NO149662B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive c-076-forbindelser. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av selektive hydrogeneringsprodukter av C-076 forbindelser og derivater derav.

Uttrykket C-076 er anvendt for å beskrive en gruppe forbindelser isolert fra fermenteringsvæsken av en C-076-produserende stamme av Streptomyces avermitilis. De morfologiske egenskaper av kulturen er fullstendig beskrevet i U.S. patentansøkning 772 éoi. C-076-forbindelsene er en gruppe makrolider som hver er substi-tuert i 13-stillingén med en 4~(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrose-gruppe. 1-gruppen av C-076-forbindelsene har også en 22,23~dobbélt-binding, såvel som flere andre dobbeltbindinger. Den selektive reduksjon av 22, 23-dobbeltbindingen, uten påvirkning av de øvrige dobbeltbindinger, er grunnlaget for foreliggende oppfinnelse. C-076-forbindelsene og de foreliggende derivater derav har en meget høy grad av anthelmintisk og antiparasittisk aktivitet.

C-076-gruppene av forbindelser har følgende struktur:

hvor R er 4'-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosegruppen med strukturen:

<p>g hvor den stiplede linje betegner en enkelt- eller en dobbelt - binding; R^ er hydroxy og er tilstede bare når den nevnte stiplede linje indikerer en enkeltbinding ;

R2 er isopropyl eller sek-butyl; og

R^ er methoxy eller hydroxy.

Der er åtte forskjellige C-076-forbindelser, og de betegnes med Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a og B2b basert på strukturen av de individuelle forbindelser.

I den foregående strukturformel er de individuelle C-076-forbindelser som angitt nedenfor.

C-076-forbindelsene med. 22 ,23-umetningene er betegnet som "1-gruppen", og det er bare disse forbindelser som reduseres for å fremstille foreliggende derivater. Enten før eller efter red-uksjonen av 22,23-dobbeltbindingen kan ytterligere reaksjoner ut-føres ved hvilke én eller begge av a-L-oleandrose-gruppene fjernes, eller ved hvilke én eller flere av de tilgjengelige

hydroxygrupper acyleres.

Forbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, har således følgende strukturformel:

hvor er isopropyl eller sek-butyl;

R2 er methoxy, . hydroxy eller lavere alkanoyloxy; og

R^ er hydrogen; lavere alkanoyl; a-L-oleandrosyl; 4-lavere alkanoyl-a-L-oleandrosyl; 4 '-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyl; 4"-lavere alkanoyl-4'-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyl.

Ved foreliggende oppfinnelse er uttrykket "lavere alkanoyl" anvendt for å betegne alkanoylgruppene med fra 2 til 6 carbon-atomer som acetyl, propionyl, butyryl, pivaloyl og lignende.

Foretrukne forbindelser som fremstilles ifølge oppfinnelsen, har ovenstående strukturformel hvor

R^ er isopropyl eller sek-butyl;

R^ er methoxy eller hydroxy; og

R^ er hydrogen, a-L-oleandrosyl eller k'-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyl .

Ytterligere foretrukne forbindelser er de hvor lavere alkanoyl - gruppen i R^ er acetyl i disaccharid-, monosaccharid og aglycon-forbindelsene.

Som det lett vil sees av analyse av strukturen for C-076-utgangsmaterialene, er der fem umetninger i 1-gruppen av forbindelser. Et mål ved foreliggende oppfinnelse er å redusere 22,23-dobbeltbindingen uten å påvirke de øvrige fire umetninger eller noen annen funksjonell gruppe som er tilstede i molekylet.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at en forbindelse med formelen: hvor R^, R2 og R^ er som ovenfor angitt,, behandles med hydrogen i nærvær av en katalytisk mengde av en forbindelse med formelen:

hvor R4 er lavere alkyl, fenyl eller lavere alkylsubstituert fenyl, og X er halogen.

I den foretrukne katalysator er R^ fenyl og X er klor, dvs. forbindelsen tris-(trifenylfosfin)-rhodium(I)-klorid, som også er kjent som Wilkinsons homogene katalysator.

Reaksjonen utføres under anvendelse av en katalytisk mengde av katalysatoren. Mengden av katalysator er ikke kritisk, og fra 0,05 til 0,5 rool av katalysatoren for hvert mol utgangsmateriale har vært anvendt med hell." Molarforhold i området 0,25 til 0,40 foretrekkes.

Hydrogeneringen utføres i en hydrogenatmosfære som kan være enten ved atmosfærisk trykk eller inntil ca. 4 atmosfærers trykk i et standard laboratorie-hydrogeneringsapparat. Et oppløsnings-middel anvendes vanligvis for å oppløse både utgangsmaterialene og katalysatoren. Foretrukne oppløsningsmidler er hydrocarbon-oppløsningsmidler som benzen, toluen, petrolether og andre alkan-hydrocarboner. Reaksjonen er fullstendig når den beregnede mengde hydrogen er tatt opp ved reaksjonen. Dette vil i alminnelighet krevé fra ' 1 til 48 timer. Reaksjonen kan utføres ved fra værelsetemperatur til ca. 75°C, men værelsetemperatur foretrekkes. Hydrogeneringsproduktene isoleres og renses ved kjente metoder.

Andre reaksjoner kan utføres på C-076-utgangsmaterialene eller på de hydrogenerte produkter for å fremstille forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Skjønt det er mulig å utføre alle de andre reaksjoner på C-076-utgangsmaterialet og anvende hydrogenerings-, trinnet som den siste reaksjon, foretrekkes det å utføre hydro-generingstrinnet først. Fordi 22,23-dobbeltbindingen er noe til-bøyelig til nucleofil addisjon, må reaksjonsbetingelsene for fjernelse av sukkergruppene og acylering av hydroxygruppene reguleres omhyggelig hvis 22,23-dobbeltbindingen er tilstede. Hvis 22,23-dobbéltbihdingen først hydrogeneres, lettes den påfølg-ende sukkerfjerning og acylering.

De ytterligere reaksjoner som kan utføres for å fremstille forbindelsene ifølge oppfinnelsen, er den selektive fjernelse av en eller begge a-L-oleandrosylgruppene eller den selektive acylering av de påvirkelige hydroxylgrupper.

Reaksjonsbetingelsene som er generelt anvendbare for fremstilling av både monosacchåridet og aglyconet, innbefatter oppløs-ning av C-076-forbindelsen eller den hydrogenerte C-076-forbindelse i et vandig surt ikke-nucleofilt organisk oppløsningsmiddel, som er blandbart med vann, fortrinnsvis dioxan, tetrahydrofuran, dimethoxyethan, dimethylformamid, bis-2-methoxyethylether, og lignende, i hvilke vannkonsentrasjonen er fra 0,1 til 20 volum%. Konsentrert syre tilsettes til det vandige organiske oppløsnings-middel i en mengde på o,01 til 10 volum%. Reaksjonsblandingen omrøres i alminnelighet ved 20 - 40°C, fortrinnsvis ved værelsetemperatur, i fra' 6 til 24 timer. De lavere sy rekonsent rasjoner fra 0,01 til 0,1% vil overveiende gi monosacchåridet under ovenstående reaksjonsbetingelser. Høyere syrekonsent rasjoner fra 1 til 10% vil overveiende gi aglyconet under ovenstående reaksjonsbetingelser. Mellomliggende syrekonsentrasjoner vil i alminnelighet gi blandinger av monosaccharid og aglycon. Prod-uktene isoleres, og blandingene skilles ved slike metoder som kolonnekromatografi, tynnskiktspreparativ kromatografi og høy-trykks -væskekromatografi, og andre kjente metoder.

Syrene som kan anvendes i ovenstående fremgangsmåte, innbefatter mineralsyrer og organiske syrer som svovelsyre, hydrohalo-gensyre, fosforsyre, trifluoreddiksyre,.trifluormethansulfonsyre og lignende. Hydrohalogensyrene er fortrinnsvis saltsyre eller hydrogenbromid. Den foretrukne syre ved ovenstående fremgangsmåte er svovelsyre.

En videre metode for fremstillingen av monosacchåridet eller aglyconet av C-076-forbindelsene eller av de hydrogenerte C-076-forbindelser anvender et annet oppløsningsmiddelsystem for monosacchåridet og aglyconet.. Ved fremgangsmåten for fremstilling av monosacchåridet anvendes 1 volum%-ig syre i isopropanol ved 20 - 40°C, fortrinnsvis værelsetemperatur, i 6 - 2k timer. For fremstillingen av aglyconet, har 1 volum% syre i methanol under ovenstående reaksjonsbetingelser vist seg å,være passende.

Når denne fremgangsmåte anvendes på utgangsmaterialet (forbindelsene med 22,23-dobbeltbindingen), er det en mulighet for nucleofil addisjon til dobbeltbindingen. Hvis dette inntrer, vil kromatografisk rensning fjerne biproduktet for å tillate ytterligere reaksjoner.

Syrene nevnt ovenfor, er passende for denne fremgangsmåte, og igjen er svovelsyre den foretrukne syre.

De ovenfor beskrevne forbindelser isoleres fra reaksjonsblandingen og blandingen av forbindelser skilles ved kjente metoder, og spesielt de kromatografiske metoder beskrevet ovenfor.

De acylerte forbindelser fremstilles ved anvendelse av acyleringsmetoder i hvilke reaksjonsbetingelsene vil variere, avhengig av reaktiyit et en av hydroxygruppen som skal acyleres. Når det er mere enn én hydroxygruppe som skal acyleres, anvendes forskjellige reaksjonsbetingelser for å nedsette dannelsen av blandinger .

De anvendte acyleringsreagenser er i alminnelighet halogen-idet, fortrinnsvis kloridet, av ovenstående lavere alkanoylgrupper. Det vil si at i alminnelighet anvendes det lavere alkanoyihalogenid-reagens. •Dessuten kunne- acyleringsreagenset være i form av anhydridet eller halogenformiatet. I tilfelle av at reaksjonene utføres med halogenidreagensene, er det ofte fordelaktig å inkludere i reaksjonsblandingen en basisk forbindelse som er i stand til å reagere med og nøytralisere hydrogenhalogenidet som frigjøres i løpet av denne reaksjon. Tertiære aminer foretrekkes som tri- .. ethylamin, pyridin, dimethylaminopyridin, diisopropyl-ethylamin og lignende. Den basiske forbindelse kreves i ekvimolare mengder i forhold til det antall mol hydrogenhalogenid som frigjøres, men overskuddsmengder, endog anvendelsen av den basiske forbindelse som et oppløsningsmiddel, er ikke skadelig.

I tilfelle av Al-forbindelsene av c-076, eller de hydrogenerte C-076-A1-forbindelser, er der bare en enkelt hydroxygruppe, 4"-hydroxy, som kan acyleres. Dannelsen av monosacchåridet eller aglyconet efterlater bare en enkelt hydroxygruppe som kan acyleres, det er 4<*>'-eller 13-hydroxygruppen.

I tilfelle av de 4"-» 4'- og 13-hydroxygrupper i C-076-A1-forbindelsene oppløses acyleringsreagenset i et passende oppløs-ningsmiddel, idet pyridin foretrekkes, og acyleringsreagenset tilsettes. Reaksjonsblandingen holdes ved fra 0°C til værelsetemperatur i fra 4 til 24 timer. Produktet isoleres ved kjente metoder.

Bl-forbindelsene har to tilgjengelige hydroxygrupper: ved 4"-(4'- eller 13") og 5-stillingene. De to hydroxygrupper har imidlertid lignende reaktiviteter. Når reaksjonen av acylerings-midlet i pyridin utføres ved værelsetemperatur i fra 4 til 24 timer, fåes diacylforbindelsen. Når reaksjonen utføres ved

0°C, fåes en blanding av 4"-(4' eller 13-) og 5-monoacyl-forbindelsene. For å utvinne individuelle forbindelser anbringes blandingen på en kromatografisk kolonne eller en preparativ lag-kromatografisk plate av aluminiumoxyd eller silicagel, og de individuelle forbindelser isoleres lett. Dessuten kan metoder som høytrykks-væskekromatografi anvendes for å skille blandinger av acylerte forbindelser.

De således fremstilte acylforbindelser isoleres fra reaksjonsblandingen under anvendelse av kjente metoder.

De nye forbindelser av formel I har betraktelig

parasitticid aktivitet som anthelmintika, ectoparasitticider, insekticider og acaricider, i menneske- og.dyrehelse og i land-bruket .

Sykdommen eller gruppen av sykdommer betegnet generelt som helminthiasis, skyldes infeksjon av en dyrevert med parasittiske ormer kjent som helminter. Helminthiasis er et fremherskende og alvorlig økonomisk problem i husdyr som svin, sauer, hester, kveg, geiter, hunder, katter og fjærkre. Blant helmintene bevirker gruppen av ormer betegnet som nematoder, en vidt utbredt og ofte alvorlig infeksjon i forskjellige arter av dyr. De mest alminne-lige slekter av nematoder som infiserer dyrene omtalt ovenfor, er Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus,- Cooperia, Ascaris , Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostomå, Uncinaria, Toxascaris og Parascaris . Enkelte av disse, som Nematodirus, Cooperia og Oesphagostomum, angriper hovedsakelig tarmkanalen mens andre,

som Haemonchus og Ostertagia, er mere fremherskende i maven, mens nok andre som Dictyocaulus, finnes i lungene. Nok andre parasitter kan være lokalisert i andre vev og organer i legemet som hjertet og blodkarene, subcutant og lymfevev og lignende.

De parasittiske infeksjoner kjent som helminthiasis, fører til anemi, underernæring, svakhet, vekttap, alvorlig skade på veggene av fordøyelseskanalen og andre vev og organer, og hvis latt ubehandlet, kan de føre tii døden av den infiserte vert. De hydrogenerte C-076-forbindelser som fremstilles ifølge oppfinnelsen, har uventet høy aktivitet mot disse parasitter, og er dessuten også aktive mot Dirofilaria i hunder, Nematospiroides, Syphåcia, Aspiculuris i gnagere, arthropod-ectoparasitter i dyr

og fugler som blodmidd , midd, lus, lopper, spyfluer, i sauer Lucilia sp., bitende insekter og slike migrerende tovingede larver som Hypoderma sp. hos kveg, Gastrophilus i hester og Cuterebra sp. i gnagere.

Fremgangsmåteforbindelsene-er også nyttige mot parasitter som _inf.ise.rer mennesker. De mest vanlige slekter av parasitter i fordøyelseskanalen hos mennesker, er Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris og Enterobius. Andre medisinsk viktige slekter av parasitter som finnes i blodet og andre vev og organer utenfor fordøyelses-kanalen, er filiariene som Wuchereria, Brugia, Onchocerca og Loa; Dracunculus og ekstra-intestinale stadier av de intenstinale

ormer St rongy loides og Trichinella. Forbindelsene er også verdifulle mot arthropoder som infiserer mennesker, bitende insekter og andre tovingede pester som generer mennesker.

Aktiviteten av representative forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen samt av forbindelser kjent fra US patentskrift 3.950.360 overfor parasitter, er vist i de etterfølgende tabeller.

Forbindelsene er også aktive mot huspester som kakerlakk, Blatella sp., klesmøll, Tineola sp., pelsbille, Attagenus sp. og husflue Musea domestica.

Forbindelsene er også nyttige mot insektpester i lagret korn som Tribolium sp., Tenebrio sp. og i landbruksplanter som spinnmidd,.(Tetranychus sp.), bladlus, (Acyrthiosiphon sp.); mot omstreifende orthoptera som gresshopper og ikke fullt utviklede stadier av insekter som lever av plantevev. Forbindelsene er nyttige som et nematocid for å bekjempe jordnematoder og plante-parasitter som Meloidogyne spp., hvilket kan være av viktighet

i jordbruket.

Disse forbindelser kan administreres oralt i en enhetsdoseform som en kapsel, bolus eller tabiett, eller som en stor flytende dose ved anvendelse som et anthelmintikum for pattedyr. Den store flytende dose er vanligvis en oppløsning, suspensjon eller dispersjon av den aktive bestanddel, vanligvis i vann, sammen med et suspenderingsmiddel som bentonit og et fuktemiddel eller lignende hjelpestoff. I alminnelighet inneholder også de store væskedoser et ant isk.umningsmiddel . Væskedosepreparater inneholder vanligvis fra ca. 0,001 til ca. 0,5 vekt% aktiv bestanddel. Foretrukne væskedosepreparater kan inneholde fra 0,01 til

0,1 vekt%. Kapsler og boluser omfatter den aktive bestanddel blandet med en bærer som stivelse, talkum, magnesiumstearat eller di-calciumfosfat.

Når det ønskes å administrere C-076-derivatene i en tørr, fast enhetsdoseform, anvendes vanligvis kapsler, boluser eller

tabletter inneholdende den ønskede mengde aktiv forbindelse. Disse doseformer fremstilles ved intim og jevn blanding av den aktive bestanddel med passende findelte fortynningsmidler, fyll-stoffer, desintegreringsmidler og/eller bindemidler som stivelse, lactose, talkum, magnesiumstearat, vegetabilske gummier og lignende. Slike enhetsdosepreparater kan varieres vidt med hensyn på deres totalvekt og innhold av det antiparasittiske middel avhengig av faktorer som typen av vertsdyr som skal behandles, graden og typen av infeksjon og vekten av verten.

Når den aktive forbindelse skal administreres via et dyre-for, dispergeres det intimt i foret eller anvendes som en topp-dressing eller i form av pellets som så kan tilsettes til det ferdige for eller eventuelt gies separat. Alternativt kan de antiparasittiske forbindelser ifølge oppfinnelsen administreres til dyr parenteralt, f.eks. ved intravom, intramuskulær, intra-tracheal eller subcutan injeksjon i hvilket tilfelle den aktive bestanddel oppløses eller dispergeres i et flytende bærermedium. For parenteral administrasjon blandes det aktive materiale passende med et godtagbart medium, fortrinnsvis av den vegetabilske oljetype som jordnøttolje, bomullsfrøolje og lignende. Andre parenterale medier som et organisk preparat som anvender solketal (2,2-dimethyl-l,3-dioxolan-4-methanol), glycerolformal og vandige parenterale preparater anvendes også. Det aktive monosaccharid-eller aglycon-C-076-forbindelse eller forbindelser oppløses eller suspenderes i det parenterale preparat for administrasjon; slike preparater inneholder i alminnelighet fra 0,005 til 5 vekt% av den aktive forbindelse.

Skjønt de antiparasittiske midler finner

sin vesentlige anvendelse ved behandlingen og/eller forhindringen av helminthiasis, er de også nyttige for å forhindre og behandle sykdommer bevirket av andre parasitter, f.eks. arthropod-parasitter som blodmidd, lus, lopper, midd og andre bitende insekter på husdyr og fjærkre. De er også effektive ved behandling av parasittiske sykdommer som forekommer i andre dyr innbe-fattende mennesker. Den optimale mengde som skal anvendes for de beste resultater, vil selvsagt avhenge av den spesielle forbindelse som anvendes, arten av dyr som skal behandles og typen og graden av parasittisk infeksjon eller angrep. I alminnelighet fåes gode resultater med foreliggende forbindelser ved oral administrasjon av fra ca. 0,001 til 10 rag pr. kg dyrelegemsvekt, idet en slik totaldose gies på en gang eller i oppdelte doser over et relativt kort tidsrom som 1-5 dager. Med de foretrukne forbindelser oppnåes utmerket bekjempelse av

slike parasitter i dyr ved administrering av fra ca. 0,025 til 0,5 mg pr. kg legemsvekt i en enkelt dose. Gjentatte behand-linger gies efter behov for å bekjempe gjeninfeksjoner og er av-hengige av arter av parasitt og avlsmetodene som anvendes. Metodene for administrering av disse materialer til dyr er kjente på det veterinære område.

Når de her beskrevne forbindelser administreres som en bestanddel av foret til dyrene, eller oppløst eller suspendert i drikkevannet, anvendes preparater i hvilke den aktive forbindelse eller forbindelser er intimt dispergert i en inert bærer eller fortynningsmiddel. Med inert bærer menes en som ikke vil reagere med det antiparasittiske middel og en som med sikkerhet kan administreres til dyrene. Fortrinnsvis er en bærer for foradmini-strasjon en som er, eller kan være, en bestanddel av dyreforet.

Passende preparater innbefatter f6r-forblandinger eller til-setninger i hvilke den aktive bestanddel er tilstede i relativt store mengder og som er egnet for direkte foring til dyret eller for tilsetning til foret enten direkte eller efter en forutgående fortynning eller et blandetrinn. Typiske bærere eller fortynningsmidler egnet for. slike preparater, innbefatter f.eks.

berme, maismel, citrusmel, fermenteringsresiduer, malte østers-skall, hvetekli, melasse, maiskolbemel, spiselig bønnemøllefor, soyagrøpp, knust kalksten og lignende. De aktive hydrogenerte C-076-forbindelser dispergeres intimt i bæreren ved metoder som maling, røring, valsing eller tumling. Preparater inneholdende fra ca. 0,005 til 2,0 vekt% av den aktive forbindelse, eir særlig egnet som f6r-forblandinger. Forsupplementer, som mates direkte til dyret, inneholder fra ca. 0,0002 til 0,3 vekt% av de aktive forbindelser.

Slike supplementer tilsettes til dyreforet i en mengde som gir det ferdige for den ønskede konsentrasjon av aktiv forbindelse for behandling eller bekjempelse av parasittiske sykdommer. Skjønt den ønskede konsentrasjon av aktiv forbindelse vil variere avhengig av de tidligere nevnte faktorer såvel som av det spesielle C-076-derivat som anvendes, gies forbindelsene ifølge oppfinnelsen vanligvis i konsentrasjoner på mellom 0,00001 til 0,002% i foret for å oppnå det ønskede antiparasittiske resultat.

Ved anvendelse av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan de individuelle hydrogenerte,C-076-bestanddeler fremstilles og anvendes i den form. Alternativt kan blandinger av to eller flere av de individuelle hydrogenerte C-076-bestanddeler anvendes, såvel som blandinger av andre stam-c-076-forbindelser andre enn C-076-forbindelsen eller andre aktive forbindelser som ikke er beslektet med C-076 og forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Ved isolering av C-076-forbindelsene som tjener som utgangs-materialer ved foreliggende fremgangsmåte, fra fermenteringsvæsken, vil man finne at de forskjellige C-076-forbindelser er dannet i ulike mengder. Spesielt vil en "a"-serie forbindelser dannes i en større mengde enn den tilsvarende "b"-serie forbindelser. Vektforholdet av "a"-serien til den tilsvarende "b"-serie er ca. 75:25 til 99:1. Forskjellen mellom "a"-serien og "b"-serien er konstant for C-076-forbindelsene og består av en sek-butylgruppe, hhv. en isopropylgruppe i 25-stillingen. Denne forskjell griper selvsagt ikke forstyrrende inn i noen av foreliggende reaksjoner. Spesielt behøver det ikke være nødvendig å skille "b"-bestanddelene fra den beslektede "a"-bestanddel. Separasjon av disse nært beslektede forbindelser praktiseres i alminnelighet ikke, da "b"-forbindelsen er bare tilstede i et meget lite vektforhold, og den strukturelle forskjell har ubetyde-lig virkning på reaksjonsprosessene og de biologiske aktiviteter.

Spesielt har det vist seg at utgangsmaterialene for forbindelsene av formel I meget ofte fremstilles i et forhold på

ca. 80% C-076 Bla eller Ala og 20% C-076 Blb eller Alb. Det foretrukne preparat ifølge oppfinnelsen er således et som inneholder ca. 80% av "a"-bestanddelen og 20% av "b"-best anddelen. C-076-forbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, er også nyttige til å bekjempe jordbrukspester som påfører skade på nyttevekster mens de vokser eller mens de lagres. Forbindelsene påføres ved kjente metoder som sprayer, støv, emulsjoner og lignende, på den voksende eller lagrede nyttevekst for effektiv be-skyttelse fra slike landbrukspester.

De følgende eksempler er gitt for å lette den fullstendige forståelse av oppfinnelsen..

De hydrogenerte C-076-derivater fremstilt i de følgende eksempler isoleres i alminnelighet som amorfe faste stoffer og ikke som krystallinske faste stoffer. De karakteriseres således ana-lytisk under anvendelse av metoder som massespektromet ri, kjernemagnetisk resonnans og lignende. Siden forbindelsene er amorfe, kjennetegnes de ikke ved skarpe smeltepunkter, men de anvendte kromatografiske og analytiske metoder viser at forbindelsene er rene.

Eksempel 1

22, 23- dihydro- C- 076 Ala

51,0 mg C-076 Ala og 14,4 mg tris-(trifenylfosfin)-rhodium(I)-klorid forenes i 3»5 ml benzen og hydrogeneres i 20 timer ved værelsetemperatur under atmosfæretrykk. Den urene reaksjonsblanding kromatograferes på en preparativ skiktkromato-grafisk plate under to gangers éluering med 10% tetrahydrofuran i kloroform. Produktet fjernes fra underlaget under anvendelse av ethylacetat som inndampes til tørrhet, og residuet analyseres

med 300 MHz kjernemagnetisk resonnans og massespektroskopi som viser dannelsen av 22,23-dihydro-C-076 Ala.

Eksempel 2

22>23- dihydro- C- 076, Bla

En oppløsning av 87,3 mg C-076 Bla i 6 ml benzen inneholdende 25.mg tris-(trifenylfosfin)-rhodium(I)-klorid hydrogeneres i 4 timer ved værelsetemperatur under 1 atmosfære hydrogentrykk. Preparativ lagkromatografi.på silicagel under eluering med 20% tetrahydrofuran i kloroform gjenvinner utgangsmateriale. Prøven hydrogeneres igjen under ovenstående betingelser i 19 timer. Preparativ lagkromatografi gir 55 mg av 22,23~dihydro-C-076 Bla som identifiseres ved massespektromet ri og 300 MHz kjernemagnetisk resonnans.

Eksempel 3

22, 23- dihydro- C- 076 Bla

En oppløsning av 1,007 g C-076 Bla,' 314 mg tris-(trifenyl-fosfin)-rhodium(I)-klorid og 33 ml benzen hydrogeneres i 21 timer ved værelsetemperatur under 1 atmosfære hydrogentrykk. Oppløs-ningsmidlet fjernes under vakuum, og residuet oppløses i en 1:1 blanding av methylenklorid og ethylacetat og filtreres. Fil-tratet anbringes på en kolonne av 6o g silicagel og elueres med en 1:1 blanding av methylenklorid og ethylacetat idet der taes 10 ml fraksjoner. Fraksjonene 14-65 forenes og inndampes til tørrhet, hvilket gir 1,118 9 av et fast stoff som indikeres av høyt rykks-væskekromatografi å være en 6o/40 blanding av det hydrogenerte produkt og utgangsmateriale. Blandingen hydrogeneres igjer i 55 ml benzen under tilsetning av 310 mg tris-(trifenylfosfin)-rhodium(i)-klorid og omrøres i 21 timer ved værelsetemperatur under 1 atmosfære hydrogentrykk. Oppløsningsmidlet fjernes under vakuum, og residuet kromatograferes på 80 g silicagel under anvendelse av 40:6o blanding av ethylacetat og methylenklorid som elueringsmiddel. lo ml fraksjoner oppfanges, og produktet viser seg i fraksjonene 26-80. Disse fraksjoner forenes og inndampes til tørrhet i vakuum, hvilket gir en gul olje. Oljen oppløses i benzen og lyofiliseres, hvilket gir et blekt gult pulver som ble identifisert som 22,23-dihydro-C-076 Bla ved massespektromet ri og 300 MHz kjernemagnetisk resonnans. Man fikk 0,976 g produkt.

Eksempel 4

22, 23- dihydro- C- 076 Ala monosaccharid

11,2 mg 22,23-dihydro-C-076 Ala oppløses i 1,1 ml 1%-ig svovelsyre i isopropanol og omrøres i 20 timer ved værelsetemperatur. Reaksjonsblandingen fortynnes med kloroform til et volum på ca. 5,0 ml og vaskes med mettet vandig natriumbicarbonatoppløs-ning og natriumkloridoppløsning. Det organiske skikt tørres over natriumsulfat og inndampes til tørrhet i vakuum, hvilket gir en olje. Oljen anbringes på en silicagel-preparativ skiktkromato-grafisk plate og elueres med 5% tetrahydrofuran i kloroform. Produktet fjernes fra platen og lyofiliseres fra benzen, hvilket gir 5,2 mg av et hvitt pulver som identifiseres ved 300 MHz kjernemagnetisk resonnans og massespektromet ri som 22,23-dihydro-

C-076 Ala monosaccharid.

Eksempel 5

22, 23- dihydro- C- Q76 Ala aglycon

10,1 mg 22,23-dihydro-C-076 Ala omrøres i 20 timer i 1,1 ml 1% svovelsyre i methanol ved værelsetemperatur. Reaksjonsblandingen behandles som i eksempel 4, hvilket gir en olje som renses ved preparativ lagskiktskromatografi på silicagel under eluering med 5% tetrahydrofuran i kloroform. Produktet fjernes fra kromato-grafiplaten og lyofiliseres fra benzen, hvilket gir 4,2 mg av et hvitt pulver som 300 MHz kjernemagnetisk resonans og massespektrometri indikerer å være 22,23-dihydro-C-076 Ala aglycon.

Eksempel 6

22, 23- dihydro- C- Q76 Bla monosaccharid

395 mg 22,23-dihydro-C-076 Bla tilsettes til en omrørt opp-løsning av 50 ml 1% svovelsyre i isopropanol, og oppløsningen om-røres i 14 timer ved værelsetemperatur. Reaksjonsblandingen behandles som i eksempel 4, hvilket gir 0,4o4 g av et skum efter lyofilisering fra benzen. Skummet kromatograferes på 6 preparative lag-silicagel-kromatografiplater under eluering to ganger med 4% tetrahydrofuran i kloroform. Monosacchåridet med en Rf 0,15 oppsamles og vaskes fra silicagelen med tilsammen 650 ml ethylacetat. De forenede vaskinger inndampes til tørrhet, og residuet lyofiliseres fra benzen, hvilket gir 0,2038 g 22,23-dihydro-C-076 Bla monosaccharid som høyt rykks-væskekromatografi indikerer å være i det vesentlige rent.

Eksempel 7

22, 23- dihydro- C- Q76 Bla aglycon

9.7 mg 22,23-dihydro-C-076 Bla omrøres over natten i 1 ml av en 1% svovelsyre i methanoloppløsning. Reaksjonsblandingen behandles som i eksempel 4, og det faste materiale behandles ved preparativ lagkromatografi på silicagel under eluering med 10% tetrahydrofuran i kloroform. Oljen utvunnet fra kromatografi - platen, lyofiliseres fra benzen, hvilket gir 4,7 mg av et hvitt pulver som 300 MHz kjernemagnetisk resonans og massespektromet ri indikerer å være 22,23~dihydro-C-076 Bla aglycon.

Eksempel 8

22, 23- dihydro- C- 076 Bla aglycon

0,486 g 22,23-dihydro-C-076 Bla tilsettes til en.omrørt oppløsning av 50 ml 1% svovelsyre i methanol, og reaksjonsblandingen omrøres i 13 timer ved værelsetemperatur. Reaksjonsblandingen fortynnes med 250 ml methylenklorid og vaskes med 50 ml mettet, vandig kaliumbicarbonat og 50 ml vann. Vannskiktet vaskes to ganger med 20 ml porsjoner methylenklorid, og de forenede organiske faser tørres med mettet saltlake og nat riumsulfat og inndampes til tørrhet i vakuum, hvilket gir 0,480 g av et blekt gult skum. Skummet oppløses i 4 ml methylenklorid og anbringes på fire preparative lag-kromatografi-silicagelplater og elueres 4 ganger med 4% tetrahydrofuran i kloroform. Produktet gjenvinnes fra silicagelplatene, hvilket gir et oljeaktig residuum som lyofiliseres fra benzen og gir 255,8 mg av et hvitt, fast stoff. Spor av methyl-oleandrosid ble påvist å være tilstede i det faste materiale. Det hvite, faste stoff lyofiliseres så igjen fra benzen og anbringes under høyvakuum i 20 timer for å fjerne for-urensningen, hvorved man får 22,23-dihydro-C-076 Bla aglycon.

Eksempel 9

4"- Q- acetyl- 22, 23- dihydro- C- 076 Ala

6.8 mg 22,23-dihydro-C-076 Ala oppløses i 4o dråper vann-fritt pyridin, avkjøles til 0°C og behandles med 20 dråper eddik-syreanhydrid. Reaksjonsblandingen får lov til å oppvarmes til

værelsetemperatur og omrøres over natten. Reaksjonsblandingen fortynnes med 5 ml ether og 6 ml vann, og skiktene skilles. Vannfasen vaskes to ganger med ether, og de organiske skikt forenes og vaskes tilbake tre ganger med vann. Etherskiktet tørres over magnesiumsulfat og inndampes til tørrhet i vakuum, hvilket gir en olje. Oljen kromatograferes på silicagel-preparativ lag-kromatograf iplater under eluering med 5% tetrahydrofuran i kloroform. Produktet utvinnes fra platene og lyofiliseres fra benzen, hvilket gir 6,1 mg 4"-O-acetyl-22,23-dihydro-C-076 Ala som be-stemt ved massespektrometri og 30O MHz kjernemagnetisk resonans.

Eksempel 10

4"-0-acetyl-22,23-dihydro-C-076 Bla og 4",5-di-0-acety1-22,23-dihydro- C- 076 Bla

18,6 mg 22,23-dihydro-C-076 Bla oppløses i 63 dråper

(ca. 1 ml) tørr pyridin og behandles med 9 dråper eddiksyrean-hydrid ved 0°C. Reaksjonsblandingen omrøres under nitrogen i 6 timer ved 0°C. Blandingen helles så i 5 ml vann og ekstraheres tre ganger med 3 ml porsjoner ether. De forenede etherekstrakter vaskes så tre ganger med 3 ml porsjoner vann og tørres over mag-nesiumsulf at og inndampes til tørrhet i vakuum. Oljen kromatograferes på preparative lag-silicagel-kromatografiplater under

to gangers eluering med 5% tetrahydrofuran i kloroform, hvilket gir 5,8 mg 4"-O-acetyl-22,23-dihydro-C-076 Bla og 5,8 mg 4",5-di-0-acetyl-22,23-dihydro-C-076 Bla efter lyofilisering med benzen. Strukturene ble bekreftet ved 300 MHz kjernemagnetisk resonans og massespekt romet ri.

Eksempel 11

22, 23- dihydro- C- 076 Bla

39 g C-076 Bla oppløses i 1540 ml toluen og innføres i en

4 liters omrørt autoklav. Til dette tilsettes 3,9 g tris-(tri-fenylfosfin)-rhodium(I)-klorid (Wilkinsons katalysator). Et hydro-gener ingst rykk på 2,8 kg/cm^ og en temperatur på 40°C ble opprett-holdt under omrøring i 4,5 timer. Ved utløpet av denne tid viste væskekromatografisk analyse 98% utbytte av dihydro-C-076 Bla med 1,5% av tetrahydro-C-076 Bla. Toluenet ble fjernet ved inndamp-ning i vakuum-, og den mørkerøde gummi ble oppløst i ethanol i en mengde på 4 ml ethanol pr. g produkt. Formamid i en mengde på

10 ml pr. g produkt ble tilsatt, og oppløsningen ble oppvarmet på

dampbad til 40 - 40°C under tilsetning av vann med en hastighet på 2 ml pr., g produkt . Efter at krystallisasjon var begynt , ble varmen fjernet, og oppløsningen fikk lov til å avkjøles langsomt under omrøring over natten. Det faste stoff ble frafiltrert og vasket med en blanding a<y> 3 deler vann.og 1 del ethanol og tørret i vakuum over natten. Det faste stoff ble oppløst i 150 ml ethanol og oppvarmet til 35 -40°C på dampbad. 150 ml vann ble til-

satt langsomt under omrøring. Når oppløsning var fullstendig ved 35°C, ble varmen fjernet, og oppløsningen fikk lov til å

avkjøles langsomt over natten. Krystallene ble fjernet ved fil-

trering og vasket med 50%-ig vandig ethanol og tørret under vakuum over natten, hvilket ga 32,55 g 22,23-dihydro-C-076 Bla med et smeltepunkt på . 155-157°C. • .

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av en terapeu-tisk aktiv forbindelse med formelen:

   hvorR^ er isopropyl eller sek-butyl;R^ er methoxy, hydroxy eller lavere alkanoyloxy; ogR^ er hydrogen; lavere alkanoyl; c-L-oleandrosyl; 4'-lavere alkanoyl-a-L-oleandrosyl; 4' - (a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyl; 4"-lavere alkanoyl-4'-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyl, karakterisert ved at en forbindelse med formelen: hvor R , R og R„ er som ovenfor angitt, behandles med hydrogen i nærvær av en katalytisk mengde av en forbindelse med formelen: hvor R^ er lavere alkyl, fenyl eller lavere alkylsubstituert fenyl, og X er halogen.