MX2013014894A - Formulaciones liofilizadas del factor de crecimiento de fibroblastos 18. - Google Patents
Formulaciones liofilizadas del factor de crecimiento de fibroblastos 18.Info
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Abstract
La invención se refiere al campo de las formulaciones farmacéuticas; más en particular, se refiere a formulaciones liofilizadas de compuesto de factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF-18) y a métodos de producción de tales formulaciones; las formulaciones liofilizadas de acuerdo con la invención son estables después del almacenamiento durante un período apropiado; se pueden usar, después de reconstituir, para el tratamiento de trastornos de los cartílagos tales como osteoartritis o lesión de los cartílagos.
Description
FORMULACIONES LIOFILIZADAS DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE
FIBROBLASTOS 18
CAMPO DE LA INVENCIÓ
La invención se refiere al campo de formulaciones farmacéuticas. Más en particular, se refiere a formulaciones liofilizadas de la proteína del factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF-18) y a métodos de producción de tales formulaciones. Las formulaciones liofilizadas de acuerdo con la invención son estables después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período apropiado.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF-18) es un miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) de proteínas, íntimamente relacionado con FGF-8 y FGF-17. Los miembros de la familia de FGF se caracterizan por dominios de unión con heparina. Este dominio putativo de unión con heparina se identificó para FGF-18. Se postula que la señalización mediada por receptores se inicia después de la unión del ligando de FGF complejizado con proteoglicanos de sulfato de heparina en la superficie celular.
Se mostró que FGF-18 es un agente proliferativo para
condrocitos y osteoblastos (Ellsworth et ai, 2002, Osteoartritis and Cartilage, 10: 308-320; Shimoaka et al., 2002, J. Bio. Chem. 277(9):7493-7500). Se propuso FGF-18 para el tratamiento de trastorno de cartílagos tales como osteoartritis y lesión de cartílagos ya sea solo (documento WO 2008/023063) o en combinación con ácido hialurónico (documento WO 2004/032849).
Las composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido de FGF se conocen del arte. El documento WO 00/21548 revela composiciones farmacéuticas que comprenden un FGF recombinante en combinación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de portadores o diluyentes apropiados para soluciones inyectables incluyen agua o soluciones fisiológicas isotónicas.
El documento WO 2008/121563 está relacionado con formulaciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de FGF-21 preparado en una forma inyectable en unidad de dosis junto con un portador farmacéuticamente aceptable. El portador apropiado puede ser, entre otros, un azúcar, un tampón y/o un agente tensoactivo.
El documento WO 92/01442 revela una composición liofilizada que comprende un FGF, un agente a granel farmacéuticamente aceptable y i) una sal de metal alcalino de celulosa o ii) una combinación de éster de ácido graso de polioxietilensorbitano con cisteína. Los componentes de i) y ii) permiten estabilizar la composición de FGF.
El documento WO 01/39788 describe composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de FGF-18 junto con una
citotoxina, en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución fisiológica tamponada con fosfato.
El documento WO 2008/023063 revela formulaciones que comprenden un compuesto de FGF-18 junto con al menos un portador farmacéuticamente aceptable, excipientes o similares. Como un ejemplo, revela una formulación para inyección que comprende FGF-18 en vehículos tales como solución fisiológica, solución de dextrosa, albúmina sérica y solución de Ringer.
Cuando se prepara una composición farmacéutica que comprende una proteína bioactiva, dicha composición debe ser formulada de tal modo que la actividad de la proteína se mantenga durante un período apropiado. Una pérdida de actividad / estabilidad de la proteína puede resultar de inestabilidades químicas o físicas de la proteína notablemente debidas a desnaturalización, agregación u oxidación. Los productos resultantes pueden ser así farmacéuticamente inaceptables. A pesar de que se conoce el uso de excipientes para incrementar la estabilidad de una proteína dada, los efectos estabilizantes de estos excipientes son muy dependientes de la naturaleza de los excipientes y de la proteína bioactiva en sí.
Aún hay una necesidad de otras formulaciones que contengan FGF-18 como un ingrediente activo, en donde dichas formulaciones sean estables para un período apropiado y apropiadas para usar en inyección, con preferencia inyección intraarticular. Dichas formulaciones podrían ser de utilidad para la administración en el tratamiento de un trastorno de cartílagos
en un paciente, tales como osteoartritis o lesión de cartílagos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Es un objeto de la presente invención proporcionar una nueva formulación que contiene una proteína de FGF-18. Más en particular, dicha formulación es una formulación liofilizada estable que contiene FGF-18. La invención también proporciona métodos para preparar la formulación liofilizada de acuerdo con la presente invención. La formulación liofilizada aquí descrita puede ser de utilidad, después de reconstituirla, para la administración en el tratamiento de trastornos de los cartílagos.
En un primer aspecto, la invención proporciona una formulación liofilizada estable que comprende o que consiste en FGF-18, un tampón, un agente tensoactivo de poloxámero y un azúcar como agente estabilizante. En una forma de realización preferida, el tampón es un tampón de fosfato, el agente tensoactivo de poloxámero es poloxámero 188 y el agente estabilizante es sacarosa. En otra forma de realización preferida, el tampón mantiene el pH en o aproximadamente de 6 a 8 y más en particular, en o aproximadamente a 7.2. En otra forma de realización de preferencia, la concentración del agente tensoactivo de poloxámero es de o de aproximadamente 0.1 a 0.4 mg/frasco. Con preferencia, FGF-18 está seleccionado del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o que consiste en la forma madura de FGF-18 humano, correspondiente a la
secuencia que comprende o que consiste en el residuo 28(Glu) al residuo 207(Ala) de SEQ ID NO: 1 , 2) un polipéptido que comprende o que consiste en una forma truncada de FGF-18 humano que comprende o que consiste en el residuo 28 (Glu) al residuo 196 (Lis) de SEQ ID NO: 1 y 3) un polipéptido que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 2. Con mayor preferencia, FGF-18 es trFGF-18, tal como se define en la presente más adelante.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un método de fabricación de una formulación liofilizada estable de FGF-18, que comprende las etapas de:
1) formar una mezcla de FGF-18, junto con un tampón, un agente tensoactivo y un agente estabilizante y
2) someter la mezcla a liofilización,
en donde el tampón es un tampón de fosfato, el agente estabilizante es un azúcar, tales como sacarosa y el agente tensoactivo es un agente tensoactivo de poloxámero, como poloxámero 188. En una forma de realización preferida, el tampón mantiene el pH a o de aproximadamente 6 a 8 y más en particular, a o a aproximadamente 7.2. Con preferencia, FGF-18 está seleccionado del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o que consiste en la forma madura de FGF-18 humano, que corresponde a la secuencia que comprende o que consiste en el residuo 28(Glu) al residuo 207(Ala) de SEQ ID NO: 1 , 2) un polipéptido que comprende o que consiste en una forma truncada de FGF-18 humano que comprende o que consiste en el residuo 28 (Glu) al residuo 196 (Lys) de SEQ ID NO: 1 y 3) un polipéptido
que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 2. Con mayor preferencia, FGF-18 es trFGF-18, tal como se define en la presente más adelante.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un artículo de manufactura para uso farmacéutico o veterinario, que comprende:
1) un primer recipiente que comprende una formulación liofilizada estable, donde dicha formulación liofilizada comprende FGF-18, un tampón, un agente tensoactivo y un agente estabilizante, y
2) un segundo recipiente que comprende un solvente para reconstitución,
en donde el tampón es un tampón de fosfato, el agente estabilizante es un azúcar, tales como sacarosa, el agente tensoactivo es un agente tensoactivo de poloxámero, como poloxámero 188 y el solvente para reconstitución es agua o una solución fisiológica (por ejemplo, 0.9% p/v de cloruro de sodio para inyección). Con preferencia, FGF-18 está seleccionado del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o que consiste en la forma madura de FGF-18 humano, correspondiente a la secuencia que comprende o que consiste en el residuo 28(Glu) al residuo 207(Ala) de SEQ ID NO: 1 , 2) un polipéptido que comprende o que consiste en una forma truncada de FGF-18 humano que comprende o que consiste en el residuo 28 (Glu) al residuo 196 (Lys) de SEQ ID NO: 1 y 3) un polipéptido que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 2. Con mayor preferencia, FGF-18 es trFGF-18, tal como se define en la presente más adelante.
Definiciones
- La expresión "proteína de FGF-18" o "FGF-18", tal como se usa en la presente, pretende ser una proteína que mantiene al menos una actividad biológica de la proteína de FGF-18 humana. FGF-18 puede ser nativo, en su forma madura o una forma truncada de él. Las actividades biológicas de la proteína de FGF-18 humana incluyen notablemente el aumento de la actividad osteoblástica (ver el documento WO 98/16644) o en la formación de cartílagos (ver el documento WO 2008/023063).
El FGF-18 humano nativo o de tipo salvaje es una proteína expresada por condrocitos de cartílago articular. FGF-18 humano se designó primero zFGF-5 y se describe por completo en el documento WO 98/16644. SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia de aminoácidos del FGF-18 humano nativo, donde un péptido señal consiste en residuos de aminoácidos 1 (Met) a 27(Ala). La forma madura de FGF-18 humano corresponda a la secuencia de aminoácidos del residuo 28(Glu) al residuo 207(Ala) de SEQ ID NO: 1 (180 aminoácidos). FGF-18 tiene una especificidad por FGFR4 y las variantes de empalme "Ule" de FGFR3 y FGFR2 (Ellsworth et al., 2002, Osteoartritis and Cartilage, 10: 308-320). La forma madura de FGF-18 tiene una masa promedio de 21.04 kDa.
FGF-18, en la presente invención, se puede producir por medio de un método recombinante, tal como se enseña en la solicitud WO 2006/063362. Según los sistemas de expresión y condiciones, FGF-18 en la presente invención se expresa en una célula huésped recombinante con una
Metionina inicial (residuo de Met) o con una secuencia señal para secreción. Cuando se expresa en un huésped procariota, como en E. coli, FGF-18 contiene un residuo Met adicional en N-terminal de su secuencia. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido de FGF-18 humano, cuando se expresa en E. coli, comienza con un residuo Met en N-term (posición 1) seguido de los residuos 28 (Glu) al residuo 207 (Ala) de SEQ ID NO: 1.
- La expresión "forma truncada" de FGF-18, tal como se usa en la presente, se refiere a una proteína que comprende o consiste en los residuos 28(Glu) a 196(Lys) de SEQ ID NO: 1. Con preferencia, la forma truncada de la proteína de FGF-18 es el polipéptido designado "trFGF-18" (170 aminoácidos), que comienza con un residuo Met (en N-terminal) seguido por los residuos de aminoácidos 28 (Glu) -196 (Lys) del FGF-18 humano de tipo salvaje. La secuencia de aminoácidos de trFGF-18 se muestra en SEQ ID NO: 2 (residuos de aminoácido 2 a 170 de SEQ ID NO: 2 corresponden a los residuos de aminoácido 28 a 196 de SEQ ID NO: 1). trFGF-18 es una forma truncada recombinante de FGF-18 humano, producida en E. coli (ver el documento WO 2006/063362). Se mostró que trFGF-18 muestra actividades similares que el FGF-18 humano maduro, por ejemplo, aumenta la proliferación de condrocitos y deposición de cartílagos que lleva a la reparación y la reconstrucción para una variedad de tejidos cartilaginosos (ver el documento WO 2008/023063). trFGF-18 tiene una masa promedio de 19.83 kDa.
- El término "estabilidad", tal como se usa en la presente, se
refiere a la estabilidad física, química y conformacional de FGF-18 en las formulaciones de acuerdo con la presente invención (incluso el mantenimiento de la potencia biológica). La inestabilidad de una formulación proteica puede ser causada por degradación química o agregación de las moléculas de proteína para formar polímeros de orden superior, deglicosilación, modificación de glicosilación, oxidación o cualquier otra modificación estructural que reduce al menos una actividad biológica de una proteína de FGF-18 de la presente invención.
- El término solución o formulación "estable", tal como se usa en la presente, es una solución o formulación, en donde el grado de degradación, modificación, agregación, pérdida de actividad biológica y similares, de proteínas se controla de modo aceptable y no aumenta inaceptablemente con el tiempo. Con preferencia, la formulación retiene al menos más del 80% de la actividad de FGF-18 durante un período de al menos 12 meses a temperatura ambiente. La formulación estabilizada de la presente invención que comprende FGF-18 tiene preferentemente una vida en almacenamiento de al menos aproximadamente 12 meses, 18 meses, con mayor preferencia, de al menos 20 meses, con mayor preferencia aún, de aproximadamente 24 meses, cuando se almacenó a temperatura ambiente. Los métodos para controlar la estabilidad de la formulación de FGF-18 de la presente invención son disponibles en el arte e incluyen los métodos descritos en los ejemplos revelados en la presente.
- El término "tampón", tal como se usa en la presente, se refiere
a soluciones de compuestos que se sabe que son seguros en formulaciones para uso farmacéutico o veterinario y que tienen el efecto de mantener o controlar el pH de la formulación en el intervalo de pH deseado para la formulación. Los tampones aceptables para controlar el pH con un pH moderadamente ácido a un pH moderadamente básico incluyen, pero sin limitación, tampones de fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS e histidina. "TRIS" se refiere a 2-amino-2-hidroximetil-1 ,3-propanodiol y a cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables. De acuerdo con la presente invención, los tampones preferibles son tampones de fosfato.
- El término "agente tensoactivo", tal como se usa en la presente, se refiere a un compuesto soluble que se puede usar notablemente para incrementar la solubilidad en agua de sustancias oleosas hidrofóbicas o incrementar de otro modo la miscibilidad de dos sustancias con diferentes hidrofobicidades. Por esta razón, estos polímeros se usan comúnmente en aplicaciones industriales, cosméticas y farmacéuticas. También se usan como sistemas de modelo para aplicaciones de suministro de fármaco, notablemente a fin de modificar la absorción del fármaco o su suministro a tejidos objeto. Los agentes tensoactivos bien conocidos incluyen polisorbatos (derivados de polioxietileno; Tween) así como poloxámeros (es decir, copolímeros en base a óxido de etileno y óxido de propileno, también conocidos como Pluronics®). De acuerdo con la invención, el agente tensoactivo preferido es un agente tensoactivo de poloxámero e incluso con mayor preferencia, es poloxámero 188 (Pluronic® F68).
- La expresión "agente estabilizante", "estabilizante" o "agente de isotonicidad", tal como se usa en la presente, es un compuesto que es fisiológicamente tolerado e imparte una estabilidad/tonicidad apropiadas a una formulación. Evita notablemente el flujo neto de agua a través de las membranas celulares que están en contacto con la formulación. Durante el proceso de liofilización, el estabilizante también es efectivo como un crioprotector. Los compuestos tales como glicerina se usan comúnmente para tales propósitos. Otros agentes estabilizantes apropiados incluyen, pero sin limitación, aminoácidos o proteínas (por ejemplo, glicina o albúmina), sales (por ejemplo, cloruro de sodio) y azúcares (por ejemplo, dextrosa, manitol, sacarosa y lactosa). De acuerdo con la presente invención, el agente estabilizante preferido es un azúcar, even con mayor preferencia, sacarosa.
- El término "frasco" o "recipiente", tal como se usa en la presente, se refiere ampliamente a un depósito apropiado para retener la formulación de FGF-18 en forma liofilizada. De modo similar, retendrá el solvente para reconstitución. Los ejemplos de un frasco que se puede usar en la presente invención incluyen jeringas, ampollas, cartuchos u otro de tales depósitos apropiados para suministrar la formulación de FGF-18 al paciente por medio de inyección, con preferencia por medio de inyección intraarticular. De modo alternativo, el frasco que retiene la formulación de FGF-18 y el otro que retiene el solvente para reconstitución se pueden presentar como los 2 compartimientos de un sistema de cámara dual (jeringa o cartucho, por ejemplo). Los frascos apropiados para productos envasados para
administración intrarticular son bien conocidos y reconocidos en el arte.
- El término "solvente", tal como se usa en la presente, se refiere a un solvente líquido ya sea acuoso o no acuoso. La selección del solvente depende notablemente de la solubilidad del compuesto farmacológico en dicho solvente y del modo de administración. El solvente acuoso puede consistir únicamente de agua o puede consistir de agua más uno o varios solventes miscibles y puede contener solutos disueltos tales como azúcares, tampones, sales u otros excipientes. Los solventes no acuosos más comúnmente usados son los alcoholes orgánicos de cadena corta tales como metanol, etanol, propanol, cetonas de cadena corta, tales como acetona y polialcoholes, como glicerol. De acuerdo con la presente invención, el solvente preferido es un solvente acuoso tales como agua o un solvente salino.
- La expresión "trastorno de los cartílagos", tal como se usa en la presente, comprende trastornos que resultan de daños debidos a lesión traumática o condropatía. Los ejemplos de trastornos de los cartílagos que se pueden tratar por medio de la administración de la formulación de FGF-18 descrita en la presente incluyen, pero sin limitación, artritis, tales como osteoartritis o artritis reumatoidea y lesión de los cartílagos.
- El término "osteoartritis" se usa para indicar la forma más común de artritis. Puede estar causada por la rotura del cartílago. Muchos cartílagos se pueden romper y causar dolor e hinchazón en las articulaciones entre los huesos. Con el paso del tiempo, el cartílago se puede desgastar por completo y los huesos se rozan entre sí. La osteoartritis puede afectar
cualquier articulación, pero usualmente afecta a manos y articulaciones que soportan peso tales como caderas, rodillas, pies y espina. En un ejemplo preferido, la osteoartritis puede ser osteoartritis de rodilla u osteoartritis de cadera. El experto es plenamente consciente de las clasificaciones de la osteoartritis que se usan en la técnica, en particular el sistema de evaluación OARSI (ver, por ejemplo, Custers et al., 2007). La osteoartritis es uno de los trastornos de los cartílagos preferidos que se puede tratar por administración de las formulaciones de FGF-18 de acuerdo con la presente invención.
- La expresión "lesión del cartílago" tal como se usa en la presente es un trastorno de los cartílagos o un daño de los cartílagos que resulta notablemente de un trauma. Las lesiones de los cartílagos pueden producirse como resultado de destrucción mecánica traumática, notablemente después de un accidente o cirugía. También se considera dentro de esta definición la lesión relacionada con el deporte o el desgaste de tejidos de la articulación relacionado con el deporte.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El objeto principal de la presente invención es una formulación liofilizada estable que comprende o que consiste en una proteína de FGF-18, un tampón, un agente tensoactivo de poloxámero y un azúcar como agente estabilizante. En una forma de realización preferida, el tampón es un tampón de fosfato, el agente tensoactivo de poloxámero es poloxámero 188 y el
agente estabilizante es sacarosa. Con preferencia, la proteína de FGF-18 está seleccionada del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o que consiste en la forma madura de FGF-18 humano, correspondiente a la secuencia que comprende o que consiste en el residuo 28(Glu) al residuo 207(Ala) de SEQ ID NO: 1 , 2) un polipéptido que comprende o que consiste en una forma truncada de FGF-18 humano que comprende o que consiste en el residuo 28 (Glu) al residuo 196 (Lys) de SEQ ID NO: 1 y 3) un polipéptido que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 2. Con mayor preferencia, FGF-18 es trFGF-18.
La concentración de FGF-18 en la presente invención es con preferencia de o de aproximadamente 20 a 300 mcg/frasco, con preferencia de o de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ó 300 mcg/frasco, con mayor preferencia aún, de o de aproximadamente 20, 30, 60, 100, 200 ó 300 mcg/frasco. Se puede añadir FGF-18 en exceso del 5%, a fin de evitar pérdidas de proteína que podrían producirse durante la formulación. Por ejemplo, para una concentración de FGF-18 de 30 mcg/frasco, el compuesto se puede añadir en una cantidad de 31.5 mcg/frasco.
Con preferencia, las formulaciones de la invención retienen al menos el 80% de la actividad biológica de FGF-18 al momento de la liofilización y/o envasado durante un período de al menos 12 meses (antes del primer uso). La actividad de FGF-18 se puede medir tal como se describió en la siguiente sección de "Ejemplos".
Los tampones preferibles de acuerdo con la presente invención son tampones de fosfato y mantienen el pH comprendido entre 6 y 8, con preferencia, comprendido entre 7 y 7.5, y con mayor preferencia, de o de aproximadamente 7.2.
La concentración del tampón en solución total es con preferencia de o de aproximadamente 5 a 500 mM. En una forma de realización preferida, la concentración del tampón es de o de aproximadamente 10 a 100 mM. Con preferencia, la concentración del tampón es de o de aproximadamente 10 mM.
El agente estabilizante en la presente invención es preferentemente un azúcar. El azúcar preferido es sacarosa. Con preferencia, la concentración del agente estabilizante es de o de aproximadamente 0.5 a 250 mg/frasco, con mayor preferencia, de o de aproximadamente 1 a 100 mg/frasco, más en particular, de o de aproximadamente 15 a 60 mg/frasco, con máxima preferencia aún, de o de aproximadamente 30 mg/frasco.
El agente tensoactivo de acuerdo con la presente invención es preferentemente un agente tensoactivo de poloxámero y en particular es poloxámero 188 (es decir, Pluronic® F68). Con preferencia, la concentración de agente tensoactivo es de o de aproximadamente 0.01 a 10 mg/frasco, con mayor preferencia, de o de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 5 mg/frasco, más en particular, de o de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 mg/frasco, con máxima preferencia aún, de o de aproximadamente 0.1 , 0.2 o 0.4 mg/frasco y en particular de o de aproximadamente 0.2 mg/frasco.
En una forma de realización preferida, la formulación liofilizada estable en la presente invención comprende o consiste en FGF-18 de o de aproximadamente 20, 30, 60, 100, 200 o 300 mcg/frasco, 10 mM del tampón de fosfato a pH 7.2, 30 mg/f rasco de sacarosa y 0.2 mg/f rasco de poloxámero 188. Cuando se incluye un exceso del 5%, la formulación liofilizada de acuerdo con la presente invención comprende FGF-18 de o de aproximadamente 21, 31.5, 63, 105, 210 ó 315 mcg/frasco.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a una formulación liofilizada estable que comprende:
1) FGF-18:sacarosa en una relación de concentración de o de aproximadamente 1 :95000 a o aproximadamente a 1 :6000, con preferencia de o de aproximadamente 1 :92000, 1 :61000, 1:31000, 1:18450, 1 :9200 o 1 :6100,
2) FGF-18: poloxámero 188 en una relación de concentración de o de aproximadamente o 1 :25 a o aproximadamente a 6:10, con preferencia de o de aproximadamente 1 :25, 5:83, 5:42, 1 :5, 2:5 o 6:10.
3) FGF-18:tampón de fosfato a pH 7.2 en una relación molar de o de aproximadamente o 1:10500 a o aproximadamente a 1:700, con preferencia de o de aproximadamente 1 :10500, 1 :7000, 1:3500, 1 :2100, 1 :1050 o 1 :700,
en donde la proteína de FGF-18 está seleccionada, con preferencia, del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o que consiste en los residuos de aminoácido 28(Glu)-207(Ala) de SEQ ID NO: 1 , 2) un polipéptido que comprende o que consiste en los residuos de aminoácido 28(Glu)-
196(Lys) de SEQ ID NO: 1 o 3) un polipéptido que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 2. Con mayor preferencia, la proteína de FGF-18 comprende o consiste en los residuos de aminoácido 28(Glu)-207(Ala) de SEQ ID NO: 1.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a una formulación liofilizada estable que comprende:
1) FGF-18:sacarosa en una relación molar de o de aproximadamente 1 :90000 a o aproximadamente a 1 :5000, con preferencia de o de aproximadamente 1 :87000, 1 :58000, 1 :29000, 1 :17400, 1 :8700 o 1 :5800,
2) FGF-18:poloxámero 188 en una relación molar de o de aproximadamente o 5:120 a o aproximadamente a 5:8, con preferencia de o de aproximadamente 5:118, 5:79, 10:79, 10:47, 5:12 o 5:8,
3) FGF-18:tampón de fosfato a pH 7.2 en una relación molar de o de aproximadamente o 1 :10000 a o aproximadamente a 1 :700, con preferencia de o de aproximadamente 1 :10000, 1 :6600, 1 :3300, 1 :2000, 1 :1000 o 1 :700,
en donde la proteína de FGF-18 está seleccionada con preferencia del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o que consiste en los residuos de aminoácido 28(Glu)-207(Ala) de SEQ ID NO: 1 , 2) un polipéptido que comprende o que consiste en los residuos de aminoácido 28(Glu)-196(Lis) de SEQ ID NO: 1 o 3) un polipéptido que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 2. Con mayor preferencia, la proteína de FGF-18 comprende o consiste en los residuos de aminoácido 28(Glu)-196(Lis) de SEQ ID NO: 1. Más particularmente aún, la proteína de FGF-18 comprende o consiste en
SEQ ID NO: 2. En una forma de realización particular, la proteína de FGF-18 es trFGF- 8.
La invención también proporciona un método de fabricación de cualquiera de las formulaciones liofilizadas estables de FGF-18 antes mencionadas, en donde el método comprende las etapas de:
1) formar una mezcla de FGF-18 junto con un tampón, un agente tensoactivo de poloxámero y un azúcar como un agente estabilizante y
2) someter la mezcla a liofilización.
Las etapas 1 y 2 se llevan a cabo usando procedimientos convencionales. Como un ejemplo, a fin de preparar una formulación estable apropiada, una cantidad dada de FGF-18, tales como trFGF-18, se mezcla con tampón de fosfato que mantiene el pH de o de aproximadamente 7.2, poloxámero 188 y sacarosa. Cada uno de estos compuestos (es decir, FGF-18, el tampón, el agente tensoactivo y el agente estabilizante) se pueden usar de acuerdo con las concentraciones, el pH y/o las relaciones antes descritas. La mezcla resultante se liofiliza y luego se dispensa en frascos. Las variaciones de este proceso serán reconocidas por un experto en el arte.
La invención también proporciona un artículo de manufactura, para uso farmacéutico o veterinario, que comprende:
1) un primer recipiente que comprende cualquiera de las formulaciones liofilizadas estables antes descritas, donde dicha formulación comprende o consiste en FGF-18, un tampón, un agente tensoactivo de poloxámero, un azúcar como un agente estabilizante y
2) un segundo recipiente que comprende un solvente para reconstitución.
Como un ejemplo, el primer recipiente comprende una formulación liofilizada estable que comprende o que consiste en una cantidad dada de FGF-18, como trFGF-18, tampón de fosfato que mantiene el pH de o de aproximadamente 7.2, poloxámero 188 y sacarosa y el segundo recipiente comprende solución fisiológica salina (0.9% p/v de cloruro de sodio para inyección). Cada uno de estos compuestos (es decir, FGF-18, el tampón, el agente tensoactivo y el agente estabilizante) se pueden usar de acuerdo con las concentraciones, el pH y/o las relaciones antes descritas. Con preferencia, el recipiente que retiene la formulación de FGF-18 y el que retiene el solvente para reconstitución corresponden a los dos compartimientos de un sistema de cámara dual (jeringa o cartucho, por ejemplo).
También se describe un material de empaque que proveen instrucciones para reconstituir la formulación liofilizada de FGF-18 (primer recipiente) en el solvente (segundo recipiente).
Las formulaciones liofilizadas de la invención se pueden mantener durante al menos aproximadamente 12 meses a aproximadamente 24 meses. En condiciones preferidas de almacenamiento, antes del primer uso, las formulaciones se mantienen alejadas de la luz fuerte (con preferencia en la oscuridad), a temperatura ambiente (de o de aproximadamente 25 °C).
La formulación liofilizada estable de la invención necesita ser reconstituida, con preferencia en condición de esterilidad, con un solvente
como agua o una solución fisiológica (por ejemplo, 0.9% p/v de cloruro de sodio para inyección) antes de usar, es decir, antes de la inyección. Después de reconstituir, el volumen por inyectar es, con preferencia, de 0.5 ml_ a 5 ml_, con mayor preferencia, de 0.5, 1 ó 2 ml_. La formulación de FGF-18 se debe administrar con preferencia dentro de la hora de reconstitución.
La presente invención proporciona formulaciones liofilizadas estables de FGF-18, en particular para uso único, apropiadas para uso farmacéutico o veterinario.
La formulación liofilizada estable que comprende FGF-18, en la presente invención, se puede usar, después de reconstituir, para administración para mejorar la reparación de los cartílagos o para el tratamiento de trastornos de los cartílagos, tales como osteoartritis o lesiones de los cartílagos.
Estas formulaciones liofilizadas estables, después de reconstituir, son apropiadas para usar en inyecciones y sistemas de suministro alternativos. En una forma de realización de particular preferencia, las formulaciones de la invención son para inyección intraarticular. Se pueden administrar, después de reconstituir, por inyección directa en el líquido sinofrasco de la articulación o directamente en el defecto. En una forma de realización preferida de la presente invención, la administración intraarticular se realiza en una articulación seleccionada de la artiaculación de la cadera, rodilla, codo, muñeca, tobillo, espina, pie, dedo, dedo del pie, mano, hombro, costillas, omóplatos, muslos, pantorrillas, talones y a lo largo de puntos óseos
de la espina. En otra forma de realización preferida, la administración intraarticular se realiza en la articulación de la cadera o la rodilla.
Las formulaciones de FGF-18 de la presente invención tienen una estabilidad mejorada y se pueden almacenar fácilmente a temperatura ambiente (de o de aproximadamente 25 °C) o a 2-8 °C (ver los siguientes ejemplos), con preferencia a temperatura ambiente. De hecho, los inventores hallaron que las formulaciones liofilizadas que comprenden FGF-18 (por ejemplo, trFGF-18), 10 mM de tampón de fosfato a pH 7.2, 30 mg/frasco de sacarosa y 0.2 mg/frasco de poloxámero 188 son estables en el transcurso del tiempo, notablemente cuando se almacenan a temperatura ambiente. Dichas formulaciones minimizan la pérdida del principio activo, es decir, FGF-18. También se halló que dichas formulaciones son más resistentes a la oxidación y a la formación de agregados de proteína.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la preparación de las formulaciones y las composiciones de la invención. El alcance de la invención no se ha de construir como consistente meramente de los siguientes ejemplos.
DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA
La figura 1 muestra el efecto del agente tensoactivo (poloxámero 188) sobre la recuperación de FGF-18 antes del proceso de liofilización. Se usaron preformulaciones que contienen 10 mg/ml (+ 5% promedio) de FGF-18
en tampón de fosfato pH 7.2, mientras que se varía la concentración de agente tensoactivo (del 0 al 0.2%). El contenido de proteína se evaluó para cada una de las preformulaciones antes de la filtración (BF) y después de la filtración (T=0).
Descripción de las secuencias:
SEQ ID NO.1 : secuencia de aminoácidos del FGF-18 humano nativo. SEQ ID NO.2: secuencia de aminoácidos del FGF-18 truncado recombinante (trFGF-18).
EJEMPLOS
Material
El FGF-18 truncado recombinante (trFGF-18) de los presentes ejemplos se preparó por expresión en E. coli, de acuerdo con la técnica descrita en la solicitud WO 2006/063362. En los siguientes ejemplos, trFGF-18 y FGF-18 se usan indistintamente.
Otras sustancias usadas en los ejemplos son las siguientes:
Sacarosa (1.07653, Merck; peso molecular: 342.30 g/Mol) - Dihidrógeno-fosfato de sodio monohidrato (1.06345, Merck)
Hidrógeno-fosfato disódico dihidrato (1.06586, Merck) Poloxámero 188 (Lutrol F 68 DAC, USP/NF, Basf; peso molecular: 8400 g/Mol)
Agua para inyección,
Solución fisiológica salina (0.9% p/v de cloruro de sodio para inyección)
Anticuerpo monoclonal anti-FGF-18 clon #F5A2, para el contenido de proteína (provisto por RBM)
Células BAF3-FGFR3c (Universidad de Washington)
RosweII Park Memorial Institute (RPMI) 1640 a base de medio selectivo (Invitrogen).
Sistema de ensayo de luminiscencia ATPIite en 1 etapa (Perkin Elmer)
Heparina H3149 (Sigma)
Equipo
- AMICON ULTRA-4 10.000 corte (UFC 8012024, Amicon) Biacore 2000 (Biacore)
Incubadora de CO2 (Heraeus)
Columna TSK2000SWxl, 7.8 x 300 mm, 5 µ (TosoHaas, código 08540)
Columna de guarda TSKG2000 (Hichrom, código 8543) Sistemas de HPLC (Waters)
Luminómetro (Perkin Elmer)
Filtros de membrana 0.22 µ?t? (Durapore de tipo GWVP,
Millipore)
Software Stabileo (ver. 1.1 ; paquete de Microsoft® Excel
Visual Basic®)
Software GraphPad (Prism)
Soportes de acero inoxidable de 22 mL y 220 mL de capacidad (Sartorius)
Zorbax 300SB-C18 (150X4.6cm) columna
Frascos de vidrio DIN2R (3 mi) (Nuova OMPI)
Topes de goma recubiertos (S2F452, D777-1 , B2-40, West
Pharmaceutical)
- Topes de goma (código 1779, W1816 gris, Pharma-Gummi)
Métodos
Diferentes ensayos en las formulaciones
Se usaron métodos estándar para:
- SE-HPLC,
- RP-HPLC,
Humedad residual,
- pH,
- Osmolaridad (tiempo 0, sólo),
- SDS-PAGE/SS y
Mapeo de péptidos UPLC (formas oxidadas).
Contenido de proteínas
La cuantificación de la proteína, es decir, trFGF-18, en las diferentes formulaciones se realizaron por medio de Biacore. Las muestras (25 pL) que contenían trFGF-18 se ensayaron (apropiadamente diluidas en presencia de 10 mg/mL de BSA) por flujo, a 5 pLJmin a 25 °C, sobre la superficie del sensor, previamente recubiertas con el anticuerpo monoclonal anti-FGF-18 clon F5A2, seguido de 5 pL de 10 mM de glicina pH 2.0 como tampón de regeneración. El estándar de referencia (IRS FGF-18 N.° 051230), que va de 125 hasta 2.000 ng/mL, se corrió en cada sesión analítica. Los resultados se recolectaron como unidad de resonancia (RU) y el nivel de FGF-18 de cada muestra se extrapoló de la curva estándar ajustada usando algoritmo cuadrático con datos Log transformados.
Bioensavo
La actividad biológica de FGF-18 se mide como actividad de proliferación por medio de un bioensayo in vitro usando línea celular BaF3 establemente transfectada con el receptor 3c FGF (FGFR3c). Las células BaF3 que expresan FGFR3c proliferan bajo estímulos de FGF-18.
Las células BaF3/FGFR3c se cultivan en RPMI 1640 a base de medio selectivo en presencia de r-hlL-3 como factor de crecimiento. A fin de ensayar específicamente el efecto proliferativo de FGF-18, las células requieren ser deprivadas de IL-3. Por ello, las células se cultivan a 37 °C, 5% de CO2 en ausencia de r-hlL-3 durante 26 horas antes del ensayo.
El estándar y las muestras se diluyen 5 veces de forma serial en medio de ensayo en el intervalo de concentración de 0.002 U/mL hasta 177.5 U/mL Las células BAF3/FGFR3c deprivadas de IL-3 (20.000 células/cavidad) se incuban a 37 °C, 5% de C02 con FGF-18 en presencia de 1 pg/mL de heparina y 10% de suero fetal de ternero y luego se evalúa la proliferación celular después de 48 horas por el ensayo de luminiscencia "ATPIite en 1 etapa", un sistema de control de ATP en base a luciferasa de luciérnaga.
La potencia de la muestra se mide aplicando el modelo de curva extendido de dosis-respuesta. Con este modelo, toda la curva de dosis-respuesta del estándar y las muestras se ajustan por medio de la curva sigmoidal de dosis-respuesta con algoritmo de bucle variable (4PL) que informa los valores de cps (es decir, recuentos por segundo) versus log de concentraciones de FGF-18. Para cada curva, se calcula automáticamente la EC50 por medio del software GraphPad. La potencia de las muestras se calcula sobre la base de la relación entre la EC50 de la preparación de referencia y la de la muestra desconocida (relación de potencia). La potencia de FGF-18 se expresa como U/mL.
EJEMPLO 1
Formulaciones liofilizadas de trFGF-18
La composición de las formulaciones liofilizadas de FGF-18 se proporciona en la siguiente Tabla 1.
TABLA 1
Composición para las formulaciones liofilizadas de FGF-18 (*)
(*) después de reconstitución con 1 ml_ de WFI (agua para inyección).
Las formulaciones liofilizadas se prepararon de la siguiente manera: sacarosa y Poloxámero 188 se disolvieron en el tampón de fosfato. A continuación, se añadió la cantidad necesaria de sustancia farmacológica (trFGF-18), se controló el pH y la solución se tomó hasta el volumen final. La solución luego se filtró a través de una membrana de 0.22 pm (Durapore®) bajo presión de nitrógeno, manteniendo una relación de filtración de aproximadamente 20 cc/cm2 o de aproximadamente 50 cc/cm2.
La solución final luego se envasó de forma manual, en condiciones de esterilidad en frascos de vidrio (0.5 mL/frasco) y se liofilizaron
de acuerdo con el siguiente ciclo:
Las formulaciones liofilizadas están listas para ser reconstituidas en cualquier momento, con un solvente, tales como agua para inyección o una solución fisiológica salina.
EJEMPLO 2
Estudios preliminares de la estabilidad de las formulaciones de FGF-18
Ejemplo 2.1: se usaron condiciones de estabilidad aceleradas (a
2-8 °C, 25 °C y 40 °C) a fin de identificar preformulaciones liofilizadas para luego estudiarlas (datos no mostrados).
Se prepararon diversas formulaciones liofilizadas preliminares, a fin de identificar las mejores formulaciones candidatas. En el marco de este estudio preliminar, se ensayaron diversos tampones, incluyendo los tampones de fosfato e histidina. También se ensayaron diversas concentraciones de sacarosa y poloxámero 188. Las preformulaciones candidatas se usaron para pureza (por SE-HPLC y RP-HPLC), contenido de proteína (por Biacore),
actividad biológica (bioensayo in vitro), humedad residual, pH y osmolaridad. Los datos de soporte de la estabilidad también se generaron por SDS-PAGE/SS (pureza) y por mapeo de péptidos/UPLC (formas oxidadas).
Ejemplo 2.2 (datos de estabilidad para las formulaciones preliminares; datos no mostrados): Los datos de estabilidad recolectados para las formulaciones liofilizadas preliminares por SE-HPLC durante 3-4 semanas de almacenamiento indican que se ha de preferir el tampón de fosfato a pH 7.2, dado que el nivel de pureza mucho mayor (es decir, mayor % de monómero) se observaron en comparación con tampón de histidina a pH 6 (ver la tabla 2). La cantidad de sacarosa (15 mcg/frasco vs 30 mcg/frasco) desempeña también un papel en estabilización de FGF-18 versus agregación, donde se observaron recuperaciones de monómeros globalmente mayores con 30 mcg/frasco de sacarosa (almacenamiento a 25 °C y 5 °C). Además, se observó una mayor recuperación de proteína después de la etapa de filtración (antes del proceso de liofilización) al aumentar el agente tensoactivo (es decir, el poloxámero 188), con mejores resultados a 0.2 mg/frasco (figura 1).
En base a los resultados de esta fase de preformulación, se prepararon seis formulaciones liofilizadas para posteriores investigaciones (formulaciones 1-6 de la Tabla 1 ; también mencionadas como formulaciones candidatas).
EJEMPLO 3
Estudios de estabilidad de formulaciones liofil izadas de FGF-18
Se recopilaron datos de dos semanas a 24 meses estabilidad sobre las formulaciones liofilizadas candidatas de la Tabla 1.
Ejemplo 3.1 (pureza por SE-HPLC): Los resultados para la evaluación estadística realizados por Stabileo en lo datos de estabilidad generados por SE-HPLC se resumen en la Tabla 3: no se detectó una pérdida significativa de la pureza (contenido de monómero) para cualquier formulación candidata liofilizada después del almacenamiento a diferentes temperaturas (hasta 6 meses a 40 °C y hasta 24 meses a 25 °C).
Ejemplo 3.2 (pureza por SDS-PAGE/SS): Los resultados por SDS-PAGE confirmaron niveles de pureza globalmente superiores al 99% para cualquier formulación liofilizada después del almacenamiento para todas las temperaturas testeadas (al menos 6 meses a 40 °C y hasta 18 meses a 25 °C). Los resultados se proporcionan en la Tabla 4.
Ejemplo 3.3 (pureza por RP-HPLC): Los resultados para la evaluación estadística realizada por Stabileo sobre los datos de estabilidad generados por RP-HPLC se resumen en la Tabla 5: no se detectó una pérdida significativa de pureza (% de pico principal) para cualquier formulación candidata liofilizada después del almacenamiento a diferentes temperaturas (hasta 6 meses a 40 °C y hasta 18 meses a 25 °C). En consecuencia, la formulación de FGF-18 de acuerdo con la presente invención no da como
resultado una pérdida de pureza en comparación con el material de partida (puro) FGF-18. Se observa que el material de partida (antes de la formulación) no era completamente puro (las impurezas no se resolvieron por completo por RP-HPLC), el pico antes de la formulación no estaba al 100%, pero por ejemplo al 77.5% para FD-30 y al 87.4% para FD-300 y el pico a T=0 estaba, por ejemplo, al 76.8% para FD-30 y al 87.7% para FD-300.
Ejemplo 3.4 (ensayo del contenido de proteína): Los resultados de la concentración de proteína medidos con Bioacore se resumen en las Tablas 6 y 7. No se detectó una pérdida mayor después de la filtración a través de la membrana de 0.22 pm, es decir, se observó casi recuperación completa de proteína (ver la columna "AF" en la Tabla 6). Después de reconstituir el producto liofilizado con 1 ml_ de WFI (ver "T0" de la columna en la Tabla 6), se obtuvo una recuperación más lenta, que se puede explicar por adsorción de la proteína en el frasco de vidrio (después de reconstitución, la solución de proteína luego se expone a una superficie más grande).
Desde el punto de vista de la estabilidad, no se detectó una pérdida en el contenido de proteína por Biacore para todas las potencias a todas las temperaturas testeadas, tal como se muestra en la Tabla 7 (hasta 6 meses a 40 °C y hasta 24 meses a 25 °C).
Ejemplo 3.5 (actividad biológica): Los resultados de la actividad biológica (expresados en U/recipiente) para todos los candidatos liofilizados después del almacenamiento se proporcionan en la Tabla 8. Por ejemplo, la actividad biológica observada para la mayor potencia (300 mcg/frasco de
trFGF-18) después del almacenamiento, tanto a 25 °C y 40 °C, era estable con el tiempo. Se observó más variabilidad con la potencia más baja FD-20. Si bien no se detectó cambio en la estabilidad del producto por medio de las otras pruebas, esta reducción observada con FD-20 debió ser confirmada después de 39, 52, 78 y 104 semanas de almacenamiento a 25 °C.
Ejemplo 3.6 (formas oxidadas): El nivel de formas oxidadas detectadas para todas las potencias después del almacenamiento se resume en la Tabla 9: entre los residuos de Met que pudieron someterse a oxidación, los resultados indican que Met 1 es más susceptible a oxidación para todas las potencias y a cualquiera de las temperaturas evaluadas.
Ejemplo 3.7 (humedad residual): no se produjo ningún aumento significativo en la humedad residual ocurrida después del almacenamiento para todas las potencias; los valores de humedad residual por abajo o por arriba del 1% se midieron de forma global a lo largo del estudio de estabilidad (ver la Tabla 10) (hasta 6 meses a 40 °C y hasta 24 meses a 25 °C).
Ejemplo 3.8 (variación del pH): no se observó una variación significativa del pH después del almacenamiento a cualquiera de las temperaturas testeadas para todas las potencias (ver la Tabla 11) (hasta 6 meses a 40 °C y hasta 24 meses a 25 °C).
Ejemplo 3.9 (variación de la osmolaridad : no se observó una variación significativa de la osmolaridad después del almacenamiento a cualquiera de las temperaturas testeadas para todas las potencias (ver la Tabla 12) (hasta 6 meses a 40 °C y hasta 24 meses a 25 °C).
TABLA 2
Porcentaje (%) de monómeros de FGF-18 en preformulaciones liofilizadas (10 mcq/frasco de FGF-18 v 0..2 mq/frasco de F68) después de almacenamiento, analizado por SE-HPLC
TABLA 3
Porcentaje (%) de monómeros de FGF-18 en las formulaciones candidatas liofilizadas después del almacenamiento, analizado por SE
HPLC
TABLA 4
Pureza de las formulaciones candidatas liofilizadas de FGF-18 después del almacenamiento, analizado por SDS-Page fen %)
Tabla 5
Pureza de las formulaciones candídatas liofilizadas de FGF-18. después del almacenamiento, analizada por RP-HPLC
El pico antes de a formulación era del 87.4%
El pico antes de la formulación era del 77.5%
TABLA 6
Recuperación de FGF-18 después de filtración/envasado, analizada por
Biacore
BF = antes de filtrar; AF = después de filtrar; TO = en el frasco * Después de reconstituir con 1 mL de WFI, el lote original estaba en 0.5 mL
** % de recuperación; comparado con la cantidad de proteína de
FGF-18 en las formulaciones BF.
TABLA 7
Recuperación de FGF-18 después del almacenamiento, en base al ensayo por
Biacore (en las formulaciones candidatas llofilizadas)
TABLA 8
Actividad biológica de trFGF-18 en las formulaciones candidatos liofilizadas. después del almacenamiento, en bioensavos (U/recipiente)
TABLA 9
Formas oxidadas de FGF-18, en las formulaciones candidatas líofilizadas después del almacenamiento
(en %)
TABLA 10
Humedad residual en las formulaciones candidatas liofilizadas de FGF- 18. después del almacenamiento fen %)
TABLA 11
Valores de pH de las formulaciones candidatas liofiiizadas de FGF-18.
después del almacenamiento
TABLA 12
Osmolalidad de las formulaciones candidatas liofilizadas de FGF-18.
después del almacenamiento
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Claims (15)
1. Una formulación liofilizada estable que comprende FGF- 18, un tampón, un agente tensoactivo de poloxámero y un azúcar como agente estabilizante.
2. La formulación liofilizada estable de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el tampón es un tampón de fosfato y mantiene el pH comprendido entre 6 y 8.
3. La formulación liofilizada estable de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el tampón de fosfato mantiene el pH a o a aproximadamente 7.2.
4. La formulación liofilizada estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la concentración del tampón es de o de aproximadamente 5 a 100 mM.
5. La formulación liofilizada estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el agente tensoactivo de poloxámero es poloxámero 188.
6. La formulación liofilizada estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la concentración del agente tensoactivo de poloxámero es de o de aproximadamente 0.1 a 0.4 mg/frasco.
7. La formulación liofilizada estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el agente estabilizante es sacarosa.
8. La formulación liofilizada estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la concentración del agente estabilizante es de o de aproximadamente 10 a 60 mg/frasco.
9. La formulación liofilizada estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la concentración de FGF-18 es de o de aproximadamente 20 a 300 mcg/f rasco.
10. La formulación liofilizada estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la formulación comprende 20, 30, 60, 100, 200 ó 300 mcg/frasco de FGF-18, 10 mM de tampón de fosfato que mantienen el pH a o a aproximadamente 7.2, 30 mg/frasco de sacarosa y 0.2 mg/frasco de poloxámero 188.
1 1. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la formulación también comprende un exceso del 5% de FGF-18.
12. La formulación liofilizada estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque FGF-18 está seleccionado del grupo que consiste en: a. un polipéptido que comprende o que consiste en los residuos de aminoácido 28-207 de SEQ ID NO: 1 , b. un polipéptido que comprende o que consiste en los residuos de aminoácido 28-196 de SEQ ID NO: 1 , y c. un polipéptido que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 2.
13. Un método para producir la formulación liofilizada estable que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende las etapas de: a. formar una mezcla de FGF-18 junto con el tampón, el agente tensoactivo y el agente estabilizante y b. someter la mezcla a liofilización.
14. Un artículo de manufactura que comprende un primer recipiente que comprende la formulación liofilizada estable que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un segundo recipiente que comprende un solvente para reconstitución.
15. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el recipiente que comprende la formulación liofilizada estable y el que comprende un solvente para reconstitución son los dos compartimientos de un sistema de cámara dual.
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Legal Events
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