KR20140111272A - 양이온성 지질의 조합을 함유하는 지질 나노 입자 - Google Patents

양이온성 지질의 조합을 함유하는 지질 나노 입자 Download PDF

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다케시 구보야마
도모히로 에라
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교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 예컨대, 핵산을 세포 내 등에 도입하는 것을 쉽게 하는 양이온성 지질을 함유하는 약물 송달을 위한, 식(I)
Figure pct00027

(식에서, R1 및 R2는 동일하거나 또는 다르며 알케닐 등이고, X3은 존재하지 않거나, 알킬 등이며, X1 및 X2는 수소 원자이거나, 또는 함께 단결합 혹은 알킬렌을 형성하고, Y1은 존재하지 않거나, 음이온이며, L1은 단결합 등이고, R3은 알킬 등이다)으로 표시되는 양이온성 지질, 및 식(II)
Figure pct00028

(식에서, R4 및 R5는 동일하거나 또는 다르며 알케닐 등이고, X4 및 X5는 수소 원자이거나, 또는 함께 단결합 혹은 알킬렌을 형성하고, X6은 존재하지 않거나, 알킬 등이며, Y2는 존재하지 않거나, 음이온이고, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 0∼3이고, L4는 단결합 등이고, R6은 알킬 등이며, L2 및 L3은 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이다)으로 표시되는 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자 등을 제공한다.

Description

양이온성 지질의 조합을 함유하는 지질 나노 입자{LIPID NANO PARTICLES COMPRISING COMBINATION OF CATIONIC LIPIDS}
본 발명은, 예컨대, 핵산을 세포 내 등에 도입하는 것을 용이하게 하는 양이온성 지질의 조합을 함유하는 지질 나노 입자 등에 관한 것이다.
양이온성 지질이란, 하나 또는 복수의 탄화수소기를 포함하는 지질 친화성 영역과, 적어도 하나의 플러스로 대전된 극성 헤드 그룹을 포함하는 친수성 영역을 갖는 양친매성 분자이다. 양이온성 지질과 핵산 등의 거대 분자가, 총 하전으로서 플러스로 대전하는 복합체를 형성함으로써, 핵산 등의 거대 분자가 세포의 원형질막을 통과하여 세포질에 들어가기 쉽게 되기 때문에, 양이온성 지질은 유용하다. 인비트로 및 인비보에 있어서 행할 수 있는 이 프로세스는, 트랜스펙션으로서 알려져 있다.
전형적으로는, 양이온성 지질은 단독으로 이용되거나 또는 인지질 등의 중성 지질과 조합된다. 양이온성 지질과 중성 지질을 조합하는 것은, 정렬된 지질 이중층을 포함하는 소포를 용이하게 형성할 수 있으므로 유용하다는 것이 알려져 있다. 양이온성 지질이 단독으로 또는 중성 지질과 조합되어 형성하는 소포 또는 리포좀은, 표면에 다수의 플러스 하전을 지니고, 이 하전에 의해, 폴리뉴클레오티드 또는 마이너스로 대전된 단백질 등의 다른 음이온 분자와 복합체를 형성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드/양이온성 지질/중성 지질 복합체의 표면상의 나머지 총 양이온 하전에 의해, 세포막 표면의 주로 마이너스의 전하와 강한 상호 반응을 일으킬 수 있다.
많은 다른 종류의 양이온성 지질이, 트랜스펙션에 사용하기 위해서 합성되고 있으며, 현재 시판되고 있다. 이러한 양이온성 지질에는, 예컨대 Lipofectin, Lipofectin ACE, Lipofect AMINE, Transfeactam, DOTAP 등이 있다.
특허문헌 1 중에 개시된, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로리드(DOTMA) 등은 초기에 개발된 양이온성 지질의 하나이다. DOTMA 등은, 분자에 양이온 부위를 부여하는, 제4급 질소를 갖는 프로파나미늄기, 및 분자의 프로필 백본에 에테르 결합하는 한 쌍의 고급 탄화수소에 의해 특징지어진다. 제4급 질소는, 메틸기 등의 비교적 단쇄의 알킬쇄로 3치환되어 있다. 구조상 유사한 양이온성 지질, N-(2,3-디-(9-(Z)-옥타데세노일옥시))-프로파-1-일-N,N,N-트리메틸암모늄클로리드(DOTAP)는, 에테르 결합한 알킬기가 아니라, 아실기를 포함한다.
특허문헌 2 및 3 중에 개시된, 예컨대, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸브롬화암모늄(DORIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카르복시아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄트리플루오로초산(DOSPA) 등은, 분자에 양이온 부위를 부여하는, 제4급 질소를 갖는 프로파나미늄기, 및 분자의 프로필 백본에 에테르 결합하는 한 쌍의 고급 탄화수소에 의해 특징지어지고, 또한 제4급 질소는, 메틸기 등의 비교적 단쇄의 알킬쇄와 히드록시알킬로 3치환되어 있는 것에 의해 특징지어진다.
특허문헌 4 중에는, 예컨대, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA) 등이 개시되어 있다. DLinDMA 등은, 보다 유연한 양이온성 지질을 개발하는 것, 이에 따라 리포좀 등의 막 유동성을 높이는 것을 목적으로, 구조상 유사한 양이온성 지질인 DOTAP 및 DOTMA의 고급 알킬기를, 불포화 부위를 적어도 2곳 포함하는 고급 알킬기로 한 것에 의해 특징지어진다. 또한, 특허문헌 5 중에는, 예컨대 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA) 등이 개시되어 있다.
또한, 특허문헌 6 중에는, 예컨대 (3R,4R)-3,4-비스((Z)-헥사데카-9-에닐옥시)-1-메틸피롤리딘(화합물 14), N-메틸-N,N-비스(2-((Z)-옥타데카-6-에닐옥시)에틸)아민(화합물 36) 등이 개시되어 있다.
한편, 특허문헌 7 중에는, N-메틸-N,N-디올레일아민 등의 단순 알킬아민형(의 염)의 양이온성 지질이 개시되어 있다.
특허문헌 1: 일본 특허공개 소61-161246호 공보(미국 특허 5049386호 명세서) 특허문헌 2: 국제공개 제91/16024호 특허문헌 3: 국제공개 제97/019675호 특허문헌 4: 국제공개 제2005/121348호 특허문헌 5: 국제공개 제2009/086558호 특허문헌 6: 국제공개 제2011/136368호 특허문헌 7: 국제공개 제1998/051278호
본 발명의 목적은, 예컨대, 핵산을 세포 내 등에 도입하는 것을 용이하게 하는 양이온성 지질을 함유하는 약물 송달을 위한 지질 나노 입자 등을 제공하는 것이다.
본 발명은 이하의 (1)∼(34)에 관한 것이다.
(1) 식(I)
Figure pct00001
(식에서, R1 및 R2는 동일하거나 또는 다르며 탄소수 10∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
X1 및 X2는 수소 원자이거나, 또는 함께 단결합 혹은 알킬렌을 형성하고,
X3은 존재하지 않거나, 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐이고,
X3이 존재하지 않는 경우에는,
Y1도 존재하지 않고, L1은 단결합이며, R3은 수소 원자, 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이거나, 혹은
Y1도 존재하지 않고, L1은 -CO- 또는 -CO-O-이며, R3은 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일, 모르폴린-3-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 또는 모르폴리닐이고,
X3이 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐인 경우에는,
Y1은 제약상 허용할 수 있는 음이온이고, L1은 단결합이며, R3은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이다)으로 표시되는 양이온성 지질 및 식(II)
Figure pct00002
(식에서, R4 및 R5는 동일하거나 혹은 다르며 탄소수 12∼24의 직쇄상 혹은 분지상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이거나, 또는 R4 및 R5가 함께 디알킬메틸렌, 디알케닐메틸렌, 디알키닐메틸렌 혹은 알킬알케닐메틸렌을 형성하고,
X4 및 X5는 수소 원자이거나, 또는 함께 단결합 혹은 알킬렌을 형성하고,
X6은 존재하지 않거나, 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐이고,
X6이 존재하지 않는 경우에는,
Y2도 존재하지 않고, a 및 b는 0이며, L4는 단결합이고, R6은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, L2 및 L3은 -O-이거나,
Y2도 존재하지 않고, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 0∼3이면서, a와 b가 동시에 0은 아니고, L4는 단결합이며, R6은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이거나,
Y2도 존재하지 않고, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 0∼3이고, L4는 단결합이며, R6은 수소 원자이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이거나, 혹은
Y2도 존재하지 않고, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 0∼3이고, L4는 -CO- 또는 -CO-O-이며, R6은 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일, 모르폴린-3-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 또는 모르폴리닐이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이고,
X6이 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐인 경우에는,
Y2는 제약상 허용할 수 있는 음이온이고, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 0∼3이고, L4는 단결합이며, R6은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이다)으로 표시되는 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자.
(2) R1 및 R2가, 도데실, 테트라데실, (Z)-도데카-7-에닐, (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-4-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐, (E)-헥사데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐, (7Z,10Z,13Z)-헥사데카-7,10,13-트리에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 상기 (1)에 기재한 지질 나노 입자.
(3) R1 및 R2가 동시에 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐 또는 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐인 상기 (1)에 기재한 지질 나노 입자.
(4) L1이 단결합이고, R3이 수소 원자, 메틸, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 상기 (1)∼(3) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(5) L1이 -CO- 또는 -CO-O-이고, R3이 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐인 상기 (1)∼(3) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(6) X1 및 X2가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하는 상기 (1)∼(5) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(7) X1 및 X2가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하고, R3이 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 상기 (1)∼(5) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(8) X1 및 X2가 수소 원자이고, R3이 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 상기 (1)∼(5) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(9) X3이 존재하지 않는 상기 (1)∼(8) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(10) L2 및 L3이 -O- 또는 -O-CO-이고, R4 및 R5가 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, 이코실, 도코실, 테트라코실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리에닐 또는 3,7,11,15-테트라메틸헥사데카-2-에닐인 상기 (1)∼(9) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(11) L2 및 L3이 -CO-O-이고, R4 및 R5가 트리데실, 펜타데실, 헵타데실, 노나데실, 헤니코실, 트리코실, (Z)-트리데카-8-에닐, (Z)-펜타데카-8-에닐, (Z)-헵타데카-5-에닐, (Z)-헵타데카-8-에닐, (E)-헵타데카-8-에닐, (Z)-헵타데카-10-에닐, (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디에닐, (8Z,11Z,14Z)-옥타데카-8,11,14-트리에닐, (Z)-노나데카-10-에닐, (10Z,13Z)-노나데카-10,13-디에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 2,6,10-트리메틸운데카-1,5,9-트리에닐 또는 2,6,10,14-테트라메틸펜타데카-1-에닐인 상기 (1)∼(9) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(12) L4가 단결합이고, R6이 수소 원자, 메틸, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 상기 (1)∼(11) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(13) L4가 -CO- 또는 -CO-O-이고, R6이 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐인 상기 (1)∼(11) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(14) X4 및 X5가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하는 상기 (1)∼(13) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(15) X4 및 X5가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하고, R6이 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 상기 (1)∼(13) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(16) X4 및 X5가 수소 원자이고, R6이 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 상기 (1)∼(13) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(17) X4 및 X5가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하고, R6이 동일하거나 또는 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 또는 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐인 상기 (1)∼(13) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(18) X4 및 X5가 수소 원자이고, R6이 동일하거나 또는 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 또는 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐인 상기 (1)∼(13) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(19) X6이 존재하지 않거나, 메틸인 상기 (1)∼(18) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(20) 약물로서 핵산을 함유하는 상기 (1)∼(19) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(21) 양이온성 지질이, 상기 핵산과 복합체를 형성하고 있거나, 또는 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 상기 핵산과의 복합체를 형성하고 있는 상기 (20)에 기재한 지질 나노 입자.
(22) 양이온성 지질이, 상기 핵산과 복합체를 형성하고 있거나, 또는 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 상기 핵산과의 복합체를 형성하고 있고, 상기 복합체 및 상기 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성된 상기 (20)에 기재한 지질 나노 입자.
(23) 핵산이 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산인 상기 (20)∼(22) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자.
(24) 표적 유전자가 종양 또는 염증에 관련되는 유전자인 상기 (23)에 기재한 지질 나노 입자.
(25) 상기 (20)∼(24) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자를 이용하여 상기 핵산을 세포 내에 도입하는 방법.
(26) 세포가 포유류의 종양 또는 염증 부위에 있는 세포인 상기 (25)에 기재한 방법.
(27) 세포가 포유류의 간장, 폐, 신장 또는 비장에 있는 세포인 상기 (25) 또는 (26)에 기재한 방법.
(28) 세포 내에 도입하는 방법이 정맥내 투여에 의해서 세포 내에 도입하는 방법인 상기 (26) 또는 (27)에 기재한 방법.
(29) 상기 (1)∼(24) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자를 포유동물에게 투여하는 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(30) 투여하는 방법이 정맥내 투여인 상기 (29)에 기재한 방법.
(31) 상기 (1)∼(24) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자를 포함하는, 질환의 치료에 이용하기 위한 의약.
(32) 정맥내 투여용인 상기 (31)에 기재한 의약.
(33) 상기 (1)∼(24) 중 어느 것에 기재한 지질 나노 입자를 포함하는, 암 또는 염증 질환의 치료에 이용하기 위한 암 또는 염증 질환의 치료제.
(34) 정맥내 투여용인 상기 (33)에 기재한 암 또는 염증 질환의 치료제.
예컨대 핵산을 함유하는 본 발명의 약물 송달을 위한 지질 나노 입자를 포유류 등에게 투여함으로써, 그 핵산을 예컨대 세포 내 등에 용이하게 도입할 수 있다.
도 1은 MIA PaCa-2 제노그라프트 마우스에 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 제제를, 각각 CKAP5 siRNA 10 mg/kg 상당량을 투여한 후 48시간 후의 종양 중 CKAP5 mRNA량을 나타낸다. 종축은 생리식염수 처치군을 1로 한 CKAP5 mRNA량의 상대치를 나타낸다.
도 2는 MIA PaCa-2 제노그라프트 마우스에 실시예 1에서 얻어진 제제를, 0일째 및 7일째에 CKAP5 siRNA 10 mg/kg 상당량을 투여했을 때의 종양 체적의 추이를 나타낸다. 종축은 0일째를 1로 한 종양 체적의 상대치를 나타낸다. 횡축은 실험 개시 후의 경과 일수를 나타낸다.
도 3은 MIA PaCa-2 제노그라프트 마우스에 실시예 2∼5 및 비교예 2에서 얻어진 제제를, 각각 Eg5 siRNA 10 mg/kg 상당량을 투여한 후 48시간 후의 종양 중 Eg5 mRNA량을 나타낸다. 종축은 생리식염수 처치군을 1로 한 Eg5 mRNA량의 상대치를 나타낸다.
도 4는 MIA PaCa-2 제노그라프트 마우스에 실시예 2에서 얻어진 제제를, 0일째에 Eg5 siRNA 10 mg/kg 상당량을 투여했을 때의 종양 체적의 추이를 나타낸다. 종축은 0일째를 1로 한 종양 체적의 상대치를 나타낸다. 횡축은 실험 개시 후의 경과 일수를 나타낸다. ◇는 생리식염수 투여군, ■은 실시예 2에서 얻어진 제제의 투여군을 나타내고 있다.
본 발명의 지질 나노 입자가 함유하는 양이온성 지질은, 식(I)
Figure pct00003
(식에서, R1 및 R2는 동일하거나 또는 다르며 탄소수 10∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
X1 및 X2는 수소 원자이거나, 또는 함께 단결합 혹은 알킬렌을 형성하고,
X3은 존재하지 않거나, 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐이고,
X3이 존재하지 않는 경우에는,
Y1도 존재하지 않고, L1은 단결합이며, R3은 수소 원자, 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이거나, 혹은
Y1도 존재하지 않고, L1은 -CO- 또는 -CO-O-이며, R3은 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일, 모르폴린-3-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 또는 모르폴리닐이고,
X3이 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐인 경우에는,
Y1은 제약상 허용할 수 있는 음이온이고, L1은 단결합이며, R3은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이다)으로 표시되는 화합물 및 식(II)
Figure pct00004
(식에서, R4 및 R5는 동일하거나 혹은 다르며 탄소수 12∼24의 직쇄상 혹은 분지상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이거나, 또는 R4 및 R5가 함께 디알킬메틸렌, 디알케닐메틸렌, 디알키닐메틸렌 혹은 알킬알케닐메틸렌을 형성하고,
X4 및 X5는 수소 원자이거나, 또는 함께 단결합 혹은 알킬렌을 형성하고,
X6은 존재하지 않거나, 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐이고,
X6이 존재하지 않는 경우에는,
Y2도 존재하지 않고, a 및 b는 0이며, L4는 단결합이고, R6은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이며, L2 및 L3은 -O-이거나,
Y2도 존재하지 않고, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 0∼3이면서, a와 b가 동시에 0은 아니고, L4는 단결합이며, R6은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이거나,
Y2도 존재하지 않고, a 및 b는, 동일하거나 또는 다르며 0∼3이고, L4는 단결합이며, R6은 수소 원자이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이거나, 혹은
Y2도 존재하지 않고, a 및 b는, 동일하거나 또는 다르며 0∼3이고, L4는 -CO- 또는 -CO-O-이며, R6은 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일, 모르폴린-3-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 또는 모르폴리닐이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이고,
X6이 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐인 경우에는,
Y2는 제약상 허용할 수 있는 음이온이고, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 0∼3이고, L4는 단결합이며, R6은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이다)으로 표시되는 화합물이다.
이하, 식(I) 및 식(II)으로 표시되는 화합물을, 각각 화합물(I) 및 화합물(II)이라고 하는 경우도 있다. 다른 식 번호의 화합물에 관해서도 마찬가지이다.
식(I)의 각 기의 정의에 있어서, 탄소수 10∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬로서는, 예컨대 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 6,10-디메틸운데카-2-일, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 6,10,14-트리메틸펜타데칸-2-일, 노나데실, 이코실, 헤니코실, 도코실, 트리코실, 테트라코실 등을 들 수 있다.
식(I)의 각 기의 정의에 있어서, 탄소수 10∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알케닐로서는, 1∼3개의 2중 결합을 포함하는 탄소수 10∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알케닐이면 되며, 예컨대 (Z)-도데카-7-에닐, (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-4-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐, (E)-헥사데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐, (7Z,10Z,13Z)-헥사데카-7,10,13-트리에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 등을 들 수 있고, 바람직하게는 (Z)-도데카-7-에닐, (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-4-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐, (E)-헥사데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐, (7Z,10Z,13Z)-헥사데카-7,10,13-트리에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 등을 들 수 있다.
식(I)의 각 기의 정의에 있어서, 탄소수 10∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알키닐로서는, 1∼3개의 3중 결합을 포함하는 탄소수 10∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알키닐이면 되며, 예컨대 데카-9-이닐, 도데카-4-이닐, 도데카-11-이닐, 테트라데카-5-이닐, 테트라데카-6-이닐, 헥사데카-7-이닐, 헥사데카-3,5-디이닐, 헥사데카-5,7-디이닐, 옥타데카-9-이닐 등을 들 수 있다.
한편, 식(I)에 있어서, R1 및 R2는, 동일한 탄소수 10∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 것이 보다 바람직하다. 또한, R1 및 R2가 동일하거나 또는 다른 어느 경우도, 탄소수 10∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬 또는 알케닐이 보다 바람직하고, 탄소수 10∼24의 직쇄상의 알케닐이 더욱 바람직하다.
식(II)의 각 기의 정의에 있어서, 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬로서는, 예컨대 도데실, 트리데실, 테트라데실, 2,6,10-트리메틸운데실, 펜타데실, 3,7,11-트리메틸도데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 6,10,14-트리메틸펜타데칸-2-일, 노나데실, 2,6,10,14-테트라메틸펜타데실, 이코실, 3,7,11,15-테트라메틸헥사데실, 헤니코실, 도코실, 트리코실, 테트라코실 등을 들 수 있다.
식(II)의 각 기의 정의에 있어서, 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알케닐로서는, 1∼3개의 2중 결합을 포함하는 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알케닐이며 되며, 예컨대 (Z)-트리데카-8-에닐, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-펜타데카-8-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-헵타데카-5-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-헵타데카-8-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-헵타데카-8-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-헵타데카-10-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (8Z,11Z,14Z)-옥타데카-8,11,14-트리에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-노나데카-10-에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (10Z,13Z)-노나데카-10,13-디에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 2,6,10-트리메틸운데카-1,5,9-트리에닐, 3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리에닐, 2,6,10,14-테트라메틸펜타데카-1-에닐, 3,7,11,15-테트라메틸헥사데카-2-에닐 등을 들 수 있고, 바람직하게는 (Z)-펜타데카-8-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-헵타데카-5-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-헵타데카-8-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 등을 들 수 있다.
식(II)의 각 기의 정의에 있어서, 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알키닐로서는, 1∼3개의 3중 결합을 포함하는 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알키닐이면 되며, 예컨대 도데카-11-이닐, 트리데카-12-이닐, 펜타데카-6-이닐, 헥사데카-7-이닐, 펜타데카-4,6-디이닐, 헥사데카-5,7-디이닐, 헵타데카-8-이닐, 옥타데카-9-이닐 등을 들 수 있다.
한편, 화합물(II)에 있어서, R4 및 R5는, 동일한 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 것이 보다 바람직하다. 또한, R4 및 R5가 동일하거나 또는 다른 어느 경우도, 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬 또는 알케닐이 보다 바람직하고, 탄소수 12∼24의 직쇄상의 알케닐이 더욱 바람직하다.
화합물(I) 및 화합물(II)에 있어서, 알킬렌으로서는, 예컨대 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 등을 들 수 있다.
탄소수 1∼6의 알킬로서는, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 시클로프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 시클로부틸, 시클로프로필메틸, 펜틸, 이소펜틸, sec-펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 시클로펜틸, 헥실, 시클로헥실 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, sec-펜틸, tert-펜틸, 네오펜틸, 헥실 등을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필 등을 들 수 있다.
탄소수 3∼6의 알케닐로서는, 예컨대 알릴, 1-프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 들 수 있고, 바람직하게는 알릴 등을 들 수 있다.
치환된 탄소수 1∼6의 알킬에 있어서의 알킬 부분 및 치환된 탄소수 3∼6의 알케닐에 있어서의 알케닐 부분으로서는, 각각 상기 탄소수 1∼6의 알킬 및 탄소수 3∼6의 알케닐과 동의이다.
디알킬메틸렌, 디알케닐메틸렌, 디알키닐메틸렌 또는 알킬알케닐메틸렌에 있어서의 알킬, 알케닐 및 알키닐 부분은, 각각 상기 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬, 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알케닐 및 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알키닐과 동의이다. 한편, 디알킬메틸렌, 디알케닐메틸렌 및 디알키닐메틸렌에 있어서의 알킬, 알케닐 및 알키닐 부분은 각각 동일한 것이 더욱 바람직하다.
화합물(I) 및 화합물(II)에 있어서, 제약상 허용할 수 있는 음이온으로서는, 예컨대 염화물 이온, 브롬화물 이온, 질산 이온, 황산 이온, 인산 이온 등의 무기 이온, 초산 이온, 옥살산 이온, 말레산 이온, 푸마르산 이온, 시트르산 이온, 안식향산 이온, 메탄술폰산 이온 등의 유기산 이온 등을 들 수 있다.
화합물(I) 및 화합물(II)에 있어서, 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일 및 모르폴린-3-일은, 각각 고리 중의 질소 원자 상에 결합한 수소 원자가 메틸 또는 에틸로 변환된 것을 포함한다.
모노알킬아미노 및 디알킬아미노로서는, 각각 하나 및 동일하거나 또는 다르며 2개의, 탄소수 1∼6의 알킬(상기와 동의) 또는, 아미노, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬(상기와 동의)로 치환된 아미노이면 되며, 예컨대 메틸아미노, 에틸아미노, 프로필아미노, 부틸아미노, 펜틸아미노, 헥실아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 에틸메틸아미노, 메틸프로필아미노, 부틸메틸아미노, 메틸펜틸아미노, 헥실메틸아미노, 아미노에틸아미노, 아미노프로필아미노, (아미노에틸)메틸아미노, 비스(아미노에틸)아미노 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 아미노프로필아미노, 비스(아미노에틸)아미노 등을 들 수 있다.
화합물(I) 및 화합물(II)에 있어서, 아미노, 모노알킬아미노 및 디알킬아미노는, 각각 질소 원자 상의 고립 전자쌍에, 수소 이온이 배위되어, 암모니오, 모노알킬암모니오 및 디알킬암모니오를 형성하고 있어도 좋으며, 아미노, 모노알킬아미노 및 디알킬아미노는, 각각 암모니오, 모노알킬암모니오 및 디알킬암모니오를 포함한다.
트리알킬암모니오로서는, 동일하거나 또는 다르며 3개인, 탄소수 1∼6의 알킬(상기와 동의) 또는, 아미노, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬(상기와 동의)로 치환된 암모니오이면 되며, 예컨대 트리메틸암모니오, 에틸디메틸암모니오, 디에틸메틸암모니오, 트리에틸암모니오, 트리프로필암모니오, 트리부틸암모니오, 트리펜틸암모니오, 트리헥실암모니오, 트리스(아미노에틸)암모니오, (아미노에틸)디메틸암모니오, 비스(아미노에틸)메틸암모니오 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 트리메틸암모니오, 트리에틸암모니오, 트리스(아미노에틸)암모니오, (아미노에틸)디메틸암모니오, 비스(아미노에틸)메틸암모니오 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 아미노, 모노알킬아미노 및 디알킬아미노의 질소 원자상의 고립 전자쌍에, 수소 이온이 배위된 암모니오, 모노알킬암모니오 및 디알킬암모니오 및 트리알킬암모니오는, 제약상 허용할 수 있는 음이온(상기와 동의)과 염을 형성하고 있어도 좋다.
알콕시로서는, 탄소수 1∼6의 알킬(상기와 동의) 또는, 아미노, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬(상기와 동의)로 치환된 히드록시이면 되며, 예컨대 메톡시, 에톡시, 프로필옥시, 부틸옥시, 펜틸옥시, 헥실옥시, 아미노에톡시, 메틸아미노에톡시 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메톡시, 에톡시, 아미노에톡시, 메틸아미노에톡시 등을 들 수 있다.
모노알킬카르바모일 및 디알킬카르바모일로서는, 각각 하나 및 동일하거나 또는 다르며 2개의, 탄소수 1∼6의 알킬(상기와 동의) 또는, 아미노, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬(상기와 동의)로 치환된 카르바모일이면 되며, 예컨대 메틸카르바모일, 에틸카르바모일, 프로필카르바모일, 부틸카르바모일, 펜틸카르바모일, 헥실카르바모일, 디메틸카르바모일, 디에틸카르바모일, 에틸메틸카르바모일, 메틸프로필카르바모일, 부틸메틸카르바모일, 메틸펜틸카르바모일, 헥실메틸카르바모일, 아미노에틸카르바모일, 아미노프로필카르바모일, (아미노에틸)메틸카르바모일, 비스(아미노에틸)카르바모일 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸카르바모일, 에틸카르바모일, 디메틸카르바모일 등을 들 수 있다.
화합물(I)에 있어서, X1 및 X2는 수소 원자인 것이 보다 바람직하다. 이 경우에는, R1 및 R2는, 동일하거나 또는 다르며 도데실, 테트라데실, (Z)-도데카-7-에닐, (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-4-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐, (E)-헥사데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐, (7Z,10Z,13Z)-헥사데카-7,10,13-트리에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 바람직하고, 동일하거나 또는 다르며 (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐, (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하게 (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐, (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 가장 바람직하다.
한편, X1 및 X2가 수소 원자인 경우에는, R3이 수소 원자, 메틸, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이 보다 바람직하고, 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이 더욱 바람직하고, 수소 원자, 메틸 등이 가장 바람직하다.
또한, X1 및 X2가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하는 경우에는, R1 및 R2는, 동일하거나 또는 다르며 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐 또는 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐인 것이 바람직하고, (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하게 (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 가장 바람직하다.
또한, X1 및 X2가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하는 경우에는, R3이 수소 원자, 메틸, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이 보다 바람직하고, 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이 더욱 바람직하고, 수소 원자, 메틸 등이 가장 바람직하다.
또한, X1 및 X2가 함께 단결합을 형성하는 경우에, L1이 -CO- 또는 -CO-O-, 바람직하게는 -CO-인 것도 본 발명의 보다 바람직한 형태의 하나이다. 이 경우에는, R3이 아미노메틸, 1,2-디아미노에틸, 2-아미노에틸, 1,3-디아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸, 3-아미노프로필, 4-아미노부틸, 5-아미노펜틸 등이 더욱 바람직하고, 1,2-디아미노에틸, 1,3-디아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸인 것이 가장 바람직하고, R1 및 R2는, 동일하거나 혹은 다르며 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐 또는 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐인 것이 바람직하고, (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하게 (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 가장 바람직하다.
또한, X1 및 X2가 함께 단결합을 형성하는 경우에, X3이 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐, 바람직하게는 메틸인 것도 본 발명의 보다 바람직한 형태의 하나이다.
또한, L1은 단결합인 것이 보다 바람직하다.
또한, L1이 단결합인 경우에는, R3은 수소 원자, 메틸, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 것이 보다 바람직하고, 수소 원자, 메틸, 히드록시메틸, 2-히드록시에틸, 2,3-디히드록시프로필, 2-히드록시프로필, 3-히드록시프로필, 2-히드록시-3-메톡시프로필, 아미노메틸, 2-아미노에틸, 3-아미노프로필, 4-아미노부틸, 5-아미노펜틸, 2-(N,N-디메틸아미노)에틸, 3-(N,N-디메틸아미노)프로필, 2-카르바모일에틸, 2-디메틸카르바모일에틸, 1-메틸피페리딘-4-일 등이 더욱 바람직하고, 수소 원자, 메틸 등이 가장 바람직하다.
또한, L1이 -CO- 또는 -CO-O-인 경우에는, R3은 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐인 것이 보다 바람직하고, R3은 아미노메틸, 1,2-디아미노에틸, 2-아미노에틸, 1,3-디아미노프로필, 3-아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 4-아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸, 5-아미노펜틸, (N,N-디메틸아미노)메틸, 2-(N,N-디메틸아미노)에틸, 3-(N,N-디메틸아미노)프로필, 1-히드록시-2-아미노에틸, 1-아미노-2-히드록시에틸 등이 더욱 바람직하고, 1,2-디아미노에틸, 2-아미노에틸, 1,3-디아미노프로필, 3-아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 4-아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸, 5-아미노펜틸 등이 가장 바람직하다.
또한, X3은 존재하지 않거나, 메틸인 것이 보다 바람직하고, X3은 존재하지 않는 것이 더욱 바람직하다. X3이 메틸인 경우에는, R3은 메틸인 것이 보다 바람직하다.
한편, X3이 존재하지 않고, Y1도 존재하지 않고, L1이 단결합이며, R3이 수소 원자인 것도 본 발명의 보다 바람직한 형태의 하나이다. 이 경우에는, R1 및 R2는, 동일하거나 또는 다르며 도데실, 테트라데실, (Z)-도데카-7-에닐, (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-4-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐, (E)-헥사데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐, (7Z,10Z,13Z)-헥사데카-7,10,13-트리에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 바람직하고, 동일하거나 또는 다르며 (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐 또는 (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하게 (Z)-테트라데카-7-에닐인 것이 가장 바람직한 것 중 하나이며, 또한 (Z)-헥사데카-7-에닐인 것이 가장 바람직한 것 중 하나이고, 또한 (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐인 것이 가장 바람직하다.
또한, X3이 존재하지 않고, Y1도 존재하지 않고, L1이 단결합이며, R3이 메틸인 것도 본 발명의 보다 바람직한 형태의 하나이다. 이 경우에는, R1 및 R2는, 동일하거나 또는 다르며 도데실, 테트라데실, (Z)-도데카-7-에닐, (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-4-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐, (E)-헥사데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐, (7Z,10Z,13Z)-헥사데카-7,10,13-트리에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 바람직하고, 동일하거나 또는 다르며 (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐, (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하게 (Z)-테트라데카-7-에닐인 것이 가장 바람직한 것 중의 하나이고, 또한 (Z)-헥사데카-7-에닐인 것이 가장 바람직한 것 중의 하나이고, 또한 (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐인 것이 가장 바람직한 것 중의 하나이며, 또한 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 가장 바람직하다.
화합물(II)에 있어서, L2 및 L3은 동일한 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-인 것이 보다 바람직하다.
또한, L2 및 L3의 적어도 하나가 -O-인 경우에는, -O-에 결합하는 R4 및 R5는 동일하거나 혹은 다르며 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, 이코실, 도코실, 테트라코실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리에닐, 3,7,11,15-테트라메틸헥사데카-2-에닐이거나, 또는 R4 및 R5가 함께 디알킬메틸렌 혹은 디알케닐메틸렌을 형성하는 것이 보다 바람직하고, R4 및 R5가 동일하거나 또는 다르며 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐이거나, 또는 R4 및 R5가 함께 디(테트라데실)메틸렌, 디(헥사데실)메틸렌, 디(옥타데실)메틸렌, 디((Z)-헥사데카-9-에닐)메틸렌, 디((Z)-옥타데카-6-에닐)메틸렌, 디((Z)-옥타데카-9-에닐)메틸렌, 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)메틸렌을 형성하는 것이 더욱 바람직하고, R4 및 R5가 동일하거나 또는 다르며 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 가장 바람직하다. 한편, 어느 경우에나 R4 및 R5는 동일이거나, 또는 R4 및 R5가 함께 알킬, 알케닐 혹은 알키닐 부분이 동일한 디알킬메틸렌, 디알케닐메틸렌 혹은 디알키닐메틸렌을 형성하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, L2 및 L3의 적어도 하나가 -O-CO-인 경우에는, -O-CO-에 결합하는 R4 및 R5는 동일하거나 또는 다르며 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, 이코실, 도코실, 테트라코실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리에닐, 3,7,11,15-테트라메틸헥사데카-2-에닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하거나 또는 다르며 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 더욱 바람직하다. 한편, 어느 경우에나 R4 및 R5는 동일한 것이 더욱 바람직하다.
또한, L2 및 L3의 적어도 하나가 -CO-O-인 경우에는, -CO-O-에 결합하는 R4 및 R5는, 동일하거나 혹은 다르며 트리데실, 펜타데실, 헵타데실, 노나데실, 헤니코실, 트리코실, (Z)-트리데카-8-에닐, (Z)-펜타데카-8-에닐, (Z)-헵타데카-5-에닐, (Z)-헵타데카-8-에닐, (E)-헵타데카-8-에닐, (Z)-헵타데카-10-에닐, (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디에닐, (8Z,11Z,14Z)-옥타데카-8,11,14-트리에닐, (Z)-노나데카-10-에닐, (10Z,13Z)-노나데카-10,13-디에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 2,6,10-트리메틸운데카-1,5,9-트리에닐, 2,6,10,14-테트라메틸펜타데카-1-에닐이거나, 또는 R4 및 R5가 함께 디알킬메틸렌, 디알케닐메틸렌, 디알키닐메틸렌 혹은 알킬알케닐메틸렌을 형성하는 것이 보다 바람직하고, R4 및 R5가 동일하거나 또는 다르며 트리데실, 펜타데실, 헵타데실, (Z)-펜타데카-8-에닐, (Z)-헵타데카-5-에닐, (Z)-헵타데카-8-에닐, (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디에닐인 더욱 바람직하다. 한편, 어느 경우에나, R4 및 R5는 동일하거나, 또는 R4 및 R5가 함께 알킬, 알케닐 혹은 알키 닐부분이 동일한 디알킬메틸렌, 디알케닐메틸렌 혹은 디알키닐메틸렌을 형성하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, a 및 b는 동시에 0 또는 1인 것이 보다 바람직하다.
한편, a 및 b가 동시에 1인 경우에는, X4 및 X5는 함께 단결합 혹은 알킬렌을 형성하는 것이 보다 바람직하다. 또한, a 및 b가 동시에 1이고, L4가 단결합인 경우에는, L2 및 L3이 -CO-O-인 것도 본 발명의 보다 바람직한 형태의 하나이다.
또한, X4 및 X5는 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하는 것이 보다 바람직하다. 한편, X4 및 X5가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하는 경우에는, R6이 수소 원자, 메틸, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이 보다 바람직하고, 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이 더욱 바람직하고, 수소 원자, 메틸, 2,3-디히드록시프로필, 3-히드록시프로필, 아미노메틸, 1,2-디아미노에틸, 2-아미노에틸, 1,3-디아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸, 3-아미노프로필, 4-아미노부틸, 5-아미노펜틸, 2-카르바모일에틸 등이 가장 바람직하다.
또한, X4 및 X5가 함께 단결합을 형성하는 경우에, L4가 -CO- 또는 -CO-O-, 바람직하게는 -CO-인 것도 본 발명의 보다 바람직한 형태의 하나이다. 이 경우에는, R6이 아미노메틸, 1,2-디아미노에틸, 2-아미노에틸, 1,3-디아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸, 3-아미노프로필, 4-아미노부틸, 5-아미노펜틸 등이 더욱 바람직하고, 1,2-디아미노에틸, 1,3-디아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸인 것이 가장 바람직하다.
또한, X4 및 X5가 함께 단결합을 형성하는 경우에, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 1∼3, 바람직하게는 1인 것도 본 발명의 보다 바람직한 형태의 하나이다. 이 경우에, L2 및 L3이 동일한 -CO-O- 또는 -O-CO-, 바람직하게는 -CO-O-이며, R6이 메틸인 것도 본 발명이 더욱 바람직한 형태의 하나이고, 그 경우에는, R4 및 R5는 동일하거나 혹은 다르며 (Z)-헵타데카-8-에닐 또는 (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디에닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하게 (Z)-헵타데카-8-에닐 또는 (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디에닐인 것이 가장 바람직하다.
또한, X4 및 X5가 함께 단결합을 형성하는 경우에, X6이 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐, 바람직하게는 메틸인 것도 본 발명의 보다 바람직한 형태의 하나이다. 이 경우, L2 및 L3은 동일한 -CO-O- 또는 -O-CO-인 것이 더욱 바람직하고, -CO-O-인 것이 가장 바람직하다.
한편, X4 및 X5가 수소 원자인 경우에는, R6이 수소 원자, 메틸, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이 보다 바람직하고, 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이 더욱 바람직하고, 수소 원자, 메틸, 2,3-디히드록시프로필, 3-히드록시프로필, 아미노메틸, 1,2-디아미노에틸, 2-아미노에틸, 1-아미노-2-히드록시에틸, 1,3-디아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸, 3-아미노프로필, 4-아미노부틸, 5-아미노펜틸, 2-카르바모일에틸 등이 가장 바람직하다.
또한, L4는 단결합인 것이 보다 바람직하다. 한편, L4가 단결합인 경우에는, L2 및 L3은 -O-인 것이 보다 바람직하다.
또한, L4가 단결합인 경우에는, R6은 수소 원자, 메틸, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 것이 보다 바람직하고, 수소 원자, 메틸, 히드록시메틸, 2-히드록시에틸, 2,3-디히드록시프로필, 2-히드록시프로필, 3-히드록시프로필, 2-히드록시-3-메톡시프로필, 아미노메틸, 2-아미노에틸, 3-아미노프로필, 4-아미노부틸, 5-아미노펜틸, 2-(N,N-디메틸아미노)에틸, 3-(N,N-디메틸아미노)프로필, 2-카르바모일에틸, 2-디메틸카르바모일에틸, 1-메틸피페리딘-4-일 등이 더욱 바람직하고, 수소 원자, 메틸, 2,3-디히드록시프로필, 3-히드록시프로필, 2-아미노에틸, 3-아미노프로필, 4-아미노부틸, 5-아미노펜틸, 2-카르바모일에틸 등이 가장 바람직하며, 어느 경우에나 L2 및 L3은 -O-인 것이 보다 바람직하다.
한편, X6이 존재하지 않고, Y2도 존재하지 않고, L4가 단결합이며, R6이 수소 원자인 경우에는, L2 및 L3이 동일한 -CO-O- 또는 -O-CO-, 바람직하게는 -CO-O-인 것도 본 발명의 보다 바람직한 형태의 하나이다. 이 경우에는, R4 및 R5는, 동일하거나 혹은 다르며 (Z)-헵타데카-5-에닐 또는 (Z)-헵타데카-8-에닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하게 (Z)-헵타데카-5-에닐 또는 (Z)-헵타데카-8-에닐인 것이 가장 바람직하다.
한편, L4가 -CO- 또는 -CO-O-인 경우에는, L2 및 L3은 동일한 -CO-O- 또는 -O-CO-인 것이 보다 바람직하고, -CO-O-인 것이 더욱 바람직하다.
또한, L4가 -CO- 또는 -CO-O-인 경우에는, R6은 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐인 것이 보다 바람직하고, R6은 아미노메틸, 1,2-디아미노에틸, 2-아미노에틸, 1,3-디아미노프로필, 3-아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 4-아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸, 5-아미노펜틸, (N,N-디메틸아미노)메틸, 2-(N,N-디메틸아미노)에틸, 3-(N,N-디메틸아미노)프로필, 1-아미노-2-히드록시에틸 등이 더욱 바람직하고, 1,2-디아미노에틸, 2-아미노에틸, 1,3-디아미노프로필, 3-아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 4-아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸, 5-아미노펜틸 등이 가장 바람직하다.
L4가 -CO- 또는 -CO-O-인 경우에, R6이 아미노메틸, 1-히드록시-2-아미노에틸, 2-아미노에틸, 1,3-디아미노프로필, 3-아미노프로필, 1,4-디아미노부틸, 4-아미노부틸, 1,5-디아미노펜틸, 5-아미노펜틸이고, L2 및 L3은 동일한 -O-인 것도 본 발명의 더욱 바람직한 형태의 하나이다. 이 경우에는, R4 및 R5는 동일하거나 혹은 다르며 (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하게 (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 가장 바람직하다.
또한, X6은 존재하지 않거나, 메틸인 것이 보다 바람직하다. X6이 메틸인 경우에는, R6은 메틸인 것이 보다 바람직하고, L2 및 L3은 동일한 -CO-O- 또는 -O-CO-인 것이 보다 바람직하고, -CO-O-인 것이 더욱 바람직하다.
화합물(II) 중에서, 식(ii)
Figure pct00005
(식에서, R7 및 R8은 R4 및 R5 중의, 동일하거나 또는 다르며 탄소수 12∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
L5 및 L6은 -CO-O- 또는 -O-CO-, 바람직하게는 -CO-O-이고,
a 및 b는 각각 상기와 동의이며, 바람직하게는 1이고,
R9는 R6 중의, 수소 원자, 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐이다)으로 표시되는 화합물(ii)을, 보다 바람직한 화합물(II)의 하나로서 들 수 있다.
이어서 화합물(I)의 제조법에 관해서 설명한다. 한편, 이하에 나타내는 제조법에 있어서, 정의한 기가 상기 제조법의 조건 하에서 변화되거나 또는 상기 제조법을 실시하는 데 부적절한 경우, 유기 합성 화학에서 상용되는 보호기의 도입 및 제거 방법(예컨대, 그린(T.W. Greene) 저, "프로텍티브 그룹스 인 오가닉 신세시스(Protective Groups in Organic Synthesis)", (미국), 제3판, 존 윌리 & 손즈 잉크(John Wiley & Sons Inc.), 1999년 등에 기재된 방법) 등을 이용함으로써 목적 화합물을 제조할 수 있다. 또한, 필요에 따라서 치환기 도입 등의 반응 공정의 순서를 바꿀 수도 있다.
제조법 1
화합물(I) 중, X1 및 X2가 수소 원자이고, L1은 단결합이며, X3 및 Y1은 존재하지 않는, 화합물(Ia)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00006
(식에서, R1, R2 및 R3은 각각 상기와 동의이고, Z는 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자, 트리플루오로메탄술포닐옥시, 메탄술포닐옥시, 벤젠술포닐옥시, p-톨루엔술포닐옥시 등의 탈리기를 나타낸다)
공정 1 및 2
화합물(IIIb)은, 화합물(IIIa)과 화합물(IVa)을, 무용매로 또는 용매 속에서, 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간∼100시간 처리함으로써 제조할 수 있다. 또한, 화합물(Ia)은, 화합물(IIIb)과 화합물(IVb)을, 무용매로 또는 용매 속에서, 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간∼100시간 처리하여 단리함으로써 제조할 수 있다.
용매로서는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 초산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 피리딘, 물 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
염기로서는, 예컨대 탄산칼륨, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 나트륨메톡시드, 칼륨 tert-부톡시드, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 피리딘, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센(DBU) 등을 들 수 있다.
화합물(IIIa)은 시판품 또는 공지된 방법(예컨대, 「실험화학강좌 14 유기 화합물의 합성 II」, 제5판, 마루젠, 2005년, p.351) 혹은 그것에 준하는 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(IVa) 및 화합물(IVb)은 시판품 또는 공지된 방법(예컨대, 「실험화학강좌 13 유기 화합물의 합성 I」, 제5판, 마루젠, 2005년, p.374) 혹은 그것에 준하는 방법으로 얻을 수 있다.
R1과 R2가 동일한 경우의 화합물(Ia)은, 공정 1에 있어서, 2 당량 이상의 화합물(IVa)을 이용함으로써 얻을 수 있다.
제조법 2
화합물(I) 중, X1 및 X2가 함께 단결합 혹은 알킬렌을 형성하고, L1은 단결합이며, X3 및 Y1은 존재하지 않는, 화합물(Ib)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00007
(식에서, R1, R2, R3 및 Z는 각각 상기와 동의이고, X4는 단결합 혹은 알킬렌을 나타낸다)
공정 3 및 4
화합물(Vb)은, 화합물(Va)과 화합물(VIa)을 용매 중에, 1∼10 당량의 염기의 존재 하에, -100℃와 100℃ 사이의 온도에서, 5분간∼100시간 처리함으로써 제조할 수 있다. 또한, 화합물(Vc)은, 화합물(Vb)과 화합물(VIb)을, 무용매로 또는 용매 속에서, 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 염기의 존재 하에, -100℃와 100℃ 사이의 온도에서, 5분간∼100시간 처리하여 단리함으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 제조법 1과 같은 것을 예로 들 수 있다.
염기로서는, 예컨대 수소화나트륨, 수소화칼륨, 칼륨tert-부톡시드, 나트륨tert-부톡시드, 리튬디이소프로필아미드(LDA), 리튬헥사메틸디실라지드(LHMDS) 등을 들 수 있다.
화합물(Va)은 시판품 또는 공지된 방법(예컨대, 「실험화학강좌 16 유기 화합물의 합성 IV」, 제5판, 마루젠, 2005년, p.146) 혹은 그것에 준하는 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(VIa) 및 화합물(VIb)은 시판품 또는 공지된 방법(예컨대, 「실험화학강좌 13 유기 화합물의 합성 I」, 제5판, 마루젠, 2005년, p.374) 혹은 그것에 준하는 방법으로 얻을 수 있다.
R1과 R2가 동일한 경우의 화합물(Vc)은, 공정 3에 있어서, 2 당량 이상의 화합물(VIa)을 이용함으로써 얻을 수 있다.
공정 5
화합물(Ib)은, 화합물(Vc)을 용매 중에, 1 당량∼큰 과잉량의 환원제 및 필요에 따라 바람직하게는 0.1∼10 당량의 금속 화합물의 존재 하에, -100℃와 100℃ 사이의 온도에서, 5분간∼100시간 처리함으로써 제조할 수 있다.
환원제로서는, 예컨대 수소화리튬알루미늄, 수소화붕소나트륨, 트리아세톡시수소화붕소나트륨, 시안화수소화붕소나트륨 등을 들 수 있다.
금속 화합물로서는, 예컨대 염화코발트, 염화철, 염화알루미늄 등을 들 수 있다.
제조법 3
화합물(I) 중, L1은 단결합이고, R3은 -CHRARB(RA 및 RB는 동일하거나 또는 다르며 수소 원자, 탄소수 1∼5의 알킬, 탄소수 2∼5의 알케닐, 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일, 모르폴린-3-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼5의 알킬 혹은 탄소수 2∼5의 알케닐이거나, 또는 인접하는 탄소 원자와 함께 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일 혹은 피페리딘-4-일을 형성하며, RA 및 RB가 함께 수소 원자인 경우를 제외하고, RA 및 RB의 알킬, 치환된 알킬의 알킬 부분, 알케닐 및 치환된 알케닐의 알케닐 부분의 탄소수의 총 합은 1∼5이고, RA 및 RB 중 어느 것이, 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일 또는 모르폴린-3-일인 경우에는, 상기 RA 및 RB의 또 한쪽은, 수소 원자, 탄소수 1∼5의 알킬, 탄소수 2∼5의 알케닐, 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일, 모르폴린-3-일 또는 동일하거나 혹은 다르며 하나 혹은 2개의 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼5의 알킬 혹은 탄소수 3∼5의 알케닐이고, RA 및 RB가 치환된 알킬 또는 알케닐인 경우에는, 상기 치환기의 총수는 2 또는 3이다)이며, X3 및 Y1이 존재하지 않는, 화합물(Ic)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00008
(식에서, R1, R2, RA, RB, X1 및 X2는 각각 상기와 동의이다)
공정 6
화합물(Ic)은, 화합물(Ia) 및 화합물(Ib) 중의 R3이 수소 원자인 화합물(Id)을, 바람직하게는 1∼10 당량의 화합물(VII)과, 용매 중에, 바람직하게는 1 당량∼큰 과잉량의 환원제 및 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 산의 존재 하에, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서, 5분간∼72시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 초산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 물 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
환원제로서는, 예컨대 트리아세톡시수소화붕소나트륨, 시안화수소화붕소나트륨 등을 들 수 있다.
산으로서는, 예컨대 염산, 초산 등을 들 수 있다.
화합물(VII)은 시판품 또는 공지된 방법(예컨대, 「실험화학강좌 15 유기 화합물의 합성 III」, 제5판, 마루젠, 2005년, p.1,「실험화학강좌 15 유기 화합물의 합성 III」, 제5판, 마루젠, 2005년, p.153) 혹은 그것에 준하여 얻을 수 있다.
제조법 4
화합물(I) 중, L1이 -CO-이고, X3 및 Y1이 존재하지 않는, 화합물(Ie)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00009
(식에서, R1, R2, R3, X1 및 X2는 각각 상기와 동의이다)
공정 7
화합물(Ie)은, 화합물(Id)과 화합물(VIII)을 용매 속에서, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서, 1 당량∼큰 과잉량의 축합제로 5분간에서 100시간 처리함으로써 제조할 수 있다. 이때, 필요에 따라 바람직하게는 0.01∼10 당량의 첨가제의 존재 하에, 및/또는 필요에 따라 바람직하게는 1 당량∼큰 과잉량의 염기를 가하여, 반응을 촉진시킬 수도 있다.
용매로서는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 초산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 디메틸설폭시드, 물 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
축합제로서는, 예컨대 1,3-디시클로헥실카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·염산염, 카르보닐디이미다졸, 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스파이트, (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스파이트, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스파이트, O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스파이트, 요오드화 2-클로로-1-메틸피리디늄 등을 들 수 있다.
첨가제로서는, 예컨대 1-히드록시벤조트리아졸, 4-디메틸아미노피리딘 등을 들 수 있다.
염기로서는, 예컨대 초산칼륨, 탄산수소나트륨, 탄산칼륨, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 나트륨메톡시드, 칼륨 tert-부톡시드, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 피리딘, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 등을 들 수 있다.
화합물(VIII)은 시판품 또는 공지된 방법(예컨대, 「실험화학강좌 16 유기 화합물의 합성 IV」, 제5판, 마루젠, 2005년, p.1) 혹은 그것에 준하여 얻을 수 있다.
제조법 5
화합물(I) 중, L1이 -CO-O-이고, X3 및 Y1이 존재하지 않는, 화합물(If)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00010
(식에서, R1, R2, R3, X1 및 X2는 각각 상기와 동의이다)
공정 8
화합물(If)은, 화합물(Id)을 화합물(IX)과, 무용매로 또는 용매 속에서, 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 첨가제의 존재 하에, 및/또는 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 염기의 존재 하에, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서, 5분간∼72시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매 및 첨가제로서는 제조법 4과 같은 것을 들 수 있다.
염기로서는, 예컨대 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 피리딘, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 등을 들 수 있다.
화합물(IX)은 시판품 또는 공지된 방법(예컨대, "저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(J. Am. Chem. Soc.)", (미국), 1981년, 103권, p.4194-4199) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
제조법 6
화합물(I) 중, L1은 단결합이고, R3은 -CH2-C(OH)RCRD(RC 및 RD는 동일하거나 또는 다르며 수소 원자, 탄소수 1∼4의 알킬, 탄소수 2∼4의 알케닐, 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일, 모르폴린-3-일 또는 동일하거나 혹은 다르며 하나 혹은 2개의 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼4의 알킬 혹은 탄소수 2∼4의 알케닐이고, RC 및 RD가 함께 수소 원자인 경우를 제외하고, RC 및 RD의 알킬, 치환된 알킬의 알킬 부분, 알케닐 및 치환된 알케닐의 알케닐 부분의 탄소수의 총 합은 1∼4이며, RC 및 RD 중 어느 것이 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일 또는 모르폴린-3-일인 경우에는, 상기 RC 및 RD의 또 한쪽은 수소 원자, 탄소수 1∼4의 알킬, 탄소수 2∼4의 알케닐, 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일, 모르폴린-3-일 또는 하나의 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼4의 알킬 혹은 탄소수 2∼4의 알케닐이고, RC 및 RD가 치환된 알킬 또는 알케닐인 경우에는, 상기 치환기의 총수는 2이다)이며, X3 및 Y1이 존재하지 않는, 화합물(Ig)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00011
(식에서, R1, R2, RC, RD, X1 및 X2는 각각 상기와 동의이다)
공정 9
화합물(Ig)은, 화합물(Id)과 화합물(X)을 용매 속에서 또는 무용매로, 0℃와 230℃ 사이의 온도에서, 5분간에서 100시간 처리함으로써 제조할 수 있다.
용매로서는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 초산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 디메틸설폭시드 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
화합물(X)은 시판품 또는 공지된 방법(예컨대, 「실험화학강좌 17 유기 화합물의 합성 V」, 제5판, 마루젠, 2005년, p.186) 혹은 그것에 준하여 얻을 수 있다.
제조법 7
화합물(I) 중, L1이 단결합이고, X3이 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐이며, Y1이 제약상 허용할 수 있는 음이온인 화합물(Ih)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00012
(식에서, R1, R2, R3, X1, X2, X3, Y1 및 Z는 각각 상기와 동의이다)
공정 10 및 11
화합물(Ii)은 화합물(Ia) 또는 화합물(Ib)이다.
화합물(Ih-A)은, 화합물(Ii)과 화합물(XI)을 용매 속에서 또는 무용매로, 0℃와 230℃ 사이의 온도에서, 5분간에서 100시간 처리함으로써 제조할 수 있다. 화합물(Ih)은, 화합물(Ih-A)을 Y형의 음이온 교환 수지로 처리함으로써 제조할 수 있다.
용매로서는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 초산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 피리딘 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
화합물(XI)은 시판품 또는 공지된 방법(예컨대, 실험화학강좌 13 유기 화합물의 합성 I」, 제5판, 마루젠, 2005년, p.374) 혹은 그것에 준하여 얻을 수 있다.
또한, Z와 Y1이 동일한 경우에는, 공정 11을 생략함으로써 (Ih)를 제조할 수 있다.
화합물(I)에 있어서의 R1, R2 또는 R3에 포함되는 관능기의 변환은, 공지된 방법(예컨대, R.C. 라로크(Larock) 저, "컴프리헨시브 오가닉 트랜스포메이션즈(Comprehensive Organic Transformations, (미국), 제2판, 베크 벨라그스게세르샤프트 엠베하(Vch Verlagsgesellschaft Mbh), 1999년 등에 기재된 방법)으로 또는 이들에 준하여 행할 수도 있다.
상기 각 제조법에 있어서의 중간체 및 목적 화합물은, 유기 합성 화학에서 상용되는 분리 정제법, 예컨대, 여과, 추출, 세정, 건조, 농축, 재결정, 각종 크로마토그래피 등에 의해 단리 정제할 수 있다. 또한, 중간체에 있어서는 특별히 정제하지 않고 다음 반응에 사용하게 할 수도 있다.
화합물(I)에 있어서, 구조 중의 질소 원자 상의 고립 전자쌍에 수소 이온이 배위되어도 좋고, 상기 질소 원자는, 제약상 허용할 수 있는 음이온(상기와 동의)과 염을 형성하고 있어도 좋으며, 화합물(I)에는, 그 질소 원자 상에 고립 전자쌍에 수소 이온이 배위된 화합물도 포함한다. 한편, 본 발명에 있어서, X3이 존재하지 않는 경우란, 수소 이온이 배위되어 있는 경우도 포함한다.
화합물(I) 중에는, 기하 이성체, 광학 이성체 등의 입체 이성체, 호변 이성체 등이 존재할 수 있는 것도 있는데, 화합물(I)은 이들을 포함하며, 모든 가능한 이성체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
화합물(I) 중의 각 원자의 일부 또는 전부는, 각각 대응하는 동위체 원자로 치환되어 있어도 좋으며, 화합물(I)은, 이들 동위체 원자로 치환된 화합물도 포함한다. 예컨대, 화합물(I) 중의 수소 원자의 일부 또는 전부는, 원자량 2의 수소 원자(중수소 원자)라도 좋다.
화합물(I) 중의 각 원자의 일부 또는 전부가, 각각 대응하는 동위체 원자로 치환된 화합물은, 시판되는 빌딩 블록을 이용하여, 상기 각 제조법과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 화합물(I) 중의 수소 원자의 일부 또는 전부가 중수소 원자로 치환된 화합물은, 예컨대, 1) 과산화중수소를 이용하여, 염기성 조건 하에 카르복실산 등을 중수소화하는 방법(미국 특허 제3849458호 명세서 참조), 2) 이리듐 착체를 촉매로서 이용하고, 중수를 중수소원으로서 이용하여 알코올, 카르복실산 등을 중수소화하는 방법("저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(J. Am. Chem. Soc.)", (미국), 2002년, 124권, 10호, p.2092 참조), 3) 팔라듐카본을 촉매로서 이용하고, 중수소원으로서 중수소 가스만을 이용하여 지방산을 중수소화하는 방법("리피즈(LIPIDS), (미국), 1974년, 9권, 11호, p.913 참조), 4) 백금, 팔라듐, 로듐, 루테늄, 이리듐 등의 금속을 촉매로서 이용하고, 중수 또는 중수 및 중수소 가스를 중수소원으로서 이용하여, 아크릴산, 아크릴산메틸, 메타크릴산, 메타크릴산메틸 등을 중수소화하는 방법(일본 특허공고 평5-19536호 공보, 일본 특허공개 소61-277648호 공보 및 일본 특허공개 소61-275241호 공보 참조), 5) 팔라듐, 니켈, 구리 또는 아크롬산구리 등의 촉매를 이용하고, 중수를 중수소원으로서 이용하여, 아크릴산, 메타크릴산메틸 등을 중수소화하는 방법(일본 특허공개 소63-198638호 공보 참조) 등을 이용하여 합성할 수도 있다.
화합물(II)은 국제공개 제2011/136368호에 기재된 제조 방법과 같은 방법으로 얻을 수 있다.
한편, 화합물(II)에 있어서, 정의한 기가 상기 제조법의 조건 하에서 변화되거나 또는 그 제조법을 실시하는 데 부적절한 경우, 유기 합성 화학에서 상용되는 보호기의 도입 및 제거 방법(예컨대, 그린(T. W.Greene) 저, "프로텍티브 그룹스 인 오가닉 신세시스(Protective Groups in Organic Synthesis)", (미국), 제3판, 존 윌리 & 손즈 잉크(John Wiley & Sons Inc.), 1999년 등에 기재된 방법) 등을 이용함으로써 목적 화합물을 제조할 수 있다. 또한, 필요에 따라서 치환기 도입 등의 반응 공정의 순서를 바꿀 수도 있다.
화합물(I)의 구체예를 표 1에 나타내고, 화합물(II)의 구체예를 표 2∼표 12에 나타낸다. 다만, 본 발명에 있어서의 화합물(I) 및 화합물(II)은 이들에 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
또한, 본 발명에서 이용되는 핵산으로서는, 뉴클레오티드 및/또는 이 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자가 중합된 분자라면, 어떠한 분자라도 좋고, 예컨대 리보뉴클레오티드의 중합체인 RNA, 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체인 DNA, RNA와 DNA로 이루어지는 키메라 핵산, 및 이들 핵산의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 그 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자로 치환된 뉴클레오티드 중합체를 들 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 및/또는 이 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자가 중합된 분자를 적어도 하나 포함하는 유도체도 본 발명의 핵산에 포함된다. 또한 펩티드 핵산(PNA)("어카운트스 오브 케미컬 리서치(Acc. Chem. Res.)", (미국), 1999년, 32권, p.624), 옥시펩티드핵산(OPNA)("저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(J. Am. Chem. Soc.)", (미국), 2001년, 123권, p.4653), 펩티드리보핵산(PRNA)("저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(J. Am. Chem. Soc.), (미국), 2000년, 122권, p.6900) 등도 예로 들 수 있다. 한편, 본 발명에 있어서, RNA 중의 우리딘 U와, DNA에 있어서는 티민 T는 각각 대체될 수 있다.
뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자로서는, 예컨대 뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다.
뉴클레오티드 유도체로서는, 뉴클레오티드에 수식을 한 분자면 어떠한 분자라도 좋지만, 예컨대 RNA 또는 DNA와 비교하여, 뉴클레아제 내성을 향상시키거나 혹은 그 밖의 분해 인자로부터 안정화시키기 위해서, 상보쇄 핵산과의 어피니티를 올리기 위해서, 세포 투과성을 올리기 위해서, 또는 가시화시키기 위해서, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드에 수식을 한 분자 등이 적합하게 이용된다.
뉴클레오티드 유도체로서는, 예컨대 당부 수식 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드, 염기 수식 뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드로서는, 뉴클레오티드의 당의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이면 어떠한 것이라도 좋지만, 2'-수식 뉴클레오티드가 바람직하게 이용된다.
당부 수식 뉴클레오티드의 수식기로서는, 예컨대, 2'-시아노, 2'-알킬, 2'-치환 알킬, 2'-알케닐, 2'-치환 알케닐, 2'-할로겐, 2'-O-시아노, 2'-O-알킬, 2'-O-치환 알킬, 2'-O-알케닐, 2'-O-치환 알케닐, 2'-S-알킬, 2'-S-치환 알킬, 2'-S-알케닐, 2'-S-치환 알케닐, 2'-아미노, 2'-NH-알킬, 2'-NH-치환 알킬, 2'-NH-알케닐, 2'-NH-치환 알케닐, 2'-SO-알킬, 2'-SO-치환 알킬, 2'-카르복시, 2'-CO-알킬, 2'-CO-치환 알킬, 2'-Se-알킬, 2'-Se-치환 알킬, 2'-SiH2-알킬, 2'-SiH2-치환 알킬, 2'-ONO2, 2'-NO2, 2'-N3, 2'-아미노산 잔기(아미노산의 카르복실산으로부터 수산기가 제거된 것), 2'-O-아미노산 잔기(상기 아미노산 잔기와 동의) 등을 들 수 있다. 또한, 2' 위치의 수식기가 4' 위치의 탄소 원자에 가교된 구조를 갖는 가교 구조형 인공 핵산(Bridged Nucleic Acid)(BNA), 보다 구체적으로는, 2' 위치의 산소 원자와 4' 위치의 탄소 원자가 메틸렌을 통해 가교된 록트 인공 핵산(Locked Nucleic Acid)(LNA) 및 에틸렌 가교 구조형 인공 핵산(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)("뉴클레익 애시드 리서치(Nucleic Acids Research)", (영국), 2004년, 32권, p.e175) 등도 본 발명에 있어서의 2' 위치에 있어서 수식기로 치환된 리보오스에 포함된다.
당부 수식 뉴클레오티드의 수식기로서, 2'-시아노, 2'-할로겐, 2'-O-시아노, 2'-알킬, 2'-치환 알킬, 2'-O-알킬, 2'-O-치환 알킬, 2'-O-알케닐, 2'-O-치환 알케닐, 2'-Se-알킬, 2'-Se-치환 알킬이 바람직하고, 2'-시아노, 2'-플루오로, 2'-클로로, 2'-브로모, 2'-트리플루오로메틸, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-이소프로필, 2'-O-트리플루오로메틸, 2'-O-[2-(메톡시)에틸], 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-[2-(N,N-디메틸)아미노옥시]에틸, 2'-O-[3-(N,N-디메틸아미노)프로필], 2'-O-{2-[2-(N,N-디메틸아미노)에톡시]에틸}, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 2'-Se-메틸 등이 보다 바람직하고, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-플루오로 등이 더욱 바람직하고, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸이 가장 바람직하다.
또한, 당부 수식 뉴클레오티드의 수식기는, 그 크기로부터 바람직한 범위를 정의할 수도 있으며, 플루오로 크기부터 -O-부틸 크기에 상당하는 것이 바람직하고, -O-메틸 크기부터 -O-에틸 크기에 상당하는 크기인 것이 보다 바람직하다.
당부 수식 뉴클레오티드의 수식기에 있어서의 알킬은 화합물(I)에 있어서의 탄소수 1∼6의 알킬과 동의이다.
당부 수식 뉴클레오티드의 수식기에 있어서의 알케닐은 화합물(I)에 있어서의 탄소수 3∼6의 알케닐과 동의이다.
당부 수식 뉴클레오티드의 수식기에 있어서의 할로겐으로서는, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자를 들 수 있다.
아미노산 잔기에 있어서의 아미노산으로서는, 예컨대 지방족 아미노산(구체적으로는, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 등), 히드록시아미노산(구체적으로는, 세린, 트레오닌 등), 산성 아미노산(구체적으로는, 아스파라긴산, 글루타민산 등), 산성 아미노산아미드(구체적으로는, 아스파라긴, 글루타민 등), 염기성 아미노산(구체적으로는, 리신, 히드록시리신, 아르기닌, 오르니틴 등), 함황아미노산(구체적으로는, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 등), 이미노산(구체적으로는, 프롤린, 4-히드록시프롤린 등) 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드의 수식기에 있어서의 치환 알킬 및 치환 알케닐의 치환기로서는, 예컨대, 할로겐(상기와 동의), 히드록시, 술파닐, 아미노, 옥소, -O-알킬(이 -O-알킬의 알킬 부분은 상기 알킬과 동의), -S-알킬(이 -S-알킬의 알킬 부분은 상기 알킬과 동의), -NH-알킬(이 -NH-알킬의 알킬 부분은 상기 알킬과 동의), 디알킬아미노옥시(이 디알킬아미노옥시의 2개의 알킬은 동일하거나 또는 다르며 상기 알킬과 동의), 디알킬아미노(이 디알킬아미노의 2개의 알킬은 동일하거나 또는 다르며 상기 알킬과 동의), 디알킬아미노알킬렌옥시(이 디알킬아미노알킬렌옥시의 2개의 알킬은 동일하거나 또는 다르며 상기 알킬과 동의이고, 알킬렌 부분은 상기 알킬로부터 수소 원자가 하나 제외된 것을 의미한다) 등을 들 수 있고, 치환수는 바람직하게는 1∼3이다.
인산디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드로서는, 뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이면 어떠한 것이라도 좋고, 예컨대, 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 포스포로디티오에이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 알킬포스포네이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 포스포로아미데이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
염기 수식 뉴클레오티드로서는, 뉴클레오티드의 염기의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이면 어떠한 것이라도 좋으며, 예컨대, 염기 내의 산소 원자가 유황 원자로 치환된 것, 수소 원자가 탄소수 1∼6의 알킬기로 치환된 것, 메틸기가 수소 원자 혹은 탄소수 2∼6의 알킬기로 치환된 것, 아미노기가 탄소수 1∼6의 알킬기, 탄소수 1∼6의 알카노일기 등의 보호기로 보호된 것을 들 수 있다.
또한, 뉴클레오티드 유도체로서, 뉴클레오티드 또는 당부, 인산디에스테르 결합 혹은 염기의 적어도 하나가 수식된 뉴클레오티드 유도체에 지질, 인지질, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 색소 등, 다른 화학 물질을 부가한 것도 들 수 있고, 구체적으로는, 5'-폴리아민 부가 뉴클레오티드 유도체, 콜레스테롤 부가 뉴클레오티드 유도체, 스테로이드 부가 뉴클레오티드 유도체, 담즙산 부가 뉴클레오티드 유도체, 비타민 부가 뉴클레오티드 유도체, Cy5 부가 뉴클레오티드 유도체, Cy3 부가 뉴클레오티드 유도체, 6-FAM 부가 뉴클레오티드 유도체 및 비오틴 부가 뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다.
또한, 뉴클레오티드 유도체는, 핵산 내의 다른 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체와 알킬렌 구조, 펩티드 구조, 뉴클레오티드 구조, 에테르 구조, 에스테르 구조 및 이들의 적어도 하나를 조합시킨 구조 등의 가교 구조를 형성하여도 좋다.
본 발명에서 이용되는 핵산으로서는, 바람직하게는 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산을 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 표적 유전자로서는, mRNA를 산생하여 발현하는 유전자라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 종양 또는 염증에 관련되는 유전자가 바람직하고, 예컨대 혈관 내피 증식 인자(vascular endothelial growth factor, 이하 VEGF라고 한다), 혈관 내피 증식 인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor, 이하 VEGFR라고 한다), 선유아 세포 증식 인자, 선유아 세포 증식 인자 수용체, 혈소판 유래 증식 인자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체, 간 세포 증식 인자, 간 세포 증식 인자 수용체, 크뤼펠 유사 인자(Kruppel-like factor, 이하 KLF라고 한다), Ets 전사 인자, 핵 인자, 저산소 유도 인자, 세포 주기 관련 인자, 염색체 복제 관련 인자, 염색체 수복 관련 인자, 미소관 관련 인자, 증식 시그널 경로 관련 인자, 증식 관련 전사 인자, 아포토시스 관련 인자 등의 단백질을 코드하는 유전자 등을 들 수 있고, 구체적으로는 VEGF 유전자, VEGFR 유전자, 선유아 세포 증식 인자 유전자, 선유아 세포 증식 인자 수용체 유전자, 혈소판 유래 증식 인자 유전자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체 유전자, 간 세포 증식 인자 유전자, 간 세포 증식 인자 수용체 유전자, KLF 유전자, Ets 전사 인자 유전자, 핵 인자 유전자, 저산소 유도 인자 유전자, 세포 주기 관련 인자 유전자, 염색체 복제 관련 인자 유전자, 염색체 수복 관련 인자 유전자, 미소관 관련 인자 유전자(예컨대, CKAP5 유전자 등), 증식 시그널 경로 관련 인자 유전자(예컨대, KRAS 유전자 등), 증식 관련 전사 인자 유전자, 아포토시스 관련 인자(예컨대, BCL-2 유전자 등) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 이용되는 표적 유전자로서는, 예컨대, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 있어서 발현되는 유전자가 바람직하고, 예컨대 상기한 종양 또는 염증에 관련되는 유전자, B형 간염 바이러스 게놈, C형 간염 바이러스 게놈, 아폴리포단백질(APO), 히드록시메틸글루타릴(HMG) CoA 환원 효소, 켁신 9형 세린프로테아제(PCSK9), 제12인자, 글루카곤 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 류코트리엔 수용체, 트롬복산 A2 수용체, 히스타민 H1 수용체, 탄산 탈수 효소, 안지오텐신 변환 효소, 레닌, p53, 티로신포스파타아제(PTP), 나트륨 의존성 글루코오스 수송 담체, 종양 괴사 인자, 인터류킨 등의 단백질을 코드하는 유전자 등을 들 수 있다.
표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산으로서는, 예컨대 단백질 등을 코드하는 유전자(표적 유전자)의 mRNA의 일부의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하면서, 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산이라면, 예컨대 siRNA(short interference RNA), miRNA(micro RNA) 등의 이중쇄 핵산, shRNA(short hairpin RNA), 안티센스 핵산, 리보자임 등의 단일쇄 핵산 등, 어느 핵산을 이용하여도 좋지만, 이중쇄 핵산이 바람직하다.
표적 유전자의 mRNA의 일부의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산을 안티센스쇄 핵산이라고 하고, 안티센스쇄 핵산의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산을 센스쇄 핵산이라고도 한다. 센스쇄 핵산은, 표적 유전자의 일부의 염기 서열로 이루어지는 핵산 그 자체 등, 안티센스쇄 핵산과 짝을 이뤄 이중쇄 형성부가 생기는 핵산을 말한다.
이중쇄 핵산이란, 2개의 쇄가 짝을 이뤄 이중쇄 형성부를 갖는 핵산을 말한다. 이중쇄 형성부란, 이중쇄 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 또는 그 유도체가 염기쌍을 구성하여 이중쇄를 형성하고 있는 부분을 말한다. 이중쇄 형성부를 구성하는 염기쌍은, 통상 15∼27 염기쌍이며, 15∼25 염기쌍이 바람직하고, 15∼23 염기쌍이 보다 바람직하고, 15∼21 염기쌍이 더욱 바람직하고, 15∼19 염기쌍이 특히 바람직하다.
이중쇄 형성부의 안티센스쇄 핵산으로서는, 표적 유전자의 mRNA의 일부 서열로 이루어지는 핵산, 또는 이 핵산에 있어서 1∼3 염기, 바람직하게는 1∼2 염기, 보다 바람직하게는 1 염기가 치환, 결실 혹은 부가되고, 또한 표적 단백질의 발현 억제 활성을 갖는 핵산이 적합하게 이용된다. 이중쇄 핵산을 구성하는 단일쇄의 핵산 길이는 통상 15∼30 염기로 이루어지는데, 15∼29 염기가 바람직하고, 15∼27 염기가 보다 바람직하고, 15∼25 염기가 더욱 바람직하고, 17∼23 염기가 특히 바람직하고, 19∼21 염기가 가장 바람직하다.
이중쇄 핵산을 구성하는 안티센스쇄, 센스쇄 중 어느 한쪽 또는 양쪽의 핵산은, 이중쇄 형성부에 계속되는 3' 측 또는 5' 측에 이중쇄를 형성하지 않는 추가 핵산을 갖더라도 좋다. 이 이중쇄를 형성하지 않는 부분을 돌출부(오버행)라고도 한다.
돌출부를 갖는 이중쇄 핵산으로서는, 적어도 한쪽의 쇄의 3' 말단 또는 5' 말단에 1∼4 염기, 통상은 1∼3 염기로 이루어지는 돌출부를 갖는 것이 이용되는데, 2 염기로 이루어지는 돌출부를 갖는 것이 바람직하게 이용되고, dTdT 또는 UU로 이루어지는 돌출부를 갖는 것이 보다 바람직하게 이용된다. 돌출부는, 안티센스쇄에만, 센스쇄에만 및 안티센스쇄와 센스쇄 양쪽에 가질 수 있지만, 안티센스쇄와 센스쇄의 양쪽에 돌출부를 갖는 이중쇄 핵산이 바람직하게 이용된다.
또한, 이중쇄 형성부에 이어서 표적 유전자의 mRNA와 일부 또는 모두가 일치하는 서열, 또는 이중쇄 형성부에 이어서 표적 유전자의 mRNA의 상보쇄의 염기 서열과 일치하는 서열을 이용하여도 좋다. 또한, 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산으로서는, 예컨대 Dicer 등의 리보뉴클레아제의 작용에 의해 상기한 이중쇄 핵산을 생성하는 핵산 분자(국제공개 제2005/089287호)나, 3' 말단이나 5' 말단의 돌출부를 갖고 있지 않은 이중쇄 핵산 등을 이용할 수도 있다.
또한, 상기한 이중쇄 핵산이 siRNA인 경우, 안티센스쇄는, 5' 말단 측에서 3' 말단 측으로 향하여 적어도 1∼17번째 염기의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 17 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이고, 바람직하게는, 상기 안티센스쇄는, 5' 말단 측에서 3' 말단 측으로 향하여 1∼19번째 염기의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 19 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이거나, 1∼21번째 염기의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 21 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이거나, 1∼25번째 염기의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 25 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이다.
또한, 본 발명에서 이용되는 핵산이 siRNA인 경우, 바람직하게는 그 핵산 중의 당의 10∼70%, 보다 바람직하게는 15∼60%, 더욱 바람직하게는 20∼50%가, 2' 위치에 있어서 수식기로 치환된 리보오스이다. 본 발명에 있어서의 리보오스의 2' 위치에 있어서 수식기로 치환되었다는 것은, 2' 위치의 수산기가 수식기로 치환되어 있는 것을 의미하고, 리보오스의 2' 위치의 수산기와 입체 배치가 같아도 달라도 좋지만, 바람직하게는 리보오스의 2' 위치의 수산기와 입체 배치가 같다. 2' 위치에 있어서 수식기로 치환된 리보오스는, 당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 2'-수식 뉴클레오티드에 포함되고, 2' 위치에 있어서 수식기로 치환된 리보오스의 수식기는, 2'-수식 뉴클레오티드의 수식기와 동의이다.
본 발명에서 이용되는 핵산에는, 핵산의 구조 중의 인산부, 에스테르부 등에 포함되는 산소 원자 등이, 예컨대 유황 원자 등의 다른 원자로 치환된 유도체를 포함한다.
또한, 안티센스쇄 및 센스쇄의 5' 말단의 염기에 결합하는 당은, 각각 5' 위치의 수산기가, 인산기 혹은 상기한 수식기, 또는 생체 내의 핵산 분해 효소 등에 의해 인산기 혹은 상기한 수식기로 변환되는 기에 의해서 수식되어 있어도 좋다.
또한, 안티센스쇄 및 센스쇄의 3' 말단의 염기에 결합하는 당은, 각각 3' 위치의 수산기가, 인산기 혹은 상기한 수식기, 또는 생체 내의 핵산 분해 효소 등에 의해 인산기 혹은 상기한 수식기로 변환되는 기에 의해서 수식되어 있어도 좋다.
단일쇄의 핵산으로서는, 표적 유전자의 연속되는 15∼27 염기, 바람직하게는 15∼25 염기, 보다 바람직하게는 15∼23 염기, 더욱 바람직하게는 15∼21 염기, 특히 바람직하게는 15∼19 염기로 이루어지는 서열의 상보 서열로 이루어지는 핵산, 또는 이 핵산에 있어서 1∼3 염기, 바람직하게는 1∼2 염기, 보다 바람직하게는 1 염기가 치환, 결실 혹은 부가되고, 또한 표적 단백질의 발현 억제 활성을 갖는 핵산이라면 어느 것이라도 좋다. 이 단일쇄의 핵산 길이는, 15∼30 염기 이하, 바람직하게는 15∼29 염기, 보다 바람직하게는 15∼27 염기, 더욱 바람직하게는 15∼25 염기, 특히 바람직하게는 15∼23 염기의 단일쇄 핵산이 적합하게 이용된다.
단일쇄 핵산으로서, 상기한 이중쇄 핵산을 구성하는 안티센스쇄 및 센스쇄를, 스페이서 서열(스페이서 올리고뉴클레오티드)을 통해 연결한 것을 이용하여도 좋다. 스페이서 올리고뉴클레오티드로서는 6∼12 염기의 단일쇄 핵산 분자가 바람직하고, 그 5' 말단 측의 서열은 2개의 U인 것이 바람직하다. 스페이서 올리고뉴클레오티드의 예로서, UUCAAGAGA의 서열로 이루어지는 핵산을 들 수 있다. 스페이서 올리고뉴클레오티드에 의해서 이어질 수 있는 안티센스쇄 및 센스쇄의 순서는 어느 쪽이 5' 측으로 되어도 좋다. 이 단일쇄 핵산으로서는, 스템 루프 구조에 의해서 이중쇄 형성부를 갖는 shRNA 등의 단일쇄 핵산인 것이 바람직하다. shRNA 등의 단일쇄 핵산은 통상 50∼70 염기 길이이다.
리보뉴클레아제 등의 작용에 의해, 상기한 단일쇄 핵산 또는 이중쇄 핵산을 생성하도록 설계한, 70 염기 길이 이하, 바람직하게는 50 염기 길이 이하, 더욱 바람직하게는 30 염기 길이 이하의 핵산을 이용하여도 좋다.
한편, 본 발명에서 이용되는 핵산은, 이미 알려진 RNA 또는 DNA 합성법 및 RNA 또는 DNA 수식법을 이용하여 제조하면 된다.
본 발명의 지질 나노 입자는 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자이며, 예컨대 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체를 함유하는 지질 나노 입자, 이 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성된 지질 나노 입자 등을 들 수 있다. 지질막은, 지질 단일막(지질 1 분자막)이라도 지질 이중막(지질 2 분자막)이라도 좋다. 한편, 상기 지질막에, 화합물(I), 화합물(II), 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, 상기 복합체 및/또는 상기 지질막에, 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질을 함유하고 있어도 좋다.
또한, 본 발명의 지질 나노 입자로서는, 예컨대 화합물(I)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자 등도 들 수 있다. 이 경우의 지질막도, 지질 단일막(지질 1 분자막)이라도 지질 이중막(지질 2 분자막)이라도 좋다. 한편, 상기 지질막에, 화합물(I), 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, 상기 복합체 및/또는 상기 지질막에, 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질을 함유하고 있어도 좋다.
또한, 본 발명의 지질 나노 입자로서는, 예컨대 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I)을 함유하는 지질 나노 입자 등도 들 수 있다. 이 경우의 지질막도, 지질 단일막(지질 1 분자막)이라도 지질 이중막(지질 2 분자막)이라도 좋다. 한편, 상기 지질막에, 화합물(II), 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, 상기 복합체 및/또는 상기 지질막에, 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질을 함유하고 있어도 좋다.
또한, 본 발명의 지질 나노 입자로서는, 예컨대 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자 등도 들 수 있다. 이 경우의 지질막도, 지질 단일막(지질 1 분자막)이라도 지질 이중막(지질 2 분자막)이라도 좋다. 한편, 상기 지질막에, 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다.
본 발명의 지질 나노 입자에 있어서, 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체를 함유하는 지질 나노 입자, 화합물(I) 또는 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자, 및 화합물(I), 화합물(II), 화합물(I) 및 화합물(II), 또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자가 보다 바람직하고, 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체를 함유하는 지질 나노 입자, 혹은 화합물(I), 또는 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자가 더욱 바람직하고, 화합물(I)과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자가 가장 바람직하다. 한편, 상기 지질막에, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, 상기 복합체 및/또는 상기 지질막에, 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질을 함유하고 있어도 좋다.
복합체의 형태로서는, 어느 경우나 핵산 등과 지질 단일층으로 이루어지는 막(역미셀)과의 복합체, 핵산 등과 리포좀과의 복합체, 핵산 등과 미셀과의 복합체 등을 들 수 있고, 바람직하게는 핵산 등과 지질 단일층으로 이루어지는 막과의 복합체 또는 핵산 등과 리포좀과의 복합체를 들 수 있다.
복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질 이중막으로 구성된 지질 나노 입자로서는, 상기 복합체 및 상기 복합체를 봉입하는 지질 이중막으로 구성된 리포좀 등을 들 수 있다.
한편, 본 발명의 지질 나노 입자는 약물로서 예컨대 핵산을 함유할 수 있는데, 핵산과 화학적으로 근사한 화합물도 함유할 수도 있다.
어느 경우에나 본 발명의 지질 나노 입자에는, 화합물(I) 및 화합물(II)을 각각 1종 또는 복수 종을 사용하여도 좋고, 또한 화합물(I) 및/또는 화합물(II)에는, 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질을 혼합하여도 좋다.
화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질로서는, 예컨대, 일본 특허공개 소61-161246호 공보(미국 특허 5049386호 명세서) 중에 개시된 DOTMA, DOTAP 등, 국제공개 제91/16024호 및 국제공개 제97/019675호 중에 개시된 DORIE, DOSPA 등, 국제공개 제2005/121348호 중에 개시된 DLinDMA 등, 국제공개 제2009/086558호 중에 개시된 DLin-K-DMA 등을 들 수 있고, 바람직하게는 DOTMA, DOTAP, DORIE, DOSPA, DLinDMA, DLin-K-DMA 등의 2개의 비치환 알킬기를 갖는 3급 아민 부위 또는 3개의 비치환 알킬기를 갖는 4급 암모늄 부위를 갖는 양이온성 지질인 것을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 3급 아민 부위를 갖는 양이온성 지질을 들 수 있다. 상기 3급 아민 부위 및 상기 4급 암모늄 부위의 비치환 알킬기는 메틸기인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 지질 나노 입자는, 공지된 제조 방법 또는 그것에 준하여 제조할 수 있으며, 어떠한 제조 방법으로 제조된 것이어도 좋다. 예컨대, 지질 나노 입자의 하나인 리포좀의 제조에는, 공지된 리포좀의 조제 방법을 적용할 수 있다. 공지된 리포좀의 조제 방법으로서는, 예컨대 반감(Bangham) 등의 리포좀 조제법("저널 오브 몰레큘러 바이올로지(J. Mol. Biol.)", 1965년, 13권, p.238-252 참조), 에탄올 주입법("저널 오브 셀 바이올로지(J. Cell Biol.)", 1975년, 66권, p.621-634 참조), 프렌치프레스법("에프이비에스 레터즈(FEBS Lett.)", 1979년, 99권, p.210-214 참조), 동결 융해법("아카이브스 오브 바이오케이스트리 앤드 바이오피직스(Arch. Biochem. Biophys.)", 1981년, 212권, p.186-194 참조), 역상증발법("프로시딩즈 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)", (미국), 1978년, 75권, p.4194-4198 참조) 또는 pH 구배법(예컨대 일본 특허 제2572554호 공보, 일본 특허 제2659136호 공보 등 참조) 등을 들 수 있다. 리포좀을 제조할 때에 리포좀을 분산시키는 용액으로서는, 예컨대 물, 산, 알칼리, 여러 가지 완충액, 생리적 식염액 또는 아미노산 수액 등을 이용할 수 있다. 또한, 리포좀을 제조할 때는, 예컨대 시트르산, 아스코르빈산, 시스테인 또는 에틸렌디아민사초산(EDTA) 등의 항산화제, 예컨대 글리세린, 포도당 또는 염화나트륨 등의 등장화제 등의 첨가도 가능하다. 또한, 지질 등을 예컨대 에탄올 등의 유기 용매에 용해하여, 용매를 유거한 후, 생리식염수 등을 첨가하고, 진탕 교반하여, 리포좀을 형성시킴에 의해서도 리포좀을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 지질 나노 입자는, 예컨대, 화합물(I) 및 화합물(II), 또는 화합물(I) 및 화합물(II)과 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질과의 혼합물을 클로로포름에 미리 용해하고, 이어서 핵산 등의 수용액과 메탄올을 가하여 혼합하여 양이온성 지질/핵산 등의 복합체를 형성시키고, 또한 클로로포름층을 빼내고, 이것에 폴리에틸렌글리콜화 인지질과 중성의 지질과 물을 가하여 유중수도형(W/O) 에멀젼을 형성하고, 역상증발법으로 처리하여 제조하는 방법(일본 특허공표 2002-508765호 공보 참조)이나, 핵산 등을, 산성의 전해질 수용액에 용해하고, 지질(에탄올 속)을 가하고, 에탄올 농도를 20 v/v%까지 내려 상기 핵산 등의 내포 지질 나노 입자를 조제하고, 사이징 여과하고, 투석에 의해서, 과잉의 에탄올을 제거한 후, 시료를 pH를 더 올려 투석하여 지질 나노 입자 표면에 부착된 핵산 등을 제거하여 제조하는 방법(일본 특허공표 2002-501511호 공보 및 "바이오키미카 에트 바이오피지카 액타(Biochimica et Biophysica Acta)", 2001년, 1510권, p.152-166 참조) 등에 의해서 제조할 수 있다.
본 발명의 지질 나노 입자 중, 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입한 지질 이중막으로 구성된 리포좀은, 예컨대, 국제공개 제02/28367호 및 국제공개 제2006/080118호 등에 기재한 제조 방법에 따라서 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 지질 나노 입자 중, 예컨대 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I), 화합물(II), 및/또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자, 화합물(I)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(II) 또는 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자, 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 또는 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자, 및 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자 등은, 국제공개 제02/28367호 및 국제공개 제2006/080118호 등에 기재된 제조 방법에 따라서, 각각의 복합체를 제조하고, 물 또는 0∼20% 에탄올 수용액 중에, 그 복합체를 용해시키지 않고서 분산시키고(A액), 별도로 각각의 지질막 성분을, 에탄올 수용액 중에 용해시키고(B액), 등량의 A액과 B액을 혼합하고, 또 적절히 물을 가함으로써 얻을 수 있다. 한편, A액 및 B액 중의 화합물(I), 화합물(II), 및 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질은, 1종 또는 복수 종을 사용하여 좋고, 각각을 조합시켜 혼합하여 사용하여도 좋다.
한편, 본 발명에 있어서, 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I), 화합물(II), 및/또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자, 화합물(I)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(II) 또는 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자, 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 또는 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자, 및 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자 등의 제조 중 및 제조 후에, 복합체 중의 핵산 등과 지질막 중의 양이온성 지질과의 정전 상호 작용이나, 복합체 중의 양이온성 지질과 지질막 중의 양이온성 지질과의 융합에 의해서, 복합체 및 막의 구조가 변위된 것도, 각각 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I), 화합물(II), 및/또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자, 화합물(I)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(II) 또는 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자, 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 또는 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자, 및 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자 등에 포함된다.
어느 경우에나, 지질막에 화합물(I)과 화합물(II)을 혼합하여 사용하는 것이 보다 바람직하다. 즉, 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I), 화합물(II), 및/또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자, 화합물(I)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자, 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자, 및 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자가 보다 바람직하고, 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I), 화합물(II), 및/또는 화합물(I) 및 화합물(II) 이외의 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자, 화합물(I)과 핵산 등과의 복합체, 화합물(I)에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자가 더욱 바람직하고, 화합물(I)과 핵산 등과의 복합체, 또는 화합물(I) 및 화합물(II)과 핵산 등과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성되고, 지질막에 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자가 가장 바람직하다.
본 발명의 핵산을 함유하는 지질 나노 입자에 있어서, 복합체 중의 화합물(I)의 분자의 총수는, 핵산의 인 원자의 수에 대하여 0.5∼8배인 것이 바람직하고, 1.5∼5배인 것이 보다 바람직하고, 2∼3배인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 복합체 중의 화합물(I) 및 화합물(I) 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 0.5∼8배인 것이 바람직하고, 1.5∼5배인 것이 보다 바람직하고, 2∼3배인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 핵산을 함유하는 지질 나노 입자에 있어서, 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성된 지질 나노 입자 중의 화합물(I)의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 1∼15배인 것이 바람직하고, 2.5∼10배인 것이 보다 바람직하고, 3.5∼8배인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 지질 나노 입자 중의 화합물(I) 및 화합물(I) 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 1∼15배인 것이 바람직하고, 2.5∼10배인 것이 보다 바람직하고, 3.5∼8배인 것이 더욱 바람직하다.
국제공개 제02/28367호 및 국제공개 제2006/080118호 등에 기재된 제조 방법에 따라서, 핵산(상기와 동의), 바람직하게는 이중쇄 핵산과 임의의 양이온성 지질, 바람직하게는 화합물(I) 및/또는 본 발명에 있어서의 화합물(I) 이외의 양이온성 지질을 함유하는 리포좀과의 복합체를 제조하여, 물 또는 0∼20% 에탄올 수용액 중에, 상기 복합체를 용해시키지 않고서 분산시키고(A액), 별도로 임의의 양이온성 지질, 바람직하게는 화합물(I) 및/또는 본 발명에 있어서의 화합물(I) 이외의 양이온성 지질을, 에탄올 수용액 중에 용해시켜(B액), 등량 또는 체적비 1:1의 A액과 B액을 혼합하거나, 또는 적절히 더 물을 가함으로써 상기 핵산과 상기 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자를 얻을 수 있다. 상기 지질 나노 입자는, 바람직하게는 양이온성 지질과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 지질 나노 입자이며, 보다 바람직하게는 상기 핵산과 상기 양이온성 지질을 함유하는 지질 단일층으로 이루어지는 막(역미셀)과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 지질 나노 입자이다. 이들의 경우의 지질막은, 지질 단일막(지질 1 분자막)이라도 지질 이중막(지질 2 분자막)이라도 좋다.
또한, 이번에 개시하는 상기 핵산과 상기 리포좀과의 복합체 중의 리포좀은, 미리 크기를, 평균 입자경 10 nm∼400 nm, 보다 바람직하게는 30 nm∼110 nm, 더욱 바람직하게는 40 nm∼80 nm로 조절한 리포좀이 바람직하다. 또한, 상기 복합체 및/또는 지질막에, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, A액은, 리포좀과 상기 핵산과의 복합체를 형성시킬 수 있으면, 에탄올 농도는 20∼40%라도 좋다.
또한, 등량의 A액과 B액을 혼합하는 대신에, A액과 B액을 혼합 후에 복합체가 용해되지 않으면서, B액 중의 양이온성 지질이 용해되지 않는 에탄올 농도, 바람직하게는 복합체가 용해되지 않고, B액 중의 양이온성 지질이 용해되지 않으면서, 에탄올 농도가 30∼60%인 에탄올 수용액으로 되는 비율로 A액과 B액을 혼합하는 것으로 대신하여도 좋고, 혹은 A액과 B액을 혼합 후에 복합체가 용해되지 않는 에탄올 농도가 되는 비율로 A액과 B액을 혼합하고, 물을 더 가함으로써 B액 중의 양이온성 지질이 용해하지 않게 되는 에탄올 농도로 하는 것으로 하여도 좋다.
여기 개시하는 상기 A액 중에서의 핵산과 리포좀과의 복합체는, A액과 B액을 혼합하고, 적절히 더 물을 가한 후에는, 양이온성 지질을 함유하는 지질 단일층으로 이루어지는 막(역미셀)과 핵산과의 복합체로 형태가 변화하고 있다. 여기 개시하는 제조 방법으로 얻어지는 상기 핵산과 상기 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자는, 바람직하게는 양이온성 지질과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 지질 나노 입자이며, 보다 바람직하게는, 양이온성 지질을 함유하는 지질 단일층으로 이루어지는 막(역미셀)과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 이 지질막에 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자이며, 그 제조성(수율 및/또는 균일성)은 우수하다.
상기 A액 중에서의 핵산과 리포좀과의 복합체에 있어서, 복합체 중의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 핵산의 인 원자의 수에 대하여 0.5∼8배인 것이 바람직하고, 1.5∼5배인 것이 보다 바람직하고, 2∼3배인 것이 더욱 바람직하다.
A액과 B액을 혼합 후의 상기 핵산과 상기 양이온성 지질을 함유하는 지질 단일층으로 이루어지는 막(역미셀)과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 지질 나노 입자에 있어서는, 상기 복합체 및 상기 복합체를 봉입하는 지질막 중의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 1∼15배인 것이 바람직하고, 2.5∼10배인 것이 보다 바람직하고, 3.5∼8배인 것이 더욱 바람직하다.
중성 지질로서는, 단순 지질, 복합 지질 또는 유도 지질의 어떠한 것이라도 좋고, 예컨대 인지질, 글리세로당지질, 스핑고당지질, 스핑고이드 또는 스테롤 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 지질 나노 입자에 있어서 중성 지질을 함유하는 경우에는, 중성 지질의 분자의 총수는, 화합물(I)과 화합물(II) 및 화합물(I)과 화합물(II) 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수에 대하여 0.1∼1.8배인 것이 바람직하고, 0.3∼1.2배인 것이 보다 바람직하고, 0.4∼0.9배인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에 있어서의 지질 나노 입자는, 중성 지질을, 복합체에 함유하고 있어도 좋고, 상기 복합체를 봉입하는 지질막에 함유하고 있어도 좋고, 적어도 상기 복합체를 봉입하는 지질막에 함유하고 있는 것이 보다 바람직하며, 상기 복합체 및 상기 복합체를 봉입하는 지질막의 어느 쪽에나 함유하고 있는 것이 더욱 바람직하다.
중성 지질에 있어서의 인지질로서는, 예컨대 포스파티딜콜린(구체적으로는 대두포스파티딜콜린, 난황포스파티딜콜린(EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC) 등), 포스파티딜에탄올아민(구체적으로는 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 16-0-모노메틸PE, 16-0-디메틸PE, 18-1-트랜스PE, 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE) 등), 글리세로인지질(구체적으로는 포스파티딜세린, 포스파티딘산, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 리조포스파티딜콜린 등), 스핑고인지질(구체적으로는 스핑고미엘린, 세라미드포스포에탄올아민, 세라미드포스포글리세롤, 세라미드포스포글리세로인산 등), 글리세로포스포노지질, 스핑고포스포노지질, 천연 레시틴(구체적으로는 난황 레시틴, 대두 레시틴 등) 또는 수소 첨가 인지질(구체적으로는 수소 첨가 대두포스파티딜콜린 등) 등의 천연 또는 합성의 인지질을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 글리세로당지질로서는, 예컨대 술폭시리보실글리세리드, 디글리코실디글리세리드, 디갈락토실디글리세리드, 갈락토실디글리세리드 또는 글리코실디글리세리드 등을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 스핑고당지질로서는, 예컨대 갈락토실세레브로시드, 락토실세레브로시드 또는 강글리오시드 등을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 스핑고이드로서는, 예컨대 스핑간, 이코사스핑간, 스핑고신 또는 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 유도체로서는, 예컨대 스핑간, 이코사스핑간 또는 스핑고신 등의 -NH2를 -NHCO(CH2)xCH3(식에서, x는 0∼18의 정수이며, 그 중에서도 6, 12 또는 18이 바람직하다)로 변환한 것 등을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 스테롤로서는, 예컨대 콜레스테롤, 디히드로콜레스테롤, 라노스테롤, β-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 에르고카스테롤, 푸코스테롤 또는 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol) 등을 들 수 있다.
고분자로서는, 예컨대 단백질, 알부민, 덱스트란, 폴리펙트(polyfect), 키토산, 덱스트란황산, 예컨대 폴리-L-리신, 폴리에틸렌이민, 폴리아스파라긴산, 스티렌말레산 공중합체, 이소프로필아크릴아미드-아크릴피롤리돈 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 수식 덴드리머, 폴리젖산, 폴리젖산폴리글리콜산 또는 폴리에틸렌글리콜화폴리젖산 등의 고분자 또는 이들 염의 1 이상으로 이루어지는 미셀을 들 수 있다.
여기서, 고분자에 있어서의 염은, 예컨대 금속염, 암모늄염, 산 부가염, 유기 아민 부가염, 아미노산 부가염 등을 포함한다. 금속염으로서는, 예컨대 리튬염, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 알루미늄염 또는 아연염 등을 들 수 있다. 암모늄염으로서는, 예컨대 암모늄 또는 테트라메틸암모늄 등의 염을 들 수 있다. 산 부가염으로서는, 예컨대 염산염, 황산염, 질산염 또는 인산염 등의 무기산염, 및 초산염, 말레산염, 푸마르산염 또는 시트르산염 등의 유기산염을 들 수 있다. 유기 아민 부가염으로서는, 예컨대 모르폴린 또는 피페리딘 등의 부가염을 들 수 있다. 아미노산 부가염으로서는, 예컨대 글리신, 페닐알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산 또는 리신 등의 부가염을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 지질 나노 입자는 어떻든 간에, 예컨대 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체 또는 계면활성제 등을 함유하는 것이 바람직하다. 상기 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체 또는 계면활성제는, 복합체에 함유되어도 좋고, 복합체를 봉입하는 지질막에 함유되어 있어도 좋으며, 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막의 어느 쪽에나 함유되어 있는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 지질 나노 입자가, 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체를 함유하는 경우에는, 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 및 지방산 유도체의 분자의 총수는, 화합물(I), 화합물(I) 및 화합물(I) 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수에 대하여 0.05∼0.3배인 것이 바람직하고, 0.07∼0.25배인 것이 보다 바람직하고, 0.1∼0.2배인 것이 더욱 바람직하다.
당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제로서는, 바람직하게는, 당지질, 또는 수용성 고분자의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체를 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 수용성 고분자의 지질 유도체 또는 지방산 유도체를 들 수 있다. 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제는, 분자의 일부가 지질 나노 입자의 다른 구성 성분과 예컨대 소수성 친화력, 정전적 상호 작용 등으로 결합하는 성질을 가지고, 다른 부분이 지질 나노 입자 제조시의 용매와 예컨대 친수성 친화력, 정전적 상호 작용 등으로 결합하는 성질을 갖는, 이면성(二面性)을 갖는 물질인 것이 바람직하다.
당, 펩티드 또는 핵산의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 자당, 소르비톨, 젖당 등의 당, 예컨대 카제인 유래 펩티드, 난백 유래 펩티드, 대두 유래 펩티드, 글루타치온 등의 펩티드, 또는 예컨대 DNA, RNA, 플라스미드, siRNA, ODN 등의 핵산과, 상기 지질 나노 입자의 정의 중에 예로 든 중성 지질 혹은 본 발명의 양이온성 지질 또는 예컨대 스테아린산, 팔미틴산, 미리스틴산, 라우린산 등의 지방산이 결합하여 이루어지는 것 등을 들 수 있다.
또한, 당의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 상기 지질 나노 입자의 정의 중에 예로 든 글리세로당지질 또는 스핑고당지질 등도 포함된다.
수용성 고분자의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세린, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 올리고당, 덱스트린, 수용성 셀룰로오스, 덱스트란, 콘드로이친황산, 폴리글리세린, 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아스파라긴산아미드, 폴리-L-리신, 만난, 풀루란, 올리고글리세롤 등 또는 이들의 유도체와, 상기 지질 나노 입자의 정의 중에 예로 든 중성 지질 혹은 본 발명의 양이온성 지질, 또는 예컨대 스테아린산, 팔미틴산, 미리스틴산 또는 라우린산 등의 지방산이 결합하여 이루어지는 것, 이들의 염 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜 유도체, 폴리글리세린 유도체 등의 지질 유도체 또는 지방산 유도체를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜 유도체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 및 이들의 염을 들 수 있다.
폴리에틸렌글리콜 유도체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜화 지질(구체적으로는 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민(보다 구체적으로는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](PEG-DSPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](PEG-DMPE) 등), 폴리옥시에틸렌경화피마자유60, 크레모포아 이엘(CREMOPHOR EL) 등), 폴리에틸렌글리콜소르비탄지방산에스테르류(구체적으로는 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 등) 또는 폴리에틸렌글리콜지방산에스테르류 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜화 지질을 들 수 있다.
폴리글리세린 유도체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 폴리글리세린화 지질(구체적으로는 폴리글리세린-포스파티딜에탄올아민 등) 또는 폴리글리세린지방산에스테르류 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 폴리글리세린화 지질을 들 수 있다.
계면활성제로서는, 예컨대 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄(구체적으로는 폴리솔베이트80 등), 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜(구체적으로는 풀루로닉 F68 등), 소르비탄지방산에스테르(구체적으로는 소르비탄모노라우레이트, 소르비탄모노올레에이트 등), 폴리옥시에틸렌유도체(구체적으로는 폴리옥시에틸렌경화피마자유60, 폴리옥시에틸렌라우릴알코올 등), 글리세린지방산에스테르 또는 폴리에틸렌글리콜알킬에테르 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 글리세린지방산에스테르 또는 폴리에틸렌글리콜알킬에테르 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 지질 나노 입자에는, 예컨대 고분자, 폴리옥시에틸렌 유도체 등에 의한 표면 개질도 임의로 행할 수 있다(라직(D.D. Lasic), 마틴(F. Martin) 편, "스텔스 리포솜즈(Stealth Liposomes)", (미국), 씨알씨 프레스 잉크(CRC Press Inc), 1995년, p.93-102 참조). 표면 개질에 사용할 수 있는 고분자로서는, 예컨대 덱스트란, 풀루란, 만난, 아밀로펙틴 또는 히드록시에틸전분 등을 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌 유도체로서는, 예컨대 폴리솔베이트80, 풀루로닉 F68, 폴리옥시에틸렌경화피마자유60, 폴리옥시에틸렌라우릴알코올 또는 PEG-DSPE 등을 들 수 있다. 이 표면 개질에 의해서, 본 발명의 지질 나노 입자, 지질 나노 입자 중의 복합체 및 지질막에 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제를 함유시킬 수 있다.
또한, 표적화 리간드를, 본 발명의 지질 나노 입자의 지질 성분의 극성 헤드 잔기에 공유 결합함으로써 본 발명의 지질 나노 입자의 표면에 임의로 직접 결합시킬 수 있다(국제공개 제2006/116107호 참조).
본 발명에 있어서의 지질 나노 입자의 평균 입자경은, 원하는 바에 따라 자유롭게 선택할 수 있는데, 하기하는 평균 입자경으로 하는 것이 바람직하다. 평균 입자경을 조절하는 방법으로서는, 예컨대 익스트루젼법, 큰 다중막 리포좀(MLV) 등을 기계적으로 분쇄(구체적으로는 만톤-가울린, 마이크로플루이다이저 등을 사용)하는 방법(뮐러(R.H. Muller), 베니타(S. Benita), 봄(B.Bohm) 편저, "에멀젼 앤드 나노서스펜션즈 포 더 포뮬레이션 오브 푸얼리 솔러블 드러그즈(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)", 독일, 사이언티픽 퍼블리셔즈 스튜가르트(Scientific Publishers Stuttgart), 1998년, p.267-294 참조) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 지질 나노 입자의 크기는, 평균 입자경이 약 10 nm∼1000 nm인 것이 바람직하고, 약 30 nm∼300 nm인 것이 보다 바람직하고, 약 50 nm∼200 nm인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 지질 나노 입자를, 포유류의 세포에 투여함으로써, 본 발명의 지질 나노 입자 중의 핵산 등을 세포 내에 도입할 수 있다.
인비트로로 본 발명의 지질 나노 입자를 포유류의 세포에 투여하는 방법은, 인비트로에 있어서 행할 수 있는 공지된 트랜스펙션 순서에 따라서 행하면 된다.
인비보로 본 발명의 지질 나노 입자를 포유류의 세포에 투여하는 방법은, 인비보에 있어서 행할 수 있는 공지된 트랜스펙션 순서에 따라서 행하면 된다. 예컨대, 본 발명의 지질 나노 입자를, 사람을 포함하는 포유동물에게 정맥내 투여함으로써, 예컨대 암 또는 염증이 생긴 장기 또는 부위에 송달되어, 송달 장기 또는 부위의 세포 내에 본 발명의 지질 나노 입자 중의 핵산 등을 도입할 수 있다. 암 또는 염증이 생긴 장기 또는 부위로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 위, 대장, 간장, 폐, 비장, 췌장, 신장, 방광, 피부, 혈관, 안구 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 지질 나노 입자를, 사람을 포함하는 포유동물에게 정맥내 투여함으로써, 예컨대 혈관, 간장, 폐, 비장 및/또는 신장에 송달되어, 송달 장기 또는 부위의 세포 내에 본 발명의 지질 나노 입자 중의 핵산 등을 도입할 수 있다. 간장, 폐, 비장 및/또는 신장의 세포는, 정상 세포, 암 혹은 염증에 관련된 세포 또는 그 밖의 질환에 관련된 세포의 어느 것이라도 좋다.
본 발명의 지질 나노 입자 중의 핵산 등이, RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산이라면, 인비보로 포유류의 세포 내에, 유전자의 발현을 억제하는 핵산 등을 도입할 수 있어, 유전자 등의 발현을 억제할수 있다. 투여 대상은 사람인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 지질 나노 입자에 있어서의 표적 유전자가 예컨대 종양 또는 염증에 관련된 유전자라면, 본 발명의 지질 나노 입자를, 암 또는 염증 질환의 치료제 또는 예방제, 바람직하게는 고형암 또는 혈관 혹은 혈관 근방 염증의 치료제 또는 예방제로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 지질 나노 입자에 있어서의 표적 유전자가 혈관 신생에 관련된 유전자 등이라면, 혈관 평활근의 증식이나 혈관 신생 등을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명의 지질 나노 입자를, 예컨대 혈관 평활근의 증식이나 혈관 신생을 동반하는 암 또는 염증 질환의 치료제 또는 예방제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 양이온성 지질을, 복수 종을 조합시켜 사용하는 경우 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 조합하여 사용하는 경우에는, 개개의 양이온성 지질을 단독으로 사용하는 경우와 비교하여 감량할 수 있기 때문에, 양이온성 지질이 원인의 바람직하지 못한 사상의 발생율이나 정도를 줄일 수 있다.
즉, 본 발명은, 상기 설명한 본 발명의 지질 나노 입자를 포유동물에게 투여하는 암 또는 염증 질환의 치료 방법도 제공한다. 투여 대상은 사람인 것이 바람직하고, 암 또는 염증 질환을 앓고 있는 사람이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 지질 나노 입자는, 암 또는 염증 질환의 치료제 또는 예방제에 관한 인비보의 약효 평가 모델에 있어서, 표적 유전자를 억제하는 유효성을 검증하기 위한 툴로서 사용할 수도 있다.
본 발명의 지질 나노 입자는, 예컨대 혈액 성분 등의 생체 성분(예컨대 혈액, 소화관 등) 속에서의 상기 핵산 등의 안정화, 부작용의 저감 또는 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에의 약제 집적성의 증대 등을 목적으로 하는 제제로서도 사용할 수 있다.
본 발명의 지질 나노 입자를, 의약품의 암 또는 염증 질환 등의 치료제 또는 예방제로서 사용하는 경우, 투여 경로로서는, 치료할 때 가장 효과적인 투여 경로를 사용하는 것이 바람직하고, 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내 등의 비경구 투여 또는 경구 투여를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥내 투여 또는 근육내 투여를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다.
투여량은, 투여 대상의 병 상태나 연령, 투여 경로 등에 따라 다르지만, 예컨대 핵산으로 환산한 하루 투여량이 약 0.1 ㎍∼1000 mg가 되도록 투여하면 된다.
정맥내 투여 또는 근육내 투여에 적당한 제제로서는, 예컨대 주사제를 들 수 있고, 전술한 방법에 의해 조제한 지질 나노 입자의 분산액을 그대로 예컨대 주사제 등의 형태로 이용하는 것도 가능하지만, 그 분산액으로부터 예컨대 여과, 원심 분리 등에 의해서 용매를 제거하여 사용하는 것도, 그 분산액을 동결 건조하여 사용하거나, 및/또는 예컨대 만니톨, 락토오스, 트레할로오스, 말토오스 혹은 글리신 등의 부형제를 가한 분산액을 동결 건조하여 사용하는 것도 가능하다.
주사제의 경우, 상기한 지질 나노 입자의 분산액 또는 상기한 용매를 제거 또는 동결 건조한 지질 나노 입자에, 예컨대 물, 산, 알칼리, 여러 가지 완충액, 생리적 식염액 또는 아미노산 수액 등을 혼합하여 주사제를 조제하는 것이 바람직하다. 또한, 예컨대 시트르산, 아스코르빈산, 시스테인 혹은 EDTA 등의 항산화제 또는 글리세린, 포도당 혹은 염화나트륨 등의 등장화제 등을 첨가하여 주사제를 조제하는 것도 가능하다. 또한, 예컨대 글리세린 등의 동결보존제를 가하여 동결 보존할 수도 있다.
이어서, 실시예 및 시험예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
한편, 참고예에 기재된 프로톤 핵자기공명 스펙트럼(1H NMR)은, 270 MHz, 300 MHz 또는 400 MHz에서 측정된 것으로, 화합물 및 측정 조건에 따라서는 교환성 프로톤이 명료하게는 관측되지 않는 경우가 있다. 한편, 시그널의 다중도 표기로서는 통상 이용되는 것을 이용하고 있지만, br이란 외관상 폭넓은 시그널임을 나타낸다.
참고예 1
메틸디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아민(화합물 1)
메틸아민(알드리치(Aldrich)사 제조, 약 2 mol/L 테트라히드로푸란 용액, 10.5 mL, 21.0 mmol)에 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(뉴체크 프렙(Nu-Chek Prep, Inc)사 제조, 1.03 g, 3.00 mmol)를 가하고, 마이크로파 반응 장치를 이용하여 150℃에서 90분간 가열 교반했다. 반응액을 초산에틸로 희석하고, 2 mol/L 수산화나트륨 수용액, 이어서 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하고, 감압 하에 농축함으로써 메틸((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아민의 조생성물을 얻었다.
얻어진 조생성물에 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에틸 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 0.93 g, 2.70 mmol) 및 50% 수산화나트륨 수용액(0.960 g, 12.0 mmol)을 가하여, 유욕(油浴)상 135℃에서 60분간 가열 교반했다. 실온까지 냉각 후, 반응액을 초산에틸로 희석하고, 물, 이어서 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 하에 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0∼97/3)로 정제함으로써 화합물 1(1.07 g, 67.2 %)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 529(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.7Hz, 6H), 1.29(br s, 32H), 1.40-1.51(m, 4H), 1.97-2.06(m, 8H), 2.20(s, 3H), 2.30(t, J=7.6Hz, 4H), 2.77(t, J=5.8Hz, 4H), 5.28-5.43(m, 8H).
참고예 2
메틸디((Z)-헥사데카-9-에닐)아민(화합물 2)
참고예 1과 같은 방법으로, 메틸아민(Aldrich사 제조, 약 2 mol/L 테트라히드로푸란 용액, 10.0 mL, 20.0 mmol) 및 (Z)-헥사데카-9-에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 1.21 g, 3.80 mmol)를 이용하여, 화합물 2(0.491 g, 51.6%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 477(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.7Hz, 6H), 1.29(br s, 36H), 1.46-1.57(m, 4H), 1.97-2.05(m, 8H), 2.33(s, 3H), 2.45(t, J=7.9Hz, 4H), 5.29-5.41(m, 4H).
참고예 3
메틸디((11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐)아민(화합물 3)
참고예 1과 같은 방법으로, 메틸아민(Aldrich사 제조, 약 2 mol/L 테트라히드로푸란 용액, 16.0 mL, 32.0 mmol) 및 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 2.98 g, 8.00 mmol)를 이용하여, 화합물 3(1.27 g, 54.4%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 585(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.7Hz, 6H), 1.27(br s, 40H), 1.39-1.51(m, 4H), 2.01-2.09(m, 8H), 2.20(s, 3H), 2.30(t, J=7.6Hz, 4H), 2.79(d, J=6.3Hz, 4H), 5.28-5.43(m, 8H).
참고예 4
디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아민(화합물 4)
참고예 1과 같은 방법으로, 암모니아(도쿄가세이고교사 제조, 약 2 mol/L 메탄올 용액, 18.0 mL, 36.0 mmol) 및 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 2.79 g, 8.10 mmol)를 이용하여, 화합물 4(0.838 g, 36.2%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 515(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J=6.9Hz, 6H), 1.30(br s, 33H), 1.41-1.54(m, 4H), 2.01-2.09(m, 8H), 2.59(t, J=7.2Hz, 4H), 2.77(t, J=5.6Hz, 4H), 5.28-5.43(m, 8H).
참고예 5
디((Z)-옥타데카-9-에닐)아민(화합물 5)
참고예 1과 같은 방법으로, 암모니아(도쿄가세이고교사 제조, 약 2 mol/L 메탄올 용액, 12.0 mL, 24.0 mmol) 및 (Z)-옥타데카-9-에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 1.87 g, 5.40 mmol)를 이용하여, 화합물 5(0.562 g, 36.2%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 519(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.7Hz, 6H), 1.29(br s, 45H), 1.41-1.52(m, 4H), 1.97-2.05(m, 8H), 2.58(t, J=7.2Hz, 4H), 5.28-5.40(m, 4H).
참고예 6
메틸디((Z)-옥타데카-9-에닐)아민(화합물 6)
참고예 1과 같은 방법으로, 메틸아민(Aldrich사 제조, 약 2 mol/L 테트라히드로푸란 용액, 11.2 mL, 22.4 mmol) 및 (Z)-옥타데카-9-에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 2.11 g, 6.09 mmol)를 이용하여, 화합물 6(1.20 g, 70.2 %)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 533(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.6Hz, 6H), 1.27(br s, 44H), 1.39-1.50(m, 4H), 1.97-2.06(m, 8H), 2.20(s, 3H), 2.30(t, J=7.6Hz, 4H), 5.28-5.40(m, 4H).
참고예 7 trans-1-(tert-부톡시카르보닐)-3,4-비스(((Z)-옥타데카-9-에노일옥시)메틸)피롤리딘(화합물 145)
국제공개 제2006/100036호를 참고로 하여 합성한 trans-3,4-비스(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르복실산tert-부틸(156 mg, 0.674 mmol)을 디클로로메탄(6 mL)에 용해시키고, 올레인산(도쿄가세이고교사 제조, 419 mg, 1.48 mmol), WSCD(고쿠산가가쿠사 제조, 297 mg, 1.55 mmol), 4-디메틸아미노피리딘(도쿄가세이고교사 제조, DMAP(20.6 mg, 0.169 mmol)를 가하여 실온에서 밤새 교반했다. 반응액에 포화중조수를 가하여 초산에틸로 추출했다. 유기층을 물 및 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후, 감압 하에 농축했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/클로로포름=50/50∼0/100)로 정제함으로써 화합물 145(280 mg, 54.6%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 761(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.6Hz, 6H), 1.25-1.46(m, 36H), 1.46(s, 9H), 1.46-1.66(m, 8H), 1.97-2.04(m, 8H), 2.27-2.38(m, 6H), 3.10-3.23(m, 2H), 3.53-3.66(m, 2H), 4.03(dd, J=10.8, 6.0Hz, 2H), 4.14(dd, J=10.8, 6.0Hz, 2H), 5.28-5.40(m, 4H).
참고예 8 trans-1-(tert-부톡시카르보닐)-3,4-비스(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노일옥시)메틸)피롤리딘(화합물 146)
참고예 7과 같은 방법으로, 국제공개 제2006/100036호를 참고로 하여 합성한 trans-3,4-비스(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르복실산tert-부틸(150 mg, 0.674 mmol) 및 리놀레산(알드리치사 제조, 400 mg, 1.48 mmol)을 이용하여, 화합물 146(351 mg, 71.7%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 757(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8Hz, 6H), 1.21-1.45(m, 26H), 1.46(s, 9H), 1.47-1.68(m, 6H), 2.05(q, J=6.7Hz, 8H), 2.26-2.38(m, 6H), 2.77(t, J=5.9Hz, 4H), 3.10-3.23(m, 2H), 3.53-3.66(m, 2H), 4.03(dd, J=11.0, 6.0Hz, 2H), 4.14(dd, J=11.0, 6.0Hz, 2H), 5.28-5.43(m, 8H).
참고예 9 trans-3,4-비스(((Z)-옥타데카-9-에노일옥시)메틸)피롤리딘(화합물 110)
참고예 7에서 얻어진 화합물 145(278 mg, 0.366 mmol)를 디클로로메탄(6 mL)에 용해시키고, 트리플루오로초산(0.563 mL, 7.31 mmol)을 가하여 실온에서 3시간 교반했다. 반응 혼합물에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하여, 수층을 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 하에 농축했다. 얻어진 잔사를 소량의 메탄올에 용해하고, 플라스틱 컬럼에 충전한 BONDESIL-SCX(바리안(VARIAN)사 제조, 6 g)의 상부에 흡착시키고, 메탄올로 세정하고, 이어서 암모니아·메탄올 용액(도쿄가세이고교사 제조, 2 mol/L)으로 목적물을 용출시켰다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 하에 농축함으로써 화합물 110(162 mg, 67.2%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 661(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.6Hz, 6H), 1.27-1.35(m, 40H), 1.56-1.64(m, 4H), 2.01(q, J=5.9Hz, 8H), 2.09-2.16(m, 2H), 2.30(t, J=7.5Hz, 4H), 2.72(dd, J=11.3, 5.5Hz, 2H), 3.11(dd, J=11.3, 7.1Hz, 2H), 3.99-4.12(m, 4H), 5.29-5.40(m, 4H).
참고예 10 trans-3,4-비스(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노일옥시)메틸)피롤리딘(화합물 111)
참고예 9와 같은 방법으로, 참고예 8에서 얻어진 화합물 146(350 mg, 0.463 mmol)을 이용하여, 화합물 111(224 mg, 73.6%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 657(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8Hz, 6H), 1.26-1.40(m, 28H), 1.57-1.66(m, 4H), 2.05(q, J=6.6Hz, 8H), 2.09-2.17(m, 2H), 2.31(t, J=7.5Hz, 4H), 2.72(dd, J=11.3, 6.0Hz, 2H), 2.77(t, J=6.2Hz, 4H), 3.11(dd, J=11.3, 7.3Hz, 2H), 3.99-4.13(m, 4H), 5.28-5.43(m, 8H).
참고예 11 trans-1-메틸-3,4-비스(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노일옥시)메틸)피롤리딘(화합물 117)
참고예 10에서 얻어진 화합물 111(80 mg, 0.12 mmol)을 1,2-디클로로에탄(1.5 mL), 메탄올(1.5 mL)에 용해시키고, 포름알데히드(0.091 mL, 1.22 mmol), 나트륨트리아세톡시보로하이드리드(아크로스 오가닉스(Acros Organics)사 제조, 129 mg, 0.610 mmol)를 복수 회에 걸쳐 가하여 실온에서 1.5시간 교반했다. 반응 용액에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하고, 수층을 초산에틸로 추출했다. 유기층을 포화염화나트륨 수용액으로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 하에 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0∼93/7)로 정제함으로써 화합물 117(66 mg, 81%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 671(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8Hz, 6H), 1.25-1.40(m, 28H), 1.57-1.66(m, 4H), 2.05(q, J=6.7Hz, 8H), 2.13-2.24(m, 2H), 2.27-2.37(m, 9H), 2.66(dd, J=9.2, 7.3Hz, 2H), 2.77(t, J=5.7Hz, 4H), 3.99-4.12(m, 4H), 5.28-5.43(m, 8H).
참고예 12 trans-1-메틸-3,4-비스(((Z)-옥타데카-9-에노일옥시)메틸)피롤리딘(화합물 116)
참고예 11과 같은 방법으로, 참고예 9에서 얻어진 화합물 110(50 mg, 0.076 mmol)을 이용하여, 화합물 116(47 mg, 92%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 675(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.6Hz, 6H), 1.26-1.35(m, 40H), 1.56-1.65(m, 4H), 2.01(q, J=5.5Hz, 8H), 2.15-2.24(m, 2H), 2.27-2.37(m, 9H), 2.67(dd, J=9.3, 7.1Hz, 2H), 3.99-4.12(m, 4H), 5.29-5.40(m, 4H).
참고예 13 trans-1-메틸-3,4-비스(((Z)-헥사데카-9-에노일옥시)메틸)피롤리딘(화합물 118)
국제공개 제2011/136368호에 기재된 방법(참고예 16)에 의해서 얻어지는 (trans-1-벤질피롤리딘-3,4-디일)디메탄올(2.06 g, 9.31 mmol)의 메탄올(3 mL) 용액에 요오드화메틸(도쿄가세이고교사 제조, 26.4 g, 186 mmol)을 가하여, 실온에서 2시간 교반했다. 반응액을 감압 하에 농축했다. 잔사를 음이온 교환 수지(Dowex 1x-200 염화물형(더 다우 케미컬 컴퍼니(The Dow Chemical Company)사 제조), 약 30 mL, 물과 메탄올로 예비 세정한 것)에 로드하여, 메탄올로 용출했다. 용출액을 감압 하에 농축했다. 잔사에 초산에틸을 가하고, 생긴 결정을 여과하여 취함으로써 trans-1-벤질-3,4-비스(히드록시메틸)-1-메틸피롤리디늄염화물(2.53 g, 정량적 수율)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 236 M+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 2.67(m, 2H), 3.08(s, 3H), 3.28-3.45(m, 4H), 3.53-3.98(m, 6H), 4.63(s, 2H), 7.49-7.63(m, 5H).
얻어진 trans-1-벤질-3,4-비스(히드록시메틸)-1-메틸피롤리디늄염화물(2.53 g, 9.31 mmol)에 팔라듐탄소(약 10% 함수, 0.495 g, 0.465 mmol)와 메탄올(25 mL)을 가하고, 수소 가스 분위기 하에 50℃에서 3시간 가열 교반했다. 반응액을 세라이트 여과하여, 메탄올로 세정했다. 여과액을 합쳐 감압 하에 농축함으로써, trans-3,4-비스(히드록시메틸)-1-메틸피롤리딘염산염(1.71 g, 정량적 수율)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 146(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 2.42(m, 2H), 2.89(s, 3H), 3.22-3.42(m, 4H), 3.44-3.69(m, 6H).
얻어진 trans-3,4-비스(히드록시메틸)-1-메틸피롤리딘염산염(200 mg, 1.10 mmol)의 클로로포름(8 ml) 용액에 (Z)-헥사데카-9-엔산(도쿄가세이고교사 제조, 616 mg, 2.422 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·염산염(도진도사 제조 485 mg, 2.53 mmol), 트리에틸아민(도쿄가세이고교사 제조, 0.614 ml, 4.40 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(도쿄가세이고교사 제조 33.6 mg, 0.275 mmol)을 가하여 실온에서 밤새 교반했다. 반응액에 포화중조수를 가하여, 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 합쳐 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 여과하여, 감압 하에 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(메탄올/클로로포름=0/100∼2/98)로 정제하여, 화합물 118(163 mg, 24%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 146(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.6Hz, 6H), 1.26-1.31(m, 34H), 1.56-1.64(m, 4H), 1.97-2.03(m, 8H), 2.15-2.23(m, 2H), 2.27-2.38(m, 9H), 2.67(dd, J=9.3, 7.1Hz, 2H), 3.99-4.12(m, 4H), 5.29-5.40(m, 4H).
비교예 1
참고예 1에서 얻어진 화합물 1을 이용하여 다음과 같이 제제를 제조했다. 이용한 핵산은, 센스쇄[5'-mGmGAAGCUGGCGAUUAUGCAGAUUmUmA-3'(m이 부쳐진 염기에 결합하는 당은, 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보오스이다)]와, 안티센스쇄[5'-UAAAUCUGCAUAAUCGCCAGCUUCC-3'(5' 말단이 인산화되어 있다)]의 염기 서열로 이루어지는, CKAP5 유전자의 발현을 억제하는 CKAP5 siRNA이며, 닛폰이지티사, 진디자인사, 인비트로젠사 또는 홋카이도시스템사이언스사로부터, 어닐링을 마친 동결 건조 siRNA를 입수하여, 증류수로 용해시킴으로써 24 mg/mL로 조제했다(이하 CKAP5 siRNA 용액이라고 함).
화합물 1/1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)나트륨염(PEG-DMPE Na, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜 2000)-1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민=나트륨염, 니치유사 제조)=57.26/5.521 mmol/L가 되도록 염산 및 에탄올을 함유하는 수용액에 현탁시키고, vortex 교반 믹서로 교반 및, 가온을 반복하여 균일한 현탁액을 얻었다. 이 현탁액을 실온 하에서 0.2 ㎛의 폴리카보네이트 멤브레인 필터 및 0.05 ㎛의 폴리카보네이트 멤브레인 필터에 통과시켜, 리드 입자의 분산액을 얻었다. Dynamic light scattering(DLS)로 얻어진 리드 입자의 평균 입자경을 측정하여, 30 nm에서 100 nm의 범위 내임을 확인했다. 얻어진 리드 입자의 분산액에, CKAP5siRNA 용액을, 3:1의 비율로 혼합하고, 또한 3배량의 증류수를 가하여 혼합함으로써 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을 조제했다.
한편, 화합물 1/1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)나트륨염(PEG-DSPE Na, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민=나트륨염, 니치유사 제조)/디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 90 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막 구성 성분의 용액을 조제했다.
얻어진 지질막 구성 성분의 용액을 가온한 후, 얻어진 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을 1:1의 비율로 혼합하고, 또한 수배량의 증류수를 혼합하여, 조제제(粗製劑)를 얻었다.
얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축하고, 또한 생리식염수로 치환하고, 0.2 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 또한 얻어진 제제의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 1.0 mg/mL가 되도록 생리식염수를 이용하여 희석했다. 이 제제 중의 지질 나노 입자의 평균 입자경은 86.0 nm였다.
실시예 1
참고예 1에서 얻어진 화합물 1과 참고예 11에서 얻어진 화합물 117을 이용하여, 다음과 같이 제제를 제조했다.
비교예 1과 같이 하여 CKAP5 siRNA 및 리드 입자로부터 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을 조제했다.
한편, 화합물 1/화합물 117/1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)나트륨염(PEG-DSPE Na, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민=나트륨염, 니치유사 제조)/디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=2.982/5.965/2.943/5.707/11.83 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 90 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막 구성 성분의 용액을 조제했다.
얻어진 지질막 구성 성분의 용액을 가온한 후, 얻어진 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을 1:1의 비율로 혼합하고, 또한 수배량의 증류수를 혼합하여, 조제제를 얻었다.
얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축하고, 또한 생리식염수로 치환하고, 0.2 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 또한 얻어진 제제의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 1.0 mg/mL가 되도록 생리식염수를 이용하여 희석했다. 입자경 측정 장치(Zetasizer Nano ZS, 마르번(Malvern)사 제조)로 제제 중의 지질 나노 입자의 입자경을 측정한 결과, 상기 제제 중의 지질 나노 입자의 평균 입자경은 93.9 nm였다.
시험예 1
실시예 1에서 얻어진 제제(화합물 1, 화합물 117 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자) 및 비교예 1에서 얻어진 제제(화합물 1 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자)를, 각각 이하의 방법에 의해 인비보 mRNA 넉다운 평가 시험을 실시했다.
인간 췌장암 유래 세포주인 MIA PaCa-2는 JCRB 세포 뱅크로부터 수령하여, 10% 불활성화 소 태아 혈청(GIBCO사 제조) 및 1 vol% 페니실린-스트렙토마이신(나카라이테스크사 제조, 26253-84)를 포함하는 고글루코오스 함유 DMEM(GIBCO사 제조, 11995-073)에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양했다. MIA PaCa-2를 (1×108 cells/mL의 농도가 되도록 PBS에 현탁하고, 이 세포 현탁액 100 μL를 SCID 마우스(닛폰쿠레아로부터 입하)의 등쪽(dorsal) 피하에 이식했다(1×107 cells/0.1 mLPBS/head). 이식 6일 후, 종양 체적을 지표로 1군 3마리로 그룹을 나눠, 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 제제를 10 mg/kg(10 mL/kg)로 마우스에게 정맥내 투여했다. 음성 대조로서 생리식염수를 사용하여, 10 mL/kg로 투여했다. 투여 전 및 투여 48시간 후에 마우스의 체중을 측정했다. 체중 측정 후에 마우스를 안락사시켜, 피하 종양을 적출했다. 적출한 종양은 즉시 액체 질소로 동결하여, 사용할 때까지 -80℃로 보존했다.
얻어진 종양 샘플에 관해서, 샘플이 들어간 2 mL 둥근 바닥 tube에 1 mL의 Trizol reagent(인비트로젠(Invitrogen) 제조, 15596-018) 및 5 mm의 지르코니아 비드를 첨가하고, Tissue lyser II(키아겐(QIAGEN) 제조)로 1/25 freq, 1.5 min x 2회의 조건으로 파쇄했다. 파쇄 후 원심(10000 rpm, 10 min)하여 상청을 회수하고, 200 μL의 클로로포름을 첨가하여 격하게 교반한 후 다시 원심(15000 rpm, 15 min)했다. 얻어진 상청 200 μL에서 자동 핵산 추출기 MagNA PURE 96(로슈(Roche) 제조)로, Cellular RNA Large Volume Kit(로슈(Roche) 제조, 5467535)를 이용하여 RNA를 추출했다. 추출한 RNA 농도를 미량 흡광광도계 Dropsense96(트리니안(Trinean) 제조)로 측정하고, 200-1000 ng 상당의 RNA를 Transcriptor(로슈(Roche) 제조, 4897030)를 이용하여 역전사를 했다. 반응액 조성, 반응 조건은 첨부 문서에 따랐다. 얻어진 cDNA 샘플을 dH2O로 10배 희석하여, qPCR의 주형으로서 이용했다. qPCR 반응에는 TaqMan Gene Expression Master Mix(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 제조, 4369542), TaqMan Gene Expression Assays(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 제조, 4331182)를 이용했다. PCR 반응의 조건은 TaqMan Gene Expression 첨부의 사용설명서에 따랐다. 검체의 mRNA량은, 생리식염수 투여군에 있어서의, CKAP5의 mRNA량을 1로 했을 때의 상대적인 비율로서 산출했다.
도 1에, 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 각 제제에 관해서, 각각 siRNA 10 mg/kg 투여 후 48시간 후의 종양 중 CKAP5 mRNA량을 나타낸다. 종축은 생리식염수 처치군을 1로 한 CKAP5 mRNA량의 상대치를 나타낸다.
도 1로부터 분명한 것과 같이, 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 제제는, 각각 인비보로 약효 평가 시험한 결과는, 매우 강하게 CKAP5 유전자의 발현을 억제하고, 인비보에서의 작용이 예상 밖으로 강하여, 어느 것이나 인비보의 약물 송달을 위한 지질 나노 입자로서 유용하다고 하는, 당업자가 예상하지 못한 효과를 갖는 것이 분명해졌다. 특히, 종양에 인비보의 약물 송달을 위한 지질 나노 입자로서 유용하다고 하는, 보다 예상할 수 없는 효과를 갖는 것이 분명해졌다.
또한, 도 1로부터 분명한 것과 같이, 실시예 1에서 얻어진 제제(화합물 1, 화합물 117 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자)는, 인비보로 종양의 세포 내에 약물 송달하는 것을 쉽게 하는 화합물 1에, 화합물 117이 혼합되어, 화합물 1의 사용량이 감소하고 있음에도 불구하고, 비교예 1에서 얻어진 제제(화합물 1 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자)와 비교하여, 인비보로 약효 평가 시험한 결과는, 같은 정도로 매우 강하게 CKAP5 유전자의 발현을 억제하고, 항종양 작용이 강하다.
따라서, 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자는, 화합물(I)의 사용량이 감소하고 있음에도 불구하고, 화합물(I)의 인비보로 종양의 세포 내에 약물 송달하는 것을 쉽게 하는 작용을 감약하지 않는다고 하는 예상 밖의 작용을 갖는 것이 분명해졌다. 또한, 인비보로 종양의 세포 내에 약물 송달하는 것을 쉽게 하는 작용을 감약하지 않고서, 화합물(I)의 사용량이 줄이게 함으로써, 화합물(I)에 기인하는 독성 작용은 감소할 수 있기 때문에, 인비보의 약물 송달을 위한 지질 나노 입자로서 보다 유용하다고 하는, 당업자가 예상하지 못한 효과를 갖는 것이 분명해졌다.
시험예 2
실시예 1에서 얻어진 제제(화합물 1, 화합물 117 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자)를, 이하의 방법에 의해 종양 증식 평가 시험을 실시했다.
시험예 1과 같은 식으로 하여, 췌장암 유래 세포주인 MIA PaCa-2를 SCID 마우스에게 이식한 제노그라프트 모델을 이용하여 실시했다. 종양 체적을 지표로 1군 6마리가 되도록 그룹을 나누고(Day0), Day0 및 Day7에 실시예 1에서 얻어진 제제를 10 mg/kg(10 mL/kg)로 정맥내 투여했다. 생리식염수는 10 mL/kg으로서 투여했다. 각 개체의 종양 직경을, Day0부터 Day14까지 측정하고, 이하의 식을 이용하여 종양 체적, 체적비를 산출했다.
(수학식 1)
종양 체적(㎣)=장경(mm)×단경(mm)×단경(mm)×0.5
(수학식 2)
체적비(V/V0)=각 시점의 종양 체적(㎣)÷Day0의 종양 체적(㎣)
도 2에, 0일째 및 7일째에 10 mg/kg 투여했을 때의 종양 체적의 추이를 나타낸다. 종축은 0일째를 1로 한 종양 체적의 상대치를 나타낸다. 횡축은 실험 시작 후의 경과 일수를 나타낸다.
도 2로부터 분명한 것과 같이, 실시예 1에서 얻어진 제제(CKAP5 유전자의 발현을 억제하는 CKAP5 siRNA와, 화합물 1 및 화합물 117을 함유하는 지질 나노 입자)를, 인비보로 약효 평가 시험한 결과는, 항종양 작용이 강했다.
따라서, 본 발명의 지질 나노 입자는, 핵산을 세포 내 등에 도입할 수 있어, 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자는, 인비보로 세포 내에 양호하게 약물 송달하는, 우수한 지질 나노 입자임이 분명하게 되었다.
비교예 2
참고예 1에서 얻어진 화합물 1을 이용하여 다음과 같이 제제를 제조했다. 이용한 핵산은, 시판되는 Eg5 유전자의 발현을 억제하는 Eg5 siRNA(인비트로젠사 제조, 카탈로그 번호 HSS105842)이며, 센스쇄에 5'-CCCAUCAACACUGGUAAGAACUGAA-3'의 염기 서열을 포함하고, 안티센스쇄에 5'-UUCAGUUCUUACCAGUGUUGAUGGG-3'의 염기 서열을 포함한다. 인비트로젠사로부터, 어닐링이 끝난 동결 건조 siRNA를 입수하여, 증류수로 용해시킴으로써 24 mg/mL로 조제했다(이하 Eg5 siRNA 용액이라고 함).
화합물 1/1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)나트륨염(PEG-DMPE Na, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜2000)-1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민=나트륨염, 니치유사 제조)=57.26/5.521 mmol/L가 되도록 염산 및 에탄올을 함유하는 수용액에 현탁시키고, vortex 교반 믹서로 교반, 및 가온을 반복하여 균일한 현탁액을 얻었다. 이 현탁액을 실온 하에서 0.2 ㎛의 폴리카보네이트 멤브레인 필터 및 0.05 ㎛의 폴리카보네이트 멤브레인 필터에 통과시켜, 리드 입자의 분산액을 얻었다. Dynamic light scattering(DLS)로 얻어진 리드 입자의 평균 입자경을 측정하여, 30 nm부터 100 nm의 범위 내임을 확인했다. 얻어진 리드 입자의 분산액에, Eg5siRNA 용액을, 3:1의 비율로 혼합하고, 또한 3배량의 증류수를 가하여 혼합함으로써 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을 조제했다.
한편, 화합물 1/1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)나트륨염(PEG-DSPE Na, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민=나트륨염, 니치유사 제조)/디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 90 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막 구성 성분의 용액을 조제했다.
얻어진 지질막 구성 성분의 용액을 가온한 후, 얻어진 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을, 1:1의 비율로 혼합하고, 또한 수배량의 증류수를 혼합하여, 조제제를 얻었다.
얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축하고, 또한 생리식염수로 치환하고, 0.2 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 또한 얻어진 제제의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 1.0 mg/mL가 되도록 생리식염수를 이용하여 희석했다. 이 제제 중의 지질 나노 입자의 평균 입자경은 80.3 nm였다.
실시예 2
참고예 1에서 얻어진 화합물 1과 참고예 11에서 얻어진 화합물 117을 이용하여, 다음과 같이 제제를 제조했다.
비교예 2와 같은 식으로 하여 Eg5 siRNA 및 리드 입자로부터 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을 조제했다.
한편, 화합물 1/화합물 117/1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)나트륨염(PEG-DSPE Na, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민=나트륨염, 니치유사 제조)/디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=2.982/5.965/2.943/5.707/11.83 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 90 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막 구성 성분의 용액을 조제했다.
얻어진 지질막 구성 성분의 용액을 가온한 후, 얻어진 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을, 1:1의 비율로 혼합하고, 또한 수배량의 증류수를 혼합하여, 조제제를 얻었다.
얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축하고, 또한 생리식염수로 치환하고, 0.2 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 또한 얻어진 제제의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 1.0 mg/mL가 되도록 생리식염수를 이용하여 희석했다. 이 제제 중의 지질 나노 입자의 평균 입자경은 80.5 nm였다.
실시예 3
참고예 1에서 얻어진 화합물 1과 참고예 11에서 얻어진 화합물 117을 이용하여, 다음과 같이 제제를 제조했다.
비교예 2와 같은 식으로 하여 Eg5 siRNA 및 리드 입자로부터 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을 조제했다.
한편, 화합물 117/1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)나트륨염(PEG-DSPE Na, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민=나트륨염, 니치유사 제조)/디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 90 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막 구성 성분의 용액을 조제했다.
얻어진 지질막 구성 성분의 용액을 가온한 후, 얻어진 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을, 1:1의 비율로 혼합하고, 또한 수배량의 증류수를 혼합하여, 조제제를 얻었다.
얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축하고, 또한 생리식염수로 치환하고, 0.2 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 또한 얻어진 제제의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 1.0 mg/mL가 되도록 생리식염수를 이용하여 희석했다. 이 제제 중의 지질 나노 입자의 평균 입자경은 79.6 nm였다.
실시예 4
참고예 1에서 얻어진 화합물 1과 참고예 12에서 얻어진 화합물 116을 이용하여, 다음과 같이 제제를 제조했다.
비교예 2와 같은 식으로 하여 Eg5 siRNA 및 리드 입자로부터, 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을 조제했다.
한편, 화합물 116/1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)나트륨염(PEG-DSPE Na, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민=나트륨염, 니치유사 제조)/디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 90 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막 구성 성분의 용액을 조제했다.
얻어진 지질막 구성 성분의 용액을 가온한 후, 얻어진 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을, 1:1의 비율로 혼합하고, 또한 수배량의 증류수를 혼합하여, 조제제를 얻었다.
얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축하고, 또한 생리식염수로 치환하고, 0.2 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 또한 얻어진 제제의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 1.0 mg/mL가 되도록 생리식염수를 이용하여 희석했다. 이 제제 중의 지질 나노 입자의 평균 입자경은 77.6 nm였다.
실시예 5
참고예 1에서 얻어진 화합물 1과 참고예 13에서 얻어진 화합물 118을 이용하여, 다음과 같이 제제를 제조했다.
비교예 2와 같은 식으로 하여 Eg5 siRNA 및 리드 입자로부터 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을 조제했다.
한편, 화합물 118/1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)나트륨염(PEG-DSPE Na, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민=나트륨염, 니치유사 제조)/디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 90 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막 구성 성분의 용액을 조제했다.
얻어진 지질막 구성 성분의 용액을 가온한 후, 얻어진 양이온성 지질/핵산 복합체 입자의 분산액을, 1:1의 비율로 혼합하고, 또한 수배량의 증류수를 혼합하여, 조제제를 얻었다.
얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축하고, 또한 생리식염수로 치환하고, 0.2 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 또한 얻어진 제제의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 1.0 mg/mL가 되도록 생리식염수를 이용하여 희석했다. 이 제제 중의 지질 나노 입자의 평균 입자경은 81.6 nm였다.
시험예 3
실시예 2∼5에서 얻어진 제제(화합물 1 및 화합물 117, 116 또는 118 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자) 및 비교예 2에서 얻어진 제제(화합물 1 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자)를, 각각 이하의 방법에 의해 인비보 mRNA 넉다운 평가 시험을 실시했다.
시험예 1과 같은 식으로 하여, 췌장암 유래 세포주인 MIA PaCa-2를 SCID 마우스에게 이식한 제노그라프트 모델을 이용하여 실시했다. 이식 6일 후, 종양 체적을 지표로 1군 3마리로 그룹을 나누고, 실시예 2∼5 및 비교예 1에서 얻어진 제제를 10 mg/kg(10 mL/kg)로 마우스에게 정맥내 투여했다. 음성 대조로서 생리식염수를 사용하여, 10 mL/kg로 투여했다. 투여 전 및 투여 48시간 후에 마우스의 체중을 측정했다. 체중 측정 후에 마우스를 안락사시켜, 피하 종양을 적출했다. 적출한 종양은 즉시 액체 질소로 동결하여, 사용할 때까지 -80℃로 보존했다.
얻어진 종양 샘플에 관해서, 샘플이 들어간 2 mL 둥근 바닥 tube에 1 mL의 Trizol reagent(인비트로젠(Invitrogen) 제조, 15596-018) 및 5 mm의 지르코니아 비드를 첨가하고, Tissue lyser II(키아겐(QIAGEN) 제조)로 1/25 freq, 1.5 min x 2회의 조건으로 파쇄했다. 파쇄 후 원심(10000 rpm, 10 min)하여 상청을 회수하고, 200 μL의 클로로포름을 첨가하여 격하게 교반한 후 다시 원심(15000 rpm, 15 min)했다. 얻어진 상청 200 μL로부터 자동 핵산 추출기 MagNA PURE 96(로슈(Roche)제조)로, Cellular RNA Large Volume Kit(로슈(Roche) 제조, 5467535)를 이용하여 RNA를 추출했다. 추출한 RNA 농도를 미량 흡광광도계 Dropsense 96(트리니안(Trinean) 제조)으로 측정하고, 200-1000 ng 상당의 RNA를 Transcriptor(로슈(Roche) 제조, 4897030)를 이용하여 역전사를 했다. 반응액 조성, 반응 조건은 첨부 문서에 따랐다. 얻어진 cDNA 샘플을 dH2O로 10배 희석하여, qPCR의 주형으로서 이용했다. qPCR 반응에는 TaqMan Gene Expression Master Mix(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 제조, 4369542), TaqMan Gene Expression Assays(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 제조, 4331182)를 이용했다. PCR 반응의 조건은 TaqMan Gene Expression 첨부의 사용설명서에 따랐다. 검체의 mRNA량은, 생리식염수 투여군에 있어서의, Eg5의 mRNA량을 1로 했을 때의 상대적인 비율로서 산출했다.
도 3에, 실시예 2∼5 및 비교예 2에서 얻어진 각 제제에 관해서, 각각 siRNA 10 mg/kg 투여 후 48시간 후의 종양 중 Eg5 mRNA량을 나타낸다. 종축은 생리식염수 처치군을 1로 한 Eg5 mRNA량의 상대치를 나타낸다.
도 3으로부터 분명한 것과 같이, 실시예 2∼5 및 비교예 1에서 얻어진 제제는, 각각 인비보로 약효 평가 시험한 결과는, 매우 강하게 Eg5 유전자의 발현을 억제하고, 인비보에서의 작용이 예상 밖으로 강하여, 어느 것이나 인비보의 약물 송달을 위한 지질 나노 입자로서 유용하다고 하는, 당업자가 예상하지 못한 효과를 갖는 것이 분명해졌다. 특히, 종양에 인비보의 약물 송달을 위한 지질 나노 입자로서 유용하다고 하는, 보다 예상할 수 없는 효과를 갖는 것이 분명해졌다.
또한, 도 3으로부터 분명한 것과 같이, 실시예 2∼5에서 얻어진 제제(화합물 1과, 화합물 117, 116 또는 118 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자)는, 인비보로 종양의 세포 내에 약물 송달하는 것을 쉽게 하는 화합물 1에, 화합물 117, 116 또는 118이 혼합되어, 화합물 1의 사용량이 감소하고 있음에도 불구하고, 비교예 1에서 얻어진 제제(화합물 1 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자)와 비교하여, 인비보로 약효 평가 시험한 결과는, 같은 정도로 매우 강하게 Eg5 유전자의 발현을 억제하여, 항종양 작용이 강하다.
따라서, 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자는, 화합물(I)의 사용량이 감소하고 있음에도 불구하고, 화합물(I)의 인비보로 종양의 세포 내에 약물 송달하는 것을 쉽게 하는 작용을 감약하지 않는다고 하는 예상 밖의 작용을 갖는 것이 분명해졌다. 또한, 인비보로 종양의 세포 내에 약물 송달하는 것을 쉽게 하는 작용을 감약하지 않고서, 화합물(I)의 사용량을 줄일 수 있어서, 화합물(I)에 기인하는 독성 작용은 감소할 수 있기 때문에, 인비보의 약물 송달을 위한 지질 나노 입자로서 보다 유용하다고 하는, 당업자가 예상하지 못한 효과를 갖는 것이 분명해졌다.
시험예 4
실시예 2에서 얻어진 제제(화합물 1, 화합물 117 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자)를, 이하의 방법에 의해 종양 증식 평가 시험을 실시했다.
시험예 1과 같은 식으로 하여, 췌장암 유래 세포주인 MIA PaCa-2를 SCID 마우스에게 이식한 제노그라프트 모델을 이용하여 실시했다. 종양 체적을 지표로 일군 5마리가 되도록 그룹을 나눠(Day0), 실시예 2에서 얻어진 제제를 10 mg/kg(10 mL/kg)로 정맥내 투여했다. 생리식염수는 10 mL/kg으로서 투여했다. 각 개체의 종양 직경을, Day0부터 Day15까지 측정하여, 시험예 2와 마찬가지로 종양 체적, 체적비를 산출했다.
도 4에, 0일째에 10 mg/kg 투여했을 때의 종양 체적의 추이를 나타낸다. 종축은 0일째를 1로 한 종양 체적의 상대치를 나타낸다. 횡축은 실험 시작 후의 경과 일수를 나타낸다.
도 4로부터 분명한 것과 같이, 실시예 2에서 얻어진 제제(Eg5 유전자의 발현을 억제하는 Eg5 siRNA와, 화합물 1 및 화합물 117을 함유하는 지질 나노 입자)를, 인비보로 약효 평가 시험한 결과는, 항종양 작용이 강했다.
따라서, 본 발명의 지질 나노 입자는, 핵산을 세포 내 등에 도입할 수 있어, 화합물(I) 및 화합물(II)을 함유하는 지질 나노 입자는, 인비보로 세포 내에 양호하게 약물 송달하는, 우수한 지질 나노 입자임이 분명하게 되었다.
본 발명의 신규의 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 지질 나노 입자를, 포유류 등에 투여함으로써, 상기 핵산을 예컨대 세포 내 등에 용이하게 도입할 수 있다.
서열 번호 1-siRNA 센스쇄
서열 번호 2-siRNA 안티센스쇄
서열 번호 2-5'-인산화아데노신(5'-phosphorylated Adenosine)
서열 번호 3-siRNA 센스쇄
서열 번호 4-siRNA 안티센스쇄
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> Lipid nano particles comprising Combination of Cationic Lipid <130> 1001P12212 <150> US61569405 <151> 2011-12-12 <150> US61670847 <151> 2012-07-12 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> um <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> am <400> 1 ggaagcuggc gauuaugcag auuua 25 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphorylated Adenosine <400> 2 uaaaucugca uaaucgccag cuucc 25 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense <400> 3 ccaucaaca cugguaagaa cugaa 25 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense <400> 4 uucaguucuu accaguguug auggg 25

Claims (34)

  1. 식(I)
    Figure pct00025

    (식에서, R1 및 R2는 동일하거나 또는 다르며 탄소수 10∼24의 직쇄상 또는 분지상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
    X1 및 X2는, 수소 원자이거나, 또는 함께 단결합 혹은 알킬렌을 형성하고,
    X3은 존재하지 않거나, 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐이고,
    X3이 존재하지 않는 경우에는,
    Y1도 존재하지 않고, L1은 단결합이며, R3은 수소 원자, 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이거나, 혹은
    Y1도 존재하지 않고, L1은 -CO- 또는 -CO-O-이며, R3은 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일, 모르폴린-3-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 또는 모르폴리닐이고,
    X3이 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐인 경우에는,
    Y1은 제약상 허용할 수 있는 음이온이고, L1은 단결합이며, R3은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이다)으로 표시되는 양이온성 지질 및 식(II)
    Figure pct00026

    (식에서, R4 및 R5는, 동일하거나 혹은 다르며 탄소수 12∼24의 직쇄상 혹은 분지상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이거나, 또는 R4 및 R5가 함께 디알킬메틸렌, 디알케닐메틸렌, 디알키닐메틸렌 혹은 알킬알케닐메틸렌을 형성하고,
    X4 및 X5는 수소 원자이거나, 또는 함께 단결합 혹은 알킬렌을 형성하고,
    X6은 존재하지 않거나, 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐이고,
    X6이 존재하지 않는 경우에는,
    Y2도 존재하지 않고, a 및 b는 0이고, L4는 단결합이며, R6은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, L2 및 L3은 -O-이거나,
    Y2도 존재하지 않고, a 및 b는, 동일하거나 또는 다르며 0∼3이면서, a와 b가 동시에 0은 아니고, L4는 단결합이며, R6은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이거나,
    Y2도 존재하지 않고, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 0∼3이고, L4는 단결합이며, R6은 수소 원자이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이거나, 혹은
    Y2도 존재하지 않고, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 0∼3이고, L4는 -CO- 또는 -CO-O-이며, R6은 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 모르폴린-2-일, 모르폴린-3-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 또는 모르폴리닐이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이고,
    X6이 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐인 경우에는,
    Y2는 제약상 허용할 수 있는 음이온이고, a 및 b는 동일하거나 또는 다르며 0∼3이고, L4는 단결합이며, R6은 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 3∼6의 알케닐, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, L2 및 L3은 동일하거나 또는 다르며 -O-, -CO-O- 또는 -O-CO-이다)으로 표시되는 양이온성 지질을 함유하는 지질 나노 입자.
  2. 제1항에 있어서, R1 및 R2가, 도데실, 테트라데실, (Z)-도데카-7-에닐, (Z)-테트라데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-4-에닐, (Z)-헥사데카-7-에닐, (E)-헥사데카-7-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디에닐, (7Z,10Z,13Z)-헥사데카-7,10,13-트리에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 지질 나노 입자.
  3. 제1항에 있어서, R1 및 R2가, 동시에 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐 또는 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐인 지질 나노 입자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L1이 단결합이고, R3이 수소 원자, 메틸, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 지질 나노 입자.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L1이 -CO- 또는 -CO-O-이고, R3이 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐인 지질 나노 입자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X1 및 X2가, 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하는 지질 나노 입자.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X1 및 X2가, 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하고, R3이 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 지질 나노 입자.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X1 및 X2가 수소 원자이고, R3이 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 지질 나노 입자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 존재하지 않는 지질 나노 입자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, L2 및 L3이 -O- 또는 -O-CO-이고, R4 및 R5가, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, 이코실, 도코실, 테트라코실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리에닐 또는 3,7,11,15-테트라메틸헥사데카-2-에닐인 지질 나노 입자.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, L2 및 L3이 -CO-O-이고, R4 및 R5가 트리데실, 펜타데실, 헵타데실, 노나데실, 헤니코실, 트리코실, (Z)-트리데카-8-에닐, (Z)-펜타데카-8-에닐, (Z)-헵타데카-5-에닐, (Z)-헵타데카-8-에닐, (E)-헵타데카-8-에닐, (Z)-헵타데카-10-에닐, (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디에닐, (8Z,11Z,14Z)-옥타데카-8,11,14-트리에닐, (Z)-노나데카-10-에닐, (10Z,13Z)-노나데카-10,13-디에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 2,6,10-트리메틸운데카-1,5,9-트리에닐 또는 2,6,10,14-테트라메틸펜타데카-1-에닐인 지질 나노 입자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, L4가 단결합이고, R6이 수소 원자, 메틸, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 지질 나노 입자.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, L4가 -CO- 또는 -CO-O-이고, R6이 피롤리딘-3-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐이고, 상기 치환기의 적어도 하나는, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모니오, 피롤리디닐, 피페리딜 혹은 모르폴리닐인 지질 나노 입자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, X4 및 X5가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하는 지질 나노 입자.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, X4 및 X5가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하고, R6이 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 지질 나노 입자.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, X4 및 X5가 수소 원자이고, R6이 수소 원자, 메틸, 또는 동일하거나 혹은 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 혹은 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 혹은 탄소수 3∼6의 알케닐인 지질 나노 입자.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, X4 및 X5가 함께 단결합 또는 알킬렌을 형성하고, R6이 동일하거나 또는 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 또는 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐인 지질 나노 입자.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, X4 및 X5가 수소 원자이고, R6이 동일하거나 또는 다르며 1∼3개인 아미노, 히드록시 또는 카르바모일로 치환된 탄소수 1∼6의 알킬 또는 탄소수 3∼6의 알케닐인 지질 나노 입자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, X6이 존재하지 않거나, 메틸인 지질 나노 입자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 약물로서 핵산을 함유하는 지질 나노 입자.
  21. 제20항에 있어서, 양이온성 지질이, 상기 핵산과 복합체를 형성하고 있거나, 또는 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 상기 핵산과의 복합체를 형성하고 있는 지질 나노 입자.
  22. 제20항에 있어서, 양이온성 지질이, 상기 핵산과 복합체를 형성하고 있거나, 또는 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 상기 핵산과의 복합체를 형성하고 있고, 상기 복합체 및 상기 복합체를 봉입하는 지질막으로 구성된 지질 나노 입자.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산인 지질 나노 입자.
  24. 제23항에 있어서, 표적 유전자가 종양 또는 염증에 관련된 유전자인 지질 나노 입자.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재한 지질 나노 입자를 이용하여 상기 핵산을 세포 내에 도입하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 세포가 포유류의 종양 또는 염증 부위에 있는 세포인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 세포가 포유류의 간장, 폐, 신장 또는 비장에 있는 세포인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 세포 내에 도입하는 방법이 정맥내 투여에 의해서 세포 내에 도입하는 방법인 방법.
  29. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재한 지질 나노 입자를 포유동물에게 투여하는 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
  30. 제29항에 있어서, 투여하는 방법이 정맥내 투여인 방법.
  31. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재한 지질 나노 입자를 포함하는, 질환의 치료에 이용하기 위한 의약.
  32. 제31항에 있어서, 정맥내 투여용인 의약.
  33. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재한 지질 나노 입자를 포함하는, 암 또는 염증 질환의 치료에 이용하기 위한 암 또는 염증 질환의 치료제.
  34. 제33항에 있어서, 정맥내 투여용인 암 또는 염증 질환의 치료제.
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