini ili fragmentu BASP1, na primer, najmanje oko 99,9% identičan SEQ ID BR: 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je oko 100% identičan fragmentu BASP1, na primer, oko 100% identičan 4-109 ili bilo kojoj BASP1 sekvenci opisanoj ovde, npr. TABLE 1, pri čemu polipeptid ne sadrži N-terminalni Met.
VI. Postupci pravljenja
[0315] EVs (npr., egzozomi) prema ovom otkriću mogu se proizvesti hemijskom sintezom, tehnologijom rekombinantne DNK, biohemijskom ili enzimskom fragmentacijom većih molekula, kombinacijama prethodno navedenog ili bilo kojim drugim postupkom. U jednom primeru izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje postupak konjugacije biološki aktivnog molekula sa EV (npr., egzozom). Postupak sadrži povezivanje biološki aktivnog molekula sa EV (npr., egzozomom) kao što je prethodno opisano.
[0316] U nekim primerima izvođenja prema ovom otkriću, EVs, npr., egzozomi prema ovom otkriću mogu se proizvesti korišćenjem ćelija proizvođača kao što je prethodno opisano. Shodno tome, ovo otkriće obezbeđuje postupak pravljenja EVs, npr., egzozoma, koji sadrži kultivisanje ćelije proizvođača koja je ovde otkrivena pod pogodnim uslovima i dobijanje EVs, npr. egzozoma prema ovom otkriću.
[0317] U drugim primerima izvođenja, skeletni proteini npr., proteini lumena egzozoma, prema ovom otkriću mogu se proizvesti rekombinantno i naknadno ugraditi u EV, npr., egzozom, prema ovom otkriću. U drugim primerima izvođenja, samo polipeptidni deo skeletnog proteina se proizvodi rekombinantno. U nekim primerima izvođenja, polipeptidni deo skeletnog proteina koji se proizvodi rekombinantno se naknadno modifikuje, npr. hemijski ili enzimski, da bi se inkorporiralo membransko sidro (npr. N-terminalna miristinska
4
kiselina). U nekim primerima izvođenja, skeletni protein proizveden polu-rekombinantno (tj. kombinovanje rekombinantnog proizvoda polipeptidnog dela praćenog hemijskom ili enzimskom modifikacijom) se zatim inkorporira u EV, npr., egzozom, prema ovom otkriću.
[0318] U drugim primerima izvođenja, skeletni proteini npr., proteini lumena egzozoma, prema ovom otkriću mogu se proizvesti hemijski npr. korišćenjem čvrste faze sinteze pepida i naknadno ugraditi u EV, npr., egzozom, prema ovom otkriću. U drugim primerima izvođenja, samo polipeptidni deo skeletnog proteina se proizvodi sintetički. U nekim primerima izvođenja, polipeptidni deo skeletnog proteina koji se proizvodi sintetički se naknadno modifikuje, npr. hemijski ili enzimski, da bi se inkorporiralo membransko sidro (npr. N-terminalna miristinska kiselina). U nekim primerima izvođenja, skeletni protein proizveden polu-sintetički (tj. kombinovanje sintetičkog proizvoda polipeptidnog dela praćenog hemijskom ili enzimskom modifikacijom) se zatim inkorporira u EV, npr., egzozom, prema ovom otkriću.
[0319] U drugim primerima izvođenja, skeletni proteini npr., proteini lumena egzozoma, prema ovom otkriću mogu se proizvesti in vitro npr. korišćenjem ekspresije bez ćelije kao što je sistem retikulocita i naknadno ugraditi u EV, npr., egzozom, prema ovom otkriću. U drugim primerima izvođenja, samo polipeptidni deo skeletnog proteina se proizvodi in vitro npr. u sistemu bez ćelije. U nekim primerima izvođenja, polipeptidni deo skeletnog proteina koji se proizvodi in vitro npr. u sistemu bez ćelija se naknadno modifikuje, npr. hemijski ili enzimski, da bi se inkorporiralo membransko sidro (npr. N-terminalna miristinska kiselina). U nekim primerima izvođenja, skeletni protein proizveden polu- in vitro (tj. kombinovanje in vitro proizvoda polipeptidnog dela praćenog hemijskom ili enzimskom modifikacijom) se zatim inkorporira u EV, npr., egzozom, prema ovom otkriću.
[0320] U nekim primerima izvođenja, postupci opisani ovde dalje sadrže korak karakterisanja EVs, npr., egzozoma, obuhvaćenih u svakoj sakupljenoj frakciji tokom njihove proizvodnje i prečišćavanja. U nekim primerima izvođenja, sadržaj EVs, na primer, egzozomi, može da se ekstrahuje za proučavanje i karakterizaciju. U nekim primerima izvođenja, EVs, npr. egzozomi, su izolovani i okarakterisani metrikom uključujući, ali ne ograničavajući se na, veličinu, oblik, morfologiju ili molekularne kompozicije kao što su nukleinske kiseline, proteini, metaboliti i lipidi.
VII. Farmaceutske kompozicije i načini primene
[0321] Ovo otkriće takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže EVs (npr., egzozome) opisane ovde koje su pogodne za primenu subjektu. Farmaceutske kompozicije generalno sadrže veći broj EVs (npr. egzozoma) koji sadrže najmanje jednu korisnu nosivost, na primer, biološki aktivan molekul, kovalentno ili nekovalentno povezan sa mnoštvom EVs (npr. egzozoma) i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent ili nosač u obliku pogodnom za primenu na subjektu.
[0322] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti ili nosači su delimično određeni posebnom kompozicijom koja se primenjuje, kao i posebnim postupkom koji se koristi za primenu kompozicije. Shodno tome, postoji širok spektar pogodnih formulacija farmaceutskih kompozicija koje sadrže mnoštvo EVs (npr., egzozoma). (Videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18th ed. (1990)). Farmaceutske kompozicije su generalno formulisane sterilno i u potpunosti u skladu sa svim propisima o dobroj praksi proizvodnje (GMP) američke Uprave za hranu i lekove. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži jedno ili više hemijskih jedinjenja, kao što su, na primer, mali molekuli kovalentno povezani sa EV (npr. egzozomom) opisanim ovde.
[0323] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži jedan ili više terapeutskih ili dijagnostičkih sredstava i EV (npr., egzozom) opisanih ovde. U određenim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se daju zajedno sa jednim ili više dodatnih terapeutskih ili dijagnostičkih sredstava, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koja sadrži EV (npr., egzozom) se primenjuje pre primene dodatnih terapeutskih ili dijagnostičkih sredstava. U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koja sadrži EV (npr., egzozom) se primenjuje nakon primene dodatnih terapeutskih ili dijagnostičkih sredstava. U daljim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koja sadrži EV (npr. egzozom) se primenjuje istovremeno sa dodatnim terapeutskim ili dijagnostičkim sredstvima.
[0324] Ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže EV (npr. egzozom) prema ovom pronalasku koji ima željeni stepen čistoće, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent, u obliku pogodnom za primenu na subjektu. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti ili nosači mogu se delimično odrediti posebnom kompozicijom koja se primenjuje, kao i posebnim postupkom koji se koristi za primenu kompozicije. Shodno tome, postoji veliki izbor pogodnih formulacija farmaceutskih kompozicija koje sadrže mnoštvo vanćelijskih vezikula. (Videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 21st ed. (2005)). Farmaceutske kompozicije su generalno formulisane sterilno i u potpunosti u skladu sa svim propisima o dobroj praksi proizvodnje (GMP) američke Uprave za hranu i lekove.
[0325] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži jedan ili više terapeutskih ili dijagnostičkih sredstava i EV (npr. egzozom) opisanih ovde. U određenim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se daju zajedno sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa ili dijagnostičkih sredstava, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koja sadrži EV (npr. egzozom) se primenjuje pre primene dodatnih terapeutskih ili dijagnostičkih sredstava. U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koja sadrži EV (npr. egzozom) se primenjuje nakon primene dodatnih terapeutskih ili dijagnostičkih sredstava. U daljim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koja sadrži EV (npr., egzozom) se primenjuje istovremeno sa dodatnim terapeutskim ili dijagnostičkim sredstvima.
[0326] Prihvatljivi nosači, ekscipijenti ili stabilizatori su netoksični za primaoce (npr. životinje ili ljude) u korišćenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanasi (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekularne težine (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatna sredstva kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protivjoni koje stvaraju soli kao što je natrijum; kompleksi metala (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili ne-jonski surfaktanti kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).
[0327] Primeri nosača ili razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, fiziološki rastvor, Ringer-ove rastvore, rastvor dekstroze i 5% humanog serumskog albumina. Upotreba takvih medijuma i jedinjenja za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u tehnici. Osim u slučaju kada bilo koji konvencionalni medijum ili jedinjenje nije kompatibilno sa ovde opisanim vanćelijskim vezikulama, razmatra se njihova upotreba u kompozicijama. Dodatna terapeutska sredstva se takođe mogu ugraditi u kompozicije. Obično, farmaceutska kompozicija je formulisana tako da bude kompatibilna sa svojim predviđenim načinom primene. EVs (npr. egzozomi) prema ovom otkriću mogu se davati parenteralno, topikalno, intravenozno, oralno, subkutano, intraarterijski, intradermalno, transdermalno, rektalno, intrakranijalno, intraperitonealno, intranazalno, intratumoralno, intramuskularno ili kao inhalanti. U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koja sadrži EVs (npr. egzozome) se primenjuje intravenozno, npr. ubrizgavanjem. EVs (npr., egzozomi) mogu izborno da se primenjuju u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima koji su najmanje delimično efikasni u lečenju bolesti, poremećaja ili stanja za koje su EVs (npr. egzozomi) namenjeni.
[0328] Rastvori ili suspenzije mogu uključivati sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što je voda, fiziološki rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi sintetički rastvarači; antibakterijska jedinjenja kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidansi kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helatna jedinjenja kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA); pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati, i jedinjenja za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti kiselinama ili bazama, kao što su hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Preparat se može staviti u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili staklene ili plastične bočice sa više doza.
[0329] Farmaceutske kompozicije pogodne za upotrebu ubrizgavanjem uključuju sterilne vodene rastvore (ako su rastvorljivi u vodi) ili disperzije i sterilne prahove. Za intravenoznu primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ili fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS). Kompozicija je generalno sterilna i tečna do te mere da postoji lako ubrizgavanje. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji obuhvata, na primer, vodu, etanol, poliol (npr. glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići raznim antibakterijskim i antifungalnim jedinjenjima, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, askorbinska kiselina, timerosal i sl. Ako se želi, u kompoziciju se mogu dodati izotonična jedinjenja, npr. šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol i natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za ubrizgavanje može se postići uključivanjem u kompoziciju jedinjenja koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearat i želatin.
[0330] Sterilni rastvori za ubrizgavanje se mogu pripremiti ugrađivanjem EVs (npr. egzozoma) prema ovom otkriću u efektivnoj količini i u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom ovde nabrojanih sastojaka, po želji. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom EVs (npr. egzozoma) u sterilno sredstvo koje obuhvata osnovni disperzioni medijum i bilo koje željene druge sastojke. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za ubrizgavanje, postupci pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem koje daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora. EVs (npr., egzozomi) se mogu primeniti u obliku depo injekcije ili preparata implantata koji se može formulisati na takav način da omogući produženo ili pulsirajuće oslobađanje EVs (npr. egzozoma).
[0331] Sistemska primena kompozicija koje sadrže EVs (npr. egzozome) prema ovom otkriću takođe može biti transmukoznim putem. Za transmukoznu primenu, u formulaciji se koriste penetranti koji odgovaraju barijeri koja se prožima. Takvi penetranti su generalno poznati u tehnici i uključuju, na primer, za transmukoznu primenu, deterdžente, žučne soli i derivate fuzidinske kiseline. Transmukozna primena se može postići upotrebom, na primer, nazalnih sprejeva.
[0332] U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koja sadrži EVs (npr., egzozome) prema ovom otkriću se primenjuje intravenozno na subjektu koji bi imao koristi od farmaceutske kompozicije. U nekim drugim primerima izvođenja, kompozicija se primenjuje u limfni sistem, npr. intralimfatičkim ubrizgavanjem ili intranodalnim ubrizgavanjem (videti npr. Senti et a/., PNAS 105( 46): 17908 (2008)), ili intramuskularnim ubrizgavanjem, subkutanom primenom, intratumoralnim ubrizgavanjem, direktnim ubrizgavanjem u timus ili u jetru.
[0333] U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koja sadrži EVs (npr., egzozome) prema ovom otkriću se primenjuje kao tečna suspenzija. U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje kao formulacija koja je sposobna da formira depo nakon primene. U određenim poželjnim primerima izvođenja, depo polako oslobađa EVs (npr., egzozome) u cirkulaciju, ili ostaje u obliku depoa.
[0334] Obično, farmaceutski prihvatljive kompozicije su visoko prečišćene da ne sadrže zagađivače, biokompatibilne su i nisu toksične i pogodne su za primenu na subjektu. Ako je voda sastavni deo nosača, voda je visoko prečišćena i obrađena da ne sadrži zagađivače, na primer, endotoksine.
[0335] Farmaceutski prihvatljivi nosač može biti laktoza, dekstroza, saharoza, sorbitol, manitol, skrob, guma bagrema, kalcijum fosfat, alginati, želatin, kalcijum silikat, mikrokristalna celuloza, polivinilpirolidon, celuloza, voda, sirup, metil-celuloza, metilhidroksi benzoate, propilhidroksi benzoat, talk, magnezijum stearat i/ili mineralno ulje, ali se ne ograničava na njih. Farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži lubrikant, sredstvo za vlaženje, zaslađivač, pojačivač ukusa, emulgator, sredstvo za suspenziju i/ili konzervanas.
[0336] Farmaceutske kompozicije opisane ovde sadrže EVs (npr. egzozome) opisane ovde i izborno farmaceutski aktivno ili terapeutsko sredstvo, i/ili dijagnostičko sredstvo. Terapeutsko sredstvo može biti biološko sredstvo, sredstvo sa malim molekulima ili sredstvo nukleinske kiseline. Dijagnostički sredstvo može biti, na primer, kontrastni reagens.
[0337] Obezbeđeni su oblici doze koji sadrže farmaceutsku kompoziciju koja sadrži EVs (npr. egzozome) opisane ovde. U nekim primerima izvođenja, oblik doze je formulisan kao tečna suspenzija za intravensko ubrizgavanje. U nekim primerima izvođenja, oblik doze je formulisan kao tečna suspenzija za intratumoralno ubrizgavanje.
[0338] U određenim primerima izvođenja, priprema EVs (npr. egzozoma) prema ovom otkriću je podvrgnuta zračenju, npr. rendgenskim zracima, gama zracima, beta česticama, alfa česticama, neutronima, protonima, elementarnim jezgrima, UV zracima da bi se oštetile rezidualne nukleinske kiseline kompetentne za replikaciju.
[0339] U određenim primerima izvođenja, priprema EVs (npr. egzozoma) prema ovom otkriću je podvrgnuta gama zračenju korišćenjem doze zračenja većom od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ili većom od 100 kGy.
[0340] U određenim primerima izvođenja, priprema EVs (npr. egzozoma) prema ovom otkriću je podvrgnuta rendgenskim zracima korišćenjem doze zračenja većom od 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, ili
[0341] EVs (npr., egzozomi) prema ovom otkriću mogu se koristiti istovremeno sa drugim lekovima. Da budemo specifični, EVs (npr. egzozomi) prema ovom otkriću mogu se koristiti zajedno sa lekovima kao što su hormonska terapeutska sredstva, hemoterapeutska sredstva, imunoterapeutski sredstva, lekovi koji inhibiraju delovanje faktora rasta ćelija ili receptora faktora rasta ćelije i slično.
VIII. Terapeutske upotrebe
[0342] Ovo otkriće obezbeđuje postupke lečenja bolesti ili stanja kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrže primenjivanje kompozicije koja sadrži EVs (npr. egzozome) prema ovom otkriću na subjektu. Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupke prevencije ili ublažavanja simptoma bolesti ili stanja kod subjekta kome je to potrebno, koje sadrži primenjivanje kompozicije koja sadrži EVs (npr. egzozome) prema ovom otkriću na subjektu. Takođe su obezbeđeni postupci za dijagnostikovanje bolesti ili stanja kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrže primenjivanje kompozicije koja sadrži EVs (npr. egzozome) prema ovom otkriću na subjektu. Takođe su obezbeđeni EVs (npr. egzozomi) prema ovom otkriću za upotrebu u
1
terapiji, za upotrebu kao lek, za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja kod subjekta kome je to potrebno, za upotrebu u prevenciji ili ublažavanju simptoma bolesti ili stanja kod subjekta kome je to potrebno, ili za dijagnostikovanje bolesti ili stanja kod subjekta kome je to potrebno.
[0343] U jednom primeru izvođenja, bolest ili poremećaj je kancer, inflamatorna bolest, neurodegenerativni poremećaj, bolest centralnog nervnog sistema ili metabolička bolest.
[0344] Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupke prevencije i/ili lečenja bolesti ili poremećaja kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrže primenjivanje EV (npr., egzozoma) ovde otkrivene na subjektu. U nekim primerima izvođenja, bolest ili poremećaj koji se može lečiti ovim postupcima sadrži kancer, bolest graft protiv domaćina (GvHD), autoimunu bolest, infektivne bolesti ili fibrotične bolesti. U nekim primerima izvođenja, lečenje je profilaktičko. U drugim primerima izvođenja, EVs (npr., egzozomi) za ovo otkriće se koriste da izazovu imuni odgovor. U drugim primerima izvođenja, EVs (npr., egzozomi) za ovo otkriće se koriste za vakcinaciju subjekta. U nekim primerima izvođenja, bolest ili poremećaj je kancer.
[0345] U nekim primerima izvođenja, bolest ili poremećaj je zarazna bolest. U određenim primerima izvođenja, bolest ili poremećaj je onkogeni virus. U nekim primerima izvođenja, infektivne bolesti koje se mogu lečiti ovim otkrićem obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, humani gama herpes virus 4 (Epstein Barr virus), virus gripa A, virus gripa B, citomegalovirus, staphylococcus aureus, mycobacterium tuberculosis, chlamydia trachomatis, HIV-1, HIV-2, korona virusi (npr. MERS-CoV i SARS CoV), filovirusi (npr. Marburg i Ebola), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Plasmodia vrste (npr. vivax i falciparum), Chikunga virus, Humani papiloma virus (HPV), Hepatitis B, Hepatitis C, humani herpes virus 8, herpes simpleks virus 2 (HSV2), Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus sp., Proteus sp., Enterobacter sp., Actinobacter sp., koagulaze-negativne stafilokoke (CoNS), Mycoplasma sp. ili njihove kombinacije.
[0346] U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se primenjuju intravenozno u cirkulatorni sistem subjekta. U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se infundiraju u odgovarajuću tečnost i primenjuju u venu subjekta.
[0347] U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se primenjuju intra-arterijski u cirkulatorni sistem subjekta. U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se infundiraju u odgovarajuću tečnost i primenjuju u arteriju subjekta.
[0348] U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se primenjuju na subjektu intratekalnim davanjem. U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se primenjuju
1 1
ubrizgavanjem u kičmeni kanal, ili u subarahnoidalni prostor tako da dospe u cerebrospinalnu tečnost (CSF).
[0349] U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se primenjuju intratumoralno u jedan ili više tumora subjekta.
[0350] U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se primenjuju na subjektu intranazalnim davanjem. U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se mogu insuflirati kroz nos u obliku ili topikalne ili sistemske primene. U određenim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se primenjuju kao sprej za nos.
[0351] U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se primenjuju na subjektu intraperitonealnom primenom. U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se infundiraju u odgovarajuću tečnost i ubrizgavaju u peritoneum subjekta. U nekim primerima izvođenja, intraperitonealna primena rezultuje distribucijom EVs (npr. egzozoma) u limfne organe. U nekim primerima izvođenja, intraperitonealna primena rezultuje distribucijom EVs (npr. egzozoma) u timus, slezinu i/ili koštanu srž. U nekim primerima izvođenja, intraperitonealna primena rezultuje distribucijom EVs (npr. egzozoma) na jedan ili više limfnih čvorova. U nekim primerima izvođenja, intraperitonealna primena rezultuje distribucijom EVs (npr. egzozoma) u jedan ili više cervikalnih limfnih čvorova, ingvinalnih limfnih čvorova, medijastinalnih limfnih čvorova ili sternalnih limfnih čvorova. U nekim primerima izvođenja, intraperitonealna primena rezultuje distribucijom EVs (npr. egzozoma) u pankreas.
[0352] U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se primenjuju na subjektu periokularnom primenom. U nekim primerima izvođenja, EVs (npr. egzozomi) se ubrizgavaju u periokularna tkiva. Periokularna primena leka uključuje puteve subkonjunktivalne, prednje pod-Tenon-ove, posteriorne pod-Tenon-ove i retrobulbarne primene.
IX. Kompleti
[0353] Ovo otkriće takođe obezbeđuje komplete ili proizvedene proizvode koji sadrže jedan ili više EVs (npr. egzozoma) prema ovom otkriću i izborno uputstva za upotrebu. U nekim primerima izvođenja, komplet ili proizveden proizvod obuhvata ovde opisanu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedan EV (npr. egzozom) prema ovom otkriću i uputstva za upotrebu.
[0354] U nekim primerima izvođenja, komplet ili proizvedeni proizvod sadrži najmanje jedan EV (npr. egzozom) prema ovom otriću ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži EVs (npr. egzozome) u jednoj ili više bočica. Stručnjak u tehnici lako će prepoznati da se EVs (npr.
1 2
egzozomi) prema ovom otkriću, farmaceutska kompozicija koja sadrži EVs (npr. egzozome) prema ovom otkriću, ili njihove kombinacije mogu lako ugraditi u jedan od utvrđenih formata kompleta koji su dobro poznati u tehnici.
[0355] U nekim primerima izvođenja, komplet ili proizvedeni proizvod sadrži (i) EVs (npr. egzozome), (ii) jedan ili više korisne nosivosti, npr. biološki aktivnih molekula, (ii) reagense za kovalentno vezivanje jedne ili više korisne nosivosti, npr. biološki aktivnih molekula, sa EVs (npr., egzozomima), ili (iv) bilo koja njihova kombinacija, i uputstva za sprovođenje reakcije za kovalentno vezivanje jedne ili više korisne nosivosti, npr. biološki aktivnih molekula sa EVs (npr. egzozoma).
[0356] U nekim primerima izvođenja, komplet sadrži reagense za konjugaciju korisne nosivosti, npr. biološki aktivnog molekula sa EV (npr. egzozomom), i uputstva za sprovođenje konjugacije.
[0357] Praksa prema ovom otkriću će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike ćelijske biologije, ćelijske kulture, molekularne biologije, transgene biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su u okviru tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, na primer, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. Br. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) i u Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
1
SEKVENCE
[0358]
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
PRIMERI
[0359] Sledeći primeri su prikazani tako da stručnjacima u tehnici obezbede potpuno otkrivanje i opis kako da naprave i koriste ovo otkriće, i nemaju za cilj da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim otkrićem niti su namenjeni da predstavljaju da su eksperimenti u nastavku svi ili jedini izvedeni. Uloženi su napori da se obezbedi tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr. količine, temperatura, itd.), ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja.
[0360] Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po težini, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskog. Mogu se koristiti standardne skraćenice, npr. bp, bazni par(ovi); kb, kilobaza(e); pl, pikolitar(i); s ili sek, sekunda(e); min, minuta(e); h ili hr, sat(i); aa, aminokiselina(e); nt, nukleotid(i); i slično.
[0361] Praksa ovog otkrića će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke hemije proteina, biohemije, tehnika rekombinantne DNK i farmakologije, u okviru tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, npr., T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); AL. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences,
11
21th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 2005); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992).
Primer 1
Identifikacija minimalne sekvence proteina koja je dovoljna za oterećivanje korisnom nosivošću luminalnog egzozoma
[0362] Da bi se identifikovala minimalna BASP1 aminokiselinska sekvenca između skraćivanja od dvanaest aminokiselina koje je olakšalo opterećenje i skraćivanja od šest aminokiselina koje nije uspelo da olakša opterećenje kao što je prethodno u tekstu prikazano, pojedinačni mutanti sa skraćenim N-krajem BASP1 fuzionisani su sa FLAG® oznakom i GFP su generisani i stabilno eksprimirani u HEK293SF ćelijama (Slika 1A). Egzozomi su prečišćeni iz stabilnih ćelijskih kultura kao što je prethodno opisano. BASP1 sekvence od sedam do dvanaest aminokiselina bile su sposobne da opterete GFP u egzozomima visoke gustine, dok prvih šest aminokiselina nisu (Slika 1B). Ovi podaci pokazuju da je najmanje jedan lizinski ostatak posle pozicije šest potreban za luminalno opterećenje egzozoma sa N-krajem BASP1, odnosno za vezivanje za luminalnu površinu egzozoma.
[0363] Serin na poziciji 6 BASP1 je visoko konzerviran među vrstama i u MARCKS i MARCKSL1. Da bi se utvrdilo da li je ova aminokiselina potrebna za opterećenje korisnom nosivošću u egzozomima, HEK293SF ćelije su stabilno transfektovane ekspresionim plazmidima koji kodiraju BASP1 1-30- FLAG®-GFP ili BASP1 1-30- FLAG®-GFP uključujući tačkasti mutant, koji je zamenio serin šest sa asparaginskom kiselinom (S6D; polarno naelektrisana supstitucija) ili alaninom (S6A; mala nepolarna supstitucija). Pored toga, lizin na poziciji pet je mutiran u glutaminsku kiselinu (L5Q) da bi se testirala potencijalna uloga ove pozicije u modulaciji miristoilacije, palmitoilacije i drugih membranskih funkcija nekoliko proteina povezanih sa membranom (Gottlieb-Abraham et al., Mol. Biol. Cell. 2016 Dec 1;27(24):3926-3936) (Slika 2A). BASP1 S6D je potpuno ukinuo opterećivanje GFP u egzozome, dok S6A nije promenio opterećenje. BASP1 L5Q takođe nije uticao na luminalno opterećenje, što ukazuje da negativno naelektrisanje na poziciji šest ometa opterećenje, dok se supstitucija polarnim aminokiselina na poziciji pet dobro toleriše (Slika 2B).
[0364] Prvih trideset aminokiselina BASP1 obuhvata N-kraj vodeće sekvence prethodno identifikovane, praćenu lizinom bogatim delom aminokiselina. Da bi se razumelo da li MARCKS i MARCKSL1 N-krajevi mogu da učitaju egzozome slično BASP1, ćelije HEK293SF su stabilno transfektovane sa MARCKS i MARCKSL1 proteinima pune dužine ili
12
aminokiselinama 1-30 fuzionisanim sa FLAG®-GFP. Prečišćeni egzozomi su analizirani SDS PAGE i COOMASSIE® bojenjem da bi se odredio stepen opterećenja. MARCKS i MARCKSL1 pune dužine su bili u stanju da opterete egzozome sa GFP, ali su aminokiseline 1-30 bile inferiorne u odnosu na proteine pune dužine, što sugeriše da postoje dodatne strukturne karakteristike ili karakteristike sekvence u distalnim regionima MARCKS i MARCKSL1 proteina potrebnih za opterećenje (Slika 3). Analiza sekvence MARCKS i MARCKSL1 otkrila je regione sa potencijalnom homologijom sekvence sa N-krajem BASP1.
[0365] Aminokiseline 152-173 MARCKS i 87-110 MARCKSL1 su bogate lizinom sa umešanim ostacima fenilalanina i serina i predviđa se da su domeni mesta fosforilacije (PSD) ili efektorski domeni (ED) (Slika 4). Ćelije HEK293SF su stabilno transfektovane plazmidnim konstruktima koji fuzionišu aminokiseline 1-3 MARCKS sa PSD domenom (MG-PSD). Pojedinačne tačkaste mutacije su generisane na predviđenom mestu miristoilacije (MA-PSD) i poziciji šest (K6S i K6A) da bi se odredila uloga ovih ostataka u opterećivanju egzozoma (Slika 5A). Western blotting prečišćenih egzozoma je pokazao da u poređenju sa pozitivnom kontrolom BASP1 1-30, ni MG-PSD ni MA-PSD ne mogu efikasno opteretiti egzozome. Zanimljivo je da su mutacije K6A i K6S dovele do poboljšanja u opterećenju, što sugeriše da pozitivno naelektrisanje na poziciji 6 sprečava učitavanje egzozomalne korisne nosivosti i da bi PSD MARCKS mogao funkcionalno da se dopuni za endogeni N-kraj sekvence (Slika 5B). Zajedno, ove studije su omogućile identifikaciju nekoliko motiva dovoljnih za opterećenje korisnom nosivošću u egzozome (Slika 6).
[0366] Najuži motiv, Motiv 1, dozvoljava proteinsku sekvencu (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 118) or (G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 202) bez prvog Met, gde je svako slovo ili grupa slova u zagradi pozicija aminokiseline, i pri čemu dodatno pozicija pet ne može biti pozitivno naelektrisana aminokiselina (K/R/H), a pozicija šest ne može biti negativno naelektrisana aminokiselina ( D/E).
[0367] Podmotivi Motiva 1 uključuju, bez ograničenja, sekvence proteina:
(M)(G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 180), (G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 191) (M)(G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 181), (G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 192), (M)(G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 182), (G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 193), (M)(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 183),
(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 194),
(M)(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 184),
(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 195),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 185),
(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 196),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 186),
(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 197),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 187),
(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 198),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 188),
(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID BR: 199),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K) (SEQ ID BR: 189),
(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K) (SEQ ID BR: 200),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K) (SEQ ID BR: 190), i
(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K) (SEQ ID BR: 201),
gde pozicija pet ne može biti pozitivno naelektrisana aminokiselina (K/R/H), a pozicija šest ne može biti negativno naelektrisana aminokiselina (D/E).
[0368] Motiv 2, širi motiv, može se eksprimirati kao (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) ili (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) bez prvog Met, pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser), ξ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg, His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu). Videti R. Aasland et al., FEBS Letters 513 (2002): 141-144 za nomenklaturu aminokiselina.
[0369] Motiv 3, najširi motiv, može se eksprimirati kao (M)(G)(π)(X)((Φ/π)(π)(+)(+) ili (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) bez prvog Met, pri čemu svaka pozicija u zagradi predstavlja aminokiselinu, i pri čemu je π bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Pro, Gly, Ala, Ser), X je bilo koja aminokiselina, Φ je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), i (+) je bilo koja aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od (Lys, Arg , His); i pri čemu pozicija pet nije (+), a pozicija šest nije ni (+) ni (Asp ili Glu). U svim slučajevima Motiva 1-3, sekvenca može biti skraćena za jednu aminokiselinu da bude ukupno sedam aminokiseline po dužini (tj. sastoje se od aminokiselina 1-7 redosledom predstavljenim u Motivima 1-3). Bilo koja od sekvenci izvedena iz bilo kog od Motiva 1, 2 ili 3 (ili ovih motiva kojima nedostaje aminokiselina 7), može se koristiti za opterećenje korisnom nosivošću u egzozomima u istoj meri kao, ili uporedivo sa BASP1 pune dužine ili prirodnim skraćenim sekvencama BASP1. Ova duboka analiza aminokiselinske sekvence-strukture-funkcije obezbeđuje novi uvid u zahteve za usmeravanje biološki eksprimirane korisne nosivosti u egzozomima ćelijama proizvođačima.
Primer 2
N-kraj BASP1 je dovljan za opterećenje različitih klasa proteina
[0370] Rezultati u Primeru 1 sugerišu da N-kraj BASP1 može biti korisni konstruisani skeletni protein za generisanje luminalnog opterećenja egzozoma direktno iz ćelija proizvođača. Da bi se testirala ova hipoteza, generisane su stabilne ćelije HEK293SF da eksprimiraju Cas9 protein pune dužine uz optimizaciju kodona (kao što je opisano u Zetsche B, Volz SE, Zhang F. A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation. Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):139-42) fuzionisan sa aminokiselinama 1-30 ili 1-10 BASP1. Egzozomi su prečišćeni iz ćelijske kulture kao što je prethodno opisano i analizirani pomoću SDS-PAGE i Western blotting korišćenjem anti-Cas9 antitela (Abcam; Catalog # ab191468, clone 7A9-3A3). Kao što je prikazano na Sl.7A, i BASP11-30 i 1-10 su bili dovoljni da opterete Cas9 u egzozome. Rekombinantni Cas9 protein je korišćen kao pozitivna kontrola za Western blotting. Denzitometrijska kvantitacija i poređenje različitih količina rekombinantnih Cas9 i BASP1-Cas9 ekzozomskih traka iz eksperimenata Western blotting otkrilo je da su egzozomi opterećeni sa 4-5 Cas9 molekula po egzozomu (Slika 7B). Ovaj Cas9 enzim, čija je masa ∼160 kDa, predstavlja značajno povećanje veličine korisne nosivosti u poređenju sa GFP eksperimentima prethodno prikazanim.
[0371] Kao dodatna validacija raznolikosti korisne nosivosti proteina koji mogu biti opterećenje kao fuzija na N-kraju BASP1, ovalbumin je stabilno eksprimiran u HEK293SF ćelijama kao fuzija sa aminokiselinama 1-10 BASP1 („BASP1(1-10) )-OVA"). Odvojena ćelijska linija je ko-transfektovana sa istim plazmidom i drugim plazmidom koji kodira trimerni CD40L fuzionisan sa površinskim glikoproteinom PTGFRN specifičnim za egzozom ("3xCD40L-PTGFRN") korišćenjem drugog selektabilnog markera. Egzozomi su prečišćeni iz dve transfektovane ćelijske kulture i analizirani pomoću SDS-PAGE (Slika 8A) i antiovalbumin Western blotting (Abcam; Catalog # ab17293, clone 6C8) (Slika 8B). Kao kontrola, rekombinantni ovalbumin (InvivoGen; Catalog # vac-pova) je titriran u posebnom gelu. Ovalbumin je bio snažno opterećnje u egzozomima kada je fuzonisan sa
12
aminokiselinama 1-10 BASP1 kao pojedinačni konstrukt ili kada je u kombinaciji sa dodatnim plazmidom prekomerne ekspresije (3xCD40L-PTGFRN). Ovaj rezultat pokazuje da se egzozomi mogu kombinatorno konstruisati, kako sa luminalnom korisnom nosivosti, tako i sa istovremenim površinskom korisnom nosivosti (npr. PTGFRN) iz odvojenog transkripta.
[0372] Druga klasa proteina koja može biti korisna u kontekstu terapeutskih egzozoma su antitela i fragmenti antitela. Jednolančano nanotelo kamile koje ciljano deluje na GFP (kao što je opisano u Caussinus E, Kanca O, Affolter M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nat Struct Mol Biol. 2011 Dec 11;19(1):117-21) je stabilno eksprimiran u HEK293SF ćelijama kao fuzioni protein za aminokiseline 1-10 BASP1 i FLAG® oznaku ("BASP1(1-10)-Nanotelo") ili samo FLAG® oznaku ("Nanotelo") (Slika 9A). Prečišćeni egzozomi su analizirani pomoću SDS-PAGE i anti-FLAG® Western blotting, koji pokazuju da je došlo do značajnog obogaćivanja nanotela jednakim količinama ukupnog opterećenog proteina kada je nanotelo fuzionisano sa N-krajem BASP1 (Slika 9B). Ovi rezultati pokazuju da se proteinska korisna nosivost različitih klasa može eksprimirati i pakovati u egzozome ćelijama proizvođačima koristeći veoma kratku proteinsku sekvencu izvedenu iz N-kraja BASP1, tj., skeletnog proteina.
Primer 3
N-kraj BASP1 se može koristiti za opteećenje nukleinskim kiselinama u lumenu egzozoma
[0373] Nukleinske kiseline, a posebno RNKs (npr. mRNKs, siRNKs, miRNKs) su atraktivna klasa terapeutski korisne nosivosti koja opterećenje lumen terapeutskih egzozoma. Opterećivanje egzozoma sa RNK može zaštititi RNK od degradacije u vanćelijskom okruženju i opterećeni egzozom može biti usmeren na određene ćelije i/ili tkiva kroz dodatne nivoe konstruisanja egzozoma, na primer, površinsku ekspresiju konstrukta sa ciljanim delovanjem. Da bi se razumelo da li se EV, na primer, proteini egzozoma (ili fragmenti proteina) pretodno identifikovani, mogu koristiti za generisanje egzozoma opterećenih sa mRNK, generisani su kombinatorno konstruisani egzozomi. Kao što je prikazano na Sl. 10, aminokiseline 1-30 BASP1 su eksprimirane kao fuzija sa FLAG® i varijantama proteina faga MCP. MCP prepoznaje i vezuje se za mRNK matičnu petlju zvanu MS2, koja se može eksprimirati kao transkripciona fuzija sa mRNKs i drugim RNKs, čime se pokreće fizička povezanost između MCP fuzionih proteina i MS2 fuzionih RNKs od interesa. Mutacionom analizom je prethodno identifikovano dve pozicije u MCP koje povećavaju afinitet prema MS2; supstitucija valina na izoleucin na poziciji 29 (V29I; Lim & Peabody, RNA. Nucleic Acids Res. 1994 Sep 11;22(18):3748-52) i supstitucija asparagina lizinom na poziciji 55 (N55K; Lim et al., J Biol Chem.1994 Mar 25;269(12):9006-10). BASP11-30 je fuzionisan sa monomernim ili dimernim varijantama MCP, gde je svaki MCP bio ili V29I ili dvostruko mutiran V29I/N55K. Luciferazni reporterski konstrukt je eksprimiran kao fuzija sa 3 MS2 matične petlje iz zasebnog plazmida. Generisano je pet stabilnih HEK293SF ćelijskih linija, bilo samo Luciferaza-MS2 (#811) ili u kombinaciji sa svakom od BASP1-MCP varijanti (#815, 817, 819 ili 821) (Slika 10). Kao dodatna kontrola, ćelije HEK293SF su stabilno transfektovane sa BASP1 1-27 označenim sa FLAG. Egzozomi su izolovani i tretirani sa BENZONASE® da bi se uklonile bilo koje eksterno povezane mRNKs, i prečišćeni prema prethodno navedenim postupcima. Prečišćeni egzozomi su analizirani pomoću SDS-PAGE (slika 11A) i anti-FLAG® Western blotting (slika 11B), pokazujući jednake količine ukupnog proteina i uporedive nivoe BASP1-FLAGS fuzije u svakom preparatu egzozoma. Važno je da su BASP1-MCP fuzije eksprimirane na uporedivim nivoima kao BASP1 1-27 FLAG fuzija kojoj nedostaje MCP protein, što pokazuje da dodavanje MCP monomera ili dimera ne remeti BASP1 posredovano opterećenje proteina u egzozomima.
[0374] Ćelije koje stabilno eksprimiraju BASP1-MCP i mRNK Luciferaze-MS2 su izolovane i ukupna mRNK luciferaze je kvantifikovana pomoću RT-qPCR (FWD Primer: 5'-TGGAGGTGCTCAAAGAGTTG-3' (SEQ ID BR: 119); REV Primer: 5'-TTGGGCGTGCACTTGAT-3' (SEQ ID BR: 120); PROBE: 5'-/56-FAM/CAGCTTTCC/ZEN/GGGCATTGGCTTC/3IABkFQ/-3' (SEQ ID BR: 121)). Netransfektovane ćelije su eksprimirale niže nivoe luciferaze od svih ćelija koje eksprimiraju 811, koje su eksprimirale uporedive nivoe luciferaze (slika 12A, vrh). Prečišćeni egzozomi iz svake od stabilnih ćelijskih linija su takođe analizirani pomoću RT-qPCR. Nativni egzozomi nisu imali detektabilne nivoe luciferaze MS2, dok su ćelije koje eksprimiraju samo 811 imale detektabilne, ali veoma niske nivoe luciferaze MS2. Važno je da svaki od BASP1-MCP fuzionih proteina obuhvata veće količine mRNK Luciferaze-MS2, što pokazuje važnost vezivanja između MCP i MS2 da bi se olakšalo opterećenje mRNK u egzozome (Slika 12A, dole). Kvantifikacija relativne mRNK između grupa pokazala je obogaćivanje od ~30 do 60 puta za sve BASP1-MCP fuzije preko samo 811 (Slika 12B). Predviđeno je da BASP1-MCP konstrukt 821, koji je obuhvatao dimerni MCP V29I/N55K, ima najveći afinitet za MS2 mRNKs, i zaista je obuhvatao najveću količinu Luciferaze-MS2 u ovom eksperimentu. Ovi rezultati pokazuju da su BASP1 fragmenti robusni i svestrani skeletni proteini za opterećenje lumena egzozoma različitim korisnim nosivostima, uključujući nukleinske kiseline.
12
Primer 4
BASP1, MARCKS, i MARCKSL1 mogu se koristiti za generisanje površinski ukrašenih egzozoma
[0375] Rezultati u prethodnim eksperimentima pokazuju da se pune dužine i N-krajevi regiona MARCKS, MARCKSL1 i BASP1 mogu koristiti za generisanje luminalno opterećenih egzozoma. Da bi se dalje istražio potencijal ovih proteina za konstruisanje egzozoma, aminokiseline 1-30 MARCKS, MARCKSL1 i BASP1, ili aminokiseline 1-10 BASP1 su fuzionisane sa endogenim transmembranskim regionom CD40L eksprimiranim kao homotrimer. Konstrukti su pripremljeni i za humane i za mišje sekvence CD40L jer ligandi ne reaguju unakrsno sa srodnim receptorom na drugim vrstama (Slika 13). Egzozomi su prečišćeni iz HEK293SF ćelija koje su stabilno transfektovane sa jednim od konstrukta ekspresije CD40L i inkubirane u mišjim ili humanim B ćelijama. Količina ulaznog CD40L na egzozomima je kvantifikovana pomoću CD40L ELISA (za merenje humanog CD40L, R&D Systems, Catalog # DCDL40, Lot # P168248; a za merenje CD40L miša, korišćeni su Abcam, Catalog # ab119517, Lot # GR3218850-2), B ćelije su kvantifikovane korišćenjem markera B-ćelija, CD19, a aktivacija B ćelija je merena procentom zatvorenih ćelija pozitivnih na CD69. Krive titracije doze kod miša (Slika 14A) ili čoveka (Slika 14B) egzozomalnog CD40L u kulturama koje se podudaraju sa vrstama pokazale su uporedivu aktivnost između konstrukta na osnovu čestica do čestica (levi grafikoni i tabela u nastavku) ili u međusobnom poređenju i jednake količine rekombinantnog proteina na CD40L molarnoj osnovi (desni grafikoni i tabela u nastavku). Uporediva aktivnost je primećena kada su konstrukti CD40L takođe eksprimirani kao monomeri, i bili su samo nešto manje potentni od trimernog CD40L eksprimiranog na N-kraju PTGFRN, skeletnog proteina za prikaz egzozoma visoke gustine (videti, npr., Međunarodnu prijavu za patent br. PCT/US2018/048026) (SLIKA 14C). Ovi rezultati pokazuju da su MARCKS, MARCKSL1 i BASP1 raznovrsni, robusni skeletni proteini korisni za generisanje različitih klasa konstruisanih egzozoma za upotrebu u primeni kod ljudi i životinja.
Primer 5
Ekspresni različiti tipovi ćelija BASP1, MARCKS i/ili MARCKSL1
[0376] Ćelijske linije iz tkiva različitog porekla (HEK293, bubreg; HT1080, vezivno tkivo; K562, koštana srž; MDA-MB-231, dojke; Raji, limfoblast) su uzgajane do logaritamske faze i prebačene u medijum dopunjen serumom osiromašenim egzozomima na ∼6 dana osim HEK293 ćelija, koje su uzgajane u hemijski definisanim medijima. Mezenhimalne matične
12
ćelije (MSC) dobijene iz koštane srži su uzgajane na 3D mikronosačima pet dana i dopunjene u medijumu bez seruma tri dana. Supernatant iz svake kulture ćelijske linije je izolovan, a egzozomi su prečišćeni korišćenjem postupka OPTIPREP™ ultracentrifugiranja sa gradijentom gustine prethodno opisanog. Svaki od prečišćenih preparata egzozoma je analiziran pomoću LC-MS/MS kao što je prethodno opisano, a broj podudaranja peptidnog spektra (PSMs) je kvantifikovan za BASP1, MARCKS i MARCKSL1 i dva široko proučavana EV, npr. proteine egzozoma (CD81 i CD9). Tetraspanini CD81 i CD9 su se mogli detektovati u većini prečišćenih populacija egzozoma, ali su, u nekim slučajevima, bili jednaki ili niži od luminalnih EV proteina, npr. egzozoma (npr. uporedite CD9 sa BASP1 ili MARCKSL1) (Slika 15). Ovaj nalaz ukazuje da novoidentifikovani markeri luminalnog egzozoma mogu biti pogodni fuzioni proteini za generisanje konstruisanih egzozoma iz nekoliko nepovezanih ćelijskih linija izvedenih iz različitih tkiva.
Primer 6
Ne-humane ćelije koje prekomerno eksprimiraju BASP1 proizvode luminalno konstruisanje egzozoma
[0377] Rezultati u Primeru 5 pokazuju da brojne ćelije dobijene od ljudi prirodno eksprimiraju BASP1 i drugi novi EV. Da bi se utvrdilo da li se BASP1 može koristiti kao univerzalni skeletni protein egzozoma, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) su stabilno transfektovane ili sa plazmidom koji eksprimira BASP1 pune dužine fuzionisan sa FLAG® oznakom i GFP („BASP1-GFP-FLAG“) , plazmid koji eksprimira aminokiseline 1-30 BASP1 fuzionisan sa FLAG® oznakom i GFP („BASP1(1-30)-GFP-FLAG“) ili plazmid koji eksprimira aminokiseline 1-8 BASP1 fuzionisan sa FLAG® oznakom i GFP („BASP1(1-8)-GFP-FLAG“). Egzozomi su prečišćeni iz CHO ćelija divljeg tipa i CHO ćelija transfektovanih sa jednim od tri BASP1 plazmida. Kao što je prikazano na Slikama. 16A-B, BASP1 i fuzioni proteini BASP1 fragmenta su uspešno prekomerno eksprimirani u CHO ćelijama i opterećeni u egzozome kao što je otkriveno pomoću PAGE bez mrlja (Slika 16A) i Western blotting sa antitelom protiv FLAG® (Slika 16B). Ovaj rezultat pokazuje da ne-humane ćelije, kao što su CHO ćelije, mogu da proizvedu egzozome koji prekomerno eksprimiraju humane BASP1 fragmente, i da ova prekomerna ekspresija može da odvede korisnu nosivost proteina u lumen egzozoma velike gustine. Ovaj rezultat ukazuje da je BASP1 univerzalni skeletni protein za generisanje konstruisanih egzozoma iz mnogih različitih tipova i vrsta ćelija.
[0378] Ovo otkriće je prethodno opisano uz pomoć funkcionalnih gradivnih blokova koji ilustruju primenu specificiranih funkcija i njihovih odnosa. Granice ovih funkcionalnih građevnih blokova su ovde proizvoljno definisane u svrhu pogodnosti opisa. Alternativne
12
granice se mogu definisati sve dok se navedene funkcije i njihovi odnosi na odgovarajući način izvode.
Ekvivalenti
[0379] Ovo otkriće obezbeđuje, između ostalog, kompozicije EVs, npr. egzozome koji obuhvataju modifikovane egzogene proteine i peptide za upotrebu u obogaćivanju egzogenih proteina u EVs, npr. egzozomima. Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju obogaćenih EVs, npr. egzozoma. Iako su ilustrovani i opisani različiti specifični primeri izvođenja, prethodno navedena specifikacija nije ograničavajuća. Širina i obim ovog otkrića ne bi trebalo da budu ograničeni nijednim od prethodno opisanih oglednih primera izvođenja. Mnoge varijacije će postati očigledne stručnjacima u tehnici nakon pregleda ove specifikacije.
[0380] Ova prijava se poziva na prioritet Međunarodne prijave Br. PCT/US2018/061679, podnete 16. novembra 2018., i SAD privremene prijave Br. 62/835,430, podnete 17. aprila 2019.
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Izolovana vanćelijska vezikula (EV) koja sadrži biološki aktivan molekul povezan sa skeletnim proteinom,
pri čemu skeletni protein sadrži domen N-kraja (ND) i efektorski domen (ED), pri čemu je ND povezan sa luminalnom površinom EV, a ED je povezan sa luminalnom površinom EV,
pri čemu ND sadrži aminokiselinsku sekvencu GGKLSK (SEQ ID BR: 203), ali ne sadrži metionin (Met) na N-kraju,
pri čemu ED sadrži lizin (Lys) na svom N-kraju koji je direktno vezan za lizin na C-kraju SEQ ID BR: 203 u ND; i
pri čemu biološki aktivni molekul sadrži jedan ili više heterolognih proteina fuzionisanih na C-kraju skeletnog proteina.
2. EV prema patentnom zahtevu 1, naznačena time da ED sadrži KK, KKK, KKKK (SEQ ID BR: 151), KKKKK (SEQ ID BR: 152), ili bilo koju njihovu kombinaciju.
3. EV prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time da je skeletni protein povezan sa biološki aktivnim molekulom pomoću linkera.
4. EV prema patentnom zahtevu 3, naznačena time da linker sadrži linker koji se cepa.
5. EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time da skeletni protein sadrži GGKLSKKK (SEQ ID BR: 161) ili GGKLSKKS (SEQ ID BR: 162).
6. EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time da je skeletni protein najmanje oko 8 aminokiselina u dužini.
7. EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time da je biološki aktivni molekul na luminalnoj površini ili u lumenu EV.
8. EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time da skeletni protein dalje sadrži:
(i) transmembranski domen,
(ii) ekstravezikularni domen, ili
(iii) oboje (i) i (ii).
9. EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time da skeletni protein dalje sadrži transmembranski domen i ekstravezikularni domen i:
(i) transmembranski domen je između ED domena skeletnog proteina i biološki aktivnog molekula, i
(ii) biološki aktivan molekul je povezan sa ekstravezikularnim domenom.
2 2
10. EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačena time da biološki aktivni molekul sadrži:
(a) protein, pri čemu protein izborno sadrži
(i) rekombinantni peptid, prirodni peptid, sintetički peptid, antitelo, fuzioni protein ili bilo koju njihovu kombinaciju;
(ii) enzim, citokin, ligand, receptor, faktor transkripcije ili njihovu kombinaciju; (iii) T-ćelijski receptor (TCR), T-ćelijski ko-receptor, glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC), humani leukocitni antigen (HLA) ili njihov derivat; (iv) tumorski antigen izborno odabran iz grupe koja se sastoji od alfa-fetoprotein (AFP), karcinoembrionalni antigen (CEA), epitelni tumorski antigen (ETA), mucin 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucin 16 (MUC16), tirozinaza, antigen povezan sa melanomom (MAGE), tumorski protein p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligand 1 programirane smrti (PD-L1), ligand 2 programirane smrti (PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, mezotelin, VEGFR, alfa-folatni receptor, CE7R, IL-3, antigen kancera testisa, MART-1 gp100 i ligand koji indukuje apoptozu povezan sa TNF;
(b) polipeptid;
(c) peptid;
(d) polinukleotid (DNK i/ili RNK);
(e) hemijsko jedinjenje;
(f) virus, pri čemu virus izborno sadrži adeno-povezani virus, parvovirus, retrovirus, adenovirus ili bilo koju njihovu kombinaciju;
(g) jonofor;
(h) nosač za jonofor;
(i) deo koji formira kanal ili poru; ili
(j) bilo koju njihovu kombinaciju.
11. EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, naznačena time da EV dalje sadrži drugi skeletni protein, pri čemu drugi skeletni protein izborno sadrži PTGFRN polipeptid, BSG polipeptid, IGSF2 polipeptid, IGSF3 polipeptid, IGSF8 polipeptid, ITGB1 polipeptid, ITGA4 polipeptid, SLC3A2 polipeptid, polipeptid ATP transportera, polipeptid aminopeptidaze N (ANPEP), polipeptid člana porodice 1 ektonukleotid pirofosfataze/fosfodiesteraze (ENPP1), polipeptid neprilizina (MME), polipeptid neuropilin-1 (NRP1), ili njegov fragment.
12. EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačena time da je biološki aktivni molekul:
(a) inhibitor za regulator negativne kontrolne tačke ili inhibitor za vezujućeg partnera regulatora negativne kontrolne tačke, pri čemu je regulator negativne kontrolne tačke izborno odabran iz grupe koja se sastoji od:
(i) citotoksični protein 4 povezan sa T-limfocitima (CTLA-4),
(ii) protein 1 programirane ćelijske smrti (PD-1),
(iii) gen 3 aktiviran limfocitima (LAG-3),
(iv) T-ćelijski imunoglobulin koji obuhvata mucin protein 3 (TIM-3),
(v) atenuator B i T limfocita (BTLA),
(vi) T ćelijski imunoreceptor sa Ig i ITIM domenima (TIGIT),
(vii) V-domen Ig supresora aktivacije T ćelija (VISTA),
(viii) adenozinski A2a receptor (A2aR),
(ix) imunoglobulinu sličan receptor ćelijama ubica (KIR),
(x) indoleamin 2,3-dioksigenaza (IDO),
(xi) CD20,
(xii) CD39, i
(xiii) CD73;
(b) imunogeni protein;
(c) toksin, toksoid ili netoksični mutant toksina, pri čemu
(i) toksin je izborno toksin difterije, ili
(ii) toksoid je izborno tetanusni toksoid;
(d) aktivator za pozitivan ko-stimulativni molekul ili aktivator za vezujućeg partnera pozitivnog ko-stimulativnog molekula, pri čemu je pozitivni ko-stimulativni molekul izborno odabran iz grupe koja se sastoji od:
(i) člana superfamilije TNF receptora izborno odabranog iz grupe koja se sastoji od: CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas receptor, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK receptor, TACI, BAFF receptor, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, i XEDAR, izborno pri čemu je aktivator za pozitivni ko-stimulativni molekul član TNF superfamilije izborno odabran iz grupe koja se sastoji od: TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB ligand, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR ligand, i EDA-2; i
2 4
(ii) ko-stimulativni molekul CD28-superfamilije, izborno odabran između ICOS i CD28, izborno pri čemu je aktivator za pozitivni ko-stimulativni molekul ICOSL, CD80 ili CD86.
13. EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, naznačena time da je EV egzozom.
14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
15. EV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13 za upotrebu u prevenciji ili lečenju bolesti kod subjekta kome je to potrebno.
2
RS20220009A 2018-11-16 2019-05-22 Konstruisane vanćelijske vezikule i njihove upotrebe RS62863B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2018/061679 WO2019099942A1 (en) 2017-11-17 2018-11-16 Compositions of engineered exosomes and methods of loading luminal exosomes payloads
US201962835430P 2019-04-17 2019-04-17
PCT/US2019/033629 WO2020101740A1 (en) 2018-11-16 2019-05-22 Engineered extracellular vesicles and uses thereof
EP19731027.9A EP3672614B1 (en) 2018-11-16 2019-05-22 Engineered extracellular vesicles and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62863B1 true RS62863B1 (sr) 2022-02-28

Family

ID=70732111

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220009A RS62863B1 (sr) 2018-11-16 2019-05-22 Konstruisane vanćelijske vezikule i njihove upotrebe

Country Status (28)

Country Link
EP (3) EP4059510B1 (sr)
JP (2) JP7538795B2 (sr)
KR (1) KR20210098473A (sr)
CN (2) CN113286603B (sr)
AU (1) AU2019378591A1 (sr)
BR (1) BR112021009231A2 (sr)
CA (1) CA3119720A1 (sr)
CL (1) CL2021001278A1 (sr)
CY (1) CY1124897T1 (sr)
DK (1) DK3672614T3 (sr)
EA (1) EA202191334A1 (sr)
ES (1) ES2907967T3 (sr)
HR (1) HRP20220020T1 (sr)
HU (1) HUE057300T2 (sr)
IL (1) IL283167A (sr)
LT (1) LT3672614T (sr)
MA (1) MA49971B1 (sr)
MD (1) MD3672614T2 (sr)
MX (1) MX2021005636A (sr)
PH (1) PH12021551088A1 (sr)
PL (1) PL3672614T3 (sr)
PT (1) PT3672614T (sr)
RS (1) RS62863B1 (sr)
SG (1) SG11202104956QA (sr)
SI (1) SI3672614T1 (sr)
SM (1) SMT202200156T1 (sr)
TW (2) TWI846697B (sr)
WO (1) WO2020101740A1 (sr)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202111290WA (en) * 2019-04-17 2021-11-29 Codiak Biosciences Inc Compositions of exosomes and aav
EP3994158A1 (en) 2019-07-03 2022-05-11 Codiak BioSciences, Inc. Extracellular vesicles targeting t cells and uses thereof
KR20220070433A (ko) * 2019-08-14 2022-05-31 코디악 바이오사이언시즈, 인크. Stat6을 표적으로 하는 세포외 소포-aso 작제물
CA3147366A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Adam T. BOUTIN Extracellular vesicles with stat3-antisense oligonucleotides
CA3147701A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles with antisense oligonucleotides targeting kras
AU2020330133A1 (en) * 2019-08-14 2022-03-17 Lonza Sales Ag Extracellular vesicle-ASO constructs targeting CEBP/beta
MX2022003570A (es) 2019-09-25 2022-07-11 Codiak Biosciences Inc Composiciones de vesícula extracelular.
KR20220094221A (ko) 2019-09-25 2022-07-05 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 종양의 치료를 위한 il-12 디스플레잉 엑소좀과 조합된 sting 효능제 포함 엑소좀
WO2021062290A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Methods of producing extracellular vesicles
WO2021062057A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Exogenous loading of exosomes via lyophilization
WO2021062058A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Sting agonist comprising exosomes for treating neuroimmunological disorders
KR20210116324A (ko) 2020-03-12 2021-09-27 기초과학연구원 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 세포 사멸 유도 방법
WO2021184020A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Methods of treating neuroinflammation
US20230114434A1 (en) 2020-03-13 2023-04-13 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles for treating neurological disorders
WO2021184021A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting pmp22
JP2023518414A (ja) 2020-03-20 2023-05-01 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 治療のための細胞外小胞
US20230220068A1 (en) 2020-06-05 2023-07-13 Codiak Biosciences, Inc. Anti-transferrin extracellular vesicles
WO2022032140A2 (en) * 2020-08-07 2022-02-10 Amicus Therapeutics, Inc. Vesicle targeting proteins and uses of same
CA3193107A1 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Codiak Biosciences, Inc. Process for preparing extracellular vesicles
WO2022066883A1 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles comprising kras antigens and uses thereof
WO2022066928A2 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Codiak Biosciences, Inc. Process for preparing extracellular vesicles
GB202015399D0 (en) * 2020-09-29 2020-11-11 Evox Therapeutics Ltd Engineered extracellular vesicles displaying enhanced pharmacokinetics
US20230364127A1 (en) 2020-10-06 2023-11-16 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting stat6
CN112410304A (zh) * 2020-11-12 2021-02-26 天津大学 一种基因修饰的外泌体及其制备方法和应用
CN112899307A (zh) * 2021-01-28 2021-06-04 苏州大学 GluN1和/或GluN2亚基羧基末端豆蔻酰化的NMDA受体的应用
JP2024506712A (ja) 2021-02-17 2024-02-14 ロンザ セールス アーゲー 細胞外ベシクルを負荷する方法
CA3207944A1 (en) * 2021-02-17 2022-08-25 Ajay Verma Extracellular vesicle-nlrp3 antagonist
KR20230166101A (ko) 2021-04-01 2023-12-06 론자 세일즈 아게 세포외 소포 조성물
CN114057893B (zh) * 2021-04-26 2022-12-30 苏州大学 一种编码线粒体定位的豆蔻酰化多肽及其制备方法与应用
CN117126886A (zh) * 2022-05-20 2023-11-28 谛邈生物科技(北京)有限公司 一种实现工程化EVs功能蛋白模块化装载的核酸构建体及其应用
KR102788272B1 (ko) * 2022-05-24 2025-04-01 주식회사 시프트바이오 표면-개질된 세포외 소포체 및 이의 치료학적 용도
WO2024215711A1 (en) * 2023-04-10 2024-10-17 Wake Forest University Health Sciences Modified mammalian vesicles and compositions and methods related thereto
CN116769718A (zh) * 2023-04-21 2023-09-19 南京逸微健华生物科技有限公司 一种工程化细胞外囊泡及用途
WO2024226723A1 (en) * 2023-04-26 2024-10-31 Northwestern University Active loading of biomolecular cargo into engineered vesicles
CN118909084A (zh) * 2023-05-08 2024-11-08 天津外泌体科技有限公司 细胞外囊泡支架蛋白及其应用
EP4644537A1 (en) 2024-04-30 2025-11-05 ConvEyXo Targeted extracellular vesicle
WO2025232431A1 (zh) * 2024-05-08 2025-11-13 天津外泌体科技有限公司 筛选影响细胞外囊泡被摄取的基因的系统和方法
WO2026055342A1 (en) 2024-09-04 2026-03-12 Arsenal Biosciences, Inc. Synthetic pathway activators

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP2254586B1 (en) * 2008-02-22 2015-04-08 Agency For Science, Technology And Research (A*star) Mesenchymal stem cell particles
FR2950350B1 (fr) 2009-09-24 2013-12-13 Centre Nat Rech Scient Nouveaux polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leurs utilisations
WO2016004043A1 (en) * 2014-06-30 2016-01-07 Blend Therapeutics, Inc. Targeted conjugates and particles and formulations thereof
WO2016138525A1 (en) * 2015-02-27 2016-09-01 University Of Washington Polypeptide assemblies and methods for the production thereof
WO2016172598A1 (en) * 2015-04-22 2016-10-27 The Broad Institute Inc. Exosomes and uses thereof
EP3397264A4 (en) * 2015-12-30 2019-06-05 The Regents of The University of California METHOD FOR IMPROVED PREPARATION AND INSULATION OF CELL-DERIVED VESICLES
US10617768B2 (en) * 2016-07-12 2020-04-14 Santa Clara University Engineered exosomes for the delivery of bioactive cargo using transmembrane tetraspanins
US20210290556A1 (en) * 2016-08-22 2021-09-23 Codiak Biosciences, Inc. Methods of suppressing delivery of exosomes to liver and spleen
US20200025685A1 (en) * 2016-12-15 2020-01-23 Codiak Biosciences, Inc. Methods of measuring exosomes using intrinsic fluorescence
IL272786B2 (en) 2017-08-25 2025-03-01 Codiak Biosciences Inc Preparation of therapeutic exosomes using membrane proteins
WO2019099942A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 Codiak Biosciences, Inc. Compositions of engineered exosomes and methods of loading luminal exosomes payloads
EP3841112A1 (en) * 2018-08-24 2021-06-30 Codiak BioSciences, Inc. Extracellular vesicles targeting dendritic cells and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022513049A (ja) 2022-02-07
AU2019378591A1 (en) 2021-06-17
TW202438105A (zh) 2024-10-01
EP4628099A2 (en) 2025-10-08
TW202038993A (zh) 2020-11-01
WO2020101740A1 (en) 2020-05-22
WO2020101740A9 (en) 2021-06-10
EA202191334A1 (ru) 2022-02-10
HRP20220020T1 (hr) 2022-04-01
EP4628099A3 (en) 2025-11-19
MA49971A (fr) 2020-07-01
PH12021551088A1 (en) 2022-01-03
SMT202200156T1 (it) 2022-05-12
SG11202104956QA (en) 2021-06-29
EP4059510B1 (en) 2025-05-21
EP4059510A1 (en) 2022-09-21
ES2907967T3 (es) 2022-04-27
DK3672614T3 (da) 2022-01-10
CY1124897T1 (el) 2023-01-05
MA49971B1 (fr) 2022-01-31
IL283167A (en) 2021-06-30
EP3672614A1 (en) 2020-07-01
EP3672614B1 (en) 2021-10-06
PT3672614T (pt) 2022-02-11
MD3672614T2 (ro) 2022-04-30
CN113286603A (zh) 2021-08-20
CN113286603B (zh) 2025-07-22
JP7538795B2 (ja) 2024-08-22
SI3672614T1 (sl) 2022-04-29
EP4059510C0 (en) 2025-05-21
CN121102502A (zh) 2025-12-12
CA3119720A1 (en) 2020-05-22
CL2021001278A1 (es) 2022-03-11
JP2024097929A (ja) 2024-07-19
LT3672614T (lt) 2022-04-11
BR112021009231A2 (pt) 2021-08-10
KR20210098473A (ko) 2021-08-10
MX2021005636A (es) 2021-07-06
TWI846697B (zh) 2024-07-01
HUE057300T2 (hu) 2022-05-28
PL3672614T3 (pl) 2022-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3672614B1 (en) Engineered extracellular vesicles and uses thereof
US20230323401A1 (en) Methods and compositions for genome editing
US20220251200A1 (en) Extracellular vesicles targeting t cells and uses thereof
TW202024120A (zh) 靶向樹突狀細胞之胞外囊泡及其用途
US20200208177A1 (en) Methods and compositions for genome editing
US20220017907A1 (en) Engineered extracellular vesicles and uses thereof
US20250249072A1 (en) Methods of treating cancer
HK40032716B (en) Engineered extracellular vesicles and uses thereof
HK40032716A (en) Engineered extracellular vesicles and uses thereof
US20220218811A1 (en) Methods of treating tuberculosis
WO2021003425A1 (en) Methods of inducing hematopoiesis