NO145162B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av nye cholecaliciferolderivater, hvilke kontrollerer kalsium-metabolismen hos varmblodige dyr. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte ved fremstilling av la,24(S)-dihydroxycholecalciferol og/eller la,24 (R)-dihydroxycholecalciferol som kontrollerer kalsium metabolisme hos varmblodige dyr, med formel

Formelen (5) angir generisk la,24(S)-dihydroksycholecalciferol som skal benevnes la,24(S)-DHCC med følgende formel la,24(R)-dihydroksycholecalciferol som benevnes la,24(R)-DHCC med følgende formel og en blanding av la,24 (S)-epimer med formel (5-1) og en la,24 (R)-epimer med formelen (5-2). I den foreliggende beskrivelsen uttrykkes blandingen ovenfor av • en la,24(S)-epimer av formelen (5-1) og en la,24(R)-epimer av formelen (5-2) i fakultativt forhold ved den følgende formel

Med andre ord, -H i 24-stilling uttrykkes ved

Den samme fremstilling som i den ovenstående formelen (5), (5-1) og (5-2) anvendes for å uttrykke precursorene for disse forbindelsene.

la,24-dihydroksychelcalciferolene med formelen (5),

har meget nyttige farmakologiske egenskaper, hvilket er påvist i det følgende.

Som det sees her nedenunder ved detaljerte dyreforsok,

viser la,24(S)-DHCC alene, la,24(R)-DHCC alene og en blanding av disse alle en meget nyttig farmakologisk virkning som et kontrollreagens for kalsiummetabolismen i varmblodsdyr, og har en langt lavere toksisitet (LD5q) enn la-hydroksycholecalciferol (la-HCC) som er en kjent analog av aktive former for vitamin D^.

la-hydroksycholecalciferol (la-HCC) blir uttrykt ved den folgende formel

la,24-dihydroksycholecalciferolene av formel er hittil ukjente forbindelser. I The Journal of Steroid Biochemistry, Vol.5, nr. 4, juni 1974 - Fourth Internation Congress on Hormonal Steroids - Mexico City, 2-7. september 1974, Abstracts of Papers Presented (actually published on the 16th Aug. 1974), angis det at 24-hydroksycholesterol (24-HC) av den følgende formel 24,25-dihydroksycholesterol (24,25-DHC) av den følgende formel

og deres la-hydroksyderivater kan overføres til vitamin D-derivater ved konvensjonelle fremgangsmåter. Imidlertid lyk-tes det bare å overføre forbindelsene av formlene (B-2) og (B-3) til vitamin D-derivatene. Det ble opplyst at overfør-ingen av la-hydroksyderivatene av (B-2) til vitamin D-derivater fremdeles var under utforskning, og intet forelå om overføringen av la-hydroksy-derivatene av (B-3) til vitamin D-derivater. Ifølge foreliggende oppfinnelse imidlertid synteti-seres nye la-24-dihydroksycholecalciferoler med formel (5), ved fremgangsmåten som skal beskrives i det følgende.

(1) Første reaksjonstrinn:

la-24-dihydroksycholesterol (som betegnes med la-24-DHC) med den følgende formel (2-a) fremstilles ved å omsette la-2a-epoksy-24-ketocholest-4,6-dien-3-on (som skal betegnes med la-2ct-epoksy) med den følgende formel

med et alkalimetall og en protondonator i nærvær av flytende ammoniakk eller et flytende amin.

la,24-DHC uttrykt ved formelen (2-a) betyr en blanding av la,24(S)-dihydroksycholesterol (la,24(S)-DHC) og la,24(R)-dihydroksycholesterol (la,24(R)-DHC) i'fritt valgte forhold og ifolge metoden for forste trinn ovenfor, oppnås la,24-

DHC som en blanding av (S)-epimer og (R)-epimer.

la,24-epoksydet med formelen (1) og la,24-DHC av formel {2-a) antas å være begge nye forbindelser som ikke er beskrevet i tidligere litteratur, men syntetisert for første gang i forbindelse med foreliggende oppfinnelse.

la,2 4-DHC ovenfor kan overføres til la,2 4-DHCC og med formelen (5), ved fremgangsmåten for denne oppfinnelsen som skal beskrives.

I tillegg er disse forbindelsene nyttige mellomprodukter for andre steroider som har fysiologiske aktiviteter, f.eks. mellomprodukter for syntese av la,24,25-trihydroksycholecalciferol som er en aktiv form av vitamin D^.

<\>Eksempler på flytende aminer anvendt i forste trinn er primære,

sekundære eller tertiære alkylaminer, slik som metylamin, etyl-amin, dietylamin eller trietylamin. Anvendelsen av flytende ammoniakk foretrekkes imidlertid. Skjont det ikke er noen spesiell begrensninger ved flytende ammoniakk, behandles den fortrinnsvis ved destillasjon for å fjerne vann så mye som mulig, egnet mengde av flytende ammoniakk eller det flytende aminet er 5 til 5oo ganger, spesielt lo til 2oo ganger,

vekten av la,2a-epoksy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on.

Eksempler på foretrukkede alkalimetaller er litium, natrium,

og kalium. Litium er spesielt egnet. Mengden av alkalimetallet er i overskudd med hensyn til la,2a-epoksydene av formelen (1), f.eks. 5 til 25o ganger (atomekvivalenter), spesielt lo til 2oo ganger, mengden av la,2a-epoksydet av formel (1).

Fortrinnsvis anvendes et inert organisk opplosningsmiddel

for la,2a-epoksydet av formelen (1) for å få reaksjonen til å forlope glatt. Eksempler på foretrukne opplosningsmidler er eter, slik som etyleter, tetrahydrofuran, dioksan eller 1,2-dimetoksyetan, alifatiske hydrokarboner såsom ligroin,

pentan, heksan, cykloheksan elJe r metylcykloheksan og blandinger av to eller flere av disse.

Mengden av det organiske opplosningsmidlet er minst lik

volumet av det benyttede flytende ammoniakk, fortrinnsvis 1 til 2 ganger volumet av den flytende ammoniakken.

Passende protondonatorer er ammoniumsalter slik som

ammoniumsalter av organiske syrer og ammoniumsalter av uorganiske syrer. Spesifikke eksempler på ammoniumsalter er ammoniumklorid, ammoniumbromid, ammoniumkarbonat, ammoniumsulfat, ammoniumfosfat, ammoniumhydrogenfosfat, ammoniumacetat, ammoniumformat, ammonium-benzoat, ammoniumbenzensulfonat og ammonium p-toluensulfonat.

Av disse er ammoniumsaltene av uorganiske syrer, slik som ammoniumklorid, spesielt foretrukket. Mengden av ammoniumsaltet er minst ekvimolart til det anvendte alkalimetallet, fortrinnsvis opp til lo ganger molaret av sistnevnte.

Lavere alkoholer slik som metanol, etanol eller tert.-butyl-alkohol kan også anvendes som protondonator.

Tilsetningsmåten av reagensene er meget viktig i utførelsen av prosessens første trinn i foreliggende oppfinnelse, og med fordel velges en av de følgende tre tilsetningsmetodene. (A) la,2«-epoksydet settes til en blanding inneholdende flytende ammoniakk og alkalimetallet, og så tilsettes ammoniumsaltet. På,dette tidspunkt foretrekkes det heller å tilsette ammoniumsaltet suksessivt i to eller flere små porsjoner. (B) En mindre del ( helst mindre enn o,7 molar ganger mengden av det anvendte alkalimetall) av ammoniumsaltet tilsettes forut til en blanding inneholdende flytende ammoniakk og alkalimetallet. la,2a-epoksydet settes til dette systemet og så tilsettes resten av ammoniumsaltet.

(C) la,2a-epoksydet og ammoniumsaltet tilsettes samtidig i

små porsjoner til en blanding bestående av flytende ammoniakk

og alkalimetall.

Av de ovenfor angitte metodene foretrekkes metode (A) spesielt.

Reaksjonstemperaturen er normalt fra -7o° til tilbakelops-temperaturen for flytende ammoniakk i reaksjonssystemet.

Det er en fordel etter at hele protondonatoren er tilsatt

at reaksjonen forloper inntil alkalimetallet, som anvendes i overskudd, er fullstendig forbrukt under tilbakelbp av flytende ammoniakk. Dette kan gi det endelige la,24-DHC i hoyere utbytte.

En tidligere kjent fremgangsmåte består av å omsette la,2a-epoksy-cholesta-4,6-dien-3-on av formelen

<

med metallisk litium og ammoniumklorid i nærvær av flytende ammoniakk under dannelse av la-hydroksycholesterol (la-HC) av formelen

i den hensikt å oppnå la-hydroksycholecalciferol (b-1)

(D.H.R. Barton et al., J. Am. Soc, 95, 2748, 1973).

Det er nå funnet at la,2a-epoksydet som anvendes blir substituert ved en okso-gruppe (=0) i 24-stillingen, og ifølge foreliggende oppfinnelse, forløper 4-trinnsreduksjons-reaksjonen av slikt la,2a-epoksyd, dvs.,

(1) reduksjonen av karbonylgruppen i 24-stilling,

(ii) reduksjonen av la,2-epoksydgruppen,

(iii) redaksjonen av 4,6-dienet til et 5-en, og

(iv) reduksjonen av karbonylgruppen i 3-stillingen, glatt i ett eneste trinn, og at når foretrukne betingelser benyttes kan la,24-dihydroksycholesterol (la,24-DHC)

bli syntetisert med et hoyt utbytte av 60- 75%. Det faktum at en slik fire-trinns reduksjonsreaksjon (trinn (i) til (iv)) forloper glatt i ett eneste trinn er heller ikke fremlagt i noen tidligere publikasjon, og dette menes å være en ny

reaksjon som for forste gang er oppdaget av oppfinnerene i foreliggende soknad-.

(2) Fremstilling av la,2a-epoksydet:

la,2a-epoksydet med formel (1) brukt som et utgangsmateriale i forste trinn i fremgangsmåten ifolge foreliggende oppfinnelse kan lett fremstilles, f.eks. ved fblgende fremgangsmåte som anvender fucosterol av folgende formel som utgangsmateriale som er tilstede i store mengder i brune marine alger. Et eksempel på denne fremgangsmåten er som folger: Fucosterol blir oksydert med ozon ved lav temperatur, og det resulterende ozonidet reduseres med et eddiksyre/sinksystem under dannelse av 24-ketocholesterol av den folgende formel i et utbytte på omkring 6o-75%. Det resulterende 24-ketocholesterol blir oksydert, f.eks. med 2,3-diklor-5,6-dicyano-benzokinon (DDQ) under tilbakelop i f.eks. dioksan og cholesta-1,4,6-trien-3,24 dion med folgende formel

og så blir dette oksydasjonsproduktet epoksydert ved romtemperatur under alkaliske betingelser (pH rundt 7,5-9)

ved anvendelse av f.eks. hydrogenperoksyd.

Denne metoden gjor det mulig å syntetisere la,2a-epoksydet

av formel (1) i et utbytte på ca. 4o - 55% fra 24-keto-cholesterolet av formel (A-2).

Cholesta-1,4,6-trien-3,24-dionet av formel (A-3) er også en

ny forbindelse som ble syntetisert forste gang av oppfinnerene i foreliggende soknad.

Når en lavere alkohol slik som metanol brukes som opplosningsmiddel for ovenstående epoksyderingsreaksjon, utfelles det dannede la,2a-epoksydet fra den lavere alkoholopplosningsmidlet. Det utskilte epoksydet kan atskilles fra reaksjonsblandingen ved filtrerting,og direkte anvendes som utgangsmateriale i første trinn i en etterfølgende syntese.

(3) Atskillelse av (S)- og (R)-epimere av la,24-DHC:

Som allerede angitt er la,24-DHC av formel (2) som oppnås

i første trinn en blanding av la,24(S)-DHC og la,24(R)-DHC.

Det er funnet at (S)-epimeren og (R)-epimeren kan lett atskilles ved substituert eller usubstituert benzoylering av hydroksygruppene i 3- og 2 4-stillingene av la,24-DHC. Med andre ord kan 1-stillingen ha en hydroksylgruppe i seg selv eller beskyttet av en beskyttelsesgruppe som kan overføres dertil i den hensikt å utføre atskillelsen av (S)- og (R)-epimerene.

Substituert eller usubstituert benzoylering av 3- og 24-stillingene i la,24-DHC kan utfores ved omsetning av la,24-

DHC med substituert eller usubstituert benzoylklorid

f.eks. i et inert organisk opplosningsmiddel i nærvær av en organisk base som syreakseptor. Reaksjonen er en konvensjonell reaksjon kjent som en Schotten-Baumann-reaksjon. En organisk base såsom pyridin kan anvendes i ovennevnte reaksjon som et inert organisk opplosningsmiddé. og i dette tilfellet er bruken av en syreakseptor ikke spesielt nodvendig.

Substituert eller usubstituert benzoylering av 3- og 24-stillingene i la,24-DHC kan oppnås selektivt ved å omsette det med substituert eller usubstituert benzoylklorid f.eks. i en pyridinopplosning ved lav temperatur (f.eks. -5

til lo°C) for en passende tidsperiode ( f.eks. lo - 24 timer). Hydroksylgruppen i 1-stilling kan acyleres ved, f.eks.

å omsette et sterol hvis hydroksygrupper i 3- og 24-stillingen er beskyttet, med et acylklorid i en pyridinopplosning ved o - 5o°C. Hydroksylgruppene i 1-stilling kan bli trimetylsilylert, f.eks. ved å omsette et sterol hvis hydroksylgrupper i 3- og 24-stiJLlingene er beskyttet med N-trimetylsilylimidazol i en pyridinopplosning ved hoy temperatur ( f.eks. 5o - llo°C).

Ved å utfore den substituerte eller usubstituerte benzoyleringen av la,24-DHC ved hoyere temperaturer, f.eks. 15 - loo°C, fortrinnsvis 3o til 8o°C, kan 1-, 3- og 24-stillingene i la,24-DHC benzoyleres i ett trinn.

Eksempler på substituerte eller usubstituerte benzoylgrupper

er benzoyl, p-brombenzoy, 2,4-dibrombenzoyl, p-klorbenzoyl og p-nitrobenzoylgrupper. Av disse er benzoyl og p-brombenzoyl-gruppene særlig foretrukket.

I 1-stillingen i la,24-DHC kan det sitte en fri hydroksylgruppe. Eksempler på beskyttelsesgrupper for denne er de ovenfor substituerte eller usubstituerte benzoylgrupper, acylgrupper (organiske karboksylsyrerester) eller grupper som er i stand

til å danne en eterbinding. Eksempler på slike acylgrupper er acetyl, propanoyl, butanoyl, pentaoyl, kaproyl, cykloheksa-noyl, kloracetyl og bromacetylgrupper. Eksempler på beskyttelsesgrupper som er i stand til å danne eterbindinger med hydroksylgruppene i 1-stilling en t-butylgruppe, en benzylgruppe en triarylgruppe såsom en trifenylmetylgruppe, en tetrahydropyranylgruppe, en metoksymetylgruppe eller en alkyl-substituert silyl-'gruppe såsom en trimetylsilylgruppe.

Ovenstående acylgrupper omfattende substituerte eller usubstituerte benzoylgrupper er foretrukket som beskyttelsesgrupper for hydroksylgruppen i 1-stilling.

For å atskille la,24-DHC i dets (S)-epimere og (R)-epimere omdannes la,24-DHC med formel (2-a) forst til et benzoylderivat av la,24-DHC uttrykt ved folgende formel hvori R"4, er en substituert eller usubstituert benzoylgruppe og R^ er et hydrogenatom eller en beskyttelsesgruppe som kan overfores til et hydrogenatom.

Dette benzoylderivat underkastes deretter kromatografi ved

å anvende en bærer som minst inneholder silicondioksyd (SiC^) for å dele det i en la,24(S)-epimer og en la,24(R)-epimer.

Disse epimerene er også nye forbindelser som ble syntetisert og atskilt med hell for forste gang av oppfinnerne i foreliggende oppfinnelse.

Bæreren som inneholder silicondioksyd kan, f.eks. være kiselgel, kiselsyre, kiselaluminiumgel, diatoméjord eller kaolin. Kiselgel, kiselsyre og kiselaluminiumgel bestående hovedsakelig av siliciumoksyd er spesielt anvendelige.

Kromatografi kan utføres på.forskjellige måter, såsom høytrykks-væske-kromatografi, tynnsjiktskromatografi eller kolonnekromatografi. Imidlertid er for atskillelse i stor skala kolonnekromatografi fortrinnsvis anvendt. Kolonnekromatografi utføres,

f.eks. ved å anvende kiselgel som bærer og n-heksan, benzen, etylacetat, metylenklorid eller eter som et utviklende oppløs-ningsmiddel for å oppnå de empimere i en ren form. Urene fraksjoner kan kolonnekromatograferes om igjen eller krystalliseres fraksjonert for å fjerne små mengder av forurensninger.

Vandrehastigheten for la,24(R)-DHC er hoy, mens vandrehastigheten for dets benzoylderivat er lav.

(4) Annet reaksjonstrinn (syntese av 5,7-dien-derivatet):

Ifolge denne syntesen blir la,24-DHC med formel (2-a) oppnådd ved reaksjonens forste trinn overfort til et beskyttet derivat av la, 3(3, 24-trihydroksycholesta-5, 7-dien etter beskyttelse av hydrogenatomene i hydroksygruppene il-, 3- og 24-stillingene med en beskyttelsesgruppe som kan overfores til et hydrogenatom eller atskillelse av la,24-DHC-benzoyl-derivatet av formel (2-b) i la, 24-(S)-epimeren og la, 24 (R)-epimeren, eller etter overforing av benzoylbeskyttelsesgruppene il-, 3- og 24-stillingene av formel (2-a) til andre beskyttelsesgrupper som kan overfores til hydroksygrupper.

Ifolge den metoden kan således minst en av de

beskyttete la, 3(3, 24(S)-trihydroksycholest-5, 7-dien-

derivatene og beskyttete la, 3(3, 24(R)-trihydroksycholesta-5, 7-dien-deriviatene (disse skal henvises til som 5,7-dien-derivatene for enkelthets skyld) av formelen

fremstilles ved å omsette minst ett av et beskyttet derivat av la,24(S)-dihydroksycholesterol og ett beskyttet derivat av la,24(R)-dihydroksycholesterol av den folgende formel

hvori R'4/R,5°g R'6er identiske eller forskjellige og representerer en beskyttelsesgruppe som omdannes til et hydrogenatom uten

å forandre strukturen i folgende formel (3),

med et allylisk bromeringsmiddel i et inert organisk medium,

og så bringe reaksjonsblandingen i kontakt med et dehydrobromeringsmiddel.

Det er viktig at i det annet trinn av dannelsen av ovenstående 5,7-dien-derivater beskyttes hydroksylgruppene il-, 3- og 24-stillingene i la,24-DHC og dets epimere av formel (2).

Hvis det andre reaksjonstrinnet utfores uten beskyttelse av disse tre hydroksylgruppene i la,24-DHC, kan ikke oksydasjonen og dekomponering av hydroksylgruppene unngås og utbyttet av de onskede 5,7-dien-derivatene blir meget lavt.

Beskyttelsesgruppen kan være enhver beskyttelsesgruppe som er

i stand til å overfores til en hydroksygruppe il-, 3- og 24-stillingene uten å bryte cholesta-5,7-dien-skjelettet etter overforing til 5,7-dien-derivatet. Eksempler på slike beskyttelsesgrupper er vist nedenfor.

(1) Acylgrupper:

C^-C^2-alifatiske eller aromatiske karb<p>ksylsyrerester eller deres nitro-, halogen- og alkoksy-substituerte derivater, f.eks. acetyl,propanoyl, butanoyl, pentanoyl, kapronyl, cyklo-heksanoyl, kloracetyl, bromacetyl, benzoyl, p-brombenzoyl, p-nitrobenzoyl, etylbenzoyl og toluylgrupper. Av disse er acetyl, benzoyl og propanoylgrupper spesielt foretrukket. (2) Grupper som danner eterbindinger med hydroksylgrupper: En tert. butyl-gruppe, en benzylgruppe, en triarylmetyl-gruppe slik som en trifenylmetylgruppe, en tetrahydropyranylgruppe, en metoksymetylgruppe og en alkyl-substituert silylgruppe såsom trimetylsilylgruppe. Av de ovenstående beskyttelsesgruppene foretrekkes acylgruppene (1) spesielt, men oppfinnelsen er på ingen måte begrenset til dem.

Bromeringsmiddelet for allyl-stillingen kan være enhver forbindelse som vanligvis anvendes for bromering av en ally1-stilling, og f.eks. N-bromsuccinimid, 1,3-dibrom-5,5-dimetylhydrantoin og N-bromkaprolactam blir fortrinnsvis anvendt. Vanligvis er mengden av det allyliske bromeringsmiddelet 1 til 2 ekvivalenter ganger mengden av 5-enet av formel (2).

Reaksjonen forløper først mellom la,24-DHC av formel (2), fortrinnsvis en beskyttet la,24-DHC eller dets beskyttete epimere,

og det allyliske bromeringsreagenset i et inert organisk medium. Denne reaksjonen kan utføres fra romtemperatur til 140 .

Det inerte organiske mediet er et som ikke reagerer med bromeringsmiddelet. Med fordel er det f.eks. et hydrokarbon eller et halogenert hydrokarbon, såsom heksan, heptan, cykloheksan,

ligroin, benzen, toluen, xylen, brombenzen, klorbenzen, nitrobenzen, karbontetraklorid, 1,2-dikloretan eller 1,2-dibrometan.

Et eteropplosningsmiddel slik som etyleter, tetrahydrofuran, dioksan, metylcellosol eller fenylcellosol kan også anvendes. Disse inerte organiske opplosningemidlene kan anvendes alene

eller i blandinger.

Reaksjonen forldper ved temperaturen ovenfor. Om onsket kan reaksjonen utfores under bestråling med aktinisk lys med en bolgelengde svarende til fra infrarodt til ultrafiolette stråler. I dette tilfellet forldper reaksjonen ved en lavere temperatur enn romtemperatur. En radikal initiator som azobi-sisobutyronitril, benzoylperoksyd eller cykloheksylhydroperoksyd kan også tilsettes i en liten mengde.

Dehydrobromeringsmiddelet er fortrinnsvis trimetylfosfit, s-collidin eller dietylanilin og de kan anvendes i blanding. Teoretisk forløper reaksjonen fullstendig når mengden av dehydrobromeringsmidlet er ekvimolart med det bromerte produktet som oppnåes ved foregående bromeringsreaksjon, men for å sikre ønsket grad av reaksjon og utbytter, anvendes dehydro-bromeringsmidelt fortrinnsvis i en mengde på minst rundt 2 ganger molar mengden av bromert produkt. Siden dehydrobromeringsmidlet også tjener som reaksjonsmedium, er det ingen særlig øvre begrensning av mengden av dette.

Vanligvis forldper reaksjonen tilfredsstillende ved en temperatur på 80til 25o°C, fortrinnsvis 12o til 18o°C. Reaksjonstiden varierer avhengig av typen av dehydrobromeringsmiddel,

typen av reaksjonsopplosningsmiddel, etc. F.eks. i en foretrukket utforelse hvor reaksjonen utfores under tilbakelop i et xylen-s-collidinsystem, er reaksjonen fullstendig innen en

kort tid på rundt 2o min.

Etter reaksjonens slutt blir opplosningsmidlet destillert

av under redusert trykk for å gi et oljeaktig rått 5,7-dien-derivat.

(5) Tredje reaksjonstrinn (rensing av rått 5,7-dien- derivat): Som ovenfor angitt er en metode for fremstiIling av la-hydroksycholesterol(la-HC) av formel

allerede kjent (D.H.R. Barton et al, J. Am. Soc., 95, 2748, 1973). Det har altså vært kjent at ovenstående la-hydroksycholesterol (la-HC) blir overfort til la,3p-diacetoksycholesta-5,7-dien av formel

hvori Ac er CH3CO-,

ved samme reaksjon som i det andre trinnet i foreliggende beskrivelse ovenfor beskrevet, og dette produktet blir så termisk omdannet ved bestråling med ultraviolette stråler for å overfore det til la,3p-diacetoksycholecalciferol (vitamin D-derivat) av formelen

Oppfinnerne forsokte derfor termisk å omdanne 5,7-dien-derivatet av formel oppnådd i annet trinn ved direkte bestråling med ultrafiolette stråler ved metoden kjent i sammenheng med syntesen av la,3J3-diacetoksycholecalciferol av formel (B-l), men det onskede la,24-dihydroksycholecalciferol-derivat av formelen

hvori R^, R,- og R^er de samme som definert i

formel (2),

kunne ikke isoleres.

Oppfinnerne antok at det er fordi 5,7-dien-derivatet med formel (3) er urent og antagelig inneholder et

4,6-dien-derivat av formelen

hvori R^, R,, og R^er det samme som ovenfor angitt.

Ut fra denne antagelse forsokte oppfinnerne å rense det rå 5,7-dien-derivatet som var dannet og atskilte i annet trinn ovenfor beskrevet ved kjent adsorpsjonskromatografi ved anvendelse av kiselgel som adsorbent, dvs. tynnsjiktskromatografi eller kolonnekromatografi, men ingen av disse kromatografiske metodene kunne atskille 4,6-dien-derivat av formel (6)

fra det rå 5,7-dien-derivatet av formel (3).

Et eksempel er kjent hvor kromatografi som benytter solvnitrat ble anvendt for å atskille og rense acetoksycholesta-5,7-diener (Tetrahedron Letters, nr. 4o, 4147, 1972 og Tysk OLS 2.4oo.931).

Således kom oppfinnerne på å anvende ovenstående solvnitrat-kromatografi på ovennevnte rå 5,7-dien-derivat av formel (3) og forsokte å rense det rå 5,7-dien-derivatet ved kolonne-kromatograf i ved anvendelse av 2% solvnitrat-kiselgel.

Men forsoket mislyktes og 4,6-dien-derivatet kunne ikke separeres.

Forskjellige påfolgende undersokelser over rensemetoder for

det rå 5,7-dien-derivatet forte til slutt til oppdagelsen at det fri 5,7-dienet kan atskilles meget godt fra det frie 4,6-dienet og andre forurensninger ved kromatografiske metoder som består av avspaltning av beskyttelsesgrupper fra det rå 5,7-dien-derivatet av formel (3) for å overfore dette til la, 3j3 , 24-trihydroksycholesta-5, 7-dien C det frie 5,7-dienet),

av formelen

og bringe det i kontakt med en bærer som inneholder silisium-dioksyd og hvortil er adsorbert ikke-metallisk solv.

Denne renseprosessen kan anvendes ikke

bare på det rå beskyttede 5,7-dien-derivatet som ble oppnådd i annet trinn,men også på 5,7-dien-derivat i form av 24(S)-epimer

eller 5,7-dien-derivatet i form av 24(R)-epimer. I hvert fall er det viktig at et slikt råprodukt underkastes renseprosessen i denne oppfinnelsen etter avspaltning av beskyttelsesgruppene il-, 3- og 24-stillingene for å overfore det til det frie 5,7-dienet av formel (3-a).

Egnede bærere som inneholder siliciumdioksyd og har adsorbert derpå ikke-metallisk solv er kiselgel og kiselaluminiumoksyd-

gel som inneholder eller har vedhengt derpå solvnitrat.

Kiselgel er spesielt fordelaktig.

Slik kiselgél fremstilles f.eks. ved å opplose solvnitrat i

vann eller et egnet organisk opplosningsmiddel, slik som acetonitril eller alkoholer, blande opplosningen med kiselgel og så avdampe losningsmidlet fra blandingen. Når det anvendes til kolonnekromatografi, blir det aktivert om onsket og fyllt i en glass-soyle. Når det anvendes for tynnsjiktskromatografi innlemmes et egnet bindemiddel, slik som gips eller stivelse 1 kiselgelen fremstilt som ovenfor, og, om onsket,tilsettes også er fluorescerende middel og blandingen spres på en egnet plate (glass eller polyesterfilm) i en tykkelse på o,2 -

2 mm, fikseres og aktiveres.

For å impregnere solvnitratet i en tynnsjiktskromatografi-

plate laget av bare kiselgel, neddykkes platen i en opplosning av solvnitrat i et organisk opplosningsmiddel ( f.eks.

acetonitril eller en alkohol) i en egnet konsentrasjon, torkes og aktiveres.

Mengden av anvendt sølvnitrat er gjerne 0,1 til 20 vekt-%

basert på silikagelen, spesielt foretrukket 0,5 - 10 vekt-%.

Når mengden sølvnitrat er mindre enn 0,1 vekt-% eller større enn 2 0 20 vekt-%, blir atskillelsesevnen dårlig. I siste tilfelle er sølvnitrat anvendt forgjeves.

Eksempler på et fremkallende opplosningsmiddel eller et

eluerende opplosningsmiddel anvendt ved tynnsjiktskromatografi eller kolonnekromatografi er organiske oppløsningsmidler såsom cykloheksan, n-heksan, benzen, toluen, kloroform, 1,2-diklormetan,

1,2-dikloretan, aceton, dietyleter, tetrahydrofuran, etylacetat, metanol, etanol, og propanol og blandinger av disse.Blant disse er blandinger av lavkokende opplosningsmidler såsom n-heksan, benzen, klororform, aceton, etylacetat eller metanol spesielt egnet. Egnede blandingsforhold kan lett bestemmes eksperimentelt.

Metodikken for utvikling, eluering og påvisning kan utfores tilfredsstillende i overensstemmelse med konvensjonelle kromatografiske teknikker.

Oppfinnerne fant at som et resultat av anvendelsen av denne rensemetoden inneholder det rå 5,7-dien-derivatet oppnådd i et annet trinn 4, 6-diener i et vektsforhold på ca. 1/2 til 1/4 basert på det rensede 5,7-dienet. En så stor mengde av 4,6-dien kan atskilles og fjernes praktisk fullstendig fra 5,7-dienet ved rensemetoden.

Det er funnet at denne rensemetoden gjor det mulig å oppnå

det frie 5,7-dienet ovenfor lett i hoy renhetsgrad og utbytte og at det som skal beskrives nedenunder kan dette 5, 7-dienet, enten som sådan> eller etter beskyttelse av minst én av hydroksylgruppene i dets 1-, 3- og 24-stillinger med samme beskyttelsesgruppe som ovenfor beskrevet, overfores til la,24-dihydroksycholecalciferol eller dets beskyttete derivat ved bestråling med ultrafiolette stråler og så omleiring (isomerisering).

Det antas derfor at rensemetoden i det tredje trinnet er av meget stor kommersiell verdi.

(6) Fjerde trinn (syntese av la,24-cholecalciferol) Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles

ved at la, 33, 24 (S)-trihydroksycholesta-5,7-dien, la, 3|3, 24 (R) - trihydroksycholesta-5,7-dien eller derivater derav med formel

hvor R^, R£og R^, som er like eller forskjellige, hver betyr et hydrogenatom eller en beskyttelsesgruppe som kan avspaltes, utsettes for ultraviolett bestråling i et inert organisk løsnings-middel, hvoretter det resulterende produkt isomeriserer, og om nødvendig hydrolyserer eller reduktivt avspalter beskyttelsesgrupper R^, R2og R^som foreligger.

Det fri 5,7-dienet eller dets beskyttede derivat med formel

(3 kan være la, 3(3, 24 (S)-trihydroksycholesta-5, 7-dien eller dets beskyttede derivater, eller la, 3|3 , 24 (R) -trihydroksycholesta-5,7-dien eller dets beskyttede derivater eller blandinger av disse tilfeldige forhold og disse kan overfores til la,24(S)-typen, la,24(R)-typen eller blandet type dihydroksy-cholecalciferol eller dets beskyttede derivater ved fremgangsmåten for fjerde trinn i denne oppfinnelsen.

R1#R2og/eller R3i formlene (3) og (5) er beskyttelsesgrupper, de kan være samme beskyttelsesgrupper som R'4/R'5og/eller R'6

i formel (2). Det rensede la , 3(3, 24-trihydroksycholesta-5, 7-dienet av formelen (3) kan omdannes til sitt beskyttede deri-

vat ved samme metode som beskrevet forut under atskillelsen av la,24-DHC i sine (S)- og (R)-epimere i paragraf (3) ovenfor.

I det fjerde trinn i denne oppfinnelsen er imidlertid anvendelse av et renset fritt 5, 7-dien hvor alle R^^/R^ og R^i formelen (3) er hydrogenatomer mer fordelaktig enn av deres beskyttede derivater. Siden la,24-dihydroksycholecalciferol av den folgende formel

er en såkalt analog av aktive former av vitamin D^muliggjbr anvendelsen av renset fritt 5,7-dien av formel (3-b) direkte fremstilling av analogen av aktiv form av vitamin D av formel (5) På den annen side når det beskyttede derivatet av formel (3) benyttes, er to ekstratrinn nodvendige for beskyttelse av hydroksygruppene av det rensede frie 5,7-dienet og avspaltning av beskyttelsesgruppen fra det resulterende beskyttede la,24-dihydroksycholecalciferol. Særlig innbefatter avspaltningen av beskyttelsesgruppene en delvis spaltning eller nedbrytning av la, 24-dihydroksycholecalcif erol.

Også av denne grunn er renseprosessen i tredje trinn en meget fordelaktig rensemetode.

Det rensede 5,7-dienet eller de beskyttede derivater av formelen (3), fortrinnsvis renset fritt 5,7-dien, omdannes ifølge foreliggende oppfinnelse til la,24-dihydroksycholecalciferol eller dets beskyttede derivat av formelen (5) ved først å bestråle med ultrafiolette stråler det frie rensede 5,7-dienet eller dets beskyttede derivat i et inert organisk opplosningsmiddel.

De ultrafiolette strålene er de som er kjent å ha en bølge-lengde fra ca. 2oo til 36o nm og i foreliggende oppfinnelse er de som har en bblgelengde fra 26o - 31o nm

spesielt foretrukket.

Eksempler på inerte organiske opplosningsmidler som anvendes

i dette trinnet er hydrokarboner eller halogenerte hydrokarboner, såsom heksan, heptan, cykloheksan, ligroin, benzen, toluen, xylen, brombenzen, klorbenzen, nitrobenzen, karbontetraklorid, 1,2-cykloetan eller 1,2-dibrometan, etere slik som dietyleter, tetrahydrofuran, dioksan, metyl, cellosol eller fenylcellosol, og alkoholer slik som metanol, etanol, propanol, heksanol eller cykloheksanol. Benzen, toluen, dietyleter, metanol og etanol, enten alene eller som blandinger, er spesielt foretrukket anvendt i denne oppfinnelsen, Hvis et slikt opplosningsmiddel benyttes kan påfolgende isomeriseringsreaksjon som skal beskrives utfores i samme opplosningsmiddel etter ultrafiolett bestråling.

Egnede temperatur for ultrafiolett bestråling er 12o°C til 8o°C, spesielt -lo° til 2o°C. Fortrinnsvis utfores bestrålingen i en oksygenfri inert atmosfære slik som en argon eller nitrogen atmosfære.

Det antas at som et resultat av ultrafiolett bestrålingen

blir 9, lo-stillingene av la, 3(3, 24-trihydroksycholesta-

5,7-dien eller dets derivat spaltet til å gi la,24-dihydroksy-precholecalcif erol-derivat som et hovedprodukt.

Isomeriseringen av precholecalciferolet gir la,24-dihydroksycholecalcif erolderivat av formelen (5).

Temperaturen i tidsrommet for isomeriseringsreaksjonen er ikke viktig for utforelsen av selve reaksjonen.

la,24-dihydroksyprecholecalciferolderiraatet og la,24-dihydroksycholecalcif erolderivatet viser en viss likevekts-verdi som er forskjellig avhengig av temperaturen, og med lavere temperaturer er det en tendens til okende andeler av den siste. Imidlertid viser det seg ved lavere temperaturer at overforingshastigheten til den siste har tendens til å

bli langsommere. Folgelig kan temperaturen fastlegges ved betraktning av likevektsverdien og omdannelseshastigheten.

På denne måten er temperaturen ikke essensielt viktig for gjennomføringen av reaksjonen selv.

Under aktuelle utforelser tas disse punkter i betraktning,

og isomerisasjonstemperaturene på lo til 12o°C, fortrinnsvis 4o til loo°C, benyttes.

Etter bnske utfores isomerisasjonen vanligvis i et inert organisk opplosningsmiddel. Hvis dette samme foretrukne opplosningsmiddel som ovenfor beskrevet anvendes, kan det også tjene som opplosningsmiddel for isomerisasjonsreaksjonen.

Således dannes la,24-dihydroksycholecalciferolet eller dets beskyttete derivater av formelen 5.

Når beskyttelsesgrupper! i det beskyttede derivatet av en la, 24-dihydroksycholecalcif erol er en acylgruppe, kan det ifølge oppfinnelsen bli spaltet av ved deacylering ved anvendelse av en metode san omfatter spaltning i en alkalisk opplosning av en alkohol slik som metanol eller etanol, eller en metode som består av reduktiv spaltning med LiAlH^,f.eks. i et opplosningsmiddel slik som eter. Fortrinnsvis utfores deacyleringen ved en temperatur på -lo° til 5o°C.

Når beskyttelsesgruppen danner en eterbinding med hydroksylgruppen, kan en del av den ifølge oppfinnelsen lett fjernes ved reduksjon eller ved kontakt med en syre eller alkali.

Avspaltning av beskyttelsesgrupper utfores fortrinnsvis direkte

1 reaksjonsblandingen som oppnås i det fjerde trinnet.

la, 24-dihydroksycholecalcif erol sem således dannes, kan atskilles

og renses ved kolonnekromatografi, preparativ tynnsjiktskromatografi, hoyttrykks væskekromatografi eller omkrystallisasjon.

Det er også mulig å benytte kromatografi ved å anvende en bærer

som inneholder siliciumdioksyd hvorpå er adsorbert ikke-metallisk sblv som nevnt i forbindelse med rensning av det rå 5,7-dienet, f.eks. kiselgel inneholdende solvnitrat. la,24-dihydroksycholecalcif erol med hoyere renhet kan isoleres ved å kombinere 2 eller flere av disse rensemetodene.

(7) Farmakologiske virkninger av produktene som fremstilles ifølge denne oppfinnelsen: la,24-dihydroksycholecalciferolet (la,24-DHCC) av formel (5-a) erholdt ved metoden for foreliggende oppfinnelse beskrevet ovenfor, mer spesifikt (i) la,24 (S)-dihydroksycholecalciferol, (ii) la,24(R)-dihydroksycholecalciferol, eller (iii) en blanding av dihydroksycholecalciferolene (i) og (ii) i fritt valgte forhold er en ny forbindelse som med hell ble syntetisert og isolert av oppfinnerne i foreliggende soknad. Disse forbindelsene er vitamin D^-analoger som har overlegne virkninger og deres toksisitet er lav.

Det er tidligere vært kjent at la,25-dihydroksycholecalciferol (la,25-DHCC) og la-hydroksycholecalciferol (la-HCC) har utmerkede

aktiviteter som analoge av aktive former av vitamin D^.

Nylig ble det oppdaget at la-HCC har en meget hoy toksisitet

og dets bivirkninger blir et problem ved kontinuerlig behandling. Ingen toksisitetsdata er blitt tilgjengelige for la,25-DHCC,

men fra forskjellige tilgjengelige data fremgår det at det er minst så toksisk som la-HCC.

Et formål for foreliggende oppfinnelse er å redusere toksisiteten

1 forhold til lo,-HCC. la,24,25-trihydroksycholecalciferol (la, 2 4,2 5-THCC) funnet in vivo viser seg å ha en temmelig selektiv, men ikke så sterk, fremkallende virkning på intestinalkalsiumtransport. Hvis la,24-DHCC-epmirblandingen, la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHVCC (disse skal generisk kalles la,24-DHCC) blir videre metabolisert in vivo, er det meget sannsynlig at la,24-DHCC blir overført til la,

24,25-THCC. Dette antyder at virkningen av la,24-DHCC-epimerbland-ingen, la,24(R)-THCC og la,24(S)-DHCC kan være selektiv. la,24-DHCC er en ny forbindelse som ennå ikke er funnet in vivo og ventes fullt ut å ha en ganske ny virkning.

Det ble foretatt en sammenlignende studie av aktivitetene til de nye forbindelsene med hensyn til la-HCC og fant at disse nye forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, som det skal vises i følgende eksempler, hadde minst en ekvivalent virkning til la-HCC på intestinal kalsiumtransport, deres virkning på benresorp-sjonen er mindre enn rundt en tredjedel av virkningen av la-HCC,

og at deres LD^q verdier er mindre enn rundt 1/10 av den for la-HCC. Det er særlig klarlagt at la,24(S)-DHCC har en noe svakere virkning som fremkaller av intestinal kalsiumtransport enn la,24(R)-DHCC, men nesten ikke utviser noen benresorpsjon.

Følgelig kan la,24-DHCC anvendes som en enestående medisin som

har nedsatte bivirkninger og høy sikkerhet sammenlignet med kjente analoger av aktive former av vitamin D3når de anvendes f.eks. ved sykdom.som er indusert av abnormal kalsiummetabolisme. Farmakologiske prøver som er utført har gjort det klart at forskjellige optimal farmasøytiske preparater kan dannes i sammenheng med forskjellige sykdomsbetingelser.

Det er blitt funnet som et resultat av de farmakologiske provene at egnede doser av de ovenfor nevnte nye aktiverte vitamin D^-derivatene ved kliniske anvendelser er rundt o,o4 til o,4 p.g (96,2 til 962 p mol) pr. kilogram kroppsvekt.

la,24-DHCC forbindelsene av formel (5) har potensiell anvendelse på forskjellige kliniske og veterinærmedisinske felter,

og er nyttige ved behandling av abnormal metabolisme av kalsium og fosfor forårsaket av leversvikt, nyresvikt, mage/tarm-svikt og parathyroidsvikt og beslektede bensykdommer slik som vitamin-D-avhengig rakitt, nyreosteodystrofi, hypoparathyroidisme, osteoporose, osteomalsi, Pegets sykdom, malabsorpsjons syndrom, hypocalcemi fremkalt ved levercirrhose, hypocalcemia fremkalt ved steatorrhoea, hypocalcemi forårsaket av vitamin-D-resistent rakitt. Disse forbindelser ventes å være sikrere medisiner enn de kjente la-HCC og la,25-DHCC. Det er også mulig å anvende en blanding inneholdende minst én av la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC sammen med andre kalsiummetabolisme-regulerende reagenser. For eksempel kan det anvendes ved behandling av Pagets sykdom i kombinasjon med calcitonin.

Passende inntaksveier omfatter oral administrasjon, bukal og parenteral (intramuskulær, subkutan, intravenos og rektal) administrasjon. Doseringsformene er f.eks. sammentrykkede tabletter, overtrukne tabletter, harde eller blote elastiske gelatinkapsler, etylalkoholopplosninger, oljeopplosninger og vandige suspensjoner.

Opplosningsmidlet for oljeopplosning kan være en vegetabilsk olje, slik som en mais, bomullsfro, kokosnott, mandel eller peanottolje, en fiskeleverolje eller en oljeaktig ester slik som "Polysorbat 80".

For rektal administrering kan forbindelsne formuleres som en farm-asøytisk blanding inneholdende en suppositoriebase slik som kakao-olje eller andre triglycerider. For å forlenge lagringsevnen innbefatter komposisjonen med fordel en anti-oksydant slik som as-corbinsyre, butylert hydroksyanisol eller hydrokinon.Forblandinger for husdyr som inneholder la,24-DHCC fremstilt ifolge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i mengder som ikke forårsaker toksisitet for å unngå hypocalcemi hos kuer i nedkomsttiden eller nær nedkomsttiden eller unngåelse av hypocalcemi hos huådyr uten hypocalcemihistorie. Når disse forbindelsene gis til fjærkre gjennom eggkanalen,

er det mulig å hindre at de legger blotskallede egg. Dette utgjor et videre karakteristikum for la, 24-DHCCsom fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse.

De folgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse nærmere.

Undersøkelsesmetodene som ble anvendt i disse eksemplene for bestemmelse av karakteristika hos sluttproduktene, varsem følger:

Med mindre annet er angitt,ble NMR-spektrene opptatt på Varian

EM 36o eller JEOL PS/PFT-loo (Nippon Electronics Co., Ltd.)

i deuterokloroform (CDCl^) ved anvendelse av tetrametylsilan som intern standard.

Massespektra og hdyopplosningsmassespektra ble opptatt på 'Shimadzu LKB-9ooo"( varemerke for et produkt fra Shimazu Seisakusho Co., Ltd.).

UV-spektret ble tatt opp på "Hitachi EPS-3T ( vare-merke for

et produkt fra Hitachi Limited) under anvendelse av etanol-opplosning.

Smeltepunkt ble målt på et smeltepunktsmikroskop og de resulterende verdier ble ikke korrigert.

Den absolutte konfigurasjonen av la,24-dihydroksycholesterol

ble bestemt som folger:

En epimerblanding av 24,24-epoksycholesterol-3-benzoat,

dvs. en blanding av

hvori Bzrepresenterer en benzoylgruppe,

blir kromatografert ved bruk av kiselgel som bærer for å

atskille og å gjenvinne de to epimere. Hver epimerene blir underkastet metanolyse for å gi et 24-OH-derivat og et 25-OCH^-derivat. Metoden for bestemmelse av absolutt konfigurasjon av de to empimere ved anvendelse av den modifiserte Horeans metode, som er fremlagt i Tetrahedron Letters, 1, 15, 1975

ble anvendt. Ved å redusere de to epimere hvis absolutte konfigurasjon således er blitt bestemt ved et AlCl^-LiAlH^-system, oppnås et 24(R)-hydroksy-derivat av 24(R),25-epoksy-

derivatet og et 24(S)-hydroksyderivat oppnås fra 24(S),25-epoksy-derivatet. Siden det er kjent at det siste S-derivatet er mer polart enn det forste.R-derivatet, antas det at dette faktum også kan anvendes på la,24-dihydroksycholesterol. Således omdannes dette la,24-dihydroksycholesterolet til sitt tribenzoat-eller dibenzoat-derivat som så kromatografers gjennom en kiselgelkolonne. Således blir en mer polar epimer omdannet til et la,24(S)-derivat og en mindre polar epimer, til et la,24-(R)-derivat.

Hvor det i foreliggende søknad ikke er noen spesifikk angivelse av et R-derivat eller et S-derivat, f.eks. når angivelsen bare er til la,24-DHCC, betyr det en ekvimolær blanding av la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC.

EKS EMPEL 1

(A) Syntese av utgangsmatearialet.

la,2a-epoksy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on ble fremstilt

ved de folgende tre trinn (1) til (3).

(1) Syntese av 24-ketocholesterol fra fucolsterol:

Fucosterol (4,1 g) ble opplost i loo ml metylenklorid

og mens opplosning ble avkjolt med torr isaceton til ca. -2o°C, ble fucosterolet oksydert i 3o minutter med ozon ved en generasjonshastighet på o,86 g/t og i en konsentrasjon pa • 17,2 g/m 3 (O,,) . Etter reaksjonen ble 2oo ml eddiksyre tilsatt, og det resulterende ozonidet ble reduktivt dekomponert ved romtemperatur i 24 timer. Den resulterende sinkacetatet ble separert ved filtrering, og vasket med en vandig opplosning av natriumkarbonat. Metylenkloridfasen som var blitt separert ble vasket grundig med vann og torket med vannfri natriumsulfat. Metylenkloridet ble avdampet ved redusert trykk, og de resulterende hvite krystallene ble kolonnekromatografert ved anvendelse av silikagel som en bærer ( eluert med et benzen-n-heksan blandet opplosningsmiddel) for å gi 2,8 g 24-ketocholesterol i utbytte på 7o,3%.

(2) Syntese av 24-ketocholesta-l,4,6-trien-3-on fra

24-ketocholesterol:

4,o g 24-ketocholesterol og 7,o g 2,3-diklor-5,6-dicyanobenzo-kinon ble opplost i 14o ml dioksan og oppløsningen ble rort under tilbakelop av dioksan i 27 timer. Etter reaksjonen ble reaksjonsblandingen avkjolt til romtemperatur. Det resulterende hydrokinon-derivatet ble separert ved filtrering og vasket med 3o ml dioksan. Filtratet og vaskevæsken ble forent og dioksan ble avdampet ved redusert trykk for å gi en svartbrun oljeaktig substans.

Den oljeaktige substansen ble separert og renset ved kolonne-kromatograf i ved anvendelse av aluminium som bærer (eluert med eti metylenklorid-aceton blandet opplosningsmiddel) for å gi 2,76 g 24-ketocholest-l,4,6-trien-3-on som krystaller. Analyse av produktet viste de folgende resultater.

NMR-spekter:

o,86 (3H, s, C-18-CH3),

l,2o (3H, s, C-19-CH3),

1,15 (6H, d, J=lo Hz, C-26,27-CH3),

5,95 - 6,lo (3H, m, C-4,6,7-H),

6,29 (1H, dd, J=ll, 15 Hz, C-2-H),

7.lo (1H, J=ll Hz, C-l-H)

Molekylvekt (ved gassmålespektrum):

394 (M<+>) (3) Syntese av la,2a-epoksy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on fra 24-ketocholesta-l,4,6-trien-3-on: 3,53 g 24-ketocholest-l,4,6,-trien-3-on ble opplost i en blanding av loo ml metanol, 2o mltetrahydrofuran og 5o ml dioksan og 1,6 ml av en 5 vekt-% metanolopplosning av natriumhydroksyd og 5 ml av 3o% vandig hydrogenperoksyd ble tilsatt. Reaksjonen ble utfort ved romtemperatur i 24 timer. Etter reaksjonen ble en liten mengde eddiksyre tilsatt for å nøytralisere opp-løsningen til en pH på 7. Reaksjonsblandingen ble så ekstrahert ved tilsetning av vann og eter. Eterfasen ble grundig vasket med vann og torket med vannfritt natriumsulfat. Eteren ble avdampet ved redusert trykk for å gi 4,o4 g av et lys gult faststoff. Det faste produktet ble kolonnekromatografert ved anvendelse av silikagel (eluert med et benzen-eter blandet opplosningsmiddel) for å gi 2,52 g la,2a-epoksy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on som viste de folgende karakteristika.

Smeltepunkt: 15o - 151,5°C.

UV-spekter: ?v.etano1 291 nm

Massespektrum, hby opplosning:

Funnet = 41o.2793

Beregnet(M<+>) = 41o.2821 (C2?<H>38<03>)

NMR-spekter:

o,8o (3H,s, C-18-Hs),

1,15 (3H, s, C-19-Hs),

3,43 (1H, dd, J =4Hz, J=15Hz, C-2-H)

3,6o (1H, d, J=4Hz, C-l-H),

5,68 (1H, d, J=l,5Hz, C-4-H)

6.lo (2H, s, C-6, C-7-Hs).

(B) Syntese av la,24-dihydroksycholesterol ifolge foreliggende oppfinnelse ( det forste trinnet).

Flytende ammoniakk (lo ml) torket med metallisk natrium ble felt i en tre-halset flaske utstyrt med en dråpetrakt og en torr iskjoler mens flasken blir avkjolt med et kjoiende medium omfattende aceton og torris. Metallisk litium (15o mg) ble tilsatt til den flytende ammoniakken og de ble omrort i lo minutter. Blandingen ble opplost i 15 ml tetrahydrofuran og loo mg la,2a-epoksy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on ble tilsatt dråpevis i lopet av lo minutter.

Etter tilsetningen ble flasken atskilt fra det kjolende medium, og ammoniakk ble tilbakelopsbehandlet i 2o minutter. Igjen ble flasken neddykket i kjolemediet og 1,5 g av et fullstendig tort pulver av ammoniumklorid ble tilsatt sakte i lopet av 2 timer. Flasken ble tatt bort fra kjolemediet og reaksjonen fortsatt med omroring..

Roringen ble stoppet når den blå fargen til opplosningen

var fullstendig forsvunnet. Kjoleren ble fjernet fra flasken og nitrogengass ble introdusert for å fjerne ammoniakken.

Etylacetat (6o ml) og 6o ml lN-hydroklorsyre ble

tilsatt til resten for å underkaste det distributiv ekstrak-sjon. Etylacetatfasen som ble fraskilt, ble vasket grundig med vann og torket, etterfulgt av avdamping av etylacetatet ved redusert trykk. Resten ble opplost i 3 ml etylacetat og kromatografert ved en kolonne inneholdende silikagel som en bærer under anvendelse av et elueringsopplosningsmiddel bestående av en blanding av benzen og aceton. Det ble erholdt 61 mg av et renset produkt med de folgende karakteristika.

NMR-spekter ( i C5D5N) , '?(ppm) :

o,7o (3H, s, 18-CH3),

o,99 (3H, s, 19-CH ),

3,28 (4H, m, 24-H og hydroksy H),

3,82 (1H, m, 1|3-H) ,

4,oo (1H, m, 3cc-H) ,

5,5o (1H, m, 6-H)

Massespektrum ( se fig. 1):

418 (M<+>), 4oo, 382

Massespekter, hoy oppløsning:

Funnet=418,3428

Krevet, M<+>(C27H4603) = 418,3449

Fra de ovenfor viste karakteristika ble det resulterende produktet identifisert som la,24-dihydroksycholesterol.

EKSEMPEL 2

Syntese av la,24-dihydroksycholesterol ( 1. trinn):

Flytende ammoniakk (15 ml) torket med metallisk natrium ble

feilt i en tre-halset flaske utstyrt med en dråpetrakt og en torris-kjoler mens flasken blir avkjolt med et kjolemedium av aceton og torris. Deretter ble 4oo mg metallisk natrium tilsatt til den og disse ble rort i lo minutter. Blandingen ble så opplost i 18 ml tetrahydrofuran og loo mg la,2a-epoksy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on ble tilsatt dråpevis i lopet av lo minutter.

Etter tilsetningen ble 1,8 g av et pulver av ammoniakk-klorid tilsatt i lopet av 1 time på samme måte som i eksempel 1. Reaksjonsblandingen ble behandlet på samme måte som i eksempel

1 og 69 mg (utbytte 68%) av et produkt som viste de samme NMR-spektrum, massespektrum og hoyt opplosningsmassespektrum

som i eksempel 1 ble erholdt. Dette produkt ble identifisert som la,2a-24-dihydroksycholesterol.

EKSEMPE L 3

(A) Syntese av la,24-dihydroksycholesterol-tribenzoat:

1,25 g la,24-dihydroksycholesterol ble blandet med 1,55 g

benzoylklorid og 2o ml pyridin og de ble omsatt ved 4o°C i en dag.

Vann (5 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen og den ble ekstrahert med 5o ml dietyleter. Eterfasen ble vasket med en syre og så med en alkali, torket og inndampet for å fjerne eteren for å få rått la, 3(3, 24-tribenzoyloksycholest-5-en. (B) Separasjon av 24(R)-derivat og 24(S)-derivat av la, 3j3, 24-tribenzoyloksycholes-5-en: En n-heksan-opplosning av 1,58 g av det råe la, 3(3,24-tribenzoyl-oksycholest-5-en ble kromatografert ved en kolonne inneholdende loo g silikagel som en bærer for å dele det i fraksjoner på hver et volum på 5o ml. Man forsikret seg om renheten av hver av fraksjonene ved hoytrykksflytende kromatografi og de tilsvarende fraksjoner ble kombinert og opplosningsmiddelet ble dampet av. To epimere med de folgende NMR-spektra ble erholdt. En mindre polar epimer (5oo mg) eluert på et tidligere trinn var 24(R)-derivatet, og en mer polar epimer (49o mg) eluert på et trinn mot slutten var 24(S)-derivatet.

NMR-spektra av la, 3(3 , 24 (R)-tribenzoyloksycholes-5-en:

o,65 (3H, s, C-18),

o,92 (3H, s, C-21),

l,ol (6H, b,s, C-25, 26),

l,2o (3H, s, C-19),

5.00(1H, m, C-24),

5,2o (1H, m, C-3),

5,44 (1H, m, C-l),

5,7o (1H, m, C-6),

7,5 (9H, m, benzoyl),

8.1 (6H, m, benzoyl).

NMR-spektret av la, 3|3 , 24 (S)-tribenzoyloksycholest-5-en:

o,63 (3H, s, C-18).

Andre spektrumdata er de samme som dem til 24(R)-derivatet.

EKSEMPEL 4

(A) Syntese av la,24-dihydroksycholesterol-dibenzoat:

2,5 g la,24-dihydroksycholesterol ble blandet med 2,lo g

benzoylklorid og 4o ml pytidin, og blandingen fikk stå

i en dag ved 2o°C.

Reaksjonsblandingen ble behandlet på samme måte som i

eksempel 3 (a) for å erholde rått la-hydroksy-3[3,24-dibenzoyl-oksycholest-5-en.

(B) Separasjon av 24(R)-derivat og 24(S)-derivat av la-hydroksy-3(3, 24-dibenzoyloksycholest-5-en: 2,1 g rått la-hydroksy-3p,24-dibenzoyloksycholest-5-en ble kromatografert ved en kolonne inneholdende 3o g silika-

gel under anvendelse av et elueringsopplbsningsmiddel bestående av 2oo:l blanding av benzen og etylacetat for å dele det i fraksjoner med hver et volum på 5o ml. Hver av fraksjonene ble underkastet hoytrykks flytende kromatografi for å forsikre seg om deres renhet. De tilsvarende fraksjonene ble kombinert, og opplosningsmiddelet ble avdampet for å danne to epimere med de folgende NMR-spektrumdata.

En mindre polar epimer ( 5oo mg, smp. 168-169°C.)

tear 24(R)-derivatet og en mer polar epimer (6oo mg, smp. 139,5-14o,5°C) var 24(S)-derivatet.

NMR-spekteret av la, hydroksy-3(3, 24 (R) -dibenzoyloksycholest-5-en: o,67 (3H, s, C-18),

o,96 (6H, b,s, C-19,21),

l.oo (6H, d, J=6Hz, C-25,26),

3,96 (1H, m, C-l),

5,o6 (1H, m, C-24),

5,36 (1H, m, C-3),

5,71 (1H, m, C-6),

7,52 (6H, m, benzoyl),

8,12 (4H, m, benzoyl).

NMR-spektrum av la-hydroksy-3[3, 24 (S)-dibenzoyloksycholest-5-en:

o,7o (3H, s, C-18)

Andre spektrum-data er de samme som de til 24(S)-derivatet.

EKSEMPEL 5

(A) Syntese av la,3(3,2 4-triacetoksycholest-5-en:

3oo mg av la,24-dihydroksycholesterol ble reagert med 4o ml eddik-eyreanhydrid og 125 ml pyridin i 3 timer ved 95°C. Reaksjonsblandingen ble behandlet på samme måten som i eksempel 3, (A) for å gi rått la, 3(3, 24-triacetoksycholest-5-en. Råproduktet ble kromatografert ved en kolonne inneholdende silikagel som en bærer under anvendelse av et elueringsopplosningsmiddel i bestående av benzen for å gi 325 mg av renset la, 3(3, 24-tri-acetoksycholest-5-en som et oljeaktig renset produkt méd det folgende NMR-spektrum og massespektrum:

NMR-spektrum:

o,67 (3H, s, C-18),

2,o2 (9H, s, 3-acetyl),

4,8 (2H, m, 3a og 24-H2),

5,o5 (1H, m, ip-H),

5,65 (1H, m, 6-H).

Massespektrum:

484 (M<+->CH3COOH), 424, 364.

(B) Syntese av la, 3(3, 24-triacetoksycholesta-5, 7-dien

(annet trinn):

3oo mg la, 3(3, 24-triacetoksycholest-5-en ble reagert med 9o mg 1,3-dibrom-5,5-dimetylhydantioin i 4,5 ml n-heksan under tilbakelop i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble avkjolt,

og det resulterende 5,5-dimetylhydantoin og overskuddet 1,3-dibrom-5,5-dimetylhydratoin ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert ved redusert trykk for å gi

349 mg av en gul oljeaktig substans. Xylen (2,5 ml) ble til-

satt til denne substansen for å danne en opplosning. Den resulterende opplosning ble tilsatt dråpevis i lopet av 15 minutter til en opplosning holdt ved 165°C av o,85 ml s-collidin i 1,9

ml xylen og reaksjonen ble gjennomfort i ytterligere lo minutter. Etter reaksjonen ble hydrobromidet av s-collidin fjernet ved filtrering og s-collidinet og xylenet ble avdampet ved redusert trykk. Eterfasen ble vasket med lN-hydroklorsyre og en 5%

vandig opplosning av natriumbikarbonat og gjentagende med vann. Den ble så behandlet med aktivert karbon og eteren ble dampet av

ved redusert trykk for å gi 31o mg av en gul oljeaktig substans.Denne oljeaktige substansen ble forsiktig separert 2 ganger ved kolonnekromatografi (eluering med benzen) under anvendelse av silikagel for å få 69 mg (utbytte 23%) av et ikke-krystallinsk renset produkt. Fra de folgende spektrum-data ble dette produktet identifisert som la,3p,24-triacetoksy-cholesta-5,7^dien.

UV-spektrum, ^^<0>l (nm):

262, 271, 282, 294

NMR-spektrum:

2,o2 og 2,o4 (9H, s, Cf^COO-),

4.75 (2H, b, 3a- og 24-H),

5,ol (1H, b, lp-H),

5,35 (1H, d, J=5,5Hz, 6 eller 7-H),

5,69 (1H, d, J=5,5Hz, 6 eller 7-H).

Massespektrum:

542 (M<+>), 514, 482, 422, 362, 249, 2o4

E KSEMPEL 6

Syntese av la,3p,24-triacetoksycholesta-5,7-dien

(annet trinn):

15o mg la,3p,24-triacetoksycholest-5-en ble reagert med 45 mg 1,3-dibrom-5,5-dimetylhydantoine i 31ml n-heksan i 15 minutter under tilbakelop. Reaksjonsblandingen ble avkjolt og de resulterende krystaller ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert ved redusert trykk for å gi

en gul oljeaktig substans. Til denne substansen ble tilsatt 1,3 ml xylen. Den resulterende opplosning ble tilsatt dråpevis i lopet av ca. 15 minutter til en opplosning av o,25 ml trimetylfosfitt i 4 ml xylen under tilbakelop og reaksjonen ble gjennomfort i ytterligere 9o minutter. Reaksjonsblandingen ble så konsentrert ved en temperatur på mindre enn 75°C for å gi 148 mg av en oljeaktig substans. Denne substansen ble behandlet på samme måte som i eksempel 5, (B). Sluttproduktet viste den samme UV, masse og NMR-spektrUmdata som la,3h-,24-triacetoksycholesta-5,7-dien erholdt i eksempel 5(B).

EKSEMPEL 7

Syntese av la,33,24-tribenzoyloksy~cholesta-5,7-dien (annet trinn): 2oo mg la, 3;3, 24-tribenzoyloksy-cholest-5-en fremstilt på samme måte som i eksempel 5,(A) ble oppvarmet i 15 minutter under tilbakelop. sammen med 55 mg N-bromsukkinimid i 15 ml karbontetraklorid. Reaksjonsblandingen ble avkjolt og de resulterende krystaller ble fjernet ved filtrering og 5 ml xylen ble tilsatt til resten for å danne en opplosning.

Den resulterende opplosning ble tilsatt dråpevis i lopet

av 15 minutter til en opplosning av o,2 ml trimetylfosfitt i 4 ml xylen under tilbakelop og blandingen ble ytterligere tilbakelopsbehandlet i 9o minutter.

Reaksjonsblandingen ble så konsentrert ved en temperatur på mindre enn 75°C og resten ble forsiktig kromatografert to ganger gjennom en kolonne inneholdende silikasyre under anvendelse av benzen som elueringsopplosning for å gi 5o mg (utbytte 25%) av et renset ikke-krystallinsk produkt. Dette produktet viste de folgende spektra og ble identifisert som la, 3(3, 24-tribenzoyloksy-cholesta-5, 7-dien.

UV-spektrum, /-^g01 (nm):

231, 262, 271, 282, 294

NMR-spektrum:

4,95 (2H, b, 3a-H og 24-H),

5,32 (2H, b, lp-H og 6 eller 7-H),

5,72 (1H, d, J=6Hz, 6 eller 7-H),

7,49 og 8,o2 (15H, m, aromatisk H)

Masse-spektrum:

728 (M<+>), 638, 62o, 606, 484, 362.

EKSEMPEL_8

Syntese av la, 3(3, 24 (S)-triacetoksycholesta-5, 7-dien

(annet trinn): la-hydxoksy-3(3, 24 (S) -dibenzoyloksy-cholest- 5-en fremstilt på samme måte som i eksempel 4, (B) ble redusert med LiAlH^i

torr dietyleter for å danne la,3p,24(S)-trihydroksycholest-5-en.

Dette produktet (18o mg) ble reagert med 24 ml av eddiksyreanhydrid og 75 ml pyridin ved 95°C i 3,5 timer. Produktet ble behandlet på samme måte som i eksempel 3, (A) og kromatografert gjennom en kolonne inneholdende silikagel som en bærer for å gi 195 mg av la, 3(3 , 24 (S)-triacetoksy-cholest-5-en.

15o mg av dette produkt ble renset på samme måte som i eksempel 5 for å gi 43,5 mg (utbytte 29%) av et renset produkt med de folgende spektrumdata. Dette rensede produkt ble identifisert som la,3p,24(S)-triacetoksycholesta-5,7-dien.

UV-spektrum, A, etano1 (nm) :

* maks ;262, 271, 282, 294 ;NMR-spektrum: ;2,o2 og 2,o4 (9H, s, Cf^COO-), ;4,75 (2H, b, c-3-, C-24-H), ;5,ol (1H, b, c-l-H), ;5,35 (1H, d, J=5-6Hz, C-6 eller C-7-H), ;5,69 (1H, d, J=5-6Hz, C-6 eller C-7-H). ;Masse-spektrum: ;542 (M<+>), 514, 482, 422, 362, 249,2o9 ;EKSEMP EL 9 ;Syntese av l. i, 3p , 24 (S)-tribenzoyloksy-cholesta-5, 7-dien ;(andre trinn): ;loo mg la, 3p,24(S)-tribenzoyloksy-cholest-5-en erholdt på samme måte som i eksempel 3, (B) ble oppvarmet under tilbakelop i 15 minutter sammen med 23 mg 1,3-dibrom-5,5-dimetylhydantoine i 16 ml karbontetraklorid. Reaksjonsblandingen ble avkjolt og de resulterende krystaller ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert og 2,5 ml xylen ble tilsatt til resten. Opplosningen ble tilsatt dråpevis i lopet av 15 minutter til en opplosning under tilbakelop av o,3 ml s-collidin i 2 ml. xylen og ytterligere tilbakelopsbehandlet i lo minutter. ;Etter reaksjonen ble hydrobromidet av s-collidin fjernet ved filtrering og s-collidin og xylen ble . avdampet ved redusert trykk. Resten ble opplost i dietyleter. Eterfasen ble vasket med IN-saltsyre og en 5% vandig opplosning av natriumbikarbonat ;og deretter gjentatt med vann. Eterfasen ble så torket og eteren ble avdampet ved redusert trykk for å gi en gul oljeaktig substans. ;Den oljeaktige substansen ble forsiktig kromatografert to ganger gjennom en kolonne inneholdende kiselsyre under anvendelse av benzen som en elueringsopplosning for å gi 28 mg (utbytte 28%) av et renset ikke-krystallinsk produkt. Produktet hadde de folgende spektra, og ble identifisert som la, 3(3, 24 (S) - tribenzoyloksycholesta-5,7-dien. ;,„, , . ~ etanol , . ;UV-spektrum, V^ma^s (nm): ;231, 262, 271, 282, 294 ;NMR-spektrum: ;4,95 (2H, b, C-3 og C-24-Hs), ;5,32 (2H, b, C-l og C-6 eller C-7-H), ;5,72 (1H, d, J=6Hz, C-6 eller C-7-H), ;7,49 og 8,o2 (15H, m, aromatisk Hs). ;Masse-spektrum: ;728 (M<+>), 638, 62o, 606, 484, 362. ;EKSEMPEL lo ;Syntese av la-acetoksy-3(3-24 (S)-dibenzoyloksy-cholesta-5, 7-dien (andre trinn): la-rhydroksy-3(3, 24 (S)-dibenzoyloksy-cholest-5-en fremstilt og separert på samme måten som i eksempel 4, (B) ble omsatt med eddiksyreanhydrid og pyridin på samme måte som i eksempel 5, (A). Reaksjonsproduktet ble renset på samme måte som i eksempel 5 for å gi la-acetoksy-3(3, 24 (S)-dibenzoyloksy-cholest-5-;en. ;462 mg la, acetoksy-3j3 , 24 (S)-dibenzoyloksycholest-5-en ble omsatt med 188,6 mg N-bromsukkinimid i 16 ml karbontetraklorid under tilbakelop i 3o minutter. Reaksjonsblandingen ble avkjolt ;og de resulterende krystaller fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert ved redusert trykk for å gi en gul oljeaktig substans. Til substansen ble tilsatt 6,8 ml xylen for å ;danne en opplosning. Opplosningen ble tilsatt dråpevis til en opplosning av o,4 ml trimetylfosfitt i 8 ml xylen under tilbakelop og reaksjonen ble gjennomfort i ytterligere 9o minutter. Etter reaksjonen ble reaksjonsblandingen konsentrert ved.redusert trykk for å gi et oljeaktig produkt. Dette produktet viste de folgende spektra og ble identifisert som la-acetoksy-3(3 ,-24 (S) -dibenzoyloksy-cholesta-5, 7-dien. ;tttt i j_ -A etanol , , ;UV-spektrum, maJcs (nm) : ;231, 262, 271, 282, 294. ;NMR-spektrum: ;2,o4 (3H, s, CH3COO-), ;4,7 - 5,4 (3H, m, 1(3, 3rc og 24-H3), ;5,33 (1H, d, J=6Hz, 6 eller 7-H), ;5,7o (1H, d, J=6Hz, 6 eller 7-H), ;7,4 - 8,2 (loH, m, aromatisk Hs). ;EKSEMPEL 11 ;Syntese av la, 3(3, 24 (R)-triacetoksy-cholesta-5, 7-dien ;(andre trinn): ;la-hydroksy-5(3, 24 (R)-dibenzoyloksy-cholest-5-en fremstilt og separert på samme måte som i eksempel 4, (B) ble underkastet den samme prosedyre som i eksempel 8. Et renset produkt med akkurat det samme UV, NMR og massespektrum som den tilsvarende S-epimeren erholdt i eksempel 8 ble dannet i et utbytte på 28%. Dette produkt ble identifisert som la , 3|3 , 24 (R)-triacetoksy-cholest-5,7-dien. ;EKSEMPEL 12 ;Syntese av la,3p,24(R)-tribenzoyloksy-cholesta-5, 7-dien ;(andre trinn): ;la, 3(3, 24 (R)-tribenzoyloksy-cholest-5-en fremstilt i og separert på samme måte som i eksempel 3,(B) ble underkastet den samme prosedyre som i eksempel 9. ;Et renset produkt med akkurat det samme UV, NMR og masse-spektrum som den tilsvarende S-epimer erholdt i eksempel 9 ;ble erholdt i et utbytte på 27%.Dette produkt ble identi- ;fisert som la, 3(3, 24 (R)-tribenzoyloksy-cholesta-5-dien. ;EKSEMPEL 13 ;Syntese av la-acetoksy-3(3, 24 (R) -dibenzoyloksy-cholesta- ;5,7-dien ( annet trinn): la-hydroksy-3|3 , 24 (R) -dibenzoyloksy-cholest-5-en fremstilt og separert på samme måte som i eksempel 4, (B) ble underkastet den samme prosedyre som i eksempel lo. ;Et renset produkt med akkurat det samme UV og massespektrum ;som den tilsvarende S-epimer erholdt i eksempel lo ble dannet. Dette produkt ble identifisert som la-acetoksy-3(3, 24 (R) - dibenzoyloksy-cholesta-5,7-dien. ;•<? ;EKSEMPEL 14 ;(A) Syntese av la, 3(3, 24-triacetoksy-cholesta-5, 7-dien ;fra la, 3(3, 24-triacetoksy-cholest-5-en: ;Ifolge prosedyren i eksempel 5, (B) ble la, 3{3, 24-triacetoksy-cholest-5-en omsatt med 1,3-dibrom-5,5-dimetylhydantoin og s-collidin i n-heksan. Reaksjonsproduktet ble vasket med syre og alkali i eter og behandlet med aktivert karbon for å gi en rå reaks jonsblandingen inneholdende la, 3(3, 24-triacetoksy-cholesta-5,7-dienet. (B) Hydrolyse av la, 3(3, 24-triacetoksy-cholesta-5, 7-dien: Råproduktet erholdt i (A) ovenfor ble hydrolysert i en 5% metanolopplosning av kaliumhydroksyd for å . gi en rå reaksjonsblandingen inneholdende la, 3(3, 24-trihydroksycholesta-5,7-dien. (C) Bestemmelse av renheten av la, 3[3, 24-trihydroksy- cholesta-5,7-dien: UV-spektret av loo% ren la, 3(3, 24-trihydroksy-cholesta-5, 7-dien er ^m^g<01>= 282 nm og UV-spektret av loo% ren la,30,24-trihydroksy-4,6-dien er ?v e\ano1 = 24o nm. Undersøkelsene har ;maies ;vist at blandingsforholdet mellom disse to forbindelser kan bestemmes ved å sammenligne deres "X- verdier. ;Forholdet av 5,7-derivatet og 4,6-derivatet i den rå reaksjonsblandingen erholdt i (B) ovenfor ble bestemt ved denne prosedyren og det ble funnet at det molare forhold til la, 33 , 24-trihydroksy-cholesta-5, 7-dien til la, 3(3, 24-trihydroksycholesta-4,6-dien var ca. 3:1. ;(D) Separering av la, 3(3, 24-trihydroksycholesta-5, 7-dien og la, 3(3, 24-trihydroksy-cholesta-4, 6-dien ;(tredje trinn): ;(D-l) Separasjon ved preparativ tynnsjiktskromatografi: ;En kommersiell plate for preparativ tynnsjiktskromatograf ;(silika-gel, et produkt fra Merck Company, 2ocm x 2o cm x o,5 cm) ;ble neddykket i en opplosning av solvnitrat i acetonitril for å impregnere det i en mengde på ca. 1,5 vekt-% som solvnitrat og varmebehandlet ved 7o°C i 2 timer. Kromatografiplaten således erholdt ble anvendt for den etterfolgende separerings-r operasjonen. ;Den rå reaksjonsblandingen (3o mg\ erholdt i (B) ovenfor ;ble adsorbert til platen og utviklet ved ca. 2o cm med en 6% metanol-kloroform blandet opplosning. Etter lufttorking av platen, ble reaksjonsblandingen igjen fremkalt med det samme opplosningsmiddelet. Det viste to bånd ved en RF på ;ca. o,23 og ca. o,33. Disse fraksjonen ble skrapet av og ekstrahert med etylacetat fra silikagelen. Man fikk 17,1 mg (57%) av en hvit fast substans (Rf o,23), og 6,0mg (2o%) av en hvit fast substans (Rf = o,33). ;En del av platen ble farget ved å anvende svovelsyre og et ;bånd av Rf = ca o, 38 ble bekreftet. Denne fraksjonen ble skrapet av og ekstrahert på samme måte som ovenfor for å ;gi ca 1 mg av en fast substans. ;Disse produktene har de folgende spektra. Produktet med en ;Rf på o,23 ble identifisert som la,33,24-trihydroksy -cholesta-5, 7-dien, produktet med en Rf på o,33 som la, 3j3, 24-trihydroksy-cholesta-4,6-dien, og produktet med en Rf på o,38 som la,24-dihydroksy-cholesterol. ;(1) Produkt med Rf = o,23 (la,3ø,24-trihydroksyc-cholesta-5,7-dien) ;UV-spektrum se fig.2), ^maks^ ^nrn^ : ;262, 271 { t = ll,ooo), 282 (t = 12,ooo), 294 ;(£ = 7ooo) ;NMR-spektrum ( i C^D^O): ;0,63 (3H, s, 18-CH3), ;3,3o (1H, m, 24-H), ;3,7o (1H, m, 10-H), ;4,o8 (1H, m, 3a-H), ;5,3o (1H, d, J=6Hz, 6 eller 7-H), ;5,6o (1H, d, J=6Hz, 6 eller 7-H). ;Masse-spektrum ( se fig. 3): ;416 (M<+>), 398, 38o, 357, 251, 227, 197, 157 ;Smeltepunkt (°C): ;lo2 til lo3°C. ;(2) Produkt med Rf = o,33 (la,30,24-trihydroksy-cholesta-4,6-dien): ;UV-spektrum, Tv. etano1 (nm) . ;ms ks 233, 24o, 248. ;Masse-spektrum: ;416 (M<+>), 398, 38o. (3) Produkt med Rf = o,38 (la,24-dihydroksycholesterol): Dette korresponderer med en standardprove med Rf = o,38. ;(D-2) Separasjon ved kolonnekromatografi: ;Silikagel kommersielt tilgjengelig for anvendelse i kolonne-kromatograf i (C-2oo,' varemerke til Wako Jyunyaku Kogyo Kabushiki Kaisha) ble impregnert med ca. 2 vekt-% solvnitrat mens det ble anvendt som en opplosning og varmebehandlet ved 7o°C i 2 timer. Silikagelen ble så satt i en glasskolonne med en diameter på 1 cm og lengde på 3o cm, 4o mg av det rå reaksjonblandingen erholdt i (B) ble heilt inn i kolonnen og eluert med et blandet opplosningsmiddel bestående av benzen og etylacetat. Det ble delt i fraksjoner hver med et volum på ca. 2o ml. Disse fraksjonene ble separert ved hjelp av tynnsjiktskromatografi og UV-spektrum. ;Når volumforholdet benzen til etylacetat var 2:1 til L 1:1, ;ble 7,6 mg (utbytte 19%) av et produkt tilsvarende Rf = o,33 i (D-L) erholdt. Når dette forholdet var 1:1,ble 19,6 mg (49%) ;av et produkt tilsvarende Rf = o,23 erholdt. ;Disse produktene ble identifisert ved varierende spektrumdata. ;S AMMENL IGNINGSEKSEMPEL 1 ;Dette eksempel illustrerer separasjonen av la, 3(3, 24-trihydroksy-cholesta-5, 7-dien og la, 3(3, 24-trihydroksy-cholesta-4, 6-dien ved en bærer inneholdende siliciumdioksyd men ikke inneholdende ikke-metallisk solv ( sammenligning med hensyn til det tredje trinn). ;3o mg av en blanding av la,30,24-trihydroksy-cholesta-5,7-dien og la, 3(3, 24-trihydroksy-cholesta-4, 6-dien i et molarforhold 3:1, som var blitt fremstilt på samme måten som i eksempel 14, (A) ;og B, og identifisert på samme måte som i eksempel 14, (C), ble kuomatografert gjennom en kolonne med en diameter på 1 cm og en lengde på 3o cm under anvendelse av silikagel som en bærer i et forsok på å separere det i bestanddeler. ;Et blandet opplosningsmiddel av benzen og etylacetat ble ;anvendt som et fremkallende opplosningsmiddel i varierende volumforhold fra lo:l til 1:1 og begynnelsesblandingen ble delt i fraksjoner med hver et volum på ca. 2o ml. Separasjonen ble forsokt ved tynnsjiktskromatografi og UV-spektrum. ;Når blandeforholdet til benzen til etylacetat var ca. 2:1, begynte hovedkomponenten å flyte ut. Analyser av hver av disse fraksjoner ved UV-spektrum viste at i alte fraksjonene som ble analysert, ble det observert en adsorpsjon ved 233, ;24o, 248, 262, 271, 282 og 294 nm. Som et resultat ble det funnet at når silikagel ble anvendt som en bærer, kunne ikke la, 3(5,24-trihydroksy-cholesta-5, 7-dien separeres fra la, 3(3, 24-trihydroksy- ;cholesta-4,6-dien. Ytterligere ble det funnet at det var så og si ingen forskjell i komposisjonen blant disse fraksjoner, og molarforholdet til 5,7-dienet til 4,6-dienet forble ved ca. 3:1. (Se sammenliningseksempel 3 under.) ;SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 2 ;Dette eksemplet illustrer separasjonen av la, 3(3, 24-triacetoksy-cholesta-5,7-dien og la,33,24-triacetoksycholest-4,6-dien under anvendelse av en bærer inneholdende siliciumdioksyd men ikke inneholdende ikke-metallisk solv (sammenligning med hensyn til det tredje trinnet). ;En blanding av la, 3(3, 24-triacetoksy-cholesta-5, 7-dien og la, 3(3, 24-triacetoksy-cholesta-4, 6-dien i et molarforhold på ;3:1, som var fremstilt på samme måten som i eksempel 14, (A), og identifisert påssamme måte som i eksempel 14, (C), ble underkastet preparativ tynnsjiktskromatografi under anvendelse av den samme platen som anvendt i eksempel 14, (D-l) og en silikagelbærer behandlet med solvnitrat (fremkallingsopplosnings-middel, o,4% metanol-kloroform). Bare en flekk ble påvist ved UV-spektrum ved Rf = ca. o,4. ;Denne fraksjonen ble isolert for å erholde en oljeaktig ;substans hvis UV-spektrum viste en absorpsjon ved 233, 24o, ;248, 262, 271, 282 og 294 nm. ;Således ble det funnet at separasjonen av la, 3(3,24-triacet-oksycholsta -5,7-dien fra la,30,24-triacetoksy-cholesta-4,6- ;dien sviktet selv om silikagel inneholdende ikke-metallisk solv ble anvendt som en bærer ( se sammenligningseksempel 4). ;EKSEMPEL 15 ;Separasjon av la, 3(3, 24 (R) -trihydroksy-cholesta-5, 7-dien og la,30,24(R)-trihydroksycholesta-4,6-dien (tredje trinn): la,hydroksy-3p,24(R)-dibenzoyloksy-cholest-5-en fremstilt og separert på samme måte som i eksempel 4, £B) ble behandlet på samme måte som i eksempel 5, (A) for å danne la-acetoksy-33, 24(R)-dibenzoyloksy-cholest-5-en. Dette produktet ble behandlet på samme måte som i eksempel lo for å gi en rå reaksjons-blanding inneholdende la-acetoksy-33,24(R)-dibenzoyloksy-cholesta- 5,7-dien. Den rå blandingen ble hydrolysert på samme måten som i eksempel 14, (B) og separert ved preparativ tynnsjiktskromatograf i på samme måte som i (D-l). ;Som et resultat ble reaksjonsblandingen inneholdende la,33,24(R)-trihydroksy-cholesta-5,7-dien og la,33,24(R)-trihydroksy-cholesta-4.6- dien i et molarforhold av va. 3:1 klart separert i disse to bestanddelene. ;Produktet separert fra flekken basert på la,33,24{R)-trihydroksy-cholesta-5, 7-dien hadde de folgende karakteristika. ;-?vetanol ;UV-spektrum, maks : ;262, 271 (c = ll,ooo), 282 (ll,8oo), 294 (7,ooo) ;NMR-spektrum (C3D60): ;3,25 (1H, m, C-24-H), ;3,68 (1H, m, 13-H), ;4,lo (1H, m, 3a-H), ;5,3o (1H, d, J=6Hz, 6 eller 7-H), ;5,6o (1H, d, J=6Hz, 6 eller 7-H), ;Masse-spektrum: ;416 (M<+>), 398, 38o, 357, 251, 227, 197, 157 ;Smeltepunkt-(°C): ;96 - 99°C. ;EKSEMPEL 16 ;Separasjon av la,33,24(S)-trihydroksy-cholesta-5,7-dien og la, 3p, 24 (S)-trihydroksy-cholesta-,,4, 6-dien ;(tredje trinn): ;la-hydroksy-3p,24(S)-dibenzoyloksy-cholest-5-en fremstilt og separert på samme måten som i eksempel 4, (B) ble behandlet på samme måte som i eksempel 5, (A) for å gi la-acetoksy-33, 24(S)-dibenzoyloksy-cholest-5-en. Dette produkt ble behandlet på den samme måten som i eksempel lo for å gi en rå reaksjons-blanding inneholdende la-acetoksy-33,24(S)-dibenzoyl-chelesta-5.7- dien. Denne reaksjonsblandingen ble hydrolysert på samme måten som i eksempel 14, (B), og separert ved preparativ ;tynnsjiktskromatograf på samme måten som i (D-l) ovenfor. ;Som et resultat kunne den ovenfor nevnte rå reaksjonsblandingen inneholdende la, 3(3, 24 (S)-trihydroksy-cholesta-5, 7,-dien og la, 3(3, 24 (S)-trihydroksy-cholesta-4, 6-dien i et molarforhold på ca. 3:1 separeres klart i disse bestanddeler. ;Produktet separert fra flekken basert på la, 3(3 , 24 (S)-trihydroksy-cholesta-5, 7-dien hadde de folgende karakteristika. ;r™ i,. -v etanol , . ;UV-spektrum, 'X,ma^ Inni) : ;262, 271 (lo,8oo), 282 (ll,5oo), 294 (6,9oo) ;NMR-spektrum (i C^DgO): ;3,27 (1H, m, C-24-H), ;3,67 (1H, m, 1B-H), ;4, lo (1H, m, 3a-H) , ;5,3o (1H, d, J=6 Hz, 6 eller 7-H), ;5,6o (1H, d, J=6 Hz, 6 eller 7-H). ;Massespektrum: ;416 (M<+>), 398, 38o, 357, 251, 227, 197, 157. ;Smeltepunkt: ;12o til 124°C ;EKSEMPEL 17 ;Syntese av la,24-dihydroksycholecalciferol (fjerde trinn): ;16 mg la,30,24-trihydroksy-cholesta-5,7-dien fremstilt og ;separert på samme måte som i eksempel 14, (D-l) ble opplost i 5oo ml dietyleter og denne opplosning ble bestrålt med ultrafiolette stråler i 2,5 minutter ved 5°C i en atmosfære av argon under anvendelse av en 2oo// hoytrykks mercury lampe ;. (654A-36, varemerke for et produkt fraHanovia Company). En del av opplosningen ble tatt ut og dens UV-spektrum ble bestemt. Det var en forhoyelse i absorpsjonen ved 262 til 263 nm som ;ble antatt forårsaket av la,24-dihydroksy-pre-cholecalciferol. Etter reaksjonen ble eter avdampet ved romtemperaur under redusert trykk. Benzen (5o ml) ble tilsatt til resten og isomerisasjonen ble gjennomfort i 2 timer under tilbakelop av benzen. ;Etter reaksjonen ble benzenet avdampet ved redusert trykk for ;å gi 16 mg av et hvitt faststoff. Dette produktet ble forsiktig separert ved preparativ tynnsjiktskromatografi under anvendelse av silikagel-bærer inneholdende ca. 1,5% solvnitrat ( erholdt på samme måte som i eksempel 14 (D-l)) (fremkalt to ganger med 6% metanol-kloroform) Det viser tre bånd som kunne bekreftes ved ultrafiolette stråler. Fra det minste polare båndet ble 2,8 mg av et hvitt faststoff erholdt. Dette produkt hadde de folgende egenskaper og ble identifisert som la, 24-dihydroksycholecalcif erol . ;UV-spektrum (fig. 4): ^V^aks01 ^nm^ = 256;^etano1 (nm) = 228 ;min ;NMR-spektrum (C3D60): ;o,57 (6H, d, 18-CH3), ;o,87 (6H, d, J = 7Hz, 26- & 27-CH3), ;o,96 (3H, d, J = 5 Hz, 21-CH3), ;3,19 (1H, m, 24-H), ;4,15 (1H, m, lp-H), ;4,36 (1H, m, 3a-H), ;4,85 (1H, b, s, 19-H), ;5,3o (1H, b,s, 19-H), ;6,o5 (1H, d, JAB= 11Hz, 6 eller 7-H), ;6,26(1H, d, JAB= 11Hz, 6 eller 7-H). ;Massespektrum (fig. 5): ;416 (M<+>), 398, 38o, 269, 251, 134. ;Massespekter,.hoy opplosning: ;Funnet = 416.32768 ;Krevet,<M+>(<C>^H^<C>^)<=><4>16.32927 ;Smeltepunkt (°C): ;84 til 85°C. ;EKSE MPEL 18 ;Syntese av la,24(R)-dihydroksycholecalciferol (fjerde trinn): lo mg la, 3|3 , 24 (R) - trihydroksycholesta-5, 7-dien fremstilt og separert på samme måten som i eksempel 15 ble opplost i 14o ml dietyleter og den resulterende opplosningen ble bestrålet med ultrafiolette stråler ved 5°C i to minutter. En del av opplosningen ble tatt ut og dens UV-spektrum ble bestemt. ;En forhbyelse av absorpsjonen ved 262 til 263 nm ble antatt ;å være forårsaket av precursoren som ble observert. Etter reaksjonen ble eteren avdampet ved romtemperatur og redusert trykk. Benzen (5o ml) ble tilsatt til residuet og isomerisasjon ble utfort i 2 timer i en atmosfære av argon under tilbakelop av benzen. ;Etter reaksjonen ble reaksjonsblandingen behandlet på samme måte som i eksempel 17 og separert og renset ved preparativ tynnsjiktskromatografi. Fra det minst polare båndet ble 1,8 mg av et hvitt faststoff erholdt. Dette produktet hadde de folgende egenskaper og ble identifisert som la, 24(R)-dihydroksycholecalciferol. ;UV-spektrum: C'<*>\-, m^"01 (nm) = 265

etanol , « _00

^ min (nm) = 228

NMR-spektrum ( C^ D^ O):

o,59 (3H, s, 18-CH3),

o,87 (6H, d, J = 7 Hz, 26- & 27-CH3),

3,2o ( 1H, m, 29-H),

4,14 (1H, m, 13-H) ,

4,42 (1H, m, 3a-H),

4,87 (1H, b,s, 19-H),

5,32 (1H, b,s, 19-H),

6,o8 (1H, d, JAB= 11Hz, 6- eller 7-H),

6,3o (1H, d, JAB= 11Hz, 6- eller 7-H).

Masse-spektrum:

416 (M<+>9, 398, 38o, 269, 251.

Massespekter, hoy opplosning:

Funnet: 416.33o84

Krevet (M+) = 416,3292<7>(C27H44C>3) .

EKSEMPEL 19

Syntese av la,24(S)-dihydroksycholecalciferol (fjerde trinn):

15 mg la,33,24(S)-trihydroksy-cholesta-5,7-dien fremstilt og separert på samme måte som i eksempel 16 ble opplost i 14o ml dietyleter og den resulterende opplosning ble bestrålet med ultrafiolette stråler i 2 minutter ved 5°C. Deretter ble den samme prosedyre som i eksempel 18 gjentatt for å gi 2,8 mg av et hvitt faststoff. Dette produkt hadde de folgende egenskaper og ble identifisert som la,24(S)-dihydroksycholecalci-ferol.

UV-spektrum: J^g01 (nm) = 265

q\ etanol - . „_0

' min (nm) = 228

NMR-spektrum ( i C^ D^ O):

o,58 (3H, s, 18-CH3),

o,87 (6H, d, J = 7Hz, 26- og 27-CH3),

3,2o (1H, m, 24-H),

4,14 (1H, m, ip-H),

4,42 (1H, m, 3a-H),

4,87 (1H, b,s, 19-H),

5,32 (1H, b,s, 19-H),

6,o8 (1H, d, JAB= 11 Hz, 6- eller 7-H),

6,3o (1H, d, JAB= 11 Hz, 6- eller 7-H),

Massespektrum:

416 (M<+>), 398, 38o, 269, 251, 134.

Massespekter, hoy opplosning:

Funnet = 416.33o95

Krevet (M<+>) = 416.3292<7>(<C>2?<H>44<0>3).

E KSEMPEL 2o

(A) Syntese av la,33,24-triacetoksycholest-5,7-dien fra la,33,24- trihydroksycholesta-5,7-dien: 2oo mg la,3p,24-trihydroksycholesta-5,7-dien fremstilt og separert på samme måte som i eksempel 14, (D-l) ble omsatt med 2 ml eddiksyreanhydrid og 5 ml pyridin ved 95°C i 3 timer. Reaksjonsblandingen ble plassert i isvann og ekstrahert.

med 4o ml dietyleter. Eterfasen ble vasket med fortynnet saltsyre, så med alkali og ytterligere med vann og torket. Eteren ble avdampet for å gi la, 3(3, 24-triacetoksycholesta-5, 7-dien som en lett gulaktig oljeaktig substans.

(B) Syntese av la, 24-diacetoksycholecalcif erol-3(3-acetat

(fjerde trinn):

5o mg la, 24-diacetoksycholecalcif erol-3(3-acetat ble opplost i 5oo ml dietyleter. Den resulterende opplosning ble bestrålet med ultrafiolette stråler i en atmosfære av argon ved 5°C

i 4 minutter.

En del av denne opplosning ble tatt og og dens UV-spektrum bestemt. En forhoyelse av absropsjonen ved 262 til 263 nm ble antatt å være forårsaket av precursoren som ble observert. Etter reaksjonen ble eteren avdampet ved redusert trykk og

ved romtemperatur. Benzen (loo ml) ble tilsatt til resten og isomerisasjon ble utfort i 2 timer i en atmosfære av argon under tilbakelop av benzen. Etter omsetningen ble det meste av benzenet avdampet ved redusert trykk og til resten ble tilsatt 2 ml av 5% kaliumhydroksyd/metanol, 2 ml metanol og 2 ml benzen. Blandingen fikk stå i en dag ved romtemperatur for å danne hydrolyse. Reaksjonsproduktet ble fortynnet med vann og ekstrahert med etylacetat. Etylacetatfasen ble gjentatt vasket med vann og torket. Etylacetatet ble så

avdampet ved redusert trykk for å gi 35 mg av en lys gul oljeaktig substans.

Denne substansen ble separert og renset ved preparativ tynnsjiktskromatografi under anvendelse av silikagelbærer inneholdende solvnitrat på samme måte som i eksempel 17.

Fra det minst polare båndet ble 5,7 mg av et faststoff erholdt. Da forskjellige spektra og egenskaper til dette produkt

tilsvarer fullstendig de til la,24-dihydroksycholecalciferol erholdt i eksempel 17, ble produktet erholdt etter isomerisasjonen identifisert som la,24-diacetoksycholecalciferol-3-acetat.

EKSEMPEL 21

(A) Syntese av la,30,24-tribenzoyloksycholesta-5,7-dien fra la, 3(3, 24-trihydroksycholesta-5, 7-dien: 16o mg av la,30,24-trihydroksycholesta-5,7-dien fremstilt og separert på samme måte som i eksempel 14 (D-l) ble omsatt med 41o mg benzoylklorid og 15 ml pyridin.

Reaksjonsblandingen ble fortynnet med vann og ekstrahert med 4o ml dietyleter. Eterfasen ble vasket med fortynnet saltsyre, så med alkali og til slutt med vann og torket. Eteren ble avdampet for å gi la, 3(3, 24-tribenzoyloksycholesta-5, 7-dien som et hvitt amorft produkt.

(B) Syntese av la,24-dibenzoyloksycholecalciferol-30-

benzoat (fjerde trinn):

3o mg la, 3(3, 24-tribenzoyloksycholesta-5, 7-dien ble opplost i 5oo ml benzen og den resulterende opplosning ble bestrålet med ultrafiolette stråler i en atmosfære av argon ved lo°C i 2 minutter. Etter reaksjon, ble isomerisasjon utfort i 2 timer i argonatmosfæren under tilbakelop av benzen.

Etter reaksjonen ble det meste av benzenet avdampet ved redusert trykk og 2 ml 5% kaliumhydroksyd-metanol og 2 ml benzen ble tilsatt til resten. Blandingen ble holdt ved romtemperatur i 28 timer i en atmosfære av argon for å få hydrolyse. Reaksjonsproduktet ble fortynnet med vann og ekstrahert med etylacetat. Etylacetat-sjiktet ble gjentagende vasket med vann og torket. Etylacetatet ble avdampet ved redusert trykk. Resten ble underkastet samme separerings og renseprosedyre som i eksempel 2o for å gi 1,9 la,24-dihydroksycholecalciferol med de samme egenskaper som produktet erholdt i eksempel 2o.

Fra dette fikk man etter isomerisasjonsreaksjonen et produkt som ble vist å være la,24-dibenzoylcholecalciferol-3-benzoat.

EKSEMPEL 22

(A) Syntese av la-hydroksy-3(3, 24-dibenzoyloksycholesta-

5-7-dien fra la, 3(3, 24-trihydroksycholesta-5, 7-dien:

25o mg la, 3(3, 24-trihydroksycholesta-5, 7-dien fremstilt på

samme måte som i eksempel 14, (D-l) ble blandet med 21o mg benzoylklorid og 5 ml pyridin og blandingen fikk stå ved 23°C i en dag. Den resulterende reaksjonsblandingen ble behandlet på samme måte som i eksempel 21 for å gi la-hydroksy-3|31 24-dibenzoyloksycholesta-5, 7-dien.

(B) Syntese av la-hydroksy-24-benzoyloksycholecalciferol- 3p-benzoate (fjerde trinn): 2o mg la-hydroksy-30,24-dibenzoyloksycholesta-5,7-dien ble opplost i 5oo ml dietyleter.Opplosningen ble bestrålet med ultrafiolette stråler, isomerisert og hydrolysert på samme måte som i eksempel 21, (B) for å gi 1,9 mg la,24-dihydroksy-, cholecalciferol som viste de samme egenskaper som produktet erholdt i eksempel 2o.

Fra dette resultatet ble det bekreftet at produktet erholdt

etter isomerisasjonsreaksjonen ovenfor var la-hydroksy-24-benzoylcholecalciferol-30-benzoat.

EKSEMPEL 23

Syntese av la,24(R)-diacetoksycholecalciferol-3p-acetat

(fjerde trinn):

la, 3(3, 24 (R) - trihydroksycholesta-5, 7-dien erholdt i eksempel 15 ble acetylert på den samme måte som i eksempel 2o, (A) for å erholde la, 3(3, 24 (R)-trihydro ksycholesta-5, 7-dien. 25 mg av dette produkt ble behandlet på samme måten som i eksempel 2o, (B) med unntagelse for at bestrålingen med ultrafiolette stråler ble foretatt i 2 minutter. Det ble erholdt 3,4 mg av et produkt med egenskaper som tilsvarer de til la,24(R)-dihydroksycholecalcif erol .

Av dette resultatet ble det bekreftet at produktet erholdt

etter isomerisasjonsreaksjonen var la,24(R)-diacetoksycholecalcif erol-3|3-acetat.

EKSEMPEL 24

Syntese av la,24(R)-dibenzoyloksycholecalciferol-3p~

benzoat ( fjerde trinn): la,33,24(R)-trihydroksycholesta-5,7-dienet ble benzoylert på samme måte som i eksempel 21 (A) for å erholdte la,3p,24(R)-tribenzoyloksycholesta-5,7-dien. Dette produktet ble behandlet på samme måte som i eksempel 21, (B) bortsett fra at 3o mg av dette produktet ble anvendt og bestrålingen av ultrafiolette stråler ble foretatt i 2 minutter. Det ble erholdt 3,4 mg av et produkt hvilke egenskaper.tilsvarer de til la,24(R)-dihydroksycholecalcif erol .

Fra dette ble produktet etter isomerisasjonsreaksjonen

identifisert som la,24(R)-dibenzoyloksy-cholecalciferol-3p-benzoat.

EKSEMPEL 25

Syntese av la-hydroksy-24(R)-benzoyloksy-cholecalciferol-30-benzoat (fjerde trinn): la,30,24(R)-trihydroksy-cholesta-5,7-dienet ble benzoylert på akkurat samme måte som i eksempel 22, (A) for å danne la-hydroksy-30,24(R)-dibenzoyloksy-cholesta-5,7-dien.

lo mg av dette produktet ble behandlet på samme måte som i eksempel 22 , (B) for å gi 1,2 mg av et produkt hvilke egenskaper tilsvarer de til la,24(R)-dihydroksycholecalciferol.

Fra dette resultat ble det bekreftet at produktet etter isomerisasjonen var la-hydroksy-24(R)-benzoyloksy-chole-calcif erol-30-benzoat.

EKSEMPEL 26

Syntese av la,24(S)-diacetoksy-cholecalciferol-30-

acetat (fjerde trinn):

la,30,24(S)-trihydroksycholesta-5,7-dien erholdt i eksempel 16 ble acetylert på samme måte som i eksempel 2o, (A) for å

danne la,30,24(S)-trihydroksycholesta-5,7-dien. 2o mg av dette produktet ble behandlet på samme måte som i eksempel 23

for å gi 3,1 mg av et produkt hvilke egenskaper tilsvarer til de til la,24(S)-dihydroksycholecalciferol.

Fra dette resultat ble det bekreftet at produktet etter isomerisasjonsreaksjonen var la,24(S)-diacetoksycholecalciferol-3'p-acetat.

EKSEMPEL 27

Syntese av la-hydroksy-24(S)-benzoyloksy-cholecalciferol-30-benzoat (fjerde trinn): la,5ø,24(S)-trihydroksycholesta-5,7-dienet erholdet i eksempel 16 ble benzoylert på akkurat samme måte som i eksempel 22, (A) for å danne la-hydroksy-30,24(S)-dibenzoyloksycholesta-5,7-dien. 15 mg av dette produktet ble behandlet på akkurat samme måte som i eksempel 25 for å 1,5 mg av et produkt hvilke egenskaper tilsvarer de til la,24(S)-dihydroksycholecalciferol. Utfra dette ble det bekreftet at produktet erholdt etter isomerisasjonen var la-hydroksy-24(S)-benzoyloksycholecalciferol-3p-benzoat.

EKSEMPEL 28

Syntese av la-acetoksy-24(S)-benzoyloksy-cholecalciferol-3(3-benzoat (fjerde trinn) : la-hydroksy-30,24(S)-dibenzoyloksycholesta-5,7-dien erholdt på samme måten som i eksempel 27 ble acetylert på samme måte som i eksempel 26 for å danne la-acetoksy-30,24(S)-dibenzoyl-oksycholesta-5, 7-dien. 15 mg av dette produktet ble behandlet på samme måte som i eksempel 26 bortsett fra at bestrålingen med ultrafiolette stråler ble utfort ved 8°C i 1 minutt. Det ble erholdt 1,5 mg av et produkt hvis egenskaper tilsvarer de til la,24(S)-dihydroksy-cholecalciferol. Utfra dette ble det bekreftet at produktet erholdt etter isomerisasjonen var la-acetoksy-24(S)-benzoyloksy-cholecalciferol-30-benzoat.

SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 3

Syntese av la,24-dihydroksy-cholecalciferol fra la,30,24-trihydroksycholesta-5,7-dien inneholdende la,30,24-trihydroksy-cholesta-4,6-dien ( sammenligning med hensyn til det fjerde trinn): lo mg av en blanding av la,30,24-trihydroksy-cholesta-5,7-dien og la,30,24-trihydroksy-cholesta-4,6-dien i et molar-forhol på ca. 3:1 erholdt på samme måte som i sammenligningseksempel 1 opplost i 5oo ml dietyleter og opplosningen ble bestrålt med ultrafiolette stråler ved 5°C i 2 minutter. Etter reaksjonen ble dietyleteren forsiktig avdampet ved redusert trykk. Til resten ble tilsatt 5o ml benzen og isomerisasjon ble utfort i en atmosfære av argon i 2 timer under tilbakelop av benzen. Etter reaksjonen ble benzenet avdampet for å gi lo mg av en brun oljeaktig substans.

UV-spekteret til dette produkt var komplisert. Spesielt var den blottet for en spesifikk absorpsjon av la,24-dihydroksycholecalcif erol som oppviser et absorpsjonsmaksimum ved 265 nm og dannelsen av la,24-dihydroksy-cholecalciferol kunne ikke bekreftes.

Dette ble bekreftet ved å underkaste substansen ovenfor preparativ tynnsjiktskromatografi under anvendelse av silikagel bærer med solvnitrat adsorbert derpå og sammenligne kromato-grammet med det til en standardprove av la,24-dihyd roksychole-calciferol. Produktet viste ingen flekk som tilsvarte standard-proven.

Det kan derfor sees at når renheten av la,33,24-trihydroksy-cholesta-5, 7-dien er lav, blir la,30,24-trihydroksychole-calciferol ikke dannet i det hele tatt ved isomerisering ved anvendelse av ultrafiolett bestråling.

SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 4

Syntese av la,24-diacetoksy-cholecalciferol-33-acetat

fra la,3p,24-triacetoksychllesta-5,7-dien inneholdende la, 33,24-triacetoksycholesta-4,6-dien (sammenligning med det fjerde trinn): lo mg av en blanding omfattende la,33,24-triacetoksy-cholesta-5,7-dien og la,33,24-triacetoksy-4,6-dien ieet molarforhold på ca. 3:1 erholdt på samme måte som i sammenligningseksempel 2 ble opplost i 5oo ml dietyleter og opplosningen ble bestrålt med ultrafiolette stråler ved 5°C

i 2 minutter. Reaksjonsblandingen ble gulaktig brun. Etter reaksjonen ble dietyleteren forsiktig avdampet ved redusert trykk. Benzen (5o ml) ble tilsatt til resten og isomerisasjon ble gjennomfort i 2 timer i en atmosfære av argon og under tilbakelop av benzen. Etter reaksjonen ble det meste av benzenet dampet av ved redusert trykk. Til resten ble tilsatt 1 ml 5% kaliumhydroksyd-metanol og blandingen fikk stå

ved romtemperatur i 24 timer i en atmosfære av argon for å fremkalle hydrolyse. Etter reaksjonen ble benzenet avdampet og dens UV-spektrum ble bestemt. Produktet ble underkastet preparativ tynnsjiktskromatografi. Resultatet var akkurat det samme som i sammenligningseksempel 3, og det ble ikke observert noen dannelse av la,24-dihydroksycholecalciferol.

FO RSØK 1

Virkning av oket intestinal kalsiumtransport ved la, 24-dihydroksycholecalcif erol (la,24-DHCC): (a) Sammenligning med la-hydroksycholecalciferol (la-HCC): tfistarrotter av hankjonn med kroppsvekt på ca. 2oo g ble fastet over natten og deretter administrert oralt med 625 p mol av en opplosning på hver la,24-DHCC og la-HCC i maisolje.

Etter en forut bestemt tidsperiode ble en opplosning av radio-aktiv kalsiumklorid ( 45CaCl^, 3o (iCi/ml) administrert oralt. Det radioaktive nivået i blodet ble målt i lopet av lo til 60 minutter. Maksimumsverdien ble laget som en indeks av intestinal kalsiumabsorpsjon.

En kontrollgruppe rotter ble administrert maisolje alene

i den samme mengde. Dosene av maisoljeopplosning med la,24-DHCC eller la-HCC og maisoljen var o,ol25 ml pr. loo g kroppsvekt for hver rotte og dosene av den radioaktive kalsiumklorid vandige opplosningen (pH 7,o) var o,l ml pr. loo g av kroppsvekten til hver rotte.

Radioaktivitetsnivået ble målt ved å plassere o,2 ml serum i en Vial-flaske,tilsetting 12 ml av en blanding inneholdende en scintillator (inneholdende 12oo ml toluen, 800ml etylcellosol, 8 g 2,5-difenyloksazol og 3oo mg 2,2'-p-fenylenbis(5-fenyl-oksazol) og bestemmelse av radioaktiviteten ved hjelp av en flytende scintillasjonsteller. Resultatene blir vist i tabell 1.

Resultatene ovenfor demonstrerer at la,24-DHCC har nesten en ekvivalent virkning til la-HCC med hensyn til okingen av intestinal kalsiumadsorpsjon. (b) Sammenligning mellom la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC:/Jistarrotter av hankjonn ble fastet over natten og deretter administrert oralt med 625 p mol av en opplosning på hver la,24-DHCC og la,24(S)-DHCC immaisolje. Åtte timer etter administrasjonen ble rottende drept og intestinal kalsiumadsorpsjon ble bestemt ved "everted gutsac"metoden (Martin D.L. og H.F. DeLuca, Amer.J. Physiol. 216, 1351 (1969)). Resultatene blir vist i tabell 2.

De eksperimentelle betingelsene var som folger:

Anvendt intestinalområde: tolvfingertarm (duodenum), 7 cm Mengde av medium heilt i

den vrengte tolvfingertarmen: o,7 ml

Sammensetning av mediumet:

Inkuberingsbetingelser: 37°C, 9o minutter

en gassblanding på 95% 0^

og 5% CC>2passerte

Mengde væske anvendt for

radioaktivitetsmålingen: o,l ml

Andre betingelser var de samme som i (a) ovenfor.

Resultatene ovenfor viser at la,24(R)-DHCC viser en storre virkning av oket intestinal kalsiumabsorpsjon enn la,24(S)-DHCC.

EORSØK 2

Sammenligning av la-HCC, la,24-DHCC, la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC med hensyn til virkningen av oket intestinal kalsiumabsorpsjon:

Den eksperimentelle prosedyren var akkurat den samme som i eksempel 29, (b). Resultatene erholdt blir vist i tabell 3.

Resultatene vist i tabell 3 ga en ny bekreftelses til de eksperimentelle resultatene i eksempel 29. Med andre ord, med hensyn til intestinalkalsiumadsorpsjonen har la,24-DHCC minst en ekvivalent aktivitet til la-HCC og blandt la,24-DHCC, la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC stemmer det folgende forholdet godt

overens med hensyn til aktivitetsgraden til oket intestinal kalsiumabsorpsjon.

la, 24 (R)-DHCC la, 24-DHCC >' la, 24 (S)-DHCC.

FORSØK 3

Sammenligning av benabsorpsjonseffekt mellom la,24-DHCC

og la-HCC:

^istarrotter av hankjonn (hver med en kroppsvekt på ca. 15o g) ble administrert subkutant med en vandig opplosning på ^CaCl»

45

i en dose pa 5o |iCi pr. rotte og holdt i 6 uker. Ca således administrert ble fort adsorbert og en storre del av den ble samlet ved bena i flere timer. Tre uker etter ble<45>Ca-nivået i blodet konstant og bare bena var i den spesifikt merkede tilstanden. Dette ble bekreftet av en makroautor.adio-grafiske analysen av hele kroppen. Etter å ha holdt rottene i 6 uker ble de administrert oralt hver dag med en opplosning av 2.125 p mol hver av la-HCC og la,24-DHCC. Blodprdver ble tatt litt etter litt og serumradioktivitetsnivået ble målt ved metoden beskrevet i eksempel 29 (a). En forhoyelse i serumradioaktivitetsnivået ble gjort til en indeks for effekten av benabsorpsjonen. Kontrollgruppen ble administrert med maisolje alene. Antallet av proverotter var 4 i hver gruppe. Resultatene erholdt blir vist i fig. 6. På denne figuren indikerer X en signifikant forskjell i serumradioaktivitetsnivået fra kontrollen.

Som det kan sees fra resultatene vist i fig. 6 forhoyes benabsorpsjonen med la-HCC signifikant to dager etter begynnelse med administrasjonen og denne tendensen blir storre etterhvert som tiden går. På den annen side forhoyes benabsorpsjonen signifikant med la,24-DHCC bare etter et tidsrom på 4 dager, men etter det var graden av forhoyelse meget lavere ennden med la-HCC ( ca. 1/3 på åtte dager). Dette lar en anta at la,24-DHCC oppviser en svakere benabsorberingseffekt enn la-HCC og er lavere med hensyn til toksisitet.

FORSØK 4

Sammenligning av benabsorberingseffekt og kroppsvekt-forskjell blant la-HCC, la,24-DHCC, la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC: En lignende test som i eksempel 31 ble foretatt på de fire ovenfornevnte forbindelser. Ulikt eksempel 31 begynte eksperi-mentet 3 uker etter administrasjon av ^CaC^. Både serumradioaktivitetsnivået og den totale kalsiumkonsentrasjonen i serumet ble målt. For måling av kalsiumkonsentrasjonen ble det anvendt et kalsiummålingsutstyr ( laget av Iatron Company). Resultatene erholdt blir vist i tabellene 4 og 5.

Av resultatene vist i tabellene 4 og 5 ble eksperiment-resultatene i eksempel 31 bekreftet på nytt. Med andre ord disse resultatene viser at la,24-DHCC er meget svakere med hensyn til benabsorberingseffekt enn la-HCC og blandt la,24-DHCC, la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC stemmer det folgende forholdet godt overens med hensyn til benabsorberingseffekten.

Hva som er spesielt bemerkelsesverdig er at det blir observert knapt noen benabsorberingseffekt med la,24(S)-DHCC og dets virkning er nesten ekvivalent med kontrollen. Ifolge dette viser det at la,24(S)-DHCC har en virkning som er spesikk oking av intestinal kalsiumtransporten og dette blir antatt å være av ytterste viktighet for kliniske applikasjoner.

Endring i kroppsvekt som fastslått i foreliggende eksperimenter er vist i fig. 7. Det er interessant å notere at la,24-DHCC forårsaker en mindre grad av endring i kroppsvekten enn la-HCC og spesielt la,24(S)-DHCC viser liten forskjell fra kontrollgruppen. Fra dette kan også antas at i likhet med benabsorpsjonen er toksisiteten til la,24-DHCC lavere enn den til la-HCC.

FORSØK 5

Sammenligning av toksisitet mellom la,24-DHCC og la-HCC: Toksisiteten til hver av de to forbindelser ovenfor ble

testet ved kjente metoder. 'Resultatené blir vist i tabell 6.

Det er tydelig fra ovenstående tabell at toksisiteten til la,24-DHCC er l/lo eller mindre til den til la-HCC. Dette resultat kan også antas å være resultatet i eksemplene 31 og 32.

På basis av resultatene erholdt i eksemplene 29 til 33 kan karakteristikkene til la,24-DHCC sammenlignes med de til la-HCC som vist i tabell 7. I disse data er aktiviteten til la-HCC satt til 1.

Da det er blitt demonstrert at la-24-DHCC i henhold til foreliggende oppfinnelse selektivt oker intestinal kalsiumabsorpsjon og utviser en svak benabsorpsjonseffekt som sammenlignet med kjente analoger av aktive former av vitamin D^, blir det antatt å være meget nyttig som medisiner som kan appliseres med små bivirkninger ved behandling av sykdommer indusert ved abnormal metabolisme av kalsium. Spesielt er la,24(S)-DHCC en meget onsket substans i dette henseende og det blir ventet å komme i meget vid anvendelse.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av la,24(S)-dihydroksycholecalcif erol og/eller la,24 (R)-dihydroksycholecalciferol, som kontrollerer kalsium metabolisme hos varmblodige dyr, med formel

   karakterisert vedat la,33,24(S)-trihydroksy-cholesta-5 , 7-dien , la,33,24(R)-trihydroksycholesta-5,7-dien eller derivater derav med formel

   hvor R^, R2og R^, som er like eller forskjellige, hver betyr et hydrogenatom eller en beskyttelsesgruppe som kan avspaltes, utsettes for ultraviolett bestråling i et inert organisk løs-ningsmiddel, hvoretter det resulterende produkt isomeriserer, og om nødvendig hydrolyserer eller reduktivt avspalter beskyttelsesgrupper R^, R2og R^som foreligger.