RS54875B1

RS54875B1 - Liofilizovane formulacije fgf-18

Info

Publication number: RS54875B1
Application number: RS20160453A
Authority: RS
Inventors: Alessandra Cerreti; Rio Alessandra Del
Original assignee: Ares Trading Sa
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2016-10-31
Also published as: EA201490032A1; MX2013014894A; CO6940377A2; EA024937B1; SI2720710T1; CN103619347A; KR102019520B1; CL2013003618A1; US20140121162A1; EP2720710B1; SG195021A1; US9326944B2; BR112013032400A2; CA2836667C; EP2720710A1; CY1117933T1; US20160228374A1; PE20141265A1; NZ617992A; BR112013032400B1

Abstract

Stabilna liofilizovana formulacija koja uključuje FGF-18, fosfatni pufer koji čini da vrednost pH ostane na između 7,0 i 7,5, poloksamer 188 i saharoza.Prijava sadrži još 11 patentnih zahteva.

Description

Polje tehnike

[0001]Ovaj pronalazak odnosi se na polje farmaceutskih formulacija. Konkretnije, odnosi se na liofilizovane formulacije proteina faktora rasta fibroblasta 18(FGF-18) i metode za proizvodnju takvih formulacija. Liofilizovane formulacije u skladu sa ovim pronalaskom su stabilne po čuvanju na sobnoj temperaturi tokom odgovarajućeg vremenskog perioda.

Stanje tehnike

[0002]Faktor rasta fibroblasta 18 (FGF-18) je član porodice proteina faktor rasta fibroblasta (FGF) koja je tesno povezana sa FGF-8 i FGF-17. Članovi porodice FGF odlikuju se domenima koji vezuju heparin. Takav putativni heparin-vezujući domen identifikovan je za FGF-18. Smatra se da signalizacija posredovana receptorima počinje pošto se veže FGF ligand u kompleksu sa cell-surface heparin sulfat proteoglikanima sa površine ćelije.

[0003] Pokazano je da je FGF-18 proliferativni agens za hondrocite i osteoblaste (Ellsworth et al., 2002, Osteoartritis and Hrskavice, 10; 308-320; Shimoaka et al., 2002, J. Bio. Chem. 277(9):7493-7500). FGF-18 se predlaže za terapiju poremećaja hrskavice kao što su osteoartritis i povreda hrskavice, bilo sam (W02008/023063) ili u kombinaciji sa hijaluronskom kiselinom (W02004/032849).

[0004]Farmaceutski sastavi koji uključuju FGF polipeptid poznati su u struci. VVOOO/21548 i 20 VV002/17956 otkrivaju farmaceutske sastave koji sadrže rekombinantni FGF u kombinaciji sa

farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem. U primere pogodnih nosača ili razblaživača ua injektabilne rastvore spadaju voda ili izotoni fiziološki rastvor.

[0005] VV02008/121563 je povezan za farmaceutske formulacije koje uključuju jedno jedinjenje FGF-21 pripremljeno u jedinici doziranja u injektabilnom obliku, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. U odgovarajuće nosače, između ostalih, spadaju šećer, pufer i/ili surfaktant.

[0006]VV092/01442 otkriva liofilizovani sastav koji uključuje FGF, farmaceutski prihvatljivo sredstvo za povećanje zapremine i bilo i) celuloznu so alkalnog metala ili ii) kombinaciju estra polioksietilen sorbitan masne kiseline sa cisteinom. Komponente i) i ii) omogućavaju da se stabilizuje sastav FGF.

[0007] VV001/39788 opisuje farmaceutski sastavi koji uključuje jedinjenje FGF-18 uz cito-toksin, u mešavini

s farmaceutski prihvatljivim nosačem, npr. fosfatom puferovani fiziološki rastvor.

[0008]VV02008/023063 otkriva formulacije koje uključuju jedno jedinjenje FGF-18 uz najmanje jedan farmaceutski prihvatljivi nosač, ekscipijens, ili slično. Kao primer, otkriva se formulacija za injekcije koja uključuje FGF-18 u nosačima kao što su fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.

[0009]Kada se priprema farmaceutski sastav koji uključuje bioaktivni protein, pomenuti sastav mora da bude formulisan na takav način da se aktivnost tog proteina održava tokom primerenog perioda vremena. Gubitak aktivnosti /stabilnosti tog proteina može da bude rezultat hemijske ili fizičke nestabilnosti proteina pre svega zbog denaturacije, agregacije ili oksidacije. Dobijeni proizvod tako može da bude farmaceutski neprihvatljiv, lako jen poznato da upotreba ekscipijenasa povećava stabilnost datog proteina, stabilizirajuća dejstva tih ekscipijenasa u mnogome zavise od prirode samih ekscipijenasa i samog bioaktivnog proteina. US2003/113316, VV02007/076354, VV02008/121563 40 i VV097/04801 otkrivaju opšta sredstva za stabilizaciju proteina.

[0010]Ostaje potreba za daljim formulacijama sa sadržajem FGF-18 kao aktivnog sastojka, naznačeno time da pomenute formulacije budu stabilne odgovarajući vremenski period i pogodne za upotrebu u injekcijama, po mogućstvu za intraartikularne injekcije. Pomenute formulacije bi mogle da budu korisne za primenu u terapiji poremećaja hrskavice kod pacijenata, u slučajevima kao što su osteoartritis ili povreda hrskavice.

Kratki prikaz pronalaska

[0011]Cilj ovog pronalaska je da se obezbedi nova formulacija sa sadržajem proteina FGF-18. Još konkretnije, pomenuta formulacija je stabilna liofilizovana (sušena smrzavanjem) formulacija sa sadržajem FGF-18. Ovaj pronalazak obezbeđuje metode za pripremu liofilizovane formulacije u skladu sa ovim pronalaskom. Liofilizovana formulacija koja je ovde opisana može da bude korisna, posle rekonstitucije, za primenu u terapiji poremećaja hrskavice.

[0012]U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje stabilnu liofilizovanu formulaciju koji uključuje ili koja se sastoji od FGF-18, pufera, a poloksamernog surfaktanta i šećera kao stabilizacionog agensa. Puferje fosfatni pufer, poloksamerni surfaktant is poloksamer 188, a stabilizacioni agens je saharoza. Pufer održava pH između 7.0 i 7.5, a još konkretnije tačno ili oko 7.2. U dodatnom preporučenom obliku, koncentracija poloksamernom surfaktanta je ili tačno ili oko 0.1 to 0.4 mg po bočici. Po mogućstvu, FGF-18 se odabire iz grupe koja se sastoji od: 1} jednog polipeptida koji uključuje ili se sastoji od zrele forme humanog FGF-18, što odgovara sekvenci koja uključuje ili se sastoji od rezidualne 28(Glu) do rezidualne 207(Ala) u SEQ ID NO: 1, 2) jednog polipeptida koji uključuje ili se sastoji od skraćene (truncated) forme humanog FGF-18 koji uključuje ili se sastoji od rezidualne 28 (Glu) do rezidualne 196 (Lys) u SEQ ID NO:1, i 3) jednog polipeptida koji uključuje ili se sastoji od SEQID NO:2. Najbolje je da FGF-18 budetrFGF-18, kako je to dole definisano.

[0013]U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje metod za proizvodnju stabilne liofilizovane formulacije FGF-18, koja uključuje sledeće korake:

1. Pravljenje mešavine FGF-18, zajedno sa puferom, surfaktantom i stabilizacionim agensom, i

2. Podvrgavanje ove mešavine liofilizaciji (sušenjem zamrzavanjem),

naznačeno time da pufer bude fosfatni pufer, stabilizacioni agens is saharoza, a surfaktant je poloksamer 188. U preporučenom obliku pufer održava pH na tačno ili oko 7,0 do 7,5, i još konkretnije na tačno ili oko 7,2. Po mogućstvu, FGF-18 se odabira iz grupe koja se sastoji od: 1) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od zrele forme humanog FGF-18, što odgovara sekvenci koja uključuje ili koja se sastoji od rezidualne 28(Glu) do rezidualne 207(Ala) u SEQ ID NO: 1, 2) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od skraćene forme humanog FGF-18 koji uključuje ili koji se sastoji od rezidualne 28 (Glu) do rezidualne 196 (Lys) u SEQ ID NO:1, i 3) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od SEQ ID NO:2. Još bolje, FGF-18 je trFGF-18, kao što je dole definisano.

[0014]U trećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje proizvodni artikal za farmaceutsku ili veterinarsku upotrebu, koji uključuje: 1) prvu posudu koja uključuje stabilnu liofilizovanu formulaciju, pri čemu pomenuta liofilizovana formulacija uključuje FGF-18, pufer, surfaktant i stabilizacioni agens, i

2) drugu posudu koja uključuje rastvarač za rekonstituisanje, naznačeno time da pufer bude fosfatni pufer, stabilizacioni agens je saharoza, surfaktant je poloksamer 188, a rastvarač za rekonstituisanje je voda ili fiziološki rastvor (npr. 0,9% težinsko-zapreminski natrijum hlorida za injekcije). Po mogućstvu, FGF-18 se odabira iz grupe se sastoji od: 1) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od zrele forme humanog FGF-18, što odgovara sekvenci koja uključuje ili koja se sastoji od rezidualne 28(Glu) do rezidualne 207(Ala) u SEQ ID NO: 1, 2} polipeptida koji uključuje ili se sastoji od skraćene forme humanog FGF-18 koji uključuje ili koji se sastoji od rezidualne 28 (Glu) do rezidualne 196 (Lys) u SEQ ID NO:1, i 3) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od SEQ ID NO:2. Još bolje, FGF-18 je trFGF-18, kao što je dole definisano.

Definicije

[0015]Izraz "FGF-18 protein" ili "FGF-18", kako se ovde koristi, treba da označi protein koji održava najmanje jednu biološku aktivnost humanog FGF-18 proteina. FGF-18 može da bude nativni, u svojoj zreloj formi, ili u svom skraćenom obliku. Biološke aktivnosti humanog FGF-18 proteina uključuju pre svega povećanje osteoblastne aktivnosti (videti VV098/16644) ili stvaranja hrskavice (videti VV02008/023063).

[0016]Nativni ili divlji tip humanog FGF-18 je protein koji eksprimiraju hondrociti zglobne hrskavice. Humani FGF- 18 je prvi put nazvan zFGF-5 i potpuno opisan u VV098/16644. SEQ ID NO:1 odgovara amino-kiselinskoj sekvenci nativnog humanog FGF-18, sa signalnim peptidom koji se sastoji od amino kiselinskog ostatka 1 (Met) do 27(Ala). Ova zrela forma humanog FGF-18 odgovara amino-kiselinskoj sekvenci od rezidualnog 28(Glu) do rezidualne 207(Ala) u SEQ ID NO: 1 (180 amino kiselina). FGF-18 je specifičan za FGFR4 i "lile" splajsovane varijante FGFR3 i FGFR2 (Ellsvvorth et al., 2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320). Ova zrela forma FGF-18 ima prosečnu masu od 21,04 kDa.

[0017]FGF-18, u sadašnjem pronalasku, može da se proizvede rekombinantnom metodom, koja se navodi u prijavi W02006/063362. Zavisno od sistema i stanja ekspresije, FGF-18 u ovom pronalasku se eksprimira u rekombinantnoj ćeliji domaćina sa početnim Metioninom (Met reziduum) ili sa signalnom sekvencom za sekreciju. Kada se eksprimira u prokariotskom domaćinu, kao što jeE. coli,FGF-18 sadrži dodatni Met ostatak na N-terminalnoj poziciji svoje sekvence. Na primer amino-kiselinska sekvenca humanog FGF-18, kada se eksprimira uE. coli,počinje sa Met ostatkom na N-term (pozicija 1) posle čega slede rezidualni 28 (Glu) do rezidualne 207 (Ala) SEQ ID NO: 1.

Izraz "skraćena forma" FGF-18, kako se ovde koristi, odnosi se na protein koji uključuje ili se sastoji od rezidualne 28{Glu) do 196(Lys) u SEQ ID NO: 1. Po mogućstvu, ova skraćena forma FGF-18 proteina je polipeptid označen kao "trFGF-18" (170 amino kiselina), koji počinje sa Met ostatkom (na N-terminalnom položaju) posle čega slede amino kiselinski ostaci (Glu) -196 (Lys) divljeg tipa humanog FGF-18. Ova amino-kiselinska sekvenca trFGF-18 prikazana je u SEG ID NO:2 (amino kiselinski ostaci od 2 do 170 u SEQ ID NO:2 odgovaraju amino-kiselinskim ostacima 28 do 196 u SEQ ID NO:1). trFGF- 18 je rekombinantni skraćeni oblik humanog FGF-18, proizveden uE. coli (videtiVV02006/063362). Pokazano je da trFGF-18 ispoljava slične aktivnosti kao i zreli humani FGF-18, npr. pojačava proliferaciju hondrocita i depozite hrskavice što dovodi po zalečenja i rekonstrukcije niza hrskavičastih tkiva (videti W02008/023063). trFGF-18 ima prosečnu masu od 19,83 kDa.

Izraz "stabilnost", kako se ovde koristi, odnosi se na fizičku, hemijsku, i konformacijsku stabilnost FGF-18 u formulacijama u skladu sa ovim pronalaskom (i uključujući održavanje biološke snage). Nestabilnost proteinske formulacije može da bude izazvana hemijskom razgradnjom ili agregacijom proteinskih molekula da formiraju polimere višeg reda, deglikozilacijom, modifikacijom glikozilacije, oksidacijom ili ma kojom drugom strukturnom modifikacijom koja smanjuje najmanje jednu biološku aktivnost proteina FGF-18 iz ovog pronalaska.

Izraz "stabilan" rastvor ili formulacija, kako se ovde koristi, je jedan rastvor ili formulacija naznačen time da da stepen razgradnje, modifikacije, agregacije ili gubitka biološke aktivnosti i slično, sadržanih proteina bude prihvatljivo kontrolisan, i da se tokom vremena ne povećava do neprihvatljive mere. Po mogućstvu, ova formulacija zadržava najmanje 80% aktivnosti FGF-18 tokom perioda od najmanje 12 meseci na sobnoj temperaturi. Stabilizovana formulacija ovog pronalaska koji uključuje FGF-18, po mogućstvu treba da ima rok trajanja od najmanje oko 12 meseci, 18 meseci, ili još bilje 20 meseci, odnosno još bolje od 24 meseci, kada se čuva na sobnoj temperaturi. Metode za praćenje stabilnosti FGF-18 formulacije ovog pronalaska poznate su u struci i uključuju metode opisane u primerima koji su dati u tekstu.

Izraz "pufer", kako se ovde koristi, odnosi se na rastvore jedinjenja za koja se zna da su bezbedne formulacije za farmaceutsku ili veterinarsku upotrebu, i da imaju dejstvo održavanja ili kontrole pH date formulacije u željenom rasponu pH za datu formulaciju. U prihvatljive pufere za kontrolu pH na umereno kiselom pH do umereno baznom pH spadaju, između ostalih, fosfatni, acetatni, citratni, argininski, TRIS, i histidinski puferi. "TRIS" se odnosi na 2-amino-2-hidroksimetil-1,3,-propanediol, i ma koju njegovu farmakološki prihvatljivu so. U skladu sa ovim pronalaskom, preporučeni puferi su fosfatni puferi.

Izraz "surfaktant", kako se ovde koristi, odnosi se na rastvorljivo jedinjenje koje može pre svega da poveća rastvorljivost hidrofobnih, uljastih supstanci u vodi ili da se na drugi način poveća mešljivost dve supstance različite hidrofobičnosti. Iz tog razloga, ovi polimeri se često koriste u industrijskim primenama, kozmetici, i farmaceutskim preparatima. Oni se koriste i kao modeli sistema za primene lekova, odnosno njihovo dopremanje na željeno mesto dejstva, pre svega da bi se izmenila apsorpcija leka ili njegovo dopremanje do ciljnih tkiva. U dobro poznate surfaktante spadaju polisorbati {derivati polioksietilena; Tween) kao i poloksameri( t. j.kopolimeri bazirani na etilen oksidu i propilen oksidu, poznat i pod imenom Pluronics®). U skladu sa ovim pronalaskom, preporučeni surfaktant je poloksamerni surfaktant, a još bolje da to bude baš poloksamer 188 (Pluronic® F68).

Izraz "stabilizacioni agens", "stabilizator" ili "agens izotoničnosti", kako se ovde koristi, je jedinjenje koje se fiziološki podnosi i obezbeđuje odgovarajuću stabilnost/toničnost formulaciji. Pre svega sprečava neto protok vode kroz ćelijske membrane koje su u dodiru sa formulacijom. Tokom procesa sušenja zamrzavanjem (lliofilizacije), stabilizator deluje i kao krioprotektant. Jedinjenja kao što je glicerin, često se koriste za ove namene. Ostali pogodni agensi za stabilnost uključuju, između ostalih, amino kiseline ili proteine (npr. glicin ili albumin), soli (npr. natrijum hlorid), i šećere (npr. dekstroza, manitol, saharoza i laktoza). U skladu sa ovim pronalaskom, preporučeni stabilizacioni agens šećer, a još bolje da to bude saharoza.

Izraz "bočica" ili "posuda", kako se ovde koristi, u širem smislu odnosi se na rezervoar koji je pogodan da se u njemu drži formulacija FGF-18 u liofilizovanom obliku. Isto tako u njemu će biti i rastvarač za rekonstituisanje. U primere posude koja može da se koristi za ovaj pronalazak spadaju špricevi, ampule, patrone, ili druge vrste posuda koje su pogodne da se formulacija FGF- 18 daje pacijentu injekcijom, odnosno ubrizgavanjem i to po mogućstvu intraartikularno. Alternativno, bočica u kojoj se nalazi formulacija FGF-18 i ona u kojoj se nalazi rastvarač za rekonstituisanje mogu da budu u 2 odeljka dvokomornog sistema (na primer, špric ili patrona). Ovakve bočice (posude) pogodne za proizvode namenjene intraartikulatnoj primeni dobro su poznate u struci.

Izraz "rastvarač", kako se ovde koristi, odnosi se na tečni rastvarač bilo da je vodeni ili nevodeni. Odabir rastvarača zavisi prvenstveno od rastvorljivosti jedinjenja leka u pomenutom rastvaraču i od načina primene. Vodeni rastvarač može da se sastoji samo od vode, ili može da se sastoji od vode plus jedan ili više mešljivih rastvarača, i može da sadrži rastvorljtve rastvorke kao što su šećeri, puferi, soli ili drugi ekscipijensi. Češće korišćeni nevodeni rastvarači su organski alkoholi kratkih lanaca, kao što su metanol, etanol, propanol, ketoni kratkih lanaca, kao što je aceton, i poli alkoholi, kao što je glicerol. U skladu sa ovim pronalaskom, preporučeni rastvarač je vodeni rastvarač kao što je voda ili fiziološki rastvor.

Izraz "poremećaj hrskavice", kako se ovde koristi, uključuje poremećaje koji nastaju usled oštećenja izazvanog traumatskom povredom ili hondropatijom. U primere poremećaja hrskavice koji se mogu lečiti primenom formulacije FGF-18 opisanom u ovom tekstu, spadaju, između ostalih, bez ikakvih ograničenja, artritis, kao što je osteoartritis ili reumatoidni artritis, i povreda hrskavice.

Izraz "Osteoartritis" koristi se da opiše najčešći tip artritisa. On može da bude uzrokovan razgradnjom hrskavice. Komadići hrskavice mogu da se odvoje i izazovu bol i otok u zglobu između kostiju. Tokom vremena, hrskavica može u potpunosli da se „izliže" i nestane, pa će se kosti trljati jedna o drugu. Osteoartritis može da napadne svaki zglob, ali obično se to dešava na šakama, i zglobovima koji nose teret, kao što su kukovi, koiena, stopala, i kičma. U preporučenom primeru, osteoartritis može da bude osteoartritis koiena ili osteoartritis kuka. Stručnjak za ovu oblast dobro zna koje se klasifikacije osteoartritia koriste među stručnjacima, a posebno zna za sistem praćene OARSI (videti, na primer, Custers et al., 2007). Osteoartritis je jedan od preporučenih poremećaja hrskavice koji se mogu lečiti primenom formulacija FGF-18 u skladu sa ovim pronalaskom.

Izraz "povreda hrskavice" kako se ovde koristi je poremećaj hrskavice ili oštećenje hrskavice prevashodno kao posledica traume. Povrede hrskavice mogu da nastanu kao rezultat mehaničkog traumatskog oštećenja, prvenstveno kao posledica udesa ili operacije. Ova definicija uključuje i sportske povrede ili „trošenje" zglobnog tkiva povezano sa sportom.

Detaljni opis pronalaska

[0018]Glavni cilj ovog pronalaska je stabilna liofilizovana formulacija koja uključuje ili se sastoji od proteina FGF-18, pufera, poloksamernog surfaktanta i šećera kao stabilizacionog agensa. Ovaj pufer je fosfatni pufer, poloksamerni surfaktant je poloksamer 188, a stabilizacioni agens je saharoza. Po mogućstvu, protein FGF-18 se odabira iz grupe koja se sastoji od: 1) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od zrele forme humanog FGF-18, Što odgovara sekvenci koja uključuje ili koja se sastoji od rezidualne 28(Glu) do rezidualne 207(Ala) u SEQ ID NO: 1, 2) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od skraćene forme humanog FGF-18 koji uključuje ili koji se sastoji od rezidualne 28 (Glu) do rezidualne 196 (Lys) u SEQ ID NO:1, i 3) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od SEQ ID NO:2. Još bolje, FGF-18 je trFGF-18.

[0019]Koncentracija FGF-18 u ovom pronalasku iznosi po mogućstvu tačno ili oko 20 to 300 mcg po bočici, po mogućstvu tačno ili oko 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili 300 mcg po bočici, ili još bolje tačno ili oko 20, 30, 35, 60, 100, 200 ili 300 mcg po bočici. FGF-18 može da se dodaje i u količini 5% većoj od deklarisane da se spreči gubitak proteina do koga bi moglo da dođe tokom formulisanja. Na primer, za koncentraciju FGF-18 od 30 mcg po bočici, ovo jedinjenje može da se doda u koncentraciji od 31.5 mcg po bočici.

[0020]Po mogućstvu, formulacije ovog pronalaska zadržavaju najmanje 80% biološke aktivnosti FGF-18 u vreme liofilizacije i/ili pakovanja tokom perioda od najmanje 12 meseci (pre prve upotrebe). Aktivnost FGF-18 može da se meri kako je opisano u narednom odeljku "Primeri".

[0021] Preporučeni puferi u skladu sa ovim pronalaskom su fosfatni pufers, i oni održavaju pH na vrednostima između 7,0 i 7,5, i ili još bolje na tačno ili oko 7,2.

[0022]Koncentracija pufera u ukupnom rastvoru iznosi po mogućstvu tačno ili oko 5 do 500 mM. U preporučenom obliku, koncentracija pufera je ili tačno ili oko 10 do 100 mM. Po mogućstvu, koncentracija pufera je ili tačno ili oko 10 mM.

[0023]Preporučuje se da stabilizacioni agens u ovom pronalasku bude šećer. Preporučeni šećer je saharoza. Po mogućstvu, koncentracija stabilizacionog agensa je ili tačno ili oko 0,5 do 250 mg/bočici, još bolje tačno ili oko 1 do 100 mg/bočici, konkretnije tačno ili oko 15 do 60 mg/bočici, a najbolje da bude tačno ili oko 30 mg/bočici.

[0024]Surfaktant u skladu sa ovim pronalaskom je poloksamerni surfaktant, i posebno to je poloksamer

188 (t.j. Pluronic® F68). Preporučuje se da koncentracija surfaktanta bude ili tačno ili oko 0,01 do 10 mg/bočici, još bolje tačno ili oko 0,05 do oko 5 mg/bočici, konkretnije tačno ili oko 0,1 do oko 1 mg/bočici, a najbolje tačno ili oko 0,1; 0,2 ili 0,4 mg/bočici, i sasvim konkretno tačno ili oko 0,2 mg/bočici.

[0025]U preporučenom obliku, stabilna liofilizovana formulacija u ovom pronalasku uključuje ili se sastoji

od FGF-18 u količini od tačno ili oko 20, 30, 60, 100, 200 ili 300 mcg/bočici, 10 mM fosfatnog pufera na pH 7.2, 30 mg saharoze po bočici i 0,2 mg poloksamera 188 po bočici. Kada se doda i višak od 5%. ovakva liofilizovana formulacija u skladu sa predstavljenim pronalaskom sadrži FGF-18 u količini od tačno ili oko 21, 31.5, 63, 105, 210 ili 315 mcg po bočici.

[0026]U dodatnom obliku, predstavljeni pronalazak je usmeren na stabilnu liofilizovanu formulaciju koja uključuje: 1) FGF-18 : saharoza u odnosu koncentracija od ili oko 1:95000 do iti do oko 1:6000, po mogućstvu tačno ili oko 1:92000, 1:61000, 1:31000, 1:18450, 1:9200 ili 1:6100, 2) FGF-18 : poloksamer 188 u odnosu koncentracija od ili oko ili 1:25 do ili do oko 6:10, po mogućstvu tačno ili oko 1:25, 5:83, 5:42, 1:5, 2:5 ili 6:10. 3) FGF-18 : fosfatni pufer na pH 7.2 u molarnom odnosu od ili oko ili 1:10500 do ili do oko 1:700, po mogućstvu tačno ili oko 1:10500, 1:7000, 1:3500, 1:2100, 1:1050 ili 1:700,

naznačeno time da protein FGF-18 po mogućstvu bude izabran iz grupe koja se sastoji od: 1) polipeptida koji uključuje ili koji se sastoji od amino kiselinskih ostataka 28{Glu)-207(Ala) u SF_Q ID NO:1, 2) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od amino kiselinskih ostataka 28(Glu)-196(Lys) u SEQ ID NO:1, ili 3) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od SEQ ID NO:2. Još bolje, protein FGF-18 uključuje ili se sastoji od amino kiselinskih ostataka 28{Glu)-207(Ala) u SEQIDNO:1.

[0027]U još jednom dodatnom obliku, predstavljeni pronalazak je usmeren na stabilnu liofilizovanu formulaciju koja uključuje : 1) FGF-18:saharoza u molarnom odnosu od ili oko 1:90000 do ili do oko 1:5000, po mogućstvu tačno ili oko 1:87000, 1:58000, 1:29000, 1:17400, 1:8700 ili 1:5800, 2) FGF-18:poloksamer 188 u molarnom odnosu od ili oko ili 5:120 do ili do oko 5:8, po mogućstvu tačno ili oko 5:118, 5:79, 10:79, 10:47, 5:12 ili 5:8,

3} FGF-18:fosfate pufer na pH 7.2 u molarnom odnosu od ili oko ili 1:10000 do ili do oko 1:700, po mogućstvu tačno ili oko 1:10000, 1:6600, 1:3300, 1:2000, 1:1000 ili 1:700,

naznačeno time da protein FGF-18 po mogućstvu bude izabran iz grupe koja se sastoji od: 1) polipeptida koji uključuje ili koji se sastoji od amino kiselinskih ostataka 28(Glu)-207(Ala) u SEQ ID NO:1, 2) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od amino kiselinskih ostataka 28(Glu)-196{Lys) u SEQ ID NO:1, ili 3) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od SEQ ID NO:2. Još bolje, protein FGF-18 uključuje ili se sastoji od amino kiselinskih ostataka 28(Glu)-196(Lys) u SEQ ID NO:1. Još konkretnije, protein FGF-18 uključuje ili se sastoji od SEQ ID NO:2. U konkretnom obliku, protein FGF- 18 je trFGF-18.

[0028]Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje metodu za proizvodnju ma koje od gore opisanih stabilnih liofilizovanih formulacija FGF-18, naznačeno time da taj metod uključuje sledeće korake: 1) pravljenje mešavine FGF-18 sa fosfatnim puferom, poloksamerom 188 i saharozom kao stabilizacionim agensom, i

2) podvrgavanje ove mešavine liofilizaciji.

[0029]Koraci 1 i 2 se sprovode korišćenjem konvencionalnih procedura. Kao primer, da se pripremi odgovarajuća stabilna formulacija, data količina FGF-18, kao što je trFGF-18, mesa se sa fosfatnim puferom koji održava pH na tačno ili oko 7.2, poloksamerom 188 i saharozom. Svako od ovih jedinjenja( t. j.FGF-18, pufer, surfaktant i stabilizacioni agens) može da se koristi u skladu sa koncentracijama, pH, i/ili gore opisanim odnosima. Dobijena mešavina se liofilizuje, a potom pakuje u bočice. Sve varijacije istog procesa prepoznaju ljudi koji su stručni za ovu oblast.

[0030]Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje proizvodni artikal, za farmaceutsku ili veterinarsku upotrebu, koji uključuje: 1) prvu posudu koja uključuje ma koju od gore opisanih stabilnih liofilizovanih formulacija, pomenutu formulaciju koja uključuje ili se sastoji od FGF-18, pufera, poloksamernog surfaktanta, Šećera kao stabilizacionog agensa, kako je gore opisano, i

2) drugu posudu koji uključuje rastvarač za rekonstituisanje.

[0031]Kao primer, prva posuda uključuje stabilnu liofilizovanu formulaciju koja uključuje ili se sastoji od date količine FGF-18, kao što je trFGF-18, fosfatni pufer koji održava pH na tačno ili oko 7.2, poloksamer 188 i saharozu, a druga posuda uključuje fiziološki rastvor (0,9% težinsko/zapreminski natrij um hlorida za injekcije). Svako od ovih jedinjenja (t.j. FGF-18, pufer, surfaktant i stabilizacioni agens) može da se koristi u skladu sa koncentracijama, pH, i/ili gore opisanim odnosima. Po mogućstvu, posuda u kojoj se nalazi formulacija FGF-18 i ona u kojoj je rastvarač za rekonstituisanje odgovaraju dvema odeljcima u dvokomornom sistemu (na primer špric ili patrona)

[0032]Ovde se opisuje i materijal za pakovanje uz uputstva za rekonstituisanje liofilizovane formulacije FGF-18 (prva posuda) u rastvaraču (druga posuda).

[0033]Liofilizovane formulacije ovog pronalaska mogu se čuvati najmanje oko 12 meseci do oko 24 meseca. Pod preporučenim uslovima čuvanja, pre prve upotrebe, ove formulacije se čuvaju od jakog svetla (po mogućstvu u mraku), na sobnoj temperaturi (na tačno ili oko 25°C).

[0034]Stabilna liofilizovana formulacija ovog pronalaska mora se rekonstituisati, po mogućstvu u sterilnim uslovima, korišćenjem rastvarača, kao što je voda ili fiziološki rastvor (npr. 0,9% težinsko/zapreminski natrijum hlorida za injekcije) pre upotrebe,t. j.pre ubrizgavanja/davanja injekcije. Posle rekonstituisanja, zapremina koju treba ubrizgati treba da bude po mogućstvu od 0,5 mL do 5 mL, još bolje od 0,5; 1 ili 25 mL. Formulaciju FGF-18 treba ubrizgati po mogućstvu u roku od jednog sata po rekonstituisanju.

[0035]Predstavljeni pronalazak obezbeđuje stabilne liofilizovane formulacije FGF-18, posebno za jednokratnu upotrebu, pogodnu za farmaceutsku ili veterinarsku upotrebu.

[0036]Ovakva stabilna liofilizovana formulacija koja uključuje FGF-18, u ovom pronalasku, može da se koristi, po rekonstituisanju, za primenu u cilju poboljšanja zarastanja hrskavice ili za terapiju poremećaja hrskavice, kao što su osteoartritis ili povrede hrskavice.

[0037]Ovakve stabilne liofilizovane formulacije, posle rekonstituisanja, pogodne su za upotrebu u injekcijama, ili drugim alternativnim sistemima davanja. U posebno preporučenom obliku, formulacije ovog pronalaska su namenjene intraartikularnoj primeni. One se mogu davati, posle rekonstituisanja, direktnim ubrizgavanjem u sinovijalnu tečnost, ili neposredno u sam defekt. U preporučenom obliku ovog pronalaska, intraartikularno se ubrizgava u odabrani zglob koji može biti zglob kuka, koleno, lakat, ručje, skočni zglob, kičma, stopalo, prst na ruci, prst na nozi, šaka, rame, rebra, lopatice, butne kosti, potkolenice, pete i duž koštanih tačaka na kičmi. U dodatnom preporučenom obliku, intraartikularna injekcija daje se u zglob kuka ili koiena.

[0038]Formulacije FGF-18 ovog pronalaska unapredile su stabilnost, i lako se mogu čuvati na sobnoj

temperaturi (na tačno ili oko 25°C) ili na 2-8 °C (videti sledeće primere), po mogućstvu na sobnoj temperaturi. I zaista, pronalazači su utvrdili da liofilizovane formulacije koje uključuju FGF-18 (npr. trFGF-18), 10 mM fosfatni pufer na pH 7,2;30 mg/bočici saharoze i 0,2 mg/bočici poloksamera 188 su stabilne

tokom vremena, a posebno kada se čuvaju na sobnoj temperaturi. Pomenute formulacije na najmanju meru svode gubitak aktivnog principa,t. j.FGF-18. Utvrđeno je i da su pomenute formulacije otpornije na oksidaciju i stvaranje proteinskih agregata.

[0038]Sledeći primeri su dati da se dodatno ilustruje priprema formulacija i sastava ovog pronalaska. Obim

ovog pronalaska se neće tumačiti tako da se odnosi samo na sledeće primere, već se i definiše zahtevima koji su dati u prilogu.

Opis slike:

[0040] Slika 1: Pokazuje dejstvo surfaktanta {poloksamer 188) na izdvajanje FGF-18 pre procesa

liofil izaći je. Korišćene su pred-formulacije sa sadržajem 10 mg/ml {+5%višak) FGF-18 u fosfatnom

puferu na pH 7,2, uz različite koncentracije surfaktanta (od 0 do 0,2%).Sadržaj proteina procenjen

jeza svaku pred-formulaciju pre filtracije (BF) i posle filtracije (T=0).

Opis sekvenci:

SEQ ID NO.1: Amino-kiselinska sekvenca nativnog humanog FGF-18.

SEQ ID NO.2: Amino-kiselinska sekvenca rekombinantnog skraćenog FGF-18 (trFGF-18).

Primeri

Materijal

[0042]Rekombinantni skraćeni FGF-18 (trFGF-18) u prikazanim primerima pripremljen je eksprimiranjem

uE. coli,u skladu sa tehnikom opisanom u zahtevu VV02006/063362. U sledećim primerima, trFGF-18 i FGF-18 se koriste neizmenično.

[0043]Ostale supstance korišćene u ovim primerima su sledeće:

- Saharoza (1.07653, Merck; Molekulska težina: 342,30 g/Mol)

- Natrijum dihidrogen fosfat monohidrat (1,06345, Merck)

Dihidrat dinatrijum hidrogen fosfat (1,06586, Merck)

- Poloksamer 188 (Lutrol F 68 DAC, USP/NF, Basf; Molekulska težina: 8400 g/Mol)

- Voda za injekcije,

Fiziološki rastvor (0,9% težinsko/zapreminski, natrijum hlorid za injekcije)

Monoklonsko antitelo anti-FGF-18 klon #F5A2, za sadržaj proteina (Obezbedio RBM)

Ćelije BAF3-FGFR3c (Vašingtonski univerzitet)

- Selektivna podloga na bazi Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Invitrogen)

ATPlite 1 step luminescence assay svstem (Perkin Elmer)

- Heparin H3149 (Sigma)

Oprema

[0044]

- AMICON ULTRA-4 10,000 granična vrednost (UFC 8012024, Amicon)

- Biacore 2000 {Biacore}

- C02 inkubator (Heraeus)

- Kolona TSK2000SWxl, 7.8 x 300 mm, 5 u, {TosoHaas, šifra 08540)

- Guard kolona TSKG2000 (Hichrom, šifra 8543)

- HPLC sistemi (VVaters)

Luminometer (Perkin Elmer)

Membranski filteri 0,22 um (Durapore type GWVP, Millipore)

Stabileo softvrare (ver. 1.1; paket Microsoft® Excel Visual Basic®)

- GraphPad software (Prism)

- Držači od nerđajućeg čelika kapaciteta 22 mL i 220 mL (Sartorius)

- Kolona Zorbax 300SB-C18 (150X4.6cm)

- DIN2R (3 ml) staklene bočice {Nuova OMPI)

- Obloženi gumeni čepovi (S2F452, D777-1, B2-40, West Pharmaceuticals)

Gumeni čepovi (šifra 1779, W1816 sivi, Pharma-Gummi)

Metode

Različiti testovi na formulacijama

[0045]Standardne metode su bile korišćene za:

SE-HPLC,

RP-HPLC, Rezidualna vlaga,

pH,

Osmolalnost (vreme 0, samo),

SDS-PAGE/SS, i

Peptiđno mapiranje/UPLC (oksidizovanih formi).

Sadržaj proteina

[0045]Kvantifikacija proteina,t. j.trFGF-18, u različitim formulacijama rađena je na aparatu Biacore. Testirani su uzorci (25uL) sa sadržajem trFGF-18 (razblaženi na odgovarajući način u prisustvu 10 mg/mL BSA) tako što je obezbeđen protok brzinom od 5|iL/min na 25°C, preko senzorske površine, prethodno obložene monoklonskim antitelom anti-FGF-18 klonom F5A2, posle čega sledi 5uL 10mM glicina pH 2.0 kao regeneracijskog pufera. Referentni standard (IRS FGF-18 No. 051230), u rasponu od 125 sve do 2.000 ng/mL, odrađen je u svakoj analitičkoj sesiji. Rezultati su prikupljeni u vidu Resonance Unit (RU) pa su nivoi FGF-18 za svaki uzorak ekstrapolirani iz standardne krive korišćenjem kvadratnog algoritma sa logaritamski transformisanim podacima.

Bioesei

[0047]Biološka aktivnost proteina FGF-18 meri se kao proliferativna aktivnost pomoću in-vitro bioeseja korišćenjem ćelijske linije BaF3 koja je stabilno transfektirana FGF receptorom 3c (FGFR3c). Ćelije BaF3 koje eksprimiraju FGFR3c proliferišu pod stimulacijom FGF-18.

[0048]Ćelije BaF3/FGFR3c se gaje u selektivnoj podlozi na bazi RPMI 1640 u prisustvu r-hlL-3 kao faktora rasta. Da bi se konkretno ispitalo proliferativno dejstvo FGF-18, ćelije moraju da budu lišene IL-3. Prema tome, ćelije se gaje na 37°C, 5% CO2u odsustvu r-hlL-3 tokom 26 sati pre određivanja.

[0049]Standard i uzorci se petostruko serijski razblažuju u podlozi za određivanje u rasponu koncentracija od 0,002 U/mL sve do 177,5 U/mL. Ćelije BAF3/FGFR3c bez IL-3 (20.000 ćelija po udubljenju na ploči) inkubiraju se na 37°C, 5% CO2sa FGF-18 u prisustvu 1 u.g/mL heparina, i 10% seruma novorođenog teleta (NBCS), a onda se proliferacija ćelija procenjuje posle 48 sati pomoću eseja luminescencije "ATPlite 1 step", stoje sistem za praćenje ATP na osnovu Fireflv luciferaze.

[0050]Jačina uzorka se meri primenom modela produžene krive odgovora na dozu. Ovim modelom, cela kriva odgovora na dozu standarda i uzoraka uklapa se sa algoritmom sigmoidne krive odgovora na dozu sa promenljivim nagibom da se dobije vrednost cps( t. j.broja po sekundi) u odnosu na log koncentracija FGF-18. Za svaku krivu automatski se izračunava EC50pomoću softvera GraphPad. Jačina uzorka se izračunava na bazi odnosa između EC50referentnog preparata i nepoznatog uzorka (koeficijent jačine). Jačina FGF-18 izražava se u U/mL.

Primer 1: Liofilizovane formulacije trFGF-18

[0052]Liofilizovane formulacije su proizvedene na sledeći način: saharoza i Poloxamer 188 rastvaraju se u fosfatnom puferu. Potom se dodaje potrebna količina supstance leka (trFGF-18), proverava se pH, pa rastvor dovodi do finalne zapremine. Rastvor se potom filtrira kroz membranu od 0,22um (Durapore®) pod azotnim pritiskom, održavajući koeficijent filtracije na oko 20 cc/cm2 ili na oko 50 cc/cm2.

[0053]Završni rastvor se potom ručno puni, u sterilnim uslovima u staklene bočice (0,5 ml/bočici) i liofilizuje po sledećem ciklusu:

[0054]Liofilizovane formulacije su spremne za rekonstituisanje, u svakom trenutku, korišćenjem rastvarača, kao što je voda za injekcije ili fiziološki rastvor.

Primer 2: Preliminarno ispitivanje stabilnosti formulacija FGF-18

[0055]Primer 2.1: Uslovi ubrzane stabilnosti (na 2-8°C, 25°C i 40°C) korišćeni su da se identifikuju liofilizovane pre-formulacije koje će se dodatno ispitivati (podaci nisu prikazani). Pripremljene su različite preliminarne liofilizovane formulacije, da bi se identifikovale najbolje formulacije kao kandidati. U okviru ovog preliminarnog ispitivanja, procenjivani su i različiti puferi, uključujući fosfatne i histidinske pufere. Ispitivane su i različite koncentracije saharoze i poloksamera 188. Preliminarni kandidati za formulacije ispitivani su na čistoću (pomoću SE-HPLC i RP-HPLC), sadržaj proteina (pomoću Biacore), biološku aktivnost (in-vitro bioesej), rezidualnu vlagu, pH i osmolalnost. Dodatni potporni podaci o stabilnosti dobijen« su pomoću SDS-PAGE/SS (čistoća) i mapiranjem peptida /UPLC (oksidizovane forme).Primer 2. 2 ( podaci o stabilnosti za preliminarne formulacije; podaci nisu prikazani) :Podaci o stabilnosti prikupljeni za preliminarne liofilizovane formulacije pomoću SE-HPLC tokom perioda čuvanja od 3-4 nedelje ukazuju da prednost treba dati fosfatnom puferu na pH 7,2 jer je tu zabeležen mnogo veći nivo čistoće( t. j.veći % monomera) u poređenju sa histidinskim puferom na pH 6 (videti tabelu 2). Količina saharoze (15 mcg/bočici u poređenju sa 30 mcg/bočici) takođe igra ulogu u stabilizaciji FGF-18 u poređenju sa agregacijom, gde su po pravilu veće pojave monomera zabeležene kada smo imali 30 mcg/bočici saharoze (Čuvanje na 25°C i 5°C). Uz to, veći sadržaj proteina zabeležen je posle koraka filtracije (pre procesa liofilizacije) kada je surfaktant (t.j. poloksamer 188) povećan, a najbolji rezultati su dobijeni kada je bilo 0,2 mg/bočici (slika 1). Na osnovu rezultata iz ove faze preliminarnih formulacija, pripremljeno je šest liofilizovanih formulacija za dalje ispitivanje (formulacije 1-6 sa Tabele 1; nazivaju se i formulacije kandidati).

Primer3:Ispitivanje stabilnosti liofilizovanih formulacija FGF-18

[0056]Obezbeđeni su podaci o stabilnosti posle 2 nedelje do 24 meseca liofilizovane formulacije kandidate sa Tabele 1.

Primer 3. 1 ( čistoća određena pomoću SE- HPLC) :Rezultati za statističku procenu koji su obrađeni programom Stabileo za podatke o stabilnosti data dobijene pomoću SE-HPLC sažeto su prikazani na Tabeli 3: nema značajnog gubitka čistoće (sadržaj monomera) ni za jednu kandidovanu liofilizovanu formulaciju po Čuvanju na različitim temperaturama (do 6 meseci na 40°C i do 24 meseca na 25"C). Primer 3.2( čistoća određena pomoćuSDS-PAGE/SSJ: Rezultati dobijeni pomoću SDS-PAGE potvrdili su da je nivo čistoće po pravilu preko 99% za sve liofilizovane formulacije po čuvanju na svim ispitivanim temperaturama {najmanje 6 meseci na 40°C i do 18 meseci na 25°C). Ovi rezultati su prikazani na Tabeli 4.

Primer3.3( čistoća određena pomoću RP- HPLC) :Rezultati statističke procene koja je rađena programom Stabileo na podacima o stabilnosti dobijenim pomoću RP-HPLC sažeto su prikazani na Tabeli 5: nema značajnijeg gubitka čistoće (% glavne vršne vrednosti) ni kod jednog kandidata za liofilizovanu formulaciju posle čuvanja na različitim temperaturama (do 6 meseci na 40°C i do 18 meseci na 25°C). Prema tome, formulisanje FGF-18 u skladu sa ovim pronalaskom ne dovodi ni do kakvog gubitka čistoće u poređenju sa početnim materijalom (čistim) FGF-18. Primećeno je da budući da početni materijal (pre formulisanja) nije bio potpuno čist (RP-HPLC nije u potpunosti otklonio baš sve nečistoće), ni vršna vrednost pre formulacije nije bila na 100%, već na primer na 77,5% za FD-30 i 87,4% za FD-300, a vršna vrednost na T=0 bila je na primer na 76,8% za FD-30 i 87,7% za FD-300.

Primer 3.4 (određivanje sadržaja proteina): Rezultati merenja koncentracije proteina pomoću Bioacore sažeto su prikazan i na Tabelama 6 i 7. Nije zabeležen veći gubitak po filtraciji kroz membranu veličine pore od 0,22 (im, t.j. utvrđen je skoro potpuni povraćaj proteina (videti "AF" kolonu na Tabeli 6). Po rekonstituisanju liofilizovanog proizvoda sa 1 mL WFI (videti "TO") kolonu na Tabeli 6), dobijena je manja količina (manji povraćaj) što se može objasniti adsorpcijom proteina na staklu bočice (po rekonstituisanju, rastvor proteina se izlaže većoj površini).

Sa tačke gledišta stabilnosti, nikakav gubitak proteinskog sadržaja ne registruje ni Biacore za sve jačine i sve ispitivane temperature, kao što se vidi na Tabeti 7 (do 6 meseci na 40°C i do 24 meseca na 25°C).

Primer 3. 5 ( biološka aktivnost) :Rezultati biološke aktivnosti (izraženo u U (jedinicama)/posudi) za sve kandidate za liofilizaciju po čuvanju prikazani su na Tabeli 8. Na primer, biološka aktivnost zabeležena za veće jačine (300 mcg/bočici trFGF-18) po čuvanju na 25°C i 40°C bila je stabilna tokom vremena. Veća varijabilnost primećena je za najniže jačine FD-20. Budući da nije utvrđena nikakva promena u stabilnosti proizvoda ni jednim od ostalih testova, ovaj pad zabeležen sa FD-20 mora da se potvrdi posle 39, 52, 78 i 104 nedelje čuvanja na 25°C.

Primer3.6( oksidizovane forme) :Nivo otkrivenih oksidizovanih formi za sve jačine po čuvanju sažeto je prikazan na Tabeli 9: među rezidualnim Met koji bi mogao da pretrpi oksidaciju, rezultati govore daje Met 1 podložniji oksidaciji za sve jačine i na svim ispitivanim temperaturama.

Primer 3. 7 ( rezidualna vlaga) :Nije zabeležen značajan porast rezidualne vlage posle čuvanja za sve jačine; vrednosti rezidualne vlage ispod ili oko 1% po pravilu su se beležile tokom celokupnog ispitivanja stabilnosti (videti Tabelu 10) (do 6 meseci na 40°C i do 24 meseci na 25"C).

Primer3.8( varijacije pH)\Nisu zabeležene značajnije varijacije pH posle čuvanja za sve jačine i za sve temperature, (videti Tabelu 11) (do 6 meseci na 40°C i do 24 meseci na 25°C).

Primer 3.9( varijacije osmolalnosti) :Nisu zabeležene značajnije varijacije osmolalnosti posle čuvanja za sve jačine i za sve temperature, (videti Tabelu 12) (do 6 meseci na 40°C i do 24 meseci na 25°C).

Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu 1 5 10 15

Leu Leu Cys Phe Gin Val Gin Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp

20 25 30

Phe Arg Ne His Val Glu Asn Gin Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser

35 40 45

Arg Lys Gin Leu Arg Leu Tyr Gin Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys

50 55 60

His lle Gin Val Leu Gly Arg Arg lie Ser Aia Arg Gly Glu Asp Gly

65 70 75 80

Asp Lys Tyr Ala Gin Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gin

85 90 95

Val Arg lie Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg

100 105 110

Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val

115 120 125

Phe lle Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala

130 135 140

Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg 145 150 155 160

Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gin Gin Asp Val His Phe Met Lys

165 170 175

Arg Tyr Pro Lys Gly Gin Pro Glu Leu Gin Lys Pro Phe Lys Tyr Thr

180 185 190

Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg lle Arg Pro Thr His Pro Ala

195 200 205

<210>2

<211> 170

<212> PRT

<213> Veštački

<220>

<23> rekombinantni skraćeni FGF-18 (trFGF-18)

<400> 2

Claims

1. Stabilna liofilizovana formulacija koja uključuje FGF-18, fosfatni pufer koji čini da vrednost pH ostane na između 7,0 i 7,5, poloksamer 188 i saharoza.

2. Stabilna liofilizovana formulacija u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time da fosfatni pufer održava pH na tačno ili oko 7,2.

3. Stabilna liofilizovana formulacija u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da koncentracija pufera bude ili tačno ili oko 5 do 100 mM.

4. Stabilna liofilizovana formulacija u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da koncentracija poloksamera 188 bude ili tačno ili oko 0,1 do 0,4 mg/bočici.

5. Stabilna liofilizovana formulacija u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da koncentracija saharoze bude ili tačno ili oko 10 do 60 mg/bočici.

6. Stabilna liofilizovana formulacija u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da koncentracija FGF-18 bude ili tačno ili oko 20 do 300 mcg/ bočici.

7. Stabilna liofilizovana formulacija u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da ta formulacija uključuje 20, 30, 60, 100, 200 ili 300 mcg FGF-18 po bočici, 10 mM fosfatnog pufera koji održava pH na tačno ili oko 7.2, 30 mg saharoze po bočici i 0,2 mg poloksamera 188 po bočici.

8. Stabilna formulacija u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da ta formulacija dodatno uključuje 5% viška FGF-18.

9. Stabilna formulacija u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se FGF-18 odabira se iz grupe se sastoji od: a) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od amino kiselinskih ostataka 28-207 u SEQ ID NO:1, b) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od amino kiselinskih ostataka 28-196 u SEQ ID NO:1 , i c) polipeptida koji uključuje ili se sastoji od SEQ ID NO:2.

10. Metod za proizvodnju stabilne liofilizovane formulacije u skladu sa svim prethodnim zahtevima, koji uključuje sledeće korake: a) pravljenje mešavine FGF-18 zajedno sa fosfatntm puferom, poloksamerom 188 i saharozom, i b) podvrgavanja te mešavine liofilizaciji.

11. Proizvodni artikal koji uključuje prvu posudu u kojoj se nalazi stabilna liofilizovana formulacija u skladu sa svim zahtevima od 1 - 9 i drugu posudu koja uključuje rastvarač za rekonstituisanje.

12. Proizvodni artikal u skladu sa zahtevom 11, naznačeno time da posuda koja uključuje stabilnu liofilizovanu formulaciju i ona koja uključuje rastvarač za rekonstituisanje predstavljaju dva odeljka dvokomornog sistema.